KR20160031028A - 조직 인자 경로 억제자에 대한 항체 - Google Patents

조직 인자 경로 억제자에 대한 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조직 인자 경로 억제자(TFPI)에 특이적으로 결합하여 혈액의 응고 시간을 감소시키는 항체에 대한 것이다. 이런 항체는 응고장애가 있는 개체의 치료에 유용하다.

Description

조직 인자 경로 억제자에 대한 항체{ANTIBODIES AGAINST TISSUE FACTOR PATHWAY INHIBITOR}
본 발명은 조직 인자 경로 억제자(TFPI)에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 것이다.
혈우병 A 및 B를 앓고 있는 인간과 같은, 응고장애를 앓고 있는 개체에서, 응고 캐스케이드의 다양한 단계가 예를 들면, 응고 인자의 부재 또는 불충분한 존재에 기인한 기능장애를 나타낸다. 응고 캐스케이드의 한 부분의 이런 기능 장애는 불충분한 혈액 응고 및 잠재적으로 생명을 위협하는 출혈, 또는 관절과 같은 내부 기관의 손상 기관을 초래한다. 혈우병 A 및 B가 있는 인간과 같은 개체는 각각 외인성 FVIIIa 또는 FIXa와 같은 응고 인자 교체 요법을 받을 수 있다. 그러나 이런 환자는 이런 외인성 인자에 대한 "억제자"(항체)를 발달시켜 이전의 치료의 효능을 비효과적이게 할 위험이 있다. 더욱이, 외인성 응고 인자는 환자에게 상당한 불편 및 불쾌감을 주는 정맥으로만 투여할 수 있다. 예를 들면, 유아 및 어린아이는 정맥에 대한 접근을 보장하기 위하여 가슴 정맥에 외과수술로 삽입된 정맥 카테터를 가져야만 할 수도 있다. 이것은 그들을 박테리아성 감염을 발달시킬 큰 위험에 처하게 한다. 응고장애가 있는 개체는 그들의 일반적인 삶의 질에 종종 영향을 미치는 예방적 평가보다는 오직 출혈이 시작된 후에 치료를 받을 수 있다.
따라서, 일반적으로 혈우병 집단, 특히, 응고장애가 있는 개체에서 아직 채워지지 않은 많은 임상적 요구가 있다.
혈관벽에 상처가 났을 때, 조직 인자(TF)는 혈액 순환의 내용물을 노출시키고, TF는 TF-함유 세포의 표면에서 인자 VII/활성화 인자 VII(FVII/FVIIa)와 복합체를 형성한다. 이것은 트롬빈(FIIa)의 제한량을 생성하는 FVa와 함께 인자 X(FX)를 FXa로 활성화시킨다. 트롬빈의 소량은 혈소판을 활성화시켜 FVIIIa/FIXa로 구성되는 테나아제 복합체의 결합을 지지하는 인지질의 표면 노출을 야기하는 시킨다.
테나아제 복합체는 이 후에 전체 트롬빈 분발(burst)을 촉진하는 FXa를 대량으로 생산한다. 전체 트롬빈 분발은 기계적으로 강한 피브린 구조의 형성 및 지혈성 마개의 안정이 요구된다. FVIII 또는 FIX는 혈우병 환자에서 없거나 낮은 수준으로 존재하고, 테나아제 활성의 결핍 때문에, FXa를 생성하는 능력이 낮고, 응고의 전파 단계를 지지하는데 불충분하다. 대조적으로, TF-매개 개시 단계는 테나아제 복합체의 형성에 의존하지 않는다. 그러나 TF-신호전달 경로는 초기 FXa 생성 후 곧, 혈장 억제자에 의해 차단될 것이다.
조직 인자 경로 억제자(TFPI)는 FXa의 촉매 활성을 중화시키는 것에 의해, FXa가 존재하는 TF-FVII 복합체를 억제하는 것에 의해 진행중인 응고를 하향 조절한다. TFPI는 표면에서 TF/FVIIa/FX 복합체를 억제하거나 FVIIa/TF 억제가 뒤따르는 분비된 FXa를 억제한다.
본 발명의 개요
본 발명자들은 조직 인자 경로 억제자("TFPI", 때때로 "TFPI1"으로서 지칭됨)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 확인함으로써 그의 활성을 조절하였다. 본 발명은 이들 항체 및 이들 항체로부터 유래하거나 이들 항체와 유사한 결합 성질을 갖는 다른 관련 항체에 대한 것이다.
따라서, 본 발명은 조직 인자 경로 억제자(TFPI)에 특이적으로 결합하고, 예를 들면, (a) 인간 FVII-결핍 혈장 및/또는 (b) 인간 전혈에서 응고 시간을 감소시키는 항체에 대한 것이다.
한 항체는 서열번호 4의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 중쇄 가변 영역를 포함한다. 다른 항체는 서열번호 15의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 18의 중쇄 가변 영역를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 경쇄 및/또는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 같은, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오티드 및 조성물을 (a) 응고장애(출혈 장애)의 치료 또는 예방, 또는 (b) 혈액 응고의 자극에서의 용도를 위해 제공한다. 즉, 본 발명은 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오티드 또는 조성물의 효과량을 치료용 또는 예방용으로 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, (a) 응고장애(출혈 장애)의 치료 또는 예방, 또는 (b) 혈액 응고의 자극을 위한 방법을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 상기 본 발명의 단일클론 항체의 투여 요법을 제공한다.
도 1은 인간 생식계열의 서열 및 인간화 TFPI4F36의 초기 CDR 접목(grafted) 버전과 정렬된, 마우스 항-TFPI4F36A1B2(또한 본원에서 MuTFPI4F36 또는 4F36으로서 지칭됨)의 VH(A) 및 VL(B) 도메인의 서열을 보여준다. 카밧 넘버링 체계가 상기 서열을 가리킨다.
도 2는 설치류 항체 TFPI4F36A1B2(MuTFPI4F36)의 VH 및 VL 서열에 대한 뉴클레오티드 서열 및 번역된 폴리펩티드 서열을 보여준다.
도 3은 설치류 4F36 항체, MuTFPI4F36의 Fab 절편의 경쇄 A) 및 중쇄(B)의 아미노산 서열을 보여준다. 상기 서열의 넘버링은 카밧에 따라 보여주었다. CDR 루프에 상응하는 위치는 카밧 넘버링에서 굵게 밑줄친 문자로 강조하였다. 파라토프를 구성하는 아미노산 잔기는 굵게 밑줄친 문자로 강조하였다. 파라토프는 MuTFPI4F36 Fab 및 TFPI K2 도메인 사이에서 복합체의 X-레이 구조로부터 결정되었고, K2에서의 중원자로부터 4 보다 적은 거리안의 중원자를 갖는 Fab에서의 잔기로서 정의되었다.
도 4는TFPI의 서열을 보여준다(신호 펩티드 서열은 생략함). Kunitz 도메인은 볼드체로 보여준다: TFPI Kunitz 도메인 1=아미노산 26 내지 76; TFPI Kunitz 도메인 2=아미노산 97-147; TFPI Kunitz 도메인 3=아미노산 188-238. TFPI의 C-말단 부분은 아미노산 240 내지 276에서 이탤릭체로 보여준다.
도 5는 TFPI에서 잔기의 상대적인 접근성을 보여준다. 40%보다 큰 접근성을 가지는 잔기는 아미노산 94-95, 98, 100-110, 118-121, 123-124, 131, 134, 138-142 및 144-145이다.
도 6은 TFPI Kunitz 도메인 2(K2) 및 MuTFPI4F36 Fab 절편(Fab) 사이에서 복합체의 SEC HPLC 분석을 보여준다. SEC-HPLC 크로마토그램은 자유 K2(짙은 선, rt 13.1분, 13.134에서 보여진 피크), 자유 Fab(대시 선, rt 11.7분, 11.676에서 보여진 피크) 및 복합체(점선, rt 11.5분, 11.496에서 보여진 피크)를 UV 280 nm에서 검출하였다. 복합체의 샘플은 ~20% 초과한 K2를 함유하였다.
도 7은 MuTFPI4F36 Fab:K2 복합체의 전체적 구조를 보여준다. 경쇄는 옅은 회색으로 나타내었고, 중쇄는 짙은 회색으로 나타내었다. 카밧 체계에 따라 정의된 CDR 루프는 L1 내지 L3 및 H1 내지 H3으로서 표지하였다.
도 8은 MuTFPI4F36 Fab와의 복합체에서 TFPI의 K2 도메인의 구조를 보여준다(Fab 분자는 보여주지 않음). N-및 C-말단 및 이차 구조 요소를 표지하였다.
도 9는 K2 구조의 주쇄 중첩을 보여준다. K2 용액 사이의 구조에서의 차이를 보여주는, K2는 돼지 트립신와의 복합체에서 MuTFPI4F36 Fab 및 K2와의 복합체로 있다.
도 10은 K2에서의 MuTFPI4F36 결합 에피토프를 보여준다. (A) 잔기의 곁쇄가 있는 TFPI의 K2 도메인의 카툰 묘사는 볼 및 스틱으로서 나타낸 결합 에피토프를 포함한다. (B)는 표면을 첨가하여 A와 같이 나타내었다. (C) 결합 에피토프를 일차 서열에 매핑하였다. 볼드체, 이탤릭체 및 밑줄친 문자는 각각 MuTFPI4F36 Fab 중쇄만(위치 10, 11, 13, 28, 31, 33 및 35), 경쇄만(위치 21, 23 및 50), 및 중쇄 및 경쇄 모두(17, 19, 34 및 36)와 접촉하는 K2-결합 에피토프의 잔기와 상응한다. 이차 구조 요소(h=나선, s=쉬트)를 가리킨다(위치 5-8 및 50-56에서의 나선 및 위치 20-26 및 31-37에서의 쉬트). 회색으로 강조한 잔기(위치 1-2 및 59-66)는 발현된 단백질 나타내지만, N- 및 C-말단은 유연하기 때문에 결정 구조에서 관찰되지 않는다.
도 11은 설치류 MuTFPI4F36 및 인간화 HzTFPI4F36 Fab 절편에 대한 동일한 결합 방법을 설명해주는, K2:MuTFPI4F36 Fab 및 K2:HzTFPI4F36 Fab 복합체의 주쇄 추적의 비교를 보여준다. K2:MuTFPI4F36 Fab는 회색으로, K2:HzTFPI4F36 Fab는 검은색으로 보여준다. 구조는 Fab 절편의 가변 영역 사이에서의 매치를 최적화하기 위해 중첩되었다.
도 12는 TNFα/IL1β로 자극된 HUVEC의 표면 위의 FX의 TF/FVIIa-유도 활성화에서의 항-TFPI 단일클론 항체(mAbs)의 효과를 보여준다. FX의 활성화는 HUVEC의 단일층에 채워진 25 mM HEPES, 137 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 5 mM CaCl2, 1 mg/ml BSA(0.1%) pH 7.4의 버퍼에서 0-20 nM mAB(mAbTFPI 2021 또는 mAb 2974), 50 pM FVIIa(NovoSeven) 및 50 nM FX의 존재하에서 측정하였다. 생성된 FXa 활성은 405 nM에서의 흡수의 증가에 의해 측정된 S-2765를 사용한 아미드분해 분석에서 결정하였다.
도 13은 MDamB 231 세포의 표면에서 FX의 TF/FVIIa-유도 활성화의 TFPI 억제에서 항-TFPI mAb의 효과를 보여준다. FX의 활성화는 MDamB 231 세포의 단일층에 채워진 25 mM HEPES, 137 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 5 mM CaCl, 1 mg/ml BSA(0.1%) pH 7.4의 버퍼에서 0-20 nM mAb(Hz mAbTFPI 2021 또는 mAb 2974), 2.5 nM flTFPI, 100 pM FVIIa 및 50 nM FX의 존재하에서 측정하였다. 생성된 FXa 활성은 405 nM에서의 흡수의 증가에 의해 측정된 S-2765를 사용한 아미드분해 분석에서 결정하였다.
도 14는 mAbTFPI 2021("mAb4F36") 및 mAb2974(n=2)에 대한 결합에서 TFPI Kunitz 2 도메인 내의 선별 잔기의 단일 아미노산 알라닌 치환의 효과를 보여준다. 선별된 잔기는 mABTFPI 2021 결합 에피토프의 일부이다. 아미노산 잔기의 넘버링은 도 10C에서 확인된 것과 같다.
도 15는 대조군 IgG(혈우병) 또는 설치류 항-TFPI 항체, TFPI-4F36A1B2("4F36", MuTFPI4F36)로 처리한 후 일시적 혈우병 토끼에서 측정된 큐티클 출혈 시간 및 혈액 손실을 보여준다.
도 16은 출혈을 유도한지 5분 후, HzTFPI4F36("항-TFPI", mAbTFPI 2021)(2 mg/kg) 또는 NovoSeven(9mg/kg)를 처리한, 항체-유도 혈우병이 있는 토끼를 "요구가 있는 즉시" 치료할 때의 큐티클 출혈 시간(단일 관찰; 평균±SEM) 및 혈액 손실(평균+SEM)을 보여준다. 출혈은 1시간(3600초)동안 관찰되었다.
도 17은 출혈을 유도한지 30분 전에 HzTFPI4F36("항-TFPI", mAbTFPI 2021)(투여량: 0.5, 1, 2 mg/kg) 또는 아이소타입 대조군 항체를 전처리하였을 때, 항체-유도 혈우병이 있는 토끼에서 큐티클 출혈 시간(단일 관찰; 평균±SEM) 및 혈액 손실(평균+SEM)을 보여준다. 출혈은 1시간(3600초)동안 관찰되었다.
도 18은 항-fVIII 항체로 자극하고, 항-TFPI-항체("항-TFPI ab", MuTFPI4F36)를 투여한 뒤, 출혈을 일으킨 다음, 개별 동물에서 측정된 혈소판 수를 보여준다. 이것은 본원에서 기술된 것과 같은 설치류 항-TFPI 항체 4F36(MuTFPI4F36)의 존재하에서 대조군 혈우병 모델에서 수행되었다.
도 19는 0시간에서 20 mg/kg HzTFPI4F36를 처리한 토끼에서 자유 HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)의 혈장 농도를 보여준다. 큐티클 출혈 실험은 96시간(4일), 168시간(7일) 및 240시간(10일)째에서 수행되었다. 점선은 투여량-반응 연구에서 찾아낸 바 HzTFPI4F36의 '효과적인 농도' 범위를 가리킨다(도 17 참조).
도 20: 출혈을 유도하기 전 4, 7 또는 10일에서 20 mg/kg의 HzTFPI4F36(n=8) 또는 아이소타입 대조군 항체(n=12)을 전처리하였을 때, 항체-유도 혈우병이 있는 토끼에서, 왼쪽 패널: 혈장 HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)(왼쪽 축:m) 및 큐티클 출혈 시간(평균±SEM;n). 오른쪽 패널: 혈장 HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)(왼쪽 축;m) 및 혈액 손실(평균+SEM;n). 출혈은 1시간(3600초)동안 관찰되었다.
도 21은 원숭이에게 HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)를 IV 및 SC 투여한 후의 혈장 농도 수준을 보여준다. 3개의 하위 그래프에서, 두 마리 원숭이는 2주 간격으로 3가지의 HzTFPI4F36 투여량을 투여받았다. 하위 왼쪽에서, 2, 20 및 80 mg/kg의 세 가지 투여량이 투여되었고, 하위 중간에서 20, 80 및 160 mg/kg의 세 가지 투여량이 투여되었고, 하위 오른쪽에서 80, 160 및 200 mg/kg의 세 가지 투여량이 투여되었다. 상위 왼쪽에서 20 mg/kg의 단일 투여량이 세 마리 원숭이에게 투여되었고; 상위 오른쪽에서 단일 IV 투여량이 세 마리 원숭이에게 투여되었다. 그래프에서 점은 개별 관찰을 나타내고, 선은 모델 적합을 나타낸다.
도 22는 매일 SC로 투여된 1 mg/kg의 HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)의 시뮬레이션을 보여준다. 굵은 수평선은 시뮬레이션된 혈장 농도 수준을 나타내고, 점 수평선은 효과 데이터로부터 추론한 상위의 효과적 농도를 나타낸다.
도 23은 매 3주마다 정맥 투여된 15 mg/kg의 HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)의 시뮬레이션을 보여준다. 굵은 수평선은 시뮬레이션된 혈장 농도 수준을 나타내고, 점 수평선은 효과 데이터로부터 추론한 상위의 효과적 농도를 나타낸다.
도 24는 매 2주마다 정맥 투여된 20 mg/kg의 HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)의 시뮬레이션을 보여준다. 굵은 수평선은 혈장 농도 수준을 나타내고, 점 수평선은 효과 연구로부터 추론한 예상되는 표적 포화를 나타낸다.
서열 목록의 간단한 설명
서열번호 1은 인간 TFPI의 아미노산 서열을 제공한다(신호 펩티드 서열은 생략되었다).
서열번호 2는 항체의 결합 에피토프를 결정하는데 사용한 컨스트럭트의 아미노산 서열을 제공한다. 컨스트럭트는 인간 TFPI의 아미노산 91 내지 150 및 C-말단 His6 표지를 포함한다.
서열번호 3, 5 및 4는 MuTFPI4F36(TFPI-4F36A1B2) 단일클론 항체의 경쇄 가변 도메인(VL)의 폴리뉴클레오티드(센스 및 안티센스) 및 폴리펩티드 서열을 제공한다. 서열번호 6은 MuTFPI4F36(TFPI-4F36A1B2) 단일클론 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 신호 펩티드 서열은 생략되었다.
서열번호 7, 9 및 8은 MuTFPI4F36(TFPI-4F36A1B2) 단일클론 항체의 중쇄 가변 도메인(VH)의 폴리뉴클레오티드(센스 및 안티센스) 및 폴리펩티드 서열을 제공한다. 서열번호 10은 MuTFPI4F36(TFPI-4F36A1B2) 단일클론 항체의 중쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 신호 펩티드 서열은 생략되었다.
서열번호 11은 중쇄 가변 도메인 증폭에 사용된 역 프라이머의 서열을 제공하고, 서열번호 12는 경쇄 증폭에 사용된 역 프라이머의 서열을 제공한다.
서열번호 13-15는 인간화 단일클론 항체, HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)의 경쇄 가변 도메안(VL)에 대한 센스 폴리뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 각각 제공한다. 신호 펩티드 서열은 생략되었다.
서열번호 16-18은 인간화 단일클론 항체, HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)의 중쇄 가변 도메인(VH)에 대한 센스 폴리뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 각각 제공한다.
서열번호 19-21은 인간화 단일클론 항체, HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)의 경쇄(LC)에 대한 센스 폴리뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 각각 제공한다.
서열번호 22-24는 인간화 단일클론 항체, HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)의 중쇄(HC)에 대한 센스 폴리뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 각각 제공한다.
서열번호 25-26은 CDRgrafted HzTFPI4F36의 경쇄 가변 도메인의 핵산 및 아미노산 서열을 각각 제공한다. 신호 펩티드 서열은 생략되었다.
서열번호 27-28은 CDRgrafted HzTFPI4F36의 중쇄 가변 도메인의 핵산 및 아미노산 서열을 각각 제공한다. 신호 펩티드 서열은 생략되었다.
서열번호 29는 CDRgrafted HzTFPI4F36(인간 카파 사슬)의 경쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 신호 펩티드 서열은 생략되었다.
서열번호 30은 인간 IgG4(S241P)인 CDRgrafted HzTFPI4F36의 중쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 신호 펩티드 서열은 생략되었다.
서열번호 31은 MuTFPI4F36의 경쇄의 인간화에 사용된 생식계열 서열, VKII_A18/JK4를 제공한다. 신호 펩티드 서열은 생략되었다.
서열번호 32는 MuTFPI4F36의 중쇄의 인간화에 사용된 생식계열 서열, VH3_21/JH6을 제공한다. 신호 펩티드 서열은 생략되었다.
서열번호 33은 MuTFPI4F36A1B2 중쇄 Fab의 아미노산 서열을 제공한다. 신호 펩티드는 생략되었다.
서열번호 34는 HzTFPI4F36 중쇄 Fab의 아미노산 서열을 제공한다. 신호 펩티드는 생략되었다.
본 발명은 TFPI에 결합하는 항체에 대한 것이다. 항체는 바람직하게는 TFPI에 특이적으로 결합하는데, 즉, 그들은 TFPI에는 결합하지만 다른 분자에는 결합하지 않거나 더 낮은 친화성으로 결합한다. 특히, 본 발명은 TFPI에 결합하여 그것의 활성을 조절하는 항체에 대한 것이다. 본 발명의 항체는 따라서 응고 시간을 짧게 하는 능력을 소유할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 인간 FVIII-결핍 혈장에서 응고 시간을 짧게 하거나 인간 전혈의 혈전탄성묘사기(TEG) 분석에서 측정된 바 응고시키기 위한 시간을 감소시키는 능력을 가질 수 있다. 또한 본 발명은 치료적 및 약학적 용도와 같은 이런 항체에 대한 용도에 대한 것이다.
용어 TFPI는 본원에서 사용된 바 임의의 적절한 유기체로부터 유래할 수 있는 TFPI의 임의의 천연 발생형을 포함한다. 예를 들면, 본원에서 기술된 바의 용도를 위한 TFPI는 인간, 마우스, 래트, 영장류, 소, 양, 또는 돼지 TFPI와 같은 포유동물 TFPI일 수 있다. 바람직하게는 TFPI는 인간 TFPI이다. TFPI는 적절한 세포 내에서 번역-후 과정을 겪은 TFPI와 같은 TFPI의 성숙형일 수 있다. 이런 성숙 TFPI 단백질은 예를 들면, 글리코실화될 수 있다. TFPI는 전장 TFPI 단백질일 수 있다. 또한 용어 TFPI는 이런 TFPI 분자의 변이체, 아이소폼 및 다른 상동체를 포함한다. 변이체 TFPI 분자는 FXa의 촉매 활성을 중화시키는 능력, 또는 TF-FVIIa/FXa의 복합체를 억제하는 능력과 같은 천연 발생 TFPI와 같은 활성의 동일한 형태를 가짐으로써 일반적으로 특징화 될 것이다.
본 발명의 항체는 TFPI에 결합하는 능력을 가질 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 TFPI에 특이적으로 결합할 것이다. 즉, 본 발명의 항체는 바람직하게는 그것이 다른 분자에 결합하는 것보다 TFPI에 더 큰 결합 친화성으로 결합할 것이다. 본 발명의 항체는 본원에서 기술된 바의 임의의 표적 분자에 본원에서 기술된바의 TFPI 분자가 결합하거나 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있다.
용어 "결합 친화성"은 본원에서 두 개의 분자, 예컨대 및 항체, 또는 이의 절편, 및 항원 사이의 비-공유 상호작용의 세기의 측정으로서 사용된다. 용어 "결합 친화성"은 단량체 상호작용을 기술하기 위하여 사용된다(내재적 활성).
단량체 상호 작용을 통한 두 가지 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 절편, 및 항원 사이의 결합 친화성은 해리 상수(KD)의 정의에 의해 정량화할 수 있다. 차례로, KD는 복합체 형성 및 해리의 동역학의 측정, 예컨대, SPR 방법(Biacore)에 의해 결정할 수 있다. 단량체 복합체의 결합 및 해리에 상응하는 속도 상수는 각각 결합 속도 상수 ka(또는 kon) 및 해리 속도 상수 kd(또는 koff)로서 지칭된다. KD는 방정식 KD=kd/ka를 통해 Ka 및 Kd와 관련된다.
앞선 정의에 따라서 다른 분자 상호작용과 연관된 결합 친화성, 예컨대 주어진 항원에 대한 다른 항체의 결합 친화성의 비교는 개별 항체/항원 복합체에 대한 KD 값의 비교에 의해 비교할 수 있다.
유사하게, 상호작용의 특이성은 관심없는 상호작용의 KD 값에 대하여 관심있는 상호작용, 예컨대 항체 및 항원 사이의 특이적 상호작용에 대한 KD 값의 결정 및 비교에 의해 평가할 수 있다.
