KR20180006462A - 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물 - Google Patents

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Abstract

세포 배양 배지로서 이용에 적합한 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 공급원 혈소판의 용해로부터 방출된 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨을 포함할 수 있고, 여기서 공급원 혈소판으로부터 세포 조직파편은 여과에 의해 제거된다 (부분적으로 또는 완전히). 이들 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨은 동결건조되어 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 형성한다.

Description

미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물
본 발명은 세포 배양 배지로서 이용에 적합한 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물에 관계한다.
배경
주류 의학에서 세포 요법 및 세포 연구가 증가하고 있다. 이러한 증가의 결과로서, 다양한 배양 배지가 창출되었다. 소 태아 혈청 (FBS) 기초된 배양 배지는 더욱 통상적인 유형 중에서 한 가지이고, 대규모로 제조될 수 있고, 로트별 가변성이 감소하고, 그리고 인간 세포를 배양할 때 이용될 수 있다. 하지만, FBS 기초된 배양 배지에서 창출된 세포 배양액은 면역원성 잔여 소 단백질에 노출될 수 있기 때문에, 순도 우려가 발생한다. 한 가지 대안 배양 배지가 인간 혈소판 용해물로부터 창출될 수 있다. 인간 혈소판 용해물 기초된 배양 배지는 FBS 기초된 배양 배지를 능가할 수 있고, 그리고 FBS 기초된 배양 배지 상에 도말된 세포 배양액과 연관된 노출 우려를 제거할 수 있다; 하지만, 이들 배지는 엄격한 보관 조건을 갖는다. 이런 이유로, FBS 기초된 배양 배지와 연관된 노출 우려를 제거하고 쉽게 보관될 수 있는 세포 배양 배지가 요구된다.
본 발명은 세포 배양 배지로서 이용에 적합한 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 제시한다.
도면의 간단한 설명
기술의 특질 및 이점은 이러한 기술의 특질을 도해하기 위한 첨부 도면과 함께 합쳐지는 아래의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 이들 도면은 단지 예시적인 구체예를 묘사할 뿐이고, 그리고 이런 이유로, 범위를 제한하는 것으로 고려되지 않는 것으로 이해된다. 게다가, 성분은 본원의 도면에서 및 다른 곳에서 일반적으로 설명되고 도해된 바와 같이, 매우 다양한 상이한 방식으로 조제되고 및/또는 설계될 수 있는 것으로 쉽게 인지될 것이다.
도면 1은 다양한 온도 및 기간에서 보관 이후에 인간 혈소판 용해물 배양된 배지에서 냉동보존된 계대 3 탯줄 유래된 중간엽 줄기 세포에 대한 성장 곡선 결과를 개략적으로 보여준다;
도면 2는 12 개월의 기간 동안 다양한 온도에서 보관된 대조 배지 및 실험적 배지를 비롯한 인간 혈소판 용해물 배양된 배지에서 도말된 냉동보존된 계대 3 탯줄 유래된 중간엽 줄기 세포에 대한 세포 분화의 흑백 이미지를 개략적으로 보여준다;
도면 3은 일군의 표본에 대한 동결 해동 용해 방법의 동결 해동 주기마다 용해된 혈소판의 백분율을 개략적으로 보여준다; 그리고
도면 4는 혈소판이 특정한 횟수의 동결 해동 주기에서 용해된 후에 획득된 특정한 성장 인자 양의 한 가지 실례를 개략적으로 보여준다.
이들 도면은 기술의 다양한 양상을 도해하기 위해 제공되고, 그리고 특허청구범위에 의해 달리 한정되지 않으면 결과 또는 성분의 면에서 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
상세한 설명
예시적인 구체예가 참조될 것이고, 그리고 이들을 설명하기 위한 특정한 언어가 본원에서 이용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 발명의 범위의 제한은 의도되지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 예시된 발명의 특질의 변경 및 추가 변형, 그리고 당업자에게 발생할, 본원에서 예시된 바와 같은 본 발명의 원리의 추가 적용은 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 본 발명은 본원에서 개시된 특정 형상, 과정 단계 및 물질에 한정되지 않는 것으로 또한 이해되는데, 그 이유는 이들이 어느 정도까지 변할 수 있기 때문이다. 게다가, 본원에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 것을 목적으로 하고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
주목할 만한 것은 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다는 점이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "혈소판-내포 유체"는 혈소판을 내포하는 임의의 생물학적 또는 인공 유체를 지칭한다. 이런 유체의 무제한적 실례는 인간 및 비인간 공급원으로부터 유래된 다양한 형태의 전혈, 혈장, 혈소판 풍부한 혈장, 임의의 배지에서 농축된 혈소판, 또는 기타 유사한 것을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "농축물" 또는 "농축하는"은 혈소판이 존재하는 혈장, 전혈, 또는 다른 유체의 벌크로부터 혈소판의 분리를 지칭한다. 가령, 원심분리, 분광분석법, 여과, 디캔팅, 중력 침강, 또는 혈소판-내포 유체로부터 혈소판을 농축하는 다른 방법이 이용될 수 있다. 혈소판을 농축할 때, 혈액, 혈장, 또는 다른 유체의 다른 성분으로부터 혈소판의 분리 동안 응고를 예방하기 위해, 혈소판의 공급원과 함께 항응고제 (특히, 원심분리 또는 중력 침강을 위한)를 이용하는 것이 바람직할 수 있다.
용어 "항응고제"는 본 발명의 실례에 따라서 이용을 위한 혈소판을 농축하거나 또는 수집할 때, 응고를 저해하는 조성물을 지칭한다. 항응고제는 일반적으로, 응고 인자 합성의 저해제, 트롬빈의 저해제, 또는 항혈소판제로서 가용하다. 간에서 일정한 응고 인자의 생산을 저해하는 응고 인자 합성의 저해제는 와파린 (쿠마딘)과 같은 조성물을 포함한다. 트롬빈의 저해제는 트롬빈의 활성을 차단함으로써 혈액 응고를 간섭하고, 그리고 헤파린 및 레피루딘 (레플루단)과 같은 조성물을 포함한다. 항혈소판제는 혈소판 자체와 상호작용하고, 그리고 아스피린, 티클로피딘 (티클리드), 클로피도그렐 (플라빅스), 티로피반 (아그라스타트), 에프티피바티드 (인테그릴린) 등과 같은 약물을 포함한다.
용어 "동결건조", 동결건조시킨다" 또는 기타 유사한 것은 혈소판을 보존하는데 종종 이용되는 동결건조 또는 탈수 과정을 지칭하지만, 본 발명의 구체예에 따라서 다소간 상이하게 이용된다. 구체적으로, 동결건조는 일차적으로 보존 과정으로서 이용될 뿐만 아니라, 초기 동결 해동 또는 다른 용해 기술이 수행된 후 혈소판을 더욱 용해하는데 이용될 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 실례에 따라서, 용해물이 본원에서 설명된 바와 같이 형성된 후, 동결건조는 혈소판 내에 초기에 에워싸이거나 또는 혈소판의 표면에 결합되지만 혈소판이 본원에서 설명된 바와 같이 용해 (가령, 동결 해동 용해)될 때 방출되는 성장 인자, 사이토킨, 케모킨 및 다른 내용물을 보존하는 부가된 유익성을 제공한다. 이러한 과정은 전형적으로, 상기 물질을 동결하고, 그리고 주변 압력을 감소시켜 상기 물질 내에 동결된 물이 고체상으로부터 가스상으로 직접적으로 승화하도록 허용함으로써 작동한다. 동결건조는 초음파처리 및/또는 여과, 또는 이들 용해 기술의 임의의 조합을 비롯한 다른 동결 해동 순환 기술을 이용하여 세포를 용해한 후, 유사하게 실행될 수 있다.
