KR20160127860A - Composition for anti-aging comprising methylated catechin as effective component - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to an anti-aging composition including methylated catechin as an effective component. More specifically, Me((-)- epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)-gallate) (EGCG-3Me) has an effect of inhibiting superoxide anion removal activity, and collagenase and elastase activity, defending nucleic acid damage due to ultraviolet, and inhibiting matrix metalloptroteinase-1 (MMP-1) expression and skin shrinkage network lowering, and thereby being usefully used for a composition for preventing, mitigating or curing skin aging.

Description

메틸화카테킨을 유효성분으로 함유하는 항피부노화용 조성물{Composition for anti-aging comprising methylated catechin as effective component}[0001] The present invention relates to a composition for anti-aging comprising methylated catechin as an active ingredient,

본 발명은 메틸화카테킨을 유효성분으로 함유하는 항피부노화용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 본 발명의 유효성분인 메틸화카테킨은 콜라게나아제(Collagenase) 및 엘라스타아제(Elastase) 활성을 저해하며, 특히 세포외기질(ECM, extracellular matrix)의 성분인 콜라겐(Collagen) 또는 젤라틴(Gelatin)을 분해하는 기질금속단백분해효소-1(MMP-1, matrix metalloptroteinase-1)의 단백질 발현을 저해함으로써 피부노화를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 메틸화카테킨을 유효성분으로 함유하는 항노화용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for antiaging skin containing methylated catechins as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to a methylated catechin which inhibits collagenase and elastase activity, In particular, it inhibits protein expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), which degrades collagen or gelatin, which is a component of the extracellular matrix (ECM) Of the methylated catechin as an active ingredient.

녹차 및 홍차 등과 같은 차는 전 세계적인 음료 시장에서 매우 중요한 위치를 차지하고 있을 뿐만 아니라, 강력한 항산화 및 노화억제활성을 근거로 하여 화장품으로의 개발도 진행되고 있다. 녹차에는 상대적으로 많은 양의 카테킨(Cateincin) 화합물들(EGCG, ECG, EGC 및 EC)을 포함하고 있으며 플라보노이드과(flavonoid family)의 한 계열인 플라보놀(flavonol)에 속하는 이러한 차 카테킨(tea chatechin)은 최근에 항돌연변이 활성 및 항종양형성 억제활성 등 다양한 약리적 효과가 입증되고 있다. Tea such as green tea and black tea has a very important position in the global beverage market and is being developed as a cosmetic product based on strong antioxidant and antioxidant activity. Green tea contains a relatively large amount of catechin compounds (EGCG, ECG, EGC and EC) and this tea chatechin belonging to flavonol, a family of flavonoid families, Recently, various pharmacological effects such as antimutagenic activity and anti-tumorigenic activity have been demonstrated.

카테킨 화합물 중에서 EGCG(epigallocatechin gallate), ECG(epicatechingallate), EGC(epigallocatechin), EC(epicatechin)는 저밀도 리포단백질(LDL, low-density lipoprotein)의 산화억제제로 활용되어질 수 있음이 보고되었으며, 몇몇의 카테킨 화합물은 DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl)와 같은 라디칼(radical), 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anions), 지질 자유 라디칼(lipid free radicals) 및 수산화 라디칼(hydroxyl radical)을 소거하는 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 또한, EGCG, ECG, EGC 및 EC의 4가지 카테킨의 혼합처리는 수퍼옥사이드 음이온에 대하여 시너지적인 라디칼 소거활성을 나타낸다고 보고되고 있다. 그러나 입체화학구조를 포함하여 이들 카테킨류의 화학적 구조 차이와 생리활성과의 상관관계에 대해서는 분명하지 않으며 특히, 카테킨 화합물의 안전성 및 입체장해와 작거나 큰 라디칼의 크기에 따라 서로 다르게 나타나는 소거활성 능력에 대해서는 거의 알려져 있는 바가 없다. It has been reported that EGCG (epigallocatechin gallate), ECG (epicatechin gallate), EGC (epigallocatechin) and EC (epicatechin) among catechin compounds can be used as antioxidants for low density lipoprotein (LDL) The compound exhibits activity of eliminating radicals such as DPPH (alpha, alpha-diphenyl-beta-picrylhydrazyl), superoxide anions, lipid free radicals and hydroxyl radicals . In addition, it has been reported that the mixing treatment of the four catechins of EGCG, ECG, EGC and EC shows a synergistic radical scavenging activity for the superoxide anion. However, the correlation between the chemical structure of these catechins, including the stereochemical structure, and the physiological activity is unclear, and in particular, the catechin compound safety and steric hindrance and the scavenging activity ability which varies depending on the size of small or large radicals There is little known about.

사람의 피부는 나이가 들어가면서 양적인 면에서나 질적인 면에서 상당히 많은 변화가 일어나게 된다. 이러한 자연 노화 외에도 여러 가지의 외부 환경에 의해서 자극을 받는다. 즉, 분자생물학적인 변화나 외부의 물리, 화학적 인자에 의하여 일련의 변화가 일어난다. 그 중에서도 특히 태양광선에 포함되어 있는 자외선(ultraviolet ray)에 의한 손상을 광노화(photoaging)라고 하며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 일반적으로 자외선은 그 파장에 따라 자외선 A(320~400nm), 자외선 B(280~320nm), 그리고 자외선 C(190~280nm) 등 세 가지로 나누어진다. 태양광으로부터 지표에 도달하는 자외선 중 자외선 C는 대기권의 상층부에 있는 오존층에서 흡수, 산란되어 여과되므로 자연적 광화학 반응에 별다른 영향을 미치지 않는다. 자외선 A는 일차적으로는 태양으로부터 방출되나 인공 램프 등에 의해서도 방출되며 피부의 표피와 진피층에 깊숙하게 투과한다. 따라서 자외선 A는 현재 피부에 가장 많은 영향을 주는 요소로서 주시되고 있다. 그러나 자외선 B 조사는 자외선 A보다 더 위험하다. 즉 자외선 B는 자외선 A보다 파장이 짧아서 피부 깊숙이 침투하지는 못한다고 알려져 있으나 자외선 A보다 훨씬 강한 에너지를 가지고 있어서 피부 표면에 예리한 홍반을 발생시키는 한편 피부의 광노화를 촉진시키는 파장으로 알려져 있다. 자외선에 의한 피부 손상 원인 중 하나는 자외선에 의해 형성된 활성 산소종이 세포 신호체계에 신호를 보내어 결국 피부의 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 성분인 콜라겐이나 젤라틴 등을 분해하는 효소인 MMP(matrix metalloproteinase)를 합성하게 함으로써 콜라겐이나 젤라틴을 파괴하여, 피부에 주름이 형성되게 하는 것이다. 이러한 광노화를 억제할 목적으로 지금까지 많은 기능성 화장품들이 개발되었으며 이들 중에는 비타민 A 계통의 레티놀을 사용하는 것과 비타민 C 계통의 아스코르브산을 사용하는 것이 대부분이다. 그러나 이들 두 가지 성분은 실온에서 불안정하여 화장품을 장기 보존할 경우 쉽게 분해되어 그 효능을 잃게 된다. 현재 이들 두 성분의 실활을 막기 위하여 이들 물질에 지방산을 결합시켜 변형하거나 리포좀으로 포집하는 등 다양한 방법이 동원되고 있다. 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고, 생체 단백질 총중량의 30%를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다. 콜라겐은 피부노화의 외적인 원인이 되는 자외선 노출에 의해서도 파괴되며, 자외선에 의한 변화는 자외선에 노출된 시간의 축적에 비례하는 것으로 알려져 있다. 자외선은 피부 진피층에서 탄력섬유성 물질을 축적시키고 교원섬유를 변성시켜 피부에 주름이 생기게 만들고 탄력성을 저하시킨다.As people age, there is a great deal of change both quantitatively and qualitatively. Besides this natural aging, it is stimulated by various external environments. That is, a series of changes occurs due to molecular biological changes or external physical and chemical factors. In particular, damage caused by ultraviolet rays included in sunlight is called photoaging, and research on this has been actively conducted. Generally, ultraviolet rays are classified into three types according to their wavelengths: ultraviolet ray A (320 to 400 nm), ultraviolet ray B (280 to 320 nm), and ultraviolet ray C (190 to 280 nm). Among the ultraviolet rays reaching the surface from the sunlight, ultraviolet C is absorbed and scattered in the ozone layer in the upper part of the atmosphere, so that it does not affect the natural photochemical reaction. Ultraviolet ray A is primarily emitted from the sun but is also emitted by artificial lamps and penetrates deeply into the epidermis and dermis of the skin. Therefore, ultraviolet ray A is considered to be the most influential factor for skin at present. However, ultraviolet B irradiation is more dangerous than ultraviolet A. It is known that ultraviolet ray B has a shorter wavelength than ultraviolet ray A and can not penetrate deeply into the skin. However, it has a much stronger energy than ultraviolet ray A, and is known as a wavelength that causes sharp skin erythema on the skin surface and promotes skin photoaging. One of the causes of skin damage caused by ultraviolet rays is that the active oxygen species formed by ultraviolet rays sends a signal to the cell signaling system and ultimately activates the MMP (matrix), an enzyme that decomposes collagen or gelatin, which is a component of the extracellular matrix (ECM) metalloproteinase) to break down collagen or gelatin, causing wrinkles to form on the skin. Many functional cosmetics have been developed for the purpose of suppressing such photoaging, and most of them use vitamin A-based retinol and vitamin C-based ascorbic acid. However, these two components are unstable at room temperature, and when they are preserved for a long time, they are easily decomposed and lose their efficacy. To prevent the inactivation of these two components, a variety of methods have been used, such as binding fatty acids to these substances and modifying them or collecting them with liposomes. Collagen is a major substrate protein produced in fibroblasts of the skin and exists in extracellular epilepsy. It is an important protein that occupies 30% of the total weight of bioprotein, and has a solid triple helix structure. Its main functions are mechanical rigidity of skin, resistance of connective tissues and binding force of tissues, support of cell adhesion, induction of cell division and differentiation. Collagen is also destroyed by ultraviolet exposure, which is an external cause of skin aging, and changes by ultraviolet rays are known to be proportional to the accumulation of time during exposure to ultraviolet light. Ultraviolet light accumulates elastic fibrous material in the dermal layer of the skin and denatures the collagen fibers, causing wrinkles on the skin and reducing elasticity.

