KR20110138595A - 야관문 추출물 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저빌에서 허혈 유발시 나타나는 해마조직의 CA1영역의 신경세포의 손상을 예방하거나 개선하는 작용을 가지며 뇌허혈시 신경세포 손상 억제 및 개선 활성이 우수한 야관문 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로서,
야관문의 잎, 뿌리 또는 줄기를 채취한 후 영양상태가 좋고 불순물이 없는 것을 선별하여 물로 세척한 후 건조하여 세절하는 제 1 과정; 건조상태의 야관문을 곱게 파쇄한 후 35 ~ 950%농도의 식음용 에틸 에탄올에 3 내지 6개월 동안 침전시켜고 50℃에서 2시간 동안 알콜추출하는 제 2 과정; 상기 제 1 과정이 이루어진 후, 상기 에탄올에 녹아 나온 야관문추출액을 회전 증발기 또는 감압농축기을 통해 농축하여 에탄올 성분을 완전히 제거하고 야관문을 농축하는 제 3 과정; 상기 제 2 과정이 이루어진 후, 동결건조기를 이용하여 48시간 동안 수분을 완전히 제거하여 추출물을 만드는 제 4 과정; 추출액을 회수하고, 회수된 추출액에 포함된 에탄올을 증류 소멸시키면서 살균하기 위해 에탄올 비등점(78.3℃) 이상으로 고온살균하는 제 5 과정; 및 상기 완성된 추출물의 1/10을 10㎖의 물에 녹인 것을 원액(98㎎ 추출물/㎖ water)으로 하여 원액의 1/10 혹은 1/100 희석액(0.98㎎ 추출물/㎖ water)을 이용하는 제 6 과정;을 포함하는 야관문 추출물 및 이를 이용한 조성물을 제공하기 위한 것이다.

Description

야관문 추출물 및 이를 포함하는 조성물{EXTRACTING MATERIAL OF Lespedeza cuneata AND COMPOSITE MATERIAL CONTAIN OF THEREOF}

본 발명은 야관문 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 뇌허혈시 신경세포 손상 억제 및 개선 활성이 우수한 야관문 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저빌에서 허혈 유발시 나타나는 해마조직의 CA1영역의 신경세포의 손상을 예방하거나 개선하는 작용을 가지는 야관문 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 야관문(夜關門)은 쌍떡잎식물 장미목 콩과의 반관목로서 콩과에 딸린 여러해살이 풀로서, 우리말로는 비수리(Lespedeza cuneata)라 하며, 한자로는 절엽철소추(截葉鐵掃?), 야관문(夜關門), 삼엽초(三葉草), 야계초(野鷄草), 반천뢰(半天雷), 폐문초(閉門草), 공모초(公母草), 음양초(陰陽草), 백관문초(白關門草), 야폐초(野閉草) 등의 여러 이름이 있다. 야관문은 밤에 빗장을 열어 주는 약초라는 뜻이니 그 이름이 묘하다. 이것을 먹으면 천리 밖에서도 빛이 난다고 하여 천리광(千里光)이라고도 한다. 또 큰 힘을 나게 한다 하여 대력왕(大力王)이라고도 하며, 뱀을 쫓는다고 하여 사퇴초(蛇退草)라는 이름도 있다. 야관문은 흔한 풀이다. 새로 찻길을 닦느라고 깍아낸 비탈 같은 곳에 무리지어 자란다.

즉, 야관문(夜關門)은 콩과에 속하는 다년생초이며, 키는 1m 정도이고 반관목처럼 보인다.

잎은 3장의 잔잎으로 이루어진 겹잎으로 어긋난다. 잎보다 작은 연한 노란색 꽃이 늦여름부터 이른 가을에 걸쳐 잎겨드랑이에 2~4송이씩 무리지어 피며 때때로 꽃이 벌어지지 않는 폐쇄화가 달리기도 한다. 줄기는 엮어 광주리를 만드는 데 썼고, 중국에서는 한방에서 거담·기관지염을 치료하거나 강장제로 사용하기도 한다.

