ES2582369T3

ES2582369T3 - Método optimizado y definido para el aislamiento y la preservación de células precursoras de cordón umbilical humano

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Publication number: ES2582369T3
Application number: ES08807881.1T
Authority: ES
Inventors: Rita Isabel Ganchas Soares; Maria Constança BAPTISTA COELHO; Jorge Miguel Silva Santos; José Paulo MARTINS; Vera Alexandra Basto; Pedro Estilita Monteiro Da Cruz; Helder Joaquim Soares Da Cruz
Original assignee: Laboratorio Medinfar-Produtos Farmaceuticos S A; Laboratorio Medinfar-Produtos Farmaceuticos Sa
Current assignee: Laboratorio Medinfar-Produtos Farmaceuticos S A; Laboratorio Medinfar-Produtos Farmaceuticos Sa
Priority date: 2007-10-04
Filing date: 2008-10-03
Publication date: 2016-09-12
Anticipated expiration: 2028-10-03
Also published as: JP5785394B2; WO2009044379A3; WO2009044379A2; CN101868536B; IL204788A; CA2701907A1; US9546353B2; IL204788A0; EP2203555B1; CN101868536A; AU2008306442B2; EP2203555A2; PT103843B; BRPI0817522A2; ZA201002260B; US20100216237A1; MX2010003511A; EA201000425A1; PT103843A; EA025532B1

