KR20170035923A

KR20170035923A - 개선된 시알릴화를 갖는 Ｆｃ 를 갖는 변이체를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20170035923A
Application number: KR1020177002628A
Authority: KR
Inventors: 셀린 모네; 알렉상드르 퐁뗀
Original assignee: 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2017-03-31
Also published as: WO2016016586A1; AU2015295090A1; US20170260254A1; CA2956822A1; FR3024453A1; CN106573978A; EP3174904A1; JP2017522040A; FR3024453B1; BR112017001966A2; MX2017001516A

Abstract

본 발명은 Fc 분절의 시알릴화를 증가시키는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임). 본 발명은 또한 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 변이체를 생산하는 방법으로서, 부모 폴리펩티드에 상대적으로 Fc 분절의 개선된 시알릴화를 갖고, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

Description

개선된 시알릴화를 갖는 Ｆｃ 를 갖는 변이체를 생산하는 방법 {METHOD FOR PRODUCING VARIANTS HAVING AN FC WITH IMPROVED SIALYLATION}

본 발명은 분절 Fc 의 시알릴화를 증가시키는 방법으로서, 상기 분절 Fc 의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

모노클로날 항체는 오늘날 암, 자가면역 질환, 만성 염증성 질환, 이식 거부증, 감염성 질환 및 심혈관 질환을 포함하는 여러 가지 병의 치료제로서 사용된다. 그러므로 모노클로날 항체는 중대한 치료적 도전을 이룬다. 모노클로날 항체 중 다수는 이미 시판 중이고, 계속해서 증가하는 비율이 임상 시험으로 개발 중이다. 그러나, 항체의 이차 효과를 제어하기 위해서, 항체의 구조적 및 기능적 특성을 최적화해야 할 상당한 필요가 존재한다.

치료시 모노클로날 항체의 사용에 있어서 중대한 문제 중 하나는 혈류 중 모노클로날 항체의 지속성이다. 항체의 청소율은 치료 효율, 및 그러므로 환자에서 바람직하지 않은 효과를 야기할 수 있는 약물의 투여 빈도 및 양에 직접 영향을 미친다.

아이소타입 G 의 면역글로불린 (IgG) 은 인간에서 가장 빈번한 클래스의 면역글로불린에 해당하고, 또한 치료시 가장 많이 사용된다. 마우스 IgG 의 불변 영역 (Fc) 에서 특정 돌연변이유발의 상이한 실험들은, 그들 중 일부에 대해, IgG 와 FcRn 사이의 상호작용에서 수반되는 특정 결정적 아미노산 잔기를 동정할 가능성을 제공했다 (Kim et al., 1994, Eur J Immunol.; 24:2429-34; Kim et al., 1994, Eur J Immunol.; 24: 542-8; Medesan et al., 1996, Eur J Immunol.; 26:2533-6; Medesan et al, 1997, J Immunol; 158:2211-7). 더욱 최근에 인간에서 연구가 수행되었다 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem.; 276: 6591-6604).

그러나, 개선된 반감기를 갖고, 흥미로운 생물학적 특성을 갖는 항체, 또는 항체 분절을 찾을 필요가 항상 존재한다.

본 발명은 최적화된 시알릴화를 갖는 분절 Fc 를 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체를 수득하는 방법을 제공한다. 이러한 최적화된, 즉 개선된, 시알릴화는 특히 변이체에게 부모 폴리펩티드에 상대적으로 증가된 반감기, 뿐만 아니라 최적화된 항-염증 특성을 제공한다.

용어 《　반감기　》 는 소정의 동물의 혈류에서의 관심의 폴리펩티드의 생물학적 반감기를 언급하고, 혈류 및/또는 동물의 다른 조직으로부터 동물의 혈류에 존재하는 양의 절반이 제거되는데 요구되는 시간으로 표시된다.

실제로, 놀랍게도, 발명자들은 N-글리코실화 자리에 가까운 특정 위치에서 돌연변이된 분절 Fc 은 돌연변이되지 않은 분절 Fc 에 상대적으로 크게 증가된 시알릴화를 갖는다는 점을 발견했다. 이는 따라서 분절 Fc 의 관심의 특성, 특히 그것의 반감기에서 증가를 허용한다. 이는 또한 그것의 항-염증 활성에서 증가를 허용할 수 있다.

본 발명의 목적은 그러므로 Fc 분절의 시알릴화를 증가시키는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법이다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

바람직하게는, Fc 분절의 시알릴화를 증가시키는 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임), 및 그 후

- 수득된 분절 Fc 의 시알릴화를 분석하는 단계.

본 발명의 목적은 또한 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 부모 폴리펩티드의 Fc 분절의 시알릴화에 상대적으로 개선된 상기 Fc 분절의 시알릴화를 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법이다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

바람직하게는, Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체를 생산하는 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 수득된 분절 Fc 의 시알릴화를 분석하는 단계.

바람직하게는, Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체를 생산하는 상기 방법은 변이체가 부모 폴리펩티드의 효과기 활성에 상대적으로 감소된 상기 분절 Fc 에 의해 매개되는 적어도 하나의 효과기 활성을 갖게 해준다.

《 시알릴화의 증가　》 또는 《　개선된 시알릴화　》 는 수득된 단백질의 시알릴화가 돌연변이 단계 전의 상기 Fc 분절 또는 부모 폴리펩티드의 상기 분절 Fc 의 시알릴화에 상대적으로 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 35%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 45%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 만큼 증가되는 것을 의미한다.

단백질의 시알릴화는 잘 알려진 글리코실화 메카니즘이다 (특히 Essentials of Glycobiology, 2^nd edition, Varki et al, 2009 참고). 단백질의 시알릴화는 단백질의 글리코실화된 사슬에서의 적어도 하나의 시알산 (즉 N-아세틸뉴라민산 및 그의 유도체, 예컨대 N-글리코실뉴라민산, N-아세틸글리코실뉴라민산) 의, 공유 결합을 통한, 부가에 해당한다.

본원에서 사용되는, 용어 《　단백질　》 및 《　폴리펩티드　》 는 호환되게 사용되고, 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드를 포함하여, 공유 결합된 적어도 2 개의 아미노산의 서열을 언급한다.

용어 《　단백질　》 및 《　폴리펩티드　》 는 특히 항체 또는 면역글로불린, 특히 전체, 모노클로날, 다중특이적, 2 특이적, 이중특이적, 합성, 키메라, 인간화, 인간, 면역글로불린, 면역글로불린과의 융합 단백질, 접합 항체 및 그의 분절을 포함한다.

용어 《　단백질　》 및 《　폴리펩티드　》 는 또한 영역 Fc 의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드에 의해 정의되는 Fc 폴리펩티드, 특히 단리된 Fc 분절, 접합체 Fc, 다합체성 Fc 및 Fc 분절과의 융합 단백질을 포함한다.

《　Fc 분절　》 또는 《　Fc 영역　》 은 불변 면역글로불린 영역의 첫번째 도메인 (즉 CH1-CL) 을 제외한 전체 길이의 면역글로불린의 불변 영역을 의미한다. 따라서 분절 Fc 는 동종이합체로서, 각각의 단량체가 IgA, IgD, IgG 의 마지막 2 개의 불변 도메인 (즉 CH2 및 CH3), 또는 IgE 및 IgM 의 마지막 3 개의 불변 도메인 (즉 CH2, CH3 및 CH4), 및 이들 도메인의 N-말단 플렉서블 힌지 영역을 포함하는 동종이합체를 언급한다. IgA 또는 IgM 로부터 확장되는 분절 Fc 는 사슬 J 를 포함할 수 있다. 바람직하게는, N-말단 플렉서블 힌지 및 도메인 CH2-CH3, 즉 아미노산 C226 으로부터 C-말단 단부까지의 부분으로 이루어지는 IgG1 의 Fc 분절이 본 발명에서 사용된다 (번호지정은 권고되는 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물에 따름). 바람직하게는, 인간 IgG1 의 Fc 분절이 사용된다 (즉 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물에 따른 아미노산 226 내지 447). 이 경우에, EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물에 따라 아래쪽 힌지는 위치 226 내지 230 을 언급하고, 도메인 CH2 는 위치 231 내지 340 을 언급하고, CH3 도메인은 위치 341-447 를 언급한다. 본 발명에 따라 사용되는 분절 Fc 는 위치 226 의 상류에 있는 위쪽 힌지 영역 부분을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우에, 바람직하게는, 위치 216 내지 226 에 위치하는 영역 부분을 포함하는 인간 IgG1 의 분절 Fc 가 사용된다 (EU 인덱스에 따름). 이 경우에, 인간 IgG1 의 분절 Fc 는 아미노산 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224 또는 225 로부터 C-말단 단부까지의 부분을 언급한다.