용어 "조직"은 작은 조직 부위부터 완전한 장기까지 전체 범위를 포함한다.
본 발명에 따라서, "용해물"은 혈소판이 그들의 세포막을 교란함으로써 파괴되는 제조된 조성물이다. 이것은 화학적으로, 기계적으로, 액체 균질화에 의해, 여과에 의해 및/또는 초음파처리에 의해 행위될 수 있지만, 본원에서 설명된 일정한 구체예에 따라서, 세포용해는 동결 해동 주기를 이용하여, 그리고 정도가 덜하긴 하지만, 최종 동결건조 과정의 일부로서 실행될 수 있다. 동결 해동 용해물은 혈소판 현탁액을 동결하고, 그리고 이후, 상기 물질을 실온을 초과하여, 예를 들면, 30℃ 내지 45℃까지 해동함으로써 형성될 수 있긴 하지만, 다른 동결 해동 섭생 또한, 혈소판의 세포용해를 야기하기만 하면, 본 발명의 범위에 포함된다. 동결 해동 기술에서, 이러한 방법은 얼음 결정이 형성됨에 따라서 세포가 팽창하고 깨지도록 유발하고, 해동 시에 수축이 뒤따른다. 따라서, 순환적 팽창 및 수축은 궁극적으로, 혈소판이 깨지고 터지도록 유발한다. 더욱 완전한 용해를 위해 복수 주기가 전형적으로 이용되긴 하지만, "더욱 완전한" 용해가 본 발명의 실례에 따라서 반드시 필요한 것은 아니다. 다양한 정도의 혈소판 세포용해, 예를 들면, 혈소판 수치에 의해 최소한 30%, 최소한 50%, 최소한 70%, 최소한 90%, 또는 최대 100% 세포용해가 일어날 수 있다. 혈소판을 용해할 때, 2회 또는 그 이상 동결 해동 주기, 3회 또는 그 이상 주기 등이 이용될 수 있다. 대안으로, 1회 동결 해동 주기, 그 이후에 동결건조 단계가 이용될 수 있다. 따라서, 기술에 상관없이, 하나 또는 그 이상의 용해 단계 (가령, 동결 해동, 초음파처리, 여과, 액체 균질화, 기계적 용해, 화학적 용해 등), 그 이후에 동결건조 단계 (가령, 동결건조 또는 탈수)가 실행된다. 동결건조 단계는 추가 용해가 하나 또는 그 이상의 용해 단계 위에서 또는 상기 단계를 초과하여 발생하도록 유발할 수 있다.
용어 "동결건조된 혈소판 용해물" 또는 "LPL"은 본원에서 설명된 바와 같이 제조된다. 하지만, 주목할 만한 것은 용어 동결건조된 혈소판 용해물이 또한, 동결건조된 혈소판 용해물의 특정한 유형으로서 "동결건조된 혈소판 풍부한 혈장 용해물" 또는 "LPRRL"을 포함한다는 점이다. 따라서, 동결건조된 혈소판 용해물 (LPL)에 관한 임의의 논의는 한 가지 차이점이 혈소판 풍부한 혈장이 방법 또는 조성물의 일부로서 이용되거나 또는 형성된다는 것임을 양해하는 조건 하에, 동결건조된 혈소판 풍부한 혈장 용해물 (LPRRL)을 또한 포함한다. 하지만, 어느 조성물이든, 둘 모두 동결건조된 혈소판 용해물을 포함한다.
"응고 활성을 전시하지 않는" 세포 배양 배지로서 조제된 재구성된 미립자 동결건조된 혈소판 조성물을 지칭할 때, 응고 활성이 없거나, 또는 배양 배지에서 세포 또는 조직 표본의 성장을 간섭하지 않는 단지 최소한의 응고 활성만 있는 것으로 이해된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약"은 소정의 값이 종결점보다 "약간 높거나" 또는 "약간 낮을" 수 있다는 것을 제시함으로써, 수치 범위 종결점에 유연성을 제공하는데 이용된다. 이러한 용어의 유연성의 정도는 특정 변수에 의해 지배될 수 있고, 그리고 경험 및 본원에서 연관된 설명에 근거하여 결정하는 당업자의 지식의 범위 내에 있을 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 복수의 성분이 편의를 위해 공통 목록에서 제시될 수 있다. 하지만, 이들 목록은 마치 목록의 각 구성원이 별개의 독특한 구성원으로서 개별적으로 확인되는 것처럼 해석되어야 하다. 따라서, 이런 목록의 어떤 개별 구성원도 반대의 지시가 없으면, 단순히 공통 군에서 그들의 제시에만 근거하여 동일한 목록의 임의의 다른 구성원의 사실상의 등가물인 것으로 해석되지 않아야 한다.
농도, 양 및 다른 수치 데이터는 본원에서 범위 형식으로 표현되거나 또는 제시될 수 있다. 이런 범위 형식은 단지 편의 및 간결성을 위해 이용되고, 그리고 따라서, 범위의 한계로서 명시적으로 언급된 수치 값뿐만 아니라 마치 각 수치 값 및 부분범위가 명시적으로 언급되는 것처럼 상기 범위 내에 포괄된 모든 개별 수치 값 또는 부분범위를 포함하는 것으로 유연하게 해석되어야 하는 것으로 이해된다. 예시로서, "약 0.01 내지 2.0"의 수치 범위는 약 0.01 내지 약 2.0의 명시적으로 언급된 값뿐만 아니라 지정된 범위 내에 개별 값 및 부분범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 개별 값, 예를 들면, 0.5, 0.7 및 1.5, 그리고 부분범위, 예를 들면, 0.5 내지 1.7, 0.7 내지 1.5, 1.0 내지 1.5 등은 이러한 수치 범위 내에 포함된다. 이러한 동일한 원리가 단지 하나의 수치 값만을 재인용하는 범위에 적용된다. 게다가, 이런 해석은 설명되는 범위 또는 특징의 폭에 상관없이 적용되어야 한다.
이들 정의를 염두에 두고, 세포 배양 배지로서 이용에 적합한 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 공급원 혈소판의 용해로부터 방출된 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨을 포함할 수 있고, 여기서 공급원 혈소판으로부터 세포 조직파편은 여과에 의해 제거되고, 그리고 여기서 이들 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨은 동결건조되어 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 형성한다. 한 특정한 실례에서, 세포 또는 조직을 배양하는 방법은 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 재구성하여 세포 배양 배지를 형성하고, 그리고 세포 또는 조직을 세포 배양 배지와 접촉시켜 배양 중인 세포 또는 조직을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배지는 중간엽 줄기 세포, 인간 배아 줄기 세포, 각질세포, 또는 심근세포로부터 유래된 세포 배양액에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 탯줄로부터 유래될 수 있다. 다른 세포 유형이 유사하게 이용될 수 있다.
