EP3174904A1 - Procédé de production de variants ayant un fc présentant une sialylation améliorée - Google Patents

Procédé de production de variants ayant un fc présentant une sialylation améliorée

Info

Publication number
EP3174904A1
EP3174904A1 EP15759880.6A EP15759880A EP3174904A1 EP 3174904 A1 EP3174904 A1 EP 3174904A1 EP 15759880 A EP15759880 A EP 15759880A EP 3174904 A1 EP3174904 A1 EP 3174904A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fragment
parent polypeptide
variant
amino acid
mutation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP15759880.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Céline MONNET
Alexandre Fontayne
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB SA
Original Assignee
LFB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB SA filed Critical LFB SA
Publication of EP3174904A1 publication Critical patent/EP3174904A1/fr
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/34—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood group antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification

Definitions

  • the present invention relates to a method for increasing the sialylation of an Fc fragment, comprising a step of mutating at least one amino acid selected from amino acids in position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said fragment.
  • Fc the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • Monoclonal antibodies are used today as therapeutics to treat a variety of conditions, including cancers, autoimmune diseases, chronic inflammatory diseases, transplant rejection, infectious diseases, and cardiac diseases. vascular. They are therefore a major therapeutic issue. Many of them are already on the market, and an ever increasing proportion is under development or clinical trials. However, there is an important need to optimize the structural and functional properties of the antibodies, in order to control the side effects.
  • Immunoglobulin isotype G (IgG) is the class of immunoglobulin most common in humans and also the most used in therapy.
  • Various experiments of specific mutagenesis in the constant region (Fc) of mouse IgG have identified certain critical amino acid residues involved, for some, in the interaction between IgG and FcRn (Kim et al, 1994, Eur J Immunol; 24: 2429-34;
  • the present invention provides means for obtaining a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment having optimized sialylation.
  • This optimized sialylation i.e. improved, in particular gives the variant an increased half-life, as well as optimized anti-inflammatory properties compared to a parent polypeptide.
  • half-life refers to a biological half-life of a polypeptide of interest in the circulation of a given animal, and is represented by the time required for half the amount present in the circulation of a given animal. animal to be removed from the circulation and / or other tissues of the animal.
  • the subject of the present invention is therefore a process for increasing the sialylation of an Fc fragment, comprising a step of mutation of at least one amino acid chosen from amino acids in position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said fragment Fc, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • said method for increasing the sialylation of an Fc fragment comprises:
  • the present invention also relates to a method for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having a improved sialylation of said Fc fragment with respect to sialylation of the Fc fragment of the parent polypeptide, which comprises a step of mutating at least one amino acid selected from amino acids at position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said fragment Fc, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • said method of producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment comprises:
  • said method of producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment is such that the variant has at least one effector activity mediated by said Fc fragment decreased relative to the effector activity of the parent polypeptide.
  • sialylation or “improved sialylation” it is meant that the sialylation of the obtained protein is increased by at least 10%, preferably at least 15%, preferably at least 20%, preferably at least 25%. %, preferably at least 30%, preferably at least 35%, preferably at least 40%, preferably at least 45%, preferably at least 50%, preferably at least 55%, preferably at least 60% preferably at least 65%, preferably at least 70%, preferably at least 75%, preferably at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, with respect to the sialylation of said Fc fragment prior to the mutation step or said Fc fragment of the parent polypeptide.
  • Sialylation of a protein is a well known glycosylation mechanism (see especially Essentials of Glycobiology, 2 nd edition, Varki et al, 2009). It corresponds to a covalent addition of at least one sialic acid (ie N-acetylneuraminic acid and its derivatives, such as N-glycosylneuraminic acid, N-acetylglycoylneuraminic acid) in the glycosylated chain of the protein.
  • sialic acid ie N-acetylneuraminic acid and its derivatives, such as N-glycosylneuraminic acid, N-acetylglycoylneuraminic acid
  • protein and “polypeptide” are used interchangeably herein and refer to a sequence of at least two covalently linked amino acids, including proteins, polypeptides, oligopeptides, and peptides. .
  • protein and polypeptide include especially antibodies or immunoglobulins, in particular whole, monoclonal, multi-specific, bi-specific, dual-specific, synthetic, chimeric, humanized, human, fusion proteins with immunoglobulins, conjugated antibodies, and their fragments.
  • protein and polypeptide also include Fc polypeptides defined by a polypeptide comprising all or part of an Fc region, including isolated Fc, conjugated Fc, multimeric Fc fragments and Fc fusion proteins.
  • Fc fragment or “Fc region” is meant the constant region of a full length immunoglobulin excluding the first immunoglobulin constant region domain (ie CH1-CL).
  • the Fc fragment refers to a homodimer, each monomer comprising the last two constant domains of IgA, IgD, IgG (ie CH2 and CH3), or the last three constant domains of IgE and IgM (ie CH2, CH3 and CH4), and the flexible N-terminal hinge region of these domains.
  • the Fc fragment when it is derived from IgA or IgM, can comprise the J chain.
  • an Fc fragment of an IgG1, which consists of the flexible N-terminal hinge is used in the present invention.
  • an Fc fragment of a human IgG1 ie amino acids 226 to 447 according to the EU index or equivalent in Kabat
  • the lower hinge refers to positions 226 to 230
  • the CH2 domain refers to positions 231 to 340
  • the CH3 domain refers to positions 341-447 according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • the Fc fragment used according to the invention may also comprise part of the upper hinge region, upstream of the position 226.
  • a Fc fragment of a human IgG1 comprising part of the region is used. located between positions 216 to 226 (according to the EU index).
  • the Fc fragment human IgG1 refers to the portion from amino acid 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224 or 225 to the C-terminus.
  • Fc fragment includes a scFc fragment for "single chain Fc".
  • scFc fragment is meant a single chain Fc fragment, obtained by genetic fusion of two Fc monomers linked by a polypeptide linker. The scFc folds naturally into a functional dimeric Fc region.
  • the Fc fragment used in the context of the invention is chosen from the Fc fragment of an IgG1 or IgG2. More preferably, the Fc fragment used is the Fc fragment of an IgG1.
  • the numbering of the residues of the Fc fragment is that of the EU index or equivalent in Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ).
  • the parent polypeptide comprises an Fc fragment, referred to as a "parent Fc fragment”.
  • amino acid mutation is meant here a change in the amino acid sequence of a polypeptide.
  • a mutation is chosen in particular from a substitution, an insertion and a deletion.
  • substitution is meant the replacement of one or more amino acids at a particular position in a parent polypeptide sequence by the same number of other amino acids.
  • the substitution is punctual, ie it concerns only one amino acid.
  • the N434S substitution refers to a variant of a parent polypeptide, wherein the asparagine at position 434 of the Fc fragment according to the EU index or equivalent in Kabat is replaced by serine.
  • insertion is meant the addition of at least one amino acid at a particular position in a parent polypeptide sequence.
  • insertion G> 235-236 refers to a glycine insertion between positions 235 and 236.
  • deletion is meant the removal of at least one amino acid at a particular position in a parent polypeptide sequence .
  • E294del refers to the removal of glutamic acid at position 294; such a deletion is called Del294.
  • parent polypeptide is meant an unmodified polypeptide which is then modified to generate a variant.
  • the parent polypeptide may be a naturally occurring polypeptide, a variant of a naturally occurring polypeptide, a modified version of a natural polypeptide, or a synthetic polypeptide.
  • the parent polypeptide comprises an Fc fragment selected from wild-type Fc fragments, fragments and mutants thereof. Therefore, the parent polypeptide may optionally include pre-existing amino acid modifications in the Fc fragment relative to wild-type Fc fragments.
  • the Fc fragment of the parent polypeptide already comprises at least one additional mutation (ie pre-existing modification), preferably selected from P230S, T256N, V259I, N315D, A330V, N361D, A378V, S383N, M428L, N434Y.
  • the Fc fragment of the parent polypeptide comprises at least one combination of additional mutations chosen from P230S / N315D / M428L / N434Y, T256N / A378V / S383N / N434Y, V259I / N315D / N434Y and N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y .
  • the parent polypeptide consists of an Fc fragment, and preferably an entire Fc fragment.
  • the parent polypeptide consists of an amino acid sequence fused to N- or C-terminal to an Fc fragment.
  • the parent polypeptide is an antibody, an Fc fusion polypeptide or an Fc conjugate.
  • the Fc fragment of the parent polypeptide is chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5.
  • the Fc fragment of the parent polypeptide has the sequence SEQ ID NO: 1.
  • sequences shown in SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 and 5 are free of an N-terminal hinge region.
  • sequences represented in SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 and 10 respectively correspond to the sequences represented in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 5 with their hinge regions at the N-terminal.
  • the Fc fragment of the parent polypeptide is chosen from the sequences SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 and 10.
  • the Fc fragment of the parent polypeptide has a sequence corresponding to positions 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9-232. , 10-232 or 11-232 of the sequence SEQ ID NO: 6.
  • the parent polypeptide consists of an immunoglobulin, an antibody or an amino acid sequence fused to an N- or C-terminal to an antibody or an immunoglobulin.
  • variant is meant a polypeptide sequence which is different from the parent polypeptide sequence by at least one amino acid modification.
  • the sequence of the variant has at least 80% identity with the sequence of the parent polypeptide, and more preferably at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%. , 98%, 99% or 99.5% identity.
  • percent identity between two amino acid sequences in the sense of the present invention, it is meant to designate a percentage of identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistics and the differences between the two sequences being randomly distributed over their entire length.
  • Best alignment or “optimal alignment” is meant the alignment for which the percentage of identity determined as hereinafter is the highest.
  • Sequence comparisons between two amino acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligning them, said comparison being performed by segment or by "comparison window" to identify and compare the local regions of sequence similarity. .
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be realized, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981, J.
  • the parent polypeptide is an immunoglobulin or an antibody, preferably an IgG, and the variant according to the invention is then selected from IgG variants. More preferentially, the variant according to the invention is chosen from human IgG 1, IgG 2, IgG 3 and IgG 4 variants.
  • the process for producing a variant according to the invention or the process for increasing the sialylation according to the invention comprises a mutation carried out on at least one amino acid of the Fc fragment located at position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 or 305, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • the process for producing the variant or the method for increasing the sialylation according to the invention comprises at least one mutation on the Fc fragment chosen from V262del, V263F, V263K, V263W, V264K, V264P, D265A, D265E, D265G.
  • the invention relates to a method for increasing the sialylation of an Fc fragment, comprising a step of mutating at least one amino acid selected from amino acids in position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said Fc fragment, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat, excluding the amino acids at position 262 and 264.
  • the invention also preferably relates to a method for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having a sialylation improved of said Fc fragment relative to the parent polypeptide, which comprises a step of mutating at least one amino acid selected from amino acids in position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said Fc fragment, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat, and wherein said mutating step does not relate to any of the amino acids at position 262 or 264.
  • the mutation is carried out on the amino acid of the Fc fragment located in position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 or 305. More preferably, the mutation is carried out on the amino acid of the Fc fragment located in position 293 or 294, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat. According to a particular embodiment, the mutation is carried out on the two amino acids of the Fc fragment located at position 293 and at position 294, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • the subject of the present invention is also a process for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having at least one effector activity mediated by said Fc fragment, decreased with respect to the effector activity of the parent polypeptide , said method comprising a step of mutating at least one amino acid selected from amino acids in position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said Fc fragment, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat .
  • Fc fragment-mediated effector activity is meant, in particular, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC or Antibody-Dependent Cell- mediated Cytotoxicity), complement-dependent cytotoxicity (CDC or Complement Depends Cytotoxicity), cell-dependent cellular phagocytosis. antibodies (ADCP), endocytosis activity or secretion of cytokines.
  • the effector activity mediated by the Fc fragment considered in the invention is selected from antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC), and antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP).
  • DCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCP antibody-dependent cellular phagocytosis
  • diminished effector activity is meant a diminished or abolished effector activity.