정의 《　Fc 분절　》 은 《　단일 사슬 Fc　》 에 관한 scFc 분절을 포함한다. 《　scFc 분절　》 은 폴리펩티드 링커를 통해 연결된 2 개의 단량체성 Fc 의 유전적 융합에 의해 수득된 단순 사슬 분절 Fc 을 의미한다. scFc 는 기능적 이합체성 Fc 영역으로 자연적으로 접혀진다. 바람직하게는, 본 발명의 범위 내에서 사용되는 Fc 분절은 IgG1 또는 IgG2 의 Fc 분절로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 사용되는 분절 Fc 는 IgG1 의 분절 Fc 이다.

본 출원에서, Fc 분절의 잔기의 번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정이다 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

본 발명의 문맥에서, 부모 폴리펩티드는 《　부모 Fc 분절　》 로 호칭되는 Fc 분절을 포함한다.

《　아미노산의 돌연변이 》 는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 변화를 의미한다. 돌연변이는 특히 치환, 삽입 및 결실로부터 선택된다. 《　치환　》 은 부모 폴리펩티드의 서열에서 특정 위치에서의 하나 또는 여러 아미노산의 동일한 수의 다른 아미노산에 의한 대체를 의미한다. 바람직하게는, 치환은 점 유사 (point like) 이며, 즉 그것은 오직 단일 아미노산과 관련된다. 예를 들어, 치환 N434S 은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물에 따른 Fc 분절의 위치 434 에서의 아스파라긴이 세린으로 대체되어 있는 부모 폴리펩티드의 변이체를 언급한다. 《　삽입 》 은 부모 폴리펩티드 서열에서 특정 위치에서의 적어도 하나의 아미노산의 부가를 의미한다. 예를 들어, 삽입 G>235-236 은 위치 235 와 236 사이에서 글라이신의 삽입을 언급한다. 《　결실 》 은 부모 폴리펩티드 서열에서 특정 위치에서의 적어도 하나의 아미노산의 제거를 의미한다. 예를 들어, E294del 은 위치 294 에서의 글루탐산의 억제를 언급한다; 그러한 결실은 Del294 로 호칭된다.

《　부모 폴리펩티드　》 은 나중에 변이체를 생성하도록 수식되는 비-수식된 폴리펩티드를 의미한다. 상기 부모 폴리펩티드는 자연 기원의 폴리펩티드, 자연 기원의 폴리펩티드의 변이체, 자연 폴리펩티드의 수식된 버전 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 부모 폴리펩티드는 야생형의 Fc 분절, 그들의 분절 및 그들의 돌연변이체로부터 선택되는 분절 Fc 를 포함한다. 그러므로, 부모 폴리펩티드는 야생형의 분절 Fc 에 상대적으로 분절 Fc 에 아미노산의 기존 (pre-existing) 수식을 임의로 포함할 수 있다. 따라서 바람직하게는, 부모 폴리펩티드의 분절 Fc 은, 바람직하게는 P230S, T256N, V259I, N315D, A330V, N361D, A378V, S383N, M428L, N434Y 로부터 선택되는, 부가 돌연변이 (즉 기존 수식) 를 적어도 하나 이미 포함한다. 바람직하게는, 부모 폴리펩티드의 Fc 분절은 P230S/N315D/M428L/N434Y, T256N/A378V/S383N/N434Y, V259I/N315D/N434Y 및 N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y 로부터 선택되는 부가 돌연변이의 조합을 적어도 하나 포함한다.

바람직하게는, 첫번째 대안에 따르면, 부모 폴리펩티드는 분절 Fc, 바람직하게는 전체 Fc 분절로 이루어진다.

바람직하게는, 두번째 대안에 따르면, 부모 폴리펩티드는 분절 Fc 에 N- 또는 C-말단에서 융합된 아미노산의 서열로 이루어진다. 이 경우에, 유리하게는, 부모 폴리펩티드는 항체, 융합 Fc 또는 접합체 Fc 폴리펩티드이다.

바람직하게는, 부모 폴리펩티드의 분절 Fc 는 서열 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 및 5 로부터 선택된다. 바람직하게는, 부모 폴리펩티드의 분절 Fc 는 서열 SEQ ID NO: 1 을 갖는다.

SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 및 5 에 나타낸 서열은 N-말단에 힌지 영역을 전혀 포함하지 않는다.

SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 및 10 에 나타낸 서열은 각각 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 및 5 에 나타낸 서열에 상응하며, N-말단 위치에 그들의 힌지 영역을 포함한다. 또한, 특정 구현예에서, 부모 폴리펩티드의 분절 Fc 은 서열 SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 및 10 로부터 선택된다.

바람직하게는, 부모 폴리펩티드의 분절 Fc 은 서열 SEQ ID NO: 6 의 위치 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 또는 11-232 에 상응하는 서열을 갖는다.

대안적으로는, 부모 폴리펩티드는 면역글로불린, 항체 또는 항체 또는 면역글로불린에 N- 또는 C-말단에서 융합된 아미노산의 서열로 이루어진다.

《　변이체　》 는 부모 폴리펩티드의 서열과 적어도 하나의 아미노산 수식 만큼 상이한 폴리펩티드 서열을 의미한다.

바람직하게는, 변이체의 서열은 부모 폴리펩티드의 서열과 적어도 80% 동일성, 더욱 우선적으로는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 의 동일성을 갖는다. 본 발명의 의미에서 아미노산 서열 2 개 사이의 《　동일성의 백분율　》 은 최상 정렬 후에 수득된 비교되는 양쪽 서열 사이에 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 언급하는 것을 의미하며, 이러한 백분율은 순수하게 통계적이고 양쪽 서열 사이의 차이는 무작위로 분포되며 그들의 길이 전체에 걸쳐 있다. 《　최상 정렬　》 또는 《　최적 정렬　》 은 이후 확인되는 동일성 백분율이 더 높은 정렬을 의미한다. 아미노산 서열 2 개 사이의 서열 비교는 전통적으로 이들 서열을 최적의 방식으로 정렬한 후 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 분절 마다 또는 국부 서열 유사 영역을 동정 및 비교하기 위한《 비교 윈도우 》 마다 이루어진다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 또한 Smith 및 Waterman 의 국부 상동성 알고리즘 (1981, J. Mol Evol., 18:38-46), Neddleman 및 Wunsch 의 국부 상동성 알고리즘 (1970), Pearson 및 Lipman 의 유사성 탐색 방법 (1988, PNAS, 85: 2444-2448), 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 패키지 (Wisconsin Genetics Software Package 내의 GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 를 이용하여 수동으로 수행될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 부모 폴리펩티드는 면역글로불린 또는 항체, 바람직하게는 IgG 이고, 본 발명에 따른 변이체는 그 때 IgG 의 변이체로부터 선택된다. 더욱 우선적으로는, 본 발명에 따른 변이체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 의 변이체로부터 선택된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 변이체를 생산하는 방법 또는 본 발명에 따른 시알릴화를 증가시키는 방법은 위치 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 또는 305 에 위치하는 Fc 분절의 아미노산 적어도 하나에 대해 수행되는 돌연변이를 포함한다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임). 바람직하게는, 본 발명에 따른 변이체를 생산하는 방법 또는 시알릴화를 증가시키는 방법은 V262del, V263F, V263K, V263W, V264K, V264P, D265A, D265E, D265G, D265L, D265S, D265V, V266A, V266P, V266S, V266T, S267N, S267P, S267R, S267W, P291C, P291V, P291Y, P291W, R292A, R292del, R292T, R292V, R292Y, E293F, E293P, E293W, E293Y, E294del, E294D, E294N, E294W, E294F, Q295D, Q295del, Q295F, Q295G, Q295K, Q295N, Q295R, Q295W, Y296A, Y296C, Y296del, Y296E, Y296G, Y296Q, Y296R, Y296V, S298del, S298E, S298F, S298G, S298L, S298M, S298N, S298P, S298R, S298T, S298W, S298Y, Y300D, Y300del, Y300G, Y300N, Y300P, Y300R, Y300S, R301A, R301F, R301G, R301H, R301I, R301K, R301Q, R301V, R301W, R301Y, V302del, V302A, V302F, V302G, V302P, V303A, V303C, V303P, V303L, V303S, V303Y, S304C, S304M, S304Q, S304T, V305F 및 V305L 로부터 선택되는 Fc 분절에 대한 돌연변이를 적어도 하나 포함한다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

