KR20130068032A - 안정한 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 및 그 제조방법 - Google Patents

안정한 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide, ASO)의 생체 내 안정성 향상을 위해 이들 ASO의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 공유결합으로 연결시킨 하이브리드 접합체 및 상기 하이브리드 접합체의 제조 방법과 상기 접합체로 이루어진 나노입자에 관한 것이다. 본 발명의 ASO와 고분자 간의 접합체는 ASO의 생체 내 안정성을 향상시킴으로써 세포 내로 치료용 ASO를 효율적으로 전달할 수 있으며, 또한 비교적 낮은 농도의 투여량으로 ASO의 활성을 나타낼 수 있다.

Description

안정한 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 및 그 제조방법{'Stable antisense oligonucleotide conjugate and its manufacturing method'}
본 발명은 암 및 감염성 질병 등 다양한 질병의 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide, 이하'ASO'라 한다)의 전달 효율성을 향상시키기 위해 ASO의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유 결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합시킨 ASO접합체, 상기 접합체의 제조방법 및 상기 접합체로 구성된 나노입자형 ASO 전달 기술에 관한 것이다.
ASO기술은 단일가닥의 RNA 또는 DNA가닥을 통해 mRNA의 중간 대사(metabolism)을 변경함으로써 유전자로부터 단백질로의 정보전달을 조절하는 기술이다. 즉, 충분히 상보적, 특이적으로 혼성화하는 염기서열을 선택하여 목표 단백질의 바람직한 발현억제가 이루어지도록 하는 것이다. ASO의 결합은 목표 유전자에 서열특이적으로 결합하므로 목표유전자 이외의 다른 유전자발현에 영향을 주지 않는다. 따라서 ASO기술은 특정 단백질의 생체 내 역할의 분석에서 유용한 도구일 뿐만 아니라, 특정 질병에 대한 유전자치료법으로 활용 가능성을 가진다(FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995).
안티센스 DNA는 목표 mRNA와 결합하여 RNA/DNA 이중나선을 형성하며, 이 RNA/DNA 이중나선구조는 생체 내에 존재하는 RNase H(RNase H; 리보핵산분해효소의 한 종류로서 RNA/DNA 혼성 이중나선이 형성되어있는 mRNA를 특이적으로 분해하는 효소)의 공격을 받아 분해가 유발된다. 안티센스 RNA는 RNA/RNA 이중나선을 형성하며, RNase L의 공격을 받아 목표 mRNA의 분해가 유발된다. RNase L은 이중나선 RNA 가닥 주변의 단일가닥 RNA를 우선적으로 분해하는 리보핵산분해효소이다 (Pharmacol. Toxicol.32, 329-376,1992).
하지만 ASO가 목표 세포로 효과적으로 전달되어야 목적하는 효과를 거둘 수 있고, 혈액 내에 존재하는 핵산 분해효소에 의해 ASO 가 분해 될 수 있기 때문에 ASO를 치료 목적으로 이용하기 위해서는 ASO접합체가 세포막을 효율적으로 투과하여 전달되어야 하며, 체내에서 ASO안정성이 확보되어야만 한다. (Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22(3): 142-151, 2007).
따라서 대부분의 ASO는 생체 내 안정성을 향상시키기 위해 핵산분해효소 저항성을 갖는 다양한 변형(modification)이 이루어진 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN; oligodeoxynucleotide)형태를 가지는데, 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´탄소 위치에서 -OH 기가 - CH3(메틸), -OCH3, -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드 간 결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형 등에서 하나 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용 가능하다(Crooke 등, Ann. Rev. Med. Vol.55: pp61-65 2004, US 5,660,985, US 5,958,691, US 6,531,584, US 5,808,023, US 6,326,358, US 6,175,001 Braasch D. A. 등 Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y. L. 등., RNA, 9:1034-1048, 2003; Amarzguioui M. 등, Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003 등 참조).
ASO를 목표 세포 내로 전달 하기 위해서 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 등 바이러스를 이용한 유전자 전달기술과 리포좀, 양이온 성 지질 또는 양이온 성 고분자를 이용한 비 바이러스성 전달체(non-viral carrier)를 이용한 유전자 전달 기술들이 개발되어 왔다. 그러나 바이러스성 전달체는 숙주의 염색체에 이입되어 숙주유전자의 정상기능의 이상을 유발하거나 발암 유전자를 활성화시키지 않는다는 확신을 할 수 없어 안전성에 문제점이 있으며, 바이러스 유전자가 적은 양이라도 계속 발현이 되어 자가 면역증을 유발하거나, 바이러스 전달체로부터 변형된 형태의 바이러스성 감염이 유발되는 경우 효율적인 ASO 전달을 못할 수 있다.
따라서 이와 같은 문제점들을 개선하기 위해 비 바이러스성 전달체인 리포좀에 유전자를 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법 등이 그들이 가진 단점을 개선하는 방향으로 연구가 진행되고 있다. 이들 비 바이러스성 전달체는 바이러스성 전달체에 비하여 효율성이 떨어지지만, 생체 내 안전성과 경제성을 고려해 볼 때 부작용이 적고 생산가격이 저렴해 질 수 있다는 장점이 있다(Lehrman S. Nature. 401(6753):517-518, 1999).
