KR20160034401A - 비-천연적으로 발생하는 인자 h 결합 단백질(fhbp) 및 이의 사용 방법 - Google Patents

비-천연적으로 발생하는 인자 h 결합 단백질(fhbp) 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)의 적어도 하나에 대해 살균성인 항체를 유발할 수 있는, 변이체 3 fHbp로부터 유래된 비-천연적으로 발생하는 인자 H 결합 단백질 및 상기 단백질의 사용 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp로부터 유래된 비-천연적으로 발생하는 인자 H 결합 단백질(fHbp)이 기재된다. 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp의 위치 223번에서 히스티딘이 아르기닌, 라이신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것을 포함하고, 여기서, 위치 223번의 넘버링은 성숙 fHbpID1의 넘버링을 기준으로 한다. 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 fHbp ID 79보다 인간 인자 H(fH)에 대해 보다 낮은 친화성을 가질 수 있다.

Description

비-천연적으로 발생하는 인자 H 결합 단백질(FHBP) 및 이의 사용 방법{NON-NATURALLY OCCURRING FACTOR H BINDING PROTEINS (FHBP) AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 8월 2일자로 출원된 미국 가출원 특허 번호 제61/861,662호의 우선권을 주장하고 이의 내용은 전문이 참조로 본원에 인용된다.
연방 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 국가 보건 기구의 알레르기 및 감염성 질환의 국가 연구소에 의해 부여된 승인번호 R01 AI 099125-01하의 정부 지원과 함께 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
서론
나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitides)(엔. 메닌기티디스(N. meningitides))는 인간 상부 호흡관에 군집하는 그람-음성 세균이고 가장 악명높게 전세계적으로 만연되고 주기적 유행성의 수막염 및 패혈증의 발병에 관여한다. 감염율 및 이환율은 2세 미만의 어린이에서 가장 높다. 다른 그람-음성 세균 처럼, 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)는 전형적으로 세포질막, 펩티도글리칸 층, 외부 환경으로 돌출된 세포 벽 및 필리(pili)를 캡슐 폴리사카라이드와 함께 구성하는 외막을 갖는다. 엔. 메닌기티디스의 캡슐화된 균주는 어린이 및 젊은 성인에서 세균 수막염 및 패혈증의 주요 원인이다. 공격적 엔. 메닌기티디스 감염의 만연은 상이한 균주에 걸쳐서 그리고 특히 상이한 혈청형 또는 혈청아유형을 갖는 유전학적으로 다양한 그룹 B 균주에 걸쳐 면역성을 부여할 수 있는 효과적인 백신에 대한 연구를 가동시켰다.
인자 H 결합 단백질(fHbp, 또한 당업계에서 지질단백질 2086(문헌참조: Fletcher et al (2004) Infect Immun 72:2088-2100), 게놈-구동된 나이세리아 항원(GNA) 1870(문헌참조: Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-99) 또는 "741"로서 언급됨)은 엔. 메닌기티디스 세균에서 발현되는 표면 노출된 지질단백질이다. fHbp는 보체 활성화를 하향조절하는 인간 보체 인자 H(fH)에 결합한다. fH의 상기 세균 표면으로의 결합은, 병원체가 비-면역 인간 혈청 또는 혈액에서 생존하고 순수한 숙주 방어를 공격하는 중요한 기작이다. 최근에, 인간 인자 H 유전자 클러스터에서 유전학적 변화는 뇌척수막염 질환의 발병에 대한 감수성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(문헌참조: Davila S et al. (2010) Nat Genetics doi:10.1038/ng.640). fH의 fHbp로의 결합은 인간 fH에 대해 특이적이고 이는 나이 세리아 메닌기티디스가 전적으로 인간 병원체인지에 대한 이유를 설명할 수 있다.
효과적인 살균 항체 반응을 유발할 수 있는 fHbp 폴리펩타이드가 여전히 요구된다.
요약
엔. 메닌기티디스의 적어도 한 균주에 대해 살균성인 항체를 유발할 수 있는 변이체 3 fHbp로부터 유래되는 비-천연적으로 발생하는 인자 H 결합 단백질, 및 상기 단백질의 사용 방법이 제공된다.
특정 양태에서, 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp로부터 유래된 비-천연적으로 발생하는 인자 H 결합 단백질(fHbp)이 기재된다. 비-천연적 fHbp는 천연에 존재하는 변이체 3 fHbp의 223번 위치에서 히스티딘이 아르기닌, 리신, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있고, 여기서, 223번 위치의 넘버링은 성숙 fHbp ID 1의 넘버링을 기초로 한다. 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 fHbp ID 79보다 인간 인자 H(fH)에 대해 보다 낮은 친화성을 가질 수 있다.
특정 양태에서, 상기 히스티딘은 아르기닌으로 치환될 수 있다.
특정 경우에, 상기 변이체 3 fHbp는 모듈러 그룹 V fHbp일 수 있다. 다른 경우에, 상기 변이체 3 fHbp는 모듈러 그룹 II fHbp일 수 있다.
예시적인 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 fHbp ID 79의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 경우에, 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 아미노산 치환 H223R을 갖는 fHbp ID 28의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 경우에, 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 아미노산 치환 H223R을 갖는 fHbp ID 67의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 경우에, 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 아미노산 치환 H223R을 갖는 fHbp ID 175의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 경우에, 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 아미노산 치환 H223R을 갖는 fHbp ID 79의 아미노산 서열을 포함할 수 있다
특정 경우에, 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 아미노산 치환 H223R을 갖는 fHbp ID 45의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 면역원성 조성물이 제공된다. 상기 면역원성 조성물은: a) 본원에 기재된 바와 같은 비-천연적으로 발생하는 fHbp; 및 b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.
특정 경우에, 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 비-천연적으로 발생하는 fHbp 를 발현하는 엔 메닌기티디스 균주로부터 제조된 소포 제제의 표면상에서 발현될 수 있다.
특정 경우에, 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 면역원성 조성물에서 단리된 폴리펩타이드로서 존재할 수 있다.
예시적인 경우에, 약제학적으로 허용되는 부형제는 보조제를 포함할 수 있다.
특정 경우에, 상기 면역원성 조성물은 추가의 엔. 메닌기티디스 항원을 추가로 포함할 수 있다.
엔. 메닌기티디스에 대한 포유동물에서의 항체 반응을 유발하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에 기재된 비-천연적으로 발생하는 fHbp, 또는 본원에 제공된 면역원성 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함할 수 있다.
특정 경우에, 상기 투여는 엔. 메닌기티디스에 대해 살균성인 항체의 제조를 제공한다.
본원에 제공된 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 암호화하는 핵산이 또한 기재된다. 또한, 본원에서 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공된다. 예시적인 양태는 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 암호화하는 핵산, 또는 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 유전학적으로 변형된 숙주 세포를 포함한다.
또 다른 면역원성 조성물이 본원에 기재된다. 상기 면역원성 조성물은: a) 본 발명에 따라 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 암호화하는 핵산으로 유전학적으로 변형되어 상기 암호화된 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 유전학적으로 변형된 숙주 세포에 의해 제조되는 유전학적으로 변형된 나이세리아 숙주 세포로부터 수득된 소포체로서 상기 암호화된 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 포함하는 소포체; 및 b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.
특정 경우에, 상기 소포체는 원산 외막 소포체일 수 있다.
특정 경우에, 상기 숙주 세포는 유전학적으로 변형되어 lpxL1 유전자 및/또는 lpxL2 유전자의 폴리펩타이드 생성물의 감소된 활성 또는 무활성을 제공할 수 있다.
예시적인 양태에서, 상기 숙주 세포는 유전학적으로 변형되어 나이세리아 항원의 증가된 발현을 제공한다.
포유동물에서 나이세리아에 대한 항체 반응을 유발하는 방법이 제공된다. 상기 방법은: a) 본 발명에 따라 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 암호화하는 핵산으로 유전학적으로 변형되어 상기 암호화된 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 유전학적으로 변형된 숙주 세포에 의해 제조되는 유전학적으로 변형된 나이세리아 숙주 세포로부터 수득된 소포체로서 상기 암호화된 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 포함하는 소포체; 및 b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함할 수 있다.
도 1. 재조합 fHbp ID 79 야생형 및 돌연변이체의 크기 및 순도를 지적하는 SDS-폴리아크릴아미드 겔. 레인 1, 벤치마크 래더 (Invitrogen); 레인 2 fHbp ID 79 야생형; 레인 3 fHbp ID 79 H223R 돌연변이체; 레인 4, fHbp ID 79 H223A 돌연변이체. 재조합 fHbp 각각 2㎍을 겔상에 로딩하였다. 아미노산 넘버링은 성숙 fHbp ID 1의 넘버링을 기준으로 함을 주지한다. 세부 사항에 대해서는 실시예 1을 참조한다.
도 2. ELISA에 의한 인간 인자 H의 fHbp ID 79 돌연변이체 H223A 및 H223R로의 결합. 패널 A는 인간 인자 H의 결합을 보여준다. fHbp ID 79 야생형(WT), 원형 기호; fHbp ID 79 H223A 돌연변이체, 삼각형 기호; fHbp ID 79 H223R 돌연변이체, 별표 기호. 패널 B는 대조군 mAb, JAR 11의 결합을 보여준다. 아미노산 넘버링은 성숙 fHbp ID 1의 넘버링을 기준으로 함을 주지한다. 세부 사항에 대해서는 실시예 2를 참조한다.
도 3. ELISA에 의한 인간 인자 H의 fHbp ID 22 돌연변이체 T221A 및 H223A로의 결합. 패널 A는 인간 인자 H의 결합을 보여준다. fHbp ID 22 야생형(WT), 원형 기호; fHbp ID 22 T221A 돌연변이체, 별표 기호; fHbp ID 22 H223A 돌연변이체, 삼각형 기호. 패널 B는 대조군 mAb, JAR 13의 결합을 보여준다. T221 및 H223의 넘버링은 성숙 fHbp ID 1의 넘버링을 기준으로 함을 주지한다. 세부 사항에 대해서는 실시예 3을 참조한다.
도 4. 성숙 fHbp ID 1, fHbp ID 22, fHbp ID 79, 및 fHbp ID 28의 아미노산 서열의 정렬. H223은 화살표로 나타낸다.
도 5. 성숙 v. 3 fHbps의 아미노산 서열의 정렬. H223은 화살표로 나타낸다.
도 6. fHbp 모듈러 그룹 I-IX의 도식.
도 7. fHbp ID 79 백신에 대한 마우스의 살균 반응을 보여주는 그래프. fHbp ID 79 야생형(WT) 및 fHbp ID 79 H223R 돌연변이체를 시험하였다. fHbp 백신에 대해, 각각의 기호는 개별 혈청 샘플의 역가를 나타내고; 알루미늄(Alum) 대조군 그룹에 대해 각각의 기호는 3개의 혈청 샘플 풀의 역가를 나타낸다. 상기 수평선은 각각의 그룹에 대한 기하학적 평균 역가를 나타낸다.
본 발명 및 본 발명의 특정 예시적 양태를 기재하기에 앞서, 본 발명은 기재된 특정 양태로 제한되지 않고 예를 들어, 물론 다양할 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 또한, 본원에 사용된 기술이 단지 특정 양태를 기재할 목적인 것이고 이를 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야만 하는데 그 이유는 본 발명의 범위가 단지 첨부된 특허청구범위에 의해 제한되기 때문이다.
일정 범위의 값이 제공되는 경우, 문단에서 명백하게 지시하지 않는 경우 상기 범위의 상한치와 하한치 사이의 보다 낮은 제한 단위의 10자리 단위에 대한 각각의 사이 값 및 진술된 범위에서 임의의 다른 진술되거나 사이 값이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 보다 작은 범위의 상한치와 하한치는 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있고 또한 상기 진술된 범위에서 임의의 특정 배제된 제한 값으로서 본 발명에서 포괄된다. 상기 진술된 값이 제한치 중 하나 또는 둘다를 포함하는 경우, 이들 포함된 제한의 둘다를 배제하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
명백하게 하기 위해 별도의 양태와 관련하여 기재된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 양태와 조합하여 제공될 수 있는 것으로 이해한다. 역으로, 간결하게 하기 위해 단일 양태와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 서브-조합으로 제공될 수 있다. 표준 아미노산 서열과 상대적으로 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 변형에 속하는 양태의 모든 조합은 구체적으로 본 발명에 의해 포괄되고 본원에서 각각 및 모든 조합이 개별적으로 및 상기 조합이 목적하는 특징을 갖는 폴리펩타이드, 예를 들어, 천연에 존재하는 fHbp보다 인간 fH에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는 비-천연적으로 발생하는 fHbp 폴리펩타이드를 포괄하는 정도로 기재된 것처럼 본원에 기재된다. 추가로, 상기 아미노산 변형을 기재하는 양태에 열거된 상기 아미노산 변형(아미노산 치환을 포함하는)의 모든 서브 조합은 또한 구체적으로 본 발명에 의해 포괄되고 각각 및 모든 상기 아미노산 변형의 서브-조합이 개별적으로 및 명백하게 본원에 기재된것 처럼 본원에 기재된다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 공보는 공보가 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 재료를 기재하고 기술하기 위해 본원에 참조로서 인용된다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같은 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 명백하게 진술되지 않는 경우 복수의 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항원"에 대한 언급은 복수의 상기 항원들을 포함하고 "단백질"에 대한 언급은 하나 이상의 단백질에 대한 언급 등을 포함한다.
본원에 논의된 공보는 본원의 출원일 전의 이들의 기재에 대해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 공보보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 추가로, 제공된 공보의 날짜는 실제 공보 날짜와 상이할 수 있고 이는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
상기 지적된 바와 같이, 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 대해 살균성인 항체를 유발할 수 있는 변이체 3 fHbp로부터 유래된 비-천연적으로 발생하는 인자 H 결합 단백질 및 상기 단백질의 사용 방법이 제공된다.
정의
"인자 H 결합 단백질"(fHbp)은 또한 문헌에서 GNA1870, GNA 1870, ORF2086, LP2086 (지질단백질 2086)로서 공지되어 있고, "741"은 한 부류의 엔. 메닌기티디 스 폴리펩타이드를 언급한다. fHbp는 천연에서 엔. 메닌기티디스 균주의 표면 상에서 발현되는 지질단백질로서 발견된다. fHbp는 아미노산 서열 다양성 및 면역학적 교차-반응성을 기준으로 3개의 fHbp 변이체(일부 보고 (문헌참조: Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-99)에서 변이체 1(v.1), 변이체 2(v.2) 및 변이체 3(v.3)으로서 언급되고 다른 보고(문헌참조: 예를 들어, Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100)에서 패밀리 A 및 B로 언급됨)로 세분되었다(문헌참조: Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-99). 엔. 메닌기티디스에서 발견된 각각의 독특한 fHbp는 또한 웹사이트(neisseria.org 또는 pubmlst.org/neisseria/fHbp/ website)에 따라 fHbp 펩타이드 ID로 할당된다. 변이체 2 (v.2) fHbp 단백질(균주 8047로부터, fHbp ID 77) 및 변이체 3 (v.3) fHBP (균주 M1239로부터, fHbp ID 28)의 길이가 MC58(fHbp ID 1)의 길이와 각각 -1 및 +7개의 아미노산 잔기만큼 차이가 있기 때문에, v.2 및 v.3 fHbp 단백질에 대한 잔기들을 언급하기 위해 사용된 넘버링은 이들 단백질의 실제 아미노산 서열을 기준으로 하는 넘버링과는 상이하다.
상기 용어 "이종성" 또는 "키메라"는 상이한 공급원 또는 선조체 서열로부터 유래된 구조에 의해 정의된 2개의 성분을 언급한다. 예를 들어, "이종성"이 키메라 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 경우, 상기 키메라 폴리펩타이드는 상이한 계통발생적 분류의 상이한 폴리펩타이드(예를 들어, α 선조체 아미노산 서열로부터의 제1 성분 및 β 선조체 아미노산 서열로부터의 제2 성분)로부터 유래될 수 있는 작동적으로 연결된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 2개 이상의 한정된 분절을 함유하는 키메라 폴리펩타이드는 이의 각각이 상이한 선조체로부터 기원하고 천연적으로 발생하거나 인공(비-천연적으로 발생하는)일 수 있다. 천연적으로 발생하는 키메라에 대한 보다 상세한 사항에 대해 문헌[Beernink PT, Granoff DM (2009) Microbiology 155:2873-83]을 참조한다. 비-천연적으로 발생하는 키메라는 "인공 키메라"를 언급하고 천연에서 발견되지 않는 이종성 성분을 갖는 fHbp를 포괄한다.
