MX2013002839A - Bacillus subtilis aislado de maiz. - Google Patents

Abstract

Se aíslan cultivos biológicamente puros de Bacillus subtilis a partir del pericarpio de maíz nixtamalizado. Los microorganismos Bacillus son caracterizados y encontrados para producir péptidos novedosos los cuales tienen actividad antimicrobiana. Los microorganismos Bacillus son activos contra bacterias Gram positivas y pueden ser usados como un agente para evitar la descomposición en alimentos. Los microorganismos Bacillus pueden ser incluidos en composiciones alimenticias probióticas para ayudar a mantener la flora gastrointestinal saludable y modular la digestión animal.

Description

BACILLUS SUBTILIS AISLADO DE MAIZ Campo de la Invención La presente invención se relaciona a cultivos biológicamente puros de una especie de Bacillus que forman esporas novedosos, aislados y más particularmente, a un aislado de Bacillus subtilis Maseca-l.

Antecedentes de la Invención La investigación en péptidos antimicrobianos ha sido continuada por más de cuatro décadas. Este campo ha atraído una gran compromiso de atención, búsqueda entre especies microbianas a partir de virtualmente cualquier esquina del planeta, para encontrar microbios como una fuente potencial de agentes terapéuticos que pueden ser tamizados para actividades antimicrobianas, antifúngicas , antivirales, inmunomodulantes , inmunosupresores , antiinflamatorios y an i umorales . Estos péptidos o lantibióticos pequeños (<4 kDa) son caracterizados por su alto contenido de residuos de aminoácidos enlazados a tioéter y residuos deshidratados insaturados .

Los lantibióticos son muy activos contra bacterias Gram positivas patogénicas (por ejemplo, B . Cereus) y hongos (por ejemplo, A. flavus) que son directamente responsables para algunas enfermedades transportadas en alimentos. Esta clase de péptidos tiene la capacidad para ser usados como un Ref. 239810 bioconservador para proteger a los productos alimentos perecederos de contaminación patógena, prevención de descomposición, inhibir patógenos y evitar infecciones en humanos y animales .

Varias especies microbianas han sido también mostradas para producir una variedad de metabolitos secundarios de interés y utilidad. Entre estos están pequeñas moléculas de péptido que representan una subclase muy grande y diversa de productos naturales bioactivos que tienen características estructurales únicas implicadas en la morfología, fisiología y sobrevivencia del microbio. Hay, por ejemplo, lipopéptidos anfifílicos los cuales son agentes reductores de tensión superficial agresivos, como surfactina y micosubtilina antifúngica. En estos compuestos, el substituyente lipo juega un papel clave en alterar la membrana celular, mientras que el componente anfifílico exhibe propiedades hemolíticas alterativas. Estas propiedades los hacen compuestos antivirales y antibacteriales muy fuertes.

El consumo de ciertos microorganismos vivos ha sido mostrado en algunas circunstancias para tener un impacto benéfico en el hombre y animales. Un grupo diverso de microbios ha sido evaluado para tal actividad "probiótica" , incluyendo muchas especies del género Lactobacilli y Bifidobacterias . Son los más abundantes en productos alimenticios que contienen probióticos. Menos común, especies de Enterococcus , Saccharomyces , Escherichia no patogénica y Sporolactobacillus formador de esporas, Brevibacillus y Bacillus no patogénicos, han sido sugeridos para alimentos probióticos .

La microflora comensal en el intestino es un ecosistema complejo con interacciones entre células huésped, nutrientes y microflora. Un cuerpo humano adulto contiene una biomasa bacterial viva de más de 1014 y más de 400 diferentes especies. Las bacterias probióticas ayudan a mantener las bacterias patogénicas en receso. También, las bacterias "simbióticas" a partir de alimentos fermentados industriales y tradicionales pueden también contribuir al desarrollo de microflora gastrointestinal saludable (por ejemplo un enriquecimiento significativo en el phylum bacterial Bacteriodetes y agotamiento en el phylum bacterial Firmicutes en la microbiota intestinal humana) .

La "hipótesis higiénica" propuesta en 1989 por David Strachan correlacionada a menos exposición ambiental a microbios - como se observa en países desarrollados- con mayores proporciones de alergias. Países occidentales desarrollados controlaron exitosamente las enfermedades infecciosas durante la segunda guerra mundial del siglo XX por mejorar la sanitización y por usar antibióticos y vacunas. Al mismo tiempo, ocurre un incremento en nuevas enfermedades como alergias, trastornos autoinmunológicos , y enfermedades inflamatorias intestinales (IBS por sus siglas en inglés) tanto en adultos y en niños. La microflora gastrointestinal es conocida para jugar un rol importante en patogénesis de IBS. La obesidad está también asociada con un desequilibrio en la microbiota intestinal normal.

Sumario de la Invención La presente invención se relaciona a cultivos biológicamente puros aislados de una nueva especies de Bacillus que forma esporas novedosos, y más particularmente, al Bacillus subtilis Maseca-1, Número de acceso en ATCC PTA-8831. La presente invención también se relaciona a péptidos producidos por Maseca-1 que tienen actividad antimicrobiana. La presente invención además se relaciona a composiciones probióticas que contienen Maseca-1.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra una imagen de microscopio de luz de las células vegetativas de Bacillus subtilis Maseca-1.

Las Figuras 2A y 2B ilustran análisis de huella de ADN genómico de cepas de Bacillus subtilis Maseca 1-4. Los patrones de huella son de (GTG)5-PCR en la Figura 2A y ERIC-PCR en la Figura 2B.

Las Figuras 3A-3B son una carta que ilustra un árbol filogenético de Bacillus spp. y otras especies relacionadas cercanamente a cepas de Maseca 1-4 en base a análisis de probabilidad máxima de secuencias de nucleótidos de 16S rADN.

Las Figuras 4A, 4B, 4C y 4D son cromatogramas de LC-MS de pico base de sobrenadante de muestra de Bacillus subtilis Maseca-1 (A-C) y un estándar nisina (D) .

La Figura 5A es un cromatograma LC-MS de pico base de sobrenadante de muestra de Bacillus subtilis Maseca-1 que muestra un pico en m/z 1701.8, la Figura 5B es un análisis de espectro de masa de ese pico.

Las Figuras 6A y 6B son cromatografía de intercambio de aniones de alta resolución con cromatogramas de detección amperométrica impulsada (HPAEC-PAD por sus siglas en inglés) de muestras de Bacillus subtilis Maseca-1 para fructosa a partir de fructosilpolímero o levano (Figura 6A) y glucosa de glucosilpolímero o dextrano (Figura 6B) .

La Figura 7 es un cromatograma de análisis de HPLC de ácido graso de cadena corta de muestra de Bacillus subtilis Maseca-1.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se relaciona a un cultivo biológicamente puro aislado de una especie de Bacillus que forma esporas novedosa, y más particularmente, a Bacillus subtilis Maseca-1 aislada de pericarpio de maíz entero nixtamalizado .

