KR20180030662A - Cd79에 결합하는 항체 분자 - Google Patents

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헬렌 마가렛 피니
스티븐 에드워드 라펙키
케리 루이스 타이슨
마이클 존 라이트
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유씨비 바이오파마 에스피알엘
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Abstract

본 개시는, 서열번호 1, 2, 3 또는 4 및/또는 서열번호 5, 6 및 7을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 항체 분자에 관한 것이다. 본 개시는 상기 항체 분자를 포함하는 약학 조성물 및 치료에 있어서의 상기 항체 분자/조성물의 용도까지도 확장된다.

Description

CD79에 결합하는 항체 분자
본 개시는, PCT/EP2015/066368, PCT/EP2015/066369 및 GB1601075.3으로부터의 우선권을 주장하며, 상기 특허 출원들은 각각 본원에 참고로 도입된다.
본 개시는 적어도 항원 CD79에 특이적인 항체 분자, 이 항체 분자를 포함하는 제제, 및 치료에 있어서의 이들 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 개시는 상기 항체 분자 및 상기 제제를 제조하는 방법까지 확장된다.
생체 내의 생물학적 메카니즘은 파악하고 이해하기 어려운, 극도로 복잡한 신호 캐스케이드이다. 이러한 신호전달의 일례는 B 세포를 활성화시키기 위해 요구되는 신호전달이다. B 세포 항원 수용체(BCR)는 막 면역글로불린(mIg) 분자 및 관련된 Igα/Igβ(CD79a/CD79b) 이종이량체(α/β)로 구성된다. mIg 서브유닛은 항원에 결합하여, 수용체 응집을 야기하는 반면, α/β 서브유닛은 신호를 세포 내부로 전달도입한다. BCR 응집은 Src 패밀리 키나제(kinases) Lyn, Blk 및 Fyn뿐만 아니라, Syk 및 Btk 티로신 키나제도 신속히 활성화시킨다. 이것은 BCR, 상기 언급된 티로신 키나제, 어댑터(adaptor) 단백질, 예컨대, CD19 및 BLNK, 및 신호전달 효소, 예컨대, PLCγ2, PI3K 및 Vav로 구성된 '시그날로좀(signalosom)'의 형성을 시작한다.
시그날로좀으로부터 나오는 신호는 키나제, GTPase 및 전사 인자를 포함하는 다수의 신호전달 캐스케이드들(cascades)을 활성화시킨다. 이것은 세포 대사, 유전자 발현 및 세포골격 조직화의 변화를 야기한다. BCR 신호전달의 복잡성은 생존, 내성(아네르기(anergy)) 또는 아폽토시스(apoptosis), 증식, 및 항체 생성 세포 또는 기억 B 세포로의 분화를 비롯한 많은 상이한 결과들을 가능하게 한다. 반응의 결과는 세포의 성숙 상태, 항원의 성질, BCR 신호전달의 크기 및 지속시간, 및 다른 수용체, 예컨대, CD40, IL-21 수용체 및 BAFF-R로부터의 신호에 의해 결정된다. 많은 다른 막관통 단백질들(이들 중 일부는 수용체임)은 BCR 신호전달의 특정 요소들을 조절한다. 이들 중 몇몇은 CD45, CD19, CD22, PIR-B 및 FcγRIIB1(CD32)을 포함한다. BCR 신호전달의 크기 및 지속시간은 Lyn/CD22/SHP-1 경로, Cbp/Csk 경로, SHIP, Cbl, Dok-1, Dok-3, FcγRIIB1, PIR-B, 및 BCR의 내재화를 포함하는 음성 피드백 루프(negative feedback loops)를 비롯한 음성 피드백 루프에 의해 한정된다. 생체 내에서, B 세포는 항원을 포획하고 이를 그의 세포 표면 상에서 디스플레이하는 항원 제시 세포에 의해 종종 활성화된다. 이러한 막 관련 항원에 의한 B 세포의 활성화는 BCR-유도된 세포골격 재조직화를 요구한다.
자가반응성 B 세포는 자가면역 상태를 직접적으로 또는 간접적으로 야기할 수 있거나 악화시킬 수 있는 병원성 자가항체의 생성을 담당한다. CD20 양성 B 세포의 고갈은 다수의 자가면역 상태들을 성공적으로 치료하는 데 사용됨으로써, B 세포가 다수의 자가면역 질환들, 예컨대, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증 및 I형 진성 당뇨병을 야기하거나 유지하는 데 중요할 역할을 수행한다는 것을 결론적으로 확립하였다. B 세포 고갈이 성공적인 치료 방법이었지만, B 세포 생장 및 활성화 상태의 조절도 B 세포 기능을 조절하는 효과적인 방식일 수 있다는 것을 입증하는 증거도 존재한다. 따라서, 일부 부작용들과 관련되어 있는 것으로 밝혀진 B 세포 면역의 장기간 억제 없이 B 세포를 고갈시키지 않고 B 세포 조절이라는 유연성을 제공하는 대안적인 방법이 바람직할 것이다. 또한, 모든 B 세포 반응들 또는 활성들이 유해한 것은 아니고, 증거는 조절 B 세포 집단의 유지가 보호적일 수 있다는 것을 암시한다. 이러한 방식은 부적절한 또는 과도한 BcR 신호전달에 의해 야기된 비정상적인 B 세포 기능을 갖는 질환에 효과적일 것이다. 이러한 질환의 예로는 염증, 자가면역 및 암이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 특히 흥미로운 것은 BcR 신호전달을 직접적으로 요구하거나 체액성 면역 반응의 억제 또는 자극을 요구하는 질환이다.
(이전에 Ig-알파 및 Ig-베타로서 공지된) CD79b와 함께 CD79a는 디설파이드 결합에 의해 안정화된 B 세포의 표면 상에서 이종이량체를 형성한다. 이 복합체는 B 세포 신호전달, 및 B 세포 발생, 활성화 및 내성의 모든 단계들을 조절하는 BCR의 이종이량체성 신호 전달도입 분자이다. CD79는 거의 B 세포 및 B 세포 신생물 상에서만 발현된다. 항체에 의해 이 분자를 통해 전달된 상이한 신호들의 조절은 B 세포 활성화, B 세포 아네르기(anergy) 또는 B 세포 사멸을 야기할 수 있으므로, 자가면역, 면역결핍 및 악성종양을 포함하는, B 세포 활성화에 의존하는 많은 상이한 질환들에서 치료적 이점을 가질 수 있다(예를 들면, 문헌(The B-Cell Antigen Receptor: Formation of Signaling Complexes and the Function of Adaptor Proteins. Current Topics in Microbiology & Immunology. 2000. Vol 245(1):53-76) 참조).
본 개시는 단독으로 사용될 수 있거나, 예를 들면, 일부 질환들, 예컨대, 자가면역 및 암과 연관된 비정상적인 B 세포 기능을 조절하는 데 유용한 물질, 예컨대, 추가 항원, 예컨대, B 세포 표면 수용체(예컨대, CD22 또는 CD45)에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편과 함께 사용될 수 있는, CD79에 특이적인 다수의 항체 분자들을 제공한다.
따라서, 하기 식 (I)의 CDRH1; 하기 식 (II)의 CDRH2; EPYEPYDDSNIYYGMDP(서열번호 3) 또는 DAGHSDVDVLDI(서열번호 4)인 CDRH3; 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 분자를 제공한다:
[식 (I)]
GFSLX1NYX2X3X4(서열번호 1)
[식 (II)]
IIYX5X6X7X8X9X10X11YAX12WAKG(서열번호 2)
상기 식에서,
X1은 S 또는 N이고, X2는 V 또는 A이고, X3은 V 또는 M이고, X4는 S 또는 V이고, X5는 V 또는 I이고, X6은 S 또는 E이고, X7은 T 또는 G이고, X8은 N 또는 G이고, X9는 T 또는 A이고, X10은 T 또는 Y이고, X11은 W이거나 부재하고, X12는 N 또는 S이다. 일례에서, 경쇄 가변 도메인은 토끼목동물로부터의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 특히 인간 프레임워크 및 토끼로부터의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 또는 이들의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, CDRL1은 하기 식 (III)을 갖고; CDRL2는 하기 식 (IV)를 갖고; CDRL3은 하기 식 (V)를 가진다:
[식 (III)]
QX13SQSX14X15X16X17NX18LA(서열번호 5)
[식 (IV)]
X19ASX20LAS(서열번호 6)
[식 (V)]
X21GX22X23SX24X25X26X27X28X29X30A(서열번호 7)
상기 식에서,
X13은 A 또는 S이고, X14는 V 또는 I이고, X15는 V 또는 Y이고, X16은 N 또는 S이고, X17은 G 또는 N이고, X18은 Y 또는 D이고;
X19는 S 또는 E이고, X20은 T 또는 K이고;
X21은 L 또는 Q이고, X22는 G 또는 E이고, X23은 G 또는 F이고, X24는 C, S 또는 G(특히 S 또는 G)이고, X25는 S 또는 G이고, X26은 D, S 또는 E이고, X27은 H, G, A, S 또는 C(특히 H, G, A 또는 S)이고, X28은 I 또는 D이고, X29는 C 또는 S이거나 부재하고, X30은 N이거나 부재한다.
식 (I) 및 (II)의 정의에 속하는 CDR들의 예는 다음과 같이 제공된다:
Figure pct00001
식 (III), (IV) 및 (V)의 정의에 속하는 CDR들의 예는 다음과 같이 제공된다:
Figure pct00002
일례에서, 본 발명은 임의의 적합한 항체 포맷으로 본원에 기재된 CD79 항체를 제공한다. 따라서, 본원에서 서열번호 11, 12, 3, 19, 20 및 21(항체 4447), 또는 서열번호 8, 9, 4, 13, 14 및 15(항체 4450)로 제공된 CDR을 포함하는, 본원 및 도 51에 기재된 결합 도메인들 중 하나 이상의 결합 도메인을 함유하는 항-CD79 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 상기 CDR들은 임의의 적합한 항체 프레임워크 및 임의의 적합한 항체 포맷 내로 도입될 수 있다. 이러한 항체는 단일클론, 인간화된, 전체 인간 또는 키메라 항체일 수 있으나 이들로 한정되지 않는 전체 항체 및 이의 기능적 활성 단편 또는 유도체를 포함한다. 따라서, 이러한 항체는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편을 포함할 수 있고, Fab, 변형된 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 이들 중 임의의 분자의 에피토프 결합 단편일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136); 및 문헌(Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) 참조). 이들 항체 단편들을 생성하고 제조하는 방법은 당분야에서 잘 알려져 있다(예를 들면, 문헌(Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181) 참조). 다가 항체는 다중특이성을 포함할 수 있거나 단일특이적일 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO92/22853호 및 제WO05/113605호 참조). 본 발명의 이 양태는 본원에 기재되어 있는 바와 같이 하나 이상의 이성질체화, 탈아미드화, 글리코실화 부위 또는 시스테인 잔기를 제거하도록 아미노산이 CDR 내에서 돌연변이되어 있는 변이체들을 비롯한, 인간화된 버전 및 변형된 버전을 포함하는 이들 CD79 항체들의 변이체들까지도 확장된다는 것이 인식될 것이다.
따라서, 일례에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3 또는 서열번호 4로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 갖는 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 항-CD79 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 예를 들면, CDRH1이 서열번호 1이고 CDRH2가 서열번호 2이고 CDRH3이 서열번호 3 또는 서열번호 4인 항-CD79 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
따라서, 한 실시양태에서, CDRH1은 서열번호 1이고 CDRH2는 서열번호 2이거나, CDRH1은 서열번호 1이고 CDRH3은 서열번호 3이거나, CDRH1은 서열번호 1이고 CDRH3은 서열번호 4이거나, CDRH2는 서열번호 2이고 CDRH3은 서열번호 3이거나, CDRH2는 서열번호 2이고 CDRH3은 서열번호 4이다.
따라서, 일례에서, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 4로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 갖는 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 항-CD79 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 예를 들면, CDRH1이 서열번호 8이고 CDRH2가 서열번호 9이고 CDRH3이 서열번호 4인 항-CD79 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
따라서, 한 실시양태에서, CDRH1은 서열번호 8이고 CDRH2는 서열번호 9이거나, CDRH1은 서열번호 8이고 CDRH3은 서열번호 4이거나, CDRH2는 서열번호 9이고 CDRH3은 서열번호 4이다.
따라서, 일례에서, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 3으로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 갖는 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 항-CD79 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 예를 들면, CDRH1이 서열번호 11이고 CDRH2가 서열번호 12이고 CDRH3이 서열번호 3인 항-CD79 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
따라서, 한 실시양태에서, CDRH1은 서열번호 11이고 CDRH2는 서열번호 12이거나, CDRH1은 서열번호 11이고 CDRH3은 서열번호 3이거나, CDRH2는 서열번호 12이고 CDRH3은 서열번호 3이다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체 분자는 예를 들면, 서열번호 5, 6 및 7로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 갖는 경쇄 또는 경쇄 단편을 포함하고, 특히 이때 CDRL1은 서열번호 5에 제공된 서열을 갖고, CDRL2는 서열번호 6에 제공된 서열을 갖고, CDRL3은 서열번호 7에 제공된 서열을 갖는다.
따라서, 한 실시양태에서, CDRL1은 서열번호 5이고 CDRL2는 서열번호 6이거나, CDRL1은 서열번호 5이고 CDRL3은 서열번호 7이거나, CDRL2는 서열번호 6이고 CDRL3은 서열번호 7이다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체 분자는 예를 들면, 서열번호 13 내지 24로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 갖는 경쇄 또는 경쇄 단편을 포함하고, 특히 이때 CDRL1은 서열번호 13 또는 19에 제공된 서열을 갖고, CDRL2는 서열번호 14 또는 20에 제공된 서열을 갖고, CDRL3은 서열번호 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23 및 24로부터 독립적으로 선택된 서열을 갖는다.
따라서, 한 실시양태에서, CDRL1은 서열번호 13이고 CDRL2는 서열번호 14이거나; CDRL1은 서열번호 13이고 CDRL3은 서열번호 15, 16, 17 또는 18이거나; CDRL2는 서열번호 14이고 CDRL3은 서열번호 15, 16, 17 또는 18이거나; CDRL1은 서열번호 13이고 CDRL2는 서열번호 14이고 CDRL3은 서열번호 15, 16, 17 또는 18이다.
따라서, 한 실시양태에서, CDRL1은 서열번호 19이고 CDRL2는 서열번호 20이거나; CDRL1은 서열번호 19이고 CDRL3은 서열번호 21, 22, 23 또는 24이거나; CDRL2는 서열번호 20이고 CDRL3은 서열번호 21, 22, 23 또는 24이거나; CDRL1은 서열번호 19이고 CDRL2는 서열번호 20이고 CDRL3은 서열번호 21, 22, 23 또는 24(예컨대, 서열번호 22)이다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체 또는 결합 단편은 서열번호 1 내지 24로부터 선택된 CDR 서열을 포함하고, 이때 CDRH1은 서열번호 1이고, CDRH2는 서열번호 2이고, CDRH3은 서열번호 3 또는 4이고, CDRL1은 서열번호 5이고, CDRL2는 서열번호 6이고 CDRL3은 서열번호 7이다.
한 실시양태에서, CDRH1은 서열번호 8 또는 11이고, CDRH2는 서열번호 9 또는 12이고, CDRH3은 서열번호 3 또는 4이고, CDRL1은 서열번호 5이고, CDRL2는 서열번호 6이고, CDRL3은 서열번호 7이다.
한 실시양태에서, CDRH1은 서열번호 8 또는 11이고, CDRH2는 서열번호 9 또는 12이고, CDRH3은 서열번호 3 또는 4이고, CDRL1은 서열번호 13 또는 19이고, CDRL2는 서열번호 14 또는 20이고, CDRL3은 서열번호 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23 또는 24이다.
한 실시양태에서, CDRH1은 서열번호 1이고, CDRH2는 서열번호 2이고, CDRH3은 서열번호 3 또는 4이고, CDRL1은 서열번호 13 또는 19이고, CDRL2는 서열번호 14 또는 20이고, CDRL3은 서열번호 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23 또는 24이다.
한 실시양태에서, CDRH1은 서열번호 8이고, CDRH2는 서열번호 9이고, CDRH3은 서열번호 4이고, CDRL1은 서열번호 13이고, CDRL2는 서열번호 14이고, CDRL3은 서열번호 15, 16, 17 또는 18이다.
한 실시양태에서, CDRH1은 서열번호 11이고, CDRH2는 서열번호 12이고, CDRH3은 서열번호 3이고, CDRL1은 서열번호 19이고, CDRL2는 서열번호 20이고, CDRL3은 서열번호 21, 22, 23 또는 24이다.
문맥이 달리 표시하지 않은 한, 카바트(Kabat) 넘버링이 본원에서 사용된다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체 분자는 인간화되고 본원에 기재된 CDR들 및 이들의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자에서 사용되는 중쇄 가변 영역 인간 프레임워크는 IGHV3-48, IGHV4-59, IGHV3-66 및 이들 중 어느 한 프레임워크의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되고, 이때 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 아미노산은 시스테인 이외의 아미노산으로 치환되고, 예를 들면, 원래의 도너 항체, 예를 들면, 서열번호 31 또는 38로 제공된 도너 VH 서열 내의 상응하는 위치의 잔기로 치환된다. 전형적으로, 인간 프레임워크는 적합한 J 영역 서열, 예컨대, JH4 또는 JH2 J 영역을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, (특히 본원에 전술되어 있는 중쇄 항-CD79 CDR들과 함께 사용될) VH 프레임워크 내의 치환은 24, 37, 48, 49, 67, 71, 73 및 78로부터 선택된 1개 이상, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 위치에서 만들어질 수 있고(예컨대, 적어도 위치 73 및 78에서의 치환), 예를 들면, 치환은 (특히 IGHV3-66에 적합한) 위치 24, 48, 49, 73 및 78 모두 또는 (특히 IGHV3-48에 적합한) 위치 24, 48, 49, 71, 73 및 78 모두, 또는 (특히 IGHV4-59에 적합한) 위치 37, 67, 71, 73, 76 및 78 모두에서 만들어질 수 있다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 24는 발린이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 37은 발린이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 48은 이소류신이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 49는 글리신이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 67은 페닐알라닌이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 71은 라이신이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 71은 아르기닌이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 73은 세린이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 78은 발린이다.
이들 치환들 중 하나 이상의 치환은 본 발명의 항체 분자에서 사용될 인간화된 VH 영역을 생성하도록 조합될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
한 실시양태에서, 인간화된 VH 가변 도메인은 서열번호 34, 35, 41 및 42로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, VH의 잔기 1은 서열의 프로세싱을 용이하게 하도록 글루탐산으로 교체된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 인간화된 항체 분자에서 사용되는 경쇄 가변 영역 인간 프레임워크는 IGKV1-6, IGKV1D-13 및 이들 중 어느 한 프레임워크의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되고, 이때 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산은 시스테인 이외의 아미노산으로 치환되고, 예를 들면, 원래의 도너 항체, 예를 들면, 서열번호 29 또는 36으로 제공된 도너 VL 서열 내의 상응하는 위치의 도너 잔기로 치환된다. 전형적으로, 인간 프레임워크는 적합한 J 영역, 예컨대, JK4 J 영역을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자에서 (예를 들면, 경쇄 항-CD79 CDR을 수용하기 위해) 사용되는 인간 VL 프레임워크는 2, 3, 36, 46, 49 및 70을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 1개의 위치, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 위치에서 치환된 아미노산을 포함하고, 예를 들면, 이때 프레임워크 내의 원래의 아미노산은 시스테인 이외의 다른 아미노산으로 치환되고, 특히 도너 항체의 프레임워크 내의 상응하는 위치의 잔기로 치환된다.
한 실시양태에서, 사용되는 인간 VL 프레임워크는 IGKV1 프레임워크이고 적어도 위치 3 및 70에서 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 사용되는 인간 VL 프레임워크(예컨대, IGKV1 프레임워크)는 (특히 IGKV1D-13에 적합한) 위치 2, 3, 36, 46, 49 및 70, 또는 (특히 IGKV1-6에 적합한) 위치 3 및 70에서 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 2는 글루타민이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 3은 발린 또는 아스파르트산이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 36은 류신이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 46은 글루타민이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 49는 히스티딘이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 70은 글루타민이다.
이들 치환들 중 하나 이상의 치환은 본 발명의 항체에서 사용될 인간화된 VL 영역을 생성하도록 조합될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
한 실시양태에서, 인간화된 VL 가변 도메인은 서열번호 33 또는 40으로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 인간화된 VL 가변 도메인은 서열번호 33, 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 서열번호 34 및 35로부터 독립적으로 선택된 VH 및 서열번호 33으로 표시된 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 34 및 35로부터 독립적으로 선택된 VH 및 서열번호 250으로 표시된 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 41 및 42로부터 독립적으로 선택된 VH 및 서열번호 40으로 표시된 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 41 및 42로부터 독립적으로 선택된 VH 및 서열번호 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
이들 인간화된 이식된 가변 영역들(서열번호 41, 42, 40, 341, 342 및 343)은 도너 잔기의 수를 감소시키고 이들을 원래의 인간 잔기(들)로 대체하도록 변형될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
일례에서, 따라서, 위치 3의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나 위치 70의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있는 서열번호 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
일례에서, 위치 24의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 48의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 49의 잔기가 세린(S)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 73의 잔기가 아스파라긴(N)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 78의 잔기가 류신(L)으로 대체되어 있는 서열번호 41에 제공된 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 분자가 제공된다.
일례에서, 위치 37의 잔기가 이소류신(I)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 67의 잔기가 발린(V)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 71의 잔기가 발린(V)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 73의 잔기가 트레오닌(T)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 78의 잔기가 페닐알라닌(F)으로 대체되어 있는 서열번호 42에 제공된 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 분자가 제공된다.
일례에서, 위치 24의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 48의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 49의 잔기가 세린(S)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 73의 잔기가 아스파라긴(N)으로 대체되어 있고/있거나 위치 78의 잔기가 류신(L)으로 대체되어 있는 서열번호 41에 제공된 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 40, 341, 342 및 343 서열로부터 독립적으로 선택된 서열, 또는 위치 3의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나 위치 70의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있는 서열번호 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
일례에서, 위치 37의 잔기가 이소류신(I)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 67의 잔기가 발린(V)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 71의 잔기가 발린(V)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 73의 잔기가 트레오닌(T)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 78의 잔기가 페닐알라닌(F)으로 대체되어 있는 서열번호 42에 제공된 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 40, 341, 342 및 343 서열로부터 독립적으로 선택된 서열, 또는 위치 3의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나 위치 70의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있는 서열번호 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 전장 항체이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 Fab 또는 Fab' 단편이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 scFv이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 다중특이성, 예를 들면, 이중특이성 또는 삼중특이성이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 항체 분자(예컨대, 이중특이성 항체 분자)는 CD79에 특이적인 결합 도메인 이외에 또 다른 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 항체 분자(예컨대, 이중특이성 항체 분자)는 CD79에 특이적인 결합 도메인 이외에, 예를 들면, 본원에 개시된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 항-CD22 CDR 또는 이의 변이체를 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인, 예컨대, 가변 도메인 또는 가변 도메인 쌍, 특히 본원에 개시된 인간화된 가변 도메인 또는 가변 도메인 쌍을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 항체 분자(예컨대, 이중특이성 항체 분자)는 예를 들면, 본원에 개시된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 항-CD45 CDR 또는 변이체를 포함하는, CD45에 대한 결합 도메인, 예컨대, 가변 도메인 또는 가변 도메인 쌍, 특히 본원에 개시된 인간화된 가변 도메인 또는 가변 도메인 쌍을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이성 분자의 결합 도메인 또는 결합 도메인들은 관련 항원에 특이적인 1개 또는 2개(예컨대, 2개)의 항체 가변 도메인(예컨대, CD79에 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인 및 CD22 또는 CD45에 특이적인 추가 결합 도메인)을 각각 독립적으로 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 CD79a에 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 CD79a/CD79b 이종이량체에 특이적이다.
본원에 명시된 항체 또는 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 결합 단편도 제공된다.
한 실시양태에서, 인간 CD79에 대한 본원에 명시된 항체 또는 결합 단편을 교차차단하거나 상기 항체에 의해 인간 CD79에의 결합으로부터 교차차단되는 항체 또는 결합 단편이 제공된다.
이중특이성 또는 삼중특이성 포맷에서 본 개시에 따른 항-CD79와 항-CD45 또는 CD22의 조합은 기능적 시험관내 어세이에서 흥미로운 생물학적 활성, 예를 들면, B 세포 상에서의 CD86, CD71 및/또는 CD40 발현의 억제 이외에 Akt S473의 인산화의 억제, P38의 인산화의 억제 및 IkB의 PLCγ2 Y759 억제 중 어느 하나에 의해 측정된 B 세포 신호전달의 억제를 보인다. 동일한 수준의 활성은 개별 성분 단독의 경우 분명하지 않고 혼합물로 제공된 성분들의 경우 분명하지 않을 수 있고, 즉 조합이 이중특이성 분자로서 제공될 때에만 존재한다.
이들 어세이에서 관찰된 억제는 CD45 또는 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 CD79에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 다중특이성 분자 및 그 조합이 B 세포 기능을 변경시키고 B 세포의 고갈에 대한 치료적 대안을 제공하는 데 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
본 발명은 본 발명의 다중특이성 분자에서 사용되거나 임의의 다른 적합한 항체 포맷 내로 도입될 신규 CD22 항체도 제공한다.
본 발명은 본 발명의 다중특이성 분자에서 사용되거나 임의의 다른 적합한 항체 포맷 내로 도입될 신규 CD45 항체도 제공한다.
도 1은 CD22 및 CD79b에 대한 특이성을 갖는 항체의 이중특이성 및 2가 조합에 대한 인산화된 Akt의 상대적 억제 효능의 막대 도표이다.
도 2는 CD22 및 CD79b에 대한 특이성을 갖는 항체의 이중특이성 및 2가 조합에 대한 인산화된 PLCγ2의 상대적 억제 효능의 막대 도표이다.
도 3은 CD22 및 CD79b에 대한 특이성을 갖는 항체의 이중특이성 및 2가 조합에 대한 CD86 발현의 상대적 억제 효능의 막대 도표이다.
도 4는 CD22 및 CD79b에 대한 특이성을 갖는 항체의 이중특이성, 2가 또는 혼합물에 대한 인산화된 Akt의 상대적 억제 효능의 막대 도표이다.
도 5는 CD22 및 CD79b에 대한 특이성을 갖는 항체의 이중특이성, 2가 또는 혼합물에 대한 인산화된 PLCγ2의 상대적 억제 효능의 막대 도표이다.
도 6은 항-IgM 자극된 B 세포에서 총 IkB 수준에 대한 CD22와 CD79b의 이중특이성 조합의 효과의 적정을 보여주는 그래프이다.
도 7은 항-IgM 자극된 B 세포 상에서의 CD86 발현에 대한 CD22와 CD79b의 이중특이성 조합의 효과의 적정을 보여주는 그래프이다.
도 8은 상이한 V 영역을 가진, CD22 및 CD79b에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 단백질에 대한 인산화된 PLCγ2의 억제의 그래프이다.
도 9는 특정 항체 포맷들을 보여주는, 문헌(Chan and Carter, Nature Reviews Immunology vol 10, May 2010, 301)으로부터 발췌한 도면이다.
도 10은 항원 격자 교차특이성에 대한 데이터를 보여주는 표이다. 항원 2 = CD79b 및 항원 3 = CD22. 값은 Syk의 인산화의 퍼센트 억제율(활성화에 대한 음성 값)이고 평가된 다수의 V 영역 조합들의 평균을 나타낸다.
도 11은 항원 격자 교차특이성에 대한 데이터를 보여주는 표이다. 항원 2 = CD79b 및 항원 3 = CD22. 값은 PLCγ2의 인산화의 퍼센트 억제율(활성화에 대한 음성 값)이고 평가된 다수의 V 영역 조합들의 평균을 나타낸다.
도 12는 항원 격자 교차특이성에 대한 데이터를 보여주는 표이다. 항원 2 = CD79b 및 항원 3 = CD22 및 항원 4 = CD4. 값은 AKT의 인산화의 퍼센트 억제율(활성화에 대한 음성 값)이고 평가된 다수의 V 영역 조합들의 평균을 나타낸다.
도 13은 Fab-Y의 CD22 특이성과 조합된 Fab-X의 CD79b 특이성에 대한 각각의 V 영역 조합에 대한 Syk, PLCγ2 및 AKT의 인산화의 퍼센트 억제율을 보여주는 그래프이다.
도 14는 Fab-Y의 CD79b 특이성과 조합된 Fab-X의 CD22 특이성에 대한 각각의 V 영역 조합에 대한 Syk, PLCγ2 및 AKT의 인산화의 Syk, PLCγ2 및 AKT 인산화의 퍼센트 억제율을 보여주는 그래프이다.
도 15는 CD79b 및 CD22 특이성 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포에서의 항-IgM 유도된 인산화된 PLCγ2의 퍼센트 억제율에 대한 데이터를 보여준다.
도 16은 CD79b 및 CD22 특이성 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포에서의 항-IgM 유도된 인산화된 P38의 퍼센트 억제율에 대한 데이터를 보여준다.
도 17은 CD79b 및 CD22 특이성 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포에서의 항-IgM 유도된 인산화된 Akt의 퍼센트 억제율에 대한 데이터를 보여준다.
도 18은 CD79b 및 CD22 특이성 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD71 발현의 퍼센트 억제율에 대한 데이터를 보여준다.
도 19는 CD79b 및 CD22 특이성 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD40 발현의 퍼센트 억제율에 대한 데이터를 보여준다.
도 20은 CD79b 및 CD22 특이성 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD86 발현의 퍼센트 억제율에 대한 데이터를 보여준다.
도 21은 CD79b 및 CD22 특이성 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의한, B 세포 상에서의 CD27 발현의 억제를 보여준다.
도 22는 CD79b 및 CD22 특이성 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의한, B 세포 상에서의 CD71 발현의 억제를 보여준다.
도 23은 CD79b 및 CD22 특이성 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의한, B 세포 상에서의 CD86 발현의 억제를 보여준다.
도 24는 CD79b 및 CD22 특이성 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의한, B 세포 상에서의 CD27 발현의 억제를 보여준다.
도 25는 CD79b 및 CD22 특이성 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의한, B 세포 상에서의 CD71 발현의 억제를 보여준다.
도 26은 CD79b 및 CD22 특이성 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의한, B 세포 상에서의 CD86 발현의 억제를 보여준다.
도 27은 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe 및 VR4447/VR4130 BYbe와 함께 배양된 PBMC로부터의 파상풍 변성독소(toxoid) IgG 생성의 억제를 보여준다. 데이터는 3명의 도너들로부터의 풀링된 데이터를 나타낸다.
도 28은 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe 및 VR4447/VR4130 BYbe와 함께 배양된 정제된 B 세포로부터의 파상풍 변성독소 IgG 생성의 억제를 보여준다. 데이터는 2명의 도너들로부터의 풀링된 데이터를 나타낸다.
도 29는 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe, VR4447/VR4130 BYbe, VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민과 함께 배양된 PBMC 또는 정제된 B 세포로부터의 파상풍 변성독소 IgG 생성의 억제를 보여준다. 데이터는 단일 도너로부터 표시된다.
도 30은 12개의 건강한 샘플 및 12개의 SLE 환자 샘플로부터의 비자극된 B 세포에서의 기준선 인산화 수준을 보여준다.
도 31은 12명의 건강한 지원자(HV) 및 12명의 SLE 도너들로부터의, 항-IgM 유도된 B 세포 NFkB 인산화에 대한 CD79b + CD22 특이성 VR4447/VR4130 BYbe의 효과를 보여준다.
도 32는 12명의 건강한 지원자(HV) 및 12명의 SLE 도너들로부터의, 항-IgM 유도된 B 세포 Akt 인산화에 대한 CD79b + CD22 특이성 VR4447/VR4130 BYbe의 효과를 보여준다.
도 33은 12명의 건강한 지원자(HV) 및 12명의 SLE 도너들로부터의, 항-IgM 유도된 B 세포 Syk 인산화에 대한 CD79b + CD22 특이성 VR4447/VR4130 BYbe의 효과를 보여준다.
도 34는 12명의 건강한 지원자(HV) 및 12명의 SLE 도너들로부터의, 항-IgM 유도된 B 세포 Erk 1 및 2 인산화에 대한 CD79b + CD22 특이성 VR4447/VR4130 BYbe의 효과를 보여준다.
도 35는 CD45 및 CD79b에 대한 특이성을 갖는 항체의 이중특이성 및 2가 조합에 대한 인산화된 Akt의 상대적 억제 효능의 막대 도표이다.
도 36은 CD45 및 CD79b에 대한 특이성을 갖는 항체의 이중특이성 및 2가 조합에 대한 인산화된 PLCg2의 상대적 억제 효능의 막대 도표이다.
도 37은 항-IgM 자극된 B 세포 상에서의 CD86 발현에 대한 CD45와 CD79b의 이중특이성 조합의 효과의 적정을 보여주는 그래프이다.
도 38은 상이한 V 영역을 가진, CD45 및 CD79b에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 단백질에 대한 인산화된 PLCg2의 억제의 그래프이다.
도 39는 Fab-Y의 CD45 특이성과 조합된 Fab-X의 CD79b 특이성에 대한 각각의 V 영역 조합에 대한 Syk, PLCγ2 및 AKT의 인산화의 퍼센트 억제율을 보여준다.
도 40은 Fab-X의 CD45 특이성과 조합된 Fab-Y의 CD79b 특이성에 대한 각각의 V 영역 조합에 대한 Syk, PLCγ2 및 AKT의 인산화의 퍼센트 억제율을 보여준다.
도 41 및 42는 도너 129 및 130으로부터의 IgM 자극된 B 세포 상에서 (일시적으로 발현된) 정제된 CD79b-CD45에 의한 PLCγ2의 억제(+/- SD)를 보여준다.
도 43 및 44는 도너 129 및 130으로부터의 IgM 자극된 B 세포 상에서 (일시적으로 발현된) 정제된 CD79b-CD45에 의한 p38의 억제(+/- SD)를 보여준다.
도 45 및 46은 도너 129 및 130으로부터의 IgM 자극된 B 세포 상에서 (일시적으로 발현된) 정제된 CD79b-CD45에 의한 Akt의 억제(+/- SD)를 보여준다.
도 47은 상이한 다중특이성 분자와 함께 배양된 PBMC로부터의 파상풍 변성독소 IgG 생성의 억제를 보여준다.
도 48은 항-인간 CD79 V 영역과 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이로부터의 B 세포의 결합을 보여준다.
도 49는 항-인간 CD79 V 영역과 사이노몰구스 원숭이로부터의 B 세포의 결합을 보여준다.
도 50은 인간 PBMC에서의 B 세포의 BCR 신호전달의 억제를 보여준다.
도 51은 본 개시의 서열을 보여준다.
B 세포 수용체 신호전달은 B 세포의 매우 중요한 기능이고 B 세포의 항원 특이성 활성화를 위한 요건이다. BcR 신호전달은 B 세포 발생의 초기 단계부터 기억 B 세포 반응의 활성화 및 발생까지 필수적이다. B 세포 수용체는 CD79a 및 CD79b의 이종이량체성 복합체와 결합하는 표면 면역글로불린(Ig) 분자로 구성된다. 표면 Ig가 항원을 인식할 때, 이것은 Src 패밀리 키나제뿐만 아니라 Syk 및 Btk 티로신 키나제도 포함하는 즉시 신호전달 캐스케이드의 다운스트림 활성화를 야기하는 CD79a/b 복합체의 클러스터링을 야기한다고 생각된다. 그 다음, 이 신호전달 복합체는 어댑터 단백질, 예컨대, CD19 및 BLNK를 동원할 수 있고 PLCγ2 및 PI3K의 활성화를 야기하고, 결과적으로 이 활성화는 추가 다운스트림 경로, 예컨대, B 세포 생장, 생존 및 분화를 조절하는 다운스트림 경로를 활성화시킬 수 있다. 이 신호전달 복합체는 BAFF-R, IL-21R 및 CD40을 통한 신호전달을 통해 다른 제2 신호에 의해 추가로 조절될 수 있고 다른 신호전달 분자, 예컨대, 특히 CD19, CD21, CD83, CD22, CD32b 및 CD45에 의해 조절될 수도 있다. BcR에 의한 항원의 인식 시, 활성화된 제1 반응들 중 하나는 표면 수용체, 예컨대, 보조자극 분자 CD80 및 CD86의 상향조절이다. 이들 분자들은 MHC 클래스 II와 함께 존재하는 항원을 인식하는 T 세포의 생존 및 증폭을 가능하게 하는 추가 생존 및 활성화 신호를 전달하는, T 세포 상의 상응하는 수용체들에 결합한다. 이 반응은 MHC 클래스 II와 함께 존재하는 항원을, IL-2 및 IL-21과 같은 인자를 방출하는 T 세포에게 다시 제시하는 B 세포의 능력에 의해 더 증폭된다. 이들 사이토카인들은 결과적으로 B 세포 수를 크게 증폭시킨다. 따라서, 세포 표면 상에서의 CD86의 하향조절은 B 세포 신호전달의 억제를 표시할 수 있다.
나아가, B 세포 수용체 신호전달의 억제는 다운스트림 기능의 억제를 유발할 수 있다. 이러한 결과들 중 한 결과는 T 세포 기능, 생존 및 분화의 억제를 유발할 보조자극 분자, 예컨대, CD86의 억제(또는 이의 감소된 발현)일 것이다.
따라서, B 세포 수용체 신호전달의 억제는 자가면역 및 암과 연관된 비정상적인 B 세포 기능의 조절에 유리할 수 있다. B 세포 수용체 신호전달은 자가면역 질환에서 B 세포 증식, 분화, 항원 제시 및 사이토카인 방출을 위해 요구된다. 따라서, BcR 활성의 억제는 B 세포 기능, 예컨대, 면역글로불린 분비 및 T 세포 활성화를 조절할 수 있고, 예를 들면, 자가면역 상태와 연관된 부적절한 B 세포 활성을 제어할 수 있다. 또한, 생존 및 생장을 위해 B 세포 수용체 신호전달을 요구하는 일부 B 세포 백혈병들 및 림프종들이 존재하고, 이들은 B 세포 수용체 활성화의 억제제에 의해 제어될 수 있다.
본원에서 사용된 "CD79"는 CD79a 및 CD79b로 구성된 복합체를 지칭한다. 따라서, CD79에 결합하는 항체 또는 결합 도메인은 CD79a 및/또는 CD79b에 결합할 수 있다. 본원에서 사용된 "CD79a 및/또는 CD79b에 결합"은 CD79a에 특이적이거나, CD79b에 특이적이거나, CD79a 및 CD79b 둘 다에 특이적이거나(즉, CD79a 상의 에피토프를 인식하고 동일한 항체 또는 결합 도메인은 CD79b 상의 에피토프도 인식하거나, 즉 범특이적이거나), CD79a 및 CD79b의 복합체에 특이적이라는 것(즉, 복합체 형태에서 CD79a와 CD79b의 상호작용으로부터 형성된 에피토프를 인식하고 이것은 개별 성분으로부터 복합체를 구별할 수 있다는 것)을 의미한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 사용되는 항체 또는 이의 결합 단편은 CD79a에 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 사용되는 항체 또는 이의 결합 단편은 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 사용되는 항체 또는 이의 결합 단편은 CD79 복합체에 특이적이고, 즉 복합체에 존재하는 에피토프, 예를 들면, CD79a와 CD79b 사이의 상호작용을 포함하는 에피토프를 인식하고 이에 특이적이다.
한 실시양태에서, 결합 도메인이 CD79a 또는 CD79b에 특이적인 경우조차도, 2개의 단백질들이 세포 표면 상에서 천연적으로 동시-발현되기 때문에, 결합 도메인은 바람직하게는 복합체 형태로 존재할 때 CD79a 또는 CD79b에 여전히 결합할 것임이 인식될 것이다.
결합 도메인 및/또는 각각의 결합 도메인에 2개의 가변 영역들이 존재하는 경우, 상기 2개의 가변 영역들은 일반적으로 관련 항원에 대한 특이성을 제공하도록 협력적으로 작동할 것이고, 예를 들면, 이들은 도메인이 특정 항원에 특이적이도록 동족 쌍이거나 친화성 성숙되어 적절한 친화성을 제공한다. 전형적으로, 이들은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 쌍(VH/VL 쌍)이다.
본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편을 포함할 수 있고, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들면, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 이들 중 임의의 분자의 에피토프 결합 단편일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136); 및 문헌(Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) 참조). 이들 항체 단편들을 생성하고 제조하는 방법은 당분야에서 잘 알려져 있다(예를 들면, 문헌(Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181) 참조). 본 발명에서 사용될 다른 항체 단편은 국제 특허출원 공보 제WO2005/003169호, 제WO2005/003170호 및 제WO2005/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중특이성, 예를 들면, 이중특이성을 포함할 수 있거나 단일특이적일 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO92/22853호, 제WO05/113605호, 제WO2009/040562호 및 제WO2010/035012호 참조).
본원에서 사용된 "다중특이성 분자"는 적어도 2개의 구별되는 항원들, 예를 들면, 상이한 항원들에 특이적으로 결합하는 능력 갖는 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 다중특이성 분자는 이중특이성, 삼중특이성 또는 사중특이성 분자, 특히 이중특이성 또는 삼중특이성 분자이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 이중특이성이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 이중특이성이고, 이때 하나의 결합 도메인이 CD79에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 삼중특이성이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 삼중특이성이고, 이때 하나의 결합 도메인이 CD79에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 CD79에 단일특이적이고 적어도 하나의 다른 항원에 단일특이적이다. 즉, 상기 분자는 CD79에 결합하는 하나의 결합 도메인만을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 CD79에 단일특이적이고 CD22에 단일특이적이다. 즉, 상기 분자는 CD79에 결합하는 하나의 결합 도메인 및 CD22에 결합하는 하나의 결합 도메인만을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자는 CD79에 단일특이적이고 CD45에 단일특이적이다. 즉, 상기 분자는 CD79에 결합하는 하나의 결합 도메인 및 CD45에 결합하는 하나의 결합 도메인만을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 분자는 단일 쇄이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 분자는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일례에서, 본원에서 사용된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 페어링은 특히, 한 실시양태에서 본 개시의 분자가 다량체를 포함하지 않는 경우, 이량체, 예컨대, 항체, 유닛/단편 또는 성분의 이량체로서 지칭되지 않는다.
한 양태에서, 본 개시는 적어도 CD22 및 CD79a에 특이적인 적합한 포맷의 분자, 및 다중특이성 분자, 예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성 포맷에서 CD22 및 CD79a에 특이적인 항체/단편 또는 이의 조합의 용도까지 확장된다.
한 양태에서, 본 개시는 적어도 CD22 및 CD79b에 특이적인 적합한 포맷의 분자, 및 다중특이성 분자, 예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성 포맷에서 CD22 및 CD79b에 특이적인 항체/단편 또는 이의 조합의 용도까지 확장된다.
한 양태에서, 본 개시는 적어도 CD22 및 CD79a/b 복합체에 특이적인 적합한 포맷의 분자, 및 다중특이성 분자, 예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성 포맷에서 CD22 및 CD79a/b 복합체에 특이적인 항체/단편 또는 이의 조합의 용도까지 확장된다.
한 양태에서, 본 개시는 적어도 CD45 및 CD79a에 특이적인 적합한 포맷의 분자, 및 다중특이성 분자, 예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성 포맷에서 CD45 및 CD79a에 특이적인 항체/단편 또는 이의 조합의 용도까지 확장된다.
한 양태에서, 본 개시는 적어도 CD45 및 CD79b에 특이적인 적합한 포맷의 분자, 및 다중특이성 분자, 예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성 포맷에서 CD45 및 CD79b에 특이적인 항체/단편 또는 이의 조합의 용도까지 확장된다.
한 양태에서, 본 개시는 적어도 CD45 및 CD79a/b 복합체에 특이적인 적합한 포맷의 분자, 및 다중특이성 분자, 예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성 포맷에서 CD45 및 CD79a/b 복합체에 특이적인 항체/단편 또는 이의 조합의 용도까지 확장된다.