한편, 최근 특별한 녹차 품종(Benihomare)로부터 제조한 홍차의 잎으로부터 분리한 EGCG-3Me((-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)-gallate)가 인간의 알러지(allergy) 반응과 질환에 중요한 역할을 하는 호염기구(basophils)와 비만세포(mast cell)에서 IgE 수용체인 Fcepsilon RI에 높은 친화성을 나타내 Fcepsilon RI의 알파 체인(alpha chain)과 감마 체인(gamma chain)의 mRNA의 발현을 감소시켜 항알러지 효과를 나타낼 수 있다고 하였으며, EGCG-3Me가 히스타민(histamine) 분비를 억제하고 IgE 수용체의 발현을 감소할 뿐만 아니라 IgE 중쇄(heavy chains)의 전사와 발현을 감소시켜 IgE의 생성을 저해하여 EGCG보다 강력한 항알러지 효과를 지닌 것을 검정하였다. 하지만 EGCG-3Me를 포함하는 녹차의 품종이 극히 제한적이고 특정한 가공과정에서 생성되지만 그 함량이 매우 적어 다양한 생리활성에 대한 검정에 대한 고찰은 매우 어려운 상황이다. EGCG-3Me ((-) - epigallocatechin-3-O- (3-O-methyl) -gallate) isolated from the leaves of black tea produced from a special green tea variety (Benihomare) In the present study, we investigated the effects of Fcepsilon RI alpha chain and gamma chain mRNA on the IgE receptor Fcepsilon RI in basophils and mast cells, EGCG-3Me inhibits the secretion of histamine and reduces the expression of IgE receptors as well as reduces the transcription and expression of IgE heavy chains, resulting in the production of IgE And it was tested to have a stronger anti-allergic effect than EGCG. However, the variety of green tea containing EGCG-3Me is extremely limited and is produced in a specific process, but its content is very small and it is very difficult to examine various bioactivity tests.

한국등록특허 제0449228호에 'EGCG 유도체와 그 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물'에 대해 개시되어 있고, 한국등록특허 제1104587호에 '항노화용 화장료 조성물'에 대해 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 메틸화카테킨을 유효성분으로 함유하는 항피부노화용 조성물에 대해서는 개시된 바가 없다.Korean Patent No. 0449228 discloses an EGCG derivative, a method for producing the EGCG derivative, and a cosmetic composition containing the EGCG derivative, and Korean Patent Registration No. 1104587 discloses an anti-aging cosmetic composition. However, as described in the present invention, there is no disclosure of a composition for antiaging skin containing methylated catechins as an active ingredient.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 메틸화카테킨을 유효성분으로 함유하는 항피부노화용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 유효성분인 메틸화카테킨(EGCG-3Me)은 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성, 콜라게나아제(Collagenase) 및 엘라스타아제(Elastase)의 활성 억제, 자외선에 대한 핵산손상 방어, 기질금속단백분해효소-1(MMP-1, matrix metalloptroteinase-1)의 발현 억제 및 피부 신축망 저하 억제 효과가 우수하여 피부노화의 예방, 개선 또는 억제에 이용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and an object of the present invention is to provide a composition for antiaging skin comprising methylated catechin as an active ingredient. The methylated catechin (EGCG-3Me), which is an active ingredient of the present invention, has a superoxide anion scavenging activity, collagenase and elastase activity inhibition, nucleic acid damage defense against ultraviolet rays, (MMP-1, matrix metalloproteinase-1) expression suppressing effect and the skin elongation and contraction inhibitory effect can be used for prevention, improvement or suppression of skin aging, the present invention has been completed .

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a health functional food composition for preventing or ameliorating skin aging comprising methylated catechin (EGCG-3Me) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 피부외용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a dermatological pharmaceutical composition for improving wrinkles containing methylated catechin (EGCG-3Me) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 메틸화카테킨(EGCG-3Me) 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition for preventing or ameliorating skin aging comprising methylated catechin (EGCG-3Me) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명은 메틸화카테킨을 유효성분으로 함유하는 항피부노화용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 메틸화카테킨(EGCG-3Me)은 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성, 콜라게나아제(Collagenase) 및 엘라스타아제(Elastase)의 활성 억제, 자외선에 대한 핵산손상 방어, 기질금속단백분해효소-1(MMP-1, matrix metalloptroteinase-1)의 발현 억제 및 피부 신축망 저하 억제 효과를 지님으로써, 피부노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 유용하게 사용할 수 있다. The present invention relates to a composition for skin aging comprising methylated catechin as an active ingredient, wherein the methylated catechin (EGCG-3Me) of the present invention has superoxide anion scavenging activity, collagenase and elastase (MMP-1, matrix metalloproteinase-1), and inhibits the skin's elasticity by inhibiting the activity of the matrix metalloproteinase-1 (Elastase) Or therapeutic compositions of the present invention.

도 1은 본 발명에 따른 EGCG-3Me의 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성을 나타낸 결과이다. A는 EGCG-3Me, EGCG, AsA(Ascorbic acid) 및 EC의 10 및 20μM 농도에 따른 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성; B는 상기 수퍼옥사이드 라디칼의 전자자기공명(ESR, Electron spin resonance) 스펙트럼; Control은 DMPO에 의한 수퍼옥사이드 라디칼이다.
도 2는 본 발명에 따른 EGCG-3Me의 콜라게나아제(Collagenase) 및 엘라스타아제(Elastase)의 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 3은 인체 진피 섬유아 세포주를 대상으로 하여 자외선을 조사하였을 때, EGCG-3Me의 핵산손상 보호효과를 나타낸 결과이다. C는 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군; 1-5는 50 mJ/cm2의 UVB를 조사한 것; 6-10은 100 mJ/cm2의 UVB를 조사한 것; 1은 50 mJ/cm2의 UVB를 조사하고 아무것도 처리하지 않은 것; 6은 100 mJ/cm2의 UVB를 조사하고 아무것도 처리하지 않은 것; 2 및 7은 250μM의 EGCG를 처리한 것; 3 및 8은 250μM의 EGCG-3Me을 처리한 것; 4 및 9는 100㎍/㎖의 AsA(Ascorbic acid)를 처리한 것; 5 및 10은 100㎍/㎖의 콜라겐 펩타이드(collagen peptide)를 처리한 것이다.
도 4는 인간 피부 섬유아 세포주에 자외선을 조사하였을 때, 기질금속단백분해효소-1(MMP-1, matrix metalloptroteinase-1)의 발현량을 나타낸 결과이다.
도 5는 인간 피부 섬유아 세포주를 대상으로 하여 EGCG-3Me을 처리하였을 때, 기질금속단백분해효소-1(MMP-1, matrix metalloptroteinase-1)의 단백질 발현 억제를 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 EGCG-3Me를 인간 피부조직에 처리하였을 때, HLE(Human leukocyte elastase)에 의한 피부 탄력섬유의 가수분해 억제를 나타낸 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군; HLE는 2㎍의 HLE 처리; HLE+EGCG 250μM은 2㎍의 HLE 및 250μM의 EGCG 처리; HLE+EGCG-3Me 250μM은 2㎍의 HLE 및 250μM의 EGCG-3Me 처리; Ep는 상피(epithelium); Ox는 옥시탈란 섬유(Oxytalan fibers); Ela는 엘라닌 섬유(elaunin fibers)이며, EF는 엘라스틱 섬유(elastic fibers); 배율(magnification)은 150배이다.FIG. 1 shows the superoxide anion scavenging activity of EGCG-3Me according to the present invention. A is a superoxide radical scavenging activity according to 10 and 20 μM concentrations of EGCG-3Me, EGCG, AsA (ascorbic acid) and EC; B is an electron spin resonance (ESR) spectrum of the superoxide radical; Control is a superoxide radical by DMPO.
FIG. 2 shows the inhibitory activity of Collagenase and Elastase of EGCG-3Me according to the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the protective effect of EGCG-3Me on nucleic acid damage when UV light was irradiated on human dermal fibroblast cells. C is a negative control without any treatment; 1-5 is 50 mJ / cm < 2 > Irradiated with UVB; 6-10 is a 100 mJ / cm < 2 > Irradiated with UVB; 1 is 50 mJ / cm < 2 > Irradiated with UVB and not treated anything; 6 is 100 mJ / cm < 2 > Irradiated with UVB and not treated anything; 2 and 7 were treated with 250 [mu] M EGCG; 3 and 8 were treated with 250 [mu] M EGCG-3Me; 4 and 9 were treated with 100 μg / ml of AsA (Ascorbic acid); 5 and 10 were treated with 100 μg / ml of collagen peptide.
FIG. 4 shows the expression levels of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) when human skin fibroblast cells were irradiated with ultraviolet light.
FIG. 5 shows the results of inhibition of protein expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) when EGCG-3Me was treated with human dermal fibroblast cells.
FIG. 6 is a graph showing inhibition of hydrolysis of skin elastic fibers by HLE (human leukocyte elastase) when EGCG-3Me of the present invention is treated on human skin tissue. Control is a negative control without any treatment; HLE treated with 2 ug of HLE; HLE + EGCG 250 [mu] M treated with 2 [mu] g HLE and 250 [mu] M EGCG; HLE + EGCG-3Me 250 μM treated with 2 μg HLE and 250 μM EGCG-3 Me; Ep is epithelium; Ox is oxtalan fibers; Ela is elaunin fibers, EF is elastic fibers; The magnification is 150 times.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메틸화카테킨 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a health functional food composition for preventing or ameliorating skin aging comprising methylated catechin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

