KR20170013178A - 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents
인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 약학적 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20170013178A KR20170013178A KR1020160094621A KR20160094621A KR20170013178A KR 20170013178 A KR20170013178 A KR 20170013178A KR 1020160094621 A KR1020160094621 A KR 1020160094621A KR 20160094621 A KR20160094621 A KR 20160094621A KR 20170013178 A KR20170013178 A KR 20170013178A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- insulin receptor
- insulin
- aptamer
- seq
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/335—Modified T or U
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/575—Hormones
- G01N2333/62—Insulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
Abstract
본 발명은 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물 및 당뇨병 진단용 조성물에 관한 것으로, 상기 압타머는 기존의 인슐린과 다른 결합 기작을 가짐으로써 암발병률 증가 및 죽상동맥경화와 같은 인슐린에 의한 부작용 보다 효과적으로 당뇨병을 치료하고 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이를 이용하여 인슐린 작용제로 사용할 수 있으며, 또는 인슐린 수용체와 관련된 질환의 치료 또는 진단용 약학 조성물에 관한 것이다.
인슐린 수용체(IR, Insulin receptor)는 티로신 카이네이즈 수용체로서, 인슐린, IGF-1 또는 IGF-2에 의해 활성화되는 막관통 수용체(transmembrane receptor)이다. 인슐린 결합부를 포함하는 α사슬(719잔기) 2개와 막 관통부를 포함하는 β사슬(620잔기) 2개가 S-S결합으로 연결된 4합체 구조로 되어 있다. 인슐린이 수용체와 결합하면, β사슬의 세포내 영역에 있는 티로신키나아제 활성이 활발해지고, 수용체 티로신잔기의 인산화가 일어난다. 이 자기인산화가 다른 단백질의 인산화를 일으킨다.
인슐린 수용체가 활성화될 경우 글루코오스 흡수를 야기하는데, 인슐린 수용체의 신호전달이 감소할 경우 글루코오스의 흡수가 저해되어 제2당뇨 또는 이와 관련된 합병증 및 과혈당(hyperglycemia)등이 야기될 수 있다.
압타머(aptamer)는 펩타이드로 이루어진 항체와 달리 4 종류의 핵산 (nucleic acid)로 이루어져 그 시퀀스의 조합에 따라 대상 단백질에 대한 특이성을 나타내는 물질이다. 대상 단백질에 특이적인 압타머는 시험관에서 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)를 통해 만들어지는데, 이 과정은 무작위 조합으로 구성된 압타머의 풀(pool)에서 정제된 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머를 찾아내고 PCR을 통해 증폭하는 과정을 포함한다. 대표적인 단일가닥 DNA 압타머 신약인 페갑타닙은 혈관 표피 성장인자를 대상으로 하여 혈관 표피 성장인자가 혈관 표피 성장인자 수용체에 결합하는 것을 방해하는 항암제로서 FDA에 승인을 받아 임상에 사용되고 있다.
현재 기능적 압타머를 발굴하기 위한 대부분의 노력은 표적에 대한 압타머의 저해 능력에 초점이 맞춰져 있다. 특히 임상적 응용을 위해서 표적분자의 활성을 방해하는 다양한 종류의 저해성 압타머(inhibitory aptamer)가 질병치료를 위해 개발되어 왔다 (e.g Macgen, AS1411). 하지만 분자간의 상호작용은 필연적으로 구조적인 변화를 동반한다는 점을 염두해 봤을 때, 만약 압타머-단백질 결합이 단백질의 적절한 구조 변화를 유도시킬 수 있다면 단백질 기능의 활성화가 가능해질 것이라 여겨진다. 따라서 이론적으로 압타머는 특정 단백질-단백질 결합을 모방함으로써 기능적 Agonist로 역할을 할 수 있는 잠재력을 가진다. 하지만 현재 표적의 기능을 활성화 키는 Agonist 압타머의 개발은 어려운 문제로 남아있다.
또한, 오늘날 당뇨병 환자의 혈당을 정상적으로 조절하기 위해 많은 종류의 인슐린 유도체들이 개발되어 사용되고 있으나 인슐린은 포도당 흡수 이외에도 세포 분열을 유도하며 몇몇 인슐린 유도체에 도입된 아미노산 서열의 변화는 IGF-1 수용체에 대한 결합력과 활성화를 증가시킨다. 따라서 당뇨병 치료를 위한 장기간의 인슐린 투여는 반대로 암 발생률을 높일 수 있고 죽상동맥경화와 같은 인슐린에 의한 부작용에 관한 우려가 지속적으로 제기되어 왔다. 또한 몇몇 역학조사를 통해 지속된 인슐린 투여와 암 발병률 증가 사이에 유의미한 상관관계가 있다는 내용 역시 보고되었다. 따라서 세포분열을 유도하지 않고 포도당 흡수만을 증가시키는 인슐린 수용체에 대한 biased agonist의 개발은 인슐린 투여에 대한 좋은 대안을 제시할 것이다.
따라서, 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이를 이용한 당뇨병 치료 또는 진단 기술의 개발이 요구된다.
이에, 본 발명은 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하고, 데옥시리보스 우라실의 5번 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 데옥시리보스 우라실을 포함하는, 인슐린 수용체 압타머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 조성물, 상기 인슐린 수용체 압타머의 약학적 유효량을 당뇨병 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법 및 당뇨 치료를 위한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 인슐린 수용체 압타머를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 진단용 조성물, 및 당뇨병 진단을 위한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 인슐린 수용체 압타머를 이용하여 당뇨병 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인슐린 수용체의 세포 외 영역에 특이적으로 결합하고, 인슐린 수용체의 인산화를 촉진하는, 인슐린 수용체 압타머를 제공한다.
본 명세서에서 인슐린 수용체 압타머란 인슐린에 특이적인 친화도로 결합할 수 있는 압타머를 의미한다. 상기 인슐린 수용체는 인간 인슐린 수용체 단백질에서 유래하는 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 인슐린 수용체 압타머는 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하고, 데옥시리보스 우라실의 5번 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 염기를 포함할 수 있다. 상기 압타머는25 내지 90개, 바람직하게는 27 내지 80개, 더욱 바람직하게는 27 내지 50개의 염기로 이루어진다. 상기 변형된 염기 이외의 본 발명의 인슐린 수용체 압타머에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한, A, G, C, T, 및 이들의 deoxy 형태의 염기들로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
상기 압타머의 결합력과 특이성을 높이기 위하여, 상기 압타머에 포함된 뉴클레오타이드의 염기의 5번 위치가 소수성 작용기로 치환된 것일 수 있다. 예를 들면 가변영역의 티민(Thymine)염기의 5번 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 데옥시리보스 우라실, 예컨대 5-[N-(1-naphthylmethyl)carboxamide]-2’-deoxyuridine (Nap-dU)을 가변영역에 8개 포함한다. 상기 소수성 작용기는 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 이소부틸기, 또는 트립토판을 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 소수성 작용기는 나프틸기 또는 벤질기이다. 상기 나프틸기로 치환되어 변형된 데옥시리보스 우라실을 아래 화학식 1에, 벤질기로 치환되어 변형된 데옥시리보스 우라실을 아래 화학식 2에 표시하였다.
[화학식 1]
[화학식 2]
인슐린 수용체 압타머의 상기 변형된 염기 개수는 4 내지 20개, 바람직하게는 6 내지 14개일 수 있다.
바람직하게, 상기 압타머는 서열번호 2, 서열번호 7, 또는 서열번호 9의 염기서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 압타머는 IR-A48로 명명된 서열번호 1의 염기서열 내의 서열번호 2의 염기 서열을 포함하고 서열번호 2의 양 옆으로 연속하는 33개 내지 80개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 인슐린 수용체 압타머 이거나, IR-A62로 명명된 서열번호 6의 염기서열 내의 서열번호 7의 염기 서열을 포함하고, 서열번호 7의 염기서열의 양 옆으로 연속하는 27개 내지 79 또는 27개 내지80개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 인슐린 수용체 압타머이거나, IR-A05 로 명명된 서열번호 8의 염기서열 내의 서열번호 9의 염기 서열을 포함하고, 서열번호 9의 염기서열의 양 옆으로 연속하는 50개 내지 80개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 인슐린 수용체 압타머일 수 있다.
서열번호 | 명칭 | 서열 | 변형 염기 N의 소수성 작용기 |
1 | IR-A48F | TATGAGTGAC CGTCCGCCTG GNGNNAAGAC AACCNCNAGG NCAGGCGCAG NGACGGGNAG CAGCCACACC ACCAGCCAAA | 나프틸기 |
2 | IR-A48 | CGCCTGGNGN NAAGACAACC NCNAGGNCAG GCG | 나프틸기 |
6 | IR-A62F | TATGAGTGAC CGTCCGCCTG GCANNACGCA NGAGNCNAGA NCCGNCAGAC CNAAGGCNNC AGCCACACCA CCAGCCAAA | 나프틸기 |
7 | IR-A62 | CANNACGCAN GAGNCNAGAN CCGNCAG | 나프틸기 |
8 | IR-A05F | TATGAGTGAC CGTCCGCCTG GGNNCGNGAC NGAACNCGGN GNGGGNGGCN NGGGNNNGGN CAGCCACACC ACCAGCCAAA | 벤질기 |
9 | IR-A05 | GCCTGGGNNC GNGACNGAAC NCGGNGNGGG NGGCNNGGGN NNGGNCAGCC | 벤질기 |
더욱 바람직하게는, 상기 압타머는 서열번호1의 염기서열 내의 서열번호 2의 염기서열을 필수적으로 포함하고 양 옆으로 연속하는 33개 내지 80개 염기서열로 이루어진 인슐린 수용체 압타머, 또는 서열번호6의 염기서열 내의 서열번호 7의 염기서열을 필수적으로 포함하는 27개 내지 79개, 또는 27개 내지 80개 염기서열로 이루어진 인슐린 수용체 압타머, 또는 서열번호 8의 염기서열 내의 서열번호 9의 염기서열을 필수적으로 포함하고 양 옆으로 연속하는 50개 내지 80개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 인슐린 수용체 압타머일 수 있다.
바람직하게는 상기 인슐린 수용체 압타머는 내부의 뉴클레오타이드로 구성된 스템-루프 구조를 형성할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 스템-루프 구조는 27개, 33개 또는 50개의 뉴클레오타이드로 구성된 것일 수 있으며, 상기 스템-루프 구조는 1 또는 2개의 스템-루프 구조를 형성할 수 있다.