La siguiente descripción, tomada junto con las figuras y/o tablas a las que se hace referencia, es presentada para permitir a un experto ordinario en la técnica hacer y usar la invención. Varias modificaciones serán fácilmente aparentes para aquellos expertos en la técnica, y los principios generales definidos en la presente pueden ser aplicados para un intervalo amplio de aspectos. De esta forma, la presente invención no es propuesta para ser limitada a los aspectos presentados, sino es para ser acordado el alcance más amplio consistente con los principios y características novedosas descritas en la presente. Adicionalmente , debe ser notado que a menos que se establezca explícitamente de otra forma, las figuras incluidas en la presente son ilustradas cualitativamente y sin ninguna escala específica, y son propuestas para generalmente presentar el concepto de la presente invención.

Definiciones Las siguientes definiciones son propuestas para proporcionar al lector con un entendimiento general del significado de los términos, pero no son propuestas para transmitir el alcance total de cada término. Más aún, las definiciones son propuestas para complementar la especificación y explicar más claramente los términos. 16S rADN - el término "16S rADN" se refiere a códigos para una subunidad pequeña de ARN ribosomal . El 16S rADN es una macromolécula informacional usada ampliamente para estudios sistemáticos bacterianos en los niveles de familia, género, especia y subespecie. El 16S rADN contiene varias secuencias conservadas que pueden ser usadas para inferir relaciones naturales entre especies distantamente relacionadas y varias regiones variables que pueden ser usadas para separar unas relacionadas cercanamente.

La huella de ADN - el término "huella de ADN" se refiere a una técnica empleada para identificar un organismo en la base de su perfil de ADN. Típicamente, son realizadas técnicas moleculares a base de PCR. La PCR de elemento repetitivo usa cebadores complementarios para secuencias de ADN repetitivas, altamente conservadas, que ocurren naturalmente. Estas secuencias no codificantes están presentes en copias múltiples en los genomas de bacterias en su mayoría Gram negativas y varias Gram positivas. Ejemplos de estos elementos repetitivos son las secuencias de consenso intergénicas repetitivas enterobacterianas (ERIC por sus siglas en inglés) y la secuencia de politrinucleótido (GTG por sus siglas en inglés) .

Grampositivo- el término "Grampositivo" se refiere a bacterias que son teñidas azul oscuro o violeta por la tinción de Gram (cristal violeta) , en contraste a bacterias Gram negativas las cuales no pueden retener la tinción cristal violeta y en lugar toman la contra tinción (safranina o fucsina) de esta forma apareciendo rojo o rosa. Los organismos Grampositivos son capaces de retener la tinción cristal violeta debido a la cantidad superior de peptidoglicano en la pared celular interna y típicamente carecen de la pared exterior o secundaria y capa de lipopolisacárido encontrado en bacterias Gram negativas.

Probiótico- El término "probiótico" se refiere a bacterias que forman por lo menos una parte de la flora temporal o endógena y por lo mismo exhibiendo un efecto profiláctico y/o terapéutico benéfico en el organismo huésped. Los probióticos son generalmente conocidos para ser seguros por aquellos expertos en la técnica. Aunque no se desea unir a ningún mecanismo particular, el efecto profiláctico y/o terapéutico de una bacteria que forma esporas de esta invención resulta de la exclusión competitiva de sitios de enlace de patógeno, inhibición competitiva de crecimiento de patógenos debido a colonización superior, parasitismo de microorganismos no deseables, producción de ácido orgánico y carboxílico y/o producción de otros productos extracelulares que tienen actividad antimicrobiana, o combinaciones de los mismos. Típicamente, los probióticos son usados para evitar la emergencia de una enfermedad colónica o sistémica, como opuesto a la mayoría de los fármacos los cuales son usados para curar una enfermedad. Estas patologías colónicas o intestinales incluyen colitis asociadas a antibióticos, enfermedades intestinales inflamatorias (IBS por sus siglas en inglés) como colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, cáncer colorrectal, enterocolitis necrotizante e ileocecitis . Los trastornos sistémicos incluyen septicemia de origen intestinal, pancreatitis y fallo de sistema orgánico múltiple.

Prebiótico- el término "prebiótico" se refiere a ingredientes alimenticios no digeribles que estimulan el crecimiento y/o actividad de bacterias en el sistema digestivo los cuales son benéficos para la salud del cuerpo. Típicamente, los prebióticos son carbohidratos (como polisacáridos no de almidón, oligosacáridos , ácidos y alcoholes de azúcar) pero la definición también incluye no carbohidratos (como lignina y glicoproteínas) . La definición prebiótica no enfatiza un grupo bacteriano específico. Generalmente, un prebiótico puede incrementar el número y/o actividad de grupos de bacterias que tienen varios efectos benéficos en el huésped, especialmente en términos de mejorar la digestión (incluyendo incrementar la absorción mineral) y la eficacia y estimulación intrínseca del sistema inmunológico.

Simbiótica - El término "simbiótico" se refiere a complementos nutricionales que combinan los microorganismos probióticos vivos y substratos prebióticos específicos en una forma de sinergismo. Esto puede estimular selectivamente el crecimiento y/o activar el metabolismo de una o más bacterias promotoras de salud y de esta forma mejorar el bienestar del huésped .

Alimento funcional- el término "alimento funcional" es un alimento que tiene una propiedad preventiva de enfermedad o promotora de salud más allá de la función básica de nutrientes complementarios. Los alimentos funcionales incluyen alimentos fortificados con aditivos promotores de salud, como productos "enriquecidos con vitaminas" y alimentos con cultivos probióticos vivos y/o ingredientes prebióticos.

Introducción Esta invención describe las cepas de Bacillus subtilis aisladas del pericarpio de maíz entero nixtamalizado . Las cepas de Bacillus aisladas y descritas en la presente se caracterizan en base en parte al procedimiento taxonómico polifásico que examina sus afiliaciones fenotípicas y genotlpicas. Es fácilmente aparente para aquellos expertos en la técnica que dentro de la naturaleza, ocurren varias modificaciones y variaciones para cualquier organismo dado y que la descripción descrita en la presente puede ser alterada para tomar en cuenta para cualquiera de estas modificaciones o variaciones.

La cepa de Bacillus subtilis Maseca-1 ha sido depositada en un depositario internacional, bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo será disponible durante la discusión de esta solicitud de patente para alguien determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas para ser titulado bajo 37 C.F.R. 1.14 y 35 U.S.C. 122. La cepa de Bacillus Maseca-1 descrita en esta descripción ha sido depositada en la Colección Americana de Cultivo tipo (ATCC por sus siglas en inglés), 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110 USA, como PTA-8831. El depósito es recibido por el ATCC el 12 de Diciembre de 2007 y se le da un número de acceso por la Autoridad Depositaría Internacional de PTA-8831. El depósito ha sido hecho y recibido por la Autoridad Depositaría Internacional bajo las condiciones del Tratado de Budapest, y todas las restricciones ante acceso público para el depósito serán removidas irrevocablemente ante la cesión de una patente de esta solicitud. Los depósitos serán disponibles como . se requiere para leyes de patente extranjeras en países donde las contrapartes de la solicitud objeto, o su progenie, son presentadas. Debe ser entendido, sin embargo, que la disponibilidad de los depósitos no constituye una licencia para practicar la invención objeto en derogación de derechos de patente garantizados por la acción gubernamental .

