KR20170090413A - 젬시타빈-포스페이트 부분입체이성질체의 분리 방법 - Google Patents

젬시타빈-포스페이트 부분입체이성질체의 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 결정화(crystallisation)를 사용하여 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트 (NUC-1031)의 포스페이트 부분입체이성질체를 분리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 아이소프로필 알코올로부터의 결정화는 높은 부분입체이성질체적으로 순수형인 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이(gemcitabine-[phenyl-benzoxy-L-alaninyl)]-(S)-phosphate)를 제공한다. 또한 본 개시는 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트의 결정형에 관한 것이다.

Description

젬시타빈-포스페이트 부분입체이성질체의 분리 방법{METHODS OF SEPARATING GEMCITABINE-PHOSPHATE DIASTEREOISOMERS}
본 발명은 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트(gemcitabine-[phenyl-benzoxy-L-alaninyl)]-phosphate)의 포스페이트 부분입체이성질체를 분리하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로 실질적 부분입체이성질체적 순수형(substantially diastereoisomerically pure form)의 (S)- 및/또는 (R)-포스페이트 부분입체이성질체(phosphate diastereoisomer)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
젬시타빈(1; 겜자르®(Gemzar®)로 시판됨)은 유방암, 비-소세포폐암, 난소암 및 췌장암을 치료하는데 현재 승인된 유효한 뉴클레오사이드 유사체이고 방광, 쓸개, 결장 및 림프종을 포함하는 다양한 암을 치료하는데 광범위하게 사용된다.
Figure pct00001
1
젬시타빈의 임상적 유용성은 다수의 선천적 및 습득된 저항성 기전에 의해 제한된다. 세포내 수준에서 저항성은 3개의 파라미터에 의존된다: (i) 활성에 필요한, 인산화된 일부분으로의 데옥시시티딘 카이나제(deoxycytidine kinase)의 하향-조절; (ⅱ) 뉴클레오사이드 전달체, 특히, 암세포에 의한 흡수에 필요한 hENT1의 감소된 발현; 및 (ⅲ) 촉매 효소 특히 젬시타빈을 분해하는 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)의 상향-조절.
WO2005/012327는 젬시타빈에 대한 일련의 뉴클레오타이드 포스페이트 유도체 및 이와 관련된 뉴클레오사이드 약물 분자를 개시한다. 이들 중에서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트(NUC-1031; 2)는 특히 유효한 화합물로서 확인된다. 상기 유도체는 젬시타빈의 유용성을 제한하는 많은 선천적 및 습득된 저항성 기전을 회피하는 것처럼 보인다('Application of ProTide Technology to Gemcitabine: A Successful Approach to Overcome the Key Cancer Resistance Mechanisms Leads to a New Agent (NUC -1031) in Clinical Development'; Slusarczyk et all; J. Med. Chem.; 2014, 57, 1531-1542).
NUC-1031 2는 일반적으로 포스페이트 중심에서 에피머성(epimeric), 2개의 부분입체이성질체의 혼합물로서 제조된다.
Figure pct00002
2
NUC-1031 2는 매우 친유성(lipophillic)이므로 물에 거의 녹지 않고(계산에 의하면: <0.1 mg/㎖), 이온화할 수 있는 부분(ionisable moieties)은 비경구 투여를 위해 적절한 pH 범위 바깥쪽에 놓여있는 pK로 계산되었다. 이것은 염의 함량 또는 pH에 상관없이, 본질적으로 물에 불용해성이고, 효과적인 치료를 위해 충분히 높은 투여량에서 화합물 전달을 위한 제제 개발에 대하여 암시한다. 또한 이것은 NUC-1031이 효과적인 비용으로 생산될 수 있도록 효율적인 제작과정의 개발을 암시한다.
젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트의 (S)-에피머 3은 치료제로서 제제 및 투여에 적절하도록 다수의 극성 유기 용매와 물의 혼합물에서 충분한 용해도를 가진다는 것이 최근에 발견되었다. (R)-에피머 4의 용해도는 상당히 낮다. 특정한 용매 혼합물에서 (S)-에피머와 (R)-에피머 사이의 용해도의 차이는 100 배(fold) 이상이다. 따라서 임상적으로 더 유효하고, 실용적이고 환자 친화적인 투여 방법은 (R)-에피머 또는 혼합물을 사용하여 개발될 수 있는 것보다 (S)-에피머를 사용하여 개발될 수 있음을 기대할 수 있다. 따라서 실질적 부분입체이성질체적으로(diastereoisomerically) 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트 3이 제공될 수 있는 것이 바람직하다.
Figure pct00003
3
Figure pct00004
4
특히 HPLC를 사용하여 화합물을 분리하는데 통상적으로 사용되는, 많은 용매에서 NUC-1031의 낮은 용해도는 HPLC를 기반으로 하는 분리(HPLC based separation)를 위하여 대량의 용매가 필요함을 의미한다. 이것은 임의의 HPLC를 기반으로 하는 산업적 규모의 분리 과정에서 고비용이 들고, 많은 양의 에너지 및 물질을 소비하며 많은 양의 폐기물을 생성함을 의미한다.
비록 본 발명을 출원시에는 (S)-에피머로서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트를 투여하는 것이 바람직할 것으로 보이지만, 누군가는 부분입체이성질체적 순수형의 (R)-에피머를 얻기 위한 필요성을 이유로 여길수 있다. 상기는 (R)-에피머를 (S)-에피머로 전환하기 위하여 또는 (R)-에피머가 (S)-에피머의 저용해도(low solubility)를 능가하는 혜택을 제공하기 때문에 비교 테스트를 수행하는 것을 포함할 것이다.
실제로 (R)-에피머는 분리된 인간 간세포의 배양상에서 (S)-에피머의 4배의 반감기를 가지고 있다. (R)-이성질체(isomer)와 관련된 긴 반감기는 낮은 내재적 제거(lower intrinsic clearance)를 나타내고 일부 혜택을 제공할 수 있는 (S)-이성질체에 대한 다른 약동학적(pharmacokinetic) 및 약역학적(pharmacodynamic) 프로파일의 결과를 초래한다.
(S)- 및 (R)-에피머 모두는 치료학적으로 활성이다.
본 발명의 특정한 실시형태의 목적은 실질적 부분입체이성질체적으로 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트 3을 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정한 실시형태의 목적은 실질적 부분입체이성질체으로 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트 4를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정한 실시형태의 목적은 확장가능하고(scalable), 경제적 및/또는 효율적, 예를 들면 HPLC를 사용하는 방법보다 더욱 확장가능하고(scalable), 더 경제적 및/또는 더 효율적인 실질적 부분입체이성질체으로 순수형의 (S) 및/또는 (R)-에피머를 제공 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명의 특정한 실시형태의 목적은 대규모 제작에 적절한 실질적 부분입체이성질체적으로 순수형의 (S) 및/또는 (R)-에피머를 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정한 실시형태의 목적은 실질적 부분입체이성질체적으로 순수형의 (S) 및/또는 (R)-에피머를 제공하는 간단한 방법, 즉, 최소수의 공정 단계를 포함하는 방법 및/또는 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정한 실시형태의 다른 목적은 분리된 (S)- 또는 (R)-에피머가 실질적 부분입체이성질체적 순수형으로 제공되고 동시에 합성 및 분리로부터 발생하는 미량의 불순물의 양 및 성질에 관하여 미국 FDA와 같은 기관에 의해 규정된 필요한 기준을 충족시키거나 초과하는 것을 보장하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정한 실시형태는 상기 목적의 일부 또는 모두를 만족한다.
본 발명의 실시형태는 첨부하는 도면에 참조로서 여기에 추가적으로 설명된다:
도 1은 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트 결정형 I의 XRPD 스펙트럼이다.
도 2는 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트 결정형 I의 FTIR 스펙트럼이다.
본 개시의 요약
본 발명의 첫번째 측면은 하기 단계를 포함하는, 실질적 부분입체이성질체적으로 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트의 적어도 하나의 부분입체이성질체를 제공하는 방법을 제공한다:
슬러리를 형성하기 위하여 용매 또는 용매 혼합물에서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트 및 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트의 혼합물을 현탁하는 단계; 및
고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트를 제거하기 위한 슬러리 및 용매 또는 용매 혼합물에 용해된 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트를 포함하는 여과액을 여과하는 단계;
상기 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트는 실질적 부분입체이성질체으로 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트이고/이거나 상기 여과액은 실질적 부분입체이성질체으로 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함한다.
발명자는 이러한 간단한 기술을 사용하여 에피머가 분리될 수 있도록 (R)- 및 (S)-에피머 간의 용해도의 차이가 충분히 높다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 상기 방법은 단순히 부분입체이성질체적으로 풍부한 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트 뿐만아니라 실질적 부분입체이성질체적으로 풍부한 형태의 하나 또는 모두의 에피머를 형성할 수 있음을 제공한다. 테스트된 모든 용매에서, (S)-에피머는 (R)-에피머보다 고용해도(higher solubility)를 가진다. 따라서, (S)-에피머는 일반적으로 여과액(filterate)의 용액으로서 부분입체이성질체적으로 풍부한 형태로 존재하고 (R)-에피머는 일반적으로 여과기(filter) 상에 고체로서 부분입체이성질체적으로 풍부한 형태로 존재할 것이다.