피부노화는 주름, 기미, 주근깨 등의 생성과 탄력 감소 현상을 의미하는데, 나이의 증가에 의한 노화와 자외선에 의한 광노화가 주요원인이 된다. 나이가 증가하면 섬유아세포의 수가 감소하고 그 작용이 저하되어 섬유성분(콜라겐, 엘라스틴)의 합성량이 줄어들고, 피부 세포 내 수분이 손실되면서 각질층의 구조가 변화된다. 또한 콜라게나아제의 작용이 증가하여, 콜라겐의 가교된 형태가 증가함으로써 피부의 매끄러움이나 팽팽함이 떨어지게 된다. 한편 피부가 자외선 등에 노출되면 체내에서 산소의 불완전 대사가 발생하고 그 결과 활성산소(oxygen free radical)가 생성된다. 활성산소는 피부 세포 및 조직의 손상, 진피의 구성성분 감소, 멜라닌 생성 증가, 표피의 각질화 등을 유발한다. 그 결과 체내에 활성산소가 많아지면, 피부에 주름이 생기고 탄력성이 감소되며 색소가 침착된다. 따라서 피부노화를 억제시켜 아름답고 건강한 피부를 유지하기 위해서는 콜라겐과 엘라스틴을 분해하는 콜라게나아제와 엘라스타아제의 활성을 억제시켜야 한다. 또한, 자외선이나 피부대사에 의해 생성되는 활성산소를 제거하여, 활성산소에 의하여 피부가 노화되는 것을 방지하여야 한다.Skin aging means generation of wrinkles, spots, and freckles, and reduction of elasticity, which are mainly caused by aging due to aging and photoaging due to ultraviolet rays. As the age increases, the number of fibroblasts decreases, the action decreases, the amount of fiber components (collagen, elastin) decreases, and the structure of the stratum corneum changes as the moisture in skin cells is lost. Also, the action of collagenase is increased, and the cross-linked form of collagen is increased, so that the smoothness and tightness of the skin are lowered. On the other hand, when the skin is exposed to ultraviolet rays, etc., incomplete metabolism of oxygen occurs in the body and oxygen free radical is produced. Active oxygen causes damage to skin cells and tissues, diminished constituents of the dermis, increased production of melanin, and keratinization of the epidermis. As a result, when the amount of active oxygen in the body increases, the skin becomes wrinkled, the elasticity is reduced, and the pigment is deposited. Therefore, in order to suppress skin aging and maintain a beautiful and healthy skin, collagenase and elastase, which degrade collagen and elastin, should be inhibited. In addition, it is necessary to remove active oxygen generated by ultraviolet rays or skin metabolism to prevent aging of skin by active oxygen.

본 발명의 상기 메틸화카테킨은 EGCG-3Me((-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)-gallate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The methylated catechin of the present invention may be, but is not limited to, EGCG-3Me ((-) - epigallocatechin-3-0- (3-O-methyl) -galate).

본 발명의 상기 메틸화카테킨은 녹차의 잎으로부터 분리하는 것이 바람직하지만, 이에 제한되지 않는다. The methylated catechins of the present invention are preferably separated from leaves of green tea, but are not limited thereto.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성을 가지거나, 콜라게나아제(collagenase) 및 엘라스타아제(elastase)의 활성을 억제하거나, 자외선에 의해 유도된 기질 금속단백분해효소-1(matrix metalloproteinase-1; MMP-1)의 단백질 발현을 억제함으로써 젤라틴의 분해를 저해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The health functional food composition according to the present invention has superoxide anion scavenging activity, inhibits the activity of collagenase and elastase, inhibits ultraviolet-induced substrate metal protein degradation The inhibition of protein expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) may inhibit the degradation of gelatin, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 상기 메틸화카테킨 이외에 갈릭산(gallic acid; GA), 갈로카테킨(gallocatechin; GC), 에피갈로카테킨(epigallocatechin; EGC), 카테킨(catechin; C), 에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG), 에피카테킨(epicatechin; EC), 갈로카테킨갈레이트(gallocatechin gallate; GCG) 및 에피카테킨갈레이트(epicatechingallate; ECG) 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The health functional food composition according to the present invention may further comprise at least one selected from the group consisting of gallic acid (GA), gallocatechin (GC), epigallocatechin (EGC), catechin (C) But are not limited to, one or more of epigallocatechin gallate (EGCG), epicatechin (EC), gallocatechin gallate (GCG) and epicatechin gallate (ECG) Do not.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The health functional food composition according to the present invention may be prepared in any form of powder, granule, ring, tablet, capsule, candy, syrup and beverage, but is not limited thereto.

상기 건강기능식품 조성물은 피부노화를 예방 또는 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. The health functional food composition is not particularly limited as long as it can be ingested to prevent or improve skin aging.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분은 그의 사용 목적(예방, 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.When the health functional food composition of the present invention is used as a food additive, the health functional food composition may be added as it is, or may be used together with other food or food ingredients, and suitably used according to a conventional method. The active ingredient can be suitably used in accordance with its intended use (prevention, improvement). Generally, the health functional food composition of the present invention is added in an amount of not more than 15 parts by weight, preferably not more than 10 parts by weight based on the raw material, when the food or beverage is produced. However, in the case of long-term intake for the purpose of controlling health, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount exceeding the above range.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the kind of the health functional food. Examples of the foods to which the health functional food composition can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen and other noodles, gums, ice cream, soups, Drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include health foods in a conventional sense.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등),디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등), 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.In addition, the health functional food composition of the present invention can be produced as a food, particularly a functional food. The functional food of the present invention includes components that are ordinarily added in food production, and includes, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, and seasonings. For example, in the case of a drink, a natural carbohydrate or a flavoring agent may be included as an additional ingredient in addition to the active ingredient. The natural carbohydrate may be selected from the group consisting of monosaccharides (e.g., glucose, fructose, etc.), disaccharides (e.g., maltose, sucrose, etc.), oligosaccharides, polysaccharides (e.g., dextrin, cyclodextrin, For example, xylitol, sorbitol, erythritol, etc.). The flavoring agent may be a natural flavoring agent (e.g., tau Martin, stevia extract, etc.) and a synthetic flavoring agent (e.g., saccharin, aspartame, etc.).

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the above health functional food composition, it is also possible to use various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acids and salts thereof, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, A carbonating agent used in beverages, and the like. Although the ratio of the above-mentioned ingredients is not critical, it is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 part by weight based on 100 parts by weight of the health functional food composition of the present invention.

또한, 본 발명은 메틸화카테킨 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 피부외용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a dermatological pharmaceutical composition for improving wrinkles containing methylated catechin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다. 산 부가염 이외에도, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민, 3차-부틸아민과 같은 염기 부가염도 사용될 수 있다.The salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable so long as it is pharmaceutically acceptable and includes, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid, formic acid acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, , Benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, and naphthalenesulfonic acid. In addition to acid addition salts, additional base salts such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethylamine, tertiary-butylamine may also be used.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient. Such a carrier is usually used at the time of formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, Calcium carbonate, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and minerals Oils, and the like, but are not limited thereto. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc., in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. A suitable dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be variously prescribed by factors such as the formulation method, the administration method, the age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and responsiveness of the patient .

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally. In the case of parenteral administration, the composition may be administered topically to the skin, intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, or transdermally.

