KR20160081977A - 세포사멸-촉진 활성을 가지는 gd2-o-아세틸화된 강글리오사이드에 대한 항체 - Google Patents

세포사멸-촉진 활성을 가지는 gd2-o-아세틸화된 강글리오사이드에 대한 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능성 단편 및 이의 치료에의 용도에 관한 것으로서, 상기 항체는 하기를 포함한다: a) 하기의 아미노산 서열을 가지는 3개의 경쇄 상보성 영역: 경쇄 CDR1: QSLLKNNGNTFL (SEQ ID NO: 1), 경쇄 CDR2: KVS, 경쇄 CDR3: SQSTHIPYT (SEQ ID NO: 2); 및 면역글로불린 경쇄의 경쇄 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄, 상기에서 상기 프레임워크 서열은 인간 카파 (κ)CL 도메인을 포함함; 및 b) 하기의 아미노산 서열을 가지는 3 개의 중쇄 상보성 영역(CDRs): 중쇄 CDR1: EFTFTDYY (SEQ ID NO: 3), 중쇄 CDR2: IRNRANGYTT (SEQ ID NO: 4), 중쇄 CDR3: ARVSNWAFDY (SEQ ID NO: 5), 및 면역글로불린 중쇄의 중쇄 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄, 상기에서 상기 프레임워크 서열은 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 및 돌연변이 되어 인간 IgG 서브클레스에 전형적인 CH1 및 경쇄 사이의 페어링을 회복하거나 또는 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 비-IgG1 서브클레스의 CH1 도메인으로 치환되는 CH1 도메인을 포함함.

Description

세포사멸-촉진 활성을 가지는 GD2-O-아세틸화된 강글리오사이드에 대한 항체{ANTIBODY AGAINST GD2-O-ACETYLATED GANGLIOSIDE WITH PRO-APOPTOTIC ACTIVITY}
본 출원은 2013년 11월 11일에 출원된 유럽특허출원 번호 EP 13005298.8호의 이익을 향유하며, 이는 여기에 참고로서 편입된다.
본 발명은 신규 항체 및 이의 암 치료에 대한 용도를 제공한다.
본 발명자들은 신경외배엽 오리진(neuroectodermal origin) 암이 특이적으로 GD2-O-아세틸화된 갱글리오사이드를 발현한다는 점 및 GD2-O-아세틸화된 갱글리오사이드를 타케팅하는 치료적 항체(mAb 8B6)가 투여되어 신경독성 없이 유리한 효과를 보일 수 있으며, 특히 이는 건강한 세포, 특히 말초 신경세포 상에서 상기 암 항원 발현의 부재에 기인된다는 점을 이미 밝혀낸 바 있다.
항-OAcGD2 뮤린 IgG3,κ mAb 8B6의 잠재적 활성이 [ALVAREZ-RUEDA et al. (PLoS One, vol.6(9), p:e25220, 2011)]에서 기술되었다. 상기 항체는 효과적인 ADCC 및 CDC in vitro 활성을 가지고 및 또한 세포사멸-촉진 활성을 나타낸다 (COCHONNEAU et al., Cancer Lett., vol.333(2), p: 194-204, 2013). 상기 항체는 in vitro 세포 사이클 정지(cell cycle arrest) 및 세포 사멸을 통해 배지 내 OAcGD2 양성 종양 세포의 증식을 억제하는 세포사멸성 경로에 의한 세포 사멸을 유도한다.
OAcGD2에 대한 mAb 8B6을 사용하여 수행된 수동 면역치료는 3가지 동물 모델에서 OAcGD2-발현 종양의 성장을 억제하는데 효과적이다. NK 세포의 용해성 기능이 mAb 8B6의 in vivo 활성의 필요조건이 아니라는 것이 입증되었다(COCHONNEAU et al., 전술됨, 2013).
휴머나이즈드 항체를 개발하기 위해, 본 발명자들은 인간-마우스 키메라 항체, c8B6 (IgG1,κ)를 발명하였다.
상기 c8B6 항체는 면역-감응성 마우스 종양 모델의 것과 비교하여 in vivo 활성을 보이는 반면, 뮤린 mAb 8B6과 비교하여 세포사멸-촉진 활성의 완벽한 소멸이 in vitro에서 관찰되었다. 따라서, mAb c8B6의 세포사멸-촉진 활성의 상실은 뮤린 IgG3 과 인간 IgG1 사이에 상이한 특정 구조의 상실에서 기인 된다는 것이 예측된다.
따라서, IgG1 인간 키메라가 가치있는 치료를 획득할 수 없다는 점이 결론되었다.
이제, 본 발명자들은 놀랍게도 c8B6의 CH1γ1에서의 특이적 돌연변이, 혹은 CH1γ3 에 의한 이의 치환이 세포사멸-촉진 활성의 회복을 야기한다는 것을 발견하였다. 결론적으로, c8B6 내, 인간 IgG1의 경쇄 및 중쇄 사이의 페어링 (이는 인간 CH1γ1 도메인 내 위치 133 근처 시스테인의 부재로 인해 이례적임)이 본 항체의 세포사멸-촉진 활성의 상실과 관련되는 것으로 보여진다.
따라서, 획득된 항체는 IgG1 특성-즉, ADCC 활성 및 긴 반감기-와 세포사멸-촉진 활성의 좋은 조합을 포함한다.
따라서, 본 발명은 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드를 인식하는 항체 또는 이의 기능성 단편과 관련되고, 상기 항체는 하기를 포함한다:
a) 하기의 아미노산 서열을 가지는 3개의 경쇄 상보성 영역:
i) 경쇄 CDR1: QSLLKNNGNTFL (SEQ ID NO: 1);
ii) 경쇄 CDR2: KVS;
iii) CDR3: SQSTHIPYT (SEQ ID NO: 2); 및
면역글로불린 경쇄의 경쇄 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄, 상기에서 상기 프레임워크 서열은 인간 카파 (κ) CL 도메인을 포함함; 및
b) 하기의 아미노산 서열을 가지는 3 개의 중쇄 상보성 영역(CDRs):
i) 중쇄 CDR1: EFTFTDYY (SEQ ID NO: 3);
ii) 중쇄 CDR2: IRNRANGYTT (SEQ ID NO: 4);
iii) 중쇄 CDR3: ARVSNWAFDY (SEQ ID NO: 5); 및
면역글로불린 중쇄의 중쇄 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄, 상기에서 상기 프레임워크 서열은 하기를 포함함:
1) 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 및
2) 돌연변이 되어 다른 IgG 서브클래스에 일반적인 CH1과 경쇄 사이의 페어링을 회복시키거나, 또는 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 비 IgG1-서브클래스의 CH1 도메인으로 치환되는, 인간 IgG1의 CH1 도메인.
본 발명은 또한 적어도 하나의 상기 항체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물과 관련된다.
게다가, 본 발명은 적어도 하나의 상기 항체 또는 적어도 하나의 항체의 기능성 단편을 포함하는 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법과 관련된다.
게다가, 본 발명은 적어도 하나의 상기 항체 또는 적어도 하나의 항체의 기능적 단편의 암을 치료 및/또는 예방하는 의약을 제조하는 용도와 관련된다.
끝으로, 본 발명은, 상기 항체의 인간 CH1γ1을 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브클레스의 일반적인 CH1 및 CL 도메인 사이의 페어링을 회복시키거나 또는 상기 인간 CH1γ1을 인간 IgG2 (CH1γ2), IgG3 (CH1γ3) 또는 IgG4 (CH1γ4)의 CH1 도메인으로 치환시키는 단계를 포함하는, O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체, 이의 유도체 또는 기능성 단편의 치료적 효율을 증가시키는 방법과 관련된다.