다른 실례에서, 세포 배양 배지는 액체 배지에서 재구성된 미립자 동결건조된 혈소판 용해물을 포함할 수 있고, 여기서 세포 배양 배지는 배양 중인 세포 또는 조직 내에서 응고 활성을 전시하지 않는 농도에서 조제된다. 한 특정한 실례에서, 세포 또는 조직을 배양하는 방법은 세포 또는 조직을 세포 배양 배지와 접촉시켜 배양 중인 세포 또는 조직을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 다시 한 번, 상기 배지는 중간엽 줄기 세포, 인간 배아 줄기 세포, 각질세포, 또는 심근세포로부터 유래된 세포 배양액에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 탯줄로부터 유래될 수 있다. 다른 세포 유형이 유사하게 이용될 수 있다.
다른 실례에서, 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 제조하기 위한 방법은 혈소판 및 유체 담체를 포함하는 혈소판 공급원을 획득하는 단계; 혈소판을 용해하여 복수의 용해물을 형성하는 단계; 및 용해 후 복수의 용해물을 여과하여 세포 조직파편을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시예에서, 추가 단계는 복수의 용해물을 동결건조시켜 가용한 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨의 방출된 농축물을 갖는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 한 특정한 실례에서, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 세포 배양 배지로서 재구성될 때, 생존 세포 또는 조직 배양액에서 응고 활성을 유발하지 않는다.
상기 실례에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물의 한 가지 이점은 이들 조성물이 세포 또는 조직 배양액에서 응고를 전시하거나 또는 증진하지 않도록, 다시 말하면, 세포 또는 조직 배양액에 실제적으로 부정적인 충격을 주지 않는 단지 최소한의 응고만을 전시하도록 제조될 수 있다는 것이다. 일부 실례에서, 세포 배양 배지에서 최소한 50 wt%, 또는 약 10 wt%, 20 wt%, 또는 30 wt% 내지 약 50 wt%, 60 wt%, 또는 70 wt% 동결건조된 혈소판 용해물의 양은 응고를 전시하거나 또는 증진하지 않는다. LPLs의 저해된 응고 활성은 용해의 정도로부터 발생하는 것으로 생각된다. 다양한 정도의 혈소판 용해가 일어날 수 있다. 한 구체예에서, 혈소판 수치에 의해 조성물 내에 남아있는 공급원 혈소판의 최소한 15%가 용해되어 동결건조된 혈소판 용해물을 형성한다. 다른 구체예에서, 혈소판 수치에 의해 조성물 내에 남아있는 공급원 혈소판의 최소한 30%가 용해되어 동결건조된 혈소판 용해물을 형성한다. 또 다른 구체예에서, 혈소판 수치에 의해 조성물 내에 남아있는 공급원 혈소판의 최소한 약 50%가 용해되어 동결건조된 혈소판 용해물을 형성한다. 한 가지 실례에서, 혈소판 수치에 의해 조성물 내에 남아있는 공급원 혈소판의 최소한 70%가 용해되어 동결건조된 혈소판 용해물을 형성한다. 다른 실례에서, 혈소판 수치에 의해 조성물 내에 남아있는 공급원 혈소판의 최소한 90%가 용해되어 동결건조된 혈소판 용해물을 형성한다. 또 다른 실례에서, 혈소판 수치에 의해 조성물 내에 남아있는 공급원 혈소판의 최소한 99%가 용해되어 동결건조된 혈소판 용해물을 형성한다.
일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 세포 또는 조직 배양 배지로서 이용을 위해 재구성될 때, LPL 미립자 조성물이 용해되거나 또는 분산되는 용매의 외부에 임의의 추가적인 성분을 내포하지 않는다. 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 세포 배양 배지의 의도된 목적에 적합한 임의의 액체 배지를 이용하여 재구성될 수 있다. 일부 구체예에서, LPLs는 의도된 적용을 위한 적절한 농도에서 액체 배지 (가령, DMEM, 식염수, 혈장, DMSO, MEM 알파, RPMI, B-메르캅토에탄올, 비필수 아미노산, 나트륨 피루브산염, 글루타민 등, 또는 이들의 조합)에서 재구성될 수 있다. 일부 실례에서, LPL 미립자 조성물은 부피로 0.01% 내지 100%, 1% 내지 90%, 10% 내지 80%, 또는 20% 내지 70%의 범위에서 변하는 상이한 농도에서 재수화되고, 그리고 이의 소수성 막 내에서 리포솜 용액과 혼합될 수 있다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 용매 이외에, 추가 성분과 혼합될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 배양 배지는 당해 분야에서 공지된 다른 배양 배지 산물(들)과 혼합된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 활성 또는 생물학적 제제를 더욱 포함할 수 있다. 활성 또는 생물학적 제제는 항진균제, 항바이러스제, 항균제, 성장 인자 및/또는 배지의 의도된 용도에 특정한 다른 화학물질 중에서 최소한 하나를 포함할 수 있다. 활성 또는 생물학적 작용제의 양은 배지의 의도된 용도의 요구에 부합하는 임의의 농도일 수 있다. 임의의 추가적인 성분과 합동될 때, 배지 내에 합동된 LPLs 및 동결-건조된 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨의 양은 중량으로 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 40% 내지 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%에서 존재할 수 있다. 한 특정한 실례에서, 합동된 LPLs 및 동결-건조된 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨의 양은 약 20 wt% 내지 약 90 wt%, 또는 약 30 wt% 내지 약 80 wt%, 또는 약 40 wt% 내지 약 70 wt%일 수 있다. 세포 배양 배지는 생체내 또는 시험관내 용도를 위해 조제될 수 있다.
미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물의 활성은 연장된 기간 동안 안정될 수 있다. 한 구체예에서, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 -80℃에서 최소한 5 년 동안 보관될 때 안정될 수 있다. 다른 구체예에서, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 4℃에서 최소한 1 년 또는 심지어 더욱 긴 기간, 예를 들면, 최소한 2 년, 최소한 3 년 등 동안 보관될 때 안정될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 실온에서 최소한 1 년 동안 보관될 때 안정될 수 있다. 일부 구체예에서, 미립자 동결건조된 혈소판 조성물을 -80℃, 4℃ 또는 실온에서 최소한 12 개월 동안 보관하는 경우에, 조성물은 액체 배지에서 쉽게 재구성될 수 있고, 그리고 이의 성질, 예를 들면, 줄기 세포 배양액 성질 및 줄기 세포 증식 또는 분화에 대하여 실제적으로 충격을 받지 않는 세포 배양액에 대한 기능 및 지지를 실제적으로 또는 완전하게 유지한다. 다른 구체예에서, 미립자 동결건조된 혈소판 조성물은 심지어 상기 개설된 바와 같은 긴 기간 동안 보관될 때에도, 도말된 세포의 양을 24 시간 이내에 배증하는 능력을 유지한다.
