KR20160087859A

KR20160087859A - 크로마토그래픽 물질을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20160087859A
Application number: KR1020167016092A
Authority: KR
Inventors: 카리나 로제스키
Original assignee: 뉴 프로테인테크 인크.
Priority date: 2013-11-17
Filing date: 2014-11-17
Publication date: 2016-07-22
Also published as: JP2016540235A; CN105793301A; EP3068811A4; EP3068811A1; RU2016123146A; AU2014349666B2; CA2967901A1; AU2018203896A1; WO2015071913A1; AU2014349666A1; US20160303541A1

Abstract

흡착제 물질은 대략 5:95 내지 대략 40:60의 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 용적비의, 매트릭스를 한정하는 복수의 가교된 모노비닐 모노머를 포함하되, 매트릭스가 대략 5 내지 대략 9의 pH 범위로 완충 가능하고 입자 크기가 대략 10 마이크로미터 내지 대략 300 마이크로미터이다. 흡착제는, 단리된 IgG가 이후에 흡착제로부터 추출되도록, 이의 단리를 위해, 혈장으로부터 면역글로불린 G(IgG)의 결합을 증진시키기 위해 크로마토그래픽 컬럼에서 사용된다. 흡착제는 또한, 단리된 IgG 모노클로날 항체가 이후에 흡착제로부터 추출되도록, 이의 단리를 위해 유전자 변형 우유로부터 면역글로불린 G(IgG) 모노클로날 항체의 결합을 증진시키기 위해 크로마토그래픽 컬럼에서 사용된다.

Description

크로마토그래픽 물질을 제조하는 방법{METHOD OF PREPARING CHROMATOGRAPHIC MATERIALS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 공동으로 소유된 2013년 11월 17일에 출원된 발명의 명칭이 "Method of Preparing New Chromatographic Materials and New Chromatographic Materials for Highly Selective Chromatography"인 미국 가특허출원 일련번호 제61/905,238호, 및 2013년 11월 17일에 출원된 발명의 명칭이 "Method of Preparing Mixed Mode Resins and Mixed Mode Resin for Highly Selective Chromatography"인 일련번호 제61/905,239호에 관한 것이고, 이를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

기술 분야

본 발명은 고도로 선택적인 크로마토그래피 적용을 위한 신규한 수지를 제조하는 것에 관한 것이다.

혈액-기반 제품에 대한 전세계적인 수요가 계속 증가함에 따라, 생물공학적 정제된 제품에 대한 효과적이고 경제적인 방법이 탐구되고 있다. 이러한 여러 방법들에서 다수의 단백질, 효소, 호르몬, 및 다양한 생리학적 유체, 천연 소스(nature source) 및 배양 배지로부터의 다른 생리활성 화합물의 단리(isolation)가 포함되어 있다. 크로마토그래피의 분야와 관련된 단리 및 정제 기술이 상당히 주목되고 있다.

당해 분야에 공지된 통상적인 크로마토그래픽 물질 그 자체는 다수의 아주 중요한 정제 적용에 충분히 그리고 효과적으로 적합하지 않다. 정제된 제품은 예를 들어, 치료제, 화장료, 및 식품에 사용된다. 통상적인 크로마토그래픽 물질을 적용하는 것의 단점들 중에는 사전처리 작업을 갖는 다단계 정제 방식; 정제 동안 물질의 큰 손실; 및 정제된 제품의 최종적인 낮은 수율 및 높은 비용이 있다.

다른 문제점은 출발 소스로서 가공되지 않은 인간 혈장(raw human blood plasma)으로부터 면역글로불린 G(IgG)의 단리 및 정제를 수반하는 것이다. 현 IgG 정제 기술은 콘 공정(Cohn process)의 분획 II+III 페이스트를 사용한다. 그러나, 상술된 정제의 스테이지(stage) 동안에, IgG의 적어도 30%가 여러 제조 단계 동안에 손실된다. 이에 따라, 결과적으로, 상업적 수율은 본래 IgG의 50% 정도로 낮아질 수 있다.

본 발명의 구현예는 매트릭스(matrix)를 한정하는 복수의 가교된 모노비닐 모노머를 포함하는 흡착제 물질(sorbent material)에 관한 것이다. 모노비닐 모노머는 대략 5:95 내지 대략 40:60의 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 용적비를 가지며, 매트릭스는 대략 5 내지 대략 9의 pH 범위로 완충 가능하고, 대략 10 마이크로미터 내지 대략 300 마이크로미터의 입자 크기를 갖는다. 흡착제(sorbent)는 단리된 IgG가 이후에 흡착제로부터 추출되도록, 이의 단리를 위해, 혈장으로부터 면역글로불린 G(IgG)의 결합을 증진시키기 위해 크로마토그래픽 컬럼에서 사용된다. 흡착제는 또한, 단리된 IgG 모노클로날 항체가 이후에 흡착제로부터 추출되도록, 이의 단리를 위해, 유전자 변형 우유(transgenic milk)로부터 면역글로불린 G(IgG) 모노클로날 항체의 결합을 증진시키기 위해 크로마토그래픽 컬럼에서 사용된다.

본 발명의 구현예는 신규한 고도로 선택적인 크로마토그래픽 물질을 기반으로 한 것이다.

본 발명의 구현예는 크로마토그래픽 물질 및 이의 적용을 포함한다. 물질들 중에는 약한 양이온 교환 작용기 및 소수성 작용기를 포함하는 이작용성 혼합 모드 크로마토그래픽 물질, 신규한 일-작용성 음이온 교환 수지 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 신규한 물질이 있다. 크로마토그래픽 물질은 다양한 가공되지 않은 소스로부터 특히 단백질, 효소, 당단백질, 다당류의 크로마토그래픽 정제 공정을 개선시키는 것에 관한 것이다.

본 발명의 구현예는 치료 목적을 위해 가공되지 않은 인간 혈장으로부터 IgG의 단리 및 정제를 위한 기술의 효능을 개선시키는 것에 관한 것이다.

