KR20180035728A - 항-pd-1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

종양을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편, 및 상기 항체의 용도가 제공된 것이다.

Description

항-PD-1 항체 및 이의 용도{ANTI-PD-1 ANTIBODY AND USE THEREOF}
본 발명은, 신규한 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 추가적으로, 종양을 치료하기 위한 약제의 제조에서 항체의 용도에 관한 것이다.
T 세포 공동-수용체 신호전달(T cell co-receptor signaling)은, 면역 반응을 단단히 조절하기 위한 중요한 매커니즘이다. 공동-신호전달(공동-자극 및 공동-저해를 포함함)에 대한 세포 표면 분자는, 두 가지의 주요한 패밀리로 나눠질 수 있다: 면역글로불린 (Ig) 상과(superfamily) 및 종양 괴사 인자(TNF)-종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 상과. 일반적으로, T 세포의 활성화는 HLA 클래스 I 또는 II 분자에 의해 나타낸 항원 펩티드에 따라 달라진다. 공동-수용체 신호전달은 이러한 활성화를 증가시키거나 예방할 것이다. 예를 들어, 말초 림프 기관(peripheral lymphoid organs)에서 림프구의 개시 및 성숙이 촉진될 수 있거나, 또는 유기체에서 이들의 반응 효과는, 유일한 공동-자극 경로(unique co-stimulation pathways)를 통해 작용물질과 CD28 또는 4-1BB의 활성화에 의해 증진될 수 있다. 면역 활성화는 또한, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), B7 동족체 1(B7-H1, PDL1으로서 또한 나타냄) 경로, 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA4), B/T 림프구 감쇠조절인자(B/T lymphocyte attenuator, BTLA) 및 그 밖의 경로와 같은, 길항물질과 공동-저해 신호전달 경로를 차단함으로써 또한 달성될 수 있다. 이러한 공동-저해 신호전달 경로는, 면역 반응을 제한하고, 종료하고 및/또는 약화시키는(attenuate), 부정적인 신호(negative signal)를 제공하는, 면역 관용(immune tolerance)의 조절에서 중요한 역할을 한다. 면역 활성화에 의해 유도된 인산화를 역전하기 위해, CTLA4, PD1 및 B/T 림프구 감쇠조절인자(BTLA) 리크루트 포스파타아제와 같은 공동-저해 수용체 반면에, 공동-자극 수용체에 의해 매개된 면역 활성화는, 막-인접한 키나아제를 자극함으로써 활성화되고, 인산화반응 캐스케이드 증폭을 생산한다[Immune activation mediated by co-stimulation receptors is activated by stimulating membrane-proximal kinase and produces phosphorylation cascade amplification, while co-suppression receptors such as CTLA4, PD1 and B/T lymphocyte attenuator (BTLA) recruit phosphatase to reverse the phosphorylation which is induced by immune activation]. 면역조절 생물학적 제형은, 이식 거부, 자가면역 질병 또는 염증성 질병에 의해 야기된 면역 기능항진을 저해하기 위해, 또는 암, 만성적인 박테리아의 감염 및 바이러스 감염 등과 같은, 면역 기능저하에 대한 면역 반응을 자극하기 위해, 면역-관련된 질병의 치료에서 널리 사용될 수 있다. 즉, 타겟 항원 또는 타겟-양성 세포의 소비 또는 중성화에 의해, 모노클로날 항체 및 재조합 융합 단백질에 근거한 주류 치료와 달리, 면역조절 생물학적 제형(immunomodulatory biological formulations)은, 림프구 반응의 강도 및 방향을 조절하기 위해, 숙주의 면역 세포의 표면에서 상기 신호 분자를 결합하고 조절함으로써 주로 항원-특이적인 T 세포 수용체(TCR) 및 B 세포 수용체(BCR)에 대한 신호를 조절한다.
PD-1 유전자는, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1)로서 명명되고, T 세포 하이브리도마가 아포토시스를 받은 경우에, 상향-조절된다. PD-1 (CD279)는 활성화된 T 세포, B 세포, 및 활성화된 골수성 세포로 표시되고(Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, Honjo T. EMBO J. 1992, 1: 3887-3895), 활성화된 대식 세포, DC 및 단핵구(monocyte)로 또한 표시되지만, 이들의 미성숙한 세포(their immature cells)를 나타내지 않는다(Agata Y, et al. Int. Immunol. 1996, 8: 765-772；Said E A, et al. Nature Med. 2010, 16: 452-459). 세포 표면에서 이러한 상향-조절된 발현은 유기체의 후천성 면역 및 선천성 면역 반응(acquired immune and innate immune responses)을 저해할 수 있다. PD-1 세포 내 도메인은 두 가지의 티로신 부위를 함유하고, 하나는 면역수용체 티로신-기초된 저해 모티프(ITIM)이고, 다른 것은 면역수용체 티로신-기초된 스위치 모티프(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)(ITSM)이다. ITSM에서 상기 티로신의 인산화는 티로신 포스파타아제 SHP2 및/또는 SHP1을 리크루트한다(recruits). 이러한 포스파타아제는 ZAP70, CD3 및 PKC를 탈인산화할 것이고(dephosphorylate), 이렇게 함으로써 T 세포 신호를 약화시킬 것이다. PD-1은 주로 세포가 G0/G1 단계(phase)에서 저해되도록 T 세포 및 B 세포 증식을 저해하고, T 세포에서 사이토카인 생산을 저해한다. PD-1 발현 삭제를 가지는 동물은, 자가면역 심근병증(cardiomyopathy), 관절염 및 신장염을 가지는 루푸스-유사 증후군(lupus-like syndromes)을 포함하는, 다양한 자가면역 표현형이 발생한다(Nishimura et al. Immunity. 1999, H: 141-51; Nishimura et al. Science. 2001, 291: 319-22). 게다가, PD-1은 또한, 자가면역 뇌척수염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 이식편대숙주병(GVHD), 당뇨병 타입 Ⅰ 및 류마티스 관절염 등에서 중요한 역할을 한다(Salama et al. J Exp Med. 2003, 198: 71-78; Prokunina and Alarcon-Riquelme, Hum MoI Genet. 1992, 13: R143; Nielsen et al. Lupus. 2004, 11: 510).
두 가지의 PD-1 리간드는 PD-L1/B7H1/CD274 및 PD-L2/B7-DC/CD273로 현재 보고되고 있다(Freeman G J, et al. J. Exp. Med. 2000, 192: 1027-1034; Latchman Y, et al. Nature Immunol. 2001, 2: 261-268). PD-L1은, B 세포, 수상 돌기 세포, 대식 세포 및 T 세포와 같은 면역 세포에서 낮은 레벨로 표현되고, 세포 활성화에서 상향-조절된다. PD-L1은 또한, 맥관의 내피 세포, 심장, 폐, 췌장, 근육, 각질세포(keratinocytes) 및 태반 등과 같은 비-림프성 장기로 표현된다. 비-림프성 조직에서의 PD-L1의 발현은, PD-L1이 말초성 조직에서 자가-반응성 T 세포, B 세포 및 골수성 세포의 기능을 조절할 수도 있는 것임을 나타내고, 또한 타겟 장기의 염증성 반응에 참가할 수도 있다. PD-L1의 발현은 주로, 또한 혈관 내피 세포 및 상피 세포에서 PD-L1 레벨의 주요한 조절인자인, 인터페론 1 또는 2에 의해 조절된다. PD-L1은 또한 종양 세포에서 발현되고, 좋지 못한 예후와 밀접하게 관련되어 있다. 다양한 바이러스성 감염은, 높은 레벨로 숙주 조직에서 PD-L1의 발현을 유도할 수 있다. PD-L2 전사물(transcript)이 심장, 간 및 췌장과 같은 비-조혈 조직에서 발견되었을지라도, 세포 표면에서 PD-L2/B7-DC의 발현은 대식 세포 및 수지상세포에 대해서만 제한되고, IFNγ 및 Th2 사이토카인의 생산에 따라 달라진다. PD-L1 및 PD-L2의 발현은 또한 상이한 자극에 의해 영향을 받는다. 대식세포에서 PD-L1는 INFγ에 의해 유도되는 반면에, PD-L2는 IL-4에 의해 조절된다. 유사한 현상은 또한 수지상 세포 위에(on) 나타난다. 상기 연구는 PD-L1가 Th1 반응을 우선적으로 조절할 수도 있는 반면에, PD-L2는 Th2 세포 반응을 조절할 것임을 나타낸다. PD-L1 및 PD-L2 둘 다는, T 세포 확산, 사이토카인 생산 및 β1/β2 인테그린에 의해 조절된 부착을 저해할 수 있다. PD-L2는 또한 수지상 세포의 반대 신호전달을 촉발시킬 수 있고, 이렇게 함으로써 IL-12 생산 및 T 세포 활성화를 결과적으로 야기한다.