한 실시양태에서, 예를 들면, 제3 결합 도메인이 예를 들면, 혈청 담체 단백질에 결합함으로써 분자의 반감기를 연장시킬 수 있는 경우, 본 개시의 분자는 삼중특이적이다.
다양한 단백질들이 혈장에 존재하고 티록신(thyroxine) 결합 단백질, 트랜스타이레틴(transthyretin), α1-산 당단백질, 트랜스페린, 피브리노겐 및 알부민, 또는 이들의 임의의 단편을 포함한다(Bartalena & Robbins, 1993, Clinics in Lab. Med. 13:583-598; Bree et al., 1986, Clin. Pharmacokin. 11:336-342; Gitlin et al. 1964, J. Clin. Invest. 10:1938-1951; Peters, 1985, Adv Protein Chem. 37:161-245; Waldeman & Strober, 1969, Progr. Allergy, 13:1-110). 일례에서, 제3 결합 도메인은 혈청 알부민, 예를 들면, 인간 혈청 알부민에 특이적이다.
다중특이성 분자 포맷
본 발명에서 사용될 적합한 다중특이성 분자의 예는 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 평론(The coming of Age of Engineered Multivalent Antibodies, Nunez-Prado et al Drug Discovery Today Vol 20 Number 5 Mar 2015, page 588-594, D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798, Chan and Carter, Nature Reviews Immunology vol 10, May 2010, 301)에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, 다중특이성 포맷은 당분야에서 공지되어 있는 다중특이성 포맷 및 본원에 기재되어 있는 다중특이성 포맷을 포함하고, 예컨대, 분자 포맷은 하기 포맷들을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택된다:
Figure pct00003
탠덤(tandem) sdAb, 탠덤 sdAb-sdAb(3개의 sdAb들);
Figure pct00004
(scFv)2(탠덤 scFv로서도 지칭됨), scFv-dsFv, dsscFv-dsFv(dsFv)2;
Figure pct00005
디아바디(diabody), ds디아바디(dsdiabody), 디ds디아바디(didsdiabody);
Figure pct00006
sc디아바디(scdiabody), dssc디아바디(dsscdiabody), 디dssc디아바디(didsscdiabody);
Figure pct00007
Dart 항체, 즉 VL1 링커 VH2 링커 및 VH1 링커 VL2(이때, VH1 및 VH2의 C 말단은 디설파이드 결합에 의해 연결됨);
Figure pct00008
BiTE®, dsBiTE, 디dsBiTE;
Figure pct00009
디-디아바디(Di-diabody)(문헌(Nunez-Prado et al.), 특히 이 문헌 내의 도 1의 분자 번호 25 참조), ds디-디아바디(dsdi-diabody), 디ds디-디아바디(didsdi-diabody);
Figure pct00010
트리아바디(triabody), ds트리아바디(dstriabody), 디ds트리아바디(didstriabody), 트리ds트리아바디(tridstriabody);
Figure pct00011
테트라바디(tetrabodies), ds테트라바디(dstetrabody), 디ds테트라바디(didstetrabody), 트리ds테트라바디(tridstetrabody), 테트라ds테트라바디(tetradstetrabody);
Figure pct00012
tandab(문헌(Nunez-Prado et al.), 특히 이 문헌 내의 도 1의 분자 번호 22 참조), dstandab, 디dstandab, 트리dstandab, 테트라dstandab;
Figure pct00013
[sc(Fv)2]2(문헌(Nunez-Prado et al.), 특히 이 문헌 내의 도 1의 분자 번호 22 참조), ds[sc(Fv)2]2, 디ds[sc(Fv)2]2, 트리ds[sc(Fv)2]2, 테트라ds[sc(Fv)2]2;
Figure pct00014
펜타바디(Pentabody)(문헌(Nunez-Prado et al.), 특히 이 문헌 내의 도 1의 분자 번호 27 참조);
Figure pct00015
Fab-scFv(비바디(bibody)로서도 지칭됨), Fab'scFv, FabdsscFv(또는 BYbe), Fab'dsscFv;
Figure pct00016
트리바디(tribody), ds트리바디(dstribody), 디ds트리바디(didstribody)(Fab디dsscFv 또는 TrYbe 또는 Fab-(dsscFv)2로서도 지칭됨), Fab'디dsscFv;
Figure pct00017
Fabdab, FabFv, Fab'dab, Fab'Fv;
Figure pct00018
Fab 단일 링커 Fv(본원에서 국제 특허출원 공보 제WO2014/096390호에 개시된 바와 같이 FabdsFv로서도 지칭됨), Fab' 단일 링커 Fv(본원에서 Fab'dsFv로서도 지칭됨);
Figure pct00019
FabscFv 단일 링커 Fv, Fab'scFv 단일 링커 Fv;
Figure pct00020
FabdsscFv 단일 링커 Fv, Fab'dsscFv 단일 링커 Fv;
Figure pct00021
FvFabFv, FvFab'Fv, dsFvFabFv, dsFvFab'Fv, FvFabdsFv, FvFab'dsFv, dsFvFabdsFv, dsFvFab'dsFv;
Figure pct00022
FabFvFv, Fab'FvFv, FabdsFvFv, Fab'dsFvFv, FabFvdsFv, Fab'FvdsFv, FabdsFvdsFv, Fab'dsFvdsFv;
Figure pct00023
디Fab, 디Fab'(화학적으로 접합된 디Fab'를 포함함);
Figure pct00024
(FabscFv)2, (Fab)2scFvdsFv, (Fab)2dsscFvdsFv, (FabdscFv)2;
Figure pct00025
(Fab'scFv)2, (Fab')2scFvdsFv, (Fab')2dsscFvdsFv, (Fab'dscFv)2;
Figure pct00026
VHHCK(문헌(Nunez-Prado et al.), 특히 이 문헌 내의 도 1의 분자 번호 6 참조);
Figure pct00027
미니바디(minibody), ds미니바디(dsminibody), 디ds미니바디(didsminibody);
Figure pct00028
미니항체(miniantibody)(ZIP)[문헌(Nunez-Prado et al.), 특히 이 문헌 내의 도 1의 분자 번호 7 참조], ds미니항체(dsminiantibody)(ZIP) 및 디ds미니항체(didsminiantibody)(ZIP);
Figure pct00029
트리비-미니바디(tribi-minibody)[문헌(Nunez-Prado et al.), 특히 이 문헌 내의 도 1의 분자 번호 15 참조], ds트리비-미니바디(dstribi-minibody), 디ds트리비-미니바디(didstribi-minibody), 트리ds트리비-미니바디(tridstribi-minibody);
Figure pct00030
디아바디-CH3, ds디아바디-CH3, 디ds디아바디-CH3, sc디아바디(scdiabody)-CH3, dssc디아바디(dsscdiabody)-CH3, 디dssc디아바디(didsscdiabody)-CH3;
Figure pct00031
탠덤scFv-CH3, 탠덤dsscFv-CH3, 탠덤디dsscFv-CH3, 탠덤트리dsscFv-CH3, 탠덤테트라dsscFv-CH3;
Figure pct00032
scFv-Fc(본원에서 국제 특허출원 공보 제WO2008/012543호에 기재된 바와 같이 (scFvCH2CH3)2로서도 지칭됨) 및 이의 단일 쇄 버전, dsscFvscFv-Fc, dsscFv-Fc(본원에서 (dsscFvCH2CH3)2로서도 지칭됨), scFv-dsFv-Fc, dsscFv-dsFv-Fc, dsFv-Fc(본원에서 (dsFvCH2CH3)2로서도 지칭됨);
Figure pct00033
스코피온(scorpion) 분자(트루비온(Trubion)), 즉 미국 특허 제8,409,577호에 기재된 바와 같이 결합 도메인, 링커-CH2CH3 결합 도메인;
Figure pct00034
SMIP(트루비온), 즉 (scFv-CH2CH3)2;
Figure pct00035
(dsFvCH2CH3)2, 탠덤 scFv-Fc, 탠덤 dsscFvscFv-Fc, 탠덤 dsscFv-Fc;
Figure pct00036
scFv-Fc-scFv, dsscFv-Fc-scFv, scFv-Fc-dsscFv;
Figure pct00037
디아바디-Fc, ds디아바디-Fc, 디ds디아바디-Fc, 트리아바디-Fc, ds트리아바디-Fc, 디ds트리아바디-Fc, 트리ds트리아바디-Fc, 테트라바디-Fc, ds테트라바디-Fc, 디ds테트라바디-Fc, 트리ds테트라바디-Fc, 테트라ds테트라바디-Fc, ds테트라바디-Fc, 디ds테트라바디-Fc, 트리ds테트라바디-Fc, 테트라ds테트라바디-Fc, sc디아바디-Fc, dssc디아바디, 디dssc디아바디;
Figure pct00038
예를 들면, 상이한 중쇄 가변 영역 및 공통된 경쇄를 갖는 이작용성 또는 삼작용성 항체, 예를 들면, 고정된 서열의 공통된 경쇄 및 (상이한 CDR을 포함하는) 상이한 중쇄, 및 상이한 중쇄들의 이량체화를 유도하기 위한 조작된 CH3 도메인을 갖는 메루스(Merus) 이중특이성 항체 포맷(Biclonics®);
Figure pct00039
듀오바디(Duobody)(즉, 이때 항체의 한 전장 쇄는 항체의 다른 한 전장 쇄에 대한 상이한 특이성을 가짐);
Figure pct00040
전장 항체로서, Fab 아암(arm) 교환이 이중특이성 포맷을 생성하는 데 사용된 것인 전장 항체;
Figure pct00041
이작용성 또는 삼작용성 항체로서, 전장 항체가 '카파/람다 바디' 또는 'κ/λ-바디'로서도 지칭되는, 공통된 중쇄 및 상이한 경쇄를 갖는 것인 이작용성 또는 삼작용성 항체(국제 특허출원 공보 제WO2012/023053호 참조);
Figure pct00042
중쇄 또는 경쇄의 C 말단 상에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 scFv를 갖는 Ig-scFv, 중쇄 또는 경쇄의 N 말단 상에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 scFv를 갖는 scFv-Ig, 단일 링커 Ig-Fv, 중쇄 또는 경쇄의 C 말단 상에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 dsscFv를 갖는 Ig-dsscFv(1개, 2개, 3개 또는 4개의 디설파이드 결합을 가짐);
Figure pct00043
중쇄 또는 경쇄의 N 말단 상에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 dsscFv를 갖는 Ig-dsscFv(1개, 2개, 3개 또는 4개의 디설파이드 결합을 가짐);
Figure pct00044
Ig 단일 링커 Fv(국제 특허출원 제PCT/EP2015/064450호 참조);
Figure pct00045
Ig-dab, dab-Ig, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V;
Figure pct00046
scFabFvFc, scFabdsFvFc(단일 링커 버전 scFavFv), (FabFvFc)2, (FabdsFvFc)2, scFab'FvFc, scFab'dsFvFc, (Fab'FvFc)2, (Fab'dsFvFc)2; 및
Figure pct00047
하기 더 상세히 논의되어 있는 DVDIg.
한 실시양태에서, 다중특이성 분자 포맷은 당분야에서 공지되어 있는 다중특이성 분자 포맷 및 본원에 기재되어 있는 다중특이성 분자 포맷을 포함하고, 예컨대, 이때 상기 분자 포맷은 디아바디, sc디아바디, 트리아바디, 트리바디, 테트라바디, 탠덤 scFv, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab-(dsscFv)2, 디Fab, 디Fab', 탠덤 scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3, Ig-scFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, 듀오바디, 및 하기 더 상세히 논의되어 있는 DVDIg를 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 항체 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않고, 즉 CH2 및 CH3 도메인을 포함하지 않고, 예를 들면, 상기 분자는 탠덤 scFv, scFv-dsFv, dsscFv-dsFv 디dsFv, 디아바디, ds디아바디, 디ds디아바디, sc디아바디((scFv)2로서도 지칭됨), dssc디아바디, 트리아바디, ds트리아바디, 디ds트리아바디, 트리ds트리아바디, 테트라바디, ds테트라바디, 디ds테트라바디, 트리ds테트라바디, 테트라ds테트라바디, 트리바디, ds트리바디, 디ds트리바디, Fabdab, FabFv, Fab'dab, Fab'Fv, Fab 단일 링커 Fv(국제 특허출원 공보 제WO2014/096390호에 개시됨), Fab' 단일 링커 Fv, FabdsFv, Fab'dsFv, Fab-scFv(비바디로서도 지칭됨), Fab'scFv, FabdsscFv, Fab'dsscFv, Fab디dsscFv, Fab'디dsscFv, FabscFv 단일 링커 Fv, Fab'scFv 단일 링커 Fv, FabdsscFvs 단일 링커 Fv, Fab'dsscFv 단일 링커 Fv, FvFabFv, FvFab'Fv, dsFvFabFv, dsFvFab'Fv, FvFabdsFv, FvFab'dsFv, dsFvFabdsFv, dsFvFab'dsFv, FabFvFv, Fab'FvFv, FabdsFvFv, Fab'dsFvFv, FabFvdsFv, Fab'FvdsFv, FabdsFvdsFv, Fab'dsFvdsFv, 디Fab, 디Fab'(화학적으로 접합된 디Fab'를 포함함), (FabscFv)2, (Fab)2scFvdsFv, (Fab)2dsscFvdsFv, (FabdscFv)2, 미니바디, ds미니바디, 디ds미니바디, 디아바디-CH3, ds디아바디-CH3, 디ds디아바디-CH3, sc디아바디-CH3, dssc디아바디-CH3, 디dssc디아바디-CH3, 탠덤scFv-CH3, 탠덤dsscFv-CH3, 탠덤디dsscFv-CH3, 탠덤트리dsscFv-CH3 및 탠덤테트라dsscFv-CH3을 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자는 본원에 후술되어 있는 바와 같이 변경된 Fc 도메인을 포함한다.
문맥이 달리 명시하지 않은 한, 본원에서 사용된 "Fc 도메인"은 일반적으로 -(CH2CH3)2를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자는 -CH2CH3 단편을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자는 CH2 도메인을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자는 CH3 도메인을 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 "분자"는 일단 복합체가 형성되면, 예를 들면, 복합체가 2개 이상의 폴리펩티드 쇄들에 의해 형성되면 적절한 조건 하에서 단일 물질로서 취급되기에 적합한 복합체를 포함하는 유기, 특히 단백질성 덩어리를 형성하는 원자들의 군을 지칭하기 위해 생화학적 의미로 사용된다.
문맥이 달리 명시하지 않은 한, 분자와 구축물은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 그럼에도 불구하고, 구축물은 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하는 데 더 자주 사용될 수 있고 분자는 주로 아미노산 서열을 포함하는 물질을 지칭하는 데 더 자주 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "특이성(또는 특이적)"은 파트너들이 상호작용에서 서로만을 인식하거나 비-파트너들에 비해 서로에 대해 상당히 더 높은 친화성, 예를 들면, 배경 수준의 결합 또는 또 다른 관련 없는 단백질에의 결합보다, 예를 들면, 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 높은 친화성을 갖는 경우를 의미한다.
본원에서 사용된 '결합 도메인'은 예를 들면, 도메인을 항원에 특이적인 도메인으로서 특징규명하기에 충분한 친화성으로 표적 항원에 결합할 수 있는 결합 영역, 전형적으로 폴리펩티드를 지칭한다.
임의의 적합한 결합 도메인들이 본 발명의 다중특이성 분자에서 사용될 수 있다. 이들은 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있다.
한 실시양태에서, 생체적합한 프레임워크 구조가 본 개시의 분자의 결합 도메인에서 사용되고, 이러한 구조는 면역글로불린 도메인 이외의 단백질 스캐폴드 또는 골격을 기반으로 한다. 예를 들면, 피브로넥틴(fibronectin), 안키린(ankyrin), 리포칼린(lipocalin), 네오카지노스테인(neocarzinostain), 사이토크롬(cytochrome) b, CP1 징크 핑거(zinc finger), PST1, 코일드 코일(coiled coil), LACI-D1, Z 도메인 및 텐드라미사트(tendramisat) 도메인 기반의 구조가 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌(Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469) 참조).
본원에서 사용된 용어 '다중특이성 분자'는 애드넥틴(Adnectins), 아피바디(Affibodies), 다핀(Darpins), 파일로머(Phylomers), 아비머(Avimers), 앱타머(Aptamers), 안티칼린(Anticalins), 테트라넥틴(Tetranectins), 마이크로바디(Microbodies), 아필린(Affilins) 및 쿠니츠(Kunitz) 도메인을 비롯한, 생물학적 스카폴드 기반의 결합 물질들도 포함할 수 있다. 본 발명의 다중특이성 분자는 전형적으로 다중특이성 항체 분자이다. 즉, 다중특이성 분자의 결합 도메인들 중 적어도 하나 이상의 결합 도메인은 항체 또는 이의 단편으로부터 유래된다.
결합 도메인이 항체로부터 유래되는 경우, 본원에서 사용된 "결합 도메인 또는 부위"는 항원과 접촉하는 항체의 부분이다. 한 실시양태에서, 결합 도메인은 적어도 하나의 가변 도메인 또는 이의 유도체, 예를 들면, 한 쌍의 가변 도메인들 또는 이들의 유도체, 예컨대, 한 동족 쌍의 가변 도메인들 또는 이들의 유도체를 함유한다. 전형적으로, 이것은 VH/VL 쌍이다.
가변 영역(본원에서 가변 도메인으로서도 지칭됨)은 일반적으로 3개의 CDR들 및 적합한 프레임워크를 포함한다. 한 실시양태에서, 결합 도메인은 2개의 가변 영역들, 즉 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 이들 요소들은 함께 항체 또는 결합 단편의 결합 상호작용의 특이성에 기여한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자 내의 결합 도메인 내의 가변 도메인은 동족 쌍이다.
본원에서 사용된 "동족 쌍"은 미리 형성된 커플로서, 숙주로부터 단리된 가변 도메인들(또는 이들의 유도체, 예컨대, 이들의 인간화된 버전)의 중쇄 및 경쇄 쌍을 지칭한다. 이 정의는 라이브러리로부터 단리된 가변 도메인을 포함하지 않고, 이때 숙주로부터의 원래의 페어링은 보유되지 않는다. 동족 쌍들은 이들이 숙주에서 종종 친화성 성숙되므로, 이들이 특이성을 나타내는 항원에 대해 라이브러리, 예컨대, 파지 라이브러리로부터 선택된 가변 도메인 쌍들의 조합보다 더 높은 친화성을 가질 수 있기 때문에 유리할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자 내의 결합 도메인은 천연 생성 결합 도메인의 유도체이다.
본원에서 사용된 "천연 생성 도메인의 유도체"는 예를 들면, 바람직하지 않은 성질을 제거함으로써 도메인의 성질을 최적화하기 위해 천연 생성 서열에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 대체되어 있거나 결실되어 있되 도메인의 특징적인 특징(들)이 보유되어 있는 경우를 의미하기 위한 것이다. 변형의 예는 글리코실화 부위, GPI 앵커 또는 용매 노출된 라이신을 제거하기 위한 변형이다. 이들 변형들은 관련 아미노산 잔기를 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 달성될 수 있다.
CDR에서의 변형은 예를 들면, 하나 이상의 시스테인을, 예를 들면, 세린 잔기로 대체하는 것을 포함할 수 있다. Asn은 탈아민화를 위한 기질일 수 있고, 이 성향은 Asn 및/또는 인접 아미노산을 대안적인 아미노산으로 대체함으로써, 예컨대, 보존적 치환에 의해 감소될 수 있다. CDR 내의 아미노산 Asp는 이성질체화될 수 있다. 후자는 Asp 또는 인접 아미노산을 대안적인 아미노산으로 대체함으로써, 예컨대, 보존적 치환에 의해 최소화될 수 있다.
가변 영역의 인간화된 버전도 본 명세서의 맥락에서 그의 유도체이다. 인간화는 인간 프레임워크 대신에 비인간 프레임워크의 대체 및 임의적으로 "도너 잔기"로의 하나 이상의 잔기의 복귀-돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "도너 잔기"는 숙주로부터 단리된 원래의 가변 영역에서 발견된 잔기, 특히 인간 프레임워크 내의 소정의 아미노산을 도너 프레임워크 내의 상응하는 위치의 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 결합 도메인 또는 각각의 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편(에 포함되어 있거나 도입되어 있는) 부분이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 결합 도메인은 면역글로불린/항체 분자에 존재한다.
본원에서 사용된 "항체 분자"는 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 적어도 하나의 항원 인식 부위(본원에서 결합 부위 또는 결합 도메인으로서도 지칭됨)를 통해 표적 항원, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드, 펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 "항체 단편"은 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, Fv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 이들 중 임의의 물질의 에피토프 결합 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 항체 결합 단편을 지칭한다(예를 들면, 문헌(Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136) 및 문헌(Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) 참조).
본원에서 사용된 "결합 단편"은 단편을 표적 펩티드 또는 항원에 특이적인 단편으로서 특징규명하기에 충분한 친화성으로 표적 펩티드 또는 항원에 결합할 수 있는 단편을 지칭한다.
이들 항체 단편들을 생성하고 제조하는 방법은 당분야에서 잘 알려져 있다(예를 들면, 문헌(Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181) 참조). 본 개시에서 사용될 다른 항체 단편은 국제 특허출원 공보 제WO05/003169호, 제WO05/003170호 및 제WO05/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중특이성, 예를 들면, 이중특이성을 포함할 수 있거나 단일특이적일 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO92/22853호, 제WO05/113605호, 제WO2009/040562호 및 제WO2010/035012호 참조).
본원에서 사용된 용어 "Fab 단편"은 경쇄의 VL(가변 경쇄) 도메인 및 불변 도메인(CL)을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH(가변 중쇄) 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 지칭한다.
Fv는 2개의 가변 도메인들, 예를 들면, 협력적 가변 도메인들, 예컨대, 한 동족 쌍 또는 친화성 성숙된 가변 도메인들, 즉 VH 및 VL 쌍을 지칭한다.
본원에서 사용된 협력적 가변 도메인들은 서로를 보완하고/하거나 둘 다가 항원 결합에 기여하여, Fv(VH/VL 쌍)가 해당 항원에 대한 특이성을 갖게 만드는 가변 도메인들이다.
다음은 본 개시의 항체 분자에서 사용될 수 있는 예시적인 항체 포맷들의 목록이다:
본원에서 사용된 "단일 도메인 항체"(본원에서 dab 및 sdAb로서도 지칭됨)는 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. 단일 도메인 항체의 예로는 VH 또는 VL 또는 VHH가 있다.
본원에서 사용된 "탠덤-sdAb"는 특히 도메인 항체들이 상이한 항원들에 대한 특이성을 갖는 경우 링커, 예를 들면, 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 도메인 항체들을 지칭한다.
본원에서 사용된 "탠덤-sdAb-sdAb"는 특히 도메인 항체들이 상이한 항원들에 대한 특이성을 갖는 경우 2개의 링커들, 예를 들면, 펩티드 링커들에 의해 일렬로 연결된 3개의 도메인 항체들을 지칭한다.
본원에서 사용된 "dsFv"는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 갖는 Fv를 지칭한다. dsFv는 보다 더 큰 분자의 성분일 수 있고, 예를 들면, 가변 도메인들 중 하나는 예를 들면, 아미노산 링커를 통해 또 다른 항체 단편/성분에 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 "(dsFv)2"는 (예를 들면, 2개의 VH들의 C 말단 사이에서) 예를 들면, 펩티드 링커 또는 디설파이드 결합을 통해 제2 dsFv의 도메인에 연결된 1개의 도메인을 갖는 dsFv를 지칭하고, 이 포맷은 후술되어 있는 (scFv)2와 유사하되, 각각의 가변 영역 쌍은 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "성분"은 특히 성분이 항체 단편, 예컨대, 특히 본원에 기재된 scFv, Fab 또는 다른 단편인 경우 본 개시의 다중특이성 분자의 빌딩 블록 또는 부분을 지칭한다.
본원에서 사용된 "단일 쇄 Fv"(또는 "scFv"로서 약칭됨)는 (예를 들면, 펩티드 링커에 의해) 연결되어 단일 폴리펩티드 쇄를 형성하는 VH 및 VL 항체 도메인들을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 이 포맷에서 생략되어 있다.
본원에서 사용된 "dsscFv"는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 갖는 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용된 "탠덤 scFv"(본원에서 디scFv 또는 (scFv)2로서도 지칭됨)는 예를 들면, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 단일 Fv 간 링커가 존재하도록 단일 링커를 통해 연결된 2개의 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용된 "탠덤 dsscFv"(본원에서 scFvdsscFv 또는 dsscFvscFv로서도 지칭됨)는 예를 들면, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 단일 Fv 간 링커가 존재하도록 단일 링커를 통해 연결된 2개의 scFv를 지칭하고, 이때 상기 scFv들 중 하나는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 갖는다.
본원에서 사용된 "탠덤 디dsscFv"(본원에서 디dsscFv로서도 지칭됨)는 예를 들면, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 단일 Fv 간 링커가 존재하도록 단일 링커를 통해 연결된 2개의 scFv를 지칭하고, 이때 각각의 scFv는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "scFv-dsFv"는 디설파이드 결합을 통해 연결되어 dsFv를 형성하는 2개의 가변 도메인들로 구성된 Fv 도메인에, 예를 들면, 펩티드 링커에 의해 연결된 scFv이다. 이 포맷에서, scFv의 VH 또는 VL은 dsFv의 VH 또는 VL에 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 "dsscFv-dsFv"는 디설파이드 결합을 통해 연결되어 dsFv를 형성하는 2개의 가변 도메인들로 구성된 Fv 도메인에, 예를 들면, 펩티드 링커에 의해 연결된 dsscFv이다. 이 포맷에서, dsscFv의 VH 또는 VL은 dsFv의 VH 또는 VL에 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 "디아바디"는 제1 Fv의 VH가 제2 Fv의 VL에 연결되고 제1 Fv의 VL이 제2 Fv의 VH에 연결되도록 2개의 Fv 간 링커를 갖는 2개의 Fv 쌍 VH/VL을 지칭한다.
본원에서 사용된 "ds디아바디"는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함하는 디아바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "디ds디아바디"는 2개의 가변 영역 내 디설파이드 결합들, 즉 각각의 가변 영역 쌍 사이에서 1개의 디설파이드 결합을 포함하는 디아바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "sc-디아바디"는, 분자가 3개의 링커를 포함하고 2개의 정상 scFv를 형성하도록 Fv 내 링커를 포함하는 디아바디, 예를 들면, VH1링커VL1링커 VH2링커VL2를 지칭한다.
본원에서 사용된 "dssc-디아바디"는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 갖는 sc-디아바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "디dssc-디아바디"는 각각의 가변 영역 쌍 사이에서 가변 영역 내 디설파이드 결합을 갖는 sc-디아바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "Dart"는 VH1 및 VH2의 C 말단들이 디설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 VL1 링커 VH2 링커 및 VH1 링커 VL2를 지칭한다(Paul A. Moore et al Blood, 2011; 117(17):4542-4551).
본원에서 사용된 Bite®는 하기 포맷으로 2개의 가변 도메인 쌍들을 포함하는 분자를 지칭한다: 링커를 통해 쌍 2로부터의 도메인(예를 들면, VH2 또는 VL2)에 연결된, 쌍 1로부터의 도메인(예를 들면, VH1)(이때, 상기 제2 도메인은 쌍 2로부터의 남은 도메인(즉, VL2 또는 VH2)에 연결된, 쌍 1로부터의 추가 도메인(예를 들면, VL1)에 링커에 의해 연결된다).
디-디아바디에 대해서는 문헌(Nunez-Prado et al.), 특히 이 문헌 내의 도 1의 분자 번호 25를 참조한다.
본원에서 사용된 "Ds디-디아바디"는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 갖는 디-디아바디이다.
본원에서 사용된 "디ds디-디아바디"는 각각의 가변 영역 쌍 사이에서 가변 영역 내 디설파이드 결합을 갖는 디-디아바디이다.
본원에서 사용된 "트리아바디"는 3개의 Fv와 3개의 Fv 간 링커를 포함하는, 디아바디와 유사한 포맷을 지칭한다.
본원에서 사용된 "ds트리아바디"는 가변 도메인 쌍들 중 한 가변 도메인 쌍 사이에서 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함하는 트리아바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "디ds트리아바디"는 2개의 가변 영역 내 디설파이드 결합들, 즉 2개의 가변 도메인 쌍들 각각 사이에서 1개의 디설파이드 결합을 포함하는 트리아바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "트리ds트리아바디"는 3개의 가변 영역 내 디설파이드 결합들, 즉 각각의 가변 영역 쌍 사이에서 1개의 디설파이드 결합을 포함하는 트리아바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "테트라바디"는 4개의 Fv와 4개의 Fv 간 링커를 포함하는, 디아바디와 유사한 포맷을 지칭한다.
본원에서 사용된 "ds테트라바디"는 가변 도메인 쌍들 중 한 가변 도메인 쌍 사이에서 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함하는 테트라바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "디ds테트라바디"는 2개의 가변 영역 내 디설파이드 결합들, 즉 2개의 가변 도메인 쌍들 각각 사이에서 1개의 디설파이드 결합을 포함하는 테트라바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "트리ds테트라바디"는 3개의 가변 영역 내 디설파이드 결합들, 즉 3개의 가변 영역 쌍들 각각 사이에서 1개의 디설파이드 결합을 포함하는 테트라바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "테트라ds테트라바디"는 4개의 가변 영역 내 디설파이드 결합들, 즉 각각의 가변 도메인 사이에서 1개의 디설파이드 결합을 포함하는 테트라바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "트리바디"(Fab(scFv)2로서도 지칭됨)는 경쇄의 C 말단에 부착된 제1 scFv 및 중쇄의 C 말단에 부착된 제2 scFv를 갖는 Fab 단편을 지칭한다.
본원에서 사용된 "ds트리바디"는 2개의 위치들 중 1개의 위치에서 dsscFv를 포함하는 트리바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "디ds트리바디" 또는 "TrYbe"는 2개의 dsscFv들을 포함하는 트리바디를 지칭한다.
본원에서 사용된 "dsFab"는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 갖는 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용된 "dsFab'"는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 갖는 Fab'를 지칭한다.
scFab는 단일 쇄 Fab 단편이다.
scFab'는 단일 쇄 Fab' 단편이다.
dsscFab는 단일 쇄로서의 dsFab이다.
dsscFab'는 단일 쇄로서의 dsFab'이다.
본원에서 사용된 "Fabdab"는 임의적으로 링커를 통해 그의 중쇄 또는 경쇄에 부착된 도메인 항체를 갖는 Fab 단편을 지칭한다.
본원에서 사용된 "Fab'dab"는 임의적으로 링커를 통해 그의 중쇄 또는 경쇄에 부착된 도메인 항체를 갖는 Fab' 단편을 지칭한다.
본원에서 사용된 "FabFv"는 중쇄의 CH1 및 경쇄의 CL 각각의 C 말단에 부착된 추가 가변 영역을 갖는 Fab 단편을 지칭한다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2009/040562호 참조). 이 포맷은 그의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2011/061492호 참조).
본원에서 사용된 "Fab'Fv"는 FabFv와 유사하되, Fab 부분이 Fab'에 의해 대체되어 있다. 이 포맷은 그의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 "FabdsFv"는, Fv 내 디설파이드 결합이, 부착된 C 말단 가변 영역을 안정화시키는 FabFv를 지칭한다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2010/035012호 참조). 이 포맷은 그의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 "Fab 단일 링커 Fv" 및 "Fab' 단일 링커"는 예를 들면, 펩티드 링커에 의해 가변 도메인에 연결된 Fab 또는 Fab' 단편을 지칭하고, 상기 가변 도메인은 가변 도메인 내 디설파이드 결합을 통해 제2 가변 도메인에 연결되어, dsFv를 형성한다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2014/096390호 참조).
본원에서 사용된 "Fab-scFv"(비바디로서도 지칭됨)는 임의적으로 링커를 통해 경쇄 또는 중쇄의 C 말단 상에 부착된 scFv를 갖는 Fab 분자이다.
본원에서 사용된 "Fab'-scFv"는 임의적으로 링커를 통해 경쇄 또는 중쇄의 C 말단 상에 부착된 scFv를 갖는 Fab' 분자이다.
본원에서 사용된 "FabdsscFv" 또는 "BYbe"는 단일 쇄 Fv의 가변 영역들 사이에서 디설파이드 결합을 갖는 Fab-scFv이다.
본원에서 사용된 "Fab'dsscFv"는 단일 쇄 Fv의 가변 영역들 사이에서 디설파이드 결합을 갖는 Fab'scFv이다.
본원에서 사용된 "FabscFv-dab"는 한 쇄의 C 말단에 부착된 scFv 및 다른 한 쇄의 C 말단에 부착된 도메인 항체를 갖는 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용된 "Fab'scFv-dab"는 한 쇄의 C 말단에 부착된 scFv 및 다른 한 쇄의 C 말단에 부착된 도메인 항체를 갖는 Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용된 "FabdsscFv-dab"는 한 쇄의 C 말단에 부착된 dsscFv 및 다른 한 쇄의 C 말단에 부착된 도메인 항체를 갖는 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용된 "Fab'dsscFv-dab"는 한 쇄의 C 말단에 부착된 dsscFv 및 다른 한 쇄의 C 말단에 부착된 도메인 항체를 갖는 Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용된 "FabscFv 단일 링커 Fv"는 Fv의 도메인이 Fab의 중쇄 또는 경쇄에 연결되어 있고 scFv가 다른 한 Fab 쇄에 연결되어 있고 Fv의 도메인들이 가변 영역 내 디설파이드에 의해 연결되어 있는 Fab 단일 링커 Fv를 지칭한다.
본원에서 사용된 "FabdsscFv 단일 링커 Fv"는 scFv가 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함하는 FabscFv 단일 링커 Fv를 지칭한다.
본원에서 사용된 "Fab'scFv 단일 링커 Fv"는 Fv의 도메인이 Fab의 중쇄 또는 경쇄에 연결되어 있고 scFv가 다른 한 Fab 쇄에 연결되어 있고 Fv의 도메인들이 가변 영역 내 디설파이드에 의해 연결되어 있는 Fab' 단일 링커 Fv를 지칭한다.
본원에서 사용된 "Fab'dsscFv 단일 링커 Fv"는 scFv가 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함하는 Fab'scFv 단일 링커 Fv를 지칭한다.
본원에서 사용된 "FvFabFv"는 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착된 제1 Fv의 도메인, 및 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착된 제2 Fv의 도메인을 갖는 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용된 "FvFab'Fv"는 Fab'의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착된 제1 Fv의 도메인, 및 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착된 제2 Fv의 도메인을 갖는 Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용된 "dsFvFabFv"는 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착된 제1 Fv의 도메인, 및 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착된 제2 Fv의 도메인을 갖는 Fab를 지칭하고, 이때 제1 Fv는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "FvFabdsFv"는 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착된 제1 Fv의 도메인, 및 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착된 제2 Fv의 도메인을 갖는 Fab를 지칭하고, 이때 제2 Fv는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "dsFvFab'Fv"는 Fab'의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착된 제1 Fv의 도메인, 및 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착된 제2 Fv의 도메인을 갖는 Fab'를 지칭하고, 이때 제1 Fv는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "FvFab'dsFv"는 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착된 제1 Fv의 도메인, 및 Fab'의 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착된 제2 Fv의 도메인을 갖는 Fab'를 지칭하고, 이때 제2 Fv는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "dsFvFabdsFv"는 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착된 제1 Fv의 도메인, 및 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착된 제2 Fv의 도메인을 갖는 Fab를 지칭하고, 이때 제1 Fv는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함하고 제2 Fv도 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "dsFvFab'dsFv"는 Fab'의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착된 제1 Fv의 도메인, 및 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착된 제2 Fv의 도메인을 갖는 Fab'를 지칭하고, 이때 제1 Fv는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함하고 제2 Fv도 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "FabFvFv"는 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 일렬로 부착된 두 쌍의 Fv들을 갖는 Fab 단편을 지칭한다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2011/086091호 참조).
본원에서 사용된 "Fab'FvFv"는 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 일렬로 부착된 두 쌍의 Fv들을 갖는 Fab' 단편을 지칭한다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2011/086091호 참조).
본원에서 사용된 "FabdsFvFv"는 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 일렬로 부착된 두 쌍의 Fv들을 갖는 Fab 단편을 지칭하고, 이때 C 말단에 직접적으로 부착된 제1 Fv 쌍은 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2011/086091호 참조).
본원에서 사용된 "Fab'dsFvFv"는 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 일렬로 부착된 두 쌍의 Fv들을 갖는 Fab' 단편을 지칭하고, 이때 C 말단에 직접적으로 부착된 제1 Fv 쌍은 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2011/086091호 참조).
본원에서 사용된 "FabFvdsFv"는 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 일렬로 부착된 두 쌍의 Fv들을 갖는 Fab 단편을 지칭하고, 이때 분자의 "C" 말단에서 제2 Fv 쌍은 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "Fab'FvdsFv"는 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 일렬로 부착된 두 쌍의 Fv들을 갖는 Fab' 단편을 지칭하고, 이때 분자의 "C" 말단에서 제2 Fv 쌍은 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "FabdsFvdsFv"는 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 일렬로 부착된 두 쌍의 Fv들을 갖는 Fab 단편을 지칭하고, 이때 제1 Fv 쌍 및 제2 Fv 쌍은 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "Fab'dsFvdsFv"는 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 일렬로 부착된 두 쌍의 Fv들을 갖는 Fab' 단편을 지칭하고, 이때 제1 Fv 및 제2 Fv는 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 "디Fab"는 그들의 중쇄의 C 말단을 통해 연결된 2개의 Fab 분자들을 지칭한다.
본원에서 사용된 "디Fab'"는 그들의 힌지 영역에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된 2개의 Fab' 분자를 지칭한다.
디Fab 및 디Fab' 분자는 그들의 화학적으로 접합된 형태를 포함한다.
본원에서 사용된 "(FabscFv)2"는 2개의 scFv들이 부착되어 있는, 예를 들면, 중쇄 또는 경쇄, 예컨대, 중쇄의 C 말단에 부착되어 있는 디Fab 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 "(Fab'scFv)2"는 2개의 scFv들이 부착되어 있는, 예를 들면, 중쇄 또는 경쇄, 예컨대, 중쇄의 C 말단에 부착되어 있는 디Fab' 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 "(Fab)2scFvdsFv"는 scFv 및 dsFv가 예를 들면, 중쇄 C 말단 각각으로부터 하나씩 부착되어 있는 디Fab를 지칭한다.
본원에서 사용된 "(Fab')2scFvdsFv"는 scFv 및 dsFv가 예를 들면, 중쇄 C 말단 각각으로부터 하나씩 부착되어 있는 디Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용된 "(Fab)2dsscFvdsFv"는 dsscFv 및 dsFv가 예를 들면, 중쇄 C 말단으로부터 부착되어 있는 디Fab를 지칭한다.
본원에서 사용된 "(Fab')2dsscFvdsFv"는 dsscFv 및 dsFv가 예를 들면, 중쇄 C 말단으로부터 부착되어 있는 디Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용된 "미니바디"는 (VL/VH-CH3)2를 지칭한다.
본원에서 사용된 "ds미니바디"는 1개의 VL/VH가 가변 영역 내 디설파이드 결합을 포함하는 (VL/VH-CH3)2를 지칭한다.
본원에서 사용된 "디ds미니바디"는 (dsFv-CH3)2를 지칭한다.
'카파/람다 바디' 또는 'κ/λ-바디'는 2개의 중쇄들 및 2개의 경쇄들을 갖는 정상 IgG의 포맷으로 존재하고, 이때 상기 2개의 경쇄들은 서로 상이하고, 하나는 람다 경쇄(VL-CL)이고 다른 하나는 카파 경쇄(VK-CK)이다. 중쇄는 국제 특허출원 공보 제WO2012/023053호에 기재된 바와 같이 CDR에서 조차도 동일하다.
본원에서 사용된 "scFv-Fc"는 분자가 2개의 결합 도메인들을 갖도록, 예를 들면, 힌지를 통해 불변 영역 단편 -(CH2CH3)의 CH2 도메인의 N 말단에 부착된 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용된 "dsscFv-Fc"는 분자가 2개의 결합 도메인들을 갖도록 예를 들면, 힌지를 통해 불변 영역 단편 -(CH2CH3)2의 CH2 도메인의 N 말단에 부착된 dsscFv 및 제2 CH2 도메인의 N 말단에 부착된 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용된 "디dsscFv-Fc"는 분자가 2개의 결합 도메인들을 갖도록, 예를 들면, 힌지를 통해 불변 영역 단편 -(CH2CH3)2의 CH2 도메인의 N 말단에 부착된 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용된 "탠덤 scFv-Fc"는 분자가 4개의 결합 도메인들을 갖도록, 예를 들면, 힌지를 통해 불변 영역 단편 -(CH2CH3)의 CH2 도메인의 N 말단에 일렬로 각각 하나씩 부착된 2개의 탠덤 scFv들을 지칭한다.
본원에서 사용된 "sc디아바디-Fc"는 예를 들면, 힌지를 통해 불변 영역 단편 -CH2CH3의 CH2 도메인의 N 말단에 각각 하나씩 부착된 2개의 sc디아바디들이다.
본원에서 사용된 "scFv-Fc-scFv"는 -CH2CH3 단편의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 N 말단 및 C 말단에 각각 하나씩 부착된 4개의 scFv들을 지칭한다.
본원에서 사용된 "sc디아바디-CH3"는, 예를 들면, 힌지를 통해 CH3 도메인에 각각 연결된 2개의 sc디아바디 분자들을 지칭한다.
본원에서 사용된 "IgG-scFv"는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C 말단 상에서 scFv를 갖는 전장 항체이다.
본원에서 사용된 "scFv-IgG"는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N 말단 상에서 scFv를 갖는 전장 항체이다.
본원에서 사용된 "V-IgG"는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N 말단 상에서 가변 도메인을 갖는 전장 항체이다.
본원에서 사용된 "IgG-V"는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C 말단 상에서 가변 도메인을 갖는 전장 항체이다.
DVD-Ig(이중 V 도메인 IgG로서도 공지되어 있음)는 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄의 N 말단 상에서 하나씩 4개의 추가 가변 도메인들을 갖는 전장 항체이다.
본원에서 사용된 "듀오바디" 또는 "Fab-아암 교환"은 혼합 시 2개의 상이한 단일클론 항체들의 불변 도메인(전형적으로 CH3) 내의 일치되고 상보적인 조작된 아미노산 변화가 이종이량체의 형성을 유발하는 경우의 이중특이성 IgG 포맷 항체이다. 제1 항체로부터의 중쇄:경쇄 쌍은 잔기 조작의 결과로서 제2 항체의 중쇄:경쇄 쌍과 회합하는 것을 선호할 것이다. 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2008/119353호, 제WO2011/131746호 및 제WO2013/060867호를 참조한다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체 분자는 하기 식을 갖는 이중특이성 단백질 복합체이다:
A-X:Y-B
상기 식에서,
A-X는 제1 융합 단백질이고;
Y-B는 제2 융합 단백질이고;
X:Y는 이종이량체-테더(tether)이고;
:는 X와 Y 사이의 결합 상호작용이고;
A는 Fab 또는 Fab' 단편으로부터 선택된 이중특이성 제1 단백질 성분이고;
B는 Fab 또는 Fab'로부터 선택된 이중특이성 제2 단백질 성분이고;
X는 항원 또는 항체 또는 이의 결합 단편으로부터 독립적으로 선택된, 결합 쌍의 제1 결합 파트너이고;
Y는 항원 또는 항체 또는 이의 결합 단편으로부터 독립적으로 선택된, 결합 쌍의 제2 결합 파트너이되;
X가 항원일 때 Y는 X로 표시된 항원에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편이고, Y가 항원일 때 X는 Y로 표시된 항원에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편이다.
