KR101437613B1

KR101437613B1 - 벼 유래 프로모터 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101437613B1
Application number: KR1020120139532A
Authority: KR
Inventors: 김범기; 변명옥; 윤인선; 김둘이; 이강섭; 황현식
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2014-09-05
Also published as: KR20140071681A

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 잎에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터에 대한 것이다. 보다 상세하게는 잎에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체에 대한 것이다. 본 발명의 프로모터는 잎에서 특이적으로 발현을 유도하기 때문에, 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 특이적으로 발현시킴으로써 작물의 형질을 개량시킬 수 있다.

Description

벼 유래 프로모터 및 이의 이용{PROMOTER FROM RICE AND USE THEREOF}

본 발명은 잎에서 특이적으로 발현을 유도하는 벼 유래 프로모터에 대한 것이다. 보다 상세하게는 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체에 대한 것이다.

최근 들어 유전공학 기술이 발달함에 따라 식물의 형질을 개량시키고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체로부터 얻고자 하는 기술들에 대해 많은 관심이 대두 되고 있는데 이러한 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터(promoter)가 요구된다.

일반적으로 프로모터란 유전자가 언제 어디서 어느 정도 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절영역의 일종이다. 그 동안 끊임없는 연구들을 통해 수많은 종류의 프로모터들이 밝혀진 바 있다. 종래 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분되어 질 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 첫째로 발현 양을 최대화할 수 있는 강한 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현량을 최대화하는데 이용되는 프로모터로써 초기에 많이 개발되었으며, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 유전자의 프로모터(P35S) 및 벼의 액틴(actin) 유전자 프로모터가 대표적이다. 이들은 식물의 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제 저항성 유전자, 식물의 병충해 억제 유전자 또는 식물을 이용한 물질 생산 등의 목적으로 주로 사용되고 있다.

둘째로, 발현 시기를 제한하는 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물 발달 단계 중 특별한 시기에만 국한시키는 프로모터로서 많은 예들이 보고되어 있다. 예를 들어, 개화에 관련된 유전자들의 프로모터는 개화기에만 유전자를 발현시키며, 각종 생물학적(biotic) 또는 비생물학적(abiotic) 자극에 의하여 발현되는 유전자들의 프로모터들도 시기를 조절하는 프로모터에 포함시킬 수 있다.

셋째로, 발현 조직을 제한하는 조직 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 프로모터들이다. 이러한 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 사용하고자 하는 다양한 목적에 따라서 식물체의 각 조직에 대하여 많은 예가 보고된 바 있다.

특히, 상기와 같이 기능 및 특징에 따라 구분되어진 프로모터들 중 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 식물체 내에서 발현되는 조직에 따라 다시 다음과 같이 분류되고 있다. 첫째로, 전신 발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물체 전신에서 발현을 유도하는 프로모터로는 발현 양을 최대화하는데 이용되는 프로모터이기도 한 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍자엽 식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자의 프로모터들이 주로 이용되고 있고, 최근에는 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 개발된 바 있다(대한민국 등록특허 제0429335호). 이들도 상기 발현 양을 최대화하는 프로모터와 동일하게 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하는 목적으로 사용되고 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.

둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로는 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 단자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 및 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터가 있다.

셋째로, 뿌리 특이 발현 프로모터로서 이는 아직까지 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하며, 당근 및 무에서는 뿌리 특이적으로 일시적 발현을 유도한다는 내용이 보고된 바 있다.

넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있는데, 이와 관련된 프로모터로는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼 및 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터 및 배추 꽃의 화분 특이적인 배추 유래의 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 있다.

이러한 종자, 뿌리 또는 잎 특이적 발현 프로모터들은 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 사용이 기대되고 있다.

그러나 상기 공지된 프로모터들, 특히 식물체에서 조직 특이적으로 발현을 유도하는 것으로 알려진 종래의 프로모터들은 조직 특이적으로 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 장점이 있으나, 그 발현 양이 미미한 단점이 있다. 따라서 식물체 내에서 목적 유전자의 발현을 조직 특이적이면서도 대량으로 발현시킬 수 있는 유용한 새로운 프로모터의 발굴이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은, 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터에 대한 연구를 계속하여 벼에서 분리한 프로모터가 식물체의 생장 및 발달 시기에 특정 조직에서 목적 유전자의 발현을 유도하는 활성이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1054891호

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 잎에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물과 상기 형질전환된 미생물로 형질전환된 식물체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질이 잎에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 잎에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공한다.