  • a variant of a parent polypeptide produced by a method according to the invention may have at least one effector activity mediated by the abolished Fc fragment.
  • a variant of a parent polypeptide produced by a method according to the invention has an effector activity mediated by the decreased Fc region, relative to that of the parent polypeptide, of at least 10%, preferably at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%.
  • the invention provides a method for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant lacking any effector activity mediated by said Fc fragment, comprising a mutation step of at least one amino acid selected from amino acids in position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said Fc fragment, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • the invention provides a method for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant exhibiting at least one effector activity mediated by said Fc fragment, decreased in relation to the effector activity of the parent polypeptide, comprising a step of mutating at least one amino acid selected from amino acids in position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said Fc fragment, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat, and wherein the mutation step is not directed to any of the amino acids at position 262, 264, 293 or 294.
  • the present invention provides a method for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having an affinity mediated by said Fc fragment, decreased relative to the affinity of the parent polypeptide for at least one of the Fc region receptors (FcR) comprising a step of mutating at least one amino acid selected from amino acids at position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said Fc fragment, numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • Fc region receptor or “FcR” is meant in particular Clq and Fcy receptors (FcyR).
  • Fc ⁇ receptors or “Fc ⁇ R” refer to the IgG-type immunoglobulin receptors, called CD64 (Fc ⁇ RIII), CD32 (Fc ⁇ RII), and CD16 (FCYRIII), in particular to the five expressed Fc ⁇ RIa, Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb, Fc ⁇ RIIIa receptors. and PcyRIIIb. All are effector cell activating receptors, except for human Fc ⁇ RIIb which is an inhibitory receptor for immune cell activation (Muta T et al., Nature, 1994, 368: 70-73).
  • the Clq complement is involved in the CDC activity.
  • the FcgRIIIa receptor (CD 16a) is involved in the ADCC; it has a V / F polymorphism at position 158.
  • the FcgRIIa receptor (CD32a) is involved in platelet activation and phagocytosis; it has an H / R polymorphism at position 131.
  • FcgRIIb receptor (CD32b) is involved in the inhibition of cellular activity.
  • the affinity is reduced, relative to that of the parent polypeptide comprising the Fc fragment, by at least 10%, preferably by at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%. , 80%, or 90%.
  • the invention provides a method for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having an affinity mediated by said decreased Fc fragment relative to the affinity of the parent polypeptide, for at least one receptors of the Fc (FcR) region chosen from Clq complement and FcgRIIIa (CD16a), FcgRIIa (CD32a) and FcgRIIb (CD32b) receptors, comprising a step of mutating at least one amino acid selected from amino acids in position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said Fc fragment, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • FcR Fc receptor region chosen from Clq complement and FcgRIIIa
  • CD32a FcgRIIa
  • CD32b FcgRIIb
  • the variant produced according to the invention has an affinity mediated by the decreased Fc fragment relative to that of the parent polypeptide, by at least 10%, of preferably at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%.
  • the affinity of the mutated Fc fragment for a FcR is less than that of the parent polypeptide.
  • the ratio of the affinity mediated by the Fc fragment of a variant according to the invention relative to that of the parent polypeptide is less than 0.9, preferably less than 0.8, preferably less than 0.7, preferably less than 0.7. 0.6, preferably less than 0.5, preferably less than 0.4, preferably less than 0.3, preferably less than 0.2, preferably less than 0.1.
  • the ratio of Fc fragment-mediated affinity of a variant according to the invention to that of the parent polypeptide is less than 0.7. More preferably, the ratio of the affinity mediated by the Fc fragment of a variant according to the invention relative to that of the parent polypeptide is between 0.9 and 0.1, preferably between 0.8 and 0.2, between 0.7 and 0.3, or between 0.6 and 0.4.
  • the affinity of a polypeptide comprising an Fc fragment for a FcR can be evaluated by methods well known in the art. For example, one skilled in the art can determine affinity (Kd) using surface plasmon resonance (SPR).
  • Binding affinity can be indifferently determined by evaluating whole polypeptides or evaluating isolated Fc regions thereof.
  • a variant produced according to a method which is the subject of the invention has an affinity mediated by said Fc fragment, decreased with respect to the affinity of the parent polypeptide, for the FcgRIIIa receptor (CD 16a), and the FcgRIIa receptor ( CD32A).
  • the invention provides a method for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having an affinity mediated by said Fc fragment, decreased relative to the affinity of the parent polypeptide for at least one of the Fc region receptors (FcR), preferably selected from complement C lq and FcgRIIIa receptors (CD 16a), FcgRIIa (CD32a), and FcgRIIb (CD32b), and comprising a step of mutating at least one amino acid selected from amino acids in position 240 to 243, 258 to 267 and 290 to 305 of said Fc fragment, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabatet wherein the mutation step is not on any of the amino acids at position 262, 264, 293 or 294.
  • FcR Fc region receptors
  • the mutation is chosen from an insertion, a substitution, preferably a single substitution, and a deletion, and is carried out on at least one amino acid located at position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 or 305, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment produced according to the invention may have an affinity for the FcRn receptor mediated by the Fc fragment, conserved or increased, with respect to said affinity of the parent polypeptide.
  • the mutation or mutations that comprise the variant according to the invention does not affect the affinity for the FcRn receptor mediated by the Fc fragment.
  • the variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment produced according to the invention comprises one or more mutations that do not affect the affinity for the FcRn receptor mediated by the Fc fragment relative to the affinity of the parent polypeptide.
  • FcRn or “neonatal Fc receptor” as used herein is meant a protein that binds to the Fc region of IgG and is encoded at least in part by an FcRn gene.
  • FcRn can be from any organism including, but not limited to, humans, mice, rats, rabbits and monkeys.
  • the functional FcRn protein comprises two polypeptides, often referred to as heavy chain and light chain. The light chain is beta-2-microglobulin and the heavy chain is encoded by the FcRn gene.
  • FcRn or FcRn protein refers to the ⁇ -chain complex with beta-2-microglobulin.
  • the gene encoding FcRn is called FCGRT.
  • the mutation step of the method for preparing the variant according to the invention is obtained as follows:
  • ii) modifying the nucleic sequence provided in i) to obtain a nucleic sequence coding for the variant; and iii) expressing the nucleic sequence obtained in ii) in a host cell, and recovering the variant.
  • Such a mutation step is thus performed using a nucleic sequence (polynucleotide or nucleotide sequence) encoding said parent polypeptide (step i)).
  • the nucleic acid sequence encoding the parent polypeptide may be synthesized chemically (Young L and Dong, 2004, -Nucleic Acids Res., Apr. 15; 32 (7), Hoover, DM and Lubkowski, J. 2002, Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et al., 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6; 7: 285).
  • the nucleotide sequence encoding the parent polypeptide may also be amplified by PCR using suitable primers.
  • the nucleotide sequence encoding the parent polypeptide may also be cloned into an expression vector.
  • the DNA coding for such a parent polypeptide is inserted into an expression plasmid and inserted into an ad hoc cell line for its production (for example the HEK-293 FreeStyle line, the YB2 / 0 line, or the CHO line).
  • the protein thus produced is then purified by chromatography.
  • nucleic sequence provided in i) (polynucleotide), which encodes the parent polypeptide, is then modified to obtain a nucleic sequence encoding the variant. This is step ii).
  • This step is the actual mutation stage. It can be performed by any known method of the prior art, in particular by site-directed mutagenesis or by random mutagenesis.
  • the random mutagenesis as described in the application WO02 / 038756 is used: it is the Mutagen technique. This technique uses a human DNA mutase, in particular chosen from DNA polymerases ⁇ , ⁇ and ⁇ . A step of selecting mutants having retained FcRn binding is necessary to retain the mutants of interest.
  • amino acid substitutions are preferably carried out by site-directed mutagenesis, by the use of P CR for the use of seeds.
  • degenerate oligonucleotides see, e.g., Zoller and Smith, 1982, Nucl Acids Res 10: 6487-6500, Kunkel, 1985, Proc Natl, Acad Sci USA 82: 488).
  • step iii) the nucleic sequence obtained in ii) is expressed in a host cell, and the variant thus obtained is recovered.
  • the cellular host may be chosen from prokaryotic or eukaryotic systems, for example bacterial cells, but also yeast cells or animal cells, in particular mammalian cells. Insect cells or plant cells can also be used.
  • the preferred host cells are the YB2 / 0 rat line, the CHO hamster line, in particular the CHO dhfr- and CHO Lecl3, PER.C6 TM (Crucell), HEK293, T1080, EB66, K562, NS0, SP2 / lines. 0, BHK or COS. More preferably, the YB2 / 0 rat line is used.
  • the host cells may be modified transgenic animal cells to produce the polypeptide in the milk.
  • the expression of a DNA sequence coding for the polypeptide according to the invention is controlled by a mammalian casein promoter or a mammalian whey promoter, said promoter not naturally controlling the transcription of said gene, and the DNA sequence further containing a secretion sequence of the protein.
  • the secretion sequence comprises a secretion signal interposed between the coding sequence and the promoter.
  • the animal can thus be chosen from sheep, goat, rabbit, sheep or cow.
  • the polynucleotide encoding the variant obtained in step ii) may also comprise optimized codons, in particular for its expression in certain cells (step iii)).
  • said cells include COS cells, CHO cells, HEK cells, BHK cells, PER.C6 cells, HeLa cells, NIH / 3T3 cells, 293 (ATCC # CRL1573), T2 cells, dendritic cells or monocytes.
  • the purpose of codon optimization is to replace natural codons with codons whose amino acid transfer RNAs (tRNAs) are the most sensitive. frequent in the cell type considered.
  • Codon optimization also plays on the prediction of mRNA secondary structures that could slow down reading by the ribosomal complex. Codon optimization also has an impact on the percentage of G / C that is directly related to the half-life of the mRNAs and therefore to their translation potential (Chechetkin, J. of Theoretical Biology 242, 2006 922-934). Codon optimization can be done by substitution of natural codons using codon frequency (Codon Usage Table) tables for mammals and more specifically for Homo sapiens. There are algorithms available on the internet and made available by the suppliers of synthetic genes (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) that make this sequence optimization possible.
  • the polynucleotide comprises codons optimized for expression in HEK cells, such as HEK293 cells, CHO cells, or YB2 / 0 cells. More preferably, the polynucleotide comprises codons optimized for its expression in YB2 / 0 cells. Alternatively, preferably, the polynucleotide comprises codons optimized for its expression in the cells of transgenic animals, preferably the goat, the rabbit, the ewe or the cow.
  • the variant obtained according to the invention may be combined with pharmaceutically acceptable excipients, and optionally extended release matrices, such as biodegradable polymers, to form a therapeutic composition.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally, sublingually, subcutaneously, intramuscularly, intravenously, intraarterially, intrathecally, intraocularly, intracerebrally, transdermally, pulmonally, locally or rectally.
  • the active ingredient alone or in combination with another active ingredient, can then be administered in unit dosage form, in admixture with conventional pharmaceutical carriers.
  • Unit dosage forms include oral forms such as tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual and oral forms of administration, aerosols, subcutaneous implants cutaneous, transdermal, topical, intraperitoneal, intramuscular, intravenous, subcutaneous, intrathecal, intranasal administration forms and rectal administration forms.
  • the pharmaceutical composition contains a pharmaceutically acceptable carrier for a formulation that can be injected.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for a formulation that can be injected.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for a formulation that can be injected.
  • It may be in particular sterile iso-tonic formulas, saline solutions (with monosodium or disodium phosphate, sodium chloride, potassium chloride, calcium or magnesium chloride and the like, or mixtures of such salts), or compositions freeze-dried, which, during the addition of sterilized water or physiological saline as appropriate, allow the constitution of injectable solutions.
  • Dosage forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions, oily formulations, including sesame oil, peanut oil, and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions.
  • the form must be sterile and must be fluid to the extent that it must be injected by syringe. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms, such as bacteria and fungi.
  • the dispersions according to the invention can be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols or mixtures thereof, or in oils. Under normal conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of micro-organisms.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, a polyol (eg, glycerine, propylene glycol, polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures of these, and / or vegetable oils.
  • a surfactant such as lecithin.
  • Prevention of the action of microorganisms can be caused by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid or thimerosal. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride.
  • Prolonged absorption injectable compositions can be caused by the use in the compositions of agents delaying absorption, for example, aluminum monostearate or gelatin.
  • Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active ingredients in the required amount in the appropriate solvent with several of the other ingredients listed above, if appropriate, followed by sterilization by filtration.
  • the dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile vehicle that contains the basic dispersion medium and the other required ingredients from those enumerated above.
  • the preferred methods of preparation are vacuum drying and lyophilization.
  • the solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in a therapeutically effective amount.