전형적으로, 표적에 대한 항체의 KD는 비연관된 물질 또는 환경에 수반하는 물질과 같은 다른 비표적 분자에 대한 KD에 비하여 2배, 바람직하게는 5배, 더욱 바람직하게는 10배 적을 것이다. 더욱 바람직하게는, KD는 50배 적거나, 100배 적거나, 200배 적고; 더욱 더 바람직하게는 500배 적거나, 1,000배 적거나, 10,000배 적을 것이다.
이 해리 상수의 값은 공지의 방법에 의해 직접 결정할 수 있고, 이들, 예를 들면, Caceci et al.(Byte 9:340-362, 1984)에 보이는 것과 같은 방법에 의해 복합체 혼합물에 대하여서도 추정할 수 있다. 예를 들면, KD는 Wong & Lohman(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)에 의해 개시된 것과 같은 이중필터 니트로셀룰로오스 필터 결합 분석을 사용하여 확립할 수 있다. 표적을 향한 항체와 같은 리간드의 결합 능력을 평가하기 위한 다른 표준 분석은 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유세포 분석기 분석을 포함하여 당업계에 공지이다. 또한, 항체의 결합 동역학 및 결합 친화성은 표면 플라즈몬 공명(SPR)과 같은 당업계에 알려진 표준 분석에 의해, 예컨대 Biacore™ 시스템을 사용하는 것에 의해 평가할 수 있다.
경쟁 결합 분석은 표적에 대한 항체의 결합이 다른 항체와 같은, 그 표적의 다른 리간드에 의한 표적의 결합과 비교하여 수행할 수 있다. 50% 억제가 일어나는 농도는 Ki로서 알려져 있다. 이상적 조건 하에서, Ki는 KD와 동등하다. Ki 값은 보다 절대 낮을 수 없을 것이고, 그래서 Ki의 측량은 KD에 대한 상위 한계를 제공하기 위해 편리하게 치환할 수 있다.
본 발명의 항체는 그의 표적에 대하여 1×10-7M 또는 그 이하, 1×10-8M 또는 그 이하, 또는 1×10-9M 또는 그 이하, 또는 1×10-10M 또는 그 이하, 1×10-11M 또는 그 이하, 또는 1×10-12M 또는 그 이하의 KD를 가질 수 있다.
그의 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 높은 친화성으로 그의 표적과 결합할 수 있고, 즉, 앞에서 기술된 바와 같은 낮은 KD를 나타내고, 낮은 친화성으로 다른, 비표적 분자와 결합할 수 있다. 예를 들면, 항체는 1×10-6M 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 1×10-5 M 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 1×10-4 M 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 1×10-3 M 또는 그 이상, 더욱 더 바람직하게는 1×10-2 M 또는 그 이상의 KD로 비표적 분자에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 그의 표적에 대하여 즉 적어도 2배, 10배, 50배, 100배 200배, 500배, 1,000배 또는 10,000배의 친화성 또는 다른 비표적 분자에 대한 결합에 대한 그것의 친화성보다 더 높은 친화성으로 결합할 수 있다.
표적 분자는 천연 발생 TFPI 분자, 완전 성숙 TFPI 분자 또는 전장 TFPI 분자와 같은 본원에서 기술된 것과 같은 임의의 TFPI 분자일 수있다. 바람직한 TFPI 분자는 완전 성숙, 천연 발생, 전장 포유동물 TFPI 분자이다. 예를 들면, TFPI 분자는 본원에서 기술된 것과 같은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 절편 또는 다른 변이체로 구성되거나 이를 포함할 수 있다.
표적 분자는 TFPI 분자의 절편과 같은 TFPI 분자의 변이체일 수 있다. 예를 들면, 표적 분자는 항체 결합에 대한 적절한 에피토프를 보유하는 TFPI의 절편 또는 다른 변이체일 수 있다. 예를 들면, 표적 분자는 본원에서 기술된 것과 같은 에피토프를 계속 유지하는 TFPI의 절편 또는 다른 변이체일 수 있다. 표적 분자는 이런 에피토프를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 표적 분자는 전장 TFPI 분자이다. 전장 TFPI 분자는 본원에서 기술된 것과 같은 제 1, 제 2 및 제 3 Kunitz 도메인을 포함할 수 있다. 전장 TFPI 분자는 본원에서 기술된 것과 같은 제 1, 제 2 및 제 3 Kunitz 도메인, 본원에서 기술된 것과 같은 카르복시 말단 영역를 또한 포함할 수 있다. 전장 TFPI 분자는 TFPI 유전자로부터 발현되거나 TFPI 발현 세포에서 분비된 전장 TFPI 폴리펩티드와 같은 천연 발생 TFPI 분자일 수 있다. 전장 TFPI 분자는 혈장에서 자유 형태로 순환하는 것에서 찾거나, 내피 세포와 같은 세포에 결합해 있는 것으로서의 천연 발생 TFPI 분자일 수 있다. 전장 TFPI 분자는 본원에서 기술된 것과 같은 천연-발생 축약된 TFPI 분자와 같은 축약된 TFPI 분자가 아니다.
한 구체예에서, 표적 분자는 축약된 TFPI 분자이다. 예를 들면, 축약된 TFPI 분자는 카르복시 말단 절단을 포함할 수 있다. 예를 들면, TFPI의 다수의 천연-발생 축약형이 알려져있다. 이들은 TFPI의 카르복시 말단 부분의 일부 또는 전부의 절단을 포함할 수 있다. 그들은 하나 이상의 Kunitz 도메인의 일부 또는 전부의 절단을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, TFPI의 축약형은 카르복시 말단 부분 및 제 3 Kunitz 도메인의 일부 또는 전부의 결실을 포함할 수 있다.
예를 들면, TFPI의 한 천연 발생 축약형은 전장 TFPI 분자의 오직 아미노산 1 내지 161(본원에서 TFPI(1-161)로서 지칭됨)만을 포함한다. TFPI(1-161)은 전장 분자와 비교하여 감소된 활성을 갖는 TFPI의 활성형이다. TFPI(1-161)는 전장 TFPI와 구조가 다르고, 표적 분자로서 TFPI(1-161)에 대하여 생성된 항체는 따라서 전장 TFPI에 대하여 생성된 항체와 다를 수 있다.
TFPI의 축약형은 전장 TFPI의 영역, 즉, TFPI(1-161)에 대한 항체를 표적하는 것을 원할 때, 적당한 표적 분자일 수 있다. 그러나 축약된 TFPI는 바람직하게는 항체가 천연 발생 축약된 TFPI와 같은 TFPI의 특이적 축약형에 대하여 유도되는 것을 원할 때 표적 분자로서 사용된다.
한 구체예에서 표적 분자는 TFPI의 천연 발생형이다. 이것은 그것이 생체 내에 존재하는 형태에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 표적 분자는 상술한 바와 같은 전장 천연-발생 TFPI일 수 있다. 표적 분자는 상술한 바와 같은 축약된 천연-발생 TFPI일 수 있다. 표적 분자는 그것이 생체 내 혈장에서 존재하는 형태의 TFPI일 수 있다. 표적 분자는 생체 내 혈장에서 존재하는 것과 같은 동일한 방법으로 지질 단백질에 결합한 TFPI일 수 있다. 표적 분자는 내피 세포에 결합한 TFPI와 같은, 생체 내에서 일으키는 것과 동일한 방법에서 세포에 결합한 TFPI일 수 있다. 본 발명의 항체는 임의의 하나 이상의 TFPI의 이들 천연 발생형과 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 TFPI의 이들 천연 발생형 모두와 결합할 수 있거나, 일부와는 결합할 수 있지만, 일부와는 결합할 수 없는, 이들 다른 형태 사이를 구별할 수 있다.
한 구체예에서, 표적 분자는 TFPI의 제 2 Kunitz 도메인이거나 이를 포함한다. 이런 표적 분자는 서열번호 1의 아미노산 97 내지 147 또는 서열번호 1의 아미노산 91 내지 150 또는 다른 TFPI 폴리펩티드로부터 나온 등가의 Kunitz 도메인 2 영역을 포함할 수 있다. 이런 표적 분자는 서열번호 2 또는 서열번호 2의 아미노산 3 내지 58 또는 10 내지 50을 포함할 수 있다. 표적 분자는 TFPI의 제 2 Kunitz 도메인의 절편이거나, 이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 표적 분자는 제 2 Kunitz 도메인으로부터 나온 5개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 12개 또는 그 이상 또는 15개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
표적 분자는 TFPI 또는 TFPI의 특정 Kunitz 도메인 또는 C 말단 부분과 같은 TFPI의 특정 영역의 표면 접근이 용이한 잔기를 5개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 12개 또는 그 이상 또는 15개 또는 그 이상 포함할 수 있다. 표면 접근이 용이한 잔기는 40% 이상의 상대적 접근용이성을 갖는 잔기이다. 예를 들면, TFPI(서열번호 1)의 Kunitz 2 도메인은 하기 아미노산이 40% 이상의 상대적 접근 용이성을 갖는다: 94-95, 98, 100-110, 118-121, 123-124, 131, 134, 138-142 및 144-145(도 5 참조). 표적 분자는 이들 잔기의 5개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 12개 또는 그 이상 또는 15개 또는 그 이상을 포함하는 TFPI의 절편과 같이, 이들 잔기의 5개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 12개 또는 그 이상 또는 15개 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
표적 분자는 TFPI로부터 나온 알려진 에피토프를 포함할 수 있다.
용어 "에피토프"는, 본원에서 사용된 바, "항원 결합 폴리펩티드"(Ab) 및 그것의 상응하는 "항원"(Ag) 사이의 분자 상호작용의 문맥에서 정의된다. 본원에서 사용된 바, 용어 Ab는 상응하는 Ag에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 절편을 포함한다. 항원-결합 절편의 예시는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv(전형적으로 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인), 단일사슬 Fv(scFv; 예컨대. Bird et al., Science 1988; 242:42S-426; 및 Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883 참조), dsFv, Fd(전형적으로 VH 및 CHI 도메인), 및 dAb(전형적으로 VH 도메인) 절편; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 도메인; 단일 VH 및 단일 VL 사슬을 포함하는 단량체 분자; 미니 항체, 이량체 항체, 삼량체 항체, 사량체 항체, 및 카파 항체(예컨대, Ill et al.. Protein Eng 1997;10:949-57 참조); 카멜 IgG; IgNAR;뿐만 아니라 분리된 CDR 또는 항원-결합 잔기 또는 폴리펩티드가 기능적 항체 절편을 형성하도록 함께 회합하거나 결합할 수 있을 때, 하나 이상의 분리된 CDR 또는 기능적 파라토프을 포함한다. 항체 절편의 다양한 타입은 예컨대, Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; WO2005040219, 및 공개된 미국 특허 출원 20050238646 및 20020161201에서 기술하거나 개괄하였다.
항체 절편은 전통적인 재조합 또는 단백질 공학 기술을 사용하여 얻을 수 있고, 절편은 항원-결합 또는 다른 기능에 대하여 완전한 항체에서 할 수 있는 것과 동일한 방법으로 스크리닝할 수 있다.
용어 항원(Ag)은 Ag를 인식하는 항체(Ab)를 생산하는 면역성 척추동물의 면역화에 사용된 분자 실재물을 지칭한다. 여기서, Ag는 더 넓게 칭하고, 일반적으로 Ab에 의해 특이적으로 인식되는 표적 분자를 포함하는 것으로 여겨지고, 따라서 Ab를 일으키기 위한 면역화 과정에서 사용된 분자의 절편 또는 미믹을 포함한다. 따라서, TFPI의 제 2 kunitz 도메인(K2)에 대한 Ab의 결합을 위하여, 분리된 K2 및 TFPI의 축약형 및 다른 변이체를 포함하는 전장 TFPI를 Ag로서 지칭한다.
보통, 용어 "에피토프"는 Ab가 특이적으로 결합하는 Ag 위의 범위 또는 영역, 즉 Ab와 물리적으로 접촉하는 범위 또는 영역을 지칭한다. 단백질 에피토프는 Ab에 대한 결합에 직접적으로 포함되는 Ag의 아미노산 잔기(또한 에피토프의 면역우성 구성요소로 불림) 및, Ab에 의해 효과적으로 차단되는 Ag의 아미노산 잔기와 같은 결합에 직접적으로 포함되지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(바꾸어 말하면, 아미노산 잔기는 Ab의 "용매-제외 표면" 및/또는 "풋프린트"에 있다). 본원에서 용어 에피토프는 달리 언급하지 않는 한, 항-TFPI 항체에 특이적으로 결합하는 TFPI의 K2의 임의의 특정 영역에서 결합 부위, 또는 본 발명에 따른 다른 K2-특이적 제제의 형태를 둘 다 포함한다(예컨대, 일부 문맥에서, 본 발명은 특정 아미노산 잔기에 직접적으로 결합하는 항체를 지칭한다). K2는 (1) 선형 펩티드 항원성 결정자, (2) 성숭 K2 입체 배좌에서 서로 가까이 위치하는 하나 이상의 비-인접성 아미노산으로 구성되는 입체 배좌 항원성 결정자; 및 (3) 카보하이드레이트 기와 같이 K2에 공유적으로 부착된 분자 구조의 전체 또는 일부 중 어느 하나로 구성되는 번역 후 항원성 결정자를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는 다수의 다른 에피토프를 포함할 수 있다.
주어진 항체(Ab)/항원(Ag) 쌍에 대한 에피토프는 다양한 실험적 및 컴퓨터를 사용한 에피토프 매핑 방법을 사용하여 상세함의 다른 수준에서 결정되고 특징화될 수 있다. 실험적 방법은 돌연변이 생성, X-선 결정학, 핵 자기 공명(NMR) 분광기, 수소 중수소 교환 질량 분석(HX-MS) 및 다양한 경쟁 결합 방법을 포함한다. 각각의 방법이 독특한 원리에 의지하기 때문에, 에피토프의 기술은 그것이 결정된 방법과 친밀히 관련된다. 따라서, 주어진 Ab/Ag 쌍에 대한 에피토프는 사용한 에피토프 매핑 방법에 의존하여 다르게 정의될 것이다.
그것의 가장 상세한 수준에서, Ag 및 Ab 사이의 상호작용에 대한 에피토프는 Ag-Av 상호작용에 존재하는 원자 접촉으로 정의되는 공간적 배위뿐만 아니라 그들이 결합 열역학에 대한 상대적 기여에 대한 정보에 의해 정의될 수 있다. 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 Ag 및 Ab 사이의 원자 접촉으로 정의되는 공간적 배위에 의해 특징화될 수 있다. 더욱 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 특이적 크리테리움에 의해 결정된 바, 예컨대 Ab 및 Ag에서의 원자 사이의 거리를 포함하는 아미노산 잔기에 의해 특징화될 수 있다. 더욱 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 기능을 통해, 예컨대 다른 Ab와의 경쟁 결합에 의해 특징화될 수 있다. 또한, 에피토프는 다른 아미노산에 의한 치환이 Ab 및 Ag 사이의 상호작용의 특징을 바꿀 것인 아미노산 잔기를 포함하는 것과 같이 더욱 일반적으로 결정될 수 있다.
Ab, 예컨대 Fab 절편, 및 그것의 Ag 사이의 복합체의 공간적 배위에 의해 결정된 X-선 유도 결정 구조의 문맥에서, 본원의 용어 에피토프는 문맥에서 달리 언급하거나 부정하지 않는 한, Ab의 중원자로부터 4 의 거리 내에 있는 중원자(즉 비-수소 원자)를 갖는 것으로서 특징화되는 K2 잔기로서 특이적으로 지칭된다.
에피토프의 기술 및 정의에 대한 사실은, 사용한 에피토프 매핑 방법에 의존하여, 상세함의 다른 수준으로 얻어지고, 이어지는 동일한 Ag 위의 다른 Ab에 대하여 에피토프의 비교가 상세함의 다른 수준을 유사하게 수행할 수 있다.
아미노산 수준에서 기술된, 예컨대 X-선 구조로부터 결정된 에피토프는 만약 그들이 아미노산 잔기의 동일한 세트를 함유한다면 동일한 것으로 언급된다. 에피토프는 만약 적어도 하나의 아미노산이 에피토프에 의해 공유된다면 겹치는 것으로 언급된다. 에피토프는 만약 아미노산 잔기가 에피토프에 의해 공유되지 않을 때, 분리된(유일한) 것으로 언급된다.
경쟁 결합에 의해 특징화된 에피토프는 만약 Ab의 상응하는 결합이 상호 배타적일 때, 즉, 한 Ab의 결합이 다른 Ab의 결합을 동시에 방해할 때, 겹치는 것으로 언급된다. 에피토프는 만약 Ag가 상응하는 Ab 모두와의 동시 결합을 수용할 수 있을 때, 분리된(유일한) 것으로 언급된다.
용어 "파라토프"의 정의는 원근법을 거꾸로함으로써 상기 "에피토프"의 정의로부터 유래한다. 따라서, 용어 "파라토프"는 Ag가 특이적으로 결합하는, 즉 그것이 Ag와의 물리적 접촉을 만드는 Ab의 범위 또는 영역을 지칭한다.
Ab, 예컨대 Fab 절편, 및 그것의 Ag 사이의 복합체의 공간적 배위에 의해 정의된 X-선 유도 결정 구조의 문맥에서, 용어 파라토프는 본원에서 달리 문맥에서 명기하거나 부정하지 않는 한, K2의 중원자로부터 4 의 거리 내에 있는 중원자(즉 비-수소 원자)를 갖는 것으로서 특징화되는 Ag 잔기로서 특이적으로 정의된다.
주어진 항체(Ab)/항원(Ag) 쌍에 대한 에피토프 및 파라토프는 일상적 방법에 의해 확인할 수 있다. 예를 들면, 에피토프의 일반적 위치는 다른 절편 또는 변이체 TFPI 폴리펩티드에 결합하는 항체의 능력을 평가하는 것에 의해 결정될 수 있다. 항체와 접촉하는 TFPI 내의 특정 아미노산(에피토프) 및 TFPI 내의 특정 아미노산(파라토프)은 또한 예시에서 기술된 것들과 같은, 일상적 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 항체 및 표적 분자는 결합할 수 있고, Ab/Ag 복합체는 결정화될 수 있다. 복합체의 결정 구조를 결정할 수 있고, 항체 및 그것의 표적 사이의 상호작용의 특이적 부위를 확인하기위해 사용할 수 있다.
본 발명자들은 본원에서 기술한 설치류 MuTFPI4F36 항체뿐만 아니라 인간화 HzTFPI4F36 항체, 및 TFPI의 Kunitz 2 도메인(K2) 사이의 상호작용에 대한 이런 분석을 수행하였다. 이 분석은 실시예에서 더욱 상세히 기술한다.
본 발명에 따른 항체의 파라토프는 하기와 같이 정의될 수 있다: 상기 항체의 경쇄는 서열번호 15의 잔기 E31, S32, D33, Y37, A96, T97, 및 F99를 포함하고, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 18의 잔기 N31, S52, R53, S54, Y57, Y59, F60, P61, D62, Q65, Y102, D103 및 D106을 포함한다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄는 따라서 서열번호 15의 아미노산 잔기:
·위치 31에 상응하는 위치에서 E,
·위치 32에 상응하는 위치에서 S,
·위치 33에 상응하는 위치에서 D,
·위치 37에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 96에 상응하는 위치에서 A,
·위치 97에 상응하는 위치에서 T 및
·위치 99에 상응하는 위치에서 F를 포함할 수 있고;
상기 항체의 중쇄는 서열번호 18의 아미노산 잔기:
·위치 31에 상응하는 위치에서 N,
·위치 53에 상응하는 위치에서 R,
·위치 54에 상응하는 위치에서 S,
·위치 57에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 59에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 60에 상응하는 위치에서 F,
·위치 61에 상응하는 위치에서 P,
·위치 62에 상응하는 위치에서 D,
·위치 65에 상응하는 위치에서 Q,
·위치 102에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 103에 상응하는 위치에서 D 및
·위치 106에 상응하는 위치에서 D를 포함할 수 있다.
중쇄는 서열번호 18의 위치 52에 상응하는 위치에서 S를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄는 서열번호 15의 위치 98에 상응하는 위치에서 H를 더 포함할 수 있고, 중쇄는 서열번호 18의 위치 56에 상응하는 위치에서 S를 더 포함할 수 있다.
MuTFPI4F36(실시예 4)에 대하여, 에피토프는 서열번호 2의 아미노산 E10, E11, P13, R17, Y19, T21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 및 L50에 상응하는, 서열번호 1의 아미노산 E100, E101, P103, R107, Y109, T111, Y113, Q118, Q121, E123, R124, F125, K126 및 L140로 구성되는 것으로 밝혀졌다. 파라토프는 서열번호 4의 경쇄 아미노산 잔기 E31, S32, D33, Y37, A96, T97, H98 및 F99 및, 서열번호 8의 중쇄 아미노산 잔기 N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, P61, D62, Q65, Y102, D103 및 D106로 구성되는 것으로 밝혀졌다.
HzTFPI4F36(실시예 5)에 대하여, 에피토프는 서열번호 2의 아미노산 E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, K36 및 L50에 상응하는, 서열번호 1의 아미노산 E100, E101, D102, P103, R107, Y109, T111, Y113, F114, N116, Q118, Q121, C122, E123, R124, F125, K126 및 L140로 구성되는 것으로 밝혀졌다. 파라토프는 서열번호 15의 경쇄 아미노산 잔기 E31, S32, D33, Y37, A96, T97 및 F99 및, 서열번호 18의 중쇄 아미노산 잔기 N31, S52, R53, S54, Y57, Y59, F60, P61, D62, Q65, Y102, D103 및 D106로 구성되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 항체는 본원에서 특이적으로 기술된 본 발명의 항체로서 TFPI의 동일한 에피토프 또는 도메인에 결합할 수 있다. 예를 들면, 다른 아직 확인되지 않은 본 발명의 항체는 단일클론 항체, MuTFPI4F36 및/또는 HzTFPI4F36의 결합과 TFPI에 대한 그들의 결합을 비교함으로써; 또는 MuTFPI4F36 및/또는 HzTFPI4F36의 기능과 아직 확인되지 않은 항체의 기능을 비교함으로써 확인할 수 있다. 이런 확인을 위한 목적을 위해 사용될 수 있는 분석은 실시예 6에서 기술된 FXa 억제 분석 및 실시예 7에서 기술된 FVIIa/TF/FXa 억제 분석과 같은 TFPI 중화 분석; 실시예 8에서 기술된 표면 플라즈몬 공명 분석과 같은 결합 상호작용 분석; 실시예 9에서 기술된 인간 배꼽 혈관 내피 세포(HUVEC)에서의 TFPI의 중화, 및 실시예 10에서 기술된 MDamB 231 인간 유방 암종 세포에서 TF/FVIIa 활성의 TFPI 억제의 중화와 같은 세포 분석을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체는 본원에서 기술한 MuTFPI4F36 또는 HzTFPI4F36 항체와 같은 동일한 에피토프 또는 영역에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 MuTFPI4F36 또는 HzTFPI4F36 항체와 같은 TFPI에서 동일한 에피토프에 결합하는 항체일 수 있다. 이것은 상기에서 기술한 바 TFPI의 특정 아미노산과 접촉하는 존재를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 서열번호 2의 아미노산 E10, E11, P13, R17, Y19, T21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 및 L50과 접촉하는 방법 또는 서열번호 2의 아미노산 E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, K36 및 L50과 과 접촉하는 방법으로 TFPI와 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, F35, K36 및 L50로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 E10를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 E11를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 D12를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 P13를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 R17를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 Y19를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 T21를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 Y23를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 F24를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 N26를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 Q28를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 Q31를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 C32를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 E33를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 R34를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 F35를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 K36를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 L50를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, K36 및 L50를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 2의 잔기 E10, E11, P13, R17, Y19, T21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 및 L50를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다..