도 1은 c8B6 항체의 경쇄 및 중쇄 서열을 보여준다.
도 2는 301.14a 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 3은 301.14b 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 4는 301.15 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 5는 301.16 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 6은 301.17 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 7은 301.18 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 8은 301.19 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 9는 301.15b 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 10은 301.20 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 11은 301.21 항체의 CH1 및 힌지 도메인 서열을 보여준다.
도 12는 프로피디움 요오드에 의한 항-OacGD2 항체의 직접 세포독성을 보여준다.
첫 번째 양상에서, 본 발명은 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것으로서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
a) 하기의 아미노산 서열을 가지는 3개의 경쇄 상보성 영역(CDRs):
i) 경쇄 CDR1: QSLLKNNGNTFL (SEQ ID NO: 1);
ii) 경쇄 CDR2: KVS;
iii) 경쇄 CDR3: SQSTHIPYT (SEQ ID NO: 2); 및
면역글로불린 경쇄의 경쇄 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄, 상기에서 상기 프레임워크 서열은 인간 카파 (κ) CL 도메인을 포함함; 및
b) 하기의 아미노산 서열을 가지는 3개의 중쇄 상보성 영역:
i) 중쇄 CDR1: EFTFTDYY (SEQ ID NO: 3);
ii) 중쇄 CDR2: IRNRANGYTT (SEQ ID NO: 4);
iii) 중쇄 CDR3: ARVSNWAFDY (SEQ ID NO: 5); 및
면역글로불린 중쇄의 중쇄 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄, 상기에서 상기 프레임워크 서열은 하기를 포함함:
1) 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 및
2) 돌연변이 되어 다른 IgG 서브클래스에 일반적인 CH1과 경쇄 사이의 IgG 페어링을 회복시키거나, 또는 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 비 IgG1-서브클래스의 CH1 도메인으로 치환되는, 인간 IgG1의 CH1 도메인.
상기 항체는 GD2-O-아세틸화된 강글리오사이드를 발현하는 세포에 대한 회복된 세포사멸-촉진 활성을 가지고, 반면에 ADCC 활성 및 반감기와 같은 IgG1 특성도 또한 나타낸다.
항체는 4개의 폴리펩티드 체인, 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 두 개의 동일한 중(H) 쇄 (전체길이일 경우 약 50-70 kDa) 및 두 개의 동일한 경(L) 쇄 (전체길이일 경우 약 25kDa), 를 포함하는 테트라머에 상응하는 면역글로불린 분자이다. 경쇄는 카파 및 람다로 분류된다.
중쇄는 IgG에 대해 감마로 분류된다. 각 중쇄는 N-말단 중쇄 가변영역 (HCVR로 약칭됨) 및 중쇄 불변영역으로 구성된다. 중쇄 불변영역은 힌지 도메인과 함께 IgG에 대한 3개의 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)으로 구성된다.
각 경쇄는 N-말단 경쇄 가변영역 (LCVR로 약칭됨) 및 경쇄 불변영역으로 구성된다. 경쇄 불변영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. HCVR 및 LCVR 영역은, 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR)으로 명명되는 초가변성 영역 및 상기 영역 사이에 배치되고 프레임워크 영역(framework region: FR)으로 명명되는 좀 더 보존적인 영역으로 더 세분된다. 각 HCVR 및 LCVR은 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성되고, 이들은 다음의 순서대로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배치된다:: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각 도메인에 대한 아미노산의 배열(assignment)은 공지된 통상의 방법에 따른다 (IMGT, The International Immunogenetics Information System®, LEFRANC et al., Nucleic acids Research, vol. 27, p : 209-212, 1999). 특정 항원에 결합하는 항체의 기능적 능력은 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변영역에 의존적이고, CDRs에 의해 크게 결정된다.
본원에서 사용되는 용어 "기능성 단편"은 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하고 CH1 도메인을 포함하는 항체 단편을 의미한다. 상기 단편은 당업자에 의해 간단하게 확인될 수 있고, 예를 들어, Fab 단편 (예컨대, 파파인 소화에 의함), Fab' 단편 (예컨대, 펩신 소화 및 부분적 환원에 의함), F(ab')2 단편 (예컨대, 펩신 소화에 의함), Facb (예컨대, 플라스민 소화에 의함), 및 또한 Fd (예컨대, 펩신 소화, 부분적 환원 및 재-응집에 의함) 단편이 본 발명에 의해 포함된다.
상기 단편은 당해 분야에 공지된 및/또는 본원에서 기술되는, 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 항체는 또한 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단된(truncated) 형태로 생성될 수 있는데, 여기서 하나 또는 그 이상의 정지 코돈이 자연 정지 사이트의 업스트림에 도입된다. 예를 들어, F(ab')2 중쇄 부분을 인코딩하는 조합 유전자는 중쇄의 힌지 영역 및/또는 CH1 도메인을 인코딩하는 DNA 서열들을 포함하도록 디자인될 수 있다. 항체의 다양한 부분은 종래 기술들에 의하여 화학적으로 함께 연결될 수 있고, 또는 유전적 엔지니어링 기술을 사용하여 인접 단백질(contiguous protein)로 제조될 수 있다.
표현 " O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는"은 2 x 10-7 M 미만의 KD를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 모노클로날 항체 그 자체를 의미한다. 모노클로날 항체는 인간 항체, 키메라 항체 및/또는 휴머나이즈드 항체일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체는 재조합적으로 생성되는데, 이들을 휴머나이즈드 형태로 전환하기 위해 적당한 특이성을 가지는 일반적으로 뮤린 또는 다른 비-인간 항체들의 조작(manupulation)이 요구된다. 비록 글리코실화된 항체들이 바람직하지만, 항체들은 글리코실화되거나 또는 되지 않을 수 있다. 항체들은 종래 공지된 바와 같이 디설파이드 결합에 의하여 적절히 가교(cross-linked) 될 수 있다.
바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 항체는 키메라 항체이다. 표현 “키메라(chimeric) 항체”는 뮤린 면역글로불린의 가변영역 및 인간 면역 글로불린의 불변영역으로 구성된 항체를 의미한다. 이러한 치환은 인간 불변영역에 의한 마우스 불변영역의 단순한 대체로 구성되고, 따라서 약학적 사용에 허용될 수 있도록 충분히 낮은 면역원성을 가질 수 있는 인간/뮤린 키메라를 발생시킨다. 본 발명에서, 상기 키메라 항체는 인간 경쇄 및 중쇄의 불변영역을 포함한다. 상기 키메라 항체를 제조하는 수많은 방법이 보고되어 졌고, 따라서 당업자의 통상의 지식의 일부분을 형성한다 (참조, 예를 들어, U.S. Pat. No. 5,225,539).
또 다른 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 항체는 휴머나이즈드 (humanized) 항체이다.
“휴머나이즈드(humanized) 항체”는 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR)을 가지는 항체의 서열을 대체함으로써 인간 항체 생식 세포에서 유래된 아미노산 서열로 부분적으로 또는 전체적으로 구성되는 항체를 의미한다. 항체의 가변영역 및 종국적으로 CDR의 이러한 휴머나이제이션은 당해 분야에서 잘 알려진 기술에 의해 수행된다.