Abstract

Método de selección para aislar células de la matriz del codón umbilical humano caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) Una etapa de recuperación en la que el cordón umbilical humano se transportado a las instalaciones del laboratorio en un recipiente cerrado estéril, bien seco o sumergido en una solución tampón estéril, con o sin antibióticos, que preferentemente contiene 186 μg/ml de CaCl2·2H2O, 400 μg/ml de KCl, 60 μg/ml de K2HPO4, 200 μg/ml de MgSO4·7H2O, 8000 μg/ml de NaCl, 350 μg/ml de NaHCO3, 90 μg/ml de NaH2PO4 · 7H2O, 2000 μg/ml de glucosa, 10 U/ml de penicilina y 10 μg/ml de estreptomicina; preferentemente a temperatura ambiente si se procesa en un periodo de 72 h, o entre 2 y 8 ºC, preferentemente a 4 ºC, si se procesa en un periodo entre 48 y 144 h después de la recogida; b) Tres etapas de lavado del cordón umbilical con una solución salina estéril, que contiene preferentemente 186 μg/ml de CaCl2,2H2O, 400 μg/ml de KCl, 60 μg/ml de K2HPO4, 200 μg/ml de MgSO4·7H2O, 8000 μg/ml de NaCl, 350 μg/ml de NaHCO3, y 90 μg/ml de NaH2PO4·7H2O; c) Una etapa de retirada de la membrana amniótica externa, donde la membrana amniótica se retira con la ayuda de pinzas estériles; d) Una etapa de fraccionamiento donde el cordón umbilical se fracciona transversalmente a lo largo de su eje longitudinal con ayuda de un escalpelo para producir fracciones de 2,5 cm (2,5 g); e) Una etapa de eliminación de coágulos de las fracciones resultantes de d), donde se realizan incisiones, con la ayuda de un escalpelo, en la ubicación donde los coágulos se identifican, y donde los coágulos se eliminan; f) Una etapa de agrupamiento donde las fracciones resultantes de e) se reúnen en grupos de 7, que se procesarán de manera independiente en las siguientes etapas; g) Una etapa de disociación celular para cada grupo de 7 fracciones, resultantes de f), llevadas a cabo en un matraz estéril y precintado que contiene una solución de digestión con pH tamponado, mediante la acción combinada de la colagenasa II y tripsina, donde la colagenasa II está a una concentración entre 0,0375 % y 0,075 % (peso/volumen de digestión total) y la tripsina está a una concentración de 0,125 % (peso/volumen de digestión total); manteniendo una relación constante entre la masa de tejido (gramos), el área superficial de la parte inferior del matraz (cm2), volumen de digestión (ml), y el volumen total del matraz (ml), de aproximadamente 1:2:2:37; y donde el matraz se incuba en condiciones definidas de tiempo de incubación, temperatura, dispersión térmica, humedad ambiente y agitación; más específicamente, comenzando a partir de un grupo de 7 fracciones de cordones umbilicales con aproximadamente 2,5 g cada uno, exento de coágulos de sangre; utilizando un volumen de solución de digestión de 35 ml; en un matraz de cultivo no ventilado y cerrado tal como un T175 con un volumen total de 650 ml, y un espacio de cabeza durante la digestión de 615 ml menos el volumen sumergido de las 7 fracciones en digestión; y donde la solución de digestión consiste en, además de enzimas, 186 μg/ml de CaCl2·2H2O, 400 μg/ml de KCl, 60 μg/ml de K2HPO4, 200 μg/ml de MgSO4·7H2O, 8000 μg/ml de NaCl, 350 μg/ml de NaHCO3, 90 μg/ml de NaH2PO4·7H2O, 1000 μg/ml de glucosa, y 76 μ/ml (0,260 mM) de EDTA; manteniendo el pH a 6,4 o superior; y donde la reacción enzimática se incuban durante un período de 4 h; a una temperatura constante de 37 ºC; en una incubadora seca cerrada; con agitación a una velocidad constante de 100 o 140 oscilaciones.min-1 (opm); preferentemente 100 opm, h) Una primera etapa de recuperación de las células disociadas del tejido, como se describe en g), que se recuperan mediante incubación horizontal estática del matraz cuando la digestión tiene lugar; durante un periodo de tiempo de 5 a 300 minutos, preferentemente de 30 minutos; a temperatura ambiente; seguido por transferencia del sobrenadante de la digestión por medio de pipeteado, evitando la succión de cualquier tejido sin digerir, a un tubo de centrífuga de 50 ml; que a su vez va seguida de la eliminación de todo el tejido sin digerir del matraz de digestión; al que se añaden 35 ml de medio de cultivo basal suplementado con desoxirribonucleasas, ribonucleósidos, glutamina, antibióticos y 10 % de suero de feto bovino (FBS) y antibióticos; y en el que el tapón del matraz no venteado se sustituyó por un filtro que contenía un tapón venteado; seguido por incubación a 37 ºC, en una atmósfera humidificada que contenía un 7 % de CO2; con cambios del medio de cultivo cada 72 h para estimular la adhesión y el crecimiento/multiplicación celular hasta obtener la máxima confluencia en la superficie; i) Una segunda etapa de recuperación de células, donde las células disociadas del tejido, como se describe en g) y contenidas en el sobrenadante de centrifugación obtenido como se describe en h) se recuperan mediante centrifugación del tubo de centrífuga de 50 ml de h) a 350 g, durante 10 minutos a temperatura ambiente; transferir 35 ml de volumen de sobrenadante tras la centrifugación a un matraz de cultivo estático (T175) con un filtro que contenía un tapón venteado; añadir al mismo matraz de cultivo 35 ml de medio de cultivo base suplementado con desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, glutamina, antibióticos y suero de feto de ternera (FBS) al 10 % y antibióticos; incubar el matraz de cultivo a 37 ºC, en una atmósfera humidificada que contenía un 7 % de CO2; y cambiar el medio de cultivo cada 72 h para estimular la adhesión y el crecimiento/multiplicación celular hasta obtener la máxima confluencia en la superficie; j) Una tercera etapa de recuperación donde las células disociadas del tejido, como se describe en g) se recuperan como aglomerado celular obtenido mediante la centrifugación del sobrenadante de la digestión como se describe en i), resuspendido en 2 ml de una solución que consiste en suero de feto bovino (FBS), y dimetil sulfóxido (DMSO) al 10 %, y criopreservación directa utilizando un congelador de velocidad controlada con una velocidad de disminución de la temperatura de 1 ºC.min-1, hasta -80 ºC, en un criovial estéril de 2,5 ml que contiene 2 ml de suspensión celular y 0,5 ml de espacio vacío; k) Una etapa de criopreservación de las poblaciones de células originadas como se describe en h) e i), después que los cultivos celulares alcanzan la máxima confluencia de la superficie, que consiste en la crioconservación directo en la fase de vapor de nitrógeno líquido de una mezcla de 0,5 ml de suspensión celular y 0,5 ml de una solución de suero de feto bovino (FBS) y dimetilsulfóxido (DMSO)al 10 %, de tal forma que la densidad celular final después de la criopreservación es de aproximadamente 3x106 célula/ml, en un criovial estéril de 1,5 ml, que contiene el 1,0 ml final de la suspensión celular y 0,5 ml de espacio vacío.

Description

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cualquier tejido sin digerir. En este momento, 35 ml de medio de cultivo basal, suplementado con desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, glutamina, antibióticos, y 10 % de suero de feto bovino (FBS) se añadieron al matraz de digestión. El tapón del matraz no venteado se sustituyó por un filtro que contenía el tapón venteado y el matraz de digestión se incubó a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía 7 % de CO2. Deben de llevarse a cabo cambios en el medio de cultivo total cada 72 h para promover el crecimiento de las células que se adhieren durante el periodo de incubación horizontal (periodo de selección) hasta que se consigue una confluencia máxima en la superficie.