구체적으로, 상기 33개 뉴클레오타이드로 구성된 스템-루프 구조는 IR-A48F로 명명된 서열번호 1의 염기서열 중 15 내지 47번의 염기에 의해 형성될 수 있고, 상기 15번 내지 47번 뉴클레오타이드로 이루어진 염기서열은 IR-A48로 명명된 서열번호 2로 이루어진 압타머일 수 있다. 또한, 상기 27개 뉴클레오타이드로 구성된 스템-루프 구조는 IR-A62F로 명명된 서열번호 6의 염기서열 중 26 내지 45번의 염기에 의해 형성될 수 있고, 상기 26번 내지 45번의 염기로 구성된 스텝-루프 구존의 양단에 추가의 뉴클레오타이드를 포함하는 염기서열은 IR-A62로 명명된 서열번호 1의 22번 내지 48번 염기를 포함하는 서열번호 7로 이루어진 압타머일 수 있다.
또한, 상기 50개 뉴클레오타이드로 구성된 스템-루프 구조는 IR-A05F로 명명된 서열번호 8의 염기서열 중 16 내지 65번의 염기에 의해 형성될 수 있고, 상기 서열번호 8의 염기서열 중 16번 내지 65번의 뉴클레오타이드로 구성된 스템-루프 구조는 IR-A05로 명명된 서열번호 9로 이루어진 압타머일 수 있다. 상기 IR-A05F의 스템-루프 구조는 서열번호 8의 염기서열 중 16번 내지 65번의 염기서열 내에 두 개의 스템-루프가 형성된 구조일 수 있다.
본 발명자들은 상기 인슐린 수용체 압타머가 인슐린 수용체와 매우 유사한 구조를 가지는 IGF-1(insulin-like growth factor) 수용체에는 결합하지 않고 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 구체적으로 본 발명의 IR-A48로 명명된 인슐린 수용체 압타머는, 인슐린과 상이한 위치(알로스테릭 자리, allosteric site)에서 비경쟁적으로 결합할 수 있고, 인슐린 수용체와 결합 시 해리 상수(Kd)가 1nm 내지 20nM이고 바람직하게는 3.5 내지 6.9nM 이다. IR-A62로 명명된 인슐린 수용체 압타머는 인슐린과 같은 위치(오쏘스테릭 자리, arthosteric site)에서 경쟁적으로 결합하며, 촉진적 상호작용 (Positive cooperativity)을 통해 인슐린의 결합을 증가시킬 수 있고, 인슐린 수용체와 결합 시 해리 상수(Kd)가 0.5nM 내지 40nM이고 바람직하게는 2.4 내지 26.9nM 이다. 또한, 본 발명의 IR-A05로 명명된 인슐린 수용체 압타머는, 인슐린과 같은 위치(오쏘스테릭 자리, orthosteric site)에서 경쟁적으로 결합할 수 있고, 인슐린 수용체와 결합 시 해리 상수(Kd)가 0.5 내지 20nM이고, 바람직하게는 1 내지 5nM 이다.
본 발명자들은 SELEX 방법을 이용하여 인슐린 수용체에 결합하는 압타머를 발굴하였고 발굴된 압타머가 인슐린 수용체와 결합하여 인슐린 수용체를 인산화 하였음을 확인하였다.
인슐린이 수용체와 결합하면 수용체 티로신 잔기가 인산화되는데, 인슐린 수용체의 인산화는 신호전달을 통해 지방세포와 근육에서 glucose transporter 4 (GLUT4)의 이동을 조절하여 포도당 흡수를 증가시킨다. 이러한 인슐린 수용체에 의한 대사기능은 주로 IRS-AKT 경로에 의해 조절되며, 또한 인슐린 신호전달 과정에서 Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)는 Protein kinase B (AKT)의 인산화에 중요한 역할을 한다. 공지된 PI3K 저해물질인 LY29400는 AKT의 인산화뿐만 아니라, 포도당 흡수와 같이 AKT에 의해 유도되는 세포기능을 완전히 차단한다.
본 발명에 의한 인슐린 수용체 압타머는 인슐린 수용체의 인산화를 촉진하며, 구체적으로 인슐린 수용체의 아미노산 서열 중 1150번째 티로신(Y1150)을 우선적으로 인산화하고 이후 AKT의 473번째 세린(AKT S473)의 인산화를 촉진시켜 인슐린 수준으로 포도당을 흡수할 수 있다. 본 발명자들은 상기 인산화 및 포도당 흡수가 PI3K를 통해 유도되는 것임을 확인하였다.
Mitogen-activated protein kinase(MAPK) 경로는 인슐린 수용체를 통해 유도되는 대표적인 신호전달 경로이며 세포 분열에 중요한 역할을 하고 인슐린 역시 몇몇 암세포주에서 세포의 분열을 유도시키는 것으로 잘 알려져 있다. 본 발명자들은 상기 인슐린 수용체 압타머는 인슐린의 작용제로서 포도당 흡수(glucose uptake)을 수행할 수 있으나, 그러나 인슐린과 달리 세포분열에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 다른 인슐린 수용체 압타머는 인슐린과 달리 MAPK 경로를 활성화시키지 않으며, 바람직하게는 MAPK 경로 활성화에 의한 인슐린 질환에 영향을 미치지 않으며, 더욱 바람직하게는 암세포의 성장에 의한 암발생률 증가와 혈관 평활근 세포의 성장에 의한 죽상동맥경화에 영향을 미치지 않으면서 혈당조절을 하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이에 따라 본 발명의 압타머는 세포의 포도당 흡수를 증가시키면서도, 지방 분해 억제 효과가 낮을 수 있다. 바람직하게는 포도당 흡수를 증가시키면서도 인슐린에 비하여 지방 분해 억제 효과가 낮은 것을 특징으로 한다. 지방분해 억제 활성은 인슐린의 대표적인 역할이며 이를 통해 인슐린을 투여하는 경우, 혈당은 조절되나 체중 증가를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 상기 인슐린 수용체 압타머의 지방분해 억제효과를 포도당 흡수와 비교 분석한 결과 인슐린에 비해 지방분해 억제 효과는 상대적으로 낮았지만, 포도당 흡수는 충분히 증가시키는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 다른 인슐린 수용체 압타머는 인슐린과 달리 낮은 지방분해 억제 효과에도 포도당 흡수를 효과적으로 증가시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게는 지방분해 억제에 의한 체중증가에 영향을 미치지 않고 혈당조절을 하는데 유용하게 사용될 수 있다.
바람직하게는 상기 압타머의 포도당 흡수의 EC50 값 및 지방 분해의 IC50값의 비율은 1:1 내지 3:1, 바람직하게는 1:1 내지 2:1, 더욱 바람직하게는 1.7:1일 수 있다.
또한, 상기 압타머는, 혈청 내 안정성을 증진시키거나 신장 클리어런스(renal clearance)를 조절하기 위하여, 5' 말단, 3' 말단, 중간 또는 양 말단에 위치한 염기를 적어도 하나 이상 변형시킬 수 있다. 상기 변형은 5' 말단, 3' 말단, 중간 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), 비오틴, idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것일 수 있다. 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드 또는 2'F-뉴클레오사이드는 압타머에 포함된 염기에 결합하여 변형된 염기를 제공함으로써 누클레이즈 저항성(nuclease resistance)을 부여한다
바람직하게, 상기 압타머는 뉴클라아제 저항성을 확보하여 최적화된 in vivo 투여를 하기 위하여 변형된 염기를 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는, 상기 변형은 2’-OMe(메톡시) 또는 2’-F(플루오르)일 수 있다.
본 발명에 의한2 이상의 압타머가 연결되어 이량체(dimer) 혹은 다합체(multimer)로 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "인슐린 수용체의 작용제"는 인슐린 수용체에 선택적으로 결합하는 약학적으로 허용 가능한 제제를 나타낸다. 통상적으로 인슐린 수용체 작용제는, 효과적으로 혈당을 조절하기 위하여 개발된 새로운 종류의 당뇨병 치료제를 나타낸다. 본 발명의 인슐린 수용체 작용제는 인슐린 수용체에 특이적으로 결합할 뿐 아니라 암 발생의 부작용이 없는 특징이 있다.
따라서, 상기 인슐린 수용체의 작용제는 인슐린과 관련한 다양한 질병의 진단 또는 치료용도로 사용될 수 있다.
이에, 본 발명의 또 다른 일 예는 상기 압타머를 인슐린 수용체 작용제로 포함하는 인슐린과 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 또 다른 일 예는, 상기 압타머를 인슐린 수용체 작용제로 포함하는 인슐린과 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 인슐린을 추가로 포함할 수 있다. 상기 인슐린 관련 질환은 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만, 심혈관 질환 등을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 투여 형태 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 임의의 경구 투여용 제형으로 될 수 있다. 이러한 경구 투여용 제형은 각 제형의 통상적인 구성에 따라 상기 유효 성분 외에, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신 등의 희석제나, 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 활택제 등의 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 경구 투여용 제형이 정제인 경우, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등의 결합제를 포함할 수 있고, 경우에 따라, 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제나, 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 또는 감미제 등을 포함할 수도 있다.
그리고, 상기 약학 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화될 수도 있는데, 이러한 경우 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 비경구 투여 방법에 의해 투여된다. 이 때, 상기 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약학 조성물은 유효 성분, 즉, 화학식 I의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 대상은 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 설치류, 또는 인간일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 인슐린 수용체 압타머를 이용하여 당뇨병 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 당뇨병 진단에 정보를 제공하는 방법은 분리된 생물학적 시료를 준비하는 단계; 상기 생물학적 시료에, 본 발명에 따른 인슐린 수용체 압타머를 반응시키는 단계; 및 상기 생물학적 시료에서의 인슐린 수용체 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고, 생물학적 시료에서의 인슐린 수용체 압타머의 결합 정도가 정상 시료보다 높은 경우, 당뇨병인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 생물학적 시료에서의 인슐린 수용체 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 DNA 압타머 결합 측정 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 인슐린 수용체 압타머 말단에 형광 또는 방사성 물질 표지하여 형광 또는 방사성 세기를 측정하거나, 이미지화하여 관찰하는 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 인슐린 수용체 압타머는 인슐린 수용체의 인산화를 촉진시켜 포도당 흡수를 증가시키면서도 인슐린 수용체의 대사 기능만을 선택적으로 유도하는 Biased Agonist로서 기능할 수 있다. 그 뿐 아니라 암 발병률 증가 등과 같은 MAPK 경로 활성화에 의한 각종 인슐린에 의한 질환을 일으키지 않거나, 체중을 증가시키지 않으면서 인슐린 수용체를 통해 혈당을 조절할 수 있다.