Además, los depósitos del cultivo objeto serán almacenados y hechos disponibles al público de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos, es decir, serán almacenados con todos los cuidados necesarios para mantenerlos viables y no contaminados por un periodo de por lo menos cinco años después de la solicitud más reciente para proporcionar una muestra de un depósito, y en cualquier caso, por un periodo de por lo menos treinta (30) años después de la fecha de depósito o para la vida ejecutable de cualquier patente la cual puede cuestionar describir los cultivos. El depositante conoce la obligación para reemplazar los depósitos si el depositario es incapaz de entregar una muestra cuando se requiere debido a la condición del depósito.

Métodos Los métodos para colección, aislamiento y caracterización descritos en la presente son para propósitos ilustrativos solamente. Se entiende que la especies B. subtilis puede ser recolectada y aislada de cualquier superficie donde la bacteria está presente y que puede haber otras técnicas para caracterizar las especies. Las siguientes técnicas son ejemplos no limitantes para completar el proceso o técnica descritos.

Preparación y Aislamiento de Muestra Se aislan las cepas de Bacillus subtilis Maseca a partir de pericarpio de maíz entero nixtamalizado que ha sido crecido en Amarillo, Texas y en Chihuahua, México. Cuatro cepas son aisladas inicialmente y designadas Maseca- 1, Maseca-2, Maseca-3 y Maseca-4.

El proceso de nixtamalización (cocido con cal) ocurre, por ejemplo, cuando se coce el maíz en 80°C-90°C en una solución de cal (>0.2% de hidróxido de calcio) por 20-40 minutos, macerado y lavado a temperatura ambiente, molido y entonces secado para hacer la harina de maíz entero nixtamalizado o harina de masa (por ejemplo, harina marca MASECA®) . Se usa el macerado para describir el proceso de atemperado o hidratación (por ejemplo, 30%-40% de humedad) que ocurre cuando el maíz cocido con alcalino industrial (nixtamalizado) se permite enfriar a temperaturas ambientes (por ejemplo, 60-150 minutos en 35°C -40°C) y el objetivo no es la separación de almidón a partir del maíz como en la operación de molido húmedo industrial. Por otra parte, la producción de almidón implica procesamiento con ácido (por ejemplo bióxido de azufre) y fermentación láctica (por ejemplo, Lactobacillus spp. endógeno) durante el macerado o enjabonamiento los granos de maíz enteros actualmente en contra (por ejemplo, 24-48 horas, 45°C-50°C y 50% -65% de humedad) . El resultado principal es una dispersión de proteína de endospermo/zeina y liberación de almidón durante el molido húmedo subsecuente y fraccionamiento de germen y pericarpio con tan poco pérdida de endosperma como sea posible antes de su secado final.

Se identifica la cepa bacteriana endógena y endofito a partir del pericarpio de maíz entero nixtamalizado industrial y colocado en placa en agar nutriente en 30°C-35°C (pH 6.5-7.5) por 18-24 horas. Las colonias representativas de placas de agar son Gram teñidas y examinadas microscópicamente para determinar la morfología y motilidad de cepa. Las colonias son también rayadas en agar nutriente inclinado, incubado en 35 °C por 24 horas y se almacena en 5°C. Los aislados son seleccionados, purificados y almacenados en una solución de glicerol en -25°C a -80°C.

Se realizan las pruebas bioquímicas para identificar putativamente las cepas aisladas. Los medios API® 50 CHB/E y API ® M (motilidad) (BIOMERIEUX®) son usadas para identificar las cepas bacterianas aisladas como aproximadamente 98% idénticas a Bacillus subtilis con movilidad de enjambre positiva.

Microscopía La Figura 1 ilustra una imagen de microscopía de luz de las células vegetativas de Bacillus subtilus Maseca-1. La cepa Maseca-1 es una bacteria formadora de esporas, aeróbica y facultativa, de forma de rodillo, Gram positiva.

La bacteria aislada es un organismo de forma de bastón largo y móvil (3 a 5 µp? por 0.5 a 1 µp?) . Las colonias representativas teñidas con 5% de solución verde de malaquita muestran una endospora elipsoidal que tiñe de verde mientras que el resto de la célula se tiñe de rojo claro. La endospora puede ser formada con tensión nutricional (por ejemplo, crecimiento estacionario) . La bacteria es capaz de enjambrar la superficie a través de la producción de flagelos y tiene la capacidad para excretar las biopelículas y substancias exopoliméricas .

Crecimiento Las cepas de Bacillus subtilis Maseca pueden ser cultivadas en un medio líquido o sólido que contiene fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, materia inorgánica y similares empleados comúnmente en medios para cultivar microorganismos. Cualquier fuente de carbono puede ser usada, siempre y cuando pueda ser metabolizado por Bacillus subtilis, por ejemplo, glucosa, fructosa, sacarosa, almidón, licor de maíz macerado, licor macerado alcalino y molasas . Ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen peptona, hidrolizado de caseína, extracto de carne, licor de maíz macerado, licor de maceración alcalino y sulfato de amonio. Si es necesario, el medio puede además contener ácido fosfórico, sales de potasio, magnesio, calcio, sodio, hierro, manganeso y similares, vitaminas, aminoácidos, tensioactivo y similares. Es preferido realizar el cultivo aeróbicamente para inhibir el crecimiento de organismos anaeróbicos como clostridio que forma endospora. Con respecto a la condición de cultivo, un medio líquido contenido en un termentador de tarro bajo aereación/agitación (por ejemplo, fermentación sólida líquida- LSF, por sus siglas en inglés) , un medio sólido del tipo de placa (por ejemplo, fermentación de substrato sólido-SSF) o un termentador productor de koj i automatizado, puede ser usado. Se realiza el cultivo en una temperatura de aproximadamente 25°C a 42°C, preferente y aproximadamente 32°C a 40°C, por 12 horas a aproximadamente 3 días en un pH de cultivo de 5 a 9, preferentemente un pH de 6 a 8.

La identificación de las cepas de Maseca purificadas es realizada por huella de ADN genómico de tipificación de PCR en base a secuencia repetitiva y por secuenciación de ácido desoxirribonucleico ribosomal (rADN) .

Huella de ADN Se aisla el ADN genómico a partir de cepas Maseca 1-4. Se realizan las amplificaciones de reacción de cadena polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) en el ADN usando cebadores para (GTG)5-PCR y ERIC-PCR. Los productos de PCR son separados por tamaño por electroforesis en un gel de agarosa, y los geles son teñidos con bromuro de etidio y capturados digitalmente bajo luz UV. Las imágenes de gel son visualmente comparadas y analizadas.

Las Figuras 2A-2B ilustran un análisis de huella de ADN genómico de las cepas de Bacillus subtilis Maseca.. En la Figura 2A, se muestran los patrones de huella de (GTG)5-PCR; en la Figura 2B, se muestran los patrones de huella de ERIC-PCR. Las bandas 1-4 corresponden a Maseca 1-4 respectivamente. M es un marcador de peso molecular de ADN.

Maseca 1 y Maseca 4 tienen el mismo patrón de huella de ADN genómico a partir de tanto los procedimientos (GTG)5-PCR y ERIC-PCR y son identificados como el mismo organismo.

