CN111944046B - 高浓度、低粘度抗人il-23单克隆抗体溶液的制备方法 - Google Patents

高浓度、低粘度抗人il-23单克隆抗体溶液的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高浓度、低粘度抗人IL‑23单克隆抗体溶液的制备方法，具体涉及在通过超滤浓缩制备包含抗人IL‑23(hIL‑23)单克隆抗体的制剂的过程中，有效降低超滤浓缩液的粘度、减少抗人IL‑23单克隆抗体聚集并提高其稳定性的方法。本发明的高浓度、低粘度抗人IL‑23单克隆抗体溶液的制备方法包括第一超滤浓缩步骤、等体积缓冲液置换步骤和第二超滤浓缩步骤。

Description

高浓度、低粘度抗人IL-23单克隆抗体溶液的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及在通过超滤浓缩制备包含抗人IL-23(hIL-23)单克隆抗体的制剂的过程中，有效降低超滤浓缩液的粘度、减少抗人IL-23单克隆抗体聚集并提高其稳定性的方法。
背景技术
随着生物制药的快速发展，越来越多的生物制剂产品投入到市场，为了降低生物制剂的临床使用成本，并提高患者的依从性，生物制剂产品逐渐由静脉给药方式向皮下注射剂型转变。对于皮下注射给药途径的单克隆抗体注射液，给药剂量通常在100mg～600mg范围，而最大皮下注射体积一般限制在2毫升以下，在所述情况下，必须制备高度浓缩的蛋白制剂，通常蛋白浓度可达到100mg/ml或者更大的浓度。
具体而言，抗人IL-23单克隆抗体可用作治疗银屑病、银屑病关节炎等自身免疫相关疾病的药物。申请人已经开发了新的抗人白介素23单克隆抗体(QX004N)，与现有的抗人白介素23单克隆抗体(Guselkumab和Risankizumab)相比，其结合hIL-23的亲和力相当，但在细胞水平的拮抗活性优于Guselkumab，而与Risankizumab相当。如将该新的抗人白介素23单克隆抗体制备成皮下注射液，则该皮下注射液中的蛋白浓度要高达100～150mg/mL。
高浓度的单克隆抗体注射液给生产工艺的可制造、工艺放大、及最终的患者施用带来了许多挑战。最主要的一个挑战是超高的粘度，由于抗体的生物高分子性质，以及分子间相互作用力(如疏水、电荷作用等)在高浓度条件时增强，倾向于形成粘性溶液。在某些极端情况下甚至会对超滤膜和超滤设备本身带来不小的挑战，比如最终浓缩时压差的急速上升导致的切向流速减小，浓差极化逐渐失控，直至出现蛋白沉淀将膜堵塞的现象，如此必然会造成回收率降低或工艺失败。另一方面，即使通过改进设备或膜包类型获得最终的高浓度蛋白溶液，也难以将其投入到实际的临床应用中，因为皮下给药时需要使用一次性无菌注射器吸取或者采用预充针的最终包装形式，过高的粘度将导致无法手动推动注射针推杆将药物注射到皮下。超滤浓缩高浓度单克隆抗体药液的另一个难题是在高度浓缩时蛋白样品容易聚集形成可溶性聚体，进一步会聚集形成蛋白沉淀。
因此，针对高浓度的抗人IL-23单克隆抗体皮下注射剂的制备，需要开发一种能够有效降低超滤浓缩液的粘度、减少单克隆抗体聚集并提高其稳定性的超滤浓缩制备方法。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种抗人IL-23单克隆抗体浓缩溶液的制备方法，该方法通过超滤浓缩制备包含抗人IL-23单克隆抗体的超滤浓缩液体，并能够有效降低超滤浓缩液的粘度、减少抗人IL-23单克隆抗体聚集并提高其稳定性。
即，本发明包括：
1.一种抗人IL-23单克隆抗体浓缩溶液的制备方法，其包括下述步骤：
步骤A.第一超滤浓缩步骤：对包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液，以流速为110～320L/m2·h、跨膜压差(TMP)维持在0.7～1.4bar的条件将该包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液浓缩至蛋白浓度为40～50mg/mL，得到第一超滤浓缩液；
步骤B.等体积缓冲液置换步骤：使用蠕动泵将待置换的缓冲液泵入至所述第一超滤浓缩液，继续超滤，并调节所述待置换的缓冲液的泵入速度与透过流速一致，当待置换的缓冲液的泵入量达到所述第一超滤浓缩液的重量的6～10倍时，等体积缓冲液置换即完成，得到等体积缓冲液置换后的超滤浓缩液；其中，所述待置换的缓冲液选为10～30mM的组氨酸-盐酸缓冲液，pH范围在5.5～6.0之间；
步骤C.第二超滤浓缩步骤：调节所述等体积缓冲液置换后的超滤浓缩液中的精氨酸浓度，使得精氨酸浓度为100mM～200mM，然后进行超滤浓缩，使得蛋白浓度为100～200mg/mL，得到第二超滤浓缩液(即为抗人IL-23单克隆抗体浓缩溶液)；其中，向所述等体积缓冲液置换后的超滤浓缩液中加入浓度为1M～2M精氨酸母液，使得精氨酸终浓度为100mM～200mM；
所述抗人白介素23单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)，其中：
(a)CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1(NHEMS)所示；
(b)CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(IITTSDTTYYATWAKG)所示；
(c)CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3(VDIVLLSVTSRI)所示；
(d)CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(QASQSVSTYLS)所示；
(e)CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：5(GASNLES)所示；且
(f)CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(QSGYVFAGLT)所示。
2.前述的制备方法，其中，所述抗人白介素23单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其氨基酸序列为
