KR101383376B1 - 벼 유래 ＯｓＴＣＰ6 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼(Oryza sativa) 유묘의 분열조직, 특히 뿌리와 줄기의 어린 유관속 조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 OsTCP6 프로모터 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이 형질전환체의 제조 방법 및 이를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 제작된 형질전환체를 벼 유묘의 유관속 분열조직에서 위치 특이적으로 발현시킬 수 있다. 따라서, 이를 이용하여 특이물질 생산, 휴면, 발아 및 생장조절에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

벼 유래 ＯｓＴＣＰ6 프로모터 및 이의 용도{OsTCP6 promoter derived from Oryza sativa and use thereof}

본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래 OsTCP6 프로모터 및 이의 용도에 관한 발명이다. 보다 상세하게는 벼 분열조직, 더 바람직하게는 벼 유묘의 분열조직, 더욱더 바람직하게는 유묘의 유관속 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 OsTCP6 프로모터, 이를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이 형질전환체의 제조 방법 및 이를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.

벼는 세계에서 가장 중요한 식량작물의 하나로 과거 20여 년 동안 꾸준히 수량증대에 힘써왔으나 현재 인구증가 추세로 볼 때 2020년이면 현재의 70% 이상에 달하는 수량을 더 생산해야만 될 형편에 놓여있다. 그러나 벼가 재배되는 농지는 세계 각국의 공업화현상으로 갈수록 줄어들고 육종의 소재가 되는 새로운 유전자원은 고갈되어 외래 유용유전자의 도입이 요구되고 있다. 다행히 분자생물학의 발달로 외래 유용유전자의 분리 및 조작이 가능하게 되어 이 유용유전자를 벼를 비롯한 많은 식물세포에 형질전환하여 새로운 유전자가 조합된 형질전환체를 얻음으로써 여러 가지 생명현상을 규명하는 유전자발현 연구는 물론 육종의 좋은 소재가 되고 있다. 이러한 형질전환을 이용한 신품종 생산은 앞으로 다가오는 21세기에는 고부가가치 산업으로 대두함은 물론이며 인류의 가장 큰 문제점으로 부각되는 식량문제를 어느 정도는 해결할 수 있으리라 생각된다.

현재까지 알려진 벼 형질전환 방법으로 80년대에는 원형질체에 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol(PEG))과 전기충격법(electroporation)으로 많은 형질전환체를 획득하였으며, 90년대 후반에는 유전자총 이용법이 보편화되었으며 최근에는 쌍자엽식물에서 널리 이용되어 왔던 아그로박테리움(Agrobacterium) 이용법도 많이 이용되고 있다. 그밖에 화분법(pollen pathway), 미세주사(microinjection) 방법 등이 있다.

벼 형질전환 효율에 영향을 미치는 프로모터(promoter)는 그 출처가 CaMV(Cauliflower mosaic virus), 벼, 옥수수, 콩, 감자 등에서 클로닝된 것으로 형질전환 효율 향상에 이바지하였다.

마커유전자 발현정도는 형질전환효율에 아주 중요한 영향을 끼치는데 그의 여러 요인은 효율적인 벡터, 적합한 프로모터, 식물 게놈에서의 위치, 복제 수, 3' 비코딩서열(noncoding sequence), 코돈의 빈도 등이 있다. 프로모터는 전환유전자의 패턴을 결정하며 지금까지 2 종류 즉, 항시적인 것과 조직 특이적 프로모터가 사용되어 왔다. 이 항시적인 프로모터는 독립적으로 모든 조직에서 유전자발현을 한다. CaMV35S 프로모터는 강력하고 항시적인 것으로 흔하게 형질전환 연구에 사용되며 광범위하게 벼, 밀, 옥수수 등에서 사용되었다.

목표하는 조직에서의 유전자발현은 작물개량의 가능성을 시사하고 있는데 벼는 현재 단자엽 식물에서 유전자발현과 프로모터 연구의 모델로서 이용되고 있으며 이미 밝혀진 요소와 DNA 결합인자간 기능적 상호작용을 이해하는데 크게 도움이 될 것이다.

벼의 형질전환에 대한 연구는 1980년대 후반에 원형질을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜방법이나 전기충격법으로 이용하여 자포니카에서 형질전환체를 획득한 것을 기점으로 인디카에서도 유전자 총, 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 형질전환체를 얻을 수 있었다는 보고가 계속되고 있다. 특히 90년대에 들어서 선발 유전자로도 알려진 제초제 저항성(bar) 유전자는 농업적 유용유전자로도 사용하여 형질전환연구에 가장 많이 이용되고 있으며, 그 후 계속해서 새로운 농업유용유전자가 개발, 제작되어 벼 형질전환에 이용하고 있다.