Secuenciación de 16S rADN El ADN genómico a partir de cultivos líquidos es usado como un templado para amplificación de PCR. -Se secuencian los amplicones purificados y se verifica la identidad de un producto de PCR dado por análisis de secuencia. Las relaciones filogenéticas de organismos cubiertos en esta descripción son determinados por comparación de las secuencias de 16S rADN individuales a secuencias existentes en bases de datos públicos, como la base de datos del National Center for Biotechnology Information Centro Nacional para Información biotecnológica (NCBI por sus siglas en inglés) . Los árboles evolucionarlos en base a análisis probables máximo y distancia son construidos con árboles filogenéticos (dendogramas) usando Neighbor-Joining unión de vecino (NJ por sus siglas en inglés) y métodos de media aritmética de método de grupo de par no pesado (UPGMA por sus siglas en inglés) . Los métodos Bootstrap son usados para proporcionar estimados de confidencia para topología de árbol en el método NJ.

Los análisis de resultados indican que las cepas Maseca 1-4 están más cercanamente relacionadas a miembros de las especies del grupo Bacillus subtilis subespecie subtilis (una variante de cepa 168, cepa atcc9799, cepa DSM10A o ATCC6051) . Un árbol filogenético probable máximo representativo en base a las secuencias de 16S rADN de varias bacterias formadoras de esporas y de bacillo lineal varios es mostrado en las Figuras 3A-3B. El número de cepa y números de acceso de base de datos GenBank (por ejemplo, AL009126) son mostrados. Los números son bootstrap en porcentaje o valores de identidad de secuencia (por ejemplo 85 + 0.01) de esa ramificación de árbol.

Como tal, la presente invención se relaciona a cultivos biológicamente puros aislados de bacterias aisladas de pericarpio de maíz entero nixtamalizado . En particular, las bacterias son Bacillus subtilis y más particular, Bacillus subtilis Maseca- 1, depositado como número de acceso ATT PTA-8831.

Como una especie, Bacillus subtilis es un organismo Grampositivo, no patogénico, formador de esporas encontrado normalmente en la rizosfera de tierra, en y alrededor de raíces vegetales (por ejemplo, maíz y trigo) y dentro del tracto gastrointestinal de animales y humanos. El organismo es aeróbico y facultativo, crecido típicamente en caldo nutriente (por ejemplo, medio NB) en aproximadamente 32 °C a aproximadamente 40°C. El organismo puede ser inducido para esporular cuando se hace crecer en medio de esporulacion (por ejemplo, medio Luria-Bertani o DSM) , el cual induce formación de esporas por agotamiento de nutrientes . La endospora fuerte, protectora permite al organismo tolerar condiciones ambientales extremas. B . Subtilis es no patogénico y es generalmente visto como seguro (es decir, clasificación GRAS por la administración de alimentos y fármacos de los Estados Unidos de Norteamérica) o como presunción calificada de seguridad (es decir estados QPS por la comisión Europea SCA, 2003) .

Caracterización de Sobrenadante de Cultivo Se realiza la caracterización de las biomoléculas presentes en el sobrenadante de cultivo gastado de Maseca-1. Se realiza el análisis metabolómico de péptidos lantibióticos , EPS-exopolisacáridos (por ejemplo, levano y dextrano) , ácidos orgánicos y análisis de proteasa.

Para producir las muestras, se incuban los cultivos Maseca-1 en caldo nutriente (NB por sus siglas en inglés) o en medio Luria-Bertani (LB por sus siglas en inglés) en 35°C, pH 6.8 con agitación orbital vigorosa (200 rpm) por 24-48 horas. El medio de cultivo es centrifugado (4000 rpm por 20 minutos) para remover las células y el sobrenadante libre de células es entonces fraccionado usando filtro de membrana Amicon ® Centricon ® (MILLIPORE™) .

En la Muestra 1 y Muestra 2, se fracciona el sobrenadante con un filtro de membrana que tiene un corte de peso molecular de 3000 daltones . Las dos fracciones son producidas, un retentado superior (FHMW por sus siglas en inglés) que no puede pasar a través de la membrana, que corresponde a material mayor a 3000 Daltones, y una fracción de filtrado inferior (FLMW por sus siglas en inglés) que corresponde a material de peso molecular bajo menor a 3000 daltones. Las fracciones FHMW y FLMW son almacenadas congeladas en -80°C.

En la muestra 3, el sobrenadante es filtrado doble, primero usando un filtro de membrana Biomax PB Amicon® Amicon ® (MILLIPORE™) con un corte de peso molecular de 8000 daltones. La fracción de filtrado inferior correspondiente a material de menos de 8000 daltones es además filtrado usando un filtro de membrana con un corte de peso molecular de 3000 daltones. Se producen dos fracciones, el retentado superior (FHMW por sus siglas en inglés) que corresponde a material de 3000-8000 daltones, y el filtrado inferior (FLMW por sus siglas en inglés) que corresponde a material menor a 3000 daltones . El material FHMW es además procesado para extraer péptidos lantibióticos a través de extracción de solvente orgánico .

Extracción de Solvente Orgánico Se extrae veinticinco (25 mi) de fracción FHMW a partir de la muestra 3 con 12.5 mi de cloroformo por aproximadamente 20 minutos. Esto produce una mezcla de leche café. Esta solución es ultracentrifugada en 10,400 g por 20 minutos en 12 °C. Se obtienen las capas múltiples, la capa superior que corresponde a la porción orgánica (cloroformo) , la capa acuosa inferior, y una capa precipitada media que flota entre las fases acuosas y orgánicas, que corresponde a la mezcla de péptido lantibiótico . Este precipitado es removido y secado durante la noche. La cantidad total de gránulo húmedo obtenido de 25 mi de filtrado es 975 mg. Después de secado, se suspende el gránulo en 2.5 mi de amortiguador Tris 0.1 M, pH 7.0. Una alícuota de esta fracción sin purificar extraída orgánica (OECF por sus siglas en inglés) es removida. El resto 2.1 mi es suspendida en 50 mi de agua de calidad de biología molecular nanopura y almacenada congelada en -80 °C.

Análisis para péptidos lantibióticos Se analizan las muestras de sobrenadante de cultivo gastado (es decir muestras 1, 2 y 3) por cromatografía de líquidos -espectrometría de masa (LC-MS por sus siglas en inglés) para la presencia de péptidos lantibióticos (por ejemplo, nisina A, nisina B, subtilina, mutacina, epidermina) . Se realiza el análisis LC-MS en un sistema Finnigan LTQ Orbitrap™ (Termo Electrón Corp.). Se realiza la detección de MS usando ionización de electroaspersión (ESI por sus siglas en inglés) en el modo positivo usando un barrido MS completo evento de m/z 200-2000. Se realizan las separaciones en el modo de fase inversa en una columna 150 300a ProSphere™ C4 x 3.2 mm, 5µp? (Grace Alltech) . Se realizan todas las separaciones usando una fase móvil de agua a acetonitrilo con 0.1% de ácido fórmico. Se prueban los gradientes diferentes.

Las condiciones de HPLC y los gradientes seleccionados son como a continuación: Solvente A: agua MilliQ + 0.1% de ácido fórmico Solvente B: acetonitrilo + 0.1% de ácido fórmico Velocidad de flujo: 400 µ?/min (división antes de MS) Temperatura de columna: 30°C Volumen de inyección: 10 µ? Gradiente: lineal Los cromatogramas de LC-MS de pico de base resultante de las tres muestras (Muestras 1, 2 y 3) son mostrados en las Figuras 4A, 4B y 4C, junto con un estándar de nisina en la Figura 4D (Sigma N5764, Sigma-Aldrich®) . Las tres muestras muestran patrones relativamente similares de picos, es decir, picos de alta densidad con alta intensidad en tiempo de retención corta y algunos picos abundantes menores en tiempos de retención altas. Como puede ser visto a partir de las figuras, se detectan los varios picos pero ninguno de ellos puede ser asignado a nisina.