바람직하게는, 본 발명은 Fc 분절의 시알릴화를 증가시키는 방법으로서, 위치 262 및 264 에서의 아미노산을 제외하고, 상기 분절 Fc 의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법을 목적으로 한다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

본 발명은 또한 바람직하게는 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 부모 폴리펩티드에 상대적으로 개선된 상기 Fc 분절의 시알릴화를 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하고 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임), 상기 돌연변이 단계는 위치 262 또는 264 에서의 아미노산 중 어느 것과도 관련되지 않는 방법을 목적으로 한다.

따라서, 이들 우선적 구현예에 따르면, 돌연변이는 위치 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 또는 305 에 위치하는 Fc 분절의 아미노산에 대해 수행된다. 더욱 우선적으로는, 돌연변이는 위치 293 또는 294 에 위치하는 Fc 분절의 아미노산에 대해 수행된다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임). 특정 구현예에 따르면, 돌연변이는 위치 293 및 위치 294 에 위치하는 Fc 분절의 아미노산 2 개에 대해 수행된다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

본 발명의 목적은 또한 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 부모 폴리펩티드의 효과기 활성에 상대적으로 감소된 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 효과기 활성을 적어도 하나 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법이다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

《　Fc 분절에 의해 매개되는 효과기 활성　》 은 특히 항체에 의존하는 세포독성 (ADCC 또는 항체-의존적 세포-매개 세포독성), 보체에 의존하는 세포독성 (CDC 또는 보체 의존적 세포독성), 항체에 의존하는 식세포작용 (ADCP), 세포내섭취 활성 또는 추가로 사이토카인의 분비를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에서 관련 Fc 분절에 의해 매개되는 효과기 활성은 항체 의존적 세포독성 (ADCC), 보체 의존적 세포독성 (CDC) 및 항체 의존적 식세포작용 (ADCP) 으로부터 선택된다.

《　감소된　》 효과기 활성은 감소된 또는 제거된 효과기 활성을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 부모 폴리펩티드의 변이체는 Fc 분절에 의해 매개되는 효과기 활성 중 적어도 하나가 제거될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 부모 폴리펩티드의 변이체는, 부모 폴리펩티드의 효과기 활성에 상대적으로, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 만큼 감소된 Fc 영역에 의해 매개되는 효과기 활성을 갖는다.

특정 구현예에서, 본 발명은 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 효과기 활성을 전혀 갖지 않는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 분절 Fc 의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법을 제공한다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

바람직하게는 이 양상에 따르면, 본 발명은 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 부모 폴리펩티드의 효과기 활성에 상대적으로 감소된, 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 효과기 활성을 적어도 하나 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하고 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임), 돌연변이 단계는 위치 262, 264, 293 또는 294 에서의 아미노산에 영향을 미치지 않는 방법을 제공한다.

또다른 양상에 따르면, 본 발명의 목적은 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, Fc 영역의 수용체 (FcR) 중 적어도 하나에 대해, 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적으로 감소된, 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도를 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법이다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

《　Fc 영역의 수용체　》 또는 《　FcR　》 은 특히 C1q 및 Fcγ 수용체 (FcγR) 를 의미한다. 《　Fcγ 수용체　》 또는 《　FcγR　》 은 CD64 (FcγRI), CD32 (FcγRII), 및 CD16 (FcγRIII) 으로 호칭되는 IgG 유형의 면역글로불린의 수용체, 특히 5 가지 발현되는 수용체 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb 를 언급한다. 면역 세포의 활성화의 저해인자인 수용기인 인간 FcγRIIb 를 제외하고는, 모두 효과기 세포의 활성화인자인 수용체이다 (Muta T et al., Nature, 1994, 368:70-73).

보체 C1q 는 CDC 활성에 관여된다.

수용체 FcγRIIIa (CD16a) 는, 그것에 관해 말하자면, ADCC 에 관여된다; 그것은 위치 158 에서 다형성 V/F 을 갖는다.

수용체 FcγRIIa (CD32a) 는, 그것에 관해 말하자면, 혈소판 활성화 및 식세포작용에 관여된다; 그것은 위치 131 에서 다형성 H/R 을 갖는다.

마지막으로, 수용체 FcγRIIb (CD32b) 는 세포 활성의 저해에 관여된다.

《　감소된　》 친화도는 감소된 또는 제거된 친화도를 의미한다. 우선적으로는, 친화도는, Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적으로, 적어도 10% 만큼, 바람직하게는 적어도 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 만큼 감소된다.

바람직하게는, 본 발명은 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 보체 C1q 및 수용체 FcγRIIIa (CD16a), FcγRIIa (CD32a) 및 FcγRIIb (CD32b) 로부터 선택되는 Fc 영역의 수용체 (FcR) 중 적어도 하나에 대해, 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적으로 감소된, 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도를 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법을 제공한다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

우선적으로는, 본 발명에 따라 생산되는 변이체는 부모 폴리펩티드의 친화도에 대해 상대적으로, 적어도 10% 만큼, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 만큼 감소된 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도를 갖는다. 다시 말하면, FcR 에 대한 돌연변이된 Fc 분절의 친화도는 부모 폴리펩티드의 친화도보다 낮다. 바람직하게는, 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적인 본 발명에 따른 변이체의 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도의 비는 0.9 미만, 바람직하게는 0.8 미만, 바람직하게는 0.7 미만, 바람직하게는 0.6 미만, 바람직하게는 0.5 미만, 바람직하게는 0.4 미만, 바람직하게는 0.3 미만, 바람직하게는 0.2 미만, 바람직하게는 0.1 미만이다. 예를 들어, 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적인 본 발명에 따른 변이체의 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도의 비는 0.7 미만이다. 더욱 바람직하게는, 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적인 본 발명에 따른 변이체의 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도의 비는 0.9 내지 0.1, 바람직하게는 0.8 내지 0.2, 0.7 내지 0.3, 또는 0.6 내지 0.4 에 포함된다.

FcR 에 대한 Fc 분절을 포함하는 폴리펩티드의 친화도는 선행 기술에서 잘 알려진 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 을 사용하여 친화도 (Kd) 를 확인할 수 있다. 대안적으로는, 당업자는 적합한 ELISA 시험을 수행할 수 있다. 적합한 ELISA 어세이는 부모 Fc 및 돌연변이된 Fc 의 결합력을 비교하는 가능성을 제공한다. 돌연변이된 Fc 및 부모 Fc 로부터 탐지되는 특이적 신호가 비교된다. 결합 친화도는 전체 폴리펩티드를 평가함으로써 또는 전체 폴리펩티드로부터 단리된 영역 Fc 를 평가함으로써 동등하게 확인될 수 있다.

특정 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 주제에 따라 생산되는 변이체는 수용기 FcγRIIIa (CD16a), 및 수용체 FcγRIIa (CD32a) 에 대해, 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적으로 감소된, 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도를 갖는다.