예를 들어, 영국 특허 출원 GB 2188638A 및 미국 등록 특허 번호 5,585,089는 항체의 치환되는 유일한 부분이 상보성 결정 영역, 또는 "CDR"인 재조합 항체의 제조방법을 개시하고 있다. 상기 CDR 그래프팅(grafting) 기술은 불변영역, 인간 가변영역 프래임워크 및 뮤린 CDR로 구성되는 항체들을 발생시키는데 사용돼 왔다. (예를 들어, RIECHMANN et al., Nature , vol.332, p: 323-327, 1988 참조). 상기 항체들은 Fc 의존성 이펙터 기능에는 필수적이지만, 항체에 대해 면역반응을 유발할 가능성은 매우 작은 인간 불변 영역을 보유한다.
일 예로, 가변영역의 프래임워크 영역은 비-인간 CDR 을 실질적으로 온전하게 남기거나 또는 심지어 CDR 을 인간 지놈에서 유래된 서열로 대체하는 상응하는 인간 프래임워크 영역에 의해 치환된다. 전체 인간 항체는 면역 시스템이 상응하는 인간 면역 시스템으로 대체되는 유전적으로 변형된 마우스에서 생성된다. 전술된 바와 같이, 단일 체인 형태를 나타내는 프래그먼트를 포함하는 면역학적으로 특이적인 항체 단편을 채택하는 것은 본 발명의 방법에서 사용되기에 충분하다.
휴머나이즈드 항체는 또한 인간 프래임워크, 적어도 하나의 비-인간으로부터의 CDR을 포함하는 항체를 의미하고, 여기에 존재하는 임의의 불변영역은 인간 면역글로불린 불변영역과 실절적으로, 예를 들어 적어도 85 또는 90%, 바람직하게는 적어도 95% 동일하다. 따라서 아마도 CDR을 제외한 휴머나이즈드 항체의 모든 부분은, 하나 또는 그 이상의 원래 인간 면역 글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하게 된다. 예를 들어, 휴머나이즈드 면역글로불린은 일반적으로 키메라 마우스 가변영역/인간 불변영역 항체를 포함하지 않을 것이다.
휴머나이즈드 항체 또는 키메라 항체는 비-인간 항체에 비하여 인간 치료에 사용에 있어서 적어도 3 개의 잠재적인 이점을 가진다:
1) 이펙터 부분 (effector portion)이 인간이기 때문에 이는 인간 면역 시스템의 다른 부분들과 더 잘 상호작용 할 수 있다 (예를 들어, 상보성-의존 세포독성(CDC) 또는 항체-의존 세포 독성 (ADCC)에 의해 타겟 세포를 더 효율적으로 파괴한다).
2) 인간 면역 시스템은 프래임워크 또는 휴머나이즈드 항체의 C 영역을 외부의 것으로 인식할 수 없고, 따라서 이러한 주입된 항체들에 대한 항체 반응은 전체적으로 외부 비-인간 항체 또는 부분적으로 외부 키메라 항체들에 비하여 덜하게 된다.
3) 주입된 비-인간 항체들은 이들의 인간 순환시스템 내에서의 반감기가 인간 항체들의 반감기보다 매우 짧은 것으로 보고되고 있다. 주입된 휴머나이즈드 항체는 그 반감기가 자연적으로 발생 된 인간 항체들과 실질적으로 동일할 것이고, 이는 주입 용량의 더 소량화 그리고 덜 자주 주입이 가능하도록 한다.
예를 들어, 휴머나이즈드 면역글로불린의 디자인은 다음에 따라 수행될 수 있다: 아미노산이 다음의 카테고리에 속하는 경우, 사용될 인간 면역글로불린의 프래임워크 아미노산 서열(수용자 면역 글로불린)은 CDR-제공 비-인간 면역글로불린 으로부터의 아미노산 프래임워크(공여자 면역글로불린)에 의해 대체된다: (a) 수용자 면역 글로불린의 인간 프래임워크 영역 내 아미노산이 해당 포지션에서의 인간 면역글로불린에 일반적이지 않은 반면, 이에 상응하는 공여자 면역글로불린 내 아미노산이 해당 포지션에서의 인간 면역 글로불린에 일반적인 경우; (b) 아미노산의 포지션이 CDRs의 하나에 바로 인접한 경우; 또는 (c) 3차원 면역글로불린 모델에서 프래임워크 아미노산의 임의의 사이드체인 원자가 CDR 아미노산의 임의의 원자와 약 5-6 암스트롱 (중심-대-중심) 범위 내인 경우 (QUEEN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p:2869, 1991). 수용자 면역글로불린의 인간 프래임워크 영역 내의 아미노산 각각 및 공여자 면역글로불린 내의 상응하는 아미노산이 그 포지션에서 인간 면역글로불린에 대해 일반적이지 않을 경우, 이러한 아미노산은 그 포지션에서 인간 면역글로불린에 일반적인 아미노산으로 대체된다.
유리하게도, 상기 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 6을 가지는 경쇄 가변영역 (LCVR) 및 SEQ ID NO: 7을 가지는 중쇄 가변영역 (HCVR)을 포함한다.
Figure pct00001
인간 카파 (κ) CL 도메인은 당업자에게 잘 알려졌고, 예를 들어, SEQ ID NO: 8.에 대응된다.
Figure pct00002
바람직하게는, 본 발명의 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 9를 가지는 경쇄를 포함한다.
Figure pct00003
인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인은 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대 SEQ ID NO: 10에 대응된다.
Figure pct00004
Figure pct00005
인간 IgG1의 CH1 도메인은 당업자에게 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 "돌연변이 되어 다른 IgG 서브클레스에 일반적인 CH1와 경쇄 사이의 페어링을 회복시키는 CH1 도메인"은, 인간 IgG1의 인간 CH1 도메인을 의미하고, 상기에서 아미노산이 시스테인 잔기에 의해 치환되어, 바람직하게는 CH1 서열의 133 또는 134 위치에 시스테인 잔기를 나타내는 인간 CH1 도메인을 의미한다. 불변영역의 넘버링(numbering)은 Kabat et al. (1991, NIH Publication n°91-3242, National technical Information Service Springfield, VA)에서 규정된 EU 인덱스의 넘버링이다. 예를 들어, 인간 IgG1의 CH1 도메인은 SEQ ID NO: 29에 대응된다. 상기 CH1 도메인이 돌연변이 되어 다른 IgG 서브클레스에 일반적인 CH1 및 경쇄 사이의 전형적 IgG 페어링이 회복되는 경우, CH1 도메인은 위치 133의 세린 잔기가 시스테인으로 치환된 아미노산 서열 SEQ ID NO: 11, 또는 위치 134의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 아미노산 서열 SEQ ID NO: 30에 대응된다. CH1 서열의 133 또는 134 위치의 시스테인 잔기는 본 발명의 항체의 경쇄 및 중쇄 사이에 결합 된 디설파이드를 회복시킨다.
Figure pct00006
인간 IgG2, IgG3, 및 IgG4의 CH1 도메인은 당업자에게 공지되어있다. 예컨대, 인간 IgG2 CH1 도메인은 SEQ ID NO: 31에 대응되고, 인간 IgG3의 CH1 도메인은 SEQ ID NO: 12에 대응되며, 및 인간 IgG4의 CH1 도메인은 SEQ ID NO: 32에 대응된다.
Figure pct00007
첫 번째 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 서열의 133 또는 134 위치에 시스테인 잔기를 나타내는 인간 IgG1의 돌연변이 된 CH1 도메인을 포함하고, 바람직하게는 상기 도메인은 서열 SEQ ID NO: 11을 가진다.
여전히 바람직하게는, 상기 항체는 301.14a, 301.14b, 301.16 및 301.18을 포함하는 군에서 선택된다.
두 번째 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키메라 항체는 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 도메인을 포함하고, 바람직하게는 상기 도메인은 서열 SEQ ID NO: 12와 같은 IgG3의 CH1 도메인이다.
