KR20160039607A - 개선된 고효율 나노입자형 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 올리고뉴클레오타이드구조체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 안정성 향상 및 세포전달 효율 개선을 위해 올리고뉴클레오타이드에 고분자 화합물을 공유결합으로 연결시킨 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 상기 구조체의 제조방법에 관한 것이다. 올리고뉴클레오타이드 구조체의 동일한(homogenous) 물질로의 개선을 통해 올리고뉴클레오타이드에 결합되는 친수성 물질이 합성 폴리머일 때 발생하는 다분산적 특성으로 인한 물질의 검증의 문제점을 해결하고, 기존 공정에 비하여 합성이 용이한 장점을 가지며, 친수성 물질 블록의 반복횟수 조절을 통해 이중나선 올리고 RNA 구조체의 크기를 정확하게 조절할 수 있어, 최적화된 올리고 뉴클레오타이드 구조체의 합성을 통해 올리고뉴클레오타이드의 유전자 발현 조절 기능이 저해되지 않고 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 올리고뉴클레오타이드를 세포 내로 전달할 수 있으므로, 암 및 감염성 질병 등에서 치료용 도구뿐만 아니라, 새로운 형태의 올리고뉴클레오타이드 전달 시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 암 및 감염성 질병 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 고효율 올리고뉴클레오타이드 구조체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체는 올리고뉴클레오타이드 구조체에 포함된 올리고뉴클레오티드를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위하여 올리고뉴클레오타이드의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합된 형태의 구조를 가지며, 수용액에서 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체들의 소수성 상호작용에 의해 나노입자 형태로 전환될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 약제학적 조성물, 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체의 제조방법 및 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체를 이용한 올리고뉴클레오타이드 전달 기술에 관한 것이다.
ASO(antisense oligonuceletide), 간섭 RNA (RNA interference, 이하 'RNAi'라고 한다), miRNA(microRNA) 등 올리고뉴클레오티드에 기반한 다양한 형태의 치료제가 현재 활발하게 개발이 이루어지고 있다.
ASO(antisense oligonuceletide)는 단일가닥의 RNA 또는 DNA가닥을 통해 mRNA의 중간 대사(metabolism)를 변경함으로써 유전자로부터 단백질로의 정보전달을 조절하는 기능을 가지는데, 충분히 상보적, 특이적으로 혼성화하는 염기서열을 선택하여 목표 단백질의 바람직한 발현억제가 이루어지도록 하는 것이다. ASO는 목표 유전자에 서열 특이적으로 결합하므로 목표 유전자 이외의 다른 유전자 발현에 영향을 주지 않는다. 따라서 ASO기술은 특정 단백질의 생체 내 역할의 분석에서 유용한 도구일 뿐만 아니라, 특정 질병에 대한 유전자 치료법의 한 형태로 활용 가능성을 가진다(FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995).
miRNA(microRNA)는 개체 내에서 자연적으로 생산되는 거대 그룹의 작은 RNA로서, 적어도 이들 중 일부는 표적 유전자들의 발현을 조절한다. miRNA는 리보뉴클레이즈 다이서(ribonuclease dicer)(Ambros et al. 2003. current biology 13(10):807-818)에 의해 대략 70개의 뉴클레오타이드 단일가닥 헤어핀 전구체 전사체로부터 형성되는데, 상기 다이서는 상기 전구체를 절단시켜 21-23개의 뉴클레오타이드 이중가닥 miRNA를 형성시킨다. 많은 경우에 있어서, 상기 마이크로 RNA는 종래 기능이 밝혀지지 않은 DNA 서열의 일부로부터 전사된다. miRNA는 단백질로 번역되지 않으며, 오히려, 이들은 번역을 차단하는 특정 mRNA들과 결합한다. miRNA는 이들의 표적과 부정확하게 염기쌍을 이루어 번역을 억제하는 것으로 생각된다.
RNAi는 그 역할이 발견된 이후로 다양한 종류의 포유동물 세포(mammalian cell)에서 서열 특이적으로 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med, 2005, 83: 764-773). 긴 사슬의 RNA 이중가닥이 세포로 전달되면, 전달된 RNA 이중가닥은 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의하여 21 내지23 염기쌍(base pair, bp)로 프로세싱된 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 'siRNA'라고 한다)로 변환된다. siRNA는 19 내지 27 염기의 짧은 RNA 이중나선 구조로서 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEICACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514).
특히, 외부에서 전달된 긴 사슬의 RNA 이중가닥은 포유동물 세포에서 인터페론(interferon) 발현을 통해 비 서열특이적인 과도하게 면역반응을 유발하는 문제점을 가지는데, 이는 짧은 가닥의 siRNA를 통해 극복된다는 사실이 밝혀졌다 (Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature.2001. 411, 494-498).
하지만 siRNA도 세포 내에 존재하는 센서들을 통해서 비서열 특이적 내재 면역 반응 유발(innate immune response stimulation)이 일어날 가능성이 있어 이를 극복하기 위해 siRNA의 특이적인 구조를 변경하거나, 2-메톡시, 2-플루오로 치환체들이 개발되고 있다.
화학적으로 합성된 siRNA는 대개 약 19 내지 27 염기쌍(base pair, bp)의 이중가닥이며, 3´ 말단부위에 2-nt(nucleotide) 오버행(overhang) 구조를 가질 수 있으며, siRNA 이중가닥이 활성을 나타내기 위해서는 3´ 수산기(OH, hydroxyl group)와 5´ 인산기 (PO4, phosphate group)로 구성된 구조를 가져야 하는 것으로 알려져 있다(Effect of asymmetric terminal structures of short RNA duplexes on the RNA interference activity and strand selection. Nucleic Acids Res 1 October 2008:5812-5821). 상용화된 합성 siRNA는 양 말단에 수산기가 있는 구조이며, 합성 siRNA가 세포 내로 전달되면, 인산화 효소(kinase)에 의해 siRNA 5´ 말단이 인산화 되어 siRNA 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다 (siRNA function in RNAi: A chemical modification analysis. RNA 2003. 9: 1034-1048).
베르트랑(Bertrand) 연구진의 연구에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 siRNA가 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다(Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo.Biochem.Biophys.Res.Commun. 2002. 296: 1000-1004).
또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 표적 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질 (small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다(Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).
하지만, siRNA 등의 올리고뉴클레오티드 기반 치료제의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 siRNA의 안정성 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되어야 한다(Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73).
특히 siRNA 등의 올리고뉴클레오타이드는 음전하를 띄고 있기 때문에, 소수성인 세포의 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵다.
이에 따라 생체 내 (in vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 올리고뉴클레오타이드를 전달 효율을 높이기 위해 많은 종류의 세포전달 물질들이 개발 되었다. 리포좀, 양이온계 계면활성제 등이 일반적으로 많이 사용되고 있으며 리포좀에 유전자를 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법 등의 전달체를 이용하기도 하고, 올리고뉴클레오타이드의 결합 기본구조를 메틸포스포네이트 (methylphosphonate)나 PNA(peptide nucleic acid) 등으로 화학구조를 변경시키거나, 접합체(conjugate)를 이용하는 방법이 알려져 있다(Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today. 2008 Oct; 13(19-20):842-855; Mechanisms and strategies for effective delivery of antisense and siRNA oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2008 Jul; 36(12):4158-71).
이중에서 나노전달체(nanocarrier)를 이용하는 방법은 리포좀, 양이온 고분자 복합체 등의 다양한 고분자를 사용하는 방법으로, 나노입자 형성을 통하여 올리고뉴클레오타이드를 나노전달체(nanocarrier)에 포획하여 세포에 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 것이다. 나노전달체를 이용하는 방법 중 주로 활용되는 방법은 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle), 고분자 미셀(polymer micelle), 리포플렉스(lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀(endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈 안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다(Mechanism of oligonucleotide release from cationic liposomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 Oct 15; 93(21):11493-8).
특히, 올리고뉴클레오타이드가 siRNA인 경우, 패신저(passenger; 센스(sense)) 가닥의 말단 부위에 화학물질 등을 연결하여 증진된 약동력학(pharmacokinetics)적 특징을 갖도록 하여 생체 내(in vivo)에서 높은 효율을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다(Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 2004 Nov 11; 432(7014):173-8). 이 때 siRNA 센스(sense; 패신저(passenger)) 또는 안티센스 (antisence; 가이드(guide)) 가닥의 말단에 결합된 화학 물질의 성질에 따라 siRNA의 안정성이 달라진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA는 양이온성 물질이 존재하는 조건에서 siRNA의 음이온성 인산기와 상호작용하여 복합체를 형성함으로써, 개선된 siRNA 안정성을 가진 전달체가 된다(Local and systemic delivery of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer. J Control Release. 2008 Jul 14; 129(2):107-16). 특히 고분자 복합체로 구성된 미셀(micelle)들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템인, 미소구체(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.
또한, siRNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 공보 제883471호 참조). 하지만 siRNA의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는 것(PEGylation)만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 타겟 조직으로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다.
이러한 단점을 해결하기 위하여 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA와 같은 이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 개발되었는데, 상기 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 SAMiRNA™(self assembled micelle inhibitory RNA) 라고 명명된 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 등록 특허 제1224828호 참조), SAMiRNA™ 기술은 기존의 전달기술들에 비해 매우 사이즈가 작으면서도 균일한(homogenous) 나노입자를 수득할 수 있다는 장점을 가진다.
SAMiRNA™ 기술의 구체적인 예로서, 친수성 물질로서 PEG(polyethylene glycol)가 사용되는데, PEG는 합성폴리머(synthetic polymer)로 흔히 의약품 특히 단백질의 수용성(solubility) 증가 및 약물동태학(pharmacokinetics)의 조절을 위해 사용된다. PEG는 모든 합성폴리머들이 그러하듯이 다분산계(polydisperse) 물질로, 한 배치(batch)의 폴리머는 다른 개수의 단량체(monomer)의 총 합으로 이루어져 분자량이 가우스곡선 형태를 나타내며, 다분산지수(polydisperse value, Mw/Mn)로 물질의 동질성 정도를 표현한다. 즉, PEG가 낮은 분자량(3~5kDa)일 때 약 1.01의 다분산지수를 나타내며 높은 분자량(20 kDa)일 때 약 1.2라는 높은 다분산지수를 나타내어, 높은 분자량일수록 물질의 동질성이 상대적으로 낮은 특징을 보인다 (F.M. Veronese. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Biomaterials (2001) 22:405-417).
이에 따라 PEG를 의약품에 결합시킨 경우 접합체에 PEG의 다분산적 특징이 반영되어 단일물질의 검증이 어려워지고, 최근에는 이러한 문제점을 해결하기 위해 PEG의 합성 및 정제과정의 개선을 통해 낮은 다분산지수를 가지는 물질을 생산하는 추세이지만, 특히 분자량이 작은 물질에 PEG를 결합시킨 경우 결합이 용이하게 이루어졌는지 판단하기 매우 어려움을 가지는 등 여전히 물질의 다분산성 특징에 따른 문제점을 가진다 (Francesco M.Veronese and Gianfranco Pasut. PEGylation, successful approach to drug delivery. DRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458).
또한 나노입자의 크기가 목표세포로의 전달 효율에 큰 영향을 미치는데, 50 nm 이하이면 배설을 통해 체외로 빠르게 제거되고, 100 nm 이상이면 조직 내로 골고루 전달이 안되어 효과가 저하되는 문제점을 가지므로, 일정한 크기의 나노입자 형성이 필요하다(Wim H De Jong and Paul JA Borm. Int J Nanomedicine. 2008 June; 3(2): 133-149.).
따라서, 기존의 SAMiRNA™의 뛰어난 효과를 그대로 유지하면서 PEG 등의 친수성 물질 자체의 다분산적 특성을 해결하기 위한 새로운 개념의 올리고뉴클레오티드 전달기술에 대한 시장의 요구가 절실한 상황이다.
본 발명의 목적은 작은 크기를 가지며 다분산성이 개선된 새로운 개념의 나노입자 및 그러한 나노입자를 구성하는 올리고뉴클레오티드 구조체를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드 구조체 및 그러한 올리고뉴클레오티드 구조체로 이루어진 나노입자의 제조방법, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 이용한 유전자 발현 조절기술을 제공하는데 있다.