본 발명의 특정한 실시형태는 실질적 부분입체이성질체으로 순수한 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 여과액 및 부분입체이성질체의 혼합물인 고체 생성물을 제공한다. 본 발명의 특정한 실시형태는 실질적 부분입체이성질체적으로 순수한 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트인 고체 및 부분입체이성질체의 혼합물을 포함하는 여과액을 제공한다. 본 발명의 특정한 실시형태는 실질적 부분입체이성질체적으로 순수한 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트인 고체 및 실질적 부분입체이성질체 순수한 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 여과액 모두를 제공한다.
슬러리의 형성은 실온(ambient temperature)(즉, 20℃부터 30℃까지)에서 수행될 수 있다. 발명자는 각각의 에피머에 대한 좋은 부분입체이성질체 순도를 임의의 가열 또는 냉각 단계의 수행없이 얻을 수 있음을 발견하였다.
그러나, 바람직하게는, 슬러리는 형성하는 단계의 적어도 일부분에 대하여 가열된다. 따라서, 슬러리가 일단 형성되면 가열될 수 있다. 슬러리는 약 30℃부터 약 80℃까지, 예를 들면 약 40℃부터 약 70℃까지의 온도로 가열될 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에서, 슬러리는 약 50℃부터 약 60℃까지 온도로 가열될 수 있다. 슬러리는 하루 이하(a day or less) 동안 가열될 수 있다. 슬러리는 30분 이상 가열될 수 있다. 1 내지 3시간이 적절할 수 있다.
또한 상기 슬러리는 슬러리 형성 단계의 적어도 일부분에서 교반(agitated)될 수 있다. 상기 슬러리는 3일 또는 그 이하(3 days or less), 예를 들면 1일 또는 그 이하 동안 교반될 수 있다. 상기 슬러리는 30 분 이상 교반될 수 있다. 1 내지 6시간이 적절할 수 있다. 교반(Agitation)은 젓기(stirring), 흔들기(shaking), 또는 모두를 포함할 수 있다. 슬러리는 동시에 또는 대체로 동시에 가열되고 저을 수 있다(stirred).
만약 슬러리가 가열되면, 바람직하게는 슬러리는 여과하기 이전에 냉각되지 않는다.
상기 방법은 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트를 세척하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 단계는 후속적으로 여과에 의한 분리를 발생시킨다. 비록 상이한 용매가 고체를 세척하는데 사용되거나, 슬러리가 용해 혼합물로부터 형성된 경우에 혼합물의 단지 하나의 용매가 고체를 세척하는데 사용될 수 있는 것이 가능하더라도, 상기 방법은 일반적으로 용매 혼합물로부터 형성된 슬러리를 형성하는데 사용된 동일한 용매 또는 용매 혼합물로 수행될 것이다. 비록 이것이 항상 그런 경우는 아니지만, 슬러리가 가열된 경우에, 상기 세척하는 단계는 상승된 온도, 예를 들면 약 40℃ 내지 약 70℃에서 용매 또는 용매 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다. 용매 또는 용매 혼합물은 슬러리처럼 동일한 온도일 수 있다.
이전 단락에서 언급된 세척하는 단계는 세척 여과액(wash filterate)을 얻기 위하여 고체가 여과기 상에 있는 동안에 항상 수행된다. 일반적으로, 세척 여과액은 첫번째 여과액과 혼합된다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 여과한 후에 여과액의 처리와 함께 사용될 때, 용어‘여과액'은 첫번째 여과액과 상기 방식으로 형성된 세척 여과액을 혼합하여 얻은 혼합된 여과액 모두를 포함하고 있고, 또한 첫번째 여과액이 세척 여과액과 혼합되지 않는 경우에는, 상기 용어가 독자적으로 첫번째 여과액을 의미하는 것으로 의도된다.
젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트 시작 물질(starting material)은 유리 염기(free base), 염(salt) 또는 수화물(hydrate) 시작 물질의 형태일 수 있다. 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트 시작 물질은 염 및/또는 용매 화합물(solvate) (예를 들면 수화물)의 형태가 아닐 수 있다. 바람직하게는, 유리 염기의 형태이다.
실질적 부분입체이성질체으로 순수한 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트 생성물은 유리 염기, 염 또는 수화물 시작 물질의 형태일 수 있다. 실질적 부분입체이성질체적으로 순수한 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트 생성물은 염의 형태 및/또는 용매 화합물(예를 들면 수화물)의 형태가 아닐 수 있다. 바람직하게는, 유리 염기의 형태이다.
항상, 시작 물질 및 생성물은 동일한 형태일 것이다. 그러나, 진행 단계는, 다를 수 있는 경우에, 염기 또는 산의 추가를 수반할 수 있는 것이 가능하다.
바람직하게는, 시작 물질 및 생성물 모두는 유리 염기 형태로 있다.
‘실질적 부분입체이성질체적으로 순수한(substantially diastereomerically pure)’은 약 85%보다 큰 부분입체이성질체적 순도로서 본 발명의 목적으로 정의된다. 본 발명의 특정한 실시형태는 85%보다 상당히 높은 부분입체이성질체 순도에서 (R)- 및/또는 (S)-젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트의 분리(isolation)를 이룬다. 따라서 상기 반응의 방법으로 수득된 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트의 에피머 또는 각각의 에피머는 약 90% 이상의 부분입체이성질체 순도를 가질 수 있다. 본 발명의 방법으로 수득된 하나 또는 모든 에피머는 부분입체이성질체 순도를 가질 수 있다. 본 발명의 방법으로 수득된 하나 또는 모든 에피머의 부분입체이성질체 순도는 5%, 98%, 99%, 또는 심지어 99.5% 이상일 수 있다.
‘부분입체이성질체적으로 풍부한 형태(diastereomericall enriched form)'로 수득된 에피머는 높은 비율로 수득된 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트가 시작 혼합물로 존재되는 것보다 에피머인 것을 의미하는 것으로서 본 발명의 목적으로 정의된다. 항상 시작 혼합물은 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트의 원래 합성(original synthesis)의 생성물일 것이다. 시작 물질에서 (R):(S) 에피머의 비율은 10:1 및 1:10 사이일 수 있다. 바람직하게는, (R):(S) 에피머의 비율은 5:1 및 1:5, 예를 들면 3:1 및 1:3 사이 또는 2:1 및 1:2 사이이다.
부분입체이성질체의 일부 분리는 테스트된 모든 용매에서 관찰되었다.
용매는 극성 양성자성 용매 및 극성 비양성자성 용매로부터 선택되는 용매이거나 용매 혼합물은 극성 양성자성(polar protic) 용매 및 극성 비양성자성(polar aprotic) 용매로부터 선택되는 용매를 포함할 수 있다. 용매 혼합물에 존재할 수 있는 다른 용매는 극성 양성자성 용매, 극성 비양성자성 용매, 비-극성 용매 및 물을 포함한다. 용매는 톨루엔이거나 용매 혼합물은 톨루엔을 포함할 수 있다. 용매는 하기로부터 선택되는 용매일 수 있다: C2-C4 알코올, 아세토니트릴(ACN), 톨루엔, 아세톤, 메틸 에틸 케톤(MEK) 및 이의 혼합물로부터 선택되는 용매일 수 있거나, 용매 혼합물은 하나 또는 그 이상의 상기 용매와 함께 추가적으로 용매 또는 용매들. 특정한 경우에, 상기 용매는 C3-C4 알코올 (예를 들면 n-프로판올, 아이소-프로판올(IPA), n-부탄올), 아세토니트릴 및 이의 혼합물로부터 선택되는 용매일 수 있거나, 또는 용매 혼합물은 하나 이상의 상기 용매들을 포함할 수 있다. 용매는 C3-C4 알코올(예를 들면 n-프로판올, IPA, n-부탄올)이거나 용매 혼합물은 C3-C4 알코올(예를 들면 n-프로판올, IPA, n-부탄올)을 포함할 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에서 용매는 IPA이거나 용매 혼합물은 IPA를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 용매는 아세토니트릴이거나 용매 혼합물은 아세토니트릴을 포함할 수 있다.
용매는 C3-C4 알코올 (예를 들면 n-프로판올, IPA, n-부탄올)일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에서 용매는 IPA이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 용매는 아세토니트릴이다.
용어 ‘C 2 -C 4 알코올’ 및 ‘C 3 -C 4 알코올’은 직쇄 (straight chain) 및 분기쇄(branched chain) 알코올 모두를 포함할 수 있다. 따라서, 완전성을 위해, 용어 C2-C4 알코올은 에탄올, n-프로판올, 아이소-프로판올(iso-propanol), n-부탄올, 아이소-부탄올, 2급-부탄올(sec-butanol) 및 3급-부탄올(tert-butanol)로부터 선택되는 알코올을 의미한다.