여전히 바람직하게는 상기 항체는 301.15, 301.15b, 301.17 및 301.19를 포함하는 군에서 선택된다.
본 발명의 키메라 항체는 또한 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이들의 유도체의 힌지 도메인을 포함한다.
인간 IgG1의 힌지 도메인은 당업자에게 공지되어 있고, 예컨데, SEQ ID NO: 13에 대응된다. 인간 IgG1 힌지 도메인의 유도체는, 힌지 서열의 5번째 위치의 시스테인 잔기가 다른 잔기에 의해 치환되는 힌지 도메인에 일반적으로 상응한다. 사실상, 상기 돌연변이는 다른 IgG 서브클레스에 일반적인 구조의 회복을 야기한다. 상기 유도체의 예로, SEQ ID NO: 14가 인용될 수 있다.
Figure pct00008
인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 힌지 도메인은 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 IgG3에 대한 SEQ ID NO: 15에 대응된다. 인간 IgG3의 유도체는 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 SEQ ID NO: 16 내지 19, 바람직하게는 SEQ ID NO: 19에 대응된다.
Figure pct00009
세 번째 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 항체는 인간 IgG1 또는 이의 유도체의 힌지 도메인을 포함하고, 바람직하게는 상기 도메인은 서열 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14를 포함한다.
여전히 바람직하게는, 상기 항체는 301.14a, 301.14b, 301.15, 301.15b, 301.20 및 301.21를 포함하는 군에서 선택된다.
네 번째 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 항체는 인간 IgG2, IgG3, IgG4 또는 이들의 유도체의 힌지 도메인을 포함하고, 바람직하게는 상기 도메인은 인간 IgG3의 도메인이고 SEQ ID NO: 15 내지 SEQ ID NO: 19로 구성된 군에서 선택되는, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 19인 서열을 가진다.
여전히 바람직하게는, 상기 항체는 301.16, 301.17, 301.18 및 301.19로 구성된 군 내에서 선택된다.
바람직한 다섯 번째 구현예에 따라, 본 발명의 항체는 하기를 포함한다:
1) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 9를 가지는 경쇄,
2) 하기로 구성되는 중쇄:
- 서열 SEQ ID NO: 10을 가지는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인,
- 하기를 포함하거나 또는 하기로 구성되는 인간 CH1 및 힌지 도메인에 상응하는 아미노산 서열:
Figure pct00010
여전히 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 항체는 301.15, 301.18 및 301.19 항체 중에서 선택된다.
사실상, 상기 항체는 본래의 항체보다 예상 밖으로 더 큰 세포사멸-촉진 활성을 보인다.
여전히 바람직하게는, 본 발명의 항체는 301.15 항체이다.
사실상, 본 항체는 원래의(original) 항체의 결합 협동성을 나타내는 유일한 항체이다.
바람직하게는, 서열의 133 또는 134 위치에서 시스테인 잔기를 나타내는 인간 IgG1의 돌연변이된 CH1 도메인에 의한, 혹은 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 도메인에 의한 본 발명의 항체 내 시스테인 잔기의 삽입은 다른 시스테인 잔기와 이전에 연결된 어느 자유 티올(thiol) 기도 유리시키지 않는다.
본 발명의 항체는 면역접합체를 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "면역접합체"는 제2 분자, 바람직하게는 세포독성 제제 또는 방사성 동위원소에 접합된(conjugated) 적어도 하나의 키메라 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 접합 분자를 의미한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 공유 결합(covalent linkage)에 의해 상기 제2 분자에 결합된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 면역접합체이다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 면역접합체로서, 상기 면역접합체는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편 및 세포독성 제제를 포함한다.
또 다른 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 면역접합체로서, 상기 면역접합체는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편 및 방사성동위원소를 포함한다.
두 번째 양상에서, 본 발명은 전술된 적어도 하나의 항체 또는 이의 적어도 하나의 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료용 약학적 조성물과 관련된다.
상기 조성물은 특히 GD2-O-아세틸화된 강글리오사이드를 발현하는 암을 치료하는데 유용하다.
상기 조성물은 환자에의 투여에 적합한 임의의 약학적인 형태일 수 있는데, 비 제한적으로, 여기에는 용액, 서스펜션, 동결건조된 파우더, 캡슐 및 정제가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 첨가제 또는 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 주사, 예를 들어, 국소 주사, 경점막 투여, 흡입, 경구 투여 및 더욱 일반적으로는 당업자가 원하는 치료를 달성하기에 적합하다고 볼 수 있는 임의의 제형으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 약학적 조성물에 의도된 목적을 달성하는데 유효한 용량으로 및 선택된 투여 경로에 적합한 투여용량으로 함유될 수 있다.
더욱 상세하게는, 치료학적으로 유효한 용량은 암을 가진 개체의 증상을 예방, 완화 또는 개선시키는데 유효한 조성물의 용량을 의미한다.
의도된 적용에 따라서, 본 발명의 키메라 항체는 부가적인 구성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 키메라 항체는 면역접합체에 상응할 수 있다.
본 발명의 세 번째 양상은 전술된 적어도 하나의 키메라 항체 또는 적어도 하나의 이의 기능적 단편을 포함하는 전술된 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 단계를 포함하는 GD2-O-아세틸화된 강글리오사이드를 발현하는 암을 치료하는 방법과 관련된다.
본원에서 사용되는 용어 "환자"는 포유동물, 바람직하게는 인간을 의미한다.
바람직하게는, 이를 필요로 하는 환자는 GD2-O-아세틸화된 강글리오사이드를 발현하는 암에 걸린 환자에 대응된다. 상기 GD2-O-아세틸화된 강글리오사이드를 발현하는 암은 신경아세포종, 흑색종, 교아종, 소세포 폐암, 유방암 및 암줄기세포 암으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 네 번째 양상은, O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체, 이의 유도체 또는 기능성 단편의 치료적 효율을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 항체의 인간 CH1γ1을 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브클래스에 일반적인 CH1 및 CL 도메인 사이의 페어링을 회복시키거나 또는 상기 인간 CH1γ1 도메인을 인간 IgG2 (CH1γ2), IgG3 (CH1γ3) 또는 IgG4 (CH1γ4)의 CH1 도메인에 의해 치환시키는 단계를 포함한다.
상기 치료적 효율을 증가시키는 방법은 상기 항체의 세포사멸-촉진 활성을 증가시키는 것을 포함한다.
첫 번째 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인을 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브클레스에 일반적인 CH1 및 CL 도메인 사이의 페어링을 회복시키는 단계를 포함한다.
인간 IgG1의 CH1 도메인은 당업자에게 공지되어 있다.
O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인은 도 1에서 제시될 수 있다.
유리하게는, O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인을 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브클레스에 일반적인 CH1 및 CL 도메인 사이의 페어링을 회복시키는 단계는 하기에 의해 수행된다:
a) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인을 포함하는 핵산 서열을 분리하는 단계, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 항체의 중쇄를 인코딩함;
b) 코돈, 바람직하게는 상기 CH1 도메인의 위치 133 또는 134를 인코딩하는 코돈을 아미노산 잔기 시스테인(C)을 인코드하도록 돌연변이 시켜 돌연변이 된 핵산 서열을 제공하는 단계;
c) 돌연변이 된 핵산 서열에 작동가능한 발현 인자를 제공하는 단계;
d) 돌연변이 된 핵산을 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 적당한 숙주 내에서 공-발현시켜 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 돌연변이된 인간 IgG1 항체, 유도체 또는 기능성 단편을 제공하는 단계; 및
e) 임의로, 돌연변이 된 항체, 이의 유도체 또는 단편을 분리하는 단계.