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNHEMSWVRQAPGKGLEWIGIITTSDTTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVDIVLLSVTSRIWGQGTLVTVSS；且，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，其氨基酸序列为
DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSVSTYLSWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSGYVFAGLTFGGGTKVEIK。
3.根据前述的制备方法，其中，所述步骤A中的包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液的蛋白浓度小于15mg/mL。
4.根据前述的制备方法，其中，所述步骤A中的包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液的蛋白浓度小于10mg/mL。
5.根据前述的制备方法，其中，所述步骤B中的待置换的缓冲液为20mM的组氨酸-盐酸缓冲液，pH值为6.0。
6.根据前述的制备方法，其中，所述步骤C中的所述等体积缓冲液置换后的超滤浓缩液中的精氨酸浓度为130mM～160mM。
7.根据前述的制备方法，其中，所述步骤C中的所述第二超滤浓缩液的蛋白浓度为130mg/mL以上，且其粘度为15cP以下。
8.根据前述的制备方法，其中，所述步骤C中的所述第二超滤浓缩液的蛋白浓度为150mg/mL以上，且其粘度为30cP以下。
9.根据前述的制备方法，其该制备方法适用于200L中试规模的超滤浓缩。
10.根据前述的制备方法，其中，所述步骤A中的包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液是通过对表达抗人IL-23单克隆抗体的细胞发酵液进行亲和层析、低pH灭活、阴离子层析、阳离子层析和纳滤而得到的。
发明的效果
本发明在超滤换液工艺中降低高浓度抗体药液的粘度并提高稳定性的方法简单易行，能够进行放大生产，可以保证样品的高纯度并获得较高的回收率。
根据本发明，能够在200L中试规模下制备出蛋白浓度为130mg/mL以上且粘度为10cP以下的高浓度、低粘度抗人IL-23单克隆抗体浓缩溶液，该抗人IL-23单克隆抗体浓缩溶液可用于制备抗人IL-23单克隆抗体皮下注射剂。
附图说明
图1是显示构建QX004N(HZD90-32)瞬转表达质粒的核酸电泳结果的图。其中，M：Marker；条带1：PCR产物90VH-Hu18；条带2：pHZDCH，HindIII/NheI；条带3：PCR产物90VK-Hu9；条带4：pHZDCK，HindIII/BsiWI。
图2是瞬转表达流程图。
图3是QX004N(HZD90-32)的电泳检测图。
具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
在本说明书中，人白介素23(Human interleukin 23，hIL-23)表示一种源自人的蛋白，由p19和p40两个亚基组成的异源二聚体。p19氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，p40氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，其中，下划线部分表示信号肽。
SEQ ID NO：9：
MLGSRAVMLLLLLPWTAQGRAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP
SEQ ID NO：10：
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
在本说明书中，“抗人白介素23单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人白介素23，使得所述单克隆抗体可用作靶向人白介素23的诊断剂和/或治疗剂。
实验结果显示，所述新的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体可以特异性结合人白介素23(IL-23)的p19亚基。
所述新的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体在诸多生物活性方面与上市同类单克隆抗体产品相当、或优于上市同类单克隆抗体产品。所述生物活性例如抑制IL-23诱导的细胞中STAT3磷酸化的活性、抑制IL23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A的活性、抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性。
在一个实施方式中，所述新的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
SEQ ID NO：11
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNHEMSWVRQAPGKGLEWIGIITTSDTTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVDIVLLSVTSRIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：12
DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSVSTYLSWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSGYVFAGLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
其中，SEQ ID NO：11和12均为经人源化的序列。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解的是，本发明不限于这些实施例。