본 발명의 항체는 본워에서 기술된 것과 같은 TFPI 또는 다른 적당한 표적에 결합하기 위한 본 발명의 다른 항체와 경쟁하는 능력을 가질 수 있다. 예를들면, 본 발명의 항체는 TFPI 또는, TFPI의 적절한 절편 또는 변이체에 대한 결합을 위해 본원에서 기술한 MuTFPI4F36 또는 HzTFPI4F36 항체와 교차-경쟁, 즉, MuTFPI4F36 또는 HzTFPI4F36 항체를 제한할 수 있다. 이런 교차-경쟁 항체는 표준 결합 분석에서 알려진 본 발명의 항체와 교차-경쟁하는 그들의 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 예를 들면, 예컨대 Biacore™ 시스템을 사용한 SPR, ELISA 분석 또는 유세포 분석기를 교차-경쟁을 증명하기 위해 사용할 수 있다. 이런 교차-경쟁은 두 항체가 동일하거나, 겹치거나 유사한 에피토프와 결합하는 것을 시사할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 하기 시판하는 단일클론 항체 중 임의의 하나 이상보다 높은 친화성으로 TFPI의 K2 도메인과 결합할 수 있다: mAb0281(Ab systems) 및/또는 mAb4904(American Diagnostica) 및/또는 mAb2974(R&D systems) 및/또는 mAb29741(R&D systems).
그러므로, 본 발명의 항체는 시험 항체가 표적 분자 위의 결합 부위에 대하여 알려진 본 발명의 항체와 경쟁할 수 있는지 여부를 평기하는 결합 분석을 포함하는 방법에 의해 확인할 수 있다. 경쟁 결합 분석을 수행하기 위한 방법은 당업계에 공지이다. 예를 들면 그들은 항체가 표적 분자에 결합할 수 있는 조건을 사용한, 표적 분자에 대한 알려진 본 발명의 항체의 결합을 포함할 수 있다. 항체/표적 복합체는 이후 시험 항체에, 시험 항체가 평가할 수 있는 항체/표적 복합체로부터 본 발명의 항체를 바꿀 수 있는 정도로 노출될 수 있다. 대안적 방법은 항체 결합을 허용하는 조건 하에서 표적 분자와 시험 항체를 접촉시키는 단계, 이후 표적 분자와 결합할 수 있는 본 발명의 항체를 첨가하는 단계, 및, 본 발명의 항체가 항체/표적 복합체로부터 시험 항체를 바꿀 수 있는 정도인지 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
표적에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 화합물이 표적에 대한 결합을 위해 본 발명의 항체와 경쟁할 수 있고, 따라서 그 시험 항체가 알려진 본 발명의 항체와 같이 TFPI 단백질의 동일한 에피토프 또는 영역에 결합할 수 있는지 증명한다. 이런 방법에서 알려진 본 발명의 항체와 경쟁하는 것으로 확인된 시험 항체는 또한 잠재적인 본 발명에 따른 항체이다. 시험 항체가 알려진 본 발명의 항체와 같은 동일한 영역에서 TFPI와 결합할 수 있고 알려진 본 발명의 항체와 경쟁할 수 있다는 사실은 시험 항체가 알려진 항체와 같이 동일한 결합 부위에서 리간드로서 작용할 수 있고, 그 시험 항체는 따라서 알려진 항체의 작용을 미믹할 수 있음을 시사한다. 이것은 본원에서 기술된 바 시험 화합물의 존재에서 TFPI의 활성을 평가하는 것에 의해 확인할 수 있다.
알려진 본 발명의 항체는 본원에서 기술된 바와 같이, 설치류 TFPI-4F36A1B2(또는 4F36 및 MuTFPI4F36로서 지칭됨) 항체, 또는 본원에서 기술된 것과 같이, 그 중 하나가 본원에서 HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)로서 지칭되는 인간화 TFPI-4F36A1B2 항체와 같은, TFPI에 결합하는 능력을 계속 유지하는 이의 임의의 변이체 또는 절편일 수 있다. 본 발명의 항체는 본원에서 기술된 바 MuTFPI4F36 항체 또는, HzTFPI4F36와 같이 TFPI에 결합할 수 있는 능력이 계속 유지되는, 본원에서 기술된바 이의 임의의 변이체 또는 절편와 같은 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 실시예에서 더욱 상세히 설명하는 바 MuTFPI4F36 에피토프와 동일하거나, 겹치거나 유사한 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 실시예에서 더욱 상세히 설명하는 바 HzTFPI4F36 에피토프와 동일하거나, 겹치거나 유사한 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 MuTFPI4F36 및/또는 HzTFPI4F36에 속하는 하나 이상의 아미노산 잔기에 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 MuTFPI4F36 또는 HzTFPI4F36의 결합을 위해 상기에서 제시한 아미노산 잔기의 5개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상과 결합할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 폴리펩티드와 접촉할 때, 본 발명의 항체는 폴리펩티드와 결합할 수 있고, 아미노산 E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, F35, K36 및 L50 또는 이들 아미노산의 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17 또는 적어도 18가 같은, 이들 아미노산의 서브세트와 접촉할 수 있다.
특이적 결합은 표적이 아닌 분자에 대한 항체의 결합을 참조하여 평가할 수 있다. 이 비교는 표적 및 다른 분자에 결합하는 항체의 능력일 비교하는 것에 의해 만들어질 수 있다. 이 비교는 KD 또는 Ki의 평가에서 상술된 바와 같이 만들어질 수 있다. 이런 비교에서 사용된 다른 분자는 표적 분자가 아닌 임의의 분자일 수 있다. 바람직하게는 다른 분자는 표적 분자와 동일하지 않다. 바람직하게는 표적 분자는 표적 분자의 절편이 아니다.
본 발명의 항체의 KD는 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.025 nM 이하, 0.015 nM 이하, 0.015 nM 내지 0 nM 사이일 수 있다.
특이적 결합을 결정하는데 사용된 다른 분자는 표적과 구조 또는 기능에서 관련되지 않을 수 있다. 예를 들면, 다른 분자는 관련되지 않은 물질 또는 환경에서 수반되는 물질일 수 있다.
특이적 결합을 결정하는데 사용된 다른 분자는 표적 분자와 같은 동일한 생체 내 신호전달 경로에 포함된 다른 분자일 수 있다. 예를 들면, 표적이 TFPI 또는 이의 절편 또는 변이체일 때, 비교를 위해 사용된 다른 분자는 혈액 응고 캐스캐이드의 일부를 형성하는 단백질일 수 있다. 본 발명의 항체가 다른 이런 분자를 능가하는 TFPI에 대한 특이성을 갖는 것을 확실하게 하는 것에 의해, 원하지 않는 생체 내 교차-반응을 피할 수 있다.
비교에 사용된 다른 분자는 표적 분자와 연관될 수 있다. 예를 들면, 오직 특정 에피토프에만 결합하는 항체를 확인하는 것을 원할 때, 비교를 위한 분자는 에피토프가 결실되거나 붕괴된 TFPI 분자일 수 있다. 비교에 사용된 분자는 따라서 문제의 항체에 의해 결합된 표적 분자와 상이한 다른 표적 분자일 수 있다.
본 발명의 항체는 표적 분자와 관련된 일부 준자에 결합하는 능력을 계속 유지할 수 있다. 예를 들면, 전장 성숙 인간 TFPI를 표적으로서 사용할 수 있지만, 항체는 또한 예컨대, 인간 TFPI의 비성숙형, 인간 TFPI의 절편 또는 축약형, 지질 단백질 또는 세포에 결합된 TFPI, 다른 포유동물 TFPI와 같은 다른 종으로부터 나온 TFPI와 결합할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 특정 표적 분자에 대한 특이성을 가질 수 있다. 예를 들면, 본원에서 기술된 바 하나의 표적 분자에 결합할 수 있지만, 본원에서 기술된 바 다른 표적 분자에는 결합하지 않거나 유의하게 낮은 친화성으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 전장 성숙 인간 TFPI는 표적으로서 사용할 수 있지만, 표적에 결합하는 항체는 예컨대, 인간 TFPI의 비성숙형, 인간 TFPI의 절편 또는 축약형, 지질 단백질 또는 세포에 결합된 TFPI, 다른 포유동물 TFPI와 같은 다른 종으로부터 나온 TFPI와 결합할 수 없거나, 더 낮은 친화성으로 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 TFPI와 결합할 수 있고, 그렇게 함으로서 TFPI의 활성을 억제할 수 있다.
앞에서 설명된 바, TFPI는 혈액 응고를 하향조절한다. 이것은 FXa의 활성을 억제하는 것에 의해 및 FXa가 존재할 때 TF-FVII복합체를 억제하는 것에 의해 이를 행한다. 본 발명의 항체에 의해 억제된 TFPI의 활성은 임의의 이들 활성 및 이들의 임의의 하류 효과일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 혈액 응고의 증가, FXa의 존재 또는 수준의 증가 또는 TF-FVIIa의 증가된 활성으로 이어질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 (a) 인간 FVIII 결핍 혈장 또는(b) 인간 전혈과 접촉하였을 때, 응고 시간을 감소시킨다.
TFPI 활성의 측정은 혈액 샘플에서 응고를 억제시키거나 응고 시간을 감소시키는 TFPI의 활성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이런 방법은 TFPI를 응고가 일어나야만 하는 조건 하에서 혈액 응고 인자를 포함하는 혈액 또는, 혈장 또는 혈청과 같은 혈액 산물 샘플을 접촉시키는 단계 및, TFPI의 존재에 의해 혈액의 응고가 억제되거나 응고 시간이 감소되는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이런 샘플에서 혈액 응고 또는 응고 시간의 수준은 이후 시험 항체가 또한 존재하는 동일한 샘플에서 비교될 수 있다. 만약 항체 샘플에서 응고 수준이 증가하거나 응고 시간이 감소되었다면, 이것은 항체가 샘플에서 TFPI의 활성을 억제하는 것을 시시한다.
혈액 응고는 혈액 그 자신, 혈장의 응고 또는 TFPI의 작용이라고 말해도 좋을 정도까지 하류에 놓인 응고 캐스케이드의 하나 이상의 특징에 대하여 찾는 것에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면, 방법은 샘플에서 FXa의 수준 또는 TF-FVIIa의 활성화를 평가할 수 있다.
혈액 응고 및 응고 시간을 평가하기 위한 다양한 다른 방법은 당업계에 공지이다. 예를 들면, 혈액 응고 시간에서의 항체의 임의의 효과는 실시예에서 기술한 바 희석한 프로트롬빈 시간 분석(dPT 분석)을 사용하여 평가할 수 있다. 간략하면, 인간 혈장을 인간 트롬포플라스틴과 접촉시킨다. 혈장이 응고하기 위해 걸리는 시간을 시험 항체의 존재 및 부재에서 측정한다. 응고 시간을 감소시킬 것으로 예상되는 FVIIa(NovoSeven)의 첨가와 같은 양성 대조군을 이런 분석에서 사용할 수 있다. 본 발명의 항체는 이런 방법에서 응고 시간을 감소시킬 수 있어야만 한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 투여량 의존적 방법으로 응고 시간을 감소시킬 수 있어야 한다.
본 발명의 항체는 dPT 분석과 같은 혈장-기반 응고 분석에서 하기 시판하는 항체 중 임의의 하나 이상보다 TFPI를 억제하는 것이 유의하게 더 좋을 수 있다: mAb0281(Ab systems) 및/또는 mAb4904(American Diagnostica) 및/또는 mAb2974(R&D systems) 및/또는 mAb29741(R&D systems).
혈전탄성묘사기를 전혈 샘플에서 혈전 형성 및 섬유소용해의 동역학을 평가하는데 사용할 수 있다. 응고 시간을 감소시키거나 혈액 응고를 촉진하는 항체의 능력은 따라서 항체의 존재 및 부재에서 혈전 형성에 걸리는 시간과 비교하는 것에 의해 전혈 샘플에서와 유사하게 평가된다.
본 발명의 항체의 기능적 효과를 평가하는 방법은 따라서 시험관 내에서 수행될 수 있다. 이런 방법은 인간 혈액 또는 혈장 샘플에서 수행될 수 있다. 이런 샘플은 정상 인간 혈액 또는 혈장일 수 있거나, 혈액 응고에 포함되는 하나 이상의 인자가 결핍되어 있거나 보충될 수 있다. 예를 들면, 이들 방법은 정상 인간 전혈, 정상 인간 혈장 또는 FVIII-결핍 혈장 또는 전혈을 사용하여 수행될 수 있다. FVIII-결핍 혈액 또는 혈장은 항-fVIII 항체로 중성화한 적절한 혈액 또는 혈장과 접촉시키는 것에 의해 생성될 수 있다. 이런 시험관 내 방법은 실시예 6-11에서 기술된 것들과 같은 결합 상호작용 분석 또는 TFPI 중성화 분석일 수 있다.
본 발명의 항체는 혈소판 결합 TFPI를 억제할 수 있다.
본 발명의 항체는 가용성 TFPI를 억제할 수 있다.
본 발명의 항체는 지질단백질-결합 TFPI를 억제할 수 있다.
본 발명의 항체는 내피 세포에 결합된 TFPI와 같은, 세포-결합 TFPI를 억제할 수 있다.
본 발명의 항체는 FXa 억제 분석에서 측정된 바 FXa가 그 활성을 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 99-100% 유지하는 TFPI에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 TFPI가 상기 항체와 FVIIa/TF/FXa 억제자 분석에서 측정된 바 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100% 까지, 100% 포화되었을 때, 막-결합 FVIIa/TF/FXa의 TFPI를 중화시킬 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 (a) 인간 전혈, (b) 인간 혈장, (c) FVIII-결핍 인간 전혈, (d) FVIII-결핍 인간 혈장, (e) FIX-결핍 인간 전혈 또는 (f) FIX-결핍 인간 혈장의 샘플에서 응고 시간을 감소 및/또는 혈액 응고를 촉진시킬 수 있다.
혈액 응고를 촉진시키거나 응고 시간을 감소시키는 항체의 능력을 결정하는 방법은 또한 생체 내에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 생체 내 연구는 실시예에서 기술된 바 일시적 혈우병 토끼에서 수행될 수 있다. 간략하면, 토끼는 항-fVIII 항체의 투여에 의해 일시적 혈우병이 만들어질 수 있다. 시험 항체를 이후 투여할 수 있고, 큐티클 출혈 시간 및/또는 혈소판 수를 평가할 수 있다. 시험 항체의 존재 하에서 큐티클 출혈의 감소는 항체가 응고 시간을 감소시키고 혈액 응고를 촉진시킬 수 있음을 지칭한다. 이런 효과를 갖는 항체는 따라서 본 발명의 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 개체에서 자유 TFPI의 퍼센트가 30% 이하, 29% 이하, 28% 이하, 27% 이하, 26% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0%로 감소된 TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 항체는 개체에서 자유 TFPI의 수가 상기 개체에 상기 단일클론 항체를 투여한지 첫 28일 동안, 첫 27일 동안, 첫 26일 동안, 첫 25일 동안, 첫 24일 동안, 첫 23일 동안, 첫 22일 동안, 첫 21일 동안, 첫 20일 동안, 첫 19일 동안, 첫 18일 동안, 첫 17일 동안, 첫 16일 동안, 첫 15일 동안, 첫 14일 동안, 첫 13일 동안, 첫 12일 동안, 첫 11일 동안, 첫 10일 동안, 첫 9일 동안, 첫 8일 동안, 첫 7일 동안, 첫 6일 동안, 첫 5일 동안, 첫 4일 동안, 첫 3일 동안, 첫 2일 동안, 첫 1일 동안 감소된 TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 혈소판 수의 유의한 감소로 이어지지 않을 수 있다. 특히, 본 발명의 항체는 혈소판 수의 임의의 유의한 감소를 야기하지 않고, (a) 인간 전혈, (b) 인간 혈장, (c) FVIII-결핍 인간 전혈(d) FVIII-결핍 인간 혈장, (e) FIX-결핍 인간 전혈 또는(f) FIX-결핍 인간 혈장의 샘플 또는 동물 생체 내에서 응고 시간을 감소 및/또는 혈액 응고를 촉진할 수 있다. 혈소판 수는 앞서 논의된 다른 효과와 같이 동일한 샘플 또는 동물에서 평가할 수 있거나, 분리되어 평가할 수 있다. 예를 들면, 혈소판 수는 환자 또는 실험 동물로부터 얻은 혈액 샘플과 같은 혈액 샘플에서 평가할 수 있다. 혈소판 수는 상술한 바 일시적 혈우병 토끼에게 항체를 투여한 후 평가할 수 있다. 본 발명의 항체는 일시적 혈우병 토끼에서의 생체 내 연구에 의해 예시된 바, 혈소판 수의 감소를 동시에 야기하지 않고, 큐티클 출혈 시간을 감소시킬 수 있다. 혈소판 수의 변화는 항체 투여 전 후의 혈소판 수를 비교하거나 관심있는 항체로 처리한 샘플 또는 동물 및, 대조군 샘플 또는 항체를 처리하지 않은 동물 사이의 혈소판 수를 비교하는 것에 의해 평가할 수 있다. 본 발명의 항체는 개체의 생체 내 응고 시간이 감소되고, 상기 개체의 혈소판 수가 유의하게 감소되지 않은 TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있다. 예를 들면, 상기 개체의 혈소판 수는 원래 혈소판 수의 대략 80%, 대략 75%, 대략 70%, 대략 65%, 대략 60%, 대략 55%, 대략 50%, 대략 45%, 대략 40%, 대략 35%, 대략 30%, 대략 25%로 떨어지지 않을 수 있다. 바람직하게는, 이런 비교를 했을 때, 혈소판 수에서 차이가 없거나, 통계적으로 유의한 차이가 없을 것이다. 즉, 본 발명의 항체는 혈소판 수에서 임의의 감소를 유발하지 않을 것이다.
본원에서 지칭한 바 용어 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 절편(즉, "항원-결합 일부") 또는 단일 사슬을 포함한다. 항체는 이황화 결합으로 서로 연결된 적어도 두 개의 중쇄(HC) 및 두 개의 경쇄(LC), 또는 이의 항원 결합 일부를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다(본원에서 VH로 생략함). 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 생략함) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. VH 및 VL 영역은 나아가 프레임워크 영역(FR)로 불리는, 더 보존된 영역에 산재하는 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 더 나뉠 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예컨대, 이펙터 세포) 및 전통적 보체계의 제 2 구성요소(Clq)를 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역 글루불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명에서 사용하였을 때, 용어 "상보성-결정 영역" 또는 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상보성-결정 영역 또는 "CDR"은 보통 경쇄 가변 도메인에서 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및, 중쇄 가변 도메인에서 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); (Kabat et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) 및/또는 "초가변 루프"로부터 나온 이들 잔기(경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및, 중쇄 가변 도메인에서 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917)가 보통 포함된다. 전형적으로, 이 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 앞의 Kabat et al.에서 기술된 방법에 의해 수행된다. 본원에서 "카밧 위치", "카밧 잔기", 및 "카밧에 따른"과 같은 구절은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이 넘버링 시스템을 지칭한다. 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, 펩티드의 실질적인 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR에서의 단축 또는 삽입에 상응하는 아미노산을 더 적거나 추가로 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 53 이후에 아미노산 삽입(카밧에 따라 잔기 52a, 52b 및 52c) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후에 삽입된 잔기(예컨대 카밧에 따라 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 "표준" 카밧 넘버링 서열을 사용하여 항체의 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다.
용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 기술된 바, CDR 내에 있지 않은 이들 VH 또는 VL 아미노산 잔기를 지칭한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체일 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. 본 발명의 항체는 이의 임의의 키메라 항체, CDR접목 항체, 인간 또는 인간화 항체 또는 항원 결합 일부일 수 있다. 단일클론 및 다중클론 항체 모두의 생산을 위해, 실험 동물은 염소, 토끼, 래트 또는 마우스와 같은 포유류가 적절하지만, 이에 제한되지 않는다.
다중클론 항체는 다른 B 세포주로부터 유래한 항체이다. 다중클론 항체는 특정 항원에 대하여 유도된 다른 면역글로불린 분자의 혼합물을 포함한다. 다중클론 항체는 항원 분자 내의 하나 이상의 다른 에피토프에 결합하는 다른 면역글로불린 분자의 혼합물을 포함한다. 다중클론 항체는 관심있는 항원을 사용한 적절한 동물의 면역화와 같은 일상적 방법에 의해 생산될 수 있다. 혈액을 동물로부터 실질적으로 제거할 수 있고 면역글로불린 분획을 정제할 수 있다.
단일클론 항체는 서로 동일하고, 특정 에피토프에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화성을 갖는 면역 글로불린 분자이다. 본 발명의 단일클론 항체(mAb)는 전통적 단일클론 항체 방법론, 예컨대, Kohler and Milstein(1975) Nature 256: 495의 표준 체세포 혼성화 기술, 또는 B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질도입을 포함하는 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 설치류 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 정립된 절차이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화된 비장 세포의 분리에 대한 기술이 당업계에 알려져 있다. 융합 파트너(예컨대, 설치류 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 알려져 있다.
본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위하여, 면역화된 마우스로부터 비장 세포 및/또는 림프절 세포를 분리하고, 마우스 골육종 세포주와 같은 적당한 불멸화 세포와 융합시킬 수 있다. 결과적인 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝될 수 있다. 항체를 분비하는 하이브리도마는 재플레이팅하여 다시 스크리닝할 수 있고, 만일 적절한 IgG에 대하여 여전히 양성이라면, 단일클론 항체는 한계 희석에 의해 적어되 2회 서브클로닝될 수 있다. 안정한 서브클론은 이후 특징화를 위해 조직 배양 배지에서 항체의 소량을 생성하도록 시험관 내에서 배양될 수 있다.
용어 항체의 "항원-결합 일부"는 본원에서 기술된 바 TFPI 또는 다른 표적 단백질과 같은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지하는 항체의 하나 이상의 절편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 절편에 의해 수행될 수 있음을 보여주었다. 용어 항체의 "항원-결합 일부"에 포함되는 결합 절편의 예시는 Fab 절편, F(ab')2 절편, Fab' 절편, Fd 절편, Fv 절편, dAb 절편 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. scFv와 같은 단일 사슬 항체 및 VHH 및 카멜 항체와 같은 중쇄 항체가 또한 용어 항체의 "항원-결합 일부"에 포함되는 것으로 여겨진다. 이들 항체 절편은 당업자에게 알려진 전통적인 기술을 사용하여 얻을 수 있고, 절편은 완전한 항체와 같이 동일한 수단에서 사용하기 위해 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 항체는 (a) 관심있는 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 동물(예컨대, 마우스) 또는 그들로부터 제조된 하이브리도마로부터 분리된 항체, (b) 관심있는 항체를 발현하기 위해 형질도입된 숙주 세포, 예컨대, 형질도입종(transfectoma)으로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에서 면역글로불린 유전자의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 방법에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창조되거나 분리된 항체와 같이 재조합 방법에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창조되거나 분리될 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바, 프레임워크 영역 및 CDR 영역 모두에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유래한 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것을 의도한다. 더욱이 만약 항체가 불변 영역을 함유한다면, 또한 불변 영역은 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예컨대, 시험관 내 무작위 또는 위치 지정 돌연변이 생성에 의해 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나 용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바, 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래한 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 접목된 항체를 포함하는 것을 의도하지 않는다.
이런 인간 항체는 인간 단일클론 항체일 수 있다. 이런 인간 단일클론 항체는 불멸화 세포와 융합된, 인간 중쇄 이식 유전자 및 경쇄 이식 유전자를 포함하는 유전체를 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예컨대, 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마로부터 생산될 수 있다.
인간 항체는 천연 및 합성 서열 다양성으로 더 다각화된 인간 생식계열 서열의 선별에 의거한 서열 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
인간 항체는 인간 림프구의 시험관 내 면역화에 이은 앱스테인-바 바이러스를 사용한 림프구의 형질도입에 의해 제조될 수 있다.
용어 "인간 항체 유도체"는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예컨대, 항체 및, 다른 제제 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소한의 서열(CDR 영역)을 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체를 지칭하는 것을 의도한다. 인간화 항체는 따라서 수령자의 초가변 영역으로부터 나온 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종(수여자 항체)의 초가변 영역으로부터 나온 잔기로 교체된 인간 면역글로불린(수령자 항체)이다. 일부 보기에서, 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 교체된다. 이런 변형의 예시는 실시예 2에서 기술된 바와 같이, 하나 이상의 소위 역-돌연변이의 도입이다.
