JP4660376B2 - 血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明者らは、オキソ酸(oxonic acid)などのウリカーゼ阻害剤を投与することによりラットに温和な高尿酸血症を発症させるモデルを開発してきた。興味深いことに、これらの高尿酸血症モデルラットは、高血圧、糸球体血管障害、及び腎障害を発症する(非特許文献1〜6参照)。このメカニズムとしては、腎内部での結晶の析出が介在しているのではなく、むしろレニンアンジオテンシン系の活性化や緻密斑(遠位尿細管上皮にある密に集合して、濃厚に染色される細胞群で、傍糸球体細胞に直接接する。)の一酸化窒素合成酵素の阻害が関連していると考えられた(非特許文献1〜2参照)。そして、本発明者らは、この血管障害が血圧とは独立して起こることを報告してきた(非特許文献2参照)。
腎臓の細胞における研究により、尿酸トランスポーターは、有機アニオントランスポーター/エクスチェンジャー(OATファミリー)及び電位感受性チャンネルの両者を含むようなものであることが示されてきた(非特許文献9〜11参照)。OATファミリーのいくつかのもの、特にOAT1及びOAT3(基底外側の膜を経由する)並びにURAT1(管腔の膜を経由する)が、腎臓の細胞において尿酸塩の取り込みに介在していることが明らかにされてきた(非特許文献12〜15参照)。電位感受性チャンネル/トランスポーターのメカニズムも示され、推定されるトランスポーター(UAT)も同定された(非特許文献16〜18参照)。しかし、ラットのVSMCにおいて、これらのチャンネル/トランスポーターのどれが発現し、これらが機能しているのかどうかということについては、全く研究されていなかった。VSMCにおいて、どのような物質が尿酸の輸送担体として機能しているのかということは知られていなかった。
また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、URAT1の遺伝子の安定発現細胞系などのURAT1を発現している細胞系を用いて、尿酸の取り込み量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、URAT1の遺伝子の安定発現細胞系などのURAT1を発現している細胞系を用いて、当該細胞の増殖能を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法に関する。
さらに、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、URAT1の遺伝子の安定発現細胞系などのURAT1を発現している細胞系を用いて、当該細胞の単球走化性因子の産生量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法に関する。
血管平滑筋細胞(VSMC)における尿酸塩の取り込みを、分極又は非分極条件下で試験した。VSMCにおける20μMの14C−尿酸塩の取り込み量を、分極条件(HEPES−生理食塩水溶液)、又は非分極条件(100mM KCl取り込み溶液)のそれぞれの取り込み溶液において、120分間測定した。14C−尿酸塩の取り込み量は、各時間(分)毎に測定した。測定結果は、3個のウエルの平均±標準偏差で示す。その結果を図1に示す。図1の縦軸は14C−尿酸塩の取り込み量(CPM)を示し、横軸は時間(分)を示す。図1中の白四角印(□)は非分極条件の場合を示し、黒菱形印(◆)は分極条件の場合を示す。図1中のアスタリスク(*)は有意差(p<0.05)があることを示す。この結果、尿酸塩はラットVSMCに急速に取り込まれ、非分極条件では約15分で安定状態に達し、分極条件では約30分で安定状態に達することがわかる。また、全ての点で、非分極条件のほうが取り込み量が多いことが分かる。この結果は、VSMCが導電的な経路で尿酸塩を取り込んでいることを示している。
尿酸に対する特定の受容体は知られていない。したがって、尿酸の取り込みは何らかのトランスポーターを介して行われていると考えられる。尿酸のトランスポーターは、腎臓において何種類か存在していることが、既に報告されている。それらは、電位感受性の経路、及び有機アニオンの交換のにより介在されていることも報告されている(非特許文献9〜11参照)。この取り込みが非分極細胞により多くなることから(図1参照)、電位感受性トランスポーターの存在が示されている。
これらの結果は、VSMCには、尿酸塩、乳酸塩やPAHに親和性を有する有機アニオントランスポーターが存在していることを示している。
図7に示されるように、尿酸(UA)はラットVSMCにおける3H−チミジンの取り込み量を増加させ、そしてこの尿酸による3H−チミジンの取り込み量の増加は、プロベネシドの存在により濃度依存的に阻害された。尿酸の非存在下における、プロベネシド単独の存在では、細胞の増殖にほとんど影響を与えなかった。同様のことは、ベンズブロマロンについても観測された(図8参照)。