용매 혼합물은 물을 포함할 수 있다. 용매와 물의 상대적 비율은 혼합(miscible)될 수 있는 정도이다. 이러한 경우에, 물은 용매 시스템에서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트의 용해도를 낮추는, 항-용매로서 작용할 수 있다. 만약 물이 존재하면, 용매 혼합물의 총 부피(즉, 용매의 부피 플러스와 물의 부피의 합)의 20% 또는 그 이하, 예를 들면 10% 또는 그 이하 또는 5% 또는 그 이하일 수 있다. 이것은 용매 혼합물의 총 부피의 0.1% 또는 그 이상일 수 있다.
용매 혼합물은 다른 극성 양성자성 용매 및/또는 극성 비양성자성 용매를 포함할 수 있다. 용매 혼합물은 비-극성 용매, 예를 들면 알칸 또는 사이클로알칸을 포함할 수 있다. 알칸 및 사이클로알칸의 예는: 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄 및 사이클로헥산을 포함한다. 용매 혼합물이 비-극성 용매를 포함하는 경우에, 일반적으로 비-극성 용매가 용매 혼합물의 50% 미만의 양으로 존재할 것이다. 항상 그런 것은 아니지만, 비-극성 용매가 용매 혼합물의 최대 90%까지 나타내는 것이 가능하다.
용매가 혼합물에서 존재하지 않을 수 있고 최소 불순물을 제외하고 대체적으로 순수하게 사용될 수 있다(즉, 95% 이상의 순도를 가지는, 예를 들면 99% 이상).
용매는 실질적으로 순수한(즉, 95% 이상의 순도를 가지는) C3-C4 알코올 (예를 들면 n-프로판올, IPA, n-부탄올) 또는 아세토니트릴일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에서, 용매는 실질적으로 순수한(즉, 95% 이상의 순도를 가지는) IPA일 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 용매는 실질적으로 순수한(즉, 95% 이상의 순도를 가지는) 아세토니트릴일 수 있다.
용매는 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, PEG 400(폴리에틸렌 글리콜), NMP 및 DMSO로부터 선택되지 않을 수 있다. 슬러리가 용매 혼합물을 사용하여 형성된 경우에, 용매 혼합물은 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, PEG 400 (폴리에틸렌 글리콜), NMP 및 DMSO로부터 선택된 용매를 포함하지 않는다.
후속적 분석 등을 용이하게 하기 위하여 하나 또는 그 이상의 동위원소적으로-표지된 용매를 포함하는 것이 적절한 상황일 수 있다.
상기 방법은 부분입체이성질체적으로 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 제공하는 방법일 수 있다.
만약 이런 경우에는, 상기 방법은 실질적 부분입체이성질체으로 순수형의 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 얻기 위하여 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 여과액으로부터 용매를 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
용매를 제거하는 단계는 증발, 예를 들면 증류 또는 감압 증발에 의해 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트로부터 실질적으로 모든 용매를 제거하여 실질적 부분입체이성질체 순수형의 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 수득하는 것을 포함할 수 있다.
용매 또는 용매 혼합물을 제거하는 단계는 하기를 포함할 수 있다:
고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 농축된 여과액을 제공하기 위하여, 증발, 예를 들면 증류 또는 감압 증발에 의해 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 여과액으로부터 용매 또는 용매 혼합물의 일부를 제거하는 단계;
선택적으로 농축된 여과액을 교반(agitating)하는 단계; 및
실질적 부분입체이성질체 순수형의 고체로서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 얻기 위하여 농축된 여과액을 여과하는 단계.
농축된 여과액은 부유물질(suspended solid)을 포함한다.
용액이 농축될수록, 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트가 결정화되고 발명자는 첫번째 여과 단계에서 얻어진 여과액에 비하여 상기 결정체의 부분입체이성질체 순도가 놀랍게도 빈번히 향상되는 것을 발견하였다. 일반적으로 일단 용액을 교반(stirring)하게 되면 농축되고 더 많은 결정체를 형성하게 하고 산출량을 증가시킨다. (S)-에피머가 (R)-에피머보다 더 용해성이 있어서 놀랍게도 (S)-에피머가 더 높은 순도를 나타낸다.
용매의 일부가 제거된 첫번째 여과 단계로부터 수득된 부피의 10%부터 90%까지일 수 있다. 바람직하게는, 첫번째 여과 단계로부터 수득된 부피의 25%부터 75%까지, 예를 들면 40%부터 60%까지이다.
농축 단계 및 교반 단계(존재하는 경우에)는 각각의 단계의 적어도 일부 기간 동안 동시에 발생할 수 있다.
만약 농축된 여과액이 교반되면(agitated), 7일 또는 그 이하, 예를 들면 5일 이하 동안 젓게(stirred)될 수 있다. 1시간 또는 그 이상, 예를 들면 6시간 또는 그 이상, 12시간 또는 그 이상 또는 1일 또는 그 이상 교반될 수 있다.
용매를 제거하는 단계는 재결정화/여과 과정에 의해 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트로부터 실질적으로 모든 용매를 제거하는 단계를 포함시켜 실질적 부분입체이성질체으로 순수형의 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 얻을 수 있다. 슬러리는 슬러리 형성 및 여과 단계 동안에 상승된 온도에서 유지되는 겅우에 특히 더 바람직하다.
용매를 제거하는 단계는 하기를 포함할 수 있다:
고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 냉각된 여과액을 제공하기 위하여 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 여과액을 냉각하는 단계;
선택적으로 냉각된 여과액을 교반(agitating)하는 단계; 및
실질적 부분입체이성질체 순수형의 고체로서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트을 수득하기 위하여 냉각된 여과액을 여과하는 단계.
냉각된 여과액은 부유물질(suspended solid)을 포함한다.
여과액은 -10℃부터 약 45℃까지, 예를 들면 약 5℃부터 약 40℃까지의 온도로 냉각될 수 있다. 바람직하게는, 여과액은 약 15℃부터 약 35℃까지의 온도로 냉각된다. 여과액은 서서히 또는 단계적으로 냉각될 수 있다. 하나의 온도(예를 들면 약 25℃부터 약 35℃까지의 온도)로 냉각된 화합물은 기간(period of time)(예를 들면 약 1시간부터 약 2일까지) 동안 그 온도에서 유지된 다음, 다른 더 낮은(예를 들면 약 15℃부터 약 25℃까지의 온도) 온도로 냉각되고 추가 기간(예를 들면 약 1시간부터 약 2일까지) 동안에 상기 온도에서 유지될 수 있다.
상기 방법은 종자 물질(seed material)을 여과액에 추가하는 단계를 포함할 수 있다. 이것은 여과액이 냉각되는 중이거나 여과액이 냉각된 후처럼, 여과액이 냉각되기 전에 발생할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 여과액이 일단 냉각되면 첨가된다. 일반적으로 종자 물질은 높은 부분입체이성질체 순도(예를 들면 90% 또는 그 이상 또는 95% 또는 그 이상)의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트의 형태를 취할 것이다. 종자 물질은 고체로서 첨가될 수 있으나, 더 편리하게 슬러리 또는 현탁액으로 첨가될 수 있다. 슬러리 또는 현탁액은 여과액으로서 동일한 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있다. 여과액이 용매 혼합물을 포함하는 경우에, 종자 물질 슬러리 또는 현탁액은 상기 용매들 중 하나에서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 종자 물질 슬러리 또는 현탁액은 여과액에 존재하지 않는 용매에서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함할 수 있다.
상기 방법은 추가 용매를 여과액에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 여과액이 냉각되거나 또는 여과액이 냉각된 후처럼, 여과액이 냉각되기 전에 발생할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 일단 여과 액이 냉각되면, 첨가된다. 추가 용매의 첨가는 용매 또는 용매 혼합물의 변형되지 않은(unmodified) 여과액의 용해도에 비하여 변형된 여과액의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트의 용해도를 일반적으로 낮출 것이다. 추가 용매는 물일 수 있다. 추가 용매는 비극성, 예를 들면 알칸 또는 사이클로알칸 또는 이의 혼합물일 수 있다. 여과액이 용매 혼합물을 포함하는 경우에, 추가 용매는 혼합물에 있는 다른 용매에 대한 용해도보다 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트의 용해도가 더 낮은 혼합물에 있는 하나 또는 그 이상의 용매일 수 있다. 따라서, 여과액이 물과 혼합된 극성 양성자성 또는 비양성자성 용매를 포함하는 경우에, 추가 용매는 물일 수 있다.
만약 냉각된 여과액이 교반되면, 7일 또는 그 이하, 예를 들면 5일 또는 그 이하 동안 저을 수 있다(stirred). 1시간 또는 그 이상, 예를 들면 6시간 또는 그 이상, 12시간 또는 그 이상 또는 1 일 또는 그 이상 교반될 수 있다.