한 양태에서, a) 하기 식 (I)의 폴리펩티드 쇄; 및 b) 하기 식 (II)의 폴리펩티드 쇄를 포함하거나 이들로 구성된 다중특이성 항체 분자가 제공된다:
[식 (I)]
VH-CH1-X-(V1)p
[식 (II)]
VL-CL-Y-(V2)q
상기 식에서,
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인, 예를 들면, 이의 도메인 1을 나타내고;
X는 결합 또는 링커, 예를 들면, 아미노산 링커를 나타내고;
Y는 결합 또는 링커, 예를 들면, 아미노산 링커를 나타내고;
V1은 dab, scFv, dsscFv 또는 dsFv를 나타내고;
VL은 가변 도메인, 예를 들면, 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 불변 영역으로부터의 도메인, 예를 들면, 경쇄 불변 영역 도메인, 예컨대, C카파를 나타내고;
V2는 dab, scFv, dsscFv 또는 dsFv를 나타내고;
p는 0 또는 1이고;
q는 0 또는 1이고;
p가 1일 때 q는 0 또는 1이고, q가 1일 때 p는 0 또는 1이다. 즉, p 및 q는 둘 다 0을 나타내지 않는다.
상기 포맷은 국제 특허출원 공보 제WO2015/19772호에 이미 기재되었다.
한 실시양태에서, 다중특이성 항체 분자는 VH/VL, V1 또는 V2로부터 선택된, CD79에 대한 하나 이하의 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 다중특이성 항체 분자는 CD45에 대한 하나 이하의 결합 도메인 및 CD79에 대한 하나 이하의 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 다중특이성 항체 분자는 CD22에 대한 하나 이하의 결합 도메인 및 CD79에 대한 하나 이하의 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, q는 0이고 p는 1이다.
한 실시양태에서, q는 1이고 p는 1이다.
한 실시양태에서, V1은 dab이고 V2는 dab이고 이들은 함께 임의적으로 디설파이드 결합에 의해 연결되는 협력적 쌍의 가변 영역들, 예컨대, 동족 VH/VL 쌍의 단일 결합 도메인을 형성한다.
한 실시양태에서, VH 및 VL은 CD79, 예를 들면, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD79, 예를 들면, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, V2는 CD79, 예를 들면, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1 및 V2는 함께 (예를 들면, 결합 도메인으로서) CD79, 예를 들면, CD79a 또는 CD79b에 특이적이고, VH 및 VL은 CD45 또는 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD45 또는 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V2는 CD45 또는 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1 및 V2는 함께 (예를 들면, 하나의 결합 도메인으로서) CD45 또는 CD22에 특이적이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD45 또는 CD22에 특이적이고, V2는 알부민에 특이적이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 알부민에 특이적이고, V2는 CD45에 특이적이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD79에 특이적이고, V2는 알부민에 특이적이고, VH 및 VL은 CD45 또는 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 알부민에 특이적이고, V2는 CD79에 특이적이고, VH 및 VL은 CD45 또는 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD45 또는 CD22에 특이적인 dsscFv이고, V2는 알부민에 특이적인 dsscFv이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 알부민에 특이적인 dsscFv이고, V2는 CD45 또는 CD22에 특이적인 dscFv이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD79에 특이적인 dsscFv이고, V2는 알부민에 특이적인 dsscFv이고, VH 및 VL은 CD45 또는 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 알부민에 특이적인 dsscFv이고, V2는 CD79에 특이적인 dsscFv이고, VH 및 VL은 CD45 또는 CD22에 특이적이다.
상기 구축물들에서 V1, V2, VH 및 VL은 결합 도메인을 각각 나타낼 수 있고 본원에서 제공된 서열들 중 임의의 서열을 포함할 수 있다.
X 및 Y는 임의의 적합한 링커를 나타낼 수 있고, 예를 들면, X 및 Y는 독립적으로 SGGGGSGGGGS(서열번호 339) 또는 SGGGGTGGGGS(서열번호 340)일 수 있다.
한 실시양태에서, V1 및/또는 V2가 dab, dsFv 또는 dsscFv일 때, V1 및/또는 V2의 가변 도메인 VH와 VL 사이의 디설파이드 결합은 위치 VH44와 VL100 사이에서 형성된다.
다중특이성 항체 분자에서 하나 이상의 가변 영역 쌍들이 VH와 VL 사이에서 디설파이드 결합을 포함하는 경우, 이것은 임의의 적합한 위치, 예컨대, 하기 나열된 잔기들 중 2개의 잔기들 사이에 존재할 수 있다(문맥이 달리 표시하지 않은 한, 카바트 넘버링이 하기 목록에서 사용된다). 카바트 넘버링이 언급되는 경우 언제나 관련 문헌은 참고문헌(Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)이다.
한 실시양태에서, 디설파이드 결합은 하기 위치들을 포함하는 군으로부터 선택된 위치, 및 분자에 위치한 가변 영역 쌍에서 그에 상응하는 위치에 존재한다:
Figure pct00048
VH37 + VL95C(예를 들면, 문헌(Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)) 참조);
Figure pct00049
VH44 + VL100(예를 들면, 문헌(Biochemistry 33 5451-5459 Reiter et al (1994)); 문헌(Journal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 pp.18327-18331 Reiter et al (1994)); 또는 문헌(Protein Engineering, vol.10 no.12 pp.1453-1459 Rajagopal et al (1997)) 참조);
Figure pct00050
VH44 + VL105(예를 들면, 문헌(J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995)) 참조);
Figure pct00051
VH45 + VL87(예를 들면, 문헌(Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)) 참조);
Figure pct00052
VH55 + VL101(예를 들면, 문헌(FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)) 참조);
Figure pct00053
VH100 + VL50(예를 들면, 문헌(Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990)) 참조);
Figure pct00054
VH100b + VL49;
Figure pct00055
VH98 + VL46(예를 들면, 문헌(Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)) 참조);
Figure pct00056
VH101 + VL46;
Figure pct00057
VH105 + VL43(예를 들면, 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993)); 또는 문헌(Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994)) 참조); 및
Figure pct00058
VH106 + VL57(예를 들면, 문헌(FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995) 참조).
한 실시양태에서, 디설파이드 결합은 위치 VH44와 VL100 사이에서 형성된다.
본원에서 사용된 "단일특이성"은 1회만 표적 항원에 결합하는 능력을 지칭한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이성 분자는 각각의 항원에 단일특이적이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시에 따른 다중특이성 분자의 결합 도메인은 단일특이적이다. 이것은, 본 개시의 분자들은 1회 넘게 표적 항원에 결합함으로써 항원을 교차결합시킬 수 없기 때문에 일부 치료적 적용에서 유리하다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이성 또는 다중특이성 분자는 예를 들면, 동일한 세포 또는 2개의 상이한 세포들 상의 2개의 상이한 위치들에서 동일한 표적에 2회 결합함으로써 교차결합할 수 없다.
특히 동일한 세포 또는 상이한 세포들 상의 CD79b와 관련하여, 교차결합은 예를 들면, 표적 항원의 활성을 자극하는 신호를 생체 내에서 생성할 수 있다.
일례에서, 본 발명의 다중특이성 분자는 CD22에 대한 하나 이하의 결합 도메인 및 CD79에 대한 하나 이하의 결합 도메인을 함유한다. 각각의 결합 도메인은 단일특이적이다.
따라서, 일례에서, 다중특이성 분자는 CD22에 대해 1가이고 CD79에 대해 1가이다.
일례에서, 본 발명의 다중특이성 분자는 CD45에 대한 하나 이하의 결합 도메인 및 CD79에 대한 하나 이하의 결합 도메인을 함유한다. 각각의 결합 도메인은 단일특이적이다.
따라서, 일례에서, 다중특이성 분자는 CD45에 대해 1가이고 CD79에 대해 1가이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 분자에서 사용되는 각각의 항체 또는 항체 단편은 1가이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 분자의 결합 도메인은 1가이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 분자의 결합 도메인은 1가이고 단일특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 분자는 임의의 적합한 방식으로 조합되거나 연결되어, 예를 들면, 본원에 전술되어 있는 바와 같은 다중특이성 분자를 구축하는 2개 이상의 단일특이성 1가 결합 도메인들, 예컨대, Fab, Fab', scFv, VH, VL, VHH, Fv, dsFv로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, 예를 들면, 본 개시의 분자가 적어도 3개의 결합 도메인들을 포함하는 경우, 2개 또는 3개의 결합 도메인들(예를 들면, 항체, 단편, 또는 항체와 단편의 조합)은 상이한 항원 특이성, 예를 들면, 3개의 상이한 표적 항원들에의 결합을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 단락들에 기재된 다중특이성 분자도 제공한다:
1. 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인은 CDRH1에 대해 서열번호 8, CDRH2에 대해 서열번호 9 및 CDRH3에 대해 서열번호 4에 제공된 서열을 갖는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
2. 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, 항원 CD79b에 특이적인 결합 도메인은 CDRH1에 대해 서열번호 11, CDRH2에 대해 서열번호 12 및 CDRH3에 대해 서열번호 3에 제공된 서열을 갖는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
3. 제1 단락에 있어서, CD79b에 특이적인 결합 도메인은 CDRL1에 대해 서열번호 13, CDRL2에 대해 서열번호 14 및 CDRL3에 대해 서열번호 15, 16, 17 또는 18에 제공된 서열을 갖는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
4. 제2 단락에 있어서, CD79b에 특이적인 결합 도메인은 CDRL1에 대해 서열번호 19, CDRL2에 대해 서열번호 20 및 CDRL3에 대해 서열번호 21, 22, 23 또는 24에 제공된 서열을 갖는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
5. 제1 단락 내지 제4 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 결합 도메인 또는 결합 도메인들은 관련 항원에 특이적인 항체 가변 영역을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
6. 제1 단락 내지 제5 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 각각의 결합 도메인은 2개의 항체 가변 도메인들을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
7. 제6 단락에 있어서, 2개의 항체 가변 도메인들은 VH/VL 쌍인 다중특이성 분자.
8. 제1 단락 내지 제7 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 이중특이성 또는 삼중특이성인 다중특이성 분자.
9. 제1 단락 내지 제8 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 융합 단백질인 다중특이성 분자.
10. 제1 단락 내지 제9 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 분자 포맷은 디아바디, sc디아바디, 트리아바디, 탠덤 scFv, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab-(dsscFv)2 디Fab, 디Fab', 트리바디, 탠덤 scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3, Ig-scFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, 듀오바디 및 DVD-Ig로부터 선택되는 것인 다중특이성 분자.
11. 제1 단락 내지 제10 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 각각의 결합 도메인은 단일특이적인 다중특이성 분자.
12. 제1 단락 내지 제11 단락 중 어느 한 단락에 있어서, CD22에 특이적인 하나 이하의 결합 도메인 및 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 하나 이하의 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자.
13. 제1 단락 내지 제12 단락 중 어느 한 단락에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인 및 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인은 Fab, scFv, Fv, dsFv 및 dsscFv로부터 독립적으로 선택되는 것인 다중특이성 분자.
14. 제1 단락 내지 제13 단락 중 어느 한 단락에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인은 본원에서 제공된 항-CD22 항체로부터의 3개의 중쇄 CDR들 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
15. 제1 단락 내지 제14 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 결합 도메인은 인간화된 것인 다중특이성 분자.
16. 제1 단락 내지 제15 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산은 다른 아미노산으로 치환된 것인 다중특이성 분자.
17. 제16 단락에 있어서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 다른 아미노산으로 치환된 것인 다중특이성 분자.
18. 제16 단락 또는 제17 단락에 있어서, 하나 이상의 아스파르트산 이성질체화 부위 및/또는 아스파라긴 탈아미드화 부위 및/또는 글리코실화 부위는 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산을 치환시킴으로써 제거된 것인 다중특이성 분자.
19. 제1 단락 내지 제18 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민에 특이적인 결합 도메인을 추가로 포함하는 다중특이성 분자.
20. 제1 단락 내지 제19 단락 중 어느 한 단락에 정의된 하나 이상의 다중특이성 단백질을 포함하는 조성물.
21. 제1 단락 내지 제21 단락 중 어느 한 단락에 정의된 다중특이성 단백질 또는 이의 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
22. 제21 단락에 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
23. 치료법에 사용하기 위한, 제1 단락 내지 제22 단락 중 어느 한 단락에 따른 다중특이성 단백질 또는 제20 단락에 따른 조성물.
24. 치료법에 사용하기 위한, 특히 본원에 기재된 병태 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제1 단락 내지 제19 단락 중 어느 한 단락에 따른 다중특이성 단백질 또는 제20 단락에 따른 조성물의 용도.
25. 치료 유효량의 제1 단락 내지 제19 단락 중 어느 한 단락에 따른 다중특이성 단백질 또는 제20 단락에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
따라서, 본 발명은 하기 단락들에 기재된 다중특이성 분자도 제공한다:
26. 항원 CD45에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인은 CDRH1에 대해 서열번호 8, CDRH2에 대해 서열번호 9 및 CDRH3에 대해 서열번호 4에 제공된 서열을 갖는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
27. 항원 CD45에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, 항원 CD79b에 특이적인 결합 도메인은 CDRH1에 대해 서열번호 11, CDRH2에 대해 서열번호 12 및 CDRH3에 대해 서열번호 3에 제공된 서열을 갖는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
28. 제1 단락에 있어서, CD79b에 특이적인 결합 도메인은 CDRL1에 대해 서열번호 13, CDRL2에 대해 서열번호 14 및 CDRL3에 대해 서열번호 15, 16, 17 또는 18에 제공된 서열을 갖는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
29. 제2 단락에 있어서, CD79b에 특이적인 결합 도메인은 CDRL1에 대해 서열번호 19, CDRL2에 대해 서열번호 20 및 CDRL3에 대해 서열번호 21, 22, 23 또는 24에 제공된 서열을 갖는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
30. 제26 단락 내지 제29 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 결합 도메인 또는 결합 도메인들은 관련 항원에 특이적인 항체 가변 영역을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
31. 제26 단락 내지 제30 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 각각의 결합 도메인은 2개의 항체 가변 도메인들을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
32. 제31 단락에 있어서, 2개의 항체 가변 도메인들이 VH/VL 쌍인 다중특이성 분자.
33. 제26 단락 내지 제32 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 이중특이성 또는 삼중특이성인 다중특이성 분자.
34. 제26 단락 내지 제33 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 융합 단백질인 다중특이성 분자.
35. 제26 단락 내지 제34 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 분자 포맷은 디아바디, sc디아바디, 트리아바디, 탠덤 scFv, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab-(dsscFv)2 디Fab, 디Fab', 트리바디, 탠덤 scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3, Ig-scFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, 듀오바디 및 DVD-Ig로부터 선택되는 것인 다중특이성 분자.
36. 제26 단락 내지 제35 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 각각의 결합 도메인은 단일특이적인 다중특이성 분자.
37. 제26 단락 내지 제36 단락 중 어느 한 단락에 있어서, CD45에 특이적인 하나 이하의 결합 도메인 및 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 하나 이하의 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자.
38. 제26 단락 내지 제37 단락 중 어느 한 단락에 있어서, CD45에 특이적인 결합 도메인 및 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인은 Fab, scFv, Fv, dsFv 및 dsscFv로부터 독립적으로 선택되는 것인 다중특이성 분자.
39. 제26 단락 내지 제38 단락 중 어느 한 단락에 있어서, CD45에 특이적인 결합 도메인은 본원에서 제공된 항-CD45 항체로부터의 3개의 중쇄 CDR들 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이성 분자.
40. 제26 단락 내지 제39 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 결합 도메인은 인간화된 것인 다중특이성 분자.
41. 제26 단락 내지 제40 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산은 다른 아미노산으로 치환된 것인 다중특이성 분자.
42. 제41 단락에 있어서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 다른 아미노산으로 치환된 것인 다중특이성 분자.
43. 제41 단락 또는 제42 단락에 있어서, 하나 이상의 아스파르트산 이성질체화 부위 및/또는 아스파라긴 탈아미드화 부위 및/또는 글리코실화 부위는 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산을 치환시킴으로써 제거된 것인 다중특이성 분자.
44. 제26 단락 내지 제43 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민에 특이적인 결합 도메인을 추가로 포함하는 다중특이성 분자.
45. 제26 단락 내지 제44 단락 중 어느 한 단락에 정의된 하나 이상의 다중특이성 단백질을 포함하는 조성물.
46. 제26 단락 내지 제45 단락 중 어느 한 단락에 정의된 다중특이성 단백질 또는 이의 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
47. 제46 단락에 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
48. 치료법에 사용하기 위한, 제26 단락 내지 제44 단락 중 어느 한 단락에 따른 다중특이성 단백질 또는 제45 단락에 따른 조성물.
49. 치료법에 사용하기 위한, 특히 본원에 기재된 병태 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제36 단락 내지 제44 단락 중 어느 한 단락에 따른 다중특이성 단백질 또는 제45 단락에 따른 조성물의 용도.
50. 치료 유효량의 제26 단락 내지 제44 단락 중 어느 한 단락에 따른 다중특이성 단백질 또는 제45 단락에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
불변 영역
본 개시의 항체 분자, 예를 들면, 전장 항체 또는 다중특이성 분자의 항체 불변 영역 도메인은 존재하는 경우 항체 분자의 제안된 기능 및 특히 요구될 수 있는 이펙터(effector) 기능을 유념하면서 선택될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 분자가 치료적 용도를 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구될 때, 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 IgG1 및 IgG3 이소타입(isotypes)의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료적 목적을 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때 IgG2 및 IgG4 이소타입이 사용될 수 있다.
이들 불변 영역 도메인들의 서열 변이체도 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들면, 위치 241에서 세린이 문헌(Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108)에 기재된 바와 같이 프롤린으로 교체되어 있는 IgG4 분자가 사용될 수 있다. 따라서, 항체가 IgG4 항체인 실시양태에서, 항체는 돌연변이 S241P를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 카파 또는 람다 CL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 카파 또는 람다 CL 도메인을 포함한다.
4종의 인간 IgG 이소타입들은 상이한 친화성으로 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제 FcγRIIb 수용체 및 보체의 제1 성분(C1q)에 결합하여, 매우 상이한 이펙터 기능들을 제공한다(Bruhns P. et al., 2009. Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses. Blood. 113(16):3716-25). 문헌(Jeffrey B. Stavenhagen, et al. Cancer Research 2007 Sep 15; 67(18):8882-90)도 참조한다.
IgG와 FcγR 또는 C1q의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치한 잔기에 의존한다. CH2 도메인의 2개 영역들은 FcγR 및 C1q 결합에 매우 중요하고, IgG2 및 IgG4에서 특유의 서열을 갖는다. 위치 233-236에서 인간 IgG1 또는 IgG2 잔기로의 치환, 및 위치 327, 330 및 331에서 인간 IgG4 잔기로의 치환은 ADCC 및 CDC를 크게 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Armour KL. et al., 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 29(8):2613-24 and Shields RL. et al., 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 276(9):6591-604). 더욱이, 일부 연구자들(Idusogie et al.)은 K322를 비롯한 상이한 위치들에서의 알라닌 치환이 보체 활성화를 상당히 감소시켰다는 것을 입증하였다(Idusogie EE. et al., 2000. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc. J Immunol. 164(8):4178-84). 유사하게, 뮤린 IgG2A의 CH2 도메인 내의 돌연변이는 FcγRI 및 C1q에의 결합을 감소시키는 것으로 확인되었다(Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J Immunol. 155(3):1165-74).
한 실시양태에서, 사용된 Fc 영역은 돌연변이되고, 특히 본원에 기재된 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 돌연변이는 결합 및/또는 이펙터 기능을 제거하기 위한 것이다.
한 실시양태에서, Fc 돌연변이는 Fc 영역의 결합을 제거하기 위한 돌연변이, 이펙터 기능을 증가시키거나 제거하기 위한 돌연변이, 반감기를 증가시키기 위한 돌연변이 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
pH 7.4에서는 FcRn에 결합하지 않으나 pH 6.0에서 FcRn에 선택적으로 결합하는 일부 항체들은 다양한 동물 모델들에서 보다 더 높은 반감기를 나타낸다. CH2 도메인과 CH3 도메인 사이의 계면에 위치한 여러 돌연변이들, 예컨대, T250Q/M428L(Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279(8):6213-6) 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F(Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nat Biotechnol. 23(10):1283-8)는 생체 내에서 FcRn에 대한 결합 친화성 및 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
그러나, 증가된 FcRn 결합과 개선된 반감기 사이에 직접적인 관계가 항상 존재하는 것은 아니다(Datta-Mannan A. et al., 2007. Humanized IgG1 Variants with Differential Binding Properties to the Neonatal Fc Receptor: Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates. Drug Metab. Dispos. 35: 86-94).
IgG4 서브클래스는 감소된 Fc 수용체(FcγRIIIa) 결합을 보이지만, 다른 IgG 서브클래스의 항체들은 일반적으로 강한 결합을 보인다. 이들 다른 IgG 서브타입들의 감소된 수용체 결합은 Pro238, Aps265, Asp270, Asn270(Fc 탄수화물의 상실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써, 예를 들면, 대체함으로써 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 분자는 IgG 서브클래스, 예를 들면, IgG1, IgG2 또는 IgG3의 Fc를 갖고, 이때 상기 Fc는 위치 S228, L234 및/또는 D265 중 1개, 2개 또는 모든 위치에서 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 영역 내의 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235A, L235E 및 이들의 조합로부터 독립적으로 선택된다.
Fc 영역의 이펙터 기능을 감소시키거나 증가시키는 것이 요구될 수 있다. 세포 표면 분자, 특히 면역 세포 상의 세포 표면 분자를 표적화하여 이펙터 기능을 제거하는 항체가 요구된다. 일부 실시양태들에서, 예를 들면, 자가면역의 치료를 위해, 음성 Fc 수용체 결합(FcγRIIb 또는 CD32b)의 증가에 의한 면역 세포 상에서의 향상된 Fc 결합이 바람직할 수 있다(문헌(Stavenhagen JB, et al., Advances in Enzyme Regulation 2007 December 3 and Veri MC, et al. Arthritis Rheum, 2010 Mar 30;62(7):1933-43) 참조). 대조적으로, 종양학에서 사용될 항체의 경우, 이펙터 기능의 증가는 치료적 활성을 개선할 수 있다.
다수의 돌연변이들이 인간 IgG1의 CH2 도메인에서 만들어졌고 시험관 내에서 ADCC 및 CDC에 대한 그들의 효과가 시험되었다(Idusogie EE. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J Immunol. 166(4):2571-5). 특히, 위치 333에서의 알라닌 치환은 ADCC 및 CDC 둘 다를 증가시키는 것으로 보고되었다. 일부 연구자들(Lazar et al.)은 FcγRIIIa에 대한 보다 더 높은 친화성 및 FcγRIIb에 대한 보다 더 낮은 친화성을 가짐으로써 ADCC를 향상시키는 삼중 돌연변이체(S239D/I332E/A330L)를 기술하였다(Lazar GA. et al., 2006. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. PNAS 103(11): 4005-4010). 동일한 돌연변이들이 증가된 ADCC를 갖는 항체를 생성하는 데 사용되었다(Ryan MC. et al., 2007. Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasma cells. Mol. Cancer Ther., 6: 3009-3018). 일부 연구자들(Richards et al.)은 대식세포에 의한 표적 세포의 향상된 식세포작용을 매개하는 개선된 FcγRIIIa 친화성 및 FcγRIIa/FcγRIIb 비를 갖는 약간 상이한 삼중 돌연변이체(S239D/I332E/G236A)를 연구하였다(Richards JO et al 2008. Optimization of antibody binding to Fcgamma RIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther. 7(8):2517-27).
IgG4 항체들은 그들의 이펙터 기능의 결여로 인해 세포 고갈 없는 수용체 차단에 적합한 IgG 서브클래스를 대표한다. IgG4 분자는 Fab-아암 교환으로서 지칭되는 동적 과정에서 절반-분자를 교환할 수 있다. 이 현상은 치료적 항체와 내재성(endogenous) IgG4 사이에 일어날 수 있다. S228P 돌연변이는 이 재조합 과정을 방해함으로써, 덜 예측불가능한 치료적 IgG4 항체의 디자인을 가능하게 하는 것으로 확인되었다(Labrijn AF. et al., 2009. Therapeutic IgG4 antibodies engage in Fab-arm exchange with endogenous human IgG4 in vivo. Nat Biotechnol. 27(8):767-71). 이 기술은 이중특이성 항체 분자를 생성하는 데 이용될 수 있다.
당업자는 항체가 다양한 번역 후 변형들을 겪을 수 있다는 것도 이해할 것이다. 이들 변형들의 유형 및 정도는 종종 항체를 발현하는 데 사용된 숙주 세포주 및 배양 조건에 의존한다. 이러한 변형들은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변형을 포함할 수 있다. 흔한 변형은 (문헌(Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995)에 기재된 바와 같이) 카복시펩티다제의 작용으로 인한 카복시 말단 염기성 잔기(예컨대, 라이신 또는 아르기닌)의 상실이다. 따라서, 항체 중쇄의 C 말단 라이신은 존재하지 않을 수 있다.
친화성
본 발명은 항-CD79 항체 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 사용된 결합 도메인은 CD79a에 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 사용된 결합 도메인은 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 사용된 결합 도메인은 CD79 복합체에 특이적이다. 즉, 상기 결합 도메인은 상기 복합체에 존재하고 그 자신에 특이적인 에피토프, 예를 들면, CD79a와 CD79b 사이의 상호작용을 포함하는 에피토프를 인식한다.
CD79a(면역글로불린 알파 및 B 세포 항원 수용체 복합체와 연관된 단백질 알파 쇄로서도 공지되어 있음)는 공지된 단백질이다. CD79a의 발현은 B 림프구로 제한된다. 인간 서열은 입력 번호 P11912 하에 유니프롯(UniProt)에서 입수가능하다(서열번호 245, 및 신호 서열을 갖지 않는 서열번호 245의 아미노산 33-226). 뮤린 버전은 입력 번호 11911 하에 유니프롯에서 입수가능하다. 본 개시는 임의의 종으로부터의 CD79a의 모든 형태들, 특히 이들의 인간 및 임의의 천연 변이체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CD79a는 이 단백질의 인간 형태를 지칭한다.
CD79b(면역글로불린과 연관된 베타 및 클러스터 분화 79B로서도 공지되어 있음)는 공지된 단백질이다. CD79b의 발현은 B 림프구로 제한된다. 인간 서열은 입력 번호 P40259 하에 유니프롯에서 입수가능하다(서열번호 298, 및 신호 서열을 갖지 않는 서열번호 298의 아미노산 29-229). 뮤린 버전은 입력 번호 P15530 하에 유니프롯에서 입수가능하다. 본 개시는 임의의 종으로부터의 CD79b의 모든 형태들, 특히 이들의 인간 및 임의의 천연 변이체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CD79b는 이 단백질의 인간 형태를 지칭한다.
한 실시양태에서, CD79에 특이적인 결합 도메인은 CD79a에 결합한다.
한 실시양태에서, CD79에 특이적인 결합 도메인은 CD79b에 결합한다.
한 실시양태에서, CD79에 특이적인 결합 도메인은 CD79a와 CD79b의 복합체에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 CD79에 대한 결합 도메인의 친화성은 약 100 nM 이상, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM 또는 100 pM 이상, 특히 50 pM 이상의 결합 친화성이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 CD79a에 대한 결합 도메인의 친화성은 약 100 nM 이상, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM 또는 100 pM 이상, 특히 50 pM 이상의 결합 친화성이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 CD79b에 대한 결합 도메인의 친화성은 약 100 nM 이상, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM 또는 100 pM 이상, 특히 50 pM 이상의 결합 친화성이다.
본 발명의 다중특이성 분자는 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 사용된 결합 도메인은 CD22에 특이적이다.
CD22(분화의 클러스터-22로서도 공지되어 있음)는 공지된 단백질이다. CD22는 B 세포 수용체(BCR)의 억제 보조수용체이고 B 세포 활성화를 위한 신호전달 역치를 확립하는 데 매우 중요한 역할을 수행한다. 인간 서열은 유니프롯 입력 번호 P20273으로 입수가능하다(서열번호 244, 및 신호 서열을 갖지 않는 서열번호 244의 아미노산 20-847). 뮤린 버전은 유니프롯 입력 번호 P35329로 입수가능하다. 본 개시는 임의의 종으로부터의 CD22의 모든 형태들, 특히 이의 인간 및 천연 변이체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CD22는 상기 단백질의 인간 형태를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 CD22에 대한 결합 도메인의 친화성은 약 100 nM 이상, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM 또는 100 pM 이상, 특히 50 pM 이상의 결합 친화성이다.
CD79에 대한 결합 도메인은 CD79a 및/또는 CD79b에 결합할 수 있다.
CD22에 대한 결합 도메인의 친화성은 CD79에 대한 결합 도메인의 친화성과 동일할 수 있거나 상이할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 사용되는 결합 도메인은 CD45에 특이적이다.
CD45(PTPRC로서도 공지되어 있음)는 공지된 단백질이다. CD45는 단백질 티로신 포스파타제(PTP) 패밀리의 구성원이다. PTP들은 세포 생장, 분화, 유사분열 주기 및 종양발생성 형질전환을 비롯한 다양한 세포 과정들을 조절하는 신호전달 분자인 것으로 공지되어 있다. 이 PTP는 세포외 도메인, 단일 막관통 분절 및 2개의 탠덤 세포질내 촉매 도메인들을 함유하므로, 수용체 유형 PTP에 속한다. CD45의 다양한 이소폼들이 존재한다: CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, CD45R(ABC). CD45RA는 미접촉(naive) T 세포 상에 위치하고, CD45RO는 기억 T 세포 상에 위치한다. CD45 스플라이스 변이체 이소폼 A, B 및 C는 인간 B 세포 상에서 상이하게 발현된다. CD45는 단백질 티로신 포스파타제(PTP) 패밀리의 구성원이다: 그의 세포내(COOH 말단) 영역은 2개의 PTP 촉매 도메인들을 함유하고 세포외 영역은 엑손 4, 5 및 6의 대안적인 스플라이싱(각각 A, B 및 C로서 표시됨) 및 상이한 수준의 글리코실화로 인해 고도로 가변적이다. 검출된 CD45 이소폼은 세포 유형, 성숙 및 활성화 상태 특이적이다. 일반적으로, 상기 단백질의 긴 형태(A, B 또는 C)는 미접촉 또는 불활성화된 B 세포 상에서 발현되고, CD45의 성숙 또는 절두된 형태(RO)는 활성화된 또는 성숙/기억 B 세포 상에서 발현된다.
인간 서열은 유니프롯 입력 번호 P08575로 입수가능하고 본원에서 서열번호 10, 또는 신호 펩티드를 결여하는 서열번호 10의 아미노산 24-1304로 제공되어 있다. 뮤린 버전은 유니프롯 입력 번호 P06800으로 입수가능하다. 본 개시는 임의의 종으로부터의 CD45의 모든 형태들에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CD45는 이 단백질의 인간 형태, 및 이의 천연 변이체 및 이소폼을 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 CD45에 대한 결합 도메인의 친화성은 약 100 nM 이상, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM 또는 100 pM 이상, 특히 50 pM 이상의 결합 친화성이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 항체 분자 또는 이의 항체/단편 성분은 표적 항원 또는 항원들에 대한 개선된 친화성을 제공하도록 프로세싱된다. 이러한 변이체는 CDR의 돌연변이유발(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 쇄 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 이. 콜라이(E. coli)의 돌연변이유발자 균주의 사용(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 성적(sexual) PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 비롯한 다수의 친화성 성숙 프로토콜들에 의해 수득될 수 있다. (상기) 문헌(Vaughan et al.)은 이들 친화성 성숙 방법들을 논의한다.
항체 및 이의 생성
본 발명에서 사용될 결합 도메인은 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있고, 예를 들면, 상업적으로 입수가능한 항체를 비롯한 비인간 항체로부터 CDR을 수득하여 인간 프레임워크 내로 이식할 수 있거나, 대안적으로 비인간 가변 영역 및 인간 불변 영역 등으로 키메라 항체를 제조할 수 있다.
전형적으로, 본 발명에서 사용될 결합 도메인은 선택된 항원에 결합하는 항체, 예컨대, CD22, CD45, 또는 CD79a 및/또는 CD79b에 결합하는 항체로부터 유래된 결합 도메인이다.
CD22, CD45 및 CD79 항체의 예는 당분야에서 공지되어 있고 이들은 본 발명의 분자에서 직접적으로 사용될 수 있거나 본원에 기재된 방법의 이용을 통해 적합성에 대해 스크리닝될 수 있고, 필요하다면, 본원에 기재된 방법의 이용을 통해 추후에 변형될, 예를 들면, 인간화될 수 있다. 임상에서의 CD22 항체의 예로는 에프라투주맙(epratuzumab) 및 이노투주맙(inotuzumab)이 있다. 다른 치료 항체는 당분에 기재되어 있다(예를 들면, 미국 특허출원 공보 제2003202975호 및 국제 특허출원 공보 제WO14/011520호에 개시된 항-CD22 항체, 국제 특허출원 공보 제WO14011521호 및 제WO15021089호에 개시된 항-CD79b 항체). 비인간 항-CD22 항체는 클론 SP104로부터의 토끼 단일클론 항체 LS-C2210357(LSBio), 클론 4C3으로부터의 마우스 단일클론 LS-C174778, 마우스 단일클론 LS-C4802, 클론 1B1로부터의 마우스 단일클론 LS-B9996, 클론 2E6으로부터의 마우스 단일클론 LS-C340404, 마우스 단일클론 LS-C312263, 마우스 단일클론 LS-C152867, 마우스 단일클론 LS-C87523, 클론 FRB4로부터의 마우스 단일클론 LS-C134333, 마우스 단일클론 LS-C134336, 클론 HIB22로부터의 마우스 단일클론 LS-C40961, 마우스 단일클론 LS-C134332, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)로부터의 하기 항체들을 포함한다: sc-271579, sc-377304, sc-7032, sc-18909, sc-7932, sc-7323, sc-7307, sc-7031, sc-20053, sc-189000, sc-136440, sc-136507, sc-53031, sc-73363, sc-53032, 애브캄(Abcam) 토끼 단일클론 Ab33859(EP498Y), 마우스 단일클론 항체 AA 1-687 카탈로그 번호 ABIN1999423, 클론 HIB22로부터의 바이오레전드(Biolegend) 워크숍 번호 V CD22.14로부터의 마우스 단일클론.
상업적으로 입수가능한 항-CD79a 항체는 클론 HM57로부터의 마우스 단일클론 LS-B4504(LSBio), 마우스 단일클론 LS-B8330, 마우스 단일클론 LS-C44954, 토끼 단일클론 LS-B9093, 클론 JCB117로부터의 마우스 단일클론 LS-B8513, 클론 SP18로부터의 토끼 단일클론 LS-C210607, 클론 5E2로부터의 마우스 단일클론 LS-C175441, 클론 3D3으로부터의 마우스 단일클론 LS-C338670, 클론 HM47/A9로부터의 마우스 단일클론 LS-C88120, 마우스 단일클론 LS-C191714, 마우스 단일클론 LS-C87592, 마우스 단일클론 LS-C44955, 마우스 단일클론 LS-C95934, 마우스 단일클론 LS-C121584, 마우스 단일클론 LS-C121585, 마우스 단일클론 LS-C204347, 마우스 단일클론 LS-C88122, 애브캄 마우스 단일클론 ab3121[HM47/A9], 토끼 단일클론 ab79414, 및 토끼 단일클론 ab133483을 포함한다.
상업적으로 입수가능한 CD79b 항체는 마우스 단일클론 애브캄 항체 ab33295, 래트 단일클론 ab23826, 마우스 단일클론 ab103422, 토끼 단일클론 ab134103, 토끼 단일클론 ab134147, 및 토끼 단일클론 ab183343을 포함한다.
CD45 항체의 예로는 래트 단일클론 YTH54, YTH25.4, 밀테니이(Miltenyi)로부터의 마우스 단일클론 클론 5B1 및 클론 30F11, 래트 단일클론 YAML568, 비디 바이오사이언스(BD Bioscience)로부터의 마우스 단일클론 클론 2D1 카탈로그 번호 347460, 노부스(Novus)로부터의 마우스 단일클론 항체 5D3A3 카탈로그 번호 NBP2-37293, 마우스 단일클론 HI30 카탈로그 번호 NBP1-79127, 마우스 단일클론 4A8A4C7A2 카탈로그 번호 NBP1-47428, 마우스 단일클론 2B11 카탈로그 번호 NBP2-32934, 래트 단일클론 YTH24.5 카탈로그 번호 NB100-63828, 토끼 단일클론 Y321 카탈로그 번호 NB110-55701, 마우스 단일클론 PD7/26/16 카탈로그 번호 NB120-875, 산타 크루즈(Santa Cruz)로부터의 마우스 단일클론 클론 B8 카탈로그 번호 sc-28369, 마우스 단일클론 클론 F10-89-4 카탈로그 번호 sc-52490, 토끼 단일클론 클론 H-230 카탈로그 번호 sc-25590, 염소 단일클론 클론 N-19 카탈로그 번호 sc-1123, 마우스 단일클론 클론 OX1 카탈로그 번호 sc-53045, 래트 단일클론(T29/33) 카탈로그 번호 sc-18901, 래트 단일클론(YAML 501.4) 카탈로그 번호 sc65344, 래트 단일클론(YTH80.103) 카탈로그 번호 sc-59071, 마우스 단일클론(351C5) 카탈로그 번호 sc-53201, 마우스 단일클론(35-Z6) 카탈로그 번호 sc-1178, 마우스 단일클론(158-4D3) 카탈로그 번호 sc-52386, CD45RO에 대한 마우스 단일클론(UCH-L1) 카탈로그 번호 sc-1183, 및 CD45RO에 대한 마우스 단일클론(2Q1392) 카탈로그 번호 sc-70712가 있다.
CD45 항체는 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공보 제WO2005/026210호, 제WO02/072832호 및 제WO2003/048327호에도 개시되어 있다.
이러한 상업적으로 입수가능한 항체는 추가 치료적 항체의 발견에 유용한 수단일 수 있다.
당업자는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 이용하여 본 발명의 다중특이성 분자에서 사용될 항체를 생성할 수 있다.
항체를 생성하는 데 사용될, 예를 들면, 숙주를 면역화시키는 데 사용되거나 패닝(panning), 예컨대, 파지 디스플레이에서 사용될 항원 폴리펩티드는 당분야에서 잘 알려져 있는 과정에 의해 발현 시스템을 포함하는 유전학적으로 조작된 숙주 세포로부터 제조될 수 있거나 천연 생물학적 공급원으로부터 회수될 수 있다. 본원에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 달리 특정되어 있지 않은 한, 이들은 상호교환적으로 사용된다. 항원 폴리펩티드는 일부 경우들에서 보다 더 큰 단백질, 예컨대, 융합 단백질, 예를 들면, 친화성 태그 또는 유사한 물질에 융합된 융합 단백질의 부분일 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주는 관련 단백질 또는 폴리펩티드로 형질감염된, 예를 들면, CD79a 및 CD79b로 동시-형질감염된 세포, 예컨대, 섬유모세포에 의해 면역화될 수 있다.
동물의 면역화가 필요한 경우, 잘 알려져 있는 상용적인 프로토콜을 이용하여 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 비인간 동물에게 투여함으로써, 항원 폴리펩티드에 대해 생성된 항체를 수득할 수 있다(예를 들면, 문헌(Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986) 참조). 많은 온혈 동물들, 예컨대, 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지가 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.
단일클론 항체는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 방법, 예컨대, 하이브리도마 기법(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마(trioma) 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)에 의해 제조될 수 있다.
항체는 예를 들면, 문헌(Babcook, J. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l); 및 국제 특허출원 공보 제WO92/02551호, 제WO2004/051268호 및 제WO2004/106377호에 기재된 방법에 의한 특정 항체의 생성을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA들을 클로닝하고 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법의 이용을 통해 생성될 수도 있다.
본 개시에서 사용될 항체는 당분야에서 공지되어 있는 다양한 파지 디스플레이 방법들의 이용을 통해 생성될 수도 있고 문헌(Brinkman et al., in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50); 문헌(Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186); 문헌(Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958); 문헌(Persic et al., Gene, 1997 187 9-18); 문헌(Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57:191-280); 국제 특허출원 공보 제WO90/02809호, 제WO91/10737호, 제WO92/01047호, 제WO92/18619호, 제WO93/11236호, 제WO95/15982호 및 제WO95/20401호; 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호 및 제5,969,108호; 및 국제 특허출원 공보 제WO20011/30305호에 개시된 항체들을 포함한다.
일례에서, 본 개시의 다중특이성 분자는 전체 인간 분자이고, 특히 가변 도메인들 중 하나 이상의 가변 도메인은 전체 인간 가변 도메인이다.
전체 인간 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역 및 불변 영역(존재하는 경우)이 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없지만 모두 인간으로부터 유래되거나 인간 유래의 서열과 실질적으로 동일한 분자이다. 전체 인간 항체의 예로는 예를 들면, 전술되어 있는 파지 디스플레이 방법에 의해 생성된 항체; 및 뮤린 면역글로불린 가변 영역 유전자 및 임의적으로 불변 영역 유전자가 예를 들면, 유럽 특허 제0546073호, 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 제5,770,429호, 및 유럽 특허 제0438474호 및 제0463151호에 일반적인 용어로 기재되어 있는 그들의 인간 대응물들로 대체되어 있는 마우스에 의해 생성된 항체가 있을 수 있다.
일례에서, 본 개시에 따른 다중특이성 분자의 결합 도메인은 인간화된다.
본원에서 사용된 "인간화된"(CDR-이식된 항체를 포함함)은 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역들(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 분자를 지칭한다(예를 들면, 미국 특허 제5,585,089호 및 국제 특허출원 공보 제WO91/09967호 참조). 전체 CDR보다는 오히려 CDR의 특이성 결정 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수 있다는 것이 인식될 것이다(예를 들면, 문헌(Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34) 참조). 인간화된 항체는 임의적으로 CDR의 기원인 비인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "인간화된 항체 분자"는 어셉터(acceptor) 항체(예를 들면, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 이식된, 도너 항체(예를 들면, 뮤린 또는 토끼 단일클론 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(원하는 경우 하나 이상의 변형된 CDR을 포함함)을 함유하는 중쇄 및/또는 경쇄를 갖는 항체 분자를 지칭한다. 검토를 위해서는 문헌(Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998)을 참조한다. 한 실시양태에서, 전체 CDR이 전달되기보다는 오히려, 본원에 전술되어 있는 CDR들 중 어느 한 CDR로부터의 특이성 결정 잔기들 중 하나 이상의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에게 전달된다(예를 들면, 문헌(Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34) 참조). 한 실시양태에서, 본원에 전술되어 있는 CDR들 중 하나 이상의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 전술되어 있는 CDR들 각각으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 이식될 때, CDR의 기원인 도너 항체의 클래스/유형을 유념하면서 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역들을 비롯한 임의의 적절한 어셉터 가변 영역 프레임워크 서열을 사용할 수 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항체는 인간 어셉터 프레임워크 영역뿐만 아니라 본원에서 제공된 CDR들 중 하나 이상의 CDR도 포함하는 가변 도메인을 갖는다.
본 개시에서 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(상기 문헌(Kabat et al.)). 예를 들면, KOL 및 NEWM은 중쇄를 위해 사용될 수 있고, REI는 경쇄를 위해 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식세포주 서열이 사용될 수 있고; 이들은 웹사이트(http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php)에서 입수가능하다.
본 개시의 인간화된 항체 분자에서, 어셉터 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없고, 원하는 경우 상이한 쇄들로부터 유래된 프레임워크 영역을 갖는 복합 쇄를 포함할 수 있다.
프레임워크 영역은 어셉터 항체의 서열과 정확히 동일한 서열을 가질 필요가 없다. 예를 들면, 희귀 잔기들이 그 어셉터 쇄 클래스 또는 유형에 대해 더 자주 발견되는 잔기로 교체될 수 있다. 대안적으로, 어셉터 프레임워크 영역 내의 선택된 잔기는 도너 항체 내의 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 교체될 수 있다(문헌(Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324) 참조). 이러한 교체는 도너 항체의 친화성을 회복하기 위해 필요한 최소한의 수준으로 유지되어야 한다. 어셉터 프레임워크 영역에서 교체될 필요가 있을 수 있는 잔기를 선택하는 프로토콜은 국제 특허출원 공보 제WO91/09967호에 기재되어 있다.
프레임워크의 유도체는 대안적인 아미노산, 예를 들면, 도너 잔기로 대체된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산을 가질 수 있다.
도너 잔기는 도너 항체, 즉 CDR의 최초 기원인 항체로부터의 잔기이고, 특히 도너 서열로부터의 상응하는 위치의 잔기가 채택된다. 도너 잔기는 인간 수용체 프레임워크로부터 유래된 적합한 잔기(어셉터 잔기)로 대체될 수 있다.