두 번째 바람직한 구현예에서, 본 발명은 상기 인간 IgG1의 CH1 도메인을 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 도메인으로 치환하는 단계를 포함한다.
인간 IgG2, IgG3 및 IgG4의 CH1 도메인은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 인간 IgG3의 CH1 도메인은 SEQ ID NO: 12에 대응된다.
유리하게는, O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인을 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 도메인으로 치환하는 단계는 하기에 의해 수행된다:
a) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인을 포함하는 핵산 서열을 분리하는 단계, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 항체의 중쇄를 인코딩함;
b) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체 핵산의 상기 CH1 도메인을 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산 서열로 치환하여 돌연변이 된 핵산 서열을 제공하는 단계;
c) 돌연변이 된 핵산 서열에 작동가능한 발현 인자를 제공하는 단계;
d) 돌연변이 된 핵산을 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 적당한 숙주 내에서 공-발현시켜 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 돌연변이된 인간 IgG1 항체, 유도체 또는 기능성 단편을 제공하는 단계; 및
e) 임의로, 돌연변이 된 항체, 이의 유도체 또는 단편을 분리하는 단계.
여전히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 힌지 IgG1 도메인을 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브클래스의 일반적인 힌지 및 CH2 도메인 사이의 페어링을 회복시키는 단계, 또는 상기 항체의 인간 힌지 IgG1 도메인을 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 힌지 도메인 또는 이들의 유도체로 치환시키는 단계를 추가로 포함한다.
인간 IgG1 의 힌지 도메인은 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대 SEQ ID NO: 13에 대응된다.
본원에서 사용되는, "O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 힌지 도메인을 돌연변이 하여 다른 IgG 서브클레스에 일반적인 힌지 및 CH2 도메인 사이의 페어링을 회복시키는" 단계는, 힌지 proteic 서열의 5번째 위치의 시스테인 잔기가 또 다른 잔기, 바람직하게는 세린으로 치환된, 상기 항체의 인간 IgG1 힌지 도메인을 의미한다. 사실상, 상기 돌연변이는 일반적인 IgG 구조의 회복을 야기한다. 상기 유도체의 예시로서, SEQ ID NO: 14가 인용될 수 있다.
유리하게는, 상기 항체의 인간 힌지를 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브클래스에 일반적인 힌지 및 CH2 사이의 페어링을 회복시키는 단계는 하기에 의해 수행된다:
a) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 힌지 도메인을 포함하는 핵산 서열을 분리하는 단계, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 항체의 중쇄를 인코딩함;
b) 상기 힌지 도메인의 위치 5의 아미노산 잔기 시스테인 (C)을 인코딩하는 코돈을 또 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린 잔기를 인코드하도록 돌연변이 시켜 돌연변이 된 핵산 서열을 제공하는 단계;
c) 돌연변이 된 핵산 서열에 작동가능한 발현 인자를 제공하는 단계;
d) 돌연변이 된 핵산을 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 적당한 숙주 내에서 공-발현시켜 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 돌연변이된 인간 IgG1 항체, 유도체 또는 기능성 단편을 제공하는 단계; 및
임의로, 돌연변이 된 항체, 이의 유도체 또는 단편을 분리하는 단계.
인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 힌지 도메인은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예컨대 IgG3에 대한 SEQ ID NO: 15에 대응된다. 인간 IgG3의 유도체도 당업자에게 잘 알려져있으며, 예컨대 SEQ ID NO: 16 내지 19, 바람직하게는 SEQ ID NO: 19에 대응된다.
여전히 유리하게는, 상기 항체의 인간 힌지 IgG1 도메인을 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이들의 유도체의 힌지 도메인으로 치환하는 단계는 하기에 의해 수행된다:
a) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 힌지 도메인을 포함하는 핵산 서열을 분리하는 단계, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 항체의 중쇄를 인코딩함;
b) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 힌지 도메인 핵산 서열을 인간 IgG2, IgG3, IgG4의 힌지 도메인 또는 이의 유도체를 인코딩하는 핵산 서열로 치환하여 돌연변이 된 핵산 서열을 제공하는 단계;
c) 돌연변이 된 핵산 서열에 작동가능한 발현 인자를 제공하는 단계;
d) 돌연변이 된 핵산을 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 적당한 숙주 내에서 공-발현시켜 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 돌연변이된 인간 IgG1 항체, 유도체 또는 기능성 단편을 제공하는 단계; 및
e) 임의로, 돌연변이 된 항체, 이의 유도체 또는 단편을 분리하는 단계.
본 발명의 다른 구현예 및 장점은 다음의 비-제한적 실시예에서 설명된다.
실시예
1-항- OAcGD2 항체의 in vitro 세포사멸-촉진 활성
제1단계로, 키메라 항-OAcGD2 항체, c8B6,가 이의 불변영역을 인간 IgG1,κ의 하나로 치환함에 의해 8B6으로부터 디자인되었다. 이의 서열이 도 1에서 제시된다 (SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 28).
상기 항체의 구조는 경쇄 내 2개의 분자내 디설파이드 결합 (Cys23-Cys93 및 Cys139-Cys199) 및 중쇄 내 4개의 분자내 디설파이드 결합 (Cys22-Cys98, Cys146-Cys202, Cys263-Cys323, 및 Cys369-Cys427)을 포함한다. 체인-내(intra-chain) 디설파이드 결합과 관련된 시스테인 잔기는 별(*)로 표시된다. 전체 구조는 3개의 분자간 디설파이드 결합에 의해 안정화된다: 경쇄의 마지막 시스테인 잔기와 상부 힌지 영역(Cys219-Cys222)의 시스테인 잔기 사이 하나의 디설파이드 결합에 의해 경쇄가 중쇄와 연결되고, 중쇄가 중간 힌지 (Cys228-Cys228 및 Cys231-Cys231) 내 시스테인을 연결하는 두 개의 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 체인-간(inter-chain) 디설파이드 결합과 관련된 시스테인 잔기가 화살표(↑)로 표시된다.
8B6 LCVR이 NotI-KasI로 pEvi 벡터 내에서 클로닝되어 인간 IgG1의 CL 도메인과 융합된다.
8B6 HCVR 도메인이 NotI-NheI로 pEvi’벡터 내에서 클로닝되어 인간 IgG1 중쇄의 불변 도매인과 융합된다.
이후, CHO K1 세포가 두 벡터에 의해 공-형질감염된다.
형질감염 후, CHO K1 세포가 무-혈청 배지에서 수일간 유지된다. 매일 배양 배지가 수득 되고, -80℃에서 동결된다. 세포 생존률이 70-80% 미만일 때까지 새로운 배지가 형질감염된 세포에 첨가된다.
수득된 배양 배지가 풀(pool)되고 항체는 세파로오스 기질 상에 고정된 단백질 A를 사용하여 정제된다.
CHO 내 c8B6의 생산이 환원조건 및 비-환원조건 둘 다에서 전기영동에 의해 분석되었다. 결과에 따르면, 비환원조건하에서, 저체 항체에 대응하여 150kDa에서의 하나의 밴드가 관찰되었다. 반면, 환원조건 하에서 HC에 대한 50kD에서의 밴드 및 LC에 대한 25kDa에서의 밴드가 관찰되었다. SUPERDEX Column 상 겔 여과는 150 kD에 대응되는 12.3 ml에서의 메인피크 (99.0%의 정제 순도)를 가지는 크로마토그램 프로파일을 나타내었다. 끝으로, 단백질 A 컬럼 상의 정제 후 키메라 c8B6의 제조 수율은 약 315 mg/L상청액이었다..
