KR20160110744A - 프로바이오틱스 활성을 갖는 류코노스톡 락티스 efel005 균주 및 이의 용도 - Google Patents

프로바이오틱스 활성을 갖는 류코노스톡 락티스 efel005 균주 및 이의 용도 Download PDF

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한남수
문진석
노솔지
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 김치에서 분리한 신규한 균주인 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주는 강한 내산성 및 내답증성, 높은 프로바이오틱스 활성 및 항균 활성을 가지고 있다. 따라서 본 발명의 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물은 식품, 사료 첨가용 또는 항균용 조성물로 이용될 수 있다.

Description

프로바이오틱스 활성을 갖는 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 및 이의 용도 {Leuconostoc lactis EFEL005 Strain Having Probiotic Activities and the Use of Thereof}
본 발명은 김치로부터 분리된 내산성 및 내담즙성 유산균인 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
유산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산(Lactic acid)을 생성하는 세균으로서, 생성되는 젖산에 의해 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 특성을 가지고 있어서 유제품, 김치류 또는 양조식품 등의 식품제조에 이용되고 있다. 또한, 포유류의 장내에 서식하면서 잡균에 의한 이상발효를 방지하는 특성이 있어서 정장제로도 이용되는 중요한 세균이다.
또한, 프로바이오틱스(Probiotics) 중의 하나로 잘 알려져 있는 유산균은 미국 FDA에서 GRAS(generally recognized safe)로 인정되어 식품, 화장품, 제약 등 다양한 산업에서 사용되고 있으며 맛, pH 조절, 미네랄 성분 강화 등에 이용되고 있다.
프로바이오틱스(probiotics)란 그리스어의 "생명을 위하여(for life)" 뜻으로부터 유래된 말로서, 생물체간의 공생관계를 의미하는 생태학적 용어에 기원을 두고 있으며, 현재는 '사람이나 동물에 건조된 세포형태나 발효산물 형태로 급여되어 사람이나 동물숙주의 장내균총을 개선함으로써 유익한 효과를 주는 단일 또는 복합균주 형태의 생균'으로 정의되고 있다. 우리나라에서는 사료첨가제로서 동물에 사용되는 경우 생균제로 표기되고, 인체 의약품으로 사용되는 경우 정장제 또는 유산균제제로 표기되고 있다.
보편적으로 많이 알려진 유산균은 치즈 등과 같은 발효된 유지방 식품에서 분리되거나 건강한 사람 또는 동물 등의 분변에서 분리된 것들로서, 동물 유래 유산균들이 대부분을 차지하고 있다. 한편, 오래전부터 아시아권의 나라에서는 서양과 다르게 식물성의 채소, 콩류를 통해서 발효된 식품을 즐겨왔으며, 최근 동물 유래 유산균에 비해 열악한 환경에서 생육을 하는 식물성 유산균에 대한 관심이 점점 높아지고 있다. 일본에서 처음 시작된 식물성 유산균에 관한 연구는 내산성이 강하고 장에서 활발하게 성장하여 장내 세균총을 활성화시키는 균종을 분리하는데 초점이 맞춰져 왔으며, 분리된 균주를 식품, 의약품 등의 다양한 분야에서 산업화하기 시작하면서 관련 연구가 더욱 각광을 받고 있다.
유산균의 프로바이오틱스로서 유효성이 인정되면서 많은 나라에서 다양한 유산균들을 이용한 유산균제제가 개발되어 판매되고 있다. 국내에서는 1962년에 처음으로 유산균제제가 시판된 이후, 현재 년간 총 850억원의 시장을 형성하고 있으며, 제약부분이 약 700억원, 사료첨가제가 약 40-50 억원, 유산균 건강보조식품이 약 80억원, 종균부분이 약 30 억원을 차지하고 있다. 그러나 원료의 생산을 위해서는 우수 균주의 선별, 균주의 관리, 배양 및 제제화에 대한 기술 축적 등이 필요하기 때문에, 유산균 원료의 국내자체 생산은 아직까지는 크게 발전하지 못하고 있는 상황이다.