항체 가변 도메인 내의 잔기는 통상적으로 카바트 등(Kabat et al.)에 의해 고안된 시스템에 따라 넘버링된다. 이 시스템은 문헌(Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)(이하, "(상기) 문헌(Kabat et al.)")에 기재되어 있다. 이 넘버링 시스템은 달리 표시되어 있는 경우를 제외하고 본 명세서에서 사용된다.
카바트 잔기 표시는 항상 아미노산 잔기의 일차 넘버링과 직접적으로 상응하지는 않는다. 실제 일차 아미노산 서열은 엄격한 카바트 넘버링보다 더 적은 아미노산 또는 추가 아미노산을 함유할 수 있고, 이러한 더 적은 아미노산 또는 추가 아미노산은 기본 가변 도메인 구조의 구조적 성분(프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR))의 단축 또는 이러한 구조적 성분 내로의 삽입에 상응한다. 항체의 서열과 "표준" 카바트 넘버링된 서열에서 상동한 잔기를 정렬함으로써 소정의 항체에 대해 잔기의 정확한 카바트 넘버링을 결정할 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 초티아(Chothia)(Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1에 해당하는 루프는 잔기 26부터 잔기 32까지 걸쳐 있다. 따라서, 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 'CDR-H1'은 카바트 넘버링 시스템과 초티아의 위상적 루프 정의의 조합에 의해 기재된 바와 같이 잔기 26부터 35까지를 지칭하기 위한 것이다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(예를 들면, VH)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 11에 제공된 서열을 갖고, CDRH2가 서열번호 12에 제공된 서열을 갖고, CDRH3이 서열번호 3에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 8, CDRH2에 대해 서열번호 9 및 CDRH3에 대해 서열번호 4의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(예를 들면, VH)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 19, CDRL2에 대해 서열번호 20 및 CDRL3에 대해 서열번호 21의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(예를 들면, VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 13, CDRL2에 대해 서열번호 14 및 CDRL3에 대해 서열번호 15의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(예를 들면, VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 11에 제공된 서열을 갖고, CDRH2가 서열번호 12에 제공된 서열을 갖고, CDRH3이 서열번호 3에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 19에 제공된 서열을 갖고, CDRL2가 서열번호 20에 제공된 서열을 갖고, CDRL3이 서열번호 21, 22, 23 또는 24에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 11에 제공된 서열을 갖고, CDRH2가 서열번호 12에 제공된 서열을 갖고, CDRH3이 서열번호 3에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 19에 제공된 서열을 갖고, CDRL2가 서열번호 20에 제공된 서열을 갖고, CDRL3이 서열번호 21에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 서열번호 11, 12, 3, 19, 20 및 21로 제공된 CDR을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인을 함유하는 항-CD79 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 8에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 9에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 4에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 13에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 14에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 15에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 서열번호 8, 9, 4, 13, 14 및 15로 제공된 CDR을 포함하는 하나 이상의 결합 도메인을 함유하는 항-CD79 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 8에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 9에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 4에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 13에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 14에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 15, 16, 17 또는 18에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체 분자는 인간화되고 본원에 기재된 CDR들 또는 이들의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자에서 사용되는 중쇄 가변 영역 인간 프레임워크는 IGHV3-48, IGHV4-59, IGHV3-66 및 이들 중 어느 한 프레임워크의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되고, 이때 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 아미노산은 시스테인 이외의 아미노산으로 치환되고, 예를 들면, 원래의 도너 항체, 예를 들면, 서열번호 31 또는 38로 제공된 도너 VH 서열 내의 상응하는 위치의 잔기로 치환된다. 전형적으로, 인간 프레임워크는 적합한 J 영역 서열, 예컨대, JH4 또는 JH2 J 영역을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, (특히 본원에 전술되어 있는 중쇄 항-CD79 CDR들과 함께 사용될) VH 프레임워크 내의 치환은 24, 37, 48, 49, 67, 71, 73 및 78로부터 선택된 1개 이상, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 위치에서 만들어질 수 있고(예컨대, 적어도 위치 73 및 78에서의 치환), 예를 들면, 치환은 (특히 IGHV3-66에 적합한) 위치 24, 48, 49, 73 및 78 모두, 또는 (특히 IGHV3-48에 적합한) 위치 24, 48, 49, 71, 73 및 78 모두, 또는 (특히 IGHV4-59에 적합한) 위치 37, 49, 67, 71, 73, 76 및 78 모두 또는 위치 37, 67, 71, 73, 76 및 78 모두에서 만들어질 수 있다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 24는 발린이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 37은 발린이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 48은 이소류신이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 49는 글리신이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 67은 페닐알라닌이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 71은 라이신이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 71은 아르기닌이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 73은 세린이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VH 프레임워크의 위치 78은 발린이다.
이들 치환들 중 하나 이상의 치환은 본 발명의 항체 분자에서 사용될 인간화된 VH 영역을 생성하도록 조합될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
한 실시양태에서, 인간화된 VH 가변 도메인은 서열번호 34, 35, 41 및 42로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, VH의 잔기 1은 서열의 프로세싱을 용이하게 하도록 글루탐산으로 교체된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 인간화된 항체 분자에서 사용되는 경쇄 가변 영역 인간 프레임워크는 IGKV1-6, IGKV1D-13 및 이들 중 어느 한 프레임워크의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되고, 이때 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산은 시스테인 이외의 아미노산으로 치환되고, 예를 들면, 원래의 도너 항체, 예를 들면, 서열번호 29 또는 36으로 제공된 도너 VL 서열 내의 상응하는 위치의 도너 잔기로 치환된다. 전형적으로, 인간 프레임워크는 적합한 J 영역, 예컨대, JK4 J 영역을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 항체 분자에서 (예를 들면, 경쇄 항-CD79 CDR을 수용하기 위해) 사용되는 인간 VL 프레임워크는 2, 3, 36, 46, 49 및 70을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 1개의 위치, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 위치에서 치환된 아미노산을 포함하고, 예를 들면, 이때 프레임워크 내의 원래의 아미노산은 시스테인 이외의 다른 아미노산으로 치환되고, 특히 도너 항체의 프레임워크 내의 상응하는 위치의 잔기로 치환된다.
한 실시양태에서, 사용되는 인간 VL 프레임워크는 IGKV1 프레임워크이고 적어도 위치 3 및 70에서 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 사용되는 인간 VL 프레임워크(예컨대, IGKV1 프레임워크)은 (특히 IGKV1D-13에 적합한) 위치 2, 3, 36, 46, 49 및 70, 또는 (특히 IGKV1-6에 적합한) 위치 3 및 70에서 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 2는 글루타민이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 3은 발린 또는 아스파르트산이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 36은 류신이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 46은 글루타민이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 49는 히스티딘이다.
한 실시양태에서, 치환 후 VL 프레임워크의 위치 70은 글루타민이다.
이들 치환들 중 하나 이상의 치환은 본 발명의 항체에서 사용될 인간화된 VL 영역을 생성하도록 조합될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
한 실시양태에서, 인간화된 VL 가변 도메인은 서열번호 33 또는 40으로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 인간화된 VL 가변 도메인은 서열번호 33, 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 서열번호 34 및 35로부터 독립적으로 선택된 VH 및 서열번호 33으로 표시된 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 34 및 35로부터 독립적으로 선택된 VH 및 서열번호 250으로 표시된 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 41 및 42로부터 독립적으로 선택된 VH 및 서열번호 40으로 표시된 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 41 및 42로부터 독립적으로 선택된 VH 및 서열번호 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
이들 인간화된 이식된 가변 영역들(서열번호 41, 42, 40, 341, 342 및 343)은 도너 잔기의 수를 감소시키고 이들을 원래의 인간 잔기(들)로 대체하도록 더 변형될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
따라서, 일례에서, 위치 3의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나 위치 70의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있는 서열번호 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
일례에서, 위치 24의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 48의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 49의 잔기가 세린(S)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 73의 잔기가 아스파라긴(N)으로 대체되어 있고/있거나 위치 78의 잔기가 류신(L)으로 대체되어 있는 서열번호 41에 제공된 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 분자가 제공된다.
일례에서, 위치 37의 잔기가 이소류신(I)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 67의 잔기가 발린(V)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 71의 잔기가 발린(V)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 73의 잔기가 트레오닌(T)으로 대체되어 있고/있거나 위치 78의 잔기가 페닐알라닌(F)으로 대체되어 있는 서열번호 42에 제공된 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 분자가 제공된다.
일례에서, 위치 24의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 48의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 49의 잔기가 세린(S)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 73의 잔기가 아스파라긴(N)으로 대체되어 있고/있거나 위치 78의 잔기가 류신(L)으로 대체되어 있는 서열번호 41에 제공된 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 40, 341, 342 및 343 서열로부터 독립적으로 선택된 서열, 또는 위치 3의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나 위치 70의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있는 서열번호 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
일례에서, 위치 37의 잔기가 이소류신(I)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 67의 잔기가 발린(V)으로 대체되어 있고/있거나, 위치 71의 잔기가 발린(V)으로 대체되어 있고/있거나 위치 73의 잔기가 트레오닌(T)으로 대체되어 있고/있거나 위치 78의 잔기가 페닐알라닌(F)으로 대체되어 있는 서열번호 42에 제공된 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 40, 341, 342 및 343 서열로부터 독립적으로 선택된 서열, 또는 위치 3의 잔기가 글루타민(Q)으로 대체되어 있고/있거나 위치 70의 잔기가 아스파르트산(D)으로 대체되어 있는 서열번호 40, 341, 342 및 343으로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 전술되어 있는 CD79 결합 도메인 및 CD22 결합 도메인, 예컨대, 본원에 후술되어 있는 결합 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 다중특이성 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 다중특이성 분자는 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 72, 73, 74, 75, 76, 101, 102, 103, 104, 105, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143 및 144를 포함하는 군으로부터 선택된 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 다중특이성 분자는 서열번호 48, 49, 50, 66, 67, 68, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 106, 107, 108, 126, 127, 128, 145, 146 및 147을 포함하는 군으로부터 선택된 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 다중특이성 분자는 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 72, 73, 74, 75, 76, 101, 102, 103, 104, 105, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143 및 144를 포함하는 군으로부터 선택된 3개의 중쇄 CDR들, 및 서열번호 48, 49, 50, 66, 67, 68, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 106, 107, 108, 126, 127, 128, 145, 146 및 147을 포함하는 군으로부터 선택된 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 43 또는 44, CDRH2에 대해 서열번호 45 또는 46, 및 CDRH3에 대해 서열번호 47의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 60 또는 61, CDRH2에 대해 서열번호 62 또는 63, 및 CDRH3에 대해 서열번호 64 또는 65의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 72 또는 73, CDRH2에 대해 서열번호 74 또는 75, 및 CDRH3에 대해 서열번호 76의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 101 또는 102, CDRH2에 대해 서열번호 103 또는 104, 및 CDRH3에 대해 서열번호 105의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 116, CDRH2에 대해 서열번호 117, 118, 119, 120, 121 또는 122, 및 CDRH3에 대해 서열번호 123, 124 또는 125의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 136 또는 137, CDRH2에 대해 서열번호 138, 139, 140, 141, 142 및 143, 및 CDRH3에 대해 서열번호 144의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 48, CDRL2에 대해 서열번호 49, 및 CDRL3에 대해 서열번호 50의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 66, CDRL2에 대해 서열번호 67, 및 CDRL3에 대해 서열번호 68의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 77, CDRL2에 대해 서열번호 78, 및 CDRL3에 대해 서열번호 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 또는 94의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 106, CDRL2에 대해 서열번호 107, 및 CDRL3에 대해 서열번호 108의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 126, CDRL2에 대해 서열번호 127, 및 CDRL3에 대해 서열번호 128의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대한 서열번호 145, CDRL2에 대한 서열번호 146, 및 CDRL3에 대한 서열번호 147의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 43 또는 44에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 45 또는 46에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 47에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 48에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 49에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 50에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 60 또는 61에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 62 또는 63에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 64 또는 65에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 66에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 67에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 68에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 72 또는 73에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 74 또는 75에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 76에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 77에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 78에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 또는 94에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 101 또는 102에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 103 또는 104에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 105에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 106에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 107에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 108에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 116에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 117, 118, 119, 120, 121 또는 122에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 123, 124 또는 125에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 126에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 127에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 128에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 136 또는 137에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 138, 139, 140, 141, 142 또는 143에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 144에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 145에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 146에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 147에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 전술되어 있는 CD79 결합 도메인 및 CD45 결합 도메인, 예컨대, 본원에 후술되어 있는 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 155 또는 156, CDRH2에 대해 서열번호 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 또는 164, 및 CDRH3에 대해 서열번호 165의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 178 또는 179, CDRH2에 대해 서열번호 180 또는 181, 및 CDRH3에 대해 서열번호 182의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 195, CDRH2에 대해 서열번호 196 또는 197, 및 CDRH3에 대해 서열번호 198의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대해 서열번호 212 또는 213, CDRH2에 대해 서열번호 214 또는 215, 및 CDRH3에 대해 서열번호 216, 217, 218 또는 219의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 166, CDRL2에 대해 서열번호 167, 및 CDRL3에 대해 서열번호 168, 169 또는 170의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 183, CDRL2에 대해 서열번호 184, 및 CDRL3에 대해 서열번호 185, 186 또는 187의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 199, CDRL2에 대해 서열번호 200, 및 CDRL3에 대해 서열번호 201, 202, 203 또는 204의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대해 서열번호 220, 221, 222 또는 223, CDRL2에 대해 서열번호 224, 및 CDRL3에 대해 서열번호 225의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 155 또는 156에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 또는 164에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 165에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 166에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 167에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 168, 169 또는 170에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 178 또는 179에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 180 또는 181에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 182에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 183에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 184에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 185, 186 또는 187에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 195에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 196 또는 197에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 198에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 199에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 200에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 201, 202, 203 또는 204에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD45에 특이적인 결합 도메인으로서, CDRH1이 서열번호 212 또는 213에 제공된 서열을 갖고 CDRH2가 서열번호 214 또는 215에 제공된 서열을 갖고 CDRH3이 서열번호 216, 217, 218 또는 219에 제공된 서열을 갖고, CDRL1이 서열번호 220, 221, 222 또는 223에 제공된 서열을 갖고 CDRL2가 서열번호 224에 제공된 서열을 갖고 CDRL3이 서열번호 225에 제공된 서열을 갖는 것인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 33과 34, 33과 35, 250과 34, 250과 35, 40과 41, 및 40과 42로부터 선택된, CD79b에 특이적인 VL과 VH 쌍을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 341과 41, 341과 42, 342와 41, 342와 42, 343과 41, 및 343과 42로부터 선택된, CD79b에 특이적인 VL과 VH 쌍을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 55와 56, 55와 246, 55와 247, 55와 248, 69와 70, 69와 71, 69와 251, 69와 252, 69와 253, 69와 254, 98과 99, 98과 100, 98과 255, 98과 256, 113과 114, 113과 115, 113과 257, 113과 258, 133과 134, 133과 135, 133과 259, 133과 260, 152와 153, 152와 154, 152와 261, 및 152와 262로부터 선택된, CD22에 특이적인 VL과 VH 쌍을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 서열번호 175와 176, 175와 177, 175와 263, 175와 264, 192와 193, 192와 194, 192와 265, 192와 266, 209와 211, 209와 267, 209와 268, 209와 269, 210과 211, 210과 267, 210과 268, 210과 269, 230과 232, 230과 270, 230과 271, 230과 272, 231과 232, 231과 270, 231과 271, 및 231과 272로부터 선택된, CD45에 특이적인 VL과 VH 쌍을 포함하는 항체 분자가 제공된다.
일례에서, 본 발명은 항원 CD79에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, 이 쌍의 결합 도메인이 CD79 항체로부터의 6개의 CDR들 및 CD22 항체로부터의 6개의 CDR을 포함하고, 상기 항체 쌍이 CD79 및 CD22 항체 쌍들의 하기 목록으로부터 선택되는 것인 다중특이성 분자를 제공한다: 4447과 4120, 4447과 4126, 4447과 4127, 4447과 4128, 4447과 4130, 4447과 4132, 4450과 4120, 4450과 4126, 4450과 4127, 4450과 4128, 4450과 4130, 및 4450과 4132.
일례에서, 본 발명은 항원 CD79에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD45에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, 이 쌍의 결합 도메인이 CD79 항체로부터의 6개의 CDR들 및 CD45 항체로부터의 6개의 CDR을 포함하고, 상기 항체 쌍이 CD79 및 CD45 항체 쌍들의 하기 목록으로부터 선택되는 것인 다중특이성 분자를 제공한다: 4447과 4122, 4447과 4129, 4447과 4131, 4447과 4133, 4450과 4122, 4450과 4129, 4450과 4131, 및 4450과 4133.
VH, VL 및 CDR 서열을 포함하는, 이들 CD79 항체(항체 4447 및 항체 4450)의 서열은 본원 및 도 51에 제공되어 있다. VH, VL 및 CDR 서열을 포함하는, 이들 CD22 항체(항체 4120, 4126, 4127, 4128, 4130, 4132)의 서열은 본원에서 제공되어 있고 본 발명의 분자에서 결합 도메인으로서 조합될 수 있다. VH, VL 및 CDR 서열을 포함하는, 이들 CD45 항체(항체 4122, 4129, 4131 및 4133)의 서열은 본원에서 제공되어 있고 본 발명의 분자에서 결합 도메인으로서 조합될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 서열을 갖는 한 쌍의 가변 도메인을 포함하는 가변 도메인 또는 결합 도메인이 제공된다.
일례에서, 서열번호 240에 제공된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 242에 제공된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 알부민에 특이적인 결합 도메인이 제공된다.
한 실시양태에서, 결합 도메인 또는 도메인들은 인간화된다.
일례에서, 본원에서 제공된 하나 이상의 CDR은 바람직하지 않은 잔기 또는 부위, 예컨대, 시스테인 잔기 또는 아스파르트산(D) 이성질체화 부위 또는 아스파라긴(N) 탈아미드화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다.
예를 들면, CDR들 중 어느 한 CDR 내의 하나 이상의 시스테인 잔기는 또 다른 아미노산, 예컨대, 세린으로 치환될 수 있다.
일례에서, 아스파라긴 탈아미드화 부위는 아스파라긴 잔기(N) 및/또는 인접 잔기를 임의의 다른 적합한 아미노산으로 돌연변이시킴으로써 하나 이상의 CDR로부터 제거될 수 있다. 일례에서, 아스파라긴 탈아미드화 부위, 예컨대, NG 또는 NS는 예를 들면, NA 또는 NT로 돌연변이될 수 있다.
일례에서, 아스파르트산 이성질체화 부위는 아스파르트산 잔기(D) 및/또는 인접 잔기를 임의의 다른 적합한 아미노산으로 돌연변이시킴으로써 하나 이상의 CDR로부터 제거될 수 있다. 일례에서, 아스파르트산 이성질체화 부위, 예컨대, DG 또는 DS는 예를 들면, EG, DA 또는 DT로 돌연변이될 수 있다.
일례에서, N-글리코실화 부위, 예컨대, NLS는 아스파라긴 잔기(N)를 임의의 다른 적합한 아미노산, 예를 들면, SLS 또는 QLS로 돌연변이시킴으로써 제거될 수 있다. 일례에서, N-글리코실화 부위, 예컨대, NLS는 세린 잔기(S)를, 트레오닌(T)을 제외한 임의의 다른 잔기로 돌연변이시킴으로써 제거될 수 있다.
당업자는 활성이 유지되는지를 확인하기 위한 임의의 적합한 어세이, 예컨대, 본원에 기재된 어세이에서 CDR 또는 인간화된 서열의 변이체를 시험할 수 있다.
예를 들면, ELISA 또는 표면 플라스몬 공명 방법, 예컨대, 비아코어(BIAcore)를 비롯한 임의의 적합한 어세이를 이용하여 항원에의 특이성 결합을 시험할 수 있고, 이때 항원(CD22 또는 CD79)에의 결합이 측정될 수 있다. 이러한 어세이는 단리된 천연 또는 재조합 CD22 또는 CD79(a 및/또는 b) 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 사용할 수 있다. 일례에서, 결합은 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 예컨대, 비아코어에 의해 재조합 CD22(예컨대, 서열번호 244에 제공된 서열, 또는 서열번호 244의 아미노산 20-847) 또는 CD79(예컨대, 서열번호 245 및 서열번호 298에 제공된 서열(CD79b), 및 서열번호 245의 아미노산 33-226 및 서열번호 298의 아미노산 29-229) 또는 CD45(예컨대, 서열번호 10에 제공된 서열, 또는 신호 펩티드를 결여하는, 서열번호 10의 아미노산 24-1304)를 사용함으로써 측정된다. 대안적으로, 단백질은 세포, 예컨대, HEK 세포 상에서 발현될 수 있고 친화성은 유세포분석(flow cytometry) 기반의 친화성 측정을 이용함으로써 측정될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 항체 서열은 추가 항체를 확인하는 데 사용될 수 있으므로, 본 발명의 항체 분자, 예컨대, 본 발명의 다중특이성 분자에서 사용되기에 적합한 결합 도메인을 확인하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 항체 분자와 CD79의 결합을 교차차단하는 항체, 특히 서열번호 38, 41 또는 42로 제공된 중쇄 서열 및 서열번호 36 또는 40으로 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자, 또는 서열번호 31, 34 또는 35로 제공된 중쇄 서열 및 서열번호 29 또는 33으로 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자는 CD79에의 결합에 유사하게 유용할 수 있으므로, 예를 들면, 본 발명의 다중특이성 분자에서 유사하게 유용한 항체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 항원 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하고 임의적으로 항원 CD22 또는 CD45에 특이적인 결합 도메인을 추가로 포함하는 항체 분자로서, CD79b에 대한 결합 도메인이 본원에 기재된 항체 분자들 중 어느 한 항체 분자와 CD79의 결합을 교차차단하고/하거나 이들 항체들 중 어느 한 항체에 의해 CD79에의 결합으로부터 교차차단되는 것인 항체 분자도 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체는 본원에 전술되어 있는 항-CD79 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 교차차단 항체는 본원에 전술되어 있는 항-CD79 항체에 의해 결합된 에피토프와 접하고/하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다.
유사하게, 본 발명에 따른 항체 분자, 특히 표 1에 제시된 중쇄 및 상응하는 경쇄를 포함하는 항체 분자와 CD22의 결합을 교차차단하는 항체가 제공된다:
Figure pct00059
따라서, 본 발명은 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, CD22에 대한 결합 도메인이 전술되어 있는 항체 분자들 중 어느 한 항체 분자와 CD22의 결합을 교차차단하고/하거나 이들 항체들 중 어느 한 항체에 의해 CD22에의 결합으로부터 교차차단되는 것인 다중특이성 분자도 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체는 본원에 전술되어 있는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 교차차단 항체는 본원에 전술되어 있는 항체에 의해 결합된 에피토프와 접하고/하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다.
유사하게, 본 발명에 따른 항체 분자, 특히 표 2에 제시된 중쇄 및 상응하는 경쇄를 포함하는 항체 분자와 CD45의 결합을 교차차단하는 항체가 제공된다:
Figure pct00060
따라서, 일례에서, 본 발명은 항원 CD45에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, CD45에 대한 결합 도메인이 전술되어 있는 항체 분자들 중 어느 한 항체 분자와 CD45의 결합을 교차차단하고/하거나 이들 항체들 중 어느 한 항체에 의해 CD45에의 결합으로부터 교차차단되는 것인 다중특이성 분자도 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체는 본원에 전술되어 있는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 교차차단 항체는 본원에 전술되어 있는 항체에 의해 결합된 에피토프와 접하고/하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다.
교차차단 항체는 당분야의 임의의 적합한 방법을 이용함으로써, 예를 들면, 경쟁 ELISA 또는 비아코어 어세이를 이용함으로써 확인될 수 있고, 이때 교차차단 항체와 항원(CD22 및/또는 CD45 및/또는 CD79)의 결합은 본 발명의 항체의 결합을 방해하거나, 그 반대의 경우도 가능하다. 이러한 교차차단 어세이는 세포에 의해 발현된 단리된 천연 또는 재조합 CD22, CD45 또는 CD79(a 및/또는 b) 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 사용할 수 있다. 일례에서, 재조합 CD22 또는 이의 적합한 단편 또는 천연 변이체(예컨대, 서열번호 224에 제공된 서열 또는 서열번호 244의 아미노산 20-847에 제공된 서열) 또는 CD79, 예컨대, 서열번호 245에 제공된 서열 또는 서열번호 245의 아미노산 33-226에 제공된 서열(CD79a) 및/또는 서열번호 298에 제공된 서열(CD79b) 또는 서열번호 298의 아미노산 29-229에 제공된 서열을 사용하여 결합 및 교차차단을 측정한다.
일례에서, 재조합 CD45 또는 이의 적합한 단편 또는 천연 변이체(예컨대, 서열번호 10에 제공된 서열, 또는 신호 펩티드를 결여하는 서열번호 10의 아미노산 24-1304)을 사용하여 결합 및 교차차단을 측정한다.
대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 이 양태에 따른 항체는 예를 들면, 표 1에 제공된 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열로부터 유래된 CDR을 포함하는, 본원에 개시된 결합 도메인에 의해 항원(CD22 또는 CD79)에의 결합으로부터 교차차단될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 이 양태에 따른 항체는 예를 들면, 표 2에 제공된 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열로부터 유래된 CDR을 포함하는, 본원에 개시된 결합 도메인에 의해 항원(CD45 또는 CD79)에의 결합으로부터 교차차단될 수 있다.
따라서, 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, CD79b에 대한 결합 도메인이 80% 초과, 예를 들면, 85% 초과, 예컨대, 90% 초과, 특히 95% 초과의 수준으로 본원에 전술되어 있는 항체 분자들 중 어느 한 항체 분자와 CD79b의 결합을 교차차단하고/하거나 이들 항체들 중 어느 한 항체에 의해 CD79b에의 결합으로부터 교차차단되고, 임의적으로 CD22에 대한 결합 도메인이 80% 초과, 예를 들면, 85% 초과, 예컨대, 90% 초과, 특히 95% 초과의 수준으로 본원에 전술되어 있는 항체 분자들 중 어느 한 항체 분자와 CD22의 결합을 교차차단하고/하거나 이들 항체들 중 어느 한 항체에 의해 CD22에의 결합으로부터 교차차단되는 것인 다중특이성 분자도 제공한다.
이러한 교차차단 항체는 기능 어세이에서 본원에 후술되어 있는 다중특이성 항체 분자와 필적할만한 활성을 가질 수 있다.
항원 CD45에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 분자로서, CD79b에 대한 결합 도메인이 80% 초과, 예를 들면, 85% 초과, 예컨대, 90% 초과, 특히 95% 초과의 수준으로 본원에 전술되어 있는 항체 분자들 중 어느 한 항체 분자와 CD79b의 결합을 교차차단하고/하거나 이들 항체들 중 어느 한 항체에 의해 CD79b에의 결합으로부터 교차차단되고, 임의적으로 CD45에 대한 결합 도메인이 80% 초과, 예를 들면, 85% 초과, 예컨대, 90% 초과, 특히 95% 초과의 수준으로 본원에 전술되어 있는 항체 분자들 중 어느 한 항체 분자와 CD45의 결합을 교차차단하고/하거나 이들 항체들 중 어느 한 항체에 의해 CD45에의 결합으로부터 교차차단되는 것인 다중특이성 분자도 제공한다.
이러한 교차차단 항체는 기능 어세이에서 본원에 후술되어 있는 다중특이성 항체 분자와 필적할만한 활성을 가질 수 있다.
본 개시는 본원에 개시된 신규 폴리펩티드 서열, 및 이와 적어도 80% 유사하거나 동일한, 예를 들면, 85% 이상, 예컨대, 90% 이상, 특히 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 유사하거나 동일한 서열까지도 확장된다.
본원에서 사용된 "동일성"은 정렬된 서열들의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에 동일하다는 것을 표시한다. 본원에서 사용된 "유사성"은 정렬된 서열들의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에 유사한 유형의 아미노산 잔기라는 것을 표시한다. 예를 들면, 류신은 이소류신 또는 발린 대신에 치환될 수 있다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산들은
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산);
- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산)
을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
동일성 및 유사성의 정도는 용이하게 계산될 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
따라서, 일례에서, 본 발명은 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 36, 29, 33, 40 또는 250의 경쇄 가변 도메인에 대한 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 항체 분자를 제공한다.
본 발명은 중쇄의 가변 도메인이 서열번호 38, 31, 34, 35, 41 또는 42의 중쇄 가변 도메인에 대한 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 항체 분자도 제공한다.
일례에서, 본 발명은 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 36, 29, 33, 40 또는 250의 경쇄 가변 도메인에 대한 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고 중쇄의 가변 도메인이 서열번호 38, 31, 34, 35, 41 또는 42의 중쇄 가변 도메인에 대한 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 항체 분자를 제공한다.
이러한 서열은 기준 서열과 적어도 80%, 예를 들면, 85% 이상, 예컨대, 90% 이상, 특히 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 유사하거나 동일하다.
본 발명의 항체 분자는 다른 분자 포맷 또는 구축물 내로 도입될 수 있다는 것이 인식될 것이고, 이때 본 발명에 의해 제공된 결합 도메인은 표적 CD79에 결합함으로써 이를 표적화한다. 예를 들면, 본 발명의 결합 영역, 예를 들면, 단편, 예컨대, Fab 또는 scFv는 예를 들면, 키메라 항원 수용체를 갖는 T 세포(CAR-T 세포)를 형질도입한 후 이들 세포를 환자 내로 전달함으로써 생체 내에서 세포의 방향을 바꾸는 데 사용될 수 있다(Nat. Revs. Drug Disc. 2015. 14. 499-509). 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체도 제공한다.
링커
링커가 예컨대, 본 발명의 임의의 다중특이성 분자에서 사용되는 경우, 한 문맥에서의 링커의 본원 교시는 상이한 문맥들에서의 링커에 동등하게 적용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자에서 사용된 링커는 예를 들면, 서열 273 내지 336으로 제시된 서열들로부터 선택된, 길이가 50개 이하의 잔기인 아미노산 링커이다.
Figure pct00061
[표 4]
Figure pct00062
Figure pct00063
(S)는 서열 284 내지 288에서 임의적이다.
강성 링커의 예로는 펩티드 서열 GAPAPAAPAPA(서열번호 337), PPPP(서열번호 338) 및 PPP가 있다.
다른 링커들은 표 5에 제시되어 있다:
[표 5]
Figure pct00064
이펙터 분자
원하는 경우, 본 발명에서 사용될 다중특이성 분자는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수 있다. 이펙터 분자는 단일 이펙터 분자를 포함할 수 있거나 본 발명의 다중특이성 분자에 부착될 수 있는 단일 모이어티(moiety)를 형성하도록 연결된 2개 이상의 이러한 분자들을 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 이펙터 분자에 연결된 본 개시에 따른 항체 또는 다중특이성 분자를 수득하고자 하는 경우, 이것은 항체 단편이 직접적으로 또는 커플링제를 통해 이펙터 분자에 연결되는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 이러한 이펙터 분자를 항체에 접합시키는 기법은 당분야에서 잘 알려져 있다(문헌(Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53); 문헌(Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58); 및 문헌(Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123) 참조). 구체적인 화학적 절차는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 93/06231호, 제WO 92/22583호, 제WO 89/00195호, 제WO 89/01476호 및 제WO 03/031581호에 기재된 화학적 절차들을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 86/01533호 및 유럽 특허 제0392745호에 기재된 바와 같이 재조합 DNA 절차를 이용하여 연결을 달성할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 다중특이성 분자는 이펙터 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "이펙터 분자"는 예를 들면, 항신생물성 물질, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들면, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 생성 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들면, DNA, RNA 및 이들의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오다이드, 방사성동위원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 레포터 기, 예컨대, 형광 화합물, 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예로는 세포에게 유해한(예를 들면, 세포를 사멸시키는) 임의의 물질을 비롯한 세포독소 또는 세포독성 물질이 있을 수 있다. 예로는 콤브레스타틴(combrestatins), 돌라스타틴(dolastatins), 에포틸론(epothilones), 스타우로스포린(staurosporin), 메이탄시노이드(maytansinoids), 스폰기스타틴(spongistatins), 리족신(rhizoxin), 할리콘드린(halichondrins), 로리딘(roridins), 헤미아스털린(hemiasterlins), 탁솔(taxol), 사이토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안쓰라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미쓰라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin) D, 1-데하이드로테스토스테론(dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol) 및 푸로마이신(puromycin), 및 이들의 유사체들 및 상동체들이 있다.
이펙터 분자는 항대사물질(예를 들면, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캡토푸린(mercaptopurine), 6-티오구아닌(thioguanine), 사이타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 데카바진(decarbazine)), 알킬화제(예를 들면, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오테파(thiotepa), 클로람부실(chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카무스틴(carmustine)(BSNU) 및 로무스틴(lomustine)(CCNU), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신(mitomycin) C 및 시스-디클로로디아민(cis-dichlorodiamine) 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안쓰라사이클린(anthracyclines)(예를 들면, 다우노루비신(daunorubicin)(이전 명칭: 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신), 항생제(예를 들면, 닥티노마이신(dactinomycin)(이전 명칭: 악티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 미쓰라마이신, 안쓰라마이신(anthramycin)(AMC), 칼리케아미신(calicheamicins) 또는 듀오카마이신(duocarmycins)), 및 항-유사분열성 물질(예를 들면, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
다른 이펙터 분자는 킬레이팅된 방사성핵종, 예컨대, 111In 및 90Y, Lu177, 비스무쓰213, 캘리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 약물, 예컨대, 알킬포스포콜린(alkylphosphocholines), 토포이소머라제(topoisomerase) I 억제제, 변성독소 및 슈라민(suramin)(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 포함할 수 있다.
다른 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심있는 효소는 단백질용해성 효소, 하이드롤라제(hydrolases), 라이아제(lyases), 이소머라제(isomerases) 및 트랜스퍼라제(transferases)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 관심있는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 면역글로불린, 독소, 예컨대, 애브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아(diphtheria) 독소, 단백질, 예컨대, 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래의 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제, 혈전제 또는 항-혈관신생제, 예를 들면, 안지오스타틴(angiostatin) 또는 엔도스타틴(endostatin), 또는 생물학적 반응 변형제, 예컨대, 림포카인, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
다른 이펙터 분자는 예를 들면, 진단에 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소들, 보결분자단들, 형광 물질들, 발광 물질들, 생체발광 물질들, 방사성 핵종들, (양전자 방출 단층촬영술에서 사용될) 양전자 방출 금속들 및 비방사성 상자성 금속 이온들이 있다. 진단제로서 사용될 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소는 호스라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase) 또는 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase)를 포함하고; 적합한 보결분자단은 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin) 및 바이오틴(biotin)을 포함하고; 적합한 형광 물질은 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실(dansyl) 클로라이드 및 파이코에리쓰린(phycoerythrin)을 포함하고; 적합한 발광 물질은 루미놀(luminol)을 포함하고; 적합한 생체발광 물질은 루시퍼라제(luciferase), 루시페린(luciferin) 및 에쿠오린(aequorin)을 포함하고; 적합한 방사성 핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
또 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체 내에서 항체의 반감기를 증가시킬 수 있고/있거나, 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있고/있거나, 항체가 상피 장벽을 가로질러 면역 시스템에게 전달되는 것을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예로는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예컨대, 국제 특허출원 공보 제WO05/117984호에 기재된 이펙터 분자들을 포함한다.
이펙터 분자가 중합체인 경우, 이 분자는 일반적으로 합성 또는 천연 생성 중합체, 예를 들면, 임의적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 분지된 또는 비분지된 폴리사카라이드, 예를 들면, 동종폴리사카라이드 또는 이종폴리사카라이드일 수 있다.
상기 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 구체적인 임의적 치환기는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 중합체의 구체적인 예로는 임의적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히 임의적으로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체가 있다.
기능 어세이
전형적으로, 본 발명에서 사용될 적합한 결합 도메인은 기능 어세이에서 하나 이상의 결합 도메인 쌍을 시험함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 항-CD79 항체 분자, 예컨대, 다중특이성 분자는 하나 이상의 기능 어세이에서 시험될 수 있다.
본원에서 사용된 "기능 어세이"는 어세이 조건에 따라 단백질 복합체, 항체 복합체 또는 항체들의 혼합물의 하나 이상의 원하는 성질 또는 활성을 확인하는 데 이용될 수 있는 어세이이다. 적합한 기능 어세이는 결합 어세이, 아폽토시스 어세이, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 어세이, 보체 의존적 세포독성(CDC) 어세이, 세포 생장 또는 증식의 억제(세포증식억제 효과) 어세이, 세포 사멸(세포독성 효과) 어세이, 세포 신호전달 어세이, 사이토카인 생성 어세이, 항체 생성 및 이소타입 전환, 및 세포 분화 어세이일 수 있다.
본 개시에 따른 다중특이성 항체의 효능은 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에게 일반적으로 공지되어 있는 방법에 의해 이러한 모델들에서 개별 항체 또는 항체들(또는 단편들)의 혼합물과 비교될 수 있다.
기능 어세이는 결과의 신뢰성을 향상시키기 위해 필요하다면 다회 반복될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 다양한 통계학적 검증들이 통계학적으로 유의한 결과를 확인함으로써 생물학적 기능을 갖는 다중특이성 분자를 확인하는 데 이용될 수 있다.
적합한 기능 어세이의 예는 본원의 실시예에 기재되어 있고, B 세포 활성화의 마커, 예컨대, 인산화된 Akt 발현, 인산화된 P38 발현, PLCγ 신호전달, CD40 발현, CD71 발현 및/또는 CD86 발현의 억제를 검출함으로써 측정될 때 항-IgM을 사용한 자극 후 B 세포 활성화를 억제하는 본 발명의 다중특이성 분자의 능력을 측정하는 것을 포함한다.
스크리닝을 위한 기능 어세이를 확립할 때, 당업자는 적합한 역치를 설정할 수 있고, 이 역치 초과의 확인된 활성은 '히트(hit)'로서 간주된다. 하나 초과의 기능 어세이가 이용되는 경우, 각각의 어세이에 대한 역치는 관리가능한 히트율을 확립하기 위해 적합한 수준으로 설정될 수 있다. 일례에서, 히트율은 3% 내지 5%일 수 있다. 일례에서, B 세포 기능을 억제하는 결합 도메인 쌍을 검색할 때 설정된 기준은 앞서 및 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 B 세포 활성화 어세이에서 적어도 2개의 인-판독대상(phospho-readouts)의 적어도 30% 억제일 수 있다.
일례에서, 본 발명의 항체 분자, 예컨대, 다중특이성 분자는 항-IgM 자극된 B 세포에서 인산화된 P38의 억제에 대해 1 nM 미만의 IC50, 바람직하게는 0.5 nM 미만의 IC50을 갖는다. 일례에서, 이 어세이에서 다중특이성 분자의 IC50은 0.05 nM 미만이다.
일례에서, 본 발명의 항체 분자, 예컨대, 다중특이성 분자는 항-IgM 자극된 B 세포에서 인산화된 Akt의 억제에 대해 1 nM 미만의 IC50, 바람직하게는 0.1 nM 미만의 IC50을 갖는다. 일례에서, 이 어세이에서 다중특이성 분자의 IC50은 0.05 nM 미만이다.
일례에서, 본 발명의 항체 분자, 예컨대, 다중특이성 분자는 항-IgM 자극된 B 세포에서 인산화된 PLCγ2의 억제에 대해 1 nM 미만의 IC50, 바람직하게는 0.8 nM 미만의 IC50을 갖는다. 일례에서, 이 어세이에서 다중특이성 분자의 IC50은 0.05 nM 미만이다.
일례에서, 본 발명의 다중특이성 분자는 항-IgM 자극된 B 세포에서 CD71 발현의 억제에 대해 5 nM 미만의 IC50, 바람직하게는 3 nM 미만의 IC50을 갖는다. 일례에서, 이 어세이에서 다중특이성 분자의 IC50은 0.5 nM 미만이다.
일례에서, 본 발명의 항체 분자, 예컨대, 다중특이성 분자는 항-IgM 자극된 B 세포에서 CD40 발현의 억제에 대해 5 nM 미만의 IC50을 갖는다. 일례에서, 이 어세이에서 다중특이성 분자의 IC50은 0.5 nM 미만이다.
일례에서, 본 발명의 항체 분자, 예컨대, 다중특이성 분자는 항-IgM 자극된 B 세포에서 CD86 발현의 억제에 대해 5 nM 미만의 IC50, 바람직하게는 2 nM 미만의 IC50을 갖는다. 일례에서, 이 어세이에서 다중특이성 분자의 IC50은 0.5 nM 미만이다.
일례에서, 본 발명의 항체 분자, 예컨대, 다중특이성 분자는 항-IgM 자극된 B 세포에서 CD71, CD40 및 CD86 발현의 억제에 대해 5 nM 미만의 IC50, 및/또는 항-IgM 자극된 B 세포에서 인산화된 PLCγ2, P38 및 AKT의 억제에 대해 1 nM 미만의 IC50을 갖는다.
한 실시양태에서, 생체내 어세이, 예컨대, 마우스 종양 모델, 자가면역 질환의 모델, 바이러스 감염 또는 세균 감염 설치류 또는 영장류 모델 등을 비롯한 동물 모델이 본 개시의 분자를 시험하는 데 사용될 수 있다.
결합 도메인의 스크리닝 및 발견에 적합한 포맷의 일례는 본원에 후술되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "생물학적 기능"은 시험되는 생물학적 물질에 천연적으로 존재하는 활성 또는 시험되는 생물학적 물질의 목적인 활성, 예를 들면, 세포, 단백질 또는 유사한 물질의 천연 활성을 지칭한다. 이상적으로, 상기 기능의 존재는 살아있는 포유동물 세포를 사용하는 어세이를 비롯한 시험관내 기능 어세이를 이용함으로써 시험될 수 있다. 본원에서 사용된 "천연 기능"은 비정상적인 기능, 예컨대, 암과 연관된 기능을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "상승작용적 기능"은 본 개시의 이중특이성 단백질 복합체의 제1 단백질 및 제2 단백질이 함께 사용되지 않을 때 관찰되지 않은 생물학적 활성 또는 관찰된 생물학적 활성보다 더 높은 생물학적 활성, 예를 들면, 이중특이성 형태에서만 관찰되는 활성을 지칭한다. 따라서, "상승작용적"은 신규 생물학적 기능을 포함한다.
본 개시는 신규 생물학적 기능을 가진, 적어도 CD22 및 CD79에 특이적인 분자를 제공한다.
본원에서 사용된 "신규 생물학적 기능"은 2개 이상의 상승작용적 물질들[단백질 A 및 단백질 B]이 (이중특이성 복합체로서 또는 다른 방식으로) 함께 존재할 때까지 분명하지 않거나 부재하는 기능, 또는 종래 미확인된 기능을 지칭한다.
본원에서 사용된 "더 높은"은 개별 비복합체화된 이중특이성 성분 또는 성분들이 관련 기능 어세이에서 활성(본원에서 신규 활성 또는 신규 생물학적 기능으로서도 지칭됨)을 갖지 않는 경우 이중특이성 복합체에서 0으로부터의 증가, 즉 약간의 활성를 비롯한 활성의 증가를 의미한다. 본원에서 사용된 "더 높은"은 개별 비복합체화된 이중특이성 성분들 또는 2가 결합 도메인들에 비해 관련 기능 어세이에서 이중특이성 복합체에서 상가적 초과의 기능, 예를 들면, 관련 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 300% 이상의 증가도 포함한다.
한 실시양태에서, 신규 상승작용적 기능은 더 높은 억제 활성이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이성 항체 분자는 단독으로 또는 혼합물로 제공된, CD22에 대한 2가 결합 도메인 및 CD79a에 대한 2가 결합 도메인의 활성의 합계보다 더 높은 억제 활성을 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산들의 짧은 중합체를 지칭하고, 이때 상기 펩티드는 2개 내지 100개의 아미노산들, 예를 들면, 5개 내지 99개, 예컨대, 6개 내지 98개, 7개 내지 97개, 또는 8개 내지 96개의 아미노산들을 함유한다. 한 실시양태에서, 본 개시에서 사용된 펩티드는 50개 이하의 아미노산 잔기들, 예를 들면, 40개, 30개 또는 10개 이하의 아미노산 잔기들의 아미노산 서열이다. 본 개시에서 사용되는 펩티드는 목적에 적합하기에 충분한 길이를 갖고, 예를 들면, 펩티드가 링커인 경우, 이 펩티드는 그에 연결되는 단편이 그의 생물학적 기능을 수행할 수 있게 하기에 적합한 길이를 가질 필요가 있고; 대안적으로, 펩티드가 결합 파트너인 경우, 이 펩티드는 또 다른 물질, 예컨대, 항체에 특이적으로 결합할 수 있어야 한다.