PD-L1-PD-1 조절 축(regulation axis)은 유기체 면역 내성(organism immune tolerance)의 유지 및 T 세포 활성화의 조절에서 중요한 역할을 하고, 또한 면역 바이러스 감염 뿐만 아니라 종양 세포에 의해 이용된다(Yao S, Chen L. Trends Mol. Med. 2006, 12: 244-246; Zou W, Chen L. Nature Rev. Immunol. 2008, 8: 467-477). PD-L1 is highly expressed in a variety of human cancer tissues (Dong et al, Nat. Med. 2002, 8: 787-9). PD-L1의 발현은 특정한 타입의 악성 종양의 진행 및 좋지 못한 예후와 연관된 것이다(Thompson R H, et al. Cancer Res. 2006, 66: 3381-3385). PD-L1-PD1 경로는 T 세포 소모( T cell depletion )를 촉진하기 위해 또한 확인되고 있다(Zajac A J, et al. J. Exp. Med. 1998, 188: 2205-2213). 종양 또는 바이러스에 의해 야기되는 PD-L1-PD1 경로는, 촉진하는 T 세포 불활성화, 피로, 반응 없음(unresponsiveness) 및 아포토시스를 포함하고, Treg 세포 증폭을 유도하고, 사멸(killing) 및 아포토시스를 저항하기 위해 종양의 본질적인 능력을 증진시키는 것을 포함하는, 다양한 매커니즘을 통해 숙주 면역학적 감시(host immunological surveillance)의 탈출을 달성할 수 있다. 암 세포에 의해 조정된 PD-1 및 PD-L1의 상호작용은, 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte)의 감소, T 세포 수용체에 의해 매개된 T 세포 증식의 저해, 증가된 면역 회피(increased immune escape)를 결과적으로 나타낸다(Dong et al. J. Mol. Med. 2003, 81: 281-7；Blank et al. Cancer Immunol. Immunother. 2005, 54: 307-314; Konishi et al. Clin. Cancer Res. 2004, 10: 5094-100).
지금까지, PD-L1-PD-1 조절 축을 특이적으로 차단하고, 항-종양 및 항-바이러스 면역 반응의 활성화를 제공하도록, 암 환자에 대한 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있는 만족스러운 방법이 여전히 없다. 따라서, 암 또는 만성 감염을 가지는 환자의 면역 저해를 극복하기 위해, PD-L1-PD-1 조절 축을 특이적으로 차단하기 위한 치료학적 방법의 설계 및 발전에 대한 절실한 필요성이 있다.
전반적으로, 본 발명은, 신규한 PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편을 제공한다. 특히, 본 발명의 항체는 인간화 항체(humanized antibody)이다.
하나의 측면에서, 본 발명은, PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능적인 단편을 제공하고, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, (ⅰ) 상기 중쇄는, SEQ ID NO: 7, 8 및 11, 또는 9, 10 및 11에 의해 각각 나타낸 아미노 서열을 가지는 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하고; 및 (ⅱ) 상기 경쇄는, SEQ ID NO:12, 13 및 14에 의해 각각 나타낸 아미노 서열을 가지는 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은, PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능적인 단편을 제공하고, (ⅰ) 상기 중쇄는, SEQ ID NO: 1, 2, 4 또는 5에 의해 나타낸 아미노 서열을 가지는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 및 (ⅱ) 상기 경쇄는, SEQ ID NO: 3 또는 6에 의해 나타낸 아미노 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능적인 단편을 제공하고, (ⅰ) 상기 중쇄는, SEQ ID NO: 4 또는 5에 의해 나타낸 아미노 서열을 가지는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 및 (ⅱ) 상기 경쇄는, SEQ ID NO: 6에 의해 나타낸 아미노 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 항-PD-1 항체는 10F8, 15H6, BA08-1 및 BA08-2로부터 선택된 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편을 인코딩하는(encodes), 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편의 경쇄를 인코딩하는(encoding) 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 항-PD-1항체 또는 이의 기능적인 단편의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오티드의 조합물(combination of isolated polynucleotides)을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 조합물을 포함하는, 발현 벡터를 제공하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 효과적으로, 숙주 세포 또는 세포-프리 발현 시스템에서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조절 서열(regulatory sequence)에 연결된다. 바람직하게, 상기 발현 벡터는 바이러스성 벡터(viral vector) 또는 비-바이러스성 벡터이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편, 및 약제학적으로 용인가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 조합물, 발현 벡터 및/또는 약제학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에게 암 또는 감염성 질병을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 특정한 실시형태에서, 상기 대상은 항-CD3 항체 치료를 받거나 받는 것을 의도하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 조합물, 발현 벡터 및/또는 약제학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 T 세포 면역 반응을 증진시키기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 T 세포 면역 반응을 증진시키는 것(the enhancing T cell immune response)은 T 세포의 사이토카인 생산을 증진시키는 것을 포함하고, 바람직하게는, 상기 사이토카인은 IL-2 및/또는 IFN-γ를 포함한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, T 세포의 증진시키는 사이토카인 생산(the enhancing cytokine production of T cells)은, 항-CD3 항체에 의해 자극된 T 세포의 사이토카인 생산을 포함한다. 몇몇 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 대상은, 암을 갖는 환자, 예를 들어, PD-L1 양성 암을 갖는 환자, 바람직하게는 폐암 및 흑색종을 가지는 환자이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편, 상기 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드들의 조합물, 발현 벡터 및/또는 약제학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에게 T 세포 활성화를 촉진하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 추가적으로 상기 대상에 항-CD3 항체를 투여하는 것을 더 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상기 대상에, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 조합물(the combination of polynucleotides), 상기 발현 벡터 및/또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에게 T 세포 활성화에서 PD-L1의 저해를 제거하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 추가적으로 상기 대상에게 항-CD3 항체를 투여하는 것을 더 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, T 세포와, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편, 상기 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 조합물, 발현 벡터 및/또는 약제학적 조성물을 접촉하는 것을 포함하는, T 세포 활성화를 촉진하기 위한 방법(바람직하게, 생체 외)을 제공한다. 바람직하게, 상기 방법은 T 세포와 항-CD3 항체를 접촉하는 것을 더 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, T 세포와, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 조합물, 발현 벡터 및/또는 약제학적 조성물을 접촉하는 것을 포함하는, T 세포 활성화에서 PD-L1의 저해를 제거하기 위한 방법(바람직하게 생체 외)을 제공한다. 바람직하게, 상기 방법은, T 세포와 항-CD3 항체를 접촉하는 것을 더 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명의 방법은 추가적으로, 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 항-PD-1 항체 및 항-CD3 항체를 투여하는 것을 포함하는, 병용 치료(combination therapy)를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 감염성 질병 또는 암을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편의 용도를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, T 세포 면역 반응을 증진하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편의 용도를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 증진시키는 T 세포 면역 반응은 T 세포의 사이토카인 생산을 증진시키는 것을 포함하고, 바람직하게는, 상기 사이토카인은 IL-2 및/또는 IFN-γ을 포함한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, T 세포의 증진시키는 사이토카인 생산(the enhancing cytokine production of T cells)은, 항-CD3 항체에 의해 자극된 T 세포의 사이토카인 생산을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편은 PD-L1 양성 암 및 PD-1 음성 암(PD-L1 positive cancer and PD-1 negative cancer)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 특정한 실시형태에서, 상기 암은 폐암 또는 흑색종(예를 들어, PD-L1 양성 폐암 또는 흑색종 및/또는 PD-L1 음성 폐암 또는 흑색종)이고, 상기 감염성 질병은 HIV 감염 또는 간염 B 바이러스 감염이다.