Debido a la carencia de compuestos de referencia apropiados para micosubtilina, subtilina, mutacina y epidermina, los cromatogramas LC-MS son buscados para masa típica para valores de carga (m/z) (ver, Tabla 1). No pueden ser encontrados acoplamientos exactos con los lantibióticos caracterizados previamente o bacteriosinas ; sin embargo, se observa un pico en todas las tres muestras que muestran características de un lantibiótico (ver, Figura 5A, pico en RT 38.96 y BP 1701.8). El tiempo de retención y masa determinada para este pico está en el mismo intervalo como se espera para lantibióticos. Adicionalmente , el análisis de espectro de masa de ese pico muestra iones de hidrógeno cargados múltiples típicos para péptidos, donde los iones cargados dobles y triples son los más abundantes (ver, Figura 5B) . El pico no puede ser asignado a un lantibiótico específico en base a la información disponible en literatura. Es conocido que los lantibióticos muestran alguna variación con respecto a masa molecular dependiendo del lantibiótico específico y las condiciones experimentales debido a la oxidación, metilación u otras modificaciones.

Tabla I. Posibles valores m/z en modo positivo ESI para los peptidos lantibióticos 1+ 2+ 3+ 4+ 5+ 6+ epidermina H 2166 .6 1083 8 722. 9 542. 4 434 1 361. 9 MW=2165.6 Na 2188 6 1105 8 744. 9 564. 4 465. 1 383. 9 H y Na 1094 8 737. 5 558. 9 451 6 380. 3 730. 2 553. 4 447. 3 376. 6 547. 9 442. 9 372. 9 438. 5 369. 1 365. 4 Nisina A H 3355 0 1678 0 1119 .0 839. 5 671. 8 560. 0 MW=3354 Na 3377 0 1700 0 1141 .0 861. 5 693. 8 582. 0 H y Na 1689. 0 1133 .7 856. 0 689. 4 578. 3 1126 .3 850. 5 685. 0 574. 7 845. 0 680. 6 571. 0 676. 2 567. 2 563. 5 Nisina Q H 3328 0 1664. 5 1110 .0 832. 8 666. 4 555. 5 MW=3327 Na 3350 0 1686. 5 1132 .0 854. 8 688. 4 577. 5 H y Na 16575 .5 1124 .7 849. 3 684. 0 573. 8 1117 .3 843. 8 679. 6 570. 2 838. 3 676. 2 566. 2 670. 8 562. 7 559. 0 Nisina Z H 3332 0 1666. 5 1111 .3 833. 8 667. 2 556. 2 MW=3331 Na 3354 0 1688. 5 1133 .3 855. 8 689. 2 578. 2 H y Na 1677.5 1126.0 850.3 684.8 574.5 1118 .7 844. 8 680. 4 570 .8 839. 3 676. 0 567 .2 671. 6 563 .3 559 .7 Mutacina I H 2365 0 1183. 0 789. 0 592. 0 473. 8 395 .0 MW=2364 Na 2387 0 1205. 0 611. 0 614. 0 495. 8 417 .0 H y Na 1194. 0 803. 7 6068 5 491. 4 413 .3 796. 3 603. 0 487. 0 409 .7 597. 5 482. 6 406 .0 478. 2 402 .2 398 .5 Mutacina H 2264 0 1132. 6 755. 3 568. 8 453. 6 378 .2 1140 MW=2263 Na 2286 0 1154. 6 777. 3 588. 8 475. 6 400 .2 H y Na 1143. 5 770. 0 583. 3 471. 2 396 .5 762. 7 577. 8 466. 8 392 .8 572. 3 462. 4 389 .2 458. 0 385 .3 381 .7 1 + 2 + 3 + 4 + 5 + 6 + Mutacina H 2271.0 1136.0 757.7 568.5 455.0 379. 3 B-Ny266 MW=2270 Na 2293.0 1158.0 779.7 590.5 477.0 401. 3 H y Na 1147.0 772.3 585.0 472.6 397. 7 765.0 579.5 468.2 394. 0 574.0 463.0 380. 3 459.4 386. 5 382.8 Subtilina H 3322.0 1661.5 1108.0 831 3 665 2 554.5 MW=3321 Na 3344.0 1683.5 1130.0 853 3 687 2 576.5 H y Na 1672.5 1122.7 547 8 382 8 572.8 1115.3 842 3 678 4 589.2 836 8 674 0 585.5 669 6 561.7 558.0 Análisis de Exopolisacárido (EPS por SUS siglas en inglés) Para preparar las muestras para análisis de exopolisacárido, se extraen las fracciones de sobrenadante con etanol y se precipita el EPS. Las fracciones FHMW y FLMW son combinadas y se agrega a la muestra etanol enfriado con hielo (1.5 veces de volumen de muestra) . Las muestras son mezcladas suavemente por 5 minutos. Tan pronto como el proceso de mezclado termina, la formación de precipitado EPS blanco empieza a agregarse en la capa superior y gradualmente precipita y deposita en la parte inferior del recipiente. Se coloca la solución durante la noche en -20°C y se permite continuar para precipitar. Entonces, la fase de etanol clara en la parte superior es removida cuidadosamente y el EPS precipitado es recolectado por centrifugación adicional (9000 rpm por minuto) .

Para determinación de fructosa, el gránulo que contiene el EPS es incubado con 2 M de ácido trifluoroacético por 2 horas. Bajo estas condiciones, los monómeros de fructosa son liberados totalmente de EPS. Para determinación de glucosa, el granulo que contiene EPS es incubado con 2 M de ácido sulfúrico por 1 hora en 100°C. Bajo estas condiciones, los monómeros de glucosa son totalmente liberados de EPS. Subsecuentemente, se diluyen las muestras y se analizan usando cromatografía de intercambio de aniones de alta resolución con detección amperométrica impulsada (HPAEC-PAD por sus siglas en inglés) . La inulina tratada con ácido trifluoroacético, almidón de papa tratado con ácido sulfúrico y EPS de LB180 tratado con ácido sulfúrico son incluidos como controles de calidad para hidrólisis.

Se analiza el EPS preparado de muestras 1, 2 y 3 y los cromatogramas HPAEC-PAD para fructosa y glucosa son mostrados en la Figura 6A y Figura 6B, respectivamente. Como puede ser observado a partir de los cromatogramas, el tiempo de retención del monómero puede diferir debido al pH de la muestra hidrolizada.

Se muestran los resultados también en la Tabla II. La proporción de fructosa/glucosa se basa en áreas pico de los cromatogramas.

Tabla II Análisis para actividad de enzima proteasa Se mide la actividad proteolítica extracelular de acuerdo a un procedimiento modificado como se describe por Holm, K. A. (determinación colorimétrica automatizada de actividad de proteanasa acida en muestras de fermentación usando un reactivo de ácido trinitrobencensulfónico (1980) Analyst, 105: 18-24) .