En una segunda fase de recuperación, se recuperaron las células a partir del sobrenadante de la digestión en un tubo de centrífuga de 50 ml, a 350 g durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, 35 ml de sobrenadante se transfirieron a un matraz de cultivo estático (T175) con un filtro que contenía un tapón venteado; y se añadieron 35 ml de medio de cultivo basal suplementado con desoxirribonucleasas, ribonucleósidos, glutamina, antibióticos y 10 % de suero de feto bovino (FBS). A continuación, se incubó el matraz a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contiene 7 % de CO2, y el medio de cultivo total culture cambió cada 72 h a fin de promover la adhesión celular y la expansión/multiplicación hasta que se consiguió la confluencia máxima en la superficie.

Las poblaciones celulares obtenidas de la primera y segunda fases se criopreservaron tras la primera adhesión y el ciclo de expansión/multiplicación (fin de P0). Esto consiste en la criopreservación directa en la fase vapor del nitrógeno líquido de una mezcla de 0,5 ml de suspensión celular, que contenía el número de células totales deseado, y el mismo volumen de una solución de suero de feto bovino (FBS) que contenía 10 % de dimetil sulfóxido (DMSO), para obtener una concentración final de aproximadamente 3x106 células/ml, en un criovial estéril de 1,5 ml, que contenía por tanto 1,0 ml de suspensión celular y 0,5 ml de espacio de cabeza.

La tercera fase y final de la recuperación celular consiste en la criopreservación directa del aglomerado celular obtenido mediante la centrifugación descrita anteriormente del sobrenadante de la digestión, resuspendido en 2 ml de una solución que consiste en suero de feto bovino (FBS), que contenía un 10 % de dimetil sulfóxido (DMSO), utilizando un congelador de velocidad controlada con una velocidad de disminución de la temperatura de 1 ºC.min-1 , hasta por debajo de -80 ºC, en un criovial estéril de 2,5 ml que contenía 2 ml de suspensión celular y 0,5 ml de espacio de cabeza.

Las células criopreservadas se pueden recuperar cuando es necesario a través de un rápido proceso de descongelación en un baño de agua a 37 ºC. A continuación, las células se vuelven a suspender en un medio de cultivo a la misma temperatura con un factor de dilución de 1:10. Se pueden llevar a cabo posteriores ciclos de expansión usando densidades de inóculo entre 5,0x103 y 2,0x104 células/cm2, con un intercambio total de medio cada 72 h. Las células presentan normalmente un factor de duplicación de 1,7/24h.

Ejemplo 1: Optimización del tipo/cantidad de manipulación mecánica y dimensión de la fracción

El tipo de manipulación mecánica y el tamaño de los fragmentos de tejido iniciales se optimizaron a una proporción constante de masa de tejido (g), área superficial de la parte inferior del matraz de digestión (cm2), volumen de digestión (ml), y el volumen total del matraz (ml), de aproximadamente 1:2:2:37, considerando que la fracción de 1 cm de cordón umbilical humano pesa aproximadamente 1 g. Tras retirar la membrana amniótica, se ensayaron algunos tipos de métodos de fraccionamiento: bajo (fracciones de 5 cm); medio (fracciones de 2,5 cm); alto (fracciones de 0,3 cm); y picado del tejido. Se llevaron a cabo todos los fraccionamientos con la ayuda de un escalpelo y se procesaron las muestras usando exactamente las mismas condiciones. Se concluyó que los mejores rendimientos, en términos de células totales al final de P0/masa de cordón umbilical/tiempo, se obtuvieron cuando se utilizan fracciones de 2,5 cm. La Tabla 1 resume los resultados de obtenidos cualitativamente.

Tabla 1: Optimización del fraccionamiento: rendimiento celular.

Bajo (5 cm) Medio (2,5 cm) Alto (0,3 cm) Picado

+++ +-

Clave: +++ = Excelente, ++ = muy bueno, + = bueno, -= razonable, --= malo, 0 = insatisfactorio

Ejemplo 2: Optimización relativa a la presencia o ausencia de coágulos de sangre en vasos del cordón umbilical (1 vena y 2 arterias).

Se sabe que la lisis de glóbulos rojos es tóxica, reduciendo la viabilidad celular in vitro. Por tanto, se compararon los rendimientos celulares cuando se llevó a cabo la digestión en presencia o ausencia de coágulos de sangre. Para el último experimento, se retiraron los coágulos de sangre con la ayuda de un escalpelo. Se concluyó que los coágulos de sangre tenían efecto negativo en el rendimiento, en términos de células totales y al fin de p0/masa de cordón

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Ejemplo 11: Demostración del fenotipo precursor de las células de las células aisladas: diferenciación osteogénica.