냉각 단계 및 교반 단계 (존재하는 경우에)는 각각의 단계동안 적어도 일부 기간 동안에 동시에 발생할 수 있다.
상기 방법은 실질적 부분입체이성질체적으로 순수한 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 세척하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 비록, 상이한 용매가 고체를 세척하는데 사용될 수 있거나, 여과액에 용매 혼합물이 포함된 경우에 혼합물에서 단지 하나의 용매가 고체를 세척하는데 사용될 수 있는 것이 가능하지만, 일반적으로는 여과액이 포함된 동일한 용매 또는 용매 혼합물로 수행될 것이다. 일반적으로 상기 세척 단계는 고체가 여과기 상에 있는 동안에 수행된다. 상기 세척 단계는 일반적으로 냉각(예를 들면 약 5℃부터 약 20℃까지의 온도) 용매 또는 용매 혼합물을 사용하여 수행된다.
잔여 용매는 실질적 부분입체이성질체으로 순수형의 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트로부터, 예를 들면 진공하에서 고체를 가열하여 제거될 것이다.
방법은 부분입체이성질체적으로 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트를 제공하는 방법일 수 있다.
이런 경우에는, 상기 방법은 하기 단계를 추가적으로 포함할 수 있다:
두번째 슬러리를 형성하기 위하여 두번째 용매 또는 두번째 용매 혼합물의 첫번째 여과로부터 수득된 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트를 현탁하는 단계; 및
실질적 부분입체이성질체적으로 순수한 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트를 제공하기 위하여 두번째 슬러리를 여과하는 단계.
두번째 용매 또는 두번째 용매의 혼합물은 첫번째 현탁액 단계에서 사용된 용매 또는 용매 혼합물과 동일하거나 상이한 것일 수 있다.
두번째 용매는 극성 양성자성 용매 및 극성 비양성자성 용매로부터 선택되는 용매이거나 두번째 용매 혼합물은 극성 양성자성 용매 및 극성 비양성자성 용매로부터 선택되는 용매를 포함할 수 있다. 두번째 용매는 톨루엔이거나 두번째 용매 혼합물은 톨루엔을 포함할 수 있다. 두번째 용매 혼합물에 존재될 수 있는 다른 용매는 극성 양성자성 용매, 극성 비양성자성 용매, 비-극성 용매 및 물을 포함한다. 두번째 용매는 하기로부터 선택되는 용매이거나 두번째 용매 혼합물은 하기로부터 선택되는 용매를 포함할 수 있다: C2-C4 알코올, 아세토니트릴(ACN), 톨루엔, 아세톤, 메틸 에틸 케톤(MEK) 및 이의 혼합물. 두번째 용매는 하기로부터 선택되는 용매이거나 두번째 용매 혼합물은 하기로부터 선택되는 용매를 포함할 수 있다: C3-C4 알코올 (예를 들면 n-프로판올, 아이소-프로판올(IPA), n-부탄올), 아세토니트릴 및 이의 혼합물. 두번째 용매는 C3-C4 알코올(예를 들면 n-프로판올, IPA, n-부탄올)이거나 두번째 용매 혼합물은 C3-C4 알코올(예를 들면 n-프로판올, IPA, n-부탄올)을 포함할 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에서 두번째 용매는 IPA이거나 두번째 용매 혼합물은 IPA를 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 두번째 용매는 아세토니트릴이거나 두번째 용매 혼합물은 아세토니트릴을 포함한다.
두번째 용매는 C3-C4 알코올(예를 들면 n-프로판올, IPA, n-부탄올)일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에서 두번째 용매는 IPA이다. 다른 더 바람직한 실시형태, 두번째 용매는 아세토니트릴이다.
두번째 용매 혼합물은 물을 포함할 수 있다. 용매와 물의 상대적 비율은 혼합(miscible)될 수 있는 정도이다. 이러한 경우에, 물은 두번째 용매 시스템에서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트의 용해도를 낮추는, 항-용매(anti-solvent)로서 작용할 수 있다. 만약 물이 존재하면, 두번째 용매 혼합물 총 부피(즉, 용매의 부피 플러스와 물의 부피의 합)의 20% 이하, 예를 들면 10% 또는 그 이하 또는 5% 또는 그 이하일 수 있다. 이것은 두번째 용매 혼합물의 총 부피의 0.1% 또는 그 이상일 수 있다.
두번째 용매 혼합물은 다른 극성 양성자성 용매 및/또는 극성 비양성자성 용매를 포함할 수 있다. 두번째 용매 혼합물은 비-극성 용매, 예를 들면 알칸 또는 사이클로알칸을 포함할 수 있다. 알칸 및 사이클로알칸의 예는 하기를 포함한다: 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄 및 사이클로헥산. 두번째 용매 혼합물이 비-극성 용매를 포함하는 경우에, 일반적으로 비-극성 용매는 두번째 용매 혼합물의 50% 미만의 양으로 존재될 것이다. 항상 그런 것은 아니지만, 비-극성 용매가 용매 혼합물의 최대 90%까지 나타내는 것은 가능하다.
두번째 용매는 혼합물에 존재하지 않을 수 있고 최소 불순물을 제외하고 실질적으로 순수하게 사용될 수 있다(즉, 95% 이상의 순도를 가지는, 예를 들면 99% 이상).
두번째 용매는 실질적으로 순수한(즉, 95% 이상의 순도를 가지는) C3-C4 알코올(예를 들면 n-프로판올, IPA, n-부탄올) 또는 아세토니트릴일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에서, 두번째 용매는 실질적으로 순수한(즉, 95% 이상의 순도를 가지는) IPA일 수 있다. 다른 더 바람직한 실시형태에서, 두번째 용매는 실질적으로 순수한(즉, 95% 이상의 순도를 가지는) 아세토니트릴일 수 있다.
또한 본 발명은 첫번째 측면에 의해 얻을 수 있는(예를 들면, 얻어진) 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트 및/또는 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트와 관련된다.
또한 본 발명은 결정형 I 형인 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트의 결정형과 관련된다. 상기 결정형 (즉, I 형)은 Kα2 / Kα1 비율이 0.5인 Cu 방사선을 사용하여 측정될 때 5.0, 6.7, 8.0, 11.3, 20.2 및 21.4로부터 선택되는 2θ에서 적어도 2개의 피크(예를 들면 적어도 4개의 피크)를 가진 XRPD 패턴을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결정형은 Kα2 / Kα1 비율이 0.5인 Cu 방사선을 사용하여 측정될 때 2θ 5.0, 6.7, 8.0, 11.3, 20.2 및 21.4에서 피크를 가지는 XRPD 패턴을 가질 수 있다. 도 1에서 나타낸 바와 같이 상기 결정형은 실질적으로 XRPD 패턴을 가진다. 상기 결정형은, 도 2에 나타낸 바와 같이 대체로, 누졸(Nujol)에서 현탁액으로 측정될 때, FTIR 패턴을 가진다.
상세한 설명
본 발명의 과정에서 사용되고/되거나 수득된 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트는 염의 형태로 수득되고, 저장되고 및/또는 반응될 수 있다. 상기 염은 약학적으로 허용가능한 염일 수 있으나 반드시 그런 것은 아니다. 약학적으로 덜 바람직한 염이 본 발명의 과정을 수행하는데 사용될 수 있고 유리 염기(free salt) 또는 약학적으로 허용가능한 염으로 전환되면, 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트는 원하는 형태로 얻어진다.
적절한 약학적으로 허용가능한 염은 적절한 약학적으로 허용가능한 염산(hydrochloric), 황산, 인산, 질산, 탄산, 붕산, 술팜산(sulfamic), 및 브롬화수소산(hydrobromic)과 같은 무기산 또는 아세트산(acetic), 프로피온산(propionic), 부티르산(butyric), 타르타르산(tartaric), 말레산(maleic), 하이드록시말레산(hydroxyl maleic), 푸마르산(fumaric), 말산(malic), 시트르산(citric), 젖산 (lactic), 점액산(mucic), 글루콘산(gluconic), 벤조산(benzoic), 숙신신(succinic), 옥살산(oxalic), 페닐아세트산(phenylacetic), 메탄술폰산(methanesulphonic), 톨루엔슬폰산(toluenesulphonic), 벤젠술폰산(benzenesulphonic), 살리실산(salicylic), 술파닐산(sulphanilic), 아스파르트산(aspartic), 글루타민산(glutamic), 에데트산(edetic), 스테아르산(stearic), 팔미트산(palmitic), 올레산(oleic), 라우르산(lauric), 판토텐산(pantothenic), 타닌산(tannic), 아스코르브산(ascorbic) 및 발레르산(valeric acids)과 같은 유기산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적절한 염기 염(base salts)은 비독성 염을 형성하는 염기로부터 형성된다. 예는 알루미늄(aluminium) 염, 아르기닌(arginine) 염, 벤자틴(benzathine) 염, 칼슘(calcium) 염, 콜린(choline) 염, 다이에틸아민(diethylamine) 염, 디올라민(diolamine) 염, 글라이신(glycine) 염, 리신(lysine) 염, 마그네슘(magnesium) 염, 메글루민(meglumine) 염, 올라민(olamine) 염, 포타슘(potassium) 염, 소듐(sodium) 염, 트로메타민(tromethamine) 염 및 아연(zinc) 염을 포함한다. 또한 산 및 염기의 절반의 염(hemisalts)이, 예를 들면, 헤미설페이트(hemisulfate) 염 및 헤미칼슘 염을 형성할 수 있다.