몇몇 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따른 상기 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편은, PD-1 및 PD-L1 사이의 상호작용 및/또는 PD-1 및 PD-L2 사이의 상호작용을 차단한다.
몇몇 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 기능적인 단편은 추가적으로, 인간 IgG4 또는 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 기재된 인간화 항체를 선별하고 제조하기 위한 방법에 관한 것이다: 인간 PD-1 단백질과 BLAC/C 마우스를 면역화하는 것(immunizing BLAC/C mice with human PD-1 protein), 플로우 사이토미터(flow cytometer)를 통해 높은 역가(high titer)의 마우스 항원-특이적인 B 세포를 선별하는 것, RT-PCR 방법으로 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자를 클로닝하는 것(cloning), 그리고 난 다음에, 293 세포들을 이용한 상기 재조합 항체를 발현하는 것. 단백질로 정제한 후, 및 친화력에 대한 스크리닝 및 PD-L1으로 상기 결합 활동의 차단을 통해, 항체 10F8 및 15H6은, 예상 밖의 높은 PD-1 친화력 및 T 세포 활성화 능력으로 최종적으로 선택된 것이다. 항체 10F8 및 15H6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NO: 1 및 2에 의해 나타낸 것이고; 상기 두 가지의 항체는, SEQ ID NO: 3에 의해 나타낸 바와 같은, 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항체 10F8의 중쇄 CDRs(H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3)의 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NO: 7, 8 및 11에 의해 나타낸 것이고; 15H6의 중쇄 CDRs(H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3)의 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NO: 9, 10 및 11에 의해 나타낸 것이고; 항체 10F8 및 15H6의 경쇄 CDRs(L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3)의 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NO: 12, 13 및 14에 의해 나타낸 것이다. 이들의 중쇄 가변 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열을 기초로 하는 비교는, 인간 항체 유전자 서열 라이브러리(human antibody gene sequence library)에 대항하여(against) 제조되었고, 인간 생식계열 항체(human germline antibody)의 가변 영역의 일련의 이에 해당하는 후보물질 서열은, 상기 중쇄 가변 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열과 유사한 것으로 발견되었다. HLA-DR 분자와 일련의 후보물질 서열의 결합 친화력은, 가장 낮은 친화력의 상기 프레임 서열(frame sequences)을 선택하고, 이로 인하여 상기 중쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 인간화 서열(humanized sequences)을 최종적으로 수립하기 위해, 컴퓨터 모의실험[실리콘에서(in silicon)] 방법에 의해 분석되었다. 이러한 프레임 서열을 기반으로, 컴퓨터 분자 모델 분석은, CDR 배열(CDR configuration)을 지지하기 위해 필요로 하는 쥣과 항체에서 보유된(reserved) 이에 해당하는 프레임 아미노 잔기를 분석하기 위해 적용된 것이다. 10F8에 해당하는 인간화 항체 BA08-1 및 15H6에 해당하는 인간화 항체 BA08-2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NO: 4 및 5에 의해 나타낸 것이다. 동일한 분석은, 상기 마우스 항체의 경쇄 가변 영역의 서열에서 수행되었다. 경쇄 가변 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 서열을 기초로 하는, 비교는 상기 인간 항체 유전자 서열 라이브러리(NCBI Ig BLAST)에 대하여 제조되었고, 인간 생식계열 항체의 가변 영역의 이에 해당하는 후보물질 서열은, 경쇄 가변 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열과 유사한 것으로 발견되었다. HLA-DR 분자로 상기 서열의 결합 친화력은 컴퓨터(실리콘으로) 분석에 의해 분석되었고, 이로 인하여 상기 경쇄 가변 영역의 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 인간화 서열을 최종적으로 설정하기 위해, 상기 가장 낮은 친화력을 가지는 상기 프레임 서열이 선택되었다. 이러한 프레임 서열을 기초로 하는, 컴퓨터 분자 모델 분석은, 상기 마우스 항체의 공간적인 스테레오 구조를 분석하기 위해, 및 CDR 배열을 지지하기 위해 필요로 하는 쥣과 항체 경쇄에 보유된 이에 대응하는 프레임 아미노 잔기를 분석하기 위해, 적용된 것이다. 10F8 및 15H6에 해당하는 인간화 항체 BA08-1 및 인간화 항체 BA08-2의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6에 의해 나타낸 것이다.
도 1은, 항체 BA08-1 및 BA-08-2가 높은 친화력을 가지는 PD-1 단백질에 결합하는 것을 나타낸 것이다.
도 2는, 항체 BA08-1 및 BA-08-2가 PD-L1 대 PD-1의 결합을 차단하는 것을 나타낸 것이다.
도 3은, 항체 BA08-1 및 BA-08-2가 T 세포의 IL-2 생산을 현저하게 증진시키는 것을 나타낸 것이다. 컬럼은 왼쪽에서 오른쪽을 나타낸 것이다: 도면의 하층부에서 범례(legends)에 기재된 바와 같은, 상기 항체 없는 음성 대조, 양성 대조(항-CD3 항체 단독), IL-2 발현 자극된 항-CD3 항체에서 PD-L1의 저해(PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께), 본 발명의 항체 BA08-1에 의한 PD-L1 저해 효과의 길항 작용(BA08-1, PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께), 본 발명의 항체 BA08-2에 의한 PD-L1 저해 효과의 길항 작용(BA08-2, PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께), 및 MK3475에 의한 PD-L1 저해성 효과의 길항 작용(MK3475, PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께).
도 4는, 항체 BA08-1 및 BA-08-2가 T 세포의 IFN-γ 생산을 현저하게 증진시키는 것을 나타낸 것이다. 컬럼은 왼쪽에서 오른쪽을 나타낸 것이다: 도면의 하층부에서 범례(legends)에 기재된 바와 같은, CD3 항체 없는 대조, 양성 대조(항-CD3 항체 단독), 항-CD3 항체 자극된 IFN-γ 발현에서의 PD-L1의 저해(PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께), 본 발명의 항체 BA08-1에 의한 PD-L1 저해성 효과의 길항 작용(BA08-1, PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께), 본 발명의 항체 BA08-2에 의한 PD-L1 저해성 효과의 길항 작용(BA08-2, PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께), 및 MK3475에 의한 PD-L1 저해성 효과의 길항 작용(MK3475, PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께).
도 5는, 림프구의 사이토카인 생산에서 항체 BA08-1 및 BA-08-2의 효과를 나타낸 것이다.
도 6은, 활성화된 T 세포의 IL-2 생산을 저해하기 위한, 종양 세포(흑색종 세포 및 폐암 세포를 포함함)에서 항체 BA08-1 및 BA-08-2의 효과를 나타낸 것이고, PD-L1은 고정된 PD-L1이다.
도 7은, 인간 폐암을 가지는 Hu-PBL SCID 마우스를 사용한 인간화 항-PD-1 항체의 생체 내 항-종양 효과의 평가를 나타낸 것이다.
도 8은, 흑색종에 대항하는 인간화 항-PD-1 항체의 생체 내 항-종양 효과의 평가를 나타낸 것이다.