본 발명의 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.The concentration of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention can be determined in consideration of the purpose of treatment, the condition of the patient, the period of time required, etc., and is not limited to a specific range of concentration.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in a unit dosage form by formulating it with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient according to a method which can be easily carried out by a person skilled in the art to which the present invention belongs Into a capacity container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

또한, 본 발명은 메틸화카테킨 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition for preventing or improving skin aging comprising methylated catechin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명의 일 구현에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 피부외용 연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.In the cosmetic composition according to one embodiment of the present invention, the cosmetic composition for preventing or improving skin aging may be at least one selected from the group consisting of ointment for external use, cream, softening longevity, nutritional lotion, pack, essence, hair tonic, shampoo, conditioner, hair conditioner, Lotion, milk lotion, moisturizing lotion, nutrition lotion, massage cream, nutritional cream, moisturizing cream, hand cream, foundation, nutrition essence, sunscreen, soap, cleansing foam, lotion, gel, skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, , A cleansing lotion, a cleansing cream, a body lotion and a body cleanser, but the present invention is not limited thereto. The cosmetic composition comprising each of these formulations may contain various bases and additives necessary for formulation of the formulation, and the kinds and amounts of these ingredients can be easily selected by those skilled in the art.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부노화 방지 활성 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 피부노화 방지 활성 성분으로는 코지산 및 이의 유도체, 알부틴, 아스코르브산 및 이의 유도체, 하이드로퀴논 및 이의 유도체, 레조르시놀, 사이클로알카논, 메틸렌디옥시페닐 알칸올, 2,7-디니트로인다졸 또는 덩굴귤 추출물, 쌀 추출물, 감초 추출물과 같은 식물 추출물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The cosmetic composition of the present invention may contain, in addition to the active ingredient, at least one skin aging-preventing active ingredient exhibiting the same or similar functions. Examples of active ingredients for skin aging prevention include kojic acid and derivatives thereof, arbutin, ascorbic acid and derivatives thereof, hydroquinone and derivatives thereof, resorcinol, cycloalkanone, methylenedioxyphenylalkanol, 2,7-dinitroindazole Or plant extracts such as Vinegar mandarin extract, rice extract, licorice extract, and the like, but are not limited thereto.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a paste, a cream or a gel, an animal fiber, a plant fiber, a wax, a paraffin, a starch, a tragacanth, a cellulose derivative, a polyethylene glycol, a silicone, a bentonite, Etc. may be used.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component. Especially, in the case of a spray, Propellants such as carbon, propane-butane or dimethyl ether.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a solution or an emulsion, a solvent, a solvent or an emulsifier is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, Glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspension such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the cosmetic composition of the present invention is an interfacial active agent-containing cleansing, it is preferable to use, as carrier components, aliphatic alcohol sulfates, aliphatic alcohol ether sulfates, sulfosuccinic acid monoesters, isethionates, imidazolinium derivatives, methyltaurate, sarcosinate , Fatty acid amide ether sulfate, alkylamidobetaine, aliphatic alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, linolenic derivative or ethoxylated glycerol fatty acid ester.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
The formulation of the cosmetic composition of the present invention may further comprise an excipient including a fluorescent substance, a fungicide, a hygroscopic substance, a humidifier, a fragrance, a fragrance carrier, a protein, a solubilizing agent, a sugar derivative, a sunscreen, a vitamin, can do.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1. One. 메틸화카테킨(EGCG-3Me)의Of methylated catechin (EGCG-3Me) 수퍼옥사이드 음이온( Superoxide anion ( SuperoxideSuperoxide Anion) 소거활성  Anion) Scavenging activity

잔틴(xanthine)과 잔틴산화효소(xanthine oxidase)의 반응에 의해 발생한 수퍼옥사이드 음이온과 이들과 급속하게 반응하는 니트론 스핀 트랩(nitrone spin trap)인 DMPO(5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide)를 이용하여 녹차로부터 분리된 메틸화카테킨(EGCG-3Me)의 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성을 측정하였다. 즉, 0.1M 인산 완충액(phosphate buffer, pH 7.4) 120㎕에 EGCG-3Me과 동일한 농도(10 및 20μM)의 아스코르브산(AsA, ascorbic acid) 및 베타-카로틴(β-carotene)을 각각 20㎕, 3M DMPO 20㎕, 10mM 잔틴(xanthine) 20㎕ 및 0.25U 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 20㎕를 첨가하여 혼합하여 총 부피(volume)가 200㎕가 되게 한 다음 실온에서 2.5분 방치하고, 석영 모세관 튜브(quartz capillary tube)에 옮겨 전자자기공명분광기(JES-FA Electron Spin Resonance spectrometer, JEOL, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 대조구(blank)는 EGCG-3Me 대신에 아세톤(acetone) 20㎕를 첨가하여 사용하였으며, 전자자기공명(ESR)의 자기장(magnetic field)은 336.5mT, 파워(power)는 20mW, 주파수(frequency)는 9.8 GHz, 진폭변조(modulation amplitude)는 1.0gauss, 이득(gain)은 200, 스캔시간(scan time)은 0.5min으로 조정하였고 스캔폭(scan width)은 10mT로 하였고 시상수(time constant)는 0.03sec, 온도는 25℃로 고정하여 측정하였다. EGCG-3Me에 대한 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion)의 소거활성 계산은 처리구와 대조구의 신호강도(signal intensity)에 대한 평균 높이의 차이를 이용하여 측정하였다.The superoxide anion generated by the reaction of xanthine and xanthine oxidase and the nitrone spin trap DMPO (5,5-dimethyl-1-pyrroline-N -oxide), the superoxide anion scavenging activity of methylated catechin (EGCG-3Me) isolated from green tea was measured. That is, 20 μl each of ascorbic acid (AsA, ascorbic acid) and β-carotene (concentration of 10 and 20 μM) identical to EGCG-3Me were added to 120 μl of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) 20 μl of 3M DMPO, 20 μl of 10 mM xanthine and 20 μl of 0.25 U xanthine oxidase were added and mixed to make the total volume 200 μl. The mixture was allowed to stand at room temperature for 2.5 minutes and quartz capillary tube (JES-FA Electron Spin Resonance Spectrometer, JEOL, Tokyo, Japan). The control blank was prepared by adding 20 μl of acetone instead of EGCG-3Me. The magnetic field of ESR was 336.5 mT, the power was 20 mW, the frequency was The modulation amplitude was 1.0 gauss, the gain was 200, the scan time was 0.5 min, the scan width was 10 mT, and the time constant was 0.03 sec. , And the temperature was fixed at 25 캜. The scavenging activity of superoxide anion for EGCG-3Me was calculated using the difference in average height of the signal intensities between the treatment and the control.

수퍼옥사이드 음이온의 소거활성=[(Ablank-Asample)/Ablank]×100%[(A blank- A sample ) / A blank ] × 100%

EGCG-3Me의 수퍼옥사이드 음이온 소거활성을 전자자기공명분광기(ESR spectrometer)를 통하여 측정하고 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG, epigallocatechin gallate), 에피카테킨(EC, epicatechin) 및 아스코르브산((AsA, ascorbic acid)과 비교하여 본 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성은 EGCG-3Me가 양성대조군인 아스코르브산보다 더 우수한 수퍼옥사이드 음이온 소거활성을 보였다. 아스코르브산의 경우, 20μM의 농도에서 21.2%의 소거활성을 보인 반면, EGCG-3Me는 10μM에서 54.8%, 20μM에서 76.3%의 소거활성을 보였다. 이러한 결과를 통하여 EGCG-3Me가 항산화제를 처리하지 않아도 발생된 DMPO-OOH(5,5-dimethylpyrroline-N-oxide) 신호(signal)을 강력히 소거할 수 있음을 알 수 있으며, 몰(Mol)수로 계산해보면 DMPO가 수퍼옥사이드 음이온과 반응하는 비율보다 EGCG-3Me가 수퍼옥사이드 음이온과 반응하는 비율이 약 10,000배 이상 높음을 예상할 수 있었다. The superoxide anion scavenging activity of EGCG-3Me was measured by using an ESR spectrometer, and EGCG, epigallocatechin gallate, epicatechin and ascorbic acid (AsA, ascorbic acid ), The superoxide anion scavenging activity of EGCG-3Me showed better superoxide anion scavenging activity than that of ascorbic acid as a positive control, as shown in Figure 1. In the case of ascorbic acid, (EGCG-3Me) showed an elimination activity of 21.2%, whereas 54.8% of EGCG-3Me showed an elimination activity of 76.3% at 20 μM, indicating that EGCG-3Me inhibited DMPO-OOH 5,5-dimethylpyrroline-N-oxide signal can be strongly erased. When the number of mols is calculated, the ratio of the DMPO to the superoxide anion is higher than that of EGCG-3M e could react with superoxide anion more than 10,000 times.

EGCG-3Me 및 EGCG의 수퍼옥사이드 음이온 소거활성 차이는 크지 않고 둘다 높은 수준을 보인 반면, EC의 경우 20μM의 농도에서 24.6%의 낮은 소거활성을 보였다. EGCG-3Me 및 EGCG가 높은 수퍼옥사이드 음이온 소거활성을 보인 것은 그들이 공통적으로 가지고 있는 갈레이트 그룹(gallate group)과 B 링(ring)에 가지고 있는 오르소-트리하이드록시(ortho-trihydroxy)에 기인하는 것으로 판단되며, 이러한 결과는 EC와 같은 비-갈로이레이티드 카테킨(non-galloylated catechin)보다 EGCG 또는 EGCG-3Me와 같이 갈레이트 그룹을 가지고 있는 카테킨이 오르소-디하이드록시 그룹(ortho-dihydroxy group)을 가지고 있는 EC 또는 (+)-C보다 오르소-트리하이드록시 그룹(ortho-trihydroxy group)을 가지고 있는 EGC(epigallocatechin) 또는 GC(gallocatechin)가 더 높은 수퍼옥사이드 음이온 소거활성을 나타낸다는 결과와 유사하게 나타났다.
The difference in superoxide anion scavenging activity of EGCG-3Me and EGCG was not high but both were high, whereas EC showed a low scavenging activity of 24.6% at a concentration of 20 μM. EGCG-3Me and EGCG exhibit high superoxide anion scavenging activity because they share common gallate groups and ortho-trihydroxy residues in the B ring These results indicate that the catechin having a gallate group such as EGCG or EGCG-3Me is more ortho-dihydroxy group than non-galloylated catechin such as EC. (EGC) or GC (gallocatechin) with an ortho-trihydroxy group than EC or (+) - C with higher superoxide anion scavenging activity Respectively.