본원에서 사용된 "기능 어세이"는 어세이 조건에 따라 단백질 복합체, 항체 복합체 또는 항체들의 혼합물의 하나 이상의 원하는 성질 또는 활성을 확인하는 데 이용될 수 있는 어세이이다. 적합한 기능 어세이는 결합 어세이, 아폽토시스 어세이, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 어세이, 보체 의존적 세포독성(CDC) 어세이, 세포 생장 또는 증식의 억제(세포증식억제 효과) 어세이, 세포 사멸(세포독성 효과) 어세이, 세포 신호전달 어세이, 사이토카인 생성 어세이, 항체 생성 및 이소타입 전환, 및 세포 분화 어세이일 수 있다. 한 실시양태에서, 생체내 어세이, 예컨대, 마우스 종양 모델, 자가면역 질환의 모델, 바이러스 감염 또는 세균 감염 설치류 또는 영장류 모델 등을 비롯한 동물 모델이 본 개시의 분자를 시험하는 데 사용될 수 있다.
이중특이성 항체 복합체와 관련하여, 본 개시에 따른 이중특이성 항체 분자의 효능은 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에게 일반적으로 공지되어 있는 방법에 의해 이러한 모델들에서 개별 항체 또는 항체들(또는 단편들)의 혼합물과 비교될 수 있다.
기능 어세이는 결과의 신뢰성을 향상시키기 위해 특정 이중특이성 항체 복합체의 상이한 샘플들을 사용하거나 사용하지 않으면서 필요하다면 다회 반복될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 다양한 통계학적 검증들이 통계학적으로 유의한 결과를 확인함으로써 생물학적 기능을 갖는 이중특이성 항체 복합체를 확인하는 데, 특히 본 발명의 다중특이성 분자에서 사용될 최적 가변 영역 쌍을 확인하는 데 이용될 수 있다.
조성물 및 의학적 용도
한 양태에서, 본 개시에 따른 분자 또는 성분, 예컨대, 융합 단백질, 이종이량체적으로 테더링된 이중특이성 단백질 복합체, 융합 단백질 또는 상기 이중특이성 단백질 복합체를 비롯한 본 발명의 분자를 포함하는 조성물, 또는 본원에서 정의된 다중체, 어레이 또는 라이브러리가 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자, 예를 들면, 본원에 기재된 항체, 다중특이성 분자 및 이중특이성 단백질 복합체는 치료적 적용에 적합하고 질환을 치료하는 신규 요법을 제공할 수 있다. 따라서, 추가 양태에서, 치료법에서 사용될 본 개시의 분자, 예를 들면, 전술되어 있는 이중특이성 단백질 복합체가 제공된다. 본원에 기재된 이중특이성 단백질 복합체를 비롯한 본 개시의 분자는 다양한 질환들, 예컨대, 암의 치료에 적합하다.
본원에 기재된 다중특이성 분자 및 이중특이성 단백질 복합체를 비롯한 본 개시의 항체 분자는 다양한 자가면역 질환들에서 면역 및 자가면역 반응을 조절하기 위해 B 세포 기능을 억제하는 데에도 특히 적합하다.
따라서, 본 개시는 치료 유효량의 본 개시의 분자, 예를 들면, 본 개시의 다중특이성 분자 또는 이중특이성 단백질 복합체를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 질환을 치료하는 방법까지 확장된다.
한 양태에서, 하나 이상의 본 개시의 분자, 예를 들면, 본 개시의 다중특이성 분자를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 비롯한 다양한 상이한 성분들이 상기 조성물에 포함될 수 있다. 임의적으로, 상기 조성물은 본 발명의 다중특이성 분자 집단의 특성을 변경시킴으로써, 예를 들면, 항체의 기능을 감소시킬 수 있고/있거나, 안정화시킬 수 있고/있거나, 지연시킬 수 있고/있거나, 조절할 수 있고/있거나 활성화시킬 수 있는 추가 분자를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 고체 또는 액체 형태로 존재할 수 있고, 특히 분말, 정제, 용액 또는 에어로졸의 형태로 존재할 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체 분자 또는 다중특이성 분자를 포함하는 약학 또는 진단 조성물도 제공한다. 따라서, 병리학적 상태 또는 질환의 치료에 사용하기 위한, 또는 이러한 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 다중특이성 분자의 용도가 제공된다.
병리학적 상태
병리학적 상태 또는 질환은 예를 들면, 감염(바이러스, 세균, 진균 및 기생충), 감염과 관련된 내독성 쇼크, 관절염, 예컨대, 류마티스성 관절염, 천식, 예컨대, 중증 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 결장염, 페이로니병(Peyronie's Disease), 복강 질환, 담낭 질환, 필로니달병(Pilonidal disease), 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 졸중, I형 당뇨병, 라임병, 수막뇌염, 자가면역 포도막염, 중추 및 말초 신경계의 면역 관련 염증성 질환, 예컨대, 다발성 경화증, 루푸스(예컨대, 전신 홍반 루푸스) 및 귈랑-바레(Guillain-Barr) 증후군, 아토피성 피부염, 자가면역 간염, 섬유화 폐포염, 그레이브스병, IgA 신장병증, 특발성 저혈소판자색반, 메니에르병(Meniere's disease), 천포창, 원발성 담관 간경화증, 사르코이드증, 경피증, 베게너 육아종증, 다른 자가면역 질환, 췌장염, 외상(수술), 이식편-대-숙주 질환, 이식 거부, 허혈성 질환, 예컨대, 심근경색 및 죽상동맥경화증을 포함하는 심장 질환, 혈관내 응고, 골 재흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염, 위산감소증, 및 유방암, 폐암, 위암, 난소암, 간세포암, 결장암, 췌장암, 식도암, 두경부암, 신장암, 특히 신장 세포 암종, 전립선암, 간암, 흑색종, 육종, 골수종, 신경모세포종, 태반 융모막암종, 자궁경부암 및 갑상선암, 및 이들의 전이성 형태를 포함하는 암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 질환은 암, 예를 들면, 림프구성 백혈병, 예컨대, 급성 림프모구성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병을 비롯한 백혈병; 또는 골수성 백혈병, 예컨대, 급성 골수성 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병이다.
한 실시양태에서, 자가면역 질환은 하기 질환들을 포함한다: 급성 파종 뇌척수염(adem), 급성 괴사 출혈성 백색질뇌염, 애디슨병(Addison's disease), 부신 기능저하, 저코르티솔증, 원혈 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 척추관절염, 스트룸펠-마리병(Strumpell-marie disease), 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질 증후군(aps), 자가면역 혈관부종, 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역 자율신경기능이상, 자가면역 간염, 자가면역 고지질혈증, 자가면역 면역결핍, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 커낼-스미쓰(Canale-Smith) 증후군, 자가면역 심근염, 자가면역 난소염, 자가면역 췌장염(AIP), 자가면역 다선성 증후군(I형, II형 및 III형), 자가면역 망막병증(AR), 자가면역 저혈소판자색반(ATP), 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 두드러기, 축삭/신경 신경병증, 발로병(balo disease), 베체트병(Behcet's disease), 수포성 유사천포창, 심근병증, 캐슬맨병(Castleman disease), 복강 질환, 샤가스병(chagas disease), 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점성 골수염(CRMO), 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 반흔성 유사천포창/양성 점막성 유사천포창(CP), 크론병, 염증성 장 질환, 결장염, 장염, 회장염, 코간스(Cogans) 증후군, 한랭응집소 질환, 선천성 심장 차단, 콕사키(Coxsackie) 심근염, 크레스트병(crest disease), 한랭글로불린혈증, 탈수초 신경병증, 헤르페스모양 피부염, 듀링병(Duhring's disease), 피부근염, I형 당뇨병, 원판상 홍반 루푸스(DLE), 드레슬러(Dressler's) 증후군, 자궁내막증, 수포성 표피박리증(EB) 및 후천성 EB(EBA), 호산구성 위장염, 식도염, 호산구성 근막염, 슐만(schulman's) 증후군, 결절성 홍반, 실험 알레르기성 뇌척수염, 에반스(Evans) 증후군, 섬유화 폐포염, 거대 세포 동맥염(측두 동맥염), 거대 세포 심근염, 사구체신염(비증식성: 국소 분절 사구체경화증 및 막 사구체신염, 증식성: IgA 신장병증), 굿파스처(goodpasture's) 증후군, 다발혈관염을 갖는 육아종증(GPA)(이전에 베게너 육아종증으로서 지칭됨), 그레이브스병(Graves' disease), 귈랑-바레 증후군, 밀러 피셔(Miller Fisher) 증후군, 급성 모터 축삭 신경병증, 급성 모터 감각 축삭 신경병증, 급성 범자율신경 신경병증, 빅커스태프(Bickerstaff's) 뇌간 뇌염, 하시모토(Hashimoto's) 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인(Henoch-Schonlein) 자색반, 임신 포진, 저감마글로불린혈증, 특발성 폐 섬유증, 특발성 저혈소판자색반(ITP), IgA 신장병증(IGAN), 버거(berger's) 증후군, 후두염동반성 사구체신염, IgA 천포창, IgG4 관련 경화 질환, 면역-조절된 불임, 봉입체(inclusion body) 근염, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 간질 방광염, 이삭(Isaac's) 증후군, 신경근긴장증, 소아 관절염, 소아 근염, 가와사키(Kawasaki) 증후군, 램버트-이튼(Lambert-Eaton) 증후군, 백혈구파괴성 혈관염, 편평태선, 경화성 태선, 목질 결막염, 선형 IgA 피부병(LAD), 유사천포창, 루푸스(SLE), 라임병, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염(MPA), 혼합된 결합 조직 질환(MCTD), 단일클론 감마병증, 무렌(Mooren's) 궤양, 무샤-하버만병(Mucha-Habermann disease), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시신경척수염(devic's), 신경근긴장증, 이삭 증후군(후천성, 부신생물성, 유전성), 호중구감소증, 눈 반흔성 유사천포창, 시신경염, 난소염, 안구간대경련-근간대경련 증후군, 고환염, 재발성 류마티즘, 판다스(pandas)(스트렙토코커스와 관련된 소아 자가면역 신경정신병학적 질환), 부신생물성 자가면역 다발장기 증후군(PAMS), 부신생물성 소뇌 변성, 부신생물성 천포창(PNP), 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 패리 롬버그(Parry Romberg) 증후군, 파소네이지-터너(Parsonnage-Turner) 증후군, 평면부염(주변 포도막염), 임신 유사천포창(PG), 심상성 천포창(PV), 낙엽상 천포창(PF), 말초 신경병증, 혈관주변 뇌척수염, 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염(PAN), 류마티스성 다발근육통, 다발근염, 심근경색후 증후군, 심막절개후 증후군, 프로게스테론 피부염, 원발성 담관 간경화증, 하노트(Hanot) 증후군, 원발성 경화 담관염(PSC), 경화 담관염, 건선, 건선성 관절염, 괴저성 농피증, 순수 적혈구 무형성증, 라스무센(Rasmussen's) 뇌염, 만성 국소 뇌염(CFE), 레이노(Raynauds) 현상, 반응성 관절염, 레이터(Reiter's) 증후군, 레코버린(recoverin) 관련 망막병증(RAR), 반사 교감신경 이영양증, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군, 후복막 섬유증, 류마티스 열, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 슈미츠(Schmidt) 증후군, 공막염, 경피증, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 강직 사람/인간 증후군, 아급성 세균성 심내막염(SBE), 수삭(Susac's) 증후군, 교감신경성 안염, 다카야스(Takayasu's) 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 폐색성 혈전혈관염, 부에르거병(Buerger's disease), 저혈소판자색반(TTP), 톨로사-헌트(Tolosa-Hunt) 증후군, 횡단 척수염, 궤양성 결장염, 미분화된 결합 조직 질환(UCTD), 포도막염, 류마티스성 다발근육통, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염, 부에르거병, 피부 혈관염, 가와사키병, 결절성 다발동맥염, 베체트 증후군, 처그-스트라우스 증후군, 피부 혈관염, 헤노흐-쇤라인 자색반, 현미경적 다발혈관염, 베게너 육아종증, 골퍼(golfer's) 혈관염, 대소수포성 피부병, 및 비틸리고베게너(Vitiligowegener's) 육아종증(현재 다발혈관염을 갖는 육아종증(GPA)으로서 지칭됨).
한 실시양태에서, 자가면역 질환은 ANCA 혈관염, IgA 신장병증(버거병), 심상성 천포창/수포성 유사천포창, ITP, 원발성 담관 간경화증, 자가면역 갑상선염(그레이브스병), 하시모토병, 루푸스 신염, 막 사구체신염(또는 막 신장병증), APS, 중중 근무력증, 시신경척수염, 원발성 쇼그렌 증후군, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 췌장염, 피부근염, 자가면역 포도막염, 자가면역 망막병증, 베체트병, IPF, 전신 경화증, 간 섬유증, 자가면역 간염, 원발성 경화 담관염, 백반증, 굿파스처 증후군, 폐 폐포 단백질증, 만성 자가면역 두드러기, 건선, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 축삭 척추관절염, 이식(GvHD를 포함함), 천식, COPD, 거대 세포 동맥염, 불응성 자가면역 혈구감소증, 에반스 증후군(자가면역 용혈성 빈혈), I형 당뇨병, 사르코이드증, 다발근염, 궤양성 결장염, 크론병, 복강 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 국소 분절 사구체경화증, 만성 라임병(라임 보렐리아증), 편평태선, 강직 사람 증후군, 확장성 심근병증, 자가면역 (림프구성) 난소염, 후천성 수포성 표피박리증, 자가면역 위축성 위염, 악성 빈혈, 아토피성 피부염, 죽상동맥경화증, 다발성 경화증, 라스무센 뇌염, 귈랑-바레 증후군, 후천성 신경근긴장증 및 졸중을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 질환은 암, 예를 들면, 백혈병, 예를 들면, 림프구성 백혈병, 예컨대, 급성 림프모구성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병; 골수성 백혈병, 예컨대, 급성 골수성 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병; 또는 림프종, 예컨대, 미만성 거대 B 세포 림프종, 또는 호지킨 또는 비호지킨 림프종이다.
본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 개시의 분자, 예컨대, 본원에 기재된 다중특이성 분자를 포함하는 약학 또는 진단 조성물도 제공한다. 따라서, 치료 및 의약의 제조에 사용될 본 개시의 분자, 예컨대, 본원에 기재된 다중특이성 분자의 용도가 제공된다.
통상적으로 상기 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 멸균 약학 조성물의 부분으로서 제공될 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 다중특이성 분자를 첨가하고 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 또는 진단 조성물을 제조하는 방법도 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 본 개시의 조성물의 원하는 특성을 향상시키기 위한 약학적으로 허용 가능한 제제화 담체, 용액 또는 첨가제를 지칭한다. 부형제는 당분야에서 잘 알려져 있고 완충제(예를 들면, 구연산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제 및 중탄산염 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들면, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해가능한 마이크로스피어 내에 캡슐화될 수 있다. 제제는 일반적으로 멸균 제조 과정을 이용함으로써 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.
이것은 제제를 위해 사용되는 완충된 용매 용액을 제조하고 여과로 멸균하는 단계, 항체를 멸균 완충된 용매 용액에 무균 현탁하는 단계, 및 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에게 익숙한 방법으로 제제를 멸균 용기 내에 분배하는 단계를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 그 자체가 조성물을 제공받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고 독성을 나타내지 않아야 한다. 적합한 담체는 느리게 대사되는 큰 거대분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들면, 무기산 염, 예컨대, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산의 염, 예컨대, 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염이 사용될 수 있다.
치료 조성물의 약학적으로 허용 가능한 담체는 액체, 예컨대, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자에 의한 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로서 제제화될 수 있게 한다.
본 개시의 분자, 예컨대, 본원에 기재된 다중특이성 분자는 예를 들면, 용액 또는 현탁액의 형태로 용매에 분산되어 전달될 수 있다. 상기 분자는 적절한 생리학적 용액, 예를 들면, 생리학적 식염수, 약학적으로 허용 가능한 용매 또는 완충된 용액에 현탁될 수 있다. 당분야에서 공지되어 있는 완충된 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하도록 물 1 ㎖당 0.05 mg 내지 0.15 mg의 에데트산이나트륨, 8.0 mg 내지 9.0 mg의 NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg의 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg의 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg의 구연산나트륨을 함유할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 현탁액은 예를 들면, 동결건조된 항체로부터 제조될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체의 심도있는 검토는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991))에서 입수가능하다.
본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 표적화된 질환 또는 병태를 치료하거나, 완화시키거나 예방하기 위해, 또는 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내기 위해 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 항체에 대한 치료 유효량은 세포 배양 어세이 또는 동물 모델, 통상적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 먼저 추정될 수 있다. 동물 모델은 투여의 적절한 농도 범위 및 경로를 결정하는 데 이용될 수도 있다. 그 다음, 이러한 정보는 인간에게의 투여에 유용한 용량 및 경로를 결정하는 데 이용될 수 있다.
인간 대상체를 위한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식습관, 투여의 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 치료법에 대한 내성/반응에 의존할 것이다. 이 양은 상용적인 실험에 의해 결정될 수 있고 임상의의 판단 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg, 예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg일 것이다. 대안적으로, 용량은 하루에 1 내지 500 mg, 예컨대, 하루에 10 내지 100, 200, 300 또는 400 mg일 수 있다. 약학 조성물은 소정의 양의 본 발명의 활성 물질을 함유하는 단위 제형으로 편리하게 제공될 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나, 다른 물질, 약물 또는 호르몬과 함께(예를 들면, 동시에, 순차적으로 또는 별도로) 투여될 수 있다.
본 개시의 다중특이성 분자가 투여되는 용량은 치료될 병태의 성질, 존재하는 염증의 정도, 및 항체 분자가 예방적으로 사용되는 것인지 아니면 기존 병태를 치료하기 위해 사용되는 것인지의 여부에 의존한다.
용량의 빈도는 다중특이성 분자의 반감기 및 그의 효과의 지속시간에 의존할 것이다. 항체 분자가 짧은 반감기(예를 들면, 2시간 내지 10시간)를 갖는 경우, 하루에 하나 이상의 용량을 제공할 필요가 있을 수 있다. 대안적으로, 다중특이성 분자가 긴 반감기(예를 들면, 2일 내지 15일)를 갖는 경우, 단지 하루에 1회, 주마다 1회 또는 심지어 1개월 또는 2개월마다 1회 용량을 제공할 필요가 있을 수 있다.
본 개시에서, 최종 제제의 pH는 다중특이성 분자의 등전점의 값과 유사하지 않고, 상기 제제의 pH가 7인 경우, 8 내지 9의 pI 또는 이보다 더 높은 pI가 적절할 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 이것은 궁극적으로 개선된 안정성을 갖는 최종 제제를 제공할 수 있다고, 예를 들면, 항체 또는 단편이 용액에 남아있다고 생각된다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 경막내, 심실내, 경진피, 경피(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO98/20734호 참조), 피하, 복강내, 코내, 장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 수의 경로들에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(Hyposprays)도 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 달성될 것이거나, 조직의 사이질 공간으로 전달될 것이다. 조성물은 관심있는 특정 조직 내로 투여될 수도 있다. 용량 치료는 단회 용량 일정 또는 다회 용량 일정일 수 있다.
생성물이 주사 또는 주입을 위한 생성물인 경우, 상기 생성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고 제제화제, 예컨대, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 다중특이성 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체에 의해 재구성될 건조된 형태로 존재할 수 있다. 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 상기 조성물은 항체를 분해로부터 보호하되, 일단 위장관으로부터 흡수되면 이중특이성 단백질 복합체를 방출하는 물질을 함유할 필요가 있을 것이다.
본 개시에 따른 분무가능한 제제는 예를 들면, 포일 외피로 포장된 단회 용량 유닛(예를 들면, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)으로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 일정 부피, 예를 들면, 2 ㎖의 용매/용액 완충제에 유닛 용량을 함유한다.
본원에서 사용된 용어 "변이체"는 상응하는 야생형 펩티드 또는 단백질의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 변경을 함유하는 펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 변이체는 상응하는 야생형 펩티드 또는 단백질에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 그러나, 변이체가 그의 상응하는 야생형 펩티드 또는 단백질과 실질적으로 유사한 기능을 나타내는 한, 변이체는 80% 미만의 서열 동일성을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 구축물은 적어도 삼중특이적이다. 이 상황에서, 추가 특이성은 임의의 관심있는 항원, 예를 들면, 반감기를 연장시키기 위한 항원, 예컨대, 알부민 또는 Fc 신생아 수용체(FcRn); 이펙터 기능, 예컨대, Fc 수용체 또는 보조자극 분자를 활성화시키거나 억제하기 위한 항원; 조직 또는 세포 표적화 항원; 또는 혈액/뇌 장벽(BBB) 전달을 보조하기 위한 항원, 예컨대, 트랜스페린 수용체 또는 LRP1에 대해 유도될 수 있다.
본 개시는 특정 항원 특이성을 갖는 상기 신규 포맷을 포함하는 조성물, 예컨대, 약학 조성물까지 확장된다.
추가 양태에서, 본 개시는 치료에 있어서 상기 포맷 및 상기 조성물의 용도를 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체 분자 또는 다중특이성 분자를 첨가하고 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 또는 진단 조성물을 제조하는 방법도 제공한다.
항체 분자 또는 다중특이성 분자는 약학 또는 진단 조성물에서 유일한 활성 성분일 수 있거나, 다른 항체 성분 또는 비항체 성분, 예컨대, 스테로이드 또는 다른 약물 분자를 비롯한 다른 활성 성분을 동반할 수 있다.
약학 조성물은 적합하게는 치료 유효량의 본 발명의 항체를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 표적화된 질환 또는 상태를 치료하거나, 완화시키거나 예방하기 위해, 또는 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내기 위해 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 항체에 대한 치료 유효량은 세포 배양 어세이 또는 동물 모델, 통상적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 먼저 추정될 수 있다. 동물 모델은 투여의 적절한 농도 범위 및 경로를 결정하는 데 이용될 수도 있다. 그 다음, 이러한 정보는 인간에게의 투여에 유용한 용량 및 경로를 결정하는 데 이용될 수 있다.
인간 대상체를 위한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식습관, 투여의 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 치료법에 대한 내성/반응에 의존할 것이다. 이 양은 상용적인 실험에 의해 결정될 수 있고 임상의의 판단 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예컨대, 100 mg/kg일 것이다.
약학 조성물은 용량당 소정의 양의 본 발명의 활성 물질을 함유하는 단위 제형으로 편리하게 제공될 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나, 다른 물질, 약물 또는 호르몬과 함께(예를 들면, 동시에, 순차적으로 또는 별도로) 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 "물질"은 투여될 때 생리학적 효과를 갖는 물질을 지칭한다.
본원에서 사용된 "약물"은 치료 용량에서 적절한 생리학적 효과를 갖는 화학 물질을 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체 또는 단편은 면역억제 요법, 예컨대, 스테로이드, 특히 프레드니손과 함께 사용된다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체 또는 단편은 리툭시맙 또는 다른 B 세포 요법과 함께 사용된다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체 또는 단편은 임의의 B 세포 또는 T 세포 조절제 또는 면역조절제와 함께 사용된다. 예로는 메토트렉세이트, 마이크로페니올레이트 및 아자티오프린이 있다.
본 발명의 항체 분자가 투여되는 용량은 치료될 병태의 성질, 존재하는 염증의 정도, 및 항체 분자가 예방적으로 사용되는 것인지 아니면 기존 상태를 치료하기 위해 사용되는 것인지의 여부에 의존한다. 용량의 빈도는 항체 분자의 반감기 및 그의 효과의 지속시간에 의존할 것이다. 항체 분자가 짧은 반감기(예를 들면, 2시간 내지 10시간)를 갖는 경우, 하루에 하나 이상의 용량을 제공할 필요가 있을 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 긴 반감기(예를 들면, 2일 내지 15일) 및/또는 긴 지속 약력학(PD) 프로파일을 갖는 경우, 단지 하루에 1회, 주마다 1회 또는 심지어 1개월 또는 2개월마다 1회 용량을 제공할 필요가 있을 수 있다.
한 실시양태에서, 용량은 격주마다, 즉 한 달에 2회 전달된다.
한 실시양태에서, 용량은 추가 용량의 투여 전에 항-약물(이 경우 항-항체) 반응이 약해지도록 간격을 두고 투여된다.
본원에서 사용된 "반감기"는 순환계, 예를 들면, 혈청/혈장에서의 분자의 지속시간을 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 "약력학적 특성(pharmacodynamics)"은 본 개시에 따른 분자의 생물학적 작용의 프로파일 및 특히 지속시간을 지칭한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 그 자체가 조성물을 제공받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고 독성을 나타내지 않아야 한다. 적합한 담체는 느리게 대사되는 큰 거대분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들면, 무기산 염, 예컨대, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산의 염, 예컨대, 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염이 사용될 수 있다.
치료 조성물의 약학적으로 허용 가능한 담체는 액체, 예컨대, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대, 습윤화제, 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자에 의한 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로서 제제화될 수 있게 한다.
투여에 적합한 제형은 비경구 투여, 예를 들면, 주사 또는 주입, 예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 투여에 적합한 제형을 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입을 위한 생성물인 경우, 상기 생성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고 제제화제, 예컨대, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체에 의해 재구성될 건조된 형태로 존재할 수 있다.
일단 제제화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 실시양태에서, 조성물은 인간 대상체에게 투여되도록 개조된다.
적합하게는, 본 개시에 따른 제제에서 최종 제제의 pH는 항체 또는 단편의 등전점의 값과 유사하지 않고, 예를 들면, 단백질의 pI가 8 내지 9의 범위 내에 있거나 이보다 더 높은 경우, 7의 제제 pH가 적절할 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 이것은 궁극적으로 개선된 안정성을 갖는 최종 제제를 제공할 수 있다고, 예를 들면, 항체 또는 단편이 용액에 남아있다고 생각된다.
일례에서, 4.0 내지 7.0 범위 내의 pH에서 약학 제제는 1 내지 200 mg/㎖의 본 개시에 따른 항체 분자, 1 내지 100 mM의 완충제, 0.001% 내지 1%의 계면활성제, a) 10 내지 500 mM의 안정화제, b) 10 내지 500 mM의 안정화제 및 5 내지 500 mM의 긴장성 물질, 또는 c) 5 내지 500 mM의 긴장성 물질을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 경막내, 심실내, 경진피, 경피(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO98/20734호 참조), 피하, 복강내, 코내, 장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 수의 경로들에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이도 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 조성물로서 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 제형도 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 달성될 것이거나, 조직의 사이질 공간으로 전달될 것이다. 조성물은 병변 내로 투여될 수도 있다. 용량 치료는 단회 용량 일정 또는 다회 용량 일정일 수 있다.
조성물 중의 활성 성분은 항체 분자일 것임이 인식될 것이다. 따라서, 상기 활성 성분은 위장관에서의 분해에 민감할 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 상기 조성물은 항체를 분해로부터 보호하되, 일단 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출하는 물질을 함유할 필요가 있을 것이다.
약학적으로 허용 가능한 담체의 심도있는 검토는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991))에서 입수가능하다.
한 실시양태에서, 제제는 흡입을 비롯한 국소 투여용 제제로서 제공된다.
적합한 흡입가능한 제제는 흡입가능한 분말, 추진제 기체를 함유하는 계량 에어로졸 또는 추진제 기체를 갖지 않는 흡입가능한 용액을 포함한다. 활성 물질을 함유하는 본 개시에 따른 흡입가능한 분말은 상기 언급된 활성 물질만으로 구성될 수 있거나, 상기 언급된 활성 물질과 생리학적으로 허용 가능한 부형제의 혼합물로 구성될 수 있다.
이들 흡입가능한 분말은 모노사카라이드(예를 들면, 글루코스 또는 아라비노스), 디사카라이드(예를 들면, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드(예를 들면, 덱스트란), 폴리알코올(예를 들면, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들면, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들 서로의 혼합물을 포함할 수 있다. 모노사카라이드 또는 디사카라이드가 적절하게 사용되고, 특히(그러나, 배타적으로는 아님) 수화물 형태의 락토스 또는 글루코스가 사용된다.
폐에서의 침착을 위한 입자는 10 ㎛ 미만, 예컨대, 1 내지 9 ㎛, 예를 들면, 1 내지 5 ㎛의 입자 크기를 요구한다. 활성 성분(예컨대, 항체 또는 단편)의 입자 크기는 가장 중요하다.
흡입가능한 에어로졸을 제조하는 데 사용될 수 있는 추진제 기체는 당분야에서 공지되어 있다. 적합한 추진제 기체는 탄화수소, 예컨대, n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예컨대, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 사이클로프로판 또는 사이클로부탄의 염소화된 및/또는 불소화된 유도체로부터 선택된다. 상기 언급된 추진제 기체들은 단독으로 또는 이들의 혼합몰로서 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진제 기체는 TG11, TG12, TG134a 및 TG227로부터 선택된 할로겐첨가된 알칸 유도체이다. 상기 언급된 할로겐화된 탄화수소들 중 TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이들의 혼합물이 특히 적합하다.
추진제 기체 함유 흡입가능한 에어로졸은 다른 성분, 예컨대, 보조용매, 안정화제, 표면 활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제, 및 pH를 조절하기 위한 수단도 함유할 수 있다. 이들 성분들 전부가 당분야에서 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진제 기체 함유 흡입가능한 에어로졸은 최대 5 중량%의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들면, 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1 중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로, 폐에의 국소 투여는 예를 들면, 장치, 예컨대, 분무기, 예를 들면, 압축기에 연결된 분무기(예를 들면, 파리 레스퍼레이토리 이퀴프먼트 인코포레이티드(Pari Respiratory Equipment, Inc.)(미국 버지니아주 리치몬드 소재)에 의해 제작된 파리 마스터(Pari Master)(R) 압축기에 연결된 파리 LC-제트 플러스(Pari LC-Jet Plus)(R) 분무기)를 이용하여 액체 용액 또는 현탁액 제제를 투여하는 것일 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 다중특이성 분자는 예를 들면, 용액 또는 현탁액의 형태로 용매에 분산되어 전달될 수 있다. 상기 항체 또는 분자는 적절한 생리학적 용액, 예를 들면, 식염수, 또는 약학적으로 허용 가능한 용매 또는 완충된 용액에 현탁될 수 있다. 당분야에서 공지되어 있는 완충된 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하도록 물 1 ㎖당 0.05 mg 내지 0.15 mg의 에데트산이나트륨, 8.0 mg 내지 9.0 mg의 NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg의 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg의 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg의 구연산나트륨을 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들면, 동결건조된 항체를 사용할 수 있다.
치료 현탁액 또는 용액 제제는 하나 이상의 부형제도 함유할 수 있다. 부형제는 당분야에서 잘 알려져 있고 완충제(예를 들면, 구연산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제 및 중탄산염 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들면, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해가능한 마이크로스피어 내에 캡슐화될 수 있다. 제제는 일반적으로 멸균 제조 과정을 이용함으로써 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.
이것은 제제를 위해 사용되는 완충된 용매/용액을 제조하고 여과로 멸균하는 단계, 항체를 멸균 완충된 용매 용액에 무균 현탁하는 단계, 및 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에게 익숙한 방법으로 제제를 멸균 용기 내에 분배하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시에 따른 분무가능한 제제는 예를 들면, 포일 외피로 포장된 단회 용량 유닛(예를 들면, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)으로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 일정 부피, 예를 들면, 2 ㎖의 용매/용액 완충제에 유닛 용량을 함유한다.
본원에 개시된 항체는 분무를 통한 전달에 적합할 수 있다.
본 발명의 항체는 유전자 요법의 이용에 의해 투여될 수 있다는 것도 예상된다. 이를 달성하기 위해, 항체 쇄들이 DNA 서열로부터 발현되고 제자리에서 조립되도록 적절한 DNA 성분의 제어 하에서 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 환자 내로 도입한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자, 예컨대, 본원에 기재된 항체 분자는 관심있는 항원 또는 항원들의 활성을 기능적으로 변경시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 개시의 항체 분자는 상기 항원 또는 항원들의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 중화시킬 수 있거나, 길항할 수 있거나 촉진할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 분자(이를 포함하는 융합 단백질, 이중특이성 단백질 복합체 또는 조성물을 포함함)는 실험실 시약으로서 사용되기 위해 제공된다.
추가 양태
추가 양태에서, 상기 정의된 다중특이성 분자 또는 융합 단백질을 비롯한 본원에 기재된 구축물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, DNA 서열이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 다중특이성 분자 또는 이중특이성 단백질 복합체 또는 항체를 비롯한 본원에 기재된 구축물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, DNA 서열이 제공된다.
또한, 본원의 개시는 상기 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터까지 확장된다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 그 자신에 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 일례는 추가 DNA 분절이 라이게이션될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프인 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 벡터들은 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면, 세균 복제기점을 갖는 세균 벡터 및 에피좀성 포유동물 벡터). 다른 벡터들(예를 들면, 비-에피좀성 포유동물 벡터)은 숙주 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있고, 여기서 이들은 나중에 숙주 게놈과 함께 복제된다. 플라스미드는 벡터의 가장 흔히 사용되는 형태이기 때문에, 본 명세서에서 용어 "플라스미드"와 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이와 관련하여, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing)을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "선택 마커"는 마커 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되어 있거나 형질감염되어 있는 세포를 확인할 수 있게 하는 발현을 갖는 단백질을 지칭한다. 광범위한 선택 마커들이 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포에게 약물, 예컨대, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선택 마커는 예를 들면, 시각적으로 식별가능한 마커, 예컨대, 형광 마커일 수도 있다. 형광 마커의 예로는 로다민, FITC, TRITC, 알렉사 플루오르(Alexa Fluors) 및 이들의 다양한 접합체들이 있다.
본 개시의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 본 개시의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 사용될 수 있다. 세균, 예를 들면, 이. 콜라이 및 다른 미생물 시스템이 사용될 수 있거나, 진핵, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포 발현 시스템도 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 개시는 본 개시의 분자를 코딩하는 DNA로부터의 단백질의 발현을 유발하기에 적합한 조건 하에서 본 개시의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 개시에 따른 분자 또는 이의 성분을 제조하는 방법도 제공한다.
본원에 기재된 이중특이성 단백질 복합체를 비롯한 본 개시의 분자는 진단/검출 키트에서 사용될 수 있다. 키트는 예를 들면, 둘 다 동일한 유형의 세포 상에 존재하는 2개의 항원들에 특이적인 이중특이성 항체 복합체를 포함할 수 있고, 이때 양성 진단은 항원들 둘 다가 성공적으로 검출되는 경우에만 이루어질 수 있다. 비복합체화된 형태로 2개의 별도의 항체들 또는 항체 단편들을 사용하기보다는 본 개시의 분자, 예컨대, 본원에 기재된 이중특이성 항체 복합체를 사용함으로써 검출의 특이성을 크게 향상시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시의 분자, 예컨대, 이중특이성 항체 복합체는 고체 표면 상에 고정된다. 고체 표면은 예를 들면, 칩 또는 ELISA 플레이트일 수 있다.
샘플에서 제1 펩티드 및 제2 펩티드의 존재를 검출하기 위한 본 개시에 따른 분자, 예를 들면, 본원에 기재된 이중특이성 단백질 복합체의 용도도 제공되고, 이로써 상기 분자는 검출제로서 사용된다.
본 개시의 분자, 예컨대, 본원에 기재된 이중특이성 항체 복합체는 예를 들면, 결합된 항체-항원 복합체의 검출을 용이하게 하는 형광 마커에 접합될 수 있다. 이러한 이중특이성 항체 복합체는 면역형광 현미경관찰을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 이중특이성 항체 복합체는 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA를 위해 사용될 수도 있다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 분자 또는 이의 성분을 정제하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 불순물이 컬럼 상에서 체류되고 항체가 비결합된 분획에서 유지되도록 비결합 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 본 개시에 따른 분자 또는 이의 성분을 정제하는 방법이 제공된다. 상기 단계는 예를 들면, 약 6 내지 8의 pH에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 예를 들면, 약 4 내지 5의 pH에서 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 초기 포획 단계도 포함할 수 있다.
상기 방법은 생성물 및 방법 관련 불순물이 생성물 스트림으로부터 적절하게 해상되도록 추가 크로마토그래피 단계(들)도 포함할 수 있다.
정제 방법은 하나 이상의 한외여과 단계, 예컨대, 농축 및 정용여과 단계도 포함할 수 있다.
상기 사용된 "정제된 형태"는 적어도 90%의 순도, 예컨대, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%(중량/중량) 이상의 순도를 의미하기 위한 것이다.
본 개시의 서열은 하기 본 명세서 및 도면에서 제공된다.
본 명세서의 문맥에서, "포함하는"은 "비롯한"으로서 해석되어야 한다.
또한, 일부 요소들을 포함하는 본 개시의 양태는 관련 요소들로 "구성"되거나 "본질적으로 구성"된 대안적인 실시양태까지 확장되기 위한 것이다.
긍정적으로 언급된 실시양태는 본원에서 부인에 대한 근거로서 사용될 수 있다.
본원에서 언급된 모든 참고문헌들은 참고로 구체적으로 도입된다.
참고문헌
Figure pct00065
실시예
실시예에서 사용된 용어 "Fab-Kd-Fab"는 하기 식을 갖는 이중특이성 단백질 복합체를 기술한다:
A-X:Y-B
상기 식에서,
A-X는 제1 융합 단백질이고;
Y-B는 제2 융합 단백질이고;
X:Y는 이종이량체-테더이고;
A는 항원, 예컨대, CD79에 특이적인 Fab 단편을 포함하고;
B는 항원, 예컨대, CD45에 특이적인 Fab 단편을 포함하고;
X는 결합 쌍의 제1 결합 파트너, 예컨대, scFv이고;
Y는 결합 쌍의 제2 결합 파트너, 예컨대, 펩티드이고;
:는 X와 Y 사이의 상호작용(예컨대, 결합 상호작용)이다.
실시예 1 - 기능 어세이를 위한 Fab'-A(Fab-scFv[A-X]) 및 Fab'-B(Fab-펩티드[B-Y])의 제조
클로닝 방법 :
제한 효소 부위 DNA 서열을 플랭킹하는 PCR 또는 유전자 합성으로 항체 가변 영역 DNA를 생성하였다. 이들 부위들은 가변 중쇄의 경우 HindIII 및 XhoI이었고 가변 경쇄의 경우 HindIII 및 BsiWI이었다. 이것은 중쇄 가변 영역이 2개의 중쇄 벡터들(FabB-Y를 갖는 pNAFH 및 FabA-Xds[디설파이드 안정화됨]를 갖는 pNAFH) 내로 라이게이션될 수 있게 만드는데, 이는 이들이 상보적 제한 부위를 갖기 때문이다. 이것은 가변 영역 업스트림(또는 5')을 뮤린 불변 영역 및 펩티드 Y(GCN4) 또는 scFv X(52SR4)에 라이게이션시킴으로써 전체 판독 프레임을 생성한다. 경쇄를, 동일한 상보적 제한 부위를 다시 사용하는 표준 사내 뮤린 불변 카파 벡터(pMmCK 또는 pMmCK S171C) 내로 클로닝하였다. 가변 영역이 토끼로부터 단리되는 경우 pMmCK S171C 벡터가 사용된다. 전체 오픈 리딩 프레임의 측면에 있는 프라이머를 사용하여 서열분석함으로써 클로닝 사건을 확인하였다.
CHO-S의 배양 :
현탁 CHOS 세포를 2 mM(100x) 글루타맥스로 보충된 CDCHO 배지(인비트로겐(Invitrogen))에 미리 적응시켰다. 세포를 진탕기 인큐베이터(쿠너 아게(Kuner AG), 스위스 비르스펠덴 소재) 상에서 140 rpm에서 교반된 상태로 대수 생장기에서 유지하고 8% CO2로 보충된 37℃에서 배양하였다.
전기천공 형질감염 :
형질감염 전, CEDEX 세포 카운터(이노바티스 아게(Innovatis AG), 독일 빌레펠트 소재)를 이용하여 세포 수 및 생존력을 측정하였고 요구된 양의 세포(2x108개의 세포/㎖)를 원심분리 원추 튜브 내로 옮기고 10분 동안 1400 rpm에서 회전시켰다. 펠렛화된 세포를 멸균 얼스 균형 염 용액((Earls Balanced Salts Solution)에 재현탁하고 추가 10분 동안 1400 rpm에서 회전시켰다. 상청액을 버렸고 펠렛을 원하는 세포 밀도까지 재현탁하였다.
2x108개 세포/㎖ 혼합물을 위해 400 ㎍ 및 800 ㎕의 최종 농도로 벡터 DNA를 피펫으로 큐벳(바이오라드(Biorad)) 내에 넣었고 사내 전기천공 시스템을 이용하여 전기천공하였다.
형질감염된 세포를, 2 mM 글루타맥스로 강화된 ProCHO 5 배지 및 항생제 항유사분열(100X) 용액(500 중 1)을 함유하는 1X3 ℓ 삼각 플라스크 내로 직접 옮겼고, 세포를 37℃, 5% CO2 및 140 rpm 진탕으로 설정된 쿠너 진탕기 인큐베이터에서 배양하였다. 공급 보충제 2 g/ℓ ASF(AJINOMOTO)를 형질감염시킨 지 24시간 후에 첨가하였고 온도를 추가 13일 배양 동안 37℃까지 낮추었다. 4일째 날, 3 mM 부티르산나트륨(n-부티르산 나트륨 염, 시그마(Sigma) B-5887)을 배양물에 첨가하였다.
14일째 날, 배양물을 튜브로 옮겼고 4000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후 세포로부터 상청액을 분리하였다. 보유된 상청액을, 0.22 ㎛ 사르토 브란(SARTO BRAN) P 밀리포어(Millipore)에 이어 0.22 ㎛ 감마 금 필터를 통해 더 여과하였다. 최종 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
대규모(1.0 ℓ) 정제 :
악타 익스프레스(AKTA Xpress) 시스템 및 히스트랩 엑셀(HisTrap Excel) 예비팩킹된 니켈 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 친화성 포획으로 Fab-A 및 Fab-B를 정제하였다. 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였고, 필요하다면 약산 또는 약염기를 사용하여 pH를 중성까지 조절한 후 컬럼 상에 적재하였다. 15 내지 25 mM 이미다졸을 함유하는 이차 세척 단계를 이용하여 니켈 수지로부터 임의의 약하게 결합된 숙주 세포 단백질/비특이성 His 결합물질을 제거하였다. 10 mM 인산나트륨(pH 7.4) + 1 M NaCl + 250 mM 이미다졸을 사용하여 용출을 수행하였고 2 ㎖ 분획을 수집하였다. 1 컬럼 부피가 용출되면, 용출 피크를 더 선명하게 하여 결과적으로 총 용출 부피를 감소시키기 위해 시스템을 10분 동안 중단시켰다. 가장 깨끗한 분획을 풀링하였고 완충제를 PBS(시그마)(pH 7.4)로 교환하고 0.22 ㎛ 여과하였다. 최종 풀(pools)을 A280 스캔, SE-HPLC(G3000 방법) 및 SDS-PAGE(환원 및 비환원)로 분석하였고 PTS 엔도세이프(Endosafe) 시스템을 이용하여 내독소에 대해 분석하였다.
실시예 2 - CD79/CD22 이중특이적이되 2가가 아닌 조합이 Akt 신호전달을 억제한다는 것을 입증하기 위한, 이종이량체적으로 테더링된 이중특이성 단백질 복합체 포맷의 Fab'-A(Fab-scFv[A-X]) 및 Fab'-b(Fab-펩티드[B-Y])의 용도
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 DMEM(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(200 nM) 양의 Fab'-A(Fab-scFv) 및 Fab'-B(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이성 또는 2가 항체의 격자를 생성하였다. 이 격자는 표 4에 표시되어 있다.