또한 본 발명은 프로모터와 작동가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 pBGWFS7-pOsKAT3일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미생물이 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 형질전환 미생물로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있다.

또한 본 발명은,

서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고;

상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 제조하고; 그리고

상기 형질전환된 미생물을 식물체에 감염시키는;

단계를 포함하는, 목적 단백질이 잎에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 식물체에서 목적 유전자를 특이적으로 발현하는 새로운 프로모터를 발굴하기 위하여, 벼 칼륨 채널 유전자 중의 하나인 OsKAT3 유전자의 발현 양상 분석 중 뿌리에서 발현되지 않는 유전자를 분리하여 염기서열 확인하였다(실시예 1 참고).

본 발명자들은 본 발명의 OsKAT3 프로모터가 식물체 내에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시키는지 확인하기 위하여 상기 본 발명의 OsKAT3 프로모터에 GUS 유전자를 융합시켜 애기장대 내에서 GUS 유전자의 발현 양상을 확인하였다(실시예 3-4 참조). 그 결과, 애기장대의 잎에서 GUS 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 2-3 참조).

상기의 결과로부터 본 발명의 OsKAT3 프로모터는 식물의 잎에서 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터임을 알 수 있었다.

상기 "프로모터"는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 또한, 이러한 프로모터 중에는 모든 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터가 있으며, 특히, 본 발명에 따른 프로모터는 식물체의 특정 부위에서만 특이적으로 발현을 유도한다.

상기 "발현 벡터"는 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 조직 특이 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.

상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드가 있고, 식물 바이러스 벡터가 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용할 수 있다. 그러나 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 조직 특이적으로 발현되길 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다.

그러므로 본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 특정 부위, 예를 들면 잎 또는 줄기 등을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 특정 조직에서 발현시킴으로써 잎 또는 줄기와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 Gus가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 공지된 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 OsKAT3 프로모터를 Gus 유전자의 상류 부분에 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터인 pBGWFS7-pOsKAT3를 제조하였다(실시예 참조).

본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 이 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포내로 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포로는 미생물이 바람직하며, 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404을 사용하였다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 이 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법을 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체 내로 도입함으로써 형질전환된 식물을 제공한다.

상기 본 발명에 따른 형질전환된 식물은 이 기술분야의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 이 기술분야에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체 뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은, 본 발명의 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고; 상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 제조하고; 그리고 상기 형질전환된 미생물을 식물체에 감염시키는; 단계를 포함하는, 목적 단백질이 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 상기 쌍자엽 식물로는 이에 제한되지는 않으나, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추,감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리 및 유채일 수 있고, 상기 단자엽 식물로는 이에 제한되지는 않으나, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파일 수 있다.

본 발명의 프로모터는 잎에서 특이적으로 발현을 유도하기 때문에, 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 특이적으로 발현시킴으로써 작물의 형질을 개량시킬 수 있다. 구체적으로, 목적유전자를 단자엽과 쌍자엽 식물 모두에서 지상부 중 잎에서 주요하게 발현시킬 수 있도록 조절하여 식물의 성장과 발달에 유익하거나 각종 환경 스트레스 저항성을 증진시키기 위하여 유전자의 발현을 조절하는 데 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 식물 형질전환용 벡터 지도를 나타낸 것이다(LB: left T-DNA border, RB: right T-DNA border, Bar: bialaphos resistance gene, egfp : enhanced green fluorescence, GUS A :beta-glucuronidase A , T35S: CaMV 35S terminator, 35S: CaMV 35S promoter ).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, OsKAT3 프로모터의 조직 발현 검정을 위한 형질전환 벼의 GUS 염색 결과를 나타낸 것이다(가: 2주차 유식물, 나: 성체 잎맥, 다: 성체 절간, 라: 성체 잎집, 마: 뿌리, 바: 꽃, 사: 종자).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른,OsKAT3 프로모터의 쌍떡잎 식물에서 조직 발현 검정을 위한 형질전환 애기장대의 GUS 염색 결과를 나타낸 것이다(가: 3주차 식물, 나: 줄기 정단, 다: 근생엽).

본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 제놈 DNA 의 PCR 에 의한 OsKAT3 프로모터 영역의 클로닝 및 염기서열 분석

1-1: 모티프 검색 및 프로모터 영역의 PCR 증폭

PLACE(a database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) 프로그램을 이용하여 상기 유전자의 프로모터 부위의 모티프(Motif)를 검색하고 TATA box 등의 주요 모티프를 포함하는 충분한 영역이 증폭 되도록 약 1.5Kb의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 프라이머를 디자인한 후, PCR을 통해 상기 유전자의 프로모터 영역을 분리하였다.