실시예Example 2.  2. 메틸화카테킨(EGCG-3Me)의Of methylated catechin (EGCG-3Me) 콜라게나아제Collagenase (( collagenasecollagenase ) 및 엘라스타아제() And elastase ( elastaseelastase ) 활성 억제) Active inhibition

녹차로부터 분리된 EGCG-3Me의 피부노화에 대한 억제활성을 확인하기 위하여 콜라게나아제(collagenase) 및 엘라스타아제(elastase) 억제활성을 측정하였다. 콜라게나아제 억제활성은 Van Wart 및 Steinbrink(Van Wart HE, Steinbrink DR: A continuous spectrophotometric assay for Clostridium histolyticum collagenase. Anal Biochem 1981, 113:356-365.)에 의한 방법을 변형하여 사용하였고, 엘라스타아제 억제활성은 Kim 등(Kim Y, Uyama H, Kobayashi S: Inhibition effects of (+)-catechinaldehyde polycondensates on proteinases causing proteolytic degradation of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun 2004, 320:256-261.)에 의한 방법을 사용하여 측정하였다. 콜라게나아제 억제활성은 클로스트리디움 히스톨리티컴(Clostridium histolyticum, ChC, EC.3.4.23.3)으로부터 얻은 콜라게나아제(0.8 units/㎖)를 50 mM 트리신 버퍼(Tricine buffer, pH 7.5의 400mM NaCl 및 10mM CaCl2)에 용해하고 기질인 FALGPA(N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala)를 트리신 버퍼에 2mM이 되도록 용해하였다. EGCG-3Me를 효소가 첨가된 버퍼에 첨가하여 기질과 반응시키기 전 15분 동안 배양하였으며, 기질을 첨가하여 최종 반응혼합물은 150㎕로 하였고 트리신 버퍼에 0.8mM FALGPA, 0.1 units 콜라게나아제 및 시료인 EGCG-3Me를 250μM(0.114mg/mL)수준으로 첨가하여 반응시켰다. 음성대조군으로 물을 사용하였으며 기질을 넣은 후 20분 후에 효소면역측정법 플레이트 리더(enzyme-linked immunosorbent assay plate reader)를 이용하여 335nm에서 흡광도를 측정하였다. 다음으로, 엘라스타아제 억제활성은 PE(Porcine pancreatic elastase, E.C.3.4.21.36)가 3.33mg/mL의 농도가 되도록 멸균된 물에 용해하여 원액(stock solution)을 만들고 기질인 AAAPVN(N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide)를 0.2mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)에 용해하여 1.6mM이 되도록 제조하였다. EGCG-3Me 및 EGCG를 효소가 첨가된 버퍼에 첨가하여 기질과 반응시키기 전 15분 동안 배양하였으며 기질을 첨가하여 최종 반응혼합물은 250㎕로 하였고 Tris-HCl 버퍼에 0.8mM AAAPVN, 1μg/mL PE 및 시료인 EGCG와 EGCG-3Me를 250μM(0.114 mg/mL) 수준으로 첨가하여 반응시켰다. 음성대조군으로 물을 사용하였으며 기질을 넣은 후 20분 후에 효소면역측정법 플레이트 리더(enzyme-linked immunosorbent assay plate reader)를 이용하여 335nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 효소에 대한 억제율은 다음과 같이 계산하여 산정하였다. Collagenase and elastase inhibitory activity was measured in order to confirm the inhibitory activity of EGCG-3Me isolated from green tea against skin aging. The collagenase inhibitory activity was modified by Van Wart and Steinbrink (Van Wart HE, Steinbrink DR: A continuous spectrophotometric assay for Clostridium histolyticum collagenase. Anal Biochem 1981, 113: 356-365) The inhibitory activity was determined by the method of Kim et al. (Kim Y, Uyama H, Kobayashi S: Inhibition effects of (+) - catechinaldehyde polycondensates on proteinases causing proteolytic degradation of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun 2004, 320: 256-261. Lt; / RTI > Collagenase inhibitory activity Clostridium Heath toll utility compartment (Clostridium histolyticum , (0.8 units / ml) was dissolved in 50 mM tris buffer (400 mM NaCl and 10 mM CaCl 2 , pH 7.5) and the substrate FALGPA ( N - [3 - (2-furyl) acryloyl] -Leu-Gly-Pro-Ala) was dissolved in tricrin buffer to 2 mM. EGCG-3Me was added to the buffer containing the enzyme and incubated for 15 min before the reaction with the substrate. The substrate was added to the final reaction mixture to make 150 μl. 0.8 mM FALGPA, 0.1 unit collagenase and sample (EGCG-3Me) at a concentration of 250 μM (0.114 mg / mL). As a negative control, water was used. After incubation for 20 minutes, the absorbance was measured at 335 nm using an enzyme-linked immunosorbent assay plate reader. Next, the elastase inhibitory activity was determined by dissolving PE (Porcine pancreatic elastase, EC 3.4.21.36) at a concentration of 3.33 mg / mL in sterilized water to prepare a stock solution, and measuring the substrate AAAPVN (N-Succinyl -Ala-Ala-Ala- p- nitroanilide) was dissolved in 0.2 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to prepare 1.6 mM. EGCG-3Me and EGCG were added to the enzyme-containing buffer and incubated for 15 min before reaction with the substrate. Substrate was added to the final reaction mixture to make 250 μl. Tris-HCl buffer was added to 0.8 mM AAAPVN, 1 μg / EGCG and EGCG-3Me were added at a concentration of 250 μM (0.114 mg / mL) and reacted. As a negative control, water was used. After incubation for 20 minutes, the absorbance was measured at 335 nm using an enzyme-linked immunosorbent assay plate reader. The inhibition rate for each enzyme was calculated as follows.

효소 억제활성(Enzyme inhibition activity) (%)=[(ODCONTROL - ODSAMPLE) /ODCONTROL]×100Enzyme inhibition activity (%) = [(OD CONTROL - OD SAMPLE ) / OD CONTROL ] x 100

EGCG-3Me 및 EGCG의 콜라게나아제 및 엘라스타아제 억제활성에 대해 비교한 결과를 도 2에 개시하였다. 250μM의 동일한 농도를 적용한 경우, EGCG가 32.6%의 콜라게나아제 억제활성을 보인 반면, EGCG-3Me는 58.9%의 더 우수한 효소 억제활성을 보였다. 또한, 엘라스타아제의 경우에서도 EGCG가 74.1%의 효소 억제율을 보인 반면, EGCG-3Me는 95.8%의 효소 억제율을 나타내어 EGCG-3Me가 강력한 엘라스타아제 억제활성을 보였으며 이러한 활성이 EGCG보다 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 EGCG와 같은 녹차로부터 분리된 카테킨들이 효과적인 프로테아제 억제재로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 그 중에서도 특히, EGCG-3Me는 EGCG보다 더 우수한 항-콜라게나아제 및 항-엘라스타아제 활성을 나타내어 항-피부노화에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 콜라게나아제가 아연(zinc)을 포함하고 있는 금속단백분해효소(metalloprotease)이고 EGCG가 금속이온(metal ion)의 킬레이트(chelate)로 작용하여 효소보다 더 쉽게 Zn2 +와 반응함으로써 효소가 기질과 반응하는 것을 억제하는 항-콜라게나아제 작용기전을 가지고 있다는 보고에 근거하여 볼 때(Kim Y, Uyama H, Kobayashi S: Inhibition effects of (+)-catechinaldehyde polycondensates on proteinases causing proteolytic degradation of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun 2004, 320:256-261.), EGCG-3Me는 EGCG보다 더 효율적인 금속이온의 킬레이트(chelate)로 작용할 가능성이 높으며, Zn2 +과 직접적으로 결합함으로써 더 높은 항-콜라게나아제 활성을 나타낼 수 있는 것으로 사료된다.
The results of comparison of collagenase and elastase inhibitory activity of EGCG-3Me and EGCG are shown in Fig. When the same concentration of 250 μM was applied, EGCG showed a collagenase inhibitory activity of 32.6%, while EGCG-3Me showed a better enzyme inhibitory activity of 58.9%. EGCG showed an enzyme inhibition rate of 74.1%, whereas EGCG-3Me showed an enzyme inhibitory activity of 95.8%, indicating that EGCG-3Me showed a strong inhibitory activity against EGCG and EGCG I could confirm. These results suggest that catechins isolated from green tea such as EGCG can be used as an effective protease inhibitor, and in particular, EGCG-3Me exhibits anti-collagenase and anti-elastase activity superior to EGCG, It can be effectively used for skin aging. In addition, collagenase is a metalloprotease that contains zinc and EGCG acts as a chelate of metal ion, which reacts more easily with Zn 2 + than enzyme, Based on the report that it has an anti-collagenase action mechanism that inhibits the reaction with the substrate (Kim Y, Uyama H, Kobayashi S: Inhibition effects of (+) - catechinaldehyde polycondensates on proteinases causing proteolytic degradation of extracellular matrix EGCG-3Me is more likely to act as a chelate of a more efficient metal ion than EGCG, and binds directly to Zn 2+ , resulting in higher anti-collagen < RTI ID = 0.0 & gt ; It is considered to be able to show the activity of the enzyme.