한편, 유산균은 경구를 통해 장에 도달하기까지 생존율이 낮기 때문에 대부분의 경우 캡슐이나 밀크제제와 혼합하여 사용되고 있으나 아직까지 그 효과는 기대에 미치지 못하고 있다. 유산균으로 가장 많이 사용되는 균주는 Lactobacillus acidophillus, L. casei 및 Bifdobacterium 속들인데, 이들 균주는 대부분 위산과 담즙산에 저항성이 있어 생존한 상태로 장에 도달할 수 있다는 특징이 있다. 국내의 경우, 김치, 장류 및 젖갈류 등에서 분리한 내산성이 강한 균주에 대한 연구가 진행되면서 다양한 균주가 확보되고 있으나, 아직까지는 일본 등 다른 국가에 비하면 상당히 열악한 실정이다. 따라서 장까지 도달하는 생존율을 높일 수 있는 내산성 및 내답즙성이 강한 균주를 확보하는 것은 유산균 관련 분야에서 매우 중요하다고 할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 김치로부터 김치의 대표 유산균으로 간주되는 류코노스톡속 유산균을 분리하고 이중에서 내산성 및 내답즙성이 강하며 프로바이오틱스 활성을 가지고 있는 균주를 발굴하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 김치에서 분리한 신규한 균주인 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주가 강한 내산성 및 내답즙성, 높은 프로바오틱스 활성 및 항균 활성을 가지고 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주(기탁번호 KACC91922P)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주(기탁번호 KACC91922P)를 제공한다.
본 발명자들은 김치로부터 내산성이 강한 균주를 선발하여, Leuconostoc lactis EFEL005로 명명하고, 이 균주의 생화학적 특성, 내담즙성, 항생제 내성, 프리바이오틱스 이용능 및 항균활성 등 유용한 생물학적 특성을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주는 강한 내산성 및 내답즙성을 가지고 있으므로 위산과 담즙산에 저항성이 있어 생존한 상태로 장에 도달할 수 있다. 또한 높은 프로바이오틱스 활성을 가지고 있어 다양한 식품 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 또는 이의 배양액 외에도, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 또는 향미제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주는 강한 내산성 및 내답즙성을 가지고 있으므로 위산과 담즙산에 저항성이 있어 생존한 상태로 장에 도달할 수 있다. 또한 높은 프로바이오틱스 활성을 가지고 있으므로 가축 사료 첨가용 조성물에 유효성분으로 포함될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분, 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 또는 질병예방제와 같은 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가용 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 제올라이트, 옥분 또는 미강 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 가축 사료 첨가용 조성물은 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있으며, 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가용 조성물을 사용할 수 있는 동물에는 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 다양한 미생물에 대해 항균 활성을 나타낸다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 리스테리아(Listeria)속 세균, 대장균(Escherichia coli), 예르시니아(Yersinia)속 세균 및 바실러스(Bacillus)속 세균에 대해 항균 활성을 갖는다.
광범위한 항균 스펙트럼을 갖는 본 발명의 항균용 조성물은 농약, 의약, 화장품, 생활용품, 식품 등에서 항균, 살균, 소독, 방부 등의 목적을 달성하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균목적으로 사용되어 질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항균용 조성물에는 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 또는 이의 배양액 이외에도 미생물 활성 및 항균 작용을 촉진하는 성분으로써 당업계에 공지된 다양한 성분이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 미생물에 대해 항균 활성을 나타낸다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 리스테리아(Listeria)속 세균, 대장균(Escherichia coli), 예르시니아(Yersinia)속 세균 및 바실러스(Bacillus)속 세균으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 세균(보다 구체적으로, 최소 두 속의 세균, 보다 더 구체적으로 최소 세 속의 세균, 보다 더욱 더 구체적으로 네 개의 속의 세균)에 대해 항균 활성을 갖는다.
광범위한 항균 스펙트럼을 갖는 본 발명의 항균용 조성물은 농약, 의약, 화장품, 생활용품, 식품 등에서 항균, 살균, 소독, 방부 등의 목적을 달성하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균목적으로 사용되어 질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항균용 조성물에는 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 또는 이의 배양액 이외에도 미생물 활성 및 항균 작용을 촉진하는 성분으로써 당업계에 공지된 다양한 성분이 포함될 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 예를 들어 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 유효성분뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 상술한 유효성분 이외에, 그 작용을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 항균제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 담체로서, 정제수, 일가 알코올류(에탄올 또는 프로필 알코올), 다가 알코올류(글리세롤, 1,3-부티렌글리콜 또는 프로필렌글리콜), 고급 지방산류(팔미틸산 또는 리놀렌산), 유지류(소맥 배아유, 동백기름, 호호바유, 올리브유, 스쿠알렌, 해바라기유, 마카데미아땅콩유, 아보가드유, 대두 수첨가 레시틴 또는 지방산 글리세라이드) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 필요에 따라 계면활성제, 살균제, 산화방지제, 자외선 흡수제, 소염제 및 청량제를 첨가할 수 있다.