이와 같은 조직 특이적인 프로모터에 대하여는, 미국특허 US 5,808,034 (Bridges 등, 1998. 09. 15 등록)에 외부의 화학물질에 특이적으로 촉진되는 발현저해자(repressor)를 이용하여 식물의 웅성기관에서 유전자의 다단계 조절(cascade)이 일어나도록 함으로써 생식능력을 조절하는 기술이 개시된 바 있다. 또한, 미국특허 US 6,784,289 (Ouellet 등, 2004. 8. 31 등록)에는 숙주 생명체에서 관여된 단백질의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있는 트랜스레이션 조절 인자의 발현 조절에 관한 기술이 개시되어 있다. 또한, 과일 표피 조직에 특이적으로 발현되는 프로모터(KR 813,118) 및 식물체의 뿌리조직에 특이적으로 발현되는 프로모터(KR 803,390)가 개시된 바가 있다. 벼의 경우에 있어서는 대한민국공개특허 KR 2003-0081377, KR 2001-0085990 등에 조직 특이적인 프로모터에 관한 기술이 기재되어 있다.

식물의 분열조직에서 조직특이적 발현양상을 보이는 유전자에는 DME 유전자가 알려져 있다. 현재 이 유전자의 기능이 명확히 밝혀져 있지는 않으나, 애기장대의 DME 유전자의 기능은 종자 생성을 위하여 수정할 시 특히 수정 전에 암술에서 특이적으로 발현하는 유전자로 세포분열이 일어날 때 일시적으로 발현이 되는 유전자로 알려져 있다.

한편, 현재 벼, 특히 유묘의 분열조직에 특이적으로 발현되는 프로모터를 이용하여 유용한 외래 유전자를 발현시키는 시스템에 대해서는 개시된 바가 없다. 이 유묘의 분열조직은 식물의 생장과 발생패턴을 결정하는 매우 중요한 기관이며, 이러한 분열조직에서의 유용유전자의 발현 또는 조절은 특이 물질 생산, 휴면, 발아 및 생장조절과도 직결될 수 있다. 따라서, 유용유전자 활성의 조절을 통해 생장에 관여되는 생리적 현상을 조절할 수 있는 직접적이면서도 적합한 기술로써 이러한 분열조직에 특이적인 유전자 발현의 조절 기술이 절실히 요구되고 있다.

이에 발명이 해결하고자 하는 과제는, 벼 유묘의 분열조직, 특히 뿌리와 줄기의 어린 유관속 조직에서 목적 단백질을 특이적으로 발현하는 프로모터, 이를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이 형질전환체의 제조방법 및 이를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 벼 유묘의 분열조직, 특히 뿌리와 줄기의 어린 유관속 조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터를 제공한다.

본 발명에서는 또한 상기의 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서는 또한 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 형질전환체는 아그로박테리움 투메파시엔스 형질전환체일 수 있다.

본 발명에서는 또한 상기 발현 벡터 또는 상기 아그로박테리움 투메파시엔스 형질전환체로 형질전환된 형질전환 식물체, 바람직하게는 벼(Oryza sativa)를 제공한다.

본 발명에서는 또한 상기 발현 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는 식물 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

상기 식물은 벼(Oryza sativa)일 수 있으며, 바람직하게 본 발명에서는 하기의 단계들을 포함하는 벼 유묘의 분열조직, 특히 뿌리와 줄기의 어린 유관속 조직에서 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체의 제조방법을 제공한다:

(1) 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 유묘의 유관속 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

(2) 벼에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및

(3) 상기 발현벡터가 도입되어 벼 유묘의 유관속 분열조직에서 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체를 선별하는 단계.

본 발명에 따르면, 상기 벼에 발현벡터를 도입하는 단계는 상기 발현벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스를 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼에 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 또한 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 유묘의 분열조직, 특히 뿌리와 줄기의 어린 유관속 조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환하여 벼 유묘의 유관속 분열조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

본 발명에 있어상동성"이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 발명의 프로모터는 벼 유묘의 유관속 분열조직에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 벼 유묘의 유관속 분열조직에서 특이적으로 목적 단백질을 발현시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 OsTCP6 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질이 벼 유묘의 유관속 분열조직, 특히 뿌리와 줄기의 어린 유관속 분열조직에서 특이적으로 발현됨을 확인하였다.