더욱이, 인간화 항체는 수령자 항체 또는 수여자 항체에서 찾을 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 정련되게 만들 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 초가변 루프의 전부 또는 실질적인 전부가 비-인간 면역글로불린의 이들에 상응하고, FR 잔기의 전부 또는 실질적인 전부가 인간 면역글로불린 서열의 이들인 적어도 하나, 전형적으로 두 개의 가변 도메인의 실질적인 전부를 포함할 것이다. 또한 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 그것의 적어도 일부를 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 예를 들면, 표준 ELISA 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 표적 단백질의 결합에 대하여 시험할 수 있다. 또한, ELISA 분석은 표적 단백질에 대한 양성 반응을 보여주는 하이브리도마에 대한 스크리닝에 이용될 수 있다. 또한, 항체의 결합 특이성은 표적 단백질을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 모니터하는 것, 예를 들면, 유세포 분석기에 의해 결정될 수 있다.
표적 단백질에 대한 본 발명의 항체의 특이성은 항체가 다른 단백질에 결합하는지 여부를 결정하는 것에 의해 더 연구될 수 있다. 예를 들면, TFPI 또는 TFPI의 특정 부분, 예컨대 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 것을 원할 때, 항체의 특이성은 항체가 다른 분자 또는 관심있는 부분이 결실된 TFPI의 변형된 형태에도 결합하는지 여부를 결정하는 것에 의해 평가될 수 있다.
앞에서 설명된 바, 본 발명의 항체는 TFPI의 활성을 변형시킬 수 있다. 따라서, 요구되는 결합 성질을 갖는 항체는 따라서 TFPI의 활성에서 그들의 효과를 결정하기 위하여 더 시험할 수 있다. 따라서, 방법은 TFPI에 결합할 수 있고, 그것의 활성을 변형, 특히 감소시킬 수 있는 적절한 항체를 확인하는데 사용할 수 있다.
일단 적절한 항체가 확인되고 선별되면, 항체의 아미노산 서열은 당업계에 알려진 방법에 의해 확인할 수 있다. 항체를 암호화하는 유전자는 특이적 및/또는 축퇴성 프라이머를 사용하여 클로닝할 수 있다. 항체는 일상적 방법에 의해 재조합적으로 생산할 수 있다.
"폴리펩티드"는 본원에서 두 개 또는 그 이상의 서브유니트 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 다른 펩티도미메틱스의 화합물을 지칭하기 위하여 그의 가장 넓은 의미로 사용되었다. 따라서 용어 "폴리펩티드"는 짧은 펩티드 서열 및 또한 더 긴 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 본원에서 사용된 바, 용어 "아미노산"은 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, D 및/또는 L 광학 이성체, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱스를 지칭할 수 있다.
본 발명자들은 실시예에서 기술된 바 설치류 항체를 확인하였다. 이 항체는 TFPI-4F36A1B2(대안적으로, 4F36 또는 MuTFPI4F36)로서 본원에서 지칭하였다. 본 발명은 설치류 항체의 하나 이상의 활성을 계속 유지하고, 또한 실시예에서 기술되어 있는 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함하는 이 항체, 이의 변이체 및 절편을 포함한다. 이 항체의 활성은 TFPI에 결합하는 능력, TFPI의 특이적 위치에 결합하는 능력 및 TFPI의 활성을 억제하는 능력을 포함한다.
이 항체의 적절한 절편 또는 변이체는 TFPI에 결합하는 능력을 계속 유지할 것이다. 그것은 바람직하게는 TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지할 것이다. 그것은 바람직하게는 그것이 유래한 항체(MuTFPI4F36)로서 TFPI 분자의 동일하거나 유사한 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지할 것이다. 그것은 바람직하게는 선택적으로 혈소판 수를 떨어뜨리지 않고 TFPI 활성을 억제하는 능력 또는 응고 시간을 감소시키는 능력과 같은, 그것이 유래한 항체의 하나 이상의 추가적인 기능을 계속 유지할 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체 "절편"은 폴리펩티드의 N 및/또는 C-말단 끝으로부터 절단, 예컨대 하나 이상의 아미노산의 제거에 의해 만들어질 수 있다. 10개 까지, 20개 까지, 30개 까지, 40개 까지 또는 그 이상의 아미노산이 이 방법에서 N 및/또는 C 말단으로부터 제거될 수 있다. 또한, 절편은 하나 이상의 내부 결실에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 항체는 MuTFPI4F36 항체 또는 이의 변이체의 절편이거나 이를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 위에서 더 기술된 바 이 항체 또는 이의 변이체의 항원 결합 일부이거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 이 항체 또는 이의 변이체의 Fab 절편일 수 있거나, 이 항체 또는 이의 변이체로부터 유래한 단일 사슬 항체일 수 있다.
MuTFPI4F36 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 6 및 10에서 주어졌다. MuTFPI4F36 항체의 VL 및 VH 사슬에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 4 및 8에서 주어졌다. 한 인간화 항체, HzTFPI4F36의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 21 및 24에서 주어졌다. HzTFPI4F36의 VL 및 VH에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 15 및 18에서 주어졌다.
본 발명의 항체는 서열번호 6에 보여준 MuTFPI4F36 경쇄 아미노산 서열 또는 이의 절편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 항체는 본원에서 기술된 바 서열번호 10에서 보여준 MuTFPI4F36 중쇄 아미노산 서열 또는 이의 절편 또는 변이체를 추가적으로 또는 대안적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 4의 VL 아미노산 서열 또는 이의 절편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 서열번호 8의 VH 아미노산 서열 또는 이의 절편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 (a) 서열번호 4의 VL 아미노산 서열, 또는 이의 절편 또는 변이체 및 (b) 서열번호 8의 VH 아미노산 서열, 또는 이의 절편 또는 변이체를 둘 다 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 도 2에서 보여준 VL 또는 VH 아미노산 서열 중 하나의 절편을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 서열번호 4 또는 8로부터 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 18, 적어도 20 또는 적어도 25개의 연속적인 아미노산의 절편을 포함할 수 있다. 이런 절편은 바람직하게는 TFPI에 결합하는 능력과 같은 상술한 하나 이상의 기능을 계속 유지할 것이다.
이들 VH 및 VL의 임의의 적절한 절편 또는 변이체는 TFPI에 결합하는 능력을 계속 유지할 것이다. 그것은 바람직하게는 TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지할 것이다. 그것은 바람직하게는 그것이 유래한 항체(MuTFPI4F36)와 같이 TFPI 분자의 동일하거나 유사한 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지할 것이다. 그것은 바람직하게는 선택적으로 혈소판 수를 감소시키지 않고 TFPI 활성을 억제하는 능력 또는 응고 시간을 감소시키는 능력과 같이, 그것이 유래한 항체의 하나 이상의 추가적 기능을 계속 유지할 것이다.
적절한 절편 또는 변이체 VL 서열은 바람직하게는 서열번호 4에서 위치 E31, S32, D33, Y37, A96, T97, H98 및 F99의 아미노산을 계속 유지할 것이다. 적절한 절편 또는 변이체 VH 서열은 바람직하게는 서열번호 8에서 위치 N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, P61, D62, Q65, Y102, D103 및 D106의 아미노산을 계속 유지할 것이다. 적절한 절편 또는 변이체 항체는 바람직하게는 서열번호 4에서 위치 E31, S32, D33, Y37, A96, T97, H98 및 F99을, 서열번호 8에서 위치 N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, P61, D62, Q65, Y102, D103 및 D106의 아미노산을 계속 유지할 것이다. 도 3에서 확인한 바, 이들은 MuTFPI4F36가 TFPI의 K2 도메인에 결합했을 때, 중원자로부터 4Å의 거리 내에 있는 중원자를 갖는 MuTFPI4F36 경쇄 및 중쇄 서열에 있는 잔기이다.
본 발명의 항체는 서열번호 4 또는 8 내에서 나온 CDR 영역과 같이 본원에서 확인된 항체로부터 나온 CDR 영역을 포함할 수 있다. 이런 항체는 바람직하게는 본원에서 기술된 바 TFPI에 결합하는 능력을 계속 유지할 것이다. 예를 들면, 도 3에서 보여준 바, 카밧 정의를 사용하여, MuTFPI4F36의 경쇄 내의 CDR 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 24 내지 39, 55 내지 61 및 94 내지 102에서 확인할 수 있다. MuTFPI4F36의 중쇄 내의 CDR 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 31 내지 35, 50 내지 66 및 99 내지 110에서 확인할 수 있다. 본 발명의 항체는 도 3에서 보여준 하나 이상의 CDR 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 서열번호 6의 잔기 24 내지 39, 55 내지 61 및 94 내지 102에서 보여준 아미노산 서열의 하나, 두 개, 또는 세 개 전부를 포함할 수 있다. 발명의 항체는 서열번호 10의 잔기 31 내지 35, 50 내지 66 및 99 내지 110에서 보여준 아미노산 서열의 하나, 두 개, 또는 세 개 전부를 대안적으로 또는 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 서열번호 6의 잔기 24 내지 39, 55 내지 61 및 94 내지 102, 서열번호 10의 31 내지 35, 50 내지 66 및 99 내지 110에서 보여준 모든 여섯 개의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)로서 본원에서 지칭되는 항체와 같은, 인간화 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄는 아미노산 중 하나가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)의 CDR1 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄는 아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)의 CDR2 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄는 아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)의 CDR3 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄는 아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)의 CDR1 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄는 아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)의 CDR2 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄는 아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)의 CDR3 서열을 포함할 수 있다.
더 특히, 본 발명의 항체는:
·이번에는 서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)을 포함하는 CDR1 서열; 및
·이번에는 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)을 포함하는 CDR2 서열; 및
·이번에는 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄를 가질 수 있다.
본 발명의 항체는:
·이번에는 서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)을 포함하는 CDR1 서열; 및
·이번에는 서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)을 포함하는 CDR2 서열; 및
·이번에는 서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄를 가질 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 CDR 영역의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
더 특히, 본 발명의 항체의 중쇄의 프레임워크 영역 2(FR2)은 서열번호 18의 아미노산:
·위치 40에 상응하는 위치에서 T,
·위치 42에 상응하는 위치에서 E,
·위치 44에 상응하는 위치에서 R, 및
·위치 49에 상응하는 위치에서 A를 포함할 수 있다.
대안적으로, 상기 중쇄의 FR2는 서열번호 18의 아미노산 36 내지 49를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 하기 중 임의의 하나를 포함할 수 있다:
·서열번호 15의 VL 아미노산 서열.
·서열번호 18의 VH 아미노산 서열.
·서열번호 15 및 18.
·서열번호 21의 경쇄 아미노산 서열.
·서열번호 24의 중쇄 아미노산 서열.
·서열번호 21 및 24.
본 발명의 항체는 대안적으로 MuTFPI4F36 항체의 변이체 또는 HzTFPI4F36의 변이체 같은 이들 특이적 서열의 하나의 변이체이거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 변이체는 임의의 상기 아미노산 서열의 치환, 결실 또는 첨가 변이체일 수 있다.
본 발명에 따른 변이체는:
서열번호 18의 CDR1 영역의
·위치 31에 상응하는 위치에서 N;
서열번호 18의 CDR2 영역의
·위치 53에 상응하는 위치에서 R;
·위치 54에 상응하는 위치에서 S;
·위치 56에 상응하는 위치에서 S;
·위치 57에 상응하는 위치에서 Y;
·위치 59에 상응하는 위치에서 Y;
·위치 60에 상응하는 위치에서 F;
·위치 61에 상응하는 위치에서 P;
·위치 62에 상응하는 위치에서 D; 및
·위치 65에 상응하는 위치에서 Q;
서열번호 18의 CDR3 영역의
·위치 102에 상응하는 위치에서 Y;
·위치 103에 상응하는 위치에서 D; 및
·위치 106에 상응하는 위치에서 D;
서열번호 15의 CDR1 영역의
·위치 31에 상응하는 위치에서 E;
·위치 32에 상응하는 위치에서 S;
·위치 33에 상응하는 위치에서 D; 및
·위치 37에 상응하는 위치에서 Y;
서열번호 15의 CDR3 영역의
·위치 96에 상응하는 위치에서 A;
·위치 97에 상응하는 위치에서 T;
·위치 98에 상응하는 위치에서 H; 및
·위치 99에 상응하는 위치에서 F를 포함하지 않는 항체일 수 있다.
변이체 항체는 상술한 특이적 서열 및 절편으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10개 까지, 20개 까지, 30개 까지 또는 그 이상 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개별 아미노산의 결실, 2, 3, 4 또는 5 아미노산과 같은 아미노산의 소 그룹의 결실, 특이적 아미노산 도메인 또는 다른 특징의 결실과 같은 더 큰 아미노산 영역의결실을 포함할 수 있다. "삽입" 변이체는 개별 아미노산의 삽입, 2, 3, 4 또는 5 아미노산과 같은 아미노산의 소그룹의 삽입, 또는 특이적 아미노산 도메인 또는 다른 특징의 삽입과 같은 더 큰 아미노산 영역의 삽입을 포함할 수 있다. "치환" 변이체는 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 만드는, 하나 이상의 아미노산의 동일한 수의 아미노산으로의 치환을 포함한다. 예를 들면, 아미노산은 유사한 성질을 갖는 대안적 아미노산, 예를 들면, 다른 염기성 아미노산, 다른 산성 아미노산, 다른 중성 아미노산, 다른 전하를 띤 아미노산, 다른 친수성 아미노산, 다른 소수성 아미노산, 다른 극성 아미노산, 다른 방향족 아미노산 또는 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적절한 치환체를 선별하는데 사용할 수 있는 20개의 주요 아미노산의 일부 성질은 하기와 같다:
Figure pat00001
바람직한 "유도체" 또는 "변이체"는 천연 발생 아미노산 대신에 서열에서 나타나는 아미노산이 이들의 구조적 유사체인 이들을 포함한다. 또한, 서열에서 사용된 아미노산은 항체의 기능에 유의한 불리한 효과를 미치지 않게 파생되거나 변형, 예컨대, 표지할 수 있다.
치환은 보존적 치환일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상술한 바 유도체 및 변이체는 항체의 합성 동안에, 또는 생산-후 변형에 의해, 또는 항체가 재조합 형태에 있을 때, 핵산의 위치지정 돌연변이, 무작위 돌연변이 생성, 또는 효소적 절단 및/또는 리게이션의 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-TFPI 항체, 또는 이의 항원-절편을 포함하는 다중특이성 분자의 특징을 나타낸다. 이런 다중특이성 분자는 TFPI에 대한 적어도 하나의 제 1 결합 특이성 및 제 2 표적 에피토프에 대한 제 2 결합 특이성을 포함하는 이중특이성 분자를 포함한다. 이중특이성 분자의 한가지 형태는 당업계에 알려진 바 이중특이성 항체이다. 이중특이성 항체, 또는 오히려 다중특이성 항체는 본원에서 기술된 전장 항체 또는 항체 절편(예컨대 F(ab')2 이중특이성 항체) 또는 임의의 다른 항원-결합 절편으로서 제조될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 제 2 제제와 접합되거나 공유적으로 결합된 항-TFPI 항체와 같은 항체 유도체(또는 면역접합체)의 특징을 나타낸다. 제 2 제제는 당업자에게 알려진 임의의 다수의 사용가능한 방법을 사용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 예를 들면, 제제는 N-숙시닐 S-(2-피리딜디티오) 프로프리오네이트(SPDP)와 같은 교차-링커를 사용한 이황화 결합의 형성을 통해, 또는 항체의 Fc 영역에서 탄수화물 모이어티를 통해 환원된 항체의 힌지 영역에 부착될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역 내에서 변형, 전형적으로 혈청 반감기, 보체 결합, Fc 수용체 결합, 단백질 안정성 및/또는 항원-의존성 세포내 세포독성, 또는 이들의 결핍과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 성질의 변경을 포함하도록 조작할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 다시 바꾸기 위해, 그것의 글리코실화를 바꾸도록 변형될 수 있다.
원한다면, 항체의 클래스는 알려진 기술에 의해 "교체"될 수 있다. 예를 들면, 원래 IgM 분자로서 생산된 항체는 IgG 항체로 교체될 수 있다. 또한, 클래스 교체 기술은 하나의 IgG 서브클래스를 다른 것으로, 예를 들면: IgG1에서 IgG2 또는 IgG4로; IgG2에서 IgG1 또는 IgG4로; 또는 IgG4에서 IgG1 또는 IgG2로 전환하는데 사용할 수 있다. 다른 IgG 서브클래스로부터 나온 영역을 조합하는 것에 의해 불변 영역 키메라 분자를 생성하기 위한 항체의 조작을 또한 수행할 수 있다.
한 구체예에서, CHI의 힌지 영역은 힌지 영역에서 변형된, 예컨대, 증가되거나 감소된 시스테인 잔기의 수로 변형될 수 있다. 이 접근은 Bodmer et al에 의한 미국 특허 번호 5,677,425에서 예시로서 더 기술되었다.
불변 영역은 항체를 안정화시키도록, 예컨대, 두 개의 단량체 VH-VL 절편으로 이량체 항체가 분리되는 위험을 감소시키도록 더 변형될 수 있다. 예를 들면, IgG4 불변 영역에서, 잔기 S241은 힌지에서 완전한 이황화 결합 형성을 허용하기 위하여 프롤린(P) 잔기로 돌연변이될 수 있다(예컨대, Angal et al., Mol Immunol. 199S; 30:105-8 참조).
본 발명에 따른 변이체 항체 서열번호 4 또는 8과 60% 또는 그 이상, 65% 또는 그 이상, 70% 또는 그 이상, 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 바람직하게는 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열 또는 그의 절편을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 다른 변이체 항체는 서열번호 15 또는 18과 60% 또는 그 이상, 65% 또는 그 이상, 70% 또는 그 이상, 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 바람직하게는 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열 또는 그의 절편을 가질 수 있다. 아미노산 동일성의 이 수준은 전장 폴리펩티드의 크기에 의존하여, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200 또는 그 이상에 걸친 아미노산과 같은, 관련된 서열번호 서열의 전장 또는 서열의 일부에 보여질 수 있다.
아미노산 서열과 관련하여, "서열 동일성"은 하기 매개 변수와 함께 ClustalW(Thompson et al., 1994, 상기)를 사용하여 평가하였을 때, 언급된 값을 갖는 서열을 지칭한다:
쌍별 정렬 매개변수-방법: 정확함, 매트릭스: PAM, 갭 개방 벌점: 10.00, 갭 신장 벌점: 0.10;
다중 정렬 매개변수-매트릭스: PAM, 갭 개방 벌점: 10.00, 지연에 대한 % 동일성: 30, 벌점을 부과한 말단 갭: on, 갭 분리 거리: 0, 음성 매트릭스: 없음, 갭 신장 벌점: 0.20, 잔기-특이적 갭 벌점: 있음, 친수성 갭 벌점: 있음, 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정 잔기에서의 서열 동일성은 단순하게 파생된 동일한 잔기를 포함하도록 의도한다.
따라서 본 발명은 특이적 VH 및 VL 아미노산 서열을 갖는 항체 및 이들 VH 및 VL 도메인의 기능 또는 활성을 유지하는 이들의 변이체 및 절편을 제공한다.
따라서, 본 발명의 항체는:
(a) 서열번호 4의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
(b) TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지하는 (a)의 적어도 7개 아미노산의 절편; 또는
(c) TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지하는 (a)의 서열과 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 (a)의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는:
(a) 서열번호 8의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열;
(b) TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지하는 (a)의 적어도 7개 아미노산의 절편; 또는
(c) TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지하는 (a)의 서열과 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 (a)의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 4의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는:
(a) 서열번호 4의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 중쇄 가변 영역;
(b) 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 또는 모두가 (a)에서 명기한 서열의 적어도 7개 아미노산의 절편을 포함하도록 변형된 (a)의 변이체; 또는
(c) 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 또는 모두가 (a) 또는 (b)의 서열에 대하여 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖도록 변형된 (a) 또는 (b)의 변이체를 포함할 수 있고;
여기서 항체는 TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지한다. 또한 항체는 선택적으로 혈소판 수를 감소시키지 않고, TFPI를 억제하는 능력 또는 응고시간을 짧게 하는 능력과 같은 본원에서 기술된 바 본 발명의 항체의 하나 이상의 추가적인 기능 또는 활성을 계속 유지할 수 있다.
서열번호 4의 바람직한 절편 및 변이체는 (i) 서열번호 6의 아미노산 24 내지 39; 및/또는 (ii) 서열번호 6의 아미노산 55 내지 61; 및/또는 (iii) 서열번호 6의 아미노산 94 내지 102을 포함할 것이다. 서열번호 8의 바람직한 절편 및 변이체는 (i) 서열번호 10의 아미노산 31 내지 35; 및/또는 (ii) 서열번호 10의 아미노산 50 내지 66; 및/또는 (iii) 서열번호 10의 아미노산 99 내지 110을 포함할 것이다.
서열번호 10의 더욱 바람직한 변이체는 서열번호 6의 아미노산 31 내지 33, 37 및 96 내지 99를 포함할 것이다. 서열번호 8의 더욱 바람직한 변이체는 서열번호 10의 아미노산 31, 53, 54, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 65, 102, 103 및 106을 포함할 것이다.
본 발명의 항체는:
(a) 서열번호 15의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
(b) TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지하는 (a)의 적어도 7개 아미노산의 절편; 또는
(c) (a)의 서열에 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖고, TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지하는 (a)의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체:
(a) 서열번호 18의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열;
(b) TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지하는 (a)의 적어도 7개 아미노산의 절편; 또는
(c) (a)의 서열에 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖고, TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지하는 (a)의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 15의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 18의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는:
(a) 서열번호 15의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 18의 중쇄 가변 영역;
(b) 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 또는 모두가 (a)에서 명기한 서열의 적어도 7개 아미노산의 절편을 포함하도록 변형된 (a)의 변이체; 또는
(c) 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 또는 모두가 (a) 또는 (b)의 서열에 대하여 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖도록 변형된 (a) 또는 (b)의 변이체를 포함할 수 있고;
여기서 항체는 TFPI에 특이적으로 결합하는 능력을 계속 유지한다. 또한 항체는 선택적으로 혈소판 수를 감소시키지 않고, TFPI를 억제하는 능력 또는 응고시간을 짧게 하는 능력과 같은 본원에서 기술된 바 본 발명의 항체의 하나 이상의 추가적인 기능 또는 활성을 계속 유지할 수 있다.
앞에서 설명된 바, 본 발명의 항체는 다른 본 발명의 항체와 같은 동일한 에피토프 또는 영역에 결합할 수 있다. 따라서 이런 항체는 본원에서 기술한 임의의 특이적 항체, 절편 및 변이체와 같은 TFPI의 동일한 에피토프 또는 영역에 결합할 수 있음이 보일 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에서 기술된 바 임의의 항체를 암호화할 수 있다. 용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 호환성있게 사용되었고, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 이의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예시는 유전자, 유전자 절편, 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분리되거나 정제된 형태로 제조될 수 있다.
선별된 폴리펩티드를 "암호화하는" 핵산 서열은 적당한 조절 서열의 조건 하에서 위치하였을 때, 생체 내의 폴리펩티드로 전사(DNA의 경우)되거나 번역(mRNA의 경우)되는 핵산 분자이다. 암호화 서열의 경계는 5'(아미노) 말단의 시작 코돈 및 3'(카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 목적을 위해서, 이런 핵산 서열은 바이러스로부터의 cDNA, 원핵 및 진핵 세포의 mRNA, 바이러스로부터의 유전체 서열 또는 원핵 세포 DNA 또는 RNA, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상술한 바 VH 또는 VL 아미노산을 암호화하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상술한 바 서열번호 4 또는 8의 서열 또는 이의 변이체 또는 절편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 이런 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 5, 7 및 9 중 임의의 하나의 핵산 서열로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 적절한 폴리뉴클레오티드 서열은 대안적으로 이들 특이적 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나의 변이체일 수 있다. 예를 들면, 변이체는 상기 임의의 핵산 서열의 치환, 결실 또는 첨가 변이체일 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오티드는 서열목록에서 주어진 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10개 까지, 20개 까지, 30개 까지, 40개 까지, 50개 까지, 75개 까지 또는 그 이상의 핵산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
적절한 변이체는 서열번호 3, 5, 7 및 9 중 임의의 하나의 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 70%의 상동성, 그에 대하여 바람직하게는 적어도 80 또는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 상동성을 측정하는 방법은 당업계에 공지이고, 본 문맥에서 당업자에 의해 이해될 것이며, 상동성은 핵산 동일성에 기초하여 계산된다. 이런 상동성은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 30, 예를 들면 적어도 40, 60, 100, 200 또는 그 이상 인접한 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 존재할 것이다. 이런 상동성은 비변형된 폴리뉴클레오티드의 전체 길이에 걸쳐 존재할 것이다.