본 발명의 구현예는 가공되지 않은 인간 혈장으로부터 IgG를 정제하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 본 발명의 크로마토그래픽 구조물을 사용함으로써 가공되지 않은 인간 혈장으로부터의 IgG의 크로마토그래픽 정제를 포함한다.

본 발명은 일부 구현예에서, 크로마토그래픽 구조물 및 이의 제조 방법을 포함한다. 크로마토그래픽 구조물은 이온 교환의 원리, 소수성 및 요망되는 기공 크기를 포함하는 물질 성질들을 조합한다. 이러한 크로마토그래픽 물질은 항체 제조를 위한 다양한 크로마토그래픽 방법에 비해 장점을 본 발명에 제공한다. 장점은 사전 처리의 방지; 원심분리 단계(또는 미세여과)를 대체; 가공되지 않은 소스로부터 고도로 선택적인 흡착의 입증(demonstration); 충분한 흡착 회수; 높은 유체역학적 성질; 구조 용적의 안정성; 및 600 ml/hr까지의 유량을 포함한다.

본 발명의 물질의 구조물은 저압 액체 크로마토그래피(LPLC)에 대해 적용 가능하고, 적어도 3 bar의 압력을 견딘다. 본 발명의 이작용성 혼합 모드 물질 또는 매질은 다양한 가공되지 않은 소스로부터 IgG(및 다수의 다른 단백질)의 포집을 위한 제1 일반 단계로서 통합될 수 있다.

다른 통상적인 수지와는 상반되게, 본 발명의 혼합 모드(예를 들어, 흡착 물질 또는 매질)는 대략 두 배의 항체 결합 용량을 제공한다. 6 내지 7의 pH 범위에서 IgG 요망되는 흡착 조건은 혼합 모드를 이용하여 높은 IgG 순도를 제공하는 역할을 한다. 본 발명은 요망되는 기공 크기를 갖는 신규한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)가 폴리싱(polishing)(IgG 마감처리된 정제)을 위해 사용되게 한다. 본 발명의 구현예의 구조물을 사용한 IgG 정제 방법은 2 내지 3개의 단계로 이루어진다.

본 발명은 높은 이온 교환 용량, 소수성/친수성 균형 및 기공 크기, 예를 들어, 큰 기공 크기로서, 원심분리 및 탈염화에 대한 필요성을 제거하며, 본 발명의 흡착제 물질에서, IgG 및 IgG 모노클로날 항체를 단리시키는데 필수적인 활성 구성요소를 포함한다.

본 발명은 이온 교환을 최적화하고 소수성 및 친수성의 균형을 맞추고 뿐만 아니라 과립 입자 크기 및 관련된 다공성을 통해 상호연결된 기공의 모방 성질(mimetic property)을 사용하기 위해 조정 가능한 파라미터로, 폴리머 매트릭스를 사용함으로써 혈장으로부터 IgG를 단리시킬 수 있다.

본 발명은 사전 처리를 방지하고, 원심분리 단계(또는 미세여과)를 대체하고, 가공되지 않은 소스로부터 고도로 선택적인 흡착을 나타내고, 충분한 흡착 회수를 제공하고, 높은 유체역학적 성질을 나타내고, 구조물 용적의 안정성을 나타내고, 600 ml/hr까지의 유량을 나타내기 때문에, 본 발명은 혈장 또는 유전자 변형 우유를 정제하기 위한 다수의 사전 제조 단계들을 방지한다. 구조물은 저압 액체 크로마토그래피(LPLC)에 대해 적용 가능하고, 적어도 3 bar의 압력을 견딘다. 본 발명의 혼합 모드(예를 들어, 흡착 물질)는 다양한 가공되지 않은 소스로부터 IgG(및 다수의 다른 단백질)를 포집하기 위한 제1 일반 단계로서 통합될 수 있다.

본 발명의 구현예는 유전자 변형 동물 우유로부터 인간 IgG를 정제하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 본 발명의 크로마토그래픽 구조물 및 흡착제 물질을 사용함으로써 유전자 변형 우유로부터의 인간 IgG, 예를 들어, IgG 모노클로날 항체의 크로마토그래픽 정제를 포함한다.

본 발명의 구현예는 흡착제 물질(또는 매질)에 관한 것이다. 흡착제 물질은 대략 5:95 내지 대략 40:60의 소수성 모노비닐 모노머(예를 들어, 코모노머) 대 친수성 모노비닐 모노머(예를 들어, 코모노머)의 용적비의, 매트릭스를 규정하는 복수의 가교된 모노비닐 모노머(예를 들어, 코모노머)를 포함하며, 매트릭스는 대략 5 내지 대략 9의 pH 범위로 완충 가능하며, 입자의 입자 크기는 대략 10 마이크로미터 내지 대략 300 마이크로미터이다.

선택적으로, 입자 크기는 대략 100 마이크로미터 내지 대략 200 마이크로미터이다.

선택적으로, 입자는 대략 500 옹스트롱 내지 대략 3 마이크로미터 크기의 기공을 포함한다.

선택적으로, 기공들은 서로 상호 연결된다.

선택적으로, 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 용적은 대략 20:80이다.

선택적으로, 매트릭스는 대략 7의 pH로 완충 가능하다.

선택적으로, 모노비닐 모노머는 대략 0.1 meq/ml 내지 대략 1.5 meq/ml의 카복실 기를 포함한다.

선택적으로, 카복실 기는 대략 0.7 meq/ml이다.

선택적으로, 모노비닐 모노머는 아크릴산, 및 부틸아크릴레이트, 3차-부틸아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 옥틸 및 페닐 아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 포함하는 소수성 비닐-함유 화합물을 포함하는 모노비닐 산 중 하나 이상을 포함한다.

선택적으로, 모노비닐 모노머는 에틸렌성 치환된 아민, 알릴아민, N-알킬에틸렌아민 및 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트를 포함하는, 치환된 아민을 포함하는, 비닐 함유 화합물 중 하나 이상을 포함한다.