구체적인 실시형태
다른 방식으로 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적인 및 과학적인 용어는, 본 분야에서 통상의 기술자에 의해 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 분야에서 정의 및 전문 용어에 대해서, 특정한 참고문헌은, 전문가에 의한 Molecular Biology (Ausubel)에서의 현재의 프로토콜로 만들 수 있다. 아미노산 잔기의 약어는, 본 분야에서 통상적으로 사용된 20 L-아미노산 중의 어느 하나에 대한 표준 3-문자 및/또는 1-문자 코드이다.
본 발명은, 프로그램된 사멸 인자 1(programmed death factor 1, PD-1)에 결합할 수 있는 항-PD-1 항체 및 이의 기능적인 단편을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 이의 기능적인 단편은, 하기의 특징의 적어도 하나를 가진다: 높은 친화력을 가지는 PD-1 및 PD-L1의 상호작용을 차단할 수 있는 것; 높은 특이성을 가지는 PD-1에 결합할 수 있는 것; 종양-특이적인 T 세포를 활성화하는 것, 이로 인하여 종양 세포를 사멸시키는 것; T 세포 면역 반응을 현저하게 증진시키는 것, 예를 들어, T 세포의 사이토카인(IFNγ 및 IL-2을 포함함) 생산을 증진시키는 것; 및 면역 이펙터(immune effectors)의 레벨을 증가시키는 것.
본 발명은 또한 인간화 항-PD-1 항체 및 이의 기능적인 단편을 제공한다. 예를 들어, 상기 인간화 항체는, 효모 디스플레이 기술(yeast display technology)과 함께 면역화된 마우스에 의해 생산된 상기 마우스-유도된 항체의 컴퓨터 모의 설계에 의해 획득된 것이다.
항체의 활성도에 실질적으로 영향이 없는 것을 전제로 하는, 본 발명의 서열에서 하나 또는 그 이상의(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그 이상과 같은) 아미노산의 치환, 첨가 및/또는 삭제는, 항체의 서열 또는 이의 기능적인 단편의 변이체(variants)를 수득하기 위해 본 분야의 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 이들은, 본 발명의 보호 범위 내로 포함되는 것으로 간주된다. 예를 들어, 가변 영역에서 아미노산은, 유사한 특성의 것으로 대체될 수 있다. 본 발명의 변이체의 서열은, 상기 근원 서열(source sequence)과 적어도 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일성을 가질 수도 있다. 본 발명의 서열 동일성은, 서열 분석 소프트웨어에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 매개 변수(default parameter)를 가지는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는, 전장 항체(예를 들어, IgGI 또는 IgG4 항체), 이의 다양한 기능적인 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편과 같은, 항체-결합하는 부분만을 포함할 수도 있음), 및 변형된 항체[예를 들어, 인간화, 글리코실화된(glycosylated) 등]를 포함한다. 본 발명은, 변형된 글리코실화 패턴을 가지는 항-PD-1 항체를 포함한다. 몇몇 적용에서, 원하지 않는 글리코실화 부위를 제거하는 변형은 유용할 수도 있거나, 또는 항체의 올리고당 사슬에서 푸코오스 모이어티(fucose moiety)의 부재는, 예를 들어, 항체 의존적인 세포의 세포독성(ADCC) 기능을 증진시킨다. 다른 적용에서, 갈락토실 변형(galactosylation modification)은, 보체-의존적인 세포독성(complement-dependent cytotoxicity)(CDC)을 변화시키도록 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능적인 단편"은, 전장 항체, 예를 들어 항원-결합하는 단편을 나타내는 단편, 특히 하기의 항체 단편: 예를 들어, Fv, scFv(sc는 단일 가닥을 나타낸다), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편 또는 단편 또는 디아바디, 또는 반감기를 연장시키기 위해 리포좀 내로 포함되거나 화학적으로 변형된 어떠한 단편을 나타내기 위한 것을 의도하고, 상기 화학적 변형은, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜["페길화(pegylation), PEG-기초됨(PEG-based)"]과 같은, 폴리(알킬렌)글리콜의 첨가이다(상기 페길화된 단편은 Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG을 나타내는 것이다)("PEG"는 폴리에틸렌 글리콜이다).
본 발명의 항-PD-1 항체를 인코딩하는 DNA 분자는, 본 분야의 통상의 기술자에 의해 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 그 다음에 숙주 세포 내로 형질전환된다. 이에 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 항-PD-1 항체를 인코딩하는 DNA 분자를 포함하는, 재조합 DNA 벡터를 제공한다.
바람직하게, 상기 재조합 DNA 벡터는 발현 벡터이고, 본 분야의 통상의 기술자는 상기 발현 벡터 내로 항체의 DNA 분자를 클로닝할 수 있고, 유도 발현(induction expression)의 수단에 의해 항체를 수득하기 위해 숙주 세포 내로 이를 형질전환할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는, 상기 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및/또는 불변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 함유한다. 그러나, 두 가지의 발현 벡터는, 중쇄 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 하나, 및 포유동물을 함께 감염시키는, 상기 경쇄 가변 영역 및 불변 영역을 함유하는 다른 것과 함께, 별도로 구성될 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 발현 벡터는 추가적으로, 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열 및 프로모터, 및 선별을 위해 적어도 하나의 약물-저항 유전자를 더 포함한다.
본 발명의 숙주 세포는, 원핵 숙주 세포(prokaryotic host cell), 진핵 숙주 세포 또는 박테리오파지일 수도 있다. 상기 원핵 숙주 세포는, 대장균, 고초균, 스트렙토미세스 또는 프로테우스 미라빌리스 등일 수도 있다. 상기 진핵 숙주 세포는, 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris ), 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae ), 스키조사카로미세스 폼베 ( Schizosaccharomyces pombe), 트리코데르마 등과 같은 균류; 미팀나 세퍼릿(Mythimna separate)과 같은 곤충 세포; 담배와 같은 식물 세포, 및 BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포 등과 같은 포유동물 세포일 수도 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포는, 바람직하게 포유동물 세포, 보다 바람직하게 BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포 또는 COS 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은, 특별한 목적을 달성하기 위해 함께 결합하는, 적어도 하나의 약물 및 임의적으로 약제학적으로 용인가능한 담체 또는 부형제의 조합을 나타낸다. 특정한 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은, 이들이 본 발명의 목적을 실현하기 위해 총괄적으로 기능할 수 있는 한, 시간 및/또는 공간의 면에서 분리된 구성 요소의 조합을 포함한다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물에 함유된 성분(예를 들어, 본 발명에 따른 항체, 핵산 분자, 핵산 분자의 조합 및/또는 컨주게이션(conjugate))는, 전체로서 대상에게 투여될 수도 있거나, 또는 별도로 대상에게 투여될 수도 있다. 약제학적 조성물에 함유된 성분이 별도로 대상에 투여되는 경우에, 상기 성분은 상기 대상에 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 바람직하게, 상기 약제학적으로 용인가능한 담체는, 물, 완충용액, PBS(인산완충생리식염수), 글루코스, 만니톨, 덱스트로스, 락토오스, 녹말, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘, 0.3 % 글리세롤, 히알루론산, 에탄올, 또는 트리글리세리드, 폴리프로필렌 글리콜 등과 같은 폴리알킬렌 글리콜과 같은 등장성 염 용액이다. 상기 약제학적으로 용인가능한 담체의 타입은, 본 발명의 조성물이, 경구, 비강(nasal), 피내(intradermal), 피하, 근육내 또는 정맥내 투여와 같이 제형되는 투여의 특정한 경로에 따라 달라진다. 본 발명의 조성물은, 첨가제로서 습윤제, 유화제(emulsifying agent) 또는 완충 물질을 함유할 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 어떠한 적절한 경로, 예를 들어, 경구, 비강, 피내, 피하의, 근육내 또는 정맥내 투여로 투여될 수도 있다.