본 발명의 방법으로부터 수득된 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트는 단일 결정형(single crystal form) 또는 결정형의 혼합물로 존재할 수 있거나 또는 무정형(amorphous)일 수 있다.
또한 본 발명의 방법은 하나 또는 그 이상의 원자가 동일한 원자번호를 가지는 원자로 대체되는 모든 약학적으로 허용가능한 동위원소적으로-표지된 형태의 화합물 3 또는 4를 제공하는데 사용될 수 있으나, 원자량 또는 질량수(mass number)는 자연에서 항상 발견되는 우세한 동위원소의 원자량 또는 질량수와는 상이하다.
본 발명에서 사용되고 얻어진 화합물의 포함에 적절한 동위원소의 예는 2H 및 3H와 같은 수소, 11C, 13C 및 14C와 같은 탄소, 36Cl과 같은 염소(chlorine), 18F와 같은 불소(fluorine), 123I 및 125I와 같은 요오드(iodine), 13N 및 15N와 같은 질소(nitrogen), 15O, 17O 및 18O와 같은 산소(oxygen), 32P와 같은 인(phosphorus), 및 35S와 같은 황(sulphur)의 동위원소를 포함한다.
예를 들면, 방사성의 동위원소가 결합된 특정한 동위원소적으로-표지된 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 유용하다. 방사성의 동위원소 삼중수소(tritium), 즉, 3H, 및 탄소-14, 즉, 14C는, 특히 용이한 결합(incorpoeation) 및 검출의 준비수단의 관점에서 상기 목적에 유용하다. 중수소(deuterium), 즉, 2H와 같은 무거운 동위원소(heavier isotope)로의 치환은 보다 큰 대사 안정성 요건으로부터 유래한 특정한 치료학적 장점, 예를 들면, 증가된 생체 내 반감기 또는 감소된 투여량을 공급할 수 있으므로 일부 상황에서 더 바람직할 수 있다.
11C, 18F, 15O 및 13N와 같은, 동위원소를 방출하는 양전자(positron)로의 치환은 기질 수용체 점유를 조사하기 위한 양전자 방출 토포그래피(Positron Emission Topography, PET) 연구에 이용될 수 있다.
동위원소적으로-표지된 화합물은 당업자에게 알려진 통상적 기술 또는 기존에 사용된 비-표지된 시약 대신에 적절한 동위원소적으로-표지된 시약을 사용하여 사용된 것과 유사한 과정에 의해 일반적으로 제조될 수 있다.
X-선 분말회절패턴(X-Ray powder diffraction pattern)은 측정 조건(사용된 장비, 시료 조제 또는 기계와 같은)에 따라 하나 또는 그 이상의 측정 에러를 가질 수 있다는 것은 당업계에 알려져 있다. 특히, X-선 분말회절패턴에서 강도는 측정 조건 및 시료 준비에 따라 변동할 수 있다는 것이 일반적으로 알려져 있다. 예를 들면, X-선 분말회절 기술 분야의 당업자는 피크의 상대적 강도가 테스트 및 유형 상의 시료의 경향(orientation) 및 사용된 기계의 세팅(setting)에 따라 다양할 수 있다는 것을 깨닫게 될 것이다. 또한 숙련공은 반사(reflections)의 위치가 회절계(diffractometer)에 시료가 있는 정확한 높이 및 회절계의 제로 교정(zero calibration)에 의해 영향을 받을 수 있음을 알 것이다. 또한 시료의 표면 평면도(surface planarity)는 작은 영향을 가질 수 있다. 따라서, 당업자는 여기에 제시된 회절 패턴(diffraction pattern) 데이타가 절대치로 해서되어서는 안되며, 본 명세서에 개시된 것과 실질적으로 동일한 파워 회절 페턴을 제공하는 임의의 결정형이 본 개시의 범위 내에 있다는 것을 알 것이다(추가 정보를 위해서 Jenkins, R & Snyder, R.L. ‘Introduction to X-Ray Powder Diffractometry’ John Wiley & Sons, 1996을 참조).”
본 명세서의 설명 및 청구항에 걸쳐, 용어 "포함하는(comprise)” 및 “포함하는(contain)”및 이들의 변형(variations)은 “포함하나 이에 제한되지 않는다"를 의미하고, 다른 부분(moieties), 첨가물(additives), 구성요소(components), 정수(integers) 또는 단계를 배제하고자 하는 것은 아니다(배제하지 않는다). 본 명세서의 설명 및 청구항에 걸쳐, 문맥에 요구하지 않는 한, 단수(singular)는 복수(plural)를 포함한다. 특히, 부정관사(indefinite article)가 사용되는 경우에, 문맥에 요구하지 않는 한, 명세서는 단일성(singularity) 뿐만 아니라 복수로 고려될 것이다.
본 발명의 특별한 패턴, 실시형태 또는 실시예와 함께 설명된 특색(features), 정수(integers), 특성(characteristics), 화합물, 화학적 부분 또는 군은, 양립할 수 없다면, 여기에 설명된 임의의 다른 패턴, 실시형태 또는 실시예로 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 개시된 모든 특색(임의의 수반하는 청구항, 요약 및 도면을 포함하는), 및/또는 개시된 임의의 방법 또는 과정의 모든 단계는, 적어도 상기 특색 및/또는 단계의 일부가 상호 배타적(mutually exclusive)인 경우의 조합(combinationss)을 제외하고, 임의의 조합으로 혼합될 수 있다. 본 발명은 앞서 말한 상세한 실시형태에 제한되지 않는다. 본 발명은 본 명세서(임의의 수반하는 청구항, 요약 및 도면을 포함하는)에 개시된 특색의 임의의 신규한 것, 또는 임의의 신규한 조합, 또는 임의의 개시된 방법 또는 과정의 단계의, 임의의 신규한 것, 또는 임의의 신규한 조합으로 연장한다.
독자는 본 출원과 관련하여 본 명세서 이전에 또는 현재 출원된 대중에게 공개된 모든 논문 및 문서에 주목해야 하고, 상기 모든 논문 및 문서의 내용은 참조로 본 전문에 삽입된다.
하기의 약어는 본 명세서에서 사용된 것이다:
ACN - 아세토니트릴(acetonitrile)
DMF - N,N-디메틸포름알데하이드(N,N-dimethylformamide)
DMSO - 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)
IPA - 아이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)
MEK - 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone)
MIBK - 메틸 아이소-부틸 케톤(methyl iso-butyl ketone)
NMP - N-메틸피롤리디논(N-methylpyrroldinone)
PEG - 프로필렌 글리콜(polyethylene glycol)
TBDMS - 3차-부틸디메틸실일(tert-butyldimethylsilyl)
TBME - 3차-부틸 메틸 에테르(tert-butyl methyl ether)
TFA - 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)
FDA - 미국식품의약국(Food and Drug Administration)
젬시타빈 -[페닐- 벤족시 -L-알라닌일)]- 포스페이트의 각각의 이성질체는 하기의 특성화 방법을 사용하여 특징화될 수 있다: 양성자(1H), 탄소(13C), 인(phosphorus) (31P) 및 불소(fluorine)(19F) NMR 스펙트럼은 25℃에서 브루커 아반스 500 분광계(Bruker Avance 500 spectrometer) 상에서 기록되었다.
스펙트럼은 중수소화된 용매 피크로 자동 보정(auto-calibrated)되었고 모든 13C NMR 및 31P NMR은 양성자-짝풀림(proton-decoupled)되었다. 최종 화합물의 순도는 35분 내에 100/0부터 0/100까지의 H2O/MeOH의 구배 용출이 있는 분석 칼럼(analytic column with a gradient elution)으로서 Varian Polaris C18-A (10 uM)을 사용하여 HPLC 분석에 의해 >95% 되도록 검증되었다. HPLC 분석은 배리언 프로스타(Varian Prostar) (LC Workstation-Varian prostar 335 LC detector)에 의해 수행되었다.
2′- 데옥시 -2′,2′- 디플루오로 -D-시티딘-5′-O-[페닐( 벤질옥시 -L-알라닌일)]-(S)-포스페이트 3
(ES+) m/z, found: (M + Na+) 603.14. C25H27F2N4O8NaP required: (M+) 580.47.