계면활성제는 폴리옥시에틸렌, 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌, 올레일에테르, 모노올레인산폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌, 글리세릴모노스테아레이트, 모노스테아린산소르비탄, 모노올레인산폴리옥시에틸렌, 소르비탄, 자당지방산에스테르, 모노라우린산헥사글리세린, 폴리옥시에틸렌 환원라놀린, POE, 글리세릴피로글루타민산, 이소스테아린산, 디에스테르, N-아세틸글루타민 및 이소스테아릴에스테르로 이루어진 군에서 선택적으로 포함할 수 있다.
산화방지제는 부틸히드록시아니솔, 몰식자산, 몰식자산프로필 및 에리소르빈산 중에서 어떠한 것도 사용가능하다.
자외선 흡수제는 디히드록시벤조페논 등의 벤조페논류, 멜라닌, 파라아미노벤조산에틸, 파라디메틸아미노벤조산 2-에틸헥실에스테르, 시녹사이트, 파라메톡시계피산 2-에틸헥실에스테르, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐) 벤조트리아졸, 우로카닌산 및 금속산화물 미립자 중에서 어떠한 것도 사용가능하다.
소염제로는 글리틸리틴산디칼륨 또는 알란토인을 사용할 수 있고, 청량제로는 고추틴크 또는 1-멘톨을 사용할 수 있다.
상기 조성물의 제형은 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주 또는 이의 배양액을 유효 성분으로서 배합할 수 있는 임의의 제형으로서 화장품의 형태로는 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 젤 등과 같이 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등 다양한 형태로 제조될 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 강한 내산성 및 내답증성, 높은 프로바이오틱스 활성 및 항균 활성을 가지는 신규한 균주를 제공한다.
(b) 본 발명의 신규한 균주 또는 그의 배양액은 식품용 조성물, 사료 첨가용 조성물 또는 항균용 조성물 등으로 이용될 수 있다.
도 1는 분리 균주 EFEL005의 계통학적 분류를 보여주는 계통도이다.
도 2는 분리 균주 EFEL005의 전자현미경 사진이다.
도 3는 분리 균주 EFEL005의 덱스트란 생성 사진이다.
도 4는 분리 균주 EFEL005의 프리바이오틱스 이용특성이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주의 동정
김치로부터 류코노스톡 유산균을 분리하기 위해 일반 편의점에서 판매하는 김치를 구입하여 4℃에서 보관하여 사용하였다. 김치의 전 처리 방법은 다음과 같다. 4℃ 김치를 무균적으로 20 g 취하여 0.85% NaCl 용액 180 ㎖로 희석한 다음, 스토마커(stomacher)로 5분간 균질화하였다. 0.85% NaCl 용액 9 ㎖이 담긴 튜브를 멸균하여 준비한 다음, 준비된 튜브에 균질화된 김치를 단계적으로 희석하여 샘플을 준비하였다. 류코노스톡속 균주 선발 배지로는 MRS 아가(Difico)와 phenylethanol 아가(Difco)에 2% 수크로오스를 첨가한 PES 한천배지 및 1 L의 증류수에 트립톤(tryptone) 10 g, 효모 추출물(yeast extract, Difico) 1 g, 쇠고기 추출물(beef extract, Difico) 1 g, 글루코스 20 g, K2HPO4 2 g, MgSO4 0.1 g, 아세트산나트륨(sodium acetate) 5 g, 황산암모늄(ammonium sulfate) 2 g, 소르빈산(sorbic acid) 0.5 g, 아지드화나트륨(sodium azide) 0.0075 g, Tween 80 1 g,아가 15 g을 함유하고 있는 기본배지에 노보비오신(novobiocin) 5 ㎎, 반코마이신(vancomycin) 30 ㎎의 항생제를 추가한 변형된 NLS 한천배지를 사용하였다. PES 배지와 NLS 배지에서 모두 자란 콜로니를 피킹(picking)하여 후보 유산균으로 최종 선발 하였다.
