JP2023522730A - 抗ｃｄ７３／抗ｐｄ－１二重特異性抗体及びその使用 - Google Patents

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Abstract

抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体、その医薬組成物及びその用途が提供される。

Description

本発明は、腫瘍処置及び分子免疫学の分野、及び具体的には抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体、その医薬組成物、及びその使用に関する。
Ｅｃｔｏ－５’－ヌクレオチダーゼ、すなわちＣＤ７３タンパク質は、ＮＴ５Ｅ遺伝子によりコードされる多機能性糖タンパク質であり、かつ７０ＫＤの分子量を有し、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）により細胞膜上に固定されている（Zimmermann H., 5’-Nucleotidase: molecular structure and functional aspects., Biochem J., 1992; 285:345-365）。
ＣＤ７３は、ヒト組織細胞の表面上に広く分布しており、そして研究においては、様々な固形腫瘍において、具体的には腫瘍の微小環境において、がん細胞、樹状細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）などに高発現していることが見出されている。ＣＤ７３の発現は、ＴＧＦ－β、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、β－カテニン及び他の分子により調節されており、特に転写因子の機能を発揮するＨＩＦ－１が最も重要である。前記腫瘍の微小環境の重要な特徴は、低酸素症であり、これは低酸素誘導因子－１（ＨＩＦ－１）及び他の分子のアップレギュレーションを誘導し、それにより腫瘍の微小環境におけるＣＤ７３の広範な発現をもたらす（Synnestvedt K, et al., Ecto-5’-nucleotidase (CD73) regulation by hypoxia-inducible factor-1 mediates permeability changes in intestinal epithelia. J Clin Invest., 2002; 110:993-1002.）。臨床腫瘍サンプルの分析は、ＣＤ７３の高発現が、潜在的なバイオマーカーであり、そして乳がん、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、胃がん、頭頸部がんなどを含む様々な種類の腫瘍の予後不良と密接に関連していることを示している。
ＣＤ７３は、加水分解酵素活性及び非加水分解酵素活性を有する。ＣＤ７３の酵素機能及び非酵素機能は、腫瘍内に関連するプロセスにおいて同時に働き、そして腫瘍の進行を相互に促進し維持する。ＣＤ７３が、インビトロでの腫瘍細胞の増殖、転移及び浸潤、及びインビボでの腫瘍血管新生及び腫瘍免疫逃避機序の鍵となる調節分子であり、免疫抑制の重要な機序が、ＣＤ７３－アデノシン代謝シグナル伝達経路により媒介されることが、ますます多くの研究により見出されている。ＣＤ７３の上流にあるＣＤ３９は、ＡＴＰを触媒してアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を生成し、生成されたＡＭＰは、ＣＤ７３によりアデノシンに変換され、そしてアデノシンは、下流のアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）に結合する。Ａ２ＡＲは、ＬＣＫ、ＭＡＰＫ、ＰＫＣなどの免疫活性化に関する一連のシグナル伝達経路を阻害し、そしてプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）及びＣｓｋキナーゼを活性化することによりＴ細胞の免疫死滅効果を阻害し、それにより腫瘍が免疫逃避を達成することを可能にする免疫抑制の役割を果たしている(Antonioli L, et al., Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer., 2013; 13:842-857)。前臨床動物モデル研究は、免疫細胞及び非免疫細胞中に発現するＣＤ７３が、腫瘍の免疫逃避、発生及び転移を促進することができることを示しており、Ｔｒｅｇ細胞関連ＣＤ７３－アデノシンシグナルによる細胞傷害性のＴ細胞（ＣＴＬ）及びＮＫ細胞機能の阻害は、最も重要である。
固形腫瘍の処置にとって、薬物耐性を克服し治療効果を改善する重要な態様の１つは、免疫エフェクター細胞に対する腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の阻害効果を緩和することである。ＴＭＥは、様々な細胞、細胞間マトリックス、酵素、サイトカイン、代謝産物などから構成される非常に複雑なシステムである。ＴＭＥは、著しい低水素、低pH、高圧を特徴とし、正常組織とは大きく異なる。腫瘍細胞を死滅させるための化学放射線療法により引き起こされる低酸素症又はＡＴＰ富化は、ＣＤ３９～ＣＤ７３アデノシンシグナルのカスケード反応を促進し、様々ながんを促進する細胞の増殖と機能に有益であるが、がんを阻害する細胞には有益ではない（Regateiro, F. S., Cobbold, S. P. & Waldmann, H., CD73 and adenosine generation in the creation of regulatory microenvironments. Clin. Exp. Immunol., 2013; 171:1-7）。
動物モデルにおけるＣＤ７３を標的とする抗体又はＣＤ７３の遺伝子ノックアウトの使用は、腫瘍の増殖又は転移を効果的にブロックすることができ、最近では、ＣＤ７３モノクローナル抗体、低分子干渉ＲＮＡ技術、特異的インヒビターＡＰＣＰなどの使用は、動物実験の抗腫瘍処置において顕著な治療効果を達成し、抗腫瘍処置のための新たな道を提供している。インビボ研究から得た証拠は、ＣＤ７３の標的遮断が腫瘍患者のための有効な処置の手段になることを示している。
ＣＤ７３の過剰発現と患者の腫瘍サブタイプ、予後及び奏効との関係は、ＣＤ７３が、将来の個人の腫瘍処置及び検出のための重要なマーカーになり得ることを示している。したがって、ＣＤ７３標的の研究は不可欠である。
膜貫通受容体ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）は、ＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄系細胞に発現する。受容体のＰＤ－１の受容体である、ＰＤＬ－１及びＰＤＬ－２は、Ｂ７スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤＬ－１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、上皮細胞を含む様々な細胞中に発現し、ＰＤＬ－２は、樹状細胞及びマクロファージなどの抗原提示細胞中にのみ発現する。
ＰＤ－１は、Ｔ細胞の活性化のダウンレギュレートにおいて非常に重要な役割を果たし、そしてＴ細胞のＰＤ－１媒介性Ｔ細胞のダウンレギュレーションは、腫瘍免疫逃避の重要な機序の１つである。腫瘍の表面上に発現したＰＤＬ－１は、免疫細胞の表面上のＰＤ－１に結合することができ、それによりＰＤ－１／ＰＤＬ－１シグナル伝達経路を通じた免疫細胞による腫瘍組織の殺傷を阻害し、そしてＰＤＬ－１の高発現を伴う腫瘍は、検出することが困難ながんと関連している(Hamanishi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007; 104:3360-5)。ＰＤ－１に拮抗し、それによってＰＤ－１／ＰＤＬ－１シグナル伝達経路を阻害する効果的な方法は、抗ＰＤＬ－１抗体の注入である。
ＰＤ－１抗体の広範な抗腫瘍展望及び驚くべき有効性により、ＰＤ－１経路を標的とする抗体は、様々な腫瘍：非小細胞肺がん、腎細胞がん、卵巣がん及び黒色腫(Homet M. B., Parisi G., et al., Anti-PD-1 therapy inmelanoma. Semin Oncol., 2015 Jun; 42(3):466-473)、及び血液腫瘍及び貧血(Held SA, Heine A, et al., Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML. Curr Cancer Drug Targets, 2013 Sep; 13(7):768-74)などの処置に打開をもたらすことが広く受け入れられている。
二機能性抗体は二重特異性抗体としても知られており、２つの異なる抗原を同時に標的とする特異的な抗体薬物であり、そして免疫選別及び精製により製造することができ、又は遺伝子工学により得ることができる。遺伝子工学は、結合部位の最適化、合成形態、収量などの態様において柔軟性を有し、したがって特定の利点を有している。現在、４５種類以上の二重特異性抗体の形態が実証されている(Muller D, Kontermann RE. Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: current perspectives. BioDrugs 2010; 24:89-98)。ＩｇＧ－ＳｃＦｖの形態、すなわちＭｏｒｒｉｓｏｎ形態(Coloma MJ, Morrison SL. Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat Biotechnol. Nature Biotechnology, 1997; 15:159-163)は、自然に存在するＩｇＧの形態に対するその類似性のために、及び抗体工学、発現、及び生成における利点のために、二機能性抗体の理想的な形態であることが実証されている(Miller BR, Demarest SJ, et al., Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies. Protein Eng Des Sel 2010; 23:549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A. Rational engineering of antibody therapeutics targeting multiple oncogene pathways. MAbs 2011; 3:299-309)。
ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在細胞障害）は、抗体のＦａｂ断片がウイルスに感染した細胞又は腫瘍細胞のエピトープに結合すること、及び抗体のＦｃ断片がキラー細胞（ＮＫ細胞、マクロファージなど）の表面上でＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することにより媒介されるキラー細胞により標的細胞を殺傷することを指す。
ＣＤＣ（補体依存性細胞障害作用）は、抗体が、細胞膜表面上の対応する抗原に結合し、その後の前記補体Ｃ１ｑへの結合し及びＣ２～Ｃ９の活性化により形成される、膜攻撃複合体による標的細胞に対する溶解作用を指す。
前記ＩｇＧファミリーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の４つのメンバーを含み、重鎖定常領域の断片結晶化可能（Ｆｃ）領域におけるアミノ酸が異なり、その結果、ＦｃγＲに対する親和性が異なる。野生型ＩｇＧ１は様々なＦｃγＲに結合することができ、そしてＡＤＣＣ及びＣＤＣの作用を誘発する。Ｚｈａｎｇらは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用を含む、Ｆｃ依存性のエフェクター機能誘導性免疫細胞の損傷が、免疫細胞の損傷をもたらす重要な機序であり得るため、ＰＤ－１などの免疫チェックポイントを標的とする抗体のＦｃ断片がＦｃ受容体に結合することが、抗体が媒介する抗がん活性に負の影響を及ぼすことを報告した(Zhang T et al, Cancer Immunol Immunother., 2018; 67(7):1079-1090.) and Dahan et al. (Dahan R et al., Cancer cell, 2015, 28(3):285-95.)。
インターロイキン－８（ＩＬ－８）は、走化性サイトカインであり、主に単球などにより分泌される。ＩＬ－８は、正常細胞及び腫瘍細胞の増殖、特に腫瘍の発生及び進行を促進する中で、重要な役割を果たしている。複数の研究が、ＩＬ－８は腫瘍の発生を促進でき、そして腫瘍細胞自身もＩＬ－８を分泌して腫瘍の増殖及び転移を促進できることを示している(Lo MC et al., Cancer letters, 2013, 335(1):81-92)。したがって、ＩＬ－８は、腫瘍微小環境において不可欠な重要な炎症因子となっている。
炎症促進性因子として、ＩＬ－８は、腫瘍の発生及び進行に密接に関連している。非腎癌細胞のメチルアルソナート誘導性の悪性形質転換の間に、ＩＬ－８遺伝子の発現は増加する。ＩＬ－８の遺伝子サイレンシングは、マウスにおける移植腫瘍の増殖を有意に阻害することができ、さらにＩＬ－８レベルの減少は、腫瘍の増殖及び転移に関連するマトリックスメタロプロテイナーゼ－９、サイクリンＤ１、アポトーシス促進性タンパク質Ｂｃｌ－２及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を抑制することができる(Escudero-Lourdes C et al., Toxicology and applied pharmacology, 2012, 258(1):10-18)。井上らは、ＩＬ－８が、非腫瘍性膀胱細胞株（２３３ＪＰ）の悪性形質転換を誘導することができ、その攻撃性を高める一方、ＩＬ－８ノックアウトマウスにおいて、２３３ＪＰ細胞の悪性形質転換の発生率が有意に低下することを見出した(Inoue K et al., Cancer Res, 2000, 60(8):2290-2299)。さらに、前立腺がんにおいて、ＩＬ－８は、患者における去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）の発生を促進することができ(Chen K et al., Cancer research, 2015, 75(10):1992-2004)、そして腫瘍処置に対する薬物耐性と関連しており(Araki S et al., Cancer Res, 2007, 67(14):6854-6862)；ＩＬ－８又はその受容体の遺伝子サイレンシングは、腫瘍細胞における細胞周期の停止を誘導し、腫瘍増殖を阻害することができる(Singh RK, Lokeshwar BL., Molecul Cancer, 2009, 8:57)。以上の研究は、ＩＬ－８のレベルが、腫瘍の発生及び進行に密接に関連していることを示している。さらなる研究が(Mian BM et al. Clin Cancer Res, 2003, 9(8):3167-3175)、ＩＬ－８が腫瘍の処置のための新たな標的となり得ることを示している。膀胱がんの腫瘍モデルでは、抗ＩＬ－８抗体の使用は、腫瘍の増殖を有意に抑制することができる。
ＩＬ－６は、主に病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）又は損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に対応してマクロファージにより迅速に産生され、そして感染因子を除去し、急性期及び免疫の応答を誘導して損傷組織を治癒させることにより保護的な役割を果たす。ＩＬ－６は、感染及び組織損傷に対する抵抗性及び修復に重要な役割を果たすが、高レベルのＩＬ－６は、凝固経路及び血管内皮細胞を活性化し、それにより心筋機能を阻害し、さらには「サイトカインストーム」を引き起こして重度の急性全身性炎症反応をもたらす可能性がある。サイトカインストームは、ウイルス感染、腫瘍免疫療法などにおいて致命的な合併症及び副作用である。
免疫関連の副作用は、免疫チェックポイントインヒビター（ＩＣＩ）を用いる抗腫瘍処置における一般的で危険な副作用である(Spain L et al., Cancer Treat Rev., 2016; 44:51-60)。近年、免疫チェックポイントインヒビターは、腫瘍免疫療法において大きな成功を収めているが、オフターゲット効果により全く新しい毒性プロファイルももたらしており、その中でも主要臓器（心臓、肺及び脳を含む）における重度の免疫関連有害事象(ｉｒＡＥ)は、特に生命を脅かすものである(Bergqvist V, et al., Cancer Immunol Immunother., 2017; 66(5):581-592; Gomatou G et al., Respiration., 2020; 1:1-11; Joshi MN et al., Clin Endocrinol (Oxf)., 2016; 85(3):331-9; Prieux-Klotz C et al., Target Oncol., 2017; 12(3):301-308; Tajiri K et al., Jpn J Clin Oncol., 2018; 48(1):7-12)。既存のデータは、ＩＣＩが、正常細胞の表面上に発現している免疫チェックポイント分子への直接結合し、そして補体過敏症を活性化すること；正常組織及び腫瘍細胞における相同の抗原／エピトープの存在；自己抗体を産生すること；ＩＬ－６などの炎症性サイトカインのレベルを増加させることを含む、４つの機序によりオフターゲット効果を誘導できることを示している(Martins F et al., The Lancet Oncology, 20(1), e54-e64)。
現在、組換えヒト化抗ＩＬ－６Ｒモノクローナル抗体であるトシリズマブなどの抗ＩＬ－６療法は、急性期における重度のｉｒＡＥ、重症・難治性関節炎、大血管血管炎、ぶどう膜炎、心筋炎、肺炎、重症筋無力症などの処置に使用されている(Martins F et al., The Lancet Oncology, 20(1), e54-e64)。
マクロファージ上のＦｃγＲＩａが野生型ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体に結合することにより、マクロファージによるＩＬ－８及びＩＬ－６の分泌を誘導することができる(Kinder M et al., mAbs., 2015)一方で、抗体のＦｃセグメントにおける変異を誘導すること及びＦｃγＲＩＡに結合を消失させることにより、ＩＬ－８の分泌を効果的に阻害し、それによる抗体の安全性と有効性を向上させることができる。
発明者らは、哺乳類細胞発現系を使用して、マウスを免疫するための抗原として組換えヒトＣＤ７３及びＰＤ－１を発現させ、そしてマウス脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合によりハイブリドーマ細胞を得た。発明者らは、多数のサンプルをスクリーニングすることにより以下のハイブリドーマ細胞株：
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４（ＣＤ７３－１９Ｆ３とも呼ばれる）：アクセッション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１８１３７を用いて、２０１８年６月１９日に中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託された；及び
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３（ＰＤ－１－１４Ｃ１２とも呼ばれる）：アクセッション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１５１０５を用いて、２０１５年６月１６日に中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託された
を得た
驚くべきことに、発明者たちは次のことを発見した：
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４は、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する特定のモノクローナル抗体（１９Ｆ３と命名する）を分泌することができ、そしてモノクローナル抗体は、非基質競合モードでＣＤ７３の酵素活性反応を効果的に阻害し、アデノシンの産生を減少させ、Ｔ細胞の活性及び腫瘍阻害効果を促進することができる；及び
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３は、ＰＤ－１に特異的に結合する特定のモノクローナル抗体（１４Ｃ１２と命名する）を分泌してもよく、そしてモノクローナル抗体は、ＰＤ－１のＰＤＬ－１への結合を効果的にブロックすることができる。
さらに、本発明者らは、ヒト化抗ＣＤ７３抗体（それぞれ１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＴＭ）と命名する）及びヒト化抗ＰＤ－１抗体（１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）と命名する）を創造的に調製した。
さらに、本発明者らは、２種類のヒト化抗体をタンパク質の組換えを通じて新たな抗体に創造的に融合させ、そしてＣＤ７３及びＰＤ－１に結合し、ＣＤ７３の活性を阻害し、そしてＰＤ－１のＰＤＬ－１への結合を遮断し、固形腫瘍及び血液学的腫瘍を予防及び治療するための医薬の調製に使用するための可能性を有することが可能な、ヒト化二機能性抗体（それぞれ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４と命名する（本明細書及び中国特許出願第二０２１１０２７０６７１．Ｘ号において、ＮＴＰＤＶ１（ｈＧ１ＴＭ）、ＮＴＰＤＶ２（ｈＧ１ＴＭ）、ＮＴＰＤＶ３（ｈＧ１ＴＭ）及びＮＴＰＤＶ４（ｈＧ１ＴＭ）とも記される））を得た。
以下に本発明の詳細を説明する。
本発明の一態様は、
ＰＤ－１を標的とする第一のタンパク質機能領域、及び
ＣＤ７３を標的とする第二のタンパク質機能領域
を含む抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体に関する。
本発明の一実施態様では、前記二重特異性抗体において、
前記第一のタンパク質機能領域は、
配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域中に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（ここで、好ましくはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号４５～４７にそれぞれ記載の配列であるか、又は配列番号４５～４７に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号４５～４７に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは、１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である）；及び
配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域中に含有されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（ここで、好ましくはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号５０～５２にそれぞれ記載の配列であるか、又は配列番号５０～５２に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号５０～５２に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である）を含み；
前記第二のタンパク質機能領域は、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域中に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（ここで、好ましくはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号３～５に記載の配列であるか、又は配列番号３～５に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号３～５に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である）；及び
配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域中に含有されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（ここで、好ましくはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号８～１０にそれぞれ記載の配列であるか、又は配列番号８～１０に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号８～１０に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である）を含む。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、
前記第一のタンパク質機能領域は、
配列番号４４又は配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号４４又は６２に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号４４又は６２に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列；及び
配列番号４９又は配列番号６４にそれぞれ記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号４９又は６４に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号４９又は６４に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含み；
及び／又は
前記第二のタンパク質機能領域が、配列番号２又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号２又は２０に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号２又は２０に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む；及び
配列番号７又は配列番号２２にそれぞれ記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号７又は２２に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号７又は２２に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか；
又は
第二のタンパク質機能領域が、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号２０に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号２０に記載の前記配列と比較して、１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む；及び
配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号２４に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号２４に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様は、
ＣＤ７３を標的とする第一のタンパク質機能領域、及び
ＰＤ－１を標的とする第二のタンパク質機能領域
を含む抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体に関する。
本発明の一実施態様では、前記二重特異性抗体において、
第一のタンパク質機能領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（ここで、好ましくはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号３～５にそれぞれ記載の配列であるか、又は配列番号３～５に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号３～５に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である）；及び
配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域中に含有されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（ここで、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、好ましくは配列番号８～１０にそれぞれ記載の配列であるか、又は配列番号８～１０に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号８～１０に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である）を含み、
第二のタンパク質機能領域は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域中に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（ここで、好ましくはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号４５～４７にそれぞれ記載の配列であるか、又は配列番号４５～４７に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号４５～４７に記載の前記配列と比較して、１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である）；及び
配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に含有されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（ここで、好ましくはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号５０～５２にそれぞれ記載の配列であるか、又は配列番号５０～５２に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号５０～５２に記載の前記配列と比較して、１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である）を含む。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、
第一のタンパク質機能領域は、
配列番号２又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号２又は２０に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号２又は２０に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列；及び
配列番号７、配列番号２２又は配列番号２４にそれぞれ記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号７、配列番号２２又は配列番号２４に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号７、２２又は２４に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含み；
及び／又は
第二のタンパク質機能領域は、
配列番号４４又は配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号４４又は配列番号６２に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号４４又は配列番号６２に記載の前記配列と比較して、１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列；及び