31P NMR (202 MHz, MeOD): δP3.66
1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 7.58 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-6), 7.38 - 7.32 (m, 7H, ArH), 7.26 - 7.20 (m, 3H, ArH), 6.24 (t, J = 7.5 Hz, 1H, H-1’), 5.84 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-5), 5.20 (AB 시스템, JAB = 12.0 Hz, 2H, OCH 2 Ph), 4.46 - 4.43 (m, 1H, H-5’), 4.36 - 4.31 (m, 1H, H-5’), 4.25 - 4.19 (m, 1H, H-3’), 4.07 - 4.00 (m, 2H, H-4’, CHCH3), 1.38 (d, J = 7.2 Hz, 3H, CHCH 3).
19F NMR (470 MHz, MeOD): δF - 118.0 (d, J = 241 Hz, F), - 120.24 (broad d, J = 241 Hz, F).
13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 174.61 (d, 3 J C -P = 5.0 Hz, C=O, 에스테르(ester)), 167.63 (C-NH2), 157.74 (C=O base), 152.10 (d, 2 J C -P = 7.0 Hz, C-Ar), 142.40 (CH-base), 137.22 (C-Ar), 130.90, 129.63, 129.39, 129.32, 126.32 (CH-Ar), 124.51 (d, 1 J C - F = 257 Hz, CF2), 121.47, 121.43 (CH-Ar), 96.67 (CH-base), 85.92 (broad signal, C-1'), 80.31 (C-4'), 71.27 (apparent t, 2 J C - F = 23.7 Hz, C-3'), 68.03 (OCH2Ph), 65.73 (d, 2 J C - P = 5.30 Hz, C-5’), 51.66 (CHCH3), 20.42 (d, 3 J C - P = 6.25 Hz, CHCH3).
35분 내에 100/0부터 0/100까지의 H2O/MeOH 용출이 있는, 역방향 HPLC(Reverse HPLC)는 t R = 22.53 분에서 부분입체이성질체의 하나의 피크를 나타냈다.
2′- 데옥시 -2′,2′- 디플루오로 -D-시티딘-5′-O-[페닐( 벤질옥시 - L-알라닌일)]-(R)-포스페이트 4.
(ES+) m/z, found: (M + Na+) 603.14. C25H27F2N4O8NaP required: (M+) 580.47.
31P NMR (202 MHz, MeOD): δP 3.83
1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 7.56 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-6), 7.38 - 7.31 (m, 7H, ArH), 7.23 - 7.19 (m, 3H, ArH), 6.26 (t, J = 7.5 Hz, 1H, H-1’), 5.88 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-5), 5.20 (s, 2H, OCH 2 Ph), 4.49 - 4.46 (m, 1H, H-5’), 4.38 - 4.34 (m, 1H, H-5’), 4.23 - 4.17 (m, 1H, H-3’), 4.07 - 4.01 (m, 2H, H-4’, CHCH3), 1.38 (d, J = 7.2 Hz, 3H, CHCH 3).
19F NMR (470 MHz, MeOD): δF - 118.3 (d, J = 241 Hz, F), - 120.38 (broad d, J = 241 Hz, F).
13C NMR (125 MHz, MeOD): δC 174.65 (d, 3 J C -P = 5.0 Hz, C=O, ester), 167.65 (C-NH2), 157.75 (C=O base), 152.10 (d, 2 J C -P = 7.0 Hz, C-Ar), 142.28 (CH-base), 137.50 (C-Ar), 130.86, 129.63, 129.40, 129.32, 126.31 (CH-Ar), 124.50 (d, 1 J C - F = 257 Hz, CF2), 121.44, 121.40 (CH-Ar), 96.67 (CH-base), 85.90 (broad signal, C-1'), 80.27 (C-4'), 71.30 (apparent t, 2 J C - F = 23.7 Hz, C-3'), 68.02 (OCH2Ph), 65.50 (C-5’), 51.83 (CHCH3), 20.22 (d, 3 J C - P = 7.5 Hz, CHCH3).
35분 내에 100/0부터 0/100까지의 H2O/MeOH 용출이 있는, 역방향 HPLC(Reverse HPLC)는 t R = 21.87 분에서 부분입체이성질체의 하나의 피크를 나타냈다.
실시예 1 - 용매 스크리닝
우선 17개의 상이한 용매로 용매 스크리닝을 수행하였다(표 1 참조). 대략 25 mg의 NUC-1031의 부분이성질체 혼합물 (33:67 (R):(S))을 열거된 용매(1 ㎖)에서 현탁하였고 하룻밤 동안 저었다. 용해가 발생한 경우에 더 많은 고체를 첨가하였다. 현탁액을 침전시켰고 용액에 있는 2개의 부분입체이성질체의 상대적 양을 HPLC로 결정하였다.
표 1: 굵게 표시된 퍼센트는 용액에 있는 높은 (>85%) 부분입체이성질체 농축도(enrichment)를 나타낸다.
용매 (R)- 에피머
[%] 		(S)- 에피머
[ % ] 		(R)- 에피머
[mg/ml] 		(S)- 에피머
[mg/ml]
TBME 39.4 60.6 0.1 0.1
아세톤 12.3 87.7 2.2 7.7
THF 18.6 81.4 3.0 6.6
MeOH 24.5 75.5 22.8 35.1
EtOAc 24.9 75.1 0.7 1.1
EtOH 13.5 86.5 4.9 15.7
IPA 5.8 94.2 1.6 13.0
MEK 12.4 87.6 0.9 3.2
ACN 5.4 94.6 1.1 10.0
iPrOAc 31.8 68.2 0.6 0.6
nPrOH 9.1 90.9 2.2 10.8
n헵탄 31.8 68.2 0.4 0.4
H2O 23.2 76.8 0.5 0.9
톨루엔 10.8 89.2 0.2 0.7
MIBK 25.6 74.4 0.7 1.0
nBuOH 5.2 94.8 1.6 14.4
MeTHF 19.9 80.1 0.6 1.2
따라서 다수의 용매 (아세톤, EtOH, IPA, MEK, CAN, nPrOH, 톨루엔, nBuOH)은 용액에 있는 (S)-에피머의 높은 부분입체이성질체 농축도를 나타낸다. 상기 스크리닝은 용액에 있는 (S)- 부분입체이성질체의 우수한 (>94%) 농축도를 주도하는 3개의 용매를 확인하였다: 아이소프로판올, 아세토니트릴 및 n-부탄올.
실시예 2 - 결정화 최적화
아세토니트릴 및 아이소프로판올에 의해 제공된 농축도(enrichment)를 농도 및 온도의 범위로 평가하였다(표 2 참조).
2가지 유형의 실험이 수행되었다: 상이한 부피에 있는 단일 슬러리 (20℃) 및 80℃에서 슬러리/재결정화. 실험을 위하여 200 mg의 부분이성질체혼합물 (33:67 (R):(S))을 하기에 나타낸 용매 및 부피에서 현탁하였고 선택적으로 환류(reflux) 가열하였고 20℃로 냉각시켰다. 현탁액을 하룻밤 동안 젓고(stirred) 분리하였다. 용액 및 고체 케이크 모두에 존재하는 2개 에피머의 상대적 비율은 HPLC로 결정되었다.
온도
[℃] 		용매
(고체/용액) 		부피
[vol] 		(R)-
에피머
[ % ] 		(S)-
에피머
[ % ] 		(R)-
에피머 [mg/ml] 		(S)-
에피머
[mg/ml] 		케이크
(Cake)
[mg]
20 ℃ ACN 고체 25 44.6 55.4 125
20 ℃ ACN 25 6.9 93.1 0.67 9.04
20 ℃ ACN 고체 50 63.7 36.3 83
20 ℃ ACN 50 6.2 93.8 0.59 8.85
20 ℃ ACN 고체 75 91.8 8.2 59
20 ℃ ACN 75 6.1 93.9 0.63 9.74
20 ℃ IPA 고체 25 77.6 22.4 68
20 ℃ IPA 25 4.2 95.8 0.77 17.75
20 ℃ IPA 고체 50 91.7 8.3 59
20 ℃ IPA 50 5.6 94.4 0.77 12.98
20 ℃ IPA 고체 75 91.8 8.2 72
20 ℃ IPA 75 7.5 92.5 0.58 7.16
83 ℃ ACN 고체 25 41.7 58.3 161
83 ℃ ACN 25 8.4 91.6 1.01 11.03
83 ℃ ACN 고체 50 65.6 34.4 80
83 ℃ ACN 50 9.0 91.0 1.09 11.00
83 ℃ ACN 고체 75 90.1 9.9 74
83 ℃ ACN 75 10.0 90.0 1.19 10.67
83 ℃ IPA 고체 25 74.3 25.7 96
83 ℃ IPA 25 7.2 92.8 1.42 18.20
83 ℃ IPA 고체 50 88.0 12.0 147
83 ℃ IPA 50 20.8 79.2 3.38 12.83
각각의 시료에 대하여, 상기 처리를 반복하였으나, 이것이 추가적 농축(enrichment)을 유도하지는 않았다. 첫번째 측면에서 서술된 바와 같이, 부분입체이성질체적 혼합물의 단순한 용해(dissolution)가 우수한 부분입체이성질체적, 특히(S)-epimer의 농축을 제공할 수 있음을 나타낸다. 상기 효과는 NUC-1031의 질량에 비례하여 용매의 농축에 의해 실질적으로 영향을 받지 않고 또한 온도에 의해서도 실질적으로 영향을 받지 않는다. 따라서, 상기 과정은 효율적인 실온 분리 기술을 제공한다(ambient temperature separation technique).