폴리뉴클레오티드 상동성 또는 동일성을 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, UWGCG Package가 상동성을 계산하는데 사용할 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다(예컨대 그것의 디폴트 세팅으로 사용함)(Devereux et al(1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395).
또한, PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 예를 들면 Altschul S.F.(1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al(1990) J Mol Biol 215:403-10에서 기술한 바 상동적이거나 늘어선 서열을 계산하는데 사용할 수 있다(전형적으로 그들의 디폴트 세팅에서).
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Centre for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공공연히 사용가능하다. 이 알고리즘은 첫째로 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬되었을 때, 일부 플러스 값의 역치 점수 T에 필적하거나 만족시키는 의문 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 점수 서열 쌍(HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 역치로서 지칭된다(Altschul et al, 상기). 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들이 함유하는 HSP를 찾기 위한 초기 연구를 위해 기초로서 역할을 한다. 단어 히트는 증가할 수 있는 누적 정렬 점수까지에 대한 각각의 서열에 따른 모든 방향으로 연장된다. 각각의 방향에 대한 단어 히트의 연장은 하나 이상의 마이너스 값의 잔기 정렬의 누적에 기인하여 누적 정렬 점수가 0이나 그 이하일 때; 또는 각각의 서열의 끝에 도달하였을 때 멈춘다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속력을 결정한다. BLAST 프로그램은 11개의 단어 길이(W) 디폴트, 50개의 BLOSUM62 점수기록 매트릭스(Henikoff and Henikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 참조) 정렬(B), 10개의 기대값(E), M=5, N=4, 및 모든 가닥의 비교로서 사용한다.
BLAST 알고리즘은 두 개의 서열 사이의 유사도의 통계적 분석을 수행하고; 예컨대, Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787을 참조하라. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사도의 한 가지 측정은 우연히 일어날 수 있는 두 가지 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이에서의 매치에 의한 확률의 징조를 제공하는 최소 합 확률(P(N))이다. 예를 들면, 서열은 만약 제 1 서열에 대한 제 2 서열의 비교에서 최소 합 확률이 약 1 이하, 바람직하게는 약 0.1 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.01 이하, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 이하일 때, 다른 서열과 유사한 것으로 고려된다.
상동체는 3, 5, 10, 15, 20 이하 또는 그 이상의 돌연변이(그 각각이 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음)에 의해 관련된 폴리뉴클레오티드와 서열이 다를 수 있다. 이들 돌연변이는 상동체의 뉴클레오티드와 적어도 30, 예를 들면 적어도 40, 60 또는 100 또는 그 이상 인접한 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.
한 구체예에서, 변이체 서열은 유전적 코드에서의 중복성에 의하여 서열 목록에서 주어진 특이적 서열과 다를 수 있다. DNA 코드는 4개의 주요한 핵산 잔기(A, T, C 및 G)를 가지며, 이들을 유기체의 유전자에서 단백질을 암호화하는 아미노산을 나타내는 3문자 코돈을 "의미하기" 위해 사용된다. DNA 분자에 따른 코돈의 선형 서열은 이들 유전자에 의해 암호화되는 단백질에서의 아미노산의 선형 서열로 번역된다. 코드는 20개의 천연 아미노산을 암호화하는 61개의 코돈 및 "정지" 신호를 나타내는 3개의 코돈으로 고도로 변화한다. 따라서, 대부분의 아미노산은 하나의 코돈 이상에 의해 암호화되고, 사실 몇몇은 네 개 이상의 다른 코돈에 의해 암호화된다. 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 다른 폴리뉴클레오티드와 같은 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화 할 수 있지만, 동일한 아미노산을 암호화하는 다른 코돈을 사용하는 것에 기인하여 다른 핵산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 "절편"은 절단에 의해, 예컨대, 폴리뉴클레오티드의 한 쪽 또는 양 쪽에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 제거에 의해 만들어질 수 있다. 10개 까지, 20개 까지, 30개 까지, 40개 까지, 50개 까지, 75개 까지, 100개 까지, 200개 까지 또는 그 이상의 아미노산이 이 방법에서 뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 끝에서 제거될 수 있다. 또한, 절편은 하나 이상의 내부 결실에 의해 생성될 수 있다. 이런 절편은 서열번호 3, 5, 7 및 9의 서열로부터 유래할 수 있고, 본원에서 기술된 바 변이체 폴리뉴클레오티드로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는 이런 절편는 30 내지 300개 사이의 잔기, 예컨대 30 내지 300, 30 내지 200, 30 내지 100, 100 내지 200 또는 200 내지 300 잔기의 길이이다. 대안적으로, 본 발명의 절편은 예를 들면, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%를 포함하는 더 긴 서열일 수 있다.
따라서 본 발명의 항체는 그것을 암호화하고, 발현시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드의 형태에서 생산되거나 전달될 수 있다. 항체가 두 개 또는 그 이상의 사슬을 포함할 때, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 항체 사슬을 암호화할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항체 경쇄, 항체 중쇄 또는 둘 다를 암호화할 수 있다. 하나는 항체 경쇄를 암호화하고, 다른 것은 상응하는 항체 중쇄를 암호화하는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 제공될 수 있다. 이런 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 쌍은 본 발명의 항체를 생성하도록 함께 발현될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 Sambrook et al(1989, Molecular Cloning-a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)에서 예시의 방법에 의해 기술된 바, 당업계에서 잘 알려진 방법에 따라 합성될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 삽입된 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 따라서 생체 내에서 본 발명의 항체의 발현을 허용하는 조절 서열, 신호 펩티드 서열을 포함하는 발현 카세트의 형태로 제공될 수 있다. 차례로, 이들 발현 카세트는 벡터 내에서 전형적으로 제공될 수 있다(예컨대, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터). 이런 발현 카세트는 숙주 개체 내로 직접적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 숙주 개체로 투여될 것이다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 유전적 벡터를 사용하여 제조 및/또는 투여된다. 적절한 벡터는 유전적 정보의 충분한 양을 수반하고, 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 허용하는 임의의 벡터일 수 있다.
따라서 본 발명은 이런 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 이런 발현 벡터는 분자 생물학의 기술 분야에서 일반적으로 구축되며, 필요하다면, 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 허용하기 위해 옳은 방위에서 예를 들면, 플라스미드 DNA 및 적당한 기폭제(initiator), 프로모터, 인핸서, 신호 펩티드 서열 및 예를 들어, 폴리아데닐화 신호와 같은 다른 요소의 사용을 포함할 수 있다. 다른 적절한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다. 이런 점에서 나아간 예시의 방법으로, 본 발명자들은 Sambrook et al.을 지칭한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 발현하기 위해 변형된 세포를 포함한다. 이런 세포는 일시적이거나 안정된, 포유동물 세포 또는 곤충 세포와 같은 고등 진핵 세포, 효모와 같은 하등 진핵 세포, 또는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포를 포함한다. 본 발명의 항체를 암호화하는 벡터 또는 발현 카세트의 삽입에 의해 변형될 수 있는 세포의 특정 예시는 포유동물 HEK293, CHO, BHK, NSO 및 인간 망막 세포를 포함한다. 바람직하게는 선별된 세포주는 안정할 것뿐만 아니라 폴리펩티드의 성숙한 글리코실화 및 세포 표면 발현을 허용할 것이다.
본 발명의 이런 세포는 본 발명의 항체를 생산하기 위한 일상적 방법을 사용하여 배양할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 벡터는 개체로부터 나온 세포로 생체 외에서 투여한 다음, 개체의 몸으로 되돌릴 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 기술된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 세포와 같은 본 발명의 분자를 포함하는 조성물 및 제형을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된, 본 발명의 하나 이상의 항체와 같은 본 발명의 하나 이상의 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본원에서 사용된 바, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 양립할 수 있는 임의의 모든 용매, 분산 배지, 코팅제, 항-박테리아제 및 항-곰팡이제, 등장제 및 흡수 지연제, 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 비경구 예컨대 정맥, 근육 내 또는 피하 투여(예컨대, 주사 또는 주입)을 위한 것이 적절하다. 투여의 루트에 의존하여, 항체는 비활성화 또는 변성 항체일 수 있는 산성 및 다른 자연적 조건의 작용으로부터 항체를 보호할 수 있는 물질로 코팅할 수 있다.
바람직한 약학적으로 허용가능한 담체는 수성 담체 또는 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에서 사용할 수 있는 적절한 수성 담체의 예시는 물, 버퍼 물 및 살린을 포함한다. 다른 담체의 예시는 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 등과 같은), 및 이들의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적당한 유동성은 예를 들면, 렉시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산의 경우 원하는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 것이다. 많은 경우에서, 예를 들면, 조성물에서 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 더욱 바람직할 것이다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 항-산화제를 포함할 수 있다. 또한 이들 조성물은 방부제, 습윤제, 유상화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 예방은 상기 멸균 절차에 의해, 다양한 항-박테리아제 및 항-곰팡이제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산, 등의 포함에 의해 모두 보장될 수 있다. 또한, 조성물에 당, 염화 나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 주사가능한 약학적 형태의 장기간의 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제의 포함에 의해 초래할 수 있다.
치료용 조성물은 전형적으로 제조 및 저장의 조건 하에서 무균이고 안정해야만 한다. 조성물은 높은 약물 농도에 적절한 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 다른 지시된 구조로서 제형화될 수 있다.
멸균한 주사가능한 용액은 필요하다면, 상기에서 열거한 성분의 하나 또는 조합과 함께 적당한 용매에서 요구량으로 활성제(예컨대 항체)를 혼합한 뒤, 멸균 정밀여과에 의해 제조될 수 있다. 보통, 분산은 염기성 분산 배지 및 앞서 열거한 이들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균한 운반체와 활성제를 혼합하는 것에 의해 제조된다. 멸균한 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 파우더의 경우에서, 제조의 바람직한 방법은 활성제의 파우더에 더한 임의의 추가적인 원하는 성분을 이들의 이전에 필터-멸균한 용액으로부터 산출하는 진공 건조 및 동결 건조(감압하에 동결 건조)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효 성분뿐만 아니라 본 발명의 항체를 추가로 포함할 수 있다. 상술한 바, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함한다. 또한 그들은 추가적인 치료 또는 예방 제제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물이 출혈 장애의 치료에에서의 사용을 의도할 때, 출혈 장애의 증상을 감소시키기 위해 의도된 하나 이상의 제제를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 하나 이상의 응고 인자를 포함할 수 있다. 조성물은 환자의 이상ㅇ르 개선하도록 의도된 하나 이상의 다른 구성 요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물이 수술한 환자 또는 외상이 있는 환자와 같이 원하지 않는 출혈이 있는 환자의 치료에서 사용하기를 의도할 때, 조성물은 하나 이상의 진통제, 마취제, 면역억제제 또는 항-염증제를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 범주에 포함되는 것은 본 발명의 항체 또는 다른 조성물 및 사용을 위한 지침서를 포함하는 키트이다. 이런 키트는 상술한 바 추가적인 치료 또는 예방 제제와 같은 하나 이상의 추가적인 시약을 더 함유할 수 있다.
본 발명의 항체, 다른 분자 및 조성물은 응고 관련 장애의 치료 및 예방을 포함하는, 다수의 시험관 내 및 생체 내 치료용 유틸리티를 갖는다. 예를 들면, 이들 항체 및 조성물은 다양한 장애의 예방 또는 치료를 위하여, 배양 중인 세포, 시험관 내, 생체 외 또는 인간 개체, 예컨대, 생체 내에 투여될 수 있다.
특히, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 다른 분자 또는 조성물의 효과량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 출혈 장애의 치료 또는 혈액 응고의 개선을 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, 이런 방법은 혈우병 A, 혈우병 B, 인자 XI 결핍, 인자 VII 결핍, 혈소판 감소증 또는 폰 빌러브란트씨 병과 같은 응고 인자 결핍의 치료를 위한 것일 수 있다. 이런 방법은 응고 인자 억제자의 존제에 의해 수반될 수 있는 이상의 치료를 위한 것일 수 있다. 이런 방법은 과다한 출혈의 치료를 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항체 및 조성물은 수술 또는 항-응고제 치료 전, 중, 또는 후 또는, 외상 후 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 기술한 항체 및 조성물은 임의의 이런 치료에서 사용될 수 있거나, 임의의 이런 치료에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 및 조성물은 예방 및/또는 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다.
치료적 응용에서, 항체 또는 조성물은 이상 또는 그것의 증상 중 하나 이상을 치료, 경감 또는 일부 저지하는데 충분한 양으로 상술한 장애 또는 이상을 이미 앓고 있는 개체에 투여된다. 이런 치료적 처치는 질병 증상의 심각성, 또는 증상이 없는 기간의 빈도 또는 기간의 증가를 야기할 수 있다. 이것을 끝내기 위해 적합한 양은 "치료용으로 효과량"으로서 정의된다. 예를 들면, 치료가 원하지 않는 출혈을 위한 것일 때, 치료는 출혈의 양에서의 감소 또는 출혈을 모두 정지시키기 위한 적절한 응고로서 정의될 수 있다.
예방적 응용에서, 항체 또는 조성물은 이상 또는 그의 하나 이상의 증상의 이후의 효과를 막거나 감소시키기는데 충분한 양으로, 상술한 바 장애 또는 이상의 위험이 있는 개체에게 투여된다. 이것을 완료하는데 적합한 양은 "예방적 효과량"으로서 정의된다. 예를 들면, 치료가 원하지 않는 출혈을 막고자 할 때, 예방 효과는 조절자의 부재에서 보일 수 있는 것과 비교하여 출혈의 예방 또는 출혈의 감소된 기간이나 양으로서 정의될 수 있다.
각각의 목적을 위한 효과량은 질병 또는 상해의 심각성뿐만 아니라 개체의 체중 및 일반적 상태에 의존할 것이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "개체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추 동물, 예컨대, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류, 등과 같은 포유류 및 비포유류를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 조성물은 당업계에 알려진 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 루트를 통해 투여될 수 있다. 당업자에게 올바로 인식될 것인 바, 투여의 루트 및/또는 수단은 원하는 결과에 의존하여 바뀔 것이다. 본 발명의 항체 또는 조성물을 위한 바람직한 투여 루트는 정맥, 근육 내, 피내, 복막 내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 루트, 예를 들면, 주사 또는 주입을 포함한다. 본원에서 사용된 바 어구 "비경구 투여"는 장 내 및 국부 투여보다 다른 투여 수단, 일반적으로 주사를 의미한다. 대안적으로, 본 발명의 항체 또는 조성물은 국부, 상피 또는 점막 투여 루트와 같은 비-비경구 경로를 통해 투여할 수 있다.
유사하게, 본 발명의 항체는 비경구 투여에 적절한 약제의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 정맥 투여에 적절한 약제의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 근육 내 투여에 적절한 약제의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 피하 투여에 적절한 약제의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체의 적절한 투여량은 숙련의에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에서 유효 성분의 실제적 투여량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않고, 특정 환자, 조성물, 및 투여의 수단에 대하여 원하는 치료적 반응을 달성하는데 효과적인 유효 성분의 양을 얻도록 바뀔 수 있다. 선별된 투여량 수준은 사용한 특정 항체의 활성, 투여 루트, 투여 시간, 항체의 분비 속도, 치료 기간, 사용한 특정 조성물과 조합하여 사용한 화합물 및/또는 물질, 치료할 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반적 건강 및 이전의 병력, 등 의학 분야에서 잘 알려진 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 의존할 것이다.
본 발명의 항체의 적절한 투여량은 예를 들면, 치료할 환자의 약 0.1/kg 내지 약 100mg/kg 체중의 범위에 있을 수 있다. 예를 들면, 적절한 투여량은 하루에 약 1/kg 내지 약 10mg/kg 체중 또는 하루에 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중일 수 있다. 본 발명의 항체의 적절한 투여량은 2 내지 200 mg/kg, 약 150-200 mg/kg, 약 150-170 mg/kg, 약 100-150 mg/kg, 약 50-100 mg/kg, 약 70-90 mg/kg, 약 10-50 mg/kg, 약 10-30 mg/kg의 범위에 있을 수 있다.
다른 적절한 투여량 대략 0.1-10 mg/kg, 대략 0.1-1 mg/kg, 대략 1-2 mg/kg 또는 대략 2-3 mg/kg 또는 대략 4-5 mg/kg 또는 대략 5-6 mg/kg 또는 대략 6-7 mg/kg 또는 대략 7-8 mg/kg 또는 대략 8-9 mg/kg 또는 대략 9-10 mg/kg; 또는 대략 10-21 mg/kg, 대략 10-11 mg/kg, 또는 대략 11-12 mg/kg, 또는 대략 12-13 mg/kg, 또는 대략 13-14 mg/kg, 또는 대략 14-15 mg/kg, 또는 대략 15-16 mg/kg, 또는 대략 16-17 mg/kg, 또는 대략 17-18 mg/kg, 또는 대략 18-19 mg/kg, 또는 대략 19-20 mg/kg 또는 대략 20-21 mg/kg일 수 있다.
개체에게 투여된 단일클론 항체의 양은 그것의 투여가 상기 단일클론 항체의 약 10 μg/ml 내지 약 40 μg/ml, 약 15-35 μg/ml, 약 10-15 μg/ml, 약 15-20 μg/ml, 약 20-25 μg/ml, 약 25-30 μg/ml, 약 30-35 μg/ml, 약 35-40 μg/ml의 혈장 농도로 개체 혈장 농도를 야기하는 것일 수 있다. 투여 요법은 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료적 반응)을 제공하기 위하여 조절될 수 있다. 예를 들면, 단일 정맥 주사로 투여할 수 있거나, 몇몇의 나뉘어진 투여량으로 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 투여량을 치료적 상황의 급박함에 의해 지시된 바 비례하여 감소시키거나 증가시켜 투여할 수 있다. 투여량의 용이함 및 투여량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는데 특히 이점이 있다. 본원에서 사용된 바 투약 단위 형태는 치료할 개체에 대한 단위 투여량으로서 적합한, 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 조합하여 원하는 치료적 효과를 생산하기 위하여 계산된 활성 화합물의 이전에 결정된 양을 함유한다.
항체는 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 다중 투여량은 동일하거나 다른 위치에 동일하거나 다른 루트로 투여될 수 있다. 대안적으로, 항체는 덜 빈번한 투여가 요구되는, 서방형 제형으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기 및 원하는 치료 기간에 의존하여 바뀔 것이다. 또한 투여량 및 투여 빈도는치료가 예방을 위한 것인지 치료를 위한 것인지 여부에 따라 바뀔 것이다. 예방적 응용에서. 상대적으로 낮은 투여량은 장기간 동안 상대적으로 드문 간격으로 투여될 수 있다. 치료적 응용에서, 상대적으로 높은 투여량은 예를 들면, 환자가 질병의 증상이 일부 또는 전부 개선되는 것을 보일 때까지 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 마다와 같이 대략 매일, 대략 2일 마다, 대략 3일 마다, 대략 4일 마다, 대략 5일 마다, 대략 6일 마다; 대략 7일 마다; 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17일 마다와 같이 대략 2 주 마다; 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일 마다와 같이 대략 3주 마다; 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일 마다와 같이 대략 4주 마다 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 요구가 있는 즉시 투여될 수 있다.
앞에서 언급한 바, 본 발명의 항체는 무엇인가 그 밖에 다른 치료적 제제와 공동투여될 수 있다. 다른 제제는 조절자의 효과를 증진시킬 제제일 수 있다. 다른 제제는 혈액 응고 인자와 같은 혈액 응고를 증진시키기 위해 작용하는 제제일 수 있다. 특히 본 발명의 조절자는 인자 VII(a) 또는 FVIII(a)와 공동투여될 수 있다. 다른 제제는 환자의 다른 증상 또는 이상을 치료하기 위해 의도될 수 있다. 예를 들면, 다른 제제는 진통제, 마취제, 면역억제제 또는 항-염증 제제일 수 있다.
두 개 또는 그 이상의 제제의 조합된 투여는 다수의 다른 방법으로 성취될 수 있다. 한 구체예에서, 항체 및 다른 제제는 단일 조성물로 함께 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 항체 및 다른 제제는 조합된 치료의 일부로서 분리된 조성물로 투여될 수 있다. 예를 들면, 조절자는 다른 제제를 투여하기 전, 후 또는 투여할 때 함께 투여될 수 있다.
용어 "치료는", 본원에서 사용된 바, 이를 필요로 하는 임의의 인간 또는 다른 동물 개체의 의학적 치료를 지칭한다. 상기 개체는 상기 특이적 치료의 사용이 상기 인간 또는 동물 개체의 건강에 이로울 것을 가리키는 시험적이고 한정적인 진단을 내린, 의학적 전문가 또는 수의학 전문가에 의한 신체 검사를 받은 것으로 예상된다. 상기 치료의 시기 및 목적은 개체의 건강의 현상에 따라 개체마다 바뀔 것이다. 따라서, 상기 치료는 예방적, 경감적, 징후적 및/또는 치유적일 수 있다. 본 발명의 용어에서, 예방적, 경감적, 징후적 및/또는 치유적 치료는 본 발명의 분리된 측면을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 비경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 정맥으로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 근육 내로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 피하로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 예방용으로 투여될 수 있다,
본 발명의 항체는 치료용으로 투여될 수 있다(요구가 있는 즉시).
본 발명의 항체는 혈액 손실을 유의하게 감소시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 출혈 시간을 유의하게 감소시킬 수 있다.
따라서, 또한 본 발명은 투여된 단일 클론 항체의 양이 그것의 표적에 포화되는 정도과 같은, TFPI의 K2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체를 이를 필요로 하는 개체에 처리하는 방법 이다. 투여된 단일클론 항체의 양은 가용성 TFPI와 포화되는 정도일 수 있다. 투여된 단일클론 항체의 양은 내피세포-결합 TFPI에 포화되는 정도일 수 있다.
용어 "응고장애"는, 본원에서 사용된 바, 정상 응고 캐스케이드의 임의의 전응고성 구성 요소 또는 섬유소 용해의 임의의 상향 조절의 임의의 정성적 또는 정량적 결핍에 의해 유발되는 증가된 출혈성 경향일 수 있다.이런 응고장애는 선천적 및/또는 후천적 및/또는 의원성(醫原性)일 수 있고, 당업자에 의해 확인된다.
선천적 저응고장애의 비제한적 예시는 혈우명 A, 혈우병 B, 인자 VII 결핍, 인자 XI 결핍, 폰 빌러브란트씨 병 및 혈소판 무력증 및 베르나르-술리에증후군과 같은 혈소판 감소증이다.
후천적 응고장애의 비제한적 예시는 비타민 K 결핍에 의해 유발되는 세린 프로테아제 결핍이고; 이런 비타민 K-결핍은 와파린(warfarin)과 같은 비타민 K 길항제의 투여에 의해 유발될 수 있다. 또한, 후천적 응고장애는 넓은 범위에 걸친 외상에 이어 발생할 수 있다. "혈액 악순환"으로서 달리 알려진 이 경우에서, 혈액희석(희석에 의한 혈소판 감소증 및 응고 인자의 희석), 저체온, 응고 인자의 소비 및 대사 교란(산과다증)에 의해 특징화된다. 유동 치료 및 증가된 섬유소 용해가 이 상황을 심화시킬 수 있다. 상기 출혈은 신체의 임의의 일부로부터 나올 수 있다.
"억제자"(즉, 인자 VIII에 대한 알로항체)가 있는 혈우병 A 및 "억제자"(즉, 인자 IX에 대한 알로항체)가 있는 혈우병 B는 일부 선천적 및 일부 후천적인 응고 장애의 비제한적 예시이다.