配列番号４９又は６４にそれぞれ記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号４９又は６４に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号４９又は６４に記載の前記配列と比較して、１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、前記第一のタンパク質機能領域及び第二のタンパク質機能領域が、直接又はリンカーを介して連結され；好ましくは、前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、及びｎは、正の整数、例えば１、２、３、４、５又はである。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体における第一のタンパク質機能領域及び第二のタンパク質機能領域は、独立して免疫グロブリン又は抗原結合性断片、例えば、半抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又は単鎖可変領域断片であり、好ましくは、第一のタンパク質機能領域は、免疫グロブリンであり、及び第二のタンパク質機能領域は、抗原結合性断片であるか、又は第一のタンパク質機能領域が抗原結合性断片であり、第二のタンパク質機能領域が免疫グロブリンである。
本発明の一実施態様では、前記抗原結合性断片の重鎖可変領域のＮ末端は、免疫グロブリンのＣＨ１のＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、及び抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＮ末端は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域ＣＬのＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結されるか；又は抗原結合性断片の重鎖可変領域のＮ末端は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域ＣＬのＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、及び抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＮ末端は、免疫グロブリンの重鎖可変領域ＣＨ１のＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結される。
本発明の一実施態様では、前記抗原結合性断片の重鎖可変領域のＣ末端は、免疫グロブリンの重鎖のＮ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、及び抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＣ末端は、免疫グロブリンの軽鎖のＮ末端に直接（又はリンカーを介して）連結されるか；又は抗原結合性断片の重鎖可変領域のＣ末端は、免疫グロブリンの軽鎖のＮ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＣ末端は、免疫グロブリンの重鎖のＮ末端に直接（又はリンカーを介して）連結される。
本発明の一実施態様では、前記抗原結合性断片は、単鎖可変領域断片であり；好ましくは、第一のタンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、及び第二のタンパク質機能領域は、単鎖可変領域断片であるか；又は第一のタンパク質機能領域は、単鎖可変領域断片であり、及び第二のタンパク質機能領域は、免疫グロブリンである。
本発明の一実施態様では、前記二重特異性抗体が提供され、ここで前記第一のタンパク質機能領域及び第二のタンパク質機能領域の数は、それぞれ独立して１、２又はそれ以上である。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、前記単鎖可変領域断片は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）とをリンカーを介して連結することにより形成される分子であり；好ましくは、単鎖可変領域断片は、一般的構造：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有してもよい。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、前記単鎖可変領域断片は、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端（ＣＨ）（又は重鎖のＮ末端、重鎖可変領域のＣＨ１のＣ末端）にリンカーにより連結されている場合、単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されるか、又は単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよく；
好ましくは、前記単鎖可変領域断片は、一般的構造：ＣＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ、又はＣＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨを有してもよく；
好ましくは、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；
前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
好ましくは、単鎖可変領域断片（たとえば、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ）は、リンカーを介して免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されるか、又は配列番号５０-５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよく、
又は好ましくは、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；及び／又は
単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
ここで、前記単鎖可変領域断片（たとえば、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ）が、リンカーを介して免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されるか、又は配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよく、
好ましくは、
１つの免疫グロブリン分子は、２つの単鎖可変領域断片分子に連結され、及びより好ましくは、前記２つの単鎖可変領域断片分子は同一である。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、単鎖可変領域断片は免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結される。免疫グロブリンは２つの重鎖からなるため、２つの単鎖可変領域分子は、１つの免疫グロブリン分子に結合される。好ましくは、前記２つの単鎖可変領域断片分子は同一である。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、
免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；
及び／又は
単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
好ましくは、単鎖可変領域断片（たとえば、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ）が、リンカーを介して免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されるか、又は配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよい。
本発明の別の実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、
免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；及び／又は
単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
ここで、単鎖可変領域断片（たとえば、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ）が、リンカーを介して免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されるか、又は配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよい。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、
免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号２及び配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を有し、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号７及び配列番号２２からそれぞれ選択されるアミノ酸配列を有すか；又は免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有し、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有し；
及び／又は
単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号４４及び配列番号６２から選択されるアミノ酸配列を有し、及び単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号４９及び配列番号６４からそれぞれ選択されるアミノ酸配列を有し；
ここで、単鎖可変領域断片が、リンカーを介して免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が連結されるか、又は単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよい。
本発明の別の実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、
免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号４４及び配列番号６２から選択されるアミノ酸配列を有し；免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号４９及び配列番号６４からそれぞれ選択されるアミノ酸配列を有するか、又は単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号２及び配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を有し、単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号７及び配列番号２２からそれぞれ選択されるアミノ酸配列を有するか、又は単鎖可変領域断の重鎖可変領域は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有し、及び単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する。
本発明の別の態様は、二重特異性抗体の重鎖可変領域をコードすることが可能なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、
前記抗体の重鎖可変領域は、
配列番号３～５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；配列番号４５～４７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；及び配列番号５０～５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；
及び二重特異性抗体の重鎖可変領域は、二重特異性抗体の一部としてＣＤ７３及びＰＤ－１抗原に特異的に結合し、及び前記二重特異性抗体は、配列番号８～１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ含む軽鎖可変領域をさらに含み；
好ましくは、前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲと異なる。
本発明の一実施態様では、前記二重特異性抗体において、
前記免疫グロブリンは、ヒト抗体由来など、マウス以外の種に由来する非ＣＤＲ領域を含む。
本発明の一実施態様では、免疫グロブリンの定常領域はヒト化されている。例えば、重鎖定常領域は、Ｉｇγ１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７であり；及び軽鎖定常領域は、Ｉｇκ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４である。
本発明の一実施態様では、免疫グロブリンの定常領域がヒト化されている。例えば、重鎖定常領域はＩｇγ１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７であり；及び軽鎖定常領域はＩｇκ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４であり；ここで、ＥＵナンバリングシステムによると、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、位置２３４，２３５及び２３７の任意の２又は３か所での変異を含み、及びＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／又はＣ１ｑに対する二重特異性抗体の親和性定数は、変異前のそれと比較して変異後に減少し；好ましくは、親和性定数はフォルテビオのオクテット系により測定される。
本発明の一実施態様において、前記二重特異性抗体について、ＥＵナンバリングシステムによれば、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、位置２３４，２３５及び／又は２３７で、以下：
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；
又は
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ
の変異を有する。
本発明一つ以上実施態様では、特に断りのない限り、位置番号の前の文字は、変異前のアミノ酸を示し、及び位置番号の後の文字は、変異後のアミノ酸を表す。
本発明の１つ以上の実施態様では、前記二重特異性抗体について、ＥＵナンバリングシステムに従い、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、以下：
Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｐ２３８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｅ２３３Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ａ３３０Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｔ３９４Ｄ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ａ、Ｌ３２８Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ３１８Ａ及びＫ３２０Ａ
から選択される１つ以上の変異を有する。
具体的な実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体は、重鎖－軽鎖－リンカー１－ｓｃＦｖとして示される構造を有し、及び前記ｓｃＦｖは、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー２－１４Ｃ１２Ｌ１Ｖ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー１－１４Ｃ１２Ｌ１Ｖ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー２－１４Ｃ１２Ｌ１Ｖ及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー１－１４Ｃ１２Ｌ１Ｖから選択され、具体的には以下：
（１）ＮＴＰＤＶ１、その重鎖は、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し；軽鎖は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー２は、配列番号８１に記載のアミノ酸配列を有し、及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有する；
（２）ＮＴＰＤＶ２、その重鎖は、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有する；
（３）ＮＴＰＤＶ３、その重鎖は、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー２は、配列番号８１に記載のアミノ酸配列を有し、及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有する；及び
（４）ＮＴＰＤＶ４、その重鎖は、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有する、
からなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、前記二重特異性抗体は、ＣＤ７３タンパク質及び／又はＰＤ－１タンパク質に約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示される単離された核酸分子を含むベクターに関する。
本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示される単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示される二重特異性抗体を調製するための方法に関し、本明細書に開示される宿主細胞を適切な条件で培養し、細胞培養物から二重特異性抗体を単離することを含む。
本発明のさらに別の態様は、二重特異性抗体及びコンジュゲートされた部分を含むコンジュゲートに関し、ここで、二重特異性抗体は、本明細書に開示される二重特異性抗体であり、及び前記コンジュゲートされた部分は、検出可能な標識であり；具体的には、前記コンジュゲートされた部分は、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、着色された物質又は酵素である。
本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示される二重特異性抗体を含む、又は本明細書に開示されるコンジュゲートを含むキットに関し；好ましくは、前記キットは、二重特異性抗体を特異的に認識する二次抗体をさらに含み；任意選択的に、前記二次抗体は、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、着色された物質又は酵素をさらに含む。
本発明のさらに別の態様は、サンプル中のＣＤ７３及び／又はＰＤ－１の存在又はレベルを検出するためのキットの調製における、本明細書に開示される二重特異性抗体の使用に関する。
本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示される二重特異性抗体又は本明細書に開示されるコンジュゲートを含む医薬組成物に関し；任意選択的に、薬学的に許容され得る担体及び／又は賦形剤をさらに含む医薬組成物に関する。
本発明のさらに別の態様は、腫瘍又は貧血を予防及び／又は治療すること、又は腫瘍又は貧血を診断することにおける本明細書に開示される二重特異性抗体又は本明細書に開示されるコンジュゲートの使用に関する。
本発明のさらに別の態様は、腫瘍又は貧血の予防及び／又は治療するための薬剤を調製すこと、又は腫瘍又は貧血を診断するための薬剤を調製することにおける、本明細書に開示される二重特異性抗体又は本明細書に開示されるコンジュゲートの使用に関する。
本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示される二重特異性抗体の使用、又は以下：
サンプル中のＣＤ７３のレベルを検出するための薬剤、
ＣＤ７３の酵素活性反応を阻害するための薬剤；
及び／又は
ＰＤ－１のＰＤＬ－１への結合を遮断するための薬剤、
ＰＤ－１の活性又はレベルをダウンレギュレート（例えば、ダウンレギュレーティング）するための薬剤、
生物におけるＰＤ－１の免疫抑制を緩和するための薬剤、
Ｔリンパ球におけるＩＬ－２発現を上昇させるための薬剤、又は
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ発現を上昇させための薬剤
の調製における本明細書に開示されるコンジュゲートの使用に関する。
本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示される二重特異性抗体又は本明細書に開示されるコンジュゲートの有効量を細胞に投与すること、又はそれを必要とする被験体に投与することを含む、インビボ又はインビトロの方法に関する。
本明細書に記載された抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体は、ＣＤ７３細胞膜表面の酵素活性を阻害し、及びＩＦＮγ及びＩＬ－２の分泌を誘導してその免疫応答を活性化することができる。
前記軽鎖及び重鎖の可変領域は、前記抗原の結合を決定し；各鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（重鎖（Ｈ）のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、及び軽鎖（Ｌ）のＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む）と呼ばれる３つの超可変領域を含み、これらはＫａｂａｔらにより命名された。Bethesda M.d., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 1991; 1-3:91-3242を参照のこと。
好ましくは、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号システムにより定義されてもよく、Ehrenmann F, Kaas Q, and Lefranc M P., IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF[J]. Nucleic acids research 2009; 38(suppl_1): D301-D307.を参照のこと。
以下の（１）～（１１）におけるモノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、当業者に周知の技術的手段により、例えば、ＩＭＧＴの定義に従って分析され、その結果は以下のとおりである：
（１）１９Ｆ３Ｆ
重鎖可変領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、及びb軽鎖可変領域は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する。
重鎖可変領域の３つのＣＤＲは、以下のアミノ酸配列：
ＨＣＤＲ１：ＧＹＳＦＴＧＹＴ（配列番号３）、
ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＹＮＡＧＴ（配列番号４）、及び
ＨＣＤＲ３：ＡＲＳＥＹＲＹＧＧＤＹＦＤＹ（配列番号５）を有し；
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲは、以下のアミノ酸配列：
ＬＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号８）、
ＬＣＤＲ２：ＦＡＳ（配列番号９）、及び
ＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＤＴＰＹＴ（配列番号１０）を有する。
（２）１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２
重鎖可変領域は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有し、及び軽鎖可変領域は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する。
重鎖可変領域の３つのＣＤＲは、１９Ｆ３と同一のアミノ酸配列を有する。
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲは、１９Ｆ３と同一のアミノ酸配列を有する。
（３）１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３
重鎖可変領域は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する。
重鎖可変領域の３つのＣＤＲは、１９Ｆ３と同一のアミノ酸配列を有する。
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲは、１９Ｆ３と同一のアミノ酸配列を有する。
（４）１４Ｃ１２
重鎖可変領域は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する。
重鎖可変領域の３つのＣＤＲは、以下のアミノ酸配列：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号４５）
ＨＣＤＲ２：ＩＳＧＧＧＲＹＴ（配列番号４６）
ＨＣＤＲ３：ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ（配列番号４７）を有する。
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲは、以下のアミノ酸配列：
ＬＣＤＲ１：ＱＤＩＮＴＹ（配列番号５０）
ＬＣＤＲ２：ＲＡＮ（配列番号５１）
ＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号５２）を有する。
（５）１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１Ｌ１
重鎖可変領域は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を有する。
重鎖可変領域の３つのＣＤＲは、１４Ｃ１２と同一のアミノ酸配列を有する。
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲは、１４Ｃ１２と同一のアミノ酸配列を有する。
（６）ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の重鎖の９つのＣＤＲは、Ｎ末端からＣ末端の順に、それぞれ１３Ｆ９重鎖、１４Ｃ１２重鎖、１４Ｃ１２軽鎖及び１４Ｃ１２のＣＤＲと同一のアミノ酸配列を有する。
上記の順の配列は次のとおりである：
ＨＣＤＲ１：ＧＹＳＦＴＧＹＴ（配列番号３）
ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＹＮＡＧＴ（配列番号４）
ＨＣＤＲ３：ＡＲＳＥＹＲＹＧＧＤＹＦＤＹ（配列番号５）
ＨＣＤＲ４：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号４５）
ＨＣＤＲ５：ＩＳＧＧＧＲＹＴ（配列番号４６）
ＨＣＤＲ６：ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ（配列番号４７）
ＨＣＤＲ７：ＱＤＩＮＴＹ（配列番号５０）
ＨＣＤＲ８：ＲＡＮ（配列番号５１）
ＨＣＤＲ９：ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号５２）
軽鎖の３つのＣＤＲは、１９Ｆ３軽鎖の３つのＣＤＲと同一のアミノ酸配列を有し、その配列は次のとおりである：
ＬＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号８）
ＬＣＤＲ２：ＦＡＳ（配列番号９）
Ｌｃｄｒ３：ＱＱＨＹＤＴＰＹＴ（配列番号１０）。
本発明のさらに別の態様は、中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に、コレクション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１８１３７を用いて寄託されたハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４に関する。
本発明のさらに別の態様は、中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に、コレクション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１５１０５を用いて寄託されたハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３に関する。
本発明において、特に断りのない限り、本明細書において使用される科学的及び技術的用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。また、本明細書において使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学の実験室操作は、対応する分野において広く使用される日常的な手順である。なお、本発明をよりよく理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に示す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＥＣ５０」は、最大効果の５０％の濃度、すなわち最大効果の５０％を引き起こすことができる濃度を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、一般的に２対のポリペプチド鎖（各対は１つの「軽」（Ｌ）鎖及び１つの「重」（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κ軽鎖とλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α又はεに分類される。抗体のアイソタイプは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義される。軽鎖及び重鎖において、可変領域及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、及び重鎖は、約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定数領域は、１つのドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）の古典的補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）への結合を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を仲介することができる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、高い可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細分することができ、これらの領域の間には、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存的な領域が分布している。ＶＨ及びＶＬは、それぞれアミノ末端からカルボキシル末端に次の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４に配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、抗体結合性部位を形成する。アミノ酸の領域又はドメインへの割り当ては、Bethesda M.d., Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, (1987 and 1991))、又はChothia & Lesk J. Mol. Biol., 1987; 196:901-917; Chothia et al., Nature, 1989; 342:878-883、又はＩＭＧＴナンバリングシステムの定義：the definition in Ehrenmann F, Kaas Q, Lefranc M P., IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF[J]., Nucleic acids research, 2009; 38(suppl_1): D301-D307に基づいている。