미립자 동결건조된 혈소판 조성물은 1 년간 보관되고, 그 이후에 재구성된 후 지속된 다분화능에 대한 능력을 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 지방생성으로, 연골원성으로 및/또는 골원성으로 분화하는 줄기 세포를 성장시키는데 이용될 수 있다. 세포를 분화하는 배양된 배지의 능력은 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물 (재구성에 앞서)이 -80℃에서 최소한 1 년 동안, 4℃에서 최소한 1 년 동안, 또는 실온에서 최소한 1 년 동안 보관된 후 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 중간엽 줄기 세포가 세포 배양 배지에서 확대될 때, 중간엽 줄기 세포는 CD166, CD73, CD29, CD9, CD13, CD71 및 CD90 중에서 최소한 하나를 표현형적으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표현형 분석은 전술한 단백질의 최소한 90% 검출을 유발할 수 있다.
일부 구체예에서, 혈소판을 획득할 때, 전혈로부터 유래된 혈소판을 비롯한 임의의 혈소판 공급원이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 혈소판 공급원은 혈소판 풍부한 혈장일 수 있다. 한 구체예에서, 혈소판은 포유류 혈소판 공급원으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 혈소판은 비인간 동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 추가 구체예에서, 혈소판은 인간 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원에 상관없이, 혈소판은 임의의 감염체가 없도록 담보하기 위해 시험될 수 있다.
혈소판은 원하는 경우에, 당해 분야에서 공지된 임의의 방법을 이용하여 농축될 수 있다. 가령, 혈소판은 혈소판 내포 유체로부터 농축되어 혈소판 풍부한 부분을 형성할 수 있다. 농축 방법의 무제한적 실례는 원심분리 또는 상업적으로 가용한 혈소판 정제 장치를 포함할 수 있다.
혈소판 농축 후, 혈소판은 용해될 수 있다. 용해는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법을 이용하여 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 용해는 초음파처리, 용해를 유발하는 방식으로 실행된 여과 및/또는 동결 해동의 결과일 수 있다.
용해가 동결 해동 과정을 통해 발생할 때, 결과의 농축된 혈소판 물질, 예를 들면, 일부 실례에서, 농축된 혈소판 풍부한 부분은 예로서, 액체 질소로 약 -190℃에서 또는 드라이아이스 및 에탄올, 아세톤 등, 또는 다른 동결 보조 조성물, 기구 (가령, -80℃ 냉동기, 또는 다른 적합한 기구), 또는 이들의 조합을 이용하여 최소한 약 -80℃까지 동결될 수 있다. 다수의 동결 온도가 상기 열거된 것들 이외에 이용될 수 있다. 하지만, 일부 구체예에서, 동결 온도는 약 -80℃ 또는 그 미만일 수 있다. 다수의 혈소판이 수분 내에 동결되도록, 낮은 온도, 예를 들면, -80℃ 또는 그 미만이 표본, 또는 표본의 유의미한 비율을 신속하게 동결하는데 효과적일 수 있다. 일부 실례에서, 신속한 동결은 세포내 성분에 피해를 입힐 수 있는 큰 얼음 결정의 형성을 예방할 수 있고, 그리고 세포내 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨의 완전성을 더욱 효과적으로 보존할 수 있다. 따라서, 일부 실례에서, 혈소판을 충분히 낮은 온도에 노출시켜 표본, 또는 표본의 최소한 일부를 가능한 빨리, 예를 들면, 5 분, 10 분, 20 분, 30 분, 또는 60 분 이내에 동결하는 것이 유리할 수 있다. 하지만, 일부 실례에서, 완전한 동결은 수 시간의 기간, 예를 들면, 약 12 시간 내지 약 36 시간, 약 24 시간 내지 약 48 시간, 또는 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 최소한 36 시간, 최소한 48 시간, 또는 다른 적합한 기간이 소요될 수 있다. 해동에 앞서 표본의 완전한 동결은 단일 동결 해동 주기 동안 용해되는 혈소판의 양을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 추가적으로, 주기마다 더욱 철저한 동결은 혈소판의 적합한 용해를 달성하기 위해 수행되어야 하는 동결 해동 주기의 횟수를 감소시킬 수 있다. 적합한 양의 원하는 세포내 성분을 달성하기 위한 동결 해동 주기의 횟수를 감소시키는 것은 이들 성분에 가해지는 열 스트레스를 감소시킬 수 있다. 주목할 만한 것은 표본의 용적이 표본의 완전한 동결을 달성하는데 필요한 시간의 양에 영향을 줄 수 있다는 점이다. 가령, 더욱 큰 용적은 표본의 완전한 동결을 달성하기 위해 더욱 긴 기간을 필요로 할 수 있다.
표본의 완전한 동결을 달성하기 위한, 한 가지 실례에서와 같은 기간 동안 동결한 후, 농축된 혈소판 물질은 실온을 초과하여, 예를 들면, 30℃ 내지 45℃, 34℃ 내지 40℃, 30℃ 내지 35℃, 39℃ 내지 45℃까지, 또는 한 가지 실례에서, 약 37℃에서 빠르게 해동될 수 있다. 이러한 동결 해동 주기는 이후, 혈소판 용해물의 농도를 증가시키기 위해 반복될 수 있다. 일부 실례에서, 혈소판의 단일 동결 해동 주기는 -80℃ 또는 그 미만의 온도에서 최소한 48 시간의 기간 동안 수행될 수 있다. 추가 동결 해동 주기가 수행되는 일부 실례에서, 각 추가 주기는 약 24 시간 내지 약 48 시간의 기간 동안 수행될 수 있다.