본 발명은 기존 자가조립 나노입자인 SAMiRNATM 기술에 있어, SAMiRNATM 를 구성하는 올리고뉴클레오티드 구조체의 친수성 물질을 일정한 분자량을 갖는 균일한 m 개의 단량체(monomer)와 필요에 따라 링커(linker)를 포함하는 기본단위를 블록(block)화하여, 이를 필요에 따라 적절한 개수를 사용할 경우, 이러한 올리고뉴클레오티드 구조체에 의해 형성된 나노입자가 기존의 SAMiRNATM 에 비해 보다 작은 크기를 가지며 또한 다분산성이 획기적으로 개선될 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서의 올리고뉴클레오타이드는 DNA(deoxyribonucleotide) 또는 RNA(ribonucleotide)로 이루어진 물질로, 단일가닥 또는 상보적인 결합으로 이루어진 이중가닥으로 구성된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucelotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), miRNA(microRNA), miRNA inhibitor, 앱타머(aptamer) 등을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 발명에서 올리고뉴클레오타이드가 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드(double stranded oligonucleotide)인 경우, 안티센스 가닥(antisense strand)은RISC(RNA-induced silencing complex)에서 목표 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 목표타겟 mRNA를 분해하는 RNAi 활성을 나타내는 가닥이며, 센스가닥(sense strand)은 안티센스 가닥과 상보적인 서열을 갖는 가닥을 의미한다. 본 발명에서 상보적 또는 상보적 결합의 의미는 두 서열이 서로 결합하여 이중나선 구조를 이루는 것을 말하며, 반드시 완벽한 상보적(perfect match) 결합일 필요는 없으며 일부 서열이 상이한 경우 (mismatch)도 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에서의 miRNA(microRNA) mimic은 자연상태에서 존재하는 miRNA와 동일한 서열 및 구조의 이중가닥 RNA로, 화학적으로 합성된 형태의 miRNA를 의미하며, miRNA inhibitor는 자연상태에서 존재하는 miRNA와 상보적으로 결합하여 해당 miRNA의 작용을 저해시키는 역할을 수행하는 화학적으로 합성된 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
하나의 구체예로서, 본 발명에서는 하기 구조식 (1) 또는 구조식 (2)의 구조를 갖는 새로운 형태의 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제공한다.
구조식 1
구조식 2
상기 구조식 (1) 및 구조식 (2)에서 A는 친수성 물질 단량체(monomer), B는 소수성 물질, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 올리고뉴클레오타이드를 서로 연결하는 링커, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커(linker)가 매개된 공유결합이고, R는 단일가닥 또는 이중나선 올리고뉴클레오타이드, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수이고,
Q는 (Li-Zj) 또는 P-J1-J2이며,
L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand), Z는 단순 공유결합 또는 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체와 리간드의 결합을 매개하는 링커이고,
i는 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 0 내지 3의 정수, j는 0 또는 1을 의미하며, 단 i가 0일 경우 j도 반드시 0이며,
P는 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹을 의미하고,
J1과 J2는 독립적으로 단순 공유결합, 또는 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹과 친수성 물질간의 결합을 매개하는 링커이다.
본 발명에서의 “친수성 물질 블록”은 구조식 (1) 및 구조식 (2)에서의 (Am-J) 또는 (J-Am)로 이루어진 반복단위를 의미한다.
상기 구조식 (1) 및 구조식 (2)에서의 친수성 물질 단량체(A)는 비이온성 친수성 고분자의 단량체 중에서 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어느 것이라도 제한없이 사용이 가능하며, 바람직하게는 표 1에 기재된 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 단량체, 더욱 바람직하게는 화합물(1)의 단량체가 사용될 수 있으며, 화합물 (1)에서 G는 바람직하게는 CH2, O, S 및 NH에서 선택될 수 있다.
특히, 친수성 물질 단량체 중에서도 화합물 (1)로 표시되는 단량체에는 다양한 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 적게 유도하는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수할 뿐 아니라, 구조식 (1) 및 구조식 (2)에 따른 구조체 내에 포함된 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가시킬 수 있다는 장점을 가지고 있어 본 발명에 따른 구조체의 제조에 매우 적합하다.
구조식 (1) 및 구조식 (2)에서의 친수성 물질은 총 분자량이 1,000 내지 2,000에 범위 내인 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 화합물 (1)에 따른 헥사에틸렌 글리콜(Hexa ethylene glycol), 즉 구조식 (1) 및 구조식(2)에서의 G가 O이고, m이 6인 물질이 사용되는 경우 헥사에틸렌글리콜 스페이서(spacer)의 분자량이 344이므로, 반복 횟수(n)는 3 내지 5인 것이 바람직하다.
특히, 본 발명은 필요에 따라 상기 구조식 (1) 및 구조식 (2)에서 (Am-J) 또는 (J-Am)으로 표시되는 친수성 그룹의 반복단위, 즉 친수성 물질 블록(block)이 n으로 표시되는 적절한 개수로 사용될 수 있음을 특징으로 한다. 상기 각 친수성 물질 블록 내에 포함되는 친수성 물질 단량체인 A와 링커인 J는 독립적으로 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 친수성 물질 블록이 3개 사용될 경우(n=3), 첫 번째 블록에는 화합물 (1)에 따른 친수성 물질 단량체가, 두 번째 블록에는 화합물 (2)에 따른 친수성 물질 단량체가, 세 번째 블록에는 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체가 사용되는 등, 모든 친수성 물질 블록별로 다른 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체에서 선택된 어느 하나의 친수성 물질 단량체가 동일하게 사용될 수도 있다. 마찬가지로, 친수성 물질 단량체의 결합을 매개하는 링커 역시 각 친수성 물질 블록별로 모두 동일한 링커가 사용될 수도 있고, 각 친수성 물질 블록별로 상이한 링커가 사용될 수도 있다. 또한, 친수성 물질 단량체의 개수인 m 역시 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 첫 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 3개 연결(m=3)되고, 두 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 5개(m=5), 세 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 4개 연결(m=4)되는 등, 서로 다른 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에서 동일한 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있다.
본 발명에서 상기 링커(J)는 PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질의 단량체 등에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 한 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
상기 친수성 물질 단량체의 전부 또는 일부는 필요에 따라 타겟 특이적 리간드와 같은 다른 물질과의 결합을 위해 필요한 기능기를 갖도록 변경되어도 무방하다.
상기 친수성 물질 블록은 단일가닥 올리고의 3’ 또는 5’ 말단의 어느 위치에 결합되어도 무방하며, 또한 이중가닥 올리고의 센스가닥 또는 안티센스 가닥의 3’ 또는 5’ 말단의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.
상기 구조식 (1) 및 구조식 (2)에서의 소수성 물질(B)은 소수성 상호작용을 통해 구조식 (1) 및 구조식 (2)에 따른 올리고뉴클레오티드 구조체로 구성된 나노입자를 형성하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하며, 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐아민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산이 바람직하다.
특히, 상기 소수성 물질 중에서도 포화 또는 불포화 탄화수소나 콜레스테롤이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체의 합성 단계에서 용이하게 결합시킬 수 있는 장점을 가지고 있다는 점에서 바람직하며, C24 탄화수소, 특히 disulfide bond를 포함하는 테트라도코산(tetradocosane)이 가장 바람직하다.
상기 소수성 물질은 친수성 물질 블록과 결합된 올리고뉴클리오타이드의 반대쪽 말단(distal end)에 결합되며, 이중가닥 올리고의 센스가닥 또는 안티센스 가닥의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.
본 발명에서 올리고뉴클레오타이드(R)는 이중가닥 또는 단일가닥의 siRNA 또는 shRNA, 안티센스 micro RNA mimic, microRNA inhibitor, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO) 등이 제한없이 사용될 수 있으며, 특히 이중가닥 siRNA가 바람직하다.
이중가닥 siRNA, miRNA 등의 이중가닥 올리고뉴클레오티드가 사용될 경우, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 센스가닥 및/또는 안티센스 가닥은 15 내지 40개, 바람직하게는 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하며, 특히 안티센스 가닥의 5´ 말단에 하나 이상의 인산기, 바람직하게는 한 개 내지 세 개의 인산기가 결합되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 상기 올리고뉴클레오타이드는 생체 내 안정성 향상을 위해 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비 특이적 면역반응 감소를 위해 다양한 변형(modification)이 이루어진 형태를 가질 수도 있는데, 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형 등에서 하나 또는 둘 이상 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다((Crooke 등, Ann. Rev. Med. Vol.55: pp61-65 2004, US 5,660,985, US 5,958,691, US 6,531,584, US 5,808,023, US 6,326,358, US 6,175,001 Braasch D. A. 등 Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y. L. 등., RNA, 9:1034-1048, 2003; Amarzguioui M. 등, Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003, Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, No. 17 5761-5773, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 5 1823-1832 참조).
한편, 종양(tumor)의 조직은 매우 견고하여 정상 조직에 비하여 확산 제한(diffusion-limitation)을 가지는데, 이러한 확산 제한은 종양 성장에 필요한 영양분, 산소 및 이산화탄소 같은 노폐물의 이동에 악영향을 주기 때문에, 혈관신생(angiogenensis)을 통해 주변에 혈관을 형성함으로써 확산 제한을 극복한다. 혈관신생을 통해 형성된 종양 조직 내 혈관은 종양의 종류에 따라 100 nm 내지 2 um 가량의 틈을 가진 헐거운 혈관 구조(leaky and defective blood vessel)를 가진다. 따라서 나노입자는 정상조직의 조직화된 모세 혈관에 비하여 헐거운 혈관 구조를 가지는 암 조직의 모세혈관 내피(capillary endothelium)를 잘 통과하게 되어 혈액 내 순환 과정 중에 종양 간질(tumor interstitium)에 접근이 용이해지고, 또한 종양 조직 안에는 림프관(lymphatic drainage)이 없어 약물이 축적되는 결과를 나타내는데, 이를 EPR(enhanced permeation and retention) 효과라고 한다. 나노입자가 이러한 효과에 의해 종양 조직 특이적으로 잘 전달되는 것을 수동적 타겟팅(passive targeting)이라고 한다(Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol. Oncol. 2008 Jan-Feb; 26(1):57-64).
능동적 타겟팅(active targeting)은 표적물질(targeting moiety)이 나노입자에 결합된 경우로, 나노입자를 타겟 조직에서의 축적을 증진(preferential accumulation)시키거나, 타겟 세포 안으로 나노입자가 전달되는 내재화(internalization)를 개선하는 것이 보고되었다 (Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26(10):552-8. Epub 2008 Aug 21). 능동적 타겟팅은 타겟 세포 표면 특이적 또는 과 발현 되어있는 탄수화물(carbohydrate), 수용체(receptor), 항원 (antigen)와 결합할 수 있는 능력을 가진 물질(타겟팅 모이어티, targeting moiety)을 이용한다(Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8): 1909-1917).
따라서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 구조체 및 이로부터 형성된 나노입자에 타겟팅 모이어티가 구비된다면, 효율적으로 타겟 세포로의 전달을 촉진하여, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 타겟 세포로 전달되어 높은 목표 유전자 발현 조절 기능을 나타낼 수 있으며, 타 장기 및 세포로의 비 특이적인 올리고뉴클레오타이드의 전달을 저해할 수 있다.
이에 따라 본 발명에서는 상기 구조식 (1) 및 구조식 (2)에 따른 구조체에서 Q가 (Li-Zj)인, 리간드(L), 특히 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)가 추가적으로 포함된 구조식 (3) 및 구조식 (4)와 같은 구조체를 제공한다.
구조식 3
구조식 4
상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서의 리간드는 바람직하게는 타겟세포 특이적으로 세포내재화 (internalization)을 증진시키는 RME 특성을 가진 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머, 펩타이드; 또는 엽산(Folate, 일반적으로 folate와 folic acid는 서로 교차 사용되고 있으며, 본 발명에서의 엽산은 자연 상태 또는 인체에서 활성화 상태인 folate를 의미한다), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG) 등의 헥소아민(hexoamine), 포도당(glucose), 만노스(mannose)를 비롯한 당이나 탄수화물(carbohydrate) 등의 화학물질 등에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 발명의 리간드가 N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG), 만노스(mannose), 글루코오스(glucose)와 같은 당류일 경우, 해당 리간드에 의해 본 발명 구조식 (3) 및 구조식 (4)에 따른 구조체로 이루어진 나노입자의 타겟팅 효과뿐만 아니라, 상기 친수성 물질 블록 내 단량체의 반복횟수에 따라 감소할 수 있는 친수성을 보완 및 강화해주어 나노입자의 형성을 용이하게 해주는 역할을 수행할 수 있다.
상기 리간드는 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체와 공유결합에 의해 직접 연결되거나, 리간드의 결합을 매개하는 링커(Z)에 의해서 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체와 결합될 수 있다. 링커(Z)에 의해 리간드와 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체가 공유결합하는 경우, 링커(Z)는 본 발명의 목적에 부합하는 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이며, 특히, 하기 표 2에 기재된 화합물 (4) 내지 화합물 (7)에서 선택된 어느 하나의 구조를 가지는 링커가 사용되는 것이 바람직하다.