주로 우리 나라 각처의 들에서 자생하며 일본과 중국, 대만 등지에도 분포한다. 가축 사료 및 빗자루 재료 과거황폐지의 지피물 조성과 지력증진 식물로 사방조림지에 파종한 바도 있다.

야관문의 약효로는 肝(간), 腎(신)을 補(보)하고 肺陰(폐음)을 補益(보익)하며 散瘀(산어), 消腫(소종) 효능이 있으며, 遺精(유정), 遺尿(유뇨), 白濁(백탁), 白帶(백대), 喘哮(천효), 胃痛(위통), 勞傷(노상), 小兒疳積(소아감적), 下痢(하리), 타박상, 시력감퇴, 目赤(목적-결막염), 急性乳腺炎(급성유선염)을 치료로 사용되며, 그 성분은 피니톨(pinitol), 플라보노이드(flavonoid), 페놀(phenol)성(性) 성분, 탄닌(tannin) 및 베타-시토스테롤(β-sitosterol)을 함유한다. 상기 플라보노이드(flavonoid)에서는 키어세틴(quercetin), 캠프페롤(kaempferol), 비테신(vitexin), 오리엔틴(orientin) 등으로 분리된다.

야관문의 맛은 쓰고 약간 매우며, 성질은 평하고 독이 없다. 폐와 간, 콩팥에 주로 작용한다. 간과 콩팥을 튼튼하게 하고 어혈을 없애며 부은 것을 내리게 한다. 몽정, 대하, 설사, 타박상, 천식을 낫게 하고 눈을 밝게 하며 근육과 힘줄을 부드럽게 하며 혈액순환이 잘 되게 한다. 또 열을 내리고 뱃속에 있는 벌레를 죽이며 유방에 생긴 종기, 뱀에 물린 상처, 눈이 빨갛게 충혈된 것을 치료하며, 위궤양, 탈항에도 효과가 있다.

야관문의 잎, 뿌리, 줄기에는 플라보노이드, 피니톨, 페놀, 탄닌, 시토스테롤 등이 있는데, 이들 성분이 염증을 없애고 가래를 삭이며 황색포도상구균, 폐렴상구균, 연쇄상구균, 카타르구균 등을 죽이거나 억제한다.

또한, 야관문을 9-10월에 채취하여 잘 게 썰어 그늘에서 말려 약으로 쓰기도 하고, 신선한 것을 그대로 약으로 쓸 수도 있다. 말린 야관문 80그램에 물 한되(1.8리터)를 붓고 약한 불로 천천히 달여서 100밀리리터쯤 되게 농축하여 설탕을 약간 넣고 한 번에 50밀리리터씩 아침, 저녁으로 하루 두 번 밥먹고 나서 먹는다. 10일 동안 복용하기를 몇차례 반복한다. 야관문은 기관지염이나 기관지 천식을 기침을 심하게 하고 가래가 많이 나오는 데에도 뛰어난 효과가 있다. 3-4일 만에 효과가 나타나는 사람도 있고 10일 이상 지나야 조금씩 효과가 나타나는 사람도 있다. 약을 먹는 동안 일종의 명현반응으로 현기증이 나거나 속이 메스꺼우며 구토가 나고 설사를 하며 잠을 잘 자지 못하고 입 안이 허는 등의 증상이 나타날 수 있으나 며칠 지나면 저절로 없어진다. 증상이 가벼운 사람일수록 효과가 빠르고 증상이 몹시 심한 사람도 잘 듣는다. 80퍼센트 이상이 낫거나 호전된다.