도 1a은 IR-A48F 및 IR-A48 압타머의 서열을 나타낸 것이다.
도 1b는 실시예 1.6의 Mfold 프로그램에 의해 예측된 압타머의 2차 구조로서, IR-A48의 뉴클레오타이드가 스템-구조를 형성하는 것을 나타낸 것이다.
도 1c는 실시예 2.3의 IR-A48F 또는 IR-A48가 인슐린 수용체 또는 IGF-1 수용체에 결합여부를 측정한 결과이다.
도 1d는 IR-A62F 및 IR-A62 압타머의 서열을 나타낸 것이다.
도 1e는 실시예 1.6의 Mfold 프로그램에 의해 예측된 압타머의 2차 구조로서, IR-A62의 뉴클레오타이드가 스템-구조를 형성하는 것을 나타낸 것이다.
도 1f는 실시예 2.3의 IR-A62F 또는 IR-A62가 인슐린 수용체 또는 IGF-1 수용체에 결합여부를 측정한 결과이다.
도 1g는 IR-A05F 및 IR-A05 압타머의 서열을 나타낸 것이다.
도 1h는 실시예 1.6의 Mfold 프로그램에 의해 예측된 압타머의 2차 구조로서, IR-A05의 뉴클레오타이드가 스템-구조를 형성하는 것을 나타낸 것이다.
도 1i는 실시예 2.3의 IR-A05F 또는 IR-A05가 인슐린 수용체 또는 IGF-1 수용체에 결합여부를 측정한 결과이다.
도 2a는 인슐린 수용체를 과발현시키고 있는 Rat-1 fibroblast(Rat-1/hIR)에 FITC-인슐린 (100nmol/L)과 IR-A48을 0.1, 0.25, 0.5 및 1μm의 농도로 처리하여 FITC 형광 변화를 특정한 실시예 2.2의 실험 결과 및 압타머의 인슐린 수용체 상 결합위치를 나타낸 것이다.
도 2b는 실시예 3.2의 Rat-1/hIR 세포에서 인슐린 및 IR-A48에 의한 IRS, AKT, ERK의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 2c는 인슐린 수용체를 과발현시키고 있는 Rat-1 fibroblast(Rat-1/hIR)에 FITC-인슐린 (100nmol/L)과 IR-A62를 0.02, 0.1, 0.25 0.5 및 1 마이크로미터의 농도로 처리하여 FITC 형광 변화를 특정한 실시예 2.2의 실험 결과 및 압타머의 인슐린 수용체 상 결합위치를 나타낸 것이다.
도 2d는 실시예 3.2의 Rat-1/hIR 세포에서 인슐린 및 IR-A62에 의한 IRS, AKT, ERK의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 2e는 인슐린 수용체를 과발현시키고 있는 Rat-1 fibroblast(Rat-1/hIR)에 FITC-인슐린 (100nmol/L)과 IR-A48을 0.1, 0.25, 0.5 및 1μm의 농도로 처리하여 FITC 형광 변화를 특정한 실시예 2.2의 실험 결과 및 압타머의 인슐린 수용체 상 결합위치를 나타낸 것이다.
도 2f는 실시예 3.2의 Rat-1/hIR 세포에서 인슐린, IR-A05에 의한 IRS, AKT, ERK의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 3a는 실시예 3.3의 인슐린, IR-A48, IR-A62 및 IR-A05에 의한 인슐린 수용체 내 Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316 및 Y1322의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 3b는 실시예 3.3의 인슐린 수용체에 대한 항체인 10C3와 pAb의 Y1150, Y1151 및 Y1150/Y1151 인산화에 대한 결합특이성을 측정한 결과이다.
도 3c는 HeLa 세포에서 IGF-1수용체의 인산화를 관찰한 결과이다.
도 4a는 실시예 3.4 의 인슐린(50nmol/L)이 처리된 3T3-L1 지방세포에서 인슐린 수용체 단백질 및 신호전달 단백질의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 4b 내지 도 4d는 인슐린 및 IR-A48에 의하여 각각 AKT(S473), AKT(T308) 및 ERK(T202/Y204)의 인산화 여부를 정량화한 실시예 3.4 실험의 결과이다.
도 5a는 실시예 5의 MCF-7 세포에 인슐린 및 IR-A48을 각각 처리하여 세포성장에 미치는 영향을 확인한 결과이고, 도 5b는 MCF-7 세포에 인슐린 및 인슐린과 IR-A48의 혼합물을 각각 처리하여 IR A48이 인슐린에 의한 세포성장에 미치는 영향을 확인한 결과이며, 도 5c는 MCF-7 세포에서 인슐린 및 IR-A48이 인슐린 수용체의 Y1150 및 AKT S473을 인산화 시키는지 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 6a는 실시예 4.1의 3T3-L1 지방세포에 인슐린, IR-A48 및 인슐린과 IR-A48 혼합물을 처리하고 시간에 따른 포도당 흡수를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 인슐린과 IR-A48의 농도에 따른 활성을 측정하기 위하여 각각 30분 및 4시간으로 처리한 후 포도당 흡수를 관찰한 실시예 4.1 의 결과이다.
도 6c는 실시예 4.2의 IR-A48의 활성이 PI3K를 통해 전달되는지 확인하기 위하여 3T3-L1에서 PI3K 저해제(LY294002)를 1시간동안 전처리한 후 IR-A48(2시간 처리) 및 인슐린(30분 처리)에 의한 포도당 흡수 증가를 비교 조사한 결과이고, 도 6d는 IR-A48의 활성이 PI3K를 통해 전달되는지 확인하기 위하여 3T3-L1에서 PI3K 저해제(LY294002)를 1시간동안 전처리한 후 IR-A48(2시간 처리) 및 인슐린(30분 처리)에 의한 AKT 인산화를 비교 조사한 결과이다.
도 7은 실시예 6의 0.6U/kg의 인슐린 및 2.5, 5, 10mg/kg의 IR-A48을 마우스에 투여한 후 120분동안 혈당 변화를 관찰한 결과이다.
도 8a는 3T3-L1 지방세포에 인슐린을 4시간 처리하고 농도에 따른 지방분해 억제와 포도당 흡수를 비교한 결과이다.
도 8b는 3T3-L1 지방세포에 IR-A48을 4시간 처리하고 농도에 따른 지방분해 억제와 포도당 흡수를 비교한 결과이다.
도 8c는 인슐린과 IR-A48이 포도당 흡수에서 EC50에 해당하는 농도에서(각각 11.nM, 52.4nM)에서 지방분재 억제 효과를 상대적으로 비교한 결과이다.
도 1b는 실시예 1.6의 Mfold 프로그램에 의해 예측된 압타머의 2차 구조로서, IR-A48의 뉴클레오타이드가 스템-구조를 형성하는 것을 나타낸 것이다.
도 1c는 실시예 2.3의 IR-A48F 또는 IR-A48가 인슐린 수용체 또는 IGF-1 수용체에 결합여부를 측정한 결과이다.
도 1d는 IR-A62F 및 IR-A62 압타머의 서열을 나타낸 것이다.
도 1e는 실시예 1.6의 Mfold 프로그램에 의해 예측된 압타머의 2차 구조로서, IR-A62의 뉴클레오타이드가 스템-구조를 형성하는 것을 나타낸 것이다.
도 1f는 실시예 2.3의 IR-A62F 또는 IR-A62가 인슐린 수용체 또는 IGF-1 수용체에 결합여부를 측정한 결과이다.
도 1g는 IR-A05F 및 IR-A05 압타머의 서열을 나타낸 것이다.
도 1h는 실시예 1.6의 Mfold 프로그램에 의해 예측된 압타머의 2차 구조로서, IR-A05의 뉴클레오타이드가 스템-구조를 형성하는 것을 나타낸 것이다.
도 1i는 실시예 2.3의 IR-A05F 또는 IR-A05가 인슐린 수용체 또는 IGF-1 수용체에 결합여부를 측정한 결과이다.
도 2a는 인슐린 수용체를 과발현시키고 있는 Rat-1 fibroblast(Rat-1/hIR)에 FITC-인슐린 (100nmol/L)과 IR-A48을 0.1, 0.25, 0.5 및 1μm의 농도로 처리하여 FITC 형광 변화를 특정한 실시예 2.2의 실험 결과 및 압타머의 인슐린 수용체 상 결합위치를 나타낸 것이다.
도 2b는 실시예 3.2의 Rat-1/hIR 세포에서 인슐린 및 IR-A48에 의한 IRS, AKT, ERK의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 2c는 인슐린 수용체를 과발현시키고 있는 Rat-1 fibroblast(Rat-1/hIR)에 FITC-인슐린 (100nmol/L)과 IR-A62를 0.02, 0.1, 0.25 0.5 및 1 마이크로미터의 농도로 처리하여 FITC 형광 변화를 특정한 실시예 2.2의 실험 결과 및 압타머의 인슐린 수용체 상 결합위치를 나타낸 것이다.
도 2d는 실시예 3.2의 Rat-1/hIR 세포에서 인슐린 및 IR-A62에 의한 IRS, AKT, ERK의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 2e는 인슐린 수용체를 과발현시키고 있는 Rat-1 fibroblast(Rat-1/hIR)에 FITC-인슐린 (100nmol/L)과 IR-A48을 0.1, 0.25, 0.5 및 1μm의 농도로 처리하여 FITC 형광 변화를 특정한 실시예 2.2의 실험 결과 및 압타머의 인슐린 수용체 상 결합위치를 나타낸 것이다.
도 2f는 실시예 3.2의 Rat-1/hIR 세포에서 인슐린, IR-A05에 의한 IRS, AKT, ERK의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 3a는 실시예 3.3의 인슐린, IR-A48, IR-A62 및 IR-A05에 의한 인슐린 수용체 내 Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316 및 Y1322의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 3b는 실시예 3.3의 인슐린 수용체에 대한 항체인 10C3와 pAb의 Y1150, Y1151 및 Y1150/Y1151 인산화에 대한 결합특이성을 측정한 결과이다.