선택적으로, 모노비닐 모노머는 부틸아크릴레이트, 3차-부틸아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 옥틸 및 페닐 아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 포함하는, 소수성 비닐 함유 화합물 중 하나 이상을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예는 혈장으로부터 면역글로불린 G(IgG)를 단리시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대략 5:95 내지 대략 40:60의 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 용적비의, 매트릭스를 한정하는 복수의 가교된 모노비닐 모노머를 포함하는 흡착제 물질을 수득하는(또는 대안적으로 제공하는) 것을 포함하며, 매트릭스는 대략 5 내지 대략 9의 pH 범위로 완충 가능하고, 이의 입자 크기가 대략 10 마이크로미터 내지 대략 300 마이크로미터인 것을 포함한다. 흡착제 물질은 크로마토그래픽 컬럼에 배치되며, 혈장은 IgG를 단리시키기 위해 크로마토그래픽 컬럼을 통해 진행된다.

선택적으로, 이러한 방법은 추가적으로, 흡착제 물질로부터 혈장의 단리된 IgG를 분리시키는 것을 포함한다.

선택적으로, 흡착제 물질로부터 혈장의 IgG의 분리는 용리에 의해 수행된다.

선택적으로, 혈장은 가공되지 않은 혈장이다.

선택적으로, 가공되지 않은 혈장은 포유동물 혈장이다.

선택적으로, 가공되지 않은 혈장은 인간 혈장이다.

본 발명의 다른 구현예는 우유의 유청(whey)으로부터 면역글로불린 G(IgG) 모노클로날 항체를 단리시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대략 5:95 내지 대략 40:60의 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 용적 비의, 매트릭스를 한정하는 복수의 가교된 모노비닐 모노머를 포함하는 흡착제 물질을 수득하는(또는 대안적으로 제공하는) 것을 포함하며, 매트릭스는 대략 5 내지 대략 9의 pH 범위로 완충 가능하고, 이의 입자 크기가 대략 10 마이크로미터 내지 대략 300 마이크로미터인 것을 포함한다. 흡착제 물질은 크로마토그래픽 컬럼에 배치되며, 우유의 유청 단백질은 IgG 모노클로날 항체를 단리시키기 위해 크로마토그래픽 컬럼을 통해 진행된다.

선택적으로, 우유는 유전자 변형 우유를 포함한다.

선택적으로, 유전자 변형 우유는 포유동물이다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및/또는 과학 용어는 본 발명과 관련된 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 물질이 본 발명의 구현예의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 물질은 하기에 기술된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 특허 명세서가 지배할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서, 필연적으로 한정적인 것으로 의도되지 않는다.

발명의 일부 구현예는 본원에서 단지 일 예로서 첨부된 도면을 참조로 하여 기술된다. 상세하게 하기에서 도면을 특히 참조하여, 도시된 특정 사항이 일 예인 것이고, 본 발명의 구현예의 예시적인 논의의 목적을 위한 것이라는 것이 강조된다. 이와 관련하여, 도면에 대한 설명은 본 발명의 구현예가 어떻게 실행될 수 있는지를 당업자에게 명확하게 만든다.
도면에서,
도 1은 본 발명에 따른 공정들의 흐름 다이아그램이다.
도 2는 본 발명의 구현예에 따른 이작용성 혼합 모드 상에서 가공되지 않은 비희석된 인간 혈장으로부터의 면역글로불린 G(IgG)의 정제이다.
도 3은 본 발명의 구현예에 따른, 음이온 교환제에 의한 가공되지 않은 인간 혈장으로부터의 면역글로불린 G(IgG)의 정제이다.
도 4는 본 발명의 구현예에 따른 인간 혈장으로부터의 면역글로불린 G(IgG)의 정제이다.
도 5는 본 발명에 따른 다른 공정의 흐름 다이아그램이다.
도 6은 본 발명의 구현예에 따른 크로마토그래픽 컬럼에서 흡착제 물질 상의 유청 단백질의 흡착 시험의 다이아그램이다.
도 7은 본 발명의 구현예에 따른 유청 단백질의 크로마토그래피의 다이아그램이다.
도 8은 본 발명에 따른, 유청의 초기 pH에서 큰 기공 크기에 의한 유청 단백질의 크로마토그래피의 다이아그램이다.
도 9는 본 발명의 구현예에 따른 작은 기공 크기 크로마토그래픽 컬럼 상에서의 유청 단백질의 크로마토그래피의 다이아그램이다.

I. 가공되지 않은 혈장으로부터의 면역글로불린 G( IgG )의 정제

먼저 도 1과 관련하여, 혈장, 예를 들어, 인간 혈액으로부터의 가공되지 않은 인간 혈장으로부터 IgG를 정제하는 예시적인 공정 및/또는 공정들을 상세히 설명하는 흐름 다이아그램이 주목된다. 흐름 다이아그램의 블록은 또한, 이러한 섹션 전반에 걸쳐 참조된다.

먼저, 블록(102)에서 흡착제가 제조된다. 블록(104)에서 흡착제는 이후에 크로마토그래픽 컬럼에 로딩된다. 공정은 블록(106)으로 이동하는데, 여기서, 블록(106)에서, 혈장, 예를 들어, 가공되지 않은 인간 혈장은 IgG를 단리시키기 위해 흡착제 로딩된 크로마토그래픽 컬럼을 통해 진행된다. 단리된 IgG는 흡착제에 결합된다.

공정은 블록(106)에서 블록(108)으로 이동하는데, 여기서, 블록(110)에서 단리된 IgG를 얻기 위해 분리된 IgG는 흡착제로부터 용리된다. 이러한 단리된 IgG는 여러 생성물들에 대해 적합하다.

블록(106)으로 되돌아가서, 크로마토그래픽 컬럼의 흡착제에 결합하지 않는 비-IgG 생성물은 선택적으로 수집될 수 있다. 이러한 생성물은 공정이 블록(106)으로 되돌아감에 따라, 동일한 흡착제-로딩된 크로마토그래픽 컬럼, 또는 예를 들어, 본 발명의 흡착제를 포함하는 상이하지만 유사한 흡착제-로딩된 크로마토그래픽 컬럼을 통해 다시 진행될 수 있으며, 이로부터 이는 다시 시작된다.