또한, 야관문 40그램과 꿀 약간에 물 1리터를 붓고 약한 불로 한 시간 가량 달여서 하루 두세 번에 나누어 밥 먹고 나서 먹는다. 혹은 가을철에 야관문 씨를 받아 가루 내어 한 번에 4-5그램씩 먹거나 가루를 꿀로 알약을 만들어 먹는다. 야관문을 오래 먹으면 눈이 밝아지고 눈병에 잘 걸리지 않으며, 야관문의 뿌리, 잎, 줄기 말린 것 100그램을 잘 게 썰어 물 1.2리터에 넣고 200밀리리터가 되게 농축하여 고운 천으로 거른다. 이것을 3-5시간마다 어른은 50밀리리터씩, 아이나 노인, 허약한 사람은 어른 양의 반이나 3분의 2쯤으로 줄여서 계속 먹는다. 하루나 일주일 사이에 설사, 급성위염에 효능이 있는 것으로 알려지며, 야관문 30~50그램에 오골계 살코기를 적당하게 넣고 은근한 불로 푹고아서 먹는다. 아니면 하루에 말린 야관문 40~80그램에 물 한되를 붓고 물이 반으로 줄어들 때까지 달여서 수시로 차 대신 마신다. 야관문은 당뇨병의 혈당치를 낮추는 데에도 상당한 효력이 있으며, 야관문 뿌리 40~80그램, 꿀 30그램에 물 1리터를 붓고 약한 불로 달여서 하루 두세 번에 나누어 먹는다. 야관문 씨를 가루내어 한 번에 4~5그램씩 하루 두세 번 먹으면 기력부족, 허약체질에 개선이 되는 효능도 있고, 야관문 뿌리 30-40그램에 물 한 되를 붓고 절반이 되게 달여서 하루 두 번에 나누어 먹는다. 야관문은 신경쇠약에도 좋은 효험이 있는 것으로 알려져 있다.

그러나, 종래의 야관문는 잎과 줄기에 함유된 여러가지 맛과 향 중에서 쓰고 매운 맛과 거부감이 가는 향으로 인하여 그 자체로서는 먹기가 어려울 뿐만 아니라 차(茶)로 사용하기가 어려웠기 때문에 주로 다른 한약재에 첨가하여 환(丸)으로 사용되거나 또는 다른 식품류에 혼합되어 제조됨으로써 깨국수(특허등록 제10-0821613호), 부침 반죽 조성물(공개특허공보 공개번호 제2007-0056329호), 야관문 에탄올 추출물을 포함하는 발기부전 및 남성 성기능의 치료와 예방을 위한 약학 조성물(공개특허공보 공개번호 제07-0117299호) 등으로 활용되어 왔었다.

연구에 따르면 야관문이 뇌허혈성의 효능 및 작용에 따라 연구를 거듭한 결과, 야관문의 잎, 뿌리, 줄기에서 추출한 유효한 추출물을 주요성분으로 하고 신경세포의 손상을 예방, 개선하는 작용을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 그 목적은 뇌허혈에 의한 신경세포 손상을 억제하는 활성이 우수한 야관문 추출물 및 이를 포함하는 조성물은 저빌에 뇌허혈(ischemia) 유발시 나타나는 신경세포사를 예방하거나 개선한 결과를 보여주어 사람의 혈관성치매 및 뇌졸중을 예방하거나 이미 진행되어진 혈관성치매 및 뇌졸중을 개선하거나, 혈관성치매 및 뇌졸중 개선용 약제, 기능성 식품 및 그에 파생되는 소재를 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따르면, 야관문의 잎, 뿌리 또는 줄기를 채취한 후 영양상태가 좋고 불순물이 없는 것을 선별하여 물로 세척한 후 건조하여 세절하는 제 1 과정; 건조상태의 야관문을 곱게 파쇄한 후 35 ~ 950%농도의 식음용 에틸 에탄올에 3 내지 6개월 동안 침전시켜고 50℃에서 2시간 동안 알콜추출하는 제 2 과정; 상기 제 1 과정이 이루어진 후, 상기 에탄올에 녹아 나온 야관문추출액을 회전 증발기 또는 감압농축기을 통해 농축하여 에탄올 성분을 완전히 제거하고 야관문을 농축하는 제 3 과정; 상기 제 2 과정이 이루어진 후, 동결건조기를 이용하여 48시간 동안 수분을 완전히 제거하여 추출물을 만드는 제 4 과정; 추출액을 회수하고, 회수된 추출액에 포함된 에탄올을 증류 소멸시키면서 살균하기 위해 에탄올 비등점(78.3℃) 이상으로 고온살균하는 제 5 과정; 및 상기 완성된 추출물의 1/10을 10㎖의 물에 녹인 것을 원액(98㎎ 추출물/㎖ water)으로 하여 원액의 1/10 혹은 1/100 희석액(0.98㎎ 추출물/㎖ water)을 이용하는 제 6 과정;을 포함하는 야관문 추출물을 제공하는데 있다.