상기 화합물 (4)에서 T는 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 어느 하나의 화합물이 1 내지 15개 반복된 화합물을 나타내며, 특히 구조식 (1)에 따른 화합물이 1 내지 15개 반복된 화합물이 바람직하다. 상기 화합물 (4)에서 T로 표시되는 부분이 리간드와 결합되며 그 반대쪽 말단이 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체 또는 링커와 결합된다.
또한, 상기 화합물 (5) 내지 (7)에서는 좌측의 기능기가 리간드와 결합하며, 우측이 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체와 결합되며, 상기 화합물 (5)에서의 n은 0 또는 1을 의미한다. 상기 화합물 (5) 내지 (7)에는 리간드와 결합할 수 있는 하나 이상의 기능기가 포함되어 있으므로, 하나 이상의 리간드가 결합되어 타겟 조직으로의 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 전달효율을 보다 제고할 수 있다는 장점이 있다.
상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서 i 및 j가 모두 0인 경우에는 리간드가 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드 구조체를 의미하며, i가 1이고 j가 0인 경우에는 리간드가 직접 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체와 결합된 형태를, i가 1 이상의 정수이고, j가 1인 경우에는 링커를 매개로 리간드가 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체와 결합된 형태를 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기 구조식 (1) 및 구조식 (2)의 구조체의 친수성 물질의 말단, 특히 siRNA와 결합된 말단의 반대편 말단 부위에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 추가적으로 도입된, 즉 구조식 (1) 및 구조식 (2)에서 Q가 P-J1-J2인 구조식 (5) 및 구조식 (6)에 따른 구조체를 제공한다.
구조식 5
구조식 6
상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 J1과 J2는 링커로서, J1 및 J2는 독립적으로 단순 공유결합, C2-12의 알킬, 알케닐, 알키닐, PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 J1과 J2는 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
바람직하게는 아민기가 도입된 경우에는, 구조식 (5)에서는 J2는 PO3 -, J1은 C6 알킬인 것이 바람직하며, 구조식 (6)에서는 J2는 단순 공유결합, J1은 C6 알킬인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입된 경우에는 구조식 (5)에서는 J2는 PO3 -, J1은 화합물 (8) 이 바람직하며, 구조식 (6)에서는 J2는 단순 공유결합, J1은 화합물 (8) 인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
화합물 (8)
상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서의 아민기로는 1차 내지 3차 아민기가 사용될 수 있으며, 1차 아민기가 사용되는 것이 특히 바람직하다. 상기 도입된 아민기는 아민염으로 존재할 수도 있는데, 예를 들어 1차 아민기의 염은 NH3+ 의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서의 폴리히스티딘 그룹은 3 내지 10개의 히스티딘을 포함하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개의 히스티딘을 포함할 수 있다. 추가적으로 히스티딘 이외에 하나 이상의 시스테인이 포함될 수 있다.
상기 아민기 또는 폴리히스티틴 그룹은 올리고뉴클레오타이드 RNA 구조체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위해 도입되는 것으로, 이미 Quantum dot, Dendrimer, liposome 등의 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위해서 아민 그룹의 도입과 폴리히스티딘 그룹이 이용할 수 있다는 점 및 그 효과가 보고된 바 있다.
구체적으로 전달체의 말단 혹은 바깥쪽에 수식된 일차 아민기는 생체 내 pH에서 양성자화되면서 음전하를 띠는 유전자와 정전기적 상호작용에 의해 결합체를 형성하며, 세포내 유입 후에 엔도좀의 낮은 pH에서 완충 효과를 갖는 내부 삼차 아민으로 인해 엔도좀의 탈출이 용이해 짐에 따라 라이소좀의 분해로부터 전달체를 보호할 수 있다고 알려져 있고(고분자 기반 하이브리드 물질을 이용한 유전자 전달 및 발현 억제. Polymer Sci. Technol., Vol. 23, No.3, pp254-259),
비필수 아미노산의 하나인 히스티딘은 잔기(-R)에 이미다졸링(pKa3 6.04)을 가지므로 엔도좀과 라이소좀에서 완충능력(buffering capacity)을 증가시키는 효과가 있어, 리포좀을 비롯한 비바이러스성 유전자전달체(non-viral gene carrier)들에서 엔도좀 탈출효율을 높이기 위해서 히스티딘 수식을 이용될 수 있다는 점이 알려져 있다 (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene trasnsfer in human hepatoma HepG2 cells. J. Controlled Release 118, pp262-270).
본 발명에서의 구조식 (1) 내지 구조식 (6)에서 친수성 물질 블록 또는 소수성 물질과 올리고뉴클레오타이드는 단순 공유 결합 또는 링커가 매개된 공유결합(X 또는 Y)에 의해 결합된다. 상기 공유결합을 매개하는 링커는 구조식 (1) 및 구조식 (2)에서 (Am-J)n 또는 (J-Am)n로 표시되는 친수성 물질 블록, 또는 소수성 물질과 올리고뉴클레오타이드의 말단에서 공유결합하며, 필요에 따라 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체의 제조과정 중 올리고 뉴클레오타이드 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용될 수 있다. 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구조식 (1) 내지 구조식 (6)에서, 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 특히 이중가닥 올리고 RNA가 사용될 경우, 이중가닥 올리고 RNA와 친수성 물질 블록 및 소수성 물질의 결합은 예를 들어 하기 표 3에 기재된 바와 같이 구조식 (7) 내지 구조식 (18)과 같이 다양한 형태로 이루어질 수 있다.
상기 표 3에서, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, AS는 안티센스 가닥을, pAS는 인산기가 결합된 안티센스 가닥을 의미한다. 나머지 A, B, X, Y, L, Z, n 및 m의 정의는 구조식 (1) 및 구조식 (2)에서의 정의와 동일하다.
특히, 상기 구조식 (4)로 표시되는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체는 바람직하게는 하기 구조식 (19)의 구조를 가진다.
구조식 19
상기 구조식 (19)에서, A는 친수성 물질 단량체(monomer), B는 소수성 물질, L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand), Z는 친수성 물질 단량체와 리간드의 결합을 매개하는 링커, R는 단일가닥 또는 이중나선 올리고뉴클레오타이드, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며, A, B, L, R 등은 모두 본 발명 명세서의 구조식 (4)에 정의된 바와 같다.
특히, A는 표 1에 기재된 화합물 (1) 내지 화합물 (3) 중에서 선택된 어느 하나의 물질을 의미하며, Z는 상기 화합물 (4)의 화합물이 바람직하다.
본 발명은 다른 관점에서, 하기 구조식 (20)으로 표시되는 고형지지체(solid support)를 제공한다.
구조식 20
상기 구조식 (20)에서, L은 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서의 정의와 동일하며, T는 화합물 (4)에서의 정의와 동일하다. 또한, C와 D중 하나는 고형지지체이고, 다른 하나는 디메톡시트리틸(Dimethoxytrityl) 이고; E와 F는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이며, i는 0 또는 1이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 구조식 (20)에서 따른 고형지지체(solid support)를 사용하여 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 구조식 (20)에 따른 고형지지체(solid support) 를 사용하여, 본 발명의 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제조하는 방법으로, 올리고뉴클레오타이드가 단일가닥인 경우에 이를 제조하는 과정은
(1) 상기 구조식 (20)의 고형지지체에 친수성 물질 블록을 n회 반복 공유결합시키는 단계;
(2) 상기 친수성 물질 블록이 결합된 고형지지체를 기반으로 올리고뉴클레오타이드 단일 가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 친수성 물질 블록이 결합된 올리고뉴클레오타이드 5’ 말단에 소수성 물질을 공유결합시키는 단계;
(4) 고형지지체로부터 올리고뉴클레오타이드 구조체를 분리하는 단계;
를 포함하여 이루어진다.
본 발명에서 고형지지체(solid support)는 예컨대 CPG(controlled pore glass), 폴리스티렌, 실리카겔, 셀룰로오스 페이퍼 등을 포함하되 이에 제한되지 않으며; 고형 지지체가 CPG인 경우 직경은 40~180 ㎛인 것이 바람직하며, 500~3000Å의 공극 크기를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 구조체의 올리고뉴클레오타이드가 이중가닥 RNA인 경우에 있어서, 상기 이중나선 올리고뉴클레오타이드 가닥은 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용 가능한 이중나선 올리고뉴클레오타이드는 유전자 치료용 또는 연구용으로 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자에 대한 이중나선 올리고뉴클레오타이드도 채택될 수 있다.
본 발명은 상기 표 3에 기재된 구조식 (7) 내지 구조식 (10) 및 구조식 (13) 내지 구조식 (16)에 따른 이중나선 올리고뉴클레오티드(RNA) 구조체 및 그 제조 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 구조식 (20)에 따른 고형지지체(solid support)를 사용하여, 본 발명의 구조식 (7) 내지 구조식 (10) 및 구조식 (13) 내지 구조식 (16)에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제조하는 방법으로, 올리고뉴클레오타이드가 이중가닥인 경우에 이를 제조하는 과정은
(1) 상기 구조식 (20)의 고형지지체에 친수성 물질 블록을 결합하는 단계를 n회 반복하는 단계;
(2) 상기 친수성 물질 블록이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일 가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 친수성 물질 블록이 결합된 RNA 5’ 말단에 소수성 물질을 공유결합시키는 단계;
(4) 고형지지체로부터 RNA-고분자 구조체 및 상보적 서열의 RNA 단일 가닥을 분리하는 단계;
(5) 상기 RNA-고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중가닥을 형성하는 단계;
를 포함하여 이루어진다.
보다 바람직하게는
(1) 상기 구조식 (20)의 고형지지체를 기반으로 친수성 물질 블록을 결합시키는 단계;
(2) (1) 단계를 n-1 회 반복하는 단계;
(3) 상기 친수성 물질 블록이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(4) 상기 RNA 단일가닥 5’ 말단에 소수성 물질을 결합시키는 단계;
(5) 합성이 완료되면 고형지지체로부터 RNA-고분자 구조체 및 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 분리 정제하는 단계;
(6) 제조된 RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링(annealing)을 통해 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 단계 (5) 이후, 제조가 완료되면, 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 상기 반응물을 정제한 뒤, MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 RNA-고분자 구조체 및 RNA단일가닥이 제조되었는지 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (3) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (5) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
또한, 구조식 (8) 또는 구조식 (14)와 같이 안티센스 가닥 5’ 말단에 인산기가 결합된 형태의 경우는, 상기 제조방법의 단계 (6) 이전 또는 이후에 안티센스 가닥 5’ 말단에 인산기를 결합시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 구조식 (9), 구조식 (10), 구조식 (15) 및 구조식 (16)과 같은 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 그 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 구조식 (20)에 따른 고형지지체(solid support) 를 사용하여 제조하는 과정은
(1) 구조식 (20)의 고형지지체를 기반으로 친수성 물질 블록을 n회 반복 공유결합시키는 단계;
(2) 단계 (1)에서 합성된 리간드-친수성 물질 블록이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(3) 단계 (2)에서 수득된 물질에 5’ 말단에 소수성 물질을 공유결합시키는 단계;
(4) 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 리간드가 부착된 RNA-고분자 구조체 단일가닥 및 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 분리 정제하는 단계;
(5) 상기 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중가닥을 형성하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 단계 (5) 이후, 제조가 완료되면, 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 상기 반응물을 정제한 뒤, MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드가 결합된RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일가닥이 제조되었는지 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (2) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (4) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
구조식 (10) 또는 구조식 (16)과 같이 안티센스 5’ 말단에 인산기가 결합된 형태의 경우는, 상기 제조방법의 단계 (6) 이전 또는 이후에 안티센스 가닥 5’ 말단에 인산기를 결합시킬 수 있다.
또 다른 관점에서, 구조식 (21)로 표시되는 물질(material) 및 이를 이용하여 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에 따른 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 방법을 제공한다. 구조식 (21)은 구조식 (20)과 C와 D에 따른 치환기만이 상이하다.
구조식 21
상기 구조식 (21) 에 따른 물질에서, C와 D중 하나는 디메톡시트리틸(Dimethoxytrityl)이고, 다른 하나는 씨아노에틸포스포아미다이트(Cyanoethylphosphor amidite)이다.
상기 구조식 (21)에 따른 물질을 이용하여 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제조하는 방법으로, 올리고뉴클레오타이드가 단일가닥인 경우에 이를 제조하는 방법은
(1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체, 바람직하게는 CPG를 이용하여 올리고뉴클레오타이드 단일 가닥을 합성하는 단계;
(2) 상기 올리고뉴클레오타이드가 결합된 고형지지체를 기반으로 친수성 물질 단량체를 결합하는 단계를 n회 반복하는 단계;
(3) 상기 친수성 물질이 결합된 올리고뉴클레오타이드 5’ 말단에 구조식 (21)에 따른 물질을 공유결합시키는 단계;
(4) 고형지지체로부터 올리고뉴클레오타이드 고분자 구조체를 분리하는 단계;
(5) 상기 단계 (4)에서 수득된 올리고뉴클레오타이드 구조체 3’ 말단에 결합된 기능기를 통해 소수성 물질을 공유결합시키는 단계;
를 포함한다.