  • the formulations are easily administered in a variety of dosage forms, such as the injectable solutions described above, but drug release capsules and the like can also be used.
  • parenteral administration in an aqueous solution for example, the solution should be suitably buffered and the liquid diluent rendered isotonic with sufficient saline or glucose.
  • aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration.
  • sterile aqueous media that can be used are known to those skilled in the art.
  • a dose may be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and then added to 1000 ml of appropriate liquid, or injected at the proposed site of the infusion.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be formulated in a therapeutic mixture comprising about 0.0001 to 1.0 milligrams, about 0.001 to 0.1 milligrams, about 0.1 to 1.0 milligrams, or about 10 milligrams per dose or more. Multiple doses may also be administered.
  • the level of therapeutically effective dose specific for a particular patient will depend on a variety of factors, including the disorder being treated and the severity of the disease, the activity of the specific compound employed, the specific composition used, the age, the body weight, general health, sex and diet of the patient, the moment administration, the route of administration, the rate of excretion of the specific compound used, the duration of treatment, or the drugs used in parallel.
  • FIG. 1 shows alignments of native human IgG1 sequences referring to positions 216 to 447 (according to the index UE) with the corresponding sequences of human IgG2 (SEQ ID NO: 2 and 7), human IgG3 (SEQ ID NO: 3 and 8) and human IgG4 (SEQ ID NO: 4 and 9).
  • the IgG1 sequences refer to the Glml allotype, 17 (SEQ ID NO: 1 and 6) and the Glm3 allotype (SEQ ID NOs: 5 and 10).
  • the "lower hinge CH2-CH3" domain of IgG1 begins at position 226 (see arrow). The CH2 domain is highlighted in gray and the CH3 domain is italicized.
  • A) Represents the evolution over time of the concentration of plasma IgG
  • Example 1 Production of deleted variants at position 294
  • the inventors have analyzed the sialylation of several variants in accordance with the invention, in particular deleted at position 294 (EU number or equivalent in Kabat).
  • several variants comprise a combination of additional mutations among the combinations described to confer an optimized binding to FcRn in the patent application EP 0 233 500.
  • this method includes the following steps:
  • the human Fc gene coding for residues 226 to 447 (according to the EU index of Kabat and represented in FIG. 1) derived from the heavy chain of a human IgG1 is cloned in a suitable vector, such as the phagemid vector pMG58 according to standard protocols well known to those skilled in the art.
  • a suitable vector such as the phagemid vector pMG58 according to standard protocols well known to those skilled in the art.
  • the Fc libraries are expressed using the Phage-display technique according to standard protocols, for use in the selection of Fc fragments.
  • the selection can be done according to the protocol detailed in the European patent application EP 2 233 500, in particular by selection on FcRn in solid or liquid phase, then determination of the binding characteristics of FcRn fragments by ELISA.
  • the Fc SEQ ID NO: 1 fragment sequence was cloned into a generic eukaryotic expression vector derived from pCEP4 (Invitrogen) and containing the heavy chain of a chimeric anti-CD20 antibody according to standard PCR protocols.
  • the light chain of this antibody was inserted into a similar pCEP4 derived vector.
  • All mutations of interest in the Fc fragment were inserted into the expression vector containing the anti-CD20 heavy chain by overlap PCR.
  • the 294Del variant was obtained using two sets of primers adapted to integrate the 294 deletion on the heavy chain contained in the expression vector.
  • the fragments thus obtained by PCR were combined and the resulting fragment was amplified by PCR using standard protocols.
  • the PCR product was purified on 1% (w / v) agarose gels, digested with the appropriate restriction enzymes and cloned into the anti-CD20 heavy chain expression vector.
  • HEK 293 cells were cotransfected with the light chain and heavy chain anti-CD20 IgG expression vectors in equimolar amounts according to standard protocols (Invitrogen). The cells were cultured to produce the antibodies transiently. The antibodies produced could be isolated and purified according to standard techniques of the art, with a view to their characterization. 2- Production of IgG variants in YB2 / 0 cells
  • Fc variants were prepared in full IgG format in the YB2 / 0 cell line (ATCC, CRL-1662) with anti-CD20 and anti-RhD specificity.
  • the IgG heavy and light chain was cloned into a bicistronic vector HKCD20 optimized for production in YB2 / 0.
  • the production was carried out in stable pools of YB2 / 0 cells.
  • the cell culture production and antibody purification steps were carried out according to standard techniques of the art, with a view to their characterization.
  • the inventors have verified that the deionization at position 294 did not have a significant impact on FcRn binding.
  • the variants deleted at position 294 retain their binding to FcRn relative to the parent IgG (IgG WT or IgG comprising mutations. "Optimized FcRn").
  • the sample to be analyzed was desalinated according to standard protocols so as to eliminate all the free reducing glucides potentially present as well as substances that could interfere during the subsequent steps (salts and excipients).
  • the sample was dried and the glycols were released by the enzymatic action of N-Glycannase under denaturing and reducing conditions, in order to maximize the yield of N-deglycosylation.
  • the dry sample was taken up in 45 of the PNGase F digestion solution diluted 1/5. 1.5 of a solution of ⁇ -mercaptoethanol 10% (v / v) in ultrapure water was added before stirring and incubation for 15 minutes at room temperature.
  • the isolation of the exoglycosidic degradation products was carried out by cold alcohol extraction by adding 60 (3 volumes) of absolute ethanol equilibrated at -20 ° C., before stirring and then incubation at -20 ° C. for 15 minutes. Centrifugation at 10,000 rpm was performed for 10 minutes at + 4 ° C, and the supernatant was immediately transferred to a 0.5 mL microtube before being dried under vacuum.
  • oligosaccharides obtained were then labeled with a fluorochrome, the APTS, then separated and quantified in HPCE-LIF.
  • the identification of the N-glycanse peaks is carried out using a standard glycoprotein standard whose N-glycosylation is perfectly known, by comparing the migration times of its N-glycans with those of the species observed on the profiles. electrophoretic samples to be analyzed. In addition, the migration times of the standard oligosaccharides are converted into units of glucose (GUs) after analysis of a heterogeneous mixture of a glucose homopolymer (Glc ladder). These values of GUs will then be compared with those of some standard oligosaccharides of known GUs, and will make it possible to increase the confidence index of the identifications. Results
  • the electrophoregrams obtained show biantennian glycan structures. These structures are mainly sialylated.
  • the electrophoregrams obtained show biantennian glycan structures. These structures are mainly sialylated.
  • the electrophoregrams obtained show biantennian glycan structures. These structures are mainly sialylated.
  • the electrophoregrams obtained show biantennary glycan structures mainly consisting of non-fucosylated agalactosylated short structures (GO: 52.06%). Fucosylated structures are a minority. Some structures possessing a GlcNac in bisecting position (G0B, G0FB) are observed.
  • the predominant oligosaccharide structure is: G0 (52.06%).
  • the calculated fucosylation rate is 17.05%
  • the fucosylation rate obtained with the run DSial + DGal + DhexNAc (*) is 13.07%.
  • the rate of forms having a GlcNac bisector is 2.87%.
  • the calculated galactosylation rate is 40.5%.
  • the electrophoregrams obtained show biantennary glycan structures and some triantennial structures. These structures are mainly sialylated.
  • the predominant oligosaccharide structure is: GO (55.20%).
  • the calculated fucosylation rate is 12.37%), the fucosylation rate obtained with the run DSial + DGal + DhexNAc (*) is 10.63%.
  • the rate of forms having a GlcNac bisector is 2.27%.
  • the calculated galactosylation rate is 39.13%.
  • the electrophoregrams obtained show biantennary glycan structures and some triantennial structures. These structures are mainly sialylated.
  • the variant T5A-74H differs from the parent variant T5A-74 by the V264E mutation.
  • the mutant T5A-74Del294 differs from the parent variant T5A-74 by the deletion of the amino acid at position 294.
  • mice hFcRn which are homozygous for a murine FcRn KO allele and heterozygous for a human FcRn transgene (mFcRn - / - hFcRnTg).
  • each animal received a single intravenous injection of 5 mg / kg IgG at the retro-orbital sinus in a protocol similar to that previously described (Petkova SB, et al., Enhanced half-life of genetically engineered human IgGl antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease (Int Immunol 2006). Blood samples were taken from the retro-orbital sinus at multiple time points and IgGs titrated by ELI SA. Results:
  • AUCO-t Area under the time / plasma concentration curve (from time T0 to the last time t where the antibody is still quantifiable)
  • Each mutation of interest in the Fc fragment was inserted independently into an expression vector containing the anti-CD20 heavy chain by overlap PCR using two sets of primers adapted to integrate a deletion or a degenerate codon (NNN or NNK ) in the targeted position (240 to 243, 258 to 267, 290 to 305).
  • the fragments thus obtained by PCR were combined and the resulting fragment was amplified by PCR using standard protocols.
  • the PCR product was purified on gels agarose 1% (w / v), digested with the appropriate restriction enzymes and cloned into the eukaryotic expression vector pMGM05-CD20 (pCEP4 InvitroGen), which contains cloning sites for the Fc fragment (BamHI and NotI) and the VH variable chain of the anti-CD20 antibody.
  • pMGM05-CD20 pCEP4 InvitroGen
  • This construction leads to the mutation of two amino acids in Fc (aa224 and 225, HT changed to GS) and the addition of the EFAAA sequence to the C-terminal of Fc, but makes it possible to very rapidly test a very large number of clones. Initially, it was verified that these mutations did not modify the binding of IgG-WT to the different receptors. Subsequently, the positive controls were cloned into this system in order to validate it:
  • IgG1-G236A from Xencor (C4): positive control for CD32aH / R;
  • the DNA of isolated clones was sequenced after colony PCR. After bioinformatic analyzes, clones with new mutations were frozen at -80 ° C with XL1-Blue bacteria and the sequences included in our database. Thus, 268 variants were constructed.
  • the anti-CD20 light chain was inserted into a pCEP4 vector identical to the vector used for the heavy chain, denoted pMGM01-CDC20 (pCEP4 InvitroGen).
  • HEK293-F Freestyle TM cells (Invitrogen), grown in 24-well plates, were co-transfected with the pMGM01-CD20 and pMGM05-CD20 vectors (Fc-WT and variants) in equimolar amounts (250 ng / ml). ) with a transfection reagent (1 ⁇ / ml) using standard protocols (Invitrogen).
  • the cells were cultured in suspension in serum-free medium for 7-9 days post transfection and the IgG-containing supernatants (1 ml) were harvested after centrifugation of the cells at 100 g for 10 min. IgG secreted in the supernatants were quantified using an ELISA test (FastELISA, R & D biotech). 3. Recombinant Fc Receptors Used:
  • CD16a is an activator receptor that has a V / F polymorphism at position 158 at the Fc binding site. The affinity is better for CD16aV.
  • CD16aV is commercially available (R & D System).
  • CD32a is an activating receptor that has an H / R polymorphism at position 131 at the Fc binding site. The affinity is better for CD32aH.
  • CD32aH was produced by PX'Therapeutics.
  • CD32aR and CD32b are commercially available (R & D System).
  • IgG variants were tested for binding to several human FcRs and FcRn by ELISA.
  • Maxisorp immunoplates were coated with 0.1 ⁇ g CD32 ⁇ H / well, or 0.2 ⁇ g CD16 ⁇ / well in PBS or 0.25 ⁇ g FcRn in P6 (100mM sodium phosphate, 50mM sodium chloride pH6.0).
  • NiNTA plates HisGrab Pierce
  • the supernatants were diluted in PBS (or P6 for the FcRn test) to a final concentration of 0.5 ⁇ g of IgG / ml and mixed with F (ab ') 2 IgG HRP of goat anti-human at the same concentration for 2 hours at room temperature.
  • IgG aggregated with F (ab ') 2 are then incubated with gentle shaking for 1 hour at 30 ° C on saturated ELISA plates without dilution for CD16aV, CD32aR and CD32b (ie IgG at 0.5 ⁇ g / ml), diluted in of PBS at 0.25 ⁇ g / ml for CD32 ⁇ H and diluted in P6 at 0.035 ⁇ g / ml for FcRn.
  • the plates are then revealed with TMB (Pierce) and the absorbance is read at 450 nm.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé d'augmentation de la sialylation d'un fragment Fc, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. La présente invention concerne également un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une sialylation améliorée dudit fragment Fc par rapport au polypeptide parent, qui comprend une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE VARIANTS AYANT UN Fc PRESENTANT
UNE SIALYLATION AMELIOREE
La présente invention concerne un procédé d'augmentation de la sialylation d'un fragment Fc, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Les anticorps monoclonaux sont utilisés aujourd'hui en tant qu'agents thérapeutiques pour traiter une variété de pathologies, y compris les cancers, les maladies auto- immunes, les maladies inflammatoires chroniques, le rejet de greffe, les maladies infectieuses et les maladies cardio-vasculaires. Ils constituent donc un enjeu thérapeutique majeur. Nombre d'entre eux est déjà commercialisé, et une proportion toujours croissante est en cours de développement ou d'essais cliniques. Cependant, il existe un besoin important pour optimiser les propriétés structurales et fonctionnelles des anticorps, afin d'en maîtriser les effets secondaires.
Une des questions critiques dans l'utilisation d'anticorps monoclonaux en thérapie est leur persistance dans la circulation sanguine. La clairance de l'anticorps affecte directement l'efficacité du traitement, et par conséquent, la fréquence et la quantité de l'administration du médicament, qui peut entraîner des effets indésirables chez le patient.
Les immunoglobulines d'isotype G (IgG) constituent la classe d'immunoglobulines la plus fréquente chez l'homme et aussi la plus utilisée en thérapie. Différentes expériences de mutagenèse spécifique dans la région constante (Fc) des IgG de souris ont permis d'identifier certains résidus d'acides aminés critiques impliqués, pour certains, dans l'interaction entre les IgG et le FcRn (Kim et al, 1994, Eur J Immunol; 24:2429-34;
Kim et al, 1994, Eur J Immunol; 24: 542-8; Medesan et al, 1996, Eur J Immunol. ; 26:2533-6; Medesan et al, 1997, J Immunol; 158:2211-7). Des études ont plus récemment été menées chez l'homme (Shields et al, 2001, J. Biol. Chem. ; 276 : 6591-
6604). Il existe cependant toujours un besoin de trouver des anticorps, ou des fragments d'anticorps, ayant une demi-vie améliorée, et présentant des propriétés biologiques intéressantes.