이때, 본 발명의 부가적인 특징에 따르면, 상기 추출물은 물 또는 알코올 등의 유기 용매를 이용하여 추출되거나, 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 분획물로 추출되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 부가적인 특징에 따르면, 상기 추출물은 신경유래세포(PC12 세포)의 세포배양 처리에 따라 항허혈 활성을 갖는 물질에 대하여 혈관성 치매 및 뇌졸중의 원인이 되는 허혈의 발생을 저빌에서 뇌허혈에 의한 뇌신경 세포 손상의 예방 또는 개선하도록 구성되는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 야관문 추출물 및 이를 포함하는 조성물은 뇌허혈에 의한 신경세포 손상을 억제하는 활성이 우수한 야관문 추출물 및 이를 포함하는 조성물은 저빌에 뇌허혈(ischemia) 유발시 나타나는 신경세포사를 예방하거나 개선한 결과를 보여주어 사람의 혈관성치매 및 뇌졸중을 예방하거나 이미 진행되어진 혈관성치매 및 뇌졸중을 개선할 수 있다.

또한, 혈관성치매 및 뇌졸중을 예방 및 개선시킬 수 있는 야관문 추출물을 이용하여 혈관성치매 및 뇌졸중 개선용 약제, 기능성 식품 및 그에 파생되는 소재를 개발 공급할 수 효과가 있다.

또한, 야관문은 식물의 뿌리에서 제공되는 것이므로 농민들에게 경쟁력 있는 고소득 작물로 제시하여 농민들의 소득 증대 및 국가경제 발전을 유도할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 조성물과 인삼, 꽃게의 유효성분과 혼합한 충진물을 통해 플라보노이드, 탄닌, 페놀 등을 함유하여 혈압강하, 이뇨, 시력보호, 혈행개선, 소염작용 등에 효능이 있는 기능성 초콜릿을 제조에 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 야관문의 뿌리, 잎부의 각 분획물을 제조하는 과정을 나타낸 도면
도 2 내지 도 3은 본 발명의 바람직한 일실시예의 PC12 세포에서 MTT 분석법 (세포생존률 분석)을 통한 약초추출물의 허혈에 의한 세포사를 억제하는 효과를 보여주는 그래프
도 4는 본 발명의 일 실시예의 저빌뇌의 해마를 cresyl violet 시약으로 염색 후 CA1영역의 신경세포가 허혈에 의해 죽은 것을 나타내어주는 도면
도 5는 본 발명의 일 실시예의 저빌에서 허혈유발시 야관문에 의해 허혈에 의한 신경세포사가 억제되는 것을 나타내는 도면
도 6는 도 5의 저빌에서 허혈유발시 야관문에 의해 세포사가 억제되는 것을 확대하여 보여주는 그림

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 야관문 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 식품이나 약제에 함유될 수 있다. 약제로 제조되는 경우 약제학적으로 허용되는 1종 이상의 담체에 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)는 모두 사용가능하다.