도 3c는 HeLa 세포에서 IGF-1수용체의 인산화를 관찰한 결과이다.
도 4a는 실시예 3.4 의 인슐린(50nmol/L)이 처리된 3T3-L1 지방세포에서 인슐린 수용체 단백질 및 신호전달 단백질의 인산화 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 4b 내지 도 4d는 인슐린 및 IR-A48에 의하여 각각 AKT(S473), AKT(T308) 및 ERK(T202/Y204)의 인산화 여부를 정량화한 실시예 3.4 실험의 결과이다.
도 5a는 실시예 5의 MCF-7 세포에 인슐린 및 IR-A48을 각각 처리하여 세포성장에 미치는 영향을 확인한 결과이고, 도 5b는 MCF-7 세포에 인슐린 및 인슐린과 IR-A48의 혼합물을 각각 처리하여 IR A48이 인슐린에 의한 세포성장에 미치는 영향을 확인한 결과이며, 도 5c는 MCF-7 세포에서 인슐린 및 IR-A48이 인슐린 수용체의 Y1150 및 AKT S473을 인산화 시키는지 여부를 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 6a는 실시예 4.1의 3T3-L1 지방세포에 인슐린, IR-A48 및 인슐린과 IR-A48 혼합물을 처리하고 시간에 따른 포도당 흡수를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 인슐린과 IR-A48의 농도에 따른 활성을 측정하기 위하여 각각 30분 및 4시간으로 처리한 후 포도당 흡수를 관찰한 실시예 4.1 의 결과이다.
도 6c는 실시예 4.2의 IR-A48의 활성이 PI3K를 통해 전달되는지 확인하기 위하여 3T3-L1에서 PI3K 저해제(LY294002)를 1시간동안 전처리한 후 IR-A48(2시간 처리) 및 인슐린(30분 처리)에 의한 포도당 흡수 증가를 비교 조사한 결과이고, 도 6d는 IR-A48의 활성이 PI3K를 통해 전달되는지 확인하기 위하여 3T3-L1에서 PI3K 저해제(LY294002)를 1시간동안 전처리한 후 IR-A48(2시간 처리) 및 인슐린(30분 처리)에 의한 AKT 인산화를 비교 조사한 결과이다.
도 7은 실시예 6의 0.6U/kg의 인슐린 및 2.5, 5, 10mg/kg의 IR-A48을 마우스에 투여한 후 120분동안 혈당 변화를 관찰한 결과이다.
도 8a는 3T3-L1 지방세포에 인슐린을 4시간 처리하고 농도에 따른 지방분해 억제와 포도당 흡수를 비교한 결과이다.
도 8b는 3T3-L1 지방세포에 IR-A48을 4시간 처리하고 농도에 따른 지방분해 억제와 포도당 흡수를 비교한 결과이다.
도 8c는 인슐린과 IR-A48이 포도당 흡수에서 EC50에 해당하는 농도에서(각각 11.nM, 52.4nM)에서 지방분재 억제 효과를 상대적으로 비교한 결과이다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
항체 및 시약의 준비
인간 인슐린 수용체 단백질은 R&D system (Minneapolie, MN)에서 구입해서 사용하였다. 사용된 압타머는 Aptamer Science, Inc. (Pohang, Korea)와 ST Pharm (Siheung, Korea)을 통해 합성되었다. 웨스턴 블랏시 사용한 항체는 다음과 같다: Anti-phosphor-ERK(T202/Y204), Anti-AKT, Anti-phosphor-AKT(S473),Anti-phosphor-AKT(T308), anti-phospho-FoxO1/3a (T24/T32), 및 anti-phospho-AS160 (T642)(signaling, Beverly, MA). Anti-IR β-subunit (C-19), anti-IGF-1R β-subunit (C-20), anti-phospho-IR (10C3, Y1150/Y1151), anti-phospho-IRS1 (Y632), 및 anti-phospho-Shc (Y239/Y240) 항체는Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechmology, Snata Cruz, CA)에서 구매함. Anti-phospho-tyrosine (4G10), anti-phospho-IRS1 (Y612) human/(Y608) mouse, 및 anti-phospho-IR (Y1146) (Millipore, Darmstadt, Germany). Anti-phospho-IR (Y960), anti-phospho-IR (pAb, Y1150/Y1151), anti-phospho-IR (Y1316), anti-phospho-IR (Y1322), anti-phospho-IR (Y1146/Y1150/Y1151) (Invitrogen, Carlsbad, CA).
세포 배양 및 분화
MCF7 인간 유방암 세포주, 인간 배아 신장 세포 HEK293, 마우스 지방세포 3T3-L1은 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 인슐린 수용체가 과발현된 Rat-1 섬유세포(Rat-1/hIR)는 University of California의 Nicholas J. G. Webster 박사로부터 제공 받았다. MCF7, HEK293, Rat-1/hIR은 10% fetal bovine serum (Gibco), penicillin (100 units/ml), 및 streptomycin (100 units/ml)가 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (Lonza)에서 37℃ 및 5% CO2조건 하에서 배양하였다. 3T3-L1은 0% Bovine serum (Gibco), penicillin (100 units/ml), 및 streptomycin (100 units/ml)가 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (Lonza)에서 37℃ 및 5% CO2조건 하에서 배양하였다.
3T3-L1의 지방세포 분화를 위해 포화상태로 성장한 세포를 2일 동안 더 배양 한 후, 1 μM dexamethasone, 500 nM IBMX, 850 nM 인슐린과 10% FBS가 포함된 DMEM을 2일동안 처리하였다. 그 후 850 nM 인슐린과 10% FBS가 포함된 DMEM을 2일 동안 처리하고, 10% FBS만 포함된 DMEM을 지방세포로의 분화가 완료 될 때까지 5~6일동안 처리하였다.
실시예
1: 인슐린 수용체
압타머
발굴
SELEX를 사용해 인슐린 수용체의 세포외 영역에 결합하는 압타머들을 발굴했다. 40mer의 가변서열과 양쪽에 20mer씩 존재하는 불가변 서열로 구성된 단일가닥의 DNA 라이브러리(서열번호 3)를 사용하여 SELEX를 진행하였다.
1.1변형 핵산 라이브러리 합성
SELEX에 필요한 단일 사슬 변형 DNA 라이브러리를 제조하기 위하여 5'에 바이오틴(biotin)이 결합된 안티센스 라이브러리(서열번호 3)를 합성하였다. 안티센스 라이브러리를 0.5mM의 dNTP(ATP, GTP, CTP, Bz-dU), 0.25U/ul의 KOD XL(Invitrogen), 10X extension buffer(1.2M Tris-HCl pH7.8, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2SO4, 70 mMMgSO4, 1% TritonX-100, 1mg/mlBSA)상에서 70℃ 1시간 동안 50uM의 역방향 프라이머(서열번호 4)와 반응시켜 이중 나선 DNA를 제조하였다. 여기에 20mM NaOH를 이용하여 단일 사슬 변형DNA 라이브러리를 용출한 뒤 HCL 용액으로 중화하였다. 제조된 DNA 라이브러리는 Amicon ultra-15(Millipore)를 이용하여 농축한 뒤 UV 분광광도계(spectrophotometer)로 정량하였다.
1.2.인슐린
수용체와 결합
상기 합성된 라이브러리 1nmole을 선택 완충액(selection buffer)(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)에 넣고 95℃, 70℃, 48℃, 37℃에서 각각 5분간 반응시킨 후, 음성 선택(Negative selection)을 위하여 10X 단백질 경쟁 완충액(protein competition buffer)(10μM prothrombin, 10μM casein, 0.1%(w/v) HSA (human serum albumin, SIGMA) 10μL를 혼합한 뒤, 상층액이 제거된 Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1(SA bead)(50%(v/v) slurry, 10mg/ml Invitrogen)에 첨가하여 37℃에서 10분간 반응 시켰다.
음성 선택 반응 후, 상층 액만을 취하여 새로운 튜브에 옮긴 후, His tag이 결합된 인슐린 수용체 단백질과 결합시킨 Dynabead TALON에 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 100μL으로 선택 완충액(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2) DNA와 인슐린 수용체와 결합한 Dynabeads TALON를 5번 세척하였다. 5번째 세척 시에는 새로운 플레이트에 옮겨 세척하였다. 2mM NaOH 용액 85μL를 첨가하여 표적에 결합하는 라이브러리를 용출한 뒤 8mM HCl 용액 20μL로 중화하였다.
1.3 증폭
표적에 결합하는 라이브러리 DNA를 QPCR(quantitative PCR, IQ5 multicolor real time PCR detection system, Bio-rad)을 이용하여 증폭하였다. 앞서 라이브러리 제조에 사용된 역방향 프라이머(서열번호 4)와 안티센스 라이브러리(서열번호 3)를, 각각 5uM (5 X QPCR master Mix, Novagen), 0.075U/ul KOD(Novagen), 1mM dNTP(Roche Applied science), 25mM MgCl2,5XSYBRgreenⅠ(Invitrogen)의 총 부피가 125μL가 되도록 혼합하여, 96℃ 15초, 55℃ 10초, 68℃ 30분 조건으로 1 회, 그리고 96℃ 15초, 72℃ 1분 조건으로 30 회 반복하여 이중 가닥 라이브러리를 제조하였다.
1.4.eDNA
제조
eDNA는 enzymatic DNA로 DNA 주형과 폴리머라제를 이용해 생산한 압타머를 의미한다. 상기 QPCR을 통하여 만들어진 DNA 라이브러리를 25μL Myone SA bead(Invitrogen)에 상온에서 10분간 혼합하여 고정하였다. 이 때 혼합된 DNA 양은 QPCR product로 60ul로 하였다. 20mM NaOH 용액을 첨가하여 단일 가닥DNA로 만들어주었다. 그리고 실시예 1.1의 라이브러리 제조와 같은 방법으로 변형된 핵산을 포함하는 DNA를 합성하여 다음 회차에 사용하였다. SELEX round는 총 8회 수행하였고 보다 선택적인 결합을 위하여 4회부터 6회까지 그리고 7회부터 8회까지 각각 DNA와 단백질 (IntegrinαVβ3) 복합체를 10mM DxSO4(sigma)용액에 1/200, 1/400로 희석하여 DNA 압타머를 선별하였다.