실시예Example 3.  3. 메틸화카테킨(EGCG-3Me)의Of methylated catechin (EGCG-3Me) 자외선에 대한 핵산손상 방어 효과 Nucleic acid damage protection effect against ultraviolet rays

일반적으로 자외선에 노출되면 비타민 C와 E를 파괴하고 지질 과산화를 일으켜 산화적 스트레스를 유도하여 핵산을 손상시키고 피부노화 및 피부질환을 유발시킬 뿐 아니라, 기질금속단백분해효소(MMPs, matrix metalloptroteinases)의 활성이 증가되어 진피층의 세포외 기질의 콜라겐과 다른 단백질을 붕괴시키고 그에 따른 회복은 불완전하게 이루어짐으로 인하여 광노화가 진행되는 것으로 알려져 있다. 피부 세포가 자외선에 노출되었을 때의 영향과 EGCG-3Me의 처리에 따른 핵산손상 방어효과를 알아보기 위하여 단일가닥 절단(single strand break)을 측정하였으며, 항산화제인 아스코르브산(ascorbic acid)과 광노화에 효과적인 방어제인 콜라겐 펩타이드 HACP(AGCP-U2, Jellice Co. Sendai, Japan)를 처리한 시료와 비교하였다. In general, exposure to ultraviolet light destroys vitamins C and E, induces lipid peroxidation, induces oxidative stress, damaging nucleic acids, causing skin aging and skin diseases, and inhibiting matrix metalloproteinases (MMPs) It is known that photoactivation is progressed due to an increase in activity and disruption of collagen and other proteins in the extracellular matrix of the dermis and resulting in incomplete recovery. To investigate the effect of skin cell exposure to ultraviolet light and the effect of EGCG-3Me treatment on nucleic acid damage, single strand breaks were measured, and ascorbic acid, an antioxidant, (AGCP-U2, Jellice Co., Sendai, Japan), a collagen peptide, HACP.

인체진피 섬유아 세포주인 HS68(ATCC CRL 1635) 세포를 사용하였으며 배지는 10%의 FBS(fetal bovine serum), 페니실린(100 unit/㎖) 및 스트렙토마이신(100 unit/㎖)이 첨가된 DMEM(dubecco's modified Eagle's medium)을 이용하여 37℃에서 5% CO2 조건하에서 배양시키면서 유지하였다. HS68 세포주를 1×106 세포/웰의 농도로 100mm의 배양접시에 배양하여 약 80%의 컨플루언시(confluency)에 도달하였을 때 PBS(Phosphate-buffered saline)로 세척하여 배지 내의 혈청(serum) 성분을 제거하였으며, 새로운 무혈청(serum free) DMEM에 EGCG-3Me를 250μM의 농도로 처리하고 37℃에서 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝나면 PBS로 다시 세척하고 세포가 PBS에 잠긴 상태에서 50 및 100mJ/cm2의 용량으로 UVB(285-350nm peak at 310-315nm)를 조사한 후 24시간 더 배양하였다. 음성 대조군으로 UVB를 조사시키지 않고 형광등 아래에 동일한 시간을 방치하였다. 처리되어진 세포주로부터 DNA를 분리하기 위하여 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 회수한 후 PBS로 2회 세척하고 원심분리를 통해 모은 후 페놀-클로로폼 추출(phenol-chloroform extraction) 방법에 의해 DNA를 분리하여 에탄올로 침전시킨 후 DNA 펠릿(pellet)을 모아 TE(termination environment) 버퍼를 녹여 시료로 사용하였다. 소량의 시료를 취하여 RNAase를 처리하고 1% 아가로스 겔(agarose gel)을 통해 전기영동을 실시하였고 에티디움브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 DNA 손상 정도를 확인하였다. HS68 (ATCC CRL 1635) cells were used as the human dermal fibroblast cell line. The medium was DMEM (dubecco's) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum), penicillin (100 unit / ml) and streptomycin modified Eagle's medium) at 37 ° C under 5% CO 2 . HS68 cell line was cultured in a 100 mm culture dish at a concentration of 1 × 10 6 cells / well and when it reached about 80% confluency, it was washed with phosphate-buffered saline (PBS) ), And EGCG-3Me was treated with 250 μM of fresh serum-free DMEM for 24 hours at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. After the incubation, the cells were washed again with PBS, and the cells were irradiated with UVB (285-350 nm peak at 310-315 nm) at a dose of 50 and 100 mJ / cm 2 while being immersed in PBS, followed by further culture for 24 hours. The same time was left under a fluorescent lamp without UVB irradiation as a negative control. To remove DNA from the treated cell line, trypsin-EDTA was added to recover the cells. The cells were washed twice with PBS, collected by centrifugation, and then separated by phenol-chloroform extraction After precipitating with ethanol, DNA pellets were collected and dissolved in a TE (termination environment) buffer to be used as a sample. A small amount of sample was taken, treated with RNAase, electrophoresed through 1% agarose gel, and stained with ethidium bromide to confirm DNA damage.

UVB 조사에 따른 인체 진피 섬유아 세포주를 대상으로 하여 핵산 손상에 대한 EGCG-3Me의 방어 효과를 비교 검정하여 본 결과, 도 3에서 개시한 바와 같이 50 및 100mJ/cm2의 용량으로 UVB를 처리한 경우 레인(lane) 1과 레인 6에서 보는 바와 같이 핵산 손상이 유도됨을 확인할 수 있었으며, EGCG-3Me 처리에 의해 UVB의 조사에 의한 핵산 손상이 보호됨을 알 수 있었다. EGCG-3Me 및 EGCG를 비교하여 보면, 50mJ/cm2의 용량에서 레인 2(EGCG)보다 레인 3(EGCG-3Me)에서 핵산 손상에 대한 방어효과가 더 우수한 것이 관찰되었다. 이러한 경향은 100mJ/cm2 용량에서도 유사하게 관찰되었으며, EGCG-3Me이 콜라겐 펩타이드 및 아스코르브산을 100㎍/㎖로 처리하는 것과 유사하게 손상보호 효과가 있음을 확인하였다.
As a result of comparing the protective effects of EGCG-3Me against nucleic acid damage, UVB-treated human dermal fibroblast cells were treated with UVB at a dose of 50 and 100 mJ / cm 2 as described in FIG. 3 As shown in lane 1 and lane 6, it was confirmed that the nucleic acid damage was induced, and the nucleic acid damage by irradiation with UVB was protected by EGCG-3Me treatment. Comparing EGCG-3Me and EGCG, it was observed that lane 3 (EGCG-3Me) had better protection against nucleic acid damage than lane 2 (EGCG) at a dose of 50 mJ / cm 2 . This tendency was observed at 100 mJ / cm < 2 > , And it was confirmed that EGCG-3Me has a damage-protecting effect similar to treatment with 100 μg / ml of collagen peptide and ascorbic acid.

실시예Example 4.  4. 메틸화카테킨(EGCG-3Me)의Of methylated catechin (EGCG-3Me) 기질금속단백분해효소( Substrate metalloproteinases ( matrixmatrix metalloproteinase-1)의 단백질 발현 및 젤라틴분해 활성( protein expression and gelatinolytic activity of metalloproteinase-1 gelatinolyticgelatinolytic activityactivity ) 억제 효과 ) Inhibitory effect

EGCG-3Me을 처리하고 UVB(Ultraviolet B)를 조사한 인체 진피 섬유아 세포를 초음파분쇄기(sonicator)로 파쇄한 이후 원심분리를 통해 얻어진 상층액을 대상으로하여 기질금속단백분해효소-1(matrix metalloproteinase-1)의 단백질 발현에 의한 젤라틴분해 활성(gelatinolytic activity)을 측정하였다. 1㎎/㎖의 타입 I 돼지 젤라틴(type I porcine gelatin, Sigma Co. LTD, USA)을 사용한 SDS-PAGE(10% Duacryl/bis acrylamide 30/8 from Millipore), 1.5M Tris-HCl(pH8.8), 10% SDS 및 4㎖의 멸균수를 포함하는 분리 겔(separation gel)과 0.125M Tris(pH6.8)에 4% 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)를 첨가하여 만든 스태킹 겔(stacking gel)을 제조하고 각각의 겔(gel)을 10% 과산화황산암모늄(ammonium persulfate) 50㎕와 0.1% TEMED(tetramethylethylene diamine) 10㎕를 첨가하여 중합시켜 제조하였다. EGCG-3Me를 첨가하여 전처리한 각 세포의 상층액을 1/2 농도의 SDS 비환원 시료버퍼(250mM Tris pH6.8. 50% glycerol, 0.4% bromophenol blue, 10% SDS)로 희석하여 겔판에 로딩(loading)하고 전개(80V, 15분 한 후에 다시 160V에 1시간 30분 동안)한 후에 2.5% 트리톤(Triton) X-100으로 30분 동안 2회 세척하여 SDS를 제거하고 배양용액(100mM Tris-HCl pH7.4, 30mM CaCl2, 0.1M의 ZnCl2, 10mM glycine, 2mM ATP, 2mM MgCl2 pH7.5)에서 배양(37℃, 24h)한 후 0.2% 아미도 블랙 염색(amido black staining)을 수행하였다. 겔(gel)에서 클리어 존(clear zone)을 분리하여 프로테아제 활성(protease activity)을 측정하였다. Human dermal fibroblasts treated with EGCG-3Me and UVB (Ultraviolet B) were disrupted with an ultrasonic sonicator and then centrifuged to obtain matrix metalloproteinase- 1) were measured for their gelatinolytic activity. (10% Duacryl / bis acrylamide 30/8 from Millipore) using 1 mg / ml Type I porcine gelatin (Sigma Co. LTD, USA), 1.5 M Tris-HCl ), A separation gel containing 10% SDS and 4 ml of sterile water, and a stacking gel prepared by adding 4% polyacrylamide to 0.125 M Tris (pH 6.8). And each gel was polymerized by adding 50 μl of 10% ammonium persulfate and 10 μl of 0.1% TEMED (tetramethylethylene diamine). The supernatant of each cell pretreated with EGCG-3Me was diluted with 1/2 SDS non-reducing sample buffer (250 mM Tris pH 6.8, 50% glycerol, 0.4% bromophenol blue, 10% SDS) SDS was removed by washing with 2.5% Triton X-100 twice for 30 minutes after loading (developing at 80V for 15 minutes and then for 1.5 hours at 160V for 1 hour and 30 minutes), and the culture solution (100 mM Tris- (37 ° C, 24h), followed by 0.2% amido black staining in HCl pH 7.4, 30 mM CaCl 2 , 0.1 M ZnCl 2 , 10 mM glycine, 2 mM ATP, 2 mM MgCl 2 Respectively. Protease activity was measured by separating the clear zone from the gel.