具体的には、重鎖は６、９又は１２などの、３つ以上のＣＤＲを含んでもよい。例えば、本明細書に開示される二重特異性抗体では、重鎖は、１つのＳｃＦｖにＣ末端が結合したＩｇＧ抗体の重鎖であってもよく、この場合、重鎖は９つのＣＤＲを含む。
用語「抗体」は、抗体を産生するための如何なる特定の方法によっても制限されない。例えば、前記抗体は、組換え抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む。抗体は、ＩｇＧ（例えば、サブタイプのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭなどの、様々なアイソタイプの抗体であってもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「ｍＡｂ」及び「モノクローナル抗体」は、自然発生的に発生する可能性のある自然突然変異を除き、高度に相同な抗体のグループに由来する、すなわち同一の抗体分子のグループに由来する抗体又は抗体の断片を指す。モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して、一般的に、抗原上の異なるエピトープを通常認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般的に、Ｋｏｈｌｅｒら(Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity [J]. Nature, 1975; 256(5517): 495)により最初に報告されたハイブリドーマ技術を使用して得ることができるが、組換えＤＮＡ技術（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）を使用して得ることもできる。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）のＣＤＲ領域の全部又は一部が、非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域により置換されたときに得られる抗体又は抗体断片を指し、ここでドナー抗体は、所望の特異性、親和性又は反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラット又はウサギ）抗体であってもよい。さらに、レセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）におけるいくつかのアミノ酸残基は、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基により、又は他の抗体のアミノ酸残基により置換されることができ、抗体の性能をさらに向上又は最適化することもできる。ヒト化抗体のさらなる詳細については、例えば、Jones et al., Nature, 1986; 321:522 525; Reichmann et al., Nature, 1988; 332:323 329; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992; 2:593-596;及びClark, Immunol. Today, 2000; 21: 397-402を参照のこと。いくつかの場合では、抗体の抗原結合性断片は、ＶＨドメインとＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上に発現している二重特異性抗体（diabodies）である。しかしながら、使用されるリンカーが短すぎて、同一のチェーン上の２つのドメインをペアリングできない。これにより、ドメインは、他の鎖上の相補的ドメインとの対になることを強制され、そして２つの抗原結合性部位が生成される（例えば、Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90:6444-6448 and Poljak R. J. et al., Structure, 1994; 2:1121-1123を参照のこと）。
本明細書で使用されるとき、用語「単鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）」は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）がリンカーにより連結される分子を指す。ＶＬドメイン及びＶＨドメインは、対になって、それらが単一のペプチド鎖を生成することを可能にするリンカーにより１価の分子を形成する（Bird et al, Science, 1988; 242:423-426 and Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988; 85:5879-5883を参照のこと）。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般的な構造：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有してもよい。先行技術における適切なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーが使用されてもよいが、その変異体が使用されてもよい(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90: 6444-6448)。本発明において使用できる他のリンカーは、Alfthan et al., Protein Eng., 1995; 8:725-731, Choi et al., Eur. J. Immunol., 2001; 31: 94-106, Hu et al., Cancer Res., 1996; 56:3055-3061, Kipriyanov et al., J. Mol. Biol., 1999; 293:41-56 and Roovers et al., Cancer Immunology, Immunotherapy, 2001, 50(1): 51-59により記載されている。。
本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、人工的な手段により、自然状態から得ることを意味する。特定の「単離された」物質又は成分が自然界に出現する場合、その自然環境に変化が生じるか、自然環境から単離されるか、又はその両方の場合でもよい。例えば、特定の非単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドは、特定の生きた動物中に自然に存在し、そしてそのような自然な状態で単離された高純度の同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ばれる。用語「単離された」は、人工物質又は合成物質、又は物質の活性に影響しないその他の不純物の存在を排除しない。
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸ビヒクルを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、前記ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、ベクターにより生じる遺伝物質要素が宿主細胞中に発現できるように、形質転換、形質導入又はトランスフェクションにより宿主細胞中に導入することができる。ベクターは当業者に周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；λファージ又はＭ１３ファージなどのファージ；及び動物ウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターとして使用できる動物ウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０など）を含むが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない、発現を制御する様々な要素を含んでもよい。さらに、前記ベクターは、複製開始部位をさらに含んでもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、ベクターを導入することができる細胞を指し、大腸菌（E. coli）又は枯草菌（bacillus subtilis）などの原核細胞、酵母細胞又はアスペルギルス（aspergillus）などの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞やＳｆ９などの昆虫細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＳ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はヒト細胞などの動物細胞を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「特異的結合」は、抗体とそれが標的とする抗原との間の反応などの、２つの分子間の非ランダム結合反応を指す。いくつかの実施態様では、抗原に特異的に結合する抗体（又は抗原に特異的な抗体）は、抗体が、約１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ以下などの、約１０－５Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で抗原に結合することを意味する。
本明細書中で使用されるとき、用語「ＫＤ」は、抗体と抗原との間の結合親和性を記載するために使用される、特異的な抗体－抗原相互作用についての解離平衡定数を指す。より小さい解離平衡定数は、より強い抗体－抗原結合、及び抗体と抗原との間のより高い親和性を示す。典型的には、抗体は、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ以下などの約１０－５Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原（例えば、ＰＤ－１タンパク質）に結合する。ＫＤは、当業者に公知の方法、例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏシステムを使用して決定することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」及び「ｍＡｂ」は、同一の意味を有し、互換的に使用することができ；用語「ポリクローナル抗体」及び「ｐＡｂ」は、同一の意味を有し、そして互換的に使用することができる。さらに、本明細書において、アミノ酸は、一般に、当該技術分野で公知の１文字及び３文字の略語により示される、例えば、アラニンは、Ａ又はＡｌａにより示すことができる。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容され得る担体及び／又は賦形剤」は、被験体及び有効成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合可能な担体及び／又は賦形剤を指す。そのような担体及び／又は賦形剤は、当技術分野で周知であり（Remington's Pharmaceutical Sciences, edited by Gennaro AR, 19thEd., Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照のこと）、pH調整剤、界面活性剤、アジュバント、及びイオン強度増強剤を含むが、これらに限定されない。例えば、pH調整剤は、リン酸緩衝液が含むが、これに限定されず；界面活性剤は、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ－８０などの、非イオン界面活性剤を含むが、これらに限定されず；イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、これに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、所望の効果を得るために又は少なくとも部分的に所望の効果を得るために十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、腫瘍）に対する予防的有効量は、疾患（例えば、腫瘍）の発症を予防、停止又は遅延させるのに十分な量を指し；治療的有効量は、疾患に罹患した患者における疾患及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量を指す。そのような有効量を決定することは、当業者の能力の範囲内であることに間違いはない。例えば、治療目的のための有効量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、年齢、体重及び性別などの患者の一般的状態、投与の経路、及び併用される他の処置など依存する。
有益な効果
本発明のモノクローナル抗体（例えば１３Ｆ９Ｈ２Ｌ３）は、ＣＤ７３に十分かつ特異的に結合でき、そして非基質競合モードでＣＤ７３の酵素活性反応を効果的に阻害でき、アデノシンの産生を減少させて、Ｔ細胞の活性及び腫瘍阻害効果を促進することができる。
本明細書に開示されるＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４などの二重特異性抗体は、ＰＤ－１及びＣＤ７３に十分かつ特異的に結合することができ、ＰＤ－１のＰＤＬ－１への結合を効果的にブロックすることができ、生物におけるＰＤ－１の免疫抑制を特異的に緩和し、ＣＤ７３の触媒活性を阻害し、アデノシンによる免疫細胞に対する阻害を緩和し、Ｔリンパ球を活性化し、そしてサイトカインＩＬ－８及びＩＬ－６の放出を引き起こさず、安全性及び有効性が効果的に向上することを示す。
本明細書に開示される二機能性抗体は、抗腫瘍薬物の調製に使用できる可能性を有する。
ＥＬＩＳＡにより測定したＰＤ－１－ｍＦｃに対するＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及びニボルマブの結合。 ＥＬＩＳＡにより測定したヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに対するＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３及びＭＥＤＩ９４４７の結合。 ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンに結合するための、ヒトＰＤＬ－１－ｍＦｃと競合するＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及びニボルマブの活性。 ＰＤ－１－ｍＦｃに対するＰ１Ｄ７Ｖ０１の親和性定数。 ＰＤ－１－ｍＦｃに対する１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の親和性定数。 ＰＤ－１－ｍＦｃに対するニボルマブの親和性定数。 ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するＰ１Ｄ７Ｖ０１の親和性定数。 ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するＭＥＤＩ９４４７の親和性定数。 ＦＡＣＳにより測定された、２９３Ｔ－ＰＤ１細胞表面上のＰＤ－１に対するＰ１Ｄ７Ｖ０１，Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ，Ｐ１Ｄ７Ｖ０３，Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の結合活性。 ＦＡＣＳにより測定された、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞表面上のＣＤ７３に対するＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、ＭＥＤＩ９４４７及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の結合活性。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１膜表面上のＣＤ７３の酵素活性に対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の阻害。 Ｕ８７－ＭＧ膜表面上のＣＤ７３の酵素活性に対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の阻害。 Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１混合リンパ球反応系におけるＩＦＮ－γ分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性。 Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１混合リンパ球反応系におけるＩＬ－２分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性。 ＤＣ混合リンパ球反応系におけるＩＦＮ－γ分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性。 ＤＣ混合リンパ球反応系におけるＩＬ－２分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性。 ＰＤ－１－ｍＦｃに対する１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数。 ＰＤ－１－ｍＦｃに対するニボルマブの親和性定数。 ＰＤ－１－ｍＦｃに対するＮＴＰＤＶ１の親和性定数。 ＰＤ－１－ｍＦｃに対するＮＴＰＤＶ２の親和性定数。 ＰＤ－１－ｍＦｃに対するＮＴＰＤＶ３の親和性定数。 ＰＤ－１－ｍＦｃに対するＮＴＰＤＶ４の親和性定数。 ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対する１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）の親和性定数。 ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するＮＴＰＤＶ１の親和性定数。 ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するＮＴＰＤＶ２の親和性定数。 ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するＮＴＰＤＶ３の親和性定数。 ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するＮＴＰＤＶ４の親和性定数。 抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体によるＵ８７－ＭＧ細胞膜表面上のＣＤ７３の酵素活性の阻害。 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）により決定される、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性。 マウスにおける腫瘍体積に対するアイソタイプコントロール、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）及び異なる用量のＮＴＰＤＶ２の効果。 マウスの体重に対するアイソタイプコントロール、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）及び異なる用量のＮＴＰＤＶ２の効果。 ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞及びヒトマクロファージの共培養系におけるＦｃセグメントのアミノ酸変異によるヒトマクロファージにおけるＰＤ－１／ＣＤ７３二重特異性抗体媒介性ＩＬ－８分泌の効果的な除去。 ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞及びヒトマクロファージの共培養系におけるＦｃセグメントのアミノ酸変異によるヒトマクロファージにおけるＰＤ－１／ＣＤ７３二重特異性抗体媒介性ＩＬ－６分泌の効果的な除去。 Ｕ８７－ＭＧ細胞及びヒトマクロファージの共培養系におけるＦｃセグメントのアミノ酸変異によるヒトマクロファージにおけるＰＤ－１／ＣＤ７３二重特異性抗体媒介性ＩＬ－８分泌の効果的な除去。 Ｕ８７－ＭＧ細胞及びヒトマクロファージの共培養系におけるＦｃセグメントのアミノ酸変異によるヒトマクロファージにおけるＰＤ－１／ＣＤ７３二重特異性抗体媒介性ＩＬ－６分泌の効果的な除去。
生体材料の回収情報：
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３（ＰＤ－１－１４Ｃ１２とも呼ばれる）は、コレクション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１５１０５を用いて、２０１５年６月１６日に、中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、回収の住所は、郵便番号：４３００７２の中国、武漢、武漢大学であった。
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４（ＣＤ７３－１９Ｆ３とも呼ばれる）は、コレクション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１８１３７を用いて、２０１８年６月２１日に、中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、回収された住所は、郵便番号：４３００７２の中国、武漢、武漢大学であった。
詳細な説明
本発明の実施態様は、実施例を参照しながら以下に詳述する。当業者は、以下の実施例が本発明を例示するためだけのものであり、本発明の範囲の制限として解釈されるべきではないことを理解するであろう。技術又は条件が明記されていない場合、前記実施例は、当技術分野における文献に記載されている技術又は条件（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, authored by J. Sambrook et al., and translated by Peitang Huang et al., 3rd Edition, Science Press）に従って、又は製品マニュアルに従って実施された。使用した試薬又は器具は、メーカーが明記されていない場合市販の従来製品である。たとえば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ８７－ＭＧ細胞は、ＡＴＣＣから購入できる。
本発明の以下の実施例では、使用するＢＡＬＢ／ｃマウスを広東医学実験動物センターから購入した。
本発明の以下の実施例では、使用されたポジティブコントロール抗体ＭＥＤＩ９４４７（一般名：オレクルマブ）は、Zhongshan Akesobio Co. Ltd.,により製造され、その配列は、Medmmune Limitedの米国公開公報第二０１６０１２９１０８Ａｌ号に記載される抗体配列番号２１から２４と同一である。
本発明の以下の実施例では、Bristol-Myers Squibbから購入した同一標的に対する市販の抗体ニボルマブ（商品名：オプジーボ）を使用した。
本発明の以下の実施例では、使用された細胞株２９３Ｔ－ＰＤ１は、Zhongshan Akesobio Co. Ltdにより構築された。前記細胞株２９３Ｔ－ＰＤ１は、第３世代レンチウイルス系（例えば、A Third Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyenm, Trono D, and Naldini L., J Virol., 1998. 72(11):8463-8471を参照のこと）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウイルス感染により調製し、ここで、使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＰＤ－１ＦＬ－Ｐｕｒｏ(ＰＤ１、ＧｅｎｅｂａｎｋＩＤ：ＮＭ００５０１８；ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－Ｐｕｒｏ、Ｙｏｕｂｉｏから購入、カタログ番号ＶＴ１４８０)であった。
本発明の以下の実施例では、使用された細胞株Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１は、Zhongshan Akesobio Co. Ltdにより構築された。前記細胞株Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１は、第３世代レンチウイルス系（例えば、A Third Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyenm, Trono D, and Naldini L., J Virol., 1998. 72(11):8463-8471を参照のこと）を使用して、Ｒａｊｉ細胞のウイルス感染により調製され、ここで、使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３－ＰＤＬ－１（ＰＤＬ－１、ＧｅｎｅｂａｎｋＩＤ：ＮＰ５４８６２．１；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号Ｋ５３１５－２０）であった。
本発明の以下の実施例では、使用された細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１は、Zhongshan Akesobio Co. Ltdにより構築された。前記細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１は、第３世代レンチウイルス系（例えば、A Third Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyenm, Trono D, and Naldini L., J Virol., 1998. 72(11):8463-8471を参照のこと）を使用してＣＨＯ－Ｋ１細胞のウイルス感染により調製した。ここで、使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＰＤ－１ＦＬ－Ｐｕｒｏ（ＰＤ１、ＧｅｎｅｂａｎｋＩＤ：ＮＭ００５０１８；ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－Ｐｕｒｏ、Ｙｏｕｂｉｏから購入、カタログ番号ＶＴ１４８０）であった。
Ｓ２２８Ｐ変異を保持するＩｇＧ４サブタイプの抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブ（商号：オプジーボ）をサンプル中の対照抗体として使用し、Bristol-Myers Squibbから購入した。
本発明の以下の実施例では、使用されたアイソタイプコントロール抗体、すなわちｈＩｇＧ１は、ヒト抗鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）を標的とする抗体であり、抗体の可変領域配列は、Ａｃｉｅｒｎｏらにより、報告された“Affinity maturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies”(Acierno et al., J Mol biol., 2007; 374(1): 130-46)と題された研究からのものである。ｈＩｇＧ１の定常領域断片において、重鎖定常領域は、Ｉｇγ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７であり、及び軽鎖定常領域は、Ｉｇκ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４である。ｈＩｇＧ１はＺｈｏｎｇｓｈａｎ Ａｋｅｓｏｂｉｏ Ｃｏ．Ｌｔｄの研究所において調製された。
抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３の調製
１．ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４の調製
抗ＣＤ７３抗体を調製するために使用された抗原は、ヒトＮＴ５Ｅ－ｈｉｓ（ＮＴ５Ｅについては、ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＰ００２５１７．１、位置：１-５５２）であった。免疫化したマウスの脾臓細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を調製した。ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチン（ＮＴ５Ｅについては、ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＰ２５１７．１、位置：１-５５２）を抗原として用いて、ハイブリドーマ細胞を間接的ＥＬＩＳＡでスクリーニングして、ＣＤ７３に特異的に結合できる抗体を分泌することが可能なハイブリドーマ細胞を得た。ＥＬＩＳＡスクリーニングにより得たハイブリドーマ細胞を、限界希釈に供して、安定なハイブリドーマ細胞株を得た。前記ハイブリドーマ細胞株をハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４と命名し、そこから分泌されるモノクローナル抗体を１９Ｆ３と命名した。
前記ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４（ＣＤ７３－１９Ｆ３とも呼ばれる）は、コレクション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１８１３７を用いて、２０１８年６月２１日に、中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、回収された住所は、郵便番号：４３００７２の中国、武漢、武漢大学であった。
２．抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３の調製
上記で調製した細胞株ＬＴ０１４を、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター中で化学的に定義された培地（ペニシリン－ストレプトマイシン １％を含むＣＤ培地）で培養した。７日後、高速遠心分離、精密ろ過膜及びＨｉＴｒａｐタンパク質Ａ ＨＰカラムを通した真空ろ過により上清を回収し精製して、抗体１９Ｆ３を得た。
抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３の配列分析
RNApreppureCell/BacteriaKit（Ｔｉａｎｇｅｎ、カタログ番号ＤＰ４３０）のマニュアルに記載されている方法に従って、実施例１で調製した細胞株ＬＴ０１４から、ｍＲＮＡを抽出した。
ＲＴ－ＰＣＲのためのInvitrogen SuperScript（商標登録） III First-Strand Synthesis Systemのマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲで増幅した産物を、pEASY-T1 Cloning Kit (Transgen CT101)のマニュアルに従って直接ＴＡクローニングに供した。