1.5.압타머
염기서열 분석
8번의 SELEX round를 거친 후 그 결과물을 QPCR 방법으로 이중 가닥 DNA로 증폭한 뒤 TA cloning kit(SolGent)를 이용하여 클로닝 하였다. 그리고 벡터 상에 존재하는 M13 프라이머(서열번호 5)를 가지고 시퀀싱하여 압타머의 서열을 얻었다.
1.6. 최적의
압타머
서열 결정
압타머를 찾아내기 위해서 발굴된 압타머(1uM)를 인슐린 수용체가 과발현되고 있는 HEK293 세포에 처리하여 AKT S473의 인산화를 증가하는지를 분석하였다. 대부분의 압타머들이 효과가 없었지만, 발굴된 IR-A48F(서열번호 1), IR-A62F(서열번호 6) 및 IR-A05F(서열번호 8) 압타머는 AKT의 인산화를 상당히 증가시켰다. IR-A48F 의 서열은 가변영역에 8개의 Nap-dU를 포함하는 80mer로 구성되어 있고(도 1a), IR-A62F 의 서열은 가변영역에 10개의 Nap-dU를 포함하는 79mer로 구성되어 있으며(도 1d), IR-A05F의 서열은 가변영역에 14개의 Bn-dU를 포함하는 80mer로 구성되어 있다(도 1g). 표적과의 결합에 필요한 압타머의 최소 서열을 찾기 위해 압타머의 2차구조를 바탕으로 압타머 서열 최소화를 수행하였다.
Mfold 프로그램에 의해 예측된 IR-A48F압타머의 2차 구조는 도 1b에 나타내었으며 6개의 Nap-dU를 포함한 압타머 내부의 33개의 뉴클레오타이드가 안정적인 스템-루프 구조를 형성한다. Mfold 프로그램에 의해 예측된 IR-A62F압타머의 2차 구조는 도 1e에 나타내었으며 6개의 Nap-dU를 포함한 압타머 내부의 27개의 뉴클레오타이드가 안정적인 스템-루프 구조를 형성한다. 또한 Mfold 프로그램에 의해 예측된 IR-A05 압타머의 2차 구조는 도 1h에 나타내었으며, 14개의 Bn-dU를 포함한 압타머 내부의 50개 뉴클레오타이드가 2개의 안정적인 스템-루프 구조를 형성하는 것을 확인하였다.
상기 실험 결과, 표적에 대한 결합분석을 통해 이 내부 스템-루프 서열 (IR-A48, 서열번호 2) (3.5 nM Kd) 이 IR-A48F(6.9 nM Kd)와 비슷한 수준으로 인슐린 수용체에 결합함을 확인하였다. 또한 IR-A48은 인슐린 수용체와 매우 유사한 구조를 가지는 인슐린 유사 성장인자 1(insulin-like growth factor 1, IGF-1) 수용체는 결합하지 않았기 때문에 인슐린 수용체에 대해 매우 높은 특이성을 가지는 것을 확인하였다. 마찬가지로 10C3 항체를 사용해 IR-A48이 IGF-1 수용체의 인산화에 미치는 영향을 조사한 결과, 결합 특이성과 일치하게 IR-A48은 인슐린과는 다르게 IGF-1 수용체의 인산화에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 상기 결과를 도 1c 및 도3c에 나타내었다.
또한, 표적에 대한 결합분석을 통해 이 내부 스템-루프 서열 (IR-A62, 서열번호 7) (2.4 nM Kd) 이 IR-A62F(26.9 nM Kd)와 비슷한 수준으로 인슐린 수용체에 결합함을 확인하였다. 또한 IR-A62은 인슐린 수용체와 매우 유사한 구조를 가지는 인슐린 유사 성장인자 1(insulin-like growth factor 1, IGF-1) 수용체는 결합하지 않았기 때문에 인슐린 수용체에 대해 매우 높은 특이성을 가지는 것을 확인하였다. 마찬가지로 10C3 항체를 사용해 IR-A62이 IGF-1 수용체의 인산화에 미치는 영향을 조사한 결과, 결합 특이성과 일치하게 IR-A62은 인슐린과는 다르게 IGF-1 수용체의 인산화에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 상기 결과를 도 1f 및 도3c에 나타내었다.
또한, 표적에 대한 결합분석을 통해 이 내부 스템-루프 서열 (IR-A05, 서열번호 9) (2.24 nM Kd)이 인슐린 수용체에 결합함을 확인하였다. 또한 IR-A05은 인슐린 수용체와 매우 유사한 구조를 가지는 인슐린 유사 성장인자 1(insulin-like growth factor 1, IGF-1) 수용체는 결합하지 않았기 때문에 인슐린 수용체에 대해 매우 높은 특이성을 가지는 것을 확인하였다. 마찬가지로 10C3 항체를 사용해 IR-A05이 IGF-1 수용체의 인산화에 미치는 영향을 조사한 결과, 결합 특이성과 일치하게 IR-A05은 인슐린과는 다르게 IGF-1 수용체의 인산화에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 상기 결과를 도 1h 및 도3c에 나타내었다.
이후의 모든 실험은 최소화가 진행된 IR-A48, IR-A62 및 IR-A05를 사용해 수행하였다.
1.7.압타머
합성 및 정제
압타머는 핵산전용 고정상합성기인 Bioautomation사의 Mermade 12 합성기를 사용하여 Solid Phase Oligo Synthesis 방법으로 자체 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 합성기(Bioautomation, Mermade12)를 이용하여 solide phase b-cyanoethyl phosphoramidite chemistry로 합성하였으며, 합성 후 CPG(200nmole synthesis column, 1000A(MM1-1000-))를 클리비지(cleavage) 용액[t-butylamine:methanol:water(1:1:2 부피비)]에 넣고 70℃에서 5시간 동안 클리비지/디프로텍션(deprotection) 후 진공 건조를 시킨 다음, HPLC(GE, AKTA basic)를 이용하여 분리/정제하였다. 사용한 컬럼은 RP-C18 컬럼 (Waters, Xbridge OST C18 10x50mm)이고 UV 254 nm/290nm,flow rate: 5ml/min, 온도: 65℃의 조건으로 0.1M TEAB/Acetonitrile Buffer를 이용하였다. 이들 압타머들은 모두 LC-ESI MS spectrometer(Waters HPLC systems(Waters) + Qtrap2000(ABI))로 0.02% 오차범위 내에서 정확한 분자량을 측정하였으며 HPLC를 이용한 순도측정에서 80-90%를 얻을 수 있었다,
실시예
2: 인슐린 수용체
압타머
결합 특성
2.1. 세포 실험을 위한 준비
압타머를 처리하기 전, 혈청 결핍을 위해 세포를 FBS가 없는 DMEM에 3시간동안 처리하였다. 이후 1시간 동안 Krebs-Ringer HEPES buffer [25 mM HEPES (pH 7.4), 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2, and 1.3 mM KH2PO4]에 세포를 처리 하였다. 세포 처리를 위한 모든 압타머는 동일한 Krebs-Ringer HEPES buffer에 준비되었으며, 정확한 2차구조 형성을 위해 95°C에서 5분 동안 가열하여 상온서 천천히 식히는 과정을 거쳤다.
2.2. 인슐린 경합 분석(Insulin competition assay)
실시예 1에서 발굴된 IR-A48, IR-A62 및 IR-A05의 인슐린 수용체에 대한 결합 특성을 조사하기 위해서 유세포 분석기(Flow cytometry)를 사용해 인슐린 경합 분석(Insulin competition assay)을 진행하였다. Rat-1/hIR세포를 5mM EDTA가 포함된 PBS를 이용하여 세포배양용기로부터 떼어 내었다. 준비된 세포에 블로킹 완충액(Blocking buffer)(PBS, 1% BSA, and 0.1% NaN3)를 처리하여 4℃에서 30분 동안 20rpm으로 회전하며 반응시켰다. 이후 FITC가 결합된 인슐린을 다양한 농도의 IR-A48, IR-A62 및 IR-A05과 함께 처리하여 각각의 결합이 평형상태에 이르도록 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. 세포를 PBS로 2번 씻어낸 후, 4% 파라포름알데하이드가 포함된 PBS로 상온에 30분 동안 고정시켰다. 세포에 결합된 인슐린의 양을 유세포 분석기(Flow cytometry, BD FACSCanto™ II)를 통해 FITC의 형광을 측정함으로써 관찰하였다.
그 결과 IR-A48는 아고니스트로서 활성을 가짐에도 불구하고, 인슐린의 결합을 방해하지 않는 것을 확인했다 (도 2a). 이는 IR-A48이 인슐린이 결합하는 오소스테릭 자리(orthosteric site)가 아닌, 완전히 다른 알로스테릭 자리(allosteric site)에 결합한다는 의미를 지닌다. IR-A62 및 IR-A05는 아고니스트로 활성을 가짐과 동시에 인슐린과 경쟁적으로 결함하며, 이는 인슐린이 결합하는 오소스테릭 자리(orthosteric site)에 결합한다는 의미를 지닌다. 특히, IR-A62의 경우 낮은 농도에서는 인슐린의 결합을 증가시키는 촉진적 상호작용(Positive co-operativity)을 가지는 것을 확인하였다 (도 2c 및 도 2e).
2.3. 필터 결합 분석(filter binding assay)
선별된 압타머의 결합력을 알아보기 위하여 필터 결합 분석법(filter binding assay)을 수행하였다. 먼저 IR-A48, IR-A62 및 IR-A05 압타머의 5‘ 말단에 TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase, NEB)로 α-P32ATP(PerkinElmer)을 표지 하였다. 압타머 1μM 0.25μL, α-P32ATP (5μM,perkinelmer), 0.25μL, TdT 및 10X NEB buffer4 10μL reaction volume으로 37℃에서 30분간 반응시키고, 70℃에서 10분간 incubation 하여, TdT를 불활성화시켰다. 표지된 DNA pool은 Micro spin G-50 column(GE healthcare)을 이용하여 정제하였다.