바람직하게는 이러한 다른 양상에 따르면, 본 발명은 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 바람직하게는 보체 C1q 및 수용체 FcγRIIIa (CD16a), FcγRIIa (CD32a), 및 FcγRIIb (CD32b) 로부터 선택되는, Fc 영역의 수용체 (FcR) 중 적어도 하나에 대해, 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적으로 감소된, 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도를 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하고 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임), 돌연변이 단계는 위치 262, 264, 293 또는 294 에서의 아미노산 중 어느 것에 대해서도 적용되지 않는 방법을 제공한다.

특정 구현예에 따르면, 돌연변이는 삽입, 치환, 바람직하게는 점 유사, 및 결실로부터 선택되고, 위치 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 또는 305 에 위치하는 아미노산 적어도 하나에 대해 수행된다 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).

유리하게는, 본 발명에 따라 생산되는 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체는, 부모 폴리펩티드의 상기 친화도에 상대적으로, 유지된 또는 증가된, Fc 분절에 의해 매개되는 수용체 FcRn 에 대한 친화도를 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 변이체에 포함되는 돌연변이(들)은 Fc 분절에 의해 매개되는 FcRn 수용체에 대한 친화도에 영향을 미친다. 다시 말하면, 바람직하게는, 본 발명에 따라 생산되는 Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체는 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적으로 Fc 분절에 의해 매개되는 수용체 FcRn 에 대한 친화도에 영향을 미치지 않는 하나 또는 여러 돌연변이를 포함한다.

본원에서 사용되는 "FcRn" 또는 "신생아 수용체 Fc" 는 IgG 의 Fc 영역에 결합되는 단백질을 의미하고, FcRn 유전자에 의해 적어도 부분적으로 코딩된다. FcRn 는 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이를 포함하나 그에 제한되지 않는 임의의 유기체에서 기원할 수 있다. 기술분야에서 알려진 바와 같이, 기능적 FcRn 단백질은 흔히 중쇄 및 경쇄 단백질로서 지칭되는 2 개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 코딩된다. 본원에서 다르게 명시되지 않으면, FcRn 또는 FcRn 단백질은 사슬 α 와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 언급한다. 인간에서, FcRn 에 대해 코딩하는 유전자는 FCGRT 로 호칭된다.

본 출원에 기재된 서열은 다음과 같이 요약될 수 있다:

더욱 우선적으로는, 본 발명에 따른 변이체를 제조하는 방법의 돌연변이 단계는 다음과 같이 수득된다:

i) Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드에 대해 코딩하는 핵산이 제공되고;

ii) 변이체에 대해 코딩하는 핵산을 수득하기 위해 i) 에서 제공된 핵산이 수식되고;

iii) ii) 에서 수득된 핵산이 숙주 세포에서 발현되고 변이체가 회수됨.

그러므로 상기 돌연변이 단계는 상기 부모 폴리펩티드에 대해 코딩하는 핵산 (폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열) 을 사용하여 수행된다 (단계 i)). 부모 폴리펩티드에 대해 코딩하는 핵산 서열은 화학적 경로를 통해 합성될 수 있다 (Young L and Dong Q., 2004, Nucleic Acids Res., Apr 1 5;32(7), Hoover, D.M. and Lubkowski, J. 2002, Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et al., 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6;7:285). 부모 폴리펩티드에 대해 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 적합한 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 증폭될 수 있다. 부모 폴리펩티드에 대해 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 그러한 부모 폴리펩티드에 대해 코딩하는 DNA 는 발현 플라스미드 내로 삽입되고, 그것의 생산을 위해 ad hoc 세포주 내로 삽입되고 (예를 들어 세포주 HEK-293 FreeStyle, 세포주 YB2/O, 또는 세포주 CHO), 그에 따라 생산되는 단백질은 그 후 크로마토그래피에 의해 정제된다.

이들 기술은 하기 참고 매뉴얼에 상세히 기재되어 있다: Molecular cloning: a laboratory manual, 3^rd edition-Sambrook and Russel eds. (2001) 및 Current Protocols in Molecular Biology - Ausubel et al. eds (2007).

부모 폴리펩티드에 대해 코딩하는, i) 에서 제공되는 핵산 (폴리뉴클레오티드) 은 그 후 변이체에 대해 코딩하는 핵산을 수득하기 위해 수식된다. 이는 단계 ii) 이다.

이러한 단계는 엄밀히 말하면 돌연변이 단계이다. 그것은 선행 기술에서 알려진 임의의 방법에 의해, 특히 지정 돌연변이유발 또는 무작위 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 출원 WO02/038756 에 기재된 바와 같은 무작위 돌연변이유발이 사용된다: 이는 Mutagen 기술이다. 이러한 기술은, 특히 DNA 폴리머라제 β, η 및 ι 로부터 선택되는, 인간 무타아제 DNA 를 사용한다. FcRn 에 대한 결합을 유지한 돌연변이체를 선별하는 단계는 관심의 돌연변이체를 유지하기 위해 요구된다.

대안적으로는, 아미노산의 치환은 바람직하게는 지정 돌연변이유발에 의해, 축퇴된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 어셈블링 PCR 기술에 의해 수행된다 (예를 들어, Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488 참고).

마지막으로, 단계 iii) 에서, ii) 에서 수득된 핵산이 숙주 세포에서 발현되고, 그에 의해 수득된 변이체가 회수된다.

숙주 세포는 원핵 또는 진핵 시스템, 예를 들어 박테리아 세포 뿐만 아니라 효모 세포 또는 동물 세포, 특히 포유류 세포로부터 선택될 수 있다. 곤충 세포 또는 식물 세포를 사용하는 것이 또한 가능하다.

바람직한 숙주 세포는 랫트 세포주 YB2/0, 햄스터 세포주 CHO, 특히 CHO dhfr- 및 CHO Lec13, PER.C6™ (Crucell), HEK293, T1080, EB66, K562, NS0, SP2/0, BHK 또는 COS 세포주이다. 더욱 바람직하게는, 랫트 세포주 YB2/0 이 사용된다.

대안적으로는, 숙주 세포는 젖에서 폴리펩티드를 생산하기 위해 수식된 트랜스제닉 동물 세포일 수 있다. 이 경우에, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대해 코딩하는 DNA 서열의 발현은 포유류 카제인 프로모터 또는 포유류 락토세럼 프로모터에 의해 제어되고, 상기 프로모터는 상기 유전자의 전사를 자연적으로 제어하지 않고, DNA 서열은 단백질 분비 서열을 추가로 함유한다. 분비 서열은 코딩 서열과 프로모터 사이에 끼어들어 있는 분비 신호를 포함한다. 동물은 따라서 양, 염소, 토끼, 암양 또는 암소로부터 선택될 수 있다.

단계 ii) 에서 수득되는 변이체에 대해 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 특히 특정 세포에서의 그것의 발현을 위해 (단계 iii)), 최적화된 코돈을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 COS 세포, CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, PER.C6 세포, HeLa 세포, NIH/3T3, 293 세포 (ATCC # CRL1573), T2 세포, 수지상 세포 또는 단핵구를 포함한다. 코돈 최적화는 자연적 코돈을, 코돈과 관련된 아미노산을 보유하는 트랜스퍼 RNA (RNAt) 가 관련 세포 유형에서 가장 빈번한 코돈으로 대체하려는 목적을 갖는다. 빈번히 부딪히는 RNAt 를 동원하는 사실은 메신저 RNA (RNAm) 의 번역 속도를 증가시키고 그러므로 최종 역가를 증가시키는 큰 이점을 갖는다 (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). 코돈 최적화는 또한 리보솜 복합체에 의한 판독을 둔화시킬 수 있는 RNAm 의 이차 구조를 예측하여 수행된다. 코돈 최적화는 또한 ARNAm 의 반감기 및 그러므로 그들의 번역 잠재성과 직접 관련되는 G/C 의 백분율에 영향을 미친다 (Chechetkin, J. of Theoretical Biology 242, 2006 922-934).