需要说明的是，下述实施例中的抗人白介素23单克隆抗体QX004N即为所述新的抗人白介素23单克隆抗体。
实施例1抗人白介素23单克隆抗体QX004N的制备
从上海近岸科技有限公司采购人白介素23(IL-23)，用于免疫新西兰兔，运用B细胞克隆技术获得抗原结合特异性抗体克隆，进而筛选出结合IL-23并具有IL-23抑制活性的单克隆抗体。首先，用Binding ELISA检测细胞上清，挑选出与IL-23结合的克隆；再用Blocking ELISA进行检测，挑选出具有IL-23抑制活性的克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。
挑选出5个克隆进行重组表达，并测序。对90#克隆进行人源化改造。利用NCBIIgBlast进行人IgG胚系序列(Germline)同源性比对，选择IGHV3-66*01作为重链CDR移植模板，将90#克隆重链的CDR区(即CDR-H1(SEQ ID No:1)、CDR-H2(SEQ ID No:2)和CDR-H3(SEQID No:3))移植入IGHV3-66*01的骨架区；选择IGKV1-39*01作为轻链CDR移植模板，将90#克隆轻链的CDR区(即CDR-L1(SEQ ID No:4)、CDR-L2(SEQ ID No:5)和CDR-L3(SEQ ID No:6))移植入IGKV1-39*01的骨架区；对骨架区特定位点进行回复突变，将重链CDR-H3中第103位甲硫氨酸(Met，M)突变亮氨酸(Leu，L)，获得本发明的单克隆抗体QX004N可变区。最终，人源化后的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示；人源化后的轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示。
上述重链可变区(SEQ ID NO：7)的基因利用PCR扩增获得；轻链可变区(SEQ IDNO：8)的基因利用PCR扩增获得。用HindIII和NheI双酶切重链表达质粒pHZDCH；用HindIII和BsiWI双酶切轻链表达质粒pHZDCK；用Infusion重组酶将PCR扩增基因分别***对应的表达质粒中，构建重链表达质粒pHZDCH-90VH-Hu18和轻链表达质粒pHZDCK-90VK-Hu9。
通过核酸电泳检测质粒的双酶切结果如图1所示。根据图1的结果可以看出，抗体重链可变区和轻链可变区PCR扩增结果以及双酶切重链和轻链表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约10000bp，轻链可变区约438bp，重链可变区约459bp。
将序列正确的重链表达质粒和轻链表达质粒共转染ExpiCHO-S细胞。转染前一天，将ExpiCHO-S细胞稀释成3×106个细胞/mL进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成6×106个细胞/mL，125mL摇瓶装25mL细胞，等待转染。转染和表达过程如图2所示。
转染后第4-8天，收获培养上清，用ProteinA进行一步纯化。用SDS-PAGE电泳检测纯化的抗体，将其命名为QX004N(HZD90-32)，利用蛋白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，图3的结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kDa和25kDa，与重链(49.1kDa)和轻链(23.1kDa)理论分子量一致。
实施例2平衡解离常数(KD)的测定
用BiacoreT200检测QX004N(HZD90-32)与IL-23的亲和力，所有过程都在25℃进行。采用商品化Protein A芯片，通过捕获法固定适量的抗体，使得Rmax在50RU左右，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用pH1.5甘氨酸再生芯片。用仪器自带分析软件选择Kinetics选项中1:1结合模型进行拟合，计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及解离平衡常数KD值。
除此之外，将QX004N(HZD90-32)与目前已经商业化的针对IL-23的单克隆抗体，即Guselkumab和Risankizumab的亲和力进行比较，针对已知抗体的检测方法与对QX004N进行检测的方法相同，结果如表1所示。其中Guselkumab和Risankizumab通过购买市售的药品获得。
表1抗体结合人IL-23的亲和力
样品名称 k<sub>a</sub>(10<sup>5</sup>M<sup>-1</sup>S<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(10<sup>-5</sup>S<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(10<sup>-10</sup>M)
Guselkumab 5.01 3.19 0.63
Risankizumab 7.06 3.70 0.52
QX004N(HZD90-32) 3.66 3.50 1.01
表中的数据为：每个样品检测两次，计算平均值的数据。
实施例3 QX004N、Guselkumab和Risankizumab的细胞水平生物活性的测定
在相同实验条件下测定了QX004N、Guselkumab和Risankizumab的细胞水平生物活性，实验结果表明：
a.QX004N能够抑制IL-23诱导的HEK BlueTM IL-23细胞中STAT3磷酸化活性，其IC50为3.21ng/mL；Guselkumab和Risankizumab也能够抑制IL-23诱导的HEK BlueTM IL-23细胞中STAT3磷酸化活性，其IC50分别为6.18ng/mL和3.51ng/mL，说明QX004N抑制IL-23诱导的信号转导活性与目前已经商业化的针对IL-23的单克隆抗体即Risankizumab的活性相当，并优于Guselkumab。