El procedimiento es totalmente automatizado usando un auto-analizador Cobas Mira Plus . Se determina la actividad proteolítica de sobrenadantes de cultivo por incubar muestras con 0.5% (p/v) de base N, -dimetilada en amortiguador MES 0.25 m (pH 6) por 17.5 minutos en 37°C. Como un testigo, se incuban muestras sin caseína N, N-dimetilada . Se detiene la reacción por la adición de una solución que contiene Na2S03 1" 1 0.5 g en amortiguador de borato 0.1 M en pH 9.3. Simultáneamente, se agrega ácido 2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBSA por sus siglas en inglés) . TNBSA reacciona con los grupos de aminoácido libres que resultan en un color amarillo, el cual se mide en 405 nm después de 3 minutos. Se usa la glicina como estándar. Se define una unidad de actividad de proteasa como la cantidad de enzima la cual en 1 minuto bajo las condiciones estándar dadas produce absorción en 405 nm igual a 1 µ? de glicina.

Los resultados de la actividad de proteasa para las muestras se dan en la Tabla III.

Tabla III Como se muestra en la Tabla III, se mide ninguna o muy poca actividad de proteasa. Las muestras contienen un alto antecedente de amoniaco enlazado libre o primario. Por consiguiente, las muestras de proteasa son diluidas 3-4 veces para disminuir el antecedente a un nivel aceptable. El resultado final de la actividad de proteasa es el mismo para las muestras diluidas; por lo tanto la dilución no tiene ningún efecto en la actividad de proteasa.

Análisis para la presencia de ácidos grasos de cadena corta Se detectan los compuestos para HPLC acoplado a UV ultravioleta y detección de RI refractivo usando una columna de ácido orgánico (Aminex®, BIO-RAD) con un flujo isocrático de agua acida que contiene H2S0 . Se realiza el análisis en un sistema HPLC Waters Alliance 2695 acoplado a Waters 996 PDA y detector I 2412. Los ácidos grados de cadena corta específicos son cuantificados usando curvas de calibración externas .

La Figura 7 ilustra un cromatograma de ejemplo de análisis HPLC de ácido graso de cadena corta de la muestra 1. Usando curvas de calibración externas, se determina la concentración de los ácidos grasos de cadena corta específicos .

Se da la concentración de ácidos grasos de cadena corta como se determina por HPLC en la Tabla IV.

Tabla IV. Concentración de ácido graso de cadena corta 1E1 límite de detección (LOD por sus siglas en inglés) para ácido succinico es 0.02 mg/ml; debido a las perturbaciones el LOD para estas muestras es 0.56 mg/ml; 3 LOD para ácido propiónico es 0.05 mg/ml; 4 debido a las perturbaciones el LOD para estas muestras es 1.3 mg/ml; 5 LOD para ácido butírico es 0.03 mg/ml.

Los resultados para ácidos grasos de cadena corta muestran concentraciones similares para las muestras 1 y 3, pero concentraciones disminuidas se encuentran en la muestra 2.

Inhibición de Crecimiento de Microorganismos Se analiza la capacidad de Bacillus s btilis Maseca-1 para inhibir el crecimiento del patógeno Grampositivo Micrococcus luteus.

Se agrega 0.3 mi de cultivo de M. Luteus (ATCC 9341) a 500 mi de agar LB líquido, se vacía en cajas de Petri y se permite solidificar. Se cargan los discos de papel (6.0 mm de diámetro) con 5 µ? de muestra y se seca. Después, se colocan los discos en la superficie de agar y se incuban las placas durante la noche en 37°C. Se mide la inhibición de crecimiento como el diámetro de la zona clara alrededor de cada disco de papel. Se toman las mediciones a partir de placas por duplicado (4 discos/placa) . Se prueban las fracciones OECF obtenidas de la muestra 3.

Tabla V. Inhibición de crecimiento de antibióticos de péptido a partir de Bacillus subtilis Maseca-1 1,2 1Los datos son media de dos pruebas repetidas 2Las distancias de inhibición de crecimiento medidas como diámetro (mm) de la zona clara alrededor del disco.

Se analiza también la capacidad del Bacillus subtilis Maseca-1 para inhibir el crecimiento de patógenos Micrococcus luteus, Bacillus cereus y Aspergillus flavus como se describe anteriormente .

Tabla VI. Inhibición de crecimiento de antibióticos de péptido a partir de Bacillus subtilis Maseca-1 en patógenos1'2 ML- Micrococcus luteus ATCC 9341; BC= Bacillus cereus NRLLL ; AF= Aspergillus flavus NRLL 1 Los datos son media de dos pruebas repetidas 2Las distancias de inhibición de crecimiento medidas como diámetro (mm) de la zona clara alrededor del disco .

El aislado Maseca-1 demuestra la capacidad para secretar péptidos los cuales inhiben el crecimiento de microorganismos patogénicos.

De acuerdo a varias modalidades de la invención, se proporcionan cultivos biológicamente puros de Bacillus subtilis . La cepa Maseca-1 de Bacillus subtilis ha sido depositada bajo número de acceso ATCC PTA-8831.

Los cultivos de Bacillus subtilis Maseca-1 son capaces de producir proteínas y/o antibióticos secretados de péptido que tienen actividad antimicrobiana (por ejemplo lantibióticos) . Estos péptidos y proteínas de estructura lineal o globular secretados son útiles en composiciones de acuerdo a la presente invención. Los cultivos de células a partir de Maseca-1 pueden ser cosechados y los sobrenadantes de cultivo recolectados, por ejemplo, por filtración (sobrenadante filtrado) , precipitación diferencial, o centrifugación (sobrenadante libre de células) y el sobrenadante resultante puede contener actividades antimicrobianas útiles en una composición antimicrobiana.

La cepa Maseca-1 puede secretar una o más proteínas o péptidos que inhiben el crecimiento de microorganismos, incluyendo bacterias Gram positivas y Gram negativas, mohos y levaduras. Por ejemplo, la proteína o péptido secretados pueden inhibir el crecimiento de patógenos Grampositivos Micrococcus luteus y Bacillus cereus y de Aspergillus flavus.

El Bacillus subtilis Maseca-1 puede ser activo contra bacterias Gram negativas y Gram positivas, así como también mohos y levaduras, los cuales son flora de descomposición común en alimentos. Muchas bacterias Gram negativas como Salmonella, Shigella, ciertos tipos serológicos de Escherichia y similares son patógenos transportados en alimentos. Las bacterias Gram positivas, como Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens y similares pueden provocar envenenamiento de alimentos .

De acuerdo a varias modalidades, la presente invención también se relaciona a un método para inhibir microorganismos indeseables en un material que contienen o expuesto a los microorganismos. El método incluye exponer el material a un inhibidor de los microorganismos indeseados obtenidos a partir de Bacillus subtilis Maseca-1 de tal forma que los microorganismos indeseados en el material son inhibidos. El material a ser protegido puede ser, por ejemplo, un material en contacto con un alimento. El alimento puede ser cualquier animal, particularmente mamíferos.

El Bacillus subtilis Maseca-1 puede estar vivo o no vivo. Si está vivo, Maseca-1 puede ser congelado o liofilizado o de otra forma secado para conservación. La inhibición de crecimiento de microorganismos puede ser producida por un componente de Maseca-1 y de esta forma Maseca-1 puede no estar vivo. Puede ser sonicado o de otra forma alterado para recuperación y conservación de fracción de pared celular antes al uso. Todas estas variaciones son conocidas para aquellos expertos en la técnica.