표적에 대한 항체의 결합은 GD2-O-아세틸화된 강글리오사이드를 발현하는 IMR5 세포 상 유동 세포분석법에 의해 확인되었다. 결합이 플루오레세인 이소시아네이트 (FITC)와 접합된 염소 항-인간 IgG에 의해 나타났다. 상기 실험에 의해 GD2-O-아세틸화에 결합하는 본 항체의 기능성이 확인되었다.
이후, c8B6 항체의 직접 세포독성이 MTT 에세이에 의해 평가되었다. 상기 에세이에서, 1 x 104 IMR5, SUM159PT 또는 H187 세포가 96-웰 마이크로플레이트 내에서 24시간 동안 37℃에서 인큐베이트되었다. 80-0.15 μg/mL의 항체가 첨가되었고 24시간 동안 37℃에서 인큐베이트되었다. MTT 50μg이 각 웰에 첨가되어 4시간 동안 37℃에서 인큐베이트된 후 세포가 10% SDS로 용해되고 37℃에서 O.N. 인큐베이트되었다. 흡광도가 이후 570 및 650nm에서 읽혀졌다. 650nm에서의 생산물의 흡광도를 570nm에서의 흡광도로부터 빼서(Abs570-Abs650), 염료의 총 전환 (Total conversion)이 산출되었다. 20 μg 에토포시드로 처치된 세포를 가지는 4개의 컨트롤웰이 0% 생존률을 부여하는 흡광도의 블랭크를 제공한다. 생존 억제율(%)이 비처치된 세포에 상대적인 비율로서 표시되었고, 각 값이 4회씩 평균 ± SEM로 표시되었다.
결과는 항체 c8B6가 뮤린 불변 IgG3 도메인에서 인간 IgG1 불변 도메인으로 옮겨짐에 의한 키메라화 단계에 의해 8B6의 직접 세포독성을 상실하였다는 것을 보여준다. 또한, 항체는 부모 IgG3 8B6의 협동성(cooperativity) 특성을 추가로 상실한다.
끝으로, 키메라화의 상이한 방법을 시도한 많은 실험에서, 매우 적은 세포사멸-촉진 활성만이 회복되었다는 것이 관찰되었고, 결합의 협동성은 관찰되지 않았다.
놀랍게도, 키메라화를 위한 CH1 불변 도메인의 특정 변형이 세포사멸-촉진 활성의 큰 변화를 야기한다.
상기 결과는 이전 구조체에 기초하여 디자인된 301.14a, 301.14b, 301.15, 301.15b, 301.16, 301.17, 301.18, 301.19, 301.20 및 301.21 항체를 사용하여 획득되었다.
항체 301.14a는 도 2 (SEQ ID NO: 20)에서 제시된 바와 같이 인간 힌지γ1 도메인을 가지는 돌연변이된 인간 CH1γ1 (강조된(underlined) 돌연변이 S133C)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
항체 301.14b는 도 3 (SEQ ID NO: 21) 에서 제시된 바와 같이, 돌연변이 된 인간 힌지γ1 도메인 (시스테인 222의 세린 잔기에 의한 치환에 대응되는 강조된 돌연변이, C222S)을 가지는 돌연변이 된 인간 CH1γ1 (강조된 돌연변이 S133C)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
항체 301.15는 도 4 (SEQ ID NO: 22) 에서 제시된 바와 같이, 인간 힌지γ1 도메인을 가지는 인간 CH1γ3 (이의 사촌 CH1γ1을 대체함)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
항체 301.15b는 도 9 (SEQ ID NO: 34)에 제시된 바와 같이, 돌연변이 된 인간 힌지γ1 도메인 (시스테인 222의 세린 잔기에 의한 치환에 상응하는 강조된 돌연변이, C222S)을 가지는 인간 CH1γ3 (이의 사촌 CH1γ1을 대체함)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
항체 301.16은 도 5 (SEQ ID NO: 23)에 제시된 바와 같이, 인간 힌지γ3 도메인 (이의 사촌 힌지γ1을 대체함)을 가지는 돌연변이된 인간 CH1γ1 (강조된 돌연변이 S133C)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
항체 301.17은 도 6 (SEQ ID NO: 24)에서 개시되는 바와 같이, 인간 힌지γ3 도메인 (사촌 힌지γ1을 대체함) 을 가지는 인간 CH1γ3 (이의 사촌 CH1γ1을 대체함)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
항체 301.18은 도 7 (SEQ ID NO: 25)에서 제시된 바와 같이, 단축된 (17개 아미노산) 인간 힌지γ3 도메인을 가지는 돌연변이 된 인간 CH1γ1 (강조된 돌연변이 S133C)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
항체 301.19는 도 8 (SEQ ID NO: 26)에서 제시된 바와 같이, 단축된 (17개 아미노산) 인간 힌지γ3 도메인을 가지는 인간 CH1γ3 (이의 사촌 CH1γ1을 대체함)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
항체 301.20는 도 10 (SEQ ID NO: 31)에서 제시된 바와 같이, 인간 힌지γ1 도메인을 가지는 인간 CH1γ2 (이의 사촌 CH1γ1을 대체함)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
항체 301.21은, 도 11에서 제시된 바와 같이 (SEQ ID NO: 32), 인간 힌지γ1 도메인을 가지는 인간 CH1γ4 (이의 사촌인 CH1γ1을 대체함)에 대응된다. 다른 불변 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인(SEQ ID NO: 9) 및 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO: 8)에 대응된다.
muIgG3 컨트롤은 뮤린 8B6 IgG3에 대응되고, 여기에서 CH1 IgG3은 SEQ ID NO: 33에 대응되며, 134 위치의 시스테인 잔기는 세린 잔기로 치환되고, 224 위치의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다.
Figure pct00011
상기 항체의 GD2-O-아세틸화된 강글리오사이드에 대한 결합이 앞서 확인되었다.
이후, 상기 항체의 잠재적 세포사멸-촉진 활성이 전술된 바와 같이 측정되었다.
결과는 하기 표에서 요약되었고, 여기에서 용해의 비율은 80 μg/ml의 항체 농도에 대해서 획득된 값이다.
항-OacGD2 301.14a, 301.14b, 301.15, 301.16, 301.17, 301.18 및 301.19 항체의 IMR5 세포에 대한 직접세포독성:
Figure pct00012
결과는 뜻밖에도, 돌연변이된 인간 CH1γ1 또는 인간 CH1γ3을 포함하는 키메라 항체가 세포사멸-촉진 활성을 가진다는 것을 보여주고, 이는 직접 독성의 상실이 인간 IgG1의 구조에 기인한다는 것을 의미한다. 또한, 상기 항체 모두에서 초기의 항체 8B6의 EC50보다 더 큰 EC50이 나타났다.
결과는 또한, 최대 % 용해와 관련하여 더 높은 세포독성 효과를 부여하는 구조는 (i) 인간 CH1γ3 및 인간 힌지γ1의 융합체 (301.15 구조체) 또는 (ii) 인간 CH1γ1 (S133C에 돌연변이됨) 또는 인간 CH1γ1 및 단축된-인간 힌지γ3 의 융합체 (301.18 및 301.19 구조체)에 대응된다는 것을 보여준다. 상기 마지막 두 개에 대하여, 본래의 c8B6과 비교하여 친화도의 증가가 관찰되었다.
끝으로, 그리고 여전히 놀랍게도, 301.15 항체는 회복된 결합 협동성에 대응하는 경쟁 곡선(competition curve) 내 집합적(aggregative) 프로파일을 나타내는 유일한 항체였다.