"이종성" 또는 "키메라" 폴리펩타이드는 또한 2개의 상이한 성분들을 함유할 수 있고, 각각은 상이한 fHbp(예를 들어, 변이체 1, 2 또는 3)로부터 기원한다. 상기 성분은 fHbp 폴리펩타이드의 길이를 따라 임의의 위치에서 작동적으로 연결될 수 있다.
상기돤 바와 같은 임의의 키메라 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 "이종성"은 상이한 유전자(예를 들어, fHBP v.1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로부터 제1 성분 및 fHBP v.2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로부터 제2 성분)로부터 유래될 수 있는 작동적으로 연결된 핵산 서열 또는 상이한 선조체 아미노산 서열(α 또는 β)을 포함할 수 있다.
다른 예시적 "이종성" 핵산은 암호화 서열을 포함하는 핵산이 암호화 서열과는 상이한 유전학적 기원으로부터 유래된 조절 요소(예를 들어, 프로모터)에 작동적으로 연결된(예를 들어, 프로모터, 암호화 서열 또는 이 둘다와 관련하여 상이한 유전학적 기원일 수 있는 목적하는 숙주 세포에서 발현을 제공하기 위해) 발현 작제물을 포함한다. 예를 들어, fHbp 폴리펩타이드 또는 이의 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결된 T7 프로모터는 이종성 핵산인 것으로 일컬어진다.
재조합 세포와 관련하여 "이종성"은 이것이 존재하는 숙주 세포와는 상이한 유전학적 기원인 핵산(또는 폴리펩타이드와 같은 유전자 생성물)의 존재를 언급할 수 있다. 예를 들어, 하나의 균주의 나이세리아성 아미노산 또는 핵산 서열은 또 다른 균주의 나이세리아성 숙주에 대해 이종성이다.
아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 관련하여 "로부터 유래된" (예를 들어, fHbp 변이체 3, 예를 들어, fHbpID 79 "로부터 유래된" 아미노산 서열)은 상기 폴리펩타이드 또는 핵산이 표준 폴리펩타이드 또는 핵산(예를 들어, 천연적으로 발생하는 fHbp 단백질 또는 암호화 핵산)을 기초로 하는 서열을 가짐을 지적하는 것으로 의미되고 상기 단백질 또는 핵산이 제조된 공급원 또는 방법으로서 제한하는 것으로 의미되지 않는다. 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 "로부터 유래된" 것일 수 있는 표준 폴리펩타이드 및 표준 뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 천연적으로 발생하는 fHbp, 예를 들어, fHbp ID 79, 및 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 포함한다. 세균 균주와 관련하여 "로부터 유래된"은 균주가 모 균주의 생체내 또는 시험관내 계대 배양을 통해 수득되고/되거나 모 균주의 변형에 의해 수득된 재조합 세포임을 지적하는 것으로 의미된다.
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 측쇄의 화학적 및 물리적 성질(예를 들어, 전하, 크기, 소수성/친수성)을 공유하는 하나의 아미노산 잔기의 또 다른 잔기로의 치환을 언급한다. "보존성 치환"은 아미노산 잔기들의 하기 그룹 내의 치환을 포함하는 것으로 의도된다: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr. 상기 치환을 위한 지침은 목적하는 에피토프를 제공하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 정렬로부터 이끌어질 수 있다.
상기 용어 "보호 면역"은 포유동물에 투여되는 백신 또는 면역화 스케줄이 엔. 메닌기티디스에 의해 유발되는 질환을 예방하거나, 이의 발병을 지연시키거나 이의 중증도를 감소시키거나 질환 증상을 감소시키거나, 또는 함께 제거하는 면역 반응을 유도함을 의미한다. 보호 면역은 살균성 항체의 생성을 수반할 수 있다. 엔. 메닌기티디스에 대한 살균성 항체의 생성은 인간에서 백신 보호 효과를 예측하는 것으로서 당해 분야에서 수용되고 있음을 주지해야 한다(문헌참조: Goldschneider et al. (1969) J. Exp. Med. 129:1307; Borrow et al. (2001) Infect Immun. 69:1568).
용어 "나이세리아 메닌기티디스의 균주에 의해 유발된 질환"은 엔. 메닌기티디스에 의한 인간 감염에서 존재하는 임상적 증상 또는 임상적 증상들의 합병증을 포함한다. 이들 증상들은 엔. 메닌기티디스의 병원성 균주에 의한 상부 호흡관(예를 들어, 인두 및 편도의 점막)의 군집화, 상기 세균의 점막 및 점막하 혈관 베드로의 침투, 패혈증, 패혈성 쇼크, 염증, 출혈성 피부 병변, 섬유소용해 활성화 및 혈액 응고의 활성화, 신장, 폐와 같은 기관 기능부전, 및 심부전증, 부신 출혈 및 근육 경색, 모세관 누출, 부종, 말초 사지 허혈, 호흡 곤란 증후군, 심낭염 및 수막염을 포함하지만 이에 의해 제한되지 않는다.
항원(예를 들어, 폴리펩타이드 항원)과 관련하여 용어 "특이적으로 항체에 결합하는" 또는 "특이적으로 면역반응성인"은 또한 다른 분자들의 이종성 집단을 포함할 수 있는 샘플에서 항원의 존재를 기초로 하고/하거나 입증하는 결합 반응을 언급한다. 따라서, 지정된 조건하에서, 특이적 항체 또는 항체들은 샘플에서 특정 항원 또는 항원들에 결합하고 샘플에 존재하는 다른 분자들에 상당량으로 결합하지 않는다. 항원의 에피토프(예를 들어, 폴리펩타이드의 에피토프)와 관련하여 "항체에 특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 면역반응성인"은 항원의 이종성 집단 뿐만 아니라 다른 에피토프들의 이종성 집단을 포함할 수도 있는 항원(예를 들어, 폴리펩타이드) 중 에피토프의 존재를 기초로 하고/하거나 입증하는 결합 반응을 언급한다. 따라서, 지정된 조건하에, 특이적인 항체 또는 항체들은 항원의 특정 에피토프에 결합하고 항원 및/또는 샘플 중에 존재하는 다른 에피토프들에 상당량으로 결합하지 않는다.
용어 "면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로"는 특정 항원 제제의 투여 전 또는 투여 후 측정되는 면역 반응 지시기간의 검출가능한 차이가 있음을 의미한다. 면역 반응 지시기는 효소-결합된 면역검정(ELISA), 살균성 검정, 유동 세포측정, 면역침전, 오우크테를로니 면역 확산; 예를 들어, 스팟, 웨스턴 블롯 또는 항원 어레이의 결합 검출 검정; 세포독성 검정 등과 같은 검정에 의한 검출시 항체 역가 또는 특이성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"표면 항원"은 엔. 메닌기티디스의 표면 구조(예를 들어, 외막, 캡슐, 필리 등)에 존재하는 항원이다.
"단리된"은 분자가 천연에 존재할 수 있는 것과는 상이한 환경에 있는 목적하는 분자를 언급한다. "단리된"은 목적하는 화합물/폴리펩타이드가 실질적으로 풍부하고/하거나 목적하는 화합물/폴리펩타이드가 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 샘플 내에 있는 화합물/폴리펩타이드를 포함하는 것으로 의미된다.
"풍부한"은 샘플이 비-천연적으로 조작되어 (예를 들어, 과학자 또는 임상의에 의해) 목적하는 화합물이 생물학적 샘플(예를 들어, 화합물이 천연적으로 발생하거나 이것이 투여 후에 존재하는 샘플) 또는 화합물이 제조된 (예를 들어, 세균성 폴리펩타이드, 항체, 폴리펩타이드 등에서와 같이) 출발 샘플 중에 화합물의 농도보다 큰 농도(예를 들어, 적어도 3배 큰, 적어도 4배 큰, 적어도 8배 큰 또는 적어도 64배 큰)로 존재한다.
표적 유전자와 관련하여 "녹-아웃" 또는 "녹아웃"은 표적 유전자의 기능 감소를 유도하는, 예를 들어, 표적 유전자 발현이 검출가능할 수 없거나 유의적이지 않고/않거나 유전자 생성물이 기능성이 아니거나 유의적으로 기능성이 아니도록 하는 유전자의 서열에서 변화를 언급한다. 예를 들어, 리포폴리사카라이드(LPS) 합성에 관여하는 유전자의 "녹아웃"은 유전자의 기능이 실질적으로 감소하여 유전자의 발현이 검출가능하지 않거나 단지 유의적이지 않은 수준으로 존재하고/하거나 유전자 생성물의 생물학적 활성(예를 들어, 효소적 활성)이 변형 전과 관련하여 유의적으로 감소되거나 검출가능하지 않도록 함을 지적한다. "녹-아웃"은 조건적 녹-아웃을 포함하고, 여기서, 표적 유전자의 변화는 예를 들어, 미리한정된 설정의 조건(예를 들어, 온도, 삼투압, 표적 유전자 변화를 촉진시키는 물질로의 노출 등)으로의 노출시 일어날 수 있다. 표적 유전자의 "녹-인" 또는 "녹인" 은 표적 유전자에 의해 제공된 기능에서 증가시키는 유전자에서의 유전학적 변화를 언급한다.
비-천연적으로 발생하는 fHbp 폴리펩타이드
본 발명에 의해 고려되는 fHbp를 추가로 기재하기에 앞서, 일부 천연적으로 발생하는 fHbp를 기재하는 것이 도움이 된다. 엔. 메닌기티디스에서 발견되는 독특한 천연적으로 발생하는 fHbp는 각각 웹사이트(neisseria.org 및 pubmlst.org/neisseria/fHbp websites)에 따라 fHbp 펩타이드 ID에 할당된다. fHbp를 지명하는 본 협의는 본원 전반에 걸쳐 채택된다.
편의와 명백하게 하기 위해, fHbp ID 1(엔. 메닌기티디스 균주 MC58의 v.1 fHbp)의 원산(native) 아미노산 서열은 본원에 기재된 fHbp의 키메라 및/또는 돌연변이체를 포괄하는, 모든 천연적으로 발생하고 비-천연적으로 발생하는 fHbp 아미노산 서열에서 아미노산 위치를 기재하기 위한 표준 서열로서 선택된다. fHbp ID 1의 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
fHbp ID 1 (v. 1)
Figure pct00001
fHbp에서 아미노산 잔기 위치를 언급하는데 있어서, 본원에 사용되는 위치 번호는 fHbp ID 1의 아미노산 잔기 번호에 상응한다.
다양한 fHbp의 정렬 및 fHbp ID 1의 아미노산 잔기에 상응하는 각각의 fHbp에서 아미노산 잔기에 대해 도 4를 참조한다. 도 4 및 서열번호 1에 나타낸 바와 같이, 위치 번호 1은 fHbp ID 1에서 보여지는 시스테인인 제1 아미노산 잔기를 언급한다. 본원에서 언급되는 fHbp는 때때로 N-말단에서 추가의 리더 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, fHbp ID 1은 N-말단에서 VNRTAFCCLSLTTALILTA(서열번호 2)의 리더 서열을 가질 수 있다. 그러나, 임의의 fHbp에서 아미노산 위치 번호 1은 여전히 본원에서 정렬에서 fHbp ID 1에 대해 상기 나타낸 아미노산 위치 1에서 시스테인에 상응하는 위치로서 본원에 정의되고, 상기 아미노산은 존재하는 경우 리더 서열 후 제1 잔기이다.
도 4는 변이체 1, 2 및 3 fHbp의 fHbp 서열의 정렬을 보여준다. fHbp ID 28 (변이체 3) 또는 fHbp ID 79(변이체 3)에서 아미노산 위치 230번은 fHbp ID 1의 아미노산 위치 223번에 상응함을 주지한다. v. 2 fHbp(예를 들어, fHbp ID 22)를 참조로, 상기 아미노산 위치는 222번이다. H223은 화살표로 나타낸다. 상기 정렬은 웹사이트(European Bioinformatic Institute website)에서 가용한 ClustalW를 사용하여 수행하였다. 아미노산 동일성은 별표로 나타내고; 강한 유사성은 쉼표로 나타내고; 약한 유사성은 마침표로 나타내고; 유사성 부재는 빈공간으로 나타낸다.
본 발명의 기재는 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp(v.3 fHbp)로부터 유래된 비-천연적으로 발생하는 fHbp, 이를 포함하는 조성물 및 비-천연적으로 발생하는 fHbp 및 조성물의 사용 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp의 위치 223번에서 히스티딘이 아르기닌, 라이신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것을 포함하고, 여기서, 위치 223번의 넘버링은 성숙 fHbp ID 1의 넘버링을 기준으로 하고, 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp 보다 인간 인자 H(fH)에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는다.
fHbp ID 79 또는 fHbp ID 28의 서열으로 참조로 하여, 본원에 기재된 비-천연적으로 발생하는 fHbp에서 치환된 히스티딘은 위치 230번에 상응한다. 구체적으로, 돌연변이된 히스티딘은 v.3 fHbp의 아미노산 서열의 서열 TYHLA 내 H이다.
본원에 사용된 바와 같은 인간 인자 H("인간 fH")는 하기에 나타낸 아미노산 서열(서열번호 3)을 포함하는 단백질, 및 이의 천연적으로 발생하는 인간 대립형질 변이체를 언급한다.
Figure pct00002
천연적으로 발생하는 fHbp는 fH와 복합체화될 가능성이 높고 상기 결합된 fH는 숙주의 면역계로부터 기원하는 fHbp 상의 하나 이상의 에피토프를 차폐시킬 수 있다. 따라서, fH와 복합체화되고/되거나 결합된 fHbp는 상기와 같이 복합체화되지 않은 fHbp와 같이 효과적인 면역원일 수 없다. 역으로, fH에 대해 비교적 낮은 친화성을 갖는 fHbp는 면역원(예를 들어, 백신 조성물 중에)으로서 투여되는 경우 면역화된 숙주의 면역계에 에피토프를 제공할 수 있고 fH에 대해 높은 친화성을 갖는 fHbp는 그렇지 못하다. 본원에 기재된 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 인간 fH에 대해 낮은 친화성을 갖고 살균성 항체를 유발하고/하거나 엔. 메닌기티디스에 대해 보호 면역을 제공하는데 유용하다. 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 천연적으로 발견되지 않고 인간에 의해 제조되고/되거나 인간에 의해 의도적으로 변형된다. 비-천연적으로 발생하는 대상체 fHbp는 화학적 합성 또는 재조합 방법을 통해 제조될 수 있다. 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 이것이 유래된 천연적으로 발생하는 fHbp에 상대적으로 돌연변이를 포함한다. 이와 같이, 이는 비-천연적으로 발생하는 fHbp 아미노산 서열을 포함하는 본원의 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "낮은 친화성", "보다 낮은 친화성", 또는 "낮은 fH 결합제"는 v.3 fHbp(예를 들어, fHbp ID79)의 친화성보다 낮은 인간 fH에 대한 결합 친화성을 갖는 fHbp를 언급한다.
본원에 기재된 비-천연적으로 발생하는 fHbp 및 인간 fH의 결합 친화성은 인간 fH에 대해 야생형 v.3 fHbp의 결합 친화성의 85% 이하이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 인간 fH에 대한 비-천연적으로 발생하는 fHbp의 대상체의 결합 친화성은 인간 fH에 대한 야생형 fHbp의 결합 친화성의 약 85% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 65%, 약 65% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만이다. 하나의 예로서, 일부 양태에서, 인간 fH에 대한 비-천연적으로 발생하는 fHbp의 대상체의 결합 친화성은 인간 fH에 대한 v.3 fHbp의 결합 친화성의 약 85% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 65%, 약 65% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만이다.
결합 친화성은 해리 상수(KD) 측면에서 기재될 수 있다. 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp 및 인간 fH는 야생형 fHbp (예를 들어, v. 3 fHbps, 예를 들어,fHbp ID 79 또는 fHbp ID 28) 및 인간 fH의 적어도 약 80% 이상, 적어도 약 100% 이상, 적어도 약 120% 이상, 적어도 약 140% 이상, 적어도 약 160% 이상, 적어도 약 200% 이상의 KD인 해리 상수(KD; M)를 가질 수 있다. 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp의 KD는 또한 약 2X (2배), 약 3X, 약 5X, 약 10X, 약 15X, 약 20X, 약 50배 이상의 fHbp ID 79의 KD로서 기재될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp 및 인간 fH는 fHbp ID 79 및 인간 fH의 110% 또는 약 15X인 KD를 가질 수 있다.
상기 지적된 바와 같이, 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 v. 3 fHbp로부터 유래한다. 변이체 그룹 3(v.3)으로 분류되는 fHbp는 문헌[참조: Masignani et al (2003) J Exp Med 197:789-99 and Pajon R et al (2010) Vaccine 28:2122-9]에 기재되어 있다. 공지된 v.3 fHbps 및 GenBank 승인 번호의 목록은 문헌[참조: Beernink P.T. and Granoff D. M. (2009) Microbiology. 2009 Sep;155(Pt 9):2873-83]에 제공되어 있다. 표 1은 공급원 엔 . 메닌기티디스 균주, 캡슐 그룹 및 상응하는 모듈러 그룹, 펩타이드 ID, GenBank 승인 번호를 포함하는 예시적인 v.3 fHbp의 목록을 보여준다.