일반적으로, 실행되는 주기가 많을수록, 더욱 많은 혈소판이 용해될 것이다. 추가 용해가 발생할 때, 증가된 양의 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨이 결과의 물질 내에 존재할 것이다. 동결 해동 주기의 양은 미리 결정된 정도의 용해가 발생할 때까지 반복될 수 있다. 용해의 미리 결정된 정도는 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 70%, 또는 최소한 90% 세포용해일 수 있다. 일부 실례에서, 최소한 48 시간의 동결 기간을 갖는 단일 또는 첫 번째 동결 해동 주기는 혈소판 공급원에서 최소한 35% 또는 약 35% 내지 약 45%의 혈소판을 용해할 수 있고, 그리고 용해물의 ml당 최소한 60 ng의 방출된 성장 인자 및 다른 세포 성분, 예를 들면, 사이토킨 및 케모킨을 제공할 수 있다. 일부 실례에서, 2회 동결 해동 주기 (여기서 추가 주기에 대한 동결 기간은 24 시간 내지 48 시간이다)는 혈소판 공급원에서 최소한 55% 또는 약 55% 내지 약 65%의 혈소판을 용해할 수 있고, 그리고 용해물의 ml당 최소한 90 ng의 방출된 성장 인자 및 다른 세포 성분, 예를 들면, 사이토킨 및 케모킨을 제공할 수 있다. 일부 실례에서, 3회 동결 해동 주기 (여기서 추가 주기에 대한 동결 기간은 24 시간 내지 48 시간이다)는 혈소판 공급원에서 최소한 65% 또는 약 65% 내지 약 75%의 혈소판을 용해할 수 있고, 그리고 용해물의 ml당 최소한 140 ng의 방출된 성장 인자 및 다른 세포 성분, 예를 들면, 사이토킨 및 케모킨을 제공할 수 있다. 일부 실례에서, 4회 동결 해동 주기 (여기서 추가 주기에 대한 동결 기간은 24 시간 내지 48 시간이다)는 혈소판 공급원에서 최소한 75% 또는 약 75% 내지 약 85%의 혈소판을 용해할 수 있고, 그리고 용해물의 ml당 최소한 190 ng의 방출된 성장 인자 및 다른 세포 성분, 예를 들면, 사이토킨 및 케모킨을 제공할 수 있다. 일부 실례에서, 5회 동결 해동 주기 (여기서 추가 주기에 대한 동결 기간은 24 시간 내지 48 시간이다)는 혈소판 공급원에서 최소한 90% 또는 약 90% 내지 약 100%의 혈소판을 용해할 수 있고, 그리고 용해물의 ml당 최소한 230 ng의 방출된 성장 인자 및 다른 세포 성분, 예를 들면, 사이토킨 및 케모킨을 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 1회 내지 모든 동결 해동 주기는 여과가 뒤따를 수 있다. 일부 실례에서, 여과는 동결 해동 용해에 앞서 또는 동결 해동 용해와는 별개로 이용될 수 있다. 복수의 용해물을 여과하거나, 또는 최소한 부분적으로 여과하는 것은 세포 조직파편, 예를 들면, 용해된 막 및 다른 큰 입자뿐만 아니라 무손상 혈소판을 부분적으로, 실제적으로 또는 완전히 제거하고, 따라서 깨끗하고 농축된 혈소판 용해물 조성물을 제공할 수 있다. 따라서, 결과의 용해물은 용해 동안 혈소판으로부터 방출되는 최소한 50 wt%, 최소한 70 wt%, 또는 최소한 90 wt% 성장 인자, 사이토킨, 케모킨, 또는 이들의 조합의 고형물 함량을 포함할 수 있다. 추가적으로, 여과는 소정의 표본에서 달성되는 혈소판 용해의 양을 약 5% 내지 약 15%, 또는 15% 이상 증가시킬 수 있다. 가령, 단일 동결 해동 주기가 표본에서 약 40%의 혈소판의 혈소판 용해를 달성한 경우에, 상기 표본의 차후 여과는 일부 실례에서, 혈소판 용해를 약 42% 내지 약 46%, 또는 그 이상까지 증가시킬 수 있다. 여과는 또한, 혈소판 용해물에서 잠재적 세균 오염의 양을 감소시킬 수 있다.
다수의 적합한 필터 막이 이용될 수 있다. 전형적으로, 필터 막은 낮은 단백질 결합 친화성을 가질 수 있고 및/또는 생물학적 표본에서 이용에 적합할 수 있다. 일부 실례에서, 필터 막은 폴리비닐 이플루오르화물 (PVDF), 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 재생된 셀룰로오스 (RC), 폴리에틸렌 (PE), 폴리카보네이트 트랙 에칭됨 (PCTE), 폴리에스테르 트랙 에칭됨 (PETE), 폴리에테르술폰 (PES), 비대칭 PES, 셀룰로오스 아세트산염 (CA) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 물질로 만들어질 수 있다. 일부 실례에서, 필터 막은 약 0.1 마이크론 내지 0.3 마이크론, 예를 들면, 약 0.22 마이크론, 약 0.2 마이크론, 또는 약 0.1 마이크론의 구멍 크기를 가질 수 있다. 일부 실례에서, 필터 막은 전여과 막 또는 층, 예를 들면, 유리 극세사, 비대칭 폴리에테르술폰, 또는 다른 적합한 프리필터를 가질 수 있다. 일부 실례에서, 혈소판 용해물 표본은 중량 압력을 통해 필터를 통과하도록 허용될 수 있다. 다른 실례에서, 필터를 통한 표본의 통과를 촉진하기 위해 진공 또는 양압이 혈소판 용해물 표본에 적용될 수 있다. 일반적으로, 양압 또는 음압 하에 여과는 혈소판 용해물 표본에서 혈소판 용해의 양을 증가시킬 수 있다. 도입된 양압 또는 음압이 더욱 높을수록, 혈소판 용해에서 증가가 더욱 크다.
혈소판 용해물이 여과된 후, 이들은 표준 동결건조 기술을 이용하여 동결건조되거나 또는 동결-건조될 수 있다. 가령, 여과된 혈소판 용해물은 액체 질소에서 동결되거나 또는 드라이아이스 및 에탄올 또는 아세톤 용액에서 동결될 수 있다. 동결한 후, 표본은 동결건조기에 유동적으로 연계되고, 그리고 표준 동결건조 파라미터 하에 미리 결정된 건조도까지 건조되도록 허용될 수 있다. 가령, 표본은 15 wt%보다 적은 수분 함량, 10 wt%보다 적은 수분 함량, 7 wt%보다 적은 수분 함량, 5 wt%보다 적은 수분 함량, 3 wt%보다 적은 수분 함량, 또는 1 wt%보다 적은 수분 함량을 갖도록 건조될 수 있다. 장기간 보관을 위해, 표본이 3 wt%보다 적은 또는 1 wt%보다 적은 수분 함량을 가질 때까지 표본을 동결-건조시키는 것이 바람직할 수 있다. 일단 혈소판 용해물이 동결건조되면, 이것은 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 형성할 수 있다. 일단 건조되면, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 혈소판 용해 동안 혈소판으로부터 방출되는 최소한 50 wt%, 최소한 70 wt%, 또는 최소한 90 wt% 성장 인자, 사이토킨, 케모킨, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 앞서 설명된 바와 같이, 세포 조직파편 및 무손상 혈소판은 조성물 내에 용해물의 농도 또는 효능을 증가시키기 위해 여과 단계 동안 주로 제거될 수 있다.
언급된 바와 같이, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 세포-배양된 배지의 의도된 목적에 적합한 임의의 액체 배지를 이용하여 재구성될 수 있다. LPLs로 농축된 이러한 유형의 배지는 인간 혈소판이 연구 또는 치료 적용에 이용될 때, 포유류 세포, 특히 인간 세포를 배양하는데 이용될 수 있다. 주목해야 할 것은 LPLs가 다양한 조직으로부터 중간엽 줄기 세포, 인간 배아 줄기 세포, 각질세포, 심근세포, 그리고 인체 내에 많은 다른 세포 유형을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 유형의 세포 또는 조직을 성장시키거나 또는 도출하는데 유용하다는 점인데, 그 이유는 본 발명에 따라서 제조된 동결건조된 혈소판 용해물이 세포 및 조직의 성장을 허용할 뿐만 아니라 장기 및 이들의 기능을 유지시키는 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨을 내포하기 때문이다.
일부 실례에서, 배양 배지는 상이한 LPL 표본으로 만들어질 수 있다. 가령, 배양 배지는 부분적으로, 낮은 횟수의 동결 해동 주기를 이용하여 획득된 LPL 표본 및 부분적으로, 높은 횟수의 동결 해동 주기를 이용하여 획득된 LPL 표본으로 만들어질 수 있다. 일부 실례에서, 이것은 동결 해동 주기의 횟수가 상이한 세포 성분에 대한 다른 효과를 가질 수 있다는 점에서 유리할 수 있다. 가령, 일부 세포 성분은 더욱 낮은 정도의 세포용해를 유도하는 조건 하에 더욱 유력할 수 있고, 반면 다른 세포 성분은 더욱 높은 정도의 세포용해를 유도하는 조건 하에 더욱 유력할 것이고, 그리고 그 반대일 수 있다.