IMR5, SUM159PT 및 H187 세포에 대한 항-OacGD2 301.15b, 301.20 및 301.21 항체의 직접 세포독성:
Figure pct00013
결과에 따르면, 뜻밖에도, 인간 CH1γ2 또는 CH1γ4를 포함하는 키메라 항체가 IMR5 세포에 대하여 세포사멸-촉진 활성을 가지는데, 이는 직접 세포독성의 상실이 인간 IgG1 구조에 기인된 것이라는 것을 의미한다.
또한, 인간 CH1γ3 및 돌연변이 된 인간 힌지γ1 도메인 (시스테인 222의 세린 잔기에 의한 치환에 상응하는 강조된 돌연변이 C222S)을 포함하는 항체가 IMR5 세포 상 세포사멸-촉진 활성을 가졌다.
또한, 결과는 인간 CH1γ1 (S133C 상 돌연변이) 및 돌연변이 된 인간 힌지γ1 도메인 (시스테인 222의 세린 잔기에 의한 치환에 대응하는 강조된 돌연변이, C222S)의 융합에 대응되는 구조체 (301.14b 구조체) 또는 인간 CH1γ3 및 인간 힌지γ1 의 융합에 대응되는 구조체 (301.15 구조체)가 SUM159PT 및 H187 세포 모두에서 세포사멸-촉진 활성을 가진다는 점이 입증된다.
상이한 항체의 직접 세포독성이 또한 프로피디움 요오드 에세이에 의해 평가되었다.
본 에세이에서, 150000 IMR5 세포가 24h 동안 37℃에서 플레이팅되었고, 이후 각 항체 40μg/mL으로 24h동안 37℃에서 처치되었다. 이후, 죽은 세포가 프로피디움 요오드 (12.5 μg/ml)에 의해 라벨링되었다. 모든 샘플들이 LSRII FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 내에서 유동 세포분석법에 의해 분석되었다.
결과가 하기 표에서 요약되었고 및 도 12에 의해 설명되었다.
Figure pct00014
결과는 인간 CH1γ1 (S133C 상 돌연변이됨) 및 돌연변이된 인간 힌지γ1 도메인 (시스테인 222의 세린 잔기에 의한 치환에 상응하는 강조된 돌연변이, C222S)의 융합(301.14b 구조체) 또는 인간 CH1γ3 및 인간 힌지γ1 의 융합(301.15 구조체)에 대응되는 구조체가 IMR5 세포 상에서 세포사멸-촉진 활성을 가진다는 것을 확인하였다. 동시에, 상기 결과는 IgG1의 구조를 흉내내기 위한 뮤린 IgG3 8B6의 돌연변이가 세포사멸-촉진 활성의 상실을 초래한다는 것을 확인한다.
비-IgG1 항체에 일반적인 CH1 및 경쇄 사이의 페어링을 재구성하는 것은 세포사멸-촉진 활성을 회복시킬 수 있다. 상기 재구성은 비-IgG1 서브클래스로부터 일반적인 CH1 시스테인을 회복시키거나 혹은 비-IgG1 CH1 도메인을 치환시킴으로써 획득될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 세포사멸-촉진 활성을 유지함과 함께 8B6 항체의 항체의 키메라화를 성공하였고, 상기에서 세포사멸-촉진 활성이 두 항체에서는 심지어 증가되었고, 이중 하나에서는 본래 항체와 같은 협동성 결합능을 또한 보여주었다.
2- 항- OAcGD2 항체의 in vivo 효능(efficiency)
뮤린 신경아세포종 model
5주 연령의 NOD/SCID 마우스를 CHARLES RIVER에서 구입하였다.
인간 신경아세포종 IMR5 종양이 면역결핍 NOD-SCID 마우스 내에서 성장되었다. 요약하면, 마우스 오른쪽 옆구리에 종양 세포 (1 x 106 IMR5 세포)가 피하적으로 투여되었다. 이후 피하의 종양 성장이 종양 이식 후에 식 [볼륨 mm3 = (길이) x (넓이2) x 0.5]을 사용하여 측정되었다. IMR5 인간 신경아세포종-보유 NOD/SCID 마우스에, 종양 볼륨이 0.1 cm3 와 동일한 경우, 항체 (500 μ/마우스)가 i.v.투여되었다. 마우스는 8B6 (muIgG3) mAb, 또는 c.8B6 (huIgG1) mAb, 또는 이중 돌연변이 된 huIgG1 mAb, 또는 huIgG3 CH1에 의해 치환된 huIgG1 CH1을 투여받았다.
SEQUENCE LISTING <110> OGD2 PHARMA UNIVERSITE DE NANTES <120> ANTIBODY AGAINST GD2-O-ACETYLATED GANGLIOSIDE WITH PRO-APOPTOTIC ACTIVITY <130> IP20162976FR <150> EP 13005298.8 <151> 2013-11-11 <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 LC <400> 1 Gln Ser Leu Leu Lys Asn Asn Gly Asn Thr Phe Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 LC <400> 2 Ser Gln Ser Thr His Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 HC <400> 3 Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 HC <400> 4 Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 HC <400> 5 Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCVR <400> 6 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCVR <400> 7 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Arg Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 9 <211> 219 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 10 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 11 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated human CH1 gamma1 <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 12 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated hinge domain <400> 14 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 15 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 50 55 60 <210> 16 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated hinge domain <400> 16 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 35 40 45 <210> 17 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated hinge domain <400> 17 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated hinge domain <400> 18 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 10 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated hinge domain <400> 19 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro <210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab 301.14a <400> 20 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 115 120 <210> 21 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab 301.14b <400> 21 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 115 120 <210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab 301.15 <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 115 120 <210> 23 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab 301.16 <400> 23 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 165 <210> 24 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab 301.17 <400> 24 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 165 <210> 25 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab 301.18 <400> 25 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 115 120 <210> 26 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab 301.19 <400> 26 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 115 120 <210> 27 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric light chain <400> 27 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 28 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimerized heavy chain <400> 28 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Arg Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 29 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type human CH1 gamma1 <400> 29 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 30 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated human CH1 gamma1 <400> 30 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 31 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CH1 gamma 2 <400> 31 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val <210> 32 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CH1 gamma4 <400> 32 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 33 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine IgG3 and inverse mutant CH1 and Hinge sequence <400> 33 Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser 1 5 10 15 Asp Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Lys Trp Asn Tyr Gly Ala Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val Arg Thr Val Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Leu Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Glu Leu Ile Lys Arg 85 90 95 Ile Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro Cys Thr Pro Pro Gly Ser Ser Cys 100 105 110 Pro <210> 34 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab 301.15b <400> 34 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro

Claims (22)

  1. 하기를 포함하는, O-아세틸화된-GD2-강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능성 단편:
    a) 하기의 아미노산 서열을 가지는 3개의 경쇄 상보성 영역(CDRs):
    i) 경쇄 CDR1: QSLLKNNGNTFL (SEQ ID NO: 1);
    ii) 경쇄 CDR2: KVS;
    iii) 경쇄 CDR3: SQSTHIPYT (SEQ ID NO: 2); 및
    면역글로불린 경쇄의 경쇄 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄, 상기에서 상기 프레임워크 서열은 인간 카파 (κ) CL 도메인을 포함함; 및
    b) 하기의 아미노산 서열을 가지는 3개의 중쇄 상보성 영역 (CDRs):
    i) 중쇄 CDR1: EFTFTDYY (SEQ ID NO: 3);
    ii) 중쇄 CDR2: IRNRANGYTT (SEQ ID NO: 4);
    iii) 중쇄 CDR3: ARVSNWAFDY (SEQ ID NO: 5); 및
    면역글로불린 중쇄의 중쇄 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄, 상기에서 상기 프레임워크 서열은:
    1) 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 및
    2) 돌연변이 되어 다른 IgG 서브클래스에 일반적인 CH1과 경쇄 사이의 페어링을 회복시키거나, 또는 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 비 IgG1-서브클래스의 CH1 도메인으로 치환되는 인간 IgG1의 CH1 도메인을 포함함.