La présente invention fournit des moyens pour obtenir un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc ayant une sialylation optimisée. Cette sialylation optimisée, i.e. améliorée, confère notamment au variant une demi-vie augmentée, ainsi que des propriétés anti-inflammatoires optimisées par rapport à un polypeptide parent. Le terme « demi- vie » se réfère à une demi- vie biologique d'un polypeptide d'intérêt dans la circulation d'un animal donné, et est représenté par le temps nécessaire à la moitié de la quantité présente dans la circulation de l'animal à être éliminée de la circulation et/ou d'autres tissus de l'animal.
En effet, de façon surprenante, les inventeurs ont découvert qu'un fragment Fc muté sur une position spécifique, proche du site de N-glycosylation, présente une sialylation fortement augmentée par rapport au fragment Fc non muté. Cela permet ainsi d'augmenter les propriétés d'intérêt du fragment Fc, et notamment sa demi-vie. Cela peut permettre en outre d'augmenter son activité anti-inflammatoire. La présente invention a donc pour objet un procédé d'augmentation de la sialylation d'un fragment Fc, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, ledit procédé d'augmentation de la sialylation d'un fragment Fc comprend :
- une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, puis
- une étape d'analyse de la sialylation du fragment Fc obtenu.
La présente invention a également pour objet un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une sialylation améliorée dudit fragment Fc par rapport à la sialylation du fragment Fc du polypeptide parent, qui comprend une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, ledit procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc comprend :
- une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, puis
- une étape d'analyse de la sialylation du fragment Fc obtenu.
De préférence, ledit procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc est tel que le variant présente au moins une activité effectrice médiée par ledit fragment Fc diminuée par rapport à l'activité effectrice du polypeptide parent.
Par « augmentation de la sialylation » ou « sialylation améliorée », on entend que la sialylation de la protéine obtenue est augmentée d'au moins 10%, de préférence au moins 15%, de préférence au moins 20%, de préférence au moins 25%, de préférence au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de préférence au moins 55%, de préférence au moins 60%, de préférence au moins 65%, de préférence au moins 70%, de préférence au moins 75%, de préférence au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 95%, par rapport à la sialylation dudit fragment Fc avant l'étape de mutation ou dudit fragment Fc du polypeptide parent.
La sialylation d'une protéine est un mécanisme de glycosylation bien connu (voir notamment Essentials of Glycobiology, 2nd édition, Varki et al, 2009). Elle correspond à un ajout, par liaison covalente, d' au moins un acide sialique (i.e. acide N- acétylneuraminique et ses dérivés, comme l'acide N-glycosylneuraminique, l'acide N- acétylglycoylneuraminique) dans la chaîne glycosylée de la protéine. Tel qu'ils sont utilisés ici, les termes «protéine» et «polypeptide» sont utilisés ici de manière interchangeable et se réfèrent à une séquence d'au moins deux acides aminés liés de façon covalente, incluant les protéines, polypeptides, oligopeptides et peptides. Les termes « protéine » et « polypeptide » incluent notamment les anticorps ou immunoglobulines, notamment entiers, monoclonaux, multi-spécifïques, bi-spécifïques, dual-spécifïques, synthétiques, chimériques, humanisés, humains, les protéines de fusion avec des immunoglobulines, les anticorps conjugués, et leurs fragments.
Les termes « protéine » et « polypeptide » incluent également les polypeptides Fc définis par un polypeptide comprenant tout ou partie d'une région Fc, notamment les fragments Fc isolés, Fc conjugués, Fc multimériques et les protéines de fusion avec un fragment Fc.
Par « fragment Fc » ou « région Fc », on entend la région constante d'une immunoglobuline de longueur totale à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (i.e. CH1-CL). Ainsi le fragment Fc fait référence à un homodimère, chaque monomère comprenant les deux derniers domaines constants des IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 et CH3), ou les trois derniers domaines constants des IgE et IgM (i.e. CH2, CH3 et CH4), et la région charnière flexible N-terminale de ces domaines. Le fragment Fc, lorsqu'il est issu d'IgA ou d'IgM, peut comprendre la chaîne J. De préférence, on utilise dans la présente invention un fragment Fc d'une IgGl, qui se compose de la charnière flexible N-terminale et des domaines CH2-CH3, c'est-à-dire la portion à partir de l'acide aminé C226 jusqu'à l'extrémité C-terminale, la numérotation étant indiquée selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, on utilise un fragment Fc d'une IgGl humaine (i.e. acides aminés 226 à 447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat). Dans ce cas, la charnière inférieure se réfère aux positions 226 à 230, le domaine CH2 fait référence aux positions 231 à 340 et le domaine CH3 se réfère aux positions 341-447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. Le fragment Fc utilisé selon l'invention peut comprendre en outre une partie de la région charnière supérieure, en amont de la position 226. Dans ce cas, de préférence, on utilise un fragment Fc d'une IgGl humaine comprenant une partie de la région située entre les positions 216 à 226 (selon l'indice EU). Dans ce cas, le fragment Fc d'une IgGl humaine fait référence à la portion à partir de l'acide aminé 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224 ou 225 jusqu'à l'extrémité C-terminale.
La définition de « fragment Fc » inclut un fragment scFc pour « single chain Fc ». Par « fragment scFc », on entend un fragment Fc simple chaîne, obtenu par fusion génétique de deux monomères Fc reliés par un linker polypeptidique. Le scFc se replie naturellement en une région Fc dimérique fonctionnelle. De préférence, le fragment Fc utilisé dans le cadre de l'invention est choisi parmi le fragment Fc d'une IgGl ou IgG2. De préférence encore, le fragment Fc utilisé est le fragment Fc d'une IgGl .
Dans la présente demande, la numérotation des résidus du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat (Séquences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Dans le contexte de la présente invention, le polypeptide parent comprend un fragment Fc, appelé « fragment Fc parent ».
Par « mutation d'acide aminé », on entend ici un changement dans la séquence d'acides aminés d'un polypeptide. Une mutation est choisie notamment parmi une substitution, une insertion et une délétion. Par «substitution», on entend le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent, par le même nombre d'autres acides aminés. De préférence, la substitution est ponctuelle, i.e. elle ne concerne qu'un seul acide aminé. Par exemple, la substitution N434S se réfère à un variant d'un polypeptide parent, dans lequel l'asparagine en position 434 du fragment Fc selon l'index EU ou équivalent dans Kabat est remplacé par la sérine. Par « insertion », on entend l'addition d'au moins un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, l'insertion G>235-236 désigne une insertion de glycine entre les positions 235 et 236. Par « délétion », on entend l'élimination d'au moins un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, E294del désigne la suppression de l'acide glutamique en position 294 ; une telle délétion est appelée Del294. Par «polypeptide parent», on entend un polypeptide non modifié qui est ensuite modifié pour générer un variant. Ledit polypeptide parent peut être un polypeptide d'origine naturelle, un variant d'un polypeptide d'origine naturelle, une version modifiée d'un polypeptide naturel ou un polypeptide synthétique. De préférence, le polypeptide parent comprend un fragment Fc choisi parmi les fragments Fc de type sauvage, leurs fragments et leurs mutants. Par conséquent, le polypeptide parent peut éventuellement comprendre des modifications pré-existantes d'acides aminés dans le fragment Fc par rapport aux fragments Fc de type sauvage. Ainsi de préférence, le fragment Fc du polypeptide parent comprend déjà au moins une mutation additionnelle (i.e. modification pré-existante), de préférence choisie parmi P230S, T256N, V259I, N315D, A330V, N361D, A378V, S383N, M428L, N434Y. De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent comprend au moins une combinaison de mutations additionnelles choisie parmi P230S/N315D/M428L/N434Y, T256N/A378V/S383N/N434Y, V259I/N315D/N434Y et N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y.
De préférence, selon une première alternative, le polypeptide parent consiste en un fragment Fc, et de préférence un fragment Fc entier.
De préférence, selon une seconde alternative, le polypeptide parent consiste en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C-terminal à un fragment Fc. Dans ce cas, avantageusement, le polypeptide parent est un anticorps, un polypeptide de fusion Fc ou un conjugué Fc.
De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5. De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent a pour séquence SEQ ID NO : 1.
Les séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 sont exemptes de région charnière en N-terminal.
Les séquences représentées en SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10 correspondent respectivement aux séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 avec leurs régions charnières en N-terminal. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le fragment Fc du polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10. De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent a une séquence correspondant aux positions 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 ou 11- 232 de la séquence SEQ ID NO : 6. Alternativement, le polypeptide parent consiste en une immunoglobuline, un anticorps ou encore en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C-terminal à un anticorps ou une immunoglobuline.
Par «variant», on entend une séquence polypeptidique qui est différente de la séquence du polypeptide parent par au moins une modification d'acide aminé.
De préférence, la séquence du variant a au moins 80% d'identité avec la séquence du polypeptide parent, et plus préférentiellement au moins 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% d'identité. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981 , J. Mol Evol., 18:38-46), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Dans des modes de réalisation préférés, le polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps, de préférence une IgG, et le variant selon l'invention est alors choisi parmi les variants d'IgG. Plus préférentiellement, le variant selon l'invention est choisi parmi les variants d'IgG 1, IgG2, IgG3 et IgG4 humaines.
De préférence, le procédé de production d'un variant selon l'invention ou le procédé d'augmentation de la sialylation selon l'invention comprend une mutation effectuée sur au moins un acide aminé du fragment Fc situé en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 , 302, 303, 304 ou 305, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, le procédé de production du variant ou le procédé d'augmentation de la sialylation selon l'invention comprend au moins une mutation sur le fragment Fc choisie parmi V262del, V263F, V263K, V263W, V264K, V264P, D265A, D265E, D265G, D265L, D265S, D265V, V266A, V266P, V266S, V266T, S267N, S267P, S267R, S267W, P291C, P291V, P291Y, P291W, R292A, R292del, R292T, R292V, R292Y, E293F, E293P, E293W, E293Y, E294del, E294D, E294N, E294W, E294F, Q295D, Q295del, Q295F, Q295G, Q295K, Q295N, Q295R, Q295W, Y296A, Y296C, Y296del, Y296E, Y296G, Y296Q, Y296R, Y296V, S298del, S298E, S298F, S298G, S298L, S298M, S298N, S298P, S298R, S298T, S298W, S298Y, Y300D, Y300del, Y300G, Y300N, Y300P, Y300R, Y300S, R301A, R301F, R301G, R301H, R301I, R301K, R301Q, R301V, R301W, R301Y, V302del, V302A, V302F, V302G, V302P, V303A, V303C, V303P, V303L, V303S, V303Y, S304C, S304M, S304Q, S304T, V305F et V305L, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, l'invention vise un procédé d'augmentation de la sialylation d'un fragment Fc, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, à l'exclusion des acides aminés en position 262 et 264.
L'invention vise aussi de préférence un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une sialylation améliorée dudit fragment Fc par rapport au polypeptide parent, qui comprend une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, et dans lequel ladite étape de mutation ne porte sur aucun des acides aminés en position 262 ou 264.
Ainsi, selon ces modes préférentiels, la mutation est effectuée sur l'acide aminé du fragment Fc situé en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305. Plus préférentiellement, la mutation est effectuée sur l'acide aminé du fragment Fc situé en position 293 ou 294, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Selon un mode de réalisation particulier, la mutation est effectuée sur les deux acides aminés du fragment Fc situés en position 293 et en position 294, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
La présente invention a également pour objet un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant au moins une activité effectrice médiée par ledit fragment Fc, diminuée par rapport à l'activité effectrice du polypeptide parent, ledit procédé comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Par « activité effectrice médiée par le fragment Fc », on entend notamment la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC ou Antibody-Dependent Cell- mediated Cytotoxicity), la cytotoxicité dépendante du complément (CDC ou Complément Dépendent Cytotoxicity), la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l'activité d'endocytose ou encore la sécrétion de cytokines. De préférence, l'activité effectrice médiée par le fragment Fc considérée dans l'invention est sélectionnée parmi la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) et la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP). Par activité effectrice « diminuée » on entend une activité effectrice diminuée ou abolie. Ainsi, un variant d'un polypeptide parent produit par un procédé selon l'invention peut présenter au moins une activité effectrice médiée par le fragment Fc abolie. De préférence, un variant d'un polypeptide parent produit par un procédé selon l'invention présente une activité effectrice médiée par la région Fc diminuée, par rapport à celle du polypeptide parent, d'au moins 10%, de préférence d'au moins 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90%. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention fournit un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant étant dépourvu de toute activité effectrice médiée par ledit fragment Fc, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence selon cet aspect, l'invention fournit un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant au moins une activité effectrice médiée par ledit fragment Fc, diminuée par rapport à l'activité effectrice du polypeptide parent, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, et dans lequel l'étape de mutation ne porte sur aucun des acides aminés en position 262, 264, 293 ou 294.
Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité médiée par ledit fragment Fc, diminuée par rapport à l'affinité du polypeptide parent, pour au moins un des récepteurs de la région Fc (FcR), comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Par « récepteur de la région Fc » ou « FcR » on entend notamment le Clq et les Récepteurs Fcy (FcyR). Les « Récepteurs Fcy » ou « FcyR » se réfèrent aux récepteurs des Immunoglobulines de type IgG, appelés CD64 (FcyRI), CD32 (FcyRII), et CD 16 (FCYRIII), en particulier aux cinq récepteurs exprimés FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIb, FcYRIIIa et PcyRIIIb. Tous sont des récepteurs activateurs des cellules effectrices, hormis le FcyRIIb humain qui est un récepteur inhibiteur de l'activation des cellules immunitaires (Muta T et al, Nature, 1994, 368 :70-73).