관련된 측면에서, 본 발명은, 제2 치료학적 제제와 항-PD-1 항체의 조합인 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 상기 제2 치료학적 제제는, 항-PD-1 항체와 유리하게 결합된 어떠한 제제이다. 항-PD-1 항체와 유리하게 결합된 대표적인 제제는, PD-1 활성도를 저해하는 다른 제제(다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 펩티드 저해제, 소분자 길항물질 등을 포함함) 및/또는 PD-1의 업스트림(upstream) 또는 다운스트림(downstream) 신호 전달을 간섭하는 제제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게, 상기 제2 치료학적 제제는 항-CD3 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "PD-L1 양성 암 또는 감염성 질병"은, PD-1 발현을 결과적으로 나타내거나, PD-1 발현의 증상/특징을 가지는 암 또는 감염성 질병을 나타내는 것을 의도한다. 상기 암은, 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 대장암, 유방암, 신경교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평상피 세포 암종(oral squamous cell carcinoma), 머리 및 목 암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 감염성 질병은, HIV 바이러스 감염 및 간염 B 바이러스 감염을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료학적 유효량(Therapeutically effective amount)"은, 투여될 대상에 이익을 부여하는데 충분한 투여량을 나타낸다. 상기 투여된 실제의 양, 및 투여의 속도 및 시간-경과(time-course)는 치료될 대상의 증상 및 심각성에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방전(예를 들어, 투여 결정)은, 궁극적으로 일반적인 의사 또는 다른 닥터의 책임이고, 상기 치료될 질병, 개별적인 환자의 증상, 전달의 부위, 투여의 방법 및 닥터에에 달려진 다른 인자를 고려하여 일반적으로, 이들의 결정에 따라 달라질 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상(subject)"는, 인간과 같은 포유동물을 나타내지만, 야생 동물(왜가리, 황새, 두루미 등과 같은), 가축(오리, 거의 등과 같은) 또는 실험 동물(오랑우탄, 원숭이, 랫, 마우스, 토끼, 기니피그 등과 같은)일 수도 있다.
하기의 실시예는, 본 발명의 몇몇의 바람직한 실시형태 및 측면을 추가적으로 설명하고 증명하기 위해 제공된 것이고, 이의 범위를 제한하는 것으로 이해하지 않아야 한다.
실시예
실시예 1. 마우스 항-PD-1 모노클로날 항체의 생산
6-10 주된 BALB/C 마우스는, PD-1 세포외 부분(25μg)(Sino Biological Inc, Cat lot: 10377-H08H)을 포함하는 재조합 융합 단백질 PD-1-mFc 항원에 의해 피하에(SC) 면역화되었다[subcutaneously (SC) immunized](Sino Biological Inc, Cat lot: 10377-H08H). 상기 마우스는, Freund's 완전 아쥬반트(Freund's complete adjuvant)(F5881, Sigma)와 혼합된 항원의 접종에 의해 초기에 면역화되었고, 그 다음에 Freund's 불완전한 아쥬반트 항원(F5506, Sigma)으로 혼합된 항원의 피하의 면역 접종에 의해 면역화되었다(day 1, 7, 14, 28, 60 및 64일에, 각각 총 6 번 면역화). 면역 반응은, 오비탈 정맥총(orbital venous plexus)으로부터 혈액 샘플링(blood sampling)에 의해 모니터되었다. 상기 항혈청은 ELISA에 의해 선별되었고, 상기 정제된 재조합 PD-1 융합 단백질(Sino Biological Inc, Cat lot: 10377-H08H)은, PBS로 1 μg/ml으로 희석되었고, 100 μl/well로 마이크로웰 플레이트(microwell plate) 내로 코팅되었고, 밤새 4 ℃에서 배양되었다. 그리고 난 다음에, 상기 웰은, 200 μl/well으로 0.05% Tween 20 및 5 % 소태아 혈청을 함유하는 PBS 용액으로 차단되었다. 희석 구배(gradient dilution) 후에, PD-1 면역화된 마우스의 혈청은 각각의 웰에 첨가되었고, 1 시간 동안 실온에서 배양되었다. PBS/Tween-20 용액으로 상기 플레이트를 세척한 후에, 호스래디시 페록시다아제-결합된 염소 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체(horseradish peroxidase-coupled goat anti-mouse IgG polyclonal antibody)(Jackson Immunoresearch Labs, Cat#: 115-035-044)는 첨가되었고, 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 상기 플레이트를 세척한 후에, 상기 플레이트는 TMB 기판(Pierce, Cat# 34021)으로 시각화되었고, OD 450 하에서 검출되었다. 역가 비교(titer comparison)에 따라, 항-PD-1 면역글로불린의 높은 역가(high titer)를 가지는 마우스는 PD-1-특정한 B 세포의 분리를 위해 사용되었다. 각각의 마우스의 B 계통 세포(B lineage cells)는, 비오틴-레벨된 PD-1과 결합에 따라 형광-활성화된 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)에 의해 분리되었고, 이에 해당하는 전장 Ig 중쇄(H) 가변 영역 및 Ig 경쇄(L) 가변 영역의 유전자 전사물(gene transcripts)은, RT-PCR에 의해 증폭되었다. 상기 제조업자의 프로토콜에 따라, 상기 증폭된 생산물은 293 발현 시스템(Life Technology) 내로 클로닝되었다. 단백질 A 컬럼은, PD-1과 결합하고, PD-1 및 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하는 능력에 대해 추가적으로 분석되는, 결과적으로 생성된 모노클로날 항체를 정제하는데 사용되었다. PD-L1과 PD-1의 결합을 차단하기 위한 항체의 능력에 따라, 10F8 및 15H6는, 상기 인간화 항체의 추가적인 연구 및 개발을 위한 후보물질 클론(candidate clones)으로서 선택되었다.
실시예 2. 인간화 모노클로날 항-PD-1 수용체 항체의 중쇄 가변 영역 서열의 설계
10F8 및 15H6 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2에 의해 나타낸 것이다. 낮은 면역원성을 가지는 인간 생식계열 프레임 서열(human germline frame sequences)은 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄의 알려진 서열과 비교에 의해 선택되었고, 이는 인간 생식계열 VH 3-66 세그멘트, 미확인된 D 세그멘트 및 인간 생식계열 JH4 세그멘트는 인간화 10F8 및 15H6 중쇄로서 사용될 수 있음을 최종적으로 결정되었다. 인간화 10F8(즉, BA08-1) 및 인간화 15H6(즉, BA08-2) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 각각, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5이었다.
본 발명의 항체의 중쇄 CDRs(H-CDRs)
10F8 15H6
H-CDR1 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:9
H-CDR2 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:10
H-CDR3 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:11
실시예 3. 인간화 모노클로날 항-PD-1 수용체 항체(humanized monoclonal anti-PD-1 receptor antibody)의 경쇄 가변 영역 서열의 설계
10F8 및 15H6 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 동일한 것이다(SEQ ID NO: 3). 낮은 면역원성을 가지는 인간 생식계열 프레임 서열은, 인간 생식계열 면역글로블린 중쇄의 알려진 서열과 비교에 의해 선택되었고, 인간 생식계열 VH 3-11 세그먼트 및 JK4 세그먼트는 인간화 10F8 및 15H6 경쇄로서 사용될 수 있음을 최종적으로 결정되었다. 인간화 10F8(BA08-1) 및 인간화 15H6(BA08-2)에 의해 공유된 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, SEQ ID NO: 6이다.