Figure pct00003
천연적으로 발생하는 v.3 fHbp의 일부 예의 아미노산 서열은 하기에 나타낸다. v.3 fHbp가 리더 서열을 포함하지만 하기에 나타낸 서열은 상기 리더 서열을 포함하지 않고 대신에 상기 제공된 fHbp ID 1 서열을 참조로 위치 1번에 상응하는 시스테인 잔기에서 개시한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
상기 지적된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 천연적으로 발생하는 v.3 Hbp로부터 유래할 수 있다. 예시적인 v. 3 fHbp는 상기 열거되어 있다. 천연적으로 발생하는 fHbp는 상이한 선조체로부터 유래된 가변 분절(α 및/또는 β)을 갖는다. 가변 분절로 인해, 상기 분자 구조는 모듈러인 것으로 나타났고 fHbp 변이체는 각각 α 또는 β 형으로 지정된 2개의 유전학적 계통 중 하나로부터 유래된, 5개의 가변 분절(A, B, C, D 및 E)의 상이한 조합에 따라 모듈러 그룹에서 서브분류될 수 있다(문헌참조: Pajon R et al. (2010) Vaccine 28:2122-9; Beernink PT, Granoff DM (2009) Microbiology 155:2873-83). I 내지 VI로 지정된 6개의 모듈러 그룹은 95% 초과의 모든 공지된 fHbp 변이체를 차지한다 (문헌참조: Pajon R et al. (2010) Vaccine 28:2122-9).
fHbp 모듈러 구조의 도식은 도 6에 제공된다. 242개의 독특한 아미노산 변이체의 계통발생 분석으로부터 추론된 9개의 fHbp 모듈러 그룹의 도식을 보여준다. 각각의 마시그나니(Masignani) 변이체 그룹 지정 및 각각의 fHbp 모듈러 그룹 내에서 관찰된 독특한 서열의 수를 보여준다. α 계통으로부터 유래된 가변 분절은 회색으로 도시하고 β 계통으로부터 유래된 것들은 백색으로 도시한다.
특정 양태에서, v. 3 fHbp는 모듈러 그룹 II fHbp일 수 있다. 그룹 II fHbp는 전반적으로 β형 분절(fHbp 가변 분절: Aβ, Bβ, Cβ, Dβ, 및 Eβ)로 구성된다. 예시적인 모듈러 그룹 II fHbp는 표 1에 제공된다.
특정 양태에서, v. 3 fHbp는 모듈러 그룹 V fHbp일 수 있다. 모듈러 그룹 V fHbp는 α 및 β 분절의 천연 키메라로 구성되고 지정된 선조체로부터의 하기의 fHbp 가변 분절: Aβ, Bβ, Cβ, Dα, 및 Eβ를 갖는다. 예시적인 모듈러 그룹 V fHbp는 표 1에 제공된다.
특정 양태에서, v. 3 fHbp는 모듈러 그룹 VIII fHbp일 수 있다. 모듈러 그룹 VIII fHbp는 α 및 β 분절로 구성되고 지정된 선조체로부터의 하기의 fHbp 가변 분절: Aβ, Bβ, Cβ, Dα, 및 Eβ를 갖는다. 예시적인 모듈러 그룹 VIII fHbp는 표 1에 제공된다.
특정 양태에서, v. 3 fHbp는 모듈러 그룹 IX fHbp일 수 있다. 모듈러 그룹 IX fHbp는 α 및 β 분절로 구성되고 지정된 선조체로부터 하기의 fHbp 가변 분절 Aβ, Bα, Cβ, Dα, 및 Eβ를 갖는다. 예시적인 모듈러 그룹 IX fHbp는 표 1에 제공된다.
특정 양태에서, 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp의 위치 223번에서 히스티딘이 아르기닌, 라이신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것을 포함하는 비-천연적으로 발생하는 fHbp는, 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 경우에, 상기 동일성은 2개 이상의 가변 분절 또는 전장의 성숙 단백질에서 분절(예를 들어, 모듈러 구조에서 정의된 바와 같은 가변 분절)내에 있을 수 있다.
대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 변이체 3 fHbp(예를 들어, fHbp ID 79)와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 경우에, 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 v.3 fHbp의 아미노산 서열과 1개 아미노산(aa)에서 25개 아미노산까지 상이하고, 예를 들어, v.3 fHbp의 아미노산 서열과 1 aa, 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 13 aa, 15 aa, 18 aa, 20 aa, 22 aa, 24 aa, 또는 25 aa로 상이하다. 따라서, 예를 들어, 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 대상체 fHbp가 유래된 v.3 fHbp에 상대적으로 최대 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 6개, 최대 8개, 최대 10개, 최대 12개, 최대 14개, 최대 16개, 최대 18개, 최대 25개 이상의 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 가질 수 있다. 하나 이상의 아미노산 변형은 변형되지 않은 fHbp와 비교하여 인간 fH에 대한 fHbp의 친화성을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp의 위치 223번에서 히스티딘이 아르기닌으로 대체된 것을 포함한다. 상기 지적된 바와 같이, v. 3 fHbp는 fHbp ID 46, fHbp ID 28, fHbp ID 76, fHbp ID 29, fHbp ID 99, fHbp ID 30, fHbp ID 64, fHbp ID 45, fHbp ID 47, fHbp ID 79, fHbp ID 84, fHbp ID 59, fHbp ID 82, fHbp ID 31, fHbp ID 85, fHbp ID 70, fHbp ID 72, fHbp ID 67, 또는 fHbp ID 175일 수있다.
예시적인 v.3 fHbp의 정렬은 표 5에 제공된다. H223의 위치가 또한 지적된다. 표준 서열인 fHbp ID 1이 또한 상기 정렬에 포함된다. 명백하게, fHbp ID 1은 위치 223번에 히스티딘을 갖지 않는다. 상기 정렬은 웹사이트(European Bioinformatic Institute website)에서 가용한 ClustalW를 사용하여 수행하였다. 아미노산 동일성은 별표로 나타내고; 강한 유사성은 쉼표로 나타내고; 약한 유사성은 마침표로 나타내고; 유사성 부재는 빈공간으로 나타낸다.
본원에 나타낸 바와 같이, v.3 fHbp로부터 유래되고 H223R 치환을 함유하는 fHbp는 천연적으로 발생하는 v.3 fHbp와 비교하여 인간 fH로의 결합을 감소시켰다. 따라서, 아르기닌 치환에 상대적으로 보존성인 아미노산 치환을 함유하는 비-천연적 fHbp는 또한 천연적으로 발생하는 v.3 fHbp와 비교하여 인간 fH로의 결합을 감소시킬 것으로 예상된다. 이와 같이, 본 발명은 아르기닌(R)과 비교하여 보존성 아미노산 치환을 고려하고, 예를 들어, 아미노산 치환 H223K가 또한 고려된다. 추가로, fH의 fHbp로의 결합에 대한 입체 장애를 제공하는 아미노산 치환이 또한 고려되고, 예시적인 아미노산 치환은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판과 같은 벌크 소수성 측쇄를 갖는 아미노산으로의 치환을 포함한다. 이와 같이, 아미노산 치환 H223F, H223Y, 및 H223W가 또한 고려된다.
일반적으로, 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 위치 223번에서 히스티딘의 알라닌으로의 치환을 포함하지 않는다.
대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp의 한가지 특징은 숙주(예를 들어, 마우스 또는 인간과 같은 포유동물)에게 투여되는 경우, 대상체의 fHbp는 이것이 유래된 v.3 fHbp(예를 들어, fHbp ID 79, 46, 28, 67, 175, 또는 59)에 의해 유발된 살균성 반응성에 상응하거나 이보다 높은 수준에서 살균성 반응을 유발할 수 있다. 살균성 반응의 수준을 측정하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 특정 경우에, 대상체 fHbp로 면역화된 마우스의 기하학적 평균 살균성 역가는 변이체 3 fHbp(예를 들어, fHbp ID 79)로 면역화된 마우스의 기하학적 평균 살균성 역가의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 150%, 적어도 약 175%, 적어도 약 200%, 또는 200% 이상이다. 일부 경우에, 대상체 fHbp로 면역화된 마우스의 기하학적 평균 살균성 역가는 변이체 3 fHbp(예를 들어, fHbp ID 79)로 면역화된 대조군 마우스의 기하학적 평균 살균성 역가보다 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배, 10배 이상 높다. 상기 대상체 fHbp는 변이체 3 fHbp(예를 들어, fHbp ID 79)에 의해 유발되는 것보다 유의적으로 낮은 살균 반응 유발하는 것들을 배제할 수 있다.
많은 경우에, 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 하나 이상의 나이세 리아 메닌기티디스 균주에 대한 살균 활성을 갖는 항체에 의해 결합된 형태적 에피토프를 유지하고 이를 제공한다. 따라서, 상기 fHbp 돌연변이체는 천연적으로 발생하는 v.3 fHbp에서 발견되는 에피토프를 유지할 수 있고, 천연적으로 발생하는 v.3 fHbp의 fH에 대한 결합 친화성과 비교하여 fH로의 감소된 결합을 나타낸다. 돌연변이체 fHbp가 살균성 항체를 유발하도록 fHbp의 형태에 최소로 또는 전혀 영향을 주지 않는 돌연변이체가 우수한 백신 후보물로서 고려된다. 돌연변이체가 fHbp의 형태에 대해 효과를 갖는지는 JAR 31, JAR 33, 또는 JAR 11 항체의 결합을 포함하는 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 JAR 31, JAR 33, 또는 JAR 11 항체에 결합할 수 있다.
본 발명의 fHbp는 하기에서 보다 상세하게 기재된 추가의 특징을 가질 수 있다.
키메라 fHbps
본 발명의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 키메라 fHbp일 수 있다. 본 발명의 키메라 fHbp는 변이체 그룹 1 또는 2(v.1 또는 v.2 fHbp) 기원의 fHbp의 N-말단 도메인(fHbpN)을 갖는 것으로서 기재될 수 있지만 C-말단 도메인(fHbpC)은 v.3 fHbp(예를 들어, fHbp ID 79)로부터 기원할 수 있고 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp의 위치 223번에서 히스티딘이 아르기닌, 라이신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 키메라 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 변이체 그룹 1 기원의 fHbp(예를 들어, fHbp ID 1) 의 fHbpN 도메인 및 v.3 fHbp (예를 들어, fHbp ID 28)로부터 유래된 fHbp C 도메인을 가질 수 있고, 상기 키메라의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp의 위치 223번에서 히스티딘이 아르기닌, 라이신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 상기 키메라 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 변이체 그룹 1 fHbp(예를 들어, fHbp ID 1)로부터 유래된 fHbpN 도메인 및 v.3 fHbp (예를 들어, fHbp ID 79)로부터 유래된 fHbp C 도메인을 가질 수 있고, 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp의 위치 223번에서 히스티딘이 아르기닌, 라이신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것을 포함한다. 특정 경우에, 상기 fHbpN 도메인은 천연적으로 발생하는 v.1 fHbp의 위치 41번에서 아르기닌의 치환을 가질 수 있다. 특정 경우에, 상기 치환은 R41S일 수 있다.
"fHbpN"은 약 8번 위치 잔기에서 개시하고 약 136번 위치 잔기에서 종료되는 연속적 아미노산 서열을 언급한다. "fHbpC"는 약 141번 위치 잔기에서 개시하여 약 255번 위치 잔기에서 종료되는 연속성 아미노산 서열을 언급한다. fHbpN과 fHbpC 사이에 삽입된 서열은 2개 도메인 사이의 링커이다.
H223R, H223W, H223F, H223Y 또는 H223K 치환을 포함하도록 변형될 수 있는 예시적인 키메라 fHbp는 문헌[참조: Beernink et al. (2008) Infec. Immun. 76:2568-2575 및 WO 2009/114485, 이의 기재는 참조로서 본원에 인용된다]에 기재된 것들과 같이 임의의 공지된 인공 키메라일 수 있다. 상기 치환을 함유하는 키메라는 상응하는 키메라 fHbp에 비해 인간 fH에 대해 감소된 친화성을 갖고, 상응하는 키메라 fHbp에서 발견되는 것들과 같이 살균 반응을 유발하기에 중요한 에피토프를 여전히 유지한다. 변형된 키메라에 유지될 수 있는 fHbp 에피토프는 문헌[참조: WO 2009/114485, 이의 기재는 본원에 참조로서 인용된다]에 기재된 것들과 같이 상응하는 키메라 fHbp에서 발견되는 것들을 포함한다. 예를 들어, 변형된 키메라 fHbp는 변이체 1 fHbp를 함유하는 균주에 대해 살균 항체 반응을 유발하기 위해 중요한 에피토프(예를 들어, mAb JAR 4 및/또는 JAR5에 의해 정의된 것들과 같이 N-말단 도메인에서의 에피토프) 및/또는 변이체 2 및/또는 3 fHbp를 함유하는 균주에 대해 살균 항체 반응을 유발하기 위해 중요한 에피토프(예를 들어, mAb JAR 10, JAR 11, JAR 13, 및/또는 JAR 36)에 의해 정의된 에피토프)를 함유할 수 있다.
예시적인 키메라는 하기에 나타낸다:
키메라 1/79
cssggggvaadigagladaltapldhkdkglqsltldqsvrkneklklaaqgaektygngdslntgklkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqvykqshsaltafqteqiqdsehsgkmvakrqfrigdiaGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTY H LALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(서열번호 23). 상기 소문자는 fHbp ID 1로부터 기원하는 아미노산 서열에 상응하고, 대문자는 fHbp ID 79로부터 유래된 아미노산에 상응한다. fHbp ID 79에서 H223에 상응하는 위치는 볼드체이고 밑줄쳐져 있다. 따라서, 본 발명의 키메라 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 H223의 H223R, H223W, H223F, H223Y, 또는 H223K로의 치환을 갖는 키메라 1/79의 서열을 포함할 수 있다.
키메라 1(R41S)/79
cssggggvaadigagladaltapldhkdkglqsltldqsv s kneklklaaqgaektygngdslntgklkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqvykqshsaltafqteqiqdsehsgkmvakrqfrigdiaGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTY H LALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(서열번호 24). 상기 소문자는 fHbp D1로부터 유래된 아미노산 서열에 상응하고, 대문자는 fHbp ID 79로부터 기원하는 아미노산에 상응한다. 위치 41번은 R의 세린으로의 치환을 포함한다. fHbp ID 79에서 H223에 상응하는 위치는 볼드체이고 밑줄쳐져 있다. 따라서, 본 발명의 상기 키메라 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 H223의 H223R, H223W, H223F, H223Y 또는 H223K로의 치환을 갖는 키메라 1(R41S)/79의 서열을 포함할 수 있다.
일반적으로, 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 위치 223번에서 히스티딘의 알라닌으로의 치환을 포함하지 않는다.
대상체의 비-천연적으로 발생하는 키메라 fHbp는 변이체 3 fHbp(예를 들어, fHbp ID 79)와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 동일성은 v.3 fHbp, 및 v.3 fHbp의 상응하는 영역으로부터 기원하는 대상체의 키메라 fHbp의 영역내에 있을 수 있다. 예를 들어, fHbp C 도메인이 v.3 fHbp로부터 유래된 키메라 단백질에서, 상기 동일성은 fHbp C 도메인에 있을 수 있다.
대상체의 키메라 비-천연적으로 발생하는 fHbp의 한가지 특징은 숙주(예를 들어, 마우스 또는 인간과 같은 포유동물)에 투여되는 경우, 대상체 fHbp가 키메라가 유래된 변이체 그룹 fHbp(예를 들어, fHbp ID 1 및 fHbp ID 79)에 의해 유발된 살균성 반응 이상의 수준에서 살균 반응을 유발할 수 있다는 것이다.
살균성 반응의 수준을 결정하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 특정 경우에, 대상체의 키메라 fHbp로 면역화된 마우스의 기하학적 평균 살균성 역가는 fHbp ID 1 또는 fHbp ID 79로 면역화된 마우스의 기하학적 평균 살균 역가의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 150%, 적어도 약 175%, 적어도 약 200%, 또는 200% 이상이다. 일부 경우에, 대상체의 fHbp로 면역화된 마우스의 기하학적 평균 살균 역가는 fHbp ID 1 또는 fHbp ID 79로 면역화된 대조군 마우스의 기하학적 평균 살균 역가보다 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배, 또는 10배 이상이다.
대상체의 fHbp는 fHbp ID 1 또는 fHbp ID 79에 의해 유발된 것보다 훨씬 낮은 살균성 반응을 유발하는 것들을 배제할 수 있다.