Le complément Clq est impliqué dans l'activité CDC.
Le récepteur FcgRIIIa (CD 16a) est, quant à lui, impliqué dans l'ADCC ; il présente un polymorphisme V/F en position 158.
Le récepteur FcgRIIa (CD32a) est, quant à lui, impliqué dans l'activation plaquettaire et la phagocytose ; il présente un polymorphisme H/R en position 131.
Enfin, le récepteur FcgRIIb (CD32b) est impliqué dans l'inhibition de l'activité cellulaire.
Par affinité « diminuée » on entend une affinité diminuée ou abolie. Préférentiellement, l'affinité est diminuée, par rapport à celle du polypeptide parent comprenant le fragment Fc, d'au moins 10%, de préférence d'au moins 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90%.
De préférence, l'invention fournit un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité médiée par ledit fragment Fc diminuée par rapport à l'affinité du polypeptide parent, pour au moins un des récepteurs de la région Fc (FcR) choisi parmi le complément Clq et les récepteurs FcgRIIIa (CD 16a), FcgRIIa (CD32a) et FcgRIIb (CD32b), comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Préférentiellement, le variant produit selon l'invention a une affinité médiée par le fragment Fc diminuée par rapport à celle du polypeptide parent, d'au moins 10% , de préférence d'au moins 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90%.. En d'autres termes, l'affinité du fragment Fc muté pour un FcR est inférieure à celle du polypeptide parent. De préférence, le ratio de l'affinité médiée par le fragment Fc d'un variant selon l'invention par rapport à celle du polypeptide parent est inférieur à 0.9, de préférence inférieur à 0.8, de préférence inférieur à 0.7, de préférence inférieur à 0.6, de préférence inférieur à 0.5, de préférence inférieur à 0.4, de préférence inférieur à 0.3, de préférence inférieur à 0.2, de préférence inférieur à 0.1. Par exemple, le ratio de l'affinité médiée par le fragment Fc d'un variant selon l'invention par rapport à celle du polypeptide parent est inférieur à 0.7. De préférence encore, le ratio de l'affinité médiée par le fragment Fc d'un variant selon l'invention par rapport à celle du polypeptide parent est compris entre 0.9 et 0.1, de préférence entre 0.8 et 0.2, entre 0.7 et 0.3, ou entre 0.6 et 0.4.
L'affinité d'un polypeptide comprenant un fragment Fc pour un FcR peut être évaluée par des procédés bien connus de l'art antérieur. Par exemple, l'homme de l'art peut déterminer l'affinité (Kd) en utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR).
Alternativement, l'homme de l'art peut effectuer un test ELISA approprié. Un dosage
ELISA approprié permet de comparer les forces de liaison du Fc parent et du Fc muté.
Les signaux détectés spécifiques du Fc muté et du Fc parent sont comparés. L'affinité de liaison peut être indifféremment déterminée en évaluant les polypeptides entiers ou en évaluant les régions Fc isolées de ceux-ci.
Selon un mode particulier, un variant produit selon un procédé objet de l'invention présente une affinité médiée par ledit fragment Fc, diminuée par rapport à l'affinité du polypeptide parent, pour le récepteur FcgRIIIa (CD 16a), et le récepteur FcgRIIa (CD32a).
De préférence selon cet autre aspect, l'invention fournit un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité médiée par ledit fragment Fc, diminuée par rapport à l'affinité du polypeptide parent, pour au moins un des récepteurs de la région Fc (FcR), de préférence choisi parmi le complément C lq et les récepteurs FcgRIIIa (CD 16a), FcgRIIa (CD32a), et FcgRIIb (CD32b), et comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabatet dans lequel l'étape de mutation ne porte sur aucun des acides aminés en position 262, 264, 293 ou 294.
Selon un mode particulier, la mutation est choisie parmi une insertion, une substitution, de préférence ponctuelle, et une délétion, et est effectuée sur au moins un acide aminé situé en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Avantageusement, un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc produit selon l'invention peut présenter une affinité pour le récepteur FcRn médiée par le fragment Fc, conservée ou augmentée, par rapport à ladite affinité du polypeptide parent. De préférence, la ou les mutations que comprend le variant selon l'invention n'affecte pas l'affinité pour le récepteur FcRn médiée par le fragment Fc. En d'autres termes, de préférence, le variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc produit selon l'invention comprend une ou plusieurs mutations qui n'affectent pas l'affinité pour le récepteur FcRn médiée par le fragment Fc par rapport à l'affinité du polypeptide parent.
Par "FcRn" ou "récepteur Fc néonatal" tel qu'utilisé ici, on entend une protéine qui se lie à la région Fc des IgG et est codée au moins en partie par un gène FcRn. Le FcRn peut être de n'importe quel organisme, y compris, mais sans s'y limiter, les humains, les souris, les rats, les lapins et les singes. Comme cela est connu dans la technique, la protéine FcRn fonctionnelle comprend deux polypeptides, souvent désignés sous le nom de chaîne lourde et de chaîne légère. La chaîne légère est la bêta-2-microglobuline et la chaîne lourde est codée par le gène FcRn. Sauf indication contraire ici, FcRn ou protéine FcRn se réfère au complexe de la chaîne a avec la bêta-2-microglobuline. Chez l'homme, le gène codant pour le FcRn est appelé FCGRT. Les séquences décrites dans la présente demande peuvent être résumées comme suit:
Plus préférentiellement, l'étape de mutation du procédé de préparation du variant selon l'invention est obtenue comme suit :
i) on fournit une séquence nucléique codant pour le polypeptide parent comprenant le fragment Fc ;
ii) on modifie la séquence nucléique fournie en i) pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant ; et iii) on exprime la séquence nucléique obtenue en ii) dans une cellule hôte, et on récupère le variant.
Une telle étape de mutation est donc effectuée en utilisant une séquence nucléique (polynucléotide ou séquence nucléotidique) codant pour ledit polypeptide parent (étape i)). La séquence nucléique codant pour le polypeptide parent peut être synthétisée par voie chimique (Young L and Dong Q., 2004,-Nucleic Acids Res., Apr 1 5;32(7), Hoover, D.M. and Lubkowski, J. 2002, Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et al, 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6;7:285). La séquence nucléotidique codant pour le polypeptide parent peut être également amplifiée par PCR en utilisant des amorces adaptées. La séquence nucléotidique codant pour le polypeptide parent peut également être clonée dans un vecteur d'expression. L'ADN codant pour un tel polypeptide parent est inséré dans un plasmide d'expression et inséré dans une lignée cellulaire ad hoc pour sa production (par exemple la lignée HEK-293 FreeStyle, la lignée YB2/0, ou la lignée CHO), la protéine ainsi produite étant ensuite purifiée par chromatographie.
Ces techniques sont décrites en détails dans les manuels de référence : Molecular cloning : a laboratory manual, 3ieme édition- S ambrook and Russel eds. (2001) et Current Protocols in Molecular Biology - Ausubel et al. eds (2007). La séquence nucléique fournie en i) (polynucléotide), qui code pour le polypeptide parent, est ensuite modifiée pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant. C'est l'étape ii).
Cette étape est l'étape de mutation à proprement parler. Elle peut être effectuée par toute méthode connue de l'art antérieur, notamment par mutagénèse dirigée ou par mutagénèse aléatoire. De préférence, la mutagénèse aléatoire telle que décrite dans la demande WO02/038756 est utilisée : il s'agit de la technique Mutagen. Cette technique utilise une ADN mutase humaine, notamment choisie parmi les ADN polymérases β, η et ɩ. Une étape de sélection des mutants ayant conservé la liaison au FcRn est nécessaire pour retenir les mutants d'intérêt.
Alternativement, les substitutions d'acides aminés sont de préférence réalisées par mutagénèse dirigée, par la tec hni que de P CR d ' as sem b l age uti li sant d es oligonucléotides dégénérés (voir, par exemple, Zoller et Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl, Acad. Sci USA 82:488).
Enfin, dans l'étape iii), on exprime la séquence nucléique obtenue en ii) dans une cellule hôte, et on récupère le variant ainsi obtenu.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes.
Les cellules hôtes préférées sont la lignée de rat YB2/0, la lignée de hamster CHO, en particulier les lignées CHO dhfr- et CHO Lecl3, PER.C6™ (Crucell), HEK293, T1080, EB66, K562, NS0, SP2/0, BHK ou COS. De préférence encore, on utilise la lignée de rat YB2/0.
Alternativement, les cellules hôtes peuvent être des cellules d'animaux transgéniques modifiés pour produire le polypeptide dans le lait. Dans ce cas, l'expression d'une séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention est contrôlée par un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, ledit promoteur ne contrôlant pas naturellement la transcription dudit gène, et la séquence d'ADN contenant en outre une séquence de sécrétion de la protéine. La séquence de sécrétion comprend un signal de sécrétion interposé entre la séquence codante et le promoteur. L'animal peut ainsi être choisi parmi le mouton, la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache.
Le polynucléotide codant pour le variant obtenu à l'étape ii) peut également comprendre des codons optimisés, notamment pour son expression dans certaines cellules (étape iii)). Par exemple, lesdites cellules comprennent les cellules COS, les cellules CHO, les cellules HEK, les cellules BHK, les cellules PER.C6, les cellules HeLa, les cellules NIH/3T3, 293 (ATCC # CRL1573), des cellules T2, les cellules dendritiques ou les monocytes. L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés a pour avantage majeur d'accroître la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). L'optimisation de codons joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourraient ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de codons a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel de traduction (Chechetkin, J. of Theoretical Biology 242, 2006 922-934). L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence.
De préférence, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules HEK, telles que des cellules HEK293, les cellules CHO, ou les cellules YB2/0. Plus préférentiellement, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules YB2/0. Alternativement, de préférence, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules d'animaux transgéniques, de préférence la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache.
Le variant obtenu selon l'invention peut être combiné avec des excipients pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération prolongée, comme des polymères biodégradables, pour former une composition thérapeutique. La composition pharmaceutique peut être administrée par voie orale, sublinguale, sous- cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrathécale, intra-oculaire, intra-cérébrale, transdermique, pulmonaire, locale ou rectale. Le principe actif, seul ou en association avec un autre principe actif, peut alors être administré sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques. Des formes unitaires d'administration comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les aérosols, les implants sous- cutanés, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous- cutanée, intrathécale, les formes d'administration par voie intranasale et les formes d'administration rectale.
De préférence, la composition pharmaceutique contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. Il peut s'agir en particulier de formules iso toniques, stériles, de solutions salines (avec phosphate monosodique ou disodique, chlorure de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium et analogues, ou des mélanges de tels sels), ou de compositions lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables.
Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, y compris l'huile de sésame, l'huile d'arachide, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de micro-organismes, comme les bactéries et les champignons.
Les dispersions selon l'invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un conservateur pour empêcher la croissance des micro -organismes.
Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion contenant, par exemple, l'eau, l'éthanol, un polyol (par exemple, la glycérine, le propylène glycol, le polyéthylène glycol, et analogues), des mélanges appropriés de ceux-ci, et/ou les huiles végétales. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par l'utilisation d'un tensioactif, tel que la lécithine. La prévention de l'action de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques, par exemple, des parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l'acide sorbique ou encore le thimérosal. Dans de nombreux cas, il sera préférable d'inclure des agents isotoniques, par exemple, des sucres ou du chlorure de sodium. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption, par exemple, le monostéarate d'aluminium ou la gélatine. Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. À cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art. Par exemple, une dose peut être dissoute dans 1 ml de solution de NaCl isotonique puis ajoutée à 1000 ml de liquide approprié, ou injectée sur le site proposé de la perfusion. Certaines variations de posologie devront nécessairement se produire en fonction de l'état du sujet traité. La composition pharmaceutique de l'invention peut être formulée dans un mélange thérapeutique comprenant environ 0.0001 à 1.0 milligrammes, soit environ 0.001 à 0.1 milligrammes, soit environ de 0.1 à 1.0 milligrammes, voire environ 10 milligrammes par dose ou plus. Des doses multiples peuvent également être administrées. Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle.
FIGURES
Figure 1 : alignements de séquences dlgGl humaine natif se référant aux positions 216 à 447 selon l'indice UE :
La figure 1 montre des alignements de séquences dlgGl humaine natif se référant aux positions 216 à 447 (selon l'indice UE) avec les séquences correspondantes d'IgG2 humaine (SEQ ID NO: 2 et 7), IgG3 humaine (SEQ ID NO: 3 et 8) et IgG4 humaine (SEQ ID NO: 4 et 9). Les séquences dlgGl se réfèrent à l'allotype Glml,17 (SEQ ID NO: 1 et 6) et à l'allotype Glm3 (SEQ ID NO: 5 et 10). Le domaine "charnière inférieure CH2-CH3" de IgGl commence à la position 226 (voir flèche). Le domaine CH2 est surligné en gris et le domaine CH3 est en italique.
Figure 2 : Demi-vie d'anticorps anti-CD20 et anti-Rhesus D produits en YB2/0 :
La persistance des immunoglobulines dans le sérum de souris transgéniques pour le FcRn humain a été évaluée. Deux spécificités antigéniques ont été testées ; les IgG anti- CD20 et les IgG anti-RhD délétées en position 294 ont été testées en comparaison avec les IgG WT correspondantes.
A) Représente l'évolution dans le temps de la concentration des IgG plasmatiques ;
B) Représente la demi-vie observée pour les deux IgG délétées en position 294 et des IgG WT.
EXEMPLES
Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention.
Exemple 1 ; Production des variants délétés en position 294 Les inventeurs ont analysé la sialylation de plusieurs variants conformes à l'invention, notamment délétés en position 294 (indice EU ou équivalent dans Kabat). Parmi les variants Del294 analysés, plusieurs variants comprennent une combinaison de mutations additionnelles parmi les combinaisons décrites pour conférer une liaison optimisée au FcRn dans la demande de brevet EP 0 233 500.
L'identification et l'obtention de tels variants « optimisés FcRn » peut se faire selon les méthodes décrites dans l'art antérieur, en particulier la demande de brevet européen EP 0 233 500, qui décrit l'obtention de tels mutants selon la technique dite Technique MutaGen™.
Typiquement, cette méthode comprend les étapes suivantes :
Al Construction d'une banque de Fc