본 발명의 위치 특이적 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.

본 발명에 있어재조합 발현 벡터란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 당업계에 알려진 다양한 구조 유전자를 포함할 수 있으며, 이러한 구조 유전자는 당업계에 알려진 다양한 프로모터와 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서프로모터란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며,작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

또한, 상기 구조 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein, AY598428) 유전자, GUS(β-glucuronidase, AF485783) 유전자, GAL(β-galactosidase, AAB49721) 유전자 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 재조합 발현 벡터는 게이트웨이 시스템을 이용하여 프로모터 발현용 pBGWFS7 벡터에 리포터 유전자 GUS를 작동 가능하게 연결시켜 제작하였다.

또한, 본 발명은 본 발명의 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법 (microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)을 이용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함되며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 예를 들어 벼, 밀, 보리 또는 옥수수일 수 있으며, 특히 벼가 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서 재조합 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환되었으며, 벼에 접종하여 형질전환체를 제작하였다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 유묘의 유관속 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환하여 벼의 유묘의 분열조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 제작된 형질전환체를 벼 유묘의 분열조직, 특히 뿌리와 줄기의 어린 유관속 분열조직에서 위치 특이적으로 발현시킬 수 있다. 따라서, 이를 이용하여 특이물질 생산, 휴면, 발아 및 생장조절에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 OsTCP6 프로모터에서 발견된 시스작용요소(cis-acting element)를 나타낸 것이다.
도 2는 게이트웨이 시스템을 통해 제조된 벼 형질전환용 OsTCP6 프로모터 함유 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이며, 목적 단백질의 예로 GUS를 사용한 모식도다.
도 3은 본 발명에 따른 OsTCP6-GUS 형질전환 벼의 게놈 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 WT1 및 WT2는 대조구로서 동진 벼를 나타낸다.
도 4는 OsTCP6 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 GUS 염색 분석 결과를 보여주는 것이다. 여기에서, A)는 발아후 5일된 유묘이고, (B)는 자엽초 (유관속 염색)이고, (C)는 곁뿌리 (유관속 염색)이며, (D)는 성숙종자이고, (E)는 종자유래 캘러스이며, (F)는 원뿌리 (주근, 유관속 염색)이고, (G) 옥신 처리한 유묘이며, VB는 유관속 (vascular bundle)이고, E는 배(embryo)이고, C는 캘러스이고, Col은 자엽초(coleoptile)이고, LT는 잎 정단이며, M은 분열조직 부위(meristemic region)를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 게놈 DNA의 PCR에 의한 OsTCP6 프로모터 영역의 클로닝 및 염기서열 분석

먼저 OsTCP6 유전자의 프로모터 영역을 분리하기 위하여 번역시작 상위염기서열 2,039 bp의 염기서열 정보를 벼 게놈 데이타베이스에서 추출하고, 프로모터 영역의 단편을 증폭하기 위한 프라이머를 디자인하여 정방향 프라이머 OsTCP6P-F: 5'-CACCCCTTGTGTACCATTAAGATTAATCG-3'(서열번호 2)와 역방향 프라이머 (OsTCP6P-R: 5'-CAATTAGGCCATGGTATATATACACAG-3'(서열번호 3)을 합성하여 동진 벼의 게놈 DNA를 주형으로 하여 Takara사의 Primestar 중합효소(polymerase)와 함께 PCR 반응액에 넣어 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 이용된 PCR 반응조건은 95℃에서 10 분간 변성한 후, 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 2분을 35회 반복한 후 다시 확장 반응을 위하여 72℃에서 10 분간 처리하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% 아가로즈에 전기영동 한 후 OsTCP6 프로모터로 추정되는 밴드를 잘라내어 QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 정제한 후 클로닝(cloning)에 이용하였다.

상기 PCR 산물을 게이트웨이 클로닝 벡터(pENTER/D-TOPO, Invitrogen)에 클로닝하고 전체 염기서열을 결정하여 GenBank (JN176138; 공개예정일자: 2012. 7. 31.)에 등록하였으며, 이에 따라 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 OsTCP6 프로모터 유전자를 확보하였다.