많은 경우에, 대상체의 비-천연적으로 발생하는 키메라 fHbp는 나이세리아 메닌기티디스 균주에 대한 살균 활성을 갖는 살균 항체에 의해 결합된 형태적 에피토프를 유지하고 제공한다. 따라서, 상기 fHbp 돌연변이체는 천연적으로 발생하는 fHbp에서 발견되는 에피토프를 유지할 수 있고, 천연적으로 발생하는 fHbp의 fH에 대한 결합 친화성과 비교하여 fH에 대해 감소된 결합을 나타낸다. 키메라 fHbp가 살균성 항체를 유발하도록 fHbp의 형태에 대해 최소의 효과 또는 어떠한 효과를 갖지 않는 본 발명의 비-천연적으로 발생하는 키메라 fHbp는 우수한 백신 후보물로 고려된다. fHbp의 형태에 대한 효과를 갖는 변이체가 JAR 4, JAR 5, JAR 31, JAR 33, 또는 JAR 11과 같은 항체의 결합을 포함하는 다양한 방식으로 결정될 수 있다.
본 발명의 fHbp는 하기에서 보다 상세하게 기재된 추가의 특징을 가질 수 있다.
접합체
본원 발명의 대상체의 fHbp는 폴리펩타이드(예를 들어, 대상체의 fHbp에 이종성 아미노산 서열을 갖는)와 같은 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가의 요소 및/또는 담체 분자를 함유할 수 있다. 상기 추가의 이종성 아미노산 서열은 예를 들어, 살균성 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이)에서 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 또는 이의 유도체(예를 들어, 피로글루타메이트)를 제공하고/하거나 이의 N-말단 또는 C-말단에서 융합 파트너를 갖는 키메라 폴리펩타이드를 제공하도록 융합될 수 있다. 목적하는 융합 파트너는 예를 들어, 글루타티온 -S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), His6-태그 등, 및 다른 단백질, 특히 지질단백질로부터의 리더 펩타이드를 포함한다. 융합 파트너는 예를 들어, 대상체의 fHbp의 단리, 정제, 검출, 면역원성을 촉진시키는데 있어서 추가의 특징을 제공할 수 있다.
대상체의 fHbp에 연결될 수 있는 다른 요소들은 담체 분자(예를 들어, 담체 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH))를 포함한다. 추가의 요소들은 링커, 예를 들어, 유연성 링커를 통해 펩타이드에 연결될 수 있다. 담체는 면역 반응을 직간접적으로 변형시키는 분자인 면역조절제를 포함한다. 특정 부류의 면역조절제는 면역학적 반응을 자극하거나 이의 자극을 보조하는 것들을 포함한다. 실시예는 파상풍 톡소이드를 포함하는, 독소 또는 이의 유도체와 같은 항원들 및 항원 담체들을 포함한다. 엔. 메닌기티디스에 대해 백신 접종되거나 치료받은 대상체에서 투여를 촉진시키고/시키거나 면역원성을 증가시키는 다른 담체 분자가 또한 고려된다. 담체 분자는 또한 목적하는 세포 또는 조직으로의 전달을 촉진시킬 수 있다. 상기 추가의 잔기는 또한 면역원성을 원조하거나 백신에서 성분과 복합체의 형성을 원조할 수 있다. 상기 담체 분자는 막 표면(예를 들어, 소포체 백신) 상에 에피토프의 디스플레이를 촉진시키는 스캐폴드 단백질로서 작용할 수 있다.
하나의 예에서, 대상체의 fHbp는 지방산(예를 들어, 지방 카복실산 그룹)을 포함하도록 N- 및/또는 C-말단에서 변형된다. 상기 지방산은 유연성 링커를 통해 fHbp에 공유적으로 연결될 수 있다. 대상체의 fHbp의 말단(예를 들어, N-말단에서 N-말단 종점)을 변형시키기 위해 사용될 수 있는 지방산의 예는 라우르산이다. 라우르산이 또 다른 분자에 공유적으로 연결되는 경우 라우로일 그룹(예를 들어, 라우로일 설페이트)로서 언급된다. 라우르산은 10개의 메틸렌 그룹과 함께 화학식 CH3-(CH2)10-COOH로 나타나는 12개의 탄소 원자를 함유한다. 대상체의 펩타이드에 연결될 수 있는 다른 지방산은 카프릴산(10 C), 미리스트산(14 C), 및 팔미트산(16 C)을 포함한다. 세부 사항에 대해서는 문헌[Westerink MA et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4021-4025]을 참조한다. 대상체의 fHbp를 세균 외막에 부착시키는 작용을 할 수 있는 임의의 소수성 잔기가 본원에서 본 발명의 fHbp의 N-말단 및/또는 C-말단 종점(예를 들어, N-말단에서)으로의 접합을 위해 고려되고, 여기서, 상기 소수성 잔기는 본원에 기재된 바와 같이 링커, 예를 들어, 유연성 링커를 통해 펩타이드에 임의로 접합될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 소수성 펜타펩타이드 FLLAV(서열번호 25)는 문헌[참조: Lowell GH et al. (1988) J. Exp. Med. 167:658-63]에 기재되어 있다.
상기 지적된 바와 같이, 상기된 다른 추가의 요소들 뿐만 아니라 지방산이 fHbp에 연결되는 한가지 방식은 링커(예를 들어, 라우로일-Gly-Gly)를 통해서이다. 본 발명의 fHbp를 변형시키는데 사용하기 위해 적합한 링커는 "유연성 링커"를 포함한다. 적합한 링커는 용이하게 선택될 수 있고 1개 아미노산(예를 들어, Gly)로부터 20개의 아미노산, 2개의 아미노산에서 15개의 아미노산, 3개의 아미노산에서 12개의 아미노산과 같은 임의의 적합한 상이한 길이를 가질 수 있고, 4개의 아미노산에서 10개의 아미노산, 5개의 아미노산에서 9개의 아미노산, 6개의 아미노산에서 8개의 아미노산 또는 7개의 아미노산에서 8개의 아미노산을 포함하고 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산일 수 있다.
유연성 링커의 예는 글라이신 중합체(G)n, 글라이신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, GSGGSn 및 GGGSn을 포함하고, 여기서, n은 적어도 1의 정수이다), 글라이신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 공지된 다른 유연성 링커를 포함한다. 글라이신 및 글라이신-세린 중합체는 이들 아미노산 둘다가 통상적으로 구조를 형성하지 않고 따라서 성분 간에 중성 매듭으로서 작용할 수 있기 때문에 흥미롭다. 글라이신 중합체는 글라이신이 심지어 알라닌보다 유의적으로 라마찬드란 (또는 phi-psi) 공간에 근접하고 보다 긴 측쇄를 갖는 잔기들보다 훨씬 덜 제한되기 때문에 특히 흥미롭다(문헌참조: Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). 예시적인 유연성 링커는 GGSG(서열번호 26), GGSGG(서열번호 2), GSGSG (서열번호 28), GSGGG(서열번호 29), GGGSG(서열번호 30), GSSSG(서열번호 31) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 통상의 기술자는 상기된 임의의 요소들에 접합된 fHbp의 디자인이 모두 또는 부분적으로 유연하여 링커가 덜 유연한 구조를 부여하는 하나 이상의 부분 뿐만 아니라 유연성 링커를 포함할 수 있도록 하는 링커를 포함할 수 있는 것으로 인지할 것이다.
원산 fHbp는 일반적으로 지질 잔기가 공유적으로 부착될 수 있는 N-말단 시스테인을 함유한다. 상기 시스테인 잔기는 일반적으로 천연적으로 발생하는 단백질에서 지질화되고 본원에 기재된 대상체의 fHbp에서 지질화될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 아미노산 서열에서, 상기 위치에서 "시스테인" 또는 "C"에 대한 언급은 구체적으로 지질화된(예를 들어, 번역후 변형으로 인해) 시스테인 뿐만 아니라 비변형된 시스테인 둘다에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 상기 대상체의 fHbp는 지질화되거나 비-지질화될 수 있다. 시험관내 (문헌참조: 예를 들어, Andersson et al. (2001) J. Immunological Methods 255:135-48) 또는 생체내 지질화된 단백질의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 지질화된 fHbp는 이전에 세제 추출에 의해 이. 콜라이 단백질의 막 분획물로부터 정제되었고(문헌참조: Fletcher et al. (2004) Infection and Immunity 72:2088-100), 이러한 방법은 지질화된 fHbp의 생성을 위해 적용될 수 있다. 지질화된 단백질은 가용성 단백질보다 면역원성일 수 있기 때문에 흥미로울 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Fletcher et al. (2004) Infection and Immunity 72:2088-100).
이종성 fHbp를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 목적하는 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이, 엔. 메닌기티디스, 인간 (DNA 기반 백산의 경우에서와 같이) 등)에서 발현을 촉진시키는 코돈 용법을 최적화하도록 변형될 수 있는 것으로 인지된다. 코돈 최적화된 서열의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
fHbp를 암호화하는 핵산
본 발명은 대상체의 fHbp를 암호화하는 핵산을 제공한다. 대상체의 핵산은 일부 양태에서 재조합 발현 작제물에 존재한다. 대상체의 핵산을 포함하는 유전학적으로 변형된 숙주 세포가 또한 제공된다.
본 발명의 fHbp 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 핵산은 임의의 적합한 엔. 메닌기티디스 균주로부터 유래할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 엔. 메닌기티디스 균주는 상이한 표면 항원과 상호작용하는 폴리클로날(문헌참조: Frasch, C. E. and Chapman, 1973, J. Infect. Dis. 127: 149-154) 또는 모노클로날 항체와의 반응을 기준으로 혈청학적 그룹(캡슐 그룹), 혈청형(PorB 표현형) 및 서브타입(PorA 표현형)으로 분류된다. 캡슐 분류는 통상적으로 캡슐 폴리사카라이드에서 면역학적으로 검출가능한 변형을 기준으로 하지만 PCR에 의해 구조적으로 상이한 캡슐 폴리사카라이드의 생합성에 관여하는 특이적 효소를 암호화하는 유전자로 대체된다. 약 12개의 캡슐 그룹(A, B, C, X, Y, Z, 29-E, 및 W-135를 포함하는)이 공지되어 있다. 캡슐 그룹 A, B, C, Y 및 W-135의 균주는 거의 모든 뇌척수막염 질환에 관여한다. 혈청형 분류는 통상적으로 포린 B(PorB)로 호칭되는 외막 단백질에서 모노클로날 항체 한정된 항원성 차이를 기반으로 한다. 약 21개의 혈청형을 한정하는 항체는 현재 공지되어 있다(문헌참조: Sacchi et al., 1998, Clin. Diag. Lab. Immunol. 5:348). 혈청형 아분류는 포린 A(PorA)로 호칭되는 외막 단백질에 대한 항체 한정된 항원 변형을 기준으로 하였다. 혈청형 분류 및 혈청형아분류 둘다는 각각 mAb 반응성과 관련된 PorB 및 PorA의 가변 영역을 암호화하는 유전자의 동정을 위한 PCR 및/또는 DNA 서열분석에 의해 대체된다(예를 들어, Sacchi, Lemos et al., supra; Urwin et al., 1998, Epidem. and Infect. 120:257).
임의의 캡슐 그룹의 엔. 메닌기티디스 균주가 사용될 수 있지만, 캡슐 그룹 B의 엔. 메닌기티디스 균주는 fHbp 및 이의 도메인을 암호화하는 핵산이 유래된 공급원일 수 있다.
본원에 고려된 대상체의 fHbp의 작제에 사용하기 위한 fHbp 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 당업계에 공지되어 있다. 다양한 fHbp 및 이들의 서열은 웹사이트(neisseria.org 및 pubmlst.org/neisseria/fHbp websites)에서 가용하다. fHbp 폴리펩타이드의 예는 또한 예를 들어, 문헌[참조: 미국 특허원 번호 제61/174,424호, PCT 출원 번호 제PCT/US09/36577호, WO 2004/048404; Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-799; Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100; Welsch et al. J Immunol 2004 172:5606-5615; and WO 99/57280]에 기재되어 있다. fHbp 변이체에 대한 핵산 (및 아미노산) 서열은 또한 GenBank에 제공된다.
본원에 기재된 대상체의 fHbp에 사용하기 위해 고려되는 관련된 아미노산 서열을 동정하기 위해, 비성숙 fHbp가 약 19개 잔기의 리더 서열을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 추가로, 아미노산 서열이 제공되는 경우, 통상의 기술자는 예를 들어, 상기 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고 이의 발현을 위해 제공하는 핵산의 서열을 용이하게 고려할 수 있다.
본원에 제공된 특이적 아미노산 서열 및 핵산 서열 뿐만 아니라, 본원 발명은 또한 아미노산 및 핵산의 상기 예와 서열에서 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 핵산을 고려한다. 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 2개 이상의 아미노산 서열과 관련된 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 지정된 영역, 예를 들어, VE 또는 길이가 적어도 약 40, 45, 50, 55, 60, 65개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드에 대한 최대 상응성에 대해 비교되거나 정렬되는 경우 동일하고(예를 들어, 특정 영역에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한) 전장의 표준 아미노산 또는 뉴클레와이드 서열(예를 들어, 전장 fHbp)까지 일 수 있는, 동일하거나 특정 %의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 언급한다. 본원 발명은 구체적으로, 천연적으로 발생하는 다형태 및 합성적으로 제조된 아미노산 서열 둘다 및 이들의 암호화 핵산을 고려한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 표준 서열(예를 들어, 천연적으로 발생하는 fHbp 폴리펩타이드 서열 또는 이의 분절)로서 작용한다. 서열 비교 알고리듬을 사용하는 경우, 시험 및 표준 서열은 컴퓨터 프로그램에 입력하고 필요한 경우 서열 좌표를 지정하고 서열 알고리듬 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서 상기 서열 비교 알고리듬은 지정된 프로그램 파라미터를 기준으로 표준 서열에 대한 시험 서열(들)에 대한 % 서열 동일성을 계산한다.
% 서열 동일성을 결정하기 위해 적합한 알고리듬의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬이고 이들 각각은 문헌[참조: Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 and Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 기관[National Center for Biotechnology Information]을 통해 대중에게 가용하다. 추가의 예시적인 알고리듬은 ClustalW를 포함한다 (문헌참조: Higgins D., et al. (1994) Nucleic Acids Res 22: 4673-4680).
동일하지 않은 일부 잔기 위치들은 보존성 아미노산 치환 만큼 차이가 있다. 보존성 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 상호교환능을 언급한다. 예를 들어, 지방 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 산성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파르테이트 및 글루타메이트이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다.
2개 핵산 간의 서열 동일성은 또한 엄중 조건하에서 서로에 대해 2개의 분자의 하이브리드화 관점에서 기재될 수 있다. 상기 하이브리드화 조건은 당업계의 하기 표준 방법에 따라 선택된다(문헌참조: 예를 들어, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). 엄중 하이브리드화 조건의 예는 50℃ 이상에서 및 0.1 x SSC(15 mM 염화나트륨/1.5 mM 나트륨 시트레이트)에서 하이브리드화이다. 엄중 하이브리드화 조건의 또 다른 예는 용액중 42℃에서 밤새 항온처리이다: 50 % 포름알데하이드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH7.6), 5 x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 mg/ml의 변성되고 전단된 연어 정액 DNA에 이어서 약 65℃에서 0.1 x SSC에서의 여과물의 세척. 엄중 하이브리드화 조건은 상기 대표적인 조건과 같이 적어도 엄중한 하이브리드화 조건이고, 여기서, 조건은 이들이 상기 특정 엄중 조건과 적어도 약 80% 엄중하고, 전형적으로 적어도 90% 엄중한 경우에 적어도 엄중한 것으로 고려된다.
제조 방법
본 발명의 fHbp는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있고 이는 재조합 및 비-재조합 방법(예를 들어, 화학적 합성)을 포함한다. 대상체의 fHbp가 재조합 기술을 사용하여 제조되는 경우, 상기 방법은 임의의 적합한 작제물 및 임의의 적합한 숙주 세포를 포함할 수 있고, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포, 일반적으로 세균 또는 효모 숙주 세포, 보다 일반적으로 세균 세포일 수 있다. 유전학적 물질의 숙주 세포로의 도입을 위한 방법은 예를 들어, 형질전환, 전기천공, 접합, 인산칼슘 방법 등을 포함한다. 전달 방법은 도입된 fHbp-암호화 핵산의 안정한 발현을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 상기 fHbp-암호화 핵산은 유전성 에피좀 요소(예를 들어, 플라스미드)로서 제공되거나 게놈에 통합될 수 있다.
fHbp-암호화 핵산을 전달하기 위해 적합한 벡터는 조성에 있어서 다양할 수 있다. 통합 벡터는 조건적으로 복제하거나 자살 플라스미드, 박테리오파아지 등일 수 있다. 상기 작제물은 다양한 요소들을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어, 프로모터, 선택가능한 유전학적 마커(예를 들어, 항생제(예를 들어, 가나마이신, 에리트로마이신, 클로르암페니콜 또는 겐타마이신)에 대한 내성을 부여하는 유전자들), 복제 오리진(숙주 세포, 예를 들어, 세균 숙주 세포에서 복제를 촉진시키기 위해) 등을 포함한다. 벡터의 선택은 증식이 요망되는 세포의 유형 및 증식 목적과 같은 다양한 인자들에 따라 다양하다. 특정 벡터는 대량의 목적하는 DNA 서열을 증폭하고 제조하기 위해 유용하다. 다른 벡터는 배양 중에 세포에서 발현하기 위해 적합하다. 여전히 다른 벡터는 전체 동물에서 세포에서 전달 및 발현을 위해 적합하다. 적당한 벡터의 선택은 당업자의 기술 범위내에 있다. 많은 이러한 벡터들이 시판되고 있다.