기질금속단백분해효소-1(MMP-1, matrix metalloptroteinase-1)의 웨스턴 블롯 분석(western blotting analysis)에서 젤라틴분해 활성측정을 위해 사용되었던 겔(gel)을 PVDF(polyvinylidene fluoride membrane, Millipore)에 80V로 1시간 동안 트랜스퍼(transfer)하였다. 블로킹용액(non-fat milk 5%, 0.05% tween 20 in PBS)으로 세척하여 비특이적인 부분을 제거하고 PBS로 15분 동안 4회 세척하였다. 각 멤브레인(membrane)에 MMP-1에 대한 1차 항체(primary antibody, Calbiochem France)를 PBS로 1/500으로 희석하여 첨가하고 4℃에서 밤새동안 배양한 후 세척하였고, HRP 2차 항체(Sigma Co. LTD, USA)를 1/750으로 희석하여 첨가하였다. 과산화효소(Peroxidase) 활성을 화학발광(ECL, chemiluminescence, Amersharm Bioscience, England)을 사용하여 발색반응을 유도하고 발현 정도를 측정하였다. Gel electrophoresis was performed by Western blotting analysis of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) using gel electrophoresis (gel electrophoresis) using a polyvinylidene fluoride membrane (Millipore) Lt; / RTI > for 1 hour. Non-specific portions were removed by washing with blocking solution (non-fat milk 5%, 0.05% tween 20 in PBS) and washed four times with PBS for 15 minutes. The primary antibody to MMP-1 (Calbiochem France) was diluted to 1/500 with PBS, incubated overnight at 4 ° C, washed with HRP secondary antibody (Sigma Co Ltd., USA) was diluted to 1/750. Peroxidase activity was induced by chemiluminescence (ECL, chemiluminescence, Amersharm Bioscience, England) and the degree of expression was measured.

HS68 섬유아 세포를 대상으로 하여 UVB(0, 50, 75 및 100 mJ/cm2)를 처리하여 72시간 후에 MMP-1의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석(western blot analysis)을 통하여 확인한 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 UVB를 조사하지 않은 대조군에 비하여 50mJ/cm2를 조사한 군에서는 MMP-1의 단백질 발현이 약 16배 증가하였으며, 75mJ/cm2를 조사한 군은 24배, 100mJ/cm2 를 조사한 군은 36배의 MMP-1의 단백질 발현이 증가하였다. 이러한 결과는 자외선에 노출되는 경우 MMP-1의 발현이 증가되고 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 세포외기질(ECM) 물질이 손실될 수 있음을 나타낸다. 전(pro)-MMPs는 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단된 후 활성화되기 때문에 43kDa에서 단백질의 활성을 나타내는 블롯(blot)이며 55kDa는 비활성화 형태인 프로폼(proform)에 해당된다. 따라서, UVB 조사에 따라 비활성화 프로폼 및 활성화 폼(form) 모두의 발현이 증가됨을 알 수 있었다.HS68 fibroblasts were treated with UVB (0, 50, 75, and 100 mJ / cm 2 ) and after 72 h, the protein expression level of MMP-1 was confirmed by western blot analysis than the control group did not examine the UVB, as described in 4, in the group a review of 50mJ / cm 2 was the protein expression of MMP-1 increased by approximately 16 times, the group review of 75mJ / cm 2 24 times, 100mJ / cm 2 The protein expression of MMP-1 increased 36-fold. These results indicate that exposure to ultraviolet light may increase expression of MMP-1 and loss of extracellular matrix (ECM) materials such as collagen and elastin. Pro-MMPs are a blot showing the activity of the protein at 43 kDa and 55 kDa corresponding to the inactive form of the proform since the amino terminal region is cleaved after structural modification. Therefore, it was found that the UVB irradiation increases the expression of both the inactivated proform and the activated form.

다음으로, EGCG-3Me를 처리하였을 때, UVB 조사 후에 MMP-1의 단백질 발현 억제 정도를 확인하기 위하여 EGCG-3Me를 250μM의 농도로 전처리하고 UVB를 조사하여 72시간 후 MMP-1의 단백질 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 EGCG-3Me를 처리하고 UVB를 조사한 경우, MMP-1의 단백질 발현이 감소하였다. EGCG를 처리한 경우에는 처리하지 않은 경우보다 1/28로 감소하였으며, EGCG-3Me을 처리한 경우 1/56의 비율로 감소하여 EGCG-3Me가 EGCG보다 높은 기질금속단백분해효소 억제활성을 보여주었다. 또한, MMP의 특성인 단백질분해 활성을 젤라틴분해 분석을 통하여 검정하여 본 결과, MMP-1의 단백질 발현감소로 인하여 EGCG-3Me를 처리하지 않고 UVB를 조사한 군보다 EGCG를 처리한 군에서는 클리어 존(clear zone)이 매우 낮은 밴드(band)를 형성하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히, EGCG-3Me을 전처리하는 경우는 단백질분해 활성이 거의 억제되는 결과를 얻을 수 있었다. EGCG-3Me 및 EGCG의 처리에 따라 활성화된 MMP-1의 폼(form, 43kDa)뿐만 아니라 비활성화 프로폼(proform, 55kDa)의 발현도 억제됨을 확인할 수 있었으며 비활성화된 MMP-1의 프로폼(proform) 발현 억제도 EGCG-3Me가 EGCG보다 우수한 경향을 보였다. 몇몇의 연구에서 EGCG는 MT-1 MMP(matrix metalloproteinase)의 발현을 감소시켜 MCF-7 유방암세포주의 MMP-2(matrix metalloproteinase-2)의 하향조절(down regulation)하여 세포 내외부의 대사와 증식과정을 조절함으로써 항 돌연변이 활성 및 종양형성 억제 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다(Sen et al., 2009, Multifunctional effect of epigallocatechin-3-gallate(EGCG) in downregulation of gelatinase-A(MMP-2) in human breast cancer cell line MCF-7. Life Sciences. 84:194-204.). 이러한 결과를 통하여 EGCG-3Me는 광노화에 따른 ECM(extracellular matrix)의 분해를 저해하여 피부노화를 방지할 수 있는 효능을 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
Next, EGCG-3Me was pretreated at a concentration of 250 μM to examine the inhibition of protein expression of MMP-1 after UVB irradiation, and after 72 hours of UVB irradiation, the protein expression level of MMP-1 Were measured. As a result, when EGCG-3Me was treated and irradiated with UVB as shown in Fig. 5, protein expression of MMP-1 decreased. When EGCG was treated, it was reduced to 1/28 of that of the untreated case, and when treated with EGCG-3Me, it decreased to 1/56, indicating that EGCG-3Me had higher substrate metalloproteinase inhibitory activity than EGCG . In addition, as a result of assaying the proteolytic activity, which is a characteristic of MMP, by gelatin degradation assay, it was found that in the group treated with EGCG than in the group treated with EGCG-3Me and treated with UVB due to a decrease in protein expression of MMP-1, clear zone formed a very low band. Especially, when EGCG-3Me was pretreated, the proteolytic activity was almost suppressed. The inhibition of proform expression (55 kDa) as well as the active form of MMP-1 (form, 43 kDa) was also inhibited by treatment with EGCG-3Me and EGCG. Inhibition of proform expression of inactivated MMP-1 EGCG-3Me showed better tendency than EGCG. In some studies, EGCG reduced the expression of matrix metalloproteinase (MT-1) and down-regulated MMP-2 (matrix metalloproteinase-2) in MCF-7 breast cancer cell lines, (EGCG) in downregulation of gelatinase-A (MMP-2) in human breast cancer (Sen et al., 2009) cell line MCF-7. Life Sciences. 84: 194-204.). These results suggest that EGCG-3Me inhibits the decomposition of ECM (extracellular matrix) due to photoaging, and thus can prevent skin aging.