이후 OsTCP6 프로모터에 존재하는 반응조절인자를 확인하기 위하여 PLACE(Plant Cis-acting Elements database: http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)와 PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 데이터베이스 프로그램을 이용하여 유전자 발현 모티프를 분석한 결과 분열조직 발현 모티프(motif) (CAT box)와 2 개의 옥신반응 모티프 (AuxRR, ARFAT) 및 ABA (ABRE), 에틸렌 (ERE), GA (P box) 등 다양한 호르몬 반응 모티프를 포함하고 있으며, 빛에 반응하는 모티프 (I box, GATT, Chs unit, GATA)와 종자 발현과 연관된 모티프 (RY repeat, O2 site)가 다수 존재하고 있음이 확인되었다. 그 결과를 도 1에 종합하여 나타내었다. 즉, 도 1에는 OsTCP6 프로모터에서 발견된 시스작용요소(cis-acting element)를 나타내었다.

<실시예 2> 벼 형질전환용 벡터(vector) 제작

상기 분리된 OsTCP6 프로모터 유전자를 목적 벡터인 pBGWFS7 벡터 (PSB 사, Plant System Biology)에 도입시켰다. 이후, 콜로니 PCR과 시퀀싱으로 도입된 유전자를 확인하였다.

도 2에는 게이트웨이 시스템을 통해 제조된 벼 형질전환용 OsTCP6 프로모터의 발현 벡터의 모식도를 나타내었다.

완성된 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(LBA4404)에 형질전환하기 위하여 동결과 해동(freeze and thaw)을 2-3번 반복한 후, 37℃의 열충격(heat shock)방법에 의해 형질전환한 후 YEP 배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L)에서 철야배양(overnight)하여 콜로니를 확인하였다.

콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K₂HPO₄ 60g, NaH₂PO₄ 20g/1L), AB Salts(NH₄Cl 60g, MgSO₄·7H₂O 6g, KCl 3g, CaCl₂·2H₂O 0.265g, FeSO₄·7H₂O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.

<실시예 3> 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환

아그로박테리움에 의한 벼 형질전환은 2N6 배지에서 동진 벼의 캘러스를 유도하기 위하여 종자를 락스에 세척한 후 적당히 건조시켜 N6 배지 (Duchefa 사 vitamin 포함 배지)에 2,4-D 호르몬이 2 mg/L 첨가된 배지에 치상하였다. 27℃에서 3-4주간 암배양하여 캘러스를 유도한 후, 2N6 새 배지에 배형성 캘러스(embryogenesis callus)를 배양(sub-culture)하였다.

형질전환 유전자를 포함하는 아그로박테리움 형질전환된 유전자를 AB 액체배지에 배양한 후 배형성 캘러스와 20분간 공배양(coculture) 시킨 후 3일간 암배양 하였다. 멸균수에 세포탁심(cefotaxime)을 첨가하여 아그로박테리움이 완전히 제거될 때까지 씻은 후 다시 2N6 배지에 세포탁심과 ppt (포스피노트리신, phosphinothricin)가 6 ㎍/L로 첨가된 배지에서 3주간 암 배양하였다. 세포탁심과 ppt가 첨가된 2N6 배지에서 갈변되지 않고 살아남은 캘러스를 다시 세포탁심과 ppt가 첨가된 2N6 배지에 옮겨 2 주간 암배양하였다. 캘러스에서 슈팅(shooting) 유도를 위해 세포탁심과 ppt가 첨가된 MSR 배지 (Duchefa MS 배지에 말토스와 솔비톨 첨가)에 옮겨 4주간 양 배양하여 슈팅된 후 발근이 되면 온실로 옮기기 이전에 순화처리를 실시하였다.

형질전환된 벼의 유묘에서 게놈 DNA를 분리하여 PCR 분석하여 도입한 벡터가 삽입되었는지 확인하였다. 상기 단편을 증폭하기 위한 프라이머로 정방향 프라이머(sense primer Os02g51280P-5 : 5'-GAC CCA CCC ACA ACG AGA GGG AGG-3'서열번호 4)와 역방향 프라이머(antisense primer EGFP-R : 5'-GGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCC-3' 서열번호 5)를 합성하였다.

도 3은 형질전환 벼의 게놈 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 WT1 및 WT2는 대조구로서 동진 벼를 나타낸다.