De acuerdo a varias modalidades de la invención, el Bacillus subtilis Maseca-1 puede ser usado para controlar el crecimiento de mohos en granos, por ejemplo en grano almacenado, y en legumbres, y en cultivos bajo tierra como cacahuetes. El tratamiento puede ser usado para evitar formación de micotoxina (por ejemplo aflatoxinas y fumonisinas) en varios granos de cereal, legumbres y cacahuetes .

Uno de los mayores problemas en la distribución y venta de tortillas es la aparición de manchas de moho y parches de decoloración de moho en tortillas empacadas. De acuerdo a varias modalidades, Maseca-1 puede ser agregado a la masa de maíz y trigo y usado para controlar moho y crecimiento bacteriano, por ejemplo, en tortillas y panes planos. Pueden ser usadas preparaciones similares para varios panes, panes planos, bienes horneados y similares, donde la pasta es el material de partida. Maseca-1 puede ser usado para inhibir los mohos y bacterias, extendiendo la vida media, y conservando la pasta durante el manejo o transportación a un sitio de horneado. Maseca-1 puede también ser usado para suprimir el moho y bacterias y extender la vida media en productos lácteos como leche, crema, dispersiones lácteas y queso.

Puede ser aplicado Bacillus subtilis Maseca-1 a materiales de empaque para suprimir la microflora de alimentos. Maseca-l puede ser de esta forma usado para tratar películas, alojamientos y otros materiales de empaque para controlar el crecimiento de mohos y bacterias en varios productos alimenticios como panes, quesos, salchichas, vegetales, frutas y similares.

De acuerdo a varias modalidades de la invención, Bacillus subtilis Maseca-1 puede producir biopolímeros naturales como fructano de alto peso molecular y ramificado hecho de unidades de fructosa enlazadas por enlaces de ß- (2, 6) - fructofuranósido y enlaces de inulina ß-(2,1).

De acuerdo a varias modalidades, el Bacillus subtilis Maseca-1 puede producir la enzima levan sucrasa, por ejemplo, ß- (2,6) fructano-D : glucosa-1-fructosiltransferasa (E. C.2.4.1.10) .

La presente invención también contempla el uso de Bacillus subtilis Maseca-1 como un probiótico para controlar biológicamente varias infecciones microbianas en el tracto intestinal. Ya que el Bacillus subtilis forma esporas resistentes al calor, esta especie es particularmente útil para hacer composiciones farmacéuticas para tratar infecciones microbianas . Las formulaciones que incluyen esporas de Maseca-1 viables en un portador aceptable farmacéuticamente pueden ser utilizadas para hacer y usar tanto composiciones profilácticas y terapéuticas.

De acuerdo a varias modalidades, una composición probiótica contiene Bacillus subtilis Maseca-1 viable. La composición puede también incluir un portador como un portador aceptable farmacéuticamente para administración oral para el tracto digestivo de un sujeto. La composición puede incluir Maseca-1 en la forma de células y/o esperas vegetativas. En otra modalidad, la invención proporciona incluir Maseca-1 en una composición en la forma de una masa celular seca, una pasta estabilizada, o un gel estabilizado.

Ya que las esporas de Bacillus son resistentes al calor y presión y pueden ser almacenadas como un polvo seco, son particularmente útiles en la formulación y fabricación de productos como varios productos horneados (por ejemplo tortillas y panes planos y similares) . Bacillus subtilis Maseca-1 es bien adecuado para la presente invención, teniendo la capacidad para formar esporas las cuales son relativamente resistentes a calor y otras condiciones, haciéndolas ideales para mejorar el almacenamiento (es decir, vida media) de productos alimenticios. Por ejemplo, Bacillus subtilis Maseca-1 puede sobrevivir al almacenamiento por dos o más años .

De acuerdo a varias modalidades, Bacillus subtilis Maseca-1 está presente en la composición probiótica o producto horneado en una concentración de 103-1012 células viables/g, por ejemplo concentraciones de 105-107 células viables/g, 108-109 células viables/g ó 109-1010 células viables/g.

En algunas modalidades, la composición probiótica también contiene por lo menos una enzima digestiva, por ejemplo, amilasa, pululanasa, proteasa, fitasa, xilanasa, glucanasa, levanasa o galactosidasa.

En algunas modalidades de la composición probiótica, las células vegetativas y/o esporas pueden ser encapsuladas o recubiertas en un polímero biodegradable o bioreadsorbible con el fin de protegerlas contra enzimas digestivas y condiciones en el tracto digestivo.

En otra modalidad, se proporciona una composición que incluye un producto extracelular de Bacíllus subtilis Maseca-1 en un portador aceptable farmacéuticamente para administración oral a un humano. En una modalidad, el producto extracelular es un sobrenadante o filtrado de un cultivo de Maseca-1. El producto extracelular puede ser, por ejemplo, lévanos, enzimas y/o lantibióticos .

La presente invención contempla un método para tratar, reducir o controlar las infecciones gastrointestinales bacterianas usando una composición o sistema profilácticos y/o terapéuticos que incluyen el Bacillus subtilis Maseca-1. Estos métodos pueden inhibir crecimiento bacteriano patogénico asociado con infecciones gastrointestinales y también reducen los síntomas de estas 3 infecciones patogénicas. Ya que Bacillus subtilis son generalmente vistos como seguros por aquellos expertos en la técnica, son muy adecuados para ingestión en productos alimenticios o como un complemento alimenticio.

Otra modalidad . de la invención proporciona un método para modular la digestión en un humano o un animal por administrar oralmente al humano o animal una composición alimenticia probiótica que tiene Bacillus subtilis Maseca-1 en una cantidad suficiente para obtener un nivel deseado de modulación. La modulación puede, por ejemplo, mejorar la ingesta de nutrientes, reducir patógenos o mejorar el crecimiento de microorganismos comensales benéficos .

De acuerdo a varias modalidades, un método para prevenir o tratar una infección gastrointestinal bacteriana en un humano o animal comprende las etapas de administrar oralmente a un sujeto humano o animal una formulación alimenticia o de bebida que contiene unidades formadoras de colonias viables de Bacillus subtilis Maseca-1, y permitir a la bacteria crecer en el tracto gastrointestinal del sujeto. En una modalidad, las unidades formadores de colonias viables son esporas de Maseca-1. La Maseca-1 puede reducir trastornos provocados por agentes infecciosos, como especies Staphylococcus aureus, S. Epidermidis, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Pseudo onas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Clostridium incluyendo C. Perfingens, C.

Difficile, C. Botulinum, C. Tributrycum, y C. Sporogenes, B. Cereus patogénicos, Gardnerella vaginalis, Propionibacterirum acnés, Aeromonas hydrophilia, Aspergillus sp incluyendo A. flavus y A. Níger, Proteus, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Yersinia y Campylobacter.