벼의 잎에서 제놈 DNA를 추출(Qiagen 사, DNeasy Plant Mini kit 사용)하였다. 상기 유전자의 프로모터 영역으로 예상되는 약 1378bp 정도의 단편을 증폭하기 위한 프라이머를 디자인하여 센스 프라이머 OsKAT3 프로모터-포워드(OsKAT3 5'- CAGTGCTGAACAAGGCCCTTCAAA -3': 서열번호 2)와 안티센스 프라이머 OsKAT3 프로모터-리버스 (5'- GGTGGCCAAGAACAAGAACAGCAA -3': 서열번호 3)을 합성하여 Invitrogen사의 Pfx 폴리머라제와 함께 PCR 반응액에 넣어 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 이용된 PCR 반응조건은 95℃에서 10 분간 변성한 후 95℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 2분을 30회 반복한 후 다시 확장 반응을 위하여 68℃에서 5 분간 처리하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% 아가로스에 전기영동 한 후 상기 프로모터로 추정되는 밴드를 아가로스 젤에서 잘라내어 QIAquick 젤 추출 키트를 이용하여 정제한 후 토포(topo) 클로닝에 이용하였다.

1-2: 게이트웨이 도입 벡터(Gateway entry vector)인 pENTR D-topo 벡터( Invitrogen 사, direct entry TOPO Cloning vector kit)에 클로닝

증폭된 유전자를 상온에서 30분 토포 반응을 시킨 후 DH5알파 균주에 열 충격(heat shock) 방법으로 형질 전환하여 LB배지에 플레이팅하여 얻어진 콜로니를 선발하여 콜로니 PCR을 실시하였다. 그 결과 밴드가 확인된 콜로니의 플라스미드를 추출하여 염기서열 결정 (sequencing)에 이용하였다.

1-3: 염기서열 분석

ABI 3700 시퀀서(sequencer)를 이용하여 염기서열을 결정하였다(서열번호 1).

실시예 2: 형질전환 벡터 제작 및 식물체 형질전환

2-1: 상기의 OsKAT3 프로모터 운반체 제작

상기 실시예 1에서 분리한 OsKAT3 유전자의 프로모터를 이용하여 리포터 유전자 GUS를 발현시키기 위하여 재조합 발현 벡터를 구축하였다. 이를 위해 먼저, 벨기에의 겐트대학으로부터 구입한 게이트웨이 프로모터 발현용 pBGWFS7 벡터에 상기 프로모터가 삽입된 재조합 벡터를 제작하였다(도 1).

먼저 LR(Invitrogen 사) 반응하여 목적 벡터인 pBGWFS7 벡터(PSB 사, Plant System Biology)에 형질 전환하였다. 콜로니 PCR과 시퀀싱으로 유전자를 확인한 후 벼에 형질전환하기 위하여 먼저 아그로박테리움(Agrobacterium)에 형질전환하였다.

완성된 이원벡터(binary vector)를 아그로박테리움(LBA4404)에 형질전환하기 위하여 얼림과 녹임을 2-3번 반복 한 후, 37℃의 열 충격 방법에 의해 형질전환하여 YEP 배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L)에서 이틀 동안 배양하여 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K₂HPO₄ 60 g, NaH₂PO₄ 20 g/1L), AB 염(NH₄Cl 60 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 6 g, KCl 3 g, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.265 g, FeSO₄.7H₂O 50 mg/1L)에서 배양하였다.

2-2: 벼 형질전환

벼 형질전환에 사용하는 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용한다. 볍씨를 70% 에탄올에서 1분간 침지시킨 후 락스를 50% 함유한 물에서 40분간 소독한다. 이 때 락스 30 mL당 10 uL 트윈 20을 떨어뜨려 사용하였다.

소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척하였다. 소독액이 잘 세척이 되면 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 후 2N6 배지에 볍씨를 치상하였다. 이때 볍씨는 배지 안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하며 씨눈은 위로 향하도록 하였다. 2N6 배지는 문헌에 기재한 배지에 일부 수정된 배지로 만든다(Hiel et al., Plant J., 1994). 즉 N6 배지 (Chu et al., Scin Sin, 1975, 18:659-668)의 다량원소, 미량원소, 비타민을 함유한 혼합물 4 g/L와 30 g/L ㅅ수수크로오스, 0.5 g/L 프롤린(proline), 0.5 g/L 글루타민(glutamine), 0.3 g/L 카사미노산(casamino acids), 0.01 g/L 마이오-이노시톨(myo-inositol), 2 mg/L 2,4-D, 4 g/L 파이타겔(phytagel)이 첨가된 고체 배지(pH5.8)이다. 배양 온도는 28℃이며 암처리하였다.