これらの結果から、VSMCにおける有機アニオン輸送システムを阻害することにより、尿酸により誘導される増殖やMCP−1の産生をブロックすることができることが示された。プロベネシドやベンズブロマロンなどの阻害剤は、単独で腎臓において尿酸排出剤として作用すると考えられていることから、これらの結果は注目される。しかし、これらの阻害剤は、VSMCにおいては、尿酸の直接的な作用のブロッカーとなるという、興味深い可能性が示されたことになる。
図11のAでは、腎臓のみにPCR産物が確認された。図11のBでは、462bpのPCR産物のバンドが腎臓と肝臓のみに確認され、加えて320bpのバンドが全てに見られるが、このバンドはブラストを用いた配列検索の結果、非特異的なものであった。図11のCでは腎臓と肝臓のみにPCR産物が確認された。図11のDでは、460bpのPCR産物のバンドが腎臓のみに確認され、加えて211bpのバンドが全てに見られるが、このバンドは配列分析の結果、非特異的なものであった。この結果、VSMCにおいては、これらのトランスポーターの発現を確認することができなかった。
RT−PCR(逆転写PCR)による、ヒト大動脈由来の血管平滑筋細胞(VSMC)における尿酸トランスポーターURAT1の検出実験を行った。この結果を図13に図面に代わる写真で示す。図13の左端及び右端のレーンMは100bpのDNAラダーを示し、レーン+Kは腎臓のcDNAを用いたものを示し、レーン−Kは腎臓のcDNAを用いなかったものを示している。また、レーン0はVSMCに何も付加しなかったものを示し、レーン3、6、9、及び12はそれぞれ、3mg/dl、6mg/dl、9mg/dl、12mg/dlの各濃度の尿酸によりVSMCを刺激した時の結果を示している。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、VSMCから得られたcDNAにおいて、PCR法によりURAT1の発現が認められた。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、VSMCから得られたcDNAにおいて、PCR法によりURAT1の発現が認められた。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、VSMCから得られた細胞溶解液において、抗URAT1抗体によりURAT1タンパク質が検出された。
また、本発明のURAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物としては、URAT1の拮抗剤、URAT1の阻害剤、URAT1のブロッカーなどのURAT1の尿酸の取り込み量を、これらの物質の存在により減少させることができる作用を有する物質であればよい。具体的には、例えば、プロベネシドやベンズブロマロンなどが挙げられる。
本発明の医薬組成物における有効成分の有効投与量は、疾患の状態や患者の状態により適宜判断されるが、通常は尿酸排出に十分な量が投与される。例えば、1日当たり1μg/kg〜50mg/kg程度の範囲で投与することもできる。
さらに、本発明は、URAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物の、血管障害や高血圧症や腎障害を治療、予防又は処置するための医薬組成物を製造するための使用を提供する。
この方法における尿酸としては、尿酸自体でもよいが、ナトリウムなどの尿酸塩であってもよい。
この方法における尿酸としては、尿酸自体でもよいが、ナトリウムなどの尿酸塩であってもよい。
この方法における尿酸としては、尿酸自体でもよいが、ナトリウムなどの尿酸塩であってもよい。
また、本発明によれば、被検化合物の存在下、又は非存在下において、URAT1の遺伝子の安定発現細胞系などのURAT1を発現している細胞系を用いて、尿酸の取り込み量、細胞の増殖能、及び/又は細胞の単球走化因子の産生量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングするための新たな方法が提供される。本発明の方法によれば、新しい抗高血圧薬や血管変性阻害による保護作用を有する新薬の開発が可能となる。
以下の実験で使用した血管平滑筋細胞(VSMC)は、ラットの大動脈から調製した(Zhang S,Yang Y,et al.,Circulation.,2003;107,1539−44)。この細胞を、10%子牛胎児血清(FBS)、1%グルタミン、及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(100ユニット/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン;GIBCO)を含有するダルベッコの修飾をしたイーグル培地(DMEM,GIBCO)で培養した。VSMCを35mmの6穴培養プレート(NUNC)に移し、湿式培養器(humidified tissue culture incubator)中で、5%炭酸ガス−95%空気の雰囲気下で37℃で保存した。培地を2日毎に交換した。実験に用いたVSMCは、5〜12世代のものであった。