b.QX004N能够抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性，其IC50为11.7ng/mL；Guselkumab和Risankizumab也能够抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性，其IC50分别为13.5ng/mL和8.43ng/mL，说明QX004N抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性较强，其与现有的商业化产品(Guselkumab和Risankizumab)的能力相当。
c.QX004N能够抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性，其IC50为10.4ng/mL；Guselkumab和Risankizumab也能够抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性，其IC50分别为16.8ng/mL和11.1ng/mL，说明QX004N抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性强于目前已经商业化的产品Guselkumab，并与Risankizumab的活性相当。
由上述可知，在测定的三项细胞水平生物活性方面，QX004N优于Guselkumab，而与Risankizumab难分伯仲。鉴于Risankizumab
Figure BDA0002656335620000091
已在临床试验中被证实对中度至重度斑块型银屑病的治疗效果显著，QX004N亦有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。
实施例4 QX004N的高浓度超滤浓缩
CHO细胞作为宿主细胞，在2L规模的生物反应器上进行QX004N的发酵，通过离心机或深层膜包过滤获得发酵液，采用Protein A层析进行目的蛋白的捕获，再经过低pH值病毒灭活澄清、阴离子和阳离子层析去除杂质，即获得待超滤的中间体样品。
采用上述中间体进行超滤工艺考察，超滤设备选用默克密理博的Labscale小型超滤仪(夹持两块50cm2 Pellicon XL膜包，截留量30KD)。以120～300L/m2·h的流速，TMP维持在0.6～1.5bar基础上将上述中间体样品浓缩至约40～50mg/mL，然后进行等体积缓冲液置换，置换缓冲液选用20mM的组氨酸-盐酸缓冲，pH值为6.0。置换体积达到7倍后即完成换液步骤，将换液后的中间体样品使用默克密理博的30kDa的超滤离心管浓缩至170mg/mL，使用0.2μm滤膜过滤样品后，与不同的缓冲液或添加剂母液混合后测定粘度值，具体配制方案及粘度值结果如下表2所示。
表2
Figure BDA0002656335620000101
由表2结果可知，随着蛋白浓度的提高，QX004N溶液的粘度值呈指数级增加，若无添加剂加入，该单抗在浓度为170mg/mL时粘度值会达到63cP，如此高的粘度值无法使用常规的超滤膜实现浓缩工艺。以150mg/mL蛋白浓度为例，通过添加100mM～200mM的碱性氨基酸或其组合可以将相同蛋白浓度条件下的抗体粘度值降至原来的50％以下，小于20cP。基于上述实验结果，可以实现QX004N溶液的给药浓度为100～150mg/mL。
进一步放大至200L中试规模，采用默克密理博Pellicon手动超滤***，夹持五块0.5m2 Pellicon 2型膜包。纳滤后的样品(UF0)以流速120～300L/m2·h，TMP控制在0.6～1.5bar，先进行第一步浓缩(UF1)，将样品浓缩至40～50mg/mL；然后采用UA进行7倍等体积置换(DF)，将样品置换至20mmol/L组氨酸，pH6.0；置换结束，加入精氨酸母液至终浓度为150mM，进一步将样品过浓缩(UF2)，回收样品，实验结果汇总如下表3所示。
表3
Figure BDA0002656335620000111
上述结果表明，通过添加终浓度为150mM的精氨酸，QX004N在中试水平可顺利实现高浓度超滤浓缩，过浓缩样品浓度为130mg/mL时的粘度值为7.6cP，如果无上述添加剂蛋白的粘度值将达到19.4cP(表2)。此外，在整个超滤过程中，样品的纯度也未发生变化，精氨酸起到了较好的保护作用。
序列表
<110> 江苏荃信生物医药有限公司
<120> 高浓度、低粘度抗人IL-23单克隆抗体溶液的制备方法
<130> TPD01174
<141> 2020-08-28
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Asn His Glu Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ile Ile Thr Thr Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Val Asp Ile Val Leu Leu Ser Val Thr Ser Arg Ile
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Gln Ser Gly Tyr Val Phe Ala Gly Leu Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn His
20 25 30
Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Thr Thr Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Asp Ile Val Leu Leu Ser Val Thr Ser Arg Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Val Phe Ala Gly
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr
1 5 10 15
Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln
20 25 30
Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His
35 40 45
Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr
50 55 60
Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly
85 90 95
Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu
100 105 110
Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu
115 120 125
Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr
130 135 140
Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu
145 150 155 160
Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala
165 170 175
Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
180 185
<210> 10
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 11
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn His
20 25 30
Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Thr Thr Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Asp Ile Val Leu Leu Ser Val Thr Ser Arg Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 12
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Val Phe Ala Gly
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (7)

1.一种抗人IL-23单克隆抗体浓缩溶液的制备方法，其包括下述步骤：
步骤A即第一超滤浓缩步骤：对包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液，以流速为110～320L/m2·h、跨膜压差维持在0.7～1.4bar的条件将该包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液浓缩至蛋白浓度为40～50mg/mL，得到第一超滤浓缩液；
步骤B即等体积缓冲液置换步骤：使用蠕动泵将待置换的缓冲液泵入至所述第一超滤浓缩液，继续超滤，并调节所述待置换的缓冲液的泵入速度与透过流速一致，当待置换的缓冲液的泵入量达到所述第一超滤浓缩液的重量的6～10倍时，等体积缓冲液置换即完成，得到等体积缓冲液置换后的超滤浓缩液；其中，所述待置换的缓冲液选为20mM的组氨酸-盐酸缓冲液，其pH值为6.0；
步骤C即第二超滤浓缩步骤：调节所述等体积缓冲液置换后的超滤浓缩液中的精氨酸浓度，使得精氨酸浓度为100mM～200mM，然后进行超滤浓缩，使得蛋白浓度为100～150mg/mL，得到第二超滤浓缩液，即为抗人IL-23单克隆抗体浓缩溶液；其中，向所述等体积缓冲液置换后的超滤浓缩液中加入浓度为1M～2M精氨酸母液，使得精氨酸终浓度为100mM～200mM；
所述抗人白介素23单克隆抗体包含三个重链互补决定区即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，以及三个轻链互补决定区即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
(a)CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(b)CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(c)CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(d)CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(e)CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；且
(f)CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述抗人白介素23单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；且，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤A中的包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液的蛋白浓度小于15mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤A中的包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液的蛋白浓度小于10mg/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤C中的所述等体积缓冲液置换后的超滤浓缩液中的精氨酸浓度为130mM～160mM。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其该制备方法适用于200L中试规模的超滤浓缩。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤A中的包含抗人IL-23单克隆抗体的溶液是通过对表达抗人IL-23单克隆抗体的细胞发酵液进行亲和层析、低pH灭活、阴离子层析、阳离子层析和纳滤而得到的。
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