블록(102, 104, 106, 108, 110, 및 112)의 공정들은 요망되는 한 반복될 수 있다.

A. 흡착제를 제조함(혼합 모드 제조)(도 1, 블록 (102))

예비-중합 스테이지(pre-polymerization stage)로 이루어지는 자유 라디칼 공중합의 원리에 의해 현탁 중합을 포함하는 방법을 포함하는, 구조물, 예를 들어, 가교되고 소수성 모노머(예를 들어, 코모노머) 및 친수성 모노머(예를 들어, 코모노머) 둘 모두를 형성하는 예를 들어, 폴리머 모노머의 매트릭스를 제조하는 방법이 하기에 기술된다.

본 발명의 일 구현예는 예를 들어, 아크릴산을 포함하는 임의 모노비닐 약산 및 소수성 비닐-함유 화합물, 예를 들어, 부틸아크릴레이트, 3차-부틸아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 옥틸 및 페닐 아크릴레이트 및 메타크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 코모노머, 바람직하게, 모노비닐 모노머를 포함한다.

대안적으로, 코모노머는 임의 약한 염기성 비닐 함유 화합물, 예를 들어, 치환된 아민, 바람직하게, 에틸렌성 치환된 아민, 예를 들어, 아릴아민, N-알킬에틸렌아민, 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트를 포함하는 군으로부터 선택된다.

대안적으로, 모노비닐 코모노머는 소수성 비닐 함유 화합물, 예를 들어, 부틸아크릴레이트, 3차-부틸아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 옥틸 및 페닐 아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 포함하는 군으로부터 선택된다. 이러한 물질은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)의 신규한 수지이다.

예를 들어, 용적 기준으로, 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 비는 대략 5:95 내지 대략 40:60, 및 예를 들어, 대략 20:80이다. 흡착제 물질은 예를 들어, 모노비닐 모노머가 대략 0.1 meq/ml 내지 대략 1.5 meq/ml(밀리당량/밀리미터)의 카복실 기를 포함하게 하며, 예를 들어, 카복실 기가 대략 0.7 meq/ml이게 한다.

상술된 모노머, 예를 들어, 코모노머에 대한 가교제는 예를 들어, 사슬에서 적어도 두 개의 반복된 탄소 기 및 바람직하게 2개 내지 10개의 반복된 탄소 기를 갖는 장쇄 가교제이다. 가교제는 헥사하이드로-1,3,5-트리아크릴로일트리아진(HTA), 트리알릴이소시아누레이트(TAIC), p-페닐렌디메타크릴아미드(p-PHDMA), N,N'-메틸렌디아크릴아미드(MDAA), N,N'-에틸렌디메타크릴아미드(EDMA), N,N'-헥사메틸렌디메타크릴아미드(HMDMA), 펜타에리스리톨 트리아크릴레이트(PETA), 및 펜타에리스리톨 테트라아크릴레이트(PETETA)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리비닐모노머이다.

본 발명의 크로마토그래픽 물질은 자유 라디칼 중합 방법을 기반으로 한 것이다. 본 방법에서 개시제는 암모늄 퍼설페이트, 1,1'-아조비스(시클로헥산카본니트릴)로 이루어진 군으로부터 선택된 자유 라디칼 개시제이다. 코모노머 및 개시제는 바람직하게, 유기 용매, 예를 들어, 유기 용매들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용액 중에서 인큐베이션된다.

추가적으로 또는 선택적으로, 코모노머 및 개시제는 바람직하게 폴리에틸렌 글리콜과 부틸 알코올, 시클로헥산올과 데실 알코올, 라우릴 알코올의 혼합물인 용액 중에서 인큐베이션된다. 선택적으로, 공중합 용액은 아세트산과 폴리에틸렌 글리콜, 포름 아미드, 부틸 알코올, 시클로헥산올 및 데실 알코올의 혼합물을 포함한다. 예비 중합 스테이지는 선택된 용매 중에 코모노머 및 개시제를 용해시키는 것으로 이루어진다.

선택된 용매에 대한 코모노머 혼합물의 예시적인 비율은 1 내지 4의 범위이다. 예비-중합 혼합물을 인큐베이션하기 위한 예시적인 용매는 일부 용매 성분들의 혼합물로 이루어진다. 모든 폴리머 구조는 예비중합 단계를 갖는 현탁 중합 방법에 의해 제조된다. 분산 매질은 무기염의 수용액을 포함한다. 예비-중합 상에 대한 분산 매질의 비율은 바람직하게 약 1 내지 4 또는 약 1 내지 5 용적/용적이다.

모든 폴리머 구조는 예비중합 단계를 갖는 현탁 중합에 의해 제조된다. 모노비닐 모노머, 가교제, 및 개시제는 선택된 용액에 용해된다. 예비-중합 단계 동안, 자유 라디칼 중합은 요망되는 점도를 달성하기 위해 50 내지 80℃의 온도에서 형성된다. 점성의 예비-중합 분산 상은 70 내지 80℃의 온도에서 분산 매질에 도입되며, 얻어진 생성물은 80 내지 95℃에서 형성된다. 분산 매질은 소듐 설페이트의 20% 용액 및/또는 선택적으로 소듐 클로라이드의 수용액이다.

얻어진 생성물은 10 ㎛ 내지 300 ㎛, 및 예를 들어, 대략 100 ㎛ 내지 200 ㎛ 범위(평균 입자 크기, 예를 들어, 직경)의 구형의 과립(입자)의 측면에서 제조된다. 과립(예를 들어, 입자)은 대략 500 옹스트롱 내지 대략 3 마이크로미터 크기의 기공을 포함하며, 기공은 서로 상호 연결된다. 과립은 빙초산, 물, 1N 소듐 하이드록사이드(NaOH), 1M 하이드로클로라이드(HCl), 및 물에 의한 세척에 의해 제조된다. 세척 후에, 과립은 습식 분별된다.