코돈 최적화는 포유류, 더욱 특히 인간 (Homo sapiens) 에 대한 코돈 빈도 표 (코돈 사용빈도 표) 를 사용하여 자연적 코돈을 치환함으로써 달성될 수 있다. 이러한 서열 최적화를 달성할 가능성을 제공하는 알고리즘이 인터넷에 존재하고 합성 유전자의 공급자에 의해 입수가능하다 (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript).

바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 HEK 세포, 예컨대 HEK293 세포, CHO 세포, 또는 YB2/0 세포에서의 그것의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함한다. 더욱 우선적으로는, 폴리뉴클레오티드는 YB2/0 세포에서의 그것의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함한다. 대안적으로는, 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 염소, 토끼, 암양 또는 암소의 세포에서의 그것의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함한다.

본 발명에 따라 수득된 변이체는 치료 조성물을 형성하기 위해서 약학적으로 허용가능한 부형제, 및 임의로 지속 방출을 위한 매트릭스, 예컨대 생분해성 고분자와 조합될 수 있다.

약학적 조성물은 경구, 설하, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 안구내, 뇌내, 경피, 폐, 국소 또는 직장 경로를 통해 투여될 수 있다. 활성 성분은, 단독으로 또는 또다른 활성 성분과의 조합으로, 종래의 약학적 담체와 혼합된 단위 투여 형태로서 투여될 수 있다. 단위 투여 형태는 경구 투여되는 형태 예컨대 정제, 겔라틴 캡슐, 분말, 과립 및 경구 용액 또는 현탁액, 설하 및 구강내 투여 형태, 에어로졸, 피하, 경피, 국소, 복강내, 근육내, 정맥내, 피하, 척추강내 임플란트, 비강내 경로를 통하는 투여 형태 및 직장 투여 형태를 포함한다.

바람직하게는, 약학적 조성물은 주사될 수 있는 제형에 허용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 이는 특히 등장성, 멸균 제형, 염류 용액 (일나트륨 또는 이나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등, 또는 그러한 염의 혼합물을 함유함), 또는 동결건조된 조성물 (이는 멸균수 또는 생리 식염수가 적절히 첨가되었을 때, 주사가능한 용질의 형성을 가능하게 함) 일 수 있다.

주사 용도에 적절한 약학적 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산물, 유성 제형, 예를 들어 참기름, 땅콩 기름, 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 어떤 경우에도, 상기 형태는 멸균되어야 하고, 주사기를 통해 주사되어야 하므로 유체여야 한다. 상기 형태는 제조 및 저장 조건 하에 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다.

본 발명에 따른 분산물은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜 또는 그들의 혼합물 중에, 또는 오일 중에 제조될 수 있다. 보통의 저장 및 사용의 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.

약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 그들의 적합한 혼합물 및/또는 식물유를 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 계면활성제 예컨대 레시틴을 사용하여, 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항생제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 또는 추가로 티메로살에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 설탕 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중에 흡수-지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 겔라틴의 사용에 의해 달성될 수 있다.

멸균 주사가능 용액은 요구되는 양의 활성 물질을 위에 열거된 여러 기타 성분들과 함께 적당한 용매 내에 포함시키고, 필요한 경우에 그에 뒤이어 여과 멸균을 수행하여 제조된다. 일반적으로, 분산물은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산매 및 위에 열거된 것 중 요구되는 기타 성분을 함유하는 멸균 담체 내에 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주가사능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 중에서의 건조 및 동결건조이다. 제형화 동안, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로 치료적 유효량으로 투여될 것이다. 제형은 여러가지 생약 형태, 예컨대 상기 주사가능 용액으로 용이하게 투여되나, 약물 방출 캡슐 및 유사한 캡슐이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어 수성 용액으로 비경구 투여하는 경우에, 용액은 적합하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 충분한 양의 염류 또는 글루코스 용액으로 등장성으로 만들어져야 한다. 이들 특별한 수성 용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 투여물은 1 ㎖ 의 등장성 NaCl 용액에 용해되고, 그 후 1000 ㎖ 의 적합한 액체에 첨가되거나, 제안되는 관류 자리에 주사될 수 있다. 특정 투여량 변화가 치료되는 대상의 상태에 따라 필수적으로 발생해야 할 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여물 당 약 0.0001 내지 1.0 ㎎, 또는 약 0.001 내지 0.1 ㎎, 즉 약 0.1 내지 1.0 ㎎, 또는 심지어는 약 10 ㎎ 또는 그 이상을 포함하는 치료적 혼합물로 제형화될 수 있다. 복수의 투여물이 또한 투여될 수 있다. 특별한 환자에 특정한 치료적 유효 투여량 수준은 치료되는 장애 및 질환의 중증도, 사용되는 특정 화합물의 활성, 사용되는 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식단, 투여 시점, 투여 경로, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료의 지속기간, 또는 추가로 병용되는 약물을 포함하는 여러가지 인자에 따라 좌우될 것이다.

도면의 간단한 설명

도　1: EU 인덱스에 따른 위치 216 내지 447 을 나타내는 선천 인간 IgG1 서열의 정렬:

도　1 은 위치 216 내지 447 (EU 인덱스에 따름) 를 나타내는 선천 인간 IgG1 서열과 인간 IgG2 (SEQ ID NO: 2 및 7), 인간 IgG3 (SEQ ID NO: 3 및 8) 및 인간 IgG4 (SEQ ID NO: 4 및 9) 의 상응하는 서열의 정렬을 보여준다. IgG1 서열은 동종이형 G1m1,17 (SEQ ID NO: 1 및 6) 및 동종이형 G1m3 (SEQ ID NO: 5 및 10) 을 나타낸다. 《　아래쪽 힌지 CH2-CH3 》 IgG1 도메인은 위치 226 (화살표 참고) 에서 시작한다. CH2 도메인은 회색으로 강조표시되어 있고, CH3 도메인은 이탤릭체이다.

도　2: YB2/0 에서 생산된 항-CD20 및 항-Rhesus D 항체의 반감기:

인간 FcRn 에 대한 트랜스제닉 마우스의 혈청 중 면역글로불린의 지속성을 평가했다. 2 가지 항원 특이성을 시험했다; 위치 294 에서 결실된 항-CD20 IgG 및 항-RhD IgG 를 상응하는 IgG WT 과 비교하여 시험했다.

A) 혈장 IgG 의 농도의 시간-의존적 변화를 나타낸다;

B) 위치 294 에서 결실된 IgG 및 IgG WT 둘 모두에 대해 관찰된 반감기를 나타낸다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 구현예를 설명하려는 목적으로 제공된다.

실시예 1: 위치 294 에서 결실된 변이체의 생산

발명자들은, 특히 위치 294 (EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물) 에서 결실된, 본 발명에 따른 여러 변이체의 시알릴화를 분석했다. 분석된 Del294 변이체 중에서, 여러 변이체는 특허 출원 EP 0 233 500 에서 FcRn 에 대해 최적화된 결합을 제공하는 것으로 기재된 조합으로부터 선택되는 부가 돌연변이의 조합을 포함한다.

그러한 《　FcRn 최적화된　》 변이체의 동정 및 수득은 선행 기술, 특히 그러한 돌연변이체를 소위 MutaGen™ 기술에 따라 수득하는 것을 기재하는 유럽 특허 출원 EP 0 233 500 에 기재된 방법에 따라 달성될 수 있다.

전형적으로, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:

A/ Fc 뱅크 (bank) 의 구축

인간 IgG1 의 중쇄에서 유래하는 잔기 226 내지 447 에 대해 코딩하는 인간 유전자 Fc (Kabat 의 EU 인덱스에 따름, 도　1 에 나타냄) 를 적합한 벡터, 예컨대 파지미드 벡터 pMG58 내에 당업자에게 잘 알려진 표준 절차에 따라 클로닝한다.