상기 조성물의 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있으며, 예컨대 1일 다음의 양 [세포배양 실험의 경우는 추출물 원액(37.2mg 추출건조물/ml water)의 1/100로 희석하여(0.372 mg추출건조물/ml water) 10ml의 배지에 1ml이 투여되었으며(372 ㎍ 추출건조물/ml 배지) 저빌에 투여량은 원액(37.2 mg추출건조물/ml water) 0.5 ml을 복강 투여 하였으므로 Kg 당 93mg 70kg의 성인의 경우 1일 6.5g 투여]으로 경구 투여할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 또한 투약 단위의 제형들을 포함한다. 제형은 개별 투약 형태, 예를 들면 캡슐제, 좌약 및 앰플제로 존재할 수 있다.

본 발명의 야관문 추출물을 포함하는 조성물은 기능성 식품 또는 약품에 첨가될 수 있으며 이러한 기능성 식품이나 약품의 종류는 특별히 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 제시한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 야관문 추출물 제조

본 발명의 야관문 추출물의 신규화합물 분리방법은

1) 야관문의 잎, 뿌리 또는 줄기를 채취한 후 영양상태가 좋고 불순물이 없는 것을 선별하여 물로 세척한 후 건조하여 세절하는 단계;

2) 건조상태의 야관문을 곱게 파쇄한 후 35 ~ 950% 농도의 식음용 에틸 에탄올에 3 내지 6개월 동안 침전시켜고 50℃에서 2시간 동안 알콜추출하는 단계;

3) 상기 에탄올에 녹아 나온 야관문추출액을 회전 증발기 또는 감압농축기를 통해 농축하여 에탄올 성분을 완전히 제거하고 야관문을 농축하는 단계와

4) 동결건조기를 이용하여 48시간 동안 수분을 완전히 제거하여 추출물을 만드는 단계와,

5) 추출액을 회수하고, 회수된 추출액에 포함된 에탄올을 증류 소멸시키면서 살균하기 위해 에탄올 비등점(78.3℃) 이상으로 고온살균하는 단계를 포함한다.

단계 3에서 감압농축기 (EYELA Co. Japan)를 이용하여 유기용매를 증발시켜 농축한 후 동결건조기 (EYELA Co. Japan)로 동결건조하여 수분을 제거하였다.

부가적으로 증발기 또는 감압농축기 등 농축추출액을 제조하는데 사용되는 통상적인 방법 중 어느 하나로 수행할 수 있으며 농축의 범위는 에탄올을 증발시켜 분리하는데 까지이며 농축과정을 거치면서 물과 비수리 유효성분이 녹아 있는 농축액을 얻을 수 있으며 농축목표에 따라 에탄올의 농도를 달리하며 필요에 따라서는 에탄올을 일정량 함유한 농축액을 만들 수 있으며, 농축 과정에서 증발하는 에탄올은 냉각 장치를 통과시켜 회수한다.

상기에 의해 야관문 추출물을 실험을 위해 보다 구체적으로

건조상태의 야관문 100g을 곱게 마쇄한 후 70% 식음용 주정 에탄올로 50℃에서 2시간 동안 추출 후 에탄올에서 녹아 나온 성분을 받아 진공회전증발기를 이용하여 에탄올 성분을 완전히 제거하고 농축하였다. 이후 동결건조기를 이용하여 48시간동안 수분을 완전히 제거한 추출물(9.8 g)을 만들었다. 이렇게 완성된 추출물의 1/10을 10ml의 물에 녹인 것을 원액(98 mg 추출물/ml water)으로 하여 원액의 1/10, 1/100 희석액(0.98 mg 추출물/ml water)을 이하 실험에 사용하였다.