실시예 3 - 규모 확대(scale-up)
2 x 25 g의 (R) 및 (S) 에피머의 부분이성질체혼합물(33:67(R):(S))을 25℃에서 75 부피의 아세토니트릴에 각각 용해시켰다. 현탁액을 여과하는 동안에 혼합하였다. 첫번째 여과액은 용액 A2 및 고체 A1을 제공하였다. 여과기 케이크(filter cake)를 재-슬러리하였고 얻어진 현탁액은 여과하여 두번째 용액 B2 및 두번째 고체 케이크 B1을 수득하였다(표 3 참조).
(R)- 에피머
[ % ] 		(S)- 에피머
[ % ] 		케이크(Cake)
[g]
고체 A1
(첫번?? 여과 후)		 73.7 26.3 18.43
용액 A2 (첫번?? 여과로부터 수득된) 5.2 94.8 ca. 31
고체 B1
(두번째 여과 후)		 91.6 8.4 14.9
용액 B2 (두번째 여과로부터 수득된) 6.5 93.5 ca. 4
실시예 4 - (S)- 에피머의 부분입체이성질체 순도의 추가 농축도
규모 확대(scale up)가 확대된 2개의 용액 A2 및 B2의 잔여물(remainder)을 아세토니트릴 (ca. 2.6 L)에 혼합하였고, 본래 부피의 약 50%로 농축시켰고 3일동안 저었다. 형성된 현탁액을 여과하였고 이는 여과기 상에서 매우 높은 부분입체이성질체적으로 농축된 (S)-에피머의 고체 시료를 얻는 결과를 가졌다(표 4).
(R)- 에피머
[ % ] 		(S)- 에피머
[ % ] 		케이크(Cake)
[g]
농축/여과 과정으로부터 얻은 고체 0.2 99.8 19.0
따라서, (S)-에피머를 본 발명의 과정을 사용하여 대규모 상에서 우수한 부분입체이성질체 순도로 수득할 수 있다. 이 과정은 모든 부수적인 어려움이 있는 크로마토그래피 단계의 필요성을 회피하기 때문에 대규모 제조를 위한 실질적 장점을 나타낸다.
실시예 5 - (R)- 에피머의 부분입체이성질체 순도의 추가 농축(enrichment)
(R)-에피머의 높은 부분입체이성질체 농축물을 수득하기 위하여, 고체 B1의 시료를 용매 혼합물에서 슬러리화(표 5에 나타낸 바와 같이 1 ㎖의 용매 혼합물에 있는 50 mg의 고체)하였고 여과하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 얻어진 고체는 항용매(antisolvent)로서 아세토니트릴에 첨가된 물로 수득되는 최상의 결과를 가지는, (R)-에피머로 농축되었다.
용매 (R)- 에피머
[ % ] 		(S)- 에피머
[ % ] 		케이크(Cake)
[mg]
IPA/H20 9:1 97.2 2.8 50
ACN/IPA 9:1 94.5 5.5 35
ACN/H20 9:1 99.2 0.8 20
IPA 93.7 6.3 34
아세토니트릴/물 혼합물로부터의 산출량은 낮았고 그래서 실험을 용매 혼합물에서 소량의 물로 반복하였다. 상기 결과는 향상된 회수 및 일부 부분입체이성질체 농축을 나타냈다(표 6).
용매 (R)- 에피머
[ % ] 		(S)- 에피머
[ % ] 		케이크(Cake)
[mg]
ACN + 2% H20 94 6 42
ACN + 1% H20 93.3 6.7 43
ACN + 0.5% H2O 93 7 43
(R)-에피머 (고체 B2)를 주로 포함하는 물질을 18 시간 동안 ACN/물 10/1의 20배 부피에서 재슬러리화 시켰고 여과된 후 수득된 고체를 아세토니트릴로 세척하였다. 결과로 나온 고체는 우수한 부분입체이성질체 순도의 (R)-에피머를 포함하였다(표 7).
- (R)- 에피머
[ % ] 		(S)- 에피머
[ % ] 		케이크(Cake)
[g]
고체 97.1 2.9 11.6
용액 65 35 -
따라서, (R)-에피머는 본 발명의 과정을 이용하여 대규모의 우수한 부분입체이성질체 순도로 얻을 수 있다. 다시 말하면, 상기 과정이 모든 자체의 수반하는 어려움이 있는 크로마토그래피 단계의 필요성을 회피하기 때문에 본 발명은 대규모 제조를 위한 실질적 장점을 나타낸다.
실시예 6 - IPA를 사용한 (S)- 에피머의 분리를 위한 추가적으로 최적화된 과정
2’-데옥시-2’, 2’-디프루오로-D-시티딘-5’-O-[페닐(벤족시- L-알아닐)]포스페이트(120 g; 4:6 (R):(S); 또한 화합물을 제조하는 과정에서 기인한 미지의 불순물 5 질량%를 포함한다)를 IPA (600 ㎖)에 첨가하였고 슬러리를 형성하였다. 슬러리를 50-54℃로 가열하였고 2시간 동안 그 온도에서 교반하였다. 그런 다음 따뜻한 동안에 슬러리를 여과하였다. 케이크가 여전히 여과기에 있는 동안에 일부의 따뜻한 (50-52℃) IPA(60 ㎖)로 추가적으로 세척하였다. 여과액을 약 2시간 동안 26-30℃로 종자물질(seed material)(12 ㎖ IPA의 슬러리로서 600 mg 또는 95% 부분입체이성질체 순도 s-이성질체)로 천천히(약 2시간에 걸쳐) 냉각시켰다. 혼합물을 26-30℃에서 18시간 동안 저었다(stirred). 그런 다음 혼합물을 18-22℃로 냉각시키고 추가적으로 8시간 동안 저었다.
현탁액을 여과하였고 케이크(cake)를 냉각된(약 15℃) IPA(120 ㎖)로 세척하였다. 고체 생성물을 약 42℃에서 진공하에서 건조시켰고 (S)-에피머를 제공하였다(총 양의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트 시작 물질에 기초하여 25% 산출량; 최종 부분입체이성질체 순도: 96-98%).
실시예 7 - NUC -1031의 (S)- 에피머의 다형체 (polymorph) I
실시예 6에서 설명된 과정은 결정형, I형으로 NUC-1031의 (S)-에피머를 제공한다. I형은 (S)-에피머의 비용매화된(unsolvated) 유리 염기의 다형체(polymorph)이다. 상기 형태는 (S)-에피머가 크로마토그래피 기술에 의해 에피머의 분리(separation) 후 격리(isolated)될 때 채택하는 것으로 관찰되는 형태 및 또한 (S)-에피머가 2개 이성질체의 혼합물의 부분으로서 수득될 때 관찰되는 형태와는 상이하다. 다형체 I가 (S)-이성질체의 열역학적으로(thermodynamically) 가장 안정한 다형체임을 발견하였다.
X-선 분말회절 ( XRPD )
NUC-1031의 (S)-에피머의 다형체 I의 시료는 3 및 35° 2θ 사이에서 스캔되었다(scanned). 물질은 켑톤 필름(Kapton film)이 장착된 웰로 부드럽게 압축되었다. 그런 다음 시료를 전송 모드에서 실행되는(running in) PANalytical X’Pert Pro 회절계로 부하(load)하였고 하기의 실험 조건을 사용하여 분석하였다:
미가공(raw) 데이터 원본 XRD 측정 (*.XRDML)
시작 위치 [°2θ] 3.0066
말단 위치 [°2θ] 34.9866
단계 크기 [°2θ] 0.0130
스캔 단계 시간[s] 67.9377
스캔 유형 지속(Continuous)
PSD 모드 스캐닝(Scanning)
PSD 길이 [°2θ] 3.35
오프셋(Offset) [°2θ] 0.0000
분기 슬릿 유형(Divergence Slit Type) 고정(Fixed)
분기 슬릿 크기(Divergence Slit Size)[°] 1.0000
견본 길이(Specimen Length) [mm] 10.00
측정 온도[℃] 25.00
양극 물질(Anode Material) Cu
Kα1 [Å] 1.54060
Kα2 [Å] 1.54443
Kα2 / Kα1 비율 0.50000
발전기 설정(Generator Settings) 40 mA, 40 kV
각도계 반지름(Goniometer Radius)[mm]: 240.00
분포 촛점-분기 슬릿(Dist. Focus-Diverg. Slit) [mm] 91.00
입사 선속 단색화 장치(Incident Beam Monochromator) No
회전(Spinning) No
얻어진 스펙트럼은 도 1에 나타낸 바와 같다. 관찰된 피크는 하기와 같다:
번호 Pos .