의원성(醫原性) 응고장애의 비제한적 예시는 혈전색전성 질한을 치료하기 위해 미리 정해질 수 있는, 항-응고제 약제-헤파린, 아스피린, 와파린 및 다른 혈소판 응집 억제자와 같은-의 과투여이다. 두 번째로, 의원성(醫原性) 응고장애의 비제한적 예시는 수혈에 의해 유도될 수 있는 것과 같은, 과다한 및/또는 부적당한 유동 치료에 의해 유발되는 것일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 출혈은 혈우병 A 또는 B와 연관된다. 다른 구체예에서, 출혈은 후천적 억제자가 있는 혈우병 A 또는 B와 연관된다. 다른 구체예에서, 출혈은 혈소판 감소증과 연관된다. 다른 구체예에서, 출혈은 폰 빌러브란트씨 병과 연관된다. 다른 구체예에서, 출혈은 심각한 조직 손상과 연관된다. 다른 구체예에서, 출혈은 심각한 외상과 연관된다. 다른 구체예에서, 출혈은 수술과 연관된다. 다른 구체예에서, 출혈은 출혈성 위염 및/또는 장염과 연관된다. 다른 구체예에서, 출혈은 태반 분리와 같은 과다한 자궁 출혈이다. 다른 구체예에서, 출혈은 두개 내, 귀 내 또는 안 내와 같이, 기계적 지혈에 제한된 가능성으로 기관에서 일어날 수 있다. 다른 구체예에서, 출혈은 항-응고제 치료와 연관된다.
본 발명의 항체는 응고장애가 있는 개체의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 또한, 본 발명은 이를 필요로하는 개체의 치료를 위한, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체의 용도뿐만 아니라, 이를 필요로하는 개체의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 항체의 용도이다. 더욱이, 본 발명은 TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일 항체를 사용한, 이를 필요로 하는 개체의 치료 방법이다.
상기 본 발명의 단일클론 항체의 용도는 혈액 손실을 유의하게 감소시킬 수 있다.
상기 본 발명의 단일클론 항체의 용도는 출혈 시간을 유의하게 감소시킬 수 있다.
더욱이, 상기 본 발명의 단일클론 항체의 사용은 일시적 혈소판 감소증을 일으키지 않고, 생체 내 응고 시간을 감소시킬 수 있다.
구체예
하기는 본 발명의 구체예의 비-제한적 목록이다:
구체예 1: TFPI의 K2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 서열번호 2의 E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, F35, K36 및 L50으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
구체예 2: 구체예 1에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2의 잔기 E10을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 3: 구체예 1 또는 2에 있어서, 서열번호 2의 잔기 E11을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 4: 구체예 1-3중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 D12를 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 5: 구체예 1-4중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 P13을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 6: 구체예 1-5중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 R17을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 7: 구체예 1-6중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 Y19를 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 8: 구체예 1-7중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 T21을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 9: 구체예 1-8중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 Y23을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 10: 구체예 1-9중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 F24를 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 11: 구체예 1-10중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 N26을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 12: 구체예 1-11중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 Q28을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 13: 구체예 1-12중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 Q31을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 14: 구체예 1-13중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 C32를 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 15: 구체예 1-14중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 E33을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 16: 구체예 1-15중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 R34를 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 17: 구체예 1-16중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 F35를 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 18: 구체예 1-17중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 K36을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 19: 구체예 1-18중 어느 하나에 있어서, 서열번호 2의 잔기 L50을 포함하는 에피토프를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 20: 구체예 1-16 및 18-19 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2의 잔기 E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, K36 및 L50을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 21: 구체예 1-3,5-9, 12-13 및 15-19 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2의 잔기 E10, E11, P13, R17, Y19, T21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 및 L50을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 22: TFPI의 K2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 15의 아미노산 잔기:
·위치 31에 상응하는 위치에서 E,
·위치 32에 상응하는 위치에서 S,
·위치 33에 상응하는 위치에서 D,
·위치 37에 상응하는 위치에서Y,
·위치 96에 상응하는 위치에서 A,
·위치 97에 상응하는 위치에서 T, 및
·위치 99에 상응하는 위치에서 F를 포함하고;
상기 항체의 중쇄는 서열번호 18의 아미노산 잔기:
·위치 31에 상응하는 위치에서 N,
·위치 53에 상응하는 위치에서 R,
·위치 54에 상응하는 위치에서 S,
·위치 57에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 59에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 60에 상응하는 위치에서 F,
·위치 61에 상응하는 위치에서 P,
·위치 62에 상응하는 위치에서 D,
·위치 65에 상응하는 위치에서 Q,
·위치 102에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 103에 상응하는 위치에서 D, 및
·위치 106에 상응하는 위치에서 D을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 23: 구체예 1-21 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 15의 아미노산 잔기:
·위치 31에 상응하는 위치에서 E,
·위치 32에 상응하는 위치에서 S,
·위치 33에 상응하는 위치에서 D,
·위치 37에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 96에 상응하는 위치에서 A,
·위치 97에 상응하는 위치에서 T, 및
·위치 99에 상응하는 위치에서 F를 포함하고;
상기 항체의 중쇄는 서열번호 18의 아미노산 잔기:
·위치 31에 상응하는 위치에서 N,
·위치 53에 상응하는 위치에서 R,
·위치 54에 상응하는 위치에서 S,
·위치 57에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 59에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 60에 상응하는 위치에서 F,
·위치 61에 상응하는 위치에서 P,
·위치 62에 상응하는 위치에서 D,
·위치 65에 상응하는 위치에서 Q,
·위치 102에 상응하는 위치에서 Y,
·위치 103에 상응하는 위치에서 D, 및
·위치 106에 상응하는 위치에서 D을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 24: 구체예 22 또는 구체예 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 18의 위치 52에 상응하는 위치에서 S를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 25: 구체예 22-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 경쇄는 서열번호 15의 위치 98에 상응하는 위치에서 H를 추가로 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 18의 위치 56에 상응하는 위치에서 S를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 26: 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 중 하나가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)의 CDR1 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 27: 구체예 1 내지 21 중 어느 하나의 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 중 하나가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)의 CDR1 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 28: 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)의 CDR2 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 29: 구체예 1 내지 21 중 어느 하나의 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)의 CDR2 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 30: 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 31: 구체예 1 내지 21 중 어느 하나의 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는 아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 32: 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)의 CDR1 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 33: 구체예 1 내지 21 중 어느 하나의 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)의 CDR1 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 34: 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)의 CDR2 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 35: 구체예 1 내지 21 중 어느 하나의 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)의 CDR2 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 36: 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 37: 구체예 1 내지 21 중 어느 하나의 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 경쇄는 아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 38: 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는:
·아미노산 중 하나가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)의 CDR1 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)의 CDR2 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 39: 구체예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는:
·아미노산 중 하나가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)의 CDR1 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)의 CDR2 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 40: 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 경쇄는:
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)의 CDR1 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)의 CDR2 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 41: 구체예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 경쇄는:
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)의 CDR1 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)의 CDR2 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 42: 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는:
·아미노산 중 하나가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는,서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)의 CDR1 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)의 CDR2 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)의 CDR3 서열을 포함하고;
상기 항체의 경쇄는:
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)의 CDR1 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)의 CDR2 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 43: 구체예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는:
·아미노산 중 하나가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)의 CDR1 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)의 CDR2 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)의 CDR3 서열을 포함하고;
상기 항체의 경쇄는:
·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)의 CDR1 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)의 CDR2 서열; 및/또는
·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는,서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 44: 구체예 26-43 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환은:
서열번호 18의 CDR1 영역의
·위치 31에 상응하는 위치에서 N;
서열번호 18의 CDR2 영역의
·위치 53에 상응하는 위치에서 R;
·위치 54에 상응하는 위치에서 S;
·위치 56에 상응하는 위치에서 S;
·위치 57에 상응하는 위치에서 Y;
·위치 59에 상응하는 위치에서 Y;
·위치 60에 상응하는 위치에서 F;
·위치 61에 상응하는 위치에서 P;
·위치 62에 상응하는 위치에서 D; 및
·위치 65에 상응하는 위치에서 Q;
서열번호 18의 CDR3 영역의
·위치 102에 상응하는 위치에서 Y;
·위치 103에 상응하는 위치에서 D; 및
·위치 106에 상응하는 위치에서 D;
서열번호 15의 CDR1 영역의
·위치 31에 상응하는 위치에서 E;
·위치 32에 상응하는 위치에서 S;
·위치 33에 상응하는 위치에서 D; 및
·위치 37에 상응하는 위치에서 Y;
서열번호 15의 CDR3 영역의
·위치 96에 상응하는 위치에서 A;
·위치 97에 상응하는 위치에서 T;
·위치 98에 상응하는 위치에서 H; 및
·위치 99에 상응하는 위치에서 F의 아미노산을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 45: 구체예 26-44 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환은 보존적 치환인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 46: 구체예 26-45 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는:
· 서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)을 포함하는 CDR1 서열; 및
· 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)을 포함하는 CDR2 서열; 및
· 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 47: 구체예 26-46 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 경쇄는:
·서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)을 포함하는 CDR1 서열; 및
·서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)을 포함하는 CDR2 서열; 및
·서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 48: 구체예 46-47 중 어느 하나에 있어서, 중쇄는:
·서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)를 포함하는 CDR1 서열; 및
·서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)을 포함하는 CDR2 서열; 및
·서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)을 포함하는 CDR3 서열을 포함하고;
경쇄는:
·서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)를 포함하는 CDR1 서열; 및
·서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)을 포함하는 CDR2 서열; 및
·서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)를 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 49: 이전의 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 15을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 50: 이전의 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 18을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 51: 이전의 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체는 서열번호 15 및 서열번호 18을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 52: 이전의 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체는 서열번호 21의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 53: 이전의 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체는 서열번호 24의 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 54: 구체예 52-53 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 서열번호 21 및 서열번호 24를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 55: 이전의 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 56: 구체예 55에 있어서, 중쇄의 프레임워크 영역 2에서 서열번호 18의 아미노산:
·위치 40에 상응하는 위치에서 T;
·위치 42에 상응하는 위치에서 E;
·위치 44에 상응하는 위치에서 R; 및
·위치 49에 상응하는 위치에서 A를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 57: 구체예 55에 있어서, 중쇄의 프레임워크 영역 2에서 서열번호 18의 위치 36 내지 49(WVRQTPEKRLEWVA)에 상응하는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 58: 구체예 1-54 중 어느 하나에 있어서, 인간 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 59: 구체예 1-54 중 어느 하나에 있어서, 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 60: 이전의 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체의 아이소타입은 IgG인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 61: 구체예 60에 있어서, 상기 아이소타입은 IgG1, IgG2 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 62: 구체예 61에 있어서, 상기 항체의 아이소타입은 IgG4인 것을 특징으로 하는 항체.
구체예 63: 구체예 60-62 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역의 적어도 하나의 아미노산은 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 64: 이전의 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역는 서열번호 24의 아미노산 122-448와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 95-100% 동일한 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 65: mAb0281보다 더 높은 친화성을 갖는, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체.
구체예 66: 구체예 1-64 중 어느 하나에 있어서, mAb0281보다 더 높은 친화성을 갖는, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체.
구체예 67: mAb4904보다 더 높은 친화성을 갖는, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체.
구체예 68: 구체예 1-66 중 어느 하나에 있어서, mAb4904보다 더 높은 친화성을 갖는, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체.
구체예 69: mAb2974보다 더 높은 친화성을 갖는, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체.
구체예 70: 구체예 1-68 중 어느 하나에 있어서, mAb2974보다 더 높은 친화성을 갖는, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체.
구체예 71: mAb29741보다 더 높은 친화성을 갖는, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체 .
구체예 72: 체예 1-70 중 어느 하나에 있어서, mAb29741보다 더 높은 친화성을 갖는, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체.
구체예 73: 단일클론 항체, 즉 capable of 결합 TFPI의 K2 도메인, 상기 항체의 KD가 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.025 nM 이하인 것을 특징으로 하는, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체.
구체예 74: 구체예 1-73 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 KD가 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.025 nM 이하인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 75: 상기 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 혈소판 결합 TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 76: 상기 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 가용성 TFPI를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 77: 구체예 76에 있어서, 상기 가용성 TFPI는 완전히 억제될 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 78: 상기 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 지질단백질-결합 TFPI를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 79: 상기 구체예 중 임의의 하나에 있어서, 내피 세포-결합 TFPI를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 80: TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있고, FXa 억제 분석에서 측정된 바, FXa가 그의 활성을 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 99-100% 유지하는 단일클론 항체.
구체예 81: 구체예 1-79 중 어느 하나에 있어서, TFPI에 결합할 수 있고, FXa 억제 분석에서 측정된 바, FXa가 그의 활성을 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 99-100% 유지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 82: TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있고, 개체에서 자유 TFPI의 퍼센트가 30% 이하, 29% 이하, 28% 이하, 27% 이하, 26% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0% 내지 1%로 감소되는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 83: 구체예 1-81 중 어느 하나에 있어서, TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있고, 개체에서 자유 TFPI의 퍼센트가 30% 이하, 29% 이하, 28% 이하, 27% 이하, 26% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0% 내지 1%로 감소되는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 84: 구체예 83에 있어서, 개체에서 자유 TFPI의 양이 상기 개체에 상기 단일클론 항체를 투여한 후 첫 28일 동안, 첫 27일 동안, 첫 26일 동안, 첫 25일 동안, 첫 24일 동안, 첫 23일 동안, 첫 22일 동안, 첫 21일 동안, 첫 20일 동안, 첫 19일 동안, 첫 18일 동안, 첫 17일 동안, 첫 16일 동안, 첫 15일 동안, 첫 14일 동안, 첫 13일 동안, 첫 12일 동안, 첫 11일 동안, 첫 10일 동안, 첫 9일 동안, 첫 8일 동안, 첫 7일 동안, 첫 6일 동안, 첫 5일 동안, 첫 4일 동안, 첫 3일 동안, 첫 2일 동안, 첫 1일 동안 상기 퍼센트로 감소되는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 85: TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있고, TFPI가 상기 항체로 포화되었을 때, FVIIa/TF/FXa 억제자 분석에 의해 측정된 바, 막-결합 FVIIa/TF/FXa의 TFPI 억제를 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100% 까지, 100% 중화시킬 수 있는 단일클론 항체.
구체예 86: 구체예 1-84 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 TFPI가 상기 항체로 포화되었을 때, FVIIa/TF/FXa 억제자 분석에 의해 측정된 바, 막-결합 FVIIa/TF/FXa의 TFPI 억제를 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100% 까지, 100% 중화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 87: TFPI의 K2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, 혈소판 수를 유의하게 감소시키지 않고 생체 내 응고 시간을 감소시키는 단일클론 항체.
구체예 88: 구체예 1-86 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 혈소판 수를 유의하게 감소시키지 않고 생체 내 응고 시간을 감소시키는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 89: 구체예 88에 있어서, 상기 혈소판 수는 원래의 혈소판 수의 대략 80%, 대략 75%, 대략 70%, 대략 65%, 대략 60%, 대략 55%, 대략 50%, 대략 45%, 대략 40%, 대략 35%, 대략 30%, 대략 25%까지 떨어지지 않는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 90: TFPI의 K2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, 일시적 혈소판 감소증을 유발하지 않고 생체 내 응고 시간을 감소시키는 단일클론 항체.
구체예 91: 구체예 1-89 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 일시적 혈소판 감소증을 유발하지 않고 생체 내 응고 시간을 감소시키는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구체예 92: 이전의 구체예 중 임의의 하나에 따른 절편.
구체예 93: 구체예 92에 있어서, Fab 절편, F(ab')2 절편, Fab' 절편, Fd 절편, Fv 절편 또는 dAb 절편인 것을 특징으로 하는 절편.
구체예 94: 결실 변이체 또는 삽입 변이체인, 이전의 구체예 중 임의 의 하나에 따른 단일클론 항체의 변이체변이체.
구체예 95: 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체를 포함하는 약학적 제형.
구체예 96: 비경구 용도에 적절한 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체를 포함하는 약학적 제형.
구체예 97: 정맥 용도에 적절한 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체를 포함하는 약학적 제형.
구체예 98: 근육 내 용도에 적절한 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체를 포함하는 약학적 제형.
구체예 99: 피하 용도에 적절한 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체를 포함하는 약학적 제형.
구체예 100: 비경구 투여에 적절한 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체의 용도.
구체예 101: 정맥 투여에 적절한 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체의 용도.
구체예 102: 근육 내 투여에 적절한 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체의 용도.
구체예 103: 피하 투여에 적절한 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체의 용도.
구체예 104: 응고장애가 있는 개체의 치료를 위한, 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체의 용도.
구체예 105: 구체예 104에 있어서, 상기 개체는 억제자가 있거나 없는 혈우병 A, 억제자가 있거나 없는 혈우병 B로 구성된느 그룹으로부터 선택될 수 있는 임의의 선천적, 후천적 및/또는 의원성(醫原性) 응고장애를 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
구체예 106: 구체예 95-105 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체는 혈액 손실을 유의하게 감소시키는 것을 특징으로 하는 용도.
구체예 107: 구체예 95-106 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체는 출혈 시간을 유의하게 감소시키는 것을 특징으로 하는 용도.
구체예 108: 구체예 95-107 중 어느 하나에 있어서, 투여된 단일클론 항체의 양은 상기 단일클론 항체의 혈장 농도가 약 10 μg/ml to 약 40 μg/ml, 약 15-35 μg/ml, 약 10-15 μg/ml, 약 15-20 μg/ml, 약 20-25 μg/ml, 약 25-30 μg/ml, 약 30-35 μg/ml, 약 35-40 μg/ml이 되도록 하는 것을 특징으로 하는 용도.
구체예 109: 구체예 1-94 중 어느 하나에 따른 단일클론 항체를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 응고장애가 있는 개체의 치료 방법.
구체예 110: 구체예 109에 있어서, 상기 응고장애는 억제자가 있거나 없는 혈우병 A, 억제자가 있거나 없는 혈우병 B로 구성된느 그룹으로부터 선택될 수 있는 임의의 선천적, 후천적 및/또는 의원성 응고장애인 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 111: 구체예 109-110 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론는 혈액손실을 유의하게 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 112: 구체예 109-111 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체는 출혈 시간을 유의하게 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 113: 구체예 109-112 중 어느 하나에 있어서, 투여된 단일클론 항체의 양은 그의 표적과 포화하는 것 만큼인 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 114: 구체예 109-113 중 어느 하나에 있어서, 투여된 단일클론 항체의 양은 가용성 TFPI와 포화하는 만큼인 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 115: 구체예 109-114 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여된 항체는 가용성 TFPI를 완전히 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 116: 구체예 109-115 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체는 내피세포-결합 TFPI와 포화키는데 충분한 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 117: 구체예 109-116 중 어느 하나에 있어서, 투여된 단일클론 항체의 양은 상기 단일클론 항체의 혈장 농도가 약 10 μg/ml to 약 40 μg/ml, 약 15-35 μg/ml, 약 10-15 μg/ml, 약 15-20 μg/ml, 약 20-25 μg/ml, 약 25-30 μg/ml, 약 30-35 μg/ml, 약 35-40 μg/ml이 되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 118: 구체예 109-117 중 어느 하나에 있어서, 단일 투여량으로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 119: 구체예 109-118 중 어느 하나에 있어서, 다중 투여량으로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 120: 구체예 109-119 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 매일 투여할될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 121: 구체예 109-120 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 매 2일째에 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 122: 구체예 109-121 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 매 3일째에 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 123: 구체예 109-122 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 매 4일째에 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 124: 구체예 109-123 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 매 5일째에 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 125: 구체예 109-124 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 매 6일째에 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 126: 구체예 109-125 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체는 매 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일째와 같이, 대략 매주 마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 127: 구체예 109-126 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체는 매 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17일째와 같이, 대략 매 2주마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 128: 구체예 109-127 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체는 매 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일째와 같이, 대략 매 3주마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 129: 구체예 109-128 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체는 매 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일째와 같이, 대략 매 4주마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 130: 구체예 109-129 중 어느 하나에 있어서, 투여량은 대략 0.1-10 mg/kg, 대략 0.1-1 mg/kg, 대략 1-2 mg/kg 또는 대략 2-3 mg/kg 또는 대략 4-5 mg/kg 또는 대략 5-6 mg/kg 또는 대략 6-7 mg/kg 또는 대략 7-8 mg/kg 또는 대략 8-9 mg/kg 또는 대략 9-10 mg/kg; 또는 대략 10-21 mg/kg, 대략 10-11 mg/kg, 또는 대략 11-12 mg/kg, 또는 대략 12-13 mg/kg, 또는 대략 13-14 mg/kg, 또는 대략 14-15 mg/kg, 또는 대략 15-16 mg/kg, 또는 대략 16-17 mg/kg, 또는 대략 17-18 mg/kg, 또는 대략 18-19 mg/kg, 또는 대략 19-20 mg/kg 또는 대략 20-21 mg/kg일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 131: 구체예 109-130 중 어느 하나에 있어서, 투여량은 대략 2 to 200 mg/kg, 약 150-200 mg/kg, 약 150-170 mg/kg, 약 100-150 mg/kg, 약 50-100 mg/kg, 약 70-90 mg/kg, 약 10-50 mg/kg, 약 10-30 mg/kg일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 132: 구체예 109-131 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체는 비경구로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 133: 구체예 132에 있어서, 상기 단일클론 항체는 정맥으로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 134: 구체예 133에 있어서, 상기 단일클론 항체의 투여량은 대략 10-20 mg/kg일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 135:구체예 133-134 중 어느 하나에 있어서, 단일클론 항체는 매 2주 마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 136:구체예 133-135 중 어느 하나에 있어서, 단일클론 항체는 매 3주 마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 137:구체예 133-136 중 어느 하나에 있어서, 단일클론 항체는 매 4주 마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 138: 구체예 133에 있어서, 상기 단일클론 항체의 투여량은 대략 10-20 mg/kg일 수 있고, 상기 단일클론 항체는 매 2주마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 139: 구체예 133에 있어서, 상기 단일클론 항체의 투여량은 대략 10-20 mg/kg일 수 있고, 상기 단일클론 항체는 매 3주마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 140: 구체예 133에 있어서, 상기 단일클론 항체의 투여량은 대략 10-20 mg/kg일 수 있고, 상기 단일클론 항체는 매 4주마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 141: 구체예 132에 있어서, 상기 단일클론 항체는 근육 내로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 142: 구체예 132에 있어서, 상기 단일클론 항체는 피하로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 143: 구체예 132에 있어서, 상기 단일클론 항체의 투여량은 대략 1 mg/kg일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 144: 구체예 141-143 중 어느 하나에 있어서, 단일클론 항체는 매일 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 145: 구체예 141-144 중 어느 하나에 있어서, 단일클론 항체는 매 2일마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 146: 구체예 141-145 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체의 투여량은 대략 1 mg/kg일 수 있고, 상기 단일클론 항체는 매일 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 147: 구체예 141-146 중 어느 하나에 있어서,상기 단일클론 항체의 투여량은 대략 1 mg/kg일 수 있고, 상기 단일클론 항체는 매 2일 마다 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 148: 구체예 109-147 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 예방용으로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 149: 구체예 109-148 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 치료용으로(요구가 있는 즉시) 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 150:구체예 109-149 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여된 항체는 가용성 TFPI를 완전히(100%) 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 151: 구체예 1-94 중 어느 하나의 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
구체예 152: 구체예 151에 있어서, 서열번호 13, 16, 19 및 22로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 153: 구체예 152에 있어서, 서열번호 19를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 154: 구체예 152에 있어서, 서열번호 22를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 155: 구체예 152에 있어서, 서열번호 19 및 22를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
구체예 156: 구체예 151-155 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진핵세포.
구체예 157: 구체예 1-94 중 어느 하나의 단일클론 항체, 또는 이의 절편을 발현하는 진핵세포.
구체예 158: 구체예 157에 있어서, 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 진핵세포.
구체예 159: 구체예 157에 있어서, 효모 세포인 것을 특징으로 하는 진핵세포.