  2. 제1항에 있어서,
    O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 상기 항체 또는 이의 기능성 단편이, 상기 강글리오사이드에 대해 2 x 10-7 M의 KD를 나타내는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항체가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 6을 가지는 경쇄 가변영역 (LCVR) 및/또는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 7을 가지는 중쇄 가변영역 (HCVR)을 포함하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 서열 SEQ ID NO: 8을 가지는 인간 카파 (κ) CL 도메인을 포함하는 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항체가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 9를 가지는 경쇄를 포함하는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 서열 SEQ ID NO: 10을 가지는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 인간 IgG1의 CH1 도메인을 포함하는 항체로서, 상기에서 인간 IgG1의 CH1 도메인이 돌연변이 되어 다른 IgG 서브클래스에 일반적인 CH1과 경쇄 사이의 페어링을 회복시키고, 서열 SEQ ID NO: 11과 같은 이의 서열의 133 또는 134 위치에 시스테인 잔기를 나타내는 인간 IgG1의 CH1 도메인과 상응하는, 항체.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 SEQ ID NO: 12와 같은 인간 IgG3의 CH1 도메인을 포함하는, 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 힌지 도메인 또는 이들의 유도체를 포함하는, 항체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 힌지 도메인이 SEQ ID NO: 13 내지 SEQ ID NO: 19를 포함하는 군에서 선택되는, 항체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는 항체:
    1) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 9를 가지는 경쇄,
    2) 하기로 구성되는 중쇄:
    - 서열 SEQ ID NO: 10을 가지는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인,
    - 하기로 구성되거나 하기를 포함하는 군에서 선택되는 인간 CH1 및 힌지 도메인에 대응되는 아미노산 서열:
    Figure pct00015
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항체는 301.14b, 301.15, 301.18 또는 301.19, 바람직하게는 301.15인, 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 면역접합체인, 항체.
  14. 적어도 하나의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 조성물은 신경아세포종, 흑색종, 교아종, 소세포 폐암, 유방암 및 암줄기세포 암과 같은 GD2-O-아세틸화된 강글리오사이드를 발현하는 암을 치료하기 위한 것인, 약학적 조성물.
  16. 하기 단계를 포함하는, O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 제1항 내지 제10항에서 기술된 항체, 이의 유도체 또는 기능성 단편의 치료적 효율을 증가 시키는 방법:
    상기 항체의 인간 CH1γ1을 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브클래스에 일반적인 CH1 및 CL 도메인 사이의 페어링을 회복시키거나 또는 상기 인간 CH1γ1 도메인을 인간 IgG2 (CH1γ2), IgG3 (CH1γ3) 또는 IgG4 (CH1γ4)의 CH1 도메인으로 치환시키는 단계.
  17. 제16항에 있어서,
    치료적 효율을 증가시키는 것이 상기 항체의 세포사멸-촉진 활성을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 항체의 인간 CH1γ1을 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브 클래스에 일반적인 CH1 및 CL 도메인 사이의 페어링을 회복시키 단계는 하기에 의해 수행되는 방법:
    a) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인을 포함하는 핵산 서열을 분리하는 단계, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 항체의 중쇄를 인코딩함;
    b) 코돈, 바람직하게는 상기 CH1 도메인의 위치 133 또는 134를 인코딩하는 코돈을 아미노산 잔기 시스테인(C)을 인코드하도록 돌연변이 시켜 돌연변이 된 핵산 서열을 제공하는 단계;
    c) 돌연변이 된 핵산 서열에 작동가능한 발현 인자(operable expression element)를 제공하는 단계;
    d) 돌연변이 된 핵산을 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 적당한 숙주 내에서 공-발현시켜 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 돌연변이된 인간 IgG1 항체, 유도체 또는 기능성 단편을 제공하는 단계; 및
    e) 임의로, 돌연변이 된 항체, 이의 유도체 또는 단편을 분리하는 단계.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인을 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 도메인으로 치환하는 단계는 하기에 의해 수행되는 방법:
    a) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인을 분리하는 단계, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 항체의 중쇄를 인코딩함;
    b) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 상기 CH1 도메인 핵산을 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산 서열로 치환하여 돌연변이 된 핵산 서열을 제공하는 단계;
    c) 돌연변이 된 핵산 서열에 작동가능한 발현 인자를 제공하는 단계;
    d) 돌연변이 된 핵산을 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 적당한 숙주 내에서 공-발현시켜 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 돌연변이된 인간 IgG1 항체, 유도체 또는 기능성 단편을 제공하는 단계; 및
    e) 임의로, 돌연변이 된 항체, 이의 유도체 또는 단편을 분리하는 단계.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법,이 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 힌지 IgG1 도메인을 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브클래스에 일반적인 힌지 및 CH2 도메인 사이의 페어링을 회복시키는 단계, 또는 상기 항체의 인간 힌지 IgG1 도메인을 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 힌지 도메인 또는 이들의 유도체로 치환시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 항체의 인간 힌지를 돌연변이 시켜 다른 IgG 서브클래스에 일반적인 힌지와 CH2 도메인 사이의 페어링을 회복시키는 단계는 하기에 의해 수행되어지는, 방법:
    a) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 힌지 도메인을 포함하는 핵산 서열을 분리하는 단계, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 항체의 중쇄를 인코딩함;
    b) 상기 힌지 도메인의 위치 5의 아미노산 잔기 시스테인 (C)을 인코딩하는 코돈을 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린 잔기를 인코드하도록 돌연변이 시켜 돌연변이 된 핵산 서열을 제공하는 단계;
    c) 돌연변이 된 핵산 서열에 작동가능한 발현 인자를 제공하는 단계;
    d) 돌연변이 된 핵산을 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 적당한 숙주 내에서 공-발현시켜 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 돌연변이 된 인간 IgG1 항체, 유도체 또는 기능성 단편을 제공하는 단계; 및
    e) 임의로, 돌연변이 된 항체, 이의 유도체 또는 단편을 분리하는 단계.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 항체의 인간 힌지 IgG1 도메인을 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 힌지 도메인 또는 이들의 유도체로 치환시키는 단계는 하기에 의해 수행되는, 방법:
    a) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 힌지 도메인을 포함하는 핵산 서열을 분리하는 단계, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 항체의 중쇄를 인코딩함;
    b) O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1 항체의 힌지 도메인 핵산 서열을 인간 IgG2, IgG3, IgG4의 힌지 도메인 또는 이의 유도체를 인코딩하는 핵산 서열로 치환하여 돌연변이 된 핵산 서열을 제공하는 단계;
    c) 돌연변이 된 핵산 서열에 작동가능한 발현 인자(operable expression element)를 제공하는 단계;
    d) 돌연변이 된 핵산을 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 적당한 숙주 내에서 공-발현시켜 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드에 특이적으로 결합하는 돌연변이된 인간 IgG1 항체, 유도체 또는 기능성 단편을 제공하는 단계; 및
    e) 임의로, 돌연변이 된 항체, 이의 유도체 또는 단편을 분리하는 단계.
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