제조된 흡착제는 크로마토그래픽 컬럼에 채워진다. 흡착제는 컬럼에서 대략 5 내지 대략 9의 pH, 및 예를 들어, 대략 pH 7에서 0.1M 소듐 아세테이트의 완충 용액에 의해 평행 상태로 유지된다. 초기 pH ~7.4에 의한 인간 혈액으로부터의 혈장, 예를 들어, 가공되지 않은 인간 혈장은 컬럼에 로딩된다. 평형화된 완충제에 의한 컬럼의 세척 후에 IgG 결합의 탈착이 수행된다. 탈착은 1M NaOH에서 pH 5; 5.5; 6.0에서 차이가 나는 0.1M 시트레이트 완충제의 용액으로의 스텝 구배(step gradient)에 의해 형성된다.

본 발명의 구현예의 구조의 가능성을 입증하기 위해 몇몇 실시예가 기술된다. 얻어진 데이타는 본 발명의 흡착제 물질 또는 매질 상에서 가공되지 않은 인간 혈장으로부터 IgG의 분리 및 정제과 관련된 것이다. 높은 선택적 흡착은 제1 단계 및 제2 단계 상에서 가공되지 않은 출발 혈장으로부터 얻어진 것이다. 전체 정제(폴리싱) IgG는 제3 단계에서 수행된다. 흡착-용리의 조건은 고순도를 갖는 IgG 단리 및 완전한 회수의 예상을 제공한다. 이는 예를 들어, 흡착-용리의 pH, 구조의 친수성-소수성 균형 및 기공의 크기와 같은 인자 및 파라미터에 기인한 것이다.

하기에 기술되는 실시예는 비-제한적인 것이고, 이와 같이, 본 발명의 구현예의 폴리머 크로마토그래픽 물질의 넓은 적용 가능성을 제한하지 않는다.

A.1. 혼합 모드 (흡착제) 제조

실시예

250 ml 플라스크에, 교반기, 아르곤용 유입구 파이프 및 적가 깔대기를 제공하였다. 이러한 플라스크에, 120 ml의 20% 소듐 설페이트를 붓고, 아르곤을 20분 동안 버블링하였다. 동시에, 2 ml의 페닐 메타크릴레이트, 3 ml의 메타크릴산, 0.921 g의 HTA, 2 ml의 라우릴 알코올, 11 ml의 부탄올, 11 ml의 시클로헥산올을 첨가하였다. 코모노머의 용해 후에, 0.06 g의 1,1'-아조비스(시클로헥산카보니트릴)을 첨가하였다. 공중합을 60℃의 온도에서 10분 동안 수행하여 점도 예비-폴리머를 수득하였다. 예비-폴리머를 120 ml의 20% 소듐 설페이트에 분산시켰다. 온도를 60℃ 내지 70℃에서 30분 동안 유지시켰다. 온도를 이후에 100℃까지 증가시키고, 반응을 그러한 온도에서 1시간 동안 계속하였다. 다음에, 25℃의 온도로 냉각시킨 후에, 얻어진 구형 과립을 분산 상으로부터 분리하였다. 과립을 이후에 빙초산으로 세척하고, 이후에, 물로 세척하고, 다음으로, 1M NaOH의 수용액으로 세척하고, 이후에 염산의 1M 수용액으로 세척하고, 마지막으로, 물로 세척하였다. 수율은 5.6 g이었다. 제조된 코폴리머를 습윤 상태에서 하기 부분으로 분별하였다: 200 ㎛, 100 ㎛ 및 100 ㎛ 미만.

이러한 과립은 대략 1000 옹스트롱의 평균 크기의 기공을 가지며, 기공은 상호 연결된다. 코모노머의 소수성 대 친수성 용적 비는 대략 20:80이며, 이온 교환을 위한 이온 농도는 대략 0.7 meq/ml(밀리당량/밀리리터)의 카복실 기(메타크릴산으로부터의)이다.

B. 가공되지 않은 인간 혈장으로부터의 IgG의 크로마토그래피

4 ml의 혼합 모드 부분 100 ㎛ 내지 200 ㎛ 과립(입자)을 내부 직경이 1.6 cm이고 높이가 2 cm의 컬럼(도 1, 블록 (104))에 도입(로딩)하고, 1M NaOH 및 1M HCl 및 증류수(DW)로 컨디셔닝하였다. 마지막으로, 흡착제를 컬럼에서 pH 7 흡착에서 0.1M 아세테이트 완충제로 평형상태로 만들었으며, 가공되지 않은 인간 혈장의 유량은 0.6 ml/min이었다(도 1, 블록 (106)).

세척: 0.1M 아세테이트 완충제 pH 7

용리: 최종 1M NaOH 중에 pH 5; 5.5; 6.0 차이가 나는 0.1M 시트레이트 완충제(도 1, 블록 (108)).

크로마토그래픽 분리의 결과는 도 2 내지 도 4에 도시되어 있다. 컬럼으로부터 용리된 단백질의 프로파일(그래프), 및 Coomassie Brilliant Blue G-250으로 염색된 용리된 피크의 환원 12.5% SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 분석이 존재한다.

도 2는 분리 그래프 및 감소된 전기영동(PAGE)에 의해 나타나는 약산 소수성 코모노머를 기반으로 한 이작용성 구조 상에서 가공되지 않은 비희석된 인간 혈장으로부터 면역글로불린 G(IgG)의 1단계 정제를 도시한 것이다. 분리 그래프의 용리 분획 5는 전기영동 이미지의 라인 2에 따른 것이며, 용리 분획 6은 전기영동 이미지의 라인 3에 따른 것이며, 용리 분획 7은 전기영동의 라인 4에 따른 것이며, 용리 분획 8은 전기영동의 라인 5에 따른 것이다. 용리 분획들의 전기영동 분석은 인간 혈청 알부민의 혼합 없이 고순도의 단리된 IgG를 입증한다. 1M 소듐 하이드록사이드에 의한 최종 용리는 280 nm 흡수의 부재를 나타내고, 이에 따라, 임의 단백질이 부재한다.