상기 방법으로 선발한 균주의 분자생물학적 특징을 조사하기 위해 균주 배양액으로부터 Chromosomal DNA를 분리한 후, 유니버설 프라이머인 27F와 1492R 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하였고, 이렇게 얻어진 염색체 DNA는 미생물 동정을 위하여 16S RNA 유전자의 전체 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 동정한 균주는 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis)에 속하는 균주인 것으로 나타났으며, 상기 동정한 균주의 염기서열(16s rRNA 서열)을 서열번호 1에 나타내었으며, 균주는 2014년 1월 14일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다(류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 - 기탁번호 KACC91922P). 도 1은 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주의 계통학적(16S rRNA) 분류를 보여주는 계통도이다.
또한 균주의 유전자 전체 서열을 Illumina 사의 MiSeq platform(USA)을 이용하여 해독 하였으며, 염기서열은 CLC Genomics Workbench 6.0(CLCbio, Denmark)프로그램을 통해서 수집 및 편집하였다. 그 결과, 크기 1,688,202 bp 와 G+C (%) 43.43을 갖는 유전자 전체 서열을 Genbank(GCA 000709265.1)에 등록하였다(서열목록 제1서열).
실시예 2: 류코노스톡 락티스 EFEL005 균주의 생화학적 특성 검사
분리된 균주(Leuconsotoc lactis EFEL005)의 생화학적 특성을 VITEK2 COMPACT(BioMerieux, France)를 사용하여 측정하였다. Gram Positive Colorimetric Identification Card를 이용하여 총 43개의 생화학적 특성을 조사하였다. 실험의 대조군으로 L. lactis KCTC 3528 균주를 사용하였다. 분석한 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.
Tests L.lactis EFEL005 L. lactis KCTC 3528 T
D-amygdalin - -
Phosphatidylinositol phospholipase C - -
D-xylose - -
Arginine Dihydrolase 1 - -
Beta-galactosidase - +
Alpha-glucosidase - -
Ala-Phe-Pro arylamidase - -
Cyclodextrin - -
L-Aspartate arylamidase - -
Beta galactopyranosidase - -
Alpha-mannosidase - -
Phosphatase - -
Leucine arylamidase - -
L-proline arylamidase - -
Beta glucuronidase - -
Alpha-galactosidase - +
L-pyrrolidonyl-
arylamidase		 - -
Beta-glucuronidase - -
Alanine arylamidase - -
Tyrosine Arylamidase - -
D-Sorbitol - -
Urease - -
Polymixin B resistance - -
D-galactose - -
D-ribose - -
L-lactate alkalinization - -
Lactose - +
N-acetyl-D-glucosamine + -
D-maltose + +
Bacitracin resistance + -
Novobiocin resistance + -
Growth in 6.5% NaCl - -
D-mannitol + -
D-mannose + -
Methyl-B-D-
glucopyranoside		 - -
Pullulan - -
D-rafinose - -
O/129 Resistance - -
Salicin - -
Saccharose/Sucrose + -
D-Trehalose - -
Arginine dihydrolase 2 - -
표 1에서와 같이, EFEL005 균주는 N-acetyl-D-glucosamine, D-maltose, Bacitracin resistance, Novobiocin resistance, D-mannitol, D-mannose, Saccharose/Sucrose, Optochin Resistance에 대해 반응을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 3: EFEL005 균주의 내산성 및 내담즙성 측정
EFEL005 균주의 내산성을 확인하기 위하여 단순 산성 pH에 대한 내성시험을 실시하였다. 단순 산성 pH에 대한 내성을 확인하기 위하여 1N HCl을 사용하여 pH 2.0과 3.0으로 조정한 0.05M 인산나트륨(sodium phosphate) 용액을 사용하였다. 분리균주를 MRS broth 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 10000 rpm에서 5 분 동안 원심분리를 하여 균주를 회수하였다. 회수한 균주에 pH 2.0과 3.0의 0.05M 인산나트륨(sodium phosphate) 용액을 초기 배양액과 동일한 양으로 첨가하여 현탁한 다음, 30℃에서 각각 0분, 90분 또는 180분 동안 반응시켰다. 반응 후 0.85% NaCl 용액으로 십진희석한 후 잘 혼합하여 MRS 아가에 도말하고 생균수를 측정하였다.