B/ 돌연변이유발

그 후 전체 표적 서열에 균일하게 무작위 돌연변이를 도입하려는 목적으로 낮은 신뢰도의 인간 폴리머라제 DNA 를 사용하는 WO 02/038756 에 기재된 절차에 따라 여러 뱅크를 생성한다. 더욱 구체적으로, 상보적 돌연변이의 프로파일을 생성하기 위해 상이한 조건 하에 3 개의 구별되는 무타아제 (pol β, η 및 ι) 를 사용했다.

C/ 파지-표시에 의한 Fc 뱅크의 발현 및 신생아 수용체 FcRn 에 대해 개선된 결합을 갖는 변이체의 선별

Fc 분절을 선별하기 위해 사용되는 표준 절차에 따라 파지-표시 기술을 사용하여 Fc 뱅크를 발현시킨다. 유럽 특허 출원 EP 2 233 500 의 상세한 절차에 따라, 특히 고체 또는 액체 상의 FcRn 상에서의 선별, 및 그 후 ELISA 에 의한 분절의 FcRn 에 대한 결합 특성의 확인에 의해 선별을 달성할 수 있다.

D/ 전체 Ig 로서 및 위치 294 에서 결실된 변이체의 생산

위치 294 에서 결실된 돌연변이체의 생산을 위한 기초로서 사용하기 위해 《　FcRn 최적화된　》 돌연변이의 여러 조합을 선별했다. 하기 조합을 선별했다:

N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y (T5A-74)

T256N/A378V/S383N/N434Y (C6A-78)

V259I/N315D/N434Y (C6A-74)

1- HEK 세포에서 IgG 변이체의 생산

표준 PCR 절차 (Invitrogen) 에 따라 pCEP4 에서 유래하고 항-CD20 키메라 항체의 중쇄를 함유하는 제네릭 진핵생물 발현 벡터 내에 Fc 분절 서열 SEQ ID NO: 1 을 클로닝했다. 이러한 항체의 경쇄를 유사한 pCEP4-유래 벡터 내에 삽입했다. 오버랩 (overlap) PCR 에 의해 항-CD20 중쇄를 함유하는 발현 벡터 내에 Fc 분절에서의 관심의 돌연변이를 모두 삽입했다. 예를 들어, 발현 벡터에 함유된 중쇄의 위치 294 에 결실을 편입시키기에 적합한 2 세트의 프라이머를 사용하여 변이체 294Del 를 수득했다.

그렇게 PCR 에 의해 수득된 분절을 연합하고, 결과적인 분절을 표준 절차를 사용하여 PCR 에 의해 증폭시켰다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 (w/ v) 에서 정제하고, 적합한 제한 효소로 소화시키고, 항-CD20 중쇄의 발현 벡터 내에 클로닝했다.

HEK 293 세포를 표준 절차 (Invitrogen) 에 따라 등몰량으로 항-CD20 IgG 의 경쇄 및 중쇄의 발현 벡터로 동시트랜스펙션시켰다. 세포를 배양하여 일시적 방식으로 항체를 생산하도록 했다. 생산된 항체를 그들의 특성분석을 목적으로 기술분야의 현재의 기술에 따라 단리 및 정제할 수 있었다.

2- YB2/0 세포에서 IgG 변이체의 생산

세포주 YB2/0 (ATCC, CRL-1662) 에서 항-CD20 및 항-RhD 특이성을 갖는 Fc 변이체를 전체 IgG 포맷으로 제조했다. 이를 위해, IgG 의 중쇄 및 경쇄를 YB2/0 에서의 생산에 최적화된 바이시스트로닉 HKCD20 벡터 내에 클로닝했다. YB2/0 세포의 안정적 푸울 (pool) 에서 생산을 수행했다.

세포 배양에 의한 생산 단계 및 항체 정제를 위한 배양을 그들의 특성분석을 목적으로 기술분야의 현재의 기술에 따라 수행했다.

발명자들은 위치 294 에서의 결실이 FcRn 에 대한 결합에 유의한 영향을 전혀 갖지 않음을 확인했다. 위치 294 에서 결실된 변이체는 부모 IgG (IgG WT 또는 《　FcRn 최적화된　》 돌연변이를 포함하는 IgG) 에 상대적으로 FcRn 에 대한 그들의 결합을 보존했다.

실시예 2: 상이한 단백질의 시알릴화의 분석

작업 방법: 샘플의 제조

1 탈염 및 N-탈글리코실화

첫번째 단계에서, 분석될 샘플을 표준 절차에 따라 염석하여 모든 잠재적으로 존재하는 유리 환원 탄수화물 뿐만 아니라 후속 단계 동안 간섭할 수 있는 물질 (염 및 부형제) 을 제거했다. 염석 후, 샘플을 건조시킨 후에, N-탈글리코실화의 수율을 최대화하기 위해, 변성 및 환원 조건 하에 N-글리카나아제의 효소 작용에 의해 글리칸을 방출시켰다. Ig 의 N-탈글리코실화를 위해, 건조 샘플을 1/5 로 희석된 45 ㎕ 의 소화 용액 PNGase F 에 넣었다. 초순수 중의 10% (v/v) β-머캅토에탄올 1.5 ㎕ 를 교반 및 15 분 동안 실온에서 인큐베이션하면서 첨가했다. 그 다음, 1 ㎕ 의 PNGase F 용액 (2.5 mU/㎕) 을 첨가한 후, 교반 및 수조 내에서 37℃ 에서 12 내지 18 시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음 탈글리코실화된 단백질로부터 차가운 EtOH 을 이용한 침전에 의해 글리칸을 분리했다.

수득된 글리칸 추출물을 그 후 엑소글리코시다아제로 처리하기 전에 4 개의 분획으로 분배했다.

2 N-글리칸의 푸코실화 및 개재하는 (intercalating) GlcNAc 수준, 및 갈락토실화 지수의 정량화

100 ㎍ 당량의 당단백질을 함유하는 각각의 건조된 알코올성 하위분획 N 을 각각 (1) 푸코실화 수준을 확인하기 위해, α-시알리다아제, β-갈락토시다아제 및 N-아세틸-β-헥소사미니다아제를 사용하여; (2) 개재하는 GlcNAc 의 수준을 계산하기 위해, α-시알리다아제, β-갈락토시다아제 및 α-푸코시다아제를 사용하여; 및 (3) 갈락토실화 지수를 확인하기 위해, α-시알리다아제 및 α-푸코시다아제를 사용하여 소화시켰다.

이들 탈글리코실화를 37℃ 에서 12 내지 18 시간 동안 수행했다.

-20℃ 에서 평형되는 60 ㎕ (3 부피) 의 절대 에탄올의 첨가에 의한 차가운 알코올 추출에 의해 엑소글리코시다아제 붕괴 산물의 단리를 수행한 후, 교반 및 그 후 -20℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 10 분 동안 +4℃ 에서 10,000 rpm 에서의 원심분리를 수행하고, 상청액을 0.5 ㎖ 의 마이크로튜브 내로 즉시 옮긴 후, 진공 중에서 건조시켰다.

수득된 올리고당을 그 후 형광색소, APTS 로 표시하고, 그 후 분리하고 HPCE-LIF 에서 정량화했다.

3 결과의 활용

N-글리코실화가 완벽하게 알려진 참조 당단백질 표준을 이용하여 그것의 N-글리칸의 이주 시간을 분석될 샘플의 전기영동 프로파일에서 관찰된 종의 이주 시간과 비교함으로써 N-글리칸 피크의 동정을 수행했다. 나아가, 글루코스 단독중합체 (Glc 사다리) 의 불균일 혼합물의 분석 후에 올리고당 표준의 이주 시간을 글루코스 유닛 (GU) 으로 전환했다. 이들 GU 값을 그 후 GU 값이 알려진 몇몇 표준 올리고당과 비교하여, 동정의 신뢰 수준을 증가시킬 수 있을 것이다.

결과

A- YB2/0 에서 생산된 변이체

하기 폴리펩티드를 분석했다:

항-CD20 Del294:

수득된 전기영동도는 바이안테나 (biantenna) 글리칸 구조를 보여준다. 이들 구조는 다수가 (in majority) 시알릴화되어 있다.