본 발명의 항체의 경쇄 CDRs (L-CDRs)
10F8 15H6
L-CDR1 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:12
L-CDR2 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:13
L-CDR3 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:14
실시예 4. 인간화 항-PD-1 수용체 모노클로날 항체의 발현 및 제조
인간 IgG4 중쇄 불변 영역의 IgG4 Fc 단편 서열(J Ellison, J Buxbaum, L Hood-DNA, 1981) 및 경쇄 불변 영역의 κ 단편 서열(Hieter, P. A., Max, E. E., Seidman, J. G., Maizel, J. V. Jr., and Leder, P. Cell. 1980; 22: 197-207)은, IDT Inc.(Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)에 의해 둘 다 합성되었다. 본 발명의 벡터 pBA-H4 및 pBA-Ck은 백본(backbones)으로서 pcDNA3과 구성되었고, pBA-H4(인간 IgG4 중쇄 불변 영역 IgG4Fc), 및 pBA-Ck(인간 경쇄 불변 영역 κ 단편) 벡터는, Bioabs Inc에 의해 구성되었다. pBA-H4에서, CMV 프로모터는, VH 및 CH에 대해 사용되었고, PGK 프로모터는 푸로마이신 저항 유전자에 대해 사용된 반면에, pBA-Ck에서, CMV 프로모터는 VL에 대해 사용되었고, SV40 프로모터는 네오마이신 저항 유전자에 대해 사용되었다. 항체의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역의 단백질 서열에 따라, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열은, CHO 세포에서 최적화된 발현에 대해 추가적으로 최적화되게, 설계되었고, 본 발명의 인간화 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열은, 각각, SEQ ID NO: 15(BA08-1) 및 16(BA08-2)에 의해 나타낸 것이고, 본 발명의 인간화 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열은, SEQ ID NO: 17에 의해 나타낸 것이다. 상기 최적화된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNAs는 IDT Inc.(Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)에 의해 합성되었다. In-Fusion® HD 클론 키트(Clontech Cat#: 638910)를 사용함으로써, BA08-1 및 BA08-2의 중쇄를 함유하는 상기 합성된 DNA 단편은, Nhe I 효소로 선형된 pBA-H4 벡터 내로 직접적으로 클로닝되었고, BA08-1 및 BA08-2의 경쇄를 함유하는 상기 합성된 DNA 단편은, BsiWI 효소로 선형화된 pBA-Ck 벡터 내로 직접적으로 클로닝된 다음에, DH5α 박테리아 내로 형질전환되고, 및 플라스미드의 추출하고, 시퀀싱(sequencing)하고, 및 시퀀싱 결과는 설계된 인간화 항체의 DNA 코딩 서열과 일치한다. CHO-S 서열(Invitrogen에서 입수가능함)은, 37°C, 8 % CO2에서 인큐베이터에서, 1×CD-CHO(GIBCO에서 입수가능함), 1×HT(GIBCO에서 입수가능함), 8 mM 글루타민(GIBCO에서 입수가능함)으로 배양되었다. 상기 CHO-S 세포는, 항체 BA08-1 및 BA08-2의 중쇄 및 경쇄를 함유하는 플라스미드로 공동-트랜스펙션되었고(co-transfected), 상기 트랜스펙션 방법은, DMRIE-C 트랜스펙션 키트(Invitrogen로부터 구입함)에 대해 설명서에 따른 것이다. 트랜스펙션 후 3일에, 상기 세포는, 상기 기재된 배양 배지(culture medium) 및 500 μg/ml G418 (GIBCO로부터 입수가능함)에서 배양되었고, 12.5 μg/ml 푸로마이신(Sigma로부터 입수가능함)은 가압된 선별(pressurized screening)을 위해 첨가되었다. 가압 후 14 일에(14 days after pressurizing), 상기 양성 클론은 선별되었고, 6-웰 플레이트에서 배양되었고, 항체의 발현 양에 대해 직접적인 ELISA 방법에 의해 발견되었다. 가장 높은 발현 속도를 가지는 양성 클론은 선택되었고, 10 일 동안 대규모로 배양되었고, 그 다음에 단백질 A 친화력 크로마토그래피 컬럼(GE로부터 입수가능함)에 의해 정화되었고, PBS 내로 투석되었고, 다양한 연구를 위해 0.22 μm 막을 통해 여과되고, 배양 상청액을 수집하기 위해 원심분리되었다.
실시예 5. 항체 및 PD-1 사이의 결합 특이성 및 상대적인 친화력
인간 PD-1을 가지는 본 발명의 항체의 상대적인 결합은, 단백질-기초된 ELISA 방법에 의해 결정되었다. 간단히, 상기 정제된 재조합 PD-1 융합 단백질(Sino Biological Inc, Cat#: 10377-H08H)은 BPS와 1 μg/ml로 희석되었고, 100 μl/well로 마이크로웰 플레이트로 코팅되었고, 밤새 4 ℃에서 배양되었다. 그 다음에 상기 웰은, 200 μl/well로 5 % 소태아혈청 및 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS 용액으로 차단되었다. 희석 구배 후에, 본 발명의 항-PD-1 항체, MK3475[상기 나타낸 MK3475 서열에 따라 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 본 발명자에 의해 구성된 MK-3475 유사체 대조(MK-3475 analog control), 이하에, 짧게 MK3475로서 나타냄, 상기 특정한 구성 프로토콜은 본 발명과 유사하다] 및 IgG 대조(IgG control)는 각각의 웰에 첨가되었고, 1 시간 동안 실온에서 배양되었다. PBS/Tween-20 용액으로 상기 플레이트를 세척한 후에, 호스래디시 페록시다아제-결합된 염소 항-인간 IgG 폴리클로날 항체(Jackson Immunoresearch Labs, Cat#:109-035-088)은 첨가되었고, 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 플레이트를 세척한 후에, 상기 플레이트는 TMB 기판(Cat# 34021, Pierce)으로 시각화되었고, OD 450 하에서 검출되었다. ELISA 결과는 도 1에 나타낸 것이다. Blitz 기구(instrument)(Pall life Science)에 의해 측정된 친화력은 표 3에 나타낸 것이다.
본 발명의 항체는, PD-1과 예상치못한 높은 결합 친화력 및 결합 특이성을 나타낸 것이다.
항-PD-1 항체의 결합 동역학(Binding kinetics)
항체 ka kd KD
BA08-1 1.22E+6 3.9E-6 4.8E-12
BA08-2 1.15E+6 7.91E-6 9.1E-12
실시예 6. 항-PD-1 항체는 PD-1 수용체와 PD-L1 리간드의 결합을 차단한다
본 발명의 인간화 항-PD-1 항체는, 이의 리간드와 PD-1의 결합을 차단하는 방식에 대해 테스트되었다. 명확하게, 96-웰 플레이트는, 16 시간 동안 1 μg/ml 표시되지 않은 hPD-L1/Fc(R&D Systems, Cat# 156-B7-100)에 의해 코팅되었다. 0.5 μg/ml PD-1 단백질은, 30 분 동안 37 ℃에서 상이한 농도의 재조합 항-PD-1 항체와 미리-배양되었고(pre-incubated), 반응을 위해 마이크로웰 플레이트 내로 첨가되었다. 상기 코팅된 PD-L1에 결합하는 PD-1 단백질은, 마우스 항-인간 PD-1 항체(eBioscience, Cat# 14-9989-8214)와 잡종화되었고(hybridized), 호스래디시 페록시다아제-결합된 염소 항-마우스 항체로 추가적으로 검출되었다. 플레이트를 세척한 후에, 상기 플레이트는 TMB 기판(Pierce, Cat# 34021)으로 시각화되었고, OD 450 하에서 검출되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 항-PD-1 BA08-1 및 BA08-2 항체는, MK-3475 보다 현저하게 더 나은 차단 효과를 가지는, 이의 리간드 PD-L1(도 2)과 PD-1의 결합을 명확하게 차단한다. 따라서, 본 발명의 항체는, PD-L1 및 PD-1의 결합에 대항하여 놀랍게도 더 높은 차단을 달성한다.