하나의 예에서, 벡터는 선택가능한 약물 내성 마커 및 상이한 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이 및 엔. 메닌기티디스 둘다에서)에서 자가 복제를 제공하는 요소들을 함유하는 에피좀 플라스미드를 기반으로 하는 발현 벡터이다. 상기 "셔틀 벡터"의 한 예는 플라스미드 pFP10이다(문헌참조: Pagotto et al. (2000) Gene 244:13-19).
작제물은 예를 들어, 전형적으로 벡터에서 절단된 제한 효소 부위로의 DNA 리가제 부착을 수단으로 목적하는 폴리뉴클레오타이드를 작제물 골격에 삽입함에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 목적하는 뉴클레오타이드 서열은 상동성 재조합 또는 부위-특이적 재조합에 의해 삽입될 수 있다. 전형적으로, 상동성 재조합은 상동성 영역을 목적하는 뉴클레오타이드 서열의 플랭크상에 벡터에 부착시킴에 의해 성취될 수 있고, 부위-특이적 재조합은 부위-특이적 재조합(예를 들어, cre-lox, att 부위 등)을 촉진시키는 서열의 사용을 통해 성취될 수 있다. 상기 서열을 함유하는 핵산은 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 연결 또는 상동성 영역 및 목적하는 뉴클레오타이드 서열 부분 둘다를 포함하는 프라이머를 사용하는 폴리머라제 쇄 반응에 의해 부가될 수 있다.
벡터는 숙주 세포에서 염색체외 유지를 제공하거나 숙주 세포 게놈으로의 통합을 제공할 수 있다. 벡터는 당업자에게 널리 공지된 다수의 공개 문헌에 기재되어 있고 상기 문헌은 예를 들어, Short Protocols in Molecular Biology, (1999) F. Ausubel, et al., eds., Wiley & Sons을 포함한다. 벡터는 대상체의 fHbp를 암호화하는 핵산의 발현을 제공할 수 있고 대상체의 핵산을 증폭시킬 수 있거나 둘다를 제공할 수 있다.
사용될 수 있는 벡터의 예는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로부터 유래된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 및 M13 mp 계열의 벡터와 같은 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. pET21은 또한 사용될 수 있는 발현 벡터이다. 박테리오파아지 벡터는 λgt10, λgt11, λgt18-23, λZAP/R 및 EMBL 계열의 박테리오파아지 벡터를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 추가의 벡터는 pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 및 카로미드 9 계열의 벡터들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
대상체의 fHbp의 발현을 위해, 발현 카세트가 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터는 전사 및 번역 조절 서열을 제공하고 유도성 또는 항상성 발현을 제공할 수 있고, 여기서, 상기 암호화 영역은 전사 개시 영역, 및 전사 및 번역 종결 영역의 전사 조절하에 작동적으로 연결된다. 이들 조절 영역은 대상체의 fHbp가 유래된 fHbp에 고유한(native) 것이거나 외인성 공급원으로부터 기원한 것일 수 있다. 일반적으로, 상기 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종료 서열, 번역 개시 및 종료 서열, 및 인핸서 또는 액티베이터 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 프로모터는 항상성이거나 유도성일 수 있고 강한 항상성 프로모터(예를 들어, T7 등)일 수 있다.
발현 벡터는 일반적으로, 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 근처에 위치된 간편한 제한 부위를 갖는다. 발현 숙주에서 작동하는 선택가능한 마커는 벡터를 함유하는 세포의 선택을 촉진시키기 위해 존재할 수 있다. 또한, 상기 발현 작제물은 추가의 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는 1개 또는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있고, 이것이 유기체, 예를 들어, 발현을 위한 포유동물 또는 곤충 세포, 및 클로닝 및 중폭을 위한 원핵 숙주에 유지되도록 한다. 추가로, 발현 작제물은 형질전환된 숙주 세포의 선택을 가능하기 위해 선택가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 선택 유전자는 당업자에게 널리 공지되어 있고 사용되는 숙주 세포에 따라 다양하다.
본 발명의 fHbp는 검출가능한 표지, 예를 들어, 방사능 표지, 형광성 표지, 비오틴 표지, 면역학적으로 검출가능한 표지(예를 들어, HA 태그, 폴리-히스티딘 태그) 등과 같은 추가의 요소들을 포함할 수 있는 것으로 주지되어야 한다. fHbp의 추가의 요소들은 다양한 방법(예를 들어, 친화성 포획 등)을 통한 단리(예를 들어, 비오틴 태그, 면역학적으로 검출가능한 태그)를 촉진시키기 위해 제공될 수 있다. 대상체의 fHbp는 임의로 공유 또는 비-공유 부착을 통해 지지체 상에 고정화시킬 수 있다.
fHbp의 단리 및 정제는 당업계에 공지된 방법에 따라 성취될 수 있다. 예를 들어, fHbp는 일반적으로 샘플을 항-fHbp 항체(예를 들어, 항-fHbp mAb, 예를 들어, 당업계에 공지된 JAR 5 MAb 또는 다른 적당한 JAR MAb)와 접촉시키고, 세척하여 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하고 특이적으로 결합된 fHbp를 용출시킴을 포함하는 면역친화성 정제에 의해 fHbp를 발현하도록 유전학적으로 변형된 세포의 용해물 또는 합성 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 단리된 fHbp는 투석 및 단백질 정제 방법에 통상적으로 사용되는 다른 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다. 하나의 예에서, fHbp는 금속 킬레이트 크로마토그래피 방법을 사용하여 단리될 수 있다.
숙주 세포
임의의 다수의 적합한 숙주 세포가 fHbp의 제조에 사용될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 상기 fHbp는 통상적인 기술에 따라 원핵 세포 또는 진핵 세포, 일반적으로 세균, 보다 일반적으로 이. 콜라이 또는 나이세리아(예를 들어, 엔. 메닌기티디스)에서 발현될 수 있다. 따라서, 본원 발명은 추가로 대상체의 fHbp를 암호화하는 핵산을 함유하는 유전학적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 대상체의 fHbp의 제조(대량 제조를 포함하는)를 위한 숙주 세포는 임의의 다양한 가용한 숙주 세포로부터 선택될 수 있다. 발현을 위한 숙주 세포의 예는 원핵 또는 진핵 단일 세포 유기체, 예를 들어, 세균(예를 들어, 에스케리치아 콜라이 균주), 효모(예를 들어, 에스 . 세레비지애(S.　 cerevisiae ), 피키아 종(Pichia spp.), 등)을 포함하고, 본래에 곤충, 척추동물, 특히, 포유동물(예를 들어, CHO, HEK 등)과 같은 고등 유기체로부터 유래된 숙주 세포를 포함할 수 있다. 일반적으로, 세균 숙주 세포 및 효모가 특히 대상체의 fHbp 생성을 위한 관심 대상이다.
대상체 fHbp는 실질적으로 순수하거나 실질적으로 단리된 형태(즉, 다른 나이세리아 또는 숙주 세포 폴리펩타이드가 실질적으로 없는) 또는 실질적으로 단리된 형태로 제조될 수 있다. 상기 대상체 fHbp는 존재할 수 있는 다른 성분(예를 들어, 다른 폴리펩타이드 또는 다른 숙주 세포 성분)에 비해 폴리펩타이드가 풍부한 조성물에 존재할 수 있다. 정제된 대상체 fHbp는 폴리펩타이드가 다른 발현된 폴리펩타이드가 없는 조성물에 존재하도록 제공될 수 있고, 예를 들어, 조성물의 90% 미만, 일반적으로 60% 미만, 및 보다 일반적으로 50% 미만이 다른 발현된 폴리펩타이드로 구성된다.
소포체 제조를 위한 숙주 세포
대상체 fHbp가 막 소포체 중에 제공되어야만 하는 경우(하기에 보다 상세하게 논의된 바와 같이), 나이세리아 숙주 세포는 대상체 fHbp를 발현하도록 유전학적으로 변형된다. 임의의 다양한 나이세리아 종 균주는 대상체 fHbp를 생성하도록 변형되고 임의로 PorA와 같은 목적하는 다른 항원들을 생성하거나 생성하도록 변형될 수 있는 균주가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다.
나이세리아 균주의 유전학적 변형 및 목적하는 폴리펩타이드의 발현을 제공하는 방법 및 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 벡터 및 방법의 예는 문헌[참조: WO 02/09746 and O'Dwyer et al. (2004) Infect Immun 72:6511-80]에서 찾을 수 있다. 강한 프로모터, 특히 항상성으로 강한 프로모터는 특정 관심 대상이다. 프로모터의 예는 porA, porB, lbpB, tbpB, p110, hpuAB, lgtF, opa, p110, lst, hpuAB, 및 rmp의 프로모터를 포함한다. 특정 양태에서, 나이세리아 균주는 본원에 기재된 비-천연적으로 발생하는 fHbp의 충분히 높은 수준의 생성을 제공하기 위한 재조합 기술에 의해 변형된다. 상기 변형된 균주는 일반적으로 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 발현하도록 유전학적으로 변형되지 않은 모 세포에서 fHbp 생성에 비해 1.5, 2, 2,5 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6,5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10배 이상인 발현 수준의 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 제공하도록 제조된다. 특정 양태에서, 모 세포는 내인성 fHbp를 녹아웃하고 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 과발현하도록 유전학적으로 변형될 수 있다.
병원성 나이세리아 종으로부터 유래된 병원성 나이세리아 종 또는 균주, 특히, 인간에 대해 병원성이거나 인간에 대해 병원성이거나 공생하는 균주로부터 유래된 균주는 특히 막 소포체 제조에 사용하기 위한 관심 대상이다. 나이세리아 종의 예는 엔. 메닌기티디스 , 엔. 플라베센스(N. flavescens), 엔. 고노로에아(N. gonorrhoeae), 엔. 락타미카(N. lactamica), 엔. 폴리사카레아(N. polysaccharea), 엔. 시네레아(N. cinerea), 엔. 뮤코사(N. mucosa), 엔. 서브플라바(N. subflava), 엔. 시카(N. sicca), 엔. 엘론가타(N. elongate) 등을 포함한다.
엔. 메닌기티디스(N. meningitides) 균주는 특히 대상체 fHbp를 발현시키고 소포체 제조에 사용하기 위한 유전학적 변형을 위한 관심 대상이다. 소포체 제조를 위해 사용되는 균주는 요망될 수 있는 다수의 상이한 특징에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 균주는 요망되는 PorA 유형(상기된 바와 같은 "혈청아유형"), 캡슐 그룹, 혈청형 등; 감소된 캡슐 폴리사카라이드 제조 등에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 제조 균주는 임의의 목적하는 PorA 폴리펩타이드를 생성할 수 있고 하나 이상의 PorA 폴리펩타이드(천연적으로 또는 유전학적 가공으로 인해)를 발현할 수 있다. 균주의 예는 혈청아유형 분류에 사용되는 통상적인 혈청학적 시약과의 반응을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 PorA 폴리펩타이드의 변이체 뿐만 아니라 P1.7,16; P1.19,15; P1.7,1; P1.5,2; P1.22a,14; P1.14; P1.5,10; P1.7,4; P1.12,13의 혈청아유형을 부여하는 PorA 폴리펩타이드를 생성하는 것들을 포함한다. 또한, PorA 가변 영역(VR) 분류에 따라 특징화되는 PorA 폴리펩타이드가 또한 관심 대상이다(문헌참조: 예를 들어, Russell et al. (2004) Emerging Infect Dis 10:674-678; Sacchi CT et al. (1998) Clin Diagn Lab Immunol 5:845-55; Sacchi et al (2000) J. Infect Dis 182:1169-1176). 상당수의 독특한 VR 유형이 동정되었고 VR1 및 VR2 계열 "원형"으로 분류될 수 있다. 이전의 분류 계획에 대한 상기 명명법 및 이의 관계를 기재하는 웹-접근가능한 데이터베이스는 웹사이트(neisseria.org/nm/typing/pora)에서 발견된다. 특정 PorA VR1 및 VR2 유형의 정렬은 문헌[참조: Russell et al. (2004) Emerging Infect Dis 10:674-678]에 제공된다.
대안적으로 또는 추가로, 상기 생성 균주는 캡슐 결핍 균주일 수 있다. 캡슐 결핍 균주는 백신이 투여되는 대상체에서 상당한 자가항체 반응을 유발하는 감소된 위험을 제공하는(예를 들어, 숙주 세포 표면에 대한 시알산과 교차 반응하는 항체의 생성으로 인해) 소포체 기반 백신을 제공할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "캡슐 결핍" 또는 "캡슐 폴리사카라이드 결핍"은 천연적으로 발생하는 균주보다 낮거나 상기 균주가 유전학적으로 변형된 경우 캡슐 결핍 균주가 유래된 모 균주의 수준보다 낮은 세균 표면상에 캡슐 폴리사카라이드 수준을 언급한다. 캡슐 결핍 균주는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상까지 표면 캡슐 폴리사카라이드 생성이 감소된 균주를 포함하고 캡슐 폴리사카라이드가 세균 표면 상에 검출가능 하지 않은(예를 들어, 항-캡슐 폴리사카라이드 항체를 사용한 전세포 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)에 의해) 균주를 포함한다.
캡슐 결핍 균주는 천연적으로 발생하거나 재조합적으로 생성된 유전자 변형으로 인해 캡슐 결핍인 것들을 포함한다. 천연적으로 발생하는 캡슐 결핍 균주(문헌참조: 예를 들어, Dolan-Livengood et al. (2003) J. Infect. Dis. 187:1616-28), 및 캡슐 결핍 균주를 동정하고/하거나 생성시키는 방법(문헌참조: 예를 들어, Fisseha et al. (2005) Infect. Immun. 73:4070-4080; Stephens et al. (1991) Infect Immun 59:4097-102; Frosch et al. (1990) Mol Microbiol.4:1215-1218)은 당업계에 공지되어 있다.
캡슐 폴리사카라이드의 감소된 생성을 제공하는 나이세리아 숙주 세포의 변형은 캡슐 합성에 관여하는 하나 이상의 유전자의 변형을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 변형은 예를 들어, 변형 전에 모 세포와 비교하여 캡슐 폴리사카라이드의 감소된 수준을 제공한다. 상기 유전학적 변형은 균주의 캡슐이 결핍되게 하는(예를 들어, 하나 이상의 캡슐 생합성 유전자에서 하나 이상의 삽입, 결실, 치환 등으로 인해) 하나 이상의 캡슐 생합성 유전자에서 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열에서의 변화를 포함할 수 있다. 캡슐 결핍 균주는 하나 이상의 캡슐 유전자가 결핍이거나 비-기능성일 수 있다.
시알산 생합성이 결핍인 균주가 특정 관심 대상이다. 상기 균주는 인간 시알산 항원과 교차 반응하는 항-시알산 항체를 유발하는 감소된 위험을 갖는 소포체의 생성을 제공하고 추가로 개선된 제조 안정성을 제공할 수 있다. 시알산 생합성에서 결핍을 갖는 균주(천연적으로 발생하는 변형 또는 가공된 변형으로 인해)는 시알산 생합성 경로에서 임의의 다수의 상이한 유전자가 결핍일 수 있다. N-아세틸글루코사민 -6-포스페이트 2-에피머라제 유전자(synX AAF40537.1 또는 siaA AAA20475로서 공지된)에 의해 암호화된 유전 생성물이 결핍인 균주가 특정 관심 대상이고, 상기 유전자가 불활성화된 균주가 특정 관심 대상이다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 캡슐 결핍 균주는 기능성 synX 유전자 생성물의 생성을 붕괴시킴에 의해 제조된다(문헌참조: 예를 들어, Swartley et al. (1994) J Bacteriol. 176:1530-4).