구조의 87.98% 가 시알릴화된 것으로 보인다. 계산된 푸코실화 수준은 48.24% 이다.

항-CD20-C6A_78-Del294:

수득된 전기영동도는 바이안테나 글리칸 구조를 보여준다. 이들 구조는 다수가 시알릴화되어 있다.

구조의 88.69% 가 시알릴화된 것으로 보인다. 계산된 푸코실화 수준은 51.87% 이다.

항-CD20-C6A_74-Del294:

구조의 93.48% 가 시알릴화된 것으로 보인다. 계산된 푸코실화 수준은 51.24% 이다.

항-RhD:

수득된 전기영동도는 다수가 짧은 비-푸코실화된 비-갈락토실화된 짧은 구조로 이루어지는 바이안테나 글리칸 구조 (G0: 52.06%) 를 보여준다. 푸코실화된 구조는 소수이다. 이등분 (bissecting) 위치에서 GlcNac 를 갖는 몇몇 구조 (G0B, G0FB) 가 관찰된다.

우세한 올리고당 구조는 G0 (52.06%) 이다. 계산된 푸코실화 수준은 17.05% 이고, 런 (run) DSial + DGal + DhexNAc 으로 수득된 푸코실화 수준 (*) 은 13.07% 이다. 이등분 GlcNac 를 갖는 형태의 수준은 2.87% 이다. 계산된 갈락토실화 수준은 40.5% 이다.

항-RhD Del294:

수득된 전기영동도는 바이안테나 글리칸 구조 및 몇몇 트리안테나 구조를 보여준다. 이들 구조는 다수가 시알릴화되어 있다.

구조의 92.25% 가 시알릴화된 것으로 보인다. 계산된 푸코실화 수준은 37.08% 이다.

항-RhD-C6A_78:

우세한 올리고당 구조는 G0 (55.20%) 이다. 계산된 푸코실화 수준은 12.37% 이고, 런 DSial + DGal + DhexNAc 로 수득된 푸코실화 수준 (*) 은 10.63% 이다. 이등분 GlcNac 를 갖는 형태의 수준은 2.27% 이다. 계산된 갈락토실화 수준은 39.13% 이다.

항-RhD-C6A_78-Del294:

구조의 91.83% 가 시알릴화된 것으로 보인다. 계산된 푸코실화 수준은 57.81% 이다.

B- HEK 세포주에서 생산된 변이체

하기 폴리펩티드를 분석했다 (항-CD20 IgG 변이체):

변이체 T5A-74H 는 부모 변이체 T5A-74 와 돌연변이 V264E 에서 상이하다. 돌연변이체 T5A-74Del294 는 부모 변이체 T5A-74 와 위치 294 에서의 아미노산 결실에서 상이하다.

이들 변이체의 글리코실화의 프로파일을 후속적으로 분석했다. 결과가 이하 표에 요약되어 있다 (단위: 백분율):

실시예 3: 위치 294 에서 결실된 IgG 의 반감기의 분석

그렇게 약동학 실험을 생쥐의 대립형질 KO 에 관한 동종접합체 및 인간 FcRn 의 이식유전자에 관한 이종접합체 FcRn (mFcRn^{-/ -} hFcRnTg) 인 hFcRn 마우스에서 수행했다.

이들 약동학 연구를 위해, 이전에 기재된 절차 (Petkova SB, et al. Enhanced half-life of genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease. Int Immunol 2006) 와 유사한 절차에 따라 각각의 동물은 IgG 의 단일 정맥내 주사 (5 ㎎/kg) 를 안와후 동굴에 맞았다. 혈액 샘플을 다수의 시점에 안와후 동굴로부터 채취하고, IgG 를 ELISA 로 적정했다.

결과:

이 시험에서, 위치 294 에서 결실된 2 가지 IgG 는 모두 반감기 증가를 1.7 의 비율 (변이체 반감기/WT) 로 보였다 (도　2).

분석된 파라미터를 아래 표에 나타냈다:

분석된 파라미터는 하기와 같이 정의된다:

C0: T0 까지 외삽된 최대 농도

AUCO-t: 시간/혈장 농도 곡선하면적 (시간 T0 으로부터 항체가 여전히 정량화가능한 마지막 시간 t 까지)

AUCinf: T0 으로부터 무한대까지의 시간/혈장 농도 곡선하면적 (= AUCO-t + 무한대까지의 외삽)

T1/2: 반감기

Vd: 분포 부피

Cl: 청소율

실시예 4: 지정 돌연변이유발에 의한 부가적 Fc 변이체의 생산 및 Fc 수용체에 대한 결합 시험:

1. Fc 변이체의 구축:

표적화된 위치 (240 내지 243, 258 내지 267, 290 내지 305) 에 결실 또는 축퇴 코돈 (NNN 또는 NNK) 을 편입시키기에 적합한 2 세트의 프라이머를 사용하여 오버랩 (overlap) PCR 에 의해 항-CD20 중쇄를 함유하는 발현 벡터 내에 분절 Fc 에서의 각각의 관심의 돌연변이를 독립적으로 삽입했다. 그렇게 PCR 에 의해 수득된 분절을 연합하고, 결과적인 분절을 PCR 에 의해 표준 절차를 사용하여 증폭시켰다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 (w/ v) 에서 정제하고, 적합한 제한 효소로 소화시키고, Fc 분절에 관한 클로닝 자리 (BamHI 및 NotI) 및 항-CD20 항체의 가변 사슬 VH 을 함유하는 진핵생물 발현 벡터 pMGM05-CD20 (pCEP4 InvitroGen) 내에 클로닝했다. 이러한 구축물은 Fc 에서 2 개의 아미노산의 돌연변이 (aa224 및 225, HT 가 GS 로 변화됨) 및 Fc 의 C-말단에서 EFAAA 서열의 부가를 야기하나, 매우 많은 수의 클론을 매우 신속히 시험할 수 있는 가능성을 제공한다. 첫번째 단계에서, 이들 돌연변이가 상이한 수용체에 대한 IgG-WT 의 결합을 변경하지 않는다는 점이 확인되었다. 후속적으로, 그것을 입증하기 위해서, 양성 대조군을 이러한 시스템에서 클로닝했다:

- Xencor (C1) 로부터의 항-CD19 항체 XmAb5574 로부터의, IgG1-S239D, I332E: CD16a 에 관한 양성 대조군;

- Xencor (C4) 로부터의, IgG1-G236A: CD32aH/R 에 관한 양성 대조군;

- Abgenix/Genentech (C3) 로부터의, IgG1-K326W, E333S: C1q 에 관한 양성 대조군; 및

- Xencor (C5) 로부터의 항-CD19 항체 XmAb5574 로부터의, IgG1-S267E, L328F: CD32b 에 관한 양성 대조군.

단리된 클론의 DNA 를 콜로니에서 PCR 후에 서열분석했다. 바이오-컴퓨터 분석 위해, 새로운 돌연변이를 포함하는 클론을 박테리아 XL1-Blue 내로 -80℃ 로 동결시키고 서열을 우리의 데이타베이스에 포함시켰다. 이에 따라, 268 개의 변이체를 구축했다.

2. HEK293 세포에서 IgG 변이체의 생산:

항-CD20 의 경쇄를 pMGM01-CDC20 (pCEP4 InvitroGen) 로 호칭되는, 중쇄에 사용된 벡터와 동일한 pCEP4 벡터 내로 삽입했다. 24-웰 플레이트에서 배양한 HEK293-F Freestyle^TM (Invitrogen) 세포를 표준 절차 (Invitrogen) 에 의해 트랜스펙션 시약 (1 ㎕/㎖) 을 사용하여 등몰량 (250 ng/㎖) 으로 벡터 pMGM01-CD20 및 pMGM05-CD20 (Fc-WT 및 변이체) 로 동시트랜스펙션했다. 세포를 트랜스펙션 후 7-9 일 동안 혈청이 전혀 없는 배지에서 현탁 배양하고, 100 G 에서 10 분 동안 세포의 원심분리 후에 IgG 를 함유하는 상청액 (1 ㎖) 을 수집했다. 상청액에 분비된 IgG 를 ELISA 시험 (FastELISA, R&D biotech) 을 사용하여 정량화했다.