Le gène humain Fc codant pour les résidus 226 à 447 (selon l'index EU de Kabat et représenté en figure 1) dérivé de la chaîne lourde d'une IgGl humaine est cloné dans un vecteur approprié, tel que le vecteur phagemide pMG58 selon les protocoles standards bien connus de l'homme du métier. B/ Mutagenèse
Plusieurs banques sont ensuite générées, suivant la procédure décrite dans WO 02/038756, qui utilise des ADN polymérases humaines de faible fidélité dans le but d'introduire des mutations aléatoires de façon homogène sur la séquence cible entière. Plus précisément, trois mutases distinctes (pol β, η et ι) ont été utilisées dans des conditions différentes pour créer des profils de mutations complémentaires.
Cl Expression des banques de Fc par Phage-display et sélection des variants présentant une liaison améliorée au récepteur néonatal FcRn
Les banques de Fc sont exprimées en utilisant la technique du Phage-display selon des protocoles standards, pour servir à la sélection des fragments Fc. La sélection peut se faire conformément au protocole détaillé dans la demande brevet européenne EP 2 233 500, notamment par sélection sur FcRn en phase solide ou liquide, puis détermination des caractéristiques de liaisons des fragments au FcRn par ELISA.
D/ Production des variants sous forme d'Ig entière et délétion en position 294
Plusieurs combinaisons de mutations « optimisées FcRn » ont été sélectionnées pour servir de base à la production de mutants délétés en position 294. Les combinaisons suivantes ont été sélectionnées :
N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y (T5A-74)
T256N/A378V/S383N/N434Y (C6A-78)
V259I/N315D/N434Y (C6A-74)
1- Production des variants IgG dans les cellules HEK
La séquence de fragment Fc SEQ ID NO : 1 a été clonée dans un vecteur d'expression eucaryote générique dérivé de pCEP4 (Invitrogen) et contenant la chaîne lourde d'un anticorps chimérique anti-CD20 selon des protocoles de PCR standard. La chaîne légère de cet anticorps a été insérée dans un vecteur dérivé de pCEP4 semblable. Toutes les mutations d'intérêt dans le fragment Fc ont été insérées dans le vecteur d'expression contenant la chaîne lourde anti-CD20 par PCR de chevauchement. Par exemple, le variant 294Del a été obtenu en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la délétion en position 294 sur la chaîne lourde contenue dans le vecteur d'expression.
Les fragments ainsi obtenus par PCR ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR a été purifié sur gels d'agarose 1% (w/ v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné dans le vecteur d'expression de la chaîne lourde anti-CD20.
Les cellules HEK 293 ont été cotransfectées avec les vecteurs d'expression de la chaîne légère et de la chaîne lourde de l'IgG anti-CD20 en des quantités équimolaires selon des protocoles standard (Invitrogen). Les cellules ont été cultivées de manière à produire les anticorps de manière transitoire. Les anticorps produits ont pu être isolés et purifiés selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation. 2- Production des variants IgG dans les cellules YB2/0
Les variants Fc ont été préparés dans un format IgG entière dans la lignée cellulaire YB2/0 (ATCC, CRL-1662) avec la spécificité anti-CD20 et anti-RhD. Pour cela, la chaîne lourde et légère des IgG ont été clonées dans un vecteur bicistronique HKCD20 optimisé pour la production dans YB2/0. La production a été réalisée dans des pools stables de cellules YB2/0.
Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps ont été réalisées selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation.
Les inventeurs ont vérifié que la déiétion en position 294 n'avait pas d'impact significatif sur la liaison au FcRn, Les variants délétés en position 294 conservent leur liaison au FcRn par rapport à l'IgG parent (IgG WT ou IgG comprenant des mutations « optimisées FcRn »).
Exemple 2 : Analyse de la sialylation de différentes protéines
Mode opératoire: préparation de l'échantillon
1 Dessalage et N-déglycosylation
Dans un premier temps, l'échantillon à analyser a été dessalé selon des protocoles standards de façon à éliminer tous les glucides réducteurs libres potentiellement présents ainsi que les substances susceptibles d'interférer durant les étapes ultérieures (sels et excipients). Après dessalage, l'échantillon a été séché puis les glycannes ont été libérés par l'action enzymatique de la N-Glycannase en conditions dénaturante et réductrice, afin de maximiser le rendement de N-déglycosylation. Pour la N- déglycosylation des Ig, l'échantillon sec a été repris par 45 de la solution de digestion PNGase F diluée au 1/5. 1,5 d'une solution de β-mercaptoéthanol 10 % (v/v) dans l'eau ultra-pure a été ajouté avant agitation et incubation 15 minutes à température ambiante. Ensuite, 1 de la solution de PNGase F (2.5 mU^L) a été ajoutée avant agitation et incubation au bain-marie à 37° C durant 12 à 18 heures. Puis les glycannes ont été séparés des protéines déglycosylées par précipitation à l'EtOH froid. L'extrait glycannique obtenu a alors été reparti en 4 fractions avant d'être traité par des exoglycosidases.
2 Quantification des taux de fucosylation et de GlcNAc intercalaire, et de l'indice de galactosylation des N-glycannes
Chaque N sous-fraction alcoolique séchée, renfermant l'équivalent de 100 μg de glycoprotéine, a été respectivement digérée (1) par les α-sialidase, B-galactosidase et N- acétyl-B-hexosaminidase, afin de déterminer le taux de fucosylation ; (2) par les a- sialidase, B-galactosidase et α-fucosidase, pour le calcul du taux de GlcNAc intercalaire; et (3) par les α-sialidase et α-fucosidase, pour déterminer l'indice de galactosylation.
Ces déglycosylations ont été effectuées à 37°C pendant 12 à 18 heures.
L'isolement des produits de dégradations exoglycosidasiques a été réalisé par extraction alcoolique à froid par ajout de 60 (3 volumes) d'éthanol absolu équilibré à - 20°C, avant agitation puis incubation à - 20°C durant 15 minutes. Une centrifugation à 10000 rpm a été réalisée pendant 10 minutes à + 4°C, et le surnageant a été immédiatement transféré dans un microtube de 0.5 mL avant d'être séché sous vide.
Les oligosaccharides obtenus ont ensuite été marqués par un fluorochrome, l'APTS, puis séparés et quantifiés en HPCE-LIF.
3 Exploitation des résultats
L'identification des pics de N-glycannes est réalisée à l'aide d'un étalon glycoprotéinique de référence dont la N-glycosylation est parfaitement connue, par comparaison des temps de migration de ses N-glycannes avec ceux des espèces observées sur les profils électrophorétiques des échantillons à analyser. De plus, les temps de migration des oligosaccharides étalons sont convertis en unités de glucose (GUs) après analyse d'un mélange hétérogène d'un homopolymère de glucose (Glc ladder). Ces valeurs de GUs seront ensuite comparées à celles de quelques oligosaccharides standards de GUs connues, et permettront d'augmenter l'indice de confiance des identifications. Résultats
A- Variants produits dans YB2/0
Les polypeptides suivants ont été analysés :
Anti-CD20 Del294 :
Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées.
87.98% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 48.24%.
Anti-CD20-C6A 78-Del294 :
Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées.
88.69% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 51.87%.
Anti-CD20-C6A 74-Del294 :
Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées.
93.48% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 51.24%.
Anti-RhD :
Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées constituées majoritairement de structures courtes agalactosylées non-fucosylées (GO : 52.06%). Les structures fucosylées sont minoritaires. On observe quelques structures possédant une GlcNac en position bissectrice (G0B, G0FB).
La structure oligosaccharidique prédominante est : G0 (52.06% ). Le taux de fucosylation calculé est de 17.05%, le taux de fucosylation obtenu avec le run DSial + DGal + DhexNAc (*) est de 13.07%. Le taux de formes possédant une GlcNac bissectrice est de 2.87%. Le taux de galactosylation calculé est de 40.5%.
Anti-RhD Del294 :
Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées et quelques structures triantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées.
92.25% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 37.08%.
Anti-RhD -C6A 78 :
La structure oligosaccharidique prédominante est : GO (55.20%). Le taux de fucosylation calculé est de 12.37%), le taux de fucosylation obtenu avec le run DSial + DGal + DhexNAc (*) est de 10.63%. Le taux de formes possédant une GlcNac bissectrice est de 2.27%. Le taux de galactosylation calculé est de 39.13% .
Anti-RhD -C6A 78-Del294 :
Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées et quelques structures triantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées.
91.83% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 57.81%.
B- Variants produits dans des lignées HEK
Les polypeptides suivants ont été analysés (Anti-CD20 IgG variants) :
Le variant T5A-74H diffère du variant parent T5A-74 par la mutation V264E. Le mutant T5A-74Del294 diffère du variant parent T5A-74 par la délétion de l'acide aminé en position 294.
Ils ont par la suite analysé le profil de glycosylation de ces variants. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-après (en pourcentage) :
Exemple 3 : Analyse de la demi-vie des IgG délétées en position 294
La persistance des Immunoglobulines dans le sérum de souris transgéniques pour le FcRn humain a été évaluée. Deux spécificités antigéniques ont été testées ; les IgG anti- CD20 et les IgG anti-RhD délétées en position 294 ont été testées en comparaison avec les IgG WT correspondantes.
Des expériences de pharmacoeinétique ont ainsi été effectuées chez la souris hFcRn qui sont homozygotes pour un allèle KO du FcRn murin et hétérozygote pour un transgène de FcRn humain (mFcRn-/- hFcRnTg).
Pour ces études phannacocinétiques, chaque animai a reçu une seule injection intraveineuse d'IgG à 5 mg / kg au niveau du sinus rétro-orbital dans un protocole similaire à celui décrit précédemment (Petkova SB, et al. Enhanced half-life of genetically engineered human IgGl antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease. Int Immunol 2006). Des échantillons de sang ont été prélevés à partir du sinus rétro-orbital à de multiples points de temps et les IgGs titrée par ELI SA. Résultats :
Dans cet essai, les deux IgG délétées en position 294 ont montré une augmentation de la demi- vie avec un ratio (demi- vie variant/WT) de 1,7 (Figure 2).
Les paramètres analysés sont regroupés dans le tableau ci-dessous :
Les paramètres analysés sont définis ci-dessous :
C0 : Concentration maximale extrapolée à T0
AUCO-t : Aire sous la courbe temps/concentration plasmatique (du temps T0 au dernier temps t où l'anticorps est encore quantifiable)
AUCinf : Aire sous la courbe temps/concentration plasmatique de T0 à l'infini (= AUCO-t + extrapolation jusqu'à l'infini)
Tl/2 : Demi- vie
Vd : Volume de distribution
Cl : Clairance
Exemple 4 : Production de variants Fc additionnels par mutagenèse dirigée et tests de liaison sur les récepteurs Fc :
1. Construction des variants Fc :
Chaque mutation d'intérêt dans le fragment Fc a été insérée indépendamment dans un vecteur d'expression contenant la chaîne lourde anti-CD20 par PCR de chevauchement en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer une délétion ou un codon dégénéré (NNN ou NNK) en position ciblée (240 à 243, 258 à 267, 290 à 305). Les fragments ainsi obtenus par PCR ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR a été purifié sur gels d'agarose 1% (w/ v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pMGM05-CD20 (pCEP4 InvitroGen), qui contient des sites de clonage pour le fragment Fc (BamHI et Notl) et la chaîne variable VH de l'anticorps anti-CD20. Cette construction entraîne la mutation de deux acides aminés dans le Fc (aa224 et 225, HT changé en GS) et l'ajout de la séquence EFAAA en C- terminal du Fc, mais permet de tester très rapidement un très grand nombre de clones. Dans un premier temps, il a été vérifié que ces mutations ne modifiaient pas la liaison de l'IgG-WT aux différents récepteurs. Par la suite, les contrôles positifs ont été clonés dans ce système afin de le valider :
- IgGl-S239D, I332E, provenant de l'anticorps anti-CD19 XmAb5574 de Xencor
(Cl) : témoin positif pour CD 16a ;
IgGl-G236A, provenant de Xencor (C4) : témoin positif pour CD32aH/R ;
IgGl-K326W, E333S, provenant d'Abgenix/Genentech (C3) : témoin positif pour Clq ; et
- IgGl-S267E, L328F, provenant de l'anticorps anti-CD19 XmAb5574 de Xencor
(C5) : témoin positif pour CD32b.
L'ADN des clones isolés a été séquencé après PCR sur colonies. Après analyses bio informatiques, les clones comportant des mutations nouvelles ont été congelés à - 80°C en bactérie XLl-Blue et les séquences inclues dans notre base de données. Ainsi, 268 variants ont été construits.
2. Production des IgG variants en cellules HEK293 :
La chaîne légère de l'anti-CD20 a été insérée dans un vecteur pCEP4 identique au vecteur utilisé pour la chaîne lourde, noté pMGM01-CDC20 (pCEP4 InvitroGen). Des cellules HEK293-F Freestyle™ (Invitrogen), cultivées dans des plaques à 24 puits, ont été co-transfectées avec les vecteurs pMGM01-CD20 et pMGM05-CD20 (Fc-WT et variants) dans des quantités équimolaires (250 ng/ml) avec un réactif de transfection (1 μΐ/ml) en utilisant des protocoles standard (Invitrogen). Les cellules ont été cultivées en suspension dans du milieu exempt de sérum pendant 7-9 jours post-transfection et les surnageants (1 ml) contenant des IgG ont été récoltés après centrifugation des cellules à 100 g pendant 10 min. Les IgG sécrétées dans les surnageants ont été quantifiées en utilisant un test ELISA (FastELISA, R&D biotech). 3. Récepteurs Fc recombinants utilisés :
CD16a est un récepteur activateur qui présente un polymorphisme V/F en position 158, sur le site de liaison au Fc. L'affinité est meilleure pour CD16aV. CD16aV est disponible commercialement (R&D System).
CD32a est un récepteur activateur qui présente un polymorphisme H/R en position 131 , sur le site de liaison au Fc. L'affinité est meilleure pour CD32aH. CD32aH a été produit par PX'Therapeutics. CD32aR et CD32b sont disponibles commercialement (R&D System).
4. Tests ELISA de variants IgG produits dans les surnageants de cellules HEK293- F :
Les variants d'IgG ont été testés pour leur liaison à plusieurs FcR humains et au FcRn par ELISA. Des immunoplaques Maxisorp ont été revêtues avec 0,1 μg CD32aH / puits, ou 0,2 μg CD16aV / puits dans du PBS ou 0,25 μg de FcRn dans du P6 (sodium phosphate lOOmM, sodium chloride 50mM pH6.0). Des plaques NiNTA (HisGrab Pierce) ont été revêtues avec 0,05 μg CD32aR / puits, ou 0^g CD32b / puits dans du PBS. Après le revêtement pendant une nuit à 4°C, les plaques ont été lavées deux fois avec du PBS (ouP6)/0,05% Tween-20 et saturées avec du PBS/4% de BSA (ou P6 4% lait-écrémé) pendant 2 heures à 37°C. En parallèle, les surnageants ont été dilués dans du PBS (ou du P6 pour le test sur FcRn) à une concentration finale de 0,5 μg d'IgG/ml et mélangés avec des F(ab')2 d'IgG HRP de chèvre anti-humaine à la même concentration pendant 2 heures à température ambiante. Les IgG agrégées aux F(ab')2 sont ensuite incubées sous agitation douce pendant 1 heure à 30°C sur les plaques ELISA saturées sans dilution pour CD16aV, CD32aR et CD32b (i.e. IgG à 0,5 μg/ml), diluées dans du PBS à 0,25 μg/ml pour CD32aH et dilués dans du P6 à 0,035 μg/ml pour FcRn. Les plaques sont ensuite révélées avec TMB (Pierce) et l'absorbance est lue à 450 nm.
Grâce à ce test ELISA, les variants construits ont été testés en comparaison avec le type sauvage Fc (Fc-WT) et leur ratio variant/Fc-WT a été calculé, comme indiqué dans les tableaux 1 à 3. Tableau 1 : Variants retenus avec mutation entre les positions 262 et 267
Tableau 2: Variants retenus avec mutation entre les positions 291 et 296
Tableau 3 : Variants retenus avec mutation entre les positions 298 et 305