도 3에 도시된 바와 같이, 가공되지 않은 인간 혈장으로부터의 면역글로불린 G(IgG)의 1단계 정제는 분리 그래프 및 환원 전기영동(PAGE)에 의해 나타난 음이온 교환 수지를 사용하여 수행된다. 그래프의 관류 및 세척의 분획 1 내지 분획 4는 전기영동 이미지 상에서 라인 1 및 라인 2에 따른다. 전체 혈청 알부민은 IgG 없이 관류에서 단리된다. 그래프의 용리 분획 7 내지 분획 18은 전기영동 이미지의 라인 3, 4, 5, 6에 따른 것이다. 인간 혈청 알부민 혼합물 없이 IgG의 실제적인 전체 흡착을 나타낸 것이다. 분리 그래프의 용리 분획 21 내지 용리 분획 27은 도 3의 전기영동 이미지의 라인 7에 따른 것이다. 여기에서, 임의 단백질의 부재를 나타낸다. 용리 분획 21 내지 용리 분획 27의 고흡수 A280 nm는 1M 소듐 하이드록사이드에서 용해된 저분자 혼합물에 기인하여 야기된다.

도 4에서, HIC 물질에 의한 인간 혈장으로부터 면역글로불린 G(IgG)의 1단계 정제는 분리 그래프 및 환원 전기영동(PAGE)을 이용한다. 그래프의 관통의 분획 1 내지 분획 3은 전기 영동 이미지의 라인 I에 따른 것이다. 그래프의 용리 분획 6 내지 용리 분획 8은 전기영동 이미지의 라인 2에 따른 것이다. 이는 마커 라인 3에 따른 인간 혈청 알부민 및 기타 혈장 단백질의 혼합물 없이 고순도의 단리된 IgG를 나타낸 것이다. 분리 그래프의 용리 분획 10 내지 용리 분획 12는 전기영동 이미지의 라인 4에 따른 것이다. 임의 단백질의 부재가 나타난다. 용리 분획 10 내지 12의 고흡수 A280 nm는 용해된 저분자 혼합물에 기인하여 야기한 것이다. 모두 세 개의 도면의 PAGE 결과는, 흡착의 종결 후에 1M NaOH의 크로마토그래픽 컬럼으로의 처리로 인해 전체 흡착 회수를 나타내며, 즉 용리 사이클은 임의 단백질을 나타내지 않았다.

II. 유전자 변형 우유로부터의 IgG의 정제

먼저 도 5와 관련하여, 유전자 변형 우유, 예를 들어, 유전자 변형 포유동물로부터의 우유로부터 IgG 모노클로날 항체를 정제하는 예시적인 공정 및/또는 공정들을 상세히 설명하는 흐름 다이아그램이 주목된다. 흐름 다이아그램의 블록은 또한, 이러한 섹션 전반에 걸쳐 참조된다.

초기에, 흡착제는 블록(502)에서 제조된다. 블록(504)에서 흡착제는 이후에 크로마토그래픽 컬럼에 로딩된다. 공정은 블록(506)으로 이동하며, 여기서, 액체 형태의 유청 단백질, 하기에서 "유청"은 블록(506)에서 IgG 모노클로날 항체를 단리하기 위해 흡착제 로딩된 크로마토그래픽 컬럼을 통해 진행된다. 단리된 IgG 모노클로날 항체는 흡착제에 결합된다.

블록 (506) 이전에, 블록 (505)에서, 유청은 우유로부터 유청을 수득하는 통상적인 공정에 의해 유전자 변형 우유로부터 수득된다. 예를 들어, 유청을 형성시키기 위해, 유전자 변형 우유는 가열되며, 레넷(rennet) 또는 식용 산이 첨가된다. 이는 유전자 변형 우유를 응고시키거나 분리시켜, 액체 유청으로부터 우유 고형물(응유(curd))을 분리시킨다.

공정은 블록 (506)에서 블록 (508)로 이동하며, 여기서, 블록 (510)에서 단리된 IgG 모노클로날 항체를 수득하기 위해 단리된 IgG 모노클로날 항체는 흡착제로부터 용리된다. 이러한 단리된 IgG는 여러 생성물에 대해 적합하다.

블록 (506)으로 되돌아가서, 비-IgG 모노클로날 항체 생성물은 크로마토그래피 컬럼의 흡착제에 결합하지 않는데, 이는 블록 (512)에서 선택적으로 수집될 수 있다.

블록 (502, 504, 506, 508, 510, 및 512)의 공정들은 요망되는 한 반복될 수 있다.

A. 흡착제 제조(혼합 모드 제조)(도 1, 블록 (502))

혼합 모드(흡착제), 즉 신규한 수지 조합물 및 이의 제조 방법은 이온 교환, 소수성, 및 다공도의 원리를 포함하는 일부 중요한 물질 성질들을 조합하기 위해 제공된다.

혼합 모드 흡착제를 크로마토그래픽 컬럼에 채웠다. 흡착제를 컬럼에서 pH 6에서 완충 용액 0.1M 소듐 아세테이트에 의해 평형 상태를 유지하게 하였다. pH 7(일부 점적의 1N NaOH)로 처리된 우유 유청(우유에는 카제인이 존재하지 않음) pH 4.5을 컬럼에 로딩하였다. 평형화된 완충제에 의한 컬럼의 세척 후에 결합하는 IgG의 흡착을 수행하였다. 최종 1N NaOH 중에 pH 5, pH 6, pH 7, 및 pH 8로 차이가 나는 0.36M 암모늄 아세테이트(NH₄Ac) 완충제의 용액으로 스텝 구배에 의해 탈착을 형성시켰다.

일부 실시예는 본 발명의 구현예의 구조의 가능성을 나타내기 위해 기술된 것이다. 얻어진 데이타는 본 발명의 구조 및 매질 상에서 유청 단백질의 분리 및 정제와 관련이 있다. IgG의 수에서 모든 유청 단백질이 새로운 구조에 의해 흡착된다는 것으로 나타났다. 흡착 조건은 고순도를 갖는 단백질의 단리의 가능성을 제공하며, 모든 회수는 예를 들어, 흡착 pH, 구조의 소수성 기여, 및 기공의 크기와 같은 인자 및 파라미터에 기인한 것이다.