3. 사용된 재조합 Fc 수용체:

CD16a 는 Fc 에 대한 결합 자리 상의 위치 158 에서 다형성 V/F 을 갖는 활성화인자 수용체이다. 친화도는 CD16aV 에 대해 더 양호하다. CD16aV 는 상업적으로 입수가능하다 (R&D system).

CD32a 는 Fc 에 대한 결합 자리 상의 위치 131 에서 다형성 H/R 을 갖는 활성화인자 수용체이다. 친화도는 CD32aH 에 대해 더 양호하다. CD32aH 는 PX'Therapeutics 에 의해 생산되었다. CD32aR 및 CD32b 는 상업적으로 입수가능하다 (R&D system).

4. HEK293-F 세포의 상청액에서 생산된 IgG 변이체의 ELISA 시험:

IgG 변이체를 여러 인간 FcR 및 FcRn 에 대한 그들의 결합에 관해 ELISA 로 시험했다. Maxisorp 이뮤노플레이트 (immunoplate) 를 0.1 ㎍ 의 CD32aH / 웰, 또는 0.2 ㎍ CD16aV / 웰 (PBS 중) 또는 0.25 ㎍ 의 FcRn (P6 중) (소듐 포스페이트 100mM, 소듐 클로라이드 50mM pH6.0) 로 코팅했다. NiNTA 플레이트 (HisGrab Pierce) 를 0.05㎍ 의 CD32aR / 웰, 또는 0.2㎍ CD32b / 웰 (PBS 중) 로 코팅했다. 4℃ 에서 밤새 코팅 후에, 플레이트를 PBS (또는 P6)/0.05% Tween-20 로 2 회 세정하고, 2 시간 동안 37℃ 에서 PBS/4% 의 BSA (또는 P6 탈지유 중 4%) 로 포화시켰다. 이와 병행하여, 상청액을 PBS (또는 FcRn 에 대한 시험의 경우 P6) 에 0.5 ㎍ 의 IgG/㎖ 의 최종 농도로 희석하고, 2 시간 동안 실온에서 동일한 농도의 항-인간 염소 HRP IgG 의 F(ab')2 와 혼합했다. F(ab')2 와 함께 응집된 IgG 를 그 후 약하게 교반하면서 1 시간 동안 30℃ 에서 포화된 ELISA 플레이트에서 인큐베이션했으며, CD16aV, CD32aR 및 CD32b 의 경우 전혀 희석하지 않았고 (즉 0.5 ㎍/㎖ 의 IgG), CD32aH 의 경우 PBS 중에 0.25 ㎍/㎖ 로 희석했고, FcRn 의 경우 P6 중에 0.035 ㎍/㎖ 로 희석했다. 그 후 플레이트를 TMB (Pierce) 로 현상하고, 450 ㎚ 에서 흡광도를 읽었다.

이러한 ELISA 시험에 의해, 구축된 변이체를 야생형 Fc (Fc-WT) 와 비교하여 시험했고, 변이체/Fc-WT 비율을 계산했고, 표 1 내지 3 에 나타냈다.

표 1: 위치 262 와 267 사이에 돌연변이가 유지된 변이체

표 2: 위치 291 과 296 사이에 돌연변이가 유지된 변이체

표 3: 위치 298 과 305 사이에 돌연변이가 유지된 변이체.

<110> LFB <120> PROCEDE DE PRODUCTION DE VARIANTS AYANT UN Fc PRESENTANT UNE SIALYLATION AMELIOREE <130> BFF140346 <160> 10 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc de l'IgG1 G1m1,17 <400> 1 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc d' IgG2 <400> 2 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 3 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc d' IgG3 <400> 3 Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 4 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc d' IgG4 <400> 4 Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 5 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc de l'IgG1 G1m3 <400> 5 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 6 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc de l'IgG1 G1m1,17 <400> 6 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 7 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc d' IgG2 <400> 7 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 8 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc d' IgG3 <400> 8 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 65 70 75 80 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 85 90 95 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp 100 105 110 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 115 120 125 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 130 135 140 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 145 150 155 160 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 165 170 175 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 180 185 190 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 195 200 205 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn 210 215 220 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser 245 250 255 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser 260 265 270 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 <210> 9 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc d' IgG4 <400> 9 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 10 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc de l'IgG1 G1m3 <400> 10 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

Claims

Fc 분절의 시알릴화를 증가시키는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).
Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 부모 폴리펩티드의 Fc 분절의 시알릴화에 상대적으로 개선된 상기 Fc 분절의 시알릴화를 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 방법 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 Fc 분절의 시알릴화는 돌연변이 단계 전의 상기 Fc 분절 또는 부모 폴리펩티드의 상기 Fc 분절의 시알릴화에 상대적으로 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 35%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 45%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 만큼 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 부모 폴리펩티드의 효과기 활성에 상대적으로 감소된 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 효과기 활성을 적어도 하나 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).
제 4 항에 있어서, Fc 분절에 의해 매개되는 효과기 활성이 항체 의존적 세포독성 (ADCC), 보체 의존적 세포독성 (CDC) 및 항체 의존적 식세포작용 (ADCP) 으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 변이체가 Fc 분절에 의해 매개되는 효과기 활성을 전혀 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드의 변이체로서, 바람직하게는 보체 C1q 및 수용체 FcγRIIIa (CD16a), FcγRIIa (CD32a), 및 FcγRIIb (CD32b) 로부터 선택되는, Fc 영역의 수용체 (FcR) 중 적어도 하나에 대해, 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적으로 감소된 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도를 갖는 변이체를 생산하는 방법으로서, 상기 Fc 분절의 위치 240 내지 243, 258 내지 267 및 290 내지 305 에서의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 돌연변이 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).
제 7 항에 있어서, 변이체가, 수용체 FcγRIIIa (CD16a) 및 수용체 FcγRIIa (CD32a) 에 대해, 부모 폴리펩티드의 친화도에 상대적으로 감소된 상기 Fc 분절에 의해 매개되는 친화도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 삽입, 치환, 바람직하게는 점 유사 (point like), 및 결실로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 위치 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 또는 305 에 위치하는 적어도 하나의 아미노산에 대해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 위치 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 또는 305 에 위치하는 적어도 하나의 아미노산에 대해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 위치 293 또는 294 에 위치하는 아미노산에 대해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법 (번호지정은 EU 인덱스 또는 Kabat 에서의 동등물의 번호지정임).
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 부모 폴리펩티드의 Fc 분절이, 바람직하게는 P230S, T256N, V259I, N315D, A330V, N361D, A378V, S383N, M428L, N434Y 로부터 선택되는, 적어도 하나의 부가 돌연변이, 바람직하게는 P230S/N315D/M428L/N434Y, T256N/A378V/S383N/N434Y, V259I/N315D/N434Y 및 N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y 로부터 선택되는 부가 돌연변이의 조합을 이미 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 부모 폴리펩티드가 Fc 분절로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 부모 폴리펩티드가 N- 또는 C-말단에서 Fc 분절에 융합된 아미노산의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부모 폴리펩티드가 면역글로불린 또는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 부모 폴리펩티드의 Fc 분절이, 바람직하게는 서열 SEQ ID NO: 1 에 해당하는, IgG1 의 Fc 분절인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 단계가 다음과 같이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
i) Fc 분절을 포함하는 부모 폴리펩티드에 대해 코딩하는 핵산 서열이 제공되고;
ii) 변이체에 대해 코딩하는 핵산을 수득하기 위해 i) 에서 제공된 핵산이 수식되고;
iii) ii) 에서 수득된 핵산이 숙주 세포에서 발현되고, 변이체가 회수됨.