상기 방법으로 분석한 내산성 측정 결과를 아래의 표2에 나타내었다.
Strain Control
(Log CFU/ml)		 pH 2.0
(Log CFU/ml)		 pH 3.0
(Log CFU/ml)
L. lactis EFEL005 9.29± 0.03 6.31± 0.09 8.72± 0.04
L. mesenteroides
ATCC 8293		 9.20± 0.17 4.03± 0.15 4.85± 0.26
Lb. rhamnossus GG 9.64± 0.01 8.67± 0.05 9.41± 0.12
분석결과, pH 3.0에서는 EFEL005이 8 Log CFU/ml 이상의 생존율을 보였는데, 이는 EFEL005이 산에 대한 저항성이 우수하다는 것을 보여주는 것이다.
EFEL005 균주의 내답즙성을 확인하기 위하여 다음과 같이 답즙산을 제조하였다. MRS broth 배지 5 ㎖에 Bile salt(Sigma-Aldrich, USA)를 0.3% 및 0.4%가 되도록 첨가하였다. 분리균주를 MRS broth 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 10000 rpm에서 5 분 동안 원심분리를 하여 균주를 회수하였다. 회수한 균주에 0.3% 및 0.4%의 담즙산 용액을 초기 배양액과 동일한 양으로 첨가하여 현탁한 다음, 30℃에서 각각 0분, 90분 또는 180분 동안 반응시켰다. 반응 후 0.85% NaCl 용액으로 십진희석한 후 잘 혼합하여서 MRS 아가에 도말하여 생균수를 측정하였다. 각 실험의 대조군으로 Lactobacillus rhamnosus GG(한국생명공학연구원) 및 Leuconostoc mesenteroides(ATCC 8293)를 표준균주로 사용하였다.　　
상기 방법으로 분석한 내담즙성 측정 결과를 아래의 표3에 나타내었다.
Strain Control
(Log CFU/ml)		 0.3%
(Log CFU/ml)		 0.4%
(Log CFU/ml)
L. lactis EFEL005 9.29± 0.03 7.59± 0.06 6.08± 0.08
L. mesenteroides ATCC 8293 9.20± 0.17 4.49± 0.19 4.23± 0.07
Lb . rhamnossus GG 9.64± 0.01 8.65± 0.04 7.77± 0.03
분석결과, EFEL005은 Lactobacillus rhamnosus GG 보다는 낮지만 Leuconostoc mesenteroides 보다는 높은 생존율을 나타내었다. 이는 EFEL005의 내담즙성이 우수하다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 4: EFEL005 균주의 항생제 감수성 측정
항생제 감수성을 European Food Safety Authority(2008)의 지침에 따라 다음 11종의 ampicillin, vancomycin, streptomycin, penicillin G sodium, kanamycin, novobiocin, chloramphenicol, ciprofloxacin, erythromycin, rifampicin, tetracycline(Sigma, St. Louis, MO, USA) 항생제에 대하여 Minimal Inhibitory Concentrations(MIC) 방법으로 측정하였으며, 결과를 아래의 표 4에 나타내었다. 실험의 대조군으로 L. lactis KCTC 3528T 균주를 사용하였다.
Antibiotic
(μg/ ml ) 		L. lactis
EFEL005 		L. lactis
KCTC 3528 T 		EFSA Breakpoint
(μg/ ml )
Ampicillin 1 1 2
Vancomycin >512 >512 n.r.
Streptomycin 8 8 64
Penicillin G sodium 1 1 n.a.
Kanamycin 8 16 16
Novobiocin 4 4 n.a.
Chloramphenicol 2 4 4
Ciprofloxacin 2 2 n.a.
Erythromycin 1 1 1
Rifampicin 1 1 n.a.