또한, 상기 구조식 (21)에 따른 물질을 이용하여 구조식 (1) 내지 구조식(4)에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제조하는 방법으로, 올리고뉴클레오타이드가 이중가닥인 경우에, 이를 제조하는 방법은
(1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체, 바람직하게는 CPG를 이용하여 올리고뉴클레오타이드 단일 가닥을 합성하는 단계;
(2) 상기 올리고뉴클레오타이드가 결합된 고형지지체를 기반으로 친수성 물질 단량체를 결합하는 단계를 n회 반복하는 단계;
(3) 상기 친수성 물질이 결합된 올리고뉴클레오타이드 5’ 말단에 구조식 (21)에 따른 물질을 공유결합시키는 단계;
(4) 고형지지체로부터 RNA-고분자 구조체 및 상보적 서열의 RNA 단일 가닥을 분리하는 단계;
(5) 상기 단계 (4)에서 수득된 올리고뉴클레오타이드 구조체 3’ 말단에 결합된 기능기를 통해 소수성 물질을 공유결합시키는 단계;
(6) 상기 RNA-고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중가닥을 형성하는 단계;
를 포함한다.
또한, 안티센스 가닥 5’ 말단에 인산기가 결합된 형태의 경우는, 상기 제조방법의 단계 (6) 이전 또는 이후에 안티센스 가닥 5’ 말단에 인산기를 결합시킬 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 구조식 (1) 내지 구조식 (6) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체로 구성된 나노입자를 제공한다. 올리고뉴클레오타이드는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성(amphiphilic)이며, n개의 친수성 물질 블록으로 이루어진 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 소수성 물질들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 나노입자(SAMiRNA)를 형성하게 된다. 즉, 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, 올리고뉴클레오타이드의 바깥쪽 방향에 친수성 물질 블록이 위치하여 이중나선 올리고 RNA를 보호하는 형태의 나노입자를 형성한다(도 1 참조). 이렇게 형성된 나노입자는 올리고뉴클레오타이드의 세포 내 전달 향상 및 올리고뉴클레오타이드의 유전자 발현 조절 효능을 향상시키며, 이를 질병의 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다.
또한, 친수성 물질 블록 내에 친수성 물질 단량체 및 그 단량체의 개수 조절이 용이하고, 또한 사용될 친수성 물질 블록의 개수 또한 용이하게 조절할 수 있으므로, 모든 올리고뉴클레오티드 구조체 내의 n개의 친수성 물질 블록으로 이루어진 친수성 물질 부분은 모두 동일하므로, 이러한 친수성 물질 부분을 가진 올리고뉴클레오타이드 구조체는 물질 분석이 용이하고, 동일 분자량을 갖도록 추가 정제 과정을 거친 친수성 물질을 사용하여 합성된 올리고뉴클레오타이드 구조체에 비해 합성 과정이 간단하고, 비용을 절감할 수 있는 특징을 지닌다.
또한 친수성 물질 블록 및 친수성 물질 블록 내 친수성 물질 단량체의 반복횟수 조절을 통해 올리고뉴클레오타이드 구조체로 이루어진 나노입자의 크기를 조절할 수 있으므로, 이러한 올리고뉴클레오티드를 기반으로 형성된 나노입자는 매우 재현성있는 세포전달능력을 가질 수 있다.
또한, 리간드가 결합된 올리고뉴클레오타이드 특히, 리간드가 N-아세틸갈락토사민, 만노스(mannose), 글루코오스(glucose)와 같은 당류일 경우, 구조식 (1) 또는 구조식 (2)에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체는 친수성 물질 블록의 반복횟수가 적었을 때 감소하는 친수성을 보완 및 강화하는 역할을 동시에 수행할 수 있어 나노입자의 형성을 안정화 시켜준다. 이렇게 형성된 나노입자 및 리간드가 결합된 나노입자는 올리고뉴클레오타이드의 세포 내 전달 향상 및 올리고뉴클레오타이드의 효능을 향상시키며, 이를 질병의 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다. 보다 구체적인 구조체의 합성과 올리고뉴클레오타이드 구조체로 구성된 나노입자의 특징, 세포전달 효율 및 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체 또는 이를 기반으로 형성되는 나노입자를 이용한 치료방법을 제공한다. 구체적으로 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체로 구성된 나노입자를 준비하는 단계와 상기 나노입자를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체로 구성된 나노입자의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다
본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.
이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 및 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체를 이용한 생체 내 또는 생체 외에서 유전자 발현 조절 방법을 제공한다. 그리고 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 나노입자를 이용한 생체 내 또는 생체 외에서 유전자 발현 조절방법을 제공한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체는 모두 동일한 친수성 물질 부분을 가질 수 있어, 올리고뉴클레오타이드에 결합되는 친수성 물질이 합성 폴리머일 때 발생하는 다분산적 특성으로 인한 품질관리(Quality Control) 등의 문제를 획기적으로 개선할 수 있으며, 다분산성 친수성 물질을 이용한 기존 정제 공정에 비하여 간단하고 합성 비용을 절감할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드 구조체의 물질 분석이 용이하다는 장점이 있다. 또한, 친수성 물질 블록의 반복횟수 및 각 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체의 반복횟수 조절을 통해 나노입자의 크기 조절이 가능하다.
특히, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 구조체에 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 결합할 수 있는 리간드를 추가적으로 결합시킬 경우, 목적하는 세포 내로의 보다 효율적인 전달이 가능하며, 또한, 상기 리간드가 당인 경우 나노입자의 타겟팅 효과와 함께, 친수성 물질 블록의 반복횟수에 따라 감소되는 친수성을 보완하는 역할을 수행하여 올리고뉴클레오타이드의 세포 내 전달 향상 및 올리고뉴클레오타이드의 유전자 발현 조절 효능을 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.
또한, 친수성 물질 블록에 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹을 도입함으로써, 세포내에 흡수된 후 엔도좀으로부터의 탈출을 용이하게 하고, 라이소좀에 의한 분해를 억제하는 효과가 있어, 보다 높은 치료효과를 거둘 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 동일한 분자량의 친수성 물질이 결합된 올리고뉴클레오타이드 구조체로 구성된 나노입자의 모식도.
도 2는 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG(Controlled Pore Glass)의 전체 합성경로를 나타내는 도면.
도 3은 2,3,4,6-테트라아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-만노즈-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-Mannose-CPG(Controlled Pore Glass)의 전체 합성경로를 나타내는 도면.
도 4는 2,3,4,6-테트라아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-글루코스-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-Glucose-CPG(Controlled Pore Glass)의 전체 합성경로를 나타내는 도면
도 5는 1,3,4,6-테트라아세틸-N-아세틸 갈락토사민 (1,3,4,6-Tetraacetyl-
NAG) (도 2의 화합물 1)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6); 7.91~7.86 (d, 1H), 5.66~5.61 (d, 1H), 5.28~5.25 (d, 1H), 5.10~5.03 (d, 1H), 4.25~4.19 (t, 1H), 4.15~3.94 (m, 3H), 2.12~2.10 (s, 3H), 2.04~2.02 (s, 3H), 2.00~1.98 (s, 3H), 1.91~1.89 (s, 3H), 1.78~1.76 (s, 3H)
도 6은 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민(3,4,6-Triacetyl-1-hexa(ethylene glycol)-NAG) (도 2의 화합물 2)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300 MHz, CDCl3); 6.66~6.61 (d, 1H), 5.33~5.29 (d, 1H), 5.02~4.96 (d, 1H), 4.80~4.75 (d, 1H), 4.25~4.07 (m, 2H), 3.93~3.79 (m, 2H), 3.73~3.54 (m, 24H), 2.16~2.14 (s, 3H), 2.05~2.03 (s, 3H), 1.99~1.97 (s, 6H)
도 7은 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’,2’-프로판다이올]-N-아세틸 갈락토사민 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’,2’-프로판다이올]-N-아세틸 갈락토사민 (도 2의 화합물 3)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300 MHz, CDCl3); 1H NMR (300MHz, CDCl3) ; 6.83~6.78 (d, 1H), 6.10~6.08 (s, 1H), 5.33~5.29 (d, 1H), 5.00~4.94 (d, 1H), 4.82~4.77 (d, 1H), 4.22~4.08 (m, 4H), 3.94~3.85 (m, 2H), 3.83~3.74 (m, 1H), 3.66~3.52 (m, 24H), 3.40~3.24 (m, 2H), 2.18~2.16 (s, 6H), 2.05~2.03 (s, 3H), 2.00~1.98 (s, 3H)
도 8은 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시(디메톡시트리틸)-2’-프로판올]-N-아세틸 갈락토사민 (도 2의 화합물 4)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300MHz, DMSO-d6) ; 7.80~7.75 (d, 1H), 7.40~7.20 (m, 9H), 7.00~6.98 (s, 1H), 6.90~6.85 (d, 4H), 5.22~5.20 (s, 1H), 5.00~4.87 (m, 2H), 4.58~4.55 (d, 1H), 4.04~4.02 (s, 4H), 3.94~3.82 (m, 1H), 3.74~3.72 (s, 6H), 3.51~3.49 (s, 24H), 3.18~3.12 (m, 1H), 2.94~2.85 (m, 2H), 2.11~2.09 (s, 3H), 2.00~1.98 (s, 3H), 1.90~1.88 (s, 3H), 1.78~1.76 (s, 3H)
도 9는 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시 (디메톡시트리틸) -2’-프로폭시(석시닉 엑시드]-N-아세틸 갈락토사민 (도 2의 화합물 5)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300MHz, CDCl3) ; 7.43~.38 (d, 2H), 7.31~7.19 (m, 7H), 6.84~6.79 (d, 4H), 6.75~6.67 (t, 1H), 5.52~4.89 (m, 1H), 5.32~5.30 (s, 1H), 5.21~5.19 (s, 1H), 5.01~4.95 (d, 1H), 4.81~4.76 (d, 1H), 4.30~4.08 (m, 3H), 3.93~3.86 (m, 2H), 3.79~3.77 (s, 6H), 3.66~3.52 (m, 24H), 3.36~3.32 (m, 1H), 3.21~3.17 (d, 2H), 2.75~2.56 (m, 4H), 2.18~2.16 (s, 3H), 2.04~2.01 (m, 6H), 1.98~1.96 (s, 3H)
도 10은 리간드가 결합된 올리고뉴클레오타이드구조체의 구조 및 그의 한 예로 mono-NAG-(Hexa ethylene glycol)n-Oligo-Lipid 구조와 도입된 Lipid의 구조를 나타내는 도면.
(A) 리간드가 결합된 올리고뉴클레오타이드구조체의 구조
(B) mono-NAG-(Hexa ethylene glycol)n-Oligo-Lipid 구조
도 11은 mono-NAG-(HexaethyleneGlycol)1-Oligo-Lipid 질량분석 (MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면.
(mono-NAG-(Hexaethylene Glycol)1-Oligo-Lipid 의 분자량(MW 7807.4))
도 12는 mono-NAG-(HexaethyleneGlycol)2-Oligo-Lipid 구조와 질량분석 (MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면.
(mono-NAG-(Hexaethylene Glycol)2-Oligo-Lipid 의 분자량(MW 8152.7))
도 13은 mono-NAG-(HexaethyleneGlycol)3-Oligo-Lipid 구조와 질량분석 (MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면.
(mono-NAG-(Hexaethylene Glycol)3-Oligo-Lipid 의 분자량(MW 8498.0))
도 14은 mono-NAG-(HexaethyleneGlycol)4-Oligo-Lipid 구조와 질량분석 (MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면.
(mono-NAG-(Hexaethylene Glycol)4-Oligo-Lipid 의 분자량(MW 8843.3))
도 15 는 본 발명에 따른 동일한 분자량의 친수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자(SAMiRNA)의 임계 미셀농도를 측정한 그래프.
도 16은 본 발명에 따른 동일한 분자량의 친수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자(SAMiRNA)의 크기 및 다분산 지수를 나타내는 도면.
(n은 친수성 물질 단량체의 반복횟수를 나타내며 해당 구조로 이루어진 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자를 의미)
도 17은 본 발명에 따른 동일한 분자량의 친수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자(SAMiRNA)가 처리된 세포주에서 목표 유전자의 발현 저해정도를 나타내는 도면.
(n은 친수성 물질 단량체의 반복횟수를 나타내며 해당 구조로 이루어진 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자를 의미)
도 2는 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG(Controlled Pore Glass)의 전체 합성경로를 나타내는 도면.
도 3은 2,3,4,6-테트라아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-만노즈-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-Mannose-CPG(Controlled Pore Glass)의 전체 합성경로를 나타내는 도면.
도 4는 2,3,4,6-테트라아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-글루코스-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-Glucose-CPG(Controlled Pore Glass)의 전체 합성경로를 나타내는 도면
도 5는 1,3,4,6-테트라아세틸-N-아세틸 갈락토사민 (1,3,4,6-Tetraacetyl-
NAG) (도 2의 화합물 1)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6); 7.91~7.86 (d, 1H), 5.66~5.61 (d, 1H), 5.28~5.25 (d, 1H), 5.10~5.03 (d, 1H), 4.25~4.19 (t, 1H), 4.15~3.94 (m, 3H), 2.12~2.10 (s, 3H), 2.04~2.02 (s, 3H), 2.00~1.98 (s, 3H), 1.91~1.89 (s, 3H), 1.78~1.76 (s, 3H)
도 6은 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민(3,4,6-Triacetyl-1-hexa(ethylene glycol)-NAG) (도 2의 화합물 2)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300 MHz, CDCl3); 6.66~6.61 (d, 1H), 5.33~5.29 (d, 1H), 5.02~4.96 (d, 1H), 4.80~4.75 (d, 1H), 4.25~4.07 (m, 2H), 3.93~3.79 (m, 2H), 3.73~3.54 (m, 24H), 2.16~2.14 (s, 3H), 2.05~2.03 (s, 3H), 1.99~1.97 (s, 6H)
도 7은 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’,2’-프로판다이올]-N-아세틸 갈락토사민 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’,2’-프로판다이올]-N-아세틸 갈락토사민 (도 2의 화합물 3)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300 MHz, CDCl3); 1H NMR (300MHz, CDCl3) ; 6.83~6.78 (d, 1H), 6.10~6.08 (s, 1H), 5.33~5.29 (d, 1H), 5.00~4.94 (d, 1H), 4.82~4.77 (d, 1H), 4.22~4.08 (m, 4H), 3.94~3.85 (m, 2H), 3.83~3.74 (m, 1H), 3.66~3.52 (m, 24H), 3.40~3.24 (m, 2H), 2.18~2.16 (s, 6H), 2.05~2.03 (s, 3H), 2.00~1.98 (s, 3H)
도 8은 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시(디메톡시트리틸)-2’-프로판올]-N-아세틸 갈락토사민 (도 2의 화합물 4)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300MHz, DMSO-d6) ; 7.80~7.75 (d, 1H), 7.40~7.20 (m, 9H), 7.00~6.98 (s, 1H), 6.90~6.85 (d, 4H), 5.22~5.20 (s, 1H), 5.00~4.87 (m, 2H), 4.58~4.55 (d, 1H), 4.04~4.02 (s, 4H), 3.94~3.82 (m, 1H), 3.74~3.72 (s, 6H), 3.51~3.49 (s, 24H), 3.18~3.12 (m, 1H), 2.94~2.85 (m, 2H), 2.11~2.09 (s, 3H), 2.00~1.98 (s, 3H), 1.90~1.88 (s, 3H), 1.78~1.76 (s, 3H)
도 9는 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시 (디메톡시트리틸) -2’-프로폭시(석시닉 엑시드]-N-아세틸 갈락토사민 (도 2의 화합물 5)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면.
1H NMR (300MHz, CDCl3) ; 7.43~.38 (d, 2H), 7.31~7.19 (m, 7H), 6.84~6.79 (d, 4H), 6.75~6.67 (t, 1H), 5.52~4.89 (m, 1H), 5.32~5.30 (s, 1H), 5.21~5.19 (s, 1H), 5.01~4.95 (d, 1H), 4.81~4.76 (d, 1H), 4.30~4.08 (m, 3H), 3.93~3.86 (m, 2H), 3.79~3.77 (s, 6H), 3.66~3.52 (m, 24H), 3.36~3.32 (m, 1H), 3.21~3.17 (d, 2H), 2.75~2.56 (m, 4H), 2.18~2.16 (s, 3H), 2.04~2.01 (m, 6H), 1.98~1.96 (s, 3H)
도 10은 리간드가 결합된 올리고뉴클레오타이드구조체의 구조 및 그의 한 예로 mono-NAG-(Hexa ethylene glycol)n-Oligo-Lipid 구조와 도입된 Lipid의 구조를 나타내는 도면.
(A) 리간드가 결합된 올리고뉴클레오타이드구조체의 구조
(B) mono-NAG-(Hexa ethylene glycol)n-Oligo-Lipid 구조
도 11은 mono-NAG-(HexaethyleneGlycol)1-Oligo-Lipid 질량분석 (MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면.
(mono-NAG-(Hexaethylene Glycol)1-Oligo-Lipid 의 분자량(MW 7807.4))
도 12는 mono-NAG-(HexaethyleneGlycol)2-Oligo-Lipid 구조와 질량분석 (MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면.
(mono-NAG-(Hexaethylene Glycol)2-Oligo-Lipid 의 분자량(MW 8152.7))
도 13은 mono-NAG-(HexaethyleneGlycol)3-Oligo-Lipid 구조와 질량분석 (MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면.
(mono-NAG-(Hexaethylene Glycol)3-Oligo-Lipid 의 분자량(MW 8498.0))
도 14은 mono-NAG-(HexaethyleneGlycol)4-Oligo-Lipid 구조와 질량분석 (MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면.
(mono-NAG-(Hexaethylene Glycol)4-Oligo-Lipid 의 분자량(MW 8843.3))
도 15 는 본 발명에 따른 동일한 분자량의 친수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자(SAMiRNA)의 임계 미셀농도를 측정한 그래프.
도 16은 본 발명에 따른 동일한 분자량의 친수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자(SAMiRNA)의 크기 및 다분산 지수를 나타내는 도면.
(n은 친수성 물질 단량체의 반복횟수를 나타내며 해당 구조로 이루어진 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자를 의미)
도 17은 본 발명에 따른 동일한 분자량의 친수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자(SAMiRNA)가 처리된 세포주에서 목표 유전자의 발현 저해정도를 나타내는 도면.
(n은 친수성 물질 단량체의 반복횟수를 나타내며 해당 구조로 이루어진 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자를 의미)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 3’ N-아세틸갈락토사민(N-acetyl galactosamine) CPG(controlled pore glass)의 제조
리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 이중나선 올리고 RNA 구조체에 결합이 가능한 리간드 물질인 N-아세틸갈락토사민 CPG를 제조하였다.
실시예 1-1. 1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG(Controlled Pore Glass) 시약의 제조
N-아세틸 갈락토사민(N-Acetyl Galactosamine, NAG)을 이중나선 올리고 RNA 구조체에 결합하기 위하여 도 2에 나타낸 바와 같이 1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG(Controlled Pore Glass) 를 제조하였다.
실시예 1-1-1 1,3,4,6-테트라아세틸-NAG (1,3,4,6-Tetraacetyl-NAG) (도 2의 화합물 1)의 제조
출발물질 염산 갈락토사민 (Galactosamine hydrochloride, Sigma Aldrich,미국) (10 g, 46.37 mmol), 아세토나이트릴 (150 ㎖), 트리에틸아민 (556.48 ㎖)을 혼합하여 1시간 동안 환류한다. 천천히 상온으로 냉각하고, 얼음물을 이용하여 0℃로 냉각한 후 무수초산 (43.83 ㎖, 463.70mmol)을 적가하였다. 적가가 끝난 후 얼음물을 제거하고, 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 완료되면 포화 탄산수소나트륨수용액으로 pH가 중성이 될 때까지 천천히 투입하였다. pH가 중성이 된 후 2시간 동안 상온에서 교반하여 생성된 고체를 여과하고, 여과물을 에틸아세테이트, 증류수, 에틸아세테이트의 순서대로 씻어주었다. 고체를 진공 건조하여 1,3,4,6-테트라아세틸- N-아세틸 갈락토사민(9.792 g, 56 %)을 얻었다(도 2 참조).
실시예 1-1-2. 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민(3,4,6-Triacetyl-1-hexa(ethylene glycol)-N-acetyl-NAG) (도 2의 화합물 2)의 제조
상기 실시예 1-1-1에서 얻어진 1,3,4,6-테트라아세틸- N-아세틸 갈락토사민(6.77 g, 18.04 mmol), 염화철 Ⅲ(3.80g, 23.45 mmol), 메틸렌 클로라이드(200 ㎖)를 혼합하여 상온에서 교반하였다. 10 분간 교반한 뒤, 헥사(에틸렌 글리콜) (5.90 ㎖, 4.82 mmol)를 투입하여 2시간 동안 환류하였다. 반응이 완료되면 셀라이트를 사용하여 여과하였고, 여과물을 메틸렌 클로라이드로 씻어주었다. 여과액을 감압농축하고, 에틸아세테이트와 증류수를 넣고 물 층을 추출하였다. 획득된 물 층을 메틸렌클로라이드로 추출하여 유기층을 모아서 무수황산마그네슘으로 건조하고 여과하였다. 여과액을 감압 농축하고, 진공 건조하여 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민 (2.24 g, 74.9 %)을 얻었다(도 3 참조).
실시예 1-1-3 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’,2’-프로판다이올]-N-아세틸 갈락토사민(3,4,6-Triacetyl-1-[hexa(ethylene glycol)-N’-1’,2’-propanediol]-N-acetyl-NAG) (도 2의 화합물 3)의 제조
상기 실시예 1-1-2에서 얻어진 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민 (13.66g, 22.33mmol)를 아세토나이트릴(220ml)에 투입하고 교반한다. 엔엔’-디석시니미딜카르보네이트(9.15g, 35.73mmol), 트리에틸아민 (9.90ml, 71.46mmol)를 투입하고, 24시간 동안 교반한다. 3-아미노-1,2-프로판다이올(3.26g, 35.73mmol)을 엔,엔’-디메틸포름아마이드 60ml에 희석하고, 트리에틸아민(4.95ml, 35.73mmol)를 투입한 후, 반응용액에 넣고 24시간 동안 교반한다. 감압농축하고, 진공건조한다. 컬럼 으로 분리하고, 용액을 감압농축한다. 진공건조하여 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’,2’-프로판다이올]-N-아세틸 갈락토사민 (9.23g, 56.7%) 을 얻는다(도 4 참조).
실시예 1-1-4 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시(디메톡시트리틸)-2’-프로판올]-N-아세틸 갈락토사민(3,4,6-Triacetyl-1-[hexa(ethylene glycol)-N’-1’ -methoxy(dimethoxytrityl)-2’-propanol]-N-acetyl-NAG) (도 2의 화합물4)의 제조
상기 실시예 1-1-3에서 얻어진 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’,2’-프로판다이올]-N-아세틸 갈락토사민 (9.23g (12.67mmol, 1eq)를 메틸렌 클로라이드(120ml)에 투입하고 교반한다. 트리에틸아민 5.27ml (38.00mmol, 3eq) 를 투입한다. 디엠티클로라이드 (4.72g, 13.93mmol) 을 메틸렌 클로라이드(20ml) 에 희석하여 투입하고, 24시간동안 교반한다. 감압농축한다. 에틸아세테이트로 추출한다. 무수황산나트륨로 건조하고, 여과한다. 여과액을 감압농축한다. 컬럼 으로 분리하고, 용액을 감압농축한다. 진공건조하여 원하는 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시-디메톡시트리틸-2’-프로판올]-N-아세틸 갈락토사민 (7.77g, 59.5%)을 얻는다.
실시예 1-1-5 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시 (디메톡시트리틸)-2’-프로폭시(석시닉 엑시드]-N-아세틸 갈락토사민(3, 4,6-Triacetyl-1-[hexa(ethylene glycol)-N’-1’ -methoxy(dimethoxytrityl)-2’-propoxy(succinic acid)]-N-acetyl-NAG) (도 2의 화합물5)의 제조
상기 실시예 1-1-4에서 얻어진 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시(디메톡시트리틸)-2’-프로판올]-N-아세틸 갈락토사민 (7.72g, 7.487mmol), 피리딘 (70ml) 를 투입하고 교반한다. 무수초산(3.75g, 37.486mmol), 디엠에이피(0.46g, 3.745mmol) 을 투입하고, 60~70℃에서 24시간 동안 교반한다. 감압농축하고, 진공건조한다. 에틸아세테이트로 추출한다. 무수황산나트륨로 건조하고, 여과한다. 여과액을 감압농축한다. 컬럼으로 분리하고, 용액을 감압농축한다. 진공건조하여 원하는 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시 (디메톡시트리틸)-2’-프로폭시(석시닉 엑시드]-N-아세틸 갈락토사민 (7.61g 89.9%) 을 얻는다.
실시예 1-1-6 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지의 Capping전 CPG 화합물(1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG의 Capping전 CPG 화합물 (도 2의 화합물6)의 제조
상기 실시예 1-1-5에서 얻어진 3,4,6-트리아세틸-1-[헥사(에틸렌 글리콜)-N’-1’-메톡시 (디메톡시트리틸)-2’-프로폭시(석시닉 엑시드]-N-아세틸 갈락토사민 (0.34g, 0.30mmol), 엘시에이에이-시피지(1000Å) (5g), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드(0.2g, 0.45mmol), 1-하이드록시벤조트리아조 (0.06g, 0.45mmol), 메틸렌 클로라이드(50ml)를 투입한다. 트리에틸아민(0.03ml, 2.25mmol)를 투입한다. 24시간 반응시킨다. 여과하고 메탄올로 씻어준다. 건조하여 원하는 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지의 Capping전 CPG화합물 (4.91g)을 얻는다.
실시예 1-1-7 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG(Controlled Pore Glass) (도 2의 화합물 7)의 제조
상기 실시예 1-1-6에서 얻어진 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지의 Capping 전 CPG화합물 (4.86g), 피리딘 (30ml), 무수초산 (6.02ml, 63.70mmol), 1-메틸이미다졸 (5.08ml, 63.70mmol)를 투입한후, 24시간 동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG(Controlled Pore Glass)(2.8g)을 얻는다.
실시예 2. 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조
이하 실시예에서는 서바이빈을 억제하기 위해 서바이빈에 대한 이중나선 올리고 RNA를 사용하였다. 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질 변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(Survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov; 35(7): 553-62).
본 발명의 서바이빈에 대한 이중나선 올리고 RNA는 서열번호 1번으로 기재되는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스 가닥으로 구성되어 있으며, 대조군으로 사용되는 이중나선 올리고 RNA는 서열번호 2번으로 기재되는 센스가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스 가닥으로 구성되어 있다. 본 실시예에 사용된 이중나선 올리고 RNA의 염기서열은 하기와 같다.
(서열번호 1) 5´-AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3´
(서열번호 2) 5´-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-3´
상기 이중나선 올리고 RNA는 β-시아노에틸포스포아미디트 (β-cyanoethylphosphoramidite)를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터(phosphodiester) 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여, 상기 이중나선 올리고RNA 단일가닥을 합성하였다 (Polymer support oligonucleotide synthesis XVIII: use of beta-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholinophosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11):4539-57).
합성 과정은 뉴클레오사이드(nucleoside)가 결합된 고형지지체(CPG) 상으로부터 시작하여 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 사이클(cycle)을 반복함으로써, 원하는 서열의 RNA단일가닥을 얻게 된다. 해당 일련의 이중나선 올리고 RNA의 합성과정은 RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하였다
이중나선 올리고 RNA 구조체를 구성하는 친수성 물질 단량체의 반복횟수에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자의 특성 분석을 위해 다음과 같은 구조의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하였다.
본 발명에서 제조된 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 표 4와 같은 구조를 갖는다.
상기 표 4에서, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥; AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스가닥; PO4는 인산기; NAG는 리간드로 N-아세틸갈락토사민(N-acetyl galactosamine); PEG는 다분산계 친수성 물질로 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol); 헥사에틸렌글리콜-PO3 -은 친수성 물질 단량체로 헥세에틸렌 글리콜(hexa ethylene glycol)이 인산기(PO3 -)를 통해 결합됨; 아래첨자는 친수성 물질 단량체의 반복횟수(n); C24는 소수성 물질로 이황화 결합이 포함되어 있는 테트라도코산 (tetradocosane); 5’ 및 3’은 이중나선 올리고 RNA의 말단 방향을 의미한다.
이중나선 올리고 RNA 구조체의 안티센스가닥은 모두 동일한 구조로, 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에 틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 제조한 뒤에 5´ 말단에 인산기를 결합하기 위해 화학적 인산화 시약(Chemical Phosphorylation Reagent, CPR)인[3-(4, 4´디메톡시트리틸옥시)-2, 2-디카르복시에틸] 프로필-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포아미디트([3-(4,4´Dimethoxytrityloxy)-2,2-dicarboxyethyl]propyl-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)- phosphoramidite)을 이용하여 5´말단에 인산기가 결합된 S-SAMiRNA-PO4의 안티센스 가닥을 제조하였다. 또는 RNA 단일가닥을 CPG로부터 회수한 뒤 인산화 효소(kinase)를 처리하여 5´말단에 인산기를 결합시키는 방법을 사용하여 인산기가 결합된 안티센스 가닥을 제조하였다.
SAMiRNA 이중나선 올리고 RNA구조체의 센스가닥의 경우, 실시예 1에서 제조된 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine -CPG를 지지체로 하여 친수성 물질인 PEG-포스포아미다이트(Polyethylene glycol phosphoramidate, 이때, 사용된 PEG의 Mn은 2,000이다)를 상기 반응으로 결합시킨 뒤, RNA 를 합성을 진행한 다음, 이황화 결합이 포함되어 있는 테트라도코산(tetradocosane)(C24)을 5´말단에 결합하여, 3’ 말단 부위에 NAG-PEG가 결합되어있고, 5’ 말단에 테트라도코산이 결합되어 있는 SAMiRNA의 센스 가닥을 제조하였다.
monoSAMiRNA(n=1) 이중나선 올리고 RNA 구조체의 센스가닥은 실시예 1에서 제조된 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG를 지지체로 하여 상기 반응을 통해 RNA 를 합성한 뒤, 추가적으로 5’ 말단 부위에 소수성 물질인 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산(tetradocosane, C24) 을 결합시켜, 3’ 말단에 NAG-헥사에틸렌글리콜이 결합되어있고, 5’ 말단에 테트라도코산이 결합되어 있는 monoSAMiRNA (n=1)의 센스가닥을 만들었다.
monoSAMiRNA(n=2) 이중나선 올리고 RNA 구조체의 센스가닥은 실시예 1에서 제조된 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG를 지지체로 하여, 친수성 물질 단량체인 DMT헥사에틸렌글리콜 포스포아미다이트(Demethoxytrityl hexaethylene glycol phosphoramidate)을 상기 반응을 통해 결합한 후, RNA 를 합성을 진행한 다음, 추가적으로 5’ 말단 부위에 소수성 물질인 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산(tetradocosane, C24) 을 결합시켜, 3’ 말단에 NAG-헥사에틸렌글리콜-(-PO4 -헥사에틸렌글리콜)1이 결합되어 있고, 5’ 말단에 테트라도코산이 결합되어 있는 monoSAMiRNA (n=2)의 센스가닥을 만들었다.
monoSAMiRNA(n=3) 이중나선 올리고 RNA 구조체의 센스가닥은 실시예 1에서 제조된 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG를 지지체로 하여, 친수성 물질 단량체인 DMT헥사에틸렌글리콜 포스포아미다이트(Demethoxytrityl hexaethylene glycol phosphoramidate) 2개를 상기 반응을 통해 연속하여 결합한 후, RNA 를 합성을 진행한 다음, 추가적으로 5’ 말단 부위에 소수성 물질인 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산(tetradocosane, C24) 을 결합시켜, 3’ 말단에 NAG-헥사에틸렌글리콜-(-PO4 -헥사에틸렌글리콜)2이 결합되어 있고, 5’ 말단에 테트라도코산이 결합되어 있는 monoSAMiRNA (n=3)의 센스가닥을 만들었다.
monoSAMiRNA(n=4) 이중나선 올리고 RNA 구조체의 센스가닥은 실시예 1에서 제조된 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-Acetyl Galactosamine-CPG를 지지체로 하여, 친수성 물질 단량체인 DMT헥사에틸렌글리콜 포스포아미다이트(Demethoxytrityl hexaethylene glycol phosphoramidate) 3개를 상기 반응을 통해 연속하여 결합한 후, RNA 를 합성을 진행한 다음, 추가적으로 5’ 말단 부위에 소수성 물질인 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산(tetradocosane, C24) 을 결합시켜, 3’ 말단에 NAG-헥사에틸렌글리콜-(-PO3 - 헥사에틸렌글리콜)3이 결합되어 있고, 5’ 말단에 테트라도코산이 결합되어 있는 monoSAMiRNA(n=4)의 센스가닥을 만들었다.
합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2´ TBDMS(tert-butyldimethylsilyl)를 제거하였다. 상기 반응물들로부터 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 RNA 단일가닥, RNA-고분자 구조체 및 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체를 분리하고, 이를 MALDI-TOF 질량 분석 (MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)로 분자량을 측정하여, 합성하고자 하는 염기서열 및 RNA-고분자 구조체와 부합하는지 확인하였다 (도 11 내지 14). 그 후, 각각의 이중나선 올리고 RNA구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스 가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, 목적하는 SAMiRNA, monoSAMiRNA(n=1), monoSAMiRNA(n=2), monoSAMiRNA(n=3) 및 monoSAMiRNA(n=4)을 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체들은 전기영동을 통해 어닐링을 확인하였다.
실시예 3. monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자의 물성분석
상기 실시예 2에서 제조된 monoSAMiRNA 이중나선 올리고 RNA의 말단에 결합된 소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의하여 나노입자, 즉 미셀(micelle)을 형성하게 된다(도 1 참조).
monoSAMiRNA의 친수성 물질 단량체 반복횟수에 따른 나노입자 크기 및 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC)값과 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 분석을 통해 해당 monoSAMiRNA로 구성된 나노입자(SAMiRNA)의 형성을 확인하였다.
실시예 3-1. monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자의 임계 미셀농도 측정
단일 분자에 소수성기와 친수성기가 함께 들어있는 양친매성인 물질(amphiphile)은 계면활성제가 될 수 있는데, 계면활성제는 수용액에 용해되면 소수성기는 물과의 접촉을 피하기 위해 가운데로 모이고 친수성기는 바깥쪽으로 향하여 미셀을 형성하게 된다. 이때, 최초로 미셀을 형성하게 되는 농도를 임계 미셀농도(critical micelle concentration, CMC)라고 한다. 형광 염료를 이용하여 CMC를 측정하는 방법은 미셀이 형성되기 전/후에 형광염료의 형광값(intensity) 그래프 곡선의 기울기가 급격하게 변하는 특성에 근거한 것이다. monoSAMiRNA로 구성된 나노입자의 임계 미셀농도 측정을 위하여 형광염료인 0.04 mM DPH(1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene, SIGMA, USA)를 준비한다. monoSAMiRNA(n=1) 1 nmole/㎕를 0.0977 ㎍/㎖에서 최고 50 ㎍/㎖의 농도로 DPBS로 단계별로 희석하여, 총 180 ㎕의 monoSAMiRNA(n=1) 시료를 준비한다. 준비된 시료에 0.04 mM DPH와 대조군으로 쓰일 DPH의 용매인 메탄올을 각각 20 ㎕씩 첨가하여 잘 혼합한 뒤, 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)를 통해 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭 20 %)하였다. 균질화된 시료는 빛을 차단된 상온 조건에서 약 24 시간 반응시킨 뒤, 형광값(excitation: 355 nm, emission: 428 nm, top read)을 측정하였다. 측정된 형광값들은 상대적인 형광값을 확인하는 것이기 때문에 동일 농도에서 DPH 포함된 시료의 형광값-메탄올만 포함된 시료의 형광값을 구하여(Y축) 처리한 monoSAMiRNA(n=1) 농도의 log 값(X축)에 대한 그래프로 도시하였다. 상기 monoSAMiRNA(n=2), monoSAMiRNA(n=3)도 동일한 방법으로 측정하였다.
각 농도 별 측정된 형광값은 저농도 구간에서 고농도 구간으로 이동하면서 급격하게 증가하게 되는데, 이렇게 급격하게 증가하는 지점의 농도가 CMC농도가 된다. 따라서 형광량이 증가하지 않는 저농도 구간과 형광량이 증가한 고농도 구간을 몇 지점으로 구분하여 추세선을 그리고, 두 추세선이 만나는 교차점의 X 값이 CMC 농도가 된다. 측정된 monoSAMiRNA(n=1)로 이루어진 나노입자의 CMC는 0.83 ㎍/㎖로 비교적 높게 형성됨이 관찰되었고, monoSAMiRNA(n=2)로 이루어진 나노입자의 CMC는 0.33㎍/㎖로 매우 낮게 형성됨이 관찰되었다. monoSAMiRNA(n=3)로 이루어진 나노입자의 CMC는 0.58 ㎍/㎖, monoSAMiRNA(n=4)로 이루어진 나노입자의 CMC는 0.44㎍/㎖ 로 관찰되었다(도면 15). 이로써 monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자가 매우 낮은 농도에서도 미셀을 잘 형성할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3-2. monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자의 제조
균질한 나노입자의 제조를 위해 상기 monoSAMiRNA(n=1)를 1.5 ㎖ DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 녹인 뒤, -75℃, 5mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조하였다. 상기 monoSAMiRNA(n=2), monoSAMiRNA(n=3), monoSAMiRNA(n=4)도 동일한 방법으로 제조되었다.
실시예 3-3 monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자의 크기 및 다분산지수(polydispersity index, 이하 'PDI'라 한다) 측정
제타-전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다. 구체적으로 실시예 3-2에서 제조된 균질화된 나노입자는 제타-전위 측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절률(Refractive index)은 1.459, 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 DPBS의 온도 25 ℃ 및 그에 따른 점도(viscosity)는 1.0200 및 굴절률은 1.335의 값을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 15 번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 6 회 반복하였다. 상기 monoSAMiRNA(n=1), monoSAMiRNA (n=2), monoSAMiRNA(n=3), monoSAMiRNA(n=4)도 동일한 방법으로 측정하였다.
monoSAMiRNA(n=1)로 구성된 나노입자의 경우 111 nm의 크기와 0.19의PDI를 가지는 것이 확인되었다. monoSAMiRNA(n=2)로 구성된 나노입자의 경우 약 86 nm의 크기와 0.25의 PDI 값을 가지고, monoSAMiRNA(n=3)로 구성된 나노입자의 경우 약 80 nm의 크기와 0.30의 PDI 값을 가지며, monoSAMiRNA(n=4)로 구성된 나노입자의 경우 약 83 nm의 크기와 0.26의 PDI 값을 가지는 것이 확인되었다 (도면 16). PDI값이 낮을수록 해당 입자가 고르게 분포하고 있음을 나타내는 수치로, 본 발명의 나노입자는 매우 균일한 크기로 형성됨을 알 수 있었다
실시예 3-4. monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자의 투과전자현미경 관찰
monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자가 형성된 형태를 확인하기 위해 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)을 통해 관찰하였다. 구체적으로 S-SAMiRNA를 DPBS에 최종 100 ㎍/㎖의 농도로 녹인 뒤, 초음파분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하였다. S-SAMiRNA로 이루어진 나노입자는 전자밀도가 높은 물질로 음성염색(negative staining)법을 통해 관찰되었다. TEM을 통해 관찰된 나노입자는 실시예 3-2에서 측정된 나노입자의 크기와 유사한 정도로 나노입자가 잘 형성되었음이 확인되었다.
실시예 4. monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자를 이용한 종양 세포주에서의 타겟 유전자의 발현 억제
상기 실시예 3-2에서 제조한 monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자를 이용하여, 형질주입(transfection)된 종양세포주의 서바이빈(survivin) 유전자의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 4-1. 종양세포주의 배양
미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 획득한 인간 자궁암 세포(HeLa)는 EMEM 배양배지(ATCC-formulated Eagle's Minimum Essential Medium, 미국)에 10 %(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖, 스트렙토마이신100㎍/㎖을 첨가하고, 37 ℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 4-2. monoSAMiRNA로 이루어진 나노입자를 이용한 종양세포주의 형질전환
상기 실시예 4-1에서 배양된 1×105 섬유모세포 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-웰 플레이트에서 18시간 동안 EMEM에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 동량의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다. Opti-MEM 배지 100㎕와 상기 실시예 3-2에서 제조한 SAMiRNA 및 monoSAMiRNA를 50 ㎍/㎖의 농도로 DPBS에 첨가하여, 실시예 3-1과 동일한 방법으로 -75℃, 5mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조하여 균일한 나노입자를 제조하였다. 그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입(transfection) 용 용액을 200 nM의 농도로 처리하고, 37 ℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 총 48 시간 동안 배양하였다.
실시예 4-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 4-2에서 형질주입(transfection)된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈(Survivin) mRNA 발현량을 대한민국 공개특허 공보 제2009-0042297호의 방법에 따라서 상대 정량하였다(도면 17). Sur584는 SAMiRNA의 구조 별로 타겟 유전자인 서바이빈에 특이적인 이중나선 올리고 RNA 서열(서열번호 1)을 가진 SAMiRNA를 의미하며, CONT은 타겟유전자의 발현에 영향을 끼치지 못하는 대조군 서열(서열번호 2)을 포함하는 SAMiRNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA 발현 저해 정도는 CON을 처리한 시료의 타겟유전자 발현량에 대한 Sur584를 처리한 시료의 타겟 유전자 발현량으로 상대적인 정량법(Comparative Quantitation)을 통해 계산되었다. 서바이빈 특이적 이중나선 올리고 RNA가 포함된 monoSAMiRNA(n=1 내지 4)들은 모두 목표 유전자의 발현저해 효과를 나타내었는데, 친수성물질 블록이 2개 이상인 monoSAMiRNA(n=2) 부터 목표 유전자의 높은 발현 저해 효과(약 75% 이상 발현저해)가 유지되는 것이 관찰되었다.
실시예 5. 아민기 및/또는 히스티딘 그룹이 친수성 물질에 도입된 이중나선 올리고 구조체의 제조
5.1 에틸렌 글리콜을 친수성 물질 단량체로 포함하는 SAMiRNA의 제조
본 발명에서의 에틸렌 글리콜, 특히 헥사 에틸렌 글리콜(hexa ethylene glycol)을 친수성 물질 단량체로 포함하고, 소수성 물질로 C24 테트라도코산(tetradocosane)을 포함하는 경우의 이중나선 올리고 구조체는 다음과 같은 구조체 (22)의 구조로 나타낼 수 있다.
구조식 22
상기 구조식 (22)에서의 C24는 소수성 물질인 테트라도코산을, n은 헥사 에틸렌 글리콜의 반복단위를 나타내며, 상기 구조식 (1) 또는 구조식 (2)에서의 n과 동일한 값을 가진다.
본 실시예에서는 n이 4인 하기 구조식 (23)과 같은 이중나선 올리고 RNA 구조체([hexa ethylene glycol]4-SAMiRNA)를 제조하였다.
구조식 23
상기 구조식 (23)를 좀더 구체적으로 나타내면 다음 구조식 (24)와 같다.
구조식 24
상기 구조식 (23) 및 (24)에서, S는 siRNA의 센스가닥; AS는 siRNA의 안티센스 가닥; Hexa ethylene glycol은 친수성 물질; C24는 소수성 물질로 이황화결합(disulfide bond)이 포함된 테트라도코산(tetradocosane); 5’ 및 3’은 이중나선 올리고 RNA 말단의 방향성을 의미한다.
상기 구조식 (23) 및 (24)에서의 siRNA의 센스가닥은 대한민국 공개특허 공보 제2012-0119212호의 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 3’ Uny-CPG를 지지체로 하여 β-시아노에틸포스포아미다이트형태의 Hexa Ethylene Glycol n개를 합성 후 앞서 언급한 방식대로 RNA β-시아노에틸포스포아미다이트를 이용하여 RNA 골격구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 통해 3’ 말단 부위에 헥사 에틸렌 글리콜(Hexa Ethylene Glycol)이 결합된 센스가닥의 올리고 RNA-친수성 물질 구조체를 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산을 5’ 말단에 결합하여 원하는 RNA-고분자 구조체의 센스가닥을 제조하였다. 상기 가닥과 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 반응을 통해 센스가닥과 상보적인 서열의 안티센스 가닥을 제조하였다.
합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28%(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥과 RNA 고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호잔기를 제거하였다. 보호잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2’TBDMS(tert-butuldimethylsilyl)를 제거하였다.
상기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 각각의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, Survivin 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링 되었음을 확인하였다.
5.2 아민기가 도입된 에틸렌 글리콜을 친수성 물질 단량체로 포함하는 SAMiRNA의 제조
친수성 물질에 아민기가 도입된 아래 구조식 (25)과 같은 이중나선 올리고 구조체를 제조하였다.
구조식 25
상기 구조식 (25)를 좀더 구체적으로 나타내면 다음 구조식 (26)과 같다.
구조식 26
상기 구조식 (25) 및 (26)에서, S는 siRNA의 센스가닥; AS는 siRNA의 안티센스 가닥; Hexa ethylene glycol은 친수성 물질; C6는 [Ethylene Glycol]4와 Amine을 연결하는 탄소 6개가 연결되어있는 링커이고, C24는 소수성 물질로 이황화결합(disulfide)이 포함된 테트라도코산(tetradocosane); 5’ 및 3’은 이중나선 올리고 RNA 내의 센스가닥 말단의 방향성을 의미한다.
또한, 상기 친수성 물질 블록은 siRNA 센스가닥의 3’ 말단의 포스페이트 그룹과 연결된 형태이다.
상기 구조식 (25) 및 (26)에서의 siRNA의 센스가닥은 3’ Succinimide유도체가 포함되어 있는 CPG를 지지체로 하여 β-시아노에틸포스포아미다이트형태의 Hexa Ethylene Glycol 4개를 합성 후 앞서 언급한 방식대로 RNA β-시아노에틸포스포아미다이트를 이용하여 RNA 골격구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 통해 3’ 말단 부위에 헥사 에틸렌 글리콜(Hexa Ethylene Glycol)이 결합된 센스가닥의 올리고 RNA-친수성 물질 구조체를 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산을 5’ 말단에 결합하여 원하는 RNA-고분자 구조체의 센스가닥을 제조하였다. 상기 가닥과 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 반응을 통해 센스가닥과 상보적인 서열의 안티센스 가닥을 제조하였다.
합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28%(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥과 RNA 고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호잔기를 제거하였다. 보호잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2’TBDMS(tert-butuldimethylsilyl)를 제거하였다.
상기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 각각의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, Survivin 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체(이하, 각각 SAMiRNA-Survivin라 함)를 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링 되었음을 확인하였다.
5.3 폴리히스티딘 그룹이 도입된 에틸렌 글리콜을 친수성 물질 단량체로 포함하는 SAMiRNA의 제조
친수성 물질에 펩타이드가 도입된 아래 구조식 (27)과 같은 이중나선 올리고 구조체를 제조하였다.
구조식 27
상기 구조식 (27)에서 H는 히스티딘(histidine)을, C는 시스테인(cystein)을 의미한다.
상기 구조식 (27)을 좀더 구체적으로 나타내면 다음 구조식 (28)과 같다.
구조식 28
상기 구조식 (27) 및 (28)에서, S는 siRNA의 센스가닥; AS는 siRNA의 안티센스 가닥; [Ethylene Glycol]4는 친수성 물질이며; linker는 peptide와 SAMiRNA를 연결해 주는 역할을 하며, Peptide는 HHHHHHC서열로 이루어진 Peptide; C24는 소수성 물질로 이황화결합(disulfide bond)이 포함된 테트라도코산(tetradocosane); 5’ 및 3’은 이중나선 올리고 RNA 말단의 방향성을 의미한다.
또한, 상기 친수성 물질 블록은 siRNA 센스가닥의 3’ 말단의 포스페이트 그룹과 연결된 형태이다.
상기 구조식 (27) 및 (28)에서의 siRNA의 센스가닥은 실시예 5-2의 구조식 (25) 및 (26)의 올리고에 아민류와 결합하는 작용기(예: NHSester)와 펩타이드의 싸이올(-SH)과 결합하는 작용기(예: Maleimide)를 갖는 링커로 연결시켜 제조하였다. 구체적으로, 구조식 (25) 및 (26)의 구조를 갖는 올리고에 상기 링커를 결합 시킨 후, HPLC나 레진으로 정제한다. 정제된 올리고에 펩타이드를 결합한 후, HPLC로 정제하여 siRNA의 센스가닥을 제조하였다. 상기 가닥과 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 반응을 통해 센스가닥과 상보적인 서열의 안티센스 가닥을 제조하였다. 상기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 각각의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, Survivin 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체(이하, 각각 SAMiRNA-Survivin라 함)를 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링 되었음을 확인하였다.
실시예 6. 이중나선 올리고 고분자 구조체(Hexa ethylene glycol-SAMiRNA)로 이루어진 나노입자에 의한 인간 자궁경부암세포(HeLa) 세포주에서 타겟 유전자의 발현 저해.
Survivin 발현양을 줄일 수 있는 siRNA 서열을 포함하는 Hexa ethylene glycol-SAMiRNA로 이루어진 나노입자를 이용하여 자궁경부암세포(HeLa)를 형질전환 시키고 이렇게 형질전환한 자궁경부암세포(HeLa) 세포주에서 목표 유전자의 발현 양상을 RNA 수준에서 분석하였다.
실시예 6-1. 인간 자궁경부암세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 자궁경부암세포(HeLa) 세포주는 실시예 5-1과 동일한 조건에서 배양하였다.
실시예 6-2. 인간 자궁경부암세포 세포주로의 아민기가 도입된 Hexa ethylene glycol-SAMiRNA의 형질주입(transfection)
상기 실시예 6-1에서 배양된 0.8×105 자궁경부암세포(HeLa) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-well 플레이트에서 18시간 동안 EMEM에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 well당 동량의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다. 나노입자의 제조는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 -75℃, 5mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조하여 균일하게 제조하였다. 상기 실시예 3-2에서 제조한 Hexa ethylene glycol-SAMiRNA를 50 ㎍/㎖의 농도로 DPBS에 첨가하여 녹인 후 Opti-MEM배지 1ml 안에 50, 100, 200 nM 에 맞게 처리한다. Hexa ethylene glycol-SAMiRNA가 포함된 Opti-MEM을 분주 후 종양세포주의 각 well에 농도에 맞게 처리하고, 37 ℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 총 24 시간과 48 시간 동안 배양하였다.
실시예 6-3. 타겟 유전자의 mRNA의 상대적 정량분석
상기 실시예 6-2에서 형질주입된 세포주로부터 상기 실시예 4-3과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다. 아민기가 도입된 Hexa ethylene glycol-SAMiRNA의 처리에 따른 타겟 유전자 발현 저해량 관찰을 통해 대조군인 Hexa ethylene glycol-SAMiRNA에 대해 아민기가 도입된 Hexa ethylene glycol-SAMiRNA의 효능을 명확하게 확인하였다 (도18).
Claims (31)
- 하기 구조식 (1) 또는 구조식 (2)의 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드 구조체.
구조식 1
구조식 2
상기 구조식 (1) 및 구조식 (2)에서 A는 친수성 물질 단량체(monomer), B는 소수성 물질, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 올리고뉴클레오타이드를 서로 연결하는 링커, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커(linker)가 매개된 공유결합이고, R는 단일가닥 또는 이중나선 올리고뉴클레오타이드, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수이고,
Q는 (Li-Zj) 또는 P-J1-J2이고,
L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand),
Z는 단순 공유결합 또는 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체와 리간드의 결합을 매개하는 링커,
i는 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 0 내지 3의 정수, j는 0 또는 1을 의미하며, 단 i가 0일 경우 j도 반드시 0이며,
P는 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹을 의미하며,
J1과 J2는 독립적으로 단순 공유결합, 또는 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹과 친수성 물질간의 결합을 매개하는 링커이다. - 제 1항에 있어서
R은 이중가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 센스가닥 및 안티센스 가닥이 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 2항에 있어서
상기 이중나선 올리고뉴클레오타드 안티센스 가닥의 5´ 말단에 인산기가 결합된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 3항에 있어서,
상기 안티센스 가닥의 5´ 말단에 결합된 인산기는 한 개 내지 세 개인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 1항에 있어서,
상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 5항에 있어서,
상기 소수성 물질은 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid) 및, 리포폴리아민(lipopolyamine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 6항에 있어서,
상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 6항에 있어서
상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 1항에 있어서,
상기 링커(J)는 PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 1항에 있어서,
상기 X, Y 및 Z로 표시되는 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 11항에 있어서,
상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 올리고 뉴클레오타이드 구조체. - 제 11항에 있어서,
상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제1항에 있어서,
Q는 (Li-Zj)이고, Z는 친수성 블록 내의 친수성 물질 단량체와 리간드의 결합을 매개하는 링커이며, 상기 링커 Z는 헥사에틸렌글리콜(hexaethylene glycol)을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제1항에 있어서,
Q는 (Li-Zj)이고, 상기 리간드(L)는 탄수화물(carbohydrate), 펩타이드, 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제 17항에 있어서,
상기 탄수화물은 헥소아민(hexoamine), 단당류(monosaccharide), 이당류(disaccharide) 및 다당류(polysaccharide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제1항에 있어서,
P는 P-J1-J2이고, P는 1차 내지 3차 아민에서 선택된 어느 하나 또는 5 내지 8개의 히스티딘을 포함하는 폴리히스티딘 그룹임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 제19항에 있어서,
J1 및 J2는 독립적으로 단순 공유결합, C2-12의 알킬, 알케닐, 알키닐, PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체. - 하기 구조식 (20)의 구조를 갖는 고형지지체(solid support)
구조식 20
상기 구조식 (20)에서
L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)이고, T는 하기 화합물 (1)이 1 내지 15개 반복된 화합물을 의미하며(화합물 (1)에서, G는 CH2, O, S 및 NH로 이루어진 군에서 선택된다),
화합물 (1)
C와 D 중 하나는 고형지지체(solid support)이고, 또 다른 하나는 디메톡시트리틸(Dimethoxytrityl) 이고; i는 0 내지 3의 정수, E와 F는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다. - 제21항에 따른 고형지지체를 이용하여 제1항에 따른 단일가닥 또는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제조하는 방법.
- 제22항에 있어서,
(1) 구조식 (20)의 고형지지체에 친수성 물질 단량체를 결합하는 단계를 n회 반복하는 단계;
(2) 상기 친수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 올리고뉴클레오타이드 단일 가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 친수성 물질이 결합된 올리고뉴클레오타이드 5’ 말단에 소수성 물질을 공유결합시키는 단계;
(4) 고형지지체로부터 올리고뉴클레오타이드 구조체를 분리하는 단계;
를 포함하는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 구조체의 제조방법. - 제22항에 있어서,
(1) 구조식 (20)의 고형지지체에 친수성 물질 단량체를 결합하는 단계를 n회 반복하는 단계;
(2) 상기 친수성물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일 가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 친수성 물질이 결합된 RNA 5’ 말단에 소수성 물질을 공유결합시키는 단계;
(4) 고형지지체로부터 RNA-고분자 구조체 및 상보적 서열의 RNA 단일 가닥을 분리하는 단계;
(5) 상기 RNA-고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중가닥을 형성하는 단계;
를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 구조체의 제조방법. - 제23항에 있어,
단계 (2)의 RNA 단일가닥과 상보적 서열을 가지는 RNA 단일가닥은 5´ 말단에 인산기가 결합된 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 나노입자.
- 제26항에 있어서, 상기 나노입자는 동결건조된 형태인 것을 특징으로 하는 나노입자.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제26항 또는 제27항에 따른 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체를 이용한 생체 내 또는 생체 외에서의 유전자 발현 조절 방법.
- 제26항 또는 제27항에 따른 나노입자를 이용한 생체 내 또는 생체 외에서의 유전자 발현 조절방법.
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20210078794A (ko) * | 2019-12-19 | 2021-06-29 | 상지대학교산학협력단 | 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 |
WO2022191567A1 (ko) * | 2021-03-08 | 2022-09-15 | (주)바이오니아 | Covid-19를 포함하는 호흡기 바이러스 감염증, 바이러스 감염에 의한 폐섬유증, 또는 호흡기 질환 예방 또는 치료를 위한 초음파 방식 연무식 흡입기를 이용한 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 투여용 조성물 |
Families Citing this family (8)
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CN113454223A (zh) * | 2019-01-15 | 2021-09-28 | 柏业公司 | 靶向dkk1基因的双链寡核苷酸、包含其的构建体以及含有其的脱发预防或毛发生长组合物 |
EP3896160A1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-10-20 | Bia Separations D.O.O. | A method of single-stranded rna purification |
EP4225326A1 (en) * | 2020-10-12 | 2023-08-16 | The Regents of the University of California | Endosomal escape domains for delivery of macromolecules into cells |
AU2022226837A1 (en) | 2021-02-25 | 2023-07-20 | Bioneer Corporation | Composition for alleviating hair graying, promoting hair growth and/or preventing or alleviating hair loss, comprising double-stranded mirna as active ingredient |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6005087A (en) | 1995-06-06 | 1999-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
US5660985A (en) | 1990-06-11 | 1997-08-26 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides |
US5386023A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-31 | Isis Pharmaceuticals | Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling |
ATE209887T1 (de) | 1993-04-02 | 2001-12-15 | Anticancer Inc | Verfahren zur verabreichung von förderlichen zusammensetzungen auf die haarfollikel |
US6277967B1 (en) | 1998-07-14 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages |
US6175001B1 (en) | 1998-10-16 | 2001-01-16 | The Scripps Research Institute | Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same |
US20030224353A1 (en) | 2001-10-16 | 2003-12-04 | Stein David A. | Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection |
CA2576925C (en) | 2004-08-16 | 2013-12-10 | The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. | Method of delivering rna interference and uses thereof |
AU2005292083A1 (en) | 2004-09-29 | 2006-04-13 | Alza Corporation | Microparticles and nanoparticles containing a lipopolymer |
TWI386225B (zh) | 2004-12-23 | 2013-02-21 | Alcon Inc | 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子(CTGF)RNA干擾(RNAi)抑制技術 |
WO2007021142A1 (en) | 2005-08-17 | 2007-02-22 | Bioneer Corporation | Sirna-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of sirna and method thereof |
WO2007044468A2 (en) | 2005-10-05 | 2007-04-19 | The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. | Method to treat flavivirus infection with sirna |
US20070231392A1 (en) | 2006-01-23 | 2007-10-04 | Ernst Wagner | CHEMICALLY MODIFIED POLYCATION POLYMER FOR siRNA DELIVERY |
JP2010501188A (ja) | 2006-08-24 | 2010-01-21 | アルコン リサーチ, リミテッド | IOPに関連した病態の処置のためのグレムリンのRNAi媒介阻害 |
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JP2010515771A (ja) | 2007-01-16 | 2010-05-13 | プロテオロジクス リミテッド | トポイソメラーゼインヒビターの治療効果を増強する方法 |
EP2205740A2 (en) | 2007-10-02 | 2010-07-14 | Rxi Pharmaceuticals Corp. | Tripartite rnai constructs |
EP4321177A3 (en) * | 2007-12-04 | 2024-05-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides |
US9173840B2 (en) | 2008-10-09 | 2015-11-03 | Northeastern University | Multifunctional self-assembling polymeric nanosystems |
ES2931174T3 (es) | 2009-03-20 | 2022-12-27 | Egen Inc | Derivados de poliamina |
KR101224828B1 (ko) | 2009-05-14 | 2013-01-22 | (주)바이오니아 | siRNA 접합체 및 그 제조방법 |
US8569256B2 (en) | 2009-07-01 | 2013-10-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents |
WO2011054939A2 (en) | 2009-11-09 | 2011-05-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for inhibiting expression of kif10 genes |
US20110206617A1 (en) | 2010-02-22 | 2011-08-25 | Krishnendu Roy | Modified polysaccharides for drug and contrast agent delivery |
RU2466188C2 (ru) * | 2010-11-08 | 2012-11-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки | Ингибитор репродукции вируса гриппа а на основе комплекса наночастиц диоксида титана и олигонуклеотида |
WO2013012835A2 (en) | 2011-07-18 | 2013-01-24 | Oregon Health & Science University | Sirna useful in the treatment of flavivirus infection |
KR20210083380A (ko) | 2011-07-29 | 2021-07-06 | 카리오팜 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | 하이드라지드 함유 핵 수송 조절인자 및 이의 용도 |
WO2013033230A1 (en) * | 2011-08-29 | 2013-03-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomer-conjugate complexes and their use |
ES2897565T3 (es) | 2011-10-18 | 2022-03-01 | Dicerna Pharmaceuticals Inc | Lípidos catiónicos de amina y uso de los mismos |
EP3733848A1 (en) * | 2011-12-15 | 2020-11-04 | Bioneer Corporation | Antisense oligonucleotide conjugates and use thereof |
KR20130068032A (ko) * | 2011-12-15 | 2013-06-25 | (주)바이오니아 | 안정한 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 및 그 제조방법 |
EP2801615A4 (en) | 2012-01-05 | 2015-08-19 | Bioneer Corp | HIGHLY EFFICIENT NANOPARTICULAR DOUBLE HELIX OLIGO RNA STRUCTURE AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
KR101392973B1 (ko) | 2012-10-15 | 2014-05-09 | (주)바이오니아 | siRNA 접합체 및 그 제조방법 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20210078794A (ko) * | 2019-12-19 | 2021-06-29 | 상지대학교산학협력단 | 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 |
WO2022191567A1 (ko) * | 2021-03-08 | 2022-09-15 | (주)바이오니아 | Covid-19를 포함하는 호흡기 바이러스 감염증, 바이러스 감염에 의한 폐섬유증, 또는 호흡기 질환 예방 또는 치료를 위한 초음파 방식 연무식 흡입기를 이용한 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 투여용 조성물 |
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