ＴＡクローニングされた産物は、直接配列され、配列結果は以下のとおりである：
１９Ｆ３重鎖可変領域のヌクレオチド配列（３６３ｂｐ）は、配列番号１に記載され、コードされたアミノ酸配列（１２１ａａ）は、配列番号２に記載される。
ＩＭＧＴのナンバリングシステムによれば、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号３に記載の配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号４に記載の配列を有し、及び重鎖ＣＤＲ３は配列番号５に記載の配列を有する。
１９Ｆ３軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（３３９ｂｐ）は配列番号６に記載され、コードされたアミノ酸配列（１１３ａａ）は、配列番号７に記載される。
ＩＭＧＴのナンバリングシステムによれば、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号８に記載された配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号９に記載の配列を有し、及び軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１０に記載の配列を有する。
１９Ｆ３重鎖の４つのフレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ１からＦＲ－Ｈ４）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１から配列番号１４に記載される。１９Ｆ３軽鎖の４つのフレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ１からＦＲ－Ｈ４）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５から配列番号１８に記載される。
ヒト化抗ヒトＣＤ７３抗体の設計、調製及び決定
１．ヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２の軽鎖及び重鎖配列の設計
ヒトＣＤ７３タンパク質の３次元結晶構造(Hage T, Reinemer P, Sebald W., Crystals of a 1:1 complex between human interleukin-4 and the extracellular domain of its receptor alpha chain., Eur J Biochem., 1998; 258(2):831-6)と実施例２で得たマウス抗体１９Ｆ３の配列を基に、コンピュータモデリングと変異設計により抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の可変領域配列を得た。対応する重鎖可変領域配列は、それぞれ１９Ｆ３Ｈ１及び１９Ｆ３Ｈ２（それぞれ配列番号９３及び配列番号９７に記載のアミノ酸配列を有する）であり、及び軽鎖可変領域配列は、それぞれ１９Ｆ３Ｌ１、１９Ｆ３Ｌ２及び１９Ｆ３Ｌ３（それぞれ配列番号９５、配列番号９８及び配列番号９９に記載のアミノ酸配列を有する）であった。抗体の定常領域配列は、ＮＣＢＩデータベースからのものであり：重鎖定常領域は、Ｉｇγ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７；軽鎖定常領域は、Ｉｇκ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４である。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３は、中国特許出願第二０２１１０２７０６７１．Ｘ号において、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＷＴ）としてしられており、ここで１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の軽鎖及び重鎖可変領域は、１９Ｆ３Ｈ１Ｖ（又は１９Ｆ３Ｈ１Ｖ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｖ（又は１９Ｆ３Ｈ２Ｖ）、１９Ｆ３Ｌ１Ｖ（又は１９Ｆ３Ｌ１Ｖ）、１９Ｆ３Ｌ２Ｖ（又は１９Ｆ３Ｌ２Ｖ）及び１９Ｆ３Ｌ３Ｖ（又は１９Ｆ３Ｌ３Ｖ）としてさらに注記することができる。
（１）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列は以下の通りである：
重鎖可変領域のヌクレオチド配列（３６３ｂｐ）は、配列番号９２に記載され、及びコードされたアミノ酸配列（１２１ａａ）は、配列番号９３に記載される。
軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（３３９ｂｐ）は、配列番号９４に記載され、及びコードされたアミノ酸配列（１１３ａａ）は、配列番号９５に記載される。
（２）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列は以下の通りである：
重鎖可変領域１９Ｆ３Ｈ２のヌクレオチド配列（３６３ｂｐ）は、配列番号１９に記載され、及びコードされたアミノ酸配列（１２１ａａ）は、配列番号２０に記載される。
軽鎖可変領域１９Ｆ３Ｌ３のヌクレオチド配列（３３９ｂｐ）は、配列番号２１に記載され、及びコードされたアミノ酸配列（１１３ａａ）は、配列番号２２に記載される。
（３）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列は以下の通りである：
重鎖可変領域１９Ｆ３Ｈ２のヌクレオチド配列（３６３ｂｐ）は、配列番号１９に記載され、及びコードされたアミノ酸配列（１２１ａａ）は、配列番号２０に記載される。
軽鎖可変領域１９Ｆ３Ｌ３のヌクレオチド配列（３３９ｂｐ）は、配列番号２３に記載され、及びコードされたアミノ酸配列（１１３ａａ）は、配列番号２４に記載される。
２．ヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の調製
重鎖定常領域は、Ｉｇγ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７；軽鎖定常領域は、Ｉｇκ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４を使用した。
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡは、ｐＵＣ５７単純（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社により提供）ベクターに別々にクローニングされ、ｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｈ１、ｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ１、ｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｈ２、ｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ２及びｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ３を得た。Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition)に記載されている標準的な技術を参照して、ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩ消化により合成された重鎖及び軽鎖全長遺伝子を、制限酵素（ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩ）による消化を通して発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２、及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３を得て、さらに組換え発現プラスミドの重鎖／軽鎖遺伝子を、配列分析に供した。次に、対応する軽鎖及び重鎖組換えプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ１／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２、及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３）を含む設計された遺伝子の組み合わせを、２９３Ｆ細胞に別々にコトランスフェクトし、培養液を回収して精製した。配列を確認した後、エンドトキシンを含まない発現プラスミドを調製し、抗体発現のためにＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。７日後に培養液を回収し、タンパク質Ａカラムを介した親和性精製に供して、ヒト化抗体を得た。
３．ヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＴＭ）の軽鎖及び重鎖の配列の設計
実施例３ １で得た１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３に基づいて、重鎖において位置２３４（Ｌ２３４Ａ）でロイシンからアラニンへの点突然変異、及び位置２３５（Ｌ２３５Ａ）でロイシンからアラニンへの点突然変異を導入することにより、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）を得た。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）の重鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５及び配列番号２６に記載され；１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）の軽鎖定常領域は、Ｉｇκ鎖Ｃ領域アクセッション番号Ｐ０１８３４であり、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）の軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７及び配列番号２８に記載される。
実施例３のステップ１で得た１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３に基づいて、重鎖において位置２３４（Ｌ２３４Ａ）でロイシンからアラニンへの点突然変異、位置２３５（Ｌ２３５Ａ）でロイシンからアラニンへの点突然変異、及び位置２３７（Ｇ２３７Ａ）でグリシンからアラニンへの点突然変異を導入することにより、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＴＭ）を得た。重鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２９及び配列番号３０に記載され；軽鎖は、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）と同一である。
１９Ｆ３Ｈ２の４つのフレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ１からＦＲ－Ｈ４）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３１から配列番号３４に記載され；
１９Ｆ３Ｌ２軽鎖の４つのフレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ１からＦＲ－Ｈ４）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３５から配列番号３８に記載され；及び
１９Ｆ３Ｌ３軽鎖の４つのフレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ１からＦＲ－Ｈ４）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３９から配列番号４２に記載される。
４．ヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）の調製
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡを、ベクターｐＵＣ５７単純（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により提供）に別々にクローニングし、それぞれｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１Ｍ）及びｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ３を得た。Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition)に記載されている標準的な技術を参照して、ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩ消化により合成された重鎖及び軽鎖全長遺伝子を、制限酵素（ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩ）による消化を通して発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１Ｍ）及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３を得、さらに組換え発現プラスミドの重鎖／軽鎖遺伝子を配列分析に供した。次に、対応する軽鎖及び重鎖組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１Ｍ）／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３を含む設計された遺伝子の組み合わせを２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトし、培養液を回収し精製した。配列を確認した後、エンドトキシンを含まない発現プラスミドを調製し、抗体発現のためにＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。７日後に培養液を回収し、タンパク質Ａカラムを介した親和性精製に供して、ヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）を得た。
抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２の調製
１．ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３の調製
抗原としてＰＤ－１－ｍＦｃ融合タンパク質（ＰＤ－１、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ００５０１８、ｍＦｃ配列番号８９）を使用して、免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞（Guangdong Medical Laboratory Animal Centerから購入）及びマウス骨髄腫細胞を、ハイブリドーマ細胞に融合させ、確立した方法（例えば、Stewart, S.J., “Monoclonal Antibody Production”, in Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Eds. G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000を参照した。
間接的ＥＬＩＳＡのために、プレートをＰＤ－１－ｈＦｃ（ＰＤ－１、ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＭ００５０１８、ｈＦｃは、ヒトＩｇＧＦｃ精製タグであり、具体的にはＩｇγ－１鎖Ｃ領域、ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：Ｐ０１８５７、位置１１４－３３０）でコーティングした。スクリーニングにより、ＰＤ－１に特異的に結合する新たな抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を得た。
ＰＤ－１に結合するためのリガンドＰＤＬ－１－ｈＦｃ（ＰＤＬ－１、ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＰ５４８６２．１）と競合するモノクローナル抗体を分泌することが可能なハイブリドーマ細胞株を競合的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、限界希釈により安定なハイブリドーマ細胞株を得た。ＬＴ００３安定細胞株（ＰＤ－１－１４Ｃ１２）を限界希釈により得て、分泌されたモノクローナル抗体を１４Ｃ１２と命名した。
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３（ＰＤ－１－１４Ｃ１２とも呼ばれる）は、コレクション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１５１０５を用いて、２０１５年６月１６日に、中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、回収の住所は、郵便番号：４３００７２の中国、武漢、武漢大学であった。
２．抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２の調製
上記で調製したＬＴ００３細胞を、１０％低ＩｇＧウシ胎児血清ＩＭＤＭ培地を含むＩＭＤＭ培地で培養した（１％ ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地、５％ＣＯ２、３７℃細胞インキュベーター中で培養）。７日後に、細胞培養上清を回収し精製して抗体１４Ｃ１２を得た。
抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２の配列分析
RNAprep pure Cell/Bacteria Kit (Ｔｉａｎｇｅｎ、カタログ番号ＤＰ４３０)のマニュアルに記載されている方法に従って、実施例１で調製したハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３から、ｍＲＮＡを抽出した。
ＲＴ－ＰＣＲのためのInvitrogen SuperScript（商標登録） III First-Strand Synthesis Systemのマニュアルに従って、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲで増幅した産物を、pEASY-T1 Cloning Kit (Transgen CT101)のマニュアルに従って直接ＴＡクローニングに供した。
ＴＡクローニングされた産物は、直接配列され、配列結果は以下のとおりである：
重鎖可変領域のヌクレオチド配列（３５４ｂｐ）は、配列番号４３に記載され、及びコードされたアミノ酸配列（１１８ａａ）は、配列番号４４に記載される。
ＩＭＧＴのナンバリングシステムによれば、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号４５に記載の配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号４６に記載の配列を有し、及び重鎖ＣＤＲ３は、配列番号４７の配列を有する。
軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）は、配列番号４８に記載の配列を有し、及びコードされたアミノ酸配列（１０７ａａ）は、配列番号４９に記載される。
ＩＭＧＴナンバリングシステムによれば、軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号５０に記載の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号５１に記載の配列を有し、及び軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号５２に記載の配列を有する。
１４Ｃ１２重鎖の４つのフレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ１からＦＲ－Ｈ４）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５３から配列番号５６に記載され；１４Ｃ１２軽鎖の４つのフレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ１からＦＲ－Ｈ４）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５７から配列番号６０に記載される。
ヒト化抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の設計及び調製
１．ヒト化抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の設計
ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖及び重鎖配列は、ＰＤ－１タンパク質の３次元結晶構造(Shinohara T, et al., Structure and chromosomal localization of the human PD-1 gene (PDCD1). Genomics 1995, 23 (3): 704-6)により設計され、そして実施例５で得た抗体１４Ｃ１２の配列を抗体モデルのコンピュータシミュレーション及びそのモデルに従って変異を設計することにより、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の可変領域配列を得た。
設計された可変領域配列は以下のとおりである：
ヒト化モノクローナル抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域１４Ｃ１２Ｈ１のヌクレオチド配列（３５４ｂｐ）は、配列番号６１に記載され、及びコードされたアミノ酸配列（１１８ａａ）は、配列番号６２に記載される。
ヒト化モノクローナル抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖可変領域１４Ｃ１２Ｌ１のヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）は、配列番号６３に記載され、及びコードされたアミノ酸配列（１０７ａａ）は、配列番号６４に記載される。
抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の定常領域は、ＮＣＢＩデータベース（重鎖定常領域は、Ｉｇγ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７；軽鎖定常領域は、Ｉｇκ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４）からのものである。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１重鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５及び６６に記載され、及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６７及び６８に記載される。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、本明細書及び中国特許出願第二０２１１０２７０６７１．Ｘにおいて１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＷＴ）としても知られており、ここで、Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、本明細書及び中国特許出願第二０２１１０２７０６７１．Ｘにおいて１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ（又は１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ）及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖ（又は１４Ｃ１２Ｌ１Ｖ）としても知られている。
２．ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の軽鎖及び重鎖配列の設計
実施例６のステップ１で得た１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１に基づいて、重鎖において位置２３４でロイシンからアラニンへの点突然変異（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５でロイシンからアラニンへの点突然変異（Ｌ２３５Ａ）、及び位置２３７でグリシンからアラニンへの点突然変異（Ｇ２３７Ａ）を導入することにより、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）を得た。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の重鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６９及び配列番号７０に記載される。軽鎖は１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１と同一である。
１４Ｃ１２Ｈ１の４つのフレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ１からＦＲ－Ｈ４）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７１～配列番号７４に設定する。
１４Ｃ１２Ｌ１軽鎖の４つのフレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ１からＦＲ－Ｈ４）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７５から配列番号７８に記載される。
３．ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の調製
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡをｐＵＣ５７単純（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社により提供）ベクターに別々にクローニングして、ｐＵＣ５７単純－１４Ｃ１２Ｈ１、ｐＵＣ５７単純－１４Ｃ１２Ｌ１及びｐＵＣ５７単純－１４Ｃ１２Ｈ１（ｈＧ１ＴＭ）を得た。Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition)に記載されている標準的な技術を参照して、ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩ消化により合成された重鎖及び軽鎖全長遺伝子を、制限酵素（ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩ）による消化を通して発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－１４Ｃ１２Ｈ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１４Ｃ１２Ｌ１及びｐｃＤＮＡ３．１－１４Ｃ１２Ｈ１（ｈＧ１ＴＭ）を得て、組換え発現プラスミドの重鎖／軽鎖遺伝子をさらに配列分析に供した。その後、対応する軽鎖及び重鎖組換えプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１－１４Ｃ１２Ｈ１（ｈＧ１ＴＭ）／ｐｃＤＮＡ３．１－１４Ｃ１２Ｌ１、及びｐｃＤＮＡ３．１－１４Ｃ１２Ｈ１／ｐｃＤＮＡ３．１－１４Ｃ１２Ｌ１）を含む設計された遺伝子の組み合わせを、２９３Ｆ細胞に別々にコトランスフェクトし、培養液を回収し精製した。配列を確認した後、エンドトキシンを含まない発現プラスミドを調製し、抗体発現のためにＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。７日後に培養液を回収し、タンパク質Ａカラムを介した親和性精製に供して、ヒト化抗体を得た。
抗ＰＤ－１／ＣＤ７３二機能性抗体の配列設計及び発現
１．配列設計
本明細書に記載された二機能性抗体の構造は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ形態（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、すなわち、ＩｇＧ抗体の２つの重鎖のＣ末端が、別の抗体のｓｃＦｖ断片にそれぞれ結合しており、重鎖及び軽鎖の主な組成設計を、以下の表１に示す。
Figure 2023522730000001
上記の表１では：
（１）右下に「Ｖ」の標識を有するものは、対応する重鎖の可変領域又は対応する軽鎖の可変領域を指す。「Ｖ」の標識のないものについては、対応する重鎖又は軽鎖は、定数領域を構成する全長である。上記の実施例に記載される対応する配列は、これらの可変領域又は全長のアミノ酸配列及びそれらをコードするヌクレオチド配列を指す。
（２）リンカー１のアミノ酸配列は、（ＧＧＧＧＳ）４（ヌクレオチド配列は、配列番号８０であり、及びアミノ酸配列は配列番号７９である）、及びリンカー２のアミノ酸配列は、（ＧＧＧＧＳ）３（ヌクレオチド配列は、配列番号８２であり、アミノ酸配列は、配列番号８１である）である。
２．抗体の発現及び精製
Ｐ１Ｄ７Ｖ０１の重鎖ｃＤＮＡ配列及び軽鎖ｃＤＮＡ配列は、ベクターｐＵＣ５７単純（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により提供）にそれぞれクローニングされ、プラスミドｐＵＣ５７単純－ＶＰ１０１Ｈ及びｐＵＣ５７単純－ＶＰ１０１Ｌをそれぞれ得た。
プラスミドｐＵＣ５７単純－ＶＰ１０１Ｈ及びｐＵＣ５７単純－ＶＰ１０１Ｌを酵素消化し（ＨｉｎｄＩＩＩ＆ＥｃｏＲＩ）、電気泳動により単離した重鎖及び軽鎖をベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞をコトランスフェクトした。７日間の細胞培養後、培養培地を高速の遠心分離により分離し、上清を濃縮してＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラムに負荷した。タンパク質は、溶出緩衝液で、１ステップで溶出した。標的サンプルを単離し、緩衝液をＰＢＳに交換した。
精製した抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０７及びＰ１Ｄ７Ｖ０８は上記のＰ１Ｄ７Ｖ０１の発現と精製法により得られた。
ＥＬＩＳＡによる抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の抗原への結合活性のためのアッセイ
１．ＥＬＩＳＡ法により測定した抗原ＰＤ－１－ｍＦｃに対するＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒの結合活性。前記測定法は、具体的には以下のとおりである：
マイクロプレートを０．５μg/mLのＰＤ－１－ｍＦｃでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコーティングしたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、次いでブロッキング溶液として１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液で、３７℃で２時間ブロックした。ブロッキングの後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で連続希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表２に示す）を加えた。試験抗体を含有するマイクロプレートを、３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄した後、１：５０００の比率で希釈したＨＲＰで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号０９－０３５－０８８）二次抗体希釈標準溶液を加え、次いでマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Neogen, 308177）を暗所で５分間加えて発色させ、次いで停止溶液を加えて発色反応を終了させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート内の各ウェルのＯＤ値を４５０nmで読み取った。データは、SoftMax Pro 6.2.1により分析及び処理した。