표지된 압타머 20,000cpm을 100μL 1xSB buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)에 넣고 95℃에서부터 1초에 0.1℃씩 37℃까지 천천히 냉각시켰다. 그리고, buffer (200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)를 이용하여 인슐린 수용체 단백질을 100nM에서 12 point로 순차적으로 희석한 뒤, 상기 가열 및 냉각시킨 DNA 풀 30μL를 각각 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 나일론 멤브레인(Nylon membrane, GE healthcare)에 DNA와 IntegrinαVβ3의 혼합물을 각각 2μL씩 spotting한 뒤 zorbax resin(Agilent) 5.5μL를 첨가하였다. 그리고 미리 1X SB buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)50μL로 적셔놓은 Durapore 필터(Millipore)에 넣고 vacuum을 걸어주었다. 그리고 멤브레인 필터를 100μL의 1X 선택 완충액(selection buffer)(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)로 씻어주었다. 필터 플레이트를 이미지 플레이트에 밤새 노출시킨 뒤 FLA-5100(Fuji)으로 이미지를 정량화 하였다.
그 결과 IR-A48 및 IRA48F의 Kd는 각각 3.5nM 및 6.9nM이었으며, IR-A48은 인슐린 수용체에는 결합하였으나 IGF-1수용체에는 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 도 1c에 나타내었다.
또한, 그 결과 IR-A62및 IR-A62F의 Kd는 각각 2.4nM 및 26.9nM이었으며, IR-A62은 인슐린 수용체에는 결합하였으나 IGF-1수용체에는 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 도 1f에 나타내었다.
또한, 그 결과 IR-A05 의 Kd는 각각 2.2nM이었으며, IR-A05는 인슐린 수용체에는 결합하였으나 IGF-1수용체에는 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 도 1i에 나타내었다.
상기 결과를 아래 표 2에 정리하였다.
IR-A48F | IR-A48 | IR-A62F | IR-A62 | IR-A05 | |
IR(Kd) | 6.9nM | 3.5nM | 26.9nM | 2.4 nM | 2.2 nM |
IGF-1R (Kd) |
N/A | N/A | N/A | N/A | N/A |
실시예
3: 인슐린 수용체
압타머의
인산화
3.1. Western Blot
인슐린 수용체 및 신호전달 단백질의 인산화를 관찰하기 위하여 용해완충용액[50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10% glycerol, 1% Triton-X, and protease inhibitor cocktails]에 세포를 용해시켰다. 세포 용해물은 95°C에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심 분리하여 단백질을 분리해 내었다. 준비된 세포 용해물은 6%~16% SDS-PAGE 상에서 전기영동 하였고 니트로 셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane)에 옮겨졌다. 막에 1차 항체를 4℃에서 12시간동안 반응시킨 후, HPR(Horseradish peroxidase) 혹은 IRDye800CW(LI-COR)가 결합된 2차 항체를 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 단백질의 존재 및 인산화 정도는 ECL(Thermo Scientific, MA)을 통한 Chemiluminescence 혹은 Infrared fluorescence system(Odyssey, LI-COR)를 이용해 측정되었다.
3.2. 인슐린 수용체 인산화
실시예 1의 IR-A48, IR-A62 및 IR-A05 압타머가 인슐린의 결합에 미치는 영향을 알아보기 위해, IR-A48, IR-A62, IR-A05 및 인슐린을 처리할 경우 인슐린 수용체의 인산화 정도를 상기 기재된 웨스턴 블로팅법을 통하여 관찰하고 그 결과를 도 2b, 도 2d 및 도 2f에 나타내었다.
인슐린 수용체 카이네이즈 영역의 Y1150/Y1151의 인산화는 인슐린과 IR-A48, IR-A62 및 IR-A05 모두에 의해서 증가하였다. 하지만 IR-A48, IR-A62 및 IR-A05과 인슐린이 함께 처리된 경우에 의한 인슐린 수용체의 인산화는 달랐다. IR-A48과 인슐린이 함께 처리되었을 때 Y1150/Y1151의 인산화는 협력적으로 증가하다. IR-A62과 인슐린이 함께 처리되었을 때 낮은 농도에서는 Y960, Y1146 및 Y1150/Y1151의 인산화는 크게 증폭되었지만, 반대로 높은 농도에서는 감소하였다. IR-A05과 인슐린 함께 처리되었을 때 Y1150/Y1151 크게 변하지 않았지만, Y960, Y1146의 인산화는 완전히 감소하였다. 종합해보면 이 결과들은 IR-A48는 인슐린과 독립적으로 작용하며, IR-A62는 인슐린의 활성을 증폭시키고, IR-A05는 인슐린의 활성을 감소시키지만, 그 활성이 공통적으로 카이네이즈 영역의 특정 티로신(Y1150/Y1151)에 편중되어 있다는 것을 보여 준다.
3.3. ELISA- 세포 내 티로신 인산화
실시예 1에서 발굴된 IR-A48, IR-A62 및 IR-A05 압타머의 인산화 효과를 알아보기 위하여 6종류의 항체를 사용하였다. 인슐린이 수용체에 결합할 때 세포 내 영역의 7개의 티로신(Y953, Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316 및 Y1322)이 인산화 되는데, 이 중 Y953에 대한 항체는 개발되지 않아 총 6가지 티로신에 대하여 실험하였다.
항체의 항원 특이성을 관찰하기 위하여 ELISA를 수행하였는데 먼저 항원으로 사용될 3종류의 펩타이드(MTRDIYETD-pY-pY-RKGGKGLL, MTRDIYETD-pY-YRKGGKGLL, MTRDIYETDY-pY-RKGGKGLL)는 Selleckchem (Houston, TX)에서 합성되었다. PBS에 녹인 20 pmol/100 μl의 펩타이드를 N-oxysuccinimide ester groups으로 코딩된 96 plate(Corning, MA)에 4℃에서 12시간동안 반응시켜 공유결합으로 연결시켰다. 1% BSA가 포함된 PBS로 1시간 동안 blocking 후, TTBS 완충용액[50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, and 0.05% Tween-20]으로 한번 씻어 내었다. 항체를 TTBS 완충용액에 1:1000으로 희석 시킨 후, 상온에서 1시간동안 96 plate에 결합된 항원과 결합시켰다. TTBS 완충용액으로 3번 씻어낸 후, AP(Alkaline phosphatase)가 결합된 2차 항체 1:2000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 결합시켰다. TTBS 완충용액으로 3번 씻어낸 후, 100ul의 CSPD를 첨가하여 상온에서 30분동안 반응시킨 후 광도계(Luminoskan Ascent)를 이용하여 화학 발광을 측정하였다.
Y1150/Y1151에 편향된 인산화를 명확히 검증하기 위해서 2가지 다른 종류의 pY1150/pY1151 항체를 사용하였다: 10C3 (sc-81500, Santa Cruz) pAb (44804G, Invitrogen). 또한 Y1150과 Y1151은 독립적으로 인산화 되기 때문에 두 항체가 각각 pY1150, pY1151, pY1150/pY1151에 서로 다른 특이성을 가지고 있다고 가정하고, 이를 검증하기 위해 pY1150, pY1151, pY1150/pY1151에 대응하는 합성 펩타이드(peptides)를 마련하면서 ELISA를 통해 항체를 특이성을 확인했다.
그 결과를 도 3a에 나타내었으며, 인슐린은 Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, Y1322의 모든 인산화를 증가시켰지만, IR-A48, IR-A62 및 IR-A05 은 오직 카이네이즈 영역의 Y1150/Y1151 인산화만을 증가시켰음을 알 수 있다.
도 3b에서 알 수 있듯이, 10C3 항체는 pY1150/pY1151과 pY1150 모두에 비슷한 정도로 결합했지만, pAb 항체는 오직 pY1150/pY1151에만 강하게 결합하였다. 이 결과를 통하여 IR-A48, IR-A62 및 IR-A05 이 인슐린 수용체 카이네이즈 영역의 Y1150만을 우선적으로 인산화시키는 편향된 아고니스트(biased agonist)라는 것이 입증되었다.
3.4. 신호전달 단백질의 인산화
실시예 1에서 발굴된 IR-A48 에 의한 Y1150 인산화가 인슐린 신호전달에 어떤 다른 영향을 미치는지 인슐린과 비교하였다.
상기 실험 결과, IR-A48 은 인슐린과 견줄 정도의 신호전달을 활성화시켰다. 인슐린(50nmol/L)이 처리된 3T3-L1 지방세포에서 인슐린 수용체와 IRS, AKT, ERK 등의 단백질의 인산화는 5분 동안 빠르게 증가하였고 시간이 지남에 따라 점차 감소하였다. 인슐린과는 대조적으로 IR-A48(200nmol/L)은 RS (Y608, Y632), AKT (T308, S473), AS160 (T642), GSK3 α/β (S21/S9), FOXO1/3a (T24/T32)의 인산화를 2시간에 걸쳐 천천히 증가시켰고 인산화는 4시간 동안 지속되었다. 상기 결과를 도 4a에 나타내었다.
인슐린 수용체의 인산화는 신호전달에서 두 가지 역할을 하는데, 첫째로 카이네이즈 영역의 인산화(Y1146, Y1150, Y1151)는 카이네이즈의 활성을 조절하고, 둘째로는 Y960과 Y1322의 인산화가 인슐린 수용체에 결합하는 신호전달 단백질의 결합위치로 사용된다. 이러한 Y1150에 편중된 인산화를 고려할 때 IR-A48은 다른 티로신의 낮은 인산화로 인해 인슐린 신호전달을 크게 높이지 못할 것으로 생각되었음에도 불구하고, IR-A48은 인슐린 수준의 신호 전달 활성을 보여 예상치 못한 효과를 보였음을 확인하였다.
무엇보다도 IR-A48은 특정 인슐린 신호전달에 편중된 활성을 보였다. IR-A48에 의해서 AKT S483의 인슐린과 비교해 98% 정도의 높은 인산화 정도를 보였지만, AKT T308의 인산화는 단지 37%에 머물렀다 (도 4A, 4B, 및 4C). 또한 IR-A48은 EKR의 인산화에는 거의 영향을 미치지 않았다 (도 4A 및 4D). 이와 같이 IR-A48은 인슐린 수용체의 신호전달을 활성화시키지만, 인슐린에 의한 신호전달과는 확연히 다른 특성을 가지고 있다.
실시예
4: 인슐린 수용체
압타머의
포도당 흡수
4.1 3T3-L1 지방 세포에서 포도당 흡수
상기 실시예 1에서 발굴된 IR-48이 AKT S473의 인산화를 증가시켰으므로 포도당 흡수에 대한 IR-A48의 활성을 3T3-L1 지방세포에서 조사하였다.