기술된 실시예는 본 발명의 구현예의 폴리머 크로마토그래픽 물질의 넓은 적용 가능성을 한정하지 않는다.

흡착제 물질을 상기에 상세히 기술된 흡착제 물질 또는 매질에 따라 제조하였다.

A.1. 혼합 모드 (흡착제) 제조

이러한 흡착제 제조는 "혼합 모드 제조"에 대해 상기에 상세히 기술된 실시예에 따른 것이다.

B. 유청 단백질의 크로마토그래피

4 ml의 혼합 모드 분획 100 ㎛ 내지 200 ㎛를 내부 직경이 1.6 cm이고 높이가 2 cm인 컬럼에 도입하고, 1M NaOH 및 1M HCl로 컨디셔닝시켰다. 마지막으로, 흡착제를 컬럼에서 pH 4.7 흡수에서 0.1M 아세테이트 완충제로 평형상태로 유지시켰다. 50 ml의 우유 유청을 0.6 ml/min의 유량으로 적용하였다.

세척: 0.1M 아세테이트 완충제 pH 4.7.

용리: 1M NaOH 중의 pH 4.5; 5; 5.2; 5.5; 6.0; 7.0; 8.0로 차이가 나는 0.36M 암모늄 아세테이트 완충제

크로마토그래픽 분리의 결과는 도 7, 도 8 및 도 9에 도시되어 있다. 컬럼으로부터 용리된 유청 단백질의 프로파일(그래프), 및 Coomassie Brilliant Blue G-250으로 염색된 용리된 피크의 환원 12.5% SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 분석이 존재한다.

도 6은 혼합 모드 수지 상에서 유청 단백질의 흡착 시험을 도시한 것이다. 라인 1은 가공되지 않은 초기 유청의 단백질을 나타낸 것이다.

라인 2, 라인 3은 큰 기공 혼합 모드에 대한 크로마토그래피로부터 0.36M NH₄Ac 완충제 pH 5 내지 5.5로 용리된 분획이다.

이러한 얻어진 데이타는 가공되지 않은 초기 유청의 내용물(라인 3)에 따른 큰 기공 혼합 모드(레인 5, 6) 상에서 모든 유청 단백질의 흡착을 나타낸다. IgG 흡착이 나타난다. 저분자량 유청 단백질은 작은 기공의 신규한 구조 상에서 분리된다(레인 1, 2). 기공 크기, 소수성 기여, 및 pH가 상이한 신규한 구조에 의한 흡착 및 용리 조건의 최적화는 IgG(IgG 모노클로날 항체) 정제를 실현시킬 수 있다.

도 7은 큰 기공 혼합 모드 수지(흡착제 물질) 상의 유청 단백질의 크로마토그래피를 도시한 것이다. IgG(예를 들어, IgG 모노클로날 항체)가 다른 단백질에서 단리된다는 것이 나타난다(레인 3, 4). IgG 정제를 위하여, pH 흡착-탈착 조건의 최적화가 요구된다.

도 8은 유청의 초기 pH에서 큰 기공 혼합 모드 수지(예를 들어, 흡착제 물질)에 의한 유청 단백질의 크로마토그래피를 도시한 것이다. 기술된 데이타로부터, 유청 단백질의 초기 pH 수치에서의 흡착이 저분자량(MM) 단백질로부터 제2 단계 분리를 가능하게 하는 것을 나타낸다.

도 9는 작은 기공 크기 및 상당한 소수성 양과 함께 혼합 모드 수지(예를 들어, 흡착제 물질) 상에서의 유청 단백질의 크로마토그래피를 도시한 것이다. 준비된 데이타는, 작은 크기의 기공 및 요망되는 소수성 기여를 갖는 신규한 구조가 낮은 MM 단백질의 분리를 가능하게 함을 나타낸다. pH 4에서의 흡착 조건은 유청 단백질의 초기 pH 값이다.

용어 "포함하다," "포함하는," "갖는" 및 이의 활용어(conjugate)는 "...을 포함하지만 이로 제한되지 않는"을 의미한다. 이러한 용어는 용어 "...로 이루어진(consisting of)" 및 "...를 본질적으로 포함하는(consisting essentially of)"을 포함한다.

구 "본질적으로 포함하는"은 조성물 또는 방법이 추가적인 구성성분 및/또는 단계를 포함할 수 있지만, 추가적인 구성성분 및/또는 단계가 청구된 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특징들을 실질적으로 변경시키지 않는 경우만을 의미한다.

본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 적어도 하나의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.

단어 "예시적인"은 "일 예로서, 경우 또는 예시를 제공하는 것"을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. "예시적인" 것으로서 기술되는 임의 구현예는 반드시 다른 구현예에 비해 바람직하거나 유리한 것으로서 해석되고/거나 다른 구현예로부터의 특징들의 도입을 배제하는 것은 아니다.

단어 "선택적으로"는 "일부 구현예에서 제공되고 다른 구현예에서 제공되지 않는" 것을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 본 발명의 임의 특정 구현예는 이러한 특징들이 충돌하지 않는 한 복수의 "선택적" 특징을 포함할 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구현예는 범위 포맷(range format)으로 제시될 수 있다. 범위 포맷으로의 설명은 단지 편의 및 간결성을 위한 것이고 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되지 않는 것으로 이해될 것이다. 이에 따라, 범위의 설명은 상세하게 기술된 모든 가능한 하위범위, 뿐만 아니라, 그러한 범위 내의 개개 수치를 갖는 것으로 고려될 것이다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6, 등과 같은 상세하게 기술된 하위범위, 뿐만 아니라 그러한 범위 내의 개개 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 갖는 것으로 고려될 것이다. 이는 범위의 폭(breadth)과는 무관하게 적용한다.

수치 범위가 본원에 명시되는 경우에, 명시된 범위 내의 임의 인용된 수치(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 구 제1 지시 숫자 및 제2 지시 숫자 사이의 "범위에 이르는/사이의 범위" 및 제1 지시 수 "내지" 제2 지시 숫자의 범위에 이르는/범위"는 본원에서 교호적으로 사용되고, 제1 지시 숫자 및 제2 지시 숫자, 및 이들 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.