구체예 160: 구체예 158에 있어서, HEK293, CHO, BHK, NSO 및 인간 망막 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진핵세포.
실시예
본 발명은 더욱 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 하는 하기 실시예에 의해 더 묘사된다. 모든 도면 및 본 출원에 언급된 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 참고문헌으로써 본 발명에 명백히 포함된다.
실시예 1: TFPI에 대하여 유도된 단일클론 항체의 생산 및 특징화
단일클론 항체를 조직 인자 경로 억제자(TFPI)에 대하여 생성하였다. 원하는 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체를 확인하고, 클로닝하고 서열분석하였다. 이 항체는 생체 내 큐티클 출혈 시간을 유의하게 감소시키고 혈소판 수를 유의하게 떨어뜨리지 않는 것으로 발견되었다.
방법 및 결과
모든 키트는 제조사의 지침서에 따라 사용하였다. 약어: HC: 중쇄; LC: 경쇄; VH: 가변 도메인 - 중쇄; VL: 가변 도메인 - 경쇄; PCR: 중합효소 연쇄 반응.
면역화 및 융합
마우스는 전장 TFPI 및 오직 제 1의 두 개 Kunitz 도메인만을 함유하는 생략 버전 TFPIB161B 모두로 면역화시켰다. RBF 마우스를 마우스 단일클론 항체의 면역화 및 생산을 위해 사용하였다. 마우스의 등에 피하로 주사하였다. 20μg의 단백질을 첫 번째 주사에서 완전 후룬즈 아주번트를 혼합하였다. 이후의 면역화에서, 불완전 후룬즈 아주번트를 항원과 동일한 농도로 사용하였다. 마지막 면역화 후 10일 후, 마우스로부터 나온 안혈을 TFPI 특이적 항체에 대하여 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 양성 혈청 적정이 있는 마우스를 정맥 주사에 의해 10 μg의 TFPI로 부스터시키고 3일 후 희생시켰다. 비장을 방부처리하여 제거하였고, 단일 세포 부유액으로 분산시켰다. 비장 세포 및 골수종 세포의 융합을 PGE-방법 또는 전기융합에 의해 수행하였다.
결합 분석: ELISA
면역플레이트를 항-마우스 IgG로 코팅하였다. 하이브리도마 세포로부터 나온 배양 상청액을 플레이트에 첨가하고, 세척한 뒤, 가용성 비오틴화 인간 TFPI 또는 TFPIB161B를 특이적 결합에 대한 시험을 위해 첨가하였다.
중화 분석: FXa 분석 및 TF/FVIIa/FXa 분석
FXa 억제 분석: FXa의 90% 억제를 발생시키는 TFPI의 고정된 농도를 항-TFPI 단일클론 항체를 함유하는 하이브리도마 세포로부터 나온 배양 상층액과 전-배양하였고, FXa에 더한 FXa-특이적 발색 기질에 첨가하였다. 이 분석은 FXa에 대한 TFPI 결합을 설명한다(실시예 6에서 더욱 자세하게 기술함).
FVIIa/TF/FXa 억제 분석: 1) 항-TFPI 단일클론 항체를 함유하는 하이브리도마 세포로부터 나온 배양 상청액의 배양 및 고정된 TFPI(FVIIa/TF의 90% 억제); 2) TFPI+FVIIa+TF+FXa의 배양; 3) FX(FX>FXa)의 첨가에 이은 FXa 발색 기질의 첨가(실시예 7에서 더 자세하게 기술함).
희석 트로트롬빈 시간(dPT)
희석 프로트롬빈(PT) 분석: 인간 혈장은 희석된 인간 트롬보플라스틴(TF source)과 조합된다. 혈장에서 응고 시간은 응고 시간의 투여량 의존성 감소를 찾기 위해 단백질 A 정제된 TFPI 단일클론 항체 농도를 증가시키는 첨가에서 측정된다. FVIIa(25 nM)는 양성 대조군이었고, 이 응고 시간을 반드시 단축시킨다.
결합 상호작용 분석
결합 상호작용 분석은 Biacore 3000에서의 표면 플라즈몬 공명에 의해 얻었다. 고정된 농도에서 상응하는 단일클론 항체의 포획을 고정된 마우스 항-IgG를 사용하여 얻었다. TFPI의 다른 농도를 시험하였다. 결합 상수(Kon, Koff, KD)의 결정을 TFPI 및 관심있는 항체의 1:1 상호작용을 평가하여 얻었다(실시예 8에서 더 자세히 기술됨).
혈전탄성묘사도
이 기록은 전혈에서 혈전 형성 및 섬유소용해의 역학을 기록한다. 혈우병 A-유사 조건을 항-FVIII IgG로 중성화한 혈액에서 전-배양시킴으로서 유도하였다.
항체 클로닝 및 서열분석
항-TFPI 항체의 설치류 중쇄 및 경쇄 서열을 하이브리도마: TFPI-4F36A1B2(본원에서 4F36으로 단축됨)로부터 클로닝하였다. Qiagen에서 나온 RNeasy-Mini 키트를 사용하여 하이브리도마로부터 추출한 전체 RNA를 cDNA 합성에 대한 주형으로서 사용하였다. cDNA를 Clontech에서 나온 SMART™ RACE cDNA 증폭 키트를 사용하여 5'-RACE 반응에서 합성하였다. 이후의 FC 서열 및 LC 서열의 증폭은 Phusion Hot Star 중합효소(Finnzymes) 및 정방향 프라이머로서 SMART™ RACE 키트에 포함된 보편적 프라이머 믹스(UPM)를 사용한 PCR에 의해 수행하였다. 하기 서열의 역 프라이머를 HC(VH 도메인) 증폭에 사용하였다: 5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3'(프라이머 #129). 하기 서열의 역 프라이머를 LC 증폭에 사용하였다: 5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3'(프라이머 #69).
PCR 산물을 겔 전기영동에 의해 분리하였고, GE Healthcare Biosciences에서 나온 GFX PCR DNA 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 추출하고, Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트 및 Invitrogen에서 나온 화학적으로 유능한 TOP10 E. coli를 사용하여 서열분석을 위해 클로닝하였다. 콜로니 PCR을 Applied Biosystems에서 나온 AmpliTaq Gold Master Mix 및 M13uni/M13rev 프라이머를 사용하여 선별된 콜로니에서 수행하였다. 콜로니 PCR 클린-업을 ExoSAP-IT enzyme mix(usb)를 사용하여 수행하였다. 서열분석을 M13uni(-21)/M13rev(-29) 또는 T3/T7 서열분석 프라이머 중 어느 하나를 사용하여 MWG Biotech, Martinsried Germany에서 수행하였다. 서열을 분석하고 VectorNTI 프로그램을 사용하여 분석 및 해석하였다.
하이브리도마 TFPI-4F36A1B2로부터 하나의 유일한 설치류 카파 타입 LC, 및 하나의 유일한 설치류 HC, 서브클래스 IgG1를 확인하였다. LC 서열은 서열번호 6에서 주어졌고, HC 서열은 서열번호 10에서 주어졌다. VH & VL 서열은 도 2에서 보여주었고, 리더 펩티드 서열은 포함하지 않는다.
에피토프
TFPI1은 세 개의 Kunitz 도메인을 포함한다(도 4 참조). TFPI1의 Kunitz 도메인의 표면 접근이 용이한 잔기는 TFPI1-2에 존재하는 구조로부터 확인하였다. 특히, 40% 이상의 상대적 접근 용이성을 갖는 잔기가 표면 접근성이 용이한 것으로 고려되었다. TFPI1-2에 대하여, 이것을 포함한다(도 5 참조): 아미노산 94-95, 98, 100-110, 118-121, 123-124, 131, 134, 138-142 및 144-145.
실시예 2: 마우스 TFPI4F36A1B2 mAb의 클로닝 및 서열분석
이 실시예는 항-TFPI 항체: TFPI4F36A1B2의 설치류 중쇄 및 경쇄 서열의 클로닝 및 서열분석을 기술한다.
전체 RNA를 Quiagen에서 나온 RNeasy-Mini 키트를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 추출하였고, cDNA 합성에 대한 주형으로서 사용하였다. cDNA를 Clontech에서 나온 SMART™ RACE cDNA 증폭 키트를 사용한 5'-RACE 반응에서 합성하였다. HC 및 LC 서열의 이후의 표적 증폭은 Phusion Hot Start 중합효소(Finnzymes) 및 정방향 프라이머로서 SMART™ RACE 키트에 포함된 보편적 프라이머를 사용한 PCR에 의해 수행되었다. 서열번호 11로서 확인된 역 프라이머를 HC(VH 도메인) 증폭에 사용하였고, 서열번호 12로서 확인된 역 프라이머를 LC 증폭에 사용하였다. PCR 산물을 겔 전기영동으로 분리하였고, GE Healthcare Biosciences에서 나온 GFX PCR DNA & Gel Band 정제 키트를 사용하여 추출하였고, Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트 및 화학적으로 유능한 TOP10 E.coli(Invitrogen)를 사용하여 서열번석을 위해 클로닝하였다. 콜로니 PCR을 Applied Biosystems에서 나온 AmpliTaq Gold Master Mix 및 M13uni/M13rev 프라이머를 사용하여 선별된 콜로니에서 수행하였다. 콜로니 PCR 클린-업을 ExoSAP-IT enzyme mix(usb)를 사용하여 수행하였다. 서열분석을 M13uni(-21)/M13rev(-29) 또는 T3/T7 서열분석 프라이머 중 어느 하나를 사용하여 MWG Biotech, Martinsried Germany에서 수행하였다. 서열을 분석하고 VectorNTI 프로그램을 사용하여 분석 및 해석하였다. 모든 키트 및 시약은 제조사의 지침서에 따라 사용하였다.
하나의 유일한 설치류 카파 타입 LC 및 하나의 유일한 설치류 HC, 서브클래스 IgG1를 확인하였다. 가변 경쇄에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 서열번호 3 및 5에서 각각 보여준다. 가변 중쇄에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 서열번호 7 및 9에서 각각 보여준다. 리더 펩티드 서열은 이들 서열에 포함되지 않는다.
BLAST 조사
번역된 항-TFPI4F36A1B2 VL 및 VH 아미노산 서열을 의문 서열로서 사용하였다. BLAST 조사를 BLASTp 번역 프로그램을 사용하여 Uniprot 데이터베이스에서 서열에 대하여 수행하였다. 항-TFPI4F36A1B2 VH에 대한 결과는 50개의 가장 높은 동일성 점수의 >20가 설치류 Ig 중쇄 서열인 정렬을 산출한다. 가장 높은 동일성 점수는 마우스 Ig 중쇄에 대하여 81%(99/121)였다. 항-TFPI4F36A1B2 VL에 대한 결과는 50개의 가장 높은 동일성 점수의 >30가 설치류 Ig 카파 경쇄 서열인 정렬을 산출한다. 가장 높은 동일성 점수는 마우스 Ig 카파 경쇄에 대하여 92%(105/113)였다. 결론적으로, 항-TFPI4F36A1B2에 대한 VH 및 VL 서열은 새로운 독특한 서열을 나타낸다.
마우스 항- TFPI4F36A1B2 발현 벡터의 생성
CMV 프로모터-기반 발현 벡터(pTT 벡터)의 시리즈를 Yves Durocher(Durocher et al. Nucleic Acids Research, 2002)에 의해 개발된 HEK293-6E EBNA-기반 발현 시스템에서 마우스 TFPI4F36 항체의 일시적 발현을 위해 생성하였다. CMV 프로모터에 추가로, 벡터는 pMB1 오리진, EBV 오리진 및 Amp 제한 유전자를 함유한다.
전장 항-TFPI4F36A1B2 LC(원래의 신호 펩티드 서열을 포함)에 상응하는 영역을 N 및 C-말단 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 원래의 TOPO 서열분석 클론에서 PCR 증폭하였다. 센스 프라이머는 클로닝 목적을 위한 말단 HindIII 제한효소 영역 서열 및 ATG 시작 코돈의 바로 상류에 Kozak 서열(5'-GCCGCCACC-3')를 함유하였다. 안티센스 프라이머는 암호화 서열의 바로 하류에 종결 코돈 이후의 XbaI 제한효소 영역 서열을 함유하였다. 생성된 PCR 절편은 제한효소로 절단하였고, 선형화된 pTT-기반 벡터의 다중 클로닝 부위(MCS)에 클로닝하였고, 선별을 위해 E. coli로 형질도입되었다. 최종 컨스트럭트의 서열을 DNA 서열분석에 의해 증명하였다.
VH 도메인(원래의 신호 펩티드 서열을 포함)에 상응하는 영역을 N-말단 서열 및 VH/CH 이행 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 원래의 TOPO 서열분석 클론에서 PCR 증폭하였다. 센스 프라이머는 클로닝 목적을 위한 말단 NotI 제한효소 영역 서열 및 ATG 시작 코돈의 바로 상류에 Kozak 서열(5'-GCCGCCACC-3')을 함유하였다. 안티센스 프라이머는 VH/CH 이행의 하류에 플레임에 맞는 NheI 제한효소 영역을 함유하였다. 생성된 VH 도메인 PCR 절편은 제한효소로 절단하였고, 설치류 IgG1에 대한 CH 도메인이 함유된 선형돠된 벡터에 클로닝하였고, 선별을 위해 E. coli로 형질도입되었다. 최종 컨스트럭트의 서열을 DNA 서열분석에 의해 증명하였다.
클로닝되고 재조합적으로 발현된 항-TFPI4F36A1B2 항체은 원래의 하이브리도마 유래 항체와 같이, 사용한 모든 분석에서 동일한 프로파일 및 친화성을 가졌다. HEK293-6E 세포에서 일시적 발현을 위해 사용한 절차는 실시예 3에서 기술한다.
실시예 3: 인간화 TFPI4F36 mAb의 설계 및 구축
마우스 항-TFPI4F36A1B2 CDR 서열을 카밧 정의에 따라 해석하였고 하기와 같이 찾았다:
CDR-H1: NYAMS(서열번호 8의 아미노산 31-35).
CDR-H2: TISRSGSYSYFPDSVQG(서열번호 8의 아미노산 50-66).
CDR-H3: LGGYDEGDAMDS(서열번호 8의 아미노산 99-110).
CDR-L1: KSSQSLLESDGKTYLN(서열번호 4의 아미노산 24-39).
CDR-L2: LVSILDS(서열번호 4의 아미노산 55-61).
CDR-L3: LQATHFPQT(서열번호 4의 아미노산 94-102).
항-TFPI4F36A1B2의 3D 모델은 2GJJ(Her2erbb2에 대한 mAB) 및 1X9Q(플루오레세인에 대한 hAB)의 구조적 주형에 기초하여 Modeller(www.salilab.org/modeller/)에서 구축되었다.
항-TFPI4F36A1B2 VL 및 VH를 사용한 인간 생식계열 V 데이터베이스에서의 BLASTp 조사는 하기 4개의 잠재적 생식계열 서열로 돌아왔다:
중쇄: VH3_21 또는 VH7183.9(e값 < 1e-45)
경쇄: VKII_A18 또는 VKII_A1(e값 < 3e-45)
히트 및 정렬의 매뉴얼 정밀검사 후, VH3_21 및 VKII_A18 생식계열 서열을 HC 및 LC 인간화 프레임워크로서 각각 선별하였다. 상응하는 생식계열 J-단편을 JH6 및 JK4로서 서열 정렬에 기초하여 선별하였다. 항-TFPI4F36A1B2 및 선별된 생식계열 서열 사이의 정렬은 인간화 TFPI4F36의 첫 번째 CDR 접목 버전과 조합하여 보여준다. 항-TFPI4F36A1B2 및 인간 골격(HC: VH3_21/JH6 및 LC: VKII_A18/JK4) 사이의 서열 동일성은 별표 아래의 서열에 의해 묘사된 것과 같이 매우 높다. 초기 인간화 VH 컨스트럭트는 CDR-H2가 카밧 정의(잔기 50-66)보다 더 짧은 버전(잔기 50-58)과 접목된 최소의 CDR 접목 전략에 따라서 설계되었다. 남아있는 5개의 CDR은 카밧 정의에 따라 접목시켰다. CDR(카밧 정의)은 아래의 접목으로서 나열하였고; CDR-H2에서 볼드체로 나타낸 잔기는 인간 생식계열 잔기이다.
CDR-H1: NYAMS(서열번호 18의 아미노산 31-35).
CDR-H2: TISRSGSYSYYADSVKG(서열번호 28의 아미노산 50-66).
CDR-H3: LGGYDEGDAMDS(서열번호 18의 아미노산 99-110).
CDR-L1: KSSQSLLESDGKTYLN(서열번호 15의 아미노산 24-39).
CDR-L2: LVSILDS(서열번호 15의 아미노산 55-61).
CDR-L3: LQATHFPQT(서열번호 15의 아미노산 94-102).
최종 인간화 변이체 HzTFPI4F36에서 CDR-H2의 조성물은 아래에 나열하였고 매치된 CDR-H2는 마우스 항체 항-TFPI4F36A1B2에 대하여 나열하였다.
CDR-H2: TISRSGSYSYFPDSVQG(서열번호 18의 아미노산 50-66).
도 1은 인간 생식계열 서열(각각 서열번호 32 및 31) 및 CDR 접목 인간화 TFPI4F36 서열(각각 서열번호 28 및 26)과 정렬된 마우스 항-TFPI4F36A1B2(각각 서열번호 8 및 4)의 VH(A) 및 VL(B) 도메인의 서열을 보여준다. 도에서 앞의 서열에서 보여준 바 카밧 넘버링 체계를 사용하였고, 카밧 정의에 따른 CDR을 볼드체로 나타낸다. 마우스 항-TFPI4F36A1B2 및 생식계열 서열 사이의 프레임워크 영역에서의 차이는 항-TFPI4F36A1B2 서열에서 회색으로 강조한다. 별표는 마우스 TFPI4F36 및 인간 생식계열 서열 사이의 서열 동일성의 위치를 가리킨다. 잠재적 역돌연변이는 HzTFPI4F36-CDRgrafted 서열(hz4F36CDRgraft로서 나열함)에서 회색으로 강조한다.
HzTFPI4F36-CDRgrafted 컨스트럭트에 대한 잠재적 역돌연변이는 마우스 TFPI4F36 및 생식계열 서열의 프레임워크 영역에서 찾아낸 위치적 차이에 기반하여 확인하였다. 3D 도 1은 잠재적 역돌연변이를 확인하고 우선순위를 매기기 위해 또한 사용된 TFPI4F36 Fab 절편의 서열 모델을 보여준다. 인간화 TFPI4F36 LC 및 HC에서 생성된 역돌연변이의 목록을 표 2 및 3에서 각각 보여준다.
인간화 TFPI4F36에 대한 발현 벡터의 생성
인간화 TFPI4F36 VH 및 VL 영역에 대한 DNA 서열을 상술한 항체의 인간화 설계에 따라서 합성하였다(GENEART AG). 서열을 기본적인 최소한의 CDR 접목으로 추가적인 역돌연변이 없이 얻었다. 저마다의 LC 및 HC 생식계열 리더 펩티드 서열은 컨스트럭트뿐만 아니라 ATG 시작 코돈의 바로 상류에 Kozak 서열(5'-GCCGCCACC-3')을 포함하였다.
pTT-기반 발현 벡터를 인간 카파/IgG4(S241P) 아이소타입으로서 인간화 TFPI4F36 항체의 일시적 발현을 위해 생성하였다. 위치 241(EU 넘버링 시스템(Edelman G.M. et AL., Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85(1969)의 잔기 228에 상응하는, 카밧에 따른 넘버링)에 프롤린 돌연변이를 단량체 항체 절편, 즉 하나의 LC 및 하나의 HC를 포함하는 "절반-항체"의 생성을 제거하기 위해 IgG4 힌지 영역에 도입하였다.
VH 절편을 GENEART 클로닝 벡터로부터 삭제하였고, 인간 IgG4(S241P) CH 도메인에 대한 서열을 함유하는 선형화된 pTT-기반 벡터에 클로닝하였고, 이후에 선별을 위해 E. coli로 형질도입되었다. 최종 컨스트럭트의 서열을 DNA 서열분석에 의해 증명하였다. VL 절편을 GENEART 클로닝 벡터로부터 삭제하였고, 인간 카파 CL 도메인에 대한 서열을 함유하는 선형화된 pTT-기반 벡터에 클로닝하였고, 이후에 선별을 위해 E. coli로 형질도입되었다. 최종 컨스트럭트의 서열을 DNA 서열분석에 의해 증명하였다.
CDR접목 HzTFPI4F36 단일클론 항체(신호 펩티드 서열 생략)의 VL, VH, LC 및 HC에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 서열목록에 나타낸다(서열번호 26-30).
마우스/인간 키메라 TFPI4F36에 대한 발현 벡터의 생성
인간화 TFPI4F36 변이체의 가장 있음직한 평가를 가능하게 하기 위해서, 항-TFPI4F36 항체(ChimTFPI4F36)의 마우스/인간 키메라 버전을 불변 영역 유래 및 아이소타입에 관련된 임의의 차이를 제거하기 위하여 구축하였다. pTT-기반 발현 벡터를 인간 카파/IgG4(S241P 아이소타입 골격에서 설치류 가변 도메인으로 키메라 항-TFPI4F36 항체에서 설치류 가변 도메인을 생성하였다.
VH 도메인에 상응하는 영역을 일반적인 pTT 특이적 프라이머 및 VH 도메인 c-말단에 특이적인 프라이머를 사용하여 항-TFPI4F36A1B2 HC 발현 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다. 센스 프라이머는 HindIII 제한효소 영역 및 ATG 시작 코돈의 상류에 부착된 서열에 특이적이다. 안티센스 프라이머는 VH/CH 이행 서열에서 인프레임 NheI 제한효소 영역을 함유한다. 생성된 PCR 절편은 제한효소로 절단하였고, 인간 IgG4(S241P) CH 도메인이 함유된 선형 pTT-기반 벡터에 클로닝하였고, 선별을 위해 E. coli로 형질도입되었다. 최종 컨스트럭트의 서열을 DNA 서열분석에 의해 증명하였다.
VL 도메인에 상응하는 영역을 VL 도메인의 C-말단에 일반적 pTT 특이적 프라이머 및 특이적인 프라이머를 사용하여 TFPI4F36A1B2 LC 발현 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다. 센스 프라이머는 HindIII 제한효소 영역 및 ATG 시작 코돈의 상위에 뻗어있는 서열에 대하여 특이적이다. 안티센스 프라이머는 VL/CL 이행 서열에서 인플레임 BsiWI 제한효소 영역을 함유한다. 생성된 PCR 절편은 제한효소로 절단하였고, 인간 카파 CL 도메인이 함유된 선형 pTT-기반 벡터에 클로닝하였고, 선별을 위해 E. coli로 형질도입되었다. 최종 컨스트럭트의 서열을 DNA 서열분석에 의해 증명하였다.
mAb 변이체의 재조합 발현
설치류 항-TFPI4F36A1B2, 키메라 항-TFPI4F36 및 인간화 TFPI4F36 항체 변이체를 하기 일반적 항체 발현 프로토콜에 따라 HEK293-6E 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 하기 절차는 부유 개조된 HEK293-6E 세포에 대하여 사용된 일반적 형질도입 프로토콜을 기술한다.
세포 유지
HEK293-6E 세포를 25 μg/ml 게네티신(Gibco), 0.1% v/v의 계면활성제 Pluronic F-68(Gibco) & 1% v/v 페니실린스트렙토마이신(Gibco)을 보충한 FreeStyle™ 293 발현 배지(Gibco)에서 부유시켜 키웠다. 세포를 37℃, 8 % CO2 및 125 rpm에서 교반 배양기로 교반 플라스크에서 배양하였고, 0.1-1.5×106 세포/ml 사이의 세포 밀도를 유지하였다.
DNA 형질도입
·형질도입에 사용된 배양의 세포 밀도는 0.9-2.0×106 세포/ml이었다.
·세포 배양 ml 당 0.5 LC 벡터 DNA+0.5 HC 벡터 DNA의 혼합을 사용하였다.
·DNA는 상온(23-25℃)에서 5분 동안 Opti-MEM 배지(Gibco) 30배지/DNA로 희석하였다.