실시예 2 신경세포를 이용한 허혈이후 세포사의 변화

가. PC12 cell 의 세포배양

PC12 신경유래세포의 세포배양을 이용하여 허혈 유발 후 MTT analysis를 통하여 세포생존률을 측정하였다. PC12 cell의 세포배양 방법으로는 PC12 신경유래세포를 트립신-EDTA로 배양함에 의하여 1:4로 희석률(2의 분열 수에 해당)로 새 페트리 디쉬(10 mm 지름)로 바꾸어 주면서 연속적으로 수를 늘리면서 다량으로 계대 배양하고, 배양액은 RPMI1640-5% 소 태아 혈청 10% 말 혈청(페니실린-스트렙토마이신 포함)을 배지로 사용하고 37℃, 5% CO2에서 매 3일 간격으로 배지를 교체하였다.

나. 허혈 유발이후 신경세포의 세포사 변화 분석

PC12 cell의 배양에 허혈(hypoxia)을 혐기성 배양기를 사용함으로써 유발한 다음 세포사를 MTT analysis에 의해 분석하였다. MTT analysis는 허혈을 준후에 배지를 제거한 후 암실에서 10mg / ml의 농도로 MTT (2-(4,5-demethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)를 1시간동안 처리하여 570 nm 의 파장에서 흡광도 값을 측정한다. 이 PC12 세포배양에서 MTT analysis를 이용하여 여러 가지 추출물의 항허혈 능력을 조사한 결과 야관문, 복분자, 유근피, 건지황, 숙지황이 허혈에 의한 세포사로부터 세포생존률을 증가시키는 결과를 주었다(그림 2, 3 ).

실시예 3 실험동물을 사용한 항허혈 효능 분석

PC12 세포를 이용한 항허혈 활성을 갖는 물질의 검색실험에서 항허혈 효과가 있는 것으로 측정된 추출물에 대하여 저빌에서 뇌허혈에 의한 뇌신경세포손상의 예방 및 개선 효능을 분석하였다.

가. 실험동물의 사육 및 투여방법

체중 66-77 g의 수컷과 암컷 Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) 60 마리를 사용하였다. 실험동물들을 오전 7시부터 오후 7시까지 빛을 가하는 일정한 명암주기 하에서 온도 23± 2 ℃와 상대습도를 55± 10%로 사육하였으며, 음식과 물은 자유로이 섭취하게 하였다.

실험은 추출한 복분자, 야관문, 유근피, 건지황, 숙지황을 허혈유발 전 30분 또는 허혈유발 후 30분에 식도용 바늘을 이용하여 0.5 ml를 경구투여 하였다. 대조군으로는 식염수를 투여하였다.

나. 허혈의 유발

질소와 산소가 7 : 3으로 혼합된 gas에 3% isoflurane (Baxtor, USA)으로 전신마취를 유도한 후, 2.5% isoflurane으로 마취를 유지하면서 수술을 수행하였다. 목 부위의 털을 깎고 소독한 다음 절개를 하여 양쪽 온목동맥(common carotid arteries)을 노출시키고 aneurysm clip (Staelting, USA)을 이용하여 5 분 동안 결찰하여 허혈을 일으킨 후 aneurysm clip을 제거하여 재관류시켰으며, 대조군은 혈관의 결찰을 하지 않았으며, 수술 과정은 동일하게 시행하였다. 각 실험군은 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 망막중심동맥(central artery of retina)의 혈액 순환 유무를 관찰하여 완전한 온목동맥의 폐쇄를 확인하였다. 허혈을 유발시키는 동안 직장 내 체온계를 삽입하여 체온을 측정하고, 실험동물의 온도에 따라 자동으로 조절되는 온열 패드를 사용하여 체온을 정상 체온인 37 ± 0.3℃로 일정하게 유지시켰다.

다. 허혈 유발이후 조직화학반응에의한 신경세포의 세포사 변화 분석

대조군과 각 실험군은 뇌허혈 유발 4일 후에 thiopental sodium (유한양행, 한국)을 체중 kg 당 각각 40 mg의 용량으로 복강 내 주사하여, 마취시킨 다음 1,000 ml 당 heparin 1000 IU를 함유한 생리식염수를 좌심실로 주입하여 관류 세척하였다. 관류 세척이 끝난 동물은 바로 4% paraformaldehyde (in 0.1 M phosphate buffer; PB, pH 7.4)로 관류 고정을 하였다.