완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 혈청 결핍을 위해 FBS가 없는 DMEM에 3시간동안 처리한 후, 1시간동안 Krebs-Ringer HEPES 완충용액으로 처리했다. 인슐린 혹은 압타머를 해당 시간 동안 처리한 후, 2-deoxy[14C]glucose(0.1 μCi/ml)를 10분 동안 처리하였다. 20mM 포도당이 첨가된 PBS로 3번을 씻어내고 0.5 N NaOH과 1% SDS가 포함된 용액으로 세포를 녹여내었다. 액체 섬광 계수기(Liquid scintillation counter)를 사용하여 세포 내로 흡수된 2-Deoxy-D-glucose의 양을 관찰하였다.
3T3-L1 지방세포에 인슐린(50nmol/L)을 처리했을 때, 포도당 흡수는 30분에서 1시간 정도에 가장 높이 증가했다가 천천히 감소하여 8시간 이후에는 절반 이하로 떨어졌다. Y1150에 편중된 인산화에도 불구하고, IR-A48(200nmol/L)은 인슐린과 비슷한 정도의 수준으로 포도당 흡수를 증가시켰다. 하지만, 신호전달 단백질의 인산화 패턴과 마찬가지로 포도당 흡수 역시 4시간에 걸쳐 천천히 증가시켰고, 8시간 이상 지속되었다. 또한, IR-A48과 인슐린을 함께 처리했을 때는 IR-A48의 알로스테릭 결합(allosteric binding) 때문에 포도당 흡수는 협력적으로 증가 되었다. 상기 결과를 도 6a에 나타내었다.
느린 증가속도에도 불구하고 IR-A48은 높은 농도에서 포도당 흡수를 충분히 증가시켰다. 인슐린과 IR-A48의 농도에 따른 활성을 측정하기 위해 각각 가장 높은 반응을 보인 처리 시간에 포도당 흡수를 관찰하였다 (인슐린은 30분, IR-A48은 4시간). 가장 높은 농도에서 인슐린과 IR-A48 모두 비슷한 정도의 포화된 포도당 흡수 정도를 보였다. 하지만 인슐린의 경우 농도에 따라 서서히 증가하는 포도당 흡수를 보였지만 (Hill coefficient: 0.77), IR-A48은 20 nmol/L와 200 nmol/L 사이에서 급격하게 증가하는 모습을 보였다 (Hill coefficient: 0.77). 그 결과, IR-A48(66.2nmol/L)의 EC50는 인슐린(8.9nmol/L)보다 높았지만, IR-A48(202.4nmol/L)의 EC95는 인슐린(261.9nmol/L)보다 약간 낮았다. 상기 결과를 도 6b에 나타내었다.
4.2
PI3K에
의한 포도당 흡수 유도
상기 실시예 1에서 발굴된 IR-A48의 활성이 PI3K를 통해 전달되는지 여부를 확인하기 위하여 3T3-L1에서 PI3K inhibitor (LY294002)을 1시간동안 처리한 후, IR-A48에 의한 AKT 인산화와 포도당 흡수 증가를 조사하였다. 그 결과 IR-A48의한 포도당 흡수뿐 아니라, AKT의 인산화 역시 LY294002에 의해서 저해되는 것을 확인하였다. 그 결과를 도 6c 및 도 6d에 나타내었으며, 이는 IR-A48에 의한 AKT 인산화와 포도당 흡수 증가는 인슐린과 마찬가지로 PI3K를 통해 유도된다는 것을 보여준다.
실시예
5: 암세포 성장 유도
실시예 1에서 발굴된 IR-A48이 세포 분열에 미치는 영향을 조사하기 위하여 인슐린의 세포분열 유도 능력을 실험하는데 폭넓게 사용되는 MCF-7 암세포 주를 사용하였다.
MCF7 세포를 24-well plate에 well당 10000개로 배양한 후 24시간 동안 키운다. 혈청 결핍을 위해 0.5% FBS DMEM으로 추가로 24시간 동안 더 키운다. 인슐린 혹은 압타머를 72시간 동안 처리하였으며 24시간이 지날 때마다 배지를 새롭게 교체해 주었다. 처리가 끝난 후 세포를 4% paraformaldehyde가 포함된 PBS로 상온에 30분 동안 고정시켰다. 세포가 가진 DNA를 1μM SYTO60 형광색소가 포함된 PBS로 염색시킨 후 LI-COR Odyssey 스캐너로 형광을 측정함으로써 세포의 양을 정량하였다.
MCF-7에 인슐린과 IR-A48을 각각 단독으로 처리한 결과, 인슐린은 세포분열을 2.1배 증가시켰지만 IR-A48은 아무런 영향이 없었다. 또한 IR-A48(1umol/L)을 인슐린과 함께 섞어 처리하였을 때 역시 인슐린에 의한 세포분열에 아무런 영향을 미치지 않았다. IR-A48이 MCF-7 세포에 존재하는 인슐린 수용체를 활성화시키지 못했을 가능성을 배제하기 위하여, MCF-7 세포에서 IR-A48에 의한 인슐린 신호전달을 확인해 보았다. 그 결과 3T3-L1 지방세포와 마찬가지로MCF-7 세포에서도 인슐린 수용체 Y1150과 AKT S473을 인산화시키는 것을 확인하였다. 상기 결과를 도 5a 내지 도 5c에 나타내었으며, 이 결과 IR-A48에 의해 유도되는 신호전달은 인슐린 수용체에 의한 세포분열 유도와 완전히 분리된 기능을 가지는 것을 알 수 있었다.
실시예
6: in
vivo
혈당 실험
상기 실시예 3 내지 실시예 6의 결과를 in vivo에서 증명하기 위해 실시예 1에서 발굴된 IR-A48이 마우스의 혈당이 미치는 영향을 측정하였다.
혈액 속에서 IR-A48이 3’ 엑소뉴클에이즈(3’ exonucleases)에 의해서 빠르게 분해되는 것을 막기 위해서 IR-A48의 3‘ 말단에 역위 데옥시티라민(inverted deoxythymidine, idT)를 추가하였다. 8주령의 수컷 C57Bl/6J 실험 쥐를 12시간 동안 금식시킨 후 10 mg/kg, 5 mg/kg, 2.5 mg/kg의 IR-A48를 PBS에 녹여 정맥주사를 통해 실험 쥐에 투여하였다. 투여 후 15분, 30분, 60분, 90분, 120분이 지났을 때, 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈당측정기(Accu-Check Active; Roche Diagnostics)를 통해 혈당의 변화를 관찰 하였다. 투여 30분 후, 10 mg/kg IR-A48가 투여된 마우스의 혈당(41% 감소)은 0.6 unit/kg의 인슐린(51% 감소)과 비슷한 정도로 감소하였다. 하지만 30분 이후 빠르게 혈당이 회복되는 인슐린과는 다르게, IR-A48이 투여된 마우스는 1시간까지 혈당이 지속적으로 감소하다가 그 이후에야 천천히 회복되는 양상을 보여줬다. 상기 결과를 도 7에 나타내었다.
이를 통하여 IR-A48이 in vitro뿐만 아니라 in vivo에서도 활성이 있음을 확인하였으며, 이는 IR-A48이 알로스테릭 조절을 통해 인슐린과는 독립적으로 혈당을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
7. 지방분해 억제 효과 측정
실시예 1에서 발굴된 IR-A48이 지방분해 억제에 미치는 영향을 조사하기 위하여 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 사용하여, 지방분해 과정에서 분비되는 글리세롤 (Glycerol)의 양을 측정하였다.
완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 혈청 결핍을 위해 FBS가 없는 DMEM에 3시간동안 처리한 후, 포도당 결핍에 의한 지반분해를 유도하기 위해 1시간동안 Krebs-Ringer HEPES 완충용액으로 처리했다. 인슐린 혹은 압타머를 농도 별로 4시간 동안 처리 후, 세포에 처리된 버퍼를 채취하였다. 96-well 플레이트에 채취된 버퍼 20ul를 각각 넣고 Free glycerol reagent (Sigma F6428) 200ul를 더한 후, 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 세포에서 분비된 글리세롤의 농도를 의한 발색을 540nm 흡광도를 통해 측정하였다.
측정 결과를 도 8 및 하기 표 3에 나타내었으며, 인슐린의 경우 포도당 흡수의 EC50(11.7nM)과 지방분해의 IC50(1.6nM)이 7.3배의 차이를 보였지만, IR-A48의 경우 포도당 흡수의 EC50와 지방분해의 IC50는 각각 52.5nM과 30.1nM로 1.7배 정도의 차이를 보였다.
insulin | IR-A48 | |
Glucose uptake (EC50) | 11.7nM | 52.5nM |
Lipolysis (IC50) | 1.6nM | 30.1nM |
이를 통해 IR-A48는 포도당 흡수 활성에 비해 지방분해 억제 효과가 상대적으로 적기 때문에 동일한 포도당 흡수를 유도하는 상황에서는 인슐린보다 지방분해 억제 효과가 적은 것으로 확인되었다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION
posco
<120> Aptamer against Insulin Receptor and Pharmaceutical Composition
Containing the Same
<130> DPP20162662
<160> 9
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IR-A48F
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<400> 1
tatgagtgac cgtccgcctg gngnnaagac aaccncnagg ncaggcgcag ngacgggnag 60
cagccacacc accagccaaa 80
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IR-A48
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<400> 2
cgcctggngn naagacaacc ncnaggncag gcg 33
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a modified single strand DNA (ssDNA) library with 40 mer random
region
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(60)
<223> random region containing 2-deoxyuridine which is modifed by
naphtyl group
<400> 3
tttggctggt ggtgtggctg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
caggcggacg gtcactcata 80
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 4
tgaccgtccg cctg 14
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M13 primer
<400> 5
caggaaacag ctatgac 17
<210> 6
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IR-A62F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(56)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<400> 6
tatgagtgac cgtccgcctg gcannacgca ngagncnaga nccgncagac cnaaggcnnc 60
agccacacca ccagccaaa 79
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IR-A62
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, naphtyl
<400> 7
cannacgcan gagncnagan ccgncag 27
<210> 8
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IR-A05F
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(24)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(57)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group, benzyl
<400> 8
tatgagtgac cgtccgcctg ggnncgngac ngaacncggn gngggnggcn ngggnnnggn 60
cagccacacc accagccaaa 80
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> IR-A05
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(36)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(42)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)
<223> 2-deoxyuridine which is modifed by hydrophobic group,benzyl
<400> 9
gcctgggnnc gngacngaac ncggngnggg nggcnngggn nnggncagcc 50
Claims (26)
- 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하고 인슐린 수용체의 인산화를 촉진시키는 압타머로서, 인슐린 수용체 압타머(aptamer).