Los efectos probióticos de Bacillus subtilis Maseca-1 pueden ocurrir ya que el microorganismo coloniza la mucosa de la pared intestinal y compite con los patógenos potenciales. El probiótico Bacillus subtilis Maseca-1 puede también producir i) ácidos orgánicos y carboxílicos como ácidos grasos de cadena corta los cuales muestran actividad antimicrobiana hacia muchos microorganismos, y disminuye el pH y el potencial redox en el intestino, creando condiciones subóptimas para patógenos, ii) metabolitos como proteínas (es decir, enzimas) y exopolisacáridos (es decir lévanos y glucanos) los cuales son antagonistas para algunos patógenos a través de la inhibición de su capacidad para tomar nutrientes e iones o su adhesión a células de mucosa intestinal, y iii) bacteriocinas y productos similares a bacteriocina (es decir lantibióticos) los cuales ejercen sus efectos por alteración de sistemas de producción de energía, síntesis de macromolécula y permeabilidad de membrana.

Será reconocido por un experto ordinario en la técnica que el probiótico Bacillus subtilis Maseca-1 puede ser encontrado en la forma de esporas, o acompañado por esporas microbianas. En general, las esporas bacterianas son de pared gruesa, de forma latente las cuales son capaces de sobrevivir' a condiciones desfavorables. Estos adjuntos dietéticos o microbianos alimentados directos pueden completar su ciclo de vida entera dentro del tracto gastrointestinal, iendo de espora a célula vegetativa y esporulando otra vez.

Otra modalidad de la invención proporciona una nueva formulación de complemento alimenticio animal o complemento microbiano vivo en base a efectos benéficos sinergíticos y/o adicionales como probióticos, prebióticos y otros ingredientes como enzimas, vitaminas y minerales. La formulación puede ser, por ejemplo, un complemento nutricional en forma de polvo que contiene un sistema probiótico de Bacillus subtilis Maseca-1, componentes prebióticos (por ejemplo, oligómeros no digeribles de fructosa, glucosa y galactosa o ácidos de azúcar y alcoholes) y enzimas. El complemento nutricional en polvo puede contener de aproximadamente 103-1012 organismos viables/gramo, por ejemplo, aproximadamente 108 organismos viables/gramo.

La presente invención también incluye métodos para mejorar la capacidad de digestión intestinal, proporción de crecimiento, y conversión alimenticia de varias especies animales por incorporar el complemento alimenticio anterior en la dieta animal . Las especies animales- incluyen pero no se limitan a vacas, cerdos, pollos y pavos. La microbiota intestinal del animal de huésped puede ser modulada por tanto introducir el Bacillus subtilis Maseca-1 y/o por estimular Maseca-1 endógeno con prebióticos.

De acuerdo a otra modalidad, la presente invención se relaciona a una composición simbiótica que incluye Bacillus subtilis Maseca-1 viable. La composición simbiótica puede ser usada, por ejemplo, en combinación con oligosacáridos bifidogénicos y lactobacilogénicos que son particularmente útiles para promover preferentemente el crecimiento de Bacillus subtilis Maseca-1. Estos oligosacáridos incluyen fructooligosacáridos (FOS por sus siglas en inglés) a partir de levano ramificado e inulina lineal, galactooligosacáridos (GOS por sus siglas en inglés) , xilooligosacáridos (XOS por sus siglas en inglés) , ácidos de azúcar (ácido glucurónico y galacturónica) , alcoholes de azúcar (lactxtol y xilitol) y otros polímeros de cadena larga (lignina y glicoproteínas) que no son fácilmente digeridos por bacterias patogénicas. El crecimiento preferencial es promovido debido a los requerimientos de nutrientes de Bacillus subtilis Maseca-1 como se compara con bacterias patogénicas. Las bacterias dañinas como Clostridium, Staphylococcus, Salmonella y E. coli no pueden metabolizar FOS, GOS, XOS u otros oligosacáridos bifidogénicos y lactobacilogénicos y por lo tanto uso de estos oligosacáridos en combinación con Bacillus subtilis Maseca-1 permite que estas bacterias benéficas y probióticas crezcan y reemplacen los microorganismos indeseables o patogénicas.

Los oligosacáridos bifidogénicos y lactobacilogénicos pueden ser usados ya sea solos o en combinación con Bacillus subtilis Maseca-1 en una composición simbiótica o profiláctica y terapéutica. Es decir, debido a la actividad promovente de crecimiento de oligosacáridos bifidogénicos y lactobacilogénicos, la invención contempla una composición que comprende un oligosacárido bifidogénico y lactobacilogénico en una cantidad promovente de crecimiento de Bacillus . Estas cantidades pueden variar ampliamente ya que el probiótico responderá a cualquier cantidad metabólica de oligosacárido nutriente, y por lo tanto la invención no necesita ser limitada.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se declara como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un cultivo biológicamente puro aislado de Bacillus subtilis Maseca-1 caracterizado porque se deposita bajo el número de acceso ATCC PTA-8831.

2. El Bacillus subtilis Maseca-1 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Maseca-1 está en una forma de células vegetativas, o una combinación de los mismos .

3. Un péptido producido por el Bacillus subtilis Maseca-1 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene actividad antimicrobiana .

4. El péptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque tiene actividad antimicrobiana contra Micrococcus luteus, Bacillus cereus y Aspergillus flavus.

5. Una composición probiótica caracterizada porque comprende el Bacillus subtilis Maseca-1 de conformidad con la reivindicación 1.

6. Un método para inhibir microorganismos no deseados en un material que contiene o expuesto a los microorganismos, caracterizado porque comprende exponer el material a una cantidad efectiva de un inhibidor de los microorganismos no deseados, el inhibidor que es un cultivo biológicamente puro del Bacillus subtilis Maseca-1 de conformidad con la reivindicación 1.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el material es un producto alimenticio .

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el material es un producto alimenticio horneado.

9. Un método para tratar una infección gastrointestinal bacteriana en un humano o un animal, caracterizado porque comprende: administrar oralmente a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende células viables de Bacillus subtilis Maseca-l de conformidad con la reivindicación 1; y permitir al Bacillus subtilis Maseca-1 crecer en el tracto gastrointestinal del sujeto, por lo mismo reduciendo la infección gastrointestinal bacterial.

10. Un producto alimenticio caracterizado porque comprende el Bacillus subtilis Maseca-1 de conformidad con la reivindicación 1.

11. El producto alimenticio de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende una composición horneada de un almidón comestible.

12. Un método para modular la digestión en un humano o animal caracterizado porque comprende administrar oralmente al humano o animal la composición probiótica de conformidad con la reivindicación 5, en una cantidad suficiente para obtener un nivel deseado de modulación.

13. Una composición simbiótica caracterizada porque comprende el Bacillus subtilis Maseca-1 de conformidad con la reivindicación 1, en combinación con por lo menos un oligosacárido bifidogénico o lactobacilogénico que no es fácilmente digerido por bacterias patogénicas y que promueve el crecimiento de Maseca-1.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el por lo menos oligosacárido bifidogénico o lactobacilogénico se selecciona del grupo que consiste de: fructooligosacáridos (FOS) , galactoolisacáridos (GOS) , xilooligosacáridos (XOS) , ácidos de azúcar, alcoholes de azúcar y polímeros de cadena larga.

15. Un cultivo biológicamente puro aislado de bacterias Bacillus subtilis caracterizado porque es aislado de pericarpio de maíz entero nixtamalizado, las bacterias secretan por lo menos una proteína de antibióticos y antibióticos de péptido que tienen actividad antimicrobiana.