관류 고정이 끝난 동물은 뼈절단기를 이용하여 머리뼈공간을 열어 뇌를 적출한 다음 동일 고정액에서 6 시간 후 고정하였다. 후고정이 끝난 뇌는 30% sucrose 용액(in 0.1 M phosphate buffer)에 넣어 바닥에 가라앉을 때까지 담가 놓았다. 이 후 sliding microtome (Reichert-Jung, Germany) 이용하여 30 ㎛ 두께로 잘라 보존액(storing solution)이 들어있는 6 well plate에 넣어 사용 시까지 4℃에서 보관하였다.

각 조직절편 중에서 해마복합체(hippocampal formation)가 잘 나와있는 조직을 골라 조직에 묻어있는 보존액을 없애기 위해 0.01M PBS로 10분씩 3회 세척하였다. 이 후 gelatin을 입힌 슬라이드에 얹어 37℃에서 충분히 말려준다. 증류수로 잠시 담갔다가 2% cresyl violet acetate (Sigma, USA) 용액에 1분간 염색하였다. 슬라이드에 묻어 있는 과량의 cresyl violet을 제거하기 위해 흐르는 수돗물에 충분히 세척한 다음 증류수에 잠시 담갔다가 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 용액을 거쳐 탈수와 함께 과량의 cresyl violet을 세척하여 세포의 Nissle body가 보이는 것을 확인한 다음 xylene (Junsei, Japan)에 담가 투명화하였으며, Canada Balsam (Kanto, Japan)으로 봉입하였다.

대조군과 실험군에서 cresyl violet을 함유한 신경세포를 계수하기 위하여 디지털 카메라가 부착되어 있는 Axioplan microscope (Carl Zeiss, Germany)로 CA1 영역을 400배로 사진촬영을 실시하였다. 보라색으로 염색된 부분을 image analyzer (Optimas 6.5, USA) 프로그램을 사용하여 선택하여, 계수하도록 하였다. 야관문, 복분자, 유근피, 건지황, 숙지황의 효능을 검증하기 위해 이들 물질의 투여 시 해마 CA1 영역에서 관찰되는 신경세포의 수를 대조군과 비교하였다. 각 군에 대한 유의성의 검증을 위하여 One-way ANOVA test를 수행하였으며 각 군 중에서 가장 일반적인 부분을 골라 Axiophot microscope (Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 사진 촬영을 하였다.

세포배양에서 선정된 야관문, 복분자, 유근피, 건지황, 숙지황 중에서 실험결과 야관문에서는 허혈에 의한 세포 손상 방지 효과를 나타냈으나 복분자, 유근피, 건지황, 숙지황에서는 효과를 보이지 않았다. 대조군의 경우 뇌허혈 유발 4일 후에 약 14% 정도가 생존하는 것을 관찰할 수 있었으며 (그림 4), 야관문은 이보다 많은 신경세포가 살아남았다.

즉, 도 4는 저빌뇌의 해마를 cresyl violet 시약으로 염색한 조직 소견으로서, A와 C는 정상 해마의 조직 소견이며, B와 D는 허혈유발 4일 후 해마조직을 cresyl violet 시약으로 염색한 것으로 해마 CA1영역의 신경세포가 허혈에 의해 죽은 것을 나타내고 있다.

야관문의 경우 뇌허혈 유발 전 보다는 뇌허혈 유발 후 투여한 경우 약효가 현저하게 증가되는 것을 관찰할 수 있었다. 야관문의 뇌허혈 유발전 투여시에는 수컷과 암컷에서 각각 16.6%, 19.7%의 신경세포가 살아남아 효능이 상대적으로 약하였지만 (그림 4, 5A, 5C, 6A, and 6C) 뇌허혈 유발후 투여군에 경우는 수컷과 암컷에서 각각 41.7%, 81.9%의 신경세포가 살아남아 특히 암컷에서 효능이 좋았다 (그림 4, 5B, 5D, 6B, and 6D). 야관문이 뇌허혈 유발전 투여군 보다는 뇌허혈 유발후 투여군에서 효과가 더 좋은 것으로 보아 야관문을 예방제 및 치료제로 사용할 수도 있다.