結果を表２及び図１に示す。図から、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒは、用量依存的に抗原ＰＤ－１－ｍＦｃに効果的に結合できることがわかる。各用量の吸光強度を表２に示す。結合した抗体の吸光度の定量的分析により、曲線フィッティングにより得た抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及びニボルマブ（対照として）の結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ０．０７８nM、０．０７８nM、０．０７５nM、０．０８９nM、０．０３３nM及び０．０５１nMであった。
上記の実験結果は、同一実験条件において、ＰＤ－１－ｍＦｃに対するＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒの結合活性が、同一標的に対する対照薬物１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及びニボルマブの結合活性と同等であることを示し、及びＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒが、ＰＤ－１－ｍＦｃに対して効果的に結合する活性を有することを示唆した。
Figure 2023522730000002
２．ＥＬＩＳＡにより測定した抗原ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに対するＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒの結合活性
マイクロプレートを２μg/mLのストレプトアビジンでコーティングし、次いで４℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、マイクロプレートブロッキング溶液として１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液で、３７℃で２時間ブロックした。ブロッキングの後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
その後、抗原ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチン ０．５μg/mLを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で連続希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表３に示す）をマイクロプレートのウェルに加えた。試験抗体を含有するマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄した後、１：５０００の比率で希釈したＨＲＰで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号０９－０３５－０８８）二次抗体希釈標準溶液を加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Neogen, 308177）を暗所で５分間加えて発色させ、次いで停止溶液を加えて発色反応を終了させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート内の各ウェルのＯＤ値を４５０nmで読み取った。データは、SoftMaxPro6.2.1により分析及び処理した。
結果を表３及び図２に示す。図から、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒは、用量依存的に抗原ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに効果的に結合できることがわかる。各用量の吸光強度を表３に示す。結合した抗体の吸光度の定量分析により、曲線フィッティングにより得た抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３及びＭＥＤＩ９４４７（対照抗体として）の結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ０．０６３nM、０．２３０nM、０．０６８nM、０．４３９nM、０．０４５nM及び０．０４２nMであった。
上記の実験結果は、同一の実験条件において、ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに対する二重特異性抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒの結合活性が、同一の標的に対する対照薬物１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３及びＭＥＤＩ９４４７の結合活性と同等であることを示し、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒが、ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに対して効果的に結合する活性を有することを示唆した。
Figure 2023522730000003
競合ＥＬＩＳＡにより測定したヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンに結合するためのヒトＰＤＬ－１－ｍＦｃで補完した抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の活性
マイクロプレートを２μg/mLのヒトＰＤＬ－１－ｍＦｃ（ＰＤＬ－１ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＰ５４８６２．１、ｍＦｃ、配列番号１４３）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、マイクロプレートを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で、３７℃で２時間ブロックした。ブロッキングの後、プレートを３回洗浄し乾燥した。抗体を１０μg/mLを出発濃度として、希釈プレート上で１：３の勾配比で７倍濃度まで連続希釈し、ブランクコントロールを設定した。その後、等量のヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチン溶液 ０．３μg/mLを加え、系をよく混合し、室温で２０分間インキュベートした。その後、反応後の混合物をコーティングしたマイクロプレートに加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥させた。ＳＡ－ＨＲＰ（KPL, 14-30-00）希釈標準溶液を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを４回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。その後、ＴＭＢ（Neogen, 308177）を暗所で５分間加えて発色させ、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。次にマイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート内の各ウェルのＯＤ値を４５０nmで読み取った。データはSoftMaxPro6.2.1により分析及び処理した。
結果を図３に示す。全投与量のＯＤ値を表４に示す。結合した抗体の吸光強度の定量分析により、曲線シミュレーションを行い、抗体の結合効率ＥＣ５０を与えた（表４）。
結果は、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及びニボルマブ（対照として）が、抗原ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンの、その受容体ヒトＰＤＬ－１－ｍＦｃに対する結合を、用量依存的に効果的にブロックすることができることを示した。ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンの、そのリガンドであるヒトＰＤＬ－１－ｍＦｃに対する結合を阻害する、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及びニボルマブのＥＣ５０値は、それぞれ１．１１５nM、１．３２９nM、１．１５４nM、１．３３９nM、１．４５９nM及び１．６９８nMであった。
Figure 2023522730000004
Ｆｏｒｔｅｂｉｏシステムにより測定された抗原ヒトＰＤ－１－ｍＦｃに対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の結合の速度論的パラメーター
サンプルの希釈緩衝液は、ＰＢＳＴ、０．１％ ＢＳＡ、pH ７．４であった。抗体を、５μg/mLの濃度で、約０．４nmの固定化高さでＡＨＣセンサー上に固定化した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡させ、０．６～５０nM（３倍希釈）の濃度でのセンサー上の固定化抗体の抗原ＰＤ－１－ｍＦｃとの結合を１２０秒間で測定した。タンパク質は、緩衝液中で１８０秒間解離した。検出温度は３７℃、検出周波数は０．３Hz、及びサンプルプレートの振動速度は１０００rpmであった。データを１：１のモデルフィッティングにより分析し、親和性定数を得た。
ヒトＰＤ－１－ｍＦｃに対するヒト化抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及びニボルマブ（対照抗体として）の親和性定数の測定結果を、表５に、検出結果を、図４、図５及び図６に示す。ヒトＰＤ－１－ｍＦｃに対するヒト化抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及びニボルマブの親和性定数は、それぞれ１．７６Ｅ－１０Ｍ、１．６４Ｅ－１０Ｍ及び２．３２Ｅ－１０Ｍであった。以上の実験結果は、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１の結合能力が、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及びニボルマブの結合能力と同等であり、ヒト化抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１がヒトＰＤ－１－ｍＦｃに対してより強い結合能力を有することを示唆した。
Figure 2023522730000005
Ｆｏｒｔｅｂｉｏシステムにより測定した抗原ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）ｈｉｓに対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の結合の速度論的パラメーター
サンプルの希釈緩衝液は、ＰＢＳＴ、pH ７．４であった。抗体を、タンパク質Ａセンサー上に５μg/mLの濃度で約１５秒の固定時間で固定化した。センサーを緩衝液中で１２０秒間平衡させ、３．１２５～２００nM(二倍希釈）の濃度で、抗原ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するセンサー上に固定化した抗体の結合を１２０秒間測定した。タンパク質を、緩衝液中で６００秒間解離した。センサーを、pH １．５の１０mM Ｇｌｙ溶液でリフレッシュした。検出温度は３７℃、検出周波数は０．６Hz、サンプルプレートの振動速度は１０００rpmであった。データを１：１モデルフィッティングにより分析して親和性定数を得た。
ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するヒト化抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１及びＭＥＤＩ９４４７（対照抗体）の親和性定数の測定結果を表６に示し、検出結果を図７及び図８に示す。ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するヒト化抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１及びＭＥＤＩ９４４７の親和性定数は、それぞれ２．２９Ｅ－１０Ｍ及び１．０４Ｅ－１０Ｍである。
上記の実験結果は、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１の結合能力が、ＭＥＤＩ９４４７の結合能力と同等であり、ヒト化抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１が、ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対してより強い結合能力を有することを示唆した。
Figure 2023522730000006
ＦＡＣＳにより測定した抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の結合活性
１．ＦＡＣＳにより測定した２９３Ｔ－ＰＤ１膜表面上のＰＤ－１に対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の結合活性
対数増殖相における２９３Ｔ－ＰＤ１細胞を回収し、１．５mLの遠心管に管あたり３×１０５細胞で移した。ＰＢＳＡ ５００μLを加え、混合物を５６００rpmで５分間遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＳＡ（１００nM、３３．３３nM、１１．１１nM、３．７nM、１．２３nM、０．４１nM、０．１４nM、０．０５nMの最終濃度）で希釈した抗体１００μLをそれぞれ加えた。系を穏やかに均一に混合し、次いで氷上で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＡ ５００μLを加え、混合物を５６００ｒpmで５分間遠心して上清を除去した。５００倍に希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（(Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－０９５－０９８）を加えて、再懸濁し、よく混合して、暗所で、氷上で０．５時間インキュベートした。ＰＢＳＡ ５００μLを加え、混合物を５６００rpmで５分間遠心分離して上清を除去した。最後にＰＢＳＡ ２００μLを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、混合物をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ検出用のフローチューブに移した。
実験結果を表７及び図９に示し、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒは、用量依存的に２９３Ｔ－ＰＤ１膜表面上のＰＤ－１に対して特異的に結合することができ、ＰＤ１単一標的対照抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１と比較して、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の結合よりも強い。
同一の実験条件下で、２９３Ｔ－ＰＤ１に結合するＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４ＲのＥＣ５０値は、それぞれ１．０００nM、１．０７５nM、１．３７７nM、１．５７nMであり、２９３Ｔ－ＰＤ１に結合する１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＥＣ５０値は２．１１１nMであった。
上記の実験結果は、同一の実験条件下で、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、Ｐ１Ｄ７Ｖ０４Ｒ及び２９３Ｔ－ＰＤ１は、いずれもＰＤ１単一標的対照抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１よりも優れた結合活性を有し、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒが、２９３Ｔ－ＰＤ１膜表面上のＰＤ－１に効果的に結合する活性を有することを示唆した。
Figure 2023522730000007
２．ＦＡＣＳにより測定したＭＤＡ－ＭＢ－２３１膜表面上のＣＤ７３に対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の結合活性
対数相におけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を通常のトリプシンで消化し、１．５mLの遠心管に管あたり３×１０５で移した。ＰＢＳＡ ５００μLを加え、混合物を５６００rpmで５分間遠心分離して上清を除去した。ＰＢＳＡ（１００nM、３３．３３nM、１１．１１nM、３．７nM、１．２３nM、０．４１nM、０．１４nM、０．０５nMの最終濃度）でそれぞれ希釈した抗体 １００μLを加えた。系を穏やかに均一に混合し、氷上で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＡ ５００μLを加え、５６００rpmで５分間遠心して上清を除去した。５００倍に希釈したＦＩＴＣで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－０９５－０９８）を加えて再懸濁しよく混合し、混合物を暗所で、氷上で０．５時間インキュベートした。ＰＢＳＡ ５００μLを加え、５６００rpmで５分間遠心分離して上清を除去した。最後にＰＢＳＡ ２００μLを加えて細胞沈殿物を再懸濁し、混合物をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ検出用のフローチューブに移した。
実験結果は表８及び図１０に示すとおりである。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１膜表面上のＣＤ７３に対するＰ１Ｄ７Ｖ０１及びＰ１Ｄ７Ｖ０３の結合活性は、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の結合活性よりも優れており、ここでＰ１Ｄ７Ｖ０１は、同一の標的に対して対照薬物ＭＥＤＩ９４４７よりも優れていた。同一の実験条件では、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１膜表面上のＣＤ７３に結合するＰ１Ｄ７Ｖ０１及びＰ１Ｄ７Ｖ０３のＥＣ５０値は、それぞれ１．３８４nM及び２．００９nMであり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１膜表面上のＣＤ７３に結合するＭＥＤＩ９４４７及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３のＥＣ５０値は、それぞれ１．５８９nM及び２．７７３nMであった。
上記の実験結果は、同一標的に対するＰ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３及び対照薬物ＭＥＤＩ９４４７は、用量依存的にＭＤＡ－ＭＢ－２３１膜表面上のＣＤ７３に特異的に結合できることを示した。Ｐ１Ｄ７Ｖ０１及びＰ１Ｄ７Ｖ０３の結合活性は、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の結合活性よりも優れており、ここでＰ１Ｄ７Ｖ０１は、同一の標的に対して対照薬物ＭＥＤＩ９４４７よりも優れていた。Ｐ１Ｄ７Ｖ０１及びＰ１Ｄ７Ｖ０３は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１膜表面上のＣＤ７３に効果的に結合する活性を有することを示唆した。
Figure 2023522730000008
細胞膜表面上のＣＤ７３の酵素活性に対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の阻害の検出
１．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１膜表面上のＣＤ７３の酵素活性に対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の阻害の検出
実験手順は以下の通りである。対数相におけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を良好な状態で取り出し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培養液中に再懸濁し、次いで計数した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１ウェルあたり２×１０４細胞／１００μLで９６ウェルプレートに播種した。抗体を無血清ＲＰＭＩ－１６４０培養液で希釈した（連続２．５倍希釈）。９６ウェルプレートに抗体をウェルあたり５０μLで加えて、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。１時間後に、１２００μMのＲＰＭＩ－１６４０で希釈したＡＭＰ（ＴＣＬ、カタログ番号Ａ０１５７）の５０μLを各ウェルに加えた。３時間後に、細胞培養上清 ２５μLを取り出して新しい９６ウェルプレートに移し、１００μM ＡＴＰ（(ＴＣＬ、カタログ番号Ａ０１５８）の２５μLを各ウェルに加えた。各ウェルに５０μLのＣＴＧ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ， ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ８６４１）発色溶液を加えて発色させ、マルチラベルマイクロプレートテスター(PerkinElmer 2140-0020)により相対蛍光強度ＲＬＵを読み取った。
実験結果は、図１１に示すとおりである。Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４ＲのＡＭＰ量は、濃度依存的にポジティブコントロールＭＥＤＩ９４４７のＡＭＰ量と同等である。
上記の実験結果は、加えたＡＭＰが、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞表面上のＣＤ７３の酵素活性により、抗体なしでアデノシンＡに変換でき、抗体を加えた後、抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４ＲのＣＤ７３への結合性のために、酵素触媒活性が低下し、その結果ＡＭＰがアデノシンＡに変換されないことを示す。抗体は、非基質競合モードでその酵素活性反応を効果的に阻害し、アデノシンの産生を減少させることが示唆された。
２．Ｕ８７－ＭＧ膜表面上のＣＤ７３の酵素活性に対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の阻害の検出
良好な状態の対数相におけるＵ８７－ＭＧ細胞を取り出し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培養液に再懸濁し、次いで計数した。Ｕ８７－ＭＧ細胞を、ウェルあたり２×１０４細胞／１００μLで９６ウェルプレートに播種した。抗体を無血清ＲＰＭＩ－１６４０培養液で希釈した（連続２．５倍希釈）。抗体を、１ウェルあたり５０μLで９６ウェルプレートに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。１時間後に、１２００μMのＲＰＭＩ－１６４０で希釈したＡＭＰ ５０μLを各ウェルに加えた。３時間後に、細胞培養上清 ２５μLを取り出して新しい９６ウェルプレートに移し、１００μMのＡＴＰ ２５μLを各ウェルに加えた。各ウェルにＣＴＧ（CellTiterGlo）発色溶液 ５０μLを加えて発色させ、マルチラベルマイクロプレートテスター(PerkinElmer 2140-0020)により相対蛍光強度ＲＬＵを読み取った。
実験結果は図１２に示すとおりである。Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４ＲのＡＭＰ量は、濃度依存的にポジティブコントロールＭＥＤＩ９４４７のＡＭＰ量と同等である。
上記の実験結果は、加えたＡＭＰが、Ｕ８７－ＭＧ細胞表面上のＣＤ７３の酵素活性により、抗体なしでアデノシンＡに変換でき、抗体を加えた後、抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４ＲがＣＤ７３に結合したために、酵素触媒機能が低下し、その結果ＡＭＰがアデノシンＡに変換されないことを示す。抗体は、非基質競合モードでその酵素活性反応を効果的に阻害し、アデノシンの産生を減少させることが示唆された。
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）により測定したＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性
１．Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１混合リンパ球反応系におけるＩＦＮ－γ分泌を促進のための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を、通常どおり継代培養した。ＰＢＭＣを解凍し、１６４０完全培地 １０mLでインキュベートし、０．５μg/mLのＳＥＢ（Ｄｉａｎｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ｓ０１０２０１）で２日間刺激した。Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を２５μg/mLのＭＭＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ４２８７）で処理し、３７℃のインキュベーター内に１時間置いた。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、完全な培地中に再懸濁し、計数した。細胞を、ウェルあたり１０万細胞でＵ字型の９６ウェルプレートに別々に加えた。研究設計に従って、抗体を加え、インキュベーター中で３日間培養した。３日後、細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ－γを測定した。
図１３に示すように、ヒトＰＢＭＣ及びＲａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞の混合培養は、ＰＢＭＣからのＩＦＮ－γの分泌を有意に促進し、混合培養系への抗体の添加は、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮ－γの分泌を有意に誘導した。ＩＦＮ－γ分泌活性を促進するレベルの点では、抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒは、親ＰＤ－１単一標的抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の活性と同等の活性を有する。
２．Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１混合リンパ球反応系におけるＩＬ－２分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を、通常どおり継代培養した。ＰＢＭＣを解凍し、１６４０完全培地 １０mLでインキュベートし、ＳＥＢ（０．５μg/mL）で２日間刺激した。Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を２５μg/mLのＭＭＣで処理し、３７℃のインキュベーターに１時間置いた。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、完全な培地中に再懸濁し、計数した。細胞を、ウェルあたり１０万細胞でＵ字型の９６ウェルプレートに別々に加えた。研究設計に従って、抗体を加え、３日間培養した。細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ－γを測定した。
図１４に示すように、ヒトＰＢＭＣ及びＲａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞の混合培養は、ＰＢＭＣにおけるＩＬ－２の分泌に特定の促進効果を有し、混合培養系に対する抗体の同時添加は、著しく用量依存的にＰＢＭＣにおけるＩＬ－２の分泌を有意に誘導した。ＩＬ－２の分泌活性を促進するレベルの点では、二機能性抗体Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒは、低濃度では、親ＰＤ－１単一標的抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の活性よりもわずかに低い活性を有し、中高濃度では、親ＰＤ－１単一標的抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の活性と同等の活性を有する。ＰＤ１標的ポジティブコントロール薬物ニボルマブと比較して、Ｐ１Ｄ７Ｖ０１、Ｐ１Ｄ７Ｖ０２Ｒ、Ｐ１Ｄ７Ｖ０３及びＰ１Ｄ７Ｖ０４Ｒは、３つの異なる抗体濃度レベルで、高いＩＬ－２分泌促進能を有する。
３．ＤＣ混合リンパ反応系を促進してＩＦＮ－γを分泌する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性検出
正常ヒト末梢血中のＰＢＭＣを単離し、完全な培地中に再懸濁し、培養皿に播種した。培養皿を培養のために一晩インキュベーター内に置いた。懸濁したＰＢＭＣを回収し、除去した。皿の底の付着細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次いでＤＣ成熟誘導を行った。ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４をそれぞれ１０００U/mLの濃度で含有する、ＲＰＭＩ－１６４０完全培地１０mLを、各皿に加えた。皿を３７℃、５％二酸化炭素のインキュベーター中で３日培養した。その後、培地の半分を交換し、１０００U/mLのＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４をそれぞれ加え、皿を３７℃、５％二酸化炭素培養器に入れ、３日連続培養した。３日後に、再び培地の半量を交換し、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４をそれぞれ１０００U/mL、及びＴＮＦ－αを１００U/mL加え、皿をさらに２日間培養した。他のドナーからのＰＢＭＣを新たに単離し、細胞数を計数した後にウェルあたり１０万細胞で９６ウェルプレートに播種した。成熟に誘導されたＤＣを回収し、完全な培地で１回洗浄した。細胞を計数し、ＰＢＭＣを含む９６ウェルプレートにウェルあたり１万細胞で播種した。研究設計に従って、抗体を加えた。系をよく混合し、３７℃、５％二酸化炭素のインキュベーター中で５日間培養して共培養を行った。５日後、細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ－γを定量した。
結果を図１５に示す。ＤＣ又はＰＢＭＣ単独の培養と比較して、ＤＣとＰＢＭＣの混合培養は、ＩＦＮ－γの分泌を有意に促進し；及びアイソタイプコントロールと比較して、ＤＣとＰＢＭＣの混合培養に基づく抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の添加により、ＩＦＮ－γ分泌レベルがさらに有意に改善された。
ＤＣ混合リンパ球反応系におけるＩＬ－２分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性