Tetracyclin 2 2 8
EFEL005는 기존의 L. lactis 균주와 동등한 항생제 내성을 보이며, Vancomycin에 대한 내성만을 가지고 있음을 확인하였다. Vancomycin은 Leuconostoc 균주의 세포벽 조성의 차이에서 유래하는 본원적 항생제 내성으로서 타세균으로는 전이되지 않는 형질이다. 따라서, 본 균주는 프로바이오틱스의 요구조건인 비전이항생제내성(non-transferable antibiotic genes)을 가지는 것으로 판명되었다.
실시예 5: 항균활성시험
분리 유산균 EFEL005의 항균 spectrum을 알아보기 위하여, 병원성 세균인 Listeria monocytogenes ATCC 19115, E. coli O157:H7, Yersinia enterocolitica ATCC 23715, Bacillus cereus KCTC1092를 검정균주로 사용하여 생육 저해 여부를 조사하였다. 이를 위하여 각 검정균주를 도말한 배지 위에 종이 디스크(paper disk)를 올리고 그 위에 분리 유산균 배양액 150 ㎕를 분주한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 penisyrinder 주변에 형성된 투명환(Clear Zone)의 직경을 측정함으로써 저해환(inhibitor zone)의 형성여부를 확인하였다.
상기 방법으로 측정된 저해환의 크기를 아래의 표 5 에 나타내었다.
Strains Listeria
monocytogenes 		E. coli
O157:H7 		Yersinia
enterocolitica 		Bacillus
cereus
L. lactis EFEL005 + + ++ +
+ : 10-15mm, ++ : 16-19mm, +++ : 20-23mm
표 5 에서 보여지는 바와 같이, EFEL005의 배양액에 의하여 생성된 저해환 크기는 Listeria monocytogenes ATCC 19115가 15mm, Escherichia coli O157:H7가 14mm, Yersinia enterocolitica ATCC 23715가 19mm, Bacillus cereus KCTC 1092 13mm로 각각 나타내었다. 즉, EFEL005 균주는 모든 검정균주들의 생육을 저해하는 활성을 나타내었다. 본 시험의 검정균주들은 김치에서 자주 발생하는 식중독 원인균으로서 지금까지 류코노스톡 락티스속의 균주 중에서 이들 검정균주들을 모두 저해하는 활성을 나타내는 균주는 보고된 바가 없다. 따라서 이러한 결과는EFEL005 균주가 기존의 류코노스톡 락티스속 균주들에 비해 현저한 활성효과를 가지고 있다는 것을 의미한다.
실시예 6: EFEL005 균주의 프리바이오틱스 이용특성
EFEL005 균주의 프리바이오틱스 이용특성을 분석하기 위하여, 다음과 같은 상업용 프리바이오틱스에 대한 생장을 분석하였다: Isomalto-oligosaccharides, Fructo-oligosaccharides, Xylo-oligosaccharides(Wako, Japan), Inulin(VIXXOL), Glucose(Sigma). 전 배양으로 우선, EFEL005 균주를 MRS-배지(5 ㎖)에서 30°C 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 배양을 마친 각 유산균을 원심분리(7000 rpm, 5 분)하여 펠렛을 얻은 다음, 0.85% 염화나트륨(sodium chloride)으로 2회 세척하고 다시 1%로 보정하여 균체를 얻었다. 글루코스가 없는 MRS 배지(30 ㎖)에 각각의 프리바이오틱스 2%가 포함되도록 조성한 배지에서 상기 균체를 각각 배양하면서 6시간 간격으로 OD 660nm에서 세포의 성장을 측정하였다.
분석결과 프락토올리고당, 이소말토올리고당, 자일로올리고당 순으로 이용을 잘하는 것으로 나타났다(도 4).
실시예 7: 덱스트란 생성 측정
덱스트란은 포도당으로서 알파 1-6 당쇄구조를 가지는 다당류이며, 미생물에 의해 주로 생성된다. 식품으로 섭취하는 경우 위와 소장에서 분해되지 않은 상태로 대장에 도달하여 장내세균에 의해 발효되어 단쇄 지방산을 생성함으로써 잡균의 성장을 억제하는 물질이다.