양, 범위 및 크기, 치수 및 다른 측정 가능한 양을 표현할 때, 단어 "대략" 및 "약"은 교호적으로 사용된다.

명확하게 하기 위하여, 별도의 구현예의 문맥에 기술되는 본 발명의 특정 특징들이 또한, 단일 구현예의 조합으로 제공될 수 있는 것으로 인식된다. 반대로, 간결하게 하기 위해, 단일 구현예의 문맥에 기술되는 본 발명의 다양한 특징은 또한, 별도로 또는 임의 적합한 하위조합으로, 또는 본 발명의 임의 다른 기술된 구현예에서 적합한 것으로서 제공될 수 있다. 다양한 구현예의 문맥에서 기술된 특정 특징들은 구현예가 이러한 구성요소 없이 작동 불가능하지 않은 경우에, 이러한 구현예의 필수적인 특징을 고려하지 않는다.

본 발명이 이의 특정 구현예와 함께 기술되지만, 다수의 대안예, 개질예 및 변형예가 당업자에게 명백하게 될 것이라는 것이 분명하다. 이에 따라, 첨부된 청구항들의 사상 및 넓은 범위 내에 속하는 모든 이러한 대안예, 개질예, 및 변형예를 수용하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 언급된 모든 공개문, 특허 및 특허 출원은 이의 전문이 본원에 명세서에 각 개개 공개문, 특허 또는 특허 출원이 본원에 상세하게 그리고 개별적으로 참고로 포함되도록 명시되는 것과 같은 정도로 참고로 포함된다. 또한, 이러한 출원에서 임의 참조문헌의 인용 또는 확인은 이러한 참조문헌이 본 발명에 대한 종래 기술로서 입수 가능한 것을 인정하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 섹션 헤딩(section heading)이 사용되는 정도까지, 이러한 것은 반드시 제한적인 것으로서 해석되지 않아야 한다.

Claims

대략 5:95 내지 대략 40:60의 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 용적비의, 매트릭스를 한정하는 복수의 가교된 모노비닐 모노머를 포함하는 흡착제 물질(sorbent material)로서, 매트릭스가 대략 5 내지 대략 9의 pH 범위로 완충 가능하고 대략 10 마이크로미터 내지 대략 300 마이크로미터의 입자크기의 입자인 흡착제 물질.
제1항에 있어서, 입자 크기가 대략 100 마이크로미터 내지 대략 200 마이크로미터인 흡착제 물질.
제2항에 있어서, 입자가 대략 500 옹스트롱 내지 대략 3 마이크로미터 크기의 기공들을 포함하는 흡착제 물질.
제3항에 있어서, 기공들이 서로 상호 연결되어 있는 흡착제 물질.
제1항에 있어서, 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 용적이 대략 20:80인 흡착제 물질.
제1항에 있어서, 매트릭스가 대략 7의 pH로 완충 가능한 흡착제 물질.
제1항에 있어서, 모노비닐 모노머가 대략 0.1 meq/ml 내지 대략 1.5 meq/ml의 카복실 기를 포함하는 흡착제 물질.
제7항에 있어서, 카복실 기가 대략 0.7 meq/ml인 흡착제 물질.
제1항에 있어서, 모노비닐 모노머가 아크리란을 포함하는 모노비닐 산 및 부틸아크릴레이트, 3차-부틸아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 옥틸 및 페닐 아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 포함하는 소수성 비닐-함유 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 흡착제 물질.
제1항에 있어서, 모노비닐 모노머가 에틸렌성 치환된 아민, 알릴아민, N-알킬에틸렌아민 및 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트를 포함하는, 치환된 아민을 포함하는 비닐 함유 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 흡착제 물질.
제1항에 있어서, 모노비닐 모노머가 부틸아크릴레이트, 3차-부틸아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 옥틸 및 페닐 아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 포함하는, 소수성 비닐 함유 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 흡착제 물질.
혈장으로부터 면역글로불린 G(IgG)를 단리시키는 방법으로서,
대략 5:95 내지 대략 40:60의 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 용적비의, 매트릭스를 한정하는 복수의 가교된 모노비닐 모노머를 포함하는 흡착제 물질로서, 매트릭스가 대략 5 내지 대략 9의 pH 범위로 완충 가능하고 입자 크기가 10 마이크로미터 내지 대략 300 마이크로미터인 흡착제 물질을 수득하는 단계로서;
흡착제 물질을 크로마토그래픽 컬럼에 배치시키는 단계; 및
혈장을 크로마토그래픽 컬럼을 통해 진행시켜 IgG를 단리시키는 단계를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 흡착제 물질로부터 혈장의 단리된 IgG를 분리시키는 것을 추가적으로 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 흡착제 물질로부터 혈장의 IgG의 분리가 용리에 의해 수행되는 방법.
제14항에 있어서, 혈장이 가공되지 않은 혈장인 방법.
제15항에 있어서, 가공되지 않은 혈장이 포유동물 혈장인 방법.
제15항에 있어서, 가공되지 않은 혈장이 인간 혈장인 방법.
우유의 유청으로부터 면역글로불린 G(IgG) 모노클로날 항체를 단리시키는 방법으로서,
대략 5:95 내지 대략 40:60의 소수성 모노비닐 모노머 대 친수성 모노비닐 모노머의 용적비의, 매트릭스를 한정하는 복수의 가교된 모노비닐 모노머를 포함하는 흡착제 물질로서, 매트릭스가 대략 5 내지 대략 9의 pH 범위로 완충 가능하고 입자 크기가 대략 10 마이크로미터 내지 대략 300 마이크로미터인 흡착제 물질을 수득하는 단계;
흡착제 물질을 크로마토그래픽 컬럼에 배치시키는 단계; 및
우유의 유청 단백질을 크로마토그래픽 컬럼을 통해 진행시켜 IgG 모노클로날 항체를 단리시키는 단계를 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 우유가 유전자 변형 우유를 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 유전자 변형 우유가 포유동물의 것인 방법.