正常ヒト末梢血中のＰＢＭＣを単離し、完全な培地中に再懸濁して、培養皿に播種した。培養皿を培養のために一晩インキュベーター内に置いた。懸濁したＰＢＭＣを回収し、除去した。皿の底部の付着細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次いでＤＣ成熟誘導に供した。ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４をそれぞれ２０００U/mLの濃度で含有する、ＲＰＭＩ－１６４０完全培地 １０mLを、各皿に加えた。皿を３７℃、５％二酸化炭素のインキュベーター中で３日間培養した。その後、培地の半量を交換し、５０ng/mLのＩＦＮ－γ及び１００ng/mLのＬＰＳを加え、さらに２日培養した。他のドナーからのＰＢＭＣを解凍し、細胞数を計測した後にウェルあたり１０万細胞で９６ウェルプレートに播種した。成熟に誘導されたＤＣを回収し、完全な培地で１回洗浄した。細胞を計数し、ＰＢＭＣをウェルあたり１万細胞含有する９６ウェルプレートに播種した。研究設計に従って、抗体を加えた。系をよく混合し、３７℃、５％二酸化炭素インキュベーター中で５日間培養して共培養した。５日後、細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ－２を定量した。結果を図１６に示す。ＤＣ又はＰＢＭＣ単独の培養と比較して、ＤＣとＰＢＭＣの混合培養はＩＬ－２の分泌を有意に促進し；及びアイソタイプコントロールと比較して、ＤＣとＰＢＭＣの混合培養に基づいた抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の添加により、ＩＬ－２分泌レベルがさらに有意に改善した。
抗ＰＤ－１／ＣＤ７３二重特異性抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の調製
二重特異性抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の構造パターンは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）で存在する、すなわち、１つのＩｇＧ抗体の２つの重鎖のＣ末端は、リンカーを介して別の抗体のｓｃＦｖ断片に別々に連結されている。重鎖及び軽鎖設計の構成要素を以下の表９に示す。
ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４は、これらの免疫グロブリン部分の定常領域がそのＦｃγＲに対する結合活性を排除するようにアミノ酸変異を導入しているため、本明細書及び中国特許出願第２０２１１０２７０６７１．Ｘ号では、ＮＴＰＤＶ１（ｈＧ１ＴＭ）、ＮＴＰＤＶ２（ｈＧ１ＴＭ）、ＮＴＰＤＶ３（ｈＧ１ＴＭ）及びＮＴＰＤＶ４（ｈＧ１ＴＭ）として知られている。
Figure 2023522730000009
上記の表９では：
右下に「Ｖ」の標識があるものは、対応する重鎖の可変領域又は対応する軽鎖の可変領域を指す。「Ｖ」標識のないものについては、対応する重鎖又は軽鎖は、定常領域を含む全長である。上記の実施例に記載の対応する配列は、これらの可変領域又は全長のアミノ酸配列、及びそれらをコードするヌクレオチド配列について参照される。
リンカー１のアミノ酸配列は（ＧＧＧＧＳ）、すなわち（ＧＧＧＧＳ）４又は（Ｇ４Ｓ）４（ヌクレオチド配列の配列番号８０及びアミノ酸配列の配列番号７９）の４つの繰り返しからなる。
リンカー２のアミノ酸配列は（ＧＧＧＧＳ）、すなわち（ＧＧＧＧＳ）４又は（Ｇ４Ｓ）３（ヌクレオチド配列の配列番号８２及びアミノ酸配列の配列番号８１）の３つの繰り返しからなる。
ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４における免疫グロブリン部分の軽鎖１９Ｆ３Ｌ２及び１９Ｆ３Ｌ３の３つのＣＤＲ配列は、１９Ｆ３の軽鎖ＣＤＲ配列と同一である。
ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４における免疫グロブリン部分の１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＴＭ）の３つのＣＤＲ配列は、１９Ｆ３の重鎖ＣＤＲ配列と同一である。
ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４におけるｓｃＦｖ部分の１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー２－１４Ｃ１２Ｌ１Ｖ及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー１－１４Ｃ１２Ｌ１ＶのＣＤＲ配列は、１４Ｃ１２の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲと同一である。
ＮＴＰＤＶ２及びＮＴＰＤＶ４の重鎖のアミノ酸配列は同一であり、ＮＴＰＤＨ２／４（配列番号８３）としてマークされ、ＮＴＰＤＶ２又はＮＴＰＤＶ４の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号８４である。
ＮＴＰＤＶ１及びＮＴＰＤＶ３の重鎖のアミノ酸配列は同一であり、ＮＴＰＤＨ１／３（配列番号８５）としてマークされ、ＮＴＰＤＶ１又はＮＴＰＤＶ３の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号８６である。
ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４における免疫グロブリン部分の１９Ｆ３Ｌ３及び１９Ｆ３Ｌ２の３つのＣＤＲ配列は、抗体１９Ｆ３の軽鎖の３つのＣＤＲと同一である。
ＮＴＰＤＶ１又はＮＴＰＤＶ２における免疫グロブリン部分の軽鎖１９Ｆ３Ｌ３のアミノ酸配列は、抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（Ｇ１Ｍ）の軽鎖配列（配列番号２８）と同一であり、ＮＴＰＤＶ１又はＮＴＰＤＶ２における免疫グロブリン部分の軽鎖１９Ｆ３Ｌ３のヌクレオチド配列は、配列番号２７である。ＮＴＰＤＶ３又はＮＴＰＤＶ４における免疫グロブリン部分の軽鎖１９Ｆ３Ｌ２のアミノ酸配列は、配列番号９６であり、ＮＴＰＤＶ３又はＮＴＰＤＶ４における免疫グロブリン部分の軽鎖１９Ｆ３Ｌ２のヌクレオチド配列は、配列番号１００である。
（１）ＮＴＰＤＶ１は、その重鎖が配列番号８５記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１が配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖが配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー２が配列番号８１に記載のアミノ酸配列を有し、及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖが配列番号６８記載のアミノ酸配列を有し；
（２）ＮＴＰＤＶ２は、その重鎖が配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１が配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖが配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１が配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖが配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有し；
（３）ＮＴＰＤＶ３は、その重鎖が配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号９６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１が配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖが配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー２が配列番号８１に記載のアミノ酸配列を有し、及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖが配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有し；及び
（４）ＮＴＰＤＶ４は、その重鎖が配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号９６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１が配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖが配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１が配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖが配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有する。
抗体の発現及び精製
ＮＴＰＤＶ１及びＮＴＰＤＶ３の重鎖ｃＤＮＡ配列、ＮＴＰＤＶ２及びＮＴＰＤＶ４の重鎖ｃＤＮＡ配列、及びその軽鎖ｃＤＮＡ配列をベクターｐＵＣ５７単純（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により提供）に別々にクローニングして、それぞれプラスミドｐＵＣ５７単純－ＮＴＰＤＨ２／４、ｐＵＣ５７単純－ＮＴＰＤＨ１／３、ｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ３及びｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ２を得た。
プラスミドｐＵＣ５７単純－ＮＴＰＤＨ２／４及びプラスミドｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ３、プラスミドｐＵＣ５７単純－ＮＴＰＤＨ２／４及びプラスミドｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ２、プラスミドｐＵＣ５７単純－ＮＴＰＤＨ１／３及びプラスミドｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ３、及びプラスミドｐＵＣ５７単純－ＮＴＰＤＨ１／３及びプラスミドｐＵＣ５７単純－１９Ｆ３Ｌ２を消化した（ＨｉｎｄＩＩＩ＆ＥｃｏＲＩ）。回収した重鎖及び軽鎖を別々にベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＮＴＰＤＨ２／４及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＮＴＰＤＨ２／４及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＮＴＰＤＨ１／３及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３、及びプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＮＴＰＤＨ１／３及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２を得た。組換えプラスミドを抽出し、２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。７日間の細胞培養後、培地を高速での遠心分離により分離し、上清を濃縮してＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラムに負荷した。タンパク質を溶出緩衝液で１ステップで溶出した。標的サンプルを単離し、緩衝液をＰＢＳに交換した。
精製した抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４は、上記調製の実施例で述べた発現方法及び精製方法に従って得た。
ＥＬＩＳＡによる抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の抗原に対する結合活性のためのアッセイ
１．ＥＬＩＳＡにより測定したＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の抗原ＰＤ－１－ｍＦｃに対する結合活性
マイクロプレートをＰＤ－１－ｍＦｃ（０．５μg/mL）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコーティングしたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、次いでブロッキング溶液として１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液で、３７℃で２時間ブロックした。ブロッキングの後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で連続希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表２に示す）を加えた。試験抗体を含有するマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次にＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の比率で希釈したＨＲＰ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－０３５－０９８）二次抗体希釈標準溶液を加え、次いでマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Neogen, 308177）を暗所で８分間加えて発色させ、次に停止溶液を加えて発色反応を終了させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート内の各ウェルのＯＤ値を４５０nmで読み取った。データはSoftMaxPro6.2.1により分析及び処理した。
結果を表１０に示す。ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４は、用量依存的に抗原ＰＤ－１－ｍＦｃに効果的に結合できることがわかる。各用量の吸光強度を表１０に示す。結合した抗体の吸光度の定量分析により、曲線フィッティングにより得た抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３、ＮＴＰＤＶ４及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）（対照として）の結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ０．１０１nM、０．１１９nM、０．１１０nM、０．１２３nM及び０．０３１nMであった。
上記の実験結果は、同一実験条件において、ＰＤ－１－ｍＦｃに対するＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の結合活性が、同一標的に対する対照薬物１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の活性と同等であり、ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４がＰＤ－１－ｍＦｃに対して有効に結合する活性を有することを示唆した。
Figure 2023522730000010
２．ＥＬＩＳＡにより測定した抗原ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに対するＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の結合活性を
マイクロプレートをストレプトアビジンＳＡ（２μg/mL）でコーティングし、次いで４℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、マイクロプレートブロッキング液として１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液で、３７℃で２時間ブロッックした。ブロッキングの後、マイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、抗原ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチン ０．５μg/mLを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で連続希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表１１に示す）をマイクロプレートのウェルに加えた。試験抗体を含有するマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄した後、１：５０００の比率で希釈したＨＲＰ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－０３５－０９８）二次抗体希釈標準溶液を加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ, 308177）を暗所で７分間加えて発色させ、次いで停止溶液を加えて発色反応を終了させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート内の各ウェルのＯＤ値を４５０nmで読み取った。データは、SoftMaxPro6.2.1により分析及び処理した。
結果を表１１に示す。ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３、ＮＴＰＤＶ４及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）は、用量依存的に抗原ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに対して効果的に結合できることがわかる（各用量の吸光強度度を表１１に示す）。結合した抗体の吸光度の定量分析により、曲線フィッティングにより得た抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３、ＮＴＰＤＶ４及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）（対照抗体として）の結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ０．０７９nM、０．０８２nM、０．０８４nM、０．０７７nM及び０．０２９nMであった。
上記の実験結果は、同一の実験条件でヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに対する二重特異性抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の結合活性が、同一の標的に対する対照薬物１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）の結合活性と同等であることを示し、ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４が、ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに効果的に結合する活性を有することを示唆した。
Figure 2023522730000011
競合的ＥＬＩＳＡにより測定したヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンに結合するための、ヒトＰＤＬ－１－ｍＦｃで補完した抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の活性
マイクロプレートを２μg/mLのヒトＰＤＬ－１－ｍＦｃ（ＰＤＬ－１、ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＰ５４８６２．１、ｍＦｃ配列番号８９）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、マイクロプレートを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で３７℃で２時間ブロックした。ブロッキングの後、プレートを一度洗浄して乾燥した。抗体を１０μg/mLを出発濃度として希釈プレート上で１：３の勾配比で７濃度まで連続希釈し、ブランクコントロールを設定した。その後、等量のヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチン溶液０．３μg/mLを加え、系をよく混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後、反応後の混合物をコーティングしたマイクロプレートに加え、マイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥させた。ＳＡ－ＨＲＰ（KPL, 14-30-00）希釈標準溶液を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを４回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。その後、ＴＭＢ（Neogen, 308177）を暗所で５分間加えて発色させ、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。その後、マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーに入れ、マイクロプレート内の各ウェルのＯＤ値を４５０nmで読み取った。データはSoftMaxPro6.2.1により分析及び処理した。
全容量のＯＤ値を表１２に示す。結合した抗体の吸光強度の定量分析により、曲線シミュレーションを行い、抗体の結合効率ＥＣ５０を与えた（表１２）。
その結果は、ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３、ＮＴＰＤＶ４及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）（対照として）は、用量依存的に抗原ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンの、その受容体ヒトＰＤＬ－１－ｍＦｃに対する結合を効果的にブロックできることを示した。ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンの、そのリガンドであるヒトＰＤＬ－１－ｍＦｃに対する結合をブロッキングするためのＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３、ＮＴＰＤＶ４及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）のＥＣ５０値は、それぞれ２．２４９nM、２．２５３nM、２．３３２nM、２．３９８nM、２．２１６nM及び２．２３１nMであった。
Figure 2023522730000012
Ｆｏｒｔｅｂｉｏシステムにより測定した抗原ヒトＰＤ－１－ｍＦｃに対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の結合のための速度論的パラメーター
サンプル希釈緩衝液は、ＰＢＳ（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡ、pH ７．４）であった。ＰＤ１－ｍＦｃを、約０．１nM（時間６０ｓ）の固定化高さで、５μg/mLの濃度でＡＭＣセンサーに固定化した。センサーを６０秒間緩衝液中で平衡させ、０．６２～５０nM（三倍希釈）の濃度で、抗体に対するセンサー上に固定化したＰＤ１－ｍＦｃの結合を１２０秒間測定した。タンパク質を緩衝液中で３００秒間解離した。検出温度は３０℃であり、検出周波数は０．３Hzであり、サンプルプレートの振動速度は１０００rpmであった。データを１：１モデルフィッティングにより分析して親和性定数を得た。
ヒトＰＤ－１－ｍＦｃに対するヒト化抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３、ＮＴＰＤＶ４及びニボルマブ（対照抗体として）の親和性定数の測定結果を表１３に示し、検出結果を図１９、２０、２１、２２及び１８に示す。ヒトＰＤ－１－ｍＦｃに対するヒト化抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３、ＮＴＰＤＶ４及びニボルマブの親和性定数は、それぞれ１．４０Ｅ－１０Ｍ、７．３９Ｅ－１１Ｍ、１．２５Ｅ－１０Ｍ、１．１３Ｅ－１１Ｍ及び２．２６Ｅ－１０Ｍであった。上記の実験結果は、ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ３及びニボルマブの結合能力は、同等であり、ＮＴＰＤＶ２及びＮＴＰＤＶ４の結合能力は、ニボルマブの結合能力よりも優れていることを示し、ヒト化抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４が、ヒトＰＤ－１－ｍＦｃに対してより強い結合能力を有することを示唆した。
Figure 2023522730000013
Ｆｏｒｔｅｂｉｏシステムにより測定した抗原ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の結合の速度論的パラメーター
サンプル希釈緩衝液は、ＰＢＳ（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡ、pH ７．４）であった。ＨＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓを、約０．４nM（時間５０ｓ）の固定化高さで、５μg/mLの濃度でＨＩＳ１Ｋセンサー上に固定化した。センサーを６０秒間緩衝液中で平衡させ、０．３１～２５nM（三倍希釈）の濃度で、抗体に対するセンサー上に固定化したＨＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓの結合を１００秒間測定した。タンパク質は緩衝液中で１８０秒間解離した。検出温度は３０℃であり、検出周波数は０．３Hzであり、サンプルプレートの振動速度は１０００rpmであった。データを１：１モデルフィッティングで分析して、親和性定数を得た。
ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）（対照抗体として）、ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の親和性定数の測定結果を表１４に示し、検出結果を図２４～２７に示す。ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対するヒト化抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の親和性定数はそれぞれ３．２９Ｅ－１１Ｍ、２．８８Ｅ－１１Ｍ、７．９２Ｅ－１１Ｍ及び５．７７Ｅ－１１Ｍであった。
以上の実験結果は、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）、ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４の結合能力は同等であり、ヒト化抗体ＮＴＰＤＶ１、ＮＴＰＤＶ２、ＮＴＰＤＶ３及びＮＴＰＤＶ４が、ヒトＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓに対して強い結合能力を有することを示唆した。
Figure 2023522730000014
Ｕ８７－ＭＧ細胞膜表面上のＣＤ７３の酵素活性に対する抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の阻害の検出
良好な状態の対数相におけるＵ８７－ＭＧ細胞を取り出し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培養液に再懸濁し、次いで計数した。Ｕ８７－ＭＧ細胞を、１ウェルあたり２．５×１０４細胞／６０μLで９６ウェルプレートに播種した。研究設計に従って、抗体を、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培養液で希釈した。抗体を、ウェルあたり６０μLで９６ウェルプレートに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、６００μMのＲＰＭＩ－１６４０で希釈したＡＭＰの６０μLを各ウェルに加えた。３時間後、１００μLの細胞培養上清を取り出して新しい９６ウェルプレートに移し、４０μLのＣＴＧ（CellTiterGlo）発色溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で５分間暗所に置いた。５分後、３００μMのＡＴＰ １０μLを、各ウェルに加えて発色させた。相対蛍光強度ＲＬＵは、マルチラベルマイクロプレートテスター（PerkinElmer 2140-0020）により読み取った。
実験結果は表１５及び図２８に示すとおりであり、ＮＴＰＤＶ２のＡＭＰ量は、ポジティブコントロールＭＥＤＩ９４４７のＡＭＰ量と同等である。
上記の実験結果は、加えたＡＭＰが、Ｕ８７－ＭＧ細胞表面上のＣＤ７３の酵素活性により、抗体なしでアデノシンＡに変換でき、抗体を加えた後、抗体ＮＴＰＤＶ２がＣＤ７３に結合したために、酵素触媒機能が低下し、その結果ＡＭＰが、アデノシンＡに変換されないことを示し、抗体が、非基質競合モードでその酵素活性反応を効果的に阻害し、アデノシンの産生を減少させることを示唆した。
Figure 2023522730000015
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）により測定されるＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性
１．Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１混合リンパ球反応系におけるＩＦＮ－γ分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を、通常どおり継代培養した。ＰＢＭＣを解凍し、１６４０完全培地１０mLでインキュベートし、０．５μg/mLのＳＥＢ（Ｄｉａｎｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ｓ０１０２０１）で二日間刺激した。Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を、２５μg/mLのＭＭＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ， Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ、カタログＳＩＨ－２４６、カタログ番号ＳＭ２８６４７４）で処理し、３７℃のインキュベーターに１時間置いた。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、完全な培地中に再懸濁して、計数した。細胞を、ウェルあたり１×１０５細胞でＵ字型の９６ウェルプレートに別々に加えた。研究設計に従って、抗体を加え、インキュベーター中で３日間培養した。３日後、細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ－γを測定した。
図２９に示すように、ヒトＰＢＭＣ及びＲａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞の混合培養は、ＰＢＭＣからのＩＦＮ－γの分泌を有意に促進し、混合培養系への抗体の添加は、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮ－γの分泌を有意に誘導した。ＩＦＮ－γの分泌活性を促進するレベルの点では、抗体ＮＴＰＤＶ２は、親ＰＤ－１単一標的抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の活性と同等の活性を有する。
２．Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１混合リンパ球反応系におけるＩＬ－２分泌を促進するための抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体の生物活性