Figure pct00066
Fab'A-X와 Fab'B-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 인큐베이션한 후, V-바닥 96웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC와 이중특이성 또는 2가 조합을 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 8분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 후, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(비디 바이오사이언시스)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500g에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 이 세포 펠렛을 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 이어서, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다. 그 다음, 형광 표지된 항-CD20 항체(비디 바이오사이언시스), 및 단백질 상의 위치 473에서 변형된 세린 잔기를 인식하는 형광 표지된 항-인 Akt 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 Akt의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트(Forecyt)™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 Akt 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다. CD22와 CD79b의 조합의 상대적 효과는 표 5에 표시되어 있다(↓= 억제, ↑= 자극 및 ↔ = 전체 효과 없음).
Figure pct00067
이 데이터는 막대 도표의 형태로도 표시되어 있고(도 1), 데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰구간이다. 데이터는 CD22와 CD79b의 조합이 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인-Akt 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, CD22와 CD22의 조합은 상승된 수준의 인-Akt 발현을 나타내었다.
실시예 3 - CD79/CD22 이중특이적이되 2가가 아닌 조합이 PLCγ2 신호전달을 억제한다는 것을 입증하기 위한, 이종이량체적으로 테더링된 이중특이성 단백질 복합체 포맷의 Fab'-A(Fab-scFv[A-X]) 및 Fab'-b(Fab-펩티드[B-Y])의 용도
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 DMEM(라이프 테크놀로지스)으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(200 nM) 양의 Fab'-A(Fab-scFv[A-X]) 및 Fab'-B(Fab-펩티드[B-Y])를 희석함으로써 이중특이성 또는 2가 항체의 격자를 생성하였다. 이 격자는 표 4에 표시되어 있다.
Fab'A-X와 Fab'B-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 인큐베이션한 후, V-바닥 96웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC와 이중특이성 또는 2가 조합을 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 8분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 후, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(비디 바이오사이언시스)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500g에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 이 세포 펠렛을 유동 완충제에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 이어서, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다.
그 다음, 형광 표지된 항-CD20 항체(비디 바이오사이언시스), 및 단백질 상의 위치 759에서 변형된 티로신 잔기를 인식하는 형광 표지된 항-인 PLCγ2 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 PLCγ2의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 PLCγ2 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다. CD22와 CD79b의 조합의 상대적 효과는 표 6에 표시되어 있다(↓= 억제, ↑= 자극 및 ↔ = 전체 효과 없음).
Figure pct00068
이 데이터는 막대 도표로서 표현될 수도 있고(도 2), 데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰구간이다. 데이터는 CD22와 CD79b의 조합 및 CD79b와 CD79b의 조합 모두가 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인-PLCγ2 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, CD22와 CD22의 조합은 상승된 수준의 인-PLCγ2 발현을 나타내었다.
실시예 4 - CD79/CD22 이중특이성 조합이 CD86 발현을 억제한다는 것을 입증하기 위한, 이종이량체적으로 테더링된 이중특이성 단백질 복합체 포맷의 Fab'-A(Fab-scFv[A-X]) 및 Fab'-b(Fab-펩티드[B-Y])의 용도
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 DMEM(라이프 테크놀로지스)으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(200 nM) 양의 Fab'-X(Fab-scFv) 및 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이성 또는 2가 항체의 격자를 생성하였다. 이 격자는 표 4에 표시되어 있다.
Fab'A-X와 Fab'B-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 인큐베이션한 후, V-바닥 96웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC와 이중특이성 또는 2가 조합을 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 24시간 동안 B 세포를 활성화시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 얼음 위에 놓고 빙냉 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)로 1회 세척하였다. 그 다음, 세포를 형광 표지된 항-CD19 항체(비디 바이오사이언스) 및 형광 표지된 항-CD86 항체로 염색하고 암실에서 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD19 및 CD86의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 CD86 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다. CD22와 CD79b의 조합의 상대적 효과는 표 7에 표시되어 있다(↓= 억제, ↑= 자극 및 ↔ = 전체 효과 없음).
Figure pct00069
이 데이터는 막대 도표의 형태로도 표시되어 있고(도 3), 데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰구간이다. 데이터는 CD22와 CD79b의 조합 및 CD79b와 CD79b의 조합 모두가 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD86 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, CD22와 CD22의 조합은 상승된 수준의 CD86 발현을 나타내었다.
실시예 5 - CD22 및 CD79b의 억제 효과는 항체들이 이중특이성 배향으로 정렬될 때에만 재현될 수 있다 .
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 DMEM(라이프 테크놀로지스)으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(200 nM) 양의 Fab'-X(Fab-scFv) 및/또는 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이적, 2가 또는 항체들의 혼합물의 조합을 생성하였다. 이들 조합들은 표 8에 제시되어 있다. 적정 곡선 실험을 위해, 이들 조합들을 2.5분의 1 희석으로 단계적으로 8회 희석하여 이 조합에 대한 용량 적정을 생성하였다.
Figure pct00070
Fab'A-X 및/또는 Fab'B-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 인큐베이션한 후, V-바닥 96웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC와 Fab'A-X 및/또는 Fab'B-Y 조합을 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 8분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 후, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(비디 바이오사이언시스)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500g에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 이 세포 펠렛을 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 이어서, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다.
그 다음, 형광 표지된 항-CD20 항체(비디 바이오사이언시스), 위치 473에서 변형된 세린 잔기를 인식하는 항-인 Akt 항체, 및 위치 759에서 변형된 티로신 잔기를 인식하는 항-인 PLCγ2 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20, Akt 및 PLCγ2의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 Akt 및 PLCγ2 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다. 도 4 및 5는 CD22와 CD79b의 이중특이성 조합뿐만 아니라 CD22 항체와 CD79b 항체의 혼합물도 인산화된 Akt 및 PLCγ2 발현을 억제하였다는 것을 보여준다(데이터는 평균 값을 나타내고 오차 막대는 95% 신뢰구간이다).
CD22와 CD79b의 이중특이성 조합의 사용 시 확인된 억제를 검증하기 위해, CD22 항체와 CD79b 항체의 혼합물과 함께 이 조합을 적정하였고 총 세포내 IkB(신호전달 판독대상) 및 CD86(24시간 후 활성화 마커)의 억제를 B 세포에서 측정하였다.
도 6에서 확인될 수 있는 바와 같이, CD22-X/CD79b-Y의 조합은 총 IkB 단백질의 수준에 의해 측정될 때 항-IgM 자극 후 NF-kB 신호 활성화를 억제할 수 있었으나, CD22-X/CD79b-X의 조합은 억제할 수 없었다. 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 6을 이용한 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트를 이용함으로써 추정된 IC50은 7.5 nM이었다(데이터는 평균 값을 나타내고 오차 막대는 표준 편차이다). 추가로, CD22-X/CD79b-Y의 조합의 적정은 24시간 후 B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD86 발현을 억제할 수 있었으나 CD22-X/CD79b-X의 조합은 억제할 수 없었다(도 7 참조).
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 DMEM(라이프 테크놀로지스)으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(500 nM) 양의 Fab'-X(Fab-scFv) 및 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이성 조합을 생성하였다. 이들 조합들을 2.5분의 1 희석으로 단계적으로 8회 희석하여 이 조합에 대한 용량 적정을 생성하였다. Fab'-X와 Fab'-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 인큐베이션한 후, 2.5x105개의 PBMC를 V-바닥 96웰 플레이트에 첨가하였다. 그 다음, PBMC를 Fab'-X와 Fab'-Y의 조합에 첨가하고 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 24시간 동안 B 세포를 활성화시켰다. 세포 표면 활성화 마커의 검출을 가능하게 하기 위해, 플레이트를 얼음 위에 놓고 빙냉 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)로 1회 세척하였다. 그 다음, 세포를 형광 표지된 항-CD19 항체(비디 바이오사이언스) 및 형광 표지된 항-CD86 항체로 염색하고 암실에서 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD19 및 CD86의 세포 발현을 측정하였다. 데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 CD86 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, CD22-X/CD79b-Y의 조합의 적정은 24시간 후 B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD86 발현을 억제할 수 있었다. 그래프패드 프리즘 6을 이용한 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트를 이용함으로써 추정된 IC50은 10.3 nM이었다(데이터는 평균 값을 나타내고 오차 막대는 표준 편차이다).
실시예 6 - CD22 및 CD79b 이중특이성 단백질의 억제 효과는 상이한 항체 V 영역들에 의해 재현될 수 있다 .
면역화 : 선택된 항원을 코딩하는 DNA를 유전자 합성 또는 상업적 공급원으로부터 수득하고 강력한 항시적(constitutive) 프로모터를 갖는 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 그 다음, 사내 전기천공 시스템을 이용하여 플라스미드 DNA를 Rab-9 토끼 섬유모세포(ATCC®　CRL-1414™) 내로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 유세포분석으로 항원 발현에 대해 확인하고 사용될 때까지 액체 질소에서 분취물로서 동결하였다. 동일한 세포 상에서의 동시-발현, 또는 단일 또는 다중 형질감염된 세포들의 혼합물의 제조를 통해 토끼 1마리당 최대 6개의 항원들을 면역화시켰다. 토끼를 3회 용량의 세포로 면역화시켰다.
항체 발견 : 문헌(Zubler et al. (1985))에 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여 B 세포 배양물을 제조하였다. 요약하면, 10% FCS(피에이에이 래보러토리스 리미티드(PAA laboratories ltd)), 2% HEPES(시그마 알드리치(Sigma Aldrich)), 1% L-글루타민(깁코 비알엘(Gibco BRL)), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(깁코 비알엘), 0.1% β-머캡토에탄올(깁코 비알엘), 3% 활성화된 비장세포 배양 상청액 및 감마-조사된 돌연변이체 EL4 뮤린 흉선종 세포(5x104/웰)로 보충된 200 ㎕/웰 RPMI 1640 배지(깁코 비알엘)를 사용하여, 면역화된 토끼로부터의 비장 또는 PBMC 유래의 B 세포를 5% CO2의 대기 하에 37℃에서 7일 동안 바코딩된 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 대략 2000개 내지 5000개 세포의 밀도로 배양하였다.
토끼의 면역화에 사용된 항원으로 동시-형질감염된 HEK293 세포를 사용한 균질한 형광 기반의 결합 어세이를 이용하여 B 세포 배양물 상청액에서 항원 특이성 항체의 존재를 확인하였다. 스크리닝은 매트릭스 플레이트메이트(Platemate) 액체 핸들러(handler)를 이용하여 10 ㎕의 상청액을 바코딩된 96웰 조직 배양 플레이트로부터, 표적 항원으로 형질감염된 HEK293 세포를 함유하는 바코딩된 384웰 흑색-벽 어세이 플레이트(대략 3000개의 세포/웰) 내로 옮기는 단계를 포함하였다. 염소 항-토끼 IgG Fcγ 특이성 Cy-5 접합체(잭슨(Jackson))로 결합을 확인하였다. 플레이트를 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 8200 세포 검출 시스템 상에서 판독하였다.
일차 스크리닝 후, 아비소 온닉스 히트-픽킹 로봇(Aviso Onyx hit-picking robot)을 이용하여 양성 상청액들을 96웰 바코딩된 마스터 플레이트 상에서 통합하였고 세포 배양 플레이트 내의 B 세포를 -80℃에서 동결하였다. 그 다음, 별도로 항원으로 형질감염된 HEK293 세포, 및 항원의 공급원으로서의 재조합 단백질로 코팅된 수퍼아비딘(Superavidin)™ 비드(뱅스 래보러토리스(Bangs Laboratories))에 대한 균질한 형광 기반의 결합 어세이에서 마스터 플레이트를 스크리닝하였다. 각각의 웰에 대한 항원 특이성을 확인하기 위해 이것을 수행하였다.
관심있는 웰의 선택으로부터 항체 가변 영역 유전자의 회수를 가능하게 하기 위해, 불균질한 B 세포 집단을 함유하는 소정의 웰에서 항원 특이성 B 세포를 확인할 수 있도록 데콘볼루션(deconvolution) 단계를 수행하였다. 형광 초점(Fluorescent foci) 방법(Clargo et al., 2014. Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159; 유럽 특허 제1570267B1호)을 이용하여 이것을 달성하였다. 요약하면, 양성 웰로부터의 면역글로불린 분비 B 세포를 표적 항원으로 형질감염된 HEK293 세포, 또는 바이오티닐화된 표적 항원 및 염소 항-토끼 Fcγ 단편 특이성 FITC 접합체(잭슨)의 1:1200 최종 희석물로 코팅된 스트렙타비딘 비드(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))와 혼합하였다. 1시간 동안 37℃에서 정적 인큐베이션을 수행한 후, 항원 특이성 B 세포는 그 B 세포를 둘러싸는 형광 할로의 존재로 인해 확인될 수 있었다. 그 다음, 올림푸스(Olympus) 현미경을 이용함으로써 확인된 다수의 이들 개별 B 세포 클론들을 에펜도르프 미세조작기(Eppendorf micromanipulator)로 채취하여 PCR 튜브 내에 침착시켰다. 형광 초점 방법을 다시 이용하여 면역화된 토끼의 골수로부터 직접적으로 유래된 불균질한 B 세포 집단으로부터 항원 특이성 B 세포를 확인하였다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이성 프라이머를 사용한 역전사(RT)-PCR로 단일 세포로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하였다. 3' 말단 및 5' 말단에서 제한 부위를 도입함으로써, 가변 영역이 마우스 Fab-X 및 Fab-Y(VH) 또는 마우스 카파(VL) 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있게 하는 네스티드(nested) 이차 PCR로 2 라운드의 PCR을 수행하였다. Fab-X 및 Fab-Y 발현 벡터를 위한 중쇄 및 경쇄 구축물을, 펙틴(Fectin) 293(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 HEK-293 세포 내로 동시-형질감염시켰거나, 엑스피펙타민(Expifectamine)(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 Expi293 세포 내로 동시-형질감염시켰고, 재조합 항체를 5 ㎖의 부피로 6웰 조직 배양 플레이트에서 발현시켰다. 5일 내지 7일 발현 후, 상청액을 수거하였다. 항원으로 형질감염된 HEK293 세포 및 재조합 단백질 또는 항원 형질감염된 HEK 세포로 코팅된 수퍼아비딘™ 비드(뱅스 래보러토리스)에 대한 균질한 형광 기반의 결합 어세이에서 상청액을 시험하였다. 클로닝된 항체의 특이성을 확인하기 위해 이것을 수행하였다.
소규모 Fab A-X 및 Fab B-Y의 제조 (소규모(50 ㎖) Expi293 형질감염)
Expi293 세포를 0.5x106개의 생존 세포/㎖의 최종 농도까지 Expi293™ 발현 배지에서 상용적으로 하위배양하고 120 rpm, 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 인큐베이터(멀티트론(Multitron), Infors HT)에서 인큐베이션하였다.
형질감염 당일, 자동화된 세포 카운터(Vi-CELL, 벡크만 코울터(Beckman Coulter))를 이용하여 세포 생존력 및 농도를 측정하였다. 2.5x106개 생존 세포/㎖의 최종 세포 농도를 달성하기 위해, 적절한 부피의 세포 현탁액을 멸균 250 ㎖ 삼각 진탕 플라스크에 첨가하고 각각의 50 ㎖ 형질감염을 위해 새로운 미리 가온된 Expi293™ 발현 배지를 첨가함으로써 42.5 ㎖의 부피에 도달되게 하였다.
각각의 형질감염을 위한 지질-DNA 복합체를 제조하기 위해, 총 50 ㎍의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA를 Opti-MEM®　I 배지(라이프 테크놀로지스)로 2.5 ㎖의 총 부피까지 희석하였고 135 ㎕의 엑스피펙타민™ 293 시약(라이프 테크놀로지스)을 Opti-MEM®　I 배지로 2.5 ㎖의 총 부피까지 희석하였다. 모든 희석물들을 약하게 혼합하고 실온에서 5분 이하의 시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 DNA 용액을 각각의 희석된 엑스피펙타민™ 293 시약에 첨가하여 5 ㎖의 총 부피를 수득하였다. DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 혼합물을 약하게 혼합하고 실온에서 20분 내지 30분 동안 인큐베이션하여 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체가 형성되게 하였다.
DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체 인큐베이션이 완료된 후, 5 ㎖의 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 120 rpm, 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 인큐베이터(멀티트론, Infors HT)에서 인큐베이션하였다.
형질감염시킨 지 대략 16시간 내지 18시간 후, 250 ㎕의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 1(라이프 테크놀로지스) 및 2.5 ㎖의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 2(라이프 테크놀로지스)를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다.
형질감염시킨 지 7일 후, 세포 배양물을 수거하였다. 세포를 50 ㎖ 스핀 튜브(팔콘(Falcon)) 내로 옮기고 4000 rpm에서 30분 동안 회전시킨 후, 0.22 ㎛ 스테리컵(Stericup)(머크 밀리포어(Merk Millipore))을 통해 멸균 여과하였다. 정화되고 멸균 여과된 상청액을 4℃에서 저장하였다. 최종 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
소규모(50 ㎖) 정제 : 소규모 진공 기반의 정제 시스템을 이용하여 친화성 포획으로 Fab-X 및 Fab-Y 둘 다를 별도로 정제하였다. 요약하면, 50 ㎖의 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과한 후, 500 ㎕의 Ni 세파로스 비드(지이 헬쓰케어)를 첨가하였다. 그 다음, 상청액 비드 혼합물을 약 1시간 동안 텀블링시킨 후, 진공을 적용함으로써 상청액을 제거하였다. 그 다음, 비드를 세척제 1(50 mM 인산나트륨 1 M NaCl pH 6.2) 및 세척제 2(0.5 M NaCl)로 세척하였다. 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.0) + 1 M NaCl을 사용하여 용출을 수행하였다. 용출된 분획을 PBS(시그마, pH 7.4)로 완충제 교환하고 0.22 ㎛ 여과하였다. 최종 풀을 A280 스캔, SE-UPLC(BEH200 방법) 및 SDS-PAGE(환원 및 비환원)로 분석하였고 PTS 엔도세이프 시스템을 이용하여 내독소에 대해 분석하였다.
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 RPMI 1640(라이프 테크놀로지스)으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 태아 소 혈청, 50 유닛/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640으로 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(200 nM) 양의 Fab'-X(Fab-scFv) 및/또는 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이성 항체, 2가 항체 또는 항체 혼합물의 조합을 생성하였다. 3개의 상이한 CD79b Fab-Y들과 3개의 상이한 CD22 Fab-X들의 이들 조합들은 표 9에 표시되어 있다.
Figure pct00071
Fab'A-X와 Fab'B-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 인큐베이션한 후, V-바닥 96웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC와 Fab'A-X 및/또는 Fab'B-Y 조합을 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 12.5 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 10분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 다음, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(비디 바이오사이언시스)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500g에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 이 세포 펠렛을 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.1% NaN3 + 2 mM EDTA)에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 그 다음, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다.
그 다음, 형광 표지된 항-CD20 항체(비디 바이오사이언시스), 및 위치 759에서 변형된 티로신 잔기를 인식하는 항-인 PLCγ2 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 40 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 PLCγ2의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 PLCγ2 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다.
도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 데이터는 모든 상이한 항체 V 영역들을 사용하는, CD22와 CD79b의 조합이 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인-PLCγ2 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 7: 신규 이중특이성 항체 표적을 확인하기 위한, 이종이량체적으로 테더링된 단백질 복합체들의 큰 패널의 격자 스크리닝
도입 : 상기 실시예들에서 이중특이성 포맷 및 스크리닝 방법을 성공적으로 검증한 후, 스크리닝을 더 큰 수의 항원 쌍들까지 확장하였다. B 세포 상에서 발현된 23개의 상이한 항원들에 대한 항체 가변(V) 영역 쌍들의 패널을 생성하였다. Fab-Kd-Fab[즉, A-X:Y-B, 이때 A 및 B는 Fab 단편임] 포맷을 사용하여, 315개의 상이한 항원 쌍 조합들 각각의 다수의 V 영역 조합들을 나타내는, 이종이량체적으로 테더링된 단백질 복합체들의 격자를 형성하였다. 이중특이성 항체에 의한 중재를 위한 신규 표적 쌍을 선택하기 위해 고속대량 유세포분석 어세이에서 BCR(B 세포 수용체) 신호전달을 조절하는 능력에 대해 이들 조합들을 스크리닝하였다.
항체를 실시예 6에 기재된 바와 같이 단리하였다.
스크리닝 어세이
37℃로 설정된 수조를 이용하여 도너 PBMC들을 신속히 해동하고 50 ㎖ 팔콘 튜브로 조심스럽게 옮겼다. 그 후, 이들을 어세이 배지로 5 ㎖까지 적가 희석하여 삼투압 쇼크를 최소화하였다. 그 다음, 세포를 20 ㎖까지 조심스럽게 희석한 후, 최종 배지 희석제를 첨가하여 50 ㎖의 부피를 만들었다. 그 후, 세포를 5분 동안 500g에서 회전시킨 후, 상청액을 제거하고 세포를 1 ㎖의 배지에 재현탁하였다. 그 다음, 세포를 카운팅하고 1.66x106개 세포/㎖까지 희석한 후, 웰당 30 ㎕를 V-바닥 TC 플레이트 내로 분배하여, 5.0x104개 세포/웰의 최종 어세이 농도를 제공하였다. 그 다음, 세포 플레이트가 요구될 때까지 이 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 덮여진 상태로 저장하여, 최소 1시간의 휴면을 상기 세포 플레이트에게 제공하였다.
Fab-X 시약과 Fab-Y 시약을 어세이 배지 중의 5x 최종 어세이 농도에서 등몰 비로 혼합하고 37℃ 및 5% CO2에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 96웰 U-바닥 폴리프로필렌 플레이트에서 제조하고 인큐베이션 동안 덮어두었다.
10 ㎕의 5x Fab-KD-Fab 혼합물을, 세포를 함유하는 적절한 시험 웰에 첨가하고 30초 동안 1000 rpm에서 진탕함으로써 혼합한 후, 37℃ 및 5% CO2에서 90분 동안 인큐베이션하였다.
그 다음, 세포를 10 ㎕의 항-인간 IgM으로 자극하였다. 자극제의 최종 어세이 농도는 어세이 패널 판독대상에 따라 달라졌고, 3개의 항체 칵테일 A, B 및 C(이하에 상세히 기재됨)를 50 ㎍/㎖(칵테일 A 및 C) 또는 25 ㎍/㎖(칵테일 B)의 최종 어세이 농도에서 자극하였다. 그 후, 어세이 플레이트를 30초 동안 1000 rpm에서 약하게 혼합한 후, 5분(항체 칵테일 A 및 C) 또는 2분(항체 칵테일 B) 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 150 ㎕의 빙냉 BD 사이토픽스를 모든 웰들에 첨가하여 어세이를 중단하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 고정된 세포를 5분 동안 500g에서 회전시켜 세포를 펠렛화하였고 바이오텍(BioTek) ELx405 플레이트 세척제를 사용하여 상청액을 제거하였다. 플레이트를 30초 동안 2400 rpm에서 볼텍싱함으로써 펠렛을 재현탁하였다. 이어서, 100 ㎕의 빙냉 BD 세포 투과가능화 완충제 III을 첨가함으로써 30분 동안 4℃에서 세포를 투과가능하게 만들었다. 그 다음, 세포를 100 ㎕ FACS 완충제로 세척하고 5분 동안 500g에서 회전시켰다. 상청액을 ELx405로 다시 제거한 후, 이를 사용하여 200 ㎕의 FACS 완충제를 신속히 분배함으로써 임의의 잔류 투과가능화 완충제를 씻어내었다. 세포를 500g에서 다시 회전시켰고 뒤집어 상청액을 제거하였다. 이전 회전 단계 동안 항체 칵테일을 FACS 완충제로 제조하고 광으로부터 차폐된 상태로 보관하였다. 그 후, 세포를 볼텍싱(2400 RPM, 30초)으로 재현탁한 후, 20 ㎕의 항체 칵테일을 모든 웰들에 첨가하였고 플레이트를 1000 rpm에서 30초 동안 진탕하였다. 그 다음, 세포를 실온의 암실에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
이어서, 세포를 500g에서 회전시키면서 200 ㎕ FACS 완충제로 2회 세척하였고, 각각의 단계 후 상청액을 제거하였다. 마지막으로, 세포를 2400 rpm에서 30초 동안 볼텍싱함으로써 재현탁한 후, 최종 20 ㎕의 FACS 완충제를 첨가하였다. 그 다음, 플레이트(들)를 인텔리사이트 HTFC/iQue 기계 상에서 판독하였다.
FACS 완충제 = PBS + 1% BSA + 0.05% NaN3 + 2 mM EDTA
항체 칵테일 A = 1:2 CD20 PerCp-Cy5.5(비디 바이오사이언시스) + 1:5 PLCγ2 AF88 + 1:10 Akt AF647 + 1:50 ERK1/2 PE(FACS 완충제로 희석됨)
항체 칵테일 B = 1:2 CD20 PerCp-Cy5.5(비디 바이오사이언시스) + 1:5 Syk PE + 1:5 BLNK AF647(FACS 완충제로 희석됨)
항체 칵테일 C = 1:5 CD20 PerCp-Cy5.5(바이오레전드(Biolegend)) + 1:5 PLCγ2 AF488 + 1:10 Akt AF647 + 1:5 Syk PE(FACS 완충제로 희석됨)
Figure pct00072
Fab-X + Fab-Y 조합을 항체 칵테일 A 및 B 또는 C 단독으로 스크리닝하였다. 모든 스크린들을 2명의 상이한 혈액 도너들로부터의 원추 세포에 대해 수행하였다. 상업적으로 입수가능한 소프트웨어 수단을 이용하여 데이터를 포획하고 평가하였다. 총 2500개의 Fab-X + Fab-Y 조합들을 315개의 상이한 항원 조합들에 대해 스크리닝하였다.
결과
B 세포 기능을 억제하는 항원들의 신규 조합을 찾는 본 실시예에서, 각각의 Fab-Kd-Fab[즉, A-X:Y-B, 이때 A 및 B는 Fab 단편임] 조합에 의한 BCR 신호전달 캐스케이드 단백질의 인산화 유도의 퍼센트 억제율을 계산하였고, 양성 조합에 대한 기준을 V 영역들의 적어도 하나의 조합에 의한 적어도 2개의 인-판독대상들의 적어도 30% 억제로서 설정하였다. 이 역치에 따르면, 조사된 315개 중 11개의 신규 항원 쌍 조합들이 요구된 기준을 충족시켰다. 이것은 원하는 활성을 갖는 조합을 찾기 위해 수많은 조합을 스크리닝해야 하는 것의 중요성, 및 CD79b와 CD22의 조합의 활성이 얼마나 드문지를 입증하는 3.5% 히트율을 나타낸다.
도 10 내지 12는 항원 격자 교차특이성에 대한 데이터를 보여준다. 값들은 각각 Syk, PLCγ2 및 AKT의 인산화의 퍼센트 억제율(활성화에 대한 음성 값)이고 평가된 다수의 V 영역 조합들의 평균을 나타낸다. 315개의 상이한 항원 조합들을 시험하였고, 확인될 수 있는 바와 같이 항체의 상이한 조합들에 의한 BCR 신호전달에 대한 효과는 강한 억제, 예를 들면, Fab-Y 상의 항원 3(CD22)과 조합된 Fab-X 상의 항원 2(CD79b)(인 Syk의 69.66% 억제) 및 Fab-X 상의 항원 3(CD22)과 조합된 Fab-Y 상의 항원 2(CD79b)(도 11에 나타낸 인 Syk의 52.32% 억제)부터 활성화, 예를 들면, X 상의 항원 6 및 Y 상의 항원 11(마이너스 118.10% 인 Syk, 도 11)까지 상당히 다양하였다.
도 10 내지 12에 나타낸 평균 % 값을 나타내는 각각의 데이터 점은 도 13에서 Fab-X 상의 항원 2(CD79b)와 Fab-Y 상의 항원 3(CD22)에 대해 표시되어 있다. 이 경우, 상이한 항체 V 영역들의 23개 상이한 조합들을 평가하였다. 대안적인 배향의 동일한 항원 조합, 즉 Fab-Y 상의 항원 2(CD79b)와 Fab-X 상의 항원 3(CD22)은 도 14에 표시되어 있다. 이 경우, 상이한 항체 V 영역들의 9개 상이한 조합들을 평가하였다. 모든 V 영역들은 억제를 보이지만, 유리하게는 이 방법도 최적 V 영역 조합의 선택에 사용될 수 있다.
실시예 8 - Fab-Kd-Fab 스크리닝 포맷에서의 항원 CD79b 및 항원 CD22 동시-표적화의 활성과 분자적으로 연결된 이중특이성 BYbe 포맷에서의 항원 CD79b 및 항원 CD22 동시-표적화의 활성의 비교
도입 : Fab-Kd-Fab 이종이량체적으로 테더링된 스크리닝 복합체에서 확인된 CD79b/CD22 표적 쌍 활성이 대안적 치료 분자적으로 연결된 포맷에서 유사한 원하는 활성으로 해석될 수 있는지를 확인하기 위해, 항원 CD79b 특이성(VR4447) 및 항원 CD22 특이성(VR4130)을 BYbe 포맷으로 생성하였다. 이 BYbe 포맷은 링커 SGGGGSGGGGS(서열번호 17)를 통해 항-항원 CD79b Fab(VR4447)의 중쇄에 융합된 디설파이드 안정화된(ds) 단일 쇄(sc)-Fv로서 항-항원 CD22 V 영역(VR4130)으로 구성된다.
방법 :
기능 스크리닝을 위한 BYbe의 정제를 다음과 같이 수행하였다:
기능 스크리닝 BYbe(Fab-dsscFv[Fab 중쇄의 C 말단 상에 부착된 scFv]) 포맷을 다음과 같이 정제하였다. 표준 expiHEK 또는 CHO 발현으로부터의 정화된 세포 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였다. 여과된 상청액을, PBS(pH 7.4)(시그마 알드리치 케미칼스(Sigma Aldrich Chemicals))로 평형화된 50 ㎖ 감마바인드플러스(GammabindPlus) 세파로스 XK26 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 2 ㎖/분의 속도로 적재하였다. 적재 후, 컬럼을 PBS(pH 7.4)로 세척한 후 0.1 M 글리신/HCl(pH 2.7)로 용출하였다. 용출 후, 280 nm에서 흡광도를 측정하였고, 용출 피크를 수집한 후 25분의 1 부피의 2 M 트리스/HCl(pH 8.5)로 중화시켰다. 10 kDa(BYbes) 분자량 컷오프 막을 갖는 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터(swing out rotor)로 4000xg에서 원심분리함으로써 상기 중화된 샘플을 농축하였다. 농축된 샘플을 PBS(pH 7.4)로 평형화된 XK16/60 또는 XK26/60 수퍼덱스200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 상기 컬럼을 각각 1 ㎖/분 또는 2.6 ㎖/분의 속도로 PBS(pH 7.4)의 등용매 구배로 현상하였다. 분획을 수집하였고, 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도에서 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8X300 mm) 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 선택된 단량체 분획을 풀링하였고, 10 kDa 분자량 컷오프 막을 갖는 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 4000xg에서 원심분리하여 1 mg/㎖ 초과의 농도까지 농축하였다. 최종 샘플을 농도에 대해서는 A280 스캐닝 UV-가시광선 분광계(Cary 50Bio)로 분석하였고; % 단량체에 대해서는 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도에서 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였고; 53분 동안 (겔당) 50 mA에서 4-20% 트리스-글리신 1.5 mm 겔(노벡스(Novex)) 상에서의 환원 및 비환원 SDS-PAGE 실행으로 분석하였고; 내독소에 대해서는 리뮬러스 아베보사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate)(LAL) 검사 카트리지를 갖춘 찰스 리버의 엔도세이프®　휴대용 검사 시스템으로 분석하였다.
기능 어세이
활성화 마커 어세이: 항원 CD79b 특이성 Fab'-Y와 항원 CD22 특이성 Fab'-X를 등몰 농도로 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 인큐베이션하였다. 조합을 1:4 연속 희석으로 100 nM의 출발 몰농도로부터 적정하였다. 항원 CD79b 및 CD22 특이성 BYbe도 1:4 연속 희석으로 100 nM의 출발 몰농도로부터 적정하였다. V-바닥 96웰 플레이트에서, 1.5x105개의 PBMC를, 적정된 Fab'-X 및 Fab'-Y 조합 또는 적정된 BYbe가 첨가된 웰에 첨가하였다. Fab'-X 및 Fab'-Y 조합 또는 BYbe를 추가 90분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 25 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 B 세포를 활성화시켰다.
100 ㎕의 빙냉 FACS 완충제(PBS + 1% BSA + 0.1% NaN3 + 2 mM EDTA)를 상기 웰에 첨가하였고, 플레이트를 밀봉하고 대략 15분 동안 젖은 얼음으로 덮은 후, 4℃에서 5분 동안 500xg에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 플레이트를 30초 동안 2000 rpm에서 진탕하였다.
그 다음, 세포를 형광 표지된 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD71 항체, 항-CD40 항체 및 항-CD86 항체(비디 바이오사이언시스)의 칵테일로 염색하였다. 플레이트를 짧게 진탕시키고 암실 내의 젖은 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 2회 세척하고 20 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 iQUE® 스크리너 유세포분석기를 이용하여 CD19, CD20, CD71, CD40 및 CD86의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 CD71, CD40 및 CD86 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다.
인유동(PhosFlow) 어세이 : 항원 CD79b 특이성 Fab'-Y 및 항원 CD22 특이성 Fab'-X를 등몰 농도로 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 인큐베이션하였다. 조합을 1:4 연속 희석으로 100 nM의 출발 몰농도로부터 적정하였다. 항원 CD79b 및 항원 CD22 특이성 BYbe도 1:4 연속 희석으로 100 nM의 출발 몰농도로부터 적정하였다. V-바닥 96웰 플레이트에서, 5.0x104개의 PBMC를 웰에 첨가하였고, 이것에 적정된 Fab'-X와 Fab'-Y의 조합 또는 적정된 BYbe를 첨가하였다. Fab'-X와 Fab'-Y의 조합 또는 BYbe를 추가 90분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 25 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃ 및 5% CO2에서 15분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 후, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(비디 바이오사이언시스)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500xg에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 이 세포 펠렛을 FACS 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3 + 2 mM EDTA)에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 이어서, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후, 유동 완충제로 2회 세척하였다.
그 다음, 세포를 형광 표지된 항-CD20 항체(비디 바이오사이언시스) 및 항-인산화된 PLCγ2, 항-인산화된 Akt 및 항-인산화된 p38 항체(비디 바이오사이언시스)로 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 2회 세척하고 20 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 iQUE® 유세포분석기를 이용하여 CD20, 및 인-PLCγ2, 인-Akt 및 인-p38의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 PLCγ2, Akt 및 p38 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다.
결과
인유동 어세이 : 도 15의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서의 항원 CD79b 및 항원 CD22의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인산화된 PLCγ2를 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 16의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서의 항원 CD79b 및 항원 CD22의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인산화된 P38을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 17의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서의 항원 CD79b 및 항원 CD22의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인산화된 Akt를 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
활성화 마커 어세이 : 도 18에서 확인될 수 있는 바와 같이, 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서의 항원 CD79b 및 항원 CD22의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD71 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 19의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서의 항원 CD79b 및 항원 CD22의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD40 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 20의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서의 항원 CD79b 및 항원 CD22의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD86 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 9 - 생체내 반감기의 연장을 위해 항-알부민 결합 도메인이 더 추가된, 분자적으로 연결된 이중특이성 BYbe 포맷에서 항원 CD79b 및 항원 CD22 동시-표적화의 활성화의 비교
도입 : Fab-Kd-Fab 이종이량체적으로 테더링된 스크리닝 복합체에서 확인된 CD79b/CD22 표적 쌍 활성이 생체내 반감기 연장에서 표적화된 항-알부민을 가진, 잠재적 치료 분자적으로 연결된 포맷에서 유사한 원하는 활성으로 해석될 수 있는지를 확인하기 위해, 서열 SGGGGSGGGGS(서열번호 17)를 갖는 링커를 통해 항-알부민 항체 단편을 실시예 8에 기재된 BYbe 포맷의 항원 CD22 Fab의 경쇄에 융합시켰다. 항원 CD79b 특이성(VR4447) 및 항원 CD22 특이성(VR4130 및 VR4126)을, 항-알부민 단편(VR0645)이 추가되거나 추가되지 않은 BYbe 포맷으로 생성하였다.
이 실험에서 사용된 구축물의 설명
Figure pct00073
방법
항-알부민 추가 특이성을 갖거나/갖지 않는 BYbe의 정제
BYbe(Fab-dsscFv[Fab 중쇄의 C 말단 상에 부착된 scFv]) 및 항-알부민을 갖는 BYbe(Fab-2xdsscFv[Fab 중쇄 및 경쇄의 C 말단 상에 부착된 scFv들]) 포맷을 다음과 같이 정제하였다. 표준 expiHEK 또는 CHO 발현으로부터의 정화된 세포 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였다. 여과된 상청액을, PBS(pH 7.4)(시그마 알드리치 케미칼스)로 평형화된 50 ㎖ 감마바인드플러스 세파로스 XK26 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 2 ㎖/분의 속도로 적재하였다. 적재 후, 컬럼을 PBS(pH 7.4)로 세척한 후 0.1 M 글리신/HCl(pH 2.7)로 용출하였다. 용출 후, 280 nm에서 흡광도를 측정하였고, 용출 피크를 수집한 후 25분의 1 부피의 2 M 트리스/HCl(pH 8.5)로 중화시켰다. 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷오프 막을 갖는 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 4000xg에서 원심분리함으로써 상기 중화된 샘플을 농축하였다. 농축된 샘플을 PBS(pH 7.4)로 평형화된 XK16/60 또는 XK26/60 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 상기 컬럼을 각각 1 ㎖/분 또는 2.6 ㎖/분의 속도로 PBS(pH 7.4)의 등용매 구배로 현상하였다. 분획을 수집하였고, 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도에서 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8X300 mm) 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 선택된 단량체 분획을 풀링하였고, 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷오프 막을 갖는 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 4000xg에서 원심분리하여 1 mg/㎖ 초과의 농도까지 농축하였다. 최종 샘플을 농도에 대해서는 A280 스캐닝 UV-가시광선 분광계(Cary 50Bio)로 분석하였고; % 단량체에 대해서는 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도에서 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였고; 53분 동안 (겔당) 50 mA에서 4-20% 트리스-글리신 1.5 mm 겔(노벡스) 상에서의 환원 및 비환원 SDS-PAGE 실행으로 분석하였고; 내독소에 대해서는 리뮬러스 아베보사이트 용해물(LAL) 검사 카트리지를 갖춘 찰스 리버의 엔도세이프®　휴대용 검사 시스템으로 분석하였다.
100 nM의 각각의 구축물 정제된 단백질을, 10% 태아소 혈청 및 2 mM 글루타맥스를 함유하는 RMPI 1640 배지(R10 배지)에서 37℃/5% CO2에서 60분 동안 5명의 개별 도너들로부터 유래된 인간 PBMC와 미리 인큐베이션하였다. 60분 후, B 세포만을 자극하도록 디자인된 25 ㎍/㎖의 염소 항-IgM 항체로 세포를 자극하였다. 24시간 후, 플레이트를 얼음 위에 놓아 임의의 추가 세포 활성화를 중단시킨 후, 빙냉 유세포분석 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)로 1회 세척하였다. 모든 상청액을 제거하였고 세포 펠렛을 재현탁하였다. 세포를 얼음 위에 놓고 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD27 항체, 항-CD71 항체 및 항-CD86 항체의 칵테일을 첨가하였다. 세포를 60분 동안 인큐베이션한 후, 유세포분석 완충제로 2회 세척하였다. iQUE 고속대량 유세포분석기를 이용하여 항-CD27 항체, 항-CD71 항체 및 항-CD86 항체와 CD19/CD20 양성 B 세포의 결합에 대한 데이터를 생성하였다. 포어사이트 소프트웨어를 사용하여 항-CD27 항체, 항-CD71 항체 및 항-CD86 항체와 B 세포의 결합에 대한 막대그래프를 생성하고 기하평균 강도 판독치를 유도하였다. 이 데이터를 엑셀 내로 불러왔고 각각의 조합에 대한 퍼센트 억제율 값을 생성하였다. 그 다음, 데이터를 그래프패드 프리즘　내로 불러왔고 각각의 조합에 대해 '+'로 표시된 평균을 갖는 휘스커(whisker) 도표를 생성하였다.
도 21은 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된, B 세포 상에서의 CD27 발현의 억제를 보여준다. 검사된 5명의 도너들 전체에서 이들 둘 다가 항-IgM 유도된 CD27의 일관되게 유사한 수준의 억제를 보였다. 도 22는 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된, B 세포 상에서의 CD71 발현의 억제를 보여준다. 5명의 도너들 전체에서 이들 둘 다가 항-IgM 유도된 CD71의 일관되게 유사한 수준의 억제를 보였다. 도 23은 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된, B 세포 상에서의 CD86 발현의 억제를 보여준다. 5명의 도너들 전체에서 이들 둘 다가 항-IgM 유도된 CD86의 일관되게 유사한 수준의 억제를 보였다.
도 24는 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된, B 세포 상에서의 CD27 발현의 억제를 보여준다. 검사된 5명의 도너들 전체에서 이들 둘 다가 항-IgM 유도된 CD27의 일관되게 유사한 수준의 억제를 보였다. 도 25는 R4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된, B 세포 상에서의 CD71 발현의 억제를 보여준다. 5명의 도너들 전체에서 이들 둘 다가 항-IgM 유도된 CD71의 일관되게 유사한 수준의 억제를 보였다. 도 26은 R4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된, B 세포 상에서의 CD86 발현의 억제를 보여준다. 5명의 도너들 전체에서 이들 둘 다가 항-IgM 유도된 CD86의 일관되게 유사한 수준의 억제를 보였다.
실시예 10 - 항-알부민이 더 추가되었거나 추가되지 않은, 분자적으로 연결된 이중특이성 BYbe의 사용 시 기억 B 세포 기능에 대한 항원 CD79b 및 항원 CD22의 동시-표적화의 효과
도입: CD79b/CD22의 표적화가 장기간 배양에서 배양된 B 세포에 대한 기능적 효과를 갖는지를 평가하기 위해, 단리 또는 혼합된 PBMC 배양에서 B 세포로부터의 IgG 생성을 측정하였다. 리콜(recall) 항원 파상풍 변성독소에 대한 특이성 항체의 측정은 기억 B 세포 기능의 판독결과를 제공한다.
항원 CD79b 특이성(VR4447) 및 항원 CD22 특이성(VR4126, VR4127 및 VR4130)을, 항-알부민 단편(VR0645)이 추가되었거나 추가되지 않은 BYbe 포맷으로 생성하였다. 서열 SGGGGSGGGGS(서열번호 17)를 갖는 링커를 통해 항-알부민 항체 단편을 실시예 8에 기재된 바와 같이 BYbe 포맷의 항원 CD22 Fab의 경쇄에 융합시켰다.
이 실험에서 사용된 구축물의 설명
Figure pct00074
방법
항-알부민 추가 특이성을 갖거나/갖지 않는 BYbe의 정제 :
BYbe(Fab-dsscFv[Fab 중쇄의 C 말단 상에 부착된 scFv]) 및 항-알부민을 갖는 BYbe(Fab-2xdsscFv[Fab 중쇄 및 경쇄의 C 말단 상에 부착된 scFv들]) 포맷을 실시예 9에 기재된 바와 같이 정제하였다.