캡슐-결핍 균주는 또한 감소된 수준의 캡슐 폴리사카라이드를 갖는 균주를 선택하기 위해 살균 항-캡슐 항체를 사용함으로써, 비-재조합 기술을 사용하여 천연적으로 발생하는 균주로부터 제조될 수 있다.
본원 발명이 2개 이상의 균주의 사용을 포함하는 경우(예를 들어, 상이한 균주로부터 대상체 fHbp-제공 소포체를 함유하는 항원성 조성물을 제조하기 위해), 상기 균주는 예를 들어, 사용되는 대상체 fHbp, PorA 등이 상이한 소포체를 제공하기 위해 하나 이상의 균주 특징을 상이하게 하기 위해 선택될 수 있다.
소포체의 제조
본원 발명에 의해 고려되는 항원성 조성물은 일반적으로 대상체 fHbp를 발현하는 나이세리아 세포로부터 제조된 소포체를 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, -소포체-는 미세소포체(또한 블레브로서 언급되는) 뿐만 아니라 외막 소포체를 포함함을 의미한다.
상기 항원성 조성물은 대상체 fHbp를 발현하도록 유전학적으로 변형된 나이세리아 메닌기티디스 종의 배양된 균주의 외막으로부터 제조된 외막 소포체(OMV)를 함유할 수 있다. OMV는 바람직하게 배양 배지로부터 세균 세포를 단리함에 의해(예를 들어, 세포 등을 펠렛화하는 여과에 의해 또는 저속 원심단리에 의해), 세포를 용해시킴에 의해(예를 들어, 세제의 첨가, 삼투압 쇼크, 초음파 처리, 공동현상, 균질화 등에 의해) 및 세포질막으로부터 외막 분획을 단리함에 의해(예를 들어, 여과에 의해 또는 차등 침전 또는 외막의 응집화 및/또는 외막 소포체에 의해 또는 외막 분자를 특이적으로 인지하는 리간드를 사용한 친화성 단리 방법에 의해 또는 외막 및/또는 외막 소포체 등을 펠렛화하는 고속 원심단리에 의해) 브로쓰 또는 고체 배지 배양물에서 성장시킨 나이세리아 메닌기티디스로부터 수득될 수 있고; 외막 분획은 OMV를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
상기 항원성 조성물은 대상체 fHbp를 함유하는 미세소포체(MV) (또는 "블레브(bleb)")를 함유할 수 있고, 여기서, MV 또는 블레브는 대상체 fHbp를 발현하도록 유전학적으로 변형된 나이세리아 메닌기티디스 균주의 배양 동안에 방출된다. 예를 들어, MV는 브로쓰 배양 배지에서 나이세리아 메닌기티디스의 균주를 배양하고, 전 세포를 상기 브로쓰 배양 배지로부터 단리시키고 (예를 들어, 여과에 의해 또는 세포만을 펠렛화하고 보다 작은 블레브 등을 펠렛화하는 고속 원심단리에 의해) 이어서 세포 부재 배양 배지에 존재하는 MV를 수거함에 의해(예를 들어, 여과, 차등 침전 또는 MV의 응집에 의해 또는 블레브 등을 펠렛화하는 고속 원심단리에 의해) 수득될 수 있다. MV의 생성에 사용하기 위한 균주는 일반적으로 배양에서 생성된 블레브의 양을 기준으로 선택될 수 있다(예를 들어, 세균은 합당한 수로 본원에 기재된 방법에서 단리 및 투여를 위해 적합한 블레브의 생성을 제공하도록 배양될 수 있다). 고수준의 블레브를 생성하는 예시적 균주는 PCT 공보 번호 WO 01/34642에 기재되어 있다. 블레브 생성에 추가로 MV 생성에 사용하기 위한 균주는 또한 NspA 생성을 기초로 선택될 수 있고, 여기서, 보다 높은 수준의 NspA를 생성하는 균주가 특정 관심 대상일 수 있다 (상이한 NspA 생성 수준을 갖는 엔. 메닌기티디스 균주의 예에 대해, 예를 들어, 문헌(Moe et al. (1999 Infect. Immun. 67: 5664)을 참조한다). 블레브의 생성에 사용하기 위한 목적하는 다른 균주는 세포 단리, 막 구조 및 독성을 위해 요구되는 지질단백질을 암호화하는 불활성화된 GNA33 유전자를 갖는 균주를 포함한다(문헌참조: 예를 들어, Adu-Bobie et al. (2004) Infect Immun.72:1914-1919).
본 발명의 항원성 조성물은 하나의 균주로부터 또는 2, 3, 4, 5개 이상의 균주로부터 기원하는 소포체를 함유할 수 있고, 상기 균주는 서로에 대해 상동성 또는 이종성, 일반적으로, 이종성일 수 있다. 예를 들어, 상기 균주는 대상체 fHbp가 유래된 PorA 및/또는 fHbp와 관련하여 상동성 또는 이종성 일 수 있다. 상기 소포체는 상이한 변이체(v.1, v.2 또는 v.3) 또는 아변이체(예를 들어, v.1, v.2 또는 v.3의 아변이체)로부터의 fHbp 아미노산 서열로 구성될 수 있는 하나 이상의 대상체 fHbp(예를 들어, 1, 2, 3개 이상의 대상체 fHbp)를 발현하는 균주로부터 제조될 수 있다.
상기 항원성 조성물은 동일하거나 상이한 대상체 fHbp를 제공하는 OMV 및 MV의 혼합물을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 대상체 fHbp는 임의로 fHbp 변이체 및/또는 아변이체의 상이한 조합 기원의 에피토프를 제공할 수 있고, 상기 OMV 및 MV는 동일하거나 상이한 균주로부터 기원할 수 있다. 상이한 균주 기원의 소포체는 혼합물로서 투여될 수 있거나 연속으로 투여될 수 있다.
경우에 따라 (예를 들어, 소포체를 제조하기 위해 사용되는 균주가 내독소 또는 특정 고수준의 내독소와 관련되는 경우), 상기 소포체는 임의로 내독소를 감소시키기 위해, 예를 들어, 투여 후 독성을 감소시키기 위해 처리된다. 하기 논의된 바와 같이 덜 요구될 수 있지만, 내독소의 감소는 적합한 세제(예를 들어, BRIJ-96, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 라우로일사코시네이트, 엠피겐(Empigen) BB, Triton X-100, TWEEN 20 (소르비탄 모노라우레이트 폴리옥시에틸렌), TWEEN 80, 0.1-10%의 농도에서, 바람직하게는 0.5-2%,및 SDS)로 추출함에 의해 성취될 수 있다. 세제 추출이 사용되는 경우, 데옥시콜레이트 이외의 다른 세제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
항원성 조성물의 소포체는 세제 없이, 예를 들어, 데옥시콜레이트 사용 없이 제조될 수 있다. 세제 처리가 내독소 활성을 제거하기 위해 유용하지만, 소포체 생성 동안에 추출에 의해 원산 fHbp 지질단백질 및/또는 대상체 fHbp(지질화된 fHbp를 포함하는)가 고갈될 수 있다. 따라서, 특히 세제를 요구하지 않는 기술을 사용하여 내독소 활성을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 방법에서, 내독소(리포폴리사카라이드, LPS)의 비교적 낮은 생성자인 균주는 인간에서 사용하기 전 최종 제제로부터 내독소가 제거할 필요성을 회피하기 위해 사용된다. 예를 들어, 상기 소포체는 백신(예를 들어, Rmp)에서 요망되지 않을 수 있는 리포폴리사카라이드 또는 다른 항원이 감소되거나 제거된 나이세리아 돌연변이체로부터 제조될 수 있다.
소포체는 감소되거나 검출가능하지 않은 지질 A의 독성 활성을 유발하는 유전학적 변형을 함유하는 엔. 메닌기티디스 균주로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 균주는 지질 A 생합성에서 유전학적으로 변형될 수 있다(문헌참조: Steeghs et al. (1999) Infect Immun 67:4988-93; van der Ley et al. (2001) Infect Immun 69:5981-90; Steeghs et al. (2004) J Endotoxin Res 10:113-9; Fissha et al, (2005) Infect Immun 73:4070). 상기 면역원성 조성물은 각각 lpxL1 또는 lpxL2에 의해 암호화된 효소의 하향조절 및/또는 불활성화 같이 LPS의 변형에 의해 번역될 수 있다. lpxL1 돌연변이체에서 제조된 펜타-아실화된 지질 A의 생성은 lpxL1에 의해 암호화된 효소가 GlcN II의 2' 위치에서 N-결합된 3-OH C14에 C12를 부가함을 지적한다. lpxL2 돌연변이체에서 발견되는 주요 지질 A 종은 테트라-아실화되고 이는 즉, lpxL2에 의해 암호화된 효소가 GlcN I의 2 위치에서 N-결합된 3-OH C14에 다른 C12를 부가함을 지적한다. 이들 유전자의 감소된(또는 부재) 발현을 유도하는 돌연변이(이들 유전자 생성물의 감소된 활성 또는 부재)는 지질 A의 변화된 독성 활성을 유도한다 (문헌참조　: van der Ley et al. (2001) Infect Immun 69:5981-90). 테트라-아실화된 (lpxL2 돌연변이체) 및 펜타 아실화된(lpxL1 돌연변이체) 지질 A는 야생형 지질 A보다 덜 독성이다. 지질 A 4'-키나제 암호화 유전자(lpxK)에서의 돌연변이는 또한 지질 A의 독성 활성을 감소시킨다. 소포체의 제조(예를 들어, MV 또는 OMV)에 사용하기 위한 특정 관심 대상은 감소되거나 검출가능하지 않은 기능성 LpxL1-암호화된 단백질을 제공하도록 유전학적으로 변형된 엔. 메닌기티디스 균주이고, 예를 들어, 여기서, 상기 나이세리아 세균(예를 들어, 엔. 메닌기티디스 균주)은 lpxL1 유전자의 유전자 생성물의 감소된 활성 또는 활성 부재를 제공하도록 유전학적으로 변형된다. 예를 들어, 상기 나이세리아 세균은 예를 들어, lpxL1 유전자가 파괴된 lpxL1 유전자 녹아웃을 갖도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 공개공보 제2009/0035328호]를 참조한다. 상기 나이세리아 세균은 lpxL2 유전자의 유전자 생성물의 감소된 활성 또는 활성 부재를 제공하도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 상기 나이세리아 세균은 lpxL1 유전자 및 lpxL2 유전자의 유전자 생성물의 감소된 활성 또는 활성 부재를 제공하도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 상기 소포체는 LPS 생성을 위해 야생형인 엔. 메닌기티디스 균주와 비교하여 감소된 활성을 제공하고 대상체 fHbp의 면역원성을 유지한다.
LPS 독성 활성은 또한 폴리믹신 B 내성(이러한 내성은 지질 A의 4' 포스페이트상에 아미노아라비노스를 부가하는 것과 상호관련된다)에 관여하는 유전자/유전자좌에 돌연변이를 도입함에 의해 변화될 수 있다. 이들 유전자/유전자좌는 UDP-글루코스 데하이드로게나제를 암호화하는 pmrE 또는 아미노아라비노스 합성 및 전달에 관여할 수 있는 많은 엔테로박테리아세애에 공통된 항미생물 펩타이드 내성 유전자 영역일 수 있다. 상기 영역에 존재하는 유전자 pmrF는 돌리콜-포스페이트 만노실 트랜스퍼라제를 암호화한다(문헌참조: Gunn J. S., Kheng, B. L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S. I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182).
포스포-릴레이 2개 성분 조절 시스템인 PhoP-PhoQ 조절 시스템(예를 들어, PhoP 항상성 표현형, PhoPc)에서 돌연변이 또는 낮은 Mg++ 환경 또는 배양 조건 (PhoP-PhoQ 조절 시스템을 활성화시키는) 4'-포스페이트 및 미리스테이트를 대신하는 2-하이드록시미리스테이트(미리스테이트의 하이드록실화) 상에 아미노아라비노스의 부가를 유도한다. 상기 변형된 지질 A는 인간 내피 세포에 의한 E-셀렉틴 발현 및 인간 단핵구로부터 TNF-분비를 자극하기 위해 감소된 능력을 나타낸다.
폴리믹신 B 내성 균주는 또한 상기 균주가 감소된 LPS 독성을 갖는 것으로 나타남으로써 사용하기에 적합하다(문헌참조: 예를 들어, van der Ley et al. (1994) In: Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, England). 대안적으로, 폴리믹신 B의 결합 활성을 모방하는 합성 펩타이드는 LPS 독성 활성을 감소시키기 위해 항원성 조성물에 부가될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Rustici et al. (1993) Science 259:361-365; Porro et al. (1998) Prog Clin Biol Res.397:315-25).
내독소는 또한 배양 조건의 선택을 통해 감소될 수 있다. 예를 들어, 배지 리터당 0,1mg 내지 100mg의 아미노아라비노스를 함유하는 성장 배지에서 균주의 배양은 감소된 지질 독성을 제공한다(문헌참조: 예를 들어, WO 02/097646).
조성물 및 제형
"조성물", "항원 조성물", "항원성 조성물" 또는 "면역원성 조성물"은 본원에서 편의적으로 본원에 기재된 대상체 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 포함하는 조성물을 언급하기 위해 사용되고, 상기 대상체 fHbp는 임의로 접합되어 면역원성을 추가로 증진시킬 수 있다. 인간에서 항체, 예를 들어, 엔. 메닌기티디스에 대한 항체, 예를 들어, 엔. 메닌기티디스에 대한 살균 항체를 유발하기 위해 유용한 조성물은 본원 발명에 의해 구체적으로 고려된다.
항원성 조성물은 면역학적 유효량의 대상체의 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 함유하고 필요시 다른 적합한 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기된 바와 같은 하나 이상의 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 함유할 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 면역원성 조성물은:
a) 상기 제공된 바와 같이 비-천연적으로 발생하는 fHbp; 및
b) 약제학적으로 허용되는 부형제
를 포함하는 조성물을 포함하지만 이에 제한되지 않고,
여기서, fHbp는 재조합 단백질로서 및/또는 소포체 기반 조성물(예를 들어, OMV)로 제공될 수 있다.
상기 조성물은 포린 A, 포린 B, NspA, 필린, 또는 다른 나이세리아 단백질과 같은 목적하는 추가의 항원을 함유할 수 있다. 추가로, 본 발명의 항원 조성물은 PCT 공개 번호 WO　99/24578, WO　99/36544; WO　99/57280, WO　00/22430, 및 WO　00/66791에서 예시된 것들과 같은 추가의 나이세리아 항원, 및 상기 단백질의 항원성 단편을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 하나 이상 유형의 fHbp를 함유할 수 있고, 여기서, 각각의 fHbp는 fHbp 변이체 및/또는 아변이체의 상이한 조합으로부터 기원하는 에피토프를 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 상기된 바와 같은 비-천연적으로 발생하는 fHbp, 및 천연적으로 발생하는 v.1 및 v.2 fHbp를 함유할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 조성물은 상기 지적된 바와 같이 비-천연적으로 발생하는 fHbp 및 돌연변이 v.1 및/또는 v.2 fHbp를 함유할 수 있고, 특히, 여기서, 상기 돌연변이체 fHbp는 천연적으로 발생하는 상응하는 fHbp에 비해 인간 fH에 데해 감소된 결합을 갖는다. v.1 및 v.2 fHbp의 상기 돌연변이체는 본원에 참조로서 인용되는 US2011/0256180에 기재되어 있다. v.1 및/또는 v.2 fHbp 아미노산 서열은 본 발명의 조성물에서 또는 융합 폴리펩타이드내에서 별도의 실체로서 본 발명의 비-천연적으로 발생하는 fHbp 아미노산 서열과 조합될 수 있다.
특정 경우에, 상기 조성물은 상기 지적된 바와 같이 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 암호화하는 핵산으로 유전학적으로 변형된 나이세리아 숙주 세포로부터 수득된 소포체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하고, 상기 암호화된 비-천연적으로 발생하는 fHbp는 상기 유전학적으로 변형된 숙주 세포에 의해 생성되고, 상기 소포체는 암호화된 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 포함한다.
상기 숙주 세포는 포린 A, 포린 B, NspA, 필린, 또는 다른 나이세리아 단백질과 같은 목적하는 추가의 항원을 발현하도록 추가로 변형될 수 있다. 추가로, 본 발명의 상기 항원 조성물은 PCT 공개 번호 WO　99/24578, WO　99/36544; WO　99/57280, WO　00/22430, 및 WO　00/66791에 예시된 것들과 같은 추가의 나이세리아 항원, 및 상기 단백질의 항원성 단편을 포함할 수 있다.