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を、通常どおり継代培養した。ＰＢＭＣを解凍し、１６４０完全培地 １０mLでインキュベートし、ＳＥＢ（０．５μg/mL）で二日間刺激した。Ｒａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を２５μg/mLのＭＭＣで処理し、３７℃のインキュベーター内に１時間置いた。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、完全な培地中に再懸濁し、計数した。細胞を、ウェルあたり１×１０５細胞でＵ字型の９６ウェルプレートに別々に加えた。研究設計に従って、抗体を加え、３日間培養した。細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ－２を測定した。
図２９に示すように、ヒトＰＢＭＣ及びＲａｊｉ－ＰＤＬ－１細胞の混合培養はＰＢＭＣからのＩＬ－２の分泌に特定の促進効果を有し、混合培養系への抗体の同時添加は、著しく用量依存的にＰＢＭＣにおけるＩＬ－２の分泌を有意に誘導した。ＩＬ－２の分泌活性の促進レベルの点では、二機能性抗体ＮＴＰＤＶ２は、低濃度では、親ＰＤ－１単一標的抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の活性と同等の活性を有し、中高濃度では、親ＰＤ－１単一標的抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の活性よりもわずかに低い活性を有する。
抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異抗体によるインビボでの腫瘍増殖の阻害実験
抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体のインビボでの抗腫瘍活性を測定するために、まず、ＭＣ３８－ｈＰＤＬ－１／ｈＣＤ７３細胞（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より）を５～７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ６－ｈＰＤ１ｈＰＤＬ－１ｈＣＤ７３トリプルトランスジェニックマウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より）に皮下接種した。モデリング及び具体的な投与方法を表１６に示す。投与後、各群の腫瘍の長さ及び幅を測定し、腫瘍体積を計算した。
Figure 2023522730000016
実験結果は図３０及び図３１に示すとおりである。結果は、アイソタイプコントロール抗体ｈＩｇＧ及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１Ｍ）と比較して、異なる用量のＮＴＰＤＶ２は、マウス腫瘍の増殖を効果的に阻害することができ、腫瘍の阻害において、高用量のＮＴＰＤＶ２は、低用量のＮＴＰＤＶ２よりも優れていることを示した。また、ＮＴＰＤＶ２は、担癌マウスの体重に影響を与えなかった。
Ｆｃセグメントのアミノ酸変異によるヒトマクロファージにおける二重特異性免疫チェックポイントインヒビターＰＤ－１／ＣＤ７３二重特異性抗体媒介性ＩＬ－８及びＩＬ－６分泌の効果的な除去
ＨＰＭＭは、ＰＢＭＣの誘導により調製した。この研究で使用されたＰＢＭＣは、提供者の告知に基づく同意を得て、Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ａｋｅｓｏｂｉｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，により単離され、調製された。
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳリンパ球分離液（ＧＥ、カタログ番号１７－１４４０－０３）；ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２２４００－１０５）；ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞（Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ａｋｅｓｏｂｉｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ．により構築された）；Ｕ８７－ＭＧ細胞（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｚｈｏｎｇｙｕａｎ Ｌｔｄ．から購入したＡＴＣＣからの細胞。）；ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｅｘｃｅｌｌ ｂｉｏ、カタログ番号ＦＳＰ５００）；ヒトＩＦＮ－γタンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏ、カタログ番号１１７２５－ＨＮＡＳ－１００）；ＬＰＳ（リポ多糖）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ４３９１）；９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）。
健康なヒトＰＢＭＣを、分離溶液Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭＰｌｕｓ試薬の指示書に従って単離し、２％ ＦＢＳを含有する１６４０培地中に再懸濁した。プレートを５％ＣＯ２の細胞インキュベーター中で、３７℃でインキュベートした。２時間後、上清を除去し、付着細胞をＰＢＳで２回洗浄して、１６４０の完全培地（１０％のＦＢＳを含む）及び１００ng/mLのヒトＭ－ＣＳＦを７日間加え誘導した。３日目と５日目に培地を交換し、Ｍ－ＣＳＦを加えてＨＰＭＭを誘導した。７日目に、ＨＰＭＭの誘導の後、細胞を回収し、完全な培地で１０万細胞／mLの濃度に調整して、９６ウェルプレートに充填した。組換えヒトＩＦＮ－γ（５０ng/mL）を加え、インキュベーター中で２４時間インキュベートした。２４時間後、ヒトＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞、又はヒトＣＤ７３を対数相に構成的に発現するＵ８７－ＭＧ細胞を回収した。細胞を再懸濁し、次いで完全な培地を用いて３０万細胞／mLの濃度に調整した。抗体を、完全な培地を用いて２５nM、２．５nM及び０．２５nMの希釈標準濃度に希釈した。アイソタイプコントロール抗体及びブランクコントロールを同時に設計した。９６ウェルプレート中の上清を除去し、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１又はＵ８７－ＭＧ細胞懸濁液及び抗体を加えた（最終容量は２００μL）。系をよく混合し、インキュベーター中で２４時間インキュベートした。混合物を５００×ｇで５分間遠心分離し、上清を回収し、Dakewe kitを用いてＩＬ－８及びＩＬ－６の分泌量を測定した。実験において、ＬＰＳをポジティブコントロールとて使用し、完全培地で１００ng/mLの濃度に調整した。
この実施例では、標的細胞としてのＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞及びＵ８７－ＭＧ細胞のＨＰＭＭとの共培養は、ＨＰＭＭの活性化を誘導し、活性化したＨＰＭＭが、抗体Ｆａｂにより標的細胞に結合した後、抗体のＦｃ断片は、ＨＰＭＭ上のＦｃγＲと相互作用し、ＨＰＭＭによるサイトカインの分泌を引き起こした。
３．実験結果
結果を図３２～３５に示す。
結果は、野生型ＩｇＧ１サブタイプのＰＤ－１抗体又はＣＤ７３抗体と比較して、Ｆｃ断片変異を行う抗ＰＤ－１／ＣＤ７３二重特異性抗体は、免疫細胞におけるＩＬ－６及びＩＬ－８の分泌を効果的に排除できることを示した。
上記に本発明の好ましい実施態様を詳述したが、本発明は前記実施態様に限定されない。当業者は、本発明の精神を侵害することなく、様々な同等の修正又は交換を行うことができる。これらの同等の修正又は置換は、本出願の特許請求の範囲により定義される範囲に含まれる。
配列リスト
１９Ｆ３重鎖可変領域のヌクレオチド配列：
Figure 2023522730000017
（ＣＤＲ配列に下線を引いた配列番号１）
１９Ｆ３重鎖可変領域のアミノ酸配列：
Figure 2023522730000018
（配列番号２、ＣＤＲ配列下線付き）
１９Ｆ３のＨＣＤＲ１：GYSFTGYT（配列番号３）
１９Ｆ３のＨＣＤＲ２：INPYNAGT（配列番号４）
１９Ｆ３のＨＣＤＲ３：ARSEYRYGGDYFDY（配列番号５）
１９Ｆ３軽鎖可変領域のヌクレオチド配列：
Figure 2023522730000019
 （配列番号６、ＣＤＲ配列下線付き）
１９Ｆ３軽鎖可変領域のアミノ酸配列：
Figure 2023522730000020
（配列番号７、ＣＤＲ配列下線付き）
１９Ｆ３のＬＣＤＲ１アミノ酸配列：QSLLNSSNQKNY（配列番号８）
１９Ｆ３のＬＣＤＲ２アミノ酸配列：FAS（配列番号９）
１９Ｆ３のＬＣＤＲ３アミノ酸配列：QQHYDTPYT（配列番号１０）
１９Ｆ３重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列：
ＦＲ－Ｈ１：EVQLQQSGPELVKPGASMRMSCKAS（配列番号１１）
ＦＲ－Ｈ２：MNWVKQSHGKNLEWIGL（配列番号１２）
ＦＲ－Ｈ３：SYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC（配列番号１３）
ＦＲ－Ｈ４：WGQGTTLTVSS（配列番号１４）
１９Ｆ３軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列：
ＦＲ－Ｌ１：DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSS（配列番号１５）
ＦＲ－Ｌ２：LAWYQQKPGQSPKLLVY（配列番号１６）
ＦＲ－Ｌ３：TRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFC（配列番号１７）
ＦＲ－Ｌ４：FGGGTKLEIK（配列番号１８）
１９Ｆ３Ｈ２のヌクレオチド配列：（配列番号１９、ＣＤＲ配列下線付き）
Figure 2023522730000021
１９Ｆ３Ｈ２のアミノ酸配列：（配列番号２０、ＣＤＲ配列下線付き）
Figure 2023522730000022
１９Ｆ３Ｌ２のヌクレオチド配列：（配列番号２１、ＣＤＲ配列下線付き）
Figure 2023522730000023
１９Ｆ３Ｌ２のアミノ酸配列：（配列番号２２、配列下線付き）
Figure 2023522730000024
１９Ｆ３Ｌ３のヌクレオチド配列：（配列番号２３、ＣＤＲ配列下線付き）
Figure 2023522730000025
１９Ｆ３Ｌ３のアミノ酸配列：（配列番号２４、ＣＤＲ配列下線付き）
Figure 2023522730000026
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（Ｇ１Ｍ）重鎖（配列番号２５、非可変領域配列下線付き）
Figure 2023522730000027
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（Ｇ１Ｍ）重鎖アミノ酸配列（配列番号２６、非可変領域配列下線付き）
Figure 2023522730000028
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（Ｇ１Ｍ）軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号２７、非可変領域配列下線付き）
Figure 2023522730000029
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（Ｇ１Ｍ）軽鎖アミノ酸配列（配列番号２８、非可変領域配列下線付き）
Figure 2023522730000030
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＴＭ）重鎖ヌクレオチド配列（配列番号２９、非可変領域配列下線付き）
Figure 2023522730000031
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＴＭ）重鎖可変領域のアミノ酸配列：（配列番号３０）
Figure 2023522730000032
１９Ｆ３Ｈ２フレームワーク領域のアミノ酸配列：
ＦＲ－Ｈ１：QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS（配列番号３１）
ＦＲ－Ｈ２：MNWVRQAPGQNLEWIGL（配列番号３２）
ＦＲ－Ｈ３：SYNQKFQGKVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC（配列番号３３）
ＦＲ－Ｈ４：QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS（配列番号３４）
１９Ｆ３Ｌ２フレームワーク領域のアミノ酸配列：
ＦＲ－Ｌ１：DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSS（配列番号３５）
ＦＲ－Ｌ２：LAWYQQKPGQAPKLLIY（配列番号３６）
ＦＲ－Ｌ３：TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVADYYC（配列番号３７）
ＦＲ－Ｌ４：FGGGTKLEIK（配列番号３８）
１９Ｆ３Ｌ３フレームワーク領域のアミノ酸配列：
ＦＲ－Ｌ１：DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSS（配列番号３９）
ＦＲ－Ｌ２：LAWYQQKPGQAPKLLIY（配列番号４０）
ＦＲ－Ｌ３：TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC（配列番号４１）
ＦＲ－Ｌ４：FGGGTKLEIK（配列番号４２）
１４Ｃ１２重鎖可変領域のヌクレオチド配列：（配列番号４３）
Figure 2023522730000033
１４Ｃ１２重鎖可変領域のアミノ酸配列：（配列番号４４）
Figure 2023522730000034
１４Ｃ１２のＨＣＤＲ１アミノ酸配列：GFAFSSYD（配列番号４５）
１４Ｃ１２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列：ISGGGRYT（配列番号４６）
１４Ｃ１２のＨＣＤＲ３アミノ酸配列：ISGGGRYT ANRYGEAWFAY（配列番号４７）
１４Ｃ１２軽鎖可変領域のヌクレオチド配列：（配列番号４８）
Figure 2023522730000035
１４Ｃ１２軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（配列番号４９）
Figure 2023522730000036
１４Ｃ１２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列：QDINTY（配列番号５０）
１４Ｃ１２のＬＣＤＲ２アミノ酸配列：RAN（配列番号５１）
１４Ｃ１２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列：LQYDEFPLT（配列番号５２）
１４Ｃ１２重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列：
ＦＲ－Ｈ１：EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS（配列番号５３）
ＦＲ－Ｈ２：MSWVRQTPEKRLEWVAT（配列番号５４）
ＦＲ－Ｈ３：YYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYC（配列番号５５）
ＦＲ－Ｈ４：WGQGTLVTVSA（配列番号５６）
１４Ｃ１２軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列：
ＨＲ－Ｌ１：DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKAS（配列番号５７）
ＨＲ－Ｌ２：LSWFQQKPGKSPKTLIY（配列番号５８）
ＨＲ－Ｌ３：RLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC（配列番号５９）
ＨＲ－Ｌ４：FGAGTKLELK（配列番号６０）
１４Ｃ１２Ｈ１のヌクレオチド配列：（配列番号６１）
Figure 2023522730000037
１４Ｃ１２Ｈ１のアミノ酸配列：（配列番号６２）
Figure 2023522730000038
１４Ｃ１２Ｌ１のヌクレオチド配列：（配列番号６３）
Figure 2023522730000039
１４Ｃ１２Ｌ１のアミノ酸配列：（配列番号６４）
Figure 2023522730000040
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１重鎖のヌクレオチド配列（配列番号６５）
Figure 2023522730000041
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１重鎖可変領域のアミノ酸配列：（配列番号６６）
Figure 2023522730000042
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号６７）
Figure 2023522730000043
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１軽鎖のアミノ酸配列：（配列番号６８）
Figure 2023522730000044
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｇ１ＴＭ）重鎖のヌクレオチド配列（配列番号６９）
Figure 2023522730000045
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｇ１ＴＭ）重鎖可変領域のアミノ酸配列：（配列番号７０）
Figure 2023522730000046
１４Ｃ１２Ｈ１重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列：
ＦＲ－Ｈ１：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS（配列番号７１）
ＦＲ－Ｈ２：MSWVRQAPGKGLDWVAT（配列番号７２）
ＦＲ－Ｈ３：YYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYC（配列番号７３）
ＦＲ－Ｈ４：WGQGTLVTVSS（配列番号７４）
１４Ｃ１２Ｌ１軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列：
ＦＲ－Ｌ１：DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRAS（配列番号７５）
ＦＲ－Ｌ２：LSWFQQKPGKSPKTLIY（配列番号７６）
ＦＲ－Ｌ３：RLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYC（配列番号７７）
ＦＲ－Ｌ４：FGAGTKLELK（配列番号７８）
リンカー１のアミノ酸配列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号７９）
リンカー１のヌクレオチド配列：（配列番号８０）
GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGC
リンカー２のアミノ酸配列：GGGGSGGGGSGGGGS：（配列番号８１）
リンカー２のヌクレオチド配列：（配列番号８２）
GGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGC
ＮＴＰＤＶ２及びＮＴＰＤＶ４の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８３）：ここで前記免疫グロブリン部分における１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＴＭ）のＣＤＲ領域は太字で、前記ｓｃＦｖ部分における１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー１－１４Ｃ１２Ｌ１ＶのＣＤＲ領域は太字で、重鎖領域にける変異アミノ酸は太字の斜体で、そしてリンカー領域は、太字で示されている。
Figure 2023522730000047
ＮＴＰＤＶ２及びＮＴＰＤＶ４の重鎖のヌクレオチド配列：（配列番号８４）
Figure 2023522730000048
ＮＴＰＤＶ１及びＮＴＰＤＶ３の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８５）：免疫グロブリン部分における１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＴＭ）のＣＤＲ領域は太字で、ｓｃＦｖ部分における１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー２－１４Ｃ１２Ｌ１ＶのＣＤＲ領域は太字で、重鎖領域における変異アミノ酸は太字の斜体で、リンカー領域は太字で示されている：
Figure 2023522730000049
ＮＴＰＤＶ１及びＮＴＰＤＶ３の重鎖のヌクレオチド配列：（配列番号８６）
Figure 2023522730000050
ＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓのアミノ酸配列：（配列番号８７）
Figure 2023522730000051
ＮＴ５Ｅ（１－５５２）－ｈｉｓのヌクレオチド配列：（配列番号８８）
Figure 2023522730000052
ｍＦｃのアミノ酸配列：（配列番号８９）
Figure 2023522730000053
１９Ｆ３Ｈ１Ｖ－リンカー－１９Ｆ３Ｌ２Ｖのアミノ酸配列：（配列番号９０）
Figure 2023522730000054
１９Ｆ３Ｈ１Ｖ－リンカー２－１９Ｆ３Ｌ２Ｖのヌクレオチド配列：（配列番号９１）
Figure 2023522730000055
１９Ｆ３Ｈ１のヌクレオチド配列：（配列番号９２）
Figure 2023522730000056
１９Ｆ３Ｈ１のアミノ酸配列：（配列番号９３）
Figure 2023522730000057
１９Ｆ３Ｌ１のヌクレオチド配列：（配列番号９４）
Figure 2023522730000058
１９Ｆ３Ｌ１のアミノ酸配列：（配列番号９５）
Figure 2023522730000059
１９Ｆ３Ｌ２軽鎖（全長）のアミノ酸（配列番号９６、非可変領域配列下線付き）
Figure 2023522730000060
ＣＤＲ配列に下線を引いた１９Ｆ３Ｈ２重鎖可変領域のアミノ酸配列：（配列番号９７）
Figure 2023522730000061
ＣＤＲ配列に下線を引いた１９Ｆ３Ｌ２重鎖可変領域のアミノ酸配列：（配列番号９８）
Figure 2023522730000062
ＣＤＲ配列に下線を引いた１９Ｆ３Ｌ３重鎖可変領域のアミノ酸配列：（配列番号９９）
Figure 2023522730000063
１９Ｆ３Ｌ２軽鎖（全長）のヌクレオチド配列：（配列番号１００）
Figure 2023522730000064
本発明の一実施態様では、前記抗原結合性断片の重鎖可変領域のＮ末端は、免疫グロブリンのＣＨ１のＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、及び抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＮ末端は、免疫グロブリンの軽鎖定常領域ＣＬのＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結されるか；又は抗原結合性断片の重鎖可変領域のＮ末端は、免疫グロブリンの軽鎖定常領域ＣＬのＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、及び抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＮ末端は、免疫グロブリンの重鎖定常領域ＣＨ１のＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結される。
本発明の一実施態様では、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体において、前記単鎖可変領域断片は、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端（ＣＨ）（又は重鎖のＮ末端、重鎖定常領域のＣＨ１のＣ末端）にリンカーにより連結されている場合、単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されるか、又は単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよく；
好ましくは、前記単鎖可変領域断片は、一般的構造：ＣＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ、又はＣＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨを有してもよく；
好ましくは、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；
前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
好ましくは、単鎖可変領域断片（たとえば、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ）は、リンカーを介して免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されるか、又は配列番号５０-５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよく、
又は好ましくは、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；及び／又は
単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
ここで、前記単鎖可変領域断片（たとえば、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ）が、リンカーを介して免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されるか、又は配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよく、
好ましくは、
１つの免疫グロブリン分子は、２つの単鎖可変領域断片分子に連結され、及びより好ましくは、前記２つの単鎖可変領域断片分子は同一である。

Claims (31)

  1. 以下：
    ＰＤ－１を標的とする第一のタンパク質機能領域；及び
    ＣＤ７３を標的とする第二のタンパク質機能領域
    を含む抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、
    前記第一のタンパク質機能領域は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、ここで、好ましくはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号４５～４７にそれぞれ記載の配列であるか、又は配列番号４５～４７に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号４５～４７に記載の前記配列と比較して、１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である；及び
    配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領領域に含有されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、ここで、好ましくはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号５０～５２にそれぞれ記載の配列であるか、配列番号５０～５２に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列であるか、又は配列番号５０～５２に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列であるか；
    又は前記第二のタンパク質機能領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、ここで、好ましくはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号３～５にそれぞれ記載のアミノ酸配列であるか、又は配列番号３～５に記載の前記配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３～５に記載の前記配列と比較して、１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である；及び
    配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に含有されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、ここで、好ましくはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の前記アミノ酸配列は、配列番号８～１０にそれぞれ記載の配列、又は配列番号８～１０に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号８～１０に記載の配前記列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列である、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  2. 請求項１記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、
    前記第一のタンパク質機能領域は、
    配列番号４４又は配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号４４又は６２に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号４４又は６２に記載の前記配列と比較して１つ以上の（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列；及び
    配列番号４９又は配列番号６４にそれぞれ記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号４９又は６４に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号４９又は６４に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含み；
    及び／又は、
    第二のタンパク質機能領域は、配列番号２又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号２又は配列番号２０に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号２又は２０に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列；及び
    配列番号７又は配列番号２２にそれぞれ記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号７又は配列番号２２に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号７又は２２に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか；
    又は、
    第二のタンパク質機能領域は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号２０に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号２０に記載の前記配列と比較して、１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列；及び
