KR20160144480A

KR20160144480A - 개선된 재조합 인간 난포-자극 호르몬을 이용한 조절된 난소 과다자극

Info

Publication number: KR20160144480A
Application number: KR1020167031711A
Authority: KR
Inventors: 슈테펜 고레츠; 라르스 스퇴클
Original assignee: 글리코토페 게엠베하
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2016-12-16
Also published as: MX2016013449A; AU2015248793A1; BR112016023668A2; AR100132A1; WO2015158875A1; SG11201608132UA; IL248362A0; JP2017513853A; EP3131571A1; CA2945883A1; CN106413735A; US20170035854A1

Abstract

본 발명은 개선된 재조합 인간 난포-자극 호르몬(rhFSH)을 이용한 여성 대상체에서 조절된 난소 과다자극을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 여성 대상체에 투여되는 적은 양의 FSH에서도 많은 수의 수정 가능한 난모세포를 발생시킨다.

Description

개선된 재조합 인간 난포-자극 호르몬을 이용한 조절된 난소 과다자극{CONTROLLED OVARIAN HYPERSTIMULATION WITH IMPROVED RECOMBINANT HUMAN FOLLICLE-STIMULATING HORMONE}

발명의 분야

본 발명은 불임 치료의 분야에 관한 것이다. 특히, 개선된 재조합 인간 난포-자극 호르몬(rhFSH)을 이용한 조절된 난소 과다자극을 위한 방법이 제공된다. 본원에 기재된 방법은 통상적인 치료에서보다 적은 양의 FSH를 이용하여 치료된 여성에서 더 많은 수의 수정 가능한 난모세포를 발생시킨다.

발명의 배경

생식샘자극호르몬은 남성 및 여성에서 생식샘 기능을 조절함으로써 인간 생식능력에서 중요한 역할을 하는 단백질 호르몬의 군이다. 이들은 생식샘자극호르몬-방출 호르몬(GnRH)에 의한 자극 후에 척추동물의 뇌하수체의 생식샘자극세포에 의해 분비된다. 생식샘자극호르몬은 난포자극호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH) 및 융모생식샘자극호르몬(CG)을 포함하는 이종이합체 당단백질이다. 생식샘자극호르몬은 동일한 알파-서브유닛을 공유하나, 수용체 결합 특이성을 책임지는 다양한 베타-서브유닛을 포함한다.

FSH는 92개의 아미노산 알파-서브유닛 및 FSH 수용체에 대한 특이적 결합을 부여하는 111개의 아미노산 베타-서브유닛을 포함한다. 자연 단백질의 둘 모두의 서브유닛은 당화에 의해 변형된다. 알파-서브유닛은 Asn52 및 Asn78에서 자연 당화되고, 베타-서브유닛은 Asn7 및 Asn24에서 자연 당화된다. 둘 모두의 서브유닛은 전구체 단백질로서 세포에서 생성된 후, 가공되고, 분비된다. FSH는 신체의 발달, 성장, 사춘기 성숙, 및 생식 과정을 조절한다. 특히, 이는 종자 세포의 성숙을 자극하고, 이에 따라 정자발생 및 난포생성과 관련된다.

난포생성은 FSH, 예를 들어, 과립층 세포의 표면 상의 FSH 수용체에 대한 FSH의 결합에 의해 유도된다. FSH 수용체는 FSH의 결합 후에 커플링된 G 단백질을 활성화시키는 G 단백질-커플링된 수용체이다. 차례로, G 단백질은 아데닐릴 사이클라제를 활성화시켜, 이차 메신저 분자인 cAMP를 생성시킨다. 세포 내에서 증가하는 cAMP 농도는 여러 다운스트림 표적, 특히 cAMP 의존성 단백질 키나제를 활성화시키고, 이는 이후에 프로게스테론 및 에스트라디올의 합성을 발생시킨다. 프로게스테론 및 에스트라디올은 과립층 세포에 의해 분비되어, 난포생성을 유도한다. FSH에 의한 과립층 세포의 자극 후, 이들은 또한 음성 피드백 루프를 형성하는 인히빈-B를 방출하여, 뇌하수체에서 FSH의 생성 및 분비를 억제한다. 인히빈-B는 FSH에 의한 난소 자극에 대한 우수한 대용 마커(surrogate marker)인 것으로 밝혀졌다.

FSH는 단독으로 또는 다른 작용제, 특히 LH와 조합하여 불임의 치료에 널리 사용된다. 당 분야에서, 일반적으로 폐경후 인간 소변로부터 정제된 FSH(소변 FSH) 또는 차이니즈 햄스터 난소(CHO)에 의해 재조합적으로 생성된 FSH가 인간 치료에 사용되어 왔다. CHO 세포로부터 획득된 재조합 FSH가, 예를 들어, WO 03/035686 A2호에 개시되어 있다. 그러나, 다양한 아이소형(isoform)이 존재함에 따라 FSH 제조와 관련된 상당한 이질성이 존재한다. 개별적 FSH 아이소형은 동일한 아미노산 서열을 나타내지만, 이의 당화의 정도 및 특성에 있어서 다양하다. 특정 아이소형은 탄수화물 분지 구조의 이질성 및 다양한 양의 시알산(음성으로 하전된 말단 단당류 단위) 통합을 특징으로 하며, 상기 특징 둘 모두는 아이소형의 특정 생물활성에 영향을 미친다. 따라서, FSH의 당화 패턴은 이의 생물학적 활성에 대해 유의한 영향을 갖는다.

그러나, 다양한 공여자 및 다양한 제조로부터의 소변 FSH는 이의 탄수화물 구조에서 유의하게 다양할 수 있어, 높은 배치간 변화(batch-to-batch variation)를 발생시킨다. 소변 생성물 내의 바이러스의 존재에 대하여 안전성 우려가 또한 존재한다. 또한, CHO 세포로부터 획득된 FSH는 인간 당화 패턴과 동일하지 않은 상기 햄스터 세포에 특이적인 당화 패턴을 나타낸다. 이들 차이는 획득되는 FSH, 및 이에 따른 환자에게 투여되는 약학적 제조물의 다양한 생물학적 활성 및 유해한 효과를 발생시킨다. FSH 치료에 수반하는 유해한 부작용은, 예를 들어, 난소낭 형성, 난소 과다자극 증후군(OHSS), 다태임신, 안면홍조, 무기력한 기분(feeling down) 또는 민감한 기분(feeling irritable), 두통, 안절부절증, 구역, 구토, 숨참, 체액의 축적으로 인한 복부 팽만감, 복통 및 난소 비대를 포함한다.

최근에, 현저한 생물학적 및 약학적 특성을 나타내는 인간 골수성 백혈병 세포로부터 획득된 개선된 FSH가 개발되었다(WO 2012/017058 A1호 참조). 이러한 FSH 제조물은 매우 활성이며, 낮은 농도에서도 과립층 세포에서의 프로게스테론 및 에스트라디올의 분비를 활성화시킨다. 또한, 이러한 FSH는 임의의 안전성 우려 없이 인간 세포주에서 안정적으로 생성되는 완전한 인간 당화 패턴을 갖는다.

자연 수정을 지지하는 것 이외에, FSH 처리는 다수의 난포의 발달을 유도하기 위해 이용된다. 조절된 난소 과다자극의 상기 처리 주기를 이용하여, 여성 환자로부터 여러 성숙 난모세포가 획득될 수 있다. 난모세포의 회수 후, 이들은 시험관 내에서 수정되고, 여성 신체로 복귀된다. 그러나, 상기 보조 생식 기술(ART)에 대해, 높은 농도의 FSH 투여가 필요하며, 이는 유해한 부작용의 위험을 갖는다. 특히, 난소 과다자극 증후군이 불임 치료와 관련된 흔한 위험이다. 그러나, 투여되는 FSH의 양을 감소시키는 것은 또한 처리 주기 당 획득되는 난모세포의 수를 감소시키고, 그러므로, 성공적인 수정 및 자궁 내의 배아의 착상의 가능성을 감소시킨다.

따라서, 적은 양의 투여되는 FSH에서 많은 수의 유도되는 난모세포를 발생시키는 조절된 난소 과다자극을 위한 개선된 FSH 치료가 당 분야에 필요하다. 이에 비추어, 개선된 불임 치료를 제공하는 것이 본 발명의 한 목적이다.

발명의 개요

본 발명자는 최적화된 당화 패턴을 갖는 개선된 FSH 제조물이 적은 전체량의 FSH를 이용한 투여 요법을 이용하는 경우에도 우수한 난포 성장 및 많은 수의 성숙 난모세포를 유도할 수 있는 것을 발견하였다. 특히, 개선된 FSH 제조물이 상업적으로 이용 가능한 FSH 제조물을 이용한 일반적으로 이용되는 투여 요법에 비해 단지 절반의 양의 FSH가 투여되는 투여 요법에서 여성 대상체에서 다수의 난모세포의 발달을 자극하는 것이 입증되었다(실시예 2 참조). 확실히, 적어도 12 mm의 크기를 갖는 유도된 난포의 수, 환자로부터 회수된 난자 난구세포 복합체(COC)의 수, 환자로부터 회수된 수정 가능한 중기 II 난모세포의 수 및 성공적으로 수정된 난모세포(2 전핵(2PN) 난모세포)의 수가 CHO 세포로부터 획득된 상업적으로 이용 가능한 FSH 제조물인 Gonal-f의 더 많은 양을 투여받은 환자와 비교하는 경우 본원에 기재된 재조합 FSH 제조물을 투여받은 환자에 대해 증가된다. 더구나, 유도된 난포의 품질이 또한 개선된 FSH 제조물에 대해 우수하였는데, 이는 유도된 난포의 더 높은 백분율의 양이 Gonal-f에 의해 유도된 난포에 비해 성공적으로 수정될 수 있기 때문이다. 잉여 난모세포(2PN) 또는 배아의 냉동보존의 현재 이용 가능한 기술은 임신 클리닉이 또 다른 FSH 자극 주기 없이 이들 잉여 배아를 해동하고 이식함으로써 첫번째 이식이 임신을 발생시키지 않은 경우에서 이후의 배아 이식을 수행하는 것을 가능케 한다. 따라서, 더 많은 수의 수정된 난모세포가 증가된 수의 이식된 배아(자극 주기 당) 및 자궁 내의 배아의 착상에 대한 더 높은 확률을 직접 발생시킨다.

더구나, 2일마다 또는 그보다 덜한 FSH의 투여가 빈번히 또한 가능하고, 우수한 치료 결과를 발생시키는 것을 발견하였다. 이들 발견은 매우 예기치 않은 것이었는데, 이는 더 긴 투여 간격이 난포 성장에 대해 부정적인 영향을 갖는 것으로 간주되는 FSH 혈청 수준에서의 원치 않는 변동을 발생시키고, 난포의 성장 중지 또는 심지어 난포 크기의 감소를 발생시킬 수 있기 때문이다. 본 발명자는 확실히 2일마다 또는 그보다 덜하게 FSH를 종종 투여하는 경우에 환자에서 FSH의 혈청 수준에서의 유의한 변동을 관찰하였다(실시예 3 및 도 4 참조). 이들 변동은 예상된 것이었는데, 이는 본 발명에 따라 사용된 개선된 FSH가 CHO 세포로부터의 일반적으로 사용되는 재조합 FSH와 유사하고, 심지어 소변 FSH의 반감기보다 낮은 다소 낮은 순환 반감기를 갖기 때문이다(실시예 3 및 도 12 참조). 그러나, 종래의 가정과 대조적으로, 이들 변동은 난포 성장을 중지시키지 않았다. 오히려, 난포 성장이 동일한 개선된 FSH의 동등한 전체량의 매일 투여 또는 일반적으로 사용되는 FSH의 심지어 두배의 전체량의 매일 투여에 비해서도 심지어 향상된 것을 발견하였다(실시예 3 및 도 1 내지 9 참조). 이들 예기치 않은 우수한 치료 결과는 본원에 기재된 바와 같은 인간 당화 패턴을 갖는 변형되지 않은 FSH 제조물을 이용하여 획득되었다. 유전공학 처리된 FSH 또는 FSH 컨쥬게이트와 같은 인공적인 변형은 이용되지 않았다.

상기 발견에 비추어, 본 발명은 여성 대상체에서 다수의 난포의 발달을 자극하기 위한 조절된 난소 과다자극을 위한 방법을 제공하며, 여기서 재조합 FSH 제조물이 여성 대상체에 투여되고, 재조합 FSH 제조물은 (i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 20%의 상대량의 이등분면(bisecting) N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및 (ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산의 특징을 포함하는 당화 패턴을 갖는다.

첫번째 양태에서, 재조합 FSH 제조물은 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 35 내지 약 250 IU의 FSH의 평균량인 투여 요법을 이용하여 여성 대상체에 투여된다. 12 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포가 존재하고/하거나, 적어도 17 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우에 배란이 촉발된다. 이후, 다수의 난모세포가 여성 대상체로부터 획득되며, 여기서 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5개의 난모세포가 획득되고/되거나, 여성 대상체로부터 적어도 5개의 난모세포가 획득된다.

두번째 양태에서, 재조합 FSH 제조물이 동일한 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양의 80% 이하인 IU의 양으로 투여되는 투여 요법이 이용된다. 12 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포가 존재하고/하거나, 적어도 17 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우에 배란이 촉발된다. 이후, 다수의 난모세포가 여성 대상체로부터 획득되며, 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양을 이용한 유사한 치료에 비해 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5% 더 많은 난모세포가 획득된다.

더구나, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 FSH 제조물을 이용한 자극으로 인해 성장된 난포는 FSH 투여의 종료 후 유의한 시간 간격 동안 인체에서 이들의 크기를 유지하는 것으로 밝혀졌다(실시예 3 및 도 11 참조). 특히, 난포는 본질적으로 수일 동안 이들의 최대 크기로 유지된다. 대조적으로, 통상적인 FSH를 이용한 자극으로 인해 성장된 난포는 이들의 최대 크기에 도달한 지 1일 또는 2일 후에 신속히 퇴행된다. 이러한 퇴행으로 인해, 일반적인 치료에서, 최종 성숙 및 배란은 적은 시간 간격, 일반적으로 FSH 투여의 종료 1일 및 최대 36시간 후에 촉발되어야 한다. 본원에 기재된 바와 같은 유리한 재조합 FSH 제조물을 이용하여, 최종 성숙 및 배란은 FSH의 투여의 종료 6일 후까지 촉발될 수 있다. 이는 훨씬 더 큰 유연성을 갖는 불임 치료를 제공한다. 특히, 이후의 단계, 예를 들어, 배란 촉발 및 난모세포 회수를 스케줄링하고, 계획하고, 구성하는 것이 본원에 기재된 바와 같은 재조합 FSH 제조물을 이용하여 크기 개선되고 간소화된다.

이에 비추어, 본 발명은 재조합 FSH 제조물을 투여함으로써 여성 대상체에서 난포 성장을 유도하거나 향상시키는 단계, 및 이후 재조합 FSH 제조물의 투여 종료 적어도 48시간 후에 개시되는 배란을 촉발시키는 단계를 포함하는, 여성 대상체에서 난포 성숙을 자극하기 위한 방법을 세번째 양태에서 제공하며, 여기서 제조물 내의 재조합 FSH는 (i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 20%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및 (ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산의 특징을 포함하는 당화 패턴을 갖는다.

본 발명의 다른 목적, 특징, 장점 및 양태는 하기 기재 및 첨부된 청구항으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 출원의 바람직한 구체예를 나타내는 하기 기재, 첨부된 청구항, 및 특정 예는 단지 예시로 제공되는 것이 이해되어야 한다. 개시된 본 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형은 하기의 기재로부터 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 개선된 당화 패턴을 갖는 본원에 기재된 재조합 FSH 제조물이 통상적인 FSH 제조물, 예를 들어, CHO-유래된 FSH, 예를 들어, Gonal-f와 비교하는 경우 대상체로 투여되는 FSH의 적은 양에도 여성 대상체에서 많은 수의 큰 난포의 성장을 유도할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 특히, FSH의 양 절반을 이용하여, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 FSH 제조물은 표준적인 양으로 사용되는 CHO 세포에서 생성된 FSH에 비해 난포 성장에서 유사하거나 심지어 더 나은 결과를 발생시킨다.

이들 발견에 비추어, 본 발명은,

(a) 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 35 내지 약 250 IU의 FSH의 평균량인 투여 요법을 이용하여 재조합 FSH 제조물을 여성 대상체에 투여하는 단계;

(b) 12 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포가 존재하고/하거나, 적어도 17 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우 배란을 촉발시키는 단계;

(c) 여성 대상체로부터 다수의 난모세포를 획득하는 단계로서, 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5개의 난모세포가 획득되고/되거나, 여성 대상체로부터 적어도 5개의 난모세포가 획득되는, 단계를 포함하는, 여성 대상체에서 다수의 난포의 발달을 자극하기 위한 조절된 난소 과다자극을 위한 방법을 첫번째 양태에서 제공하며,

제조물 내의 재조합 FSH는,

(i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 20%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및

(ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산의 특징을 포함하는 당화 패턴을 갖는다.

두번째 양태에서, 본 발명은,

(a) 재조합 FSH 제조물이 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양의 80% 이하인 IU의 양으로 투여되는 투여 요법을 이용하여 재조합 FSH 제조물을 여성 대상체에 투여하는 단계;

(c) 여성 대상체로부터 다수의 난모세포를 획득하는 단계로서, 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양을 이용한 유사한 치료에 비해 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5% 더 많은 난모세포가 획득되는 단계를 포함하는, 여성 대상체에서 다수의 난포의 발달을 자극하기 위한 조절된 난소 과다자극을 위한 방법을 제공하며,

제조물 내의 재조합 FSH는,

세번째 양태에서, 본 발명은,

(a) 재조합 FSH 제조물을 투여함으로써 여성 대상체에서 난포 성장을 유도하거나 향상시키는 단계; 및

(b) 이후, 배란을 촉발시키는 단계를 포함하는, 여성 대상체에서 난포 성숙을 자극하기 위한 방법을 제공하며,

제조물 내의 재조합 FSH는,

(ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산의 특징을 포함하는 당화 패턴을 갖고,

단계 (b)에서의 배란 촉발은 단계 (a)에서의 재조합 FSH 제조물의 투여 종료 적어도 48시간 후에 개시된다.

재조합 FSH

"FSH 제조물"은 FSH를 포함하거나 이로 구성되는 임의의 조성물 또는 물질일 수 있다. 이는 고체 또는 유체 형태로 존재할 수 있고, FSH에 더하여 추가 성분을 포함할 수 있다. 특히, FSH 제조물은 FSH 및 적합한 용매, 예를 들어, 물 및/또는 알콜을 포함하는 용액, 또는, 예를 들어, FSH를 함유하는 용액의 동결건조 후에 획득된 분말일 수 있다. FSH 제조물의 적합한 예는 세포에서의 FSH의 발현 후, 특히 FSH의 정제 후에 획득된 조성물, 또는 FSH를 포함하는 약학적 조성물이다. FSH 제조물은 FSH에 더하여, 예를 들어, 용매, 희석제, 부형제, 안정화제, 보존제, 염, 애쥬번트 및/또는 계면활성제를 함유할 수 있다. 용어 "FSH 제조물"은, 특히 "FSH를 포함하는 조성물"의 의미로 본원에서 사용된다. 이들 용어는 바람직하게는 본원에서 동의어로 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "FSH"는 난포-자극 호르몬인 생식샘자극호르몬을 나타낸다. FSH는 2개의 서브유닛인 표지된 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된 당단백질이다. 바람직하게는, FSH는 인간 FSH, 특히 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 알파 서브유닛 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 베타 서브유닛으로 구성된 인간 FSH이다. 그러나, 하나 이상, 예를 들어, 1개, 1개 또는 2개, 3개 이하, 5개 이하, 10개 이하 또는 20개 이하의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실이 하나 또는 둘 모두의 서브유닛에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 알파 서브유닛의 아미노산 서열은 이의 전장에 걸쳐 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 전체 상동성 또는 동일성을 공유한다. 또한, 베타 서브유닛의 아미노산 서열은 바람직하게는 이의 전장에 걸쳐 SEQ ID NO:2에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 전체 상동성 또는 동일성을 공유한다. FSH의 서브유닛은 바람직하게는 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬이나, 본원에서 사용되는 용어 "FSH"는 또한 2개의 서브유닛이, 예를 들어, 가교제 또는 연결 폴리펩티드 사슬에 의해 서로 공유적으로 부착되는 구체예, 및 하나 또는 둘 모두의 서브유닛이 여러 폴리펩티드 사슬로 추가로 나누어지는 구체예를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 FSH는 FSH 수용체, 바람직하게는 인간 FSH 수용체에 결합하고/하거나 이를 활성화시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "FSH"는 특히 제조물 내의 모든 FSH 단백질을 나타낸다. 따라서, 용어 "FSH"는 특히 FSH 제조물 또는 조성물 내의 모든 FSH 단백질의 전체를 나타낸다.

본 발명에 따른 FSH는 당화되며, 즉, 이는 폴리펩티드 사슬에 부착된 하나 이상, 바람직하게는 4개의 올리고당류에 의해 변형된다. 글리칸, 탄수화물 또는 탄수화물 구조로도 언급되는 이들 올리고당류는 선형 또는 분지형 당류 사슬일 수 있고, 바람직하게는 복합체-타입의 N-결합된 올리고당류 사슬이다. 분지의 수에 따라, 올리고당류는 모노안테나리, 바이안테나리, 트리안테나리 또는 테트라안테나리(또는 심지어 펜타안테나리)로 언급된다. 모노안테나리 올리고당류는 분지되지 않으며, 즉, 이는 분지 포인트를 갖지 않고 단지 하나의 안테나를 포함하는 반면, 바이안테나리, 트리안테나리 또는 테트라안테나리 올리고당류는 1개, 2개 또는 3개의 분지 포인트를 갖고, 그러므로 각각 2개, 3개 또는 4개의 안테나를 갖는다. 따라서, 더 높은 안테나성(antennarity)을 갖는 당단백질은 더 많은 올리고당류 종점을 가지며, 더 많은 기능성 말단 당류 단위, 예를 들어, 시알산을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "적어도 트리안테나리"는 트리안테나리, 테트라안테나리 및 펜타안테나리 올리고당류를 포함하는 적어도 3의 안테나성을 갖는 올리고당류를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "적어도 테트라안테나리"는 테트라안테나리 및 펜타안테나리 올리고당류를 포함하는 적어도 4의 안테나성을 갖는 올리고당류를 나타낸다. 복합체-유형의 N-글리칸과 관련하여, 이등분면 GlcNAc 잔기는 바람직하게는 분지 또는 안테나로 간주되지 않으며, 따라서 FSH의 안테나성에 추가되지 않는다. 글리칸 구조의 용어 "분지" 및 "안테나"는 본원에서 동의어로 사용된다.

본원에 언급된 바와 같은 FSH의 당화 패턴은 특히 본 발명에 따른 FSH 제조물 내의 모든 FSH 단백질의 전체 당화 패턴을 나타낸다. 특히, FSH 단백질에 포함되고, 이에 따라 FSH 제조물 내의 FSH 폴리펩티드 사슬에 부착되는 임의의 글리칸 구조가 고려되며, 당화 패턴에서 반영된다.

바람직하게는, FSH 단백질의 둘 모두의 서브유닛은 폴리펩티드 사슬에 부착된 하나 이상의 탄수화물 구조를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 탄수화물 구조는 서브유닛의 아스파라긴 잔기에 부착된다. 특히 바람직한 구체예에서, 알파 서브유닛은 바람직하게는 SEQ ID NO:1에 따른 알파 서브유닛의 인간 아미노산 서열의 Asn52 및 Asn78에 해당하는 아스파라긴 잔기에 부착된 2개의 탄수화물 구조를 포함하고/하거나, 베타-서브유닛은 바람직하게는 SEQ ID NO:2에 따른 베타 서브유닛의 인간 아미노산 서열의 Asn7 및 Asn24에 해당하는 아스파라긴 잔기에 부착된 2개의 탄수화물 구조를 포함한다. 특정 구체예에서, 알파 서브유닛은 2개 이하의 탄수화물 사슬을 포함하고, 베타 서브유닛은 2개 이하의 탄수화물 사슬을 포함하며, 이들은 바람직하게는 상기 언급된 아스파라긴 잔기에 부착된다. 이러한 구체예에서, 추가의 당화 부위 및 특히 인공적으로 도입된 당화 부위가 FSH의 아미노산 서열에 존재하지 않는다. 인간 FSH의 탄수화물 부분은 바람직하게는 푸코스, 갈락토스, 만노스, 갈락토사민, (N-아세틸) 글루코사민, 및/또는 시알산 잔기로 구성된다. 특히, 인간 FSH의 탄수화물 부분은 본질적으로 N-아세틸 글루코사민, 만노스, 갈락토스, 시알산, 푸코스 및 설페이트 잔기로 구성된다.

본 발명에 따라 사용되는 FSH는 재조합 FSH, 바람직하게는 재조합 인간 FSH이다. 용어 "재조합 FSH"는 살아있는 인간 또는 동물 신체에 의해 자연 생성되지 않고, 인간 또는 동물 신체로부터 유래된 샘플, 예를 들어, 인간 또는 동물 신체의 소변, 혈액 또는 다른 체액, 배설물 또는 조직으로부터 획득되는 FSH를 나타낸다. 바람직하게는, 재조합 FSH는 생물공학적으로 조작된 세포, 특히 FSH를 인코딩하는 핵산 또는 FSH의 알파 또는 베타 서브유닛으로 형질전환되거나 트랜스펙션된 세포로부터 획득된다. 바람직한 구체예에 따르면, 재조합 FSH는 FSH를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 인간 숙주 세포로부터 획득된다. 각각의 외인성 핵산은, 예를 들어, 숙주 세포로 도입될 수 있는 하나 이상의 발현 벡터를 이용함으로써, 예를 들어, 트랜스펙션을 통해 도입될 수 있다. 재조합적으로 생성되는 단백질 및 FSH에 대한 각각의 방법은 종래 분야에 널리 공지되어 있고, 따라서 추가 설명이 필요 없다. 또한, 재조합적으로 생성되는 FSH에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된다.

본 발명에 따른 FSH 제조물은 본 발명의 FSH 제조물과 일반적으로 사용되는 FSH 제조물, 특히 CHO 세포에서 생성되거나 인간 소변으로부터 획득되는 FSH 제조물을 또한 구별하는 이의 당화 패턴을 특징으로 한다.

바람직한 구체예에서, 제조물 내의 재조합 FSH는 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 20%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸을 갖는다. bisGlcNAc를 갖는 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 23%, 적어도 25%, 적어도 27% 또는 적어도 30%이다. 더욱 바람직하게는, 이는 약 20% 내지 약 50%의 범위, 특히 약 25% 내지 약 40%의 범위 또는 약 28% 내지 약 35%의 범위 내이다.

본 발명에 따른 "글리칸의 상대량"은 FSH 제조물의 FSH 당단백질에 부착된 글리칸의 특정 백분율 또는 백분율 범위를 나타낸다. 특히, 글리칸의 상대량은 FSH 단백질에 포함되고, 이에 따라 FSH 제조물 내의 FSH 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 특정 백분율 또는 백분율 범위를 나타낸다. 100%의 글리칸은 FSH 제조물의 FSH 당단백질에 부착된 모든 글리칸을 나타낸다. 예를 들어, 60%의 상대량의 이등분면 GlcNAc를 갖는 글리칸은 FSH 단백질에 포함되고, 이에 따라 상기 FSH 제조물 내의 FSH 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 60%가 이등분면 GlcNAc 잔기를 포함하는 한편, FSH 단백질에 포함되고, 이에 따라 상기 FSH 제조물 내의 FSH 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 40%가 이등분면 GlcNAc 잔기를 포함하지 않는 FSH 제조물을 나타낸다.

특정 구체예에서, 제조물 내의 재조합 FSH는 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 2%의 상대량의 황산화된 글리칸을 갖는다. 바람직하게는, 설페이트 기를 갖는 글리칸(황산화된 글리칸)의 상대량은 적어도 2.5%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 또는 적어도 6%, 더욱 바람직하게는 적어도 7% 또는 적어도 8%이다. 한 구체예에 따르면, 설페이트 기를 갖는 글리칸의 상대량은 50%를 초과하지 않고, 바람직하게는 이는 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하 또는 20% 이하이다.

제조물 내의 재조합 FSH의 당화 패턴은 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 80%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸을 포함할 수 있다. 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 83%, 적어도 85% 또는 적어도 88%이고, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸의 상대량은 약 85% 내지 약 98%의 범위 또는 약 88% 내지 약 95%의 범위 내, 가장 바람직하게는 약 90%이다. 용어 "시알산"은 특히 뉴라민산의 임의의 N-치환된 또는 O-치환된 유도체를 나타낸다. 이는 5-N-아세틸뉴라민산(NeuNAc) 및 5-N-글리콜릴뉴라민산(NeuGc) 둘 모두를 나타낼 수 있으나, 바람직하게는 5-N-아세틸뉴라민산만을 나타낸다. 시알산, 특히 5-N-아세틸뉴라민산은 바람직하게는 2,3-결합 또는 2,6-결합을 통해 탄수화물 사슬에 부착된다. 바람직하게는, 본원에 기재된 FSH 제조물에서, 2,3-커플링된 시알산 뿐만 아니라 2,6-커플링된 시알산 둘 모두가 존재한다.

바람직한 구체예에서, 제조물 내의 재조합 FSH의 당화 패턴은 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산을 갖는다. "2,6-커플링된 시알산의 상대량"은 2,6-커플링된 시알산인 전체량의 시알산의 특정 백분율 또는 백분율 범위를 나타낸다. 따라서, 100%의 2,6-커플링된 시알산의 상대량은 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸 상에서 발견되는 모든 시알산이 2,6-커플링된 시알산인 것을 의미한다. 예를 들어, 60%의 2,6-커플링된 시알산의 상대량은 FSH 단백질에 포함되고, 이에 따라 상기 FSH 제조물 내의 FSH 단백질의 올리고당류 사슬에 부착된 모든 시알산의 60%가 2,6-결합을 통해 부착되는 반면, FSH 단백질에 포함되고, 이에 따라 상기 FSH 제조물 내의 FSH 단백질의 올리고당류 사슬에 부착된 모든 시알산의 40%가 2,6-결합을 통해 부착되지 않고, 예를 들어, 2,3-결합 또는 2,8-결합을 통해 부착되는 FSH 제조물을 나타낸다. 바람직하게는, 제조물 내의 재조합 FSH 중 2,6-커플링된 시알산의 상대량은 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 53%, 적어도 55%, 적어도 60% 또는 적어도 65%, 특히 약 40% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 75% 또는 약 53% 내지 약 70%의 범위 내이다. 바람직하게는, 2,6-커플링된 시알산 대 2,3-커플링된 시알산의 비는 약 2:3 내지 약 10:1, 더욱 바람직하게는 약 2:3 내지 약 5:1 또는 약 1:1 내지 약 2:1, 가장 바람직하게는 약 1:1 내지 약 3:2의 범위 내이다. 바람직한 구체예에서, 2,6-커플링된 시알산의 상대량은 2,3-커플링된 시알산의 상대량을 초과한다.

FSH의 시알화의 정도는 또한 Z-수로 표현될 수 있다. Z-수는 당단백질의 글리칸 구조의 상대 음성 전하를 나타낸다. Z-수는 하기 식에 의해 계산된다:

Z = A1% * 1 + A2% * 2 + A3% * 3 + A4% * 4

상기 식에서, A1%는 -1의 전하를 갖는 글리칸의 백분율이고, A2%는 -2의 전하를 갖는 글리칸의 백분율이고, A3%는 -3의 전하를 갖는 글리칸의 백분율이고, A4%는 -4의 전하를 갖는 글리칸의 백분율이다. 이들 백분율은 하전된 글리칸 뿐만 아니라 하전되지 않은 글리칸을 포함하는 FSH에 부착된 모든 글리칸과 관련하여 계산된다. 글리칸의 전하는 글리칸에 포함된 임의의 하전된 단당류 단위 또는 치환기, 특히 시알산 잔기 및/또는 설페이트기 및/또는 포스페이트기에 의해 제공될 수 있다. FSH의 글리칸의 전하는 일반적으로 이들의 시알산 잔기에 의해서만 결정되고, FSH는 일반적으로 4개의 글리칸 구조를 가지므로, Z-수는 FSH 상의 시알산의 양 또는 FSH의 산도에 대한 지표이다. 그러나, FSH가 또한 유의한 양의 황산화된 글리칸을 포함하는 경우, Z-수는 시알산 및 설페이트 기의 조합된 양에 대한 지표이다.

조성물 내의 재조합 FSH는 바람직하게는 적어도 200의 Z-수를 갖는다. Z-수는 바람직하게는 적어도 210, 더욱 바람직하게는 적어도 215 또는 적어도 220이다. 더 높은 Z-수는, 예를 들어, 산성 및/또는 음성으로 하전된 FSH 단백질에 대해 숙주 세포로부터 획득된 FSH 제조물을 농축시킴으로써 획득 가능하다.

특정 구체예에서, 제조물 내의 재조합 FSH의 당화 패턴은 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 15%의 상대량의 적어도 테트라안테나리 글리칸을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 테트라안테나리 글리칸의 상대량은 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18% 또는 적어도 19%, 더욱 바람직하게는 적어도 20% 또는 적어도 21%이다. 적어도 테트라안테나리 글리칸의 상대량은, 예를 들어, 10% 내지 50%, 바람직하게는 12% 내지 40%, 더욱 바람직하게는 15% 내지 35% 또는 17% 내지 30%의 범위 내일 수 있다. 적어도 트리안테나리 글리칸, 특히 트리안테나리 및 테트라안테나리 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 45%이다. 적어도 트리안테나리 글리칸의 상대량은, 예를 들어, 20% 내지 70%, 바람직하게는 30% 내지 65%, 더욱 바람직하게는 35% 내지 60% 또는 40% 내지 55%의 범위 내일 수 있다.

추가의 구체예에서, 제조물 내의 재조합 FSH의 당화 패턴은 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 90%의 상대량의 갈락토스를 갖는 글리칸을 추가로 포함할 수 있다. 갈락토스를 갖는 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 95% 또는 적어도 97%이고, 가장 바람직하게는 약 98%이다. 갈락토스를 갖는 글리칸의 상기 상대량은 글리칸 구조의 적어도 하나의 분지 또는 안테나 상에 갈락토스 잔기를 갖는 모든 글리칸을 나타낸다. FSH의 글리칸 구조는 일반적으로 하나 초과의 분지, 특히 3개 또는 4개의 분지를 가지므로, 갈락토스 단위를 갖거나 갖지 않는 분지의 수가 또한 결정될 수 있다. 바람직하게는, 시알산 잔기에 의해 임의로 변형된 갈락토스 단위를 갖는 글리칸 분지의 상대량은 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸의 모든 글리칸 분지의 적어도 65%, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 73%이다. 이는 바람직하게는 약 60% 내지 약 95%의 범위 내, 더욱 바람직하게는 약 70% 내지 약 80%의 범위 내이다.

특정 구체예에서, 제조물 내의 재조합 FSH의 당화 패턴은 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 20%의 상대량의 코어 푸코스를 갖는 글리칸을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 코어 푸코스를 갖는 글리칸의 상대량은 적어도 25%, 적어도 30% 또는 적어도 35%이다. 이는 약 30% 내지 약 60%의 범위 내, 특히 약 35% 내지 약 50%의 범위 내일 수 있다. 본 발명에 따른 "코어 푸코스"는 N-결합된 탄수화물 사슬의 환원 말단의 N-아세틸갈락토사민(GlcNAc) 잔기, 즉, FSH의 폴리펩티드 사슬에 직접 부착된 N-아세틸갈락토사민 잔기에 부착된 푸코스 잔기를 나타낸다. 코어 푸코스 잔기는 바람직하게는 α1,6-결합을 통해 GlcNAc 잔기에 연결된다. 코어 푸코스 잔기는 외부 아암(arm) 푸코스 잔기에 반대된다. 본원에 언급되는 바와 같은 "외부 아암 푸코스"는 N-결합된 탄수화물 사슬의 분지 또는 안테나에 부착되는 푸코스 잔기를 의미한다. 특히, 외부 아암 푸코스는 바람직하게는 α1,3-결합을 통해 안테나에 존재하는 GlcNAc 잔기에 부착된다. 특정 구체예에서, 제조물 내의 재조합 FSH의 당화 패턴은 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 5% 이하의 상대량의 외부 아암 푸코스를 갖는 글리칸을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 외부 아암 푸코스를 갖는 글리칸의 상대량은 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하이다. 이는 약 0% 내지 약 5%의 범위 내, 특히 약 0% 내지 약 2%의 범위 내일 수 있다. 특정 구체예에서, 제조물 내의 재조합 FSH는 검출 가능한 양의 외부 아암 푸코스를 포함하지 않는다.

특정 구체예에서, 제조물 내의 재조합 FSH는 다양한 당화 패턴을 갖는다. 용어 "다양한 당화 패턴"은 특히 당화 패턴이 다수의 상이한 글리칸 구조를 포함하는 제조물 또는 조성물 내의 FSH 단백질의 당화 패턴을 나타낸다. 상이한 글리칸 구조는 적어도 하나의 단당류 단위 및/또는 적어도 하나의 화학적 변형, 예를 들어, 설페이트 잔기, 아세틸 잔기 등의 존재/부재, 양 및/또는 위치에 있어서 상이한 올리고당류 구조이다. 특정한 "상이한 글리칸 구조"는 바람직하게는 이와 관련하여 이의 상대량이 당화 패턴 내의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.02%, 더욱 바람직하게는 적어도 0.03%, 적어도 0.05%, 적어도 0.07%, 적어도 0.1%, 적어도 0.15%, 적어도 0.2%, 적어도 0.25%, 적어도 0.3% 또는 적어도 0.5%인 경우에만 고려된다. 다양한 당화 패턴은 특히 적어도 5개의 상이한 글리칸 구조를 포함하는 당화 패턴이다. 바람직하게는, 다양한 당화 패턴은 적어도 7개, 더욱 바람직하게는 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 가장 바람직하게는 적어도 60개의 상이한 글리칸 구조를 포함한다. 한 구체예에 따르면, 다양한 당화 패턴은 특히 당화 패턴이 각각의 제조물 또는 조성물 내의 CHO 세포로부터 획득된 FSH보다 많은 상이한 글리칸 구조를 포함하는 제조물 또는 조성물 내의 FSH의 당화 패턴을 또한 나타낸다. 특히, 당화 패턴은 CHO 세포로부터 획득된 FSH보다 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 100% 더 많은 상이한 글리칸 구조를 포함한다. 특정 구체예에서, 제조물 내의 FSH는 바람직하게는 제조물 내의 FSH가 적어도 45개 또는 바람직하게는 적어도 50개의 상이한 글리칸 구조를 포함하고, 상이한 글리칸 구조의 각각 하나가 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.05%의 상대량을 갖는 다양한 당화 패턴을 갖는다. 한 구체예에 따르면, 제조물 내의 FSH는 적어도 35개 또는 바람직하게는 적어도 40개의 상이한 글리칸 구조를 포함하며, 상이한 글리칸 구조의 각각 하나는 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.1%의 상대량을 갖고/갖거나; 제조물 내의 FSH는 적어도 20개 또는 바람직하게는 적어도 25개의 상이한 글리칸 구조를 포함하며, 상이한 글리칸 구조의 각각 하나는 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.5%의 상대량을 갖는다. 추가의 구체예에서, 제조물 내의 FSH는 상응하는 제조물 내의 CHO 세포로부터 획득된 FSH보다 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50% 더 많은 상이한 글리칸 구조를 포함하며, 상이한 글리칸 구조의 각각 하나는 각각의 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.05%, 0.1% 또는 0.5%의 상대량을 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "CHO"는 바람직하게는 CHO 세포주 CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096]를 나타낸다.

특정 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 N-글리콜릴 뉴라민산(NeuGc) 또는 검출 가능한 양의 NeuGc를 포함하지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 또한 갈릴리(Galili) 에피토프(Galα1,3-Gal 구조) 또는 검출 가능한 양의 갈릴리 에피토프를 포함하지 않는다.

본 발명은 특히 인간 당화 패턴을 갖는 FSH를 제공한다. 인간 당화 패턴은 특히 인체에 의해 생성되는 자연 인간 당단백질에서 또한 발견될 수 있는 글리칸 구조만 포함하는 당화 패턴이다. 이들 당화 특성으로 인해, 부작용을 유도할 수 있는 외래 면역원성 비-인간 구조가 부재하며, 이는 특정 외래 당 구조, 예를 들어, 둘 모두가 설치류 생성 시스템에 대해 공지된 면역원성 비-인간 시알산(NeuGc) 또는 갈릴리 에피토프(Gal-Gal 구조), 또는, 예를 들어, 효모 시스템으로부터 공지된 바와 같은 면역원성 고-만노스 구조와 유사한 다른 구조에 의해 야기되는 것으로 공지된 원치 않는 부작용 또는 불이익이 회피되는 것을 의미한다.

특정 구체예에서, 본 발명에 따른 제조물 내의 재조합 FSH의 당화 패턴은 하기 특징 중 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상 또는 3개 이상, 가장 바람직하게는 전부를 포함한다:

(i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 약 25% 내지 약 50%의 범위 내의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸;

(ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 6%의 상대량의 황산화된 글리칸;

(iii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 53%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산;

(iv) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 88%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸;

(v) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 16%의 상대량의 적어도 테트라안테나리 글리칸; 및

(vi) 적어도 210의 Z-수를 갖는 FSH.

추가의 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 하기 특징 중 하나 이상, 바람직하게는 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 전부를 포함한다:

(i) 이는 인간 재조합 FSH이고/이거나;

(ii) 이는 인간 세포주 또는 인간 세포에 의해 생성되고/되거나;

(iii) 이는 다양한 당화 패턴을 갖고, 바람직하게는 적어도 20개의 상이한 글리칸 구조를 포함하며, 상이한 글리칸 구조의 각각 하나는 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.1%의 상대량을 갖는다.

특히, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 하기 특징 중 하나 이상, 바람직하게는 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 적어도 3개 또는 적어도 4개, 가장 바람직하게는 전부를 포함하는 당화 패턴을 갖는다:

(ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 약 53% 내지 약 80%의 범위 내의 상대량의 2,6-커플링된 시알산;

(iii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 약 6% 내지 약 25%의 범위 내의 상대량의 설페이트 기를 갖는 글리칸;

(iv) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 5% 이하의 상대량의 외부 아암 푸코스를 갖는 글리칸;

(v) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 30%의 상대량의 코어 푸코스를 갖는 글리칸;

(vi) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 16%의 상대량의 적어도 테트라안테나리 글리칸;

(vii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 88%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸;

(viii) 적어도 210의 Z-수;

(ix) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 95%의 상대량의 갈락토스를 갖는 글리칸;

(x) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 분지 중 적어도 60%의 상대량의 시알산 잔기에 의해 임의로 변형된 갈락토스 단위를 갖는 글리칸 분지;

(xi) 상이한 글리칸 구조의 각각 하나가 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.05%의 상대량을 갖는 적어도 45개의 상이한 글리칸 구조를 포함함;

(xii) 상이한 글리칸 구조의 각각 하나가 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.1%의 상대량을 갖는 적어도 35개의 상이한 글리칸 구조를 포함함; 및/또는

(xiii) 상이한 글리칸 구조의 각각 하나가 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.5%의 상대량을 갖는 적어도 20개의 상이한 글리칸 구조를 포함함.

특정한 바람직한 구체예에서, 재조합 FSH 제조물은 하기 표 1에 나열된 당화 패턴 중 하나를 갖는다:

표 1: 특정한 당화 파라미터

하기 특성을 갖는 글리칸의 상대량이 제시된다:

B: 이등분면 GlcNAc; 2,6-S: 2,6-커플링된 시알산; 설페이트: 황산화된 글리칸; S>0: 적어도 하나의 시알산; Z: Z 수; 테트라: 적어도 테트라안테나리 글리칸

표 1에 나열된 구체예 1 내지 12에서, 바람직하게는 이등분면 GlcNAc의 상대량은 적어도 20% 대신 적어도 25%이고/이거나; 2,6-커플링된 시알산의 상대량은 바람직하게는 적어도 53% 대신 적어도 55%이고/이거나; 황산화된 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 2.5% 대신 적어도 3%, 더욱 바람직하게는 적어도 8%이다. 표 1에 나열된 당화 패턴은 바람직하게는 인간 당화 패턴이고/이거나, NeuGc 및 갈릴리 에피토프를 포함하지 않는다.

특정 구체예에서, FSH는 비자연 분자, 특히 재조합 생성을 위해 사용되는 숙주 세포에 의해 이에 부착되지 않는 분자에 의해 변형되지 않는다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 FSH는 분자, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 하이드록시에틸 전분 또는 FSH의 반감기를 연장시키기 위해 사용되는 다른 분자를 포함하지 않거나, 이에 컨쥬게이션되지 않는다. 이들 분자는 특히 인체 내의 FSH의 순환 반감기를 인공적으로 증가시키기 위해 종래 기술에서 사용된다. 그러나, 이들 접근법은 문제가 되는데, 이는 FSH에 부착된 중합체 물질 또는 이들의 분해 생성물이, 예를 들어, 독성이 되거나 원치 않는 면역 반응을 야기시킴에 의해 환자에서 유해한 반응을 야기시킬 수 있기 때문이다. 또한, 높은 순환 반감기는 FSH가 치료 종료 후 장기간 동안 인체에 남아 있도록 할 수 있다. 그러므로, 조절된 치료는 높은 순환 반감기를 갖는 FSH를 이용하여 달성하기가 훨씬 더 어렵다. 특정 구체예에서, FSH의 아미노산 서열은 또한 인체에서의 이의 순환 반감기를 연장시키기 위해 인공적으로 공학처리되지 않는다. 특히, 본 발명에 따른 FSH는 키메라 단백질이 아니고/아니거나, 자연 FSH 단백질에 존재하지 않는 당화 부위를 함유하지 않는다.

특정 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 50시간 이하, 바람직하게는 45시간 이하 또는 심지어 40시간 이하의 인간에서의 순환 반감기(t_1/2)를 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물의 순환 반감기는 20시간 내지 60시간, 더욱 바람직하게는 25시간 내지 50시간 또는 30시간 내지 45시간의 범위 내이다. 추가의 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 인간 소변으로부터 획득된 FSH 제조물보다 낮은 순환 반감기를 갖는다. 순환 반감기는 특히 인간에서 결정된다. 바람직하게는, 순환 반감기는 인간 소변으로부터 획득된 FSH 제조물의 순환 반감기보다 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20%보다 더 낮다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 인간 소변으로부터 획득되고/되거나, CHO 세포, 특히 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및/또는 마우스 중 하나 이상의 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물보다 낮은 생체이용율을 갖는다. 바람직하게는, 생체이용율은 인간 소변으로부터 획득되고/되거나, CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물의 생체이용율보다 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20% 더 낮다. 이 점에서 생체이용율은 바람직하게는 약동학 연구에서 획득된 곡선하 영역(AUC) 값을 나타내며, 여기서 혈청 FSH 농도는 FSH의 규정된 양의 투여 후에 상이한 시점에서 결정된다. 순환 반감기 및 생체이용율은 바람직하게는 피하 주사에 의한 FSH의 투여 후, 특히 단일 용량 투여 후에 결정되며, 단일 용량은 바람직하게는 약 10 내지 약 1000 IU의 FSH, 더욱 바람직하게는 약 25 IU 내지 약 500 IU의 FSH, 약 50 IU 내지 약 300 IU의 FSH 또는 약 75 IU 내지 약 150 IU의 FSH, 특히 약 100 IU의 FSH를 포함한다. 특히, 순환 반감기 및 생체이용율은 하기 실시예 4에 개시된 바와 같이 결정된다.

인간 소변으로부터 획득된 FSH 제조물은 특히 폐경후 여성의 소변으로부터 획득된다. CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물은, 예를 들어, CHO 세포주 CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096]에서 발현된다. 인간 소변으로부터 획득된 FSH 제조물 및 CHO 세포에서 발현된 FSH 제조물은 바람직하게는 상업적으로 이용 가능하고 승인된 약학적 제조물, 특히 각각 Bravelle 및 Gonal-f이다. 상이한 FSH 제조물의 순환 반감기 또는 생체이용율을 비교하는 경우, FSH 제조물은 이들을 동일 투여 경로를 이용한 동일 투여 요법을 이용하여 유사한 대상체 그룹에 투여함으로써 분석된다.

FSH의 생성

본 발명에 따라 사용되는 FSH는 바람직하게는 FSH, 더욱 바람직하게는 인간 세포, 바람직하게는 인간 세포주에서의 재조합 생성에 의해 획득 가능한 인간 FSH이다. 재조합 생성을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있는 인간 세포주는 바람직하게는 인간 혈액 세포로부터 유래되고, 특히 이는 골수성 세포주, 바람직하게는 골수성 백혈병 세포주이다. 세포주는 바람직하게는 무한증식 세포주이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 FSH의 생성을 위한 세포주는 Glycotope GmbH(Robert-Rossle-Str, 10, 13125 Berlin (DE))에 의해 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE))에 부다페스트 조약의 요구조건에 따라 등록 번호 DSM ACC3078로 2010년 7월 28일에 수탁된 세포주 GT-5s, 또는 이로부터 유래된 세포주, 또는 동종 세포주이다. GT-5s는 본원에 기재된 바와 같은 특정 당화 패턴을 제공할 수 있는 무한증식 인간 골수성 백혈병 세포주이다. 본 발명에 따르면, 용어 "GT-5s" 및 "GT-5s 세포주"는 또한 GT-5s로부터 유래된 세포 또는 세포주를 포함한다. GT-5s로부터 유래되는 세포주는, 예를 들어, 이러한 세포주의 돌연변이 비율을 향상시키기 위해 임의로 GT-5s 세포를 처리한 후에 GT-5s 배양으로부터 세포의 단일한 클론 또는 세포군을 무작위적 또는 특별히 선택하거나, GT-5s 세포주를 유전적으로 변경시킴에 의해 획득될 수 있다. 선택된 세포의 클론 또는 세포군은 상기 기재된 바와 같이 추가로 처리될 수 있고/있거나 추가 라운드의 선택이 수행될 수 있다. GT-5s에 동종인 세포주는 특히 무한증식 인간 골수성 세포주이다. 바람직하게는, GT-5s로부터 유래되거나 이와 동종인 세포주는 GT-5s로부터 획득된 것과 유사한 당화 패턴을 갖는 FSH를 제공할 수 있다. 바람직하게는, GT-5s로부터 유래되거나 이와 동종인 세포주에 의해 생성되는 FSH는 본원에 기재된 바와 같은 당화 특징, 특히 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 클리칸 중 적어도 20%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및/또는 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 30%의 상대량의 푸코스를 갖는 글리칸; 및/또는 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산 중 하나 이상을 갖는다. 한 구체예에 따르면, GT-5s로부터 유래되거나 이와 동종인 세포주는 본원에서 바람직한 것으로 기재되는 당화 패턴, 특히 표 1로부터 선택된 당화 패턴을 갖는 FSH를 발현할 수 있다. GT-5s로부터 유래되거나 이와 동종인 세포주에 의해 생성되는 FSH의 유사한 당화 패턴은 바람직하게는 특히 bisGlcNAc의 상대량, 시알화된 글리칸의 상대량, 황산화된 글리칸의 상대량, 2,6-커플링된 시알산의 상대량, 푸코스의 상대량, 테트라안테나리 글리칸의 상대량, 갈락토스를 갖는 글리칸 분지의 상대량, 및 Z 수로 구성되는 군으로부터 선택된 당화 특성 중 하나 이상, 바람직하게는 상기 당화 특성 모두에서 GT-5s로부터 획득된 FSH의 당화 패턴과 유사하고, 특히 20% 이하, 더욱 바람직하게는 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하까지 GT-5s로부터 획득된 FSH의 당화 패턴과 상이하다. 또한, 본 발명에 따른 FSH는 바람직하게는 FSH, 더욱 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 특정 당화 특징, 바람직하게는 표 1로부터 선택된 당화 패턴을 갖는 인간 FSH이다. 세포주 GT-5s 뿐만 아니라 이로부터 유래된 세포주 및 이에 동종인 세포주가 특히 유리한데, 이는 이들이 특히 FSH 단백질과 관련하여 매우 안정적이고 균일한 단백질 생성을 제공하기 때문이다. 이들은 매우 우수한 배치간 일관성(batch-to-batch consistency)을 가지며, 즉, 생성된 단백질 및 이의 당화 패턴은 다양한 생성 작업으로부터 획득되거나, 다양한 스케일 및/또는 다양한 배양 절차로 생성되는 경우에 유사하다. 특히, 본원에 기재된 바와 같은 다양한 당화 패턴은 FSH를 발현시키기 위해 상기 세포주를 이용하는 다양한 생성 작업에서 매우 재현성이 있다.

상기 세포주에서 생성된 FSH가 상기 기재된 바와 같은 당화 패턴을 나타내며, 특히 본원에 기재된 유리한 치료적 및 약리학적 활성 및 특징을 나타낸 것으로 밝혀졌다. 재조합 FSH 제조물은 적합한 세포주, 특히 상기 기재된 바와 같은 세포주, 바람직하게는 세포주 GT-5s, GT-5s로부터 유래된 세포주 또는 GT-5s와 동종의 세포주에서 FSH를 재조합적으로 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 각각 생성된 재조합 FSH는 분리될 수 있고, 임의로 정제될 수 있다.

따라서, 재조합 FSH 제조물은 바람직하게는 (i) FSH의 발현에 적합한 조건하에서 FSH 알파 및 베타 서브유닛을 코딩하는 핵산을 포함하는 인간 숙주 세포, 바람직하게는 세포주 GT-5s 또는 동종 세포주로부터 유래된 인간 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) FSH를 분리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 획득 가능하다.

발현에 사용되는 인간 숙주 세포는 바람직하게는 골수 세포, 특히 무한증식 골수성 백혈병 세포이고, 바람직하게는 세포주 GT-5s이거나 세포주 GT-5s로부터 유래되거나, 이와 동종인 세포주이다. 인간 숙주 세포는 이들이 FSH를 발현하도록 배양된다. 적합한 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있다.

용어 "핵산"은 단일-가닥 및 이중-가닥 핵산 및 리보핵산 뿐만 아니라 데옥시리보핵산, 특히 데옥시리보핵산을 포함한다. 용어 "벡터"는 이의 가장 보편적인 의미로 본원에서 사용되고, 이는 핵산이, 예를 들어, 원핵생물 및/또는 진핵생물 숙주 세포에 도입되고, 적절한 경우 숙주 세포의 유전체로 통합되는 것을 가능케 하는 상기 핵산에 대한 임의의 중간 비히클을 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게는 숙주 세포에서 복제되고/되거나 발현된다. 벡터는 바람직하게는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 적합한 선택 마커는 숙주 세포에, 예를 들어, 특정 약물, 예를 들어, 항생제에 대한 내성을 제공하는 내성 유전자이다. 추가의 적합한 선택 마커는, 예를 들어, DHFR 또는 GS와 같은 효소에 대한 유전자이다. FSH 뿐만 아니라 적합한 발현 카세트 및 숙주 세포에서 높은 수율로 재조합 단백질의 발현을 가능케 하는 발현 구성요소를 포함하는 재조합 단백질의 발현을 가능케 하는 벡터는 종래 분야에 널리 공지되어 있고, 또한 시판되며, 따라서 본원에서 상세한 설명을 필요로 하지 않는다. 상기 벡터는 FSH의 재조합 발현을 위한 숙주 세포로 FSH의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 도입시키기 위해 이용될 수 있다.

용어 "세포" 및 "세포들" 및 "세포주"는 상호교환적으로 사용되고, 바람직하게는 하나 이상의 포유동물 세포, 특히 인간 세포를 나타낸다. 상기 용어는 세포 또는 세포 집단의 프로제니(progeny)를 포함한다. 당업자는 "세포들"이 단일 세포의 프로제니를 포함하고, 프로제니가 자연적, 우연적, 또는 계획적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 본래의 모(parent) 세포와 반드시 완전히 동일(형태 또는 전체 DNA 상보성에서)할 필요가 없을 수 있음을 인지할 것이다. "세포"는 바람직하게는 살아있는 인간 또는 동물 신체 내에 통합되지 않는 분리된 세포 및/또는 배양된 세포를 나타낸다.

FSH의 분리는 바람직하게는 (a) FSH가 인간 세포에 의해 분비되는 배양 상층액을 획득하거나, FSH가 분비되지 않는 인간 세포를 용해시키는 단계; (b) 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 배양 상층액 또는 세포 용해질로부터 FSH를 분리시키는 단계; 및 (c) 바람직하게는 염기성 FSH 아이소형을 제거하는 세척 단계, 예를 들어, 약 pH 5.0 또는 약 pH 4.5 또는 약 pH 4.0에서의 세척 단계를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 염기성 FSH 아이소형을 제거함으로써 FSH의 산성 분획을 임의로 획득하는 단계의 추가 단계를 포함한다.

바람직하게는, FSH 알파 서브유닛을 코딩하는 핵산 및 FSH 베타 서브유닛을 코딩하는 핵산이 인간 숙주 세포에서의 발현을 가능케 하는 적합한 발현 벡터에 포함되는 발현 카세트에 포함된다. FSH 알파 서브유닛을 코딩하는 핵산 및 FSH 베타 서브유닛을 코딩하는 핵산은 동일한 벡터에 포함될 수 있으나, 바람직하게는 공동-트랜스펙션에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있는 별개의 벡터에 포함된다. 더욱이, 이들은 또한 IRES 구성요소와 같은 적절한 구성요소를 이용하여 하나의 발현 카세트로부터 발현될 수 있다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포에 의해 분비된다. 바람직한 구체예에서, 인간 세포의 배양은 발효기 내 및/또는 혈청 비함유 조건하에서 수행된다.

재조합 FSH에 대한 적합한 정제 방법은, 예를 들어, PCT 특허 출원 번호 WO 2011/063943호에 기재되어 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 재조합 FSH는 바람직하게는 인간 FSH 서브유닛을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 및 숙주 세포에서 상기 하나 이상의 핵산을 발현시키기 위한 요소를 포함하는 인간 세포주, 예를 들어, 세포주 GT-5s에서의 생성에 의해 획득 가능한 재조합 인간 FSH(rhFSH)이다. 바람직하게는, rhFSH의 알파 서브유닛은 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열 또는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 이의 전체 길이에 걸친 SEQ ID NO:1와의 상동성 또는 바람직하게는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 구체예에서, rhFSH의 알파 서브유닛은 SEQ ID NO:1의 위치 52 및 78에 해당하는 위치에 아스파라긴 잔기를 포함하며, SEQ ID NO:1의 Asn52 및 Asn78에 해당하는 아스파라긴 잔기에서 당화된다. rhFSH의 알파 서브유닛은 바람직하게는 이들 2개의 당화 부위만을 포함하며, 임의의 추가의 당화 부위를 포함하지 않는다. rhFSH의 베타 서브유닛은 바람직하게는 SEQ ID NO:2에 따른 아미노산 서열 또는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 이의 전체 길이에 걸친 SEQ ID NO:2와의 상동성 또는 바람직하게는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 구체예에서, rhFSH의 베타 서브유닛은 SEQ ID NO:2의 위치 7 및 24에 해당하는 위치에 아스파라긴 잔기를 포함하며, SEQ ID NO:2의 Asn7 및 Asn24에 해당하는 아스파라긴 잔기에서 당화된다. rhFSH의 베타 서브유닛은 바람직하게는 이들 2개의 당화 부위만을 포함하며, 임의의 추가의 당화 부위를 포함하지 않는다. 특정 구체예에서, FSH는 하나의 알파 서브유닛 및 하나의 베타 서브유닛으로 구성되며, 임의의 추가의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.

FSH 조성물

재조합 FSH 제조물은 바람직하게는 약학적 조성물에 존재한다. 용어 "약학적 조성물"은 특히 인간 또는 동물로 투여하기에 적합한 조성물, 즉, 약학적으로 허용되는 성분을 함유하는 조성물을 나타낸다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 활성 화합물로서 FSH 또는 이의 염 또는 프로드러그와 함께 담체, 희석제 또는 약학적 부형제, 예를 들어, 완충제, 보존제 및 긴장성 조절제를 포함한다. 약학적 조성물은 바람직하게는 주사, 예를 들어, 피하 주사 또는 정맥내 주사에 적합한 조성물, 예를 들어, FSH를 포함하는 수용액, 또는 정맥내 주사에 적합한 조성물을 제조하기 위해 이용될 수 있는 조성물, 예를 들어, 동결건조된 FSH 조성물이다. 약학적 조성물은 추가의 약학적 활성제, 특히 불임 치료에 유용한 추가의 작용제, 예를 들어, 생식샘자극호르몬-방출 호르몬(GnRH) 효능제 또는 생식샘자극호르몬-방출 호르몬(GnRH) 길항제를 포함할 수 있다. 예시적 GnRH 효능제는 자연 GnRH 데카펩티드 또는 변형된 펩티드, 예를 들어, 류프롤리드(leuprolide), 부세렐린(buserelin), 히스트렐린(histrelin), 고세렐린(goserelin), 데스로렐린(deslorelin), 나파렐린(nafarelin) 및 트리프토렐린(triptorelin)이다. 예시적 GnRH 길항제는 세트로렐릭스(cetrorelix), 가니렐릭스(ganirelix), 아바렐릭스(abarelix) 및 데가렐릭스(degarelix)를 포함한다. 대안적으로, 재조합 FSH를 포함하는 약학적 조성물은 상기 추가의 약학적 활성제와 함께 사용하도록 설계될 수 있다. 바람직한 구체예에서, FSH 제조물은 임의의 추가의 약학적 활성제 또는 임의의 다른 생식샘자극호르몬, 예를 들어, LH 및 CG를 포함하지 않는다.

약학적 조성물은 단일 단위 용량 또는 다수의 단위 용량의 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 본 발명에 따른 재조합 FSH를 포함하고, 용매, 예를 들어, 물, 완충제 물질, 안정화제, 보존제, 부형제, 계면활성제 및 염으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 멸균 용액이다. 다수의 단위 용량은 다수의 단일 용량, 특히 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개 또는 적어도 50개의 단일 용량을 제공하기에 충분한 FSH를 포함한다. 약학적 조성물은, 예를 들어, 주사 펜의 형태로 존재할 수 있다. 조성물의 성분은 바람직하게는 모두 약학적으로 허용되는 것이다. 조성물은 고체 또는 유체 조성물, 특히, 바람직하게는 수성의 용액, 에멀젼 또는 현탁액 또는 동결건조된 분말일 수 있다.

약학적 조성물은 바람직하게는 1 내지 5000 IU/㎖, 더욱 바람직하게는 10 내지 2500 IU/㎖, 100 내지 2000 IU/㎖ 또는 250 내지 1500 IU/㎖, 특히 약 500 IU/㎖ 또는 약 1000 IU/㎖의 범위 내의 농도의 FSH를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 환자로의 비경구 투여를 위한 것이다. 특히, 재조합 FSH는 주사 또는 주입, 예를 들어, 정맥내, 근내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여되어야 한다.

조절된 난소 과다자극을 위한 방법

본 발명은 조절된 난소 과다자극을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 조절된 난소 과다자극은 여성 대상체에서의 다수의 난포의 발달의 자극을 포함한다. 상기 다수의 난포의 발달은 한 단일 주기에서 동시에 달성된다. 조절된 난소 과다자극은 특히 자연 발생하는 높은 수의 난포의 발달의 자극을 나타낸다. 난포의 발달은 특히 난자 난구세포 복합체(COC) 및 중기 II 난모세포의 형성을 발생시킨다. 난자 난구세포 복합체는 난모세포 및 이를 둘러싸는 난구 세포를 포함하는 세포의 집합체이다. 이는 배란 전에 난포의 일부이며, 배란 동안 파열된 난포를 떠나 자궁관으로 진입한다. 중기 II 난모세포는 난모세포 발달의 두번째 감수분열의 중기에서 중지된다.

특정 구체예에서, 조절된 난소 과다자극은 보조 생식 기술(ART)의 일부이다. 특히, 이는 체외수정, 예를 들어, 세포질내 정자 주입, 난모세포와 정자의 공동-인큐베이션 및 생식세포 자궁관내 이식; 및/또는 배아 이식, 예를 들어, 접합자 자궁관내 이식과 조합될 수 있다.

여성 대상체에서 다수의 난포의 발달을 자극하기 위한 조절된 난소 과다자극을 위한 방법은 특히 (a) 여성 대상체에 재조합 FSH 제조물을 투여하는 단계; (b) 배란을 촉발시키는 단계; 및 (c) 여성 대상체로부터 다수의 난모세포를 획득하는 단계를 포함한다.

투여 요법

단계 (a)에서, 재조합 FSH 제조물은 특정 투여 요법을 이용하여 여성 대상체에 투여된다. 첫번째 양태에서, 투여 요법은 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 35 내지 약 250 IU의 FSH의 평균량인 재조합 FSH 제조물의 투여를 포함한다. 본 발명의 두번째 양태에서, 투여 요법은 동일한 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양의 80% 이하인 IU의 양의 재조합 FSH 제조물의 투여를 포함한다.

다양한 투여 간격이 이용될 수 있다. 특히, 재조합 FSH 제조물은 하루에 수회, 예를 들어, 하루에 4회, 하루에 3회 또는 매일 2회, 하루에 1회, 또는 2일에 1회, 3일에 1회, 4일에 1회 또는 5일에 1회로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 FSH 제조물은 하루에 1회, 2일에 1회 또는 3일에 1회, 특히 하루에 1회 또는 2일에 1회, 특히 하루에 1회 투여된다. 투여 일수에 의해 나누어진 각각의 단일 용량에서의 FSH의 양의 합은 하루 당 FSH의 평균량을 발생시킨다. 그러므로, 하루에 100 IU의 FSH의 평균량은, 예를 들어, (a) 하루에 2회의 50 IU의 FSH, (b) 매일 100 IU의 FSH, (c) 2일마다 200 IU의 FSH, 또는 (d) 3일마다 300 IU의 FSH의 단일 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다.

특정 구체예에서, 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 35 내지 약 150 IU의 FSH의 평균량인 투여 요법이 이용된다. 특히, 평균량은 하루에 약 45 내지 약 125 IU의 FSH, 특히 하루에 약 50 내지 약 115 IU의 FSH, 하루에 약 55 내지 약 100 IU의 FSH, 또는 하루에 약 60 내지 약 90 IU의 FSH이다. 특정 구체예에서, 투여 요법은 약 35 내지 약 150 IU의 FSH, 바람직하게는 약 45 내지 약 125 IU의 FSH, 약 50 내지 약 115 IU의 FSH, 약 55 내지 약 100 IU의 FSH, 또는 약 60 내지 약 90 IU의 FSH의 일일 용량을 포함한다. 추가의 구체예에서, 투여 요법은 2일마다 약 70 내지 약 300 IU의 FSH, 바람직하게는 2일마다 약 90 내지 약 250 IU의 FSH, 2일마다 약 100 내지 약 230 IU의 FSH, 2일마다 약 110 내지 약 200 IU의 FSH, 또는 2일마다 약 120 내지 약 180 IU의 FSH의 용량을 포함한다. 추가의 구체예에서, 투여 요법은 3일마다 약 105 내지 약 450 IU의 FSH, 바람직하게는 3일마다 약 135 내지 약 375 IU의 FSH, 3일마다 약 150 내지 약 345 IU의 FSH, 3일마다 약 165 내지 약 300 IU의 FSH, 또는 3일마다 약 180 내지 약 270 IU의 FSH의 용량을 포함한다.

추가의 구체예에서, 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 70 내지 약 300 IU의 FSH의 평균량인 투여 요법이 이용된다. 특히, 평균량은 하루에 약 90 내지 약 250 IU의 FSH, 특히 하루에 약 110 내지 약 230 IU의 FSH, 하루에 약 125 내지 약 190 IU의 FSH, 또는 하루에 약 140 내지 약 160 IU의 FSH이다. 특정 구체예에서, 투여 요법은 하루에 약 70 내지 약 300 IU의 FSH, 바람직하게는 하루에 약 90 내지 약 250 IU의 FSH, 하루에 약 110 내지 약 230 IU의 FSH, 하루에 약 125 내지 약 190 IU의 FSH, 또는 하루에 약 140 내지 약 160 IU의 FSH의 용량을 포함한다. 추가의 구체예에서, 투여 요법은 2일에 약 140 내지 약 600 IU의 FSH, 바람직하게는 2일에 약 180 내지 약 500 IU의 FSH, 2일에 약 220 내지 약 460 IU의 FSH, 2일에 약 250 내지 약 380 IU의 FSH, 또는 2일에 약 280 내지 약 320 IU의 FSH의 용량을 포함한다. 이들 구체예에서, 여성 대상체는 특히 난포 성장의 자극에 대한 낮은 반응성을 갖거나, 난소 자극에 대한 불량한 난소 반응을 나타낼 수 있다. 특히, 여성 대상체는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:

- 적어도 35세, 특히 적어도 37세 또는 적어도 40세, 바람직하게는 약 38세 내지 약 50세 범위 내의 연령을 갖는 여성 대상체;

- 1.5 ng/㎖ 이하, 특히 1.4 ng/㎖ 이하, 1.3 ng/㎖ 이하, 1.2 ng/㎖ 이하 또는 1.1 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 약 0.25 ng/㎖ 내지 약 1.25 ng/㎖의 범위 내의 항-뮬러리안 호르몬(AMH)의 혈청 수준을 갖는 여성 대상체;

- 둘 모두의 난소의 합계로서 9 이하, 특히 8 이하, 7 이하 또는 6 이하, 바람직하게는 4 내지 7의 범위 내의 동난포 수를 갖는 여성 대상체;

- 적어도 25 ㎏/m², 특히 적어도 26 ㎏/m², 적어도 27 ㎏/m², 적어도 28 ㎏/m², 적어도 29 ㎏/m² 또는 적어도 30 ㎏/m², 바람직하게는 약 28 ㎏/m² 내지 약 45 ㎏/m²의 범위 내의 신체 질량 지수(BMI)를 갖는 여성 대상체;

- 6개 미만, 특히 5개 미만, 4개 미만 또는 3개 미만의 난모세포의 발달이 유도된 이전의 통상적인 FSH 자극 주기를 겪은 여성 대상체; 및

- 문헌[Ferraretti et al. (2011) Human Reproduction 26(7), 1616-1624]에 정의된 바와 같은 2011 ESHR Bologna 기준에 따라 불량한 난소 반응을 갖는 여성 대상체.

특정 구체예에서, 난포 성장의 자극에 대한 낮은 반응성을 갖거나, 난소 자극에 대한 불량한 난소 반응을 나타내는 여성 대상체는 상기 기준 중 2개 이상, 특히 3개 이상에 해당한다.

특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 FSH 제조물은 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양의 75% 이하, 특히 60% 이하 또는 50% 이하인 IU의 양으로 투여된다. CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물은 특히 Gonal-f이다. CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양은 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물의 처방 정보에 표시된 투여량일 수 있다. 다른 구체예에서, CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양은, 특히 여성 대상체에서 다수의 난모세포, 특히 적어도 5개의 난모세포의 발달을 자극하기 위해 여성 대상체에서의 조절된 난소 과다자극에 적합한 바와 같은 당업자, 특히 의사에 의해 결정된 양이다.

바람직하게는, FSH 제조물의 투여는 대상체의 신체로의 FSH 제조물의 1회 용량의 이식을 나타낸다. 특히, FSH 제조물의 단일 용량이 투여된다. FSH 제조물의 상기 용량은 바람직하게는, 예를 들어, 1회 주사에 의한 단일 용량으로 제공된다. 매일 투여는 특히 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에 적어도 12시간, 바람직하게는 18시간, 특히 약 24시간이 존재하는 것을 의미한다. 특히, 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에는 온전한 역일(calendar day)이 존재하지 않는다. 2일마다의 투여는 특히 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에 적어도 30시간, 바람직하게는 적어도 36시간이 존재하는 것을 의미한다. 특히, 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에는 전체 역일이 존재한다. 특히, 2일마다 투여하는 경우, FSH의 이후의 용량은 이전 용량 약 42시간 내지 약 54시간, 바람직하게는 약 44시간 내지 약 52시간, 더욱 바람직하게는 약 46시간 내지 약 50시간 후에 제공된다. 3일마다의 투여는 특히 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에 적어도 54시간, 바람직하게는 적어도 60시간이 존재하는 것을 의미한다. 특히, 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에는 2일의 전체 역일이 존재한다. 특히, 3일마다 투여하는 경우, FSH의 이후의 용량은 이전 용량 약 66시간 내지 약 78시간, 바람직하게는 약 68시간 내지 약 76시간, 더욱 바람직하게는 약 70시간 내지 약 74시간 후에 제공된다. 4일마다의 투여는 특히 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에 적어도 78시간, 바람직하게는 적어도 84시간이 존재하는 것을 의미한다. 특히, 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에는 3일의 전체 역일이 존재한다. 특히, 4일마다 투여하는 경우, FSH의 이후의 용량은 이전 용량 약 90시간 내지 약 102시간, 바람직하게는 약 92시간 내지 약 100시간, 더욱 바람직하게는 약 94시간 내지 약 98시간 후에 제공된다. 5일마다의 투여는 특히 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에 적어도 102시간, 바람직하게는 적어도 108시간이 존재하는 것을 의미한다. 특히, 1회 투여의 종료와 다음 투여의 시작 사이에는 4일의 전체 역일이 존재한다. 특히, 5일마다 투여하는 경우, FSH의 이후의 용량은 이전 용량 약 114시간 내지 약 126시간, 바람직하게는 약 116시간 내지 약 124시간, 더욱 바람직하게는 약 118시간 내지 약 122시간 후에 제공된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 FSH 제조물은 적어도 5일, 바람직하게는 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일 또는 적어도 9일의 시간 간격으로 투여된다. 특히, FSH 제조물은 5 내지 21일, 바람직하게는 6 내지 18일의 시간 간격으로 투여된다.

특정한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 FSH 제조물은 먼저 약 4 내지 9일, 바람직하게는 5 내지 7일의 시간 간격으로 투여(최초 투여 요법)되고, 이후 치료되는 대상체는 치료에 대한 반응에 대해 검사된다. 상기 검사는 특히 하나 또는 둘 모두의 난소에서 유도된 난포의 수 및/또는 크기의 결정을 포함한다. 이후, 추가 치료는 검사 결과를 기초로 하여, 예를 들어, 난포 성장 자극을 지속시키거나, 심지어 난포 성장 자극을 증가시키도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 의도된 목적에 충분히 큰 난포가 검출되는 경우 FSH 처리가 중지될 수 있거나, 1회 이상, 바람직하게는, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상의 용량의 FSH가 이후에 투여될 수 있다. 이후의 투여 요법은 검사 전의 투여 요법과 동일하거나 상이할 수 있다. 추가의 FSH 용량은 검사 전에 투여된 FSH 용량과 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 투여되는 용량은 검사 전에 제공된 투여량의 약 50% 내지 약 300%, 바람직하게는 약 75% 내지 약 200%, 더욱 바람직하게는 약 100% 내지 약 150%의 범위 내의 FSH의 양을 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 투여 요법 및 FSH의 용량은 검사 전 및 검사 후에 동일하거나, 투여 요법은 동일하고 FSH의 용량은 검사 후에 50%까지 증가된다. 한 구체예에 따르면, FSH는 20일 초과 동안 투여되지 않고, 바람직하게는 18일 이상 투여되지 않는다.

바람직하게는, FSH는 약 10 내지 약 2000 IU의 FSH의 범위 내의 단일 용량을 이용한 투여 요법으로 투여된다. 각각의 투여에 대해 사용된 단일 용량은 바람직하게는 약 20 내지 약 1500 IU의 FSH, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 약 1000 IU의 FSH, 약 30 내지 약 750 IU의 FSH, 약 37.5 내지 약 500 IU의 FSH, 약 50 내지 약 300 IU의 FSH, 또는 약 60 내지 약 200 IU의 FSH, 가장 바람직하게는 약 75 내지 약 150 IU의 FSH를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 투여 요법 또는 적어도 최초 투여 요법의 각각의 용량은 동일량의 FSH를 함유하거나, 용량 당 FSH의 양은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하까지 변화된다.

FSH에 대한 국제 단위(IU)는 인간 소변 FSH 및 LH에 대한 네번째 국제 표준(Storring, P.L. & Gaines Das, R.E. (2001) Journal of Endocrinology 171, 119-129)을 나타내며, 이는 증강된 난소 중량 획득 방법에 따라 결정된다(Steelman, S.L. & Pohley, F.M. (1953) Endocrinology 53, 604-616).

조절된 난소 과다자극 방법은 재조합 FSH 제조물의 투여 전 및 임의로 또한 재조합 FSH 제조물의 투여 동안 자연 월경 주기의 하향조절을 추가로 포함할 수 있다. 자연 월경 주기의 하향조절은 둘 모두가 자연 황체형성호르몬(LH) 및 자연 난포-자극 호르몬(FSH)의 감소된 혈청 수준을 궁극적으로 발생시키는 생식샘자극호르몬-방출 호르몬 효능제(GnRH-효능제) 또는 생식샘자극호르몬-방출 호르몬 길항제(GnRH-길항제)를 이용한 여성 대상체의 치료에 의해 달성될 수 있다. GnRH-효능제는 생식샘자극호르몬-방출 호르몬 수용체에 강하게 결합하여 이를 활성화시키고, 그러므로 뇌하수체의 일정한 자극을 야기시킨다. 결과로서, 먼저 FSH 및 LH 분비에서의 증가가 존재한다(소위 "플레어 이펙트(flare effect)"). 그러나, 약 10일 후, 수용체의 내재화에 의한 수용체 하향조절을 통해 현저한 생식샘저하 효과(즉, FSH 및 LH에서의 감소)가 달성된다. 적합한 GnRH-효능제는, 예를 들어, 트리프토렐린(triptorelin), 류프롤리드(leuprolide), 부세렐린(buserelin), 나파렐린(nafarelin), 히스트렐린(histrelin), 고세렐린(goserelin) 및 데스로렐린(deslorelin)이다. GnRH-효능제는, 예를 들어, 월경 주기 20일 또는 22일에 시작하여 제공될 수 있다. GnRH-길항제는 뇌하수체 내의 GnRH 수용체에 경쟁적으로 결합하고, 이에 의해 이들의 활성화를 차단하며, 그러므로 뇌하수체로부터 자연 황체형성호르몬(LH) 및 자연 난포-자극 호르몬(FSH)의 방출을 차단한다. 적합한 GnRH-길항제는, 예를 들어, 세트로렐릭스(cetrorelix), 가니렐릭스(ganirelix), 아바렐릭스(abarelix) 및 데가렐릭스(degarelix)이다. 재조합 FSH 제조물의 투여는 바람직하게는 FSH 및 LH 수준의 하향조절이 달성된 후, 일반적으로 하향조절 치료의 시작으로부터 약 8 내지 25일 후에 시작된다. GnRH-효능제 또는 GnRH-길항제를 이용한 치료는 FSH 치료 동안 지속될 수 있다. 각각의 치료는 종래에 널리 공지되어 있으며, 따라서 상세한 설명을 필요로 하지 않는다.

특정 구체예에서, 단계 (a)에서의 재조합 FSH 제조물의 투여는 또 다른 생식샘자극호르몬, 예를 들어, LH 또는 CG 또는 난포 성장을 유도하거나 향상시키는 또 다른 작용제의 동시 투여를 포함하지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "동일한 치료 상황"은 유사한 여성 대상체가 참조 상황과 유사하게 치료되는 상황을 나타낸다. 특히, 비교되는 상황에서, 여성 대상체는 수정능력 치료와 관련된 조건, 예를 들어, 연령, 항-뮬러리안 호르몬의 혈청 수준, 동난포 수, 신체 질량 지수 및 이전의 불임 치료, 예를 들어, 이전의 통상적인 FSH 자극 주기와 관련하여 유사하다. 또한, 비교되는 상황에서, 바람직하게는 치료는 투여 스케줄, 난모세포를 획득하기 위해 이용된 방법, 회수된 난모세포의 이후의 치료, 여성 대상체의 이전 치료, 달리 지정된 것을 제외한 다른 작용제를 이용한 임의의 동시 치료 등을 포함하여 유사하다. 이와 관련하여 유사함은 특히 25% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 특히 5% 이하의 수에 있어서의 편차를 나타낸다. 수에서 표현될 수 없는 특징의 경우, 상황은 바람직하게는 동일하다. 일반적으로, 당업자는 2개의 치료 상황이 동일한지의 여부를 결정할 수 있다.

배란의 유도

본 발명에 따른 방법의 단계 (b)에서, 배란이 여성 대상체에서 촉발된다. 특히, 배란은 12 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포가 존재하고/하거나, 적어도 17 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우에 촉발된다. 특정 구체예에서, 배란은 12 mm 이상의 평균 직경, 특히 13 mm 또는 14 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포, 특히 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 난포가 존재하는 경우에 촉발된다. 추가의 구체예에서, 배란은 적어도 17 mm의 직경, 특히 적어도 18 mm, 적어도 19 mm 또는 적어도 20 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우에 촉발된다. 특정 구체예에서, 배란은 12 mm 이상의 평균 직경, 특히 13 mm 또는 14 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포, 특히 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 난포가 존재하는 경우, 및 적어도 17 mm의 직경, 특히 적어도 18 mm, 적어도 19 mm 또는 적어도 20 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우에 촉발된다. 난포의 수 및 크기는 초음파 분석, 예를 들어, 부인과 초음파촬영술에 의해 결정될 수 있다.

배란 촉발은 특히 여성 대상체로의 배란 유도제의 투여에 의해 달성된다. 적합한 배란 유도제는 융모 생식샘자극호르몬, 특히 인간 융모 생식샘자극호르몬(hCG), 예를 들어, 재조합 hCG, 황체형성호르몬(LH), 예를 들어, 재조합 LH, GnRH 효능제, 또는 이들의 유도체이다. 배란 유도제는 바람직하게는 FSH를 이용한 치료가 중지된 후에 투여된다.

특히, 배란 유도제는 마지막 FSH 투여 6 내지 72시간, 바람직하게는 12 내지 54시간, 특히 18 내지 36시간 후에 투여될 수 있다. 어떤 특정한 구체예에서, 배란 유도제의 투여는 재조합 FSH 제조물의 투여 종료 적어도 48시간 후, 특히 재조합 FSH 제조물의 투여 종료 약 60시간 내지 약 120시간, 또는 약 72시간 내지 약 96시간 후에 개시된다. 바람직하게는, 약 100 내지 500 ㎍, 더욱 바람직하게는 200 내지 300 ㎍, 특히 약 250 ㎍의 hCG 또는 이의 유도체가 투여된다. 이와 관련하여 배란 촉발은 특히 난모세포의 감수분열 II의 유도, 중기 II 단계에서의 난모세포의 발달의 자극, 및/또는 배란 자체의 유도를 포함한다.

배란을 촉발시키는 단계는 하나 이상의 난포의 실제 배란을 포함하지 않아야 한다. 이는 특히, 예를 들어, 난모세포의 최종 성숙을 포함하는 배란 과정의 유도를 나타낸다. 특정 구체예에서 단계 (c)에서 난모세포를 획득하는 것은 배란 과정의 완료 전에 수행된다.

난모세포의 회수

조절된 난소 과다자극을 위한 방법의 단계 (c)에서, 다수의 난모세포가 여성 대상체로부터 획득된다. 본 발명의 첫번째 양태에서, 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5개의 난모세포가 획득되고/되거나, 여성 대상체로부터 적어도 5개의 난모세포가 획득된다. 본 발명의 두번째 양태에서, 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양을 이용한 유사한 치료에 비해 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5% 더 많은 난모세포가 획득된다.

특정 구체예에서, 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5개의 난모세포가 획득된다. 특히, 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 난모세포가 획득된다. 여성 대상체 당 난모세포의 평균 수는 여성 대상체의 그룹으로부터 획득된 모든 난모세포의 합계를 여성 대상체의 수로 나눔으로써 결정된다. 모든 여성 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 FSH 제조물을 이용하여 동일 투여 요법으로 치료되었다. 여성 대상체의 그룹은 적어도 20명의 대상체, 바람직하게는 적어도 40명의 대상체 또는 적어도 100명의 대상체를 포함한다. 추가의 구체예에서, 재조합 FSH 제조물이 단계 (a)에서 투여된 여성 대상체로부터 적어도 5개의 난모세포가 획득된다. 특히, 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 난모세포가 여성 대상체로부터 획득된다.

추가의 구체예에서, 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양을 이용한 유사한 치료에 비해 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5%, 특히 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 10% 또는 적어도 15% 더 많은 난모세포가 획득된다. CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물은 특히 Gonal-f이다. CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양은 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물의 처방 정보에 표시된 투여량일 수 있다. 다른 구체예에서, CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양은, 특히 여성 대상체에서 다수의 난모세포, 특히 적어도 5개의 난모세포의 발달을 자극하기 위해 여성 대상체에서의 조절된 난소 과다자극에 적합한 바와 같은 당업자, 특히 의사에 의해 결정된 양이다. 특정 구체예에서, 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양을 이용한 유사한 치료에 비해 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5%, 특히 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 10% 또는 적어도 15% 더 많은 난자 난구세포 복합체 및/또는 평균적으로 적어도 5%, 특히 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 10% 또는 적어도 15% 더 많은 중기 II 난모세포가 획득된다.

난모세포는 수술, 특히 천자, 예를 들어, 초음파-유도 천자에 의해 여성 대상체로부터 획득될 수 있다. 난모세포를 획득하기 위한 적합한 방법은 경질 난자 회수이다. 특히, 획득된 난모세포는 적어도 10 mm, 바람직하게는 적어도 12 mm의 평균 직경을 갖는다. 특정 구체예에서, 난모세포는 난자 난구세포 복합체(COC)의 형태로 획득된다. 특정 구체예에서, 획득된 난모세포의 적어도 일부는 중기 II 난모세포, 즉, 두번째 감수분열의 중기에서 중지된 난모세포이다. 특히, 획득된 난모세포 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개가 중기 II 난모세포이다.

난모세포는 바람직하게는 배란 촉발 약 24시간 내지 약 38시간, 특히 약 32시간 내지 약 36시간 후에 획득된다. 특정 구체예에서, 난모세포는 배란이 단계 (b)에서 촉발된 후, 그러나 배란 과정의 완료 전, 특히, 난포의 파열 전에 난포로부터 획득된다.

추가 방법 단계

특정 구체예에서, 조절된 난소 과다자극을 위한 방법은 (d) 단계 (c)에서 획득된 적어도 1개의 난모세포를 수정시키는 단계; 및 (e) 단계 (d)에서 획득된 적어도 1개의 수정된 난모세포 또는 이로부터 유래된 적어도 하나의 배아를 여성 환자로 이식하는 단계의 추가 단계를 포함할 수 있다.

적어도 하나의 난모세포의 수정은 특히 세포질내 정자 주입(IVF-ICSI) 또는 정자와의 공동-인큐베이션(IVF)에 의한 체외수정에 의해 달성된다. 난모세포와 정자의 공동-인큐베이션은 자궁관내에서도 발생할 수 있는데, 이는 생식세포 자궁관내 이식으로 언급된다. 수정은 2 전핵(2PN) 난모세포의 존재를 검출함으로써 모니터될 수 있다. 특정 구체예에서, 1개, 2개 또는 3개의 난모세포가 수정된다. 다른 구체예에서, 단계 (c)에서 획득된 적어도 4개 또는 적어도 5개, 특히 모든 난모세포가 수정된다.

단계 (e)에서, 특히 1개, 2개 또는 3개의 수정된 난모세포 또는 이로부터 유래된 배아가 여성 대상체로 이식된다. 특정 구체예에서, 단계 (d)에서 수정된 난모세포의 단지 일부가 이식된다. 난모세포가 획득되는 여성 대상체는 수정된 난모세포 또는 이로부터 유래된 배아가 이식되는 여성 대상체와 동일하거나 상이할 수 있다.

특정 구체예에서, 조절된 난소 과다자극을 위한 방법은 단계 (c)에서 획득된 적어도 하나의 난모세포를 특히 단계 (d) 전에 동결시키거나 유리화시키는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 단계 (c)에서 획득된 모든 난모세포는 동결되거나 유리화된다. 다른 구체예에서, 단계 (c)에서 획득된 난모세포의 단지 부분집단, 특히 단계 (d)에서 수정되지 않은 난모세포 또는 단계 (d)에서 수정된 난모세포만이 동결되거나 유리화된다. 획득된 난모세포를 동결시키거나 유리화시키는 것은 난모세포의 안전한 저장을 위하고/위하거나, 배아의 착상 효율을 향상시키고/시키거나, 임신율을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 방법은 단계 (d)에서 획득된 적어도 하나의 수정된 난모세포 또는 이로부터 유래된 적어도 하나의 배아를 특히 단계 (e) 전에 동결시키거나 유리화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 단계 (d)에서 획득된 모든 수정된 난모세포/배아가 동결되거나 유리화된다. 다른 구체에에서, 단계 (d)에서 획득된 수정된 난모세포/배아의 단지 부분집단, 특히 단계 (e)에서 여성 환자로 이식되지 않는 수정된 난모세포/배아 또는 단계 (e)에서 여성 대상체로 이식되는 수정된 난모세포/배아만이 동결되거나 유리화된다. 특정 구체예에서, 단계 (c)에서 획득된 난모세포의 단지 부분집단이 단계 (d)에서 수정되고/되거나, 단계 (d)에서 수정된 난모세포의 단지 부분집단이 단계 (e)에서 여성 환자로 이식된다. 임의로, 단계 (d)에서 수정되지 않은 난모세포 또는 단계 (e)에서 여성 환자로 이식되지 않은 수정된 난모세포 또는 배아는 이후의 사용을 위해 동결되거나 유리화된다.

특정 구체예에서, 조절된 난소 과다자극을 위한 방법은 단계 (e)에 더하여 여성 환자로 적어도 하나의 수정된 난모세포 또는 이로부터 유래된 적어도 하나의 배아를 이식하는 하나 이상의 추가 단계를 포함한다. 수정된 난모세포는 단계 (d) 또는 단계 (c)에서 획득된 적어도 하나의 난모세포를 수정시키는 하나 이상의 추가 단계에서 획득될 수 있다. 상이한 이식 단계의 여성 환자는 동일하거나 상이한 환자일 수 있다. 여성 환자가 동일한 구체예에서, 이후의 이식 단계는 이전 치료 주기의 완료 후, 특히 성공적인 임신, 유산 또는 이전 이식의 실패 후에만 수행된다. 특히, 이들 수정 및 이식 단계에 사용되는 난모세포는 모두 단계 (c)에서 획득되며, 상기 방법은 조절된 난소 과다자극의 두번째 주기를 포함하지 않는다. 그러므로, 특정 구체예에서, 상기 방법은 조절된 난소 과다자극의 단지 하나의 주기를 포함한다.

특정 구체예에서, 조절된 난소 과다자극을 위한 방법은 획득된 난모세포의 시험관내 성숙을 포함하지 않는다. 특히, 획득된 난모세포는 추가의 난모세포 성숙을 자극하기 위해 여성 대상체의 신체 외부의 호르몬과 같은 작용제로 처리되지 않는다.

추가의 구체예에서, 조절된 난소 과다자극을 위한 방법은 단계 (a)에서 재조합 FSH 제조물의 투여 전 또는 투여와 동시에 또 다른 생식샘자극호르몬, 예를 들어, LH 또는 hCG 또는 난포 성장을 유도하거나 향상시키는 또 다른 작용제의 투여를 포함하지 않는다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 FSH 제조물은 임의의 애쥬번트 자극 없이, 특히 클로미펜 시트레이트의 사용 없이 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에 따르면, 난포 성장을 자극하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 재조합 FSH 제조물과 함께 경구 배란 유도제가 사용되지 않는다. 한 구체예에 따르면, 재조합 FSH 제조물은 난포 성장의 자극을 위해 단일 작용제 요법으로 사용된다. 특히, 난포 성장을 뒷받침하기 위해 재조합 FSH 투여 동안 배란 유도제가 제공되지 않는다. 그러나, 마지막 FSH 투여 후, 최종 난포 성숙을 유도하고/하거나 배란을 촉발시키는 작용제, 예를 들어, hCG가, 특히 방법의 단계 (b)에서 대상체에 제공될 수 있다.

여성 대상체

특정 구체예에서, 여성 대상체는 생식 또는 수정능력과 관련된 기능이상 또는 질병으로부터 고통받는 환자이다. 본 발명에 따른 용어 "대상체" 또는 "환자"는 인간, 비인간 영장류 또는 또 다른 동물, 특히 포유동물, 예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류, 예를 들어, 마우스 및 래트를 나타낸다. 특히 바람직한 구체예에서, 대상체 또는 환자는 인간이다. 인간 대상체 또는 환자의 경우에서, FSH는 바람직하게는 인간 FSH이다. 특정 구체예에서, 여성 대상체 또는 여성 환자는 보조 생식 기술(ART)을 겪는다. 특히, 보조 생식 기술은 체외수정, 예를 들어, 세포질내 정자 주입, 난모세포와 정자의 공동-인큐베이션 및 생식세포 자궁관내 이식; 및/또는 배아 이식, 예를 들어, 접합자 자궁관내 이식을 포함한다. 특정 구체예에서, 조절된 난소 과다자극을 위한 방법에 적용되는 여성 대상체는 수정된 난모세포 또는 배아가 이식되는 여성 대상체와 상이하다. 이들 구체예는 특히 난자 기증자 프로그램에서 이용된다. 다른 구체예에서, 여성 대상체 및 여성 환자는 동일하다.

특정 구체예에서, 여성 대상체는 난포 성장의 자극에 대한 낮은 반응성을 갖거나, 난소 자극에 대한 불량한 난소 반응을 나타낸다. 특히, 여성 대상체는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:

난포 성숙을 자극하기 위한 방법

세번째 양태에서, 본 발명은 (a) 재조합 FSH 제조물을 투여함으로써 여성 대상체에서 난포 성장을 유도하거나 향상시키는 단계; 및 (b) 이후 배란을 촉발시키는 단계를 포함하는 여성 대상체에서 난포 성숙을 자극하기 위한 방법에 관한 것으로, 제조물 내의 재조합 FSH는 (i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 20%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및 (ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산의 특징을 포함하는 당화 패턴을 가지며, 단계 (b)에서의 배란 촉발은 단계 (a)에서의 재조합 FSH 제조물의 투여 종료 적어도 48시간 후에 개시된다.

특정 구체예에서, 배란은 12 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포가 존재하고/하거나, 적어도 17 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우에 촉발된다. 특정 구체예에서, 배란은 12 mm 이상의 평균 직경, 특히 13 mm 또는 14 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포, 특히 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 난포가 존재하는 경우에 촉발된다. 추가의 구체예에서, 배란은 적어도 17 mm의 직경, 특히 적어도 18 mm, 적어도 19 mm 또는 적어도 20 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우에 촉발된다. 특정 구체예에서, 배란은 12 mm 이상의 평균 직경, 특히 13 mm 또는 14 mm 이상의 평균 직경을 갖는 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 난포가 존재하는 경우, 및 적어도 17 mm의 직경, 특히 적어도 18 mm, 적어도 19 mm 또는 적어도 20 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우에 촉발된다. 난포의 수 및 크기는 초음파 분석, 예를 들어, 부인과 초음파촬영술에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 배란 촉발에 결정적인 난포의 수 및 크기는 재조합 FSH 제조물의 마지막 투여 전, 투여 동안 또는 투여 후 최대 24시간 후에 결정된다.

특정 구체예에서, 단계 (b)에서의 배란 촉발은 단계 (a)에서의 재조합 FSH 제조물의 투여 종료 적어도 54시간, 특히 적어도 60시간, 적어도 72시간, 적어도 84시간 또는 적어도 96시간 후에 개시된다. 예를 들어, 단계 (b)에서의 배란 촉발은 단계 (a)에서의 재조합 FSH 제조물의 투여 종료 약 60시간 내지 약 120시간, 바람직하게는 약 72시간 내지 약 96시간 후에 개시된다.

배란 촉발은 특히 여성 대상체로의 배란 유도제의 투여에 의해 달성된다. 적합한 배란 유도제는 융모 생식샘자극호르몬, 특히 인간 융모 생식샘자극호르몬(hCG), 예를 들어, 재조합 hCG, 황체형성호르몬(LH), 예를 들어, 재조합 LH, GnRH 효능제, 또는 이들의 유도체이다. 배란 유도제는 바람직하게는 hGC 또는 이의 유도체이다. 바람직하게는, 약 100 내지 500 ㎍, 더욱 바람직하게는 200 내지 300 ㎍, 특히 약 250 ㎍의 hCG 또는 이의 유도체가 투여된다. 이와 관련하여 배란 촉발은 특히 난모세포의 감수분열 II의 유도, 중기 II 단계에서의 난모세포의 발달의 자극, 및/또는 배란 자체의 유도를 포함한다.

조절된 난소 과다자극을 위한 방법과 관련한 본원에 기재된 모든 구체예 및 특징은 또한 마찬가지로 난포 성숙을 자극하기 위한 방법에 적용될 수 있다. 또한, 조절된 난소 과다자극을 위한 방법은 난포 성숙을 자극하기 위한 방법과 조합될 수 있다.

특정 구체예

여성 대상체에서 다수의 난포의 발달을 자극하기 위한 조절된 난소 과다자극을 위한 방법의 특정 구체예에서, 단계 (a)에서, 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 50 내지 약 125 IU의 FSH의 평균량인 투여 요법이 이용되고; 단계 (b)에서, 적어도 17 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우에 배란이 촉발되고; 단계 (c)에서, 적어도 5개의 난모세포가 난자 난구세포 복합체(COC)의 형태로 여성 대상체로부터 획득되고, 이들 난모세포 중 적어도 4개가 중기 II 난모세포이고; 제조물 내의 재조합 FSH는 하기 특징을 포함하는 당화 패턴을 갖는다:

(iii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 5%의 상대량의 황산화된 글리칸;

(viii) 적어도 210의 Z 수.

특정 구체예에서, 본원에 기재된 재조합 FSH 제조물은 Gonal f^®과 같은 IU의 용량의 절반으로 투여되는 경우에 동일 치료 상황에서 Gonal f^®과 적어도 동일한 치료 효과를 달성한다. 치료 효과는 특히 여성 대상체에서 유도된 12 mm 이상의 평균 직경을 갖는 난모세포의 수, 여성 대상체로부터 회수된 난모세포, COC 및/또는 중기 II 난모세포의 수, 및 성공적으로 수정된 배아의 수 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 치료 효과는 바람직하게는 적어도 20명의 여성 대상체, 더욱 바람직하게는 적어도 40명의 여성 대상체 또는 적어도 100명의 여성 대상체를 포함하는 여성 대상체의 그룹에서의 평균으로 결정된다. 상기 그룹은 특히 과학 기준에 따라 동등하다.

본원에서 사용되는 표현 "포함하다"는 이의 통상적인 의미 외에도 또한 표현 "~을 필수적으로 포함하는" 및 "~로 구성되는"을 포함하며, 특별히 이를 나타낸다. 따라서, 한 구체예에 따르면, 표현 "포함하다"는 특별히 나열된 요소를 "포함하는" 주제가 추가의 요소를 포함하지 않는 구체예 뿐만 아니라 특별히 나열된 요소를 "포함하는" 주제가 추가의 요소를 포함할 수 있고/있거나 확실히 포함하는 구체예를 나타낸다. 한 구체예에 따르면, 방법의 경우에서 특정 단계를 포함하는 바와 같거나, 조성물, 용액 및/또는 완충액의 경우에서 특정 성분을 포함하는 바와 같은 본원에 기재된 주제는 각각의 단계 또는 성분으로 구성되는 주제를 나타낸다.

본원에 제공된 수, 특히 특정 당화 특성의 상대량은 바람직하게는 대략적인 수로 이해되어야 한다. 특히, 수는 바람직하게는 10%까지 높고/높거나 낮을 수 있고, 특히 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%까지 높고/높거나 낮을 수 있다. 한 구체예에 따르면, 본원에 제공된 수는 높거나 낮지 않을 수 있는 정확한 수로 이해되어야 한다.

본 발명은 본원에 개시된 예시적 방법 및 물질에 의해 제한되지 않는다. 숫자 범위는 이러한 범위를 규정하는 수를 포함한다. 본원에 제공된 제목은 본 발명의 다양한 양태 또는 구체예의 제한이 아니며, 전체로서의 명세서에 대한 언급으로 해석될 수 있다. 본원에 기재된 바람직한 구체예를 선택하고 조합하는 것이 바람직하며, 바람직한 구체예의 각각의 조합으로부터 발생하는 특정 주제가 또한 본 발명의 개시에 속한다.

도 1은 표시된 양의 FSH(본 발명)의 단일 투여 후의 건강한 여성 지원자에서의 평균 난포 크기의 상대 변화를 제시한다. 투여 전 난포 크기가 참조(100%)로서 이용된다.
도 2는 위약 또는 150 IU의 Bravell 또는 Gonal-f의 단일 투여 후의 건강한 여성 지원자에서의 평균 난포 크기의 상대 변화를 제시한다. 투여 전 난포 크기가 참조(100%)로서 이용된다.
도 3은 표시된 양의 FSH(본 발명)(A) 또는 위약, 150 IU의 Bravell 또는 150 IU의 Gonal-f(B)의 단일 투여 후의 모든 대상체의 평균으로서의 평균 난포 크기의 상대 변화를 제시한다. 투여 전 난포 크기가 참조(100%)로서 이용된다.
도 4는 FSH(본 발명), Gonal-f 또는 Bravelle의 매일 투여(또한 2일마다의 FSH 투여)를 이용한 다수의 용량 연구 동안 건강한 여성 지원자의 혈청 내의 FSH의 농도를 제시한다. 투여되는 유사한 양의 FSH는 동등한 FSH 혈청 수준을 발생시켰다.
도 5는 7일 동안 150 IU의 FSH(본 발명)의 매일 투여 후의 건강한 여성 지원자(10명의 대상체의 평균)에서 관찰된 8.0 mm 이상의 직경을 갖는 난포의 평균 수를 제시한다. 막대의 채색은 난포 크기를 나타낸다.
도 6은 7일 동안 150 IU의 Gonal-f의 매일 투여 후의 건강한 여성 지원자(10명의 대상체의 평균)에서 관찰된 8.0 mm 이상의 직경을 갖는 난포의 평균 수를 제시한다. 막대의 채색은 난포 크기를 나타낸다.
도 7은 7일 동안 150 IU의 Bravelle의 매일 투여 후의 건강한 여성 지원자(10명의 대상체의 평균)에서 관찰된 8.0 mm 이상의 직경을 갖는 난포의 평균 수를 제시한다. 막대의 채색은 난포 크기를 나타낸다.
도 8은 7일 동안 75 IU의 FSH(본 발명)의 매일 투여 후의 건강한 여성 지원자(10명의 대상체의 평균)에서 관찰된 8.0 mm 이상의 직경을 갖는 난포의 평균 수를 제시한다. 막대의 채색은 난포 크기를 나타낸다.
도 9는 7일 동안 2일마다의 150 IU의 FSH(본 발명)의 투여 후의 건강한 여성 지원자(10명의 대상체의 평균)에서 관찰된 8.0 mm 이상의 직경을 갖는 난포의 평균 수를 제시한다. 막대의 채색은 난포 크기를 나타낸다.
도 10은 1일 내지 7일 동안 FSH(본 발명)(매일 75 IU, 매일 150 IU, 2일마다 150 IU) 또는 Gonal-f(매일 150 IU)의 투여를 이용한 다수의 용량 연구 후의 건강한 여성 지원자의 혈청 내의 인히빈-B(A) 및 에스트라디올(B)의 농도를 제시한다.
도 11은 7일 동안 (A) 150 IU의 FSH(본 발명), (B) 150 IU의 Gonal-f 또는 (C) 매일 75 IU의 FSH(본 발명) 또는 (D) 2일마다 150 IU의 FSH(본 발명)의 투여 후의 건강한 여성 지원자(10명의 대상체의 평균)에서 관찰된 10.0 mm 이상의 직경을 갖는 난포의 평균 수를 제시한다. 막대의 채색은 난포 크기를 나타낸다.
도 12는 피하 투여되는 FSH의 다수의 용량의 마지막 용량 후의 평균 혈장 FSH 농도 대 시간을 제시한다.
도 13은 상이한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(본 발명); 제조물 1: 속이 빈 사각형, 제조물 2: 속이 채워진 삼각형) 또는 CHO 세포로부터 획득된 FSH(Gonal F; 속이 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립층 세포의 cAMP 방출을 제시한다.
도 14는 상이한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(본 발명); 제조물 1: 속이 빈 사각형, 제조물 2: 속이 채워진 삼각형) 또는 CHO 세포로부터 획득된 FSH(Gonal F; 속이 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립층 세포의 에스트라디올 합성을 제시한다.
도 15는 상이한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(본 발명); 제조물 1: 속이 빈 사각형, 제조물 2: 속이 채워진 삼각형) 또는 CHO 세포로부터 획득된 FSH(Gonal F; 속이 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립층 세포의 프로게스테론 합성을 제시한다.
도 16은 상이한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(본 발명); 속이 빈 사각형) 또는 소변 FSH(Fostimon; 속이 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립층 세포의 cAMP 방출을 제시한다.
도 17은 상이한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(본 발명); 속이 빈 사각형) 또는 소변 FSH(Fostimon; 속이 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립층 세포의 에스트라디올 합성을 제시한다.
도 18은 상이한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(본 발명); 속이 빈 사각형) 또는 소변 FSH(Fostimon; 속이 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립층 세포의 프로게스테론 합성을 제시한다.
도 19는 표준 소변 FSH 및 CHO 세포로부터 획득된 표준 재조합 FSH에 비한 개선된 재조합 인간 FSH를 이용한 스틸만-폴리(Steelman-Pohley) 검정의 결과를 제시한다. 3일 동안의 매일 투여 후의 미성숙 암컷 래트에서의 난소 중량 증가가 사용된 FSH 농도에 대해 플로팅된다.
도 20은 FSH 당화 부위에 부착될 수 있는 복합체-유형 글리칸 구조의 개략적 도면을 도시한다. (a) 바이안테나리, (b) 트리안테나리 및 (c) 테트라안테나리 구조가 제시된다. 시알산 및 갈락토스 잔기 중 하나 이상이 또한 상기 구조에 부재할 수 있고, 상기 구조는, 예를 들어, 이등분면 GlcNAc 잔기, 푸코스 잔기 및/또는 설페이트기를 추가로 포함할 수 있다. Sia: 시알산; Gal: 말단 갈락토스로도 본원에 언급되는 갈락토스; GlcNAc: N-아세틸글루코사민; Man: 만노스.

실시예

실시예 1: FSH(본 발명)의 제조

FSH는 인간 FSH의 알파 및 베타 사슬(알파 사슬 등록 번호 NT_007299.13; 베타 사슬 등록 번호 NT_009237.18)을 갖는 2개의 발현 작제물로 안정적으로 트랜스펙션된 GT-5s 세포의 배양에 의해 생성된다. FSH 알파 사슬의 발현을 위한 플라스미드는 자연 형태보다 효소 억제제 메토트렉세이트에 대해 보다 높은 내성을 갖는 뮤린 디하이드로폴레이트 환원효소(dhfr)의 돌연변이된 형태의 유전자를 가지며, FSH 알파 사슬의 발현을 위한 두번째 플라스미드는 퓨로마이신 내성 유전자를 갖는다.

FSH(본 발명) 발현을 위한 세포주의 트랜스펙션을 상기 기재된 2개의 발현 플라스미드를 이용한 누클레오펙션(nucleofection)에 의해 수행하였다. 안정적 항체 생성 세포 클론의 선택 및 증폭을 위해, 퓨로마이신 및 메토트렉세이트를 증가하는 농도로 첨가하였다. 증폭된 세포 푸울(pool)을 Clone PixFL 기술에 의한 단일 세포 클로닝 또는 제한희석에 의한 단일 세포 클로닝을 위해 반고체 매트릭스에 시딩하였다. 클론을 온전한 FSH 분자의 고분비에 대해 스크리닝하였다.

FSH는 혈청 비함유 조건하에서 회분(batch), 유가배양(fed-batch) 또는 관류 과정의 최종 FSH 생성 GT-5s 클론의 발효에 의해 생성된다. 발효는 보통 2-3주 동안 수행된다.

발효 후, 상층액은 0.2 ㎛ 필터를 이용한 멸균 여과 단계 전에 세포 및 세포 조직파편을 제거하기 위해 2 ㎛ 필터를 통해 여과된다. 정제 방법은 포획 단계로서 역상 크로마토그래피(RPC) 후, 농축 단계 및 이후 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용한다. 임의로, 용리액이 이후 음이온 교환 크로마토그래피(AEC)에 적용되어 덜 산성인 FSH 내용물이 제거된다. 이는 요망되는 FSH 분획의 용리 전에 덜 산성인 FSH 아이소형을 용리하기 위해 pH 5.0("pH 5.0에서의 농축") 또는 pH 4.5("pH 4.5에서의 농축")에서의 세척 완충액을 이용한 결합된 FSH의 세척에 의해 수행된다. 연마 단계로서, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용하여 높은 순도로 FSH가 획득된다.

실시예 2: FSH(본 발명)를 이용한 II상 임상 연구

FSH 제조물의 다양한 투여량의 치료 효능 및 안전성을 연구하기 위해 FSH(본 발명) 및 비교측정기 작용제(Gonal-F)를 이용한 II상 임상 연구를 수행하였다.

세포질내 정자 주입(ICSI) 치료에 대한 적응증을 갖는 240명의 무작위화된 여성 인간 환자를 연구에 등록시켰다. 각각 40명의 환자를 포함하는 6개의 상이한 치료 아암(arm)에서, 환자를 하루에 52.5 IU, 75 IU, 112.5 IU 또는 150 IU FSH(본 발명), 2일마다 150 IU FSH(본 발명) 또는 하루에 150 IU Gonal-f로 처리하였다.

각각의 환자에 대한 치료 주기는 GnRH 효능제 프로토콜을 이용한 내인성 호르몬 수준의 하향조절, FSH의 투여에 의한 난포 성장의 자극, 난모세포의 회수, ICSI 및 배아 이식을 포함하였다. 적어도 하나의 난포가 적어도 20 mm의 직경에 도달할 때까지 FSH를 이용한 자극을 18일 이하 동안 수행하였다. FSH 처리의 평균 기간은 약 9 내지 10일이었다. 이후, 마지막 FSH 용량 약 1일 후 단일 용량의 hCG의 투여에 의해 난모세포의 최종 성숙을 유도하였다. hCG 투여 32 내지 36시간 후, 적어도 12 mm의 크기를 갖는 모든 난포를 천자시켰다. 난모세포 회수 2 내지 3일 후, 선택된 난모세포를 ICSI에 의해 수정시키고, 환자 당 최대 2개의 배아를 이식하였다.

결과로서, FSH(본 발명)를 이용한 난포 성장의 자극은 Gonal-f 용량의 절반 또는 3/4의 Gonal-f를 이용한 것보다 많은 수의 난포 및 회수된 난모세포를 발생시켰다:

표 2: FSH (본 발명) 및 Gonal -f의 비교

결과는 Gonal-f에 비해 FSH(본 발명)가 더 낮은 용량(Gonal-f의 용량의 단지 50%로 하향)에서도 유의하게 증가된 수의 큰 난포의 발달을 유도하는 것을 나타낸다. 마찬가지로, 또한 회수된 난자 난구세포 복합체(COC)의 수, 중기 II 난모세포의 수 및 성공적으로 수정된 난모세포의 수는 2배까지 더 높은 용량의 Gonal-f와 비교하는 경우 본 발명에 따른 FSH에 대해 유의하게 더 높다. 이는 FSH(본 발명)의 우수한 활성을 인상적으로 입증한다.

더욱이, 확인된 발달된 난포를 기초로 한 성공적인 수정의 상대 수가 또한 FSH(본 발명)에 대해 증가된다. 예를 들어, 2일마다 150 IU의 FSH(본 발명)로 처리된 환자에서, 처리된 환자에서 확인된 적어도 12 mm의 직경을 갖는 모든 난포의 59%가 성공적으로 수정되었고, 2 코어 난모세포(2PN)를 형성하였다. 대조적으로, Gonal-f로 처리된 환자에서 확인된 12 mm 이상의 난포의 단지 50%가 성공적으로 수정되었다. 그러므로, FSH(본 발명)에 의해 유도된 난포는 Gonal-f에 의해 유도된 것보다 높은 품질을 나타내었다.

실시예 3: FSH(본 발명)를 이용한 I상 임상 연구

FSH 제조물의 치료 효능을 결정하기 위해 FSH(본 발명) 및 비교측정기 작용제(Gonal-F 및 Bravelle)를 이용한 I상 임상 연구를 수행하였다.

FSH를 여성 지원자에게 투여하고, 약동학 및 약역학 파라미터를 결정하였다. 첫번째 연구에서, 건강한 여성 지원자에 단일 피하 용량으로 25 IU, 75 IU, 150 IU 또는 300 IU FSH(본 발명)를 투여하고, 투여전 크기와 관련한 평균 난포 크기를 투여 4일 후로부터의 매일 측정에 의해 결정하였다. 대조군으로서, 지원자에 위약 또는 100 IU의 Bravelle 또는 Gonal-F를 투여하였다. 도 1, 2 및 3에 제시된 바와 같이, 평균 난포 크기는 FSH(본 발명)의 단일 용량 후에 유의하게 증가하였다. 난포 크기에서의 증가는 용량 의존적이었다. 난포 크기에서의 증가는 위약 또는 참조 FSH 제조물(Bravelle 및 Gonal-F)와 비교하는 경우 유의하게 더 컸다. 그러므로, FSH(본 발명)는 일반적으로 사용되는 FSH 제조물보다 난포 성장을 유도하는데 있어서 훨씬 더 높은 효능을 가지며, 단일 용량 후에도 유의한 난포 성장을 유도할 수 있는 것을 나타내었다.

또한, 다수의 용량 임상 연구를 수행하였다. FSH(본 발명), Gonal-F 및 Bravelle을 7일 동안 150 IU의 매일 용량으로 투여하였다. 추가의 코호트에서, FSH(본 발명)를 7일 동안 75 IU의 매일 용량으로 제공하였다. 또 다른 코호트에서, FSH(본 발명)를 150 IU의 용량으로 2일마다 투여하였다. FSH를 월경 주기의 하향조절 후에 투여하여, 난포 성장을 자극시켰다. FSH, 인히빈-b 및 에스트라디올의 혈청 수준을 모니터하고, 난포의 수 및 크기를 결정하였다. 도 4에 제시된 바와 같이, FSH의 혈청 수준은 동일한 용량으로 투여된 상이한 FSH 제조물에 대해 동등하였다. 절반 용량 또는 2일마다 제공된 FSH(본 발명)는 FSH 혈청 수준을 반감시켰고, 2일마다의 투여는 예상된 변동을 나타내었다(도 4 참조). 그러나, 도 5 내지 7에 제시된 바와 같이, FSH(본 발명)의 투여는 Gonal-F 및 Bravelle에 비해 유도된 난포의 현저하게 증가된 수 및 크기를 발생시켰다. 절반 용량으로 투여되는 경우, FSH(본 발명)는 Gonal-F의 난포 성장과 동등한 난포 성장을 발생시켰다(도 8 참조). 더욱이, 2일마다의 FSH(본 발명)의 투여는 2일마다 대신 매일 동일 용량으로 투여되는 Gonal-F와 비교하는 경우 동등한 수이나 현저하게 증가된 크기의 유도된 난포를 발생시킨다(도 9 참조). 투여되는 FSH의 동일량을 발생시키는 2일마다의 150 IU FSH(본 발명) 및 매일의 75 IU FSH(본 발명)의 투여와 비교하는 경우 난포 크기에서의 유사한 증가가 또한 관찰될 수 있다. 그러므로, 동일량의 FSH(본 발명)는 매일이 아닌 2일마다 제공되는 경우 훨씬 증가된 난포 크기를 발생시킬 수 있다. 상기 차이는 또한 환자 혈청에서의 인히빈-b 및 에스트라디올 수준에서도 관찰되며, 150 IU로 2일마다 제공되는 FSH(본 발명)는 75 IU로 매일 투여되는 FSH(본 발명) 또는 150 IU로 매일 투여되는 Gonal-F에 비해 유의하게 증가된 수준을 나타낸다(도 10 참조).

또한, FSH(본 발명)로 유도된 난포의 높은 수는 환자에서 수일 동안 관찰된다. 특히, 적어도 10 mm의 크기를 갖는 난포의 수는 평균적으로 약 5일 동안 FSH(본 발명)로 처리된 환자에서 유지된다(도 11 참조). 예를 들어, 큰 난포의 수는 8/9 내지 14/15일 전체에 걸쳐, 즉, FSH 투여 종료 후에 본질적으로 일정하다. 대조적으로, Gonal-f는 9일 및 10일에서 큰 난모세포의 수에서 피크를 나타내고, 이후 신속히 감소한다. 그러므로, FSH(본 발명)는 FSH 적용의 종료 후에 수일 동안 난포의 발달 상태를 유지하는 끌림 효과(trailing effect)를 나타낸다. 이러한 효과는 불임 치료에 중요한데, 이는 최종 난모세포 성숙의 성공적인 유도를 위한 범위를 확장시키기 때문이다. 일반적인 치료에서, hCG 또는 다른 배란 유도제는 FSH 투여 종료 약 1일 후에 환자에게 투여되어야 한다. 그 밖에, 유도된 큰 난포는 회귀할 것이며, 난모세포의 최종 성숙은 더 이상 불가능하다. FSH(본 발명)를 이용하여, 난모세포는 FSH 투여의 종료 후에 달성된 크기 및 성숙 상태를 유의하게 길게, 즉, 약 5 내지 6일 동안 유지한다. 그러므로, 예를 들어, hCG를 이용한 최종 난모세포 성숙의 자극 및 배란의 유도는 Gonal-f의 사용에 비해 난포 성장의 자극을 위해 FSH(본 발명)를 이용하는 경우 훨씬 긴 시간 간격 동안 가능하다.

더욱이, FSH의 약동학을 상기 기재된 다수 투여 요법 후에 분석하였다. 이를 위해, FSH의 혈청 수준을 다수의 투여 요법 후에 모니터하였다. 도 12는 매일 투여되는 75 또는 150 IU FSH(본 발명) 및 2일마다 투여되는 150 IU FSH(본 발명), 선형 스케일로 매일 투여되는 150 IU Bravelle 및 150 IU QD Gonal-f의 다수 피하 주사의 마지막 주사 후 혈장 FSH에 대한 평균 농도 대 시간 곡선을 제시한다. 플롯은 다수 주사의 마지막 피하 주사 후의 혈장 FSH 농도에서의 증가를 나타낸다. 피크 혈장 FSH 농도(C_max) 후, 혈장 FSH 농도는 기준선 수준까지 감소하였다. 혈장 FSH의 C_max는 FSH(본 발명)의 용량 수준이 증가함에 따라 증가하였다. 150 IU FSH(본 발명)가 매일 1회 대신 2일마다 1회 투여된 경우 C_max는 감소하였다. 매일 투여되는 150 IU FSH(본 발명)와 동일 용량 수준의 비교측정기 Bravelle 및 Gonal-f의 농도 대 시간 플롯(도 12)을 비교하는 경우, 곡선이 매우 유사한 것이 관찰될 수 있다. 150 IU FSH(본 발명)(12.989 mIU/㎖), Bravelle(13.370 mIU/㎖), 및 Gonal-f(12.281 mIU/㎖) 후의 C_max는 동등하였다. Bravelle(1172.066 h*mIU/㎖)의 AUC_0-last는 FSH(본 발명)(824.897 h*mIU/㎖) 및 Gonal-f(917.400 h*mIU/㎖)의 AUC_0-last보다 높았다. 또한, 상이한 FSH 제조물의 순환 반감기 t_1/ ₂은 동등하였고, Bravelle의 순환 반감기 t_1/2은 약간 더 높았다(FSH(본 발명): ~33시간; Gonal-f: ~ 36시간; Bravelle: ~ 54시간). 이는 Bravelle이 유의하게 낮은 약학적 효능을 나타냄에 따라 주목할만 하다(상기 참조).

결론적으로, FSH(본 발명)가 동일량의 Gonal-F 및 Bravelle에 비해 난포 성장과 관련하여 훨씬 더 높은 치료 효능을 갖는 것이 I상 임상 연구에서 입증되었다. 또한, FSH(본 발명)가 2일마다 투여되는 투여 요법은 매일 투여에 비해 현저하게 증가된 난포 크기를 발생시킨다.

실시예 4: 과립층 세포 검정

과립층 세포 검정을 수행하기 위해, 일차 세포를 난모세포의 수거 동안 IVF 환자의 난포액으로부터 분리시켰다. 다른 세포 유형, 예를 들어, 적혈구 세포를 제거하는 피콜(Ficoll) 구배 원심분리 후, 과립층 세포를 안드로스텐디온 또는 테스토스테론을 함유하는 배양 배지 중에서 5-7일 동안 24 내지 96 웰 플레이트 포맷에 시딩하였다. 상기 기간 후, 세포(웰 당 2 내지 4*10⁴ 세포)를 도표에 제시된 단계(웰 당 400 ㎕ 배지)에서 1 pg/㎖ 내지 2 ㎍/㎖ 범위의 FSH로 자극시켰다. 인큐베이션 3 내지 4시간 후, cAMP 검정을 수행하기 위해 상층액의 절반을 수거하였다. 또 다른 24시간 후, 세포를 나머지 상층액에서의 동결 해동에 의해 용해시켰다. 용해질을 프로게스테론 및 에스트라디올 검정에 적용시켰다.

FSH(본 발명) 및 Gonal F의 비교

첫번째 세트의 실험에서, FSH(본 발명)를 Gonal F(Merck Serono SA)와 비교하였다. Gonal F는 CHO 세포에서 재조합적으로 생성되는 FSH이다. 결과는 도 13 내지 15에 제시된다. Gonal F 및 FSH(본 발명) 생성물의 동등한 FSH 농도에서 이차 메신저 cAMP가 동등한 양으로 생성되는 반면, 스테로이드 프로게스테론 및 에스트라디올은 CHO 세포에서 재조합적으로 생성되는 FSH(Gonal F)에 비해 FSH(본 발명) 생성물의 경우에서 훨씬 낮은 FSH 농도로 방출된다.

FSH(본 발명) 및 Fostimon의 비교

또 다른 세트의 실험에서, FSH(본 발명)를 인간 소변에서 분리된 FSH 생성물인 Fostimon(IBSA Institut Biochimique SA)과 비교하였다. 결과는 도 16 내지 18에 제시된다. cAMP 수준은 둘 모두의 생성물에 대해 FSH의 동등한 용량 범위에서 유사하게 상승한 반면, 성 스테로이드는 Fostimon에 비해 FSH(본 발명)의 유의하게 낮은 농도에서 생성된다.

주: 검정은 상이한 공여자를 이용하여 수행되므로, 자극 프로파일에서의 차이는 각각의 검정에서 사용된 공여자를 설명할 수 있다.

실시예 5: 스틸만- 폴리 검정

FSH의 활성을 또한 스틸만-폴리 검정에 의해 결정하였다. 검정을 약전에 따라 수행하였다. 특히, 미성숙 암컷 래트에서의 난소 중량 증가를 3일 동안 매일 각각 제공된 3개의 상이한 FSH 농도의 투여 후에 측정하였다. 효능을 평행선 평가를 이용하여 계산하였다. 본 발명에 따른 FSH 제조물의 표준 국제 단위(IU)를 결정하기 위해 스틸만-폴리 검정을 이용하였다.

스틸만-폴리 검정에 의해 입증되는 바와 같이, FSH(본 발명) 및 소변 및 재조합 표준 FSH의 생체내 활성은 래트에서 유사하였다(도 19 참조).

실시예 6: 글리코프로파일링 ( Glycoprofiling )

상이한 FSH 제조물의 글리코프로파일을 당화의 구조 분석에 의해 결정하였다. 글리코프로파일링은 당화 부위의 복잡한 글리칸 구조에 대한 정보를 발생시킨다. 글리코프로파일링을 위해, 온전한 N-글리칸이 단백질 코어로부터 방출되었고, N-글리칸의 환원 말단이 형광 마커로 표지되었다. 표지된 N-글리칸의 정제된 샘플이 UPLC에 의해 분리되었다. N-글리칸 구조의 상대 몰 과다의 계산을 위해 형광측정법 검출을 기초로 한 피크 영역이 이용되었다. FSH에 대한 측정된 데이터가 표 3에 요약되어 있다. 값은 단당류(예를 들어, 푸코스)의 관심 유형을 함유하는 N-글리칸의 상대 몰 함량이다.

표 3: 다양한 당화 특성의 상대량

F: 푸코스를 함유하는 글리칸; S: 적어도 하나의 시알산을 함유하는 글리칸; S0: 시알산을 함유하지 않는 글리칸; S1: 1개의 시알산을 함유하는 글리칸; S2: 2개의 시알산을 함유하는 글리칸; S3: 3개의 시알산을 함유하는 글리칸; S4: 4개의 시알산을 함유하는 글리칸; G: 갈락토스를 함유하는 글리칸; B: 이등분면 N-아세틸갈락토사민을 함유하는 글리칸; Sulf: 황산화 N-글리칸

¹: 문헌 값(Hard, K. et al. (1990) European Journal of Biochemistry 193, 263-271)

표시된 단위를 갖는 FSH에 대한 N-글리칸의 상대량이 제시된다. Puregon은 CHO 세포에서 생성된 또 다른 재조합 인간 FSH이다.

또한, FSH의 글리칸 내의 2,3-커플링된 시알산 및 2,6-커플링된 시알산의 비를, 시알리다제 A(2,3- 및 2,6-커플링된 시알산 분해) 및 시알리다제 S(2,3-커플링된 시알산만 분해함)에 의해 방출된 시알산의 양을 비교함으로써 분석하였다.

표 4: 시알산 결합의 상대량

FSH(본 발명)에서, 2,3-커플링된 시알산보다 2,6-커플링된 시알산을 더 포함하는 시알산 잔기는 약 1:1의 비의 2,3- 및 2,6-결합에 의해 글리칸에 커플링되는 반면, 소변 FSH Bravelle(Ferring Pharmaceuticals Inc.)에서, 상기 비는 약 3:1로 2,3-결합된 시알산이 선호된다. CHO 세포에서의 재조합 생성으로 인해, Puregon(Organon/EssexPharma) 및 Gonal F(Merck Serono)는 어떠한 이등분면 N-아세틸갈락토사민도 갖지 않으며, 2,3-커플링된 시알산만 포함한다.

안테나성, 말단 갈락토스 단위 및 Z-수를 상기 측정, 및 FSH로부터의 방출 후의 글리칸의 전하 분포의 결정에 의해 계산하였다.

표 5: 다양한 FSH의 당화의 안테나성

Bi: 바이안테나리 N-글리칸; Tri: 트리안테나리 N-글리칸; Tetra: 테트라안테나리 N-글리칸

¹: 문헌 값(Gervais, A. et al. (2003) Glycobiology 13(3), 179-189)

²: 문헌 값(Hard, K. et al. (1990) European Journal of Biochemistry 193, 263-271)

FSH 상의 바이-, 트리- 및 테트라안테나리 N-글리칸의 상대량이 제시된다.

표 6: 다양한 FSH의 Z-수

FSH 제조물의 Z-수, 즉, 상대 산도가 제시된다. 보다 높은 Z-수는 보다 산성인 FSH 제조물을 나타낸다.

결론적으로, 본 발명에 따른 FSH(FSH(본 발명))는 높은 정도의 이등분면 N-아세틸글루코사민, 높은 안테나성, 높은 정도의 시알화 및 높은 황산화 정도를 갖는다. 상기 3개의 당화 파라미터 중 하나 이상으로 인해, FSH(본 발명)는 통상적인 재조합 또는 소변 FSH 제조물에 비해 우수한 활성을 갖는 것으로 추정된다.

또한, FSH(본 발명)는 약 1:1의 2,3- 대 2,6-시알화의 비 또는 심지어 더 높은 양의 2,6-시알화를 갖는다.

또한, FSH 제조물의 글리칸 구조를 또한 방출된 글리칸의 질량분광법에 의해 분석하였다. 하기 결과가 획득되었다:

표 7: 다양한 당화 특성의 상대량

하기 특성을 갖는 글리칸의 상대량이 제시된다:

F: 푸코스; S0: 시알산 없음; S1: 1개의 시알산; S2: 2개의 시알산; S3: 3개의 시알산; S4: 4개의 시알산; S>0: 적어도 1개의 시알산; G0: 갈락토스 없음; G1: 1개의 갈락토스; G2: 2개의 갈락토스; G3: 3개의 갈락토스; G4: 4개의 갈락토스; G>0: 적어도 1개의 갈락토스; B: 이등분면 GlcNAc

표 8: 다양한 FSH의 당화의 안테나성

표 9: 황산화된 글리칸의 상대량

설페이트 기를 갖는 FSH 상의 N-글리칸의 상대량이 제시된다.

독일미생물보존센터(DSMZ)

DSMACC3078

20100728

SEQUENCE LISTING <110> Glycotope GmbH <120> Controlled ovarian hyperstimulation with improved recombinant human follicle-stimulating hormone <130> indicate your ref <150> US 61/981,621 <151> 2014-04-18 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro 1 5 10 15 Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys 20 25 30 Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 35 40 45 Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser 50 55 60 Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr 65 70 75 80 Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln 35 40 45 Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 60 Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80 Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 100 105 110

Claims

(a) 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 35 내지 약 250 IU의 FSH의 평균량인 투여 요법을 이용하여 재조합 FSH 제조물을 여성 대상체에 투여하는 단계;
(b) 12 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포가 존재하고/하거나, 적어도 17 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우 배란을 촉발시키는 단계;
(c) 여성 대상체로부터 다수의 난모세포를 획득하는 단계로서, 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5개의 난모세포가 획득되고/되거나, 여성 대상체로부터 적어도 5개의 난모세포가 획득되는, 단계를 포함하는,
여성 대상체에서 다수의 난포의 발달을 자극하기 위한 조절된 난소 과다자극을 위한 방법으로서,
제조물 내의 재조합 FSH가,
(i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 20%의 상대량의 이등분면(bisecting) N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및
(ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산의 특징을 포함하는 당화 패턴을 갖는, 방법.
제 1항에 있어서,
단계 (a)에서, 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 50 내지 약 125 IU의 FSH의 평균량인 투여 요법이 이용되고;
단계 (b)에서, 적어도 17 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우 배란이 촉발되고;
단계 (c)에서, 적어도 5개의 난모세포가 난자 난구세포 복합체(COC)의 형태로 여성 대상체로부터 획득되고, 이들 난모세포 중 적어도 4개가 중기 II 난모세포이고;
제조물 내의 재조합 FSH가,
(i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 약 25% 내지 약 50%의 범위 내의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸;
(ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 약 53% 내지 약 80%의 범위 내의 상대량의 2,6-커플링된 시알산;
(iii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 5%의 상대량의 황산화된 글리칸;
(iv) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 5% 이하의 상대량의 외부 아암(arm) 푸코스를 갖는 글리칸;
(v) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 30%의 상대량의 코어 푸코스를 갖는 글리칸;
(vi) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 16%의 상대량의 적어도 테트라안테나리 글리칸;
(vii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 88%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸; 및
(viii) 적어도 210의 Z 수의 특징을 포함하는 당화 패턴을 갖는, 방법.
제 1항에 있어서, 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 50 내지 약 125 IU의 FSH의 평균량인 투여 요법이 단계 (a)에서 사용되는 방법.
제 1항에 있어서, 약 50 내지 약 125 IU의 FSH가 매일 투여되거나; 약 100 내지 약 250 IU의 FSH가 2일마다 투여되거나; 약 150 내지 약 375 IU의 FSH가 3일마다 투여되는 투여 요법이 단계 (a)에서 사용되는 방법.
제 1항에 있어서, 단일 용량들의 합이 하루에 최대 약 70 내지 약 250 IU의 FSH의 평균량인 투여 요법이 단계 (a)에서 사용되고, 여성 대상체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 방법:
- 적어도 35세, 바람직하게는 약 37세 내지 약 50세 범위 내의 연령을 갖는 여성 대상체;
- 1.5 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 약 0.25 ng/㎖ 내지 약 1.25 ng/㎖의 범위 내의 항-뮬러리안 호르몬(AMH)의 혈청 수준을 갖는 여성 대상체;
- 둘 모두의 난소의 합계로서 9 이하, 바람직하게는 4 내지 8의 범위 내의 동난포 수를 갖는 여성 대상체;
- 적어도 25 ㎏/m², 바람직하게는 약 28 ㎏/m² 내지 약 45 ㎏/m²의 범위 내의 신체 질량 지수(BMI)를 갖는 여성 대상체; 및
- 4개 미만의 난모세포의 발달이 유도되는 이전의 통상적인 FSH 자극 주기를 겪은 여성 대상체.
제 1항에 있어서, 재조합 FSH 제조물이 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물, 특히 Gonal-f에 대해 권장된 양의 75% 이하, 바람직하게는 50% 이하인 IU의 양으로 투여되는 투여 요법이 단계 (a)에서 사용되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이 조절된 난소 과다자극의 단지 1회의 주기를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 난모세포가 난자 난구세포 복합체(COC)의 형태로 단계 (c)에서 획득되고/되거나, 단계 (c)에서 획득된 난모세포 중 적어도 4개가 중기 II 난모세포인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이, (d) 단계 (c)에서 획득된 적어도 1개의 난모세포를 수정시키는 단계; 및 (e) 적어도 1개의 수정된 난모세포 또는 이로부터 유래된 배아를 여성 인간 환자로 이식하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 방법이 단계 (d) 전에 단계 (c)에서 획득된 적어도 1개의 난모세포를 동결시키거나 유리화시키는 단계; 또는 단계 (e) 전에 단계 (d)에서 획득된 적어도 1개의 수정된 난모세포 또는 이로부터 유래된 적어도 1개의 배아를 동결시키거나 유리화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 9항에 있어서, 단계 (c)에서 획득된 난모세포의 부분집단만이 단계 (d)에서 수정되고/되거나, 단계 (d)에서 수정된 난모세포의 부분집단만이 단계 (e)에서 여성 인간 환자로 이식되고, 단계 (d)에서 수정되지 않은 난모세포 또는 단계 (e)에서 여성 인간 환자로 이식되지 않은 수정된 난모세포 또는 배아가 이후의 사용을 위해 임의로 동결되거나 유리화되는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (a)에서의 재조합 FSH 제조물의 투여가 또 다른 생식샘자극호르몬, 예를 들어, LH 또는 hCG 또는 난포 성장을 유도하거나 향상시키는 또 다른 작용제의 동시 투여를 포함하지 않는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (a)에서의 재조합 FSH 제조물의 투여가 GnRH 효능제 또는 GnRH 길항제의 이전 및/또는 동시 투여를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 여성 대상체가 보조 생식 기술(ART), 특히 체외수정(IVF), 세포질내 정자 주입(ICSI), 생식세포 자궁관내 이식(GIFT), 접합자 자궁관내 이식(ZIFT), 및/또는 배아 이식을 포함하는 보조 생식 기술을 겪는 방법.
제 1항에 있어서, 등록 번호 DSM ACC3078로 수탁된 인간 세포주 GT-5s, 또는 이로부터 유래된 세포주 또는 이와 동종인 세포주에서의 생성에 의해 획득 가능한 방법.
제 1항에 있어서, 당화 패턴이 하기 특징을 포함하는 방법:
(i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 약 25% 내지 약 50%의 범위 내의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸;
(ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 약 53% 내지 약 80%의 범위 내의 상대량의 2,6-커플링된 시알산;
(iii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 3%의 상대량의 황산화된 글리칸;
(iv) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 5% 이하의 상대량의 외부 아암(arm) 푸코스를 갖는 글리칸;
(v) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 30%의 상대량의 코어 푸코스를 갖는 글리칸;
(vi) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 16%의 상대량의 적어도 테트라안테나리 글리칸;
(vii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 88%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸; 및
(viii) 적어도 210의 Z 수.
(a) 재조합 FSH 제조물을 투여함으로써 여성 대상체에서 난포 성장을 유도하거나 향상시키는 단계; 및
(b) 이후, 배란을 촉발시키는 단계를 포함하는, 여성 대상체에서 난포 성숙을 자극하기 위한 방법으로서,
제조물 내의 재조합 FSH가,
(i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 20%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및
(ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산의 특징을 포함하는 당화 패턴을 갖고,
단계 (b)에서의 배란 촉발이 단계 (a)에서의 재조합 FSH 제조물의 투여 종료 적어도 48시간 후에 개시되는, 방법.
제 17항에 있어서, 단계 (b)에서의 배란 촉발이 단계 (a)에서의 재조합 FSH 제조물의 투여 종료 약 60시간 내지 약 120시간, 바람직하게는 약 72시간 내지 약 96시간 후에 개시되는 방법.
제 17항에 있어서, 단계 (b)에서의 배란 촉발이 hCG 또는 이의 유도체를 투여함으로써 수행되는 방법.
(a) 재조합 FSH 제조물이 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양의 80% 이하인 IU의 양으로 투여되는 투여 요법을 이용하여 재조합 FSH 제조물을 여성 대상체에 투여하는 단계;
(b) 12 mm 이상의 평균 직경을 갖는 다수의 난포가 존재하고/하거나, 적어도 17 mm의 직경을 갖는 적어도 하나의 난포가 존재하는 경우 배란을 촉발시키는 단계;
(c) 여성 대상체로부터 다수의 난모세포를 획득하는 단계로서, 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물에 대해 권장된 양을 이용한 유사한 치료에 비해 여성 대상체 당 평균적으로 적어도 5% 더 많은 난모세포가 획득되는 단계를 포함하는, 여성 대상체에서 다수의 난포의 발달을 자극하기 위한 조절된 난소 과다자극을 위한 방법으로서,
제조물 내의 재조합 FSH가,
(i) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 글리칸 중 적어도 20%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및
(ii) 제조물 내의 FSH에 부착된 모든 시알산 잔기 중 적어도 40%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산의 특징을 포함하는 당화 패턴을 갖는, 방법.
제 20항에 있어서, 재조합 FSH 제조물이 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물, 특히 Gonal-f에 대해 권장된 양의 50% 이하인 IU의 양으로 투여되는 투여 요법이 단계 (a)에서 사용되는 방법.
제 20항에 있어서, 단계 (c)에서, 동일 치료 상황에서 CHO 세포에 의해 생성되는 재조합 FSH 제조물, 특히 Gonal-f에 대해 권장된 양을 이용한 유사한 치료에 비해 평균적으로 적어도 5% 더 많은 중기 II 난모세포 및/또는 적어도 5% 더 많은 난자 난구세포 복합체가 획득되는 방법.