·293Fectin™(Invitrogen)을 DNA 당 1μl의 농도로 형질 도입 시약으로서 사용하였다.
·293Fectin™은 상온(23-25℃)에서 5분 동안 Opti-MEM 배지(Gibco)로 30X로 희석하였다.
·DNA 및 293Fectin 용액을 혼합하였고, 상온(23-25℃)에서 25분간 배양하도록 두었다.
·DNA-293Fectin 혼합을 이후에 세포 배양에 직접 첨가하였다.
·형질도입된 세포 배양을 37℃, 8% CO2 및 125 rpm에서 교반 배양하기 위해 옮겼다.
·형질도입한지 3-6일 후, 세포 배양 상청액을 원심분리에 이어 0.22 μm PES 필터(Corning)을 통한 여과에 의해 수확하였다.
·항체 생산의 정량 분석을 FortOctet system 및 단백질 A 바이오센서 또는 정량 단백질 A HPLC를 사용하여 깨끗한 세포 배양 상청액에서 직접 Biolayer Interferometry에 의해 수행하였다.
인간화 항- TFPI4F36의 CDR 접목 변이체의 항체 분석
최소한의 CDR 접목에 의한 인간화는 on- 및 off- 속도에서의 효과에 의해 유발된 친화성의 극적인 손실을 초래하였다. 인간화 TFPI4F36 항체(인간화 TFPI4F36로서 나열한 HzTFPI4F36-CDRgrafted)의 초기 접목 버전의 TFPI 결합 친화성은 원래의 마우스 TFPI4F36 항체의 ~30 pM의 친화성보다 적어도 100배 더 낮았다(표 1 참조). 키메라 항체에서의 친화성의 유지로 인간 카파/IgG4(S241P) FC가 항체 친화성에서 효과가 없음을 확인하였다. 친화성 분석은 아래에서 기술된 바 SPR을 사용하여 수행하였다.
mAb Ka(1/Ms) Kd(1/M) KD(M)
설치류 TFPI4F36 4,70E+06 1,33E-04 2,82E-11
키메라 TFPI4F36 8,88E+06 1,44E-04 1,62E-11
인간화 TFPI4F36 1,07E+06 2,21E-03 2,06E-09
hzTFPI4F36 - TFPI 상호작용의 표면 플라즈몬 공명( Biacore ) 분석
원래의 설치류 항-TFPI4F36A1B2, 키메라 항-TFPI4F36, 및 인간화 TFPI4F36 항체의 다양한 변이체에 대한 재조합 인간 TFPI의 상호작용에 대한 역학적 매개변수를 두 개의 다른 응용을 사용한, Biacore에서의 SPR 분석에 의해 결정하였다. 초기 동역학 랭킹 연구는 실시예 1에서 기술된 바 정제된 mAb의 포획 절차에 기초를 두었다. 이들은 센서 칩 표면에서 카르복시메틸레이티드 덱스트란 막(CM5)에 자유 아미노기를 통해 공유적으로 결합된 단일클론 항체와, 선별된 mAb 컨스트럭트에서 역학적 절차에 직접적으로 결합하는 것에 따랐다. 재조합 인간 TFPI를 다양한 농도로 주입하였고, 실시예 8에서 기술한 바 센서 칩 표면 위의 끊임없는 버퍼 흐름으로 해리 기간이 뒤따른다.
인간화 mAb에서 역돌연변이를 도입하기 위한 위치지정 돌연변이
인간화 항-TFPI4F36의 CDR 접목 버전의 낮은 친화성에 기초를 둔, 인간에서 마우스로의 역돌연변이(역돌연변이로서 지칭됨)의 27개 시리즈가 HzTFPI4F36-CDRgrafted의 경쇄(LC) 및 중쇄(HC)에서 생성되었다. 이들 돌연변이를 발현시켰고, 정제하였고, 분리된 돌연변이 또는 LC/HC 조합 돌연변이 중 어느 하나로서 Biacore에 의해 분석하였다. 생성된 돌연변이의 목록은 표 2 및 3에서 각각 보여준다.
위치지정 돌연변이는 인간화 설계에서 강조된 것과 같이 HzTFPI4F36-CDRgrafted LC/HC 컨스트럭트에서의 특이적 잔기에서 인간에서 마우스로의 역 돌연변이(여기 이후로 역돌연변이로서 지칭됨)를 도입하기 위해 수행하였다. 돌연변이를 두 가지 다른 방법에 의해 도입하였다:
1) Stratagene에서 나온 QuickChange위치지정 또는 다중 위치지정 돌연변이 키트를 점 돌연변이 및 조합 돌연변이를 도입하기 위해 사용하였다. 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다.
2) 또한 표준 2-단계 중복 PCR 방법을 점 돌연변이를 도입하고, 조합 돌연변이를 생성하기 위해 사용하였다.
HzTFPI4F36-CDRgrafted를 위한 LC 및 HC 발현 플라스미드를 돌연변이 생성의 첫 번째 순환에 대한 주형으로서 사용하였다. 이후의 순환에서, 돌연변이는 주형으로서 이전의 돌연변이된 플라스미드를 사용하여 도입하였다. 모든 최종 컨스트럭트의 서열을 DNA 서열분석에 의해 증명하였다.
HzTFPI4F36-CDRgrafted 경쇄의 돌연변이된 변이체
LC 돌연변이 돌연변이 KD(M)
HzTFPI4F36 LC-S63T S63T 7.8E-9
HzTFPI4F36 LC-P15I P15I 17.0E-9
HzTFPI4F36 LC-FR2 Y36L, K39R, Q42E, Q45K 6.3E-10
HzTFPI4F36 LC-P15I,FR2 P15I, Y36L, K39R, Q42E, Q45K 6.4E-10
HzTFPI4F36 LC-Y36L Y36L >3E-11
HzTFPI4F36-CDRgrafted 중쇄의 돌연변이된 변이체
HC 돌연변이 돌연변이 KD(M)
HzTFPI4F36 HC-Q3E Q3E 5.8E-9
HzTFPI4F36 HC-G44R G44R 2.3E-9
HzTFPI4F36 HC-S49A S49A 3.0E-9
HzTFPI4F36 HC-Y59F Y59F 5.5E-9
HzTFPI4F36 HC-A60P A60P 2.2E-9
HzTFPI4F36 HC-K64Q K64Q 2.5E-9
HzTFPI4F36 HC-S77T S77T 1.5E-9
HzTFPI4F36 HC-A93T A93T 2.7E-9
HzTFPI4F36 HC-Y59F,A60P Y59F,A60P 2.3E-9
HzTFPI4F36 HC-KABATCDR2 Y59F, A60P, K64Q 9.0E-10
HzTFPI4F36 HC-FR2,S49A A40T, G42E, G44R, S49A 1.3E-9
HzTFPI4F36 HC-FR3 N82aS, A84S, V89M 5.3E-9
HzTFPI4F36 HC-FR3,S77T S77T, N82aS, A84S, V89M 7.7E-9
HzTFPI4F36 HC-FR3,A93T N82aS, A84S, V89M, A93T 4.1E-9
HzTFPI4F36 HC-FR2 A40T, G42E, G44R 8.8E-10
HzTFPI4F36 HC-FR2,S49A,CDR2 A40T, G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q 2.6E-11
HzTFPI4F36 HC-G42E,G44R,CDR2 G42E, G44R, Y59F, A60P, K64Q 3.9E-11
HzTFPI4F36 HC-FR2,CDR2 A40T, G42E, G44R, Y59F, A60P, K64Q >3E-11
HzTFPI4F36 HC-G42E,G44R,S49ACDR2 G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q >3E-11
HzTFPI4F36 HC-G42E,G44R,A60P,K64Q G42E, G44R, A60P, K64Q 9.3E-11
HzTFPI4F36 HC-G44R,A60P,K64Q G44R, A60P, K64Q 3.0E-11
표 2 및 3에서 나열된 바 LC 및 HC 모두에서의 돌연변이는 도 1에서 보여진 바 카밧 넘버링 체계에 따라서 일관되게 넘버링하였다.
표 2에서 나열된 LC 돌연변이를 오직 야생형 HC HzTFPI4F36 CDRgrafted와 함께 LC 돌연변이로서 발현시켰다. 표 3에 나열된 HC 돌연변이를 오직 야생형 LC HzTFPI4F36 CDRgrafted와 함께 HC 돌연변이로서 발현시켰다. 또한, LC-HC 조합 돌연변이를 다른 LC 및 HC 돌연변이로 조합함으로써 발현시켰다. 돌연변이는 최종 인간화 mAb 변이체가 야생형 HzTFPI4F36-CDRgrafted LC 및 돌연변이된 HzTFPI4F36 FR2, S49A , CDR2 HC와 함께 발현되도록, 돌연변이된 사슬 이후에 일관되게 명명하였다. 일시적 HEK293-6E 발현을 상술한 바와 같이 수행하였다.
9개의 점 돌연변이(HzTFPI4F36 LC-S63T & HzTFPI4F36 HC-Q3E ; G44R ; S49A ; Y59F; A60P; K64Q; S77T; A93T)의 초기 세트는 인간화 설계에서 강조한 역 돌연변이의 초기 세트에 초하였다. 점 돌연변이는 항체의 친화성을 치유하지 않지만, 두 번째 인간 중쇄 프레임워크 영역(CDR H1 및 CDR H2 사이의 FR2) 및 CDR H2의 C-말단 영역(최소 CDR 접목 모식도에서 생략함)에서의 돌연변이는 TFPI 결합에 중요한 것으로 강조되었다. Biacore 분석에 의한 친화성 측정은 상술한 바와 같이 수행하였다.
개별 영역에서의 모든 잔기인 다수의 패치 돌연변이를 포함하는 돌연변이 생성의 이후의 순환은 집단적으로 돌연변이되었다. 카밧 정의에 따르고, 최소 CDR 접목 모식도에 따르지 않는 접목 CDR H2에 상응하는, CDR H2의 C-말단 영역에 3개의 돌연변이 Y59F, A60P, K64Q를 갖는 돌연변이 HzTFPI4F36 HC-Kabat CDR2를 초기 HzTFPI4F36-CDRgrafted 변이체를 위하여 사용하였다. LC FR2 및 HC FR2에서의 패치 돌연변이를 따라서 이 패치된 돌연변이는 인간화 TFPI4F36 항체의 친화성을 유의하게 개선시켰지만, 세 가지의 패치 돌연변이의 어느 것도 높은 TFPI4F36 친화성을 개벌적으로 복구하지 못했다.
HC FR2, 및 CDR2(A40T, G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q)에서 조합된 돌연변이가 있는 HC 돌연변이는 친화성을 완전히 복구하였다. 이 돌연변이는 항체 서열에 7개의 추가적인 설치류 잔기를 도입하였다. LC FR2 돌연변이(FR2 돌연변이 및 Y36L 모두) 및 HC FR2 및/또는 CDR2 돌연변이의 조합은 또한 높은 친화성 돌연변이를 초래하였다. 그러나 이들 LC/HC 돌연변이의 조합은 일관되게 HC 돌연변이 단독과 비교하여 낮은 발현 수율을 초래하였다. 이들 결과는 LC 돌연변이의 포함이 이들 항체 변이체의 안정성에 부정적 영향을 갖고, 따라서 인간화 TFPI4F36 LC 및 HC 사이에서 미미한 상호작용 패턴이 존재하는 것을 시사한다.
돌연변이의 마지막 시리즈에서, HC FR2, 및 CDR2(A40T, G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q)에서의 7개 돌연변이는 잠재적인 비-기여 역돌연변이를 제거하기 위해 절개하였다. 5개 돌연변이의 시리즈를 이 점을 설명하기 위해 생성하였다.
3개의 돌연변이에서, 역돌연변이는 FR2에서 제거되었다:
HzTFPI4F36 HC-G42E , G44R , CDR2
HzTFPI4F36 HC-FR2, CDR2
HzTFPI4F36 HC-G42E , G44R , S49CDR2 .
두 개의 돌연변이에서 CDR2에서 추가적으로 돌연변이가 또한 제거되었다:
HzTFPI4F36 HC-G44R , A60P , K64Q
HzTFPI4F36 HC-G42E , G44R , A60P , K64Q .
그러나 돌연변이의 무엇도 조합된 HC FR2 CDR2 돌연변이와 동등하지 않았다. 친화성 또는 발현 수준 중 어느 하나(또는 둘다)가 HC FR2 CDR2 돌연변이 서브세트에서의 임의의 감소에 의해 영향을 받았다. 다섯 개의 남아있는 역돌옅변이를 갖는 두 개의 돌연변이 HzTFPI4F36 HC G42E, G44R, Y59F, A60P, K64Q 및 4개의 나머지 역돌연변이를 갖는 HzTFPI4F36 HC G42E, G44R, A60P, K64Q을 HzTFPI4F36 HC-FR2, S49A, CDR2와의 비교를 통해 집어냈다.
o HzTFPI4F36 HC-G42E , G44R , A60P , K64Q 및 HzTFPI4F36 HC-FR2, S49A , CDR2는 유사한 수준으로 발현되었지만, HzTFPI4F36 HC-G42E , G44R , CDR2는 약간 낮은 발현 수준을 가졌다. 촉진된 생물물리학적 안정성 연구는 세 가지 변이체의 안정성에서 어떠한 차이도 보이지 않았다.
o bIACORE에 의해 측정된 친화성은 아래에 나열한다.
o dPT 분석(아래에서 기술한 바)에서 측정한 생체 내 효능은 모든 세 가지 변이체에서 유사하였다
TFPI 및 인간화 TFPI4F36 변이체 사이의 상호작용에 대한 역학적 매개변수.
돌연변이 KD(pM) 발현 수율(mg/L) 역돌연변이의 수
HzTFPI4F36 A40T, G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q 26 54 7
HzTFPI4F36 G42E, G44R, Y59F, A60P, K64Q 39 24 5
HzTFPI4F36 G42E, G44R, A60P, K64Q 93 53 4
상술한 데이터에 기초하여, 원래의 HC FR2, 및 7 HC 역돌연변이(A40T, G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q)가 있는 CDR2 돌연변이를 다른 변이체보다 우월하게 시험하였고, 이 변이체는 여기서 HzTFPI4F36 또는 mAbTFPI2021로서 지칭된다.
CDR2 돌연변이 Y59F, A60P, K64Q는 항원과 직접적으로 상호작용하는 것에 의해 영향을 주는 것이다. 돌연변이 A40T, G42E, G44R은 CDRH1 및 CDR H2를 연결하는 FR2에서 존재하고, 항원 결합면에서 멀리 떨어지고 LC-HC 상호작용을 안정화시키기 위한 태세를 갖출 수 있다. 돌연변이 S49A는 알라닌이 이 위치에서 세린보다 왜 바람직한지 설명할 수 있는 곁쇄으 고도로 높은 소수성 클러스터의 중간에 뭍힌다. 따라서, 흥미롭게도, HzTFPI4F36의 높은 친화성은 직접적인 항원 상호작용을 향상시키는 돌연변이 및 항체를 안정화하는 항원 결합 영역으로부터 멀리 떨어진 돌연변이의 조합으로서 얻어진다.
결론적으로, HzTFPI4F36은 ~25 pM의 친화성(KD)을 갖고 항체에서 잔기의 전체 수의 5.2%에 상응하는, 마우스 항체 서열로부터 유래한 35개의 아미노산 잔기를 함유한다.
가변 경쇄(VL) 영역, 가변 중쇄(HL) 영역, 선별된 인간화 컨스트럭트의 경쇄 및 중쇄, HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)에 대한 아미노산 서열을 각각 서열번호 15, 18, 21 및 24에서 보여준다.
시험관 내 효능 분석
항-TFPI4F36 항체는 응고 인자 Xa(FXa) 및 조직 인자(TF) 및 인자 VIIa(FVIIa)의 복합체의 TFPI-매개 억제를 중성화할 수 있다. 설치류 및 인간화 TFPI4F36 항체 변이체의 활성은 희석한 프로트롬빈 시간(dPT) 시험에서 측정하였다. dPT 분석을 항-TFPI 항체의 전응고제 활성을 측정하기 위해 사용하였다. 항-TFPI 항체의 증가하는 혈장 농도는 dPT 응고 시간을 짧게 한다.
실시예 4: MuTFPI4F36 ( Fab )의 Fab -절편 및 인간 조직 인자 경로 억제 자(TFPI)의 제 2 Kunitz 도메인(K2)의 정제, 결정화 및 구조
그의 Kunitz 도메인(K2) 및 C-말단 His6-태그(서열번호 2)를 포함하는 TFPI의 결정을 MuTFPI4F36 Fab 절편(Fab)와 동시결정화하였다. 복합체의 구조는 X-선 결정학에 의해 풀었다. K2 결합 에피토프는 잔기 E10, E11, P13, R17, Y19, T21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 및 L50로 구성될 것으로 밝혀졌다. Fab 위의 파라토프는 MuTFPI4F36 경쇄(서열번호 4)의 잔기 E31, S32, D33, Y37, A96, T97, H98 및 F99 및, MuTFPI4F36 중쇄(서열번호 8)의 잔기 N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, P61, D62, Q65, Y102, D103 및 D106을 포함하는 것으로 밝혀졌다.
물질 및 방법
분석적 크기 배재 크로마토그래피.
분석적 크기 배재 크로마토그래피(SEC)를 0.8 ml/min의 유속으로 PBS-버퍼(10mM 인산염, 150mM NaCl, 3mM KCl, pH 7,5)로 용출한 Biosep S-3000(300×7,80mm) 컬럼(Phenomenex)을 사용하여 수행하였다.
Fab /K2 복합체의 제조 및 정제.
Fab/K2 복합체를 1:1.5의 몰라 비(5.4 mg Fab 및 1.4 mg K2)로 Fab(PBS 버퍼에서 0.27mg/ml, pH 7.4) 및 K2(PBS 에서 0.29 mg/ml, pH 7.4)를 혼합하는 것에 의해 제조하였다. 복합체를 ~6.7 mg/ml의 농도까지 Centrifugal Filter 장치(Amicon, 10 kD mw 컷-오프)에서 농축시켰다. 과다한 K2를 제거하기 위하여, 농축된 샘플을 1 ml/min의 유속으로 PBS-버퍼, pH 7.4로 용출한 Superdex 75(CV300) 겔 여과 컬럼에 적용하였다. Fab/K2 복합체를 함유하는 분획을 모으고, 9.2 mg/ml의 단백질 농도로 농축하였다. 이 용액을 결정화에 사용하였다.
Fab /K2 복합체의 결정화.
Fab/K2 복합체를 0.2 M 3염기 구연산칼륨(pH 8.0) 및 20 % w/v PEG 3,350를 함유하는 침전 용액을 사용하여 핸드 드롭 방법에 의해 막대로서 결정화시켰다.
결정 구조 결정.
Fab/K2 복합체의 구조는 Fab 및 K2 분자에 대한 주형으로서 각각 PDB 구조 1F8T 및 1TFX를 사용하여 분자 교체 방법에 의해 풀었다.
결과
Fab 및 K2 사이의 복합체를 Fab의 용액에 K2를 과하게 첨가하는 것에 의해 제조하였다. 도 6은 분석적 크기 배재 크로마토그래피(SEC)에 해 모티터된 복합체 형성을 보여준다. 이 방법은 큰 분자 종이 더 작은 분자 종 보다 더 빨리 용출되어 그들의 분자 크기에 따라 분자를 분리한다. K2 및 Fab에 상응하는 피크는 분자량에서의 큰 차이로 인해 잘 분리되었다(각각 mw ~8 kDa 및 48 kDa). Fab 용액으로의 K2의 첨가는 더 짧은 유지 시간쪽으로 피크 위치에서 예상된 작은 쉬프트를 초래하였다. 복합체는 쉽게 분리되었고, 예비적 SEC를 사용한 과다 K2의 분리에 의해 순수한 형태로 얻었다.
Fab/K2 복합체의 결정화에 대한 조건은 몇몇의 시판하는 결정화 스크린을 사용하여 스크리닝하였다.핸드 드롭 방법은 단일 결정 X-ray 분석에 적절한 막대-모양 결정을 공급하였고, 구조는 주형으로서 PDB에 침전된 구조를 사용하여 분자 교체 방법에 의해 풀었다. 도 7은 Fab/K2 복합체의 전체적 구조를 보여준다. 보여준 것은 Fab 분자를 구성하고, 항체 분자에 대한 예상된 면역글로불린의 b-샌드위치 폴드 특징을 지니는 경쇄 및 중쇄이다. 또한 보준 것은 항원과 접촉하고, 항체의 특이성 및 친화성을 결정하는 CDR 루프이다.
항원, K2는 Kunitz-접힘을 결정하는 특징적인 단일 항-평행 b-시트(b1(I20-N26) 및 b2(Q31-Y37)) 및 N-말단 a-나선(a1, L50-I56)를 나타낸다(도 8). 또한, 나타내는 것은 N-말단(a0, D5-F8)에 가까운 선택적 310-나선에 이어 짧은 루프(Lb, N27-K30)를 통해 b2와 연결되는, b1으로 이어지는 루프 1(L1, L9-Y19)이다. C-말단 단편에서, 루프 2(L2, G38-T49)는 a1과 함께 b2로 이어진다. 최종적으로, 특징적인 세 개의 이황화 결합(C7-C57, C16-C40 및 C33-C53)은 각각 a1으로 a0에, L2로 L1에, a1으로 b2에 연결된다.
K2의 두 가지 구조는 Worldwide Protein DataBank(PDB)에 기탁하였다. 하나의 구조, 1ADZ는 NMR 분광기에 의해 결정되고, 자유 용액 구조를 나타내며, 이에 반해 다른 1TFX는 X-선 결정학에 의해 결정되고, 돼지 트립신과 복합체를 이룬 K2를 나타낸다. 도 9는 Fab와 함께 복합체를 이룬 1ADZ, 1TFX 및 K2 분자에 의해 나타낸 K2의 구조적 중첩을 보여준다. 주쇄 자취는 모든 세 가지 구조에서 매우 유사함을 나타내고, 이는 그것의 세 가지 안정화 이황화 결합을 갖는 Kunitz-접힘이 더욱 단단함을 시사한다.
MuTFPI4F36 K2 결합 에피토프의 서술
Fab의 중원자로부터 4 또는 그 이하의 거리 내에 위치하는 적어도 하나의 곁쇄 중원자를 함유하는 K2의 잔기로서 정의된 항원 K2 위의 결합 에피토프는 잔기 E10, E11, P13, R17, Y19, T21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 및 L50를 포함한다(도 10). K2의 접촉 잔기는 b-시트 구조(T21, Y23, Q31, E33, R34, F35, K36) 및 연결 루프, Lb(Q28)에서 L1(E10, E11, P13, R17, Y19), 최종적으로, a1(L50)에서 단독으로 하나 위치한다. 도 10은 K2의 3D-구조 및 일차 아미노산 서열 모두에서 매핑된 결합 에피토프를 묘사한다.
MuTFPI4F36 파라토프의 묘사
MuTFPI4F36 Fab 절편의 파라토프는 MuTFPI4F36 Fab 및 TFPI K2 도메인 사이의 동일한 X-ray 복합체의 구조로부터 결정되었다. 파라토프는 K2 도메인의 중원자로부터 적어도 4의 거리 내에 있는 중원자를 갖는 MuTFPI4F36 Fab의 이들 잔기로서 정의된다. 경쇄에서의 접촉 잔기는 서열번호 4의 잔기 E31, S32, D33, Y37, A96, T97, H98 및 F99에 위치한다. 중쇄에서의 접촉 잔기는 서열번호 8의 잔기 N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, P61, D62, Q65, Y102, D103 및 D106에 위치한다. 파라토프의 위치는 도 3에서 묘사하였다.
실시예 5: K2/ HzTFPI4F36 Fab 복합체의 구조
K2에 결합한 MuTFPI4F36 Fab의 3차원 구조의 결정에 대하여 기술된 것과 유사한 방법론을 사용하여, 인간화 항체에서 나온 Fab 절편, HzTFPI4F36, 및 K2 사이의 복합체의 구조를 결정하였다. HzTFPI4F36의 Fab는 그것이 유래한 설치류 Fab로서 