    配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する配列か、又は配列番号２４に記載の前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列か、又は配列番号２４に記載の前記配列と比較して１つ以上（好ましくは１、２又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  3. 請求項１又は２記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、前記第一のタンパク質機能領域及び前記第二のタンパク質機能領域の数は、独立して１、２又はそれ以上である、抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  4. 請求項１～３のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、前記第一のタンパク質機能領域及び前記第二のタンパク質機能領域は、直接又はリンカーを介して連結され、好ましくは、前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、及びｎは、正の整数、例えば１、２、３、４、５又は６である、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体
  5. 請求項１～４のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、前記第一のタンパク質機能領域及び前記第二のタンパク質機能領域は、独立して免疫グロブリン又は抗原結合性断片、例えば、半抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又は単鎖可変領域断片であり、好ましくは、前記第一のタンパク質機能領域は、免疫グロブリンであり、及び前記第二のタンパク質機能領域は、抗原結合性断片であるか；又は第一のタンパク質機能領域は、抗原結合性断片であり、第二のタンパク質機能領域は免疫グロブリンである、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  6. 請求項１～５のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、ここで、前記抗原結合性断片の重鎖可変領域のＮ末端は、前記免疫グロブリンのＣＨ１のＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、及び前記抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＮ末端は、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域ＣＬのＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結されるか；又は前記抗原結合性断片の重鎖可変領域のＮ末端は、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域ＣＬのＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、及び前記抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＮ末端は、前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のＣ末端に直接（又はリンカーを介して）連結されるか、又は、
    前記抗原結合性断片の重鎖可変領域のＣ末端は、前記免疫グロブリンの重鎖のＮ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、及び前記抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＣ末端は、前記免疫グロブリンの軽鎖のＮ末端に直接（又はリンカーを介して）連結されるか；又は前記抗原結合性断片の重鎖可変領域のＣ末端は、前記免疫グロブリンの軽鎖のＮ末端に直接（又はリンカーを介して）連結され、及び前記抗原結合性断片の軽鎖可変領域のＣ末端は、前記免疫グロブリンの重鎖のＮ末端に直接（又はリンカーを介して）連結される、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  7. 請求項１～６のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、前記抗原結合性断片は、単鎖可変領域断片であり；好ましくは、前記第一のタンパク質機能領域は、免疫グロブリンであり、及び前記第二のタンパク質機能領域は、単鎖可変領域断片であるか；又は、前記第一のタンパク質機能領域は単鎖可変領域断片であり、及び前記第二のタンパク質機能領域は、免疫グロブリンである、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  8. 請求項７記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、ここで、前記単鎖可変領域断片は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を、リンカーを介して連結することにより形成された分子であり；好ましくは、前記単鎖可変領域断片は、次の構造：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有する
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  9. 請求項７又は８記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、前記単鎖可変領域断片は、リンカーを介して前記免疫グロブリンの重鎖のＣ末端（ＣＨ）（又は前記重鎖のＮ末端、前記重鎖可変領域のＣＨ１のＣ末端）に連結されている場合、前記単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されているか、又は前記単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されており；好ましくは、前記単鎖可変領域断片は、次の構造：リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ、又は、リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨを有してもよく、
    好ましくは、
    前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；
    前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び前記単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
    好ましくは、前記単鎖可変領域断片（ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨなど）がリンカーを介して前記免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の前記単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されてもよく、又は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよく、
    又は好ましくは、
    前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；及び／又は
    前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び前記単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
    ここで、前記単鎖可変領域断片（ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨなど）がリンカーを介して前記免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されてもよく、又は配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結してもよく、
    好ましくは、
    １つの免疫グロブリン分子は２つの単鎖可変領域断片分子に結合され、及びより好ましくは、前記２つの単鎖可変領域断片分子は同一である
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  10. 請求項１又は２記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、前記免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である、抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  11. 請求項１又は２記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、前記単鎖可変領域断片は、前記免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に結合され、好ましくは、１つの免疫グロブリン分子は、２つの単鎖可変領域断片分子に結合され、及びより好ましくは、前記２つの単鎖可変領域断片分子は同一である、抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  12. 請求項１又は２記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；
    及び／又は、
    前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び前記単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
    好ましくは、前記単鎖可変領域断片がリンカーを介して前記免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されてもよく、又は配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよい、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  13. 請求項１又は２記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、
    前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号３～５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；及び／又は、
    前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、及び前記単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
    ここで、前記単鎖可変領域断片がリンカーを介して前記免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、配列番号４５～４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されてもよく、配列番号５０～５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結してもよい、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  14. 請求項１又は２記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、
    前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号４４及び配列番号６２から選択されるアミノ酸配列を有し、及び前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号４９及び配列番号６４からそれぞれ選択されるアミノ酸配列を有し；
    及び／又は
    前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号２及び配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を有し、前記単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号７及び配列番号２２からそれぞれ選択されるアミノ酸配列を有するか；又は前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有し、単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有し；
    ここで、前記単鎖可変領域断片がリンカーを介して前記免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている場合、前記単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されてもよく、前記単鎖可変領域断片の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよい、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  15. 請求項１又は２記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、
    前記免疫グロブリンの重鎖可変領域は、配列番号２及び配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を有し、及び前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域は、配列番号７及び配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を有するか；又は前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有し、及び前記単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有し；
    及び／又は
    前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域は、配列番号４４及び配列番号６２から選択されるアミノ酸配列を有し、及び前記単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域は、配列番号４９及び配列番号６４から選択されるアミノ酸配列を有し、
    ここで、前記単鎖可変領域断片がリンカーを介して重鎖のＣ末端に連結されている場合、前記単鎖可変領域断片の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が最初に連結されてもよく、又は、前記抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）が最初に連結されてもよい、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  16. 請求項５～１４のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、ここで、前記免疫グロブリンは、非ＣＤＲ領域を含み、及び前記非ＣＤＲ領域は、ヒト抗体由来など、マウス以外の種に由来し；より好ましくは、前記免疫グロブリンの定常領域は、ヒト化され；例えば、前記重鎖定常領域は、Ｉｇγ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７；であり、及び前記軽鎖定常領域は、Ｉｇκ鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８３４であるか、又は
    前記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、Ｉｇγ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ１８５７に基づいて、位置２３４、２３５及び２３７の任意の２又は３か所で変異し、及び変異後、前記二重特異性抗体は、変異前の二重特異性抗体と比較して、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／又はＣ１ｑに対して減少した親和性定数を有し；
    より好ましくは、ＥＵナンバリングシステムに従って、前記重鎖定常領域は、Ｉｇγ－１鎖Ｃ領域、アクセッション番号Ｐ０１８５７に基づいて、位置２３４，２３５及び／又は２３７で次の変異：
    Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
    Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
    Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；
    又は
    Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを有し、
    さらにより好ましくは、前記免疫グロブリンの重鎖定常領域も、以下の変異：
    Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｐ２３８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｅ２３３Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ａ３３０Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｔ３９４Ｄ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ａ、Ｌ３２８Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ３１８Ａ及びＫ３２０Ａ、
    から選択される１つ以上の変異を有し、
    好ましくは、前記抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体は、重鎖－軽鎖－リンカー１－ｓｃＦｖとして示される構造を有し、及び前記ｓｃＦｖは、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー２－１４Ｃ１２Ｌ１Ｖ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー１－１４Ｃ１２Ｌ１Ｖ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー２－１４Ｃ１２Ｌ１Ｖ及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｖ－リンカー１－１４Ｃ１２Ｌ１Ｖから選択され、具体的には以下：
    （１）ＮＴＰＤＶ１、その重鎖は、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー２は、配列番号８１に記載のアミノ酸配列を有し、及び１４Ｃ１２Ｌ１Ｖは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有する；
    （２）ＮＴＰＤＶ２、その重鎖は、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｌ１Ｖは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有する；
    （３）ＮＴＰＤＶ３、その重鎖は、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー２は、配列番号８１に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｌ１Ｖは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有する；及び
    （４）ＮＴＰＤＶ４、その重鎖は、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｖは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有し、リンカー１は、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有し、１４Ｃ１２Ｌ１Ｖは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を有する、
    からなる群より選択される、
    抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体であって、抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体は、約１０－５Ｍ未満、例えば、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ以下などのＫＤでＣＤ７３タンパク質及び／又はＰＤ－１タンパク質に結合する、抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体。
  18. 二重特異性抗体の重鎖可変領域をコードすることができるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、
    前記抗体の重鎖可変領域は、
    配列番号３～５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号４５～４７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、及び配列番号５０～５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲか；
    又は
    配列番号４５～４７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３～５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、及び配列番号８～１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；
    及び前記二重特異性抗体の重鎖可変領域は、前記二重特異性抗体の一部としてＣＤ７３及びＰＤ－１抗原に特異的に結合し、及び前記二重特異性抗体はさらに、以下：
    配列番号８～１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；
    又は、配列番号５０～５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ
    を含む軽鎖可変領域を含み、
    好ましくは、前記軽鎖可変領域のＣＤＲは、前記重鎖可変領域のＣＤＲと異なる、
    単離された核酸分子。
  19. 請求項１８記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
  20. 請求項１８記載の単離された核酸分子又は請求項１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  21. 請求項１～１７のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体を調製するための方法であって、請求項２０記載の宿主細胞を適切な条件で培養すること、及び前記細胞培養物から前記二重特異性抗体を単離することを含む方法。
  22. 請求項１～１７のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体及びコンジュゲートされた部分を含むコンジュゲートであって、前記コンジュゲートされた部分は、検出可能な標識であり；具体的には、コンジュゲートされた部分は、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、着色された物質又は酵素である、コンジュゲート。
  23. 請求項１～１７のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体又は請求項２２に記載のコンジュゲートを含むキットであって、好ましくは、前記キットは、前記二重特異性抗体を特異的に認識する二次抗体をさらに含み、任意選択的に、前記二次抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、着色物質又は酵素をさらに含む、キット。
  24. サンプル中のＣＤ７３及び／又はＰＤ－１の存在又はレベルを検出するためのキットの調製における、請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の使用。
  25. 請求項１～１７のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体又は請求項２２記載のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、任意選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体及び／又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
  26. 腫瘍又は貧血の予防及び／又は治療、又は腫瘍又は貧血の診断における、請求項１～１７のいずれかに記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体又は請求項２２に記載のコンジュゲートの使用。
  27. 腫瘍又は貧血を予防及び／又は治療するための薬剤の調製における、又は腫瘍又は貧血を診断するための薬剤の調製における、請求項１～１７のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体又は請求項２２記載のコンジュゲートの使用。
  28. 以下の薬剤：
    サンプル中のＣＤ７３のレベルを検出するための薬剤、
    ＣＤ７３の酵素活性反応を阻害するための薬剤；
    及び又は
    ＰＤ－１のＰＤＬ－１に対する結合をブロックするための薬剤、
    ＰＤ－１の活性又はレベルをダウンレギュレート（例えばダウンレギュレーティング）するための薬剤、
    生物におけるＰＤ－１の免疫抑制を緩和するための薬剤、
    Ｔリンパ球におけるＩＬ－２発現を上昇させるための薬剤、又は
    Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ発現を上昇させるための薬剤。
    の調製における、請求項１～１７のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体又は請求項２２記載のコンジュゲートの使用。
  29. 請求項１～１７のいずれか１項記載の抗ＣＤ７３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体又は請求項２２記載のコンジュゲートの有効量を、細胞に投与すること、又はそれを必要とする被験体に投与することを含む、インビボ又はインビトロの方法。
  30. 以下：
    アクセッション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１８１３７を用いて、２０１８年６月１９日に中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４（ＣＤ７３－１９Ｆ３とも呼ばれる）；又は
    アクセッション番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１５１０５を用いて、２０１５年６月１６日に中国培養コレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３（ＰＤ－１－１４Ｃ１２とも呼ばれる）
    から選択されるハイブリドーマ細胞株。
  31. 抗ＣＤ７３モノクローナル抗体であって、ここで前記抗体は、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＴＭ）であり、及び配列番号３０に記載される重鎖アミノ酸配列及び配列番号２８に記載される軽鎖アミノ酸配列を有する、抗ＣＤ７３モノクローナル抗体。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230125774A (ko) * 2020-10-23 2023-08-29 아케소 바이오파마, 인크. 항-cd73 항체 및 이의 용도
WO2022188867A1 (zh) * 2021-03-12 2022-09-15 中山康方生物医药有限公司 提高含有免疫球蛋白Fc片段的药物的安全性的方法
WO2023201267A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
CN117257934A (zh) * 2022-06-22 2023-12-22 中山康方生物医药有限公司 药物组合物及其用途

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
WO2011159877A2 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US9938356B2 (en) * 2014-11-10 2018-04-10 Medimmune Limited Binding molecules specific for CD73 and uses thereof
GB2538120A (en) 2014-11-11 2016-11-09 Medimmune Ltd Therapeutic combinations comprising anti-CD73 antibodies and uses thereof
KR102569813B1 (ko) * 2014-11-21 2023-08-24 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Cd73에 대항한 항체 및 그의 용도
KR20180068999A (ko) * 2015-10-06 2018-06-22 알렉터 엘엘씨 항-trem2 항체 및 그의 사용방법
KR20180104635A (ko) * 2015-12-30 2018-09-21 코디악 사이언시스 인코포레이티드 항체 및 이의 접합체
SG10201913033UA (en) * 2016-03-04 2020-03-30 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
EP3494991A4 (en) * 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
CN106977602B (zh) * 2016-08-23 2018-09-25 中山康方生物医药有限公司 一种抗pd1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
CN106967172B (zh) * 2016-08-23 2019-01-08 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途
AU2018359894A1 (en) * 2017-11-06 2020-05-21 Corvus Pharmaceuticals, Inc. Adenosine pathway inhibitors for cancer treatment
EP3762030A4 (en) * 2018-03-09 2022-01-05 Phanes Therapeutics, Inc. ANTI-CD73 ANTIBODIES AND USES THEREOF
CN112218657A (zh) * 2018-04-12 2021-01-12 百时美施贵宝公司 Cd73拮抗剂抗体和pd-1/pd-l1轴拮抗剂抗体的抗癌组合疗法

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