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'augmentation de la sialylation d'un fragment Fc, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
2. Procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une sialylation améliorée dudit fragment Fc par rapport à la sialylation du fragment Fc du polypeptide parent, qui comprend une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la sialylation dudit fragment Fc est augmentée d'au moins 10%, de préférence au moins 15%, de préférence au moins 20% , de préférence au moins 25%, de préférence au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de préférence au moins 55%, de préférence au moins 60%, de préférence au moins 65%, de préférence au moins 70%, de préférence au moins 75%, de préférence au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 95%, par rapport à la sialylation dudit fragment Fc avant l'étape de mutation ou dudit fragment Fc du polypeptide parent.
4. Procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant au moins une activité effectrice médiée par ledit fragment Fc diminuée par rapport à l'activité effectrice du polypeptide parent, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'activité effectrice médiée par le fragment Fc est sélectionnée parmi la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) et la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP).
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que le variant est dépourvu de toute activité effectrice médiée par le fragment Fc.
7. Procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité médiée par ledit fragment Fc diminuée par rapport à l'affinité du polypeptide parent, pour au moins un des récepteurs de la région Fc (FcR), de préférence choisi parmi le complément Clq et les récepteurs FcgRIIIa (CD 16a), FcgRIIa (CD32a), et FcgRIIb (CD32b), et caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le variant présente une affinité médiée par ledit fragment Fc diminuée par rapport à l'affinité du polypeptide parent, pour le récepteur FcgRIIIa (CD 16a) et le récepteur FcgRIIa (CD32a).
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mutation est choisie parmi une insertion, une substitution, de préférence ponctuelle, et une délétion.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mutation est effectuée sur au moins un acide aminé situé en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mutation est effectuée sur au moins un acide aminé situé en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305.
12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mutation est effectuée sur l'acide aminé situé en position 293 ou 294, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le fragment Fc du polypeptide parent comprend déjà au moins une mutation additionnelle, de préférence choisie parmi P230S, T256N, V259I, N315D, A330V, N361D, A378V, S383N, M428L, N434Y, de préférence une combinaison de mutations additionnelles choisie parmi P230S/N315D/M428L/N434Y, T256N/A378V/S383N/N434Y, V259I/N315D/N434Y et N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que le polypeptide parent consiste en un fragment Fc.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que le polypeptide parent consiste en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C- terminal à un fragment Fc.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que ledit polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps.
17. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le fragment Fc du polypeptide parent est un fragment Fc d'une IgGl, de préférence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1.
18. Procédé selon l'une des revendications 2 à 17, caractérisé en ce que l'étape de mutation est obtenue comme suit : i) on fournit une séquence nucléique codant pour le polypeptide parent comprenant le fragment Fc ;
ii) on modifie la séquence nucléique fournie en i) pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant ; et
iii) on exprime la séquence nucléique obtenue en ii) dans une cellule hôte, et on récupère le variant.
EP15759880.6A 2014-08-01 2015-07-31 Procédé de production de variants ayant un fc présentant une sialylation améliorée Ceased EP3174904A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1457504A FR3024453B1 (fr) 2014-08-01 2014-08-01 Procede de production de variants ayant un fc presentant une sialylation amelioree
PCT/FR2015/052123 WO2016016586A1 (fr) 2014-08-01 2015-07-31 Procédé de production de variants ayant un fc présentant une sialylation améliorée