실시예 7. PD-L1에 의해 조정된( mediated ) 인간 T 세포 활성도의 저해에서 항-PD-1 항체의 효과
인간 말초 혈액 단핵 세포(Human peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는, 피콜 방법에 의해 건강한 공여자(healthy donors)로부터 분리되었다. 나머지 인간(resting human)의 말초 혈액 T 세포는, CD3+ T 세포 농축 컬럼(CD3+ T cell enriching column)(R&D Systems)을 통해 음성 선별(negative selection)에 의해 수득되었다. 96-웰 플레이트는 4 ℃에서 500 ng/mL 항-CD3 항체 및 1 μg/ml 재조합 인간 PD-L1/Fc에 의해 코팅되었다. 1 μg 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 MK3475는 각각의 웰에 첨가되었고, 4 시간 동안 37 ℃에서 배양되었다. 분리된 T 세포의 RMPI 현탁액(2× 104)은 첨가되었고, 상기 상청액은 2 일 동안 배양한 후에 수집되었다. IL-2 및 IFN-γ 발현은, 사용을 위한 설명서에 따라 각각 IL-2 ELISA 키트(eBioscience Cat# 88-7025-88) 및 IFN-γ ELISA 키트(R&D Systems)로 검출되었다. 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 컬럼은 왼쪽에서 오른쪽을 나타낸 것이다: CD3 항체 없는 대조, 양성 대조(항-CD3 항체가 단독으로 사용되었다), 항-CD3 항체에 의해 자극된 IL-2 또는 IFN-γ 발현에서의 PD-L1의 저해(PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께), PD-L1 저해성 효과에 대한 본 발명의 항체 BA08-1의 길항작용(BA08-1, PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께), PD-L1 저해성 효과에 대한 본 발명의 항체 BA08-2의 길항작용(BA08-2, PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께), 및 PD-L1 저해성 효과에 대한 MK3475의 길항작용(MK3475, PD-L1 및 항-CD3 항체의 첨가와 함께). 항-PD-1 BA08-1 및 BA08-2 항체 둘 다는, MK-3475 아날로그의 것과 현저하게 더 높은 면역-증진하는 효과(* p <0.05)를 가지는, CD3-자극된 T 세포의 IL-2 및 IFN-γ 생산에서의 PD-L1의 저해성 효과(** p <0.01)를 현저하게 제거한다.
실시예 8. 혼합된 림프구 반응에서 사이토카인 발현 상의(on) 항-PD-1 항체의 효과
이펙터 림프구(effector lymphocytes)에서 PD-L1/PD-1 경로를 차단하는 효과는, 이종기원 혼합된 림프구(MLR) 반응을 사용함으로써 검출되었다. T 세포에 의한 IFN-γ 분비에서 항-PD-1 인간 모노클로날 항체의 존재 또는 부재의 효과가 결정되었다. 인간 CD4+ T 세포는 CD4+ 음성 선택 키트(Miltenyi Biotech)와 PBMC로부터 정제함으로써 수득되었다. 수지상 세포는, 7 일 동안 1000 U/ml IL-4 및 500 U/ml GM-CSF(R&D Biosystems)으로 배양된, 정제된 단핵구로부터 유도되었다. 각각의 MLR 반응은, 200 μl의 전체 부피에서 105 정제된 T 세포 및 104 동종이계(allogeneic) 수지상 세포를 포함한다. 상기 인간화 항-PD-1 모노클로날 항체는 상이한 농도로 배양 플레이트 내로 첨가되었고, 5 일 동안 37 ℃에서 세포를 배양한 후에, 100 μl 배양 상청액은 사이토카인 함량을 측정하기 위해 취해졌다. IL-2의 측정은, 도 5에 나타낸 바와 같은 결과와 함께, 실시예 7에서와 같은 동일한 방법에 의해 수행되었다. 항-PD-1 BA08-1 및 BA08-2 항체는, MK-3475의 것보다 현저하게 우세한 효과로, T 세포 활성화를 현저하게 촉진하고, 투여량-의존적인 방식으로 IL-2 발현을 증가시킨다.
실시예 9. 활성화된 T 세포의 IL-2 생산의 종양 세포의 저해에서 항-PD-1 항체의 효과
인간 흑색종 세포주 A2058 및 인간 폐 암 세포주 HCC827로부터의 세포는, ATCC(Manassas, VA)로부터 구입한 것이다. 재조합 인간 인터페론(IFN)-γ, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA) 및 식물성응집소(phytohemagglutinin, PHA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구매되었다. 흑색종 및 폐암 세포는, 80 % 컨플런스(confluence)로 완전한 RPMI 1640 배지에서 성장되었고, 그 다음에 500 U/mL 재조합 인간 IFN-γ은, 마우스 항-인간 PD-L1 항체(BD Pharmingen, Cat# 557924)로 플로우 사이토미터에 의해 확인된, PD-L1 발현을 상향-조절하도록 48 시간 초과 동안 치료를 위해 사용되었다. 나머지 인간의 말초 혈액 T 세포는, CD3+ T 세포 농축 컬럼(R&D Systems)을 통해 음성 선별에 의해 수득되었다. 결과적으로 생성된 T 세포는 밤새 1 μg/mL PHA 및 50 ng/mL PMA로 처리되었고, 그 다음에 1 μg/ml 재조합 PD-L1-Fc 단백질(Corning, NY)로 미리코팅된 96-웰 플레이트 내로 첨가되었고(도 6에서 PD-L1으로서 표시됨); 또는 3 μg/ml 항체의 존재에서(IgG 대조, 본 발명의 항-PD-1 항체 BA08-2 또는 BA08-1, 또는 MK3475), 6:1의 비(종양 세포 : T 세포)로 IFN-γ 처리된 종양 세포에 첨가되었고, 48 hrs 동안 배양되었고(도 6에서 A2058 및 HCC827로 표시됨); 또는 어떠한 추가적인 처리 없음(도 6에서 대조, PMA + PHA로 표시됨). 상기 상청액은 ELISA에 의해 IL-2 발현에 대해 수집되었고 검출되었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 고정된 PD-L1(immobilized PD-L1)은 상기 활성화된 T 세포의 IL-2 생산하는 능력을 저해할 수 있고, 항-PD-1 BA08-1 및 BA08-2 항체는 PD-L1의 저해 효과를 현저하게 제거한다. 유사하게, IFN-γ 미리처리된 종양 세포는 활성화된 T-세포에 의해 조정된 IL-2 발현의 저해를 또한 나타내고, 저해 효과는, 항-PD-1 BA08-1 및 BA08-2 항체에 의해 또한 차단될 수 있고(*p<0.05), 본 발명의 항체의 효과는 MK-3475의 것보다 현저하게 더 좋다.
실시예 10. 폐암의 치료를 위해 본 발명의 항-PD-1 항체의 생체 내 실험
인간화 항-PD1 항체의 생체 내 효과를 평가하기 위해, 실험의 Day 1에서, 6 주된 NOD-SCID 마우스는 조직 배양으로부터 획득된 1×107 HCC827 인간 폐 암 세포으로 피하 접종되었다. 상기 치료는, 각각의 그룹에서 6 마리 동물과 함께, 평균 종양 부피가 100 mm3 (55-150 mm3)에 도달하는 경우에 Day 8에서 시작하였고, 모든 동물은 동일한 배치에서 인간 PBMC로 복강 내 주입되었다. 인간 PBMC에 대한 제조 방법은 상기에 기재된 것이다. 상기 PBMC는 3 시간 내에 피콜 정제 방법에 의해 수득되었다. 각각의 마우스는 1×107 인간 PBMC를 함유하는 RPMI 현탁액으로 복강내 주입에 의해 접종되었고, 총 4 번 투여량, 5 mg/kg의 투여량으로 일주일에 두 번, 동일한 날에 항체로 복강내 주입되었다. 마우스의 종양 부피는 캘리퍼로 일주일에 두 번 측정되었고, 하기의 방정식을 사용하여 계산되었다: 부피 = (길이 x 너비2)/2. 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 인간화 항-PD-1 항체는 효과적이고 오래-지속되는 항-종양 활성도를 나타내고, 본 발명의 항체의 효과는 MK-3475의 것보다 현저하게 더 나았다. 대조군과 비교하여, Day 32에서 항-PD-1 BA08-1 및 BA08-2 항체의 종양 저해 속도(tumor inhibition rates)는, 66 %(p<0.05)의 종양 저해 속도를 가지는 MK3475 샘플보다 현저하게 증가된, 각각 84.5 % 및 77.8 %(p<0.01)이었다.