<실시예 4> OsTCP6 프로모터의 조직발현 검정을 위한 형질전환 벼의 GUS 단백질 활성 염색에 의한 분석

OsTCP6 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼 계통을 PPt (6 ㎍/L) 가 포함된 MS 배지에서 1-5일간 생장시킨 후, 유묘를 GUS 염색액 (1 mM X-glu, 0.5 mM ferrocyanide, 0.5 mM ferricyanide, 10 mM EDTA, 50 mM Na phosphate, 0.1% Triton X-100) 에서 24 시간 이내 염색하여 관찰한 결과 어린 유묘의 기저부 및 자엽초, 어린 잎 정단에서 GUS가 발현되는 것을 확인하였다. 또한 생장과 세포분열을 촉진하는 호르몬인 옥신 (2, 4-dichlorophenoxy acetic acid)을 처리하면 유묘의 줄기와 뿌리에서 GUS 발현이 크게 증가하는 것을 보여주었다. 뿌리와 줄기의 GUS 염색 위치에 대한 상세분석을 위해서 GUS 염색 시료를 조직투명화 용액 (Cloral hyrate 500 g, glycerol 62.5 ml. H₂0 125 ml) 에 1일간 처리 후 현미경 (Carl Zeiss DE/Axio imager M1)으로 관찰하고 이미지 분석 프로그램 (AxioVision Imaging System)으로 분석하였다. 그 결과 OsTCP6 프로모터가 자엽초와 뿌리의 유관속 조직, 특히 어린 뿌리원기가 시작되는 위치에서 특이적으로 GUS 발현을 유도한다는 것을 증명하였다. 또한 OsTCP6 프로모터가 성숙 종자의 배와 종자유래 캘러스에서 GUS 발현을 유도하는 특성이 있음을 확인하였다.

이를 통해 OsTCP6 프로모터가 대표적인 단자엽 식물인 벼에서 목적유전자를 주요하게 어린 유관속 분열조직에서 발현시킬 수 있으며, 세포분열을 촉진하는 호르몬인 옥신농도 조절을 통해 발현을 더 강하게 유도할 수 있음을 증명하였다.

도 4에는 OsTCP6 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 GUS 단백질 염색 분석 결과를 보여주는 것이다. 여기에서,(A)는 발아후 5일된 유묘이고, (B)는 자엽초 (유관속 염색)이고, (C)는 곁뿌리 (유관속 염색)이며, (D)는 성숙종자이고, (E)는 종자유래 캘러스이며, (F)는 원뿌리 (주근, 유관속 염색)이고, (G) 옥신 처리한 유묘이며, VB는 유관속(vascular bundle)이고, E는 배(embryo)이고, C는 캘러스이고, Col은 자엽초(coleoptile)이고, LT는 잎 정단이며, M은 분열조직 부위(meristemic region)를 나타낸다.

본 발명에 따른 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 제작된 형질전환체는 벼의 발아초기 유묘의 유관속 분열조직, 특히 뿌리와 줄기의 어린 유관속 분열조직에서 목적 단백질을 위치 특이적으로 발현시킬 수 있다. 따라서, 이를 이용하여 특이물질 생산, 휴면, 발아 및 생장조절에 유용하게 이용될 수 있다.

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Claims (14)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는, 벼 유묘의 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터.
2. 제 1항에 있어서, 상기 분열조직은 뿌리와 줄기의 유관속 조직인 것을 특징으로 하는 프로모터.
3. 제 1항 또는 제 2항의 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터.
4. 제 3항의 벡터에 의해 형질전환된 식물의 형질전환을 위한 매개체.
5. 제 4항에 있어서, 상기 식물의 형질전환을 위한 매개체는 아그로박테리움 투메파시엔스인 것을 특징으로 하는 식물의 형질전환을 위한 매개체.
6. 제 3항에 따른 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
7. 제 6항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 벼(Oryza sativa)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
8. 제 3항의 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는 식물 형질전환체의 제조방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 식물은 벼(Oryza sativa)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
10. 제 9항에 있어서,
    하기의 단계들을 포함하는 벼 유묘의 유관속 분열조직에서 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체의 제조방법:
    (1) 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는, 벼 유묘의 유관속 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 벼에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
    (3) 상기 발현벡터가 도입되어 벼 유묘의 유관속 분열조직에서 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체를 선별하는 단계.
11. 제 10항에 있어서, 상기 벼에 발현벡터를 도입하는 단계는 상기 발현벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스를 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼에 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼 형질전환체의 제조방법.
12. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 유묘의 유관속 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환하여 벼 유묘의 유관속 분열조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법.
13. 제4항에 따른 식물의 형질전환을 위한 매개체로 형질전환된 형질전환 식물체.
14. 제13항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 벼(Oryza sativa)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
    

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