[ °2Th .] 		d-spacing
[Å] 		Rel . Int .
[%]
1 5.0 17.6 100
2 6.7 13.1 47
3 8.0 11.0 99
4 11.3 7.8 20
5 12.3 7.2 49
6 12.8 6.9 17
7 13.1 6.8 48
8 13.3 6.7 44
9 14.2 6.2 22
10 14.5 6.1 36
11 15.1 5.9 19
12 16.1 5.5 12
13 16.4 5.4 12
14 17.3 5.1 22
15 17.6 5.0 39
16 19.4 4.6 24
17 20.2 4.4 67
18 21.4 4.2 50
°2Th.= °2θ. 일반적으로 ± 0.2o 2θ ± 에러는 XRPD 피크 위치에 존재한다.
푸리에 변환 적외선 분광법(Fourier Transform infrared spectroscopy, FTIR)
NUC-1031의 (S)-에피머의 다형체 I의 적외선 분광법을 브루커 알파 분광계(Bruker ALPHA P spectrometer) 상에서 수행하였다. 시료를 2950 - 2800cm -1, 1465 - 1450cm-1 및 1380 - 1370cm-1에서 주요 피크를 가지는, 누졸(Nujol)(파라핀 오일)의 현탁액으로 측정하였다. 따라서, 기록된 스펙트럼은 물질의 흡광도 피크에 추가적으로 상기 흡광도를 나타냈다. 현탁액을 분광계의 플레이트의 중심으로 배치하였고 스펙트럼을 하기의 파라미터를 사용하여 수득하였다:
해상도: 4 cm-1
배경 스캔 시간: 16 스캔
시료 스캔 시간: 16 스캔
데이타 수득(Data Collection): 4000 내지 400 cm-1
결과 스펙트럼: 투과율(Transmittance)
소프트웨어: OPUS 버젼 6
얻어진 스펙트럼은 도 2에 나타낸 바와 같다. 관찰된 피크는 하기와 같다:
번호 파장수 [cm -1 ] Rel . Int . [ % ] 폭 [cm -1 ]
1 425.7392 0.021 7.4353
2 448.5075 0.026 219.8878
3 463.8758 0.080 21.4726
4 525.8831 0.233 26.2914
5 549.5826 0.015 9.4326
6 586.0468 0.143 32.4597
7 600.7830 0.027 31.8945
8 627.2445 0.023 381.6600
9 644.8066 0.036 8.3719
10 688.9070 0.166 26.6137
11 698.6981 0.016 17.5876
12 724.9307 0.036 9.2117
13 753.7883 0.120 39.1492
14 770.4498 0.048 10.5722
15 791.0419 0.055 9.3795
16 817.0425 0.034 556.0071
17 837.8835 0.030 296.7700
18 893.7064 0.047 333.1303
19 904.0403 0.016 5.0158
20 942.5805 0.283 48.3700
21 1010.0664 0.065 9.4593
22 1031.9486 0.124 85.9780
23 1065.9395 0.079 22.7902
24 1093.1437 0.152 21.7363
25 1149.3243 0.189 30.0541
26 1196.3871 0.133 30.4226
27 1250.1776 0.127 13.7038
28 1291.5686 0.068 17.8539
29 1335.1966 0.013 17.5460
30 1409.8531 0.039 10.4020
31 1488.6895 0.072 608.5739
32 1521.4792 0.044 1460.2810
33 1619.6333 0.232 57.7815
34 1654.7923 0.070 11.9699
35 1733.6353 0.131 12.0269
36 3203.2904 0.061 100.4941
37 3425.8598 0.019 18.5688
38 3467.9918 0.007 9.6384

Claims (24)

  1. 하기 단계를 포함하는, 실질적 부분입체이성질체으로 순수형(substantially diastereoisomerically pure form)의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트(gemcitabine-[phenyl-benzoxy-L-alaninyl)]-phosphate)의 적어도 하나의 부분입체이성질체(diastereoisomer)를 제공하는 방법:
    슬러리(slurry)를 형성하기 위하여 용매 또는 용매 혼합물(mixture of solvents)에 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트 및 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트의 혼합물을 현탁하는 단계; 및
    고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트를 제공하기 위한 슬러리 및 용매 또는 용매의 혼합물에 용해된 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트를 포함하는 여과액을 여과하는 단계;
    여기서 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트는 실질적 부분입체이성질체적으로 순수한 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트이고/이거나 상기 여과액은 실질적 부분입체이성질체적으로 순수한 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 슬러리는 일단 형성되면 약 30℃부터 약 80℃까지의 온도에서 선택적으로 가열되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 슬러리는 바람직하게는 여과하기 전에 냉각되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트를 세척하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 부분입체이성질체적으로 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 제공하는 방법 및 상기 방법은 실질적 부분입체이성질체적으로 순수형의 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 수득하기 위하여 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 여과액으로부터 용매를 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 용매 또는 용매의 혼합물을 제거하는 단계는 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 농축된 여과액을 제공하기 위하여, 증발, 예를 들면, 증류 또는 감압 증발에 의해 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 여과액으로부터 용매 또는 용매 혼합물의 일부를 제거하는 단계;
    선택적으로 농축된 여과액을 교반(agitating)하는 단계; 및
    실질적 부분입체이성질체적으로 순수형의 고체로서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 얻기 위하여 농축된 여과액을 여과하는 단계.
  7. 제5항에 있어서, 용매 또는 용매의 혼합물을 제거하는 단계는 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 냉각된 여과액을 제공하기 위하여 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 포함하는 여과액을 냉각시키는 단계;
    선택적으로 냉각된 여과액을 교반(agitating)하는 단계; 및
    실질적 부분입체이성질체 순수형태의 고체로서 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 얻기 위하여 냉각된 여과액을 여과하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 종자 물질(seed material)을 여과액에 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 추가 용매를 여과액에 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적 부분입체이성질체적으로 순수한 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트를 세척하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 부분입체이성질체적으로 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트를 제공하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 하기의 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    두번째 슬러리를 형성하기 위하여 두번째 용매 또는 두번째 용매 혼합물에서 첫번째 여과로부터 수득된 고체 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-포스페이트를 현탁하는 단계; 및
    실질적 부분입체이성질체적 순수형의 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트를 제공하기 위하여 두번째 슬러리를 여과하는 단계.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 극성 양성자성 용매(polar protic solvent) 및 극성 비양성자성 용매(polar aprotic solvent)로부터 선택되는 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 IPA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 용매는 IPA인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 용매 또는 용매 혼합물은 아세토니트릴(acetonitrile)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(R)-포스페이트.
  19. I 형태의 결정형인, 젬시타빈-[페닐-벤족시-L-알라닌일)]-(S)-포스페이트 결정 형(crystalline form).
  20. 제19항에 있어서, 상기 결정형은 Kα2 / Kα1 비율이 0.5인 Cu 방사선을 사용하여 측정될 때 5.0 ± 0.2, 6.7 ± 0.2, 8.0 ± 0.2, 11.3 ± 0.2, 20.2 ± 0.2 및 21.4 ± 0.2로 구성된 군으로부터 선택되는 2θ에서 적어도 2개의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 가지는 것을 특징으로 하는 결정형.
  21. 제20항에 있어서, 상기 결정형은 Kα2 / Kα1 비율이 0.5인 Cu 방사선을 사용하여 측정될 때 5.0 ± 0.2, 6.7 ± 0.2, 8.0 ± 0.2, 11.3 ± 0.2, 20.2 ± 0.2 및 21.4 ± 0.2로 구성된 군으로부터 선택되는 2θ에서 적어도 4개의 피크를 갖는 XRPD 패턴 가지는 것을 특징으로 하는 결정형.
  22. 제21항에 있어서, 상기 결정형은 Kα2 / Kα1 비율이 0.5인 Cu 방사선을 사용하여 측정될 때 2θ 5.0 ± 0.2, 6.7 ± 0.2, 8.0 ± 0.2, 11.3 ± 0.2, 20.2 ± 0.2 및 21.4 ± 0.2로 구성된 군으로부터 선택되는 피크들(peaks)을 갖는 XRPD 패턴 가지는 것을 특징으로 하는 결정형.
  23. 제19항에 있어서, 상기 결정형은 도 1에 나타낸 바와 같은 실질적으로 XRPD 패턴을 갖는 것을 특징으로 하는 결정형.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정형은 도 2에 나타낸 바와 같이 실질적으로, 누졸(Nujol)에서 현택액으로서 측정될 때, FTIR 패턴을 갖는 것을 특징으로 하는 결정형.
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