2N6에서 5일간 배양하며, 캘러스가 유도되면 배유를 제거한다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어야 캘러스가 훼손되는 것을 방지한다.

아그로박테리움은 목적 유전자가 삽입된 것을 준비하여 AB 고체 배지에 3일간 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 만들었다. 흡광도기계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하며 먼저 OD595=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD595=0.01이 되도록 만들었다.

현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분간 침지시켜 아그로박테리움을 접종하며, 2분 동안 부드럽게 용액을 흔들어 주었다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리며 여과지를 이용하여 여액을 제거하였다. 이 작업은 신속히 진행하며 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의한다. 캘러스는 2N6-AS 배지에 옮겨서 공동배양하였다. 2N6-AS배지는 2N6 배지에 10g/L 글루코오스와 100 uM 아세토시린곤(acetosyringone)을 추가하여 만든 배지로 pH 5.2로 조정하였다. 배지 위에는 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 접종이 끝난 캘러스를 여과지 위에 올려놓았다. 여과지는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 공동배양은 25℃에서 7일간 암배양하였다.

공동배양이 끝나면 캘러스에 유용 유전자를 삽입하는 기능을 맡았던 아그로박테리움이 더 이상 필요 없으므로 세척 작업을 통해 제거하였다. 세척은 멸균증류수 1L에 항생제인 카르베니실린(carbenicillin)을 500mg을 넣은 용액으로 수행하며, 캘러스를 3회 정도 세척한 뒤 여과지를 사용하여 여액까지 모두 제거하였다. 캘러스는 2N6 배지에 항생제인 세포탁심(cefotaxime) 200 mg/L, 하이그로마이신(Hygromycin) 40 mg/L가 첨가된 2N6-CH 배지로 옮긴다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2~3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양하였다. 배양온도는 28℃가 적당하며 암배양기에서 14일간 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도하였다.

14일 후, 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양하였다. 형질전환된 캘러스의 구분은 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 판단하며 갈변되어 죽은 캘러스는 버린다. MSR 재분화 배지에서 성장한 유 식물체는 수도용 상토로 옮겨 온실에서 생육하였다.

실시예 3: OsKAT3 프로모터의 GUS 염색에 의한 발현 분석

GUS염색에 의한 프로모터 영역의 조직화학(Histochemistry) 검정은 2주간 키운 유식물 형질전환체를 이용하여 프로모터의 발현을 분석한 결과를 통하여 이루어졌다.

OsKAT3 프로모터가 작동되는 부위는 GUS염색에 의해 파란색으로 염색되는데, 2주차된 벼 유식물(seedling)의 잎이 파란색으로 염색된 것으로 볼 때, OsKAT3 프로모터는 목적유전자를 잎에서 발현시키는 것을 알 수 있었다. 그러나 뿌리 부위에서는 염색되지 않는 것으로 보아 OsKAT3 프로모터는 목적 유전자를 잎에 주요하게 발현시키는 것을 알 수 있었다.

약 2달간 키운 성체를 이용한 다양한 조직에서 상기 프로모터의 발현을 분석한 결과 주요하게 잎새(leaf blade)가 강하게 염색되었고 또한 잎집(leaf sheath) 부분이 염색되었다. 그러나 종자나 꽃 뿌리 및 절간(internode)에서는 거의 염색되지 않음을 알 수 있었으며, 이를 통해 OsKAT3 프로모터는 대표적인 단자엽 식물인 벼에서 목적유전자를 주요하게 잎 부분에서 발현시킬 수 있음을 확인하였다(도 2).

OsKAT3 프로모터가 작동하는 대표적인 모델 쌍자엽 식물인 애기장대의 형질전환체를 GUS 염색법으로 분석한 결과, 지하부인 뿌리는 거의 염색이 되지 않았으며 줄기와 꽃도 염색이 거의 되지 않음을 확인할 수 있었고 상기의 프로모터는 오직 경생엽(cauline leaf)과 근생엽(rossette leaf)과 같은 잎에서만 주요하게 발현됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해 OsKAT3 프로모터는 대표적인 쌍자엽 식물인 애기장대에서도 목적유전자를 주요하게 잎 부분에서 발현시킬 수 있음을 확인 하였다(도 3).