B 세포의 활성화 및 파상풍 변성독소 특이성 IgG의 측정
10% 태아소 혈청 및 2 mM 글루타맥스를 함유하는 1640 배지(R10 배지)에서 최대 3명의 개별 도너들로부터 유래된 인간 PBMC 또는 정제된 B 세포를 6일 동안 500 ng/㎖ CD40L, 1 ㎍/㎖ CpG 및 50 ng/㎖ IL-21로 자극하였다. 정제된 단백질의 구축물을 0일째 날에 100 nM의 최종 농도로 첨가하고 어세이의 지속시간 동안 배양 배지에서 유지하였다. 6일 후, 상청액을 수거하고 파상풍 변성독소 특이성 IgG의 양을 ELISA로 검출하였다. 요약하면, 맥시소르프(Maxisorp) 절반-웰 ELISA 플레이트(넌크(Nunc))를 4℃에서 하룻밤 동안 PBS 중의 10 ㎍/㎖ 파상풍 변성독소로 코팅하였다. 그 다음, 상기 플레이트를, 2시간 동안 0.05% 트윈20을 함유하는 PBS 중의 5% 밀크로 차단하였다. 상청액을 희석한 후, 실온에서 2시간 동안 첨가하였다. 상기 플레이트를 PBS-0.05% 트윈 20으로 세척하였고, 5% 밀크-PBS 0.05% 트윈20으로 1 ㎍/㎖까지 희석된 퍼록시다제-염소 항-인간 IgG(H+L)를 사용하여 파상풍 결합된 항체를 검출하였다. TMB 기질 용액(KPL)을 사용하여 플레이트를 현상하였고, 시너지(Synergy) 2 마이크로플레이트 판독기(바이오텍)를 이용하여 450 nM에서 흡광도를 측정하였다. 데이터를 엑셀 내로 불러왔고 시험 항체 없이 배양된 세포와 비교하여 퍼센트 억제율을 계산하였다. 그 후, 데이터를 그래프패드 프리즘® 내로 불러오고 막대 도표로서 작도하였다.
도 27은 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe 및 VR4447/VR4130 BYbe와 함께 배양된 PBMC로부터의 파상풍 변성독소 IgG 생성의 억제를 보여준다. 데이터는 3명의 도너들로부터의 풀링된 데이터를 나타낸다.
도 28은 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe 및 VR4447/VR4130 BYbe와 함께 배양된 정제된 B 세포로부터의 파상풍 변성독소 IgG 생성의 억제를 보여준다. 데이터는 2명의 도너들로부터의 풀링된 데이터를 나타낸다.
도 29는 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe, VR4447/VR4130 BYbe, VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민과 함께 배양된 PBMC 또는 정제된 B 세포로부터의 파상풍 변성독소 IgG 생성의 억제를 보여준다. 데이터는 단일 도너로부터 표시된다.
실시예 11 - SLE 환자 B 세포에서의 BCR 신호전달의 이상조절 및 SLE B 세포 기능에 대한 항원 CD79b 및 항원 CD22의 동시-표적화의 효과
도입: CD79b/CD22의 조합이 자가면역 질환을 갖는 사람을 치료하는 데 사용될 수 있는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 갖는 환자로부터의 B 세포를 모델 시스템으로서 사용하였다. B 세포 기능에 관여하되 강강한 지원자에 비해 SLE 환자에서 이상조절되는 것으로 공지되어 있는 신호전달 단백질의 활성화 상태에 대한 CD79b/CD22 조합(VR4447/VR4130)의 영향을 시험하였다. 이 실험에서, 12명의 SLE 환자들 및 12명의 건강한 지원자들로부터의 B 세포를 그의 활성화 상태에 미치는 CD79b와 CD22의 동시-표적화의 효과에 대해 비교하였다.
방법:
인유동 어세이: 웰당 2x105개의 PBMC를 사용하여 모든 어세이들을 수행하였다.
처리된 샘플에서 항원 CD79b 및 항원 CD22 특이성 BYbe를 100 nM의 농도로 시험하였다. 건강한 지원자 및 SLE를 갖는 환자 둘 다로부터의 PBMC를 37℃에서 90분 동안 BYbe와 함께 미리 인큐베이션하였다. 비처리된 샘플에서, 이 항원처리 기간 동안 BYbe를 단순히 누락하였다. 이 시간 후, 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10분 동안 25 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)으로 활성화시켰고 고정제(사이토픽스 - 비디 바이오사이언시스)를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 비자극된 샘플에서, 이 인큐베이션 기간 동안 항-인간 IgM을 단순히 누락시켰다. 실온에서 15분 후, 세포를 펠렛화한 후(5분 동안 500xg) 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후, 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3 + 2 mM EDTA)로 2회 세척하였다. 그 다음, 세포를 항-CD20, 항-인산화된(p) NF-κB, 항-pSyk, 항-pAtk 및 항-pErk1&2로 염색하고 1시간 동안 실온의 암실에서 인큐베이션하였다. 최종적으로, 플레이트를 유동 완충제로 2회 세척한 후, iQUE 유세포분석기(인텔리사이트) 상에서 측정하였다. 그 다음, B 세포에서의 pNF-κB, pSyk, pAkt 및 pErk1&2 발현의 기하평균(평균 형광 강도, MFI)을 계산하고 그래프 형태로 표현하였다.
결과:
도 30은 NF-κB, Syk, Akt 및 Erk1&2(비자극 및 비처리)의 기준 인산화가 건강한 지원자로부터의 B 세포에 비해 SLE 환자 B 세포에서 상승된다는 것을 보여준다.
도 31 내지 34는 CD79/CD22 BYbe가 건강한 지원자 및 SLE 환자에서 pNF-κB, pSyk, pAkt 및 pErk1&2를 동등하게 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
결론:
이 데이터는 SLE 환자로부터의 B 세포가 건강한 지원자와 비교될 때 임의의 시험관내 자극 전에 활성화된다는 것을 보여준다. B 세포 수용체를 통한 세포의 자극 시, 건강한 지원자 및 SLE 환자는 배경 신호에 비해 향상된 수준의 활성화를 보인다. 건강한 지원자 및 SLE 환자에서, 이 신호는 CD79b/CD22 조합에 의해 실질적으로 차단된다. 이 데이터는 CD79b/CD22 조합이 건강한 지원자 및 기저 자가면역 질환을 갖는 사람으로부터의 B 세포를 억제할 수 있다는 것을 시사하고, 이것은 이 경로가 B 세포 활성화에 근본적으로 중요하다는 것을 시사한다.
실시예 12 - CD45 Fab/CD79 Fab 이중특이성 복합체는 Akt 신호전달을 억제하나, CD45와 CD79 Fab의 혼합물 또는 2가 CD79 Fab 복합체는 Akt 신호전달을 억제하지 않는다 .
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 DMEM(라이프 테크놀로지스)으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 CD45 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(200 nM) 양의 Fab'-A(Fab-scFv) 및 Fab'-B(Fab-펩티드) 또는 Fab-A(Fab-펩티드) 및 Fab-B(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이성 또는 2가 항체의 격자를 생성하였다. 이 격자는 표 10에 표시되어 있다.
Figure pct00075
FabA-X 및 FabB-Y 또는 Fab-A-Y 및 Fab-B-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 인큐베이션한 후, V-바닥 96웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC와 이중특이성 또는 2가 조합을 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 8분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 후, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(비디 바이오사이언시스)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500g에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 이 세포 펠렛을 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 이어서, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다. 그 다음, 형광 표지된 항-CD20 항체(비디 바이오사이언시스), 및 단백질 상의 위치 473에서 변형된 세린 잔기를 인식하는 형광 표지된 항-인 Akt 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 Akt의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 Akt 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다. CD45와 CD79b의 조합의 상대적 효과는 표 11에 표시되어 있다(↓= 억제, ↑= 자극 및 ↔ = 전체 효과 없음).
Figure pct00076
이 데이터는 막대 도표의 형태로도 표시되고(도 35), 데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰구간이다. 데이터는 CD45와 CD79b의 이중특이성 조합이 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인-Akt 발현을 억제할 수 있는 반면, 이중특이성 복합체를 형성할 수 없는 혼합물인 CD79b-Y와 CD79b-Y의 조합은 그러하지 않다는 것을 보여준다.
실시예 13 - CD45 Fab/CD79Fab 이중특이성 복합체는 PLCγ2 신호전달을 억제하나, CD45와 CD79 Fab의 혼합물 또는 2가 CD79 Fab' 복합체는 PLCγ2 신호전달을 억제하지 않는다 .
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 DMEM(라이프 테크놀로지스)으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 CD45 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(200 nM) 양의 Fab-a(Fab-scFv[A-X]) 및 Fab'-B(Fab-펩티드[B-Y]) 또는 Fab-A(Fab-펩티드) 및 Fab-B(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이성 또는 2가 항체의 격자를 생성하였다. 이 격자는 표 10에 표시되어 있다.
Fab'A-X 및 Fab'B-Y 또는 Fab-A-Y 및 Fab-B-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 인큐베이션한 후, V-바닥 96웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC와 이중특이성 또는 2가 조합을 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 8분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 후, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(비디 바이오사이언시스)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500g에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 이 세포 펠렛을 유동 완충제에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 이어서, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다.
그 다음, 형광 표지된 항-CD20 항체(비디 바이오사이언시스), 및 단백질 상의 위치 759에서 변형된 티로신 잔기를 인식하는 형광 표지된 항-인 PLCγ2 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 PLCg2의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 PLCγ2 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다. CD45와 CD79b의 조합의 상대적 효과는 표 12에 표시되어 있다(↓= 억제, ↑= 자극 및 ↔ = 전체 효과 없음).
Figure pct00077
이 데이터는 막대 도표로서 표현될 수도 있고(도 36), 데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰구간이다. 데이터는 CD45와 CD79b의 이중특이성 조합이 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인-PLCγ2 발현을 억제하는 반면, 이중특이성 복합체를 형성할 수 없는 혼합물인 CD79b-Y와 CD79b-Y의 조합은 그러하지 않다는 것을 보여준다.
실시예 14 - 이중특이성 CD45 및 CD79b 복합체는 B 세포 상에서의 CD86의 발현을 강력히 억제할 수 있다 .
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 DMEM(라이프 테크놀로지스)으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 CD45 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(500 nM) 양의 Fab-X(Fab-scFv) 및 Fab-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이성 조합을 생성하였다. 이들 조합들을 2.5분의 1 희석으로 단계적으로 8회 희석하여 이 조합에 대한 용량 적정을 생성하였다. Fab'-X와 Fab'-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 인큐베이션한 후, 2.5x105개의 PBMC를 V-바닥 96웰 플레이트에 첨가하였다. 그 다음, PBMC를 Fab'-X와 Fab'-Y의 조합에 첨가하고 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 24시간 동안 B 세포를 활성화시켰다. 세포 표면 활성화 마커의 검출을 가능하게 하기 위해, 플레이트를 얼음 위에 놓고 빙냉 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)로 1회 세척하였다. 그 다음, 세포를 형광 표지된 항-CD19 항체(비디 바이오사이언스) 및 형광 표지된 항-CD86 항체로 염색하고 암실에서 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD19 및 CD86의 세포 발현을 측정하였다. 데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 CD86 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다. 도 37에서 알 수 있는 바와 같이, CD45-X/CD79b-Y의 조합의 적정은 24시간 후 B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD86 발현을 억제할 수 있었다. 그래프패드 프리즘 6을 이용한 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트를 이용함으로써 추정된 IC50은 4.7 nM이었다(데이터는 평균 값을 나타내고 오차 막대는 표준 편차이다).
실시예 15 - CD45 및 CD79b 이중특이성 단백질의 억제 효과는 상이한 항체 V 영역들에 의해 재현될 수 있다 .
면역화 : 항원 CD79a, CD79b 및 CD45를 코딩하는 DNA를 유전자 합성 또는 상업적 공급원으로부터 수득하고 강력한 항시적 프로모터를 갖는 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 그 다음, 사내 전기천공 시스템을 이용하여 플라스미드 DNA를 Rab-9 토끼 섬유모세포(ATCC® CRL-1414™) 내로 형질감염시켰다. CD79 면역화를 위해, CD79a 및 CD79b 둘 다를 동시-형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 유세포분석으로 항원 발현에 대해 확인하고 사용될 때까지 액체 질소에서 분취물로서 동결하였다. 동일한 세포 상에서의 동시-발현, 또는 단일 또는 다중 형질감염된 세포들의 혼합물의 제조를 통해 토끼 1마리당 최대 6개의 항원들을 면역화시켰다. 토끼를 3회 용량의 세포로 면역화시켰다.
항체 발견 : 문헌(Zubler et al. (1985))에 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여 B 세포 배양물을 제조하였다. 요약하면, 10% FCS(피에이에이 래보러토리스 리미티드), 2% HEPES(시그마 알드리치), 1% L-글루타민(깁코 비알엘), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(깁코 비알엘), 0.1% β-머캡토에탄올(깁코 비알엘), 3% 활성화된 비장세포 배양 상청액 및 감마-조사된 돌연변이체 EL4 뮤린 흉선종 세포(5x104/웰)로 보충된 200 ㎕/웰 RPMI 1640 배지(깁코 비알엘)를 사용하여, 면역화된 토끼로부터의 비장 또는 PBMC 유래의 B 세포를 5% CO2의 대기 하에 37℃에서 7일 동안 바코딩된 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 대략 2000개 내지 5000개 세포의 밀도로 배양하였다.
CD79a 및 CD79b 또는 CD45로 동시-형질감염된 HEK293 세포를 사용한 균질한 형광 기반의 결합 어세이를 이용하여 B 세포 배양물 상청액에서 항원 특이성 항체의 존재를 확인하였다. 스크리닝은 매트릭스 플레이트메이트 액체 핸들러를 이용하여 10 ㎕의 상청액을 바코딩된 96웰 조직 배양 플레이트로부터, 표적 항원으로 형질감염된 HEK293 세포를 함유하는 바코딩된 384웰 흑색-벽 어세이 플레이트(대략 3000개의 세포/웰) 내로 옮기는 단계를 포함하였다. 염소 항-토끼 IgG Fcγ 특이성 Cy-5 접합체(잭슨)로 결합을 확인하였다. 플레이트를 어플라이드 바이오시스템스 8200 세포 검출 시스템 상에서 판독하였다.
일차 스크리닝 후, 아비소 온닉스 히트-픽킹 로봇을 이용하여 양성 상청액들을 96웰 바코딩된 마스터 플레이트 상에서 통합하였고 세포 배양 플레이트 내의 B 세포를 -80℃에서 동결하였다. 그 다음, CD79a 및 CD79b 또는 CD45 항원으로 형질감염된 HEK293 세포, 또는 항원의 공급원으로서의 재조합 CD45 단백질로 코팅된 수퍼아비딘™ 비드(뱅스 래보러토리스)에 대한 균질한 형광 기반의 결합 어세이에서 마스터 플레이트를 스크리닝하였다. 각각의 웰에 대한 항원 특이성을 확인하기 위해 이것을 수행하였다.
관심있는 웰의 선택으로부터 항체 가변 영역 유전자의 회수를 가능하게 하기 위해, 불균질한 B 세포 집단을 함유하는 소정의 웰에서 항원 특이성 B 세포를 확인할 수 있도록 데콘볼루션 단계를 수행하였다. 형광 초점 방법(Clargo et al., 2014. Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159; 유럽 특허 제1570267B1호)을 이용하여 이것을 달성하였다. 요약하면, 양성 웰로부터의 면역글로불린 분비 B 세포를 표적 항원으로 형질감염된 HEK293 세포, 또는 바이오티닐화된 표적 항원 및 염소 항-토끼 Fcγ 단편 특이성 FITC 접합체(잭슨)의 1:1200 최종 희석물로 코팅된 스트렙타비딘 비드(뉴 잉글랜드 바이오랩스)와 혼합하였다. 1시간 동안 37℃에서 정적 인큐베이션을 수행한 후, 항원 특이성 B 세포는 그 B 세포를 둘러싸는 형광 할로의 존재로 인해 확인될 수 있었다. 그 다음, 올림푸스 현미경을 이용함으로써 확인된 다수의 이들 개별 B 세포 클론들을 에펜도르프 미세조작기로 채취하여 PCR 튜브 내에 침착시켰다. 형광 초점 방법을 다시 이용하여 면역화된 토끼의 골수로부터 직접적으로 유래된 불균질한 B 세포 집단으로부터 항원 특이성 B 세포를 확인하였다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이성 프라이머를 사용한 역전사(RT)-PCR로 단일 세포로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하였다. 3' 말단 및 5' 말단에서 제한 부위를 도입함으로써, 가변 영역이 마우스 Fab-X 및 Fab-Y(VH) 또는 마우스 카파(VL) 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있게 하는 네스티드 이차 PCR로 2 라운드의 PCR을 수행하였다. Fab-X 및 Fab-Y 발현 벡터를 위한 중쇄 및 경쇄 구축물을, 펙틴 293(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 HEK-293 세포 내로 동시-형질감염시켰거나, 엑스피펙타민(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 Expi293 세포 내로 동시-형질감염시켰고, 재조합 항체를 5 ㎖의 부피로 6웰 조직 배양 플레이트에서 발현시켰다. 5일 내지 7일 발현 후, 상청액을 수거하였다. 항원으로 형질감염된 HEK293 세포 및 재조합 단백질 또는 항원 형질감염된 HEK 세포로 코팅된 수퍼아비딘™ 비드(뱅스 래보러토리스)에 대한 균질한 형광 기반의 결합 어세이에서 상청액을 시험하였다. 클로닝된 항체의 특이성을 확인하기 위해 이것을 수행하였다.
소규모 Fab A-X 및 Fab B-Y의 제조 (소규모(50 ㎖) Expi293 형질감염)
Expi293 세포를 0.5x106개 생존 세포/㎖의 최종 농도까지 Expi293™ 발현 배지에서 상용적으로 하위배양하고 120 rpm, 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 인큐베이터(멀티트론, Infors HT)에서 인큐베이션하였다.
형질감염 당일, 자동화된 세포 카운터(Vi-CELL, 벡크만 코울터)를 이용하여 세포 생존력 및 농도를 측정하였다. 2.5x106개 생존 세포/㎖의 최종 세포 농도를 달성하기 위해, 적절한 부피의 세포 현탁액을 멸균 250 ㎖ 삼각 진탕 플라스크에 첨가하고 각각의 50 ㎖ 형질감염을 위해 새로운 미리 가온된 Expi293™ 발현 배지를 첨가함으로써 42.5 ㎖의 부피에 도달되게 하였다.
각각의 형질감염을 위한 지질-DNA 복합체를 제조하기 위해, 총 50 ㎍의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA를 Opti-MEM®　I 배지(라이프 테크놀로지스)로 2.5 ㎖의 총 부피까지 희석하였고 135 ㎕의 엑스피펙타민™ 293 시약(라이프 테크놀로지스)을 Opti-MEM®　I 배지로 2.5 ㎖의 총 부피까지 희석하였다. 모든 희석물들을 약하게 혼합하고 실온에서 5분 이하의 시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 DNA 용액을 각각의 희석된 엑스피펙타민™ 293 시약에 첨가하여 5 ㎖의 총 부피를 수득하였다. DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 혼합물을 약하게 혼합하고 실온에서 20분 내지 30분 동안 인큐베이션하여 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체가 형성되게 하였다.
DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체 인큐베이션이 완료된 후, 5 ㎖의 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 120 rpm, 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 인큐베이터(멀티트론, Infors HT)에서 인큐베이션하였다.
형질감염시킨 지 대략 16시간 내지 18시간 후, 250 ㎕의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 1(라이프 테크놀로지스) 및 2.5 ㎖의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 2(라이프 테크놀로지스)를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다.
형질감염시킨 지 7일 후, 세포 배양물을 수거하였다. 세포를 50 ㎖ 스핀 튜브(팔콘) 내로 옮기고 4000 rpm에서 30분 동안 회전시킨 후, 0.22 ㎛ 스테리컵(머크 밀리포어)을 통해 멸균 여과하였다. 정화되고 멸균 여과된 상청액을 4℃에서 저장하였다. 최종 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
소규모(50 ㎖) 정제 : 소규모 진공 기반의 정제 시스템을 이용하여 친화성 포획으로 Fab-X 및 Fab-Y 둘 다를 별도로 정제하였다. 요약하면, 50 ㎖의 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과한 후, 500 ㎕의 Ni 세파로스 비드(지이 헬쓰케어)를 첨가하였다. 그 다음, 상청액 비드 혼합물을 약 1시간 동안 텀블링시킨 후, 진공을 적용함으로써 상청액을 제거하였다. 그 다음, 비드를 세척제 1(50 mM 인산나트륨 1 M NaCl pH 6.2) 및 세척제 2(0.5 M NaCl)로 세척하였다. 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.0) + 1 M NaCl을 사용하여 용출을 수행하였다. 용출된 분획을 PBS(시그마, pH 7.4)로 완충제 교환하고 0.22 ㎛ 여과하였다. 최종 풀을 A280 스캔, SE-UPLC(BEH200 방법) 및 SDS-PAGE(환원 및 비환원)로 분석하였고 PTS 엔도세이프 시스템을 이용하여 내독소에 대해 분석하였다.
혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 어세이를 수행하기 전, 세포를 해동시키고 RPMI 1640(라이프 테크놀로지스)으로 세척하고 37℃/5% CO2 환경에 적응시켰다. 이 기간 동안, 10% 태아 소 혈청, 50 유닛/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640으로 세포 표면 단백질 CD45 및 CD79b에 대한 항원 특이성을 갖는 등몰(200 nM) 양의 Fab'-X(Fab-scFv) 및 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이성 항체, 2가 항체 또는 항체 혼합물의 조합을 생성하였다. 3개의 상이한 CD79b Fab-Y들과 2개의 상이한 CD45 Fab-X들의 이들 조합들은 표 13에 표시되어 있다.
Figure pct00078
FabA-X와 FabB-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 인큐베이션한 후, V-바닥 96웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC와 FabA-X 및/또는 FabB-Y의 조합을 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 12.5 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃에서 10분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 다음, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(비디 바이오사이언시스)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500xg에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 이 세포 펠렛을 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.1% NaN3 + 2 mM EDTA)에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 그 다음, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다.
그 다음, 형광 표지된 항-CD20 항체(비디 바이오사이언시스), 및 위치 759에서 변형된 티로신 잔기를 인식하는 항-인 PLCγ2 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 40 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 PLCγ2의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(인텔리사이트)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 PLCγ2 수준의 기하평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 퍼센트 억제율로서 표현하였다.
도 38에서 알 수 있는 바와 같이, 데이터는 상이한 항체 V 영역을 사용하는, CD45와 CD79b의 조합이 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인-PLCγ2 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 16 - 실시예 7에 이미 기재된 큰 패널의 격자 스크리닝
결과
B 세포 기능을 억제하는 항원들의 신규 조합을 찾는 본 실시예에서, 각각의 Fab-Kd-Fab[즉, A-X:Y-B, 이때 A 및 B는 Fab 단편임] 조합에 의한 BCR 신호전달 캐스케이드 단백질의 인산화 유도의 퍼센트 억제율을 계산하였고, 양성 조합에 대한 기준을 V 영역들의 적어도 하나의 조합에 의한 적어도 2개의 인-판독대상들의 적어도 30% 억제로서 설정하였다. 이 역치에 따르면, 조사된 315개 중 11개의 신규 항원 쌍 조합들이 요구된 기준을 충족시켰다. 이것은 원하는 활성의 조합을 찾기 위한 다수의 조합들의 스크리닝의 중요성, 및 CD79b와 CD45의 조합의 활성이 얼마나 드문 지를 입증하는 3.5% 히트율을 나타낸다.
도 10 내지 12는 항원 격자 교차특이성에 대한 데이터를 보여준다. 값들은 각각 Syk, PLCγ2 및 AKT의 인산화의 퍼센트 억제율(활성화에 대한 음성 값)이고 평가된 다수의 V 영역 조합들의 평균을 나타낸다. 315개의 상이한 항원 조합들을 시험하였고 관찰될 수 있는 바와 같이 항체의 상이한 조합들에 의한 BCR 신호전달에 대한 효과는 강한 억제, 예를 들면, Fab-Y 상의 항원 4(CD45)와 조합된 Fab-X 상의 항원 2(CD79b)(인 Syk의 70.4% 억제, 도 10)부터 활성화, 예를 들면, X 상의 항원 6 및 Y 상의 항원 11(마이너스 118.10% 인 Syk, 도 10)까지 상당히 다양하였다.
도 10 내지 12에 나타낸 평균 % 값을 나타내는 각각의 데이터 점은 도 39에서 Fab-X 상의 항원 2(CD79b)와 Fab-Y 상의 항원 4(CD45)의 조합에 대해 표시되어 있다. 이 경우, 상이한 항체 V 영역들의 10개 상이한 조합들을 평가하였다. 대안적인 배향의 동일한 항원 조합, 즉 Fab-Y 상의 항원 2(CD79b)와 Fab-X 상의 항원 4(CD45)는 도 40에 표시되어 있다. 이 경우, 상이한 항체 V 영역들의 6개 상이한 조합들을 평가하였다. 다시, 모든 V 영역들은 억제를 보이지만, 상기 방법을 이용하여 최적 V 영역 조합을 확인하고 선택할 수 있다.
실시예 17 - 최적 항-CD45 항체 V 영역을 선택하기 위한, 이종이량체적으로 테더링된 단백질 복합체에서 정제된 항-CD79b Fab-Y를 사용한, Fab-X로서의 항원 CD45에 대한 일시적으로 발현된 V 영역의 스크리닝
도입 : 이종이량체적으로 테더링된 단백질 복합체의 격자 스크리닝을 이용하여 CD79b 특이성 V 영역과 함께 이중특이성 항체로서 B 세포 신호전달을 억제하는, CD45에 대한 신규 V 영역을 확인하였다. CD45 V 영역을 Fab-X로서 일시적으로 발현시키고 정제된 항-CD79b Fab-Y와 조합하였다. B 세포 신호전달의 활성화의 억제를 측정하여 가장 강력한 항-CD45 및 항-CD79b V 영역을 선택하였다.
항원 발현 세포의 제조 및 토끼의 면역화를 실시예 6에 기재된 방식과 동일한 방식으로 수행하였다.
항체 발견 : B 세포 배양물을 실시예 6에 기재된 방식과 동일한 방식으로 제조하였다.
B 세포 배양 상청액에서의 항원 특이성 항체의 스크리닝 및 항원 특이성 B 세포의 확인을 위한 데콘볼루션 단계를 실시예 6과 동일한 방식으로 결정하였다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이성 프라이머를 사용한 역전사(RT)-PCR로 단일 세포로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하였다. 3' 말단 및 5' 말단에서 제한 부위를 도입하여, 가변 영역이 마우스 Fab-X 및 마우스 카파(VL) 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있게 하는 네스티드 2o PCR로 2 라운드의 PCR을 수행하였다. 그 다음, 이들 벡터들을, 293펙틴(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 HEK-293 세포 내로 동시-형질감염시켰거나, 엑스피펙타민(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 Expi293 세포 내로 동시-형질감염시켰고 6일 동안 발현시켰다. 항원으로 형질감염된 HEK293 세포, 및 재조합 단백질 또는 항원 형질감염된 HEK 세포로 코팅된 수퍼아비딘™ 비드(뱅스 레보러토리스)에 대한 균질한 형광 기반의 결합 어세이에서 상청액을 시험하였다. 클로닝된 항체의 특이성을 확인하기 위해 이것을 수행하였다.
Fab-X 일시적 상청액 이외에, 관련 없는 대조군 DNA를 사용하여 동일한 방식으로 음성 대조군 모의체(Mock) 상청액을 제조하였다.
Fab-X의 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
정제된 Fab-X 및 Fab-Y의 제조 : 실시예 6에 기재된 방법과 동일한 방법을 이용하여 정제된 Fab-X 및 Fab-Y를 제조하였다.
인유동 어세이 : 정제된, 또는 일시적 상청액 중의 CD79b 특이성 Fab-Y 및 CD45 특이성 Fab-X를 200 nM 및 90 nM의 등몰 농도로 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 인큐베이션하였다. 모의체 상청액도 순수한 상태로 포함시켰다. V-바닥 96웰 플레이트에서, 5.0x104개의 PBMC를 웰에 첨가하였고, 이것에 적정된 Fab-X와 Fab-Y의 조합 또는 모의체 상청액을 첨가하였다. 그 다음, 상기 조합과 세포를 추가 90분 동안 함께 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 25 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(서던 바이오테크놀로지)을 첨가함으로써 37℃ 및 5% CO2에서 15분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 후, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(비디 바이오사이언시스)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500xg에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 버렸고 이 세포 펠렛을 FACS 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3 + 2 mM EDTA)에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 이어서, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(비디 바이오사이언시스)에 재현탁한 후, 유동 완충제로 2회 세척하였다. 그 다음, 3개의 상이한 항체 칵테일들 대신에 1개의 칵테일만이 실시예 6에서 항체 칵테일 A에 대해 기재된 어세이 농도 및 인큐베이션 조건과 동일한 어세이 농도 및 인큐베이션 조건으로 사용되었다는 점을 제외하고, 실시예 6에 기재된 바와 같이 세포를 염색하였다.
항체 칵테일 = 1:3 CD20 PerCp-Cy5.5 + 1:5 PLCγ2 AF88 + 1:10 Akt AF647 + 1:5 p38 MAPK PE(FACS 완충제로 희석됨).
결과
도 41 내지 46에서 알 수 있는 바와 같이, 데이터는 Fab-X의 상이한 일시적으로 발현된 항원 CD45 V 영역들과 Fab-Y의 2개의 상이한 정제된 항원 CD79b V 영역들(VR447 및 VR4450)의 조합이 B 세포 활성화(PLCγ2, p38 및 Akt의 억제에 의해 측정됨)를 상이한 수준까지 억제할 수 있으므로, 이중특이성 포맷에서의 스크리닝이 최적 V 영역 조합의 선택을 용이하게 한다는 것을 보여준다. 일시적 Fab-X를 갖는 조합은 정제된 CD45 Fab-X(VR4122)를 갖는 기준 조합과 비교된다.
실시예 18 - 항-알부민이 더 추가되었거나 추가되지 않은, 분자적으로 연결된 이중특이성 BYbe의 사용 시 기억 B 세포 기능에 대한 항원 CD79b 및 항원 CD45의 동시-표적화의 효과
도입 : CD79b/CD45의 표적화가 장기간 배양에서 B 세포에 대한 기능적 효과를 갖는지를 확인하기 위해, 혼합된 PBMC 배양물에서 B 세포로부터의 IgG 생성을 측정하였다. 리콜 항원 파상풍 변성독소에 대한 특이성 항체의 측정은 기억 B 세포 기능의 판독결과를 제공한다.
항원 CD79b 특이성(VR4447) 및 항원 CD45 특이성(VR4248 및 VR4133)을, 항-알부민 단편(VR0645)이 추가되었거나 추가되지 않은 BYbe 포맷으로 생성하였다. 항-알부민 항체 단편을 실시예 8에 기재된 바와 같이 BYbe 포맷의 항원 CD45 Fab의 경쇄에 융합시켰다.
이 실험에서 사용된 구축물의 설명
Figure pct00079
방법
항-알부민 추가 특이성을 갖거나/갖지 않는 BYbe의 정제
BYbe(Fab-dsscFv[Fab 중쇄의 C 말단 상에 부착된 scFv]) 및 항-알부민을 갖는 BYbe(Fab-2xdsscFv[Fab 중쇄 및 경쇄의 C 말단 상에 부착된 scFv들]) 포맷을 다음과 같이 정제하였다. 표준 expiHEK 또는 CHO 발현으로부터의 정화된 세포 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였다. 여과된 상청액을, PBS(pH 7.4)(시그마 알드리치 케미칼스)로 평형화된 50 ㎖ 감마바인드플러스 세파로스 XK26 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 2 ㎖/분의 속도로 적재하였다. 적재 후, 컬럼을 PBS(pH 7.4)로 세척한 후 0.1 M 글리신/HCl(pH 2.7)로 용출하였다. 용출 후, 280 nm에서 흡광도를 측정하였고, 용출 피크를 수집한 후 25분의 1 부피의 2 M 트리스/HCl(pH 8.5)로 중화시켰다. 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷오프 막을 갖는 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 4000xg에서 원심분리함으로써 상기 중화된 샘플을 농축하였다. 농축된 샘플을 PBS(pH 7.4)로 평형화된 XK16/60 또는 XK26/60 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 상기 컬럼을 각각 1 ㎖/분 또는 2.6 ㎖/분의 속도로 PBS(pH 7.4)의 등용매 구배로 현상하였다. 분획을 수집하였고, 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도에서 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8X300 mm) 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 선택된 단량체 분획을 풀링하였고, 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷오프 막을 갖는 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 4000xg에서 원심분리하여 1 mg/㎖ 초과의 농도까지 농축하였다. 최종 샘플을 농도에 대해서는 A280 스캐닝 UV-가시광선 분광계(Cary 50Bio)로 분석하였고; % 단량체에 대해서는 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도에서 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였고; 53분 동안 (겔당) 50 mA에서 4-20% 트리스-글리신 1.5 mm 겔(노벡스) 상에서의 환원 및 비환원 SDS-PAGE 실행으로 분석하였고; 내독소에 대해서는 리뮬러스 아베보사이트 용해물(LAL) 검사 카트리지를 갖춘 찰스 리버의 엔도세이프®　휴대용 검사 시스템으로 분석하였다.
B 세포의 활성화 및 파상풍 변성독소 특이성 IgG의 측정
10% 태아소 혈청 및 2 mM 글루타맥스를 함유하는 1640 배지(R10 배지)에서 인간 PBMC들을 6일 동안 500 ng/㎖ CD40L, 1 ㎍/㎖ CpG 및 50 ng/㎖ IL-21로 자극하였다. 정제된 단백질의 구축물을 0일째 날에 100 nM의 최종 농도로 첨가하고 어세이의 지속시간 동안 배양 배지에서 유지하였다. 6일 후, 상청액을 수거하고 파상풍 변성독소 특이성 IgG의 양을 ELISA로 검출하였다. 요약하면, 맥시소르프 절반-웰 ELISA 플레이트(넌크)를 4℃에서 하룻밤 동안 PBS 중의 10 ㎍/㎖ 파상풍 변성독소로 코팅하였다. 그 다음, 상기 플레이트를, 2시간 동안 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS 중의 5% 밀크로 차단하였다. 상청액을 희석한 후, 실온에서 2시간 동안 첨가하였다. 상기 플레이트를 PBS-0.05% 트윈 20으로 세척하였고, 5% 밀크-PBS 0.05% 트윈 20으로 1 ㎍/㎖까지 희석된 퍼록시다제-염소 항-인간 IgG(H+L)를 사용하여 파상풍 결합된 항체를 검출하였다. TMB 기질 용액(KPL)을 사용하여 플레이트를 현상하였고, 시너지 2 마이크로플레이트 판독기(바이오텍)를 이용하여 450 nM에서 흡광도를 측정하였다. 데이터를 엑셀 내로 불러왔고 시험 항체 없이 배양된 세포와 비교하여 퍼센트 억제율을 계산하였다. 그 후, 데이터를 그래프패드 프리즘®　내로 불러오고 막대 도표로서 작도하였다.
도 47은 VR4447/VR4248 BYbe, VR4447/VR4133 BYbe, VR4447/VR4248/VR645 BYbe/알부민 및 VR4447/VR4133/VR645 BYbe/알부민과 함께 배양된 PBMC들로부터의 파상풍 변성독소 IgG 생성의 억제를 보여준다. 표시된 데이터는 단일 도너로부터 유래된다.
실시예 19 인간화 방법
CDR을 토끼 항체 V 영역으로부터 인간 생식세포주 항체 V 영역 프레임워크 상으로 이식함으로써, 이전 실시예에서 수득되었고 본원의 도 51에서 제공된 항체의 인간화된 버전을 디자인하였다. 항체의 활성의 회복 가능성을 개선하기 위해, 토끼 V 영역으로부터의 다수의 프레임워크 잔기들도 디자인된 인간화된 서열 내에 보유되었다. 문헌(Adair et al. (1991)(Humanised antibodies. WO91/09967))에 의해 요약된 프로토콜을 이용하여 이들 잔기들을 선택하였다. 조합된 초티아/카바트 정의가 사용된 CDRH1을 제외하고, 도너 서열로부터 어셉터 서열로 이식된 CDR들은 카바트(Kabat et al., 1987)에 의해 정의된 바와 같다(문헌(Adair et al., 1991 Humanised antibodies. WO91/09967) 참조). 통상적으로, 토끼 항체의 VH 유전자는 선택된 인간 VH 어셉터 유전자보다 더 짧다. 인간 어셉터 서열과 정렬될 때, 토끼 항체의 VH 영역의 프레임워크 1은 전형적으로 인간화된 항체 내에 보유되는 N 말단 잔기를 결여한다. 토끼 항체 VH 영역의 프레임워크 3도 전형적으로 베타 시트 가닥 D와 E 사이의 루프에서 1개 또는 2개의 잔기(75, 또는 75 및 76)를 결여한다: 인간화된 항체에서 갭은 선택된 인간 어셉터 서열로부터의 상응하는 잔기로 채워진다.
인간화된 서열은 도 51에서 제공되고 도너 잔기는 굵은 글자체 및 밑줄로 표시되어 있다. 변이체 CDR 서열도 제공된다.
항체 4450에 대한 일부 이식물도 발현하고 시험하였다(실시예 21 참조).
CD79 Ab 4447
인간 V 영역 IGKV1D-13 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4447 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4447 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 2, 3, 36, 46, 49 및 70(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 글루타민(Q2), 발린(V3), 류신(L36), 글루타민(Q46), 히스티딘(H49) 및 글루타민(Q70).
일부 경우, CDRL3은 한 쌍의 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있거나(CDRL3 변이체 1) CDRL3은 1개의 시스테인 잔기만을 제거하도록 돌연변이될 수 있다(CDRL3 변이체 2 및 3).
인간 V 영역 IGHV3-48 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4447의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4447 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 48, 49, 71, 73 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 발린(V24), 이소류신(I48), 글리신(G49), 라이신(K71), 세린(S73) 및 발린(V78).
인간 V 영역 IGHV4-59 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4447의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4447 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 37, 67, 71, 73 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 발린(V37), 페닐알라닌(F67), 라이신(K71), 세린(S73) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다: 항체 및 항체 단편의 N 말단에서 피로글루타메이트로의 글루타민의 전환은 널리 보고되어 있다.
CD79 Ab 4450
인간 V 영역 IGKV1-6 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4450 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4450 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 3 및 70(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 아스파르트산(D3) 및 글루타민(Q70). 일부 경우, CDRL3은 잠재적 아스파르테이트 이성질체화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRL3 변이체 1-3).
인간 V 영역 IGHV3-66 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4450의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4450 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 48, 49, 73 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 발린(V24), 이소류신(I48), 글리신(G49), 세린(S73) 및 발린(V78).
인간 V 영역 IGHV4-59 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4450의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4450 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 37, 67, 71, 73 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 발린(V37), 페닐알라닌(F67), 아르기닌(R71), 세린(S73) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다.
CD22 Ab 4120
인간 V 영역 IGKV1D-13 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4120 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4120 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 2 및 3(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 페닐알라닌(F2) 및 글루탐산(E3).
인간 V 영역 IGHV3-33 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4120의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4120 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 11, 48, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 류신(L11), 이소류신(I48), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다.
일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체).
인간 V 영역 IGHV4-38-2 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4120의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4120 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 37, 49, 67, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A24), 발린(V37), 알라닌(A49), 페닐알라닌(F67), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다.
일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체).
CD22 Ab 4126
인간 V 영역 IGKV1-5 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4126 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4126 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 3 및 70(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 발린(V3) 및 글루타민(Q70).
인간 V 영역 IGHV3-7 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4126의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4126 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78).
일부 경우, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체, CDRH2 변이체 및 CDRH3 변이체).
인간 V 영역 IGHV4-4 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4126의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4126 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 48, 49, 67, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A24), 발린(V48), 알라닌(A49), 페닐알라닌(F67), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다.
일부 경우, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체, CDRH2 변이체 및 CDRH3 변이체).
CD22 Ab 4127
인간 V 영역 IGKV1-5 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4127 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4127 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 1, 3 및 70(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A1), 발린(V3) 및 글루타민(Q70). 일부 경우, CDRL3은 잠재적 아스파르트산 이성질체화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRL3 변이체 1-15).
인간 V 영역 IGHV3-9 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4127의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4127 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 47, 48, 49, 71, 73, 76, 78 및 94(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 류신(L47), 이소류신(I48), 글리신(G49), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76), 발린(V78) 및 아르기닌(R94).
일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체).
인간 V 영역 IGHV4-38-2 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4127의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4127 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 37, 47, 67, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A24), 발린(V37), 류신(L47), 페닐알라닌(F67), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다. 일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체).
CD22 Ab 4128
인간 V 영역 IGKV1-5 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4128 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4128 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 3, 36, 63, 65, 66 및 71(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 발린(V3), 페닐알라닌(F36), 라이신(K63), 아스파르트산(D65), 아르기닌(R66) 및 티로신(Y71).
인간 V 영역 IGHV3-33 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4128의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4128 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 11, 23, 24, 48, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 류신(L11), 라이신(K23), 글리신(G24), 이소류신(I48), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다. 일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체).
인간 V 영역 IGHV4-59 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4128의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4128 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 23, 24, 37, 49, 67, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 라이신(K23), 글리신(G24), 발린(V37), 알라닌(A49), 페닐알라닌(F67), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다. 일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체).
CD22 Ab 4130
인간 V 영역 IGKV1-9 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4130 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4130 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 1, 2 및 3(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A1), 알라닌(A2) 및 발린(V3).
인간 V 영역 IGHV3-66 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4130의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4130 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 48, 49, 67, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 이소류신(I48), 글리신(G49), 발린(V67), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 일부 경우, CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하고/하거나 잠재적 아스파라긴 탈아미드화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH2 변이체 1-5). CDRH3도 잠재적 아스파라긴 탈아미드화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH3 변이체 1-2).
인간 V 영역 IGHV4-4 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4130의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4130 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A24), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다. 일부 경우, CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하고/하거나 잠재적 아스파라긴 탈아미드화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH2 변이체 1-5). CDRH3도 잠재적 아스파라긴 탈아미드화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH3 변이체 1-2).
CD22 Ab 4132
인간 V 영역 IGKV1-5 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4132 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4132 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 3 및 71(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 발린(V3) 및 티로신(Y71).
인간 V 영역 IGHV3-21 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4132의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4132 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 48, 49, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 세린(S48), 글리신(G49), 아스파라긴(N71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78).
일부 경우, CDRH1은 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(CDRH1 변이체). CDRH2도 시스테인 잔기를 제거하고/하거나 잠재적 아스파라긴 탈아미드화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH2 변이체 1-5).
인간 V 영역 IGHV4-4 및 JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4132의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4132 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 48, 67, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A24), 세린(S48), 페닐알라닌(F67), 아스파라긴(N71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다. 일부 경우, CDRH1은 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(CDRH1 변이체). CDRH2도 시스테인 잔기를 제거하고/하거나 잠재적 아스파라긴 탈아미드화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH2 변이체 1-5).
CD45 Ab 4122
인간 V 영역 IGKV1-5 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4122 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4122 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기(도너 잔기)는 위치 71(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 티로신(Y71). 일부 경우, CDRL3은 잠재적 아스파르트산 이성질체화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRL3 변이체 1-2).
인간 V 영역 IGHV3-7 및 JH2 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4122의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4122 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 48, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 이소류신(I48), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78).
일부 경우, CDRH1은 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(CDRH1 변이체). CDRH2도 시스테인 잔기를 제거하고/하거나 잠재적 아스파라긴 탈아미드화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH2 변이체 1-7).
인간 V 영역 IGHV2-70 및 JH2 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4122의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4122 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 37, 44, 48, 67, 73 및 76(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A24), 발린(V37), 글리신(G44), 이소류신(I48), 페닐알라닌(F67), 세린(S73) 및 트레오닌(T76). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다. 일부 경우, CDRH1은 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(CDRH1 변이체). CDRH2도 시스테인 잔기를 제거하고/하거나 잠재적 아스파라긴 탈아미드화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH2 변이체 1-7).
CD45 Ab 4129
인간 V 영역 IGKV1-5 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4129 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4129 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기(도너 잔기)는 위치 70(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 글루타민(Q70).
일부 경우, CDRL3은 잠재적 아스파르트산 이성질체화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRL3 변이체 1-2).
인간 V 영역 IGHV3-7 및 JH2 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4129의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4129 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 48, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 이소류신(I48), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78).
일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체).
인간 V 영역 IGHV2-70 및 JH2 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4129의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4129 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 37, 44, 48, 67, 73 및 76(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A24), 발린(V37), 글리신(G44), 이소류신(I48), 페닐알라닌(F67), 세린(S73) 및 트레오닌(T76). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다. 일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체).