VSMC(4×105細胞)を、10%FBS−DMEMと共に6穴培養プレートに移した。1日後に、血清の無いDMEM培地に終夜置いて成長を停止させた。各実験中は、細胞及び全ての溶液を37℃に維持した。VSMCを、8−14C−尿酸塩(比活性は50μCi/mmol;アメリカンラディオラベルド化学社製(セントルイス、MO))と共に培養し、尿酸塩の最終濃度を20μMにし、種々の阻害剤の存在下又は非存在下で培養した。取り込みの過程としては少し早いが、培養を5分間で停止した。この結果を図3及び図4に示す。
いくつかの実験では、放射性元素で標識化した尿酸塩の取り込み実験を、冷たい尿酸塩、乳酸塩、パラ−アミノ馬尿酸塩(PAH)などの他の有機アニオンの存在下、又は有機アニオントランスポーター阻害剤(プロベネシド又はベンズブロマロン)の存在下で行った。媒体(media)を急速に吸い取ることにより、取り込みを停止させ、すぐに氷冷したPBSで3回洗浄した。急速に吸い取られた培養溶液及び前記したように洗浄された細胞の全値からブランクが差し引かれた。次いで、細胞を、1N NaOHの1mlで15分間で溶解した。細胞に蓄積された8−14C−尿酸塩の量を、BCSシンチレーション溶液(アマーシャム社製)の5ml中へ0.5mlの細胞溶解液を加えて測定した。放射能を、溶液シンチレーションカウンターで測定した。取り込み量は、全cpm/ウエル、又は対照に対する百分率(%)で示される。この結果を図2、図5、及び図6に示す。
この結果を図1に示す。
VSMC(4×105細胞)を、10%FBS−DMEMと共に6穴培養プレートに移し、24時間培養した。次いで、0.5%FBS−DMEM中で48時間、細胞を飢餓状態にした。DNA合成を測定するために、静止状態のVSMCに、3H−チミジンの1μCiを含む3mg/dLの尿酸で48時間刺激した。細胞を採取する2時間前に、さらに2μCi/mLの3H−チミジンを各ウエルに添加した。細胞を氷冷したPBSで3回洗浄し、1mLの1N NaOHで溶解した。細胞に取り込まれた3H−チミジンの量を、5mLのシンチレーション溶液中へ0.5mlの細胞溶解液を加えて測定した。CPM/ウエルで示される3H−チミジンの取り込み量は、溶液シンチレーションカウンターで記録された。いくつかの実験では、種々の濃度のプロベネシド又はベンズブロマロン(有機アニオントランスポーター阻害剤)の存在下で実験を行った。この結果を図7及び図8に示す。
同様の方法で、VSMCの増殖を、有機アニオン(乳酸塩やPAH)を用いて評価した。
24穴プレートに細胞を取り(5×104細胞/ウエル)を、70%コンフルエンスの状態になったときに血清を取り除いた。次いで、1mMのプロベネシドの存在下、又は非存在下に、3mg/dLの尿酸を含有、又は含有していない培地を24時間加えた。上澄みのMCP−1タンパク質をELISA(OptEIA MCP−1セット、BDファーミンゲン社)で計測し、細胞数で補正した。実験は各々3回行った。この結果を、図10に示す。
RNeasy RNA精製キット(キアゲン社、バレンシア、CA)を用いてラットのVSMCから全RNAを調製した。オリゴテックスmRNA精製システム(キアゲン社)を用いてポリ(A)+RNAを単離し、ワンステップRT反応におけるランダムプライマーを用いて逆転写した。クロンテック社(パロアルト、CA)から販売されている腎臓及び肝臓のポリ(A)+RNAを陽性コントロールとして使用した。陰性コントロール反応を、DNAによる汚染をテストするためにプライマーを添加する前に逆転写酵素の熱不活性化により行った。以下のヌクレオチドセットを用いてPCR反応を行った。
784−810 5’−CTGTGCAGCCTATGCACCCAACTATAC−3’
アンチセンス鎖の1218−1190
5’−CCTTTGCTTAGAGTCAGTTCCTTCTGCAG−3’
642−672
5’−CCATCAACTACATCATGTTCGTAGTCACCCG−3’
アンチセンス鎖の1105−1076
5’−GATATGTCGGAGCTGAGATGTTCGGAACAG−3’
437−465 5’−GAGACACCATTGTGATAGAGTGGGACTTG−3’
アンチセンス鎖の920−889
5’−GATAGAACCAGCCAGCGTATGGACTCTGGTAC−3’
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アンチセンス鎖の768−739
5’−GAGTCTGTTGAAGAGGGTAGAGCAGTCTAC−3’
RNaseプロテクションアッセイ(RPA)を、RPAsIキット(トレイピネスバイオラボ社、ヒューストン、TX)を用いて、2〜4μgのRNAについて行った。ラットUAT(ジーンバンク、アクセッション番号:NM 012977)の5’末端から325番目までの325bp塩基からなるヌクレオチドを、pcDNA−UAT−EGFPにサブクローンした。このプラスミドをBamHI及びEcoRIで消化し、これをプラスミドpBluescriptにライゲートし、このプラスミドをpBS−UAT−325と命名した。このプラスミドをBamHIで消化して鎖状にし、α−32P[UTP]の存在下でT7RNAポリメラーゼを用いてリボプローブ(RNAプローブ)を合成した。
この結果を図12に示す。
結果を図13に示す。図13の、左端及び右端のレーンMは100bpのDNAラダーを示し、レーン+Kは腎臓のcDNAを用いたものを示し、レーン−Kは腎臓のcDNAを用いなかったものを示している。また、レーン0はVSMCに何も付加しなかったものを示し、レーン3、6、9、及び12はそれぞれ、3mg/dl、6mg/dl、9mg/dl、12mg/dlの各濃度の尿酸によりVSMCを刺激した時の結果を示している。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、VSMCから得られたcDNAにおいて、PCR法によりURAT−1の発現が認められた。
結果を図14に示す。図14の左端及び右端のレーンMは100bpのDNAラダーを示し、レーン+Kは腎臓のcDNAを用いたものを示し、レーン−Kは腎臓のcDNAを用いなかったものを示している。また、レーン0はVSMCに何も付加しなかったものを示し、レーン3、6、9、及び12はそれぞれ、3mg/dl、6mg/dl、9mg/dl、12mg/dlの各濃度の尿酸によりVSMCを刺激した時の結果を示している。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、VSMCから得られたcDNAにおいて、PCR法によりURAT−1の発現が認められた。
結果を図15に示す。図15の左端及び右端のレーンMは100bpのDNAラダーを示し、レーン+Kは腎臓のcDNAを用いたものを示し、レーン+EndoはHUVECから合成したcDNAを用いたものを示している。腎臓同様、HUVECから得られたcDNAにおいても、PCR法によりURAT−1の発現が認められた。
結果を図16に示す。図16のレーン0はVSMCに何も付加しなかったものを示し、レーン3、6、9、及び12はそれぞれ、3mg/dl、6mg/dl、9mg/dl、12mg/dlの各濃度の尿酸によりVSMCを刺激した時の結果を示している。図16のGAPDHは陽性コントロールを示す。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、VSMCから得られた細胞溶解液において、抗URAT−1抗体によりURAT−1タンパクが検出された。
配列番号2は、OAT1検出用のリバースプライマーである。
配列番号3は、OAT2検出用のフォーワードプライマーである。
配列番号4は、OAT2検出用のリバースプライマーである。
配列番号5は、OAT3検出用のフォーワードプライマーである。
配列番号6は、OAT3検出用のリバースプライマーである。
配列番号7は、RST1検出用のフォーワードプライマーである。
配列番号8は、RST1検出用のリバースプライマーである。
Claims (9)
- 被検化合物の存在下、又は非存在下において、血管平滑筋細胞系を用いて、URAT1を介した尿酸の取り込み量を測定することからなる、血管平滑筋細胞におけるURAT1を介した尿酸の取り込みに起因する血管障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法。
- 前記細胞系が、臍帯静脈上皮細胞系である請求項1に記載の方法。
- 前記細胞系の尿酸取り込み溶液中に、被検化合物を存在させたときのURAT1を介した尿酸の取り込み量を測定することからなる請求項1又は2に記載の方法。
- 血管平滑筋細胞系を用いて、尿酸塩の存在下での当該細胞の増殖能を測定し、被検化合物を添加した場合に、当該細胞の増殖能が低下する化合物をスクリーニングすることからなる、血管平滑筋細胞におけるURAT1を介した尿酸の取り込みに起因する血管障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法。
- 前記細胞系が、臍帯静脈上皮細胞系である請求項4に記載の方法。
- 細胞の増殖能の測定が、チミジンの取り込み量を測定することからなる請求項4又は5に記載の方法。
- 血管平滑筋細胞系を用いて、尿酸塩の存在下での当該細胞の単球走化性因子の産生量を測定し、被検化合物を添加した場合に、当該細胞の単球走化性因子の産生量が低下する化合物をスクリーニングすることからなる、血管平滑筋細胞におけるURAT1を介した尿酸の取り込みに起因する血管障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法。
- 前記細胞系が、臍帯静脈上皮細胞系である請求項6に記載の方法。
- 単球走化性因子が、MCP−1である請求項7又は8に記載の方法。
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