일부 실례에서, 세포 배양 혼합물 배지를 형성하기 위해 추가 배양 배지가 LPL 배양 배지와 혼합될 수 있다. 일부 실례에서, 추가 배양 배지는 약 10 wt% 내지 약 90 wt%, 약 20 wt% 내지 약 80 wt%, 또는 약 30 wt% 내지 약 70 wt%의 세포 배양 혼합물 배지를 포함할 수 있다. 일부 실례에서, 세포 배양 혼합물 배지는 세포 배양 배지가 -80℃, 4℃ 또는 실온에서 최소한 1 년 동안 보관된 후, 도말된 세포의 양을 24 시간 이내에 배증하는 세포 배양 배지의 능력을 유지할 수 있다.
세포 배양 배지는 큰 배치에서 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 배양 배지는 약 0.5L 내지 약 1000L, 1L 내지 500L, 10L 내지 1000L 등의 배치 크기에서 제조된다. 더욱 특정하게는, 배치 크기는 각각 약 0.5L, 1L, 10L, 100 L, 200 L, 400 L, 500 L, 또는 750L일 수 있다. 큰 배치 크기를 생산하는 능력은 감소된 로트별 가변성을 갖는 배양된 배지를 유발할 수 있다.
명백한 성격의 다양한 변화와 변형이 개시된 기술 구체예의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있고, 그리고 이와 같은 모든 변화와 변형이 첨부된 청구항을 비롯한 본원에서 언급된 바와 같은 기술의 범위에 들어가는 것으로 고려된다는 것은 당업자에게 쉽게 명확할 것이다. 이런 변화와 변형의 한 가지 실례는 추가 성분을 배양 배지에 통합하고 및/또는 본원에서 진술된 것들 중간의 보관 온도를 이용하는 것을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
실시예
다음 실시예는 현재 최적으로 알려져 있는 본 발명의 구체예를 예증한다. 하지만, 다음은 본 발명의 원리의 적용의 단지 예시이거나 또는 전형인 것으로 이해된다. 다양한 변형 및 대안적 조성물, 방법과 시스템이 본 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 창안될 수 있다. 첨부된 청구항은 이런 변형과 배열을 커버하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명이 앞서 특정하게 설명되긴 했지만, 다음 실시예는 가장 실질적인 구체예인 것으로 현재 간주되는 것과 관련하여 추가 상세를 제공한다.
실시예 1 - 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물 및 재구성된 세포 배양 배지의 제조
말초혈은 처리 동안 혈액의 응고를 예방하기 위한 적절한 양의 항응고제로 수집된다. 본 실시예에서, 35 mL의 혈액이 수집되는데, 이것은 이후, 오프 모드로 설정된 브레이크로 4℃에서 10 분 동안 200 x g (1000 rpm)에서 원심분리된다. 원심분리 후, 혈소판 풍부한 부분은 이전되고, 그리고 혈소판 풍부한 부분의 튜브는 24 시간의 기간 동안 -190℃ 내지 -80℃의 동결 범위 내로 배치된다. 24 시간 후, 혈소판은 37℃에서 빠르게 해동함으로써 용해된다. 해동한 후, 튜브는 여과되고, 그리고 24 시간의 기간 동안 동일한 동결 범위 내에 다른 동결 주기에 복귀된다. 동결 해동 주기 (1회 동결 주기, 그 이후에 1회 해동 주기)는 최소한 추가 1회 반복되고, 그리고 더욱 전형적으로, 총 3 주기, 예를 들면, 3 내지 6 동결 해동 주기 동안 최소한 2회 반복된다. 1회 또는 그 이상의 동결 해동 주기 이후에, 용해된 혈소판은 세포 막 및 조직파편을 제거하기 위해 여과될 수 있다. 초음파처리, 여과 등이 또한, 본원에서 설명된 동결 해동 주기에 대하여 대안으로 또는 부가적으로, 혈소판을 용해하거나 또는 수집하는데 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 최종 동결 해동 주기 후, 튜브는 -80℃에서 재동결되고 하룻밤 동안 보관된다. 다음 날, 튜브는 -84℃에서 48 시간 동안 0.008 mBar 하에 FreeZone 2.5 플러스 (Labconco)를 이용하여 동결건조된다. 동결건조는 또한, 추가 혈소판을 더욱 용해할 수 있다. 동결건조되는 총 부피에 따라, 시간은 48 시간을 뛰어넘어 증가될 수 있다. 유사하게, 일부 구체예에서, 시간은 어느 정도까지 감소될 수 있다. 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물이 형성된다. 상기 조성물은 이후, 액체 배지에서 재구성되고, 교반되고, 가열되고, 그리고 페트리 접시 또는 시험관 내로 부어질 수 있다.
실시예 2 - 중간엽 줄기 세포 연구
실시예 1에서 설명된 바와 유사하게 제조된 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 각각, -80℃, 4℃ 및 실온에서 3, 6, 9 및 12 개월 동안 보관되었다. 이들 보관 기간 후, 재구성된 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 유세포분석법, 세포 형태, 배증 비율, 그리고 탯줄 유래된 중간엽 줄기 세포에서 분화 잠재력에 근거하여, 상업적으로 제조된 배지 XcytePLUSTM (iBiologicsTM, LLC, Arizona로부터 가용하고, 그리고 -80℃에서만 보관됨)와 기능에서 비교되었다. 주목해야 할 것은 XcytePLUSTM는 4℃에서 또는 실온에서 긴 기간 동안 보관될 수 없다는 점이다.
유세포분석법
모든 인간 혈소판 용해물 조건에서 확대된 중간엽 줄기 세포의 표현형 분석은 유세포분석법을 이용하여 시험되었다. 90% 양성 결과 또는 그 이상이 앞서 설명된 다양한 조건에서 보관된 모든 배양된 배지에서 CD166, CD73, CD29, CD9, CD13, CD71 및 CD90에 대해 확인되었다. CD106, HLA-DR -DP -DQ, CD86, CD137, CD133/2 및 Stro1에 대한 긍정적인 결과는 거의 또는 전혀 지시되지 않았다.
형태
도립 광학 검경이 모든 인간 단백질 용해물 조건에서 확대된 세포에 대한 중간엽 줄기 세포 형태를 평가하는데 활용되었다. 설명된 다양한 조건에서 보관된 모든 배양된 배지는 안정된 형태를 유발하였다.
성장 곡선
냉동보존된 계대 3 탯줄 유래된 중간엽 줄기 세포는 10% 인간 혈소판 용해물로 보충된 배지에서 2100 세포/cm2로 도말되었다. 세포는 80-90% 합류점에서 수확되고 2회 추가 계대를 위해 재도말되었다. 각 조건에 대한 성장된 중간엽 줄기 세포의 배증 시간은 통계학적으로 계산되었다. 다양한 조건 및 보관 기간에서 보관된 모든 배양된 배지는 20-25 시간 사이의 기간에서 배증을 유발하였다. 성장 곡선 시험의 결과는 도면 1에서 도시된다.