도 5는 저빌에서 허혈유발시 야관문에 의해 허혈에 의한 신경세포사가 억제되는 것을 도시한 것으로 A와 C는 야관문을 뇌허혈 유발전에 처리한 군이며 B와 D는 뇌허혈 유발후 야관문을 처리한 군으로 A와 B는 수컷이고 C와 D는 암컷의 해마조직을 cresyl violet 시약으로 염색한 것이다. 허혈유발 후 야관문 처리시에 신경세포사 억제효과가 암수에 대해 모두 있으며 허혈유발 전 처리시에는 신경세포사 억제효과가 약한 것으로 나타났다 (Scale bars = 800 ㎛).

또한, 도 6은 도 5의 저빌에서 허혈유발시 야관문에 의해 세포사가 억제되는 것을 확대하여 도시한 것으로 A와 C는 야관문을 뇌허혈 유발전에 처리한 군이며 B와 D는 뇌허혈 유발후 야관문을 처리한 군으로 A와 B는 수컷이고 C와 D는 암컷의 해마조직을 cresyl violet 시약으로 염색한 것이다 (Scale bars = 50 ㎛). 마찬가지로 허혈유발 후 야관문 처리시에 신경세포사 억제효과가 암수에 대해 모두 있으며 허혈유발 전 처리시에는 신경세포사 억제효과가 약한 것으로 나타났다.

이상의 본 발명은 상기에 기술된 실시예들에 의해 한정되지 않고, 당업자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.

Claims (4)

1. 야관문의 잎, 뿌리 또는 줄기를 채취한 후 영양상태가 좋고 불순물이 없는 것을 선별하여 물로 세척한 후 건조하여 세절하는 제 1 과정;
   건조상태의 야관문을 곱게 파쇄한 후 35 ~ 950%농도의 식음용 에틸 에탄올에 3 내지 6개월 동안 침전시켜고 50℃에서 2시간 동안 알콜추출하는 제 2 과정;
   상기 제 1 과정이 이루어진 후, 상기 에탄올에 녹아 나온 야관문추출액을 회전 증발기 또는 감압농축기을 통해 농축하여 에탄올 성분을 완전히 제거하고 야관문을 농축하는 제 3 과정;
   상기 제 2 과정이 이루어진 후, 동결건조기를 이용하여 48시간 동안 수분을 완전히 제거하여 추출물을 만드는 제 4 과정;
   추출액을 회수하고, 회수된 추출액에 포함된 에탄올을 증류 소멸시키면서 살균하기 위해 에탄올 비등점(78.3℃) 이상으로 고온살균하는 제 5 과정; 및
   상기 완성된 추출물의 1/10을 10㎖의 물에 녹인 것을 원액(98㎎ 추출물/㎖ water)으로 하여 원액의 1/10 혹은 1/100 희석액(0.98㎎ 추출물/㎖ water)을 이용하는 제 6 과정;을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 야관문 추출물
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 추출물은 물 또는 알코올 등의 유기 용매를 이용하여 추출되거나, 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 분획물로 추출되는 것을 특징으로 하는 야관문 추출물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 추출물은 신경유래세포(PC12 세포)의 세포배양 처리에 따라 항허혈 활성을 갖는 물질에 대하여 혈관성 치매 및 뇌졸중의 원인이 되는 허혈의 발생을 저빌에서 뇌허혈에 의한 뇌신경 세포 손상의 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 하는 야관문 추출물.
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항의 추출물에 기능성 식품 또는 약품을 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 야관문 추출물을 포함하는 조성물.

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