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> PROMOTER FROM RICE AND USE THEREOF <130> P120987 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2003 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 cagtgctgaa caaggccctt caaaaagcag tagaaattcg ttgatatcaa aagataatta 60 ttccatctta atgggataaa ctcaatgtag ttgataagaa tcgaaattac agaagatgca 120 aacgaatcaa caaaaaaaat gcatatttaa tagaaaaaag gttgacatcc caggtagagg 180 atggaccagt agtcacctgt atggaattct gcctctgaaa gtatattgaa gagcatacca 240 gatagggact cgtatggttt agcttttggc caggcccaca aagatagtac taatacacaa 300 atagccctga aatttctatt tcctcgtgtc cttcaaacac gtgcaatggc ataatgatgg 360 ctaggcaaca atggataact aatgcattta tcattgctaa attatagaca agttcaacat 420 agttcctttt ttctggaaag gtttttaaaa tagaaaatga gtaacattgg acgttatttt 480 acaatttaaa aaaatgtata gtttaccttc aaggaaaaga tttaaccagt atatgattgt 540 caatgacttt gacatcaata ccagaaaatt acagaagatg tacgaaaaaa gtatccccag 600 cagcacatcc taacatcaaa gtaggcacca cttattgttg tcagccagta tgccatagta 660 ccctgcatga catgtgagca tctgtcagga tagcaattag caagtgctat atccagccag 720 caaaatcatt acaaaagtaa atcatacgct tattattcag ttataacatc gacaagccca 780 acaattagtg taccaagaag aaggtttttt cctttgtcta gaatataact tcggggtcca 840 ttgcaaagca caagatatga agtgggtacc atctgaccaa gtactggctg attcaccaag 900 aacgcgatac aagacagaac ttcaaataag attgtaaaca agtgaaactt ttgccagaga 960 tcacaataat ggagatacag tctgttcatt cctcactggt cccatgaaaa caggcagccc 1020 aatcagtgca ccggataaac actaattgca gcaactggta ggcatcagaa cacggaggct 1080 acttagactg agtgactgac aagagattgt ggatgatctt attagccatt catctgcttt 1140 aattagttga gatgaacgta gagaatggat ccttcacccc cactaaaaca aatcttagtt 1200 gaacacaact accaaaagaa tatacccaac gattaagtcc attgcagatt actggcagaa 1260 atgacatcca tgattccggc cgtcctgttc acatttgcac aaacatgtgg atggcagtgc 1320 taagaaaaac atatgtcaga agtaaatttg actgagatta acagaatgcc acttactgat 1380 gcacgagttc tttttttaac ctttgacttg ggaaccaatg gctactacaa aagtaacaat 1440 tatgaagaag catagctatc cagaaattaa ttactagtca caattgccac ttcagcacaa 1500 ggactggatg cacaacacac cagcaaaaca atacacacca cagactgttc ttggttgaat 1560 cgaggagagc accagtccac agaaggagcc tgcacattca ccagagcaaa tggttggaga 1620 ggagcctgtt ggttcttgct caacagaagg cattcgcaag agaatctatc cttgcagatc 1680 agctggaaat aaattgcttc aggagttaat ttgactgcag ctgatcatct accaaaagaa 1740 gtcaactctg tctcgtgata gaatctgccg acttgtctta gctaacagct tcccacatct 1800 cccatctaaa acacgcatgc cctgtccgtt gttttcctcg taaggtacag gacacgagca 1860 gtttccggtt cccttctttt taaaattcct caccttgacc ctgcatgttc atcatgtgca 1920 gcatacatat atatatatat ataaagaccc agcctccaca ccctctgcaa acagagttgg 1980 gtggccaaga acaagaacag caa 2003 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsKAT3 promoter forward primer <400> 2 cagtgctgaa caaggccctt caaa 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsKAT3 promoter reverse primer <400> 3 ggtggccaag aacaagaaca gcaa 24

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 잎에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터.
제1항의 프로모터와 작동가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제2항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터가 pBGWFS7-pOsKAT3인 재조합 발현 벡터.
제2항 또는 제3항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens).
삭제
제4항의 형질전환 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)으로 형질전환된 형질전환 식물체.
제6항에 있어서,
상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물인 형질전환 식물체.
제6항에 있어서,
상기 쌍자엽 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추,감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리 및 유채로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 형질전환 식물체.
제6항에 있어서,
상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 형질전환 식물체.
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고;
상기 재조합 발현 벡터로 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 형질전환시켜 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 제조하고; 그리고
상기 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 식물체에 감염시키는;
단계를 포함하는, 목적 단백질이 잎에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법.