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 압타머에 포함된 뉴클레오타이드의 염기의 5번 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 데옥시리보스 우라실을 포함하는 것인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제2항에 있어서, 상기 소수성 작용기는 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기 및 트립토판로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 인슐린 수용체에 결합하고, IGF-1 수용체에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 인슐린과 경쟁적 또는 비경쟁적으로 인슐린 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는, 인슐린 수용체 압타머.
- 제5항에 있어서, 상기 인슐린과 경쟁적으로 인슐린 수용체에 결합하는 인슐린 수용체 압타머는 촉진적 상호작용을 통해 인슐린의 결합을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 인슐린 수용체의 Y1150을 인산화하거나 또는 AKT S473을 인산화시키는 것인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 MAPK 경로를 활성화시키지 않는 것을 특징으로 하는, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 세포의 포도당 흡수를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 인슐린 대비 지방 분해 억제 효과가 적은 것을 특징으로 하는 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 세포분열을 촉진시키지 않는 것을 특징으로 하는, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호 2, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 것인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호1의 염기서열 내의 서열번호 2의 염기서열을 필수적으로 포함하고, 상기 서열번호 2의 염기서열의 적어도 일 말단으로 연속하는 33개 내지 80개 뉴클레오타이드로 이루어진 것인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호6의 염기서열 내의 서열번호 7의 염기서열을 필수적으로 포함하고, 상기 서열번호 7의 염기서열의 적어도 일 말단으로 연속하는 27개 내지 80개 뉴클레오타이드로 이루어진 것인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호8의 염기서열 내의 서열번호 9의 염기서열을 필수적으로 포함하고, 상기 서열번호 9의 염기서열의 적어도 일 말단으로 연속하는 50개 내지 80개 뉴클레오타이드로 이루어진 것인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제12항에 있어서, 상기 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 압타머는 인슐린 수용체와 결합 시 해리 상수(Kd)가 1 내지 20 nM인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제12항에 있어서, 상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 압타머는 인슐린 수용체와 결합 시 해리 상수(Kd)가 0.5 내지 40 nM 인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제12항에 있어서, 상기 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 압타머는 인슐린 수용체와 결합 시 해리상수(Kd)가 1 내지 10 nM 인, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머에 포함된 적어도 하나의 염기는 PEG(polyethylene glycol), 비오틴 idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것을 특징으로 하는, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항에 있어서, 이량체(dimer) 또는 다량체(multimer)로 존재하는, 인슐린 수용체 압타머.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 인슐린 수용체 압타머를 포함하는, 인슐린 수용체 작용제(agonist).
- 제21항에 있어서, 상기 압타머는 인슐린 수용체에 결합하고, IGF-1 수용체에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 작용제.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 인슐린 수용체 압타머를 유효 성분으로 함유하는, 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 질환은 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만 또는 심혈관 질환인 약학 조성물.
- 제23항에 있어서, 인슐린을 추가로 포함하는, 약학 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 인슐린 수용체 압타머를 유효 성분으로 함유하는, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20150106151 | 2015-07-27 | ||
KR1020150106151 | 2015-07-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20170013178A true KR20170013178A (ko) | 2017-02-06 |
KR101881500B1 KR101881500B1 (ko) | 2018-07-24 |
Family
ID=57885164
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020160094621A KR101881500B1 (ko) | 2015-07-27 | 2016-07-26 | 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10724039B2 (ko) |
EP (1) | EP3330379B1 (ko) |
JP (1) | JP6514825B2 (ko) |
KR (1) | KR101881500B1 (ko) |
ES (1) | ES2899917T3 (ko) |
WO (1) | WO2017018641A1 (ko) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019216458A1 (ko) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 주식회사 압타머사이언스 | 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물 |
WO2020080809A1 (ko) * | 2018-10-15 | 2020-04-23 | 한양대학교 산학협력단 | 성상교세포 특이적 핵산 압타머 및 이의 용도 |
WO2021201516A1 (ko) * | 2020-03-30 | 2021-10-07 | 주식회사 압타머사이언스 | 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 용도 |
WO2023167528A1 (ko) * | 2022-03-03 | 2023-09-07 | 주식회사 압타머사이언스 | 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 이용 |
WO2024005240A1 (ko) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | 포항공과대학교 산학협력단 | 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 및 이의 용도 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113549623B (zh) * | 2021-05-31 | 2023-07-11 | 武汉维尔博生物科技有限公司 | 一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法 |
KR20240053520A (ko) * | 2022-10-14 | 2024-04-24 | 포항공과대학교 산학협력단 | Igf-1 수용체 결합 압타머 및 이의 용도 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004011680A1 (en) * | 2002-07-25 | 2004-02-05 | Archemix Corp. | Regulated aptamer therapeutics |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100076060A1 (en) * | 2005-09-15 | 2010-03-25 | Duke University | Aptamers as agonists |
US8926976B2 (en) * | 2009-09-25 | 2015-01-06 | Xoma Technology Ltd. | Modulators |
US20130059292A1 (en) * | 2011-08-30 | 2013-03-07 | Aptamer Sciences Inc. | Method of detecting a target using aptamer-mediated protein precipitation assay |
-
2016
- 2016-05-03 EP EP16830674.4A patent/EP3330379B1/en active Active
- 2016-05-03 ES ES16830674T patent/ES2899917T3/es active Active
- 2016-05-03 WO PCT/KR2016/004665 patent/WO2017018641A1/ko active Application Filing
- 2016-05-03 JP JP2018503571A patent/JP6514825B2/ja active Active
- 2016-05-03 US US15/746,654 patent/US10724039B2/en active Active
- 2016-07-26 KR KR1020160094621A patent/KR101881500B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004011680A1 (en) * | 2002-07-25 | 2004-02-05 | Archemix Corp. | Regulated aptamer therapeutics |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 448, Issue 1, pp. 114-119 (2014.05.23.)* * |
Journaal of Biomedical Optics, Vol. 19, No. 5, pp. 0512046-1~0512046-6 (2014.05.) * |
한국생물공학회 학술대회, P0814호, pp. 568 (2015.04.)* * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019216458A1 (ko) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 주식회사 압타머사이언스 | 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물 |
WO2020080809A1 (ko) * | 2018-10-15 | 2020-04-23 | 한양대학교 산학협력단 | 성상교세포 특이적 핵산 압타머 및 이의 용도 |
WO2021201516A1 (ko) * | 2020-03-30 | 2021-10-07 | 주식회사 압타머사이언스 | 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 용도 |
WO2023167528A1 (ko) * | 2022-03-03 | 2023-09-07 | 주식회사 압타머사이언스 | 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 이용 |
WO2024005240A1 (ko) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | 포항공과대학교 산학협력단 | 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 및 이의 용도 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2899917T3 (es) | 2022-03-15 |
US20190032060A1 (en) | 2019-01-31 |
EP3330379A9 (en) | 2018-07-18 |
KR101881500B1 (ko) | 2018-07-24 |
WO2017018641A8 (ko) | 2017-03-02 |
US10724039B2 (en) | 2020-07-28 |
JP6514825B2 (ja) | 2019-05-15 |
EP3330379B1 (en) | 2021-10-27 |
EP3330379A1 (en) | 2018-06-06 |
JP2018530994A (ja) | 2018-10-25 |
WO2017018641A1 (ko) | 2017-02-02 |
EP3330379A4 (en) | 2019-01-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101881500B1 (ko) | 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 약학적 조성물 | |
JP6929231B2 (ja) | Rtk突然変異細胞を有する患者を処置するための組成物及び方法 | |
JP2018530994A6 (ja) | インスリン受容体アプタマーおよびこれを含む薬学的組成物 | |
Wu et al. | Pharmacological inhibition of c-Jun N-terminal kinase signaling prevents cardiomyopathy caused by mutation in LMNA gene | |
WO2012176952A1 (ko) | Erbb2 수용체에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 | |
EP2868747A1 (en) | Aptamer for periostin and anti-cancer composition including same | |
WO2004017997A1 (ja) | 腎疾患治療又は予防剤及び腎疾患の診断方法 | |
JP2008516617A (ja) | Gpr17調節因子、そのスクリーニング方法、およびその使用 | |
JP5103187B2 (ja) | バソプレッシン結合性のl体核酸 | |
Zheng et al. | Exenatide regulates substrate preferences through the p38γ MAPK pathway after ischaemia/reperfusion injury in a rat heart | |
CN115177728A (zh) | Mapk/erk通路激活导致的癌症的治疗方法和应用及crept-cdk9复合物 | |
US20230159934A1 (en) | Insulin receptor aptamer and pharmaceutical composition for treating diabetes comprising the same | |
KR100973990B1 (ko) | 대장암 진단용 마커 prr7과 이에 의해 코드되는 단백질 및 이를 이용한 대장암 진단 키트 | |
KR102242900B1 (ko) | Slc1a5 전사물 변이체를 이용한 항암용 조성물, 항암제 스크리닝 방법 및 암 진단 방법 | |
JP4660376B2 (ja) | 血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法 | |
CN114450067A (zh) | 人受试者的心力衰竭的治疗 | |
US20130171158A1 (en) | Treatment of abnormalities of glucose metabolism with an antagonist of inhibitor of differentiation 1 | |
KR20240053520A (ko) | Igf-1 수용체 결합 압타머 및 이의 용도 | |
KR101680335B1 (ko) | 상피세포 성장인자 수용체 압타머 및 이를 포함하는 항암제 조성물 | |
RU2811365C2 (ru) | Лечение сердечной недостаточности у человека | |
RU2794975C2 (ru) | Усовершенствованное соединение для лечения сердечной недостаточности | |
EP4382133A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating triple negative breast cancer, containing non-natural nucleic acid ligand as active ingredient | |
KR20220079459A (ko) | Kras 억제제에 대한 내성 억제용 조성물 | |
KR20230161769A (ko) | 전립선특이막항원에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 | |
KR20200112069A (ko) | 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 Jmjd2b 억제제의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |