KR20160136318A

KR20160136318A - 암의 치료를 위한 결합 방법

Info

Publication number: KR20160136318A
Application number: KR1020167026143A
Authority: KR
Inventors: 대런 샤프렌; 고프 제프리 아우
Original assignee: 비랄리틱스 리미티드
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2015-02-27
Publication date: 2016-11-29
Also published as: EP3441084A1; US11389495B2; KR102407019B1; JP2017506662A; WO2015127501A1; AU2020230335A1; AU2015222685A1; SG10201801562PA; CN107073099A; CA2940570A1; US20190134119A1; EP3110443A1; US20200297788A1; US20170000832A1; EP3110443A4; SG11201607130RA; CN107073099B; JP2021063120A; JP6857498B2

Abstract

본 발명은 포유동물에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제의 공동 투여와 결합되어 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 직접 주입이나 전신 투여 또는 소포 내 투여를 통해 암 또는 종양에 전달하는 단계를 포함하는 종양들을 치료하는 방법들에 관한 것이다.

Description

암의 치료를 위한 결합 방법{COMBINATION METHOD FOR TREATMENT OF CANCER}

본 발명은 포유동물에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제(immunostimulatory agent)와 결합되는 종양 용해성 바이러스(oncolytic virus) 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 직접 주입 또는 전신 투여를 통해 종양 또는 암에 전달하는 단계를 포함하는 종양들을 치료하는 방법들에 관한 것이다.

본 출원은 2014년 2월 27일에 출원되었고, 그 개시 사항들이 전체적으로 여기에 참조로 포함되는 오스트레일리아 임시 특허 출원 제2014900647호(발명의 명칭: "암의 치료를 위한 결합 방법(Combination method for treatment of cancer)")를 우선권으로 수반하는 출원이다.

흑색종(melanoma) 치료를 위한 몇몇 새로운 면역 치료적 접근들이 최근의 임상 시험들에서 유망한 결과들을 보여주었다. 상기 항체를 기초로 하는 치료인 이필리무맙(ipilimumab)은 2011년 3월에 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 승인되었고, 페이스(Phase) III 임상 시험들에서 전이성 흑색종이 있는 환자들의 증진된 전체적인 생존을 입증하였다. 이필리무맙(상표명: 여보이®(Yervoy®), 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb))은 단백질 세포독성 T-림프구-관련 항원 4(CTLA-4)(CD152)을 표적으로 하는 단일클론성 항체이다. CTLA-4를 통한 신호 전달은 세포독성 T-림프구(CTL)들에 대한 억제 효과를 가지는 것으로 알려져 있으며, 이필리무맙으로 이러한 억제 신호를 차단함에 의해, CTL들은 성공적으로 암세포들의 파괴를 표적으로 할 수 있다. 흑색종 환자들에서, 이필리무맙 단독으로의 전체적인 생존은 당단백질(glycoprotein) 100(gp100) 펩티드 백신으로 치료된 환자들에 대해 6.4개월에 비하여 10.1개월이었다[Hodi 등의 2010]. 페이스 III 연구들에서, 이전에 치료된 진행 흑색종 환자들의 응답률은 후속되는 이필리무맙 치료만의 11%였고, 치료 경험이 없는 환자들의 이필리무맙 플러스 다카바진(dacarbazine) 치료에서 15%였다(Hodi 등의 2010; Robert 등의 2011). 이들 시험들 모두에서, 이필리무맙으로 증진된 전체적인 생존이 사망의 가능성에서 34%(백신과 비교할 경우) 및 28%(다카바진 단독과 비교할 경우)의 감소로 증거가 되어 분명하게 나타났다. 이필리무맙이 다카바진과 결합되어 사용되었을 때, 가장 우수한 전체적인 반응의 평균 기간은 다카바진 단일치료로의 8.1개월에 비해 19.3개월이었다.

암의 면역 치료를 위해 표적으로 되는 다른 면역관문 분자(immune-checkpoint molecule)는 활성화된 T 세포들, B 세포들 및 골수 세포들의 표면상에서 발견되는 세포 예정사(programmed cell death 1: PD-1)(CD279)이다[Keir 등의 2008]. 분자 세포 예정사 1 리간드(ligand) 1(PD-L1)(CD274) 또는 PDL-2(CD273)가 PD-1 수용체에 결합될 때, 상기 T 세포가 억제됨에 따라 잠재적인 항종양 반응들을 제한한다. 현재, 항종양 T 세포 면역을 자극하는 수단들로서 PD-1 및 PD-L1을 표적으로 하도록 설계된 항체들의 범위, 즉 니볼루맙(nivolumab)(BMS-936558, 브리스톨-마이어스 스큅) 및 항-PD-L1 항체 BMS-936559가 존재한다(Brahmer 등의 2012; Topalian 등의 2012). PD-1 및 PD-L1에 대한 이들 항체들은 CTLA-4와 결합되어 임상전의 연구들의 범위 및 페이스 III 인간 시험들에서 사용되었다[Curran 등의 2010; Merelli의 2014; Ott 등의 2013].

콕삭키바이러스(Coxsackievirus) A21(CVA21)은 바이러스-세포 진입 수용체 세포간 접합 분자(intercellular adhesion molecule)-1(ICAM-1) 및/또는 붕괴 촉진 인자(decay accelerating factor: DAF)를 지니는 악성 세포들을 우선적으로 감염시키고 파괴하는 능력을 갖는 자연 피코르나바이러스(picornavirus)이다. 앞서 본 발명자들은 면역 결핍 마우스들을 이용한 임상전의 이종이식편 모델들의 범위에서 흑색종 세포들에 대해서 뿐만 아니라 유방암, 전립선암, 대장암 및 난소암과 같은 다른 암들(Shafren 등의 2004; Au 등의 2005; Au 등의 2007; 국제 공개 특허 WO 2001/037866)에 대해서와 혈액암들(국제 공개 특허WO 2006/017914)]에 대한 CVA21의 효능을 입증하였다.

암의 치료, 완화 또는 예방을 위한 새로운 개선된 방법들 및 종양들이나 암이 있는 대상들의 생존을 증진시키는 방법들에 대한 요구가 존재한다.

본 발명자들은 CVA21 감염 및 후속하는 종양 세포들의 용해가 항종양 면역을 자극하는 흑색종(melanoma) 항원들을 함유하는 세포 잔해물의 방출을 가져오며, 이에 따라 개인에 맞춰진 제자리 항암 백신으로 작용하는 점을 제시한다. 먼저 본 발명자들은 면역적격(immune-competent) B16-ICAM-1 흑색종 모델을 확립하였고, 여기서 CVA21에 정상적으로 저항하는 B16 세포들은 이들이 감염을 허용하게 만들도록 인간 ICAM-1로 세포 감염되었다. 대부분의 항암 백신들의 항종양 면역의 일반적으로 낮은 유도가 정해지기 때문에[Blanchard 등의 2013; Garbe 등의 2011], 본 발명자들은 CVA21 바이로테라피(virotherapy)와 결합된 면역 자극 항-PD-1 항체의 사용 및 CVA21 바이로테라피와 결합된 면역 자극 항-CTLA-4 항체의 별도의 사용뿐만 아니라 항-PD-1 항체 및 항-CTLA-4 항체 모두와 결합된 CVA21 바이로테라피를 조사하였다.

여기에 입증되는 바와 같이, 종양 용해성 CVA21과 결합되는 쥐의 항-PD-1 항체 및 쥐의 항-CTLA-4 항체로 여기에 예시되는 면역 관문(immune checkpoint) 분자들을 표적으로 하는 면역 자극제(immunostimulatory agent)들의 사용이 흑색종의 쥐의 B16-ICAM-1 모델에서 종양 부담(tumour burden), 종양 궤양형성(ulceration)의 비율들을 감소시키고 생존을 연장시켜 치료적으로 유익할 수 있었다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 대상 내의 암의 치료를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제의 공동 투여와 결합되는 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여를 통해 전달하는 단계를 포함한다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 대상 내의 방광암의 치료를 위한 방법들 제공하며, 상기 방법은 대상에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제의 공동 투여와 결합되는 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여 또는 소포내(intravesicular) 투여를 통해 전달하는 단계를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 피코르나바이러스과(Family Picornaviridae)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 종양 세포의 표면상의 세포간 접합 분자-1(ICAM-1) 및/또는 붕괴 촉진 인자(DAF)에 결합되는 피코르나바이러스과의 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 상기 종양 세포의 표면상의 세포간 접합 분자-1(ICAM-1) 및/또는 붕괴 촉진 인자(DAF)에 결합되는 엔테로바이러스속(Genus Enterovirus)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 엔테로바이러스는 인간 엔테로바이러스 C이다. 일 실시예에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 상기 종양 세포의 표면상의 세포간 접합 분자-1(ICAM-1) 및/또는 붕괴 촉진 인자(DAF)에 결합되는 A군(Group A) 콕삭키바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 콕삭키바이러스 A21이다.

일 실시예에 있어서, 상기 면역 자극제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD134, CD134L, CD137, CD137L, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, B7RP1, ICOS, TIM3, GAL9, CD28 또는 OX-40으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 관문 분자를 표적으로 하는 약제이다. 일 실시예에 있어서, 상기 면역 자극제는 표면 표출된 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4 또는 OX-40d[ 특이적으로 결합되는 약제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 면역 자극제는 표면 표출된 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4 또는 OX-40에 특이적으로 결합되는 단일클론성 항체들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 전신 경로를 통한 면역 자극제의 투여 이전에 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 직접 주입 또는 전신 투여 혹은 소포내 투여를 통해 전달하는 단계를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 대상에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제의 투여에 후속하여 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 직접 주입 또는 전신 투여 혹은 소포내 투여를 통해 전달하는 단계를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 치료는 상기 치료의 부존재에서 추정되는 생존 시간에 비해 대상에 대해 증가된 생존 시간을 제공한다. 일 실시예에 있어서, 상기 치료는 상기 치료의 부존재에서 추정되는 종양 성장에 비해 종양 성장의 지연을 제공한다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 암이 있는 대상의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA의 용도를 제공하며, 여기서 상기 약물은 상기 대상에 대한 전신 경로를 통해 전달되는 면역 자극제와 결합되어 사용되고, 상기 약물은 상기 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여를 통해 전달된다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 방광암이 있는 대상의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA의 용도를 제공하며, 여기서 상기 약물은 상기 대상에 대한 전신 경로를 통해 전달되는 면역 자극제와 결합되어 사용되고, 상기 약물은 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여 혹은 소포내 투여를 통해 전달된다.

상기 용도의 일 실시예에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 포유동물에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제의 투여 이전에 직접 주입 또는 전신 혹은 소포 내 투여를 통해 상기 종양에 투여된다. 상기 용도의 일 실시예에 있어서, 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 포함하는 약물은 포유동물에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제의 투여에 후속하여 직접 주입 또는 전신 혹은 소포내 투여를 통해 상기 종양에 투여된다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 암이 있는 대상의 치료에서 사용되기 위한 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 제공하며, 상기 사용은 면역 자극제와 결합되고, 상기 사용에서 상기종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여를 통해 상기 대상에 투여되며, 상기 면역 자극제는 전신 경로를 통해 상기 대상에 투여된다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 방광암이 있는 대상의 치료에서 사용되기 위한 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 제공하며, 여기서 상기 사용은 면역 자극제와 결합되고, 상기 사용에서 상기종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여 혹은 소포내 투여를 통해 상기 대상에 투여되며, 상기 면역 자극제는 전신 경로를 통해 상기 대상에 투여된다.

일 실시예에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA의 투여는 상기 면역 자극제의 투여에 앞선다. 일 실시예에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA의 투여는 상기 면역 자극제의 투여에 후속한다.

일 실시예에 있어서, 상기 포유동물 또는 대상은 인간이다.

일 실시예에 있어서, 상기 암 또는 종양은 전립선암, 유방암, 난소암, 림프암(lymphoid cancer), 백혈병, 뇌종양, 폐암, 대장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 위암, 장암, 방광암, 신장의 암종, 다발성 골수종(multiple myeloma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC), 췌장암, 교모세포종(glioblastoma) 그리고 흑색종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일 실시예에 있어서, 상기 암 또는 종양은 흑색종이다.

일 실시예에 있어서, 상기 암 또는 종양은 전이성 암 또는 전이성 종양이다.

도 1: 면역적격의 쥐의 흑색종 연구 계획의 개괄. A) 치료군들을 나타내는 흐름도. 동물들은 종양내로 CVA21(1×10⁸TCID 50[5×10⁹TCID 50/㎏]), UV-불활화 CVA21 또는 식염수로 먼저 치료되었고, 쥐의 동형 대조 항체 또는 항-PD-1항체(12.5㎎/㎏)로의 복강 내의 주입들이 수반되었다. B) 시간선은 치료의 계획(녹색 삼각형들 및 주황색 별들) 및 모니터링 과정들을 나타낸다. 실험은 45일째에 종료되었다(NTC＝종양이 없는 대조군).
도 2: 마우스들의 평균 체중(g) 대 시간(일). 에러 바(error bar)들은 표준 오차를 나타낸다. 점선들은 12일, 15일, 18일 및 21일에 치료의 각 사이클을 나타낸다. 다중 비교들을 위해 수정된 다중 t-검증들(홀름-시닥법(Holm-Sidak) method)을 이용하면, 31일에서 UV-CVA21＋항-PD-1군을 제외하면 치료군들 및 종양이 없는 대조군(NTC) 마우스들의 평균 체중들 사이에 통계적으로 중요한 차이들은 없었다. 평균 체중들에서 일부 변동들이 연구의 지속에 걸친 마우스들의 안락사로 인해 관찰되었다.
도 3: 마우스들의 각각의 체중(g) 대 시간(일). 점선들은 12일, 15일, 18일 및 21일에서 치료의 네 라운드들을 나타낸다. A) 종양이 없는 대조군, B) 식염수＋대조 Ab, C) 식염수＋항-PD-1, D) UV-CVA21＋대조 Ab, E) UV-CVA21＋항-PD-1, F) CVA21＋대조 Ab, G) CVA21＋항-PD-1.
도 4: B16-ICAM-1 쥐의 흑색종 종양들에 대한 결합 면역 치료 및 CVA21 바이로테라피 다음의 각 마우스의 각각의 종양 부피들(군 당 n＝8). C57BL/6 마우스들은 뒷옆구리 상에서 B16-ICAM-1 세포들이 피부 내로 주입되었다. 12일, 15일, 18일 및 21일에, 종양들은 상기 대조 또는 항-PD-1 항체(각기 12.5㎎/㎏)와 결합된 식염수, CVA21(1×10⁸TCID₅₀[5×10⁹TCID₅₀/㎏]) 또는 UV-불활화 CVA21(1×10⁸TCID₅₀[5×10⁹TCID₅₀/㎏])이 종양 내로 주입되었다. 치료 일자들은 점선들로 나타낸다. 치료 기간 동안, 대조 항체군들에 비하여 항-PD-1 치료된 군들에서 지연된 종양 성장의 뚜렷한 경향이 있었다. 식염수＋항-PD-1 치료군에서 종양 수용 속도는 매우 가변적이었고, 적어도 세 마리의 동물들이 치료의 과정이 완료되기 전에 안락사되었다.
도 5: 항-PD-1 면역 치료와 결합된 CVA21 종양 용해 바이로테라피 다음의 A) 바이러스 혈증 및 B) 항-CVA21 중화 항체들의 검출. 그래프들은 평균＋SEM을 나타낸다(연구의 개시에서 n＝8). CVA21＋항-PD-1 항체 대 CVA21＋대조 항체 사이의 중화 항체 레벨들의 차이들은 33일째에 중요하였다(p＝0.04 일방적 t-검증).
도 6: 대조 항체 또는 항-PD-1와 결합된 식염수, UV-CVA21 또는 CVA21로의 치료 다음의 C57BL/6 마우스들의 생존. 점선은 45일에 실험의 끝/종료를 나타낸다.
도 7: 대조 항체 또는 항-PD-1 항체와 결합된 식염수, UV-불활화 CVA21, CVA21로의 치료 다음의 C57BL/6 마우스들의 생존. A) 식염수＋대조 Ab 대 CVA21＋대조 Ab, B) 식염수＋항-PD-1 대 CVA21＋항-PD-1, C) 식염수＋대조 Ab 대 식염수＋항-PD-1, D) CVA21＋대조 Ab 대 CVA21＋항-PD-1, E) 식염수＋대조 Ab 대 CVA21＋항-PD-1, F) UV-CVA21＋항-PD-1 대 CVA21＋항-PD-1 사이의 생존 곡선 비교들. 점선들은 50%의 생존 컷오프 및 대응되는 중앙 생존 시간을 나타낸다.
도 8: 실험예 2에 기재된 바와 같은 면역적격의 쥐의 흑색종 연구 계획의 개괄. 시간선은 치료 계획(청색 원들[항-PD-1 항체], 주황색 정사각형들[CVA21]) 및 모니터링 과정들(적색 삼각형들[혈액 수집] 및 녹색 삼각형들[종양 측정들 및 체중 측정들])을 나타낸다. 동물들은 먼저 식염수 또는 CVA21(1×10⁸TCID₅₀/주입[5.56×10⁹TCID₅₀/㎏])로, 후속하여 쥐의 동형 대조 항체 또는 항-PD-1 항체(12.5㎎/㎏)의 복강 내의 주입들로 치료되었다. 실험은 66일째에 종료되었다.
도 9: B16-ICAM-1 쥐 흑색종 종양들에 대한 면역 치료 및 CVA21 바이로테라피의 결합에 후속하는 각 마우스들로부터의 각각의 종양 부피들(군 당 n＝12). A) 식염수＋대조 Ab, B) 식염수＋항-PD-1, C) CVA21＋대조 Ab, D) CVA21＋항-PD-1. C57BL/6 마우스들은 뒷옆구리 상에 B16-ICAM-1 세포들이 피부 내로 주입되었다. 6일, 9일, 12일 및 15일에, 종양들은 대조 또는 항-PD-1항체(각기 12.5㎎/㎏)와 결합되어 식염수 또는 CVA21(1×10⁸TCID₅₀[5:56×10⁹TCID₅₀/㎏])이 종양 내로 주입되었다. 치료 일자들은 점선들로 나타낸다. 추가적인 종양내의 바이러스 주입들(1×10⁸TCID₅₀[5:56×10⁹TCID₅₀/㎏)은 19일, 26일, 33일 및 40일에 투여되었다. 치료 기간 동안, 대조 항체군들에 비해 항-PD-1 치료된 군들에서 지연된 종양 성장의 현저한 경향이 있었다.
도 10: 속발 B16 종양 결절들의 종양 부피들. 31일에 뒷옆구리 상에 B16 종양 세포들(1×10⁵)로의 재접종 다음의 각각의 종양 부피들. A) 식염수＋대조 Ab, B) 식염수＋항-PD-1, C) CVA21＋대조 Ab, D) CVA21＋항-PD-1. 모든 동물들은 결국 촉지 가능한 종양들이 발달하였지만, CVA21＋항-PD-1 치료에 의해 지연된 B16 종양 성장의 개시를 나타내는 경향이 있었다.
도 11: 대조 항체 또는 항-PD-1와 결합된 식염수 또는 CVA21로의 치료 다음의 C57BL/6 마우스들의 생존. A) 식염수＋항-PD-1 생존 곡선이 CVA21＋항-PD-1 치료군과 비교되었을 때, 통계적 차이가 있었다(p＝0.0026 로그-순위[만텔-콕스] 테스트). B) 항-PD-1 항체와 결합되어 사용된 CVA21은 충분한 생존 이점을 제공하였다(식염수＋항-PD-1 및 CVA21＋항-PD-1 각각에 대해 45일 대 60일의 중앙 생존 기간). 상기 연구는 66일에 종료되었다.
도 12: 면역적격의 쥐의 흑색종 연구 계획의 개괄. 시간선은 치료 계획(청색 원들[항-CTLA-4 항체] 및 주황색 정사각형들[CVA21]) 및 모니터링 과정들(적색 삼각형들[혈액 수집] 및 녹색 삼각형들[종양 측정들 및 체중 측정들])을 나타낸다. 실험은 77일에 종료되었다.
도 13: B16-ICAM-1 쥐 흑색종 종양들에 대한 결합 면역 치료 및 CVA21 바이로테라피 다음의 종양 부피들. (A) 식염수＋대조 항체, 식염수＋항-CTLA-4, CVA21＋대조 항체 또는 CVA21＋항-CTLA-4로의 치료 다음의 평균 종양 부피들(㎣)±S.E.M.. (B 및 C) B16-ICAM-1 쥐 흑색종 종양들에 대한 결합 면역 치료 및 CVA21 바이로테라피 다음의 각 마우스로부터 각각의 종양 부피들. C57BL/6 마우스들은 뒷옆구리 상에서 B16-ICAM-1 세포들이 피부 내로 주입되었다. 7일, 10일, 13일 및 16일에, 종양들은 대조 또는 항-CTLA-4항체(각기 12.5㎎/㎏)와 결합되어 식염수 또는 CVA21(1×10⁸TCID₅₀[5.56×10⁹TCID₅₀/㎏])로 종양 내로 주입되었다. 치료 일자들은 점선들로 나타낸다.
도 14: 속발 B16 종양 결절들의 종양 부피들. (A) 연구의 결말(77일)에서 식염수＋대조 항체, 식염수＋항-CTLA-4, CVA21＋대조 항체 그리고 CVA21＋항-CTLA-4 치료된 마우스들 내의 속발 종양 발달의 발생 퍼센티지. (B) 종양 발생 대 일자의 그래프. 마우스들은 37일에 뒷옆구리 상에 B16 종양 세포들로 재접종되었고, 종양들은 77일까지 모니터되었다. (C) 오른쪽 뒷옆구리 상에 B16 종양 세포들(2×10⁵개)로의 재접종 다음의 각 마우스로부터 각각의 종양 부피들.
도 15: 대조 항체 또는 항-CTLA-4와 결합된 식염수 또는 CVA21로의 치료 다음의 C57BL/6 마우스들의 생존. (A) 대조 항체 또는 항-CTLA-4와 결합된 식염수 또는 CVA21로의 치료 다음의 C57BL/6 마우스들의 생존. 실험의 끝/종료는 77일째였다. (B) 표는 각 치료군으로부터 마우스들의 중앙 생존기간을 나타낸다.
도 16: B16-ICAM-1 쥐의 흑색종 종양들에 대한 결합 면역 치료 및 CVA21 바이로테라피에 후속하는 종양 부피들. (A) 식염수＋대조 항체, 식염수＋항-CTLA-4, 식염수＋항-PD-1, CVA21＋대조 항체, CVA21＋항-CTLA-4, CVA21＋항-PD-1 또는 CVA21＋항-CTLA-4＋항-PD-1로 치료된 마우스들로부터 연구 27일째의 평균 종양 부피들(㎣)±S.E.M. (B) 식염수＋대조 항체, 식염수＋항-CTLA-4, 식염수＋항-PD-1, CVA21＋대조 항체, CVA21＋항-CTLA-4, CVA21＋항-PD-1 또는 CVA21＋항-CTLA-4＋항-PD-1로의 치료에 후속하는 평균 종양 부피들(㎣)±S.E.M. (C) B16-ICAM-1 쥐의 흑색종 종양들에 대한 결합 면역 치료 및 CVA21 바이로테라피에 후속하는 각 마우스로부터의 종양 부피들. C57BL/6 마우스들은 뒷옆구리 상에서 B16-ICAM-1 세포들로 피부 내로 주입되었다. 7일, 10일, 13일 및 16일에, 마우스들은 대조, 항-PD-1, 항-CTLA-4 또는 항-CTLA-4＋항-PD-1 항체(각기 12.5㎎/㎏)와 결합되어 식염수 또는 CVA21(1×10⁸TCID₅₀[5.56×10⁹TCID₅₀/㎏])이 정맥 내로 주입되었다. 치료 일자들은 점선들로 나타낸다.
도 17: Pt 12-002: 수컷 환자의 다리 상에 전이성 흑색종 병변들의 종양내 CVA21 주입은 85일에 주입된 및 주입되지 않은 병변들에 대한 효과를 나타낸다. Pt 03-032: 왼쪽 목과 허파들에 전이성 흑색종이 있는 수컷은 66일에 주입되지 않은 원격 내장 반응을 나타내었다. 왼쪽 목만에 CVA21 종양 내로의 주입.
도 18: ALM 페이스 II 시험. 일차 분석: 혈청 시토카인 활성(객관적 반응들이 있는 환자들). 각각의 환자들로부터의 혈청 샘플들은 초기 종양 내의 CVA21 주입 다음에 나타낸 시간들에서 취해졌다. 혈청 샘플들은 바이오-플렉스 프로™(Bio-Plex Pro™) 인간 시토카인(Human Cytokine) 17-플렉스 분석(#M50-00031YV)(바이오라드, 리치몬드, 버지니아주, 미국)을 이용하여 멀티플렉스 면역분석에 의해 제조업자들의 지시에 따라 염증 시토카인 레벨들에 대해 분석되었다. 환자 종양 반응들은 면역 관련 RECIST 1.1 기준을 채용하여 평가되었다.
도 19: 정맥 내에 투여된 CVA21(카바탁^TM(CAVATAK^TM)으로 도면상에도 나타냄)은 종양 세포 유전자 발현 변화들을 유도하였다. BALB 마우스들은 CVA21 또는 식염수가 투여되었고, 투여 후의 3시간, 6시간, 24시간 및 72시간에서 희생되었으며 유전자 발현에 대해 분석되었다(오른쪽의 네 패널들). CVA21 복제 동태들은 왼쪽의 단일 패널 내에 도시된다.

약어들

Ab: 항체

ACEC: 동물 보호 및 윤리 위원회(Animal Care and Ethics Committee)

ANOVA: 분산 분석(Analysis of Variance)

ATCC: 미국 균주 은행(American Type Culture Collection)

BSA: 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)

CI: 조합 지수(Combination Index)

CO₂: 이산화탄소

CD: 분화 집단(cluster of differentiation)

CPE: 세포변성 효과(cytopathic effect)

CTL: 세포독성 T 림프구

CVA21: 콕삭키바이러스(Coxsackievirus) A21

DAF: 붕괴 촉진 인자(decay-accelerating factor)

dH₂O: 증류수

DMEM: 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)

DNA: 데옥시뉴클레오티드 포스페이트(deoxynucleotide phosphate)

EtOH: 에탄올

FCS: 송아지 태반 혈청(foetal calf serum)

g: 감마

ICAM-1: 세포간 접합 분자(intercellular adhesion molecule)-1

i.p.: 복강 내(intraperitoneal)

i.t.: 종양 내(intratumoural)

i.v.: 정맥 내(intravenous)

irPFS: 면역 관련 무진행 생존(immune-related progression-free survival)

MAb: 단일클론성(monoclonal) 항체

nAb: 중화(neutralising) 항체

MOI: 감염 다중도(multiplicity of infection)

PBS: 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)

PCR: 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)

PD-1: 세포예정사(programmed cell death) 1

PD-L1: 세포예정사 1 리간드(ligand) 1

p.i.: 접종후(post inoculation)

p.t.i.: 종양 접종후(post tumour inoculation)

RNA: 리보핵산(ribonucleic acid)

RPMI: 로열 파크 메모리얼 인스터튜트(Royal Park Memorial Institute)

RT: 실온

RT-PCR: 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)

s.c.: 피하의(subcutaneous)

SCID: 중증 복합형 면역부전증(severe combined immunodeficient)

SD: 표준 편차

SE: 표준 오차

sICAM-1: 가용성 세포간 접합 분자-1

TCID₅₀: 조직 배양 감염 유발량(Tissue Culture Infectious Dose) 50 %

UV: 자외선

XTT: 2,3-비스(Bis)-(2-메톡시(Methoxy)-4-니트로(Nitro)-5-술포페닐(Sulfophenyl))-2H-테트라졸리움(Tetrazolium)-5-카르복사닐리드(Carboxanilide)

단위들

℃: 섭씨온도

d: 일

g: 중력

g: 그램

h: 시간

L: 리터

m: 미터

M: 몰랄(Molar)

min: 분

mol: 몰(mole)

rpm: 분당 회전수

s: 초

U: 유닛(unit)들

V: 볼트

v/v: 체걱 부피(volume per volume)

w/v: 체적 중량(weight per volume)

뉴클레오티드(nucleotide)들

A: 아데닌(adenine)

C: 시토신(cytosine)

G: 구아닌(guanine)

T: 티민(thymine)

접두사들

k: 킬로 10³

m: 밀리 10^-3

μ: 마이크로 10^-6

n: 나노 10^-9

p: 피코 10^-12

실시예들의 설명

이하, 다음의 예들에 대하여 예시의 형태만을 포함하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

다음은 본 발명의 설명을 이해하는 데 도움이 될 수 있는 일부 정의들이다. 이들은 일반적인 정의들로서 의도되며. 본 발명의 범주가 어떠한 방식으로도 이들 용어들에만 제한되는 것은 아니지만, 다음의 설명을 보다 나은 이해를 위해 제시된다.

본 발명의 방법들은 통상적으로 종양 용해성 바이러스(oncolytic virus) 또는 종양 용해성 바이러스 RNA 및 면역 자극제(immunostimulatory agent)의 치료적 유효량의 투여를 포함한다. "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"이라는 용어는 여기에 사용되는 바에서 원하는 치료 효과를 제공하도록 본 발명에 사용되기 위한 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA 및 of 상기 면역 자극제의 비독성이지만 충분한 양을 의미하는 것을 포함한다. 요구되는 정확한 양은 치료되는 종들, 대상의 연령과 일반적인 상태, 치료되는 상태의 중증도(severity), 투여되는 특정 약제(agent)와 투여의 모드 등과 같은 인자들에 따라 대상들 사이에서 변할 수 있다. 따라서, 정확한 "유효량(effective amount)"을 명시하는 것은 가능하지 않다. 그러나, 임의의 주어진 경우에 대해 적절한 "유효량"은 일상적인 실험만을 이용하여 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서의 내용에 있어서, "치료(treatment)"라는 용어와 "치료되는", "치료된" 및 "치료하는"과 같은 연관된 용어들은 질병 상태나 증상들을 해결하거나 완화시키거나, 질병의 확립을 방지하거나, 그렇지 않으면 어떠한 방식으로든지 질병이나 다른 원하지 않는 증상들의 진행을 방지하거나, 저해하거나, 지연시키거나, 반전시키는 임의의 및 모든 사용들 언급한다. 오해를 방지하기 위해, 여기에 사용되는 바와 같은 "치료" 및 관련 용어들이 치료되는 질병의 완전한 치료나 완화를 요구하지는 않는 점에 유의한다.

본 명세서의 내용에 있어서, "포함하는"이라는 용어는 "주로 포함하지만, 반드시 단독으로는 아니게 포함하는"을 의미한다. 또한, "구비하는" 및 "가지는" 등과 같이 "포함하는"이라는 단어의 변형들은 상응하는 변화된 의미들을 가진다.

허용되는 정도까지, 여기서 언급되는 문헌들 내용들은 여기에 참조로 포함된다.

본 명세서의 내용에 있어서, "대상(subject)" 또는 "환자(patient)"라는 용어는 인간들 및 이에 한정되는 것은 아니지만, 양, 소, 말, 돼지, 고양이, 개, 영장류, 설치류 속(genus)들의 구성원들을 포함하여 경제적이나 연구 중요성이 있는 사회의 임의의 종들의 개체들을 포함한다. 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 대상 또는 환자는 인간이다.

본 문에서 다르게 요구되거나 특히 반대되는 것으로 기재되지 않는 한, 단수 정수들, 단계들 또는 요소들로 여기에 언급되는 정수들, 단계들 또는 본 발명의 요소들은 분명하게 언급되는 정수들, 단계들 또는 요소들의 단수 및 복수의 형태들을 모두 포괄한다.

본 명세서의 내용에 있어서, 단수 형태는 또한 특정한 내용에서 분명하게 그렇지 않은 것으로 기재되는 경우를 제외하고 복수의 형태들을 포괄한다. 예를 들면, 본 발명이 면역 자극제의 공통 투여와 결합되는 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA의 투여에 의한 암의 치료를 위한 방법들을 포함하는 것으로 기재되는 경우, 이러한 사항이 하나 또는 그 이상의 이러한 바이러스들 또는 바이러스 RNA들의 투여를 포괄하고, 하나 또는 그 이상의 면역 자극제들의 투여를 포괄하는 점이 이해될 것이다.

본 명세서의 내용에 있어서, "약(about)"이라는 용어는 수치적인 값들과 관련되어 사용될 때에 설명되는 측정에 대해 해당 기술 분야에서 알려진 통상적인 정도의 변화를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 종래 기술에서 측정에 대한 통상적인 정도의 변화가 인식되어 있지 않은 경우, 또는 인식되어 있지만 그럼에도 불구하고 추가적인 지적이 요구되는 경우, "약"이라는 용어는 여기에 사용되는 바에서 "약"이라는 용어가 사용되는 수치적인 값의 플러스 또는 마이너스 10%의 변화를 수반하는 것으로 이해될 것이다.

여기서의 종래 문헌들의 임의의 기재 또는 이들 문헌들로부터 혹은 이들에 기초하는 여기서의 기재들은 상기 문헌들이나 유래되는 기재들은 오스트레일리아나 그 밖의 지역에서 관련 기술 분야의 통상적인 일반 지식의 일부인 것으로 인정되지는 않는다.

해당 기술 분야의 숙련자는 여기서 설명되는 본 발명이 명확하게 기재되는 경우들 이외에도 변형들과 변경들을 허용하는 점을 이해할 것이다. 본 발명이 모든 이러한 변형들 및 변경들을 포함하는 점이 이해될 것이다. 본 발명은 또한 개별적으로나 총괄적으로 본 명세서에서 언급되거나 기재되는 모든 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물들과 상기 단계들 또는 특징들의 임의의 및 모든 결합들이나 임의의 둘 또는 그 이상을 포함한다.

본 명세서의 내용에 있어서, 수치적인 범위가 제공되는 경우에 상기 범위의 기재된 종점들과 이들 종점들 내의 임의의 하위 범위들을 포함하여 이들 종점들 사이의 모든 값들을 포괄하는 점이 이해될 것이다.

본 발명자들은 여기서 종양 용해성 CVA21과 결합되는 쥐의 항-PD-1 항체 및 쥐의 항-CTLA-4 항체의 사용으로 여기에 예시되는 면역 관문(immune checkpoint) 분자들을 표적으로 하는 면역 자극제들의 사용이 종양 부담(tumour burden), 종양 궤양형성의 속도 등을 감소시키고 흑색종(melanoma)의 쥐의 B16-ICAM-1 모델의 생존을 연장시키는 데 치료적으로 유익할 수 있었던 점을 입증한다. 면역 자극제들의 사용하여 면역 체계를 향상시키는 것이, 예를 들면 면역 제거 또는 바이러스의 표적화에 의해 종양 용해성 바이러스의 효능에 불리한 영향을 미칠 수 있었던 것으로 예상되었지만, 본 발명자들은 여기서 놀랍고 직관에 반대되게 종양 용해성 바이러스 및 면역 자극제의 결합이 약제 바이러스 또는 면역 자극제만의 경우에 비해 증진된 항종양 효과들을 제공하는 점을 입증한다. 여기에 기재되는 본 발명은 이에 따라 포유동물에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제의 공통 투여와 결합되어 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 직접 주입 또는 전신 투여를 통해 종양에 전달하는 단계를 포함하는 종양들을 치료하는 방법을 제공한다. 치료되기를 원하는 암이 바이러스 또는 약제(agent)의 전달의 특정 메커니즘이 유리할 수 있는 경우, 이러한 전달의 방법이 바람직하다. 예를 들면, 상기 방법이 방광암 또는 전이성 방광암의 치료를 위한 것인 경우, 적어도 상기 바이러스 또는 바이러스 RNA의 투여는 유리하게는 소포 내(intravesicular) 경로에 의한다.

CVA21은 바이러스들의 인간 엔테로바이러스(human enterovirus) C(HEC)과에 속한다. 상기 HEC과의 다른 주목할 만한 구성원들은 콕삭키바이러스(Coxsackievirus)들, 예를 들면 CVA13, CVA15 및 CVA18을 포함한다. CVA13, CVA15, CVA18 및 CVA21은 각기 유방암, 전립선암, 대장암, 난소암 및 흑색종과 같은 다양한 고형암(solid cancer)들(Shafren 등의 2004; Au 등의 2005; Au 등의 2007; 2000년 11월 27일에 출원되고, 그 개시 사항이 전체적으로 여기에 참조로 포함되는 국제 공개 특허 WO 2001/037866(발명의 명칭: "대상 내의 암을 치료하는 방법 및 동일한 용도를 위한 약제학적 조성물(A method of treating a malignancy in a subject and a pharmaceutical composition for use in same)") 뿐만 아니라 다발성 골수종과 같은 혈액암(2005년 8월 22일에 출원되고, 그 개시 사항이 전체적으로 여기에 참조로 포함되는 국제 공개 특허 WO 2006/017914(발명의 명칭:"혈액암들의 치료를 위한 방법들 및 조성물들(Methods and compositions for treatment of hematologic cancers)")의 치료에서 종양 용해 효과를 가지는 것으로 입증되었다. 이들은 각기 숙주 세포의 감염을 위해 ICAM-1 수용체(Shafren 등의 1997) 및 협동 분리 부위로서 작용하는 붕괴 촉진 인자(DAF)(Shafren 등의 1997)와 상호작용한다. 이에 따라, 면역 자극제들과 CVA21의 공동 투여의 암 모델에서 유익한 효과의 입증은 또한 CVA13, CVA15 및 CVA18과 다른 인간 엔테로바이러스 C와 같은 CVA21과 기능적으로 관련된 바이러스들에 적용될 것이다.

상기 바이러스의 임의의 적합한 소스가 본 발명의 방법들에 이용될 수 있다. 예를 들면, 바이러스의 다양한 적합한 균주(strain)들은 미국 균주 은행(American Type Culture Collection: ATCC)(10801 유니버서티로, 마나사스, 버지니아, 20110-2209 미국)으로부터 수득될 수 있으며, 이러한 물질은 다음에 제공되는 일자들에 부다페스트 조약 하에서 기탁되었고, 부다페스트 조약의 조항들에 따라 이용 가능하다. 콕삭키 A군 바이러스, 균주 CVA13 ATCC 번호: PTA-8854, 2007년 12월 20일에 기탁; 콕삭키 A군 바이러스, 균주 CVA15(G9) ATCC 번호: PTA-8616, 기탁 일자: 2007년 8월 15일; 콕삭키 A군 바이러스, 균주 CVA1 8 ATCC 번호: PTA-8853, 2007년 12월 20일에 기탁; 콕삭키 A군 바이러스, 균주 CVA21(카이켄달(Kuykendall)) ATCC 번호: PTA-8852, 2007년 12월 20일에 기탁.

여기에 기재되는 바와 같이, 상기 방법들은 종양 용해성 바이러스로 투여되는 바이러스제(viral agent) 및 CVA21에 상응하는 바이러스 RNA와 같이 종양 용해성 바이러스 RNA의 형태로 투여되는 바이러스제를 포괄한다. 암의 치료에서 종양 용해성 바이러스 RNA의 사용을 위한 방법들은 그 개시 사항이 여기에 참조로 포함되는 국제 공개 특허 WO 2006/074526(발명의 명칭:"신생물들의 치료를 위한 방법 및 조성물(Method and composition for treatment of neoplasms)")에 기재되어 있다.

감염에 후속하여, 종양 용해성 바이러스는 직접적인 용균 감염(lytic infection), 세포자살(apoptosis)의 유도에 의하거나 바이러스 항원들에 대한 면역 반응을 개시함에 의해 암성 세포(cancerous cell)를 죽일 수 있다. 종양 용해성 바이러스는 이에 따라 단일 투입 투여량에 한정되지 않고, 다중 사이클 감염을 겪을 수 있으며, 많은 숫자의 자손 바이러스(progeny virus)의 생산을 가져온다. 이들 자손들은 인접하는 종양 세포들에 국부적으로 또는 원격 전이성 부위들에 전신으로 분산될 수 있다. 종양 용해 치료의 이러한 특징은 원격 종양들 또는 진단되지 않는 미세 전이들의 치료를 위해 특히 매력적이다. 예를 들면, 환자의 목 위의 흑색종에 대한 CVA21의 종양 내 투여가 주입된 및 원격의 주입되지 않은 병변들 모두에서의 항종양 활성과 관련되는 점에 대한 여기서의 입증(도 17)은 발생되는 전신 효과와 부합한다. 여기서 입증되는 바와 같이, 병변 내의 CVA21은 절제 불가능 단계의 IIIC-IVM1c 흑색종의 치료를 위한 유망한 새로운 종양 용해성 면역 치료제(immunotherapeutic agent)이며, 실험예 5의 연구 하에서 여기에 기재되는 임상 연구는 6개월에서 그 irPFS의 일차 종료점을 만족시켰다. CVA21은 국부 및 원격 지속성 종양 반응들 모두에 잘 견뎠고 나타내었다.

주입되지 않은 병변들에서의 항종양 활성의 여기서의 관찰은 특히 전신성 숙주 면역 매개 항종양 반응과 일치하였다. 여기서의 실험예들은 CVA21 매개된 주입되지 않은 원격 전이성 병변 활성이 혈청 IL-8 및 g-IFN의 상승된 레벨들의 가능한 새로운 혈청 시토카인(cytokine) 용법에 의한 증거로 인하여 숙주 발생 면역 반응과 연계되었던 점을 제시한다(도 18). 흑색종 세포들(SK-Mel 28)이 옆구리로 이식된 마우스 모델에서 CVA21의 정맥 내 전달은 상기 바이러스의 투여에 후속하는 종양 생검의 시간적인 처리에 의해 평가된 바와 같이 종양 세포들에 의한 인터페론(interferon)-γ 유도 단백질 10(IP-10) 및 PD-L1의 발현의 증가와 관련되었다(도 19). IP-10은 IFN-g에 노출된 세포들에 의해 분비되는 케모카인(chemokine)이며, 조직 염증의 부위들 내로 활성화된 T 세포들을 동원하는 데 중요한 역할을 한다. 진행 중인 임상 연구들에서, 그 종양이 항-PD-1 또는 항-PD-L1 차단을 이용한 치료에 수반되는 PD-L1 발현이 결핍된 환자들과 비교하여 그 종양들이 PD-L1과 같은 면역 관문 분자들의 보다 높은 레벨들을 발현시키는 환자들이 우수한 종양 반응들을 나타내는 점이 점점 더 분명해지고 있다. 이는 흑색종, NSCLC, 전이성 방광암, 신장, 다발성 골수종(multiple myeloma), 췌장, 교모세포종(glioblastoma)과 전립선암들, 그리고 다른 암들과 같은 암들을 표출시키는 ICAM-1 내의 면역관문 억제제 항체들과 결합되어 종양 면역 혼합기(immuno-agitator)로서 작용하는 CVA21에 대한 잠재성을 입증한다.

본 발명의 방법들은 통상적으로 상기 바이러스 및 상기 면역 자극제의 치료적 유효량의 투여를 수반한다. 여기에 사용되는 바에 있어서 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"이라는 용어는 원하는 치료 효과를 제공하기 위한 상기 바이러스 또는 면역 자극제의 비독성이지만 충분한 양을 의미하는 범주를 포함한다. 여기서 유의되는 바와 같이, 상승적인 효과들로 인하여 사용되는 바이러스 및 면역 자극제의 양은 단일 치료(상기 바이러스 또는 상기 면역 자극제의 하나만을 사용하여 대상에서의 암의 치료)에 사용될 수 있었던 경우보다 낮을 수 있다. 요구되는 정확한 양은 치료되는 종들, 대상의 연령과 일반적인 상태, 치료되는 상태의 중증도, 투여되는 특정한 환자와 투여의 모드 등과 같은 인자들에 따라 대상들 사이에서 변화될 것이다. 따라서, 요약에서 정확한 "유효량(effective amount)"을 명시하는 것은 가능하지 않다. 그러나, 임의의 주어진 경우에 대해, 적절한 "유효량"은 일상적인 실험만을 이용하여 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다.

상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA 및 상기 면역 자극제는, 일 측면에서, 종양이 있거나 암이 있는 대상의 치료를 위해 서로 함께 사용된다. 상기 방법이 대상에 대한 상기 바이러스 및 상기 면역 자극제들의 "공동 투여(co-administration)"를 수반하는 실시예들에 있어서, 이러한 용어가 상기 약제들이 치료적 활성들을 중첩시키기 위해 투여되지만, 반드시 상기 약제들이 상기 대상에 동시에 투여되지는 않는 것을 의미하는 점이 이해될 것이다. 상기 약제들은 투여 이전에 물리적으로 결합될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 통상적으로, 상기 약제들은 투여되기 이전에 또는 투여될 때에 물리적으로 결합되지 않을 것이다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이러스 및 상기 면역 자극제(들)는 대략 동일한 시간에 대상에 동시에 투여된다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이러스는 상기 면역 자극제(들)가 투여되지 전에 상기 대상에 투여된다.

상기 바이러스는 통상적으로 바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable) 운반체(carrier)를 포함하는 약제학적 조성물(pharmaceutical composition)의 형태로 상기 대상에 투여된다. 상기 조성물은 ㎖ 당 약 10⁵의 바이러스 입자들 내지 ㎖ 당 약10¹⁵의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10⁶의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10⁷의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10⁸의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10⁹의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10¹⁰의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10¹¹의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10¹²의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10¹³의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10¹⁴의 바이러스 입자들, 또는 ㎖ 당 약 10¹⁵의 바이러스 입자들의 농도 범위와 같이 임의의 적합한 농도로 상기 바이러스를 포함할 수 있다.

상기 바이러스 조성물의 보존은, 예를 들면 원하는 부피로 투여되는 바이러스 입자들의 원하는 투여량을 구현하도록 투여를 위해 적절한 부피로 희석될 수 있다. 예를 들면, 대상은 약 10⁵의 바이러스 입자들 내지 약 10¹⁵의 바이러스 입자들, 또는 약 10⁶의 바이러스 입자들, 또는 약 10⁷의 바이러스 입자들, 또는 약 10⁸의 바이러스 입자들, 또는 약 10⁹의 바이러스 입자들, 또는 약 10¹⁰의 바이러스 입자들, 또는 약 10¹¹의 바이러스 입자들, 또는 약 10¹²의 바이러스 입자들, 또는 약 10¹³의 바이러스 입자들, 또는 약 10¹⁴의 바이러스 입자들, 또는 약 10¹⁵의 바이러스 입자들을 포함하는 바이러스의 투여량으로 투여될 수 있다. 상기 바이러스가 투여되는 부피는 투여의 방식에 의해 영향을 받을 것이다. 예를 들면, 주입에 의한 상기 바이러스의 투여는 통상적으로 약 10㎖ 내지 약 100㎖, 예를 들면 약 20㎖, 약 30㎖, 약 40㎖, 약 50㎖, 약 60㎖, 약 70㎖, 약 80㎖ 또는 약 90㎖를 사용할 수 있는 방광암의 치료의 경우에서의 소포내 점적주입에 의한 투여, 또는 방광암의 치료를 위한 BCG의 점적주입에 대해 알려진 과정들과 유사한 부피들보다 작은 부피, 예를 들면 약 0.5㎖ 내지 약 10㎖가 될 수 있었다. 다른 예로서, 바이러스의 정맥 내의 투여는 통상적으로 대략 30분에 걸쳐 자동 펌프로 주입되는 보통의 식염수(saline)로 희석되는 약 100㎖ 내지 약 500㎖의 바이러스를 사용할 수 있다.

조성물들은 약제학적으로 허용 가능한 희석제(diluent), 부형제(excipient) 및/또는 보조제(adjuvant)를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 운반체들, 희석제들, 부형제들 및 보조제들은 상기 조성물의 다른 구성 성분들과 양립될 수 있는 측면에서 "허용 가능(acceptable)"하고, 수용자 대상에 허용되지 않게 유해하지 않아야 한다.

상기 바이러스는, 예를 들면 2006년 1월 17일에 출원되었고, 국제 공개 특허 WO 2006/074526호로 공개되었으며, 그 전체적인 이용들이 여기에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 PCT/AU2006/000051(발명의 명칭: "신생물들의 치료를 위한 방법들 및 조성물(Methods and composition for the treatment of neoplasms)")에 기재된 바와 같이, 바이러스 입자들보다는 상기 바이러스를 인코딩하는 노출 바이러스 RNA로서 투여될 수 있다. 이러한 실시예에 있어서, 상기 바이러스 RNA는 리포솜(liposome)들의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜들은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질들로부터 유래되며, 수성 배지에 분산되는 단일- 또는 다중-층판 수화 액정들에 의해 형성된다. 임의의 비독성의 생리학적으로 허용 가능하고 대사 작용 가능한 리포솜들을 형성할 수 있는 지질이 사용될 수 있다. 리포솜 형태내의 조성물은 안정화제(stabiliser)들, 보존제(preservative)들, 부형제들 및 유사한 것들을 함유할 수 있다. 바람직한 지질들은 모두 천연 및 합성인 상기 인지질들 및 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline)들(레시틴(lecithin)들)이다. 리포솜들을 형성하는 방법들은 해당 기술 분야에 알려져 있으며, 여기에 관련되는 이러한 특정한 참조 문헌으로는 그 개시 사항이 여기에 참조로 포함되는 Prescott, Ed.의 "Methods in Cell Biology"(Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y., 1976, p. 33 이하 참조)가 있다.

상기 바이러스는 주입과 같은 임의의 적절한 수단들에 의해 상기 대상에 투여될 수 있다. 상기 주입은 전신으로, 비경구적으로, 상기 암에 대한 직접 주입, 또는 방광 내로가 될 수 있다. 통상적으로, 방광암의 치료에서 상기 바이러스의 투여는 방광 내로(방광 내로 직접 주입되는)이다.

종양의 병변(lesion) 내의 주입은 치료되는 종양의 유형, 종양의 크기와 위치, 직접 주입에 대한 종양의 접근 가능성 등과 같은 인자들을 고려하여 숙련자에게 알려진 임의의 적절한 수단들에 의해 수행될 수 있다. 상기 종양에 걸쳐 상기 바이러스의 분산을 증가시키거나 최대화시키는 주입 기술들은 증진된 치료 결과들을 제공할 수 있다. 예를 들면, 흑색종 및 다른 고형 종양들의 치료에서, 다중의 병변들에는 용량 과다 분할 양상으로 4.0㎖의 최대까지의 가장 큰 병변(들)(＞2.5㎝의 종양들 내로 2.0㎖ 주입, 1.5㎝ 내지 2.5㎝ 내로 1.0㎖ 주입; 0.5㎝ 내지 1.5㎝ 내로 0.5㎖ 주입)로 출발하여 주입될 수 있다. CVA21로의 초기 주입에 이어서, ＜0.5㎝까지 직경이 감소하는 임의의 주입된 병변에는 상기 병변이 완전히 용해될 때까지 기재된 치료 계획에 따라 0.1㎖의 CVA21이 주입될 수 있다.

이론적으로 초기에 감염되는 암세포들의 숫자 및 상기 종양에 걸친 영역들의 최대화는 파괴되는 암세포들의 양을 증가시킬 것이다. 이는 또한 상기 종양에 의해 생성되는 바이러스 자손의 양을 증가시킬 것이며, 이에 따라 원격 종양들의 파종을 위해 진행성 바이러스혈증(viremia)의 기회를 증가시킬 것이다. 상기 종양을 통해 투여된 바이러스의 원하는 분산을 구현하는 임의의 적절한 수단들이 이용될 수 있고, 숙련된 수신자에게 분명할 것이다. 다음에 종양에 대한 CVA21의 투여의 구성에서 본 발명자들이 여기서 보고된 실험들에 이용하였던 하나의 예시적인 수단이 기재된다.

CVA21과 같은 요구되는 바이러스의 부피 및 25-게이지(gauge)의 바늘을 수용할 것인 주사기가 투여를 위해 사용된다. 투여되는 CVA21의 부피는 앞서 기재된 바와 같이 주입되는 종양의 직경에 기초하여 결정된다. 주사기에 CVA21을 적재하기 위해, 각각의 카톤(carton)으로부터 바이알(vial)을 제거하고, 실온(18℃-25℃)에서 해동시킨다. 상기 바이알을 내용물들을 해동시키기에 필요한 경우보다 길게 RT에 두지 않는다. 상기 바이알을 5초 동안 부드럽게 혼합한다. 적절한 부피 및 21-게이지 바늘의 루어락(luer-lock) 주사기를 사용하여 요구되는 부피까지 인출한다. 기포들을 제거한다. 회수된 바늘을 제거하고, 25-게이지의 뚜껑이 있는 바늘로 대체한다. 요구될 때까지 얼음위에 유지시킨다(2℃-8℃). 다음에 기재되는 바와 같이 상기 주사기의 적재로부터 상기 종양들 내로 분배되도록 3시간 이내에 투여한다.

상기 주입은 각 주입 날짜에 종양 내의 9개의 영역 이내가 될 수 있다. 상기 영역들은 중첩되지 않으며, 이들은 다음의 기준점들을 이용하여 선택될 수 있다. 바이러스 용액의 분포는 1일의 첫 번째 주입에 대해 다음과 같을 수 있다. (i) 상기 종양의 중심이 추정되고 표기되며, (ii) 표기들은 45도 방사상으로 상기 종양의 주변부 주위에 만들어지고, (iii) 바늘 삽입의 부위는 첫 번째 투여량 주입 부위인 대략적인 중심이 상기 중심 표기와 270도 방사상 사이에 있으며, (iv) 분포의 부피는 10으로 분할되고, 상기 종양 내의 9개의 구역들로 분배될 것이다. 주입의 표적 영역은 상기 종양이 종양의 외부 20%의 "테(rim)" 내부에 대략적으로 추정되는 상기 방사상 표기들에 인접하는 영역이다. 이는 8회의 주입들을 가져올 것이다. 이들 처음의 8회의 주입들은 초음파에 의해 안내되는 바와 같이 상기 종양의 중심 평면에 깊게 되는 것을 표적으로 해야 한다. 최후의 주입은 상기 종양의 예상되는 중심에 깊게 직접적으로 이루어지고, 이러한 첫 번째 투여량에 대해 상기 중심 상부의 깊이를 표적으로 하며, 주입 부피의 20%를 포함한다.

투여되는 바이러스의 양의 앞서 언급한 계산뿐만 아니라 상기 바이러스가 투여될 수 있는 기재되는 방법들이 예시의 목적을 위해서만 제공되며, 여기에 기재되는 본 발명을 제한하려고 의도되는 것은 아닌 점이 이해될 것이다.

본 발명은 암의 치료를 위한 방법들을 제공하며, 상기 방법들은 면역 자극제와 결합되는 CVA21와 같은 인간 엔테로바이러스 C의 사용을 포함한다. 많은 최근의 연구 및 임상적 진전의 대상이 있었던 상기 면역 자극제들이 이른바 관문 억제제(checkpoint inhibitor)들을 표적으로 하는 것들이다. 관문 차단에 있어서, 인간화 단일클론성(monoclonal) 항체들이 숙주 면역 관문 분자들 및 이들의 자연 리간드들을 간섭하는 데 사용된다. PD-1, PDL1/L2 및 CTLA-4를 포함하는 이러한 분자들의 차단은 많은 숫자의 진행암 환자들(흑색종, 비소세포성 폐암, 방광 및 신장암들)에서 극적인 항종양 반응들을 가져왔다. 면역 관문 분자들은 정상적으로는 숙주 면역 체계가 균형을 이루고 자기 관용(self-tolerance)을 유지하도록 기능한다. 특정 차단 면역 관문 분자들은 음성 되먹임(negative feedback) 기전을 이완시키고, 특히 암성(cancerous) 세포들 및 항원들에 대한 숙주 면역 체계의 활성이 보다 활발하게 되도록 상승시킨다. 간단히 말하면, 이는 상기 숙주 면역 체계의 "생물학적 핸드브레이크(biological handbrake)"를 취한다. 면역관문 차단은 생존 이익들을 의미하는 것으로 해석되는 증진된 지속성 종양 반응들을 가져왔다. 많은 숫자의 암 환자들에서 인상적인 광범위한 종양 반응들에도 불구하고, 면역관문 차단에 의해 유발되는 종양 반응들의 속도와 지속성을 증가시킬 필요성이 남아 있다.

여기에 입증되는 바와 같이, 항-PD-1 항체 또는 항-CTLA-4 항체와 같은 면역관문 차단 분자(면역 자극제) 및 CVA21과 같은 종양 용해성 인간 엔테로바이러스 C의 결합은 바람직한 종양 반응을 유발하는 데 놀라운 이점들을 제공한다. 중요하게는, 상기 바이러스의 투여가 면역 관문 분자들의 발현 레벨 및 숙주 면역 세포 침윤물들에 대한 충격에 관하여 종양 미세환경의 정체에 변화들을 유도하는 점이 놀랍게도 확인되었다. 많은 이들 면역 상향조절 프로세스들이 인터페론들, 특히 인터페론-γ와 같은 면역 자극제들의 직접적인 활성을 수반하기 때문에, 세포내 바이러스 복제를 유도하기 위한 CVA21과 같은 인간 엔테로바이러스 C의 투여를 수반하는 치료적 접근은 숙주 면역 체계 활성들의 섬세한 균형의 표적화된 파열을 개시하는 매력적인 프로세스이다.

상기 면역 자극제(들)는 임의의 적절한 약제로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 구성에서, 면역 자극제는 개체에 투여될 때에 종양 세포들에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 임의의 약제로서 이해될 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 면역 자극제는 면역 관문 분자의 능력을 차단하거나, 감소시키거나 반대 작용을 하도록 상기 면역 관문 분자와 상호작용하는 임의의 약제, 또는 상기 개체의 선천 면역계 항종양 반응들을 감소시키는 상기 면역 관문 분자를 포함하는 복합체가 될 수 있다. 따라서, 면역 자극제는 상기 면역 관문 분자들이 상기 항종양 반응에 영향을 미치는 "핸드브레이크" 효과를 감소시킨다. 예를 들면, 상기 면역 자극제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD134, CD134L, CD137,CD137L, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, B7RP1, ICOS, TIM3, GAL9, CD28, 또는 OX-40로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 관문 분자를 표적으로 하는 임의의 약제가 될 수 있다. 또한, 여기에 사용되는 바에서 "면역 자극제(immunostimulatory agent)"라는 용어가 상기 면역 자극제가 면역 관문을 표적으로 할 때에 면역 관문 억제제들로서도 언급될 수 있는 점이 이해될 것이다.

통상적으로, 상기 면역 자극제는 항체가 될 수 있거나, 바람직한 실시예들에서 단일클론성 항체가 될 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위한 항체들의 제조는 잘 알려진 기술들을 이용하여 단일클론성 항체들을 제조하는 과정 및 높은 친화도의 항체들을 분별하는 과정을 포함하는 해당 기술 분야에서 알려진 방법들에 의하거나, 상당히 높은 친화도를 갖는 단일클론성 항체를 먼저 식별하고, 이후에 잘 알려진 방법들을 이용하여 상기 친화도를 향상시키는 과정에 의해 수행될 수 있다[예를 들면, 항체들의 제조와 관계가 있는 각각의 일부가 여기에 참조로 포함되는, Huse, W. D. 등의 "Internat'l Rev. Immunol."(10: 129-137, 1993); Yelton, D. E. 등의 "J. Immunol."(155: 1994-2004, 1995); Wu, H. 등의 "Proc. Natl. Acad. Sci."(USA, 95: 6037-6042, 1998); Crameri, A. 등의 "Nature Medicine"(2: 100-103, 1996); Stemmer의 "Proc. Natl. Acad. Sci."(USA, 91: 10747-10751, 1994); Stemmer의 "Nature"(370: 389-391, 1994)]. 선택적으로, 상기 약제는 제조되기보다는 수득될 수 있다. 관문 억제제 분자들에 대한 항체들의 예들은 전이성 흑색종이 있는 107명의 환자들의 페이스 I 시험에서 테스트되는 그 첫 번째 클래스였던 완전한 인간 면역글로불린(immunoglobulin) G4(IgG4) 단일클론성 PD-1 항체[Sosman 등의 2012b]인 니볼루맙(Nivolumab)(BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538)을 포함한다. 인간화 단일클론성 IgG4 PD-1 항체인 람브롤리주맙(Lambrolizumab)(MK-3475)이 전이성 흑색종이 있는 132명의 환자들을 포함하였던 페이스 I 시험에서 연구되었다[Iannone 등의 2012]. 완전한 인간 IgG4 PD-L1 항체인 BMS-936559가 페이스 I 시험의 일부로서 전이성 흑색종이 있는 55명의 환자들에서 테스트되었다[Brahmer 등의 2012].

특정한 유형의 암에 대한 환자의 치료에서, 숙련된 수신자는 치료의 추가적인 방법들이나 단계들 또한 적절할 수 있는 점을 알 것이다. 예를 들면, 방광암에 대한 환자의 치료에서, 본 발명의 방법들은, 예를 들면 상기 바이러스의 효능을 감소시킬 수 있는 약제들의 존재를 제거하거나 감소시킴에 의한 상기 바이러스의 증진된 수용성을 위해 방광을 준비하도록 상기 바이러스의 투여 이전에 선택적으로 방광 세정이나 세척을 포함할 수 있다. 예를 들면, 요로상피(urothelium)는 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan: GAG) 층에 의해 보호되고, 이의 파열은 세포들에 대한 상기 바이러스의 보다 효과적인 결합을 허용할 수 있으며, 이에 따라 보다 효과적인 세포들의 형질도입을 가능하게 할 수 있다. 제한적이지 않은 예에서, 음식 첨가물 및 가용화제로 사용되는 비이온성의 가벼운 세제인 DDM(n-도데실(dodecyl)-β-D-말토시드(maltoside))가 임의의 적절한 농도에서, 예를 들면 약 0.1%의 농도에서 상기 GAG 층을 파열시키거나 제거하는 데 사용될 수 있으며, 이에 따라 형질도입을 가능하게 하는 것을 보조한다.

본 발명의 방법들은 암의 외과적인 치료와 결합되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 종양 절제에 본 발명에 따른 결합 방법을 이용하는 대상의 치료가 수반될 수 있다. 이러한 점이 종양의 재발을 방지하거나 감소시킬 수 있는 것으로 예상된다.

상기 방법들은 상기 바이러스의 임의의 하나 또는 그 이상, 혹은 예를 들면, 특히 표면 표출된 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4 또는 OX-40에 결합되는 단일클론성 항체인 약제와 같은 면역 자극제의 단일 또는 다중 투여량을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법들에서 사용을 위한 키트(kit)들과 관련된다. 기본적인 형태에 있어서, 상기 키트는 환자 내의 암의 치료를 위하여 화학요법제(chemotherapeutic agent)나 방사선과 결합되어 인간 엔테로바이러스 C와 약제학적으로 허용 가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물, 그리고 상기 조성물의 사용에 대한 지시들을 포함할 수 있다. 상기 조성물은, 예를 들면 바이알(vial), 앰플(ampoule) 또는 주사기와 같은 임의의 적합한 용기 내에 제공될 수 있다. 상기 조성물은 감압 동결 건조되거나 동결 건조된 액체 형태 또는 동결된 상태로 제공될 수 있다.

상기 키트는 임의의 숫자의 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 제한적이지 않은 예로서, 추가적인 성분들은 (i) 플레코르닐(Plecornil)과 같은 하나 또는 그 이상의 항바이러스제들; (ii) 종양 용해성 바이러스를 포함하는 하나 또는 그 이상의 추가적인 약제학적 조성물들; (iii) 종양 용해성 바이러스 RNA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 추가적인 약제학적 조성물들; (iv) 환자 내의 암의 치료에 유용한 하나 또는 그 이상의 추가적인 치료제들 등을 포함할 수 있다. 상기 키트는 표면 표출된 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4 또는 OX-40에 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체와 같은 결합 치료에 사용을 위한 면역 자극제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 1회용 바이알, 직접적인 인간 투여를 위해 사전 적재된 주사기 등에 함유되거나, 정맥 내의 투입을 위해 생리적 용액에 희석되거나, 생리적 용액들로 적절한 희석을 가능하게 하는 농축된 형태가 되는 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 용액들은, 예를 들면, 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline) 또는 NaC1₂의 생리적 농축이 될 수 있다

여기에 사용되는 바와 같이, "키트(kit)"라는 용어는 물질들을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템으로 언급된다. 약제학적 조성물들의 구성에 있어서, 이러한 전달 시스템들은 하나의 위치로부터 다른 위치로의 치료제들(예를 들면, 적절한 용기들 내의 종양 용해성 바이러스들 또는 적절한 용기들 내의 면역 자극제들) 및/또는 지지 물질들(예를 들면, 완충제들, 상기 조성물들의 사용을 위한 서면 지시들 등)의 저장, 이송 또는 전달을 가능하게 하는 시스템들을 포함한다. 예를 들면, 키트들은 적절한 성분들 및/또는 지지 물질들을 함유하는 박스들과 같은 하나 또는 그 이상의 엔클로저(enclosure)들을 포함한다.

상기 키트는 조각 키트가 될 수 있다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "조각 키트(fragmented kit)"라는 용어는 각기 전체 키트 성분들의 하위 부분을 함유하는 둘 또는 그 이상의 분리된 용기들을 포함하는 전달 시스템을 언급한다. 상기 용기들은 함께 또는 별도로 의도되는 수용자에게 전달될 수 있다. 조각 키트는, 예를 들면, 상기 바이러스 또는 상기 면역 자극제와 같은 하나 또는 그 이상의 성분들이 하나 또는 그 이상의 다른 성분들과 비교하여 다른 온도와 같은 다른 조건들 하에서 최적으로 저장되거나 이송될 수 있는 경우에 적합할 수 있다. 실제로, 각기 전체 키트 성분들의 하위 부분을 함유하는 둘 또는 그 이상의 분리된 용기들을 포함하는 임의의 전달 시스템은 "조각 키트"라는 용어에 포함된다. 대조적으로, "결합 키트(combined kit)"는 단일 용기 내(예를 들면, 각각의 원하는 성분들을 수용하는 단일 박스 내)에 반응 분석의 모든 성분들을 함유하는 전달 시스템을 언급한다. "키트"라는 용어는 조각 및 결합 키트들을 모두 포함한다.

실험예들

실험예 1: 면역 자극 항체 항-PD-1와 결합된 종양 용해성 CVA21 바이로테라피

이러한 연구는 악성 흑색종의 B16-ICAM-1 쥐 모델에서 면역 자극 항체 항-PD-1와 결합된 CVA21 종양 용해 바이로테라피(virotherapy)의 효과를 조사하였다. 마우스(mouse)들은 피부내로 종양들이 이식되었고(2×10⁵개의 세포들), 치료의 개시 전에 12일 동안 확립하게 하였다. 마우스들은 12일, 15일, 18일 및 21일에 쥐의 항-PD-1항체 또는 짝지은 대조(matched control) 항체와 결합된 식염수(saline), CVA21 또는 UV-불활화 CVA21로 치료되었다. 상기 식염수, CVA21 또는 UV-불활화 CVA21 치료들은 종양 내로 투여되었던 반면, 상기 항-PD-1 및 대조 항체들은 복강 내로 투여되었다. 상기 항-PD-1항체와 결합되어 CVA21로 치료된 동물들은 종양 궤양형성의 종료점 또는 10%보다 큰 체중의 감소에 기초하여 대조군(식염수＋대조 항체)의 동물들에 비해 약간의 생존 이익을 보였다. 12일 내지 21일 사이의 치료 기간 동안, CVA21＋항-PD-1의 결합은 종양발달 정지 효과를 보였지만, 치료가 중단되면, 상기 종양들은 서서히 부피가 증가하였다. 그럼에도 불구하고, 이러한 군의 동물들은 상기 식염수＋대조 항체, UV-CVA21＋대조 항체 및 UV-CVA21＋항-PD-1 항체 치료군들과 비교하여 통계적으로 중요한 생존 이점을 보여주었다. 이러한 연구는 또한 항-CVA21 중화 항체 레벨들이 CVA21＋대조 항체와 비교하여 CVA21＋항-PD-1을 수용한 마우스들에서 보다 높은 레벨들이 검출되었기 때문에 상기 항-PD-1 항체의 면역 자극 성질들을 확인하였다. 요약하면, 이러한 연구의 주요한 발견은 종양이 있는 CVA21＋항-PD-1로 치료된 마우스들이 종양 성장의 지연 및 종양 궤양형성의 감소와 관련된 전체적인 생존 이익을 보여주었다는 점이다.

테스트 물질: 바이러스

테스트 물품인 콕삭키바이러스(Coxsackievirus) A21(CVA21)[상품명: 카바탁™(CAVATAK™)]은 바이알리틱스(주)(Viralytics Ltd)에서 제공되었다. 생체외의 사용을 위한 연구 보존들은 상업적으로 제조된 카바탁^TM의 바이알로부터 만들어졌다. 배치: CCVA2115; 농도: 1×10⁹TCID₅₀/㎖(1.1㎖의 바이알들); 재시험 일자: 2008년 12월, 실험예 2 및 실험예 3에 대해 2014년 1월; 저장 권고 사항: -70℃ 이하에서 저장.

상기 UV-불활화 CVA21은 7㎖의 동일한 카바탁™ 배치(Batch): 바이오해저드 후드(biohazard hood) 내에서 UV광에 CVA2115 생성물을 노출시켜 제조되었다. 상기 바이러스는 처음에 최초 생성물 바이알들로부터 6-웰(well) 플레이트의 웰들로 처음에 이송되었고, 대략 10㎝의 거리에서 한 시간 동안 UV 광원에 노출되었다. 상기 UV-불활화 바이러스는 이후에 부분 표본으로 되었고 -80℃에서 동결되었다.

항체들

대조 항체들

바이옥셀(BioXCell)로부터의 항체 InVivoMAb Rat IgG2a가 실험예 1 및 실험예 2에서 대조 항체로 사용되었다. 클론(clone): 2A3. 카탈로그 #: BE0089. 로트(lot): 4807/0713. 엔도톡신(endotoxin):＜0.35EU/㎎. 제형(formulation): PBS, pH 6.5. 멸균: 0.2㎛ 여과. 순도:＞95%. 저장: 4℃에서 희석되지 않고 어둠 속. 상기 바이옥셀로부터의 항체 InVivoMAb Rat IgG2b는 실험예 3에서 대조 항체로 사용되었다. 클론: MPC-11. 카탈로그 #: BE0086. 로트: 4700-2/0414. 엔도톡신:＜2.0EU/㎎. 제형: PBS, pH 7. 멸균: 0.2㎛ 여과. 순도:＞95%. 저장: 4℃에서 희석되지 않고 어둠 속.

항-PD-1

활성 항-쥐 PD-1 항체가 바이옥셀로부터 수득되었다. 제품명: InVivoMAb anti m PD-1. 클론: RMP1-14. 카탈로그 g#: BE0416. 로트: 4781/0813. 엔도톡신:＜0.61EU/㎎. 제형: PBS, pH 7. 멸균: 0.2㎛ 여과. 순도:＞95%. 저장: 4℃에서 희석되지 않고 어둠 속.

항-CTLA-4

활성 항-쥐 CTLA-4 항체가 바이옥셀로부터 수득되었다. 제품명: InVivoMAb anti m CTLA-4. 클론: 9D9. 카탈로그 #: BE0164. 로트: 5159/0414. 엔도톡신:＜2.0EU/㎎. 제형: PBS, pH 7. 멸균: 0.2㎛ 여과. 순도:＞95%. 저장: 4℃에서 희석되지 않고 어둠 속.

세포들

인간 흑색종 세포주 SK-Mel-28과 쥐 흑색종 세포주들 B16 및 B16-ICAM-1이 이러한 연구에 사용되었다. 상기 흑색종 세포주 SK-Mel-28은 ATCC(미국 균주 은행)으로부터 수득되었다. Mel-RM은 Dr. P. Hersey(뉴캐슬대학, 뉴 사우스 웨일즈, 오스트레일리아)가 기부하였다. B16 쥐 흑색종 세포들은 Dr. A. Shurbier(퀸즐랜드 의학 연구 기관(Queensland Institute for Medical Research), 브리즈번, 퀸즐랜드, 오스트레일리아)로부터 최초로 수득되었고, 이후에 세포주 B16-ICAM-1을 발생시키도록 인간 ICAM-1 유전자로 안정하게 세포 감염되었다. 모든 세포주들은 DMEM(써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 내에 유지되었고, 10%의 소 태아 혈청(fetal calf serum: FCS)(SAFC 바이오사이언시즈™(Biosciences™), 오스트레일리아), 10mM의 멸균 N-2-하이드록시에틸피페라진(hydroxyethylpiperazine) N'-2-에탄술폰산(ethanesulphonic acid: HEPES)(써모 사이언티픽, 오스트레일리아), 2mM의 L-글루타민(glutamine)(써모 사이언티픽, 오스트레일리아), 나트륨 피루베이트(sodium pyruvate)(인비트로겐(Invitrogen), 오스트레일리아) 그리고 100IU/㎖의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)(인비트로겐, 오클랜드, NZ)을 함유하였다. 모든 세포들은 5%의 CO₂환경에서 37℃에서 배양되었다.

동물들

모든 동물 작업은 뉴캐슬대학 동물 보호 및 윤리 위원회(Animal Care and Ethics Committee: ACEC)에서 승인 번호: A-2013-327로 승인되었다. 6주 내지 8주 연령의 암컷 C57BL/6 마우스들(n＝52)이 뉴캐슬대학의 동물 서비스 유닛(Animal Services Unit)을 통해 수득되었다. 이들은 동물 자원 설비 내의 특정한 병원체가 없는 지역에서 개별 통풍 우리(IVC)들 내에 유지되었다. 마우스들은 12/12시간의 명암 주기로 PC2 실험실 내부의 테크니-플라스트(Techni-Plast) 슬림 라인(Slim Line) 공기 조화 시스템에 연결된 HEPA-여과된 테크니-플라스트 케이지들(Cages)(1145 IVC) 내에서 4개의 그룹들로 수용되었다. 마우스들은 스페셜티 피드즈(Specialty Feeds)(서부오스트레일리아주, 오스트레일리아)에서 제조한 마우스 큐브들/펠릿들로 임의로 먹이 공급되었다. 이러한 표준 마우스의 먹이 공급은 지방 함량(대략 5%)이 낮고 육류가 없는 것으로 조제되었다. 방 내부의 공기 흐름은 시간 당 12회 내지 15회의 공기 변화들이 있었지만, 상기 IVC 우리들 내의 공기 흐름은 시간 당 70회의 변화들의 속도였다. 상기 마우스들은 유성펜에 의한 꼬리 마크들에 의해 식별되었다. 모든 동물 연구들은 상기 동물 윤리 위원회의 연구 계획 승인에 따라 수행되었다. 연구의 결말에서나 동물들이 인도적 종료시점에 도달했을 때, 마우스들은 CO₂질식에 의해 안락사되었다.

방법들

바이러스 TCID ₅₀ 분석

96-윌 조직 배양 플레이트들 내의 SK-Mel-28 세포들의 융합성 단일층들은 CVA21의 10-폴드 연속 희석들(100㎕/웰 4회)로 접종되었고, 5%의 CO₂환경 내의 37℃에서 72시간 동안 배양되었다. 마우스 혈청은 2%의 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM 내의 1:10²부터 1:10⁸까지 범위의 연속하여 희석된 10-폴드였다. 웰들은 도립 현미경 하에서 시각적으로 세포 병변 효과(cytopathic effect: CPE)들에 대해 점수가 부여되었다. 검출 가능한 CPE를 가졌던 웰들은 양으로 점수가 부여되었고, 50%의 바이러스 종료점 역가(endpoint titre)는 카버법(Karber method)(Dougherty의 1964)을 이용하여 계산되었다.

바이러스 중화 분석

중화 항체들의 존재에 대한 테스트를 위해, 가열 불활화 마우스 혈청 샘플들이 DMEM(2%의 FCS) 내에서 1:32 내지 1:2048으로 먼저 희석되었다. 일백 마이크로리터의 각 혈청 희석액이 37℃에서 1시간 동안 100㎕의 CVA21(100 TCID₅₀)로 배양되었다. 오십 마이크로리터의 이러한 혈청/바이러스 혼합물이 이후에 384-웰 포맷 내의 SK-Mel-28 세포들 상에 3회 도포되었다. +IgG(양성 대조군(positive control))는 호주 국립 혈청 연구소(Commonwealth Serum Laboratories)(산도글로불린(Sandoglobulin) NF 리퀴드(Liquid), 배치 번호: 4322800002)로부터 상업적으로 수득되었다. 웰들은 도립 현미경 하에서 시각적으로 바이러스 중화(CPE의 결핍)의 존재에 대해 범수가 부여되었다. 상기 중화 항체 역가는 이후에 카버법(Dougherty 1964)을 이용하여 계산되었다.

흑색종의 면역적격 B16-ICAM-1 마우스 모델

6주 내지 8주 연령의 오십이 마리의 암컷 C57BL/6 마우스들(동물 서비스 유닛, 뉴캐슬대학, 오스트레일리아)이 전술한 바와 동일한 조건에서 수용되었다. 상기 마우스들의 뒷옆구리들은 충분한 회복 시간이 허용되도록 종양 세포들의 주입 이전의 3일에 전자 캘리퍼스로 면도되었다. B16-ICAM-1 세포들 트립신(trypsin)으로 수확되었고, 멸균 PBS 내에서 2회 세척되었고 재현탁되었다. 제조된 세포들의 생존도는 트리판 블루(trypan blue) 염색 및 TC-10 자동화 셀 카운터(Automated Cell Counter)(바이오라드(Biorad), 헤라클레스(Hercules), 캘리포니아, USA)로의 분석에 의해 평가되었고, ＞95%의 생존도를 갖는 세포 제제들만이 이종기관이식(xenotransplantation)을 위해 사용되었다. 종양 이식 이전에, 동물들은 5%의 이소플루레인(isoflurane)으로 마취되었다. 종양들은 상기 마우스들의 뒷옆구리 내에 50㎕의 PBS의 부피 내의 2×10⁵개의 B16-ICAM-1 세포들의 단일 주입으로 패부 내로 접종되었다.

실험예 1-실험예 3에 사용된 치료군들 및 전체적인 연구 계획은 다음에 간략하게 기재된다.

실험예 1에서, 동물들은 상기 대조 항체 또는 상기 항-PD-1항체(각기 12.5㎎/㎏)와 결합되어 식염수, CVA21(1×10⁸/주입) 또는 UV-불활화 CVA21(1×10⁸/주입)으로 치료되었다. 치료는 복강 내의 항체(0.2㎖)가 즉시 이후에 수반되는 종양 내 치료(0.1㎖)를 먼저 수용한 동물들로 종양 세포 이식 후의 12일에 개시되었다. 마우스들에게는 3일 마다 치료의 네 가지 과정들이 주어졌고, 종양 접종은 12일에 시작되어 21일에 종료되었다. 실험예 1에 대해 이용된 치료 계획의 요약은 도 1에 도시된다.

실험예 2에서, 동물들은 상기 대조 항체 또는 상기 항-PD-1항체(각기 12.5㎎/㎏)와 결합되어 식염수 또는 CVA21(1x10⁸TCID₅₀/주입)로 치료되었다. 치료는 복강 내의 항체(0.2㎖/마우스)가 즉시 이후에 수반되는 종양 내 치료(0.1㎖/마우스)를 먼저 수용한 동물들로 종양 세포 이식 후의 6일에 개시되었다. 마우스들에게는 3일 마다 치료의 네 가지 과정들이 주어졌고, 종양 접종은 6일에 시작되어 15일에 종료되었다. 동물들은 그 이후에 4주의 기간 동안 매주 간격으로 CVA21(1x10⁸TCID₅₀/주입)의 식염수의추가적인 탑-업(top-up) 주입들을 받았다. 실험예 2에 대해 이용된 치료 계획의 요약은 도 8에 도시된다.

실험예 3에서, 동물들은 상기 대조 항체 또는 상기 항-CTLA-4항체(각기 12.5㎎/㎏)와 결합되어 식염수, CVA21 (1×10⁸TCID₅₀/주입)로 치료되었다. 치료는 복강 내 항체(0.2㎖)가 이후에 즉시 수반되는 종양 내 치료(0.1㎖)를 먼저 받은 동물들로 종양 세포 이식 후의 7일에 개시되었다. 마우스들은 3일 간격으로 네 회의 치료들을 받았고, 종양 접종 후의 10일에 시작되어 16일에 종료되었다. 실험예 3에 대해 이용된 치료 계획의 요약은 도 12에 도시된다.

실험예 4에서, 마우스들은 7일, 10일, 13일 및 16일에 전술한 바와 같이 쥐 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 또는 항-PD-1＋항-CTLA-4 항체들 혹은 짝지은 대조 항체(12.5㎎/㎏)와 결합되어 정맥 내 식염수 또는 정맥 내 CVA21(1×10⁸TCID₅₀[18g의 마우스로 가정하여 5.56×10⁹TCID₅₀/㎏])로 치료되었다. 식염수 또는 CVA21 치료들은 정맥 내로 투여되었던 반면, 상기 항-CTLA-4, 상기 항-PD-1 및 대조 항체들은 복강 내로 투여되었다(군 당 n＝12-14). 숙련된 수신자에게 이해될 것인 바와 같이, 복강 내 투여는 혈류 내로 상기 항체를 투입하는 효과적인 방식이며, 이에 따라 전신 투여를 위한 적절한 모델을 제공한다.

종양들은 주당 두 번 측정되었고, 종양 부피들은 스페로이드(spheroid) V＝Π/6ㆍaㆍb²의 부피에 기초하여 추정되었고, 여기서 "a" 및 "b"는 각기 상기 종양의 가장 길고 가장 짧은 직교하는 직경들이다. 모든 마우스들로부터 혈액이 복재 정맥의 정맥천자(venipuncture)에 의해 매주 단위로 수집되었고, 혈청의 수집을 위해 실온에서 5분 동안 10,000rpm으로 원심 분리되었다. 혈청 샘플들은 다른 시험들까지 -80℃에서 저장되었다. 상기 동물들은 종양들이 궤양으로 되었거나 체중 감소가 10%를 초과하였을 때에 CO₂질식에 의해 인도적으로 안락사되었거나, 그렇지 않으면 마우스들은 연구의 종료 시점(실험예 1에서 45일째; 실험예 2에서 66일째; 실험예 3에서 77일째)에서 희생되었다.

표 1. 면역적격 C57BL /6 마우스 모델: 마우스 식별 번호들 및 치료군들의 할당

통계적 분석

모든 데이터가 분석되었고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v6.0(그래프패드 소프트웨어사(GraphPad Software Inc.))을 이용하여 도표로 표시되었다. 동물 데이터 분석을 위해, 그래프패드 프리즘 v6.0(그래프패드 소프트웨어사)이 이원 분산 분석(two-way ANOVA)(반복되는 측정들로) 및 본페로니 사후검증(Bonferroni post-test)을 이용하여 치료군들 사이의 종양 부피들의 차이를 비교하는데 이용되었다. 생존 곡선들의 비교는 로그-순위(Log-rank)[만텔-콕스(Mantel-Cox)] 테스트를 이용하여 수행되었다.

결과들

면역적격 마우스 모델에서 종양 용해 바이로테라피 및 항-PD-1 면역 치료의 결합의 생체 내 평가

결합 CVA21 및 항-PD-1 치료 접근이 흑색종의 면역적격 마우스 모델에서 효과적이었던 지를 평가하기 위해, C57BL/6 마우스들은 뒷옆구리 상에 피부 내로 쥐의 B16-ICAM-1 종양 세포들(2×10⁵개)이 이식되었다. 종양들은 종양 접종 후의 12일, 15일, 18일 및 21일에 치료의 개시 전에 확립되게 하였다(도 1 참조). 식염수 또는 CVA21은 나타낸 시점들에서 종양 내로 투여되었던 반면, 상기 대조 항체 또는 항-PD-1 항체는 복강 내로 투여되었다. 마우스들은 매일 모니터되었고, 주당 3회까지 체중이 측정되었으며, 종양 부피들은 전자 캘리퍼스로 주당 2회 측정되었다. 복재 정맥으로부터의 혈액 샘플링은 주 간격으로 수행되었다. 상기 연구는 종양 접종 후의 45일째에 종료되었다.

항-PD-1 또는 대조 항체와 결합된 식염수, CVA21 또는 UV-불활화 CVA21로의 치료 다음의 체중들

동물들은 주당 3회 체중이 측정되었고, 결과들은 기록 유지를 위해 파일마커 프로(FileMaker Pro) 및 등록된 동물 모니터링 데이터베이스를 이용하여 전자적으로 기록되었다(내부 참조: 실험 #53). 기초 무게(raw weight)들은 표 2 내지 표 10에서 찾아볼 수 있다. 체중들 또한 본 발명자들의 기관인 동물 보호 및 윤리 위원회의 요구 사항들을 만족시키도록 동물 모니터링 체크리스트/레코드들에 기록되었다. 31일째에 상기 UV-CVA21＋항-PD-1 군을 제외하면, 임의의 시점들에서 상기 치료군들 및 NTC 마우스들 사이에 평균 체중에서 통계적으로 중요한 차이점들(홀름-시닥법을 이용하여 다중 비교들에 대해 수정된 다중 t-검증들)은 없었다(맥(Mac) OS X 버전(Version) 6.0c를 위한 프리즘 6, 그래프패드 소프트웨어(라 호야 캘리포니아(La Jolla California), 미국, www.graphpad.com). 동물들은 상기 CVA21 및 항-PD-1 치료를 잘 견디는 것으로 보였고, 상기 치료로부터 독성들은 관찰되지 않았다. 전체 9마리의 동물들이 종양 궤양형성 및/또는 10% 이상의 체중 감소로 인해 안락사되었다. 체중의 감소는 종양 궤양형성 및 연관된 종양 부담(tumour burden)과 연계된 대부분의 경우들에서 있었다.

표 2. 면역적격 동물 모델: 군 1-종양이 없는 대조군(NTC) 마우스들의 각각의 마우스 체중

표 3. 면역적격 동물 모델: 군 2-식염수＋대조 Ab 치료된 마우스들의 각각의 마우스 체중

표 4. 면역적격 동물 모델: 군 3-식염수＋항-PD-1 치료된 마우스들의 각각의 마우스 체중

군 3-식염수＋항-PD-1-마우스 No .

표 5. 면역적격 동물 모델: 군 4- UVCVA21 ＋대조 Ab 치료된 마우스들의 각각의 마우스 체중

표 6. 면역적격 동물 모델: 군- UV CVA21 ＋항-PD-1 치료된 마우스들의 각각의 마우스 체중

표 7. 면역적격 동물 모델: 군 6- CVA21 ＋대조 항체 치료된 마우스들의 각각의 마우스 체중

표 8. 면역적격 동물 모델: 군 7- CVA21 ＋항-PD-1 치료된 마우스들의 각각의 마우스 체중

표 9, 표 10 및 표 11은 본 출원의 도면 부분에 포함된다.

항-PD-1 또는 대조 항체와 결합되는 식염수, CVA21 또는 UV-불활화 CVA21로의 치료에 뒤따르는 종양 부피 데이터

종양 부피들은 전자 버니어 캘리퍼스를 사용하여 주당 두 번 측정되었다. 31일까지, 모든 식염수＋대조 항체 치료된 마우스들은 종양 부피 및 종양 궤양형성에 의해 증거가 되는 진행성 질병으로 인해 안락사되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 적은 항종양 활성이 상기 UV-CVA21＋대조 항체 치료된 종양들 내에서 관찰되었다. 35일까지 모든 종양 부피들은 최대의 인도적 종료시점에 도달될 때까지 확장되었고 안락사가 요구되었다. 초기 종양 출발 부피들에서 높은 정도의 변동성이 있었고, 활성 CVA21＋항-PD-1에 대한 가장 적절한 대조군은 식염수＋항-PD-1보다는 UV-CVA21＋항-PD-1 치료된 군으로 보였다(3마리의 동물들이 치료의 완료 이전에 안락사가 필요했다). 24일에 UV-CVA21＋항-PD-1 및 CVA21＋항-PD-1 치료들 사이의 종양 부피들의 비교는 양방적 t-검증의 이용하여 중요한 차이(p＜0.0039)가 있었던 점을 보였다. 상기 UV-불활화 CVA21에 비해 살아있는 CVA21＋항-PD-1 군의 마우스들 사이의 종양 부피들의 상당한 감소가 치료의 활성기 동안 가장 중요하였으며, 결국 종양들은 대부분의 군들에서 재발되었다.

면역적격 마우스들 및 항-CVA21 중화 항체들의 증가된 레벨들로부터의 바이러스 제거

감염성 CVA21이 12일에 바이러스의 종양 내 주입 후 대략 45분에 바이러스 치료된 동물들의 혈청 내에서 검출되었다. 혈액 내의 순환하는 바이러스는 CVA21 종양 내로의 추가적인 치료에도 불구하고 19일까지 첫 번째 주 내에 제거되었다. 살아있는 CVA21로 치료된 동물들은 26일에 최대에 도달하는 CVA21 중화 항체들의 가장 높은 레벨들을 생산하였다. 기능적 면역 체계를 갖는 이들 마우스들이 정해지면, 혈류로부터 CVA21의 제거는 기대되지 않았다. 놀랍게도, 상기 항-PD-1 항체의 투여가 45일까지 지속되는 1:228 중화 유닛들 보다 큰 항-CVA21 항체들의 상승된 레벨들을 나타내는 이들 마우스들로 상기 항바이러스 면역 반응을 향상시키는 것으로 나타났다. 이는 보다 큰 정도의 바이러스 복제 및 후속하는 항바이러스 항체들의 생산을 가능하게 하는 상기 항-PD-1 항체의 작용의 결과일 수 있다. 이러한 발견은 항바이러스 항체들의 향상된 레벨이 생성되었을 뿐만 아니라 보다 높은 레벨의 특정 항종양 항체들이 이러한 프로세스에서 발생되었으며, 이에 따라 항종양 항체들이 종양 부담을 감소시키는 결과로서 임상적 유익을 가져올 수 있는(항체-의존형 세포의 세포독성) 가능성을 제기한다.

식염수 및 항-PD-1와 비교한 항-PD-1과 결합된 CVA21로의 마우스 치료에서 향상된 생존

상기 항-PD-1 항체와 결합된 CVA21은 식염수＋대조 항체군에 비해 전체적인 생존에서 통계적으로 중요한 증진을 입증하였다(p＝0.014 로그-순위(Log-rank)[만텔-콕스(Mantel-Cox)] 테스트)(도 7E). 상기 식염수＋항-PD-1과 식염수＋대조 항체군을 비교할 경우, 통계적으로 중요한 차이는 없었다. 이는 생존에 대해 상기 대조 항체 및 상기 항-PD-1 항체 사이에 차이가 없었던 점을 제시한다. 상기 식염수＋항-PD-1 생존 곡선이 상기 CVA21＋항-PD-1 치료군과 비교되었을 때, 통계적인 차이는 없었다(p＝0.4901 로그-순위[만텔-콕스] 테스트)(도 7B). 이러한 발견은 생존의 주요 효과가 대체로 항-PD-1계이었지만, 살아있는 CVA21을 나타냈던 항-PD-1와 함께 UV-불활화 CVA21 및 활성 CVA21 군들 사이의 어느 정도는 예기치 않은 비교가 추가적인 충분한 생존 시간 이점을 가져오는 것을 제시한다. 높은 정도의 출발 종양 변이성과 조기 희생으로 인해, 상대적인 생존 이익들의 엄격한 분석들은 상당히 어려웠다. 그러나, 상기 식염수＋항-PD-1 군에 비해 상기 살아있는 CVA21＋항-PD-1 치료된 군의 주목할 만한 생존 이익의 경향이 활성 치료 기간 동안에 관찰되었다.

논의

결과들은 상기 항-PD-1 항체와 결합된 살아있는 CVA21의 사용이 상기 식염수＋대조 항체 치료군과 비교하여 가장 우수한 전체적인 생존을 가져왔던 점을 나타내었다. 상기 항-PD-1 항체와 결합된 CVA21은 상기 식염수＋대조 항체군에 비해 전체적인 생존에서 통계적으로 중요한 향상을 입증하였다(p＝0.014 로그-순위[만텔-콕스] 테스트)(도 7E). 상기 식염수＋항-PD-1과 식염수＋대조 항체군을 비교할 경우, 통계적으로 중요한 차이는 없었다. 이는 생존에 대해 상기 대조 항체 및 상기 항-PD-1 항체 사이에 차이가 없는 것을 제시한다. 상기 식염수＋항-PD-1 생존 곡선이 상기 CVA21＋항-PD-1 치료군과 비교되었을 때, 통계적인 차이는 없었다(p＝0.4901 로그-순위[만텔-콕스] 테스트)(도 7B). 이러한 발견은 생존의 주요 효과가 대체로 항-PD-1계였지만, CVA21의 첨가는 본 발명자들의 제한된 군 규모들에 기초하여 식염수에 비해 상당히 향상되지는 않았던 점을 제시한다. 흥미롭게도, 항-PD-1와 함께 UV-불활화 CVA21 및 활성 CVA21 군들 사이의 비교는 살아있는 CVA21이 약간 긴 생존 시간을 제공하며, 통계적으로 중요하였던 점을 나타내었다. 이는 활발하게 복제되는 CVA21 및 종양 세포들의 용해가 불활화 바이러스 입자들에 비해 면역 자극 항-PD-1 항체들의 존재에서 항종양 면역을 보다 효과적으로 자극할 수 있는 본 발명자들의 가설에 부합한다. 상기 UV-불활화 CVA21＋항-PD-1 항체군의 생존은 상기 UV-불활화 CVA21＋대조 항체 또는 상기 CVA21＋대조 항체군의 경우와 통계적으로 다르지 않았다.

이러한 연구의 중요한 발견은 종양이 있는 CVA21＋항-PD-1로 치료된 마우스들이 종양 성장의 지연 및 종양 궤양형성의 감소와 연관되었던 전체적인 생존 이익을 보여주었던 점이었다. 치료의 활성기 동안, 상기 CVA21＋항-PD-1 항체로 치료된 동물들은 대조군들과 비교하여 중양 진행의 지연을 보여주었다.

실험예 2: 면역자극 항체 항-PD-1과 결합된 종양 용해성 CVA21 바이로테라피: 종양 재접종 연구

이러한 연구는 악성 흑색종의 B16-ICAM-1 쥐 모델에서 면역자극 항체 항-PD-1와 결합된 콕삭키바이러스 A21(CVA21) 종양 용해 바이로테라피의 효과를 조사하여 실험예 1에서 보고된 작업의 연장이었다. 실험예 2의 시간선 표시는 도 8에 도시된다. 실험예 1과는 다르게, 실험예 2의 전체적인 시간선은 66일이었고, 다음에 보다 상세하게 설명하는 바와 같은 "종양 재접종(tumor re-challenge)"을 포함하였다. 실험예 2에 대해 사용된 마우스들이 4주 내지 6주 사이의 연령이었지만, 실험예 2에 사용된 물질들과 방법들은 그 이외에는 실험예 1에서 기재된 바와 대체로 같았다.

마우스들은 오른쪽 뒷옆구리 상에 피부 내로 B16-ICAM-1 종양들(2×10⁵개의 세포들)이 이식되었고, 치료의 개시 전에 6일 동안 확립되게 하였다. 마우스들은 6일, 9일, 12일 및 15일에 쥐의 항-PD-1항체 또는 짝지은 대조 항체(12.5㎎/㎏)와 결합된 식염수 또는 CVA21(1×10⁸TCID₅₀[5.56×10⁹TCID₅₀/㎏])로 치료되었다. 식염수 또는 CVA21 치료들은 종양 내로 투여되었던 반면, 상기 항-PD-1 및 대조 항체들은 복강 내로 투여되었다(군 당 n＝12). 식염수 또는 CVA21(1×10⁸TCID₅₀[5.56×10⁹TCID₅₀/㎏])의 추가적인 탑-업 주입들이 그 이후에 4주의 기간 매주 간격으로 투여되었다. 원발 B16-ICAM-1 흑색종 종양들은 2일 내지 3일마다 디지털 캘리퍼스를 사용하여 규칙적으로 모니터되었고, 종양 부피들은 종양의 x/y 평면 내의 두 개의 가장 긴 직교하는 축들을 이용한 스페로이드에 대한 공식에 기초하여 계산되었다. 궤양 형성의 징후들, ＞10%의 체중 감소 또는 2500㎣ 보다 큰 종양 부피들을 나타내는 종양이 있는 동물들은 안락사되었다.

31일에, 마우스들이 항-PD-1 치료와 결합된 CVA21 바이로테라피 다음에 강한 항종양 반응을 발달시켰던 지를 결정하기 위해 남아 있는 동물들은 1×10⁵개의 B16 쥐 흑색종 세포들(인간-ICAM-1 수용체가 결핍됨)이 피부 내로 재접종되었다. 재접종되었던 37마리의 동물들 중에서, 모든 동물들은 결국 촉지 가능한 종양들을 발달시켰지만, 존재하는 B16-ICAM-1 종양들의 CVA21＋항-PD-1 치료에 의해 지연되었던 점을 나타내는 경향이 있었다.

상기 항-PD-1 항체와 결합된 CVA21로 치료된 동물들은 CVA21＋항-PD-1가 임상 현장에서 유익할 수 있는 것을 제시하는 식염수＋항-PD-1 항체 및 식염수＋대조 항체 군의 동물들에 비해 생존에서 통계적으로 중요한 연장(각기 60일 대 45일의 중앙 생존기간)을 나타내었다. CVA21＋항-PD-1의 사용은 시험된 항원들과 관련된 부작용 보고들이 없이 흑색종의 이러한 면역적격 마우스 모델에서 잘 용인되는 것으로 발견되었다.

항-PD-1 또는 대조 항체와 결합된 식염수 또는 CVA21로의 치료 다음의 체중들

각각의 동물들의 체중이 수집되었고, 실험예 1에 기재된 바와 같이 분석되었다. 임의의 시점들에서 상기 치료군들 및 NTC 마우스들 사이에 평균 체중에서 통계적으로 중요한 차이점들은 관찰되지 않았다(결과들은 도시되지 않음; 홀름-시닥법을 이용하는 다중 비교에 대해 수정된 다중 t-검증들)[맥 OS X 버전 6.0c를 위한 프리즘 6, 그래프패드 소프트웨어, 라 호야 캘리포니아, 미국, www.graphpad.com]. 동물들은 상기 CVA21 및 항-PD-1 치료를 잘 견디는 것으로 보였고, 상기 치료들로부터 관찰 가능한 독성들은 없었다. 체중의 감소는 종양 궤양형성 및 연관된 종양 부담에 연계되는 대부분의 경우들에서 있었다.

원발 B16- ICAM -1 결절들의 종양 부피들

종양 부피들은 전자 버니어 캘리퍼스를 사용하여 주당 세 번 측정되었다. 42일까지, 모든 식염수＋대조 항체 치료된 마우스들은 종양 부피 및 종양 궤양형성에 의해 증거가 되는 진행성 질병으로 인해 안락사되었다. 도 9에 도시된 바와 같이, 적은 항종양 활성이 상기 식염수＋대조 항체 치료된 종양들에서 관찰되었다. 모든 종양 부피들은 도달된 최대의 인도적 종료시점에서 확대되었고 안락사가 필요했다. 상기 CVA21＋항-PD-1 치료군은 종양 발병에서 주목할 만한 지연으로 가장 우수한 반응들을 나타내었고, 여섯 마리의 동물들만이 연구의 후반부를 향해 원발 종양 성장의 징후들을 보였다.

속발 B16 결절들의 종양 부피들

항-PD-1 치료와 결합된 CVA21 치료 다음에 강한 항종양 면역 반응이 발달되었던 지를 확립하기 위해, 마우스들은 B16 쥐 흑색종 세포들로 재접종되었다. B16 세포들은 인간 ICAM-1 수용체가 결핍되며, 이에 따라 CVA21 치료에 저항성이 있다. 이들 세포들은 B16-ICAM-1 세포주를 발생시키는 데 사용된 상기 B16 세포들과 항원과 관련하여 유사하며, 후속하는 원발 종양의 종양 용해를 가져올 수 있는 항종양 면역 반응들의 존재를 확인하는 데 이용되었다. 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, B16 종양들은 B16 세포들로 재접종된 모든 마우스들에서 결국 발달되었지만, 45일에 상기 식염수＋대조 항체군의 평균 종양 부피는 상기 식염수＋항-PD-1, CVA21＋대조 항체 및 CVA21＋항-PD-1 항체군들 보다 통계적으로 컸다(이원 분산 분석).

식염수 및 항-PD-1와 비교한 항-PD-1과 결합된 CVA21으로 치료된 마우스들의 향상된 생존

상기 항-PD-1 항체와 결합된 CVA21은 상기 식염수＋대조 항체군에 비해 전체적인 생존에서 통계적으로 중요한 향상을 입증하였다(p＜0.0001 로그-순위[만텔-콕스] 테스트)(도 11). CVA21＋대조 항체와 상기 식염수＋대조 항체군을 비교할 경우, 통계적으로 중요한 차이는 없었다. 상기 식염수＋항-PD-1 생존 곡선이 상기 CVA21＋항-PD-1 치료군과 비교되었을 때, 통계적인 차이는 없었다(p＝0.0026 로그-순위[만텔-콕스] 테스트)(도 11). 이러한 발견은 상기 항-PD-1 항체와 결합되어 사용된 CVA21이 gave 중요한 생존 이점을 가져왔던 점을 제시한다(식염수＋항-PD-1 및 CVA21＋항-PD-1에 대한 각기 45일 60일의 중앙 생존기간).

논의

실험예 2의 결과들은 상기 항-PD-1 항체와 결합된 CVA21의 사용이 상기 식염수＋항-PD-1 항체 치료군을 수용한 동물들에 비해 종양이 있는 마우스들의 전체적인 생존을 증진시켰던 점을 나타내었다. 상기 항-PD-1 항체와 결합된 CVA21은 상기 식염수＋대조 항체군에 비해 전체적인 생존에서 통계적으로 중요한 향상을 입증하였다(p＜0.0001 로그-순위[만텔-콕스] 테스트)(도 11). 상기 항-PD-1와 결합된 CVA21의 치료 요법은 테스트 물품들에 기인하는 부작용들이 없이 잘 용인되었다. 이러한 연구의 주요한 발견은 종양이 있는 CVA21＋항-PD-1로 치료된 마우스들이 종양 성장의 지연과 관련된 전체적인 생존 이익을 보였던 점이었다. 상기 CVA21＋항-PD-1 항체로 치료된 동물들은 대조군들과 비교하여 질병 진행의 서행을 보여주었고, 속발 B16 종양으로의 재접종에 보다 저항성이었다.

실험예 3. 면역자극 항체 항-CTLA-4와 결합된 종양 용해성 CVA21 바이로테라피: 종양 재접종 연구

이러한 연구는 악성 흑색종의 B16-ICAM-1 쥐 모델에서 면역 자극 항체 항-CTLA-4와 결합된 콕삭키바이러스 A21(CVA21) 종양 용해 바이로테라피의 효과를 조사한다.

마우스들은 오른쪽 뒷옆구리 상에 피부 내로 B16-ICAM-1 종양들(2×10⁵개의 세포들)로 이식되었고, 치료의 개시 전에 7일 동안 확립되게 하였다. 마우스들은 7일, 10일, 13일 및 16일에 쥐의 항-CTLA-4항체 또는 짝지은 대조 항체(12.5㎎/㎏)와 결합되어 식염수 또는 CVA21(1×10⁸TCID₅₀[18g의 마우스로 가정하여 5.56×10⁹TCID₅₀/㎏])로 치료되었다. 식염수 또는 CVA21 치료들은 종양내로 투여되었던 반면, 상기 항-CTLA-4 및 대조 항체들은 복강 내로 투여되었다(군 당 n＝12). 원발 B16-ICAM-1 흑색종 종양들은 2일 내지 3일마다 디지털 캘리퍼스를 사용하여 규칙적으로 모니터되었고, 종양 부피들은 종양의 x/y 평면 내의 두 개의 가장 긴 직교하는 축들을 이용하는 스페로이드에 대한 공식에 기초하여 계산되었다. 궤양형성의 징후들, ＞10%의 체중 감소 또는 2500㎣보다 큰 종양 부피들을 나타낸 종양이 있는 동물들은 안락사되었다. B16-ICAM-1 종양이 있는 마우스들에서 CVA21＋항-CTLA-4 치료는 모든 다른 치료군들에 비해 지속성의 종양 퇴행을 가져왔다.

37일에, 마우스들이 항-CTLA-4 치료와 결합된 CVA21 바이로테라피 다음에 강한 항종양 면역 반응을 발달시켰던 지를 결정하기 위해 남아 있는 동물들은 2×10⁵개의 B16 쥐 흑색종 세포들(인간-ICAM-1 수용체가 결핍됨)로 피부 내로 재접종되었다. 재접종되었던 34마리의 동물들 중에서, 거의 여섯 마리의 동물들이 결국 촉지 가능한 종양들을 발달시켰다(종양이 없이 남아있던 두 마리의 식염수＋항-CTLA-4 및 네 마리의 CVA21＋항-CTLA-4 마우스들).

상기 항-CTLA-4 항체와 결합된 CVA21로 치료된 동물들은 단일 약제 CVA21 및 항-CTLA-4 항체만으로 치료되었던 식염수＋대조 항체군(39일 대 72일의 중앙 생존기간)의 동물들과 비교하여 생존에서 통계적으로 중요한 연장을 보였다. CVA21＋항-CTLA-4 대 단일 약제 항-CTLA-4 사이에 중요한 차이는 없었지만, 결합 CVA21＋항-CTLA-4는 CVA21만에 비해 증진된 생존을 가져왔으며(72일 대 56.5일의 중앙 생존기간), 이러한 결합이 임상적 상황에서 유익할 수 있는 점을 제시하였다. CVA21＋항-CTLA-4의 사용은 시험된 항체들과 연관된 부작용들이 없이 흑색종의 이러한 면역적격 마우스 모델에서 잘 용인되는 것으로 발견되었다.

항-CTLA-4 또는 대조 항체와 결합된 식염수 또는 CVA21로의 치료 다음의 체중들

각각의 동물들의 체중이 실험예 1에 기재된 바와 같이 수집되었고 분석되었다. 임의의 시점들에서 상기 치료군들 및 NTC 마우스들 사이에 평균 체중에서 통계적으로 중요한 차이점들은 없었다(결과들은 도시되지 않음; 홀름-시닥법을 이용하는 다중 비교들에 대해 수정된 다중 t-검증들[맥 OS X 버전 6.0c을 위한 프리즘 6, 그래프패드 소프트웨어, 라 호야 캘리포니아, 미국, www.graphpad.com]. 동물들은 상기 CVA21 및 항-CTLA-4 치료를 잘 견디는 것으로 보였고, 상기 치료들로부터 관찰 가능한 독성들은 없었다. 체중의 감소는 종양 궤양형성 및 연관된 종양 부담과 연계되는 대부분의 경우들에서 있었다.

원발 B16- ICAM -1 결절들의 종양 부피들

종양 부피들은 전자 버니어 캘리퍼스를 사용하여 주당 두 번 측정되었다. 45일까지, 모든 식염수＋대조 항체 치료된 마우스들은 종양 부피 및 종양 궤양형성에 의해 증거가 되는 진행성 질병으로 인해 안락사되었다. 도 13에 도시된 바와 같이, 적은 항종양 활성이 상기 식염수＋대조 항체 치료된 종양들에서 관찰되었다. 모든 종양 부피들은 확장되었고 최대의 인도적 종료시점과 요구되는 안락사에 도달하였다. 상기 CVA21＋항-CTLA-4 치료군은 종양 발병에서 주목할 만한 지연으로 가장 우수한 반응들을 나타내었고, 상기 연구의 후반 동안에 원발 종양 성장의 징후들을 나타내는 동물들은 없었다. 지속성 반응이 수반되는 완전한 종양 퇴행이 각 단일 치료들로 치료된 동물들의 60%에서 관찰되었다. 보다 흥미롭게는, CVA21＋항-CTLA-4 결합 치료로 치료된 모든 동물들은 상기 원발 종양에 대한 완전한 거부를 입증하였다.

속발 B16 결절들의 종양 부피들

항-CTLA-4 치료와 결합된 CVA21 치료 다음에 항종양 면역 반응이 발달되었던 지를 확립하기 위해, 마우스들은 B16 쥐 흑색종 세포들로 재접종되었다. B16 세포들은 인간 ICAM-1 수용체가 결핍되며, 이에 따라 CVA21 치료에 저항성이 있다. 이들 세포들은 B16-ICAM-1 세포주를 발생시키는 데 사용된 상기 B16 세포들과 항원과 관련하여 유사하며, 후속되는 원발 종양의 종양 용해를 가져올 수 있는 항종양 면역 반응들의 존재를 확인하는 데 이용되었다. 77일에, 항-CTLA-4＋CVA21 결합 치료로 치료된 동물들은 단일 약제 항-CTLA-4 항체로 치료된 동물들에서의 25%의 보호에 비해 종양 재접종에 대하여 40%의 보호를 입증하였다(도 14).

식염수 및 항-CTLA-4와 비교한 항-CTLA-4와 결합된 CVA21로 치료된 마우스들의 향상된 생존

연구에 대한 동물들의 전체적인 생존. 식염수 치료된 동물들에 대해 비교되었을 때, 모든 치료군들은 상기 동물들의 전체적인 생존이 상당히 연장된다. 단일 약제 항-CTLA-4(p＝0.0068), 단일 약제 CVA21(p＝0.0067) 그리고 CVA21＋항-CTLA-4＋CVA21(p＝＜0.0001). 상기 항-CTLA-4 항체와 결합된 CVA21은 상기 식염수＋대조 항체군에 비해 전체적인 생존에서 통계적으로 중요한 향상을 입증하였다(p＜0.0001 로그-순위[만텔-콕스] 테스트)(도 15). 상기 CVA21＋대조 항체와 상기 식염수＋대조 항체군을 비교할 경우, 통계적으로 중요한 차이는 없었다. 상기 식염수＋항-CTLA-4 생존 곡선이 상기 CVA21＋항-CTLA-4 치료군과 비교되었을 때, 통계적인 차이는 없었다(p＝0.0026 로그-순위[만텔-콕스] 테스트)(도 15). 이러한 발견은 상기 항-CTLA-4 항체와 결합되어 사용된 CVA21이 중요한 생존 이점을 가져왔던 것을 제시한다(식염수＋항-CTLA-4 및 CVA21＋항-CTLA-4에 대한 각기 45일 대 60일의 중앙 생존기간). 연구에서 동물들의 중앙 생존기간은 도 15(B)에 도시된다. CVA21＋항-CTLA-4의 결합 치료를 수용한 동물들이 가장 긴 중앙 생존기간을 가졌다(72일).

논의

실험예 3의 결과들은 상기 CVA21＋대조 항체 치료군을 수용한 동물들에 비해 종양이 있는 마우스들의 전체적인 생존을 증진시켰던 점을 나타내었다. 모든 CVA21＋항-CTLA-4 치료된 B16-ICAM-1 종양들은 77일에 퇴행되었다. 상기 항-CTLA-4 항체와 결합된 CVA21은 상기 식염수＋대조 항체군에 비해 전체적인 생존에서 통계적으로 중요한 향상을 입증하였다(p＜0.0001 로그-순위[만텔-콕스] 테스트)(도 15). 45일째까지, 모든 식염수＋대조 항체 치료된 마우스들은 종양 진행 및/또는 궤양 형성으로 인해 안락사되었다. 상기 항-CTLA-4와 결합된 CVA21의 치료 요법은 테스트된 물품들에 기인하는 명백한 부작용 보고들이 없이 잘 용인되었다.

실험예 3에서 제시된 이러한 연구의 주요한 발견은 종양이 있는 CVA21＋항-CTLA-4로 치료된 마우스들이 B16-ICAM-1 종양 성장의 지연과 연관되었던 전체적인 생존 이익을 보여주었던 점이었다. 상기 CVA21＋항-CTLA-4 항체로 치료된 동물들은 대조군들에 비하여 종양 진행의 억제를 보여주었고, 단일 약제 치료된 군들에 비해 속발 B16 종양으로의 재접종에 대해 보다 저항성을 나타내었다.

실험예 4: 면역자극 항체 항-PD-1, 항-CTLA-4 및 항-PD-1＋항-CTLA-4와 결합된 정맥 내의 종양 용해성 CVA21 바이로테라피 종양 연구

이러한 연구는 악성 흑색종의 B16-ICAM-1 쥐 모델에서 상기 면역자극 항체들 항-PD-1, 항-CTLA-4 및 항-PD-1＋항-CTLA-4와 결합된 콕삭키바이러스 A21(CVA21) 종양 용해 바이로테라피의 효과를 조사하였다.

마우스들은 오른쪽 뒷옆구리 상에 B16-ICAM-1 종양들(2×10⁵개의 세포들)이 피부내로 이식되었고, 치료의 개시 전에 7일 동안 확립되게 하였다. 마우스들은 7일, 10일, 13일 및 16일에 쥐 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 혹은 항-PD-1＋항-CTLA-4 항체들 또는 짝지은 대조 항체(12.5㎎/㎏)와 결합되어 정맥 내의 식염수 또는 정맥 내의 CVA21(1×10⁸TCID₅₀[18g의 마우스로 가정하여 5.56×10⁹TCID₅₀/㎏])로 치료되었다. 식염수 또는 CVA21 치료들은 정맥 내로 투여되었던 반면, 상기 항-CTLA-4 및 대조 항체들은 복강 내로 투여되었다(군 당 n＝12-14). The 원발 B16-ICAM-1 흑색종 종양들은 2일 내지 3일마다 디지털 캘리퍼스를 사용하여 규칙적으로 모니터되었고, 종양 부피들은 상기 종양의 x/y 평면 내의 두 개의 가장 긴 직교하는 축들을 이용하여 스페로이드에 대한 공식에 기초하여 계산되었다. 궤양 형성의 징후들, ＞10%의 체중 감소 또는 2500㎣ 보다 큰 종양 부피들을 나타내는 종양들이 있는 동물들은 안락사되었다.

원발 B16-ICAM-1 결절들의 종양 부피들

종양 부피들은 전자 버니어 캘리퍼스를 사용하여 주당 두 번 측정되었다. 도 16A에 도시된 바와 같이, 연구 일자 27에서, 적은 항종양 활성이 상기 식염수＋대조 항체 치료된 종양들에서 관찰되었다. 모든 단일 약제군들(CVA21, 항-PD-1 및 항-CTLA-4)은 상기 식염수군에 비해 상당한 종양 감소들을 나타내었다. 모든 결합 치료군들은 상기 식염수군에 비해 상당한 종양 감소들을 나타내었지만, 일반적으로 상기 단일 약제 치료들에 대해 보다 큰 유의의성 레벨을 가졌다. 도 16B에 있어서, 전체 연구 시간 과정에 걸친 평균 종양 부피들의 분석은 상기 식염수 대조군 동물들에 비해 단일 약제 및 결합 군들 모두에서 상당한 종양 감소들을 다시 나타내었다. 주목할 만한 경향이 단일 약제 CVA21 또는 항-PD-1 치료 단독이 비해 감소된 종양 발달 동태를 나타낸 항-PD-1 및 CVA21의 결합으로 확인되었다. 종양 발달의 각각의 스파이더(spider) 도표들은 도 16C에 나타난다. 데이터는 상기 식염수 대조군에 비해 모든 치료군들 내에 촉지 가능한 종양 발달의 발생에서 상당한 감소를 나타낸다. 특별히 중요한 점은 상기 단일 약제 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 치료된 동물들 내의 검출 가능한 종양들의 존재에 비해 정맥 내 CVA21 투여와 결합될 때에 항-PD-1 및 항-CTLA-4 모두에서 종양 발생의 감소이다. 보다 놀라운 점은 CVA21＋항-PD-1＋항-CTLA-4 결합 치료로 치료되었던 모든 동물들이 연구 일자 27일에 원발 종양 발달에 대한 완전한 거부를 입증하였던 관찰이다.

실험예 5: 원격 종양들에 대한 CVA21 종양 내 주입의 전신 효과

종양 내(i.t) 주입에 후속하여, CVA21이 종양 세포들을 발현시키는 ICAM-1을 우선적으로 감염시켰고, 종양 세포 용해 및 전신 면역 매개성 항종양 반응을 가져왔다. 진행 흑색종 환자들 내의 전달된 CVA21의 페이스 II 시험은 주입된 및 원격의 주입되지 않은 병변들 모두에서 항종양 활성을 강조하였다(도 17).

상기 CALM 연구(말기 흑색종에서 카바탁^TM)는 치료되거나 치료되지 않은 절제 불가능 단계 IIIC-IVM1c 흑색종이 있는 57의 환자들 내의 CVA21의 종양 내 투여의 효능과 안전성을 조사하였다. 각 환자는 1일, 3일, 5일, 8일, 22일, 43일, 64일에 및 다른 3주마다의 간격들(최대 10세트의 주입까지)에 과도한 독성의 질병 진행이나 발달이 확인될 때까지 i.t. 투여에 의해 4.0㎖의 최대 부피 내의 3×10^8.0TCID₅₀(70㎏의 환자에 대해 약 4.5×10⁶TCID₅₀/㎏)의 전체 투여량까지 CVA21을 수용하였다. 각 계획된 주입 방문에서, 가능한 경우에 다중 병변들이 필요한 경우에 초음파 유도를 이용하여 4.0㎖의 최대까지 가장 큰 병변(들)로부터 출발하여 용량 과다 분할 양상으로 주입되었다(2.0㎖의 CVA21이 ＞2.5㎝의 종양들 내로 주입, 1.0㎖의 CVA21이 1.5㎝ 내지 2.5㎝의 종양들 내로 주입; 0.5㎖의 CVA21이 0.5㎝ 내지 1.5㎝의 종양들 내로 주입). 주입된 각 종양의 길이가 측정되었고, 각 종양 내로 주입되는 tCVA21의 부피가 결정되었다. 이들 부피들의 합계는 투여를 위해 요구되는 CVA21의 전체 부피이다. 투여되는 CVA21의 최대 부피는 4.0㎖이다. CVA21로의 초기 주입에 이어서, ＜0.5㎝까지 직경이 감소되는 임의의 주입된 병변에 상기 병변이 완전히 용해될 때까지 기재된 치료 계획에 따라 0.1㎖의 CVA21이 주입되었다. 면역 관련 무진행 생존(immune-related progression-free survival: irPFS)을 나타내거나 6개월에 나아진 환자들은 9회의 추가적인 연속 주입들을 위해 적격이었다. 중요한 적격성 기준은 ≥18년의 연령, ECOG 0-1 및 적어도 1의 주입 가능한 피부의 sc 또는 ＞1.0㎝의 결절 종양이었다. 일차적인 종료점은 치료 다음의 6개월에서 irPFS로 54의 평가 가능한 환자들의 ＞9를 확립하는 것이었고, 이차적인 종료점들은 1년의 생존 및 객관적 반응 비율을 포함하였다. 2-단계의 시몬(Simon)의 최소-최대 설계가 채용되었다. 삼십오의 환자들이 이들 환자들이 단계 2로 진행되는 변경된 고형 종양들에서의 반응 평가 기준(RECIST 1.1; Eisenhauer 등의 2009)을 기준으로 평가된 3 또는 그 이상의 객관적 반응들(완전하거나 부분적인; 각기 CR 또는 PR)의 관찰을 요구하는 무용 조항(futility clause)으로 단계 1에서 치료되었다. 다른 22의 환자들이 단계 2에서 등록되었다.

상기 연구의 일차 종료점은 4.2mos의 중앙 irPFS로 6개월에서 irPFS를 나타내는 57 중의 21(38.6%)의 평가할 수 있는 환자들로 구현되었다. 전체적인 반응 비율(irRECIST)은 19.3%(57 중의 11의 환자들)의 ≥6개월의 지속성 반응 비율로 28.1%(57 중의 16의 평가 가능한 환자들)이었다. 상기 반응에 대한 중앙 시간은 2.8개월이었고, 1년의 생존율이 75.4%였다(57 중의 43의 환자들). ~16.5개월의 후속되는 중앙값 이후, 응답자들에서의 반응의 중앙 기간 및 모든 환자들에 대한 중앙의 전체적 생존(OS)은 도달되지 않았다. 가장 통상적인 부작용 보고(AE)들은 등급 1의 피로, 오한, 국부적 주입 부위 반응들 및 열이었다. 등급 3 또는 4의 생성물-관련 AE들은 관찰되지 않았다.

주입된 및 원격 주입된 병변들 모두 내의 항종양 활성은 환자들 내에서 분명하였고(도 17), 나중의 관찰은 특히 전신 면역 매개성 항종양 반응과 일치하였다. CVA21 매개의 주입되지 않은 원격 전이성 병변 활성은 잠재적인 활성의 전신 항종양 면역 반응의 발생을 나타내는 혈청 IL-8 및 g-IFN의 상승된 레벨들의 가능한 새로운 혈청 시토카인 용법과 연계되었다.

전이성 흑색종이 있는 환자들 내에서 예정사 1(PD-1) 및 CTLA-4의 차단은 종양 유도 T 세포 억제의 역전을 수반하는 메커니즘을 통해 실질적인 종양 반응들을 가져왔다. 여기서 입증되는 바와 같이, CVA21 및 PD-1 또는 CTLA-4 차단의 결합은 항종양 반응들을 향상시키며, 이에 따라 증진된 임상적 활성을 제공한다.

실험예 6: 종양 세포 유전자 발현 변화들을 유도하는 정맥내로 투여된 CVA21

Balb-C SCID 마우스들에 SK Mel 28 세포들이 좌측 옆구리 상에 이식되었다(0일). 마우스들은 꼬리 정맥 내로의 주입에 의해 CVA21 또는 식염수가 정맥 내로 투여되었다(14일). 마우스들은 치료 후에 3시간, 6시간, 24시간 및 72시간에서 희생되었고, 종양들은 절제 바이러스 및 세포 유전자 검사를 위해 절제되었다. 인터페론-g 유도 단백질 10(IP-10) 및 PD-L1의 상향조절은 CVA21로 치료된 마우스들로부터의 종양 세포들에서 관찰되었다(도 19).

세포들, 배양 조건들 및 바이러스는 대체로 실험예 1에 기재된 바와 같다. 6주-8주 연령의 암컷 SCID-BALB/c 마우스들이 ARC(퍼스, 오스트레일리아)로부터 수득되었고, 대학 동물 유지 설비 내에 SPF 조건들 하에서 수용되었다. SK-Mel-28 세포들은 10%의 FCS를 함유하는 DMEM 내에서 성장되었다. 세포들이 수확되었고, 멸균 PBS 내에서 두 번 세척되었다. 세포 생존이 세포의 생존도＞95%가 이종기관이식을 위해 요구되었기 때문에 트리판 블루 염색에 의해 평가되었다. 세포들은 멸균 PBS 내에 재현탁되었고, 생존도를 유지하도록 얼음 위에 유지되었다. 이종기관이식 이전에, 마우스들은 이소플루레인(isoflurane) 흡입(4L/분, 2%에서 유지)으로 마취되었다. 마우스들은 뒷옆구리 내로 2×10⁶개의 SK-Mel-28 세포들의 피하 주입을 받았다. 마우스들은 시각적으로 매일 모니터되었고, 3일 내지 4일마다 무게를 측정하였다. 종양 발달은 촉진에 의해 3일 내지 4일마다 모니터되었다. 종양들은 전자 캘리퍼스를 사용하여 측정되었고, 종양 부피의 산정들은 전술한 바(실험예 1)와 같다.

종양들이 촉지 가능하였을 경우(부피≒50mm³), 마우스들은 이소플루레인(4L/분, 2%에서 유지)으로 마취되었고, 눈 뒤(retro-orbital) 경로를 통해 1×10⁷TCID₅₀ CVA21 또는 멸균 PBS(전체 부피 100㎕)가 투여되었다. 두 마리는 PBS로 치료되었고 두 마리는 CVA21로 치료되었던 각 종양 모델로부터 네 마리의 마우스들이 후속하여 치료 후의 3시간, 6시간, 24시간 및 72시간에서 CO₂질식에 의해 희생되었다. 혈액은 심장천자를 통해 취해졌다. 종양들은 절제되었고, 4℃에서 RNA 안정화를 위해 RNALater(퀴아젠(QIAGEN)) 내에 저장되었다. 혈청(1:10-1:100의 출발 희석에서)은 다음과 같이 3회로 종료점 바이러스 감염성 분석을 통해 감염성 바이러스의 존재에 대해 분석되었다.

감염된 샘플들 내의 CVA21의 역가를 결정하기 위해, SK-Mel-28 세포들이 96-웰 플레이트들 내에 파종되었고, 2%의 FCS를 함유하는 DMEM 내에 50%-80%의 컨플루언시(confluency)까지 성장되었다. 세포 단일층들이 2%의 FCS를 함유하는 DMEM 내에서 3회 또는 4회 정제된 CVA21의 10-폴드 연속 희석으로 접종되었고, 5%의 CO₂환경 내의 37℃에서 72시간 동안 배양되었다. 현미경 조사에 따라 CPE를 나타내었던 웰들은 양으로 점수가 부여되었다. 오십 퍼센트의 감염 종료점 역가들이 카버법(Dougherty, 1964)을 이용하여 계산되었다. 전체 RNA는 제조업자의 계획서에 따라 RNEasy 미니 키트(Mini Kit)(퀴아젠)를 사용하여 이종이식 조직으로부터 추출되었다. 바이러스 RNA는 제조업자의 계획서에 따라 바이러스(Viral) RNA 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 혈청으로부터 추출되었다.

종양 및 혈청 샘플들로부터 추출된 RNA가 실시간 정량적 RT-PCR을 이용하여 표출된 CVA21 RNA의 레벨을 결정하도록 분석되었다. 원 스텝(one step) RT-PCR이 슈퍼스크립트(SuperScript) III 플래티넘 원-스텝(Platinum One-Step) qRT-PCR 키트(인트로겐)를 이용하여 수행되었다. 프라이머들과 프로브(probe)는 CVA21(쿠켄달(Kuykendall)) 게놈의 VP3 영역에 대해 특이적이었고, 프라이머 익스프레스(Primer Express) 1.5 소프트웨어(어를라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 포스터 시티, 캘리포니아)를 이용하여 설계되었다. 전향(forward) 프라이머(KKVP3fwd)에 대한 서열은 5'-GAGCTAAACCACCAACCAATCG-3'였고, 역향(reverse) 프라이머(KKVP3rev)는 5'-CGGTGCAACCATGGAACAA-3'였다. 사용된 FAM 표지 프로브(KKVP3)는 6FAMCACACACATCATCTGGGA-MGB이었다. 25㎕의 부피에서, 반응 혼합물은 1x 슈퍼스크립트 반응 혼합형(SuperScript reaction mix), 500nM의 전향 프라이머, 500nM의 역향 프라이머, 250nM의 프로브, 500nM의 ROX, 0.5㎕의 슈퍼스크립트 III RT/플래티넘(Platinum) Taq Mix 및 5㎕의 추출된 RNA를 포함하였다. RT-PCR 반응들은 ABI 프리즘(Prism) 7000 서열 검출 시스템(Sequence Detection System)(어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 수행되었다. 순환 조건들은 95℃에서 5분이 수반되는 60℃에서 30분이었고, 이후에 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분의 50의 순환들이었다. 샘플들은 알려진 농도의 미리 승인된 CVA21 RNA 표준들에 대해 양이 평가되었고, 결과들은 등가의 혈청 RNA에 대해 TCID₅₀/㎖ 또는 이종이식 조직 RNA에 대해 TCID₅₀/㎎로 보고되었다.

cRNA가 증식되었고, 바이오틴(biotin)-dUTP 라벨이 포함되었다. SK-Mel-28 이종 이식편들로부터 얻어진 바이오티닐화(biotinylated) cRNA 샘플들은 제조업자의 계획서에 따라 ＞22000의 전사물들을 나타내는 인간 Ref-8 v2 발현 비드 칩들(Expression BeadChips)(일루미나(Illumina))과 잡종으로 되었다. 비드칩 어레이들은 비드스테이션(BeadStation) 500 시스템(일루미나)을 이용하여 조사되었다. 마이크로어레이 데이터는 젠스프링(GeneSpring) 7.0 소프트웨어(실리콘 제네틱스(Silicon Genetics), 미국)을 이용하여 분석되었다. 데이터 세트들은 ＜0.01 내지 0.01로 측정들을 설정하고, 이후에 칩마다 50번째 백분위까지 및 유전자마다 중앙값으로 더 정규화하여 변형되었다. 각 이종이식 모델 내에서, 각 치료(PBS 및 CVA21) 및 시점(3시간, 6시간, 24시간 및 72시간)에 대해 수득된 각 쌍의 마우스들로부터의 데이터 세트들은 동형 배양된 샘플들로서 분석되었다. 유전자들은 상기 동형 배양된 샘플들의 적어도 하나 내의 양성 유전자 발현(신호 강도)에 기초하여 여과되었다.

세포내 바이러스 복제는 숙주 면역 체계 활성들의 섬세한 균형의 표적화된 파괴를 개시하는 매력적인 프로세스이다. 도 19에서, 마우스 모델 내의 인간 흑색종 이종이식편에 대한 CVA21의 전신 전달은 특히 눈 뒤의 경로를 통한 전신 투여 후의 24시간에 시작되는 상기 연구의 기간에 걸쳐 상기 종양 조직 내의 CVA21 특이적 RNA의 증가하는 레벨들에 의한 증거로서 중요한 표적화된 바이러스 복제를 유도하였다. CVA21 후의 3시간, 6시간, 24시간 및 72시간에서 유전자 발현 분석은 종양 미세 환경 내부의 인터페론 반응 유전자, 특히 인터페론 유도 단백질-10(IP-10), IFN-g에 노출된 세포들로부터 분비되는 케모카인의 중요한 상향 조절을 나타내었고, 이는 조직 염증의 부위들 내로 동원되는 활성화된 T-세포들에서 중요한 역할을 한다. 활성화된 T-세포들에 의해 제공되는 IFN-g가 면역 관문 분자들을 상향 조절하는 것으로 알려져 있기 때문에, PD-L1 유전자의 발현 레벨들이 모니터되었다. 도 19에 도시된 바와 같이, CVA21 복제는 IFN-g 활성을 포함하여 IP-10 및 PD-L1 발현의 동반되는 증가와 나란히 전신 투여 후의 24-72시간에서 피크가 된다. 흑색종 종양 조직 내에서 표적화된 CVA21 복제에 의해 유도되는 면역 교란에 기초하여, 본 발명자들은 이러한 면역을 자극하는 사건이 두 약제들이 결합되어 사용될 때에 면역관문 차단의 항종양 활성을 증가시킬 수 있는 점을 예상하였다.

참조 문헌들

Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, Weber RW, Sosman JA, Haanen JB 등의 "Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma"(N Engl J Med. 2010, Aug; 363(8):711-23).

Keir ME, Butte MJ, Freeman GJ, Sharpe AH.의 "PD-1 and its ligands in tolerance and immunity"(Annu Rev Immunol., 2008; 26:677-704).

Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQM, Hwu WJ, Topalian SL, Hwu P 등의 "Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer"(N Engl J Med. 2012 Jun; 366(26):2455-65).

Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, Gettinger SN, Smith DC, McDermott DF 등의 "Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer"(N Engl J Med. 2012 Jun; 366(26):2443-54).

Curran MA, Montalvo W, Yagita H, Allison JP.의 "PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors"(Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2010 Mar; 107(9):4275-80).

Merelli B, Massi D, Cattaneo L, Mandala M.의 "Targeting the PD1/PD-L1 axis in melanoma: biological rationale, clinical challenges and opportunities"(Crit Rev Oncol Hematol. 2014 Jan; 89(1):140-65).

Ott PA, Hodi FS, Robert C.의 "CTLA-4 and PD-1/PD-L1 blockade: new immunotherapeutic modalities with durable clinical benefit in melanoma patients"(Clin Cancer Res. 2013 Oct; 19(19):5300-9).

Shafren DR, Au GG, Nguyen T, Newcombe NG, Haley ES, Beagley L 등의 "Systemic therapy of malignant human melanoma tumors by a common cold-producing enterovirus, coxsackievirus a21"(Clin Cancer Res. 2004 Jan; 10(1 Pt 1):53-60).

Au GG, Lindberg AM, Barry RD, Shafren DR.의 "Oncolysis of vascular malignant human melanoma tumors by Coxsackievirus A21"(Int J Oncol. 2005 Jun; 26(6):1471-6).

Blanchard T, Srivastava PK, Duan F.의 "Vaccines against advanced melanoma"(Clin Dermatol. 2013; 31(2):179-90).

Garbe C, Eigentler TK, Keilholz U, Hauschild A, Kirkwood JM.의 "Systematic review of medical treatment in melanoma: current status and future prospects"(Oncologist. 2011; 16(1):5-24).

Dougherty RM.의 "Animal virus titration techniques. Techniques in experimental virology"(1964; 178).

Robert C, Thomas L, Bondarenko I, O'Day S, M D JW, Garbe C 등의 "Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma"(N Engl J Med. 2011 Jun; 364(26):2517-26).

E.A. Eisenhauera, P. Therasseb, J. Bogaertsc, L.H. Schwartzd, D. Sargente, R. Fordf, J. Danceyg, S. Arbuckh, S. Gwytheri, M. Mooneyg, L. Rubinsteing, L. Shankarg, L. Doddg, R. Kaplanj, D. Lacombec, J. Verweijk의 "New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline(version 1.1)"(European Journal of Cancer 45 (2009) 228-247).

Dougherty, R. M.의 "Animal virus titration techniques"(1964, p.169-223. In R.J.C. Harris(ed.), "Techniques in experimental virology"(Academic Press, New York.).

Claims

대상 내의 암의 치료를 위한 방법에 있어서, 상기 대상에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제(immunostimulatory agent)의 공동 투여와 결합되는 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여를 통해 종양 용해성 바이러스(oncolytic virus) 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
대상 내의 방광암의 치료를 위한 방법에 있어서, 상기 대상에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제의 공동 투여와 결합되는 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여 또는 소포 내(intravesicular) 투여를 통해 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 피코르나바이러스과(Family Picornaviridae)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 상기 종양 세포의 표면상의 세포간 접합 분자(intercellular adhesion molecule)-1(ICAM-1) 및/또는 붕괴 촉진 인자(decay-accelerating factor: DAF)에 결합되는 피코르나바이러스과 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 상기 종양 세포 표면상의 세포간 접합 분자-1(ICAM-1) 및/또는 붕괴 촉진 인자(DAF)에 결합되는 엔테로바이러스속(Genus Enterovirus)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 상기 종양 세포 표면상의 세포간 접합 분자-1(ICAM-1) 및/또는 붕괴 촉진 인자(DAF)에 결합되는 A군(Group A) 콕삭키바이러스(Coxsackievirus)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 콕삭키바이러스 A21인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 면역 자극제는 표면 표출된 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4 또는 OX-40에 특이적으로 결합하는 약제(agent)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 면역 자극제는 표면 표출된 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4 또는 OX-40에 특이적으로 결합하는 단일클론성(monoclonal) 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 직접 주입이나 전신 투여 또는 소포 내 투여를 통해 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스를 전달하는 단계는 상기 전신 경로를 통한 면역 자극제의 투여 이전인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 직접 주입이나 전신 투여 또는 소포 내 투여를 통해 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스를 전달하는 단계는 상기 대상에 대한 전신 경로를 통한 면역 자극제의 투여에 후속하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 전립선암, 유방암, 난소암, 림프암(lymphoid cancer), 백혈병, 뇌종양, 폐암, 대장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 위암, 장암, 방광암, 신장의 암종, 다발성 골수종(multiple myeloma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC), 췌장암, 교모세포종(glioblastoma) 그리고 흑색종(melanoma)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 흑색종인 것을 특징으로 하는 방법.
암이 있는 대상의 치료를 위한 약물(medicament)의 제조를 위한 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA의 용도에 있어서, 상기 약물은 상기 대상에 대한 전신 경로를 통해 전달되는 면역 자극제와 결합되는 용도를 위한 것이고, 상기 약물은 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여를 통한 전달을 위한 것을 특징으로 하는 용도.
방광암이 있는 대상의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA의 용도에 있어서, 상기 약물은 상기 대상에 대한 전신 경로를 통해 전달되는 면역 자극제와 결합되는 용도를 위한 것이고, 상기 약물은 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여 또는 소포 내 투여를 통한 전달을 위한 것을 특징으로 하는 용도.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 포유동물에 대한 전신 경로를 통한 상기 면역 자극제의 투여 이전에 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여 또는 소포 내 투여를 통한 상기 대상에 대한 투여를 위한 것을 특징으로 하는 용도.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA를 포함하는 약물은 상기 대상에 대한 전신 경로를 통한 상기 면역 자극제의 투여에 후속하여 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여 또는 소포 내 투여를 통한 상기 대상에 대한 투여를 위한 것을 특징으로 하는 용도.
암이 있는 대상의 치료용 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA로서, 사용 시에 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여를 통해 상기 대상에 투여되고, 상기 면역 자극제는 상기 대상에 대한 전신 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA.
방광암이 있는 대상의 치료용 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA로서, 면역 자극제와 결합되어 사용되고, 사용 시에 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA는 종양에 대한 직접 주입 또는 상기 대상에 대한 전신 투여 또는 소포 내 투여를 통해 상기 대상에 투여되고, 상기 면역 자극제는 상기 대상에 대한 전신 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA의 투여는 상기 면역 자극제의 투여 이전인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA의 투여는 상기 면역 자극제의 투여 이후인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 RNA.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.