실시예Example 5. 엘라스타아제( 5. Elastase ( elastaseelastase )에 의한 피부 ) Skin 신축망New network 저하 및 메틸화카테킨( Lowered and methylated catechins ( EGCGEGCG -3-3 MeMe ) 처리에 의한 피부 ) Skin by treatment 신축망New network 저하 억제 효과 Lowering effect

동결건조된 인간의 피부조직을 대상으로 하여 HLE(human leukocyte elastase)를 처리하여 피부 신축망 저하 및 EGCG-3Me 처리에 의한 신축망 저하 억제 효과를 측정하였다. 이를 위하여 인간 피부조직은 유방 성형수술을 받은 여성으로부터 환자의 동의하에 기증받은 조직을 강원대학교 병원으로부터 제공받아 사용하였다. 피부조직을 400 IU/㎖의 페니실린, 400㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 4㎍/㎖의 암포테리신 B(amphotericin B)가 포함된 DMEM(Dublescco's Modified Eagle's medium, Gibco, Paisley, UK)으로 3회 세척하고 작은 단편조직으로 절단한 다음 25cm2의 배양 플라스크에 20% FCS(fetal calf serum), 100 IU/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 2㎍/㎖의 암포테리신 B가 포함된 DMEM(Dublescco's Modified Eagle's medium)에서 5% CO2로 배양하였으며 배양된 상태를 동결보존하여 보관하였다. 2㎍의 HLE을 포함한 배양용액(100mM Tris HCl) 10㎕에 EGCG-3Me를 처리하지 않은 군과 250μM의 농도로 전처리한 군으로 나누어 37℃에서 30분 동안 전배양하고 각각의 조직을 섹션(8㎛, 6 section)하여 슬라이드 글라스에 위치시킨 다음 3시간 동안 휴미디파이드 챔버(humidified chamber)에서 배양하였다. 각각의 섹션은 하츠 레조르신-푹신 엘라스틴 염색(Harts resorcin-fuchsin elastin stain)을 수행하여 피부를 구성하는 결합조직, 상피세포(Ep, Epithelium), 옥시탈란 섬유(Ox, oxytalan fiber), 엘라스틴 섬유(EF, elastin fiber) 등을 관찰하여 피부 신축망에 대한 저하를 관찰하고 EGCG-3Me 처리에 의한 신축망 저하 억제효과를 관찰하였다. Human leukocyte elastase (HLE) was administered to lyophilized human skin tissues, and the effect of suppression of skin elasticity by EGCG-3Me treatment was examined. For this purpose, human skin tissue was donated from Kangwon National University Hospital under the consent of a patient who received breast plastic surgery. The skin tissue was treated three times with DMEM (Dublesco's Modified Eagle's medium, Gibco, Paisley, UK) containing 400 IU / ml penicillin, 400 ug / ml streptomycin and 4 ug / ml amphotericin B Washed and cut into small pieces of tissue and then incubated in a 25 cm 2 culture flask containing 20% FCS (fetal calf serum), 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 2 μg / ml amphotericin B The cells were cultured in DMEM (Dublescco's Modified Eagle's medium) at 5% CO 2 . The cells were pre-cultured for 30 min at 37 ° C in 10 μl of a culture solution (100 mM Tris HCl) containing 2 μg of HLE and divided into a group not treated with EGCG-3Me and a group pretreated with a concentration of 250 μM. Mu m, 6 sections), placed in a slide glass, and cultured in a humidified chamber for 3 hours. Each section was treated with Harts resorcin-fuchsin elastin stain to determine the epithelial cells (Ep, Epithelium), oxytalan fibers (Ox, oxytalan fiber), elastin fibers EF, and elastin fiber) were observed to observe the deterioration of the skin elastic network and to observe the effect of EGCG-3Me treatment on the reduction of the stretching net.

인간의 피부조직에 HLE(human leukocyte elastase)를 처리하게 되면 피부의 엘라스틴이 급속하게 파괴되고 결합조직의 신축망이 저하된다. EGCG-3Me은 금속분해단백질효소의 활성을 저해하여 엘라스틴의 파괴를 막고 결합조직의 신축망이 저하되는 것을 억제할 수 있을 것으로 사료되어 피부조직에 인위적으로 HLE를 처리하여 신축망을 저해시키고 여기에 다시 EGCG-3Me를 처리하여 피부조직의 신축망 저해를 억제할 수 있는지의 여부를 측정하였다. 그 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 2㎍ 의 HLE를 처리하게 되면 피부조직의 엘라스틱 네트워크를 구성하는 옥시탈란 섬유(Ox, 진피와 표피의 접합부분 기저막에 부착되어 있는 섬유)가 평평해지면서 얇아지게 되는 것을 관찰할 수 있는데 이러한 결과는 표피와 진피 사이의 접촉과 교환면적이 줄어들어 표피의 신진대사가 저하되는 것을 예측할 수 있다. 또한, 엘라스틱 섬유(Elastic fiber)가 급속하게 파괴되어 거의 관찰되지 않으며 엘라스틴 섬유(Ela, elaunin fiber)도 거의 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 하지만 EGCG-3Me 및 EGCG를 250μM의 농도로로 처리한 시료에서는 Ox는 동그랗고 두꺼운 형태를 지니며 엘라스틴 및 엘라스틱 섬유도 안정적으로 유지되는 것이 관찰되었다. 특히, EGCG-3Me를 처리한 시료에서는 Ox가 더 두꺼운 형태로 유지되고 있으며 엘라스틴 및 엘라스틱 섬유도 결합조직 전체에 고르게 존재하는 것이 관찰되었다. 이러한 결과를 통하여 EGCG-3Me는 피부조직에서 엘라스틴 및 콜라겐의 파괴를 막고 피부조직을 구성하는 ECM(extracelluar matrix)을 온전하게 유지시켜 피부의 신축망을 유지하고 피부노화를 억제하는데 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 활성의 차이에 근거하여 EGCG-3Me가 EGCG보다 피부노화를 억제할 수 있는 더 강력한 소재가 될 것으로 사료된다. When human leukocyte elastase (HLE) is applied to human skin tissue, elastin of the skin is rapidly destroyed and the stretching net of connective tissue is lowered. EGCG-3Me inhibits metallase-degrading protein enzyme activity and inhibits destruction of elastin and inhibits degeneration of connective tissues. It treats skin tissue artificially by HLE, EGCG-3Me was treated again to determine whether or not inhibition of stretch retractile network of skin tissue could be suppressed. As a result, as shown in FIG. 6, when 2 μg of HLE was treated, the oxytallane fibers (Ox, fibers adhering to the junctional base layer of the epidermis and dermis) constituting the elastic network of the skin tissue became thin and thin These results suggest that the contact area between the epidermis and the dermis and the area of exchange can be reduced, leading to a decrease in the epidermal metabolism. In addition, it was confirmed that elastic fibers were rapidly broken and hardly observed, and elastin fibers (Ela, elaunin fiber) were hardly observed. However, in the samples treated with EGCG-3Me and EGCG at a concentration of 250 μM, Ox was observed to have a round and thick shape, and elastin and elastomeric fibers stably maintained. Particularly, in the sample treated with EGCG-3Me, Ox was kept thicker, and elastin and elastomeric fibers were uniformly present throughout the connective tissue. These results suggest that EGCG-3Me may protect elastin and collagen from destruction of skin tissue and maintain the extracellular matrix (ECM) that constitutes the skin tissue to maintain skin's elastic network and inhibit skin aging . In addition, based on the difference in activity, EGCG-3Me is expected to be a more powerful material that can inhibit skin aging than EGCG.

Claims (13)

메틸화카테킨 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.A health functional food composition for preventing or ameliorating skin aging comprising methylated catechin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. 제1항에 있어서, 상기 메틸화카테킨은 EGCG-3Me((-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)-gallate)인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.The health functional food composition according to claim 1, wherein the methylated catechin is EGCG-3Me ((-) - epigallocatechin-3-O- (3-O-methyl) -gallate). 제1항에 있어서, 상기 메틸화카테킨은 녹차 잎으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.The health functional food composition according to claim 1, wherein the methylated catechin is isolated from green tea leaves. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성을 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.The health functional food composition according to claim 1, wherein the composition has a superoxide anion scavenging activity. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 콜라게나아제(collagenase) 및 엘라스타아제(elastase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.The health functional food composition according to claim 1, wherein the composition inhibits the activity of collagenase and elastase. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 자외선에 의해 유도된 기질 금속단백분해효소-1(matrix metalloproteinase-1; MMP-1)의 단백질 발현을 억제함으로써 젤라틴의 분해를 저해하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물. The composition according to claim 1, wherein the composition inhibits the degradation of gelatin by inhibiting protein expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) induced by ultraviolet light. Composition. 제1항에 있어서, 상기 메틸화카테킨 이외에 갈릭산(gallic acid; GA), 갈로카테킨(gallocatechin; GC), 에피갈로카테킨(epigallocatechin; EGC), 카테킨(catechin; C), 에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG), 에피카테킨(epicatechin; EC), 갈로카테킨갈레이트(gallocatechin gallate; GCG) 및 에피카테킨갈레이트(epicatechingallate; ECG) 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.The method of claim 1, further comprising, in addition to the methylated catechin, gallic acid (GA), gallocatechin (GC), epigallocatechin (EGC), catechin (C), epigallocatechin gallate wherein the composition further comprises at least one selected from the group consisting of epigallocatechin gallate (EGCG), epicatechin (EC), gallocatechin gallate (GCG) and epicatechin gallate (ECG). 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.The health functional food composition according to claim 1, wherein the composition is prepared from one of powder, granule, ring, tablet, capsule, candy, syrup and beverage. 메틸화카테킨 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 피부외용 약학 조성물. A dermatological pharmaceutical composition for improving wrinkles containing methylated catechin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. 제9항에 있어서, 상기 메틸화카테킨 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.The pharmaceutical composition according to claim 9, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the methylated catechin. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.[Claim 11] The pharmaceutical composition according to claim 9, wherein the composition is prepared from any one of a capsule, a powder, a granule, a tablet, a suspension, an emulsion, a syrup and an aerosol. 메틸화카테킨 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물.A cosmetic composition for preventing or improving skin aging comprising methylated catechin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁택, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 게면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액, 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 중에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.The composition of claim 12, wherein the composition is selected from the group consisting of a solution, a suspension, a suspension, a paste, a gel, a cream, a lotion, a powder, a soap, a surfactant-containing cleansing agent, an oil, a powder foundation, an emulsion, a foundation, a wax foundation, Wherein the composition is a single formulation.
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