분화 잠재력
인간 혈소판 조건에서 확대된 중간엽 줄기 세포의 다분화능은 지방생성, 연골원성 및 골원성 분화에 대해 시험되었다. 이들 결과는 앞서 설명된 바와 같은 다양한 조건 및 보관 기간에서 보관된 모든 배양된 배지가 세포 분화를 유발했다는 것을 지시한다. 도면 2는 분화 키트 (Life Technologies, Grand Island, NY로부터)를 이용하여 촬영된 분화의 이미지를 전시한다.
실시예 3 - 혈소판 용해 연구
혈소판 풍부한 표본은 실시예 1에서 설명된 바와 동일한 방식으로 획득되었다. 혈소판 풍부한 표본은 48 시간의 기간 동안 -190℃ 내지 -80℃의 동결 범위 내로 배치된다. 48 시간 후, 혈소판은 37℃에서 빠르게 해동함으로써 용해된다. 표본의 첫 번째 세트는 단일 동결 해동 주기 후, 용해된 세포의 양을 결정하기 위해 검정되었다. 추가 표본은 24 시간 내지 48 시간의 기간 동안 재동결되고, 그리고 각각, 총 2회, 3회, 4회 및 5회 주기 동안 앞서 설명된 바와 같이 재해동되었다. 본 연구의 결과는 도면 3에서 묘사된다. 도면 3에서 목격될 수 있는 바와 같이, 모든 혈소판의 완전한 용해는 5 동결 해동 주기로 달성되었다. 대조적으로, 단일 동결 해동 주기는 단지 약 40% 용해만을 달성하였다.
추가적으로, 이용된 동결 해동 주기의 횟수에 비하여 획득된 각 개별 성장 인자의 양을 결정하기 위해, 3가지 특정한 성장 인자가 각 시험 표본에 대해 모니터링되었다. 도면 4에서 목격될 수 있는 바와 같이, 더욱 큰 횟수의 동결 해동 주기는 더욱 큰 숫자의 용해된 세포뿐만 아니라 더욱 많은 양의 성장 인자를 달성하였다. 따라서, 이용된 동결 해동 주기의 횟수가 더욱 클수록, 용해된 혈소판의 숫자가 더욱 크고, 그리고 획득될 수 있는 성장 인자 및 다른 세포 성분의 양이 더욱 많다.
실시예 4 - 미립자 동결건조된 혈소판 용해물의 특징화
표본은 상기 실시예 1에 따라서 삼중으로 제조되었다. 표적 세포 성분 중에서 어느 것이 어떤 양으로 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 내에 존재하는 지를 결정하기 위해 다양한 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨이 모니터링되었다. 결과는 아래의 표 1에서 묘사된다 (모든 값은 표본의 밀리리터당 세포 성분의 피코그램이다 (pg/ml):
표 1: 세포 성분에 대한 동결건조 및 세포 용해의 효과
평균 (pg/ml)
BMP-5 0
BMP-7 0
CD84 0
EGF R 113
프랙탈카인 293
갈렉틴-1 78
IFNab R2 655
IGFBP-1 165
IL-10 Ra 11
IL-13 R2 371
인슐린 62
페리오스틴 1,173
TNFb 316
TRANCE 1,657
WISP-1 1,580
ACE-2 14,037
알부민 14,137
BMP-2 142
IGFBP-3 7,881
PF4 13,712
표 1로부터 목격될 수 있는 바와 같이, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물은 세포 배양 배지 및 다른 적용에서 이용에 유익할 수 있는 다양한 상이한 세포 성분을 포함한다.
실시예 5 - 응고 연구
미립자 동결건조된 혈소판 용해물은 상기 실시예 1에 따라서 제조되었다. 미립자 동결건조된 혈소판 용해물은 50 wt%보다 큰 양으로 물에서 재구성되었다. 조성물은 페트리 접시에 첨가되고, 그리고 상기 조성물의 응고 속도를 결정하기 위해 모니터링되었다. 하지만, 표본에서 응고는 관찰되지 않았다.
미립자 동결건조된 혈소판 용해물의 응고 활성을 더욱 시험하기 위해, 표본이 앞서 설명된 바와 같이 제조되었고, 그리고 응고 속도를 결정하기 위해 트롬빈이 조성물에 부가적으로 첨가되었다. 이번에도, 표본에서 응고는 관찰되지 않았다.
실시예 6 - 줄기 세포 회수 연구
미립자 동결건조된 혈소판 용해물은 상기 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조되었다. 표본은 1 년 동안 실온에서 보관되었다. 1 년 보관 기간 후, 표본은 최소한 50 wt%의 농도에서 무균수에서 재구성되었다. 재구성된 미립자 동결건조된 혈소판 용해물은 장기간 보관된 용해물과 함께 배양된 중간엽 줄기 세포의 퍼센트 회수를 결정하기 위해, 배양 배지로서 중간엽 줄기 세포 배양액과 합동되었다. 3개의 별개의 표본에서, 줄기 세포는 실온에서 1 년 동안 보관 이후에도 각각, 98%, 96% 및 99% 회수되었다.
상기 실시예가 본원에서 논의된 원리 및 개념을 예증하긴 하지만, 실행의 형태, 용법 및 상세에서 다양한 변형이 발명 재능의 실시 없이, 그리고 이들 원리와 개념으로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 이들 원리와 개념은 아래에 진술된 특허청구범위에 의한 것을 제외하고, 한정되지 않는 것으로 의도된다.

Claims (56)

  1. 세포 배양 배지로서 이용에 적합하고 공급원 혈소판의 용해로부터 방출된 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨을 포함하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물에 있어서, 공급원 혈소판으로부터 세포 조직파편은 여과에 의해 최소한 부분적으로 제거되고, 그리고 상기 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨은 동결건조되어 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 형성하는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨은 조성물 내에 최소한 30%의 공급원 혈소판으로부터 용해에 의해 방출되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨은 조성물 내에 최소한 50%의 공급원 혈소판으로부터 용해에 의해 방출되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨은 조성물 내에 최소한 70%의 공급원 혈소판으로부터 용해에 의해 방출되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨은 조성물 내에 최소한 90%의 공급원 혈소판으로부터 용해에 의해 방출되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 조성물은 -80℃에서 보관될 때 최소한 5 년 동안 미립자 형태에서 안정되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 조성물은 4℃에서 보관될 때 최소한 1년 동안 미립자 형태에서 안정되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 조성물은 실온에서 보관될 때 최소한 1년 동안 미립자 형태에서 안정되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 조성물은 시험관내 이용을 위해 조제된 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 조성물은 생체내 이용을 위해 조제된 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 공급원 혈소판은 인간 이외의 포유류 혈소판 공급원으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 공급원 혈소판은 인간 혈소판 공급원으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 액체 배지로 재구성되어 세포 배양 배지를 형성하는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  14. 청구항 1에 있어서, 조성물은 복수의 무손상 혈소판을 유지하는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  15. 청구항 1에 있어서, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 실온에서 최소한 12 개월 동안 보관하는 것은 초기에 제조된 미립자 동결건조된 혈소판 용해물과 비교할 때 및 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물이 세포 배양 배지로서 재구성될 때 줄기 세포 증식 또는 분화에 실제적으로 영향을 주지 않는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  16. 청구항 1에 있어서, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물은 용해된 혈소판으로부터 세포 조직파편을 포함하는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  17. 청구항 1에 있어서, 혈소판 용해에 의해 산출된 세포 조직파편은 동결건조된 혈소판 용해물 조성물의 미립자 형태를 형성하기 위한 동결건조에 앞서, 조성물로부터 최소한 부분적으로 여과되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  18. 청구항 1에 있어서, 혈소판 용해에 의해 산출된 세포 조직파편은 동결건조된 혈소판 용해물 조성물의 미립자 형태를 형성하기 위한 동결건조에 앞서, 여과에 의해 실제적으로 제거되거나 또는 완전히 제거되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  19. 청구항 1에 있어서, 조성물은 3 wt%보다 적은 물을 갖는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.