De acuerdo con la descripción detallada de la invención, las células precursoras aisladas de las fracciones del cordón umbilical humano muestran la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células especializadas. En este ejemplo se demuestra las capacidades de diferenciación de estas células para dar osteoblastos.

Las células se inocularon en P3 a una densidad de 2,0x104 células/cm2 en medio de diferenciación osteogénico que contenía medio base alfa-MEM (con desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y ultraglutamina) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, β-glicerofosfato 10 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 50 µg/ml de ascorbato-2-fosfato, 100 nM de dexametasona (Hung et al., 2002).

La totalidad del medio se cambió 2 veces por semana durante 3 semanas, después de local, se llevaron a cabo los protocolos de tinción específica con rojo de alizarina y fosfatasa alcalina, y en ambos casos el resultado fue positivo. Con respecto a la tinción con rojo de alizarina, el medio se aspiró cuidadosamente del matraz de cultivo de tejido, y las células se fijaron con para-formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Las células se lavaron con PBS y se incubaron con la solución de tinción específica, rojo de alizarina S, 40 mM, pH 4,2, durante 15 minutos a temperatura ambiente. La solución de rojo de alizarina S se eliminó y las células se lavaron cuidadosamente con agua (Kotobuki et al., 2006).

En el caso del ensayo con la fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich), las células también se fijaron con para-formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron con PBS y se sumergieron en 2,5 ml de solución de citrato y se dejaron incubar durante 30 segundos.

La solución de citrato se retiró a continuación, y las células se lavaron con agua desionizada (milliQ) y se incubaron con la solución de tinción, Rojo neutro, durante 2 minutos. La solución se eliminó a continuación y las células se lavaron cuidadosamente con agua (Shim et al., 2004). El ensayo dio un resultado positivo para la diferenciación osteogénica (Fig. 5).

Ejemplo 12: Demostración del fenotipo precursor de las células de las células aisladas: diferenciación adipogénica.

Para diferenciar las células en adipocitos, las células se sembraron en placas en P3 a una densidad de 2,0x104 células/cm2 en medio base alfa-MEM (con desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y ultraglutamina) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina) y se mantuvieron en este medio de cultivo. Al alcanzar la confluencia, el medio se cambió a medio de diferenciación adipogénico compuesto de DMEM-LG con FBS al 10 %, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 10 µg/ml de insulina, 200 µM de indometacina, isobutil-1-metilxantina 0,5 mM y dexametasona 1 µM (Shih et al., 2005).

La totalidad del medio se cambió 2 veces por semana durante 3 semanas, después de lo cual, se llevaron a cabo los ensayos de tinción específica con Oil red O y se confirmó la diferenciación adipogénica. Para esto, el medio de cultivo aspiró cuidadosamente del matraz de cultivo de tejido (NUNC) mediante aspiración y las células se fijaron con para-formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron con PBS y se incubaron con la solución filtrada de Oil red Oil (2:3) durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. La solución de Oil red Oil se eliminó a continuación y las células se lavaron cuidadosamente con agua (Do, et al., 2006). El ensayo dio un resultado positivo para la diferenciación adipogénica (Fig. 5).

Ejemplo 13: Demostración del fenotipo precursor de las células de las células aisladas: diferenciación condrogénica.

Para la diferenciación condrogénica, las células se resuspendieron en P3 a una densidad final de 1,1x106 células/ml y se introdujeron en un tubo cónico de 15 ml para dejar que las condroesferas se formaran. El medio de cultivo utilizado fue el medio de diferenciación condrogénica que consiste en DMEM-LG con FBS al 1 %, 6.25 µg/ml de insulina, 10 ng/ml de TGF β1 y ascorbato-2-fosfato 50 µM (Shih et al., 2005).

La totalidad del medio se cambión dos veces a la semana durante 4 semanas, prestando especial atención a no perturbar las condroesferas, después de lo cual, se realizaron los protocolos de tinción específica con azul alcián y hematoxilina, y se confirmó la diferenciación condrogénica. Para ello, la totalidad del medio se retiró del tubo mediante aspiración, y las condroesferas se lavaron con PBS. A continuación, las condroesferas se sumergieron en agar y se congelaron en la fase vapor de nitrógeno líquido.

Con un microtomo, el agar se cortó en cortes de tejido de 5 µm. Estos cortes se tiñeron con azul alcián al 1 % y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y a continuación se lavaron con PBS. Las preparaciones

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