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3174904A1 true EP3174904A1 (fr) 2017-06-07

Family

ID=51987257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP15759880.6A Ceased EP3174904A1 (fr) 2014-08-01 2015-07-31 Procédé de production de variants ayant un fc présentant une sialylation améliorée

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20170260254A1 (fr)
EP (1) EP3174904A1 (fr)
JP (1) JP2017522040A (fr)
KR (1) KR20170035923A (fr)
CN (1) CN106573978A (fr)
AU (1) AU2015295090A1 (fr)
BR (1) BR112017001966A2 (fr)
CA (1) CA2956822A1 (fr)
FR (1) FR3024453B1 (fr)
MX (1) MX2017001516A (fr)
WO (1) WO2016016586A1 (fr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3032820A1 (fr) 2016-08-02 2018-03-22 Visterra, Inc. Polypeptides synthetiques et leurs utilisations
FR3058159B1 (fr) * 2016-10-28 2022-02-25 Lab Francais Du Fractionnement Variants de polypeptide fc presentant une demi-vie augmentee
FR3064007A1 (fr) * 2017-03-20 2018-09-21 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Anticorps pour le traitement de cancers
FR3075200B1 (fr) * 2017-12-15 2022-12-23 Lab Francais Du Fractionnement Variants avec fragment fc ayant une affinite augmentee pour fcrn et une affinite augmentee pour au moins un recepteur du fragment fc
FR3080376B1 (fr) * 2018-04-20 2022-12-09 Lab Francais Du Fractionnement Autoanticorps hautement sialyles et leurs utilisations
WO2021057726A1 (fr) * 2019-09-23 2021-04-01 南开大学 CRIBLAGE DE LIAISON SPÉCIFIQUE FC À FCγR AU MOYEN D'UNE PRÉSENTATION DE MAMMIFÈRES
WO2023104128A1 (fr) * 2021-12-09 2023-06-15 上海宝济药业有限公司 Polypeptide fc présentant une modification de glycosylation modifiée

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008150494A1 (fr) * 2007-05-30 2008-12-11 Xencor, Inc. Procédés et compositions permettant l'inhibition de cellules d'expression du cd32b
WO2011122011A2 (fr) * 2010-03-30 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Molécules de liaison à l'antigène favorisant la clairance des antigènes
EP2679681A1 (fr) * 2011-02-25 2014-01-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps fc spécifique de fc riib

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3601822A1 (de) 1986-01-22 1987-07-23 Peter Stenzel Mit einem druckmedium arbeitende betaetigungsvorrichtung
FR2816319B1 (fr) 2000-11-08 2004-09-03 Millegen Utilisation d'adn polymerase mutagene pour la creation de mutations aleatoires
KR20060124656A (ko) * 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
EP1896071B1 (fr) * 2005-06-30 2015-04-29 Janssen Biotech, Inc. Procédés et compositions à effet thérapeutique amélioré
EP2233500A1 (fr) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Variantes Fc optimisées
US10087236B2 (en) * 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
WO2011149999A2 (fr) * 2010-05-27 2011-12-01 Merck Sharp & Dohme Corp. Méthode de synthèse d'anticorps présentant des propriétés améliorées
EP2409712A1 (fr) * 2010-07-19 2012-01-25 International-Drug-Development-Biotech Anticorps Anti-CD19 doté de fonctions ADCC et CDC et d'un profil de glycosylation amélioré
CA2834589A1 (fr) * 2011-05-25 2012-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Procede de preparation de polypeptides contenant fc a proprietes ameliorees
EP2537864B1 (fr) * 2011-06-24 2019-08-07 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Variantes Fc dotées de fonctions effectrices réduites
WO2013163297A1 (fr) * 2012-04-25 2013-10-31 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Glycoprotéines modifiées

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008150494A1 (fr) * 2007-05-30 2008-12-11 Xencor, Inc. Procédés et compositions permettant l'inhibition de cellules d'expression du cd32b
WO2011122011A2 (fr) * 2010-03-30 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Molécules de liaison à l'antigène favorisant la clairance des antigènes
EP2679681A1 (fr) * 2011-02-25 2014-01-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps fc spécifique de fc riib

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of WO2016016586A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170035923A (ko) 2017-03-31
WO2016016586A1 (fr) 2016-02-04
AU2015295090A1 (en) 2017-02-16
US20170260254A1 (en) 2017-09-14
CA2956822A1 (fr) 2016-02-04
FR3024453A1 (fr) 2016-02-05
CN106573978A (zh) 2017-04-19
JP2017522040A (ja) 2017-08-10
FR3024453B1 (fr) 2018-06-29
BR112017001966A2 (pt) 2017-11-21
MX2017001516A (es) 2017-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016016586A1 (fr) Procédé de production de variants ayant un fc présentant une sialylation améliorée
US20190382481A1 (en) Anti-cd33 antibodies, anti-cd33/anti-cd3 bispecific antibodies and uses thereof
EP2931749B1 (fr) Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes
WO2011108502A1 (fr) Composition d'anticorps modifié
WO2016156450A1 (fr) Anticorps monoclonaux anti-cd303
WO2017006052A2 (fr) UTILISATION DE FRAGMENTS Fc MODIFIÉS EN IMMUNOTHÉRAPIE
WO2019115773A1 (fr) Variants avec fragment fc ayant une affinité augmentée pour fcrn et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment fc
KR20190122674A (ko) 인지 장애를 치료 또는 예방하기 위한 인간화된 항체, 이것을 생산하는 공정, 및 이것을 사용하여 인지 장애를 치료 또는 예방하기 위한 제제
WO2018078138A1 (fr) Variants de polypeptide fc presentant une demi-vie augmentee
EP3481865B1 (fr) Mutants fc à activité fonctionnelle ameliorée
EP2547694B1 (fr) Nouveau peptide signal, et son utilisation pour la production de proteines recombinantes
EP3781595A1 (fr) Autoanticorps hautement sialylés et leurs utilisations
EP3063277A1 (fr) Proteine chimerique dans le traitement de l'amylose
WO2022180342A1 (fr) Anticorps, fragments ou derives se liant specifiquement a un antigene proteique capable de se lier aux acides nucleiques et leurs utilisations
WO2023139292A1 (fr) Thérapie anti-tau

Legal Events

Date Code Title Description
17P Request for examination filed

Effective date: 20170131

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20171107

REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R003

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN REFUSED

18R Application refused

Effective date: 20200514