  20. 청구항 1에 있어서, 조성물은 최소한 50 wt% 성장 인자, 케모킨, 사이토킨, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 성장 인자, 케모킨, 사이토킨, 또는 이들의 조합은 혈소판 용해 동안 혈소판으로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물.

  21. 액체 배지에서 재구성된 미립자 동결건조된 혈소판 용해물을 포함하는 세포 배양 배지에 있어서, 세포 배양 배지는 배양 중인 세포 또는 조직의 응고 활성을 전시하지 않는 농도에서 조제되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  22. 청구항 21에 있어서, 미립자 동결건조된 혈소판 용해물은 약 20 wt% 내지 약 70 wt%의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  23. 청구항 21에 있어서, 세포 배양 혼합물 배지를 형성하기 위해 함께 혼합된 추가 배양 배지를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  24. 청구항 23에 있어서, 추가 배양 배지는 10 wt% 내지 90 wt%의 세포 배양 혼합물 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  25. 청구항 23에 있어서, 세포 배양 혼합물 배지는 세포 배양 배지가 -80℃, 4℃ 또는 실온에서 최소한 1 년 동안 보관된 후, 도말된 세포의 양을 24 시간 이내에 배증 (doubling)하는 능력을 유지하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  26. 청구항 21에 있어서, 세포 배양 배지는 초기에서뿐만 아니라 실온에서 1 년 동안 보관된 후에도 지속된 다분화능을 전시하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  27. 청구항 21에 있어서, 세포 배양 배지는 초기에서뿐만 아니라 실온에서 1 년 동안 보관된 후에도 줄기 세포를 지방생성으로, 연골원성으로 및 골원성으로 분화하는 능력을 전시하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  28. 청구항 21에 있어서, 세포 배양 배지는 중간엽 줄기 세포를 확대하는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  29. 청구항 28에 있어서, 세포 배양 배지에서 확대된 중간엽 줄기 세포는 CD166, CD73, CD29, CD9, CD13, CD71 및 CD90 중에서 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  30. 청구항 21에 있어서, 항진균제, 항바이러스제, 항생제 및 성장 인자로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 활성제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  31. 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 제조하기 위한 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    혈소판 및 유체 담체를 포함하는 혈소판 공급원을 획득하는 단계;
    혈소판을 용해하여 복수의 용해물을 형성하는 단계;
    용해 후 복수의 용해물을 여과하여 세포 조직파편을 제거하는 단계; 및
    복수의 용해물을 동결건조시켜, 가용한 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨의 방출된 농축물을 갖는 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 형성하는 단계.
  32. 청구항 31에 있어서, 생존 세포 또는 조직 배양액에서 응고 활성을 유발하지 않는 농도에서 액체 배지에서 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 재구성하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 농도는 약 20 wt% 내지 약 70 wt%인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 청구항 31에 있어서, 혈소판 공급원을 획득하는 단계는 혈소판-내포 유체로부터 혈소판을 농축하여 혈소판 풍부한 부분을 형성하는 것을 포함하고, 그리고 혈소판을 용해하는 단계는 혈소판 풍부한 부분으로부터 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 농축 단계는 원심분리에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 청구항 31에 있어서, 혈소판 공급원은 전혈인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 청구항 31에 있어서, 혈소판 공급원은 혈소판 풍부한 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 청구항 31에 있어서, 혈소판 공급원은 인간으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 청구항 31에 있어서, 용해 단계는 혈소판 공급원에서 동결 해동 주기를 이용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 단일 동결 해동 주기는 혈소판 공급원에서 최소한 35%의 혈소판을 용해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 청구항 39에 있어서, 동결 해동 주기 동안 동결은 최소한 48 시간의 기간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 청구항 39에 있어서, 동결 해동 주기는 미리 결정된 정도의 세포용해가 발생할 때까지 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 각각의 동결 해동 주기 동안 동결은 최소한 24 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 청구항 42에 있어서, 미리 결정된 정도의 세포용해는 혈소판 수치에 의한 최소한 30% 세포용해인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 청구항 42에 있어서, 최소한 하나의 동결 해동 주기는 세포막 및 조직파편을 제거하기 위해 복수의 용해물을 여과하는 것에 의해 이어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 여과는 폴리비닐 이플루오르화물 (PVDF), 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 재생된 셀룰로오스 (RC), 폴리에틸렌 (PE), 폴리카보네이트 트랙 에칭됨 (PCTE), 폴리에스테르 트랙 에칭됨 (PETE), 폴리에테르술폰 (PES), 비대칭 PES, 셀룰로오스 아세트산염 (CA) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 여과 막을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 여과 막은 약 0.1 마이크론 내지 0.3 마이크론의 구멍 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 청구항 46에 있어서, 여과는 여과 막에 더하여 프리필터를 이용하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 청구항 31에 있어서, 용해 단계는 혈소판 공급원에서 초음파처리를 이용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 청구항 31에 있어서, 용해 단계는 혈소판 공급원에서 여과를 이용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 세포 또는 조직을 배양하는 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    청구항 1 내지 20 중에서 어느 한 항의 미립자 동결건조된 혈소판 용해물 조성물을 재구성하여 세포 배양 배지를 형성하는 단계; 및
    세포 또는 조직을 세포 배양 배지와 접촉시켜 배양 중인 세포 또는 조직을 형성하는 단계.
  52. 청구항 51에 있어서, 배양 중인 세포 또는 조직은 중간엽 줄기 세포, 인간 배아 줄기 세포, 각질세포, 또는 심근세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 청구항 51에 있어서, 배양 중인 세포 또는 조직은 중간엽 줄기 세포로부터 유래되고, 그리고 상기 중간엽 줄기 세포는 탯줄로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 세포 또는 조직을 배양하는 방법에 있어서, 세포 또는 조직을 세포 배양 배지와 접촉시켜 청구항 21 내지 30 중에서 어느 한 항의 배양 중인 세포 또는 조직을 형성하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, 배양 중인 세포 또는 조직은 중간엽 줄기 세포, 인간 배아 줄기 세포, 각질세포, 또는 심근세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 청구항 54에 있어서, 배양 중인 세포 또는 조직은 중간엽 줄기 세포로부터 유래되고, 그리고 상기 중간엽 줄기 세포는 탯줄로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
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