"면역학적 유효량"이란 일련의 동일하거나 상이한 항원성 조성물의 일부로서 단일 용량으로 상기 양의 개체로의 투여가 예를 들어, 나이세리아, 특히, 엔. 메닌기티디스, 보다 특히, 그룹 B, C 또는 Y N. 메닌기티디스에 의한 감염에 의해 유발된 증상 또는 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 항체 반응을 유발하는데 효과적임을 의미한다. 이러한 양은 치료될 개체의 건강 및 물리적 조건, 연령, 항체를 생성하는 개체의 면역계의 능력, 목적하는 보호 정도, 백신의 제형, 의학적 상황에 대한 치료 담당의의 평가 및 다른 관련 인자들에 따라 다양하다. 상기 양은 통상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 광범위에 속하는 것으로 예상된다.
투여 용법은 상이한 시점에 투여되는 항원성 조성물의 단위 투여 형태와 함께 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄(예를 들어, 부스터 용량을 포함하는)일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 상기 용어 "단위 용량 형태"는 인간 및 동물 대상체에 대한 단위 투여 형태로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 언급하고, 각각의 단위는 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양으로 본 발명의 항원성 조성물의 소정량을 함유하고, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제(예를 들어, 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클)와 연합되어 제공된다. 상기 항원성 조성물은 다른 면역조절제와 연계하여 투여될 수 있다.
항원성 조성물은 멸균 수용액, 흔히 식염 용액과 같은 용액일 수 있는 약제학적으로 허용되는 부형제 중에 제공될 수 있거나, 이들은 분말 형태로 제공될 수 있다. 상기 부형제는 요구되는 경우 실질적으로 불활성일 수 있다.
일부 양태에서, 대상체 면역원성 조성물은 소포체에 존재하는 대상체 fHbp를 포함한다. 일부 양태에서, 대상체 면역원성 조성물은 MV에 존재하는 대상체 fHbp를 포함한다. 일부 양태에서, 대상체 면역원성 조성물은 OMV에 존재하는 대상체 fHbp를 포함한다. 일부 양태에서, 대상체 면역원성 조성물은 대상체 fHbp를 포함하는 MV 및 OMV의 혼합물을 포함한다. MV 및 OMV와 같은 소포체는 상기된 바와 같다.
상기 항원성 조성물은 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 인간에서 사용될 수 있는 공지된 적합한 보조제의 예는 알룸, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, MF59 (4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v Tween 80TM 0.5% w/v Span 85), CpG-함유 핵산(여기서, 시토신은 비메틸화되어 있다), QS21, MPL, 3DMPL, 아퀼라(Aquilla)로부터의 추출물, ISCOMS, LT/CT 돌연변이체, 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 퀼(Quil) A, 인터류킨 등을 포함하지만 이에 필연적으로 제한되지 않는다. 실험 동물을 위해, 프륜트(Freund's), N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라닐-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로서 언급됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디프-알미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로서 언급됨), 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 중 세균으로부터 추출된 3개의 성분, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포 벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 함유하는 RIBI를 사용할 수 있다. 보조제의 효과는 면역원성 항원 또는 이의 항원성 에피토프에 대해 지시된 항체의 양을 측정함에 의해 결정될 수 있다.
조성물의 효과를 증진시키기 위한 추가의 예시적인 보조제는: (1) 수중유 에멀젼 제형 (무라밀 펩타이드(하기 참조) 또는 세균 세포벽 성분과 같은 다른 특이적 면역자극제 존재 또는 부재), 예를 들어 (a) 미세유동화기를 사용하여 서브마이크론 입자로 제형화된 5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80, 및 0.5% Span 85 (임의로 MTP-PE를 함유하는)를 함유하는 MF59TM (문헌참조: WO 90/14837; Vaccine Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), (b) 10% 스쿠알란, 0.4% Tween 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 L121, 및 서브마이크론 에멀젼으로 제형화되거나 보다 큰 입자 크기 에멀젼으로 볼텍싱된 thr-MDP을 함유하는 SAF, 및 (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80, 및 모노포스포리지질 A(MPL), 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS), 바람직하게는 MPL+CWS (Detox TM)과 같은 하나 이상의 세포벽 성분을 함유하는 RIBI TM 보조제 시스템 (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.); (2) 사포닌 보조제, 예를 들어, QS21 또는 StimulonTM(Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.)(이는 사용될 수 있거나 ISCOM (면역자극 복합체)와 같은 것으로부터 생성된 입자이다) (이러한 ISCOMS은 추가의 세제가 없을 수 있다, 예를 들어 WO 00/07621); (3) 완전한 프룬트(Complete Freund's) 보조제 (CFA) 및 불완전 프룬트 (Incomplete Freund's) 보조제 (IFA); (4) 사이토킨, 예를 들어, 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (WO99/44636), 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 마크로파아지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 등; (5) 모노포스포릴지질 A (MPL) 또는 3-O-탈아실화된 MPL (3dMPL) 예를 들어, GB-2230221, EP-A-0689454, 임의로 폐렴 사카라이드와 사용되는 경우 실질적으로 알룸의 부재하에, 예를 들어, WO 00/56358; (6) 예를 들어, QS21과 3dMPL의 병용물 및/또는 수중유 에멀젼, 예를 들어, EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (7) CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 (문헌참조: Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr Opin Mol Ther2001 3:15-24; Roman et al., Nat. Med, 1997, 3, 849-854; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al, J. Immunol, 1998, 160, 810-876; Chu et al., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al, Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveami e/ al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al, J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al, J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al, Cell Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al, J. Immunol., 1996, 157,2116-2122; Messina et al, J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157,4918-4925; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402; Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761; and Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 5898-5906; International patent applications WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 and WO 98/52581, 즉, 적어도 하나의 CG 디뉴클레오타이드를 함유(여기서, 시토신은 비메틸화되어 있다); (8) 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들어, WO 99/52549; (9) 옥톡시놀과 병용된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (WO 01/21207) 또는 옥톡시놀과 같은 하나 이상의 추가의 비-이온성 계면활성제와 병용되는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제 (WO 01/21152); (10) 사포닌 및 면역자극 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, CpG 올리고뉴클레오타이드) (WO 00/62800); (11) 면역자극제 및 금속염의 입자, 예를 들어, WO 00/23105; (12) 사포닌 및 수중유 에멀젼, 예를 들어, WO 99/11241; (13) 사포닌 (예를 들어, QS21)+3dMPL+IM2 (임의로 +스테롤) 예를 들어, WO 98/57659; (14) 조성물의 효능을 증진시키기 위한 면역자극 제제로서 작용하는 다른 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 무라밀 펩타이드는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-25 아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(노르-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타르니닐 -L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-- sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE) 등을 포함한다. 인간에 투여하기 위해 적합한 보조제는 특정 관심 대상이다.
상기 항원 조성물은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈쿰, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스, 마그네슘, 카보네이트 등과 같은 다른 성분을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 대략적인 생리학적 조건에 요구되는 바와 같이 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제 등, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등을 함유할 수 있다.
제형 중 대상체 fHbp의 농도는 광범위하게 다양할 수 있고(예를 들어, 약 0.1중량% 미만, 일반적으로 2중량% 또는 적어도 약 2 중량%에서, 많게는 20 중량% 내지 50 중량%) 일반적으로 주로 유체 용적, 점도 및 선택된 투여의 특정 방식 및 환자의 필요성에 따른 환자 기반 인자들을 기초로 선택된다.
대상체 fHbp-함유 제형은 용제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 겔, 크림, 로션, 연고, 에어로졸 등의 형태로 제공될 수 있다. 경구 투여는 분해로부터 조성물의 보호를 필요로 할 수 있는 것으로 인지된다. 이것은 전형적으로 이것이 산성 및 효소적 가수분해에 내성이 되게 하는 제제와 조성물을 연합하거나 상기 조성물을 적당한 내성 담체 중에 팩키징함에 의해 성취된다. 분해로부터 보호하는 수단은 당업계에 널리 공지되어 있다.
fHbp-함유 제형은 또한 투여 후 fHbp의 혈청 반감기를 증진시키도록 제공될 수 있다. 예를 들어, 단리된 fHbp가 주사용으로 제형화되는 경우, 상기 fHbp는 콜로이드로서 제조되는 리포좀 제형 중에 또는 혈청 반감기를 연장하기 위한 다른 통상의 기술로 제공될 수 있다. 문헌[참조: 예를 들어, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), 미국 특허 번호 4,235,871, 4,501,728 및 4,837,028]에 기재된 바와 같이 리포좀을 제조하기 위해 다양한 방법이 가용하다. 상기 제제는 또한 조절 방출 또는 서방출 형태로 제공될 수 있다.
면역화
본 발명은 포유동물 숙주에서 하나 이상의 나이세리아 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 대상체 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다. 본 발명은 또한 약제(예를 들어, 면역원성 조성물로서 또는 백신으로서)로서 또는 진단 시약으로서 사용하기 위한 본 발명의 비-천연적으로 발생하는 인자 H 결합 단백질(fHbp)를 제공한다. 본원 발명은 추가로 포유동물에서 나이세리아 (예를 들어, 뇌척수막염) 감염을 예방하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 핵산 또는 단백질의 용도를 제공한다.
상기 fHbp-함유 항원성 조성물은 일반적으로 질환 및 이의 합병증의 발병을 예방하거나 적어도 부분적으로 억제하기 위해 나이세리아 질환을 나타낼 위험에 처한 인간 대상체에게 투여된다. 이를 성취하기 위해 적당한 양은 "치료학적 유효량"으로서 정의된다. 치료학적 용도를 위한 유효량은 예를 들어, 항원성 조성물, 투여 방식, 환자의 체중 및 건강의 일반적 상태 및 처방 담당의의 판단에 따라 다양하다. 항원성 조성물의 단일 또는 다중 용량은 환자에 의해 요구되고 관용성이고 용량 및 횟수 및 투여 경로에 따라 투여될 수 있다.
상기 fHbp-함유 항원성 조성물은 일반적으로 숙주에서 면역 반응, 특히, 체액성 면역 반응, 예를 들어, 살균성 항체 반응을 유발하기 위한 유효량으로 투여된다. 상기 지적된 바와 같이, 면역화를 위한 양은 다양하고 환자 70kg당 약 1㎍ 내지 100㎍의 범위, 일반적으로 5㎍ 내지 50㎍/70kg일 수 있다. 실질적으로 보다 높은 용량 (예를 들어, 10 mg 내지 100 mg이상)은 경구, 비강 또는 국소 투여 경로에서 적합할 수 있다. 초기 투여 후 동일하거나 상이한 fHbp-함유 항원성 조성물로 부스터 면역화시킬 수 있다. 일반적으로 백신 접종은 하나 이상의 부스터, 보다 일반적으로는 2회 부스터를 포함한다.
일반적으로 면역화는 부가된 부형제의 존재 또는 부재하에 경구적으로, 비강으로, 비인두로, 비경구로, 대장으로, 위장으로, 국소적으로, 경피로, 피하로, 근육내로, 정제로, 고체로, 분말로, 액체, 에어로졸 형태로, 국소적으로 또는 전신으로 조성물의 투여를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의한 투여에 의해 성취될 수 있다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있고 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)]과 같은 공개 문헌에 보다 상세하게 기재되어 있다.
항-fHbp 면역 반응은 공지된 방법(예를 들어, 초기 면역화 전후 개체 기원의 샘플을 수득하고 개체의 면역 상태의 변화를 입증함에 의해, 예를 들어, 면역침전 검정 또는 ELISA, 또는 살균성 검정 또는 웨스턴 블롯 또는 유동 세포측정 검정 등)에 의해 평가할 수 있다.
상기 항원성 조성물은 나이세리아 메닌기티디스에 대하여 면역학적으로 순수한 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 대상체는 약 5세 이하 및 바람직하게는 약 2세 이하의 인간 어린이이고 상기 항원성 조성물은 하기의 시점 중 어느 하나 이상에서 투여된다: 생후 2주, 1개월, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개월, 또는 1년 또는 15, 18, 또는 21개월 또는 2, 3, 4 또는 5세.
일반적으로 질환 증상의 첫번째 징후 전에 또는 감염 또는 질환(예를 들어, 나이세리아에 의한 노출 또는 감염으로 인해)에 대한 가능하거나 실제 노출의 첫번째 징후에 면역화를 개시하는 것이 바람직할 수 있다.
스크리닝 방법
하나의 예에서, 백신 조성물 중 대상체 fHbp의 효능을 평가하는 방법은: (a) 숙주 동물(예를 들어, 비-인간 포유동물 숙주 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스)을 본원 발명의 fHbp를 포함하는 조성물로 면역화시키고; (b) 숙주에서 살균성 항체의 수준을 측정함을 포함한다. 상기 대상체 방법은 또한 대상체 fHbp를 포함하는 백신이 투여된 숙주 동물의 나이세리아 세균에 대한 민감성을 평가함을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 대상체 fHbp에 의해 유발된 항체를 제조하고 동정함을 포함할 수 있다. 상기 방법은 fHbp에 대한 결합 친화성을 갖는, 숙주 동물로부터 기원하는 항체를 단리하고, 세균 세포를 상기 단리된 항체와 접촉시키고; 항체의 세균 세포로의 결합을 평가함을 포함한다. 추가의 단계는 인간 인자 H를 갖는 fHbp로의 항체의 경쟁 결합을 평가하고, 상기 항체가 세균 병원체와 접촉된 동물에게 투여되는 경우 세균 병원체에 대한 살균성 활성을 평가함을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 항체는 항체 집단 중에 있고, 상기 방법은 추가로 세균 세포에 결합하는 항체 집단 중 하나 이상의 항체를 단리함을 포함할 수 있다. 특징화된 측면은 예를 들어, 인간 혈액 중 세균의 생존능을 감소시킬 수 있는 보체 매개된 살균성 활성 및/또는 옵소닌식세포 활성을 포함할 수 있는 세균 세포에 대해 살균성인 단리된 항체이다.
특정 관심 대상인 세균 병원체는 엔. 메닌기티디스 혈청그룹 B, 엔. 메닌기 티디스 혈청그룹 C, 엔. 메닌기티디스 혈청 그룹 X, 엔. 메닌기티디스 혈청 그룹 Y, 엔. 메닌기티디스 혈청 그룹 W-135, 등과 같은 다양한 캡슐 그룹의 임의의 또는 모든 변이체 그룹의 엔. 메닌기티디스이다.
fHbp에 대한 반응을 평가하는 방법
본원 발명은 fHbp가 개체에서 살균성 반응을 유발하는 가능성을 결정하기 위한 방법 및 면역원성 조성물에 내포시키기 위한 적합성을 위한 변이체 fHbp를 평가하는 방법을 제공한다.
fHbp가 살균성 반응을 유발할 가능성을 결정하는 방법
본원 발명은 본원 발명의 비-천연적으로 발생하는 fHbp(예를 들어, 나이세리아 백신 중 존재하는 fHbp)는 적어도 하나의 나이세리아 메닌기티디스 균주에 대한 개체에서의 살균성 반응을 유발하는 가능성을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 fHbp로 면역화된 개체로부터 수득된 혈청 중 존재하는 항체가 fH의 fHbp로의 결합을 억제하는 능력을 결정함을 포함한다. fHbp로의 fH 결합을 억제하지만 살균성 반응을 생성하지 않는 대조군 항체에 의한 fH의 fHbp로의 억제 수준 보다 적어도 약 10% 이상, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 10배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 또는 100배 초과인 수준에서 항체에 의한 fH의 fHbp로의 결합 억제는 fHbp가 적어도 하나의 나이세리아 메닌기티디스 균주에 대한 살균성 반응을 유발할 수 있음을 지적한다.
대상체 fHbp를 사용한 면역화에 의해 유발된 항체에 의한 fH의 fHbp로의 결합 억제 정도는 본원에 기재된 검정 또는 임의의 다른 공지된 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, fH 및/또는 fHbp는 검출가능한 표지를 포함할 수 있고 fH/fHbp 결합 억제는 fH/fHbp 복합체에 존재하는 표지된 성분의 양을 검출하고/하거나 유리된 fH 및/또는 유리된 fHbp(예를 들어, fH/fHbp 복합체에 없는 fH 또는 fHbp)에 존재하는 표지의 양을 검출함에 의해 평가될 수 있다.
하나의 예에서, fHbp에 결합하는 fH를 평가하기 위한 검정은 지지체상에 고정화된 fHbp(예를 들어, 미세역가 플레이트의 웰상에 고정화된 fHbp)의 용도를 포함한다. 시험 항체(예를 들어, 항혈청, 예를 들어, 면역원성 조성물의 항체-유발 용량을 투여받은 인간 또는 비-인간 시험 동물(예를 들어, 마우스)로부터)의 희석과 함께 고정된 농도의 인간 fH의 혼합물을 웰에 부가하고 항체 결합을 허용하기에 충분한 시간 동안 항온처리하였다. 웰을 세척한 후, 결합된 fH는 표지된 성분을 함유하는 특이적 항-fH 항혈청(예를 들어, 염소 또는 당나귀) 또는 2차 표지된 항체(예를 들어, 래빗 항-염소 또는 항-당나귀 항-혈청)을 사용하여 검출한다. 결합된 fH의 % 억제는 부가된 인간 또는 마우스 항체의 부재하에 결합된 fH의 양에 의해 계산될 수 있다.