실시예 11. 흑색종의 치료를 위한 본 발명의 항-PD-1 항체의 생체 내 실험
6 주된 NOD-SCID 마우스는, 조직 배양으로부터 수득된 상기 동일한 종양 세포에 의해 자극된 1×106 인간 T 세포 및 2×106 A375 인간 흑색종 세포 둘 다와 피하 접종되었다. 상기 종양 세포에 의해 자극된 인간 T 세포는, 하기와 같이 수득되었다: RosetteSep 키트(Stemcell technologies)에 의해 건강한 인간에서 말초 혈액 단핵 세포로부터 음성적으로 선별된 T 세포는, 7 일 동안 50 U/ml 재조합 IL-2을 함유하는 10% FBS-RPMI 배양 배지에서 16 시간 동안 2 μg 미토마이신 C로 처리된 A375 인간 흑색종 세포와 함께 배양되었고 사용을 위해 수집되었다. 처리는 각각의 그룹에 포함된 6 마리의 동물과 동일한 날에 시작하였고, 상기 동물은 총 4 번 투여량으로, 3 mg/kg의 투여량으로 일주일에 두 번 항-PD-1 항체와 복강내 주입되었다. 상기 마우스 종양 부피는 캘리퍼로 일주일에 두 번 측정되었고, 하기의 방정식을 사용하여 계산되었다: 부피 = (길이 x 너비2)/2. 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, Day 35에 항-PD-1 BA08-1 및 BA08-2 항체의 종양 저해 속도는, 58 %(p <0.05)의 종양 저해 속도를 가지는 MK3475 샘플보다 현저하게 증가된, 각각, 82 % 및 72 %(p<0.01)이었다.
상기 바람직한 실시형태는 하나의 예로서 기재된 것이고, 본 발명을 실행하기 위한 필수적인 특징의 조합을 위한 제한이 아니다. 제공된 제목은, 본 발명의 다양한 실시형태를 제한하는 것을 의도하지 않는다. "포함한다", "함유한다"와 같은 용어는, 한정인 것을 의도하지 않는다. 게다가, 다른 방식으로 나타내지 않는 한, 명사가 숫자에 의해 변형되지 않는 경우에, 이는 이의 복수형태를 포함하고, "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 다른 방식으로 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적인 및 과학적인 용어는, 본 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 동일한 의미를 가진다.
본 출원에서 언급된 모든 공개 및 특허는, 참고문헌에 의해 본원에 포함된다. 본 발명의 범위 및 본질로부터 벗어남이 없이, 본 발명에 기재된 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 변화는, 본 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 및 바람직한 실시형태의 형태로 기재되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 특정한 실시형태로 적절하지 않게 한정되지 않아야 하는 것으로 이해될 것이다. 사실은, 본 발명의 기재된 방식을 실행하기 위해 본 분야의 통상의 기술자에 있어서 명백한 많은 변형은, 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것을 의도한다.
SEQUENCE LISTING <110> LIVZON MABPHARM INC. <120> ANTI-PD-1 ANTIBODY AND USE THEREOF <130> OP150727 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Val 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequences <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Leu Ala Ser Tyr Leu Glu 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 15 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 15 caggtccagc tcgtgcaatc cggagccgaa gtgaaaaagc ctggcgcttc cgtcaaggtc 60 tcctgtaagg cttccggata cacattcaca tcctattaca tgtattgggt caggcaagcc 120 cctggccaag gcctcgagtg gatgggaggc gtcaaccctt ccaatggcgg aaccaatttc 180 aatgagaaat tcaaatcccg ggtgacaatc acagccgata agagcaccag caccgcttac 240 atggaactga gctccctcag gagcgaggat accgctgtgt attactgtgc ccggagggat 300 taccggtacg atatgggatt cgattactgg ggacagggaa ccacagtgac agtgagctcc 360 <210> 16 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 16 caggtccagc tcgtgcaatc cggagccgaa gtgaaaaagc ctggcgcttc cgtcaaggtc 60 tcctgtaagg cttccggata cacattcaca aactattaca tgtattgggt caagcaagcc 120 cctggccaag gcctcgagtg gattggcgga atcaatccca gcaacggagg cacaaactat 180 aacgaaaagt ttaagaataa ggctaccctc accgctgaca aatccacatc cacagcctat 240 atggaactga gctccctcag gagcgaggat accgctgtgt attactgtac ccggagggat 300 taccggtacg atatgggatt cgattactgg ggacagggaa ccacagtgac agtgagctcc 360 <210> 17 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 17 gagattgtgc tcacccaatc ccctgccaca ctgagcctga gccccggaga gcgggccaca 60 atcagctgcc gggccagcaa gggagtgagc accagcggct attcctatct gcattggtat 120 cagcaaaagc ctggccaagc ccctaggctc ctgatttacc tcgccagcta cctcgagagc 180 ggcgtccccg ctaggttttc cggatccgga tccggaaccg atttcacact gacaatcagc 240 tccctcgagc ctgaggattt cgctacctat tactgtcagc attcccggga gctccccctc 300 acctttggca caggcacaaa ggtcgagatt aag 333

Claims (13)

  1. PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체로서,
    (ⅰ) 상기 중쇄는, SEQ ID NO: 7, 8 및 11 또는 9, 10 및 11에 의해 각각 나타낸 아미노 서열을 가지는 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하고; 및
    (ⅱ) 상기 경쇄는, SEQ ID NO:12, 13 및 14에 의해 각각 나타낸 아미노 서열을 가지는 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하는 것인, 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    (ⅰ) 상기 중쇄는 SEQ ID NO: 1, 2, 4 또는 5에 의해 나타낸 아미노 서열을 가지는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 및
    (ⅱ) 상기 경쇄는 SEQ ID NO: 3 또는 6에 의해 나타낸 아미노 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    (ⅰ) 상기 중쇄는 SEQ ID NO: 4 또는 5에 의해 나타낸 아미노 서열을 가지는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 및
    (ⅱ) 상기 경쇄는 SEQ ID NO: 6에 의해 나타낸 아미노 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 10F8, 15H6, BA08-1 및 BA08-2로부터 선택된 것인, 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 인코딩하는, 분리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체의 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오티드의 조합물(combination).
  7. 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드의 조합물을 포함하는 발현 벡터로서,
    상기 폴리뉴클레오티드는, 숙주 세포 또는 세포-프리 발현 시스템(cell-free expression system)에서 상기 폴리뉴클레오티에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조절 서열(regulatory sequence)에 효과적으로 연결하는 것인, 발현 벡터.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체, 및 약제학적으로 용인가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드의 조합물, 제7항에 따른 발현 벡터 및/또는 제8항에 따른 약제학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 암 또는 감염성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 암은 폐암 또는 흑색종이고, 상기 감염성 질병은 HIV 감염 또는 간염 B 바이러스 감염인 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드의 조합물, 제7항에 따른 발현 벡터 및/또는 제8항에 따른 약제학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 T 세포 면역 반응을 증진시키기 위한 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    T 세포 면역 반응을 증진시키는 것은, T 세포의 사이토카인 생산을 증진시키는 것을 포함하고, 바람직하게는, 상기 사이토카인은 IL-2 및/또는 IFN-γ를 포함하는 것인, 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 방법은, 상기 대상에 항-CD3 항체를 투여하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
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