CD45 Ab 4131
인간 V 영역 IGKV1-12 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4131 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4131 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 3 및 63(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 발린(V3) 및 라이신(K63).
일부 경우, CDRL3은 잠재적 아스파르트산 이성질체화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRL3 변이체 1-3).
인간 V 영역 IGHV3-7 및 JH2 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4131의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4131 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 48, 69, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 이소류신(I48), 발린(V69), 글루탐산(E71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 일부 경우, CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(CDRH2 변이체).
인간 V 영역 IGHV4-31 및 JH2 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4131의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4131 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 37, 49, 67, 69, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A24), 발린(V37), 알라닌(A49), 페닐알라닌(F67), 발린(V69), 글루탐산(E71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다.
일부 경우, CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(CDRH2 변이체).
CD45 Ab4133
인간 V 영역 IGKV1D-13 및 JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4133 경쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4133 VK 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 2, 3 및 70(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 글루타민(Q2), 발린(V3) 및 글루타민(Q70).
일부 경우, CDRL1은 잠재적 N-글리코실화 부위를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(CDRL1 변이체 1-2).
인간 V 영역 IGHV3-21 및 JH1 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4133의 중쇄 CDR들에 대한 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4133 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 48, 49, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 이소류신(I48), 글리신(G49), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78).
일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체). CDRH3도 잠재적 아스파르트산 이성질체화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH3 변이체 1-3).
인간 V 영역 IGHV4-4 및 JH1 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 항체 4133의 중쇄 CDR들에 대한 대안적인 어셉터로서 선택하였다. 상기 CDR들 이외에, 4133 VH 유전자로부터의 하기 프레임워크 잔기들(도너 잔기들) 중 하나 이상의 잔기는 위치 24, 71, 73, 76 및 78(카바트 넘버링)에서 보유될 수 있다: 각각 알라닌(A24), 라이신(K71), 세린(S73), 트레오닌(T76) 및 발린(V78). 인간 프레임워크의 위치 1에서 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하였다.
일부 경우, CDRH1 및 CDRH2는 시스테인 잔기를 제거하도록 돌연변이될 수 있다(각각 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체). CDRH3도 잠재적 아스파르트산 이성질체화 부위를 변형시키도록 돌연변이될 수 있다(CDRH3 변이체 1-3).
실시예 20 - 항-인간 CD79 V 영역과 사이노몰구스 원숭이 B 세포의 교차반응성의 시험
도입
항-인간 CD79 V 영역이 임상 전 연구를 위한 비인간 영장류 B 세포와 교차반응하는지를 시험하기 위해 사이노몰구스 원숭이 PBMC에 대한 결합 연구를 수행하였다. CD79 V 영역 VR4447 및 VR4450을 Fab-Y 정제된 분자로서 생성하였고, Fab-Y 구축물의 불변 영역에 결합하는 항-마우스 이차 항체를 사용하여 이들 V 영역과 B 세포의 특이성 결합을 검출하였다.
이 실험에서 사용된 구축물의 설명
Figure pct00080
방법
Fab-Y 분자의 생성
항-CD79b(VR4447) 및 (VR4450)에 대한 모 토끼 V 영역을 기재된(W02016/009030) 토끼 B 세포로부터 앞서 기재된 Fab-Y 구축물 벡터 내로 클로닝하였다.
Fab-Y의 일시적 발현 및 정제
Expi293 세포를 0.5x106개 생존 세포/㎖의 최농 농도로 Expi293™ 발현 배지에서 상용적으로 하위배양하고 120 rpm, 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 인큐베이터(멀티트론, Infors HT)에서 인큐베이션하였다.
형질감염 당일, 자동화된 세포 카운터(Vi-CELL, 벡크만 코울터)를 이용하여 세포 생존력 및 농도를 측정하였다. 2.94x106개 생존 세포/㎖의 최종 세포 농도를 달성하기 위해, 적절한 부피의 세포 현탁액을 멸균 1 ℓ 삼각 진탕 플라스크에 첨가하고 각각의 200 ㎖ 형질감염을 위해 새로운 미리 가온된 Expi293™ 발현 배지를 첨가함으로써 170 ㎖의 부피에 도달되게 하였다.
각각의 형질감염을 위한 지질-DNA 복합체를 제조하기 위해, 총 200 ㎍의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA(2:1 경쇄:중쇄 DNA 비)를 Opti-MEM® I 배지(라이프 테크놀로지스)로 10 ㎖의 총 부피까지 희석하였고 540 ㎕의 엑스피펙타민™ 293 시약(라이프 테크놀로지스)을 Opti-MEM® I 배지로 10 ㎖의 총 부피까지 희석하였다. 모든 희석물들을 약하게 혼합하고 실온에서 5분 이하의 시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 DNA 용액을 각각의 희석된 엑스피펙타민™ 293 시약에 첨가하여 20 ㎖의 총 부피를 수득하였다. DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 혼합물을 약하게 혼합하고 실온에서 20분 내지 30분 동안 인큐베이션하여 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체가 형성되게 하였다.
DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체 인큐베이션이 완료된 후, 20 ㎖의 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 120 rpm, 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 인큐베이터(멀티트론, Infors HT)에서 인큐베이션하였다.
형질감염시킨 지 대략 16시간 내지 18시간 후, 1 ㎖의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 1(라이프 테크놀로지스) 및 10 ㎖의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 2(라이프 테크놀로지스)를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다.
형질감염시킨 지 7일 후, 세포 배양물을 수거하였다. 세포를 50 ㎖ 스핀 튜브(팔콘) 내로 옮기고 4000 rpm에서 30분 동안 회전시킨 후, 0.22 ㎛ 스테리컵(머크 밀리포어)을 통해 멸균 여과하였다. 정화되고 멸균 여과된 상청액을 4℃에서 저장하였다. 최종 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
소규모 진공 기반의 정제 시스템을 이용하여 친화성 포획으로 Fab-Y를 정제하였다. 요약하면, 200 ㎖의 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과한 후, 약 2 ㎖의 Ni 세파로스 비드(지이 헬쓰케어)를 첨가하였다. 그 다음, 상청액 비드 혼합물을 약 1시간 동안 텀블링시킨 후, 진공을 적용함으로써 상청액을 제거하였다. 그 다음, 비드를 세척제 1(50 mM 인산나트륨 0.5 M NaCl pH 6.2) 및 세척제 2(0.5 M NaCl)로 세척하였다. 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.0) + 1 M NaCl을 사용하여 용출을 수행하였다. 용출된 분획을 PBS(시그마, pH 7.4)로 완충제 교환하고 0.22 ㎛ 여과하였다. 최종 풀을 A280 스캔, SE-UPLC(BEH200 방법) 및 SDS-PAGE(환원 및 비환원)로 분석하였고 PTS 엔도세이프 시스템을 이용하여 내독소에 대해 분석하였다.
항-인간 CD79 V 영역과 사이노몰구스 원숭이로부터의 B 세포의 결합
밀도 원심분리를 이용하여 전혈로부터 사이노몰구스 원숭이 PBMC를 정제하였다. 요약하면, 전혈을 RPMI 배지로 1:2 희석한 후, 림포라이트(Lympholyte)® 포유동물 분리 배지(세다레인(CedarLane)) 상에 적층하였다. 가속화 및 중단 없이 25분 동안 800g에서 샘플을 원심분리하였고, 계면에서 세포의 층을 수집하였다. 5분 동안 5 ㎖의 ACK 용해 완충제(깁코)를 사용하여 오염 적혈 세포를 용해시켰다.
단리된 PBMC를 96웰 환저 플레이트 내로 플레이팅한 후, 냉각된 결합 완충제(PBS + 0.5% BSA + 0.1% 아지드화나트륨)로 세척하였다. VR4447 및 VR4450 Fab-Y 분자를 냉각된 결합 완충제 중의 50 ㎍/㎖의 농도로 세포에 첨가하였다. 세포를 얼음 위에 30분 동안 놓아둔 후 세척하였고, Fab-Y 분자의 결합을 냉각된 결합 완충제에 의해 10 ㎍/㎖까지 희석된 FITC-접합된 염소 항-마우스 IgG F(ab')2(잭슨 이뮤노리서치)로 검출하였다. 샘플을 BD FACS 캔토(Canto) II 기계 상에서 획득하였고 FLOWJO 소프트웨어를 사용하여 결합을 측정하였다. CD20 항체를 사용하여 B 세포를 확인하였다. 결합을 B 세포(CD20+) 상에서 FITC 형광의 기하평균 또는 퍼센트 양성 세포 비율로서 분석하였다. 그 다음, 데이터를 그래프패드 프리즘® 내로 불러오고 막대 도표로서 작도하였다.
결과
도 48 및 도 49는 VR4447 및 VR4450 Fab-Y 분자와 CD20+ B 세포의 결합을 보여준다. 데이터는 FITC 형광의 기하평균 또는 퍼센트 양성 세포 비율로서 작도되어 있다. 제시된 데이터는 단일 동물로부터의 데이터이다.
항-CD79b V 영역 4450은 B 세포 상의 사이노몰구스 원숭이 CD79b와 교차반응하는 반면, V 영역 4447은 교차반응하지 않는다.
실시예 21 - 인간화된 항-CD79b V 영역 4450의 상이한 버전의 활성의 평가
도입
VR4450의 인간화된 V 영역들의 활성을 평가하기 위해, 이들을 Fab-Y 구축물 내로 클로닝하고 일시적으로 발현된 Fab-Y의 모 토끼 4450 V 영역과 함께 정제된 항-CD22 Fab-X(VR4130)로 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용하여, 인간 PBMC에서 B 세포의 BCR 신호전달의 억제를 측정함으로써 기능을 시험할 수 있게 하였다.
방법
항-CD79b(VR4450) 및 항-CD22(VR4130)에 대한 모 토끼 V 영역(도 51)을 기재된 바와 같이(W02016/009030) 토끼 B 세포로부터 각각 Fab-Y 구축물 벡터 및 Fab-X 구축물 벡터 내로 클로닝하였다. 인간화된 4450 V 영역을 유전자 합성으로 생성하고 Fab-Y 구축물 벡터 내로 클로닝하였다.
Fab-X 및 Fab-Y의 일시적 발현
Expi293 세포를 0.5x106개 생존 세포/㎖의 최농 농도로 Expi293™ 발현 배지에서 상용적으로 하위배양하고 120 rpm, 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 인큐베이터(멀티트론, Infors HT)에서 인큐베이션하였다.
형질감염 당일, 자동화된 세포 카운터(Vi-CELL, 벡크만 코울터)를 이용하여 세포 생존력 및 농도를 측정하였다. 2.94x106개 생존 세포/㎖의 최종 세포 농도를 달성하기 위해, 적절한 부피의 세포 현탁액을 멸균 1 ℓ 삼각 진탕 플라스크에 첨가하고 각각의 200 ㎖ 형질감염을 위해 새로운 미리 가온된 Expi293™ 발현 배지를 첨가함으로써 170 ㎖의 부피에 도달되게 하였다.
각각의 형질감염을 위한 지질-DNA 복합체를 제조하기 위해, 총 200 ㎍의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA(2:1 경쇄:중쇄 DNA 비)를 Opti-MEM® I 배지(라이프 테크놀로지스)로 10 ㎖의 총 부피까지 희석하였고 540 ㎕의 엑스피펙타민™ 293 시약(라이프 테크놀로지스)을 Opti-MEM® I 배지로 10 ㎖의 총 부피까지 희석하였다. 모든 희석물들을 약하게 혼합하고 실온에서 5분 이하의 시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 DNA 용액을 각각의 희석된 엑스피펙타민™ 293 시약에 첨가하여 20 ㎖의 총 부피를 수득하였다. DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 혼합물을 약하게 혼합하고 실온에서 20분 내지 30분 동안 인큐베이션하여 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체가 형성되게 하였다.
DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체 인큐베이션이 완료된 후, 20 ㎖의 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 120 rpm, 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 인큐베이터(멀티트론, Infors HT)에서 인큐베이션하였다.
형질감염시킨 지 대략 16시간 내지 18시간 후, 1 ㎖의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 1(라이프 테크놀로지스) 및 10 ㎖의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 2(라이프 테크놀로지스)를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다.
형질감염시킨 지 7일 후, 세포 배양물을 수거하였다. 세포를 50 ㎖ 스핀 튜브(팔콘) 내로 옮기고 4000 rpm에서 30분 동안 회전시킨 후, 0.22 ㎛ 스테리컵(머크 밀리포어)을 통해 멸균 여과하였다. 정화되고 멸균 여과된 상청액을 4℃에서 저장하였다. 최종 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
정제
소규모 진공 기반의 정제 시스템을 이용하여 친화성 포획으로 Fab-X를 정제하였다. 요약하면, 200 ㎖의 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과한 후, 약 2 ㎖의 Ni 세파로스 비드(지이 헬쓰케어)를 첨가하였다. 그 다음, 상청액 비드 혼합물을 약 1시간 동안 텀블링시킨 후, 진공을 적용함으로써 상청액을 제거하였다. 그 다음, 비드를 세척제 1(50 mM 인산나트륨 0.5 M NaCl pH 6.2) 및 세척제 2(0.5 M NaCl)로 세척하였다. 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.0) + 1 M NaCl을 사용하여 용출을 수행하였다. 용출된 분획을 PBS(시그마, pH 7.4)로 완충제 교환하고 0.22 ㎛ 여과하였다. 최종 풀을 A280 스캔, SE-UPLC(BEH200 방법) 및 SDS-PAGE(환원 및 비환원)로 분석하였고 PTS 엔도세이프 시스템을 이용하여 내독소에 대해 분석하였다.
스크리닝 어세이
37℃로 설정된 수조를 이용하여 도너 PBMC를 신속히 해동시킨 후, 어세이 배지(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 글루타맥스로 보충된 RPMI-1640 배지) 내로 적가 희석하여 삼투압 충격을 최소화하였다. 세포를 500g에서 회전시킨 후, 상청액을 제거하고 세포를 어세이 배지에 재현탁하였다. 그 다음, 세포를 카운팅하고 5.0x104개의 세포를 96웰 V-바닥 플레이트(넌크)의 각각의 웰에 첨가한 후, 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
Fab-X 시약과 Fab-Y 시약을 어세이 배지에서 5x 최종 어세이 농도로 등몰 비로 혼합하고 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 적절한 Fab-KD-Fab 혼합물을, 세포를 함유하는 시험 웰에 첨가하여(표 14) 100 nM의 출발 농도를 제공하였고, 그 다음 이중으로 연속 희석하고(1:5) 30초 동안 1000 rpm에서 진탕함으로써 혼합한 후, 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
그 후, 세포를 12.5 ㎍/㎖ 최종 농도의 항-인간 IgM(서던 바이오텍)으로 자극한 반면, 어세이 배지를 대조군 비자극된 세포에 첨가하였다. 그 후, 어세이 플레이트를 30초 동안 1000 rpm에서 약하게 혼합한 후, 8분 동안 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 빙냉 BD 사이토픽스를 모든 웰들에 첨가하여 어세이를 중단하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 고정된 세포를 5분 동안 500g에서 회전시켜 세포를 펠렛화하였고 바이오텍 ELx405 플레이트 세척제를 사용하여 상청액을 제거하였다. 플레이트를 30초 동안 2400 rpm에서 볼텍싱함으로써 펠렛을 재현탁하였다. 이어서, 빙냉 BD 세포 투과가능화 완충제 III을 첨가함으로써 30분 동안 4℃에서 세포를 투과가능하게 만들었다. 그 다음, 세포를 FACS 완충제(1% BSA, 0.05% NaN3 및 2 mM EDTA를 갖는 PBS)로 세척하고 5분 동안 500g에서 회전시켰다. 이를 사용하기 전에 FACS 완충제를 신속히 분배함으로써 임의의 잔류 투과가능화 완충제를 씻어내기 위해 상청액을 ELx405로 다시 제거하였다. 세포를 500g에서 다시 회전시켰고 ELx405로 상청액을 제거하였다. 그 후, 세포를 볼텍싱(2400 RPM, 30초)으로 재현탁한 후, 항체 칵테일(항-인간 CD20(H1FB1) 알렉사 플루오르 488(1:10 희석); 항-인간 Akt 알렉사 플루오르 647(1:10 희석))을 모든 웰들에 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 1000 rpm에서 30초 동안 진탕하였고 세포를 실온의 암실에서 45분 동안 인큐베이션하였다.
이어서, 세포를 500g에서 회전시키면서 FACS 완충제로 2회 세척하였고, 각각의 단계 후 상청액을 제거하였다. 마지막으로, 세포를 2400 rpm에서 30초 동안 볼텍싱함으로써 재현탁한 후, 20 ㎕의 FACS 완충제를 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 인텔리사이트 iQue 플러스 기계 상에서 판독하였다.
Figure pct00081
샘플
Figure pct00082
결과
도 50에서 알 수 있는 바와 같이, VR4450의 모든 4종의 인간화된 버전들은 모 토끼 VR4450 V 영역과 유사한 활성을 갖는다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB BIOPHARMA SPRL <120> ANTIBODY MOLECULES WHICH BIND CD79 <130> PF0062 <160> 343 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of formula (I) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is S or N <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is V or A <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is V or M <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is S or V <400> 1 Gly Phe Ser Leu Xaa Asn Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of formula (II) <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is V or I <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is S or E <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is T or G <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is N or G <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is T or A <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is T or Y <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is W or absent <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is N or S <400> 2 Ile Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Xaa Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDHR3 <400> 3 Glu Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Pro <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 4 Asp Ala Gly His Ser Asp Val Asp Val Leu Asp Ile 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> In one embodiment CDRL1 has a formula (III) <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is A or S <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is V or I <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is V or Y <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is G or N <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is L or D <400> 5 Gln Xaa Ser Gln Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Leu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 has a formula (IV) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is S or E <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is T or K <400> 6 Xaa Ala Ser Xaa Leu Ala Ser 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 has a formula (V) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is L or Q <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is G or E <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is G or F <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is C, S or G (particularly S or G) <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is S or G <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is D, S or E <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is H, G, A, S or C (particularly H, G, A or S) <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is I or D <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is C, S or absent <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is N or absent <400> 7 Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 8 Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr Val Met Val 1 5 10 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 9 Ile Ile Tyr Val Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 1304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD45 <400> 10 Met Tyr Leu Trp Leu Lys Leu Leu Ala Phe Gly Phe Ala Phe Leu Asp 1 5 10 15 Thr Glu Val Phe Val Thr Gly Gln Ser Pro Thr Pro Ser Pro Thr Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ala Lys Met Pro Ser Val Pro Leu Ser Ser Asp Pro Leu 35 40 45 Pro Thr His Thr Thr Ala Phe Ser Pro Ala Ser Thr Phe Glu Arg Glu 50 55 60 Asn Asp Phe Ser Glu Thr Thr Thr Ser Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser 65 70 75 80 Thr Gln Val Ser Pro Asp Ser Leu Asp Asn Ala Ser Ala Phe Asn Thr 85 90 95 Thr Gly Val Ser Ser Val Gln Thr Pro His Leu Pro Thr His Ala Asp 100 105 110 Ser Gln Thr Pro Ser Ala Gly Thr Asp Thr Gln Thr Phe Ser Gly Ser 115 120 125 Ala Ala Asn Ala Lys Leu Asn Pro Thr Pro Gly Ser Asn Ala Ile Ser 130 135 140 Asp Val Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ala Ser Thr Phe Pro Thr Asp Pro 145 150 155 160 Val Ser Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ala His His Ser Ser Ala 165 170 175 Ala Leu Pro Ala Arg Thr Ser Asn Thr Thr Ile Thr Ala Asn Thr Ser 180 185 190 Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Ser Glu Thr Thr Thr Leu Ser Pro Ser Gly 195 200 205 Ser Ala Val Ile Ser Thr Thr Thr Ile Ala Thr Thr Pro Ser Lys Pro 210 215 220 Thr Cys Asp Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn 225 230 235 240 Lys Glu Thr Lys Leu Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val 245 250 255 Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr 260 265 270 Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala 275 280 285 Pro Asp Lys Thr Leu Ile Leu Asp Val Pro Pro Gly Val Glu Lys Phe 290 295 300 Gln Leu His Asp Cys Thr Gln Val Glu Lys Ala Asp Thr Thr Ile Cys 305 310 315 320 Leu Lys Trp Lys Asn Ile Glu Thr Phe Thr Cys Asp Thr Gln Asn Ile 325 330 335 Thr Tyr Arg Phe Gln Cys Gly Asn Met Ile Phe Asp Asn Lys Glu Ile 340 345 350 Lys Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu His Glu Tyr Lys Cys Asp Ser Glu 355 360 365 Ile Leu Tyr Asn Asn His Lys Phe Thr Asn Ala Ser Lys Ile Ile Lys 370 375 380 Thr Asp Phe Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gln Ile Ile Phe Cys Arg Ser 385 390 395 400 Glu Ala Ala His Gln Gly Val Ile Thr Trp Asn Pro Pro Gln Arg Ser 405 410 415 Phe His Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Glu Lys Asp Cys 420 425 430 Leu Asn Leu Asp Lys Asn Leu Ile Lys Tyr Asp Leu Gln Asn Leu Lys 435 440 445 Pro Tyr Thr Lys Tyr Val Leu Ser Leu His Ala Tyr Ile Ile Ala Lys 450 455 460 Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr Lys Ser 465 470 475 480 Ala Pro Pro Ser Gln Val Trp Asn Met Thr Val Ser Met Thr Ser Asp 485 490 495 Asn Ser Met His Val Lys Cys Arg Pro Pro Arg Asp Arg Asn Gly Pro 500 505 510 His Glu Arg Tyr His Leu Glu Val Glu Ala Gly Asn Thr Leu Val Arg 515 520 525 Asn Glu Ser His Lys Asn Cys Asp Phe Arg Val Lys Asp Leu Gln Tyr 530 535 540 Ser Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Ala Tyr Phe His Asn Gly Asp Tyr Pro 545 550 555 560 Gly Glu Pro Phe Ile Leu His His Ser Thr Ser Tyr Asn Ser Lys Ala 565 570 575 Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile Ala Leu 580 585 590 Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg Ser Cys 595 600 605 Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu Lys Gln 610 615 620 Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu Thr Tyr 625 630 635 640 Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu Phe Gln 645 650 655 Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala Arg Lys 660 665 670 Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu Pro Tyr Asp 675 680 685 Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala Gly Ser Asn 690 695 700 Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro Arg Lys Tyr 705 710 715 720 Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe Trp Arg 725 730 735 Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr Arg Cys 740 745 750 Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser Met Glu 755 760 765 Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn Gln His 770 775 780 Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val Asn Lys 785 790 795 800 Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe Thr Ser 805 810 815 Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu Lys Leu 820 825 830 Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro Ile Val 835 840 845 Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ile 850 855 860 Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp Val Tyr 865 870 875 880 Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val Gln Val 885 890 895 Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr Asn Gln 900 905 910 Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro Tyr Leu His 915 920 925 Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu Glu Ala 930 935 940 Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln His Ile 945 950 955 960 Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn Val Ile 965 970 975 Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu Met Ser 980 985 990 Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp 995 1000 1005 Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser 1010 1015 1020 Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys 1025 1030 1035 Glu Thr Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val 1040 1045 1050 Lys Val Ile Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu 1055 1060 1065 Ile Cys Ala Gln Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp 1070 1075 1080 Ile Glu Val Asp Leu Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr 1085 1090 1095 Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg 1100 1105 1110 Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu 1115 1120 1125 Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile Ser Met Ile Gln Val Val Lys 1130 1135 1140 Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser Glu Gly Asn Lys His His 1145 1150 1155 Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg Asp Gly Ser Gln Gln 1160 1165 1170 Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Glu Ser Ala Glu 1175 1180 1185 Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys Ala Leu Arg 1190 1195 1200 Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr Gln Phe 1205 1210 1215 Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly Gln 1220 1225 1230 Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn 1235 1240 1245 Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu 1250 1255 1260 Gly Ala Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly 1265 1270 1275 Ser Glu Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn 1280 1285 1290 Gly Pro Ala Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser 1295 1300 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 11 Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala Val Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 12 Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly 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Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 15 <210> 291 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 291 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ser Ala Ser 20 <210> 292 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 292 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25 <210> 293 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 293 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25 30 <210> 294 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 294 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 295 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 295 Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr 20 25 <210> 296 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 296 Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 297 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 297 Ala Thr Thr Thr Gly Ser 1 5 <210> 298 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD79b <400> 298 Met Ala Arg Leu Ala Leu Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu 20 25 30 Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln 35 40 45 Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr Val Lys Met His 50 55 60 Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp Leu Trp Lys Gln 65 70 75 80 Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met 85 90 95 Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr Ile Gln Gly Ile 100 105 110 Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Lys Cys Asn Asn 115 120 125 Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly 130 135 140 Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly 145 150 155 160 Ile Ile Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro 165 170 175 Ile Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu 180 185 190 Asp His Thr Tyr Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu 195 200 205 Asp Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu 210 215 220 His Pro Gly Gln Glu 225 <210> 299 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 299 Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu 1 5 10 15 Ser His Lys Ser Pro 20 <210> 300 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 300 Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 1 5 10 15 <210> 301 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 301 Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 302 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 302 Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 303 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 303 Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 304 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 304 Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 305 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 305 Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 306 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 306 Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 307 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 307 Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val 1 5 10 15 Arg Pro <210> 308 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 308 Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu 1 5 10 15 Thr Thr <210> 309 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 309 Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr 1 5 10 15 Phe Asn <210> 310 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 310 Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu 1 5 10 15 Pro Ala <210> 311 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 311 Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile 1 5 10 15 Arg Thr <210> 312 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 312 Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Phe Gly <210> 313 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 313 Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu 1 5 10 15 Gly Ala <210> 314 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 314 Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro 1 5 10 15 Asp Leu <210> 315 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 315 Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Ser Leu <210> 316 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 316 Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ser <210> 317 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 317 Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Pro <210> 318 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 318 Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe 1 5 10 15 Pro Pro <210> 319 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 319 Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro 1 5 10 15 Pro Tyr <210> 320 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 320 Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr 1 5 10 15 Pro <210> 321 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 321 Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn 1 5 10 15 Leu Arg <210> 322 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker sequence <400> 322 Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr 1 5 10 15 Phe Pro <210> 323 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 323 Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 324 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 324 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 325 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 325 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp 1 5 10 15 <210> 326 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 326 Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Glu Asp Asp Glu 20 <210> 327 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 327 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val 20 <210> 328 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 328 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val Lys 20 <210> 329 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 329 Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 330 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 330 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 331 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 331 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 332 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 332 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp 1 5 10 15 <210> 333 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 333 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 334 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 334 Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly 20 <210> 335 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 335 Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu 1 5 10 15 Arg Ser Glu Gln 20 <210> 336 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Other linker <400> 336 Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met 1 5 10 <210> 337 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence <400> 337 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 338 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence <400> 338 Pro Pro Pro Pro 1 <210> 339 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 339 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 340 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 340 Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 341 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4450gL5 V-region - IGKV1-6 framework <400> 341 Ala Ile Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Glu Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 342 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4450gL6 V-region - IGKV1-6 framework <400> 342 Ala Ile Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Asp Ala Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 343 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4450gL7 V-region - IGKV1-6 framework <400> 343 Ala Ile Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Asp Ser Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (35)

  1. CD79에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 항체 분자로서, 상기 결합 도메인이 하기 식 (I)의 CDRH1, 하기 식 (II)의 CDRH2, 및 EPYEPYDDSNIYYGMDP(서열번호 3) 또는 DAGHSDVDVLDI(서열번호 4)의 CDHR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것인 항체 분자:
    [식 (I)]
    GFSLX1NYX2X3X4 (서열번호 1)
    상기 식에서, X1은 S 또는 N이고, X2는 V 또는 A이고, X3은 V 또는 M이고, X4는 S 또는 V이다;
    [식 (II)]
    IIYX5X6X7X8X9X10X11YAX12WAKG (서열번호 2)
    상기 식에서, X5는 V 또는 I이고, X6은 S 또는 E이고, X7은 T 또는 G이고, X8은 N 또는 G이고, X9는 T 또는 A이고, X10은 T 또는 Y이고, X11은 W이거나 부재하고, X12는 N 또는 S이다.
  2. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 도메인(VL)이 하기 식 (III)의 CDRL1, 하기 식 (IV)의 CDRL2 및 하기 식 (V)의 CDRL3을 포함하는 것인 항체 분자:
    [식 (III)]
    QX13SQSX14X15X16X17NX18LA (서열번호 5)
    상기 식에서, X13은 A 또는 S이고, X14는 V 또는 I이고, X15는 V 또는 Y이고, X16은 N 또는 S이고, X17은 G 또는 N이고, X18은 Y 또는 D이다;
    [식 (IV)]
    X19ASX20LAS (서열번호 6)
    상기 식에서, X19는 S 또는 E이고, X20은 T 또는 K이다;
    [식 (V)]
    X21GX22X23SX24X25X26X27X28X29X30A (서열번호 7)
    상기 식에서, X21은 L 또는 Q이고, X22는 G 또는 E이고, X23은 G 또는 F이고, X24는 C, S 또는 G(특히 S 또는 G)이고, X25는 S 또는 G이고, X26은 D, S 또는 E이고, X27은 H, G, A, S 또는 C(특히 H, G, A 또는 S)이고, X28은 I 또는 D이고, X29는 C 또는 S이거나 부재하고, X30은 N이거나 부재한다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식 (I)이 서열번호 8 또는 11, 예컨대, 서열번호 8인 항체 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (II)가 서열번호 9 또는 12, 예컨대, 서열번호 9인 항체 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CDRH3이 서열번호 3인 항체 분자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CDRH3이 서열번호 4인 항체 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (III)이 서열번호 13 또는 19, 예컨대, 서열번호 13인 항체 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (IV)가 서열번호 14 또는 20, 예컨대, 서열번호 14인 항체 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (V)가 서열번호 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23 및 24를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 항체 분자.
  10. 제1항에 있어서, CDRH1이 서열번호 8이고, CDRH2가 서열번호 9이고, CDRH3이 서열번호 4이고, CDRL1이 서열번호 13이고, CDRL2가 서열번호 14이고, CDRL3이 서열번호 15, 16, 17 또는 18로부터 독립적으로 선택되는 것인 항체 분자.
  11. 제1항에 있어서, CDRH1이 서열번호 11이고, CDRH2가 서열번호 12이고, CDRH3이 서열번호 3이고, CDRL1이 서열번호 19이고, CDRL2가 서열번호 20이고, CDRL3이 서열번호 21, 22, 23 또는 24로부터 독립적으로 선택되는 것인 항체 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, VH 및 VL이 인간화된 것인 항체 분자.
  13. 제12항에 있어서, 중쇄의 가변 도메인(VH)이 위치 24, 37, 48, 49, 67, 71, 73 및 78 중 적어도 1개의 위치의 잔기가 도너 잔기인 인간 프레임워크 영역을 포함하고, 경쇄의 가변 도메인(VL)이 위치 2, 3, 36, 46, 49 및 70 중 적어도 1개의 위치의 잔기가 도너 잔기인 인간 프레임워크 영역을 포함하는 것인 항체 분자.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 서열번호 34 또는 35에 제공된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 33 또는 250에 제공된 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 분자.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 서열번호 41 또는 42에 제공된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 40, 341, 342 또는 343에 제공된 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 분자.
  16. 제12항에 있어서, 경쇄의 가변 도메인은 서열번호 33, 40 또는 250의 경쇄 가변 도메인에 대해 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고, 중쇄의 가변 도메인은 서열번호 34, 35, 41 또는 42의 중쇄 가변 도메인에 대해 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 것인 항체 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 전장 항체인 항체 분자.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 scFv, Fv, Fab 또는 Fab' 단편인 항체 분자.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 다중특이성 분자, 예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성 분자인 항체 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 포맷이 디아바디(diabody), sc디아바디(scdiabody), 트리아바디(triabody), 탠덤(tandem) scFv, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab-(dsscFv)2 디Fab, 디Fab', 트리바디(tribody), 탠덤 scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3, Ig-scFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, 듀오바디(Duobody) 및 DVD-Ig로부터 선택되는 것인 항체 분자.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, CD79에 특이적인 하나의 결합 도메인 및 CD22 또는 CD45에 특이적인 하나의 결합 도메인을 포함하는 항체 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 결합 도메인이 단일특이성인 항체 분자.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 이중특이성 또는 삼중특이성 분자는 CD22에 특이적인 하나 이하의 결합 도메인 및 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 하나 이하의 결합 도메인을 포함하는 것인 항체 분자.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 이중특이성 또는 삼중특이성 분자는 CD45에 특이적인 하나 이하의 결합 도메인 및 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 하나 이하의 결합 도메인을 포함하는 것인 항체 분자.
  25. 제21항 또는 제22항에 있어서, CD22 또는 CD45에 특이적인 결합 도메인 및 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인은 Fab, scFv, Fv, dsFv 및 dsscFv로부터 독립적으로 선택되는 것인 항체 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 결합 도메인이 인간화된(예컨대, 모든 결합 도메인이 인간화된) 것인 항체 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산이 시스테인 이외의 다른 아미노산으로 치환된 것인 항체 분자.
  28. 제27항에 있어서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것인 항체 분자.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민에 특이적인 결합 도메인을 추가로 포함하는 항체 분자.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 정의된 하나 이상의 항체 분자를 포함하는 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 정의된 항체 분자 또는 이의 기능성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  32. 제31항에 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  33. 치료법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자 또는 제30항에 따른 조성물.
  34. 치료법에 사용하기 위한, 특히 본원에 기재된 병태 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자 또는 제30항에 따른 조성물의 용도.
  35. 치료 유효량의 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자 또는 제30항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201521382D0 (en) * 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521393D0 (en) * 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
AU2019287720A1 (en) * 2018-06-14 2021-01-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CD79A chimeric antigen receptors
US20220226374A1 (en) * 2018-06-14 2022-07-21 2seventy bio, Inc Cd79b chimeric antigen receptors
KR20210071987A (ko) * 2018-10-03 2021-06-16 네펜쓰 바이오사이언스, 엘엘씨 항-cd79 항체 및 이들의 용도
MX2021008760A (es) 2019-01-28 2021-08-24 Tuojie Biotech Shanghai Co Ltd Anticuerpo anti-cd79b, fragmento de union a antigeno del mismo y uso farmaceutico del mismo.
CN110684740B (zh) * 2019-08-09 2020-12-08 无锡傲锐东源生物科技有限公司 一种抗人泛素羧基末端水解酶-1(uch-l1)的单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (150)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE151110T1 (de) 1988-09-02 1997-04-15 Protein Eng Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
US6106834A (en) 1993-06-02 2000-08-22 Research Corporation Technologies, Inc. Use of anti-CD45 leukocyte antigen antibodies for immunomodulation
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
WO1995020401A1 (en) 1994-01-31 1995-08-03 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
AU740904B2 (en) 1997-03-20 2001-11-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Recombinant antibodies and immunoconjugates targeted to CD-22 bearing cells and tumors
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6368596B1 (en) 1997-07-08 2002-04-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
AU2719099A (en) 1998-01-23 1999-08-09 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Multipurpose antibody derivatives
CA2364160C (en) 1999-02-25 2014-05-20 National Jewish Medical And Research Center Product and method for treatment of conditions associated with receptor-desensitization
EP1543839B1 (en) 1999-06-09 2017-09-20 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target B-cells
WO2000074718A1 (en) 1999-06-09 2000-12-14 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
DE19952956A1 (de) 1999-11-03 2001-05-17 Acgt Progenomics Ag Verfahren zur Verbindung von molekularen Substanzen
EP2392596A3 (en) 1999-12-28 2013-11-27 ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC Intrabodies with defined framework that is stable in a reducing environment and applications thereof
FR2809806B1 (fr) 2000-05-30 2003-01-10 Livbag Snc Initiateur electro-pyrotechnique a pont en couche mince et a tres basse energie de fonctionnement
GB0103389D0 (en) 2001-02-12 2001-03-28 Novartis Ag Organic compounds
US20050069538A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Gregorio Aversa Therapeutic binding molecules
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
EP1448584B1 (en) 2001-09-26 2010-05-19 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of Health and Human Services Mutated anti-cd22 antibodies with increased affinity to cd22-expressing leukemia cells
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
WO2003048327A2 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Anti-cd45rb antibodies for use in treating autoimmune disease and transplant rejection
WO2003072736A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Duke University Reagents and treatment methods for autoimmune diseases
US8658773B2 (en) 2011-05-02 2014-02-25 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
PT1507556T (pt) 2002-05-02 2016-09-28 Wyeth Holdings Llc Conjugados de derivado da caliqueamicina - transportador
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0225279D0 (en) 2002-10-30 2002-12-11 Celltech R&D Ltd Biological products
PT1570267E (pt) 2002-12-03 2012-01-03 Ucb Pharma Sa Ensaio para a identificação de células produtoras de anticorpos
US8420086B2 (en) 2002-12-13 2013-04-16 Immunomedics, Inc. Camptothecin conjugates of anti-CD22 antibodies for treatment of B cell diseases
GB0305702D0 (en) 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
US20050048578A1 (en) 2003-06-26 2005-03-03 Epitomics, Inc. Methods of screening for monoclonal antibodies with desirable activity
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2005003169A2 (en) 2003-07-01 2005-01-13 Celltech R & D Limited Modified antibody fab fragments
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
JP2007520991A (ja) 2003-08-07 2007-08-02 エピトミクス インコーポレーティッド ウサギ単クローン抗体をヒト型化する方法
EP1664122B1 (en) 2003-09-18 2010-03-17 Novartis AG Therapeutic humanised antibodies against cd45 isoforms
DK2295073T3 (da) 2003-11-17 2014-07-28 Genentech Inc Antistof mod cd22 til behandling af tumor af hæmatopoietisk oprindelse
EP2204385A1 (en) 2003-11-25 2010-07-07 The Government Of U.S.A, As Represented By Secretary, Department of Health and Human Sevices Pseudomonas exotoxin A mutants and uses thereof
GB0411186D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
AU2005250216B2 (en) 2004-06-01 2009-12-10 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2006004910A2 (en) 2004-06-28 2006-01-12 Transtarget Inc. Improved bispecific antibodies
TW200621282A (en) 2004-08-13 2006-07-01 Wyeth Corp Stabilizing formulations
ATE459648T1 (de) 2005-05-11 2010-03-15 Philogen Spa Fusionsprotein von antikörper l19 gegen fibronectin ed-b und interleukin 12
US7745393B2 (en) 2005-11-03 2010-06-29 Jumi Shin Minimalist bZIP proteins and uses thereof
GB0523954D0 (en) 2005-11-24 2006-01-04 Ucb Celltech Bioassays
GB0601513D0 (en) 2006-01-25 2006-03-08 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules 3
WO2007092196A2 (en) 2006-01-27 2007-08-16 Cellerant Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating myeloid proliferative disorders
CA2644906C (en) 2006-03-06 2016-05-10 Medimmune, Inc. Humanized anti-cd22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
EP1999148B8 (en) 2006-03-06 2014-03-05 Medlmmune, LLC Humanized anti-cd22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
RS53168B (en) 2006-05-30 2014-06-30 Genentech Inc. Antibodies and Immunoconjugates and Their Use
WO2007146968A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
SG177168A1 (en) 2006-12-01 2012-01-30 Medarex Inc Human antibodies that bind cd22 and uses thereof
CA2681974C (en) 2007-03-29 2019-12-31 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
AU2008276128B2 (en) 2007-07-16 2013-10-10 Genentech, Inc. Humanized anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
ES2381788T3 (es) 2007-07-16 2012-05-31 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-CD79b e inmunoconjugados y métodos de uso
JP5592792B2 (ja) 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
IL287292B (en) 2008-01-31 2022-09-01 Genentech Inc and fusion antibody-drug-cd79b engineered antibodies cysteine-
EP2252631B1 (en) 2008-04-02 2016-04-13 MacroGenics, Inc. Bcr-complex-specific antibodies and methods of using same
US8591889B2 (en) 2008-04-04 2013-11-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for CD22
WO2010035012A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
CA2749501C (en) 2009-02-13 2017-01-10 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
WO2011025904A1 (en) 2009-08-31 2011-03-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific immunocytokine dock-and-lock (dnl) complexes and therapeutic use thereof
GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
US20110250642A1 (en) 2010-04-12 2011-10-13 Sorrento Therapeutics Method for Displaying Antibodies
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
US20130209463A1 (en) 2010-06-30 2013-08-15 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of multiple sclerosis, rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders
EP3797847A1 (en) 2010-07-30 2021-03-31 Medlmmune, LLC Purified active polypeptides or immunoconjugates
CN103261220B (zh) 2010-08-16 2016-06-15 诺夫免疫股份有限公司 用于生成多特异性和多价抗体的方法
US9499605B2 (en) 2011-03-03 2016-11-22 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
AU2012258637B2 (en) 2011-05-24 2017-07-20 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
EP2717912A4 (en) 2011-06-08 2015-08-05 Univ California ANTI-CD22 ANTIGEN-BINDING MOLECULES FOR THE TREATMENT OF LUNG CANCER AND PROSTATE CANCER
PT2771364T (pt) 2011-10-27 2019-09-10 Genmab As Produção de proteínas heterodiméricas
CA2887880A1 (en) 2011-11-23 2013-05-30 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Proteomic identification of antibodies
US20140212425A1 (en) 2011-12-05 2014-07-31 Immunomedics, Inc. Therapeutic use of anti-cd22 antibodies for inducing trogocytosis
US9192664B2 (en) 2011-12-05 2015-11-24 Immunomedics, Inc. Therapeutic use of anti-CD22 antibodies for inducing trogocytosis
US9642918B2 (en) 2011-12-16 2017-05-09 Pfizer Inc. Combination of inotuzumab ozogamicin and torisel for the treatment of cancer
CA2871764A1 (en) 2012-04-26 2013-10-31 Gerhard Frey Anti-cd22 antibodies
EP2861622A4 (en) 2012-06-15 2016-06-01 Sinomab Bioscience Ltd Anti-idiotypic anti-CD22 antibodies and uses thereof
MX2014014065A (es) 2012-06-27 2015-02-04 Hoffmann La Roche Metodo para la seleccion y produccion de moleculas terapeuticas hechas a la medida, selectivas y multiespecificas que comprenden al menos dos diferentes entidades de direccionamiento y usos de las mismas.
TW201408698A (zh) 2012-07-09 2014-03-01 Genentech Inc 抗ｃｄ７９ｂ抗體及免疫結合物
KR20150030698A (ko) 2012-07-09 2015-03-20 제넨테크, 인크. 항-cd79b 항체를 포함하는 면역접합체
WO2014011520A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
CN104540524A (zh) 2012-07-09 2015-04-22 基因泰克公司 包含抗cd22抗体的免疫缀合物
EP3539563A1 (en) 2012-07-19 2019-09-18 Redwood Bioscience, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
US9682143B2 (en) 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
KR101963231B1 (ko) 2012-09-11 2019-03-28 삼성전자주식회사 이중특이 항체의 제작을 위한 단백질 복합체 및 이를 이용한 이중특이 항체 제조 방법
GB201223276D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
EP2961773B1 (en) 2013-02-26 2019-03-20 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN103214578B (zh) 2013-05-10 2014-05-28 北京东方百泰生物科技有限公司 一种新型的人源化抗cd22抗体
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
CA2927543C (en) 2013-10-15 2021-07-20 The California Institute For Biomedical Research Peptidic chimeric antigen receptor t cell switches and uses thereof
CN106029098A (zh) 2014-02-25 2016-10-12 免疫医疗公司 人源化rfb4抗cd22抗体
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
GB201411420D0 (en) 2014-06-26 2014-08-13 Ucb Biopharma Sprl Antibody constructs
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
SG11201700885SA (en) 2014-08-06 2017-03-30 Astellas Pharma Inc NOVEL ANTI-HUMAN Igβ ANTIBODY
HUE045216T2 (hu) 2014-12-05 2019-12-30 Hoffmann La Roche Anti-CD79B antitestek és alkalmazási eljárások
WO2016168773A2 (en) 2015-04-15 2016-10-20 The California Institute For Biomedical Research Optimized pne-based chimeric receptor t cell switches and uses thereof
US20160304611A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Immunomedics, Inc. Combination therapy for treating adult patients with relapsed/refractory cd22+ b-cell acute lymphoblastic leukemia
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521393D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
JP7252627B2 (ja) 2016-12-15 2023-04-05 デューク ユニバーシティ 制御性ｂ１０細胞を枯渇させる抗体および方法並びに免疫チェックポイント阻害剤との併用における使用

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