상기 검정의 또 다른 변화에서, 항혈청의 존재 또는 부재하에 fH의 생세균으로의 결합은 유동 세포측정에 의해 평가한다. 세균 세포는 고정된 농도의 fH(예를 들어, 검출가능하게 표지된 fH) 및 항체를 함유하는 상이한 희석의 시험 혈청으로 항온처리한다. 상기 세균을 세척하고 결합된 fH를 검출한다(예를 들어, 상기 지적된 바와 같이).
따라서, 대상체 fHbp로 면역화된 개체로부터 항혈청의 fH/fHbp 결합을 어제하기 위한 능력은 항혈청의 살균성 활성을 직접 평가하기 위한 대상물로서 작용한다. 대상체 fHbp가 개체에서 살균성 반응을 유발할 가능성을 결정하기 위한 본원 발명의 방법은 특정 면역원성 조성물이 개체에서 살균성 반응을 유발하는데 효과적인 지에 관하여 임상의 또는 다른 의료진에게 정보를 제공할 수 있다.
면역화된 개체는 ELISA에 의한 유사한 혈청 IgG 항-fHbp 항체 역가를 가질 수 있다. fH 결합의 총 우수한 억제를 제공하는 항혈청은 보다 효과적인, 보다 우수한 품질의 항-fHbp 항체 반응을 지적하고 보다 우수한 보호를 부여한다. 따라서, 예를 들어, 2개의 개체에서 항-나이세리아 항체 반응을 평가하는데 있어서(항-fHbp 항체에 의해 즉, 1:10,000의 혈청 희석이 다른 개체에 의한 1:3000의 희석과 비교하여 억제한다), 보다 높은 억제 활성을 갖는 개체는 보다 우수한 보호를 부여하는 보다 높은 우수한 품질의 항-fHbp 항체를 갖는다. 상기 fH 억제 검정은 따라서 보체-매개된 살균성 역가 검정을 위한 대용물이고, 상기 보체-매개된 살균성 역가 검정은 일반적으로 fH 억제 보다 시간 소모적이고 측정하기 어렵다.
대상체 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 평가하는 방법
본원 발명은 본원에 기재된 바와 같은 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 개체에서 살균성 항체 반응을 유발하는데 효과적일 가능성을 평가하거나 예측하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 fHbp 변이체에 특이적인 항체의 fH의 fHbp로의 결합을 억제하는 능력을 평가함을 포함한다. fHbp 변이체로 면역화시킴에 의해 유발되는 항체에 의한 fH의 fHbp로의 결합 억제 강도는 fHbp 변이체에 대해 유발된 항체의 살균성 활성과 양성적으로 상호관련된다. 높은 혈청 희석에서 fH의 fHbp로의 결합을 억제하는 항체를 유발하는 fHbp 변이체는 나이세리아의 하나 이상의 균주에 대한 보호를 유발하기 위한 백신을 위해 적합한 후보물로 고려된다.
예를 들어, 본원 발명은 fHbp ID 79 보다 인간 fH에 대해 낮은 친화성을 갖는 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 개체에서 하나 이상의 나이세리아 메닌기티디스 균주에 대한 살균성 항체를 유발할 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 시험 비-인간 동물에서 비-천연적으로 발생하는 fHbp에 대한 항체의 fH의 fHbp로의 결합을 억제하는 능력을 측정함을 포함한다. 시험 비-인간 동물에서 fHbp ID 79에 대해 유발된 항체에 의한 fH의 fHbp로의 억제 수준 보다 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 10배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 또는 100배 초과로 높은 수준에서 비-천연적으로 발생하는 fHbp에 대해 유발된 항체에 의한 fH의 fHbp로의 결합 억제는 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 하나 이상의 나이세리아 메닌기티디스 균주에 대한 살균성 반응을 유발할 수 있음을 지적한다.
적합한 시험 비-인간 동물은 예를 들어, 마우스, 래트,래빗 등을 포함한다. fHbp 변이체에 대해 유발된 항체에 의한 fH의 fHbp로의 결합 억제 정도는 본원에 기재된 검정 또는 임의의 다른 공지된 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 항체의 살균 활성은 본원에 기재된 바와 같은 검정 또는 임의의 다른 공지된 검정을 사용하여 용이하게 측정된다.
fHbpID 79 보다 인간 fH에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는 소정의 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 개체에서 하나 이상의 나이세리아 메닌기티디스 균주에 대한 살균 항체를 유발할 가능성을 측정하기 위한 대상체 방법은 예를 들어, 백신 개발 과정에서 적합한 면역원을 동정하기 위해 (및/또는 적합하지 않은 면역원을 제거하기 위해) 유용하다.
실시예
본원에 기재된 실시예 및 양태는 단지 설명을 위한 것이고 이와 관련하여 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안되고 본원의 취지 및 범위 및 첨부된 특허청구범위의 범위내에 포함되어야만 하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 이들의 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
실시예 1: 돌연변이체 fHbp ID 79의 제조
인간 인자 H에 감소된 결합을 갖는 v.3 fHbp 단백질을 제조하기 위해, H223A 및 H223R 치환을 fHbp ID 79로 도입하였다. 도 1은 재조합 인자 H-결합 단백질 ID 79 야생형 및 돌연변이체의 크기 및 순도를 지적하는 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 보여준다. 히스티딘의 넘버링은 도 4에 제공된 정렬에 보여지는 바와 같이 fHbp ID 1의 아미노산 서열을 참조로 아미노산 위치를 기준으로 한다. 상기 히스티딘 223번 위치는 v.3 fHbp에서 히스티딘 230번에 상응한다(도 4 및 5를 참조한다). 상기 히스티딘 223번 위치는 v.2 fHbp(예를 들어, fHbp ID 22; 도 4를 참조한다)에서 히스티딘 222번에 상응한다. 레인 1, 벤치마크 래더 (Invitrogen); 레인 2 ID 79 야생형; 레인 3 H223R 돌연변이체; 레인 4, H223A 돌연변이체. 2㎍의 각각의 재조합 fHbp는 겔 상에 로딩하였다. NuPAGE 4-12% 폴리아크릴아미드/Bis-Tris 겔은 MES 전개 완충제 (Invitrogen)와 함께 사용하였다. 상기 겔은 심플리 블루 세이프 염료(Simply Blue SafeStain) (Invitrogen)를 사용하여 염색시켰다.
실시예 2: 감소된 fH 결합을 갖는 v.3 fHbp 돌연변이체의 동정
ID 79 돌연변이체 H223A 및 H223R로의 인간 인자 H의 결합은 ELISA로 분석하였다. 상기 결과는 도 2에 나타낸다. 도 2, 패널 A는 인간 인자 H의 결합을 보여준다. fHbp ID 79 야생형(WT), 원형 기호; H223A 돌연변이체, 삼각형 기호; H223R 돌연변이체, 별표 기호. 도 2, 패널 B는 대조군 mAb, JAR 11의 결합을 보여준다.
반면, H223A 돌연변이체는 결합에서 단지 약간 감소하였고, H223R 돌연변이체는 인간 인자 H로의 검출가능한 결합을 나타내지 않았다(도 2, 패널 A). H223A 및 H223R 돌연변이체 단백질로의 대조군 항-fHbp mAb, JAR 11의 결합은 야생형 fHbp ID 79와 유사하였다(도 2, 패널 B).
정제된 재조합 fHbp ID 79 야생형 또는 돌연변이체 단백질(PBS 중 2㎍/ml)은 미세역가 플레이트의 웰에 흡착시켰다. 비-특이적 결합은 PBS/1% BSA로 차단시켰다. 패널 A에서의 데이터에 대해, 정제된 인간 인자 H의 연속 희석물 (0.0012 내지 20㎍/ml)을 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 1시간동안 실온에서 항온처리하였다. 세척 후, 양 항-인간 인자 H(1:2000 희석; 패널 A) 또는 항-fHbp mAb JAR 11 (0.00032-25㎍ /ml; 패널 B)은 웰에 첨가하고 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 다시 세척한 후, 당나귀 항-양(sheep) IgG (1:5000; Sigma; 패널 A) 또는 염소 항-마우스 IgG (1:5000; Sigma Panel B)를 첨가하고 상기 플레이트는 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 다시 세척한 후, 포스파타제 기질 (p-니트로페닐 포스페이드, 1 mg/ml; Sigma)을 첨가하고 405nm에서 광학 밀도는 실온에서 30분 항온처리 후 측정하였다.
실시예 3: 감소된 fH 결합을 갖는 fHbp 돌연변이체
T221A 및 H223A 치환은 개별적으로 fHbp ID 22(변이체 그룹 2)에 도입하였다. T221 및 H223의 넘버링은 도 4에 제공된 정렬에 나타낸 바와 같이 fHbp ID 1의 아미노산 서열의 아미노산 위치를 기반으로 한다. T221은 v.2 fHbp(예를 들어, fHbp ID 22)에서 아미노산 위치 220번에 상응하고 H223은 v.2 fHbp(예를 들어, fHbp ID 22)에서 아미노산 위치 222번에 상응한다.
T221A 돌연변이체는 인간 인자 H에 대해 어떠한 검출가능한 결합을 보여주지 않은 반면, H223A 돌연변이체는 야생형 fHbp ID 22 단백질과 비교하여 결합에서 약간의 감소를 보여주었다(도 3, 패널 A). 대조군 항-fHbp mAb, JAR 13의 결합은 야생형 fHbp ID 22 단백질, T221A 돌연변이체 및 H223A 돌연변이체에 대해 유사하였다(도 3, 패널 B).
ID 22 돌연변이체 T221A 및 H223A로의 인간 인자 H의 결합은 ELISA에 의해 분석하였다. 도 3, 패널 A는 인간 인자 H의 결합을 보여준다. fHbp ID 22 야생형(WT), 원형 기호; T221A 돌연변이체, 별표 기호; H223A 돌연변이체, 삼각형 기호. 도 3, 패널 B는 대조군 mAb, JAR 13의 결합을 보여준다. 정제된 재조합 fHbp ID 22 야생형 또는 돌연변이체 단백질(PBS 중 2㎍/ml)은 미세역가 플레이트의 웰에 흡착하였다. 비-특이적 결합은 PBS/1% BSA로 차단시켰다. 패널 A에서의 데이터에 대해, 정제된 인간 인자 H의 연속 희석물(0.00032-25㎍/ml)을 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 1시간동안 실온에서 항온처리하였다. 세척 후, 양 항-인간 인자 H (1:2000 희석; 패널 A) 또는 항-fHbp mAb JAR 13 (0.00032-25㎍/ml; Panel B)을 웰에 첨가하고 1시간동안 실온에서 항온처리하였다. 다시 세척한 후, 당나귀 항-양 IgG(1:5000; Sigma; 패널 A) 또는 염소 항-마우스 IgG(1:5000; Sigma 패널 B)를 첨가하고 상기 플레이트를 1시간동안 실온에서 항온처리하였다. 다시 세척한 후, 포스파타제 기질(p-니트로페닐 포스페이트, 1 mg/ml; Sigma)을 첨가하고 405nm에서 광학 밀도는 실온에서 30분 항온처리 한 후 측정하였다.
실시예 4: 살균 반응
야생형 CD-1 마우스는 보조제로서 수산화알루미늄(투여 당 600 ㎍; Alhydrogel, Brenntag Biosector)과 함께 10㎍의 재조합 fHbp ID 79 백신을 사용하여 면역화시켰다. 6개 동물 그룹은 단독의 보조제(Alum)로 면역화시키고 각각 8개 동물 그룹들은 재조합 fHbp 백신으로 면역화시켰다. 3회 용량의 백신을 3주 간격으로 투여하고 혈액은 세번째 투여한지 3주 후 수거하였다. 혈청 살균 검정은 보조제 대조군 그룹에 대한 혈청 풀(각각 3마리의 마우스로부터 2개 풀) 및 fHbp 백신 그룹에 대한 개별 혈청을 사용하여 수행하였다. 살균 검정은 0.25% 글루코스 및 0.02 mM CMP-NANA, 보체 공급원으로서 IgG-고갈된 혈청을 함유하는 무엘러-힌톤 브로쓰에서 성장시킨 로그상 세균을 사용하여 수행하였다. 상기 역가는 순수 마우스 기원의 혈청을 함유하는 음성 대조군 세포에 상대적으로 60분동안 항온처리 후 세균의 50% 생존을 유도하는 혈청의 상호 희석으로서 정의된다. 상기 결과는 도 7에 나타낸다.

Claims (24)

  1. 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp로부터 유래된 비-천연적으로 발생하는 인자 H 결합 단백질(fHbp)로서,
    상기 비-천연적 fHbp는 상기 천연적으로 발생하는 변이체 3 fHbp의 위치 223번에서 히스티딘이 아르기닌, 라이신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것을 포함하고, 위치 223번의 넘버링이 성숙 fHbp ID 1의 넘버링을 기준으로 하고,
    상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 fHbp ID 79보다 인간 인자 H(fH)에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는, 비-천연적으로 발생하는 인자 H 결합 단백질(fHbp).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 히스티딘이 아르기닌으로 치환된, 비-천연적으로 발생하는 fHbp.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체 3 fHbp가 모듈러 그룹(modular group) V fHbp인, 비-천연적으로 발생하는 fHbp.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체 3 fHbp가 모듈러 그룹 II fHbp인, 비-천연적으로 발생하는 fHbp.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 상기 fHbp ID 79의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 비-천연적으로 발생하는 fHbp.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 상기 아미노산 치환 H223R을 포함하는 fHbp ID 28을 포함하는, 비-천연적으로 발생하는 fHbp.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 상기 아미노산 치환 H223R을 포함하는 fHbp ID 67 또는 fHbp ID 175를 포함하는, 비-천연적으로 발생하는 fHbp.
  8. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 상기 아미노산 치환 H223R을 포함하는 fHbp ID 79를 포함하는, 비-천연적으로 발생하는 fHbp.
  9. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 상기 아미노산 치환 H223R을 포함하는 fHbp ID 45를 포함하는, 비-천연적으로 발생하는 fHbp.
  10. 면역원성 조성물로서,
    a) 청구항 1 내지 9 중 어느 한 청구항의 비-천연적으로 발생하는 fHbp; 및
    b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 면역원성 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 상기 fHbp를 발현하는 나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis) 균주로부터 제조된 소포체 제제(vesicle preparation)의 표면상에 발현되는, 면역원성 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 단리된 폴리펩타이드로서 존재하는, 면역원성 조성물.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제가 보조제를 포함하는, 면역원성 조성물.
  14. 청구항 10 내지 13 중 어느 한 청구항에 있어서, 추가의 엔. 메닌기티디스 (N. meningitidis) 항원을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  15. 포유동물에서 항체 반응을 유발하는 방법으로서,
    청구항 1 내지 9 중 어느 한 청구항의 비-천연적으로 발생하는 fHbp 또는 청구항 10 내지 14 중 어느 한 청구항의 면역원성 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항체 반응을 유발하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 투여 단계가 엔. 메닌기티디스에 대한 살균(bactericidal) 항체를 생성하기 위한 것인, 포유동물에서 항체 반응을 유발하는 방법.
  17. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 청구항의 fHbp를 암호화하는, 핵산.
  18. 청구항 17의 핵산을 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  19. 청구항 17의 핵산 또는 청구항 18의 재조합 발현 벡터를 포함하는, 유전학적으로 변형된 숙주 세포.
  20. 면역원성 조성물로서,
    a) 청구항 1 내지 9 중 어느 한 청구항의 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 암호화하는 핵산으로 유전학적으로 변형된 나이세리아 (Neisseria) 숙주 세포로부터 수득된 소포체로서, 이로써 상기 암호화된 비-천연적으로 발생하는 fHbp가 상기 유전학적으로 변형된 숙주 세포에 의해 생성되도록 하고, 상기 소포체는 상기 암호화된 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 포함하는, 상기 소포체; 및
    b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 면역원성 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 소포체가 원산(native) 외막 소포체인, 면역원성 조성물.
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 숙주 세포가 lpxL1 유전자 및/또는 lpxL2 유전자의 폴리펩타이드 생성물의 감소된 활성 또는 활성 부재를 제공하도록 유전학적으로 변형된, 면역원성 조성물.
  23. 청구항 20 내지 22 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 숙주 세포가 나이세리아 항원의 증가된 발현을 제공하도록 유전학적으로 변형된, 면역원성 조성물.
  24. 포유동물에서 항체 반응을 유발하는 방법으로서,
    청구항 20 내지 23 중 어느 한 청구항의 면역원성 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항체 반응을 유발하는 방법.
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