EFEL005 균주의 덱스트란 생성량을 측정하기 위하여 S-배지(sucrose 24.7 g, peptone 4.2 g, yeast extract 4.2 g, K2HPO4 20 g, MgSO42H2O 0.2 g, NaCl 0.1 g, FeSO47H2O 0.1 g,MnSO4H2O 0.1 g, CaCl22H2O 0.13 g/L D.W)에서 배양한 다음, 에탄올 침전법을 이용하여 측정하였다. 실험의 대조군으로 L. lactis KCTC 3528 균주를 사용하였다. 분석한 아래의 표 6에 나타내었다.
L. lactis EFEL005 20.1 (mg/㎖)
L. lactis KCTC 3528T 1.3 (mg/㎖)
우유에서 유래한 L. lactis KCTC 3528 균주는 덱스트란을 생성하지 않은 반면, 김치 유래의 분리균주인 L. lactis EFEL005는 덱스트란을 20 mg/㎖을 생성하였다.
덱스트란 수크레이즈 활성을 DNS법을 이용하여 측정하였다. 효소 활성을 측정한 결과, 덱스트란 생성 결과와 같이 L. lactis KCTC 3773 균주는 효소 활성을 보이지 않았고, L. lactis EFEL005 균주는 3.3 unit/㎖의 효소 활성을 나타내었다.
이와 같은 결과는 L. lactis EFEL005 균주가 자당 배지에서 배양시 다량의 덱스트란 다당류를 생성할 수 있으며, 이를 식품으로 섭취하는 경우, 장내세균의 발효에 의해 대장 건강을 개선할 가능성을 보여주는 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 어떤 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
농업생명공학연구원 KACC91922 20140114
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Leuconostoc lactis EFEL005 Strain Having Probiotics Properties and Use Thereof <130> PN150079 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1355 <212> RNA <213> Leuconostoc lactis EFEL005 16S rRNA <400> 1 cctttcaagc gagtggcgaa cgggtgagta acacgtggat aacctgcctc aaggctgggg 60 ataacatttg gaaacagatg ctaataccga ataaaactta gtatcgcatg atacaaagtt 120 gaaaggcgct acggcgtcac ctagagatgg gtccgcggtg cattagttag ttggtggggt 180 aaaggcctac caagacaatg atgcatagcc gagttgagag actgatcggc cacattggga 240 ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg ctgcagtagg gaatcttcca caatgggcga 300 aagcctgatg gagcaacgcc gcgtgtgtga tgaaggcttt agggtcgtaa agcactgttg 360 tatgggaaga aatgctagaa tagggaatga ttctagttcg acggtaccat accagaaagg 420 gacggctaaa tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg tcccgagcgt tatccggatt 480 tattgggcgt aaagcgagcg cagacggttg attaagtctg atgtgaaagc ccggagctca 540 actccggaat ggcattggaa actggttaac ttgagtgttg tagaggtaag tggaactcca 600 tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggcttactg 660 gacaacaact gacgttgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt 720 agtccacacc gtaaacgatg aatactaggt gttaggaggt ttccgcctct tagtgccgaa 780 gctaacgcat taagtattcc gcctggggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 840 ttgacgggga cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 900 cttaccaggt cttgacatcc tttgaagctt ctagagatag aagtgttctc ttcggagaca 960 aagtgacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020 gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc cagcattcag ttgggcactc tagcgagact 1080 gccggtgaca aaccggagga aggcggggac gacgtcagat catcatgccc cttatgacct 1140 gggctacaca cgtgctacaa tggcgtatac aacgagttgc caacccgcga gggtgagcta 1200 atctcttaaa gtacgtctca gttcggactg cagtctgcaa ctcgactgca cgaagtcgga 1260 atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac 1320 cgcccgtcac accatgggag tttgtaatgc ccaaa 1355

Claims (9)

  1. 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주(기탁번호 KACC91922P).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 김치로부터 분리되고, 내산성 및 내답즙성을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 덱스트란을 생성하는 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주(기탁번호 KACC91922P) 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 프로바이오틱스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물,
  6. 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주(기탁번호 KACC91922P) 또는 이의 배양액을 포함하는 사료 첨가용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 사료 첨가용 조성물은 프로바이오틱스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EFEL005 균주(기탁번호 KACC91922P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 항균용 조성물은 리스테리아(Listeria)속 세균, 대장균(Escherichia coli), 예르시니아(Yersinia)속 세균 및 바실러스(Bacillus)속 세균으로 구성된 군으로부터 선택되는 세균에 대해 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
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