비 바이러스성 전달체를 이용한ASO를 포함한 ODN분자의 안정적(stable) 전달을 효과적으로 이루기 위해서 효소 또는 비 효소적인 분해를 막는 효과적 방법이 요구되는데, ASO를 화학적으로 변형시키는 방법을 통해 핵산분해효소에 대한 불안정성 및 세포 내 낮은 흡수율을 개선하는 방법이 제안되고 있다 (Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida. Drug Metab.Parmacokinet. 22(3): 142-151, 2007).
한편, PEG(polyethylene glycol)을 접합시킨 고분자들은 서로 간의 상호작용으로 인해 자발적으로 형성된 미셀 구조를 지닌 복합체를 형성하는데, 이를 고분자 복합체 미셀이라고 한다(Kataoka K. et al. Macromolecules, 29:8556-8557, 1996). 이들 고분자 복합체 미셀들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템, 즉, 미소구체(microsphere), 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.
최근ASO의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, ASO에 생체 적합성 고분자인 PEG 등의 친수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합시킨 접합체를 통해, ASO의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 공보0466254호). 하지만 화학적 변형 및 PEG(polyethylene glycol)의 접합(PEGylation)만으로는 ASO의 생체 내 안정성을 개선하고, 목표 조직으로의 전달이 원활히 이루어지지 않는 단점을 여전히 가진다.
한편, siRNA의 전달을 위한siRNA에 소수성 및 친수성 물질을 부여하여 세포전달을 개선시킨 나노입자에 대한 기술인 자가조립(self-assembly) 나노입자 형성 기술(대한민국 공개특허 공보2009-0042297호)이 개발되었으나, 상기 기술이 ASO의 전달에 적용된 사례는 보고된 바 없다. 따라서 ASO에 여러 가지 화학적 변형의 도입 및 고분자물질의 접합을 통해 이들을 분해효소로부터 보호하여 안정성을 향상시키고자 하는 시도를 통해 ASO의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성 향상을 담보할 수 있는 ASO의 전달체 및 그 제조 기술 개발이 필연적으로 요구된다.
대한민국 등록특허공보 0466254호: 세포내 전달을 위한 올리고 뉴클레오티드와 친수성 고분자로 구성되는 유전자 전달용 접합체, 고분자 전해질 복합 미셀 및 그의 제조방법 등록일자:2005년 01월 04일, 출원인: 한국과학기술원 대한민국 공개특허공보 2009-0042297호: siRNA 접합체 및 그 제조방법. 공개일자 2010년 11월24일, 출원인 : 바이오니아
본 발명의 목적은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 개발된 것으로 ASO의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, ASO의 양 말단에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유 결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 통해 접합시킨 ASO-고분자 접합체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자를 이용한 ASO 전달기술 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명은 하기구조의 ASO-고분자 접합체를 제공한다.
A-X-R-Y-B 식(1)
상기 식(1)에서 A와B 중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 소수성 물질이고, X와 Y는 서로 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 ASO를 나타낸다.
상기 식(1)에서 친수성 물질은 목표 특이적인 리간드가 부착된 형태를 가질 수 있다. 상기 타겟 특이적 리간드는 목표 특이적으로 세포내재화(internalization)를 증진시키는 RME(receptor-mediated endocytosis) 특성을 가진 타겟 특이적 항체나 앱타머(aptamer), 수용체 특이적 리간드 등에서 선택되는 펩타이드; 또는 엽산, N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl galactosamine, NAG), 만노스(mannose)를 비롯한 화학물질 등에서 선택될 수 있다. 이 때 타겟팅 모이어티(moiety)는 타겟 특이적으로 전달을 수행하도록 하는 물질로 상기 항체, 앱타머, 펩타이드 및 화학물질에만 한정되는 것만은 아니다.
본 발명의 접합체에 있어서, 상기 ASO는10 내지 50 개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 13 내지 25개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 생체 내 안정성을 향상시키기 위해 핵산분해효소 저항성을 갖는 다양한 변형(modification)이 이루어진 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN; oligodeoxynucleotide)형태를 포함한다. 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2탄소 위치에서 -OH 기가 - CH3(메틸), -OCH3, -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드 간 결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형 등에서 하나 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용 가능하다.
본 발명에서 사용 가능한 ASO는 치료용 또는 연구용으로 사용되고 있는 것으로 특별히 한정되지 않고, 유전자 치료용 또는 연구를 위해 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자에 대한ASO도 채택될 수 있다.
또한, 본 발명에서의 ASO는 목적하는 mRNA와 완벽하게 상보적 결합(perfect match) 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 일부 서열에서 상보적 결합을 이루지 않더라도 목적하는 mRNA와 결합하여 그러한 mRNA의 번역(translation)을 저해할 수 있는 불완전한 상보적 결합(mismatch) 관계에 있는 것도 사용 가능함은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
상기 친수성 물질은 분자량 200 내지 10,000 인 친수성 물질이 바람직하고, 분자량이1,000 내지 2,000인 고분자 화합물 더욱 바람직하다. 또한 상기 친수성 물질은 양이온성 또는 비이온성 고분자 화합물인 것이 바람직하다.
예를 들어, 친수성 고분자 화합물은 폴리에틸린글리콜(PEG, polyethylene), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 및 폴리옥사졸린(polyoxazoline) 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 친수성 물질은 필요에 따라 다른 물질의 접합을 위해 필요한 기능기를 갖도록 변경되어도 무방하다. 상기 친수성 물질 중에서도 특히, PEG는 다양한 분자량과 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 유도하지 않는 등의 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수하며, 생체 내에서 ASO의 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가 시키므로 본 발명의 접합체의 제조에 매우 적합하다.
또한, 상기 소수성 물질은 분자량 250 내지 1,000인 소수성 물질인 것이 바람직한데, 그 중에서도 바람직한 소수성 물질로는 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
특히, 상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐아민으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산임을 특징으로 한다.
상기 소수성 물질은 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 일으켜 나노입자를 형성하게 하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질 중에서도 특히, 탄소 사슬이나 콜레스테롤의 경우, ASO의 제조 단계에서 용이하게 접합시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 본 발명의 접합체 제조에 매우 적합하다.
또한, 상기 식(1)에서 X 또는Y로 표시되는 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 (amide bond)또는 인산화 결합(phosphate bond)이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
ASO-고분자 접합체는 친수성 물질이 ASO의 5´ 말단 또는 3 말단에 결합할 수 있으며, 그 반대 말단에 소수성 물질이 결합되는 형태를 가진다.
ASO의 3 말단에 친수성 물질이 결합된 형태의 ASO-고분자 접합체를 제조하는 방법은
(a) 고형지지체에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(b) 상기 친수성 물질을 포함하는 고형지지체 기반으로 ASO를 합성하는 단계;
(c) 상기 고형지지체 상의 ASO의 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(d) 상기 친수성 물질과 소수성 물질이 결합한ASO-고분자 접합체를 고형지지체로부터 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 ASO-고분자 접합체의 제조방법이다.
보다 바람직한 구체적인 예는 3´말단 부위에 친수성 물질이 결합된 고형지지체(solid support; 고형지지체(solid support)는 Controlled Pore Glass(CPG)를 사용)를 기반으로 합성하는 단계; 친수성 물질이 공유결합된 고형지지체(CPG) 기반으로 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 ASO를 합성하는 단계; 상기 ASO의 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계로 원하는 ASO-고분자 접합체를 제조하는 방법이 있으며, ASO-고분자 접합체의 제조가 완료되면 60 ℃ 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 고형지지체(CPG)로부터 ASO-고분자 접합체를 분리하고, 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리, 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는ASO-고분자 접합체가 제조되었는지를 확인할 수 있다.
또 다른 양태로 ASO의 5´말단에 친수성 물질이 결합된 형태의 ASO-고분자 접합체를 제조하는 방법은
(a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체를 기반으로 ASO를 합성하는 단계;
(b) 상기 ASO 5´말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(c) 상기 친수성 물질이 결합한 ASO 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;
(d) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO 3´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;를 포함하는 ASO-고분자 접합체의 제조방법이다.
보다 바람직한 구체적인 예는 기능기가 부착되어있는 CPG를 기반으로 ASO를 합성하는 단계; 상기 ASO의 5´말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; 합성이 완료되면 60 ℃ 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 고형지지체(CPG)로부터 기능기가 부착된 ASO-친수성 고분자 접합체를 분리하는 단계; 및 상기 기능기를 통해 소수성 물질을 부착하여 양 말단에 친수성 고분자 및 소수성 물질이 부착된 ASO-고분자 접합체를 합성하는 단계; 를 포함하여 이루어지며, 제조가 완료되면 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는ASO-고분자 접합체 가 제조되었는지를 확인할 수 있다.
한편, 본 발명의 ASO-고분자 접합체는 리간드가 추가적으로 결합된 형태를 가질 수 있는데, 이때 리간드는 친수성 물질에 결합되어 있는 형태를 가진다.
친수성 물질에 리간드가 결합되는 형태는 리간드에 부착된 기능기에 따라서 결정되는데, 예를 들면, 포스포아미디트(phosphoramidite) 형태로 제조된 리간드- 포스포아미디트(phosphoramidite) 는 ASO의 합성과정과 동일한 방법으로 친수성 물질에 결합될 수 있고, 엔-하이드록시 숙시니미드(N-Hydroxy succinimide, NHS)-리간드 형태의 리간드는 친수성 물질에 엔-하이드록시숙시니미드(N-Hydroxysuccinimide(NHS)) 에스터(ester) 결합으로 결합될 수 있다.
ASO의 3 말단에 친수성 물질이 부착된 형태의 ASO-고분자 접합체에 리간드가 부착된 형태의 리간드 결합 ASO-고분자 접합체를 제조하는 방법은
(a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체에 친수성 물질을 결합 시키는 단계;
(b) 상기 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체에 ASO를 합성하는 단계;
(c) 상기 ASO 5말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(d) 상기 친수성 물질과 소수성 물질이 결합한 ASO-고분자 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;
(d) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO-고분자 접합체의 친수성 물질 말단에 리간드를 결합시키는 단계;를 포함하는 리간드 결합 ASO-고분자 복합체 제조 방법이다.
보다 바람직한 구체적인 예는 기능기가 부착되어있는 고형지지체(CPG)에 친수성 물질을 결합시키는 단계; 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체(CPG)에 ASO를 합성하는 단계; 상기 ASO의 말단기에 소수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 기능기-ASO-고분자 접합체를 분리하는 단계; 및 상기 기능기를 통해 리간드를 친수성 고분자 말단에 부착하여 리간드 결합 ASO-고분자 복합체를 제조하는 단계;를 포함하여 이루어지며, 제조가 완료되면 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드 결합ASO-고분자 접합체가 제조되었는지를 확인할 수 있다.
또 다른 양태로, ASO의 5말단에 친수성 물질이 부착된 형태의 ASO-고분자 접합체에 리간드가 부착된 형태의 리간드 결합 ASO-접합체를 제조하는 방법은
(a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체를 기반으로 ASO를 합성하는 단계;
(b) 상기 ASO 말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(c) 상기 친수성 물질이 결합한 ASO 접합체에 리간드를 공유결합 시키는 단계;
(d) 상기 기능기가 부착된 ASO-친수성 고분자-리간드 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;
(e) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO 3´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;를
포함하는 리간드 결합 ASO-고분자 접합체의 제조방법이다.
보다 바람직한 구체적인 예는 기능기가 부착되어있는 고형지지체(CPG)를 기반으로 ASO를 합성하는 단계; 상기 ASO의 말단기에 친수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; 상기 ASO-친수성 물질에 리간드를 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 기능기가 부착된 ASO-친수성 고분자-리간드 접합체를 분리하는 단계; 및 상기 기능기를 통해 소수성 물질을 부착하여 친수성 고분자의 반대편 말단에 소수성 물질이 부착된 리간드 결합 ASO-고분자 접합체를 합성하는 단계; 를 포함하여 이루어지며, 제조가 완료되면 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드 결합 ASO-고분자 접합체가 제조되었는지를 확인할 수 있다.
상기와 같이 본 발명에서 합성된 ASO-고분자 접합체는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성이며, 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 소수성 물질들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 나노입자(nanoparticle)를 형성하게 된다. 즉, 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, ASO의 바깥쪽에 친수성 물질이 위치하여 ASO를 보호하는 형태의 나노입자를 형성한다(도1 참조). 이렇게 형성된 나노입자는 ASO의 세포 내 전달을 향상시키며, 이를 질병의 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다. 보다 구체적인 접합체의 제조와 접합체로 구성된 나노입자의 특징, 세포전달 효율 및 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
또한, 본 발명은 상기 ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자를 준비하는 단계와 상기 나노입자를 통해 생체 외(in vitro)상에서 ASO를 전달하는 단계를 포함하는 유전자 치료방법을 제공한다. 상기 유전자 치료방법은 생체 외(in vitro)상에 적용하는 것에만 한정된 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 ASO-고분자 접합체 또는 ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체 1종 이상을 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 적절한 방법으로 또는 레밍톤의 약학 과학(Remington´s pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술 분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며, 단위-투여량 또는 다-투여량용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술 분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명은 암 및 감염성 질병 등의 다양한 질병의 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있는 ASO의 전달 효율성을 향상 시키기 위해 ASO와 고분자 화합물을 단순 공유 결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합시킨 ASO 접합체, 상기 접합체의 제조방법 및 상기 ASO 접합체의 세포 내 전달 기술을 제공한다.
본 발명의 ASO- 고분자 접합체 및 ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자는 ASO의 생체 내 안정성을 향상시킴으로써 세포 내로 치료용 ASO를 효율적으로 전달할 수 있으며, 형질주입 물질 없이도 말단이 변형되지 않은 ASO에 대비하여 비교적 낮은 농도의 투여량에서 ASO의 활성을 나타낼 수 있으므로, 암 및 감염성 질병 등의 다양한 질병을 위한 ASO 치료용 도구뿐만 아니라, 새로운 형태의 ASO 전달 시스템으로 생명공학을 위한 기초연구와 의학 산업에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 ASO-고분자 접합체를 포함하는 나노입자의 모식도.
도 2는 본 발명에 따른 ASO 및 ASO-고분자 접합체의 MALDI-TOF MS를 이용한 질량분석 결과 스펙트럼이며, 5과 3 양 말단에 4개의 뉴클레오사이드가 2-OCH3(Methoxy)로 변형된 뉴클레오티드(nucleotide) 서열이고, 'm'은 OCH3 (methoxy) group 을 의미한다.
(A) ASO의 MALDI-TOF data (M.W. 5967.9 Da), (B) ASO-고분자 접합체의 MALDI-TOF data (M.W. 8448 Da).
도 3은 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자의 물성 분석 결과.
(A) ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자의 크기 및 다분산지수(polydispersity index, PDI) 값의 그래프,
(B) ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자의 임계 미셀 농도 그래프.
도 4는 본 발명에 따른 ASO 및 ASO-고분자접합체의 종양세포 내 목표 유전자 발현 저해효과 확인을 위한 각 처리농도(10, 50, 100 nM)에 따른 mRNA 발현량 분석 결과(scramble, 대조군 서열인 서열번호 2번의 ASO; Survivin, 서바이빈 서열인 서열번호 1번의 ASO; ASO, 아무것도 접합되지 않은 ASO; ASO-고분자 접합체, 3PEG-ASO-5lipid 형태의 ASO 고분자 접합체)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. ASO-고분자 접합체의 제조
본 발명의 실시예에서는 서바이빈(survivin)을 억제하기 위해 서바이빈(survivin) ASO를 사용하였다(Biol. Proced. Online 2004; 6(1): 250-256). 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(Abbrosini G. et al. Nat. Med. 3(8):917-921, 1997).
이하, 실시예에서는 사용된 ASO는 서열번호 1번으로 기재되는 서바이빈 특이적인 서열과 서열번호 2번으로 기재되는 대조군 서열로 구성되어 있다.
(서열번호 1) survivin ASO (ISIS 23722), 5-TGTGCTATTCTGTGAATT-3
(서열번호 2) scrambled control (ISIS 28598), 5-TAAGCTGTTCTATGTGTT-3
상기 ASO서열은 β-시아노에틸포스포아미디트 (β-cyanoethylphosphoramidite)를 이용하여 DNA골격 구조를 이루는 포스포디에스터(phosphodiester) 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 상기 ASO를 합성하였다(Shina et al. Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984).
ASO의 합성 과정은 뉴클레오사이드(nucleoside)가 부착된 고형지지체(CPG)를 기반으로 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 사이클(cycle)을 반복함으로써 원하는 서열의 DNA를 얻게 된다.
구체적으로, 첫 단계인 차단제거(deblocking)는 뉴클레오티드가 부착된 CPG에 3 % 트라이클로로아세트산(trichloroacteic acid, TCA)를 처리하여 DMT(4,4´-dimethoxytrityl)를 제거하는 단계; 다음 단계인 결합(coupling)은 이전 단계에서 CPG에 형성된 5´-수산(hydroxyl)기와 원하는 서열의 뉴클레오사이드 포스포아미디트 단량체(nucleoside phosphoramidite monomer)와 결합반응을 통해 뉴클레오티드 사슬이 연결되는 단계; 세 번째 단계인 캐핑(capping)은 결합단계에서 반응되지 않은 5´-수산기를 차단(blocking)하여 다음 사이클에서 결합 과정에서 원하지 않는 염기 배열을 갖는 뉴클레오티드 사슬을 배제하는 단계로, 무수초산(acetic anhydride)와 엔-메틸이미다졸(N-methylimidazole)을 처리하여 아세틸화(acetylation)되는 단계; 마지막 단계인 산화(oxidation)는 결합단계에서 형성된 5´-수산기와 포스포아미디트 간의 결합이 아인산트리에스터(phosphitetriester) 결합을 이루는데 이를 포스포디에스터(phosphodiester)결합으로 변환시키는 단계로, 0.02 M 산화용액(Oxidizing solution, 0.02 M-I2 in THF/Pyridine/H2O)을 처리하여 아인산(phosphite)이 인산(phosphate)으로 변경되는 단계이다. 해당 일련의 ASO의 합성과정은 DNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하여 진행되었다.
ASO-고분자 접합체(3´PEG-ASO-5´lipid)의 합성과정은 3´말단부위에 친수성 물질 PEG가 부여된3PEG-CPG 지지체로부터 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 ASO를 합성하고, 이황화 결합이 포함되어 있는 24개의 탄소 수(C24)를 갖는 소수성 물질인 테트라도코산(tetradocosane) 을 5´말단에 부여하여 원하는 ASO-고분자 접합체를 제조하였다(대한민국공개특허공보 2009-0042297호 참조).
또한 리간드가 부착된 리간드 결합 ASO-고분자 접합체(3´리간드-PEG-ASO-5´lipid)를 제조하기 위해, 아민기와 같은 기능기가 부착되어 있는 CPG로부터 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 PEG 포스포아미디트(phosphoramidite)시약을 이용하여 PEG를 결합한 뒤, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 ASO를 합성하고, 이황화결합이 포함되어 있는 24개의 탄소 수(C24)를 갖는 소수성 물질인 테트라도코산 (tetradocosane) 을 5´말단에 부여하여 원하는 리간드가 부착 가능한ASO-고분자 접합체(3기능기-PEG-ASO-5lipid)를 제조하였다. 합성이 완료되면 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 리간드가 부착 가능한ASO-고분자 접합체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 기능기를 통해 리간드를 부착시켜 원하는 리간드가 부착된 ASO-고분자 접합체(3´리간드-PEG-ASO-5´lipid)를 제조하였다.
한편, ASO-고분자 접합체(3´lipid -ASO-5´PEG)를 합성하기 위해, 아민(amine)기와 같은 기능기가 부여된CPG로부터 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 ASO를 합성하고, PEG 포스포아미디트(phosphoramidite)를 이용하여 5´말단에 부여하여 원하는 기능기-ASO친수성 고분자 접합체를 제조하였다. 기능기-ASO 친수성 고분자 접합체의 합성이 완료되면 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 기능기-ASO 친수성 고분자 접합체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 기능기를 통해 소수성 물질을 결합시켜 원하는 친수성 및 소수성 물질이 결합된 형태의ASO- 고분자 접합체를 제조하였다. 이후, 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)(LC-20A Prominence, SHIMADZU, 일본)를 수행하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리 정제하고, MALDI-TOF 질량 분석(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)을 통해 상기의 ASO 및 ASO-고분자 접합체의 분자량을 측정하여 합성하고자 하는 염기서열과 부합되는지를 확인하였다.
실시예 2. 포스포티오에이트(phosphothioate)로 변형된 ASO-고분자 접합체의 합성
본 실시예에서 사용된 ASO는DNA골격 구조를 이루고 있는 인산(phosphate)그룹이 포스포티오에이트(phosphothioate) 그룹으로 치환되어있는 S-올리고(S-oligo)를 이용하여 포스포티오에이트(phosphothioate)결합방법으로 연결된 것이다.
구체적으로는 우선 알려진 방법인, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 반복과정(cycle)을 통해 ASO를 합성하였는데, S-올리고(S-oligo)를 사용하는 경우 산화 과정에서 0.02 M 산화용액(Oxidizing solution) 대신에 0.1 M 황화제(Sulfurizing Reagent)를 처리하였다. 해당 ASO의 합성과정을 통해 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 가지는 포스포티오에이트(phosphothioate)로 변형된 ASO를 합성하였다(Shina et al. Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). 나머지 합성과정은 실시예 1과 유사한 방법이 사용되었다.
5과 3 양 말단에 4개의 뉴클레오사이드가 2-OCH3(Methoxy)로 변형된 ASO를 합성하는 경우, 2´-OCH3-DNA 형태로 변형된 부위의 뉴클레오사이드는 2´-OCH3-DNA 憊시아노에틸(-cyanoethyl) 포스포아미디트[rA(Bz),rC(Ac),rG(ibu),rU]를 이용하여 합성하여 골격구조를 포스포티오에이트(phosphothiolate)로 치환하는 방식으로 제조한 뒤, 앞서 기술한 바와 같이S-올리고를 이용하여 포스포티오에이트(phosphothiolate) 결합방법으로 DNA골격구조를 합성하는 방식으로 제조되었다.
포스포티오에이트(phosphothiolate)로 변형된 ASO-고분자 접합체의 경우, 3´말단부위에 PEG가 부여된3´PEG-CPG를 지지체를 기반으로 알려진 방법인, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 반복과정을 통해 포스포티오에이트로 변형된ASO 접합체를 합성한 뒤(대한민국공개특허공보 2009-0042297호 참조), 이황화 결합이 포함되어 있는 탄소수 24개의 소수성 물질인 테트라도코산(tetradocosane)을 5´말단에 부여함으로써, 원하는 포스포티오에이트로 변형된 ASO-고분자 접합체를 제조하였다.
또한 포스포티오에이트로 변형된 ASO-고분자 접합체 친수성 물질 말단부위에 리간드를 부여하기 위하여 3´CPG에 리간드가 결합될 수 있는 기능기를 부여한 뒤, 친수성 물질을 결합시키고 상기 반응을 수행하여 리간드가 부여될 수 있는 ASO-고분자 접합체를 제조하였다.
ASO-고분자 접합체의 합성이 완료되면 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 ASO 및 ASO-고분자 접합체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)(LC-20A Prominence, SHIMADZU, 일본)를 수행하여 상기 반응물들과 ASO-고분자접합체를 분리 정제하고, MALDI-TOF 질량 분석(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)을 통해 상기의 ASO 및 ASO-고분자 접합체의 분자량을 측정하여 합성하고자 하는 염기서열과 부합되는지를 확인하였다 (도 2 참조).
실시예 3. ASO-고분자 접합체의 생체내의 동일한 조건에서의 안정성 평가
상기 실시예 1및 실시예 2에서 합성, 분리한 ASO-고분자 접합체가 고분자 접합체가 결합되지 않은 원래 형태의 ASO에 비하여 ASO의 안정성이 향상되었는지 여부를 확인하였다. 고분자 접합체가 결합되지 않은 ASO와 ASO-고분자 접합체를 생체 내 조건을 모방한 형태인 30 및 50 % (v/v) FBS (fetal bovine serum)가 첨가된 배지에서 각각 0, 3, 5, 7 및 10일 동안 배양한 후 원래 ASO에 비해 분해된 정도를 전기영동법 또는 중합효소연쇄 반응법(PCR)으로 검증하였다.
그 결과, 사용된 FBS 농도와 무관하게ASO 고분자 접합체는 시간이 경과함에 따라 PEG가 ASO로부터 분리되는 것과 같은 양상을 보였을 뿐, ASO가 안정성을 나타낸 반면, ASO의 경우 3일 이후부터 안정성이 감소하였다.
실시예 4. ASO-고분자 접합체의 나노입자(nanoparticle) 물성 분석
ASO-고분자 접합체는 ASO의 말단에 부여된 소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의하여 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자를 형성하게 된다(도 1참조). 제타 전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자의 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 및 크기를 측정하였다.
실시예 4-1. ASO-고분자 접합체의 나노입자(nanoparticle)의 크기 측정
실시예 2에서 제조한 서열번호 1번의 ASO-고분자 접합체의 나노입자 크기를 제타 전위 측정기로 측정하였다. 상기 ASO-고분자 접합체 50 ㎍을 1 ml의 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 에 녹인 뒤, 초음파분산기 (Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하였다. 균질화된 나노입자는 제타전위측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)으로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절률(Refractive index)은 1.454, 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 물의 온도 25 ℃ 및 그에 따름 점도 및 굴절률을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 20번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 3회 반복하였다.
ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자의 크기는 100 내지 200 nm의 크기와 0.4 미만의 다분산지수(polydispersity index, PDI)값을 관찰할 수 있었다(도 3, (A) 참조), 다분산지수(polydispersity index, PDI)값은 낮을수록 해당 입자가 고르게 분포하고 있음을 판단할 수 있는 수치로, ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자는 비교적 균일한 크기의 나노입자를 형성하며, 이는 내포작용(endocytosis)을 통해 세포 내로 섭취되기에 충분한 크기이다(Kenneth A. Dawson et al. nature nanotechnology 4:84-85, 2009).
실시예 4-2. ASO-고분자 접합체의 임계미셀농도 측정
단일 분자에 소수성 기와 친수성 기가 함께 들어있는 양친매성인 물질(amphiphile)은 계면활성제가 될 수 있는데, 계면활성제는 수용액에 용해되면 소수성 부분은 물과의 접촉을 피하기 위해 가운데로 모이고 친수성 부분은 바깥쪽으로 향하여 미셀을 형성하게 된다. 이때, 최초로 미셀을 형성하게 되는 농도를 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC)라고 한다. 형광 염료를 이용하여 CMC를 측정하는 방법은 미셀이 형성되기 전/후에 형광염료의 형광 값 그래프 곡선의 기울기가 급격하게 변하는 특성에 근거한 것이다.
ASO-고분자접합체로 구성된 나노입자의 임계 미셀농도 측정을 위하여 형광 염료인 0.04 mM DPH(1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene, SIGMA, USA)를 준비한다. 서열번호 1번의 ASO-고분자 접합체 1 nmole/㎕를 0.0977 ㎍/ml에서 최고 50 ㎍/ml의 농도로 DPBS로 단계별로 희석하여, 총 180㎕의ASO-고분자접합체 시료를 준비한다. 준비된 시료에 0.04mM DPH와 대조군으로 쓰일 DPH의 용매인 메탄올을 각각 20㎕씩 더하여 잘 섞어준 뒤, 실시예4-1과 동일한 방법으로 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)를 통해 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하였다. 균질화된 시료는 빛을 차단된 상온 조건에서 약 24 시간 반응시킨 뒤, 형광 값(excitation: 355 nm, emission: 428 nm, top read)을 측정하였다. 측정된 형광 값들은 상대적인 형광 값을 확인하는 것이기 때문에 동일 농도에서 DPH 포함된 시료의 형광 값-메탄올만 포함된 시료의 형광 값 구하여(Y축)을 처리한 ASO-고분자접합체 농도의 log 값(X축)에 대한 그래프로 도시하였다(도 3. (B) 참조).
각 농도 별 측정된 형광 값은 저 농도 구간에서 고 농도 구간으로 이동하면서 급격하게 증가하게 되는데, 이렇게 급격하게 증가하는 지점의 농도가 CMC농도가 된다. 따라서 형광 량이 증가하지 않는 저 농도 구간과 형광 량이 증가한 고농도 구간을 몇 지점으로 구분하여 추세 선을 그리고, 두 추세 선이 만나는 교차점의 X 값이 CMC농도가 된다. 측정된 ASO-고분자접합체의 CMC는 1.56㎍/ml로 매우 낮게 형성됨이 관찰되었으며, 이로써 ASO-고분자접합체로 이루어진 나노입자가 매우 낮은 농도에서도 미셀을 잘 형성할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 5. ASO-고분자 접합체와 형질주입 물질(transfection reagent)을 이용한 종양 세포주에서의 목표 유전자의 발현 억제
실시예 2에서 제조한 아무것도 접합되지 않은 ASO 와 ASO-고분자 접합체를 이용하여 종양세포주인 인간 대장암 세포주 (SW480)를 형질주입 시키고, 상기 형질주입 된 종양세포주의 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다.
5-1. 종양 세포주의 배양
미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 대장암 세포주 (SW480)는 생장배지(Leibovitz´s L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국)에 10 %(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml을 첨가하고 37 ℃, 5 %(v/v) 이산화탄소(CO2)의 조건하에 배양하였다.
실시예 5-2. ASO-고분자 접합체를 이용한 종양세포주의 형질주입
상기 실시예 2에서 제조한 아무것도 접합되지 않은 ASO 와 ASO-고분자 접합체를 이용하여 종양세포주인 인간 대장암 세포주(SW480)를 형질주입 시키고, 상기 형질주입 된 종양세포주의 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다.
상기 실시예 5-1에서 배양된 종양세포주는 웰(well)당 1.3 × 105를 상기 실시예의 5-1 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 생장배지(Leibovitzs L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국)에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 800㎕의Opti-MEM(modification of Eagle's Minimum Essential Media, GIBCO/Invitorgen; 미국) 배지를 분주하였다.
한편, 리포펙타민(Lipofectamine™ 2000, Invitrogen; 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 198㎕를 혼합하고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1및 실시예 2에서 제조한 각각의 ASO-고분자 접합체(25 pmole/㎕)를 최종10, 50, 100 nM의 농도로 처리한 뒤, 다시 실온에서 20분간 반응시켜서 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 200㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 생장배지(Leibovitz´s L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국) 2.5 ㎖를 분주한 다음 24 시간 동안 37 ℃, 5 %(v/v) 이산화탄소(CO2)의 조건하에 배양하였다.
실시예 5-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
실시예 5-3에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 특허 대한민국 공개특허 공보2009-0042297호의 방법에 따라서 상대정량 하였다(도 4 참조).
아무것도 접합되지 않은ASO와 ASO-고분자 접합체의 목표유전자 발현저해효과를 분석하기 위해 형질주입물질과 함께 형질 전환시킨 뒤, 서바이빈 유전자의 mRNA발현 정도를 비교한 결과, ASO-고분자 접합체는 접합체가 없는 아무것도 접합되지 않은ASO와 유사한 정도의 발현 저해를 나타내어, 고분자가 접합되어있는 형태가 ASO의 메커니즘(mechanism)을 방해하지 않는 것으로 사료된다.
실시예 6. ASO-고분자 접합체만을 이용한 종양 세포주에서의 목표 유전자의 발현 억제
실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 각 각의 ASO-고분자 접합체를 이용하여 종양세포주인 인간 대장암 세포주 (SW480)를 형질주입 시키고, 상기 형질주입 된 종양세포주의 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 6-1. 종양 세포주의 배양
미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 대장암 세포주 (SW480)는 생장배지(Leibovitz´s L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국)에 10 %(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml을 첨가하고 37 ℃, 5 %(v/v) 이산화탄소(CO2)의 조건하에 배양하였다.
실시예 6-2. ASO-고분자 접합체를 이용한 종양세포주의 형질 전환
실시예 6-1에서 배양된 종양세포주 웰(well)당 1.3 × 105 을 상기 실시예 5-1 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 생장배지(Leibovitzs L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국)에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후, 각 웰당 800 ㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.
Opti-MEM 배지 100㎕와 상기 실시예 1, 2에서 제조한 각각의 ASO-고분자 접합체 (1 nmole/㎕) 5, 10, 100㎕를 첨가하고(500 nM, 1 μM, 10 μM 처리), 실시예4-1과 동일한 방법으로 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)를 통해 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하여 ASO-소수성 물질 접합체로 구성된 나노입자를 균등화하여 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 100㎕ 씩 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 20% FBS가 포함된 생장배지(Leibovitz´s L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국) 1 ml을 첨가하였다. 여기에 24 시간 동안 추가적으로 37 ℃, 5 %(v/v) 이산화탄소(CO2)의 조건하에 배양하여, ASO-고분자 복합체 처리 후 총 48 시간 동안 배양하였다.
실시예 6-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
실시예 6-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 대한민국공개특허2009-0042297호의 방법에 따라서 상대정량 하였다.
아무것도 접합되지 않은ASO와 ASO-고분자 접합체의 형질주입 물질 없는 조건에서 세포에 전달되어 서바이빈 유전자의 mRNA 발현 저해 정도를 비교한 결과 형질주입 물질이 없는 조건에서 ASO-고분자 접합체의 경우, 아무것도 변형하지 않은 ASO에 비하여 상대적으로 낮은 농도에서 목표유전자의 mRNA발현 저해를 유발함을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명에서 합성한 ASO-고분자 접합체 또는 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자는 형질주입 물질이 없는 조건에서도 세포 내로 전달이 되어 ASO의 목표유전자의 발현을 저해함을 확인 할 수 있었다.

Claims (21)

  1. 하기 구조식(1)의 구조를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)와 고분자 물질 접합체;
    A-X-R-Y-B 식(1)
    (식 (1)에서 A와 B 중 하나는 친수성 물질이고, 다른 하나는 소수성 물질이며; X와 Y는 서로 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; R은 ASO를 의미한다.)
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 ASO 는10 내지 50 개의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´탄소 위치에서 -OH 기가 CH3(메틸), -OCH3, -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드 간 결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형이 하나 또는 둘 이상의 조합되어 변형되거나, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid) 형태로의 변형 된 것을 특징으로 하는 접합체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 친수성 물질은 분자량 200 내지 10,000 인 고분자 화합물인 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 친수성 물질은 폴리에틸린글리콜(PEG,polyethylene), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 및 폴리옥사졸린(polyoxazoline)의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 소수성 물질은 분자량 250 내지 1,000임을 특징으로 하는 접합체.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 소수성 물질은 C12내지C50의 탄화수소 또는 콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 접합체.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 접합체.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  11. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 ASO-고분자 접합체의 친수성 물질에 리간드가 결합된 것을 특징으로 하는 리간드 결합 ASO-고분자 접합체.
  12. (a) 고형지지체에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
    (b) 상기 친수성 물질을 포함하는 고형지지체 기반으로 ASO를 합성하는 단계;
    (c) 상기 고형지지체 상의 ASO의 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
    (d) 상기 친수성 물질과 소수성 물질이 결합한ASO-고분자 접합체를 고형지지체로부터 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 ASO-고분자 접합체의 제조방법.
  13. (a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체를 기반으로 ASO를 합성하는 단계;
    (b) 상기 ASO 5´말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
    (c) 상기 친수성 물질이 결합한 ASO 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;
    (d) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO 3´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;를 포함하는 ASO-고분자 접합체의 제조방법.
  14. (a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체에 친수성 물질을 결합 시키는 단계;
    (b) 상기 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체에 ASO를 합성하는 단계;
    (c) 상기 ASO 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
    (d) 상기 친수성 물질과 소수성 물질이 결합한 ASO-고분자 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;
    (d) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO-고분자 접합체의 친수성 물질 말단에 리간드를 결합시키는 단계;를 포함하는 리간드 결합 ASO-고분자 복합체 제조 방법.
  15. (a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체를 기반으로 ASO를 합성하는 단계;
    (b) 상기 ASO 말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
    (c) 상기 친수성 물질이 결합한 ASO 접합체에 리간드를 공유결합 시키는 단계;
    (d) 상기 기능기가 부착된 ASO-친수성 고분자-리간드 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;
    (e) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO 3´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;를 포함하는 리간드 결합 ASO-고분자 접합체의 제조방법.
  16. 제 1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 ASO-고분자 접합체를 포함하는 나노입자.
  17. 제 11항의 리간드 결합 ASO-고분자 접합체를 포함하는 나노입자.
  18. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 ASO-고분자 접합체의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제 16항의 나노입자를 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제 11항의 리간드 결합 ASO-고분자 접합체의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제 17항의 나노입자를 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
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WO2015002511A1 (ko) * 2013-07-05 2015-01-08 (주)바이오니아 개선된 고효율 나노입자형 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 그의 제조방법
CN110592082A (zh) * 2013-07-05 2019-12-20 柏业公司 呼吸疾病相关基因特异性siRNA、含有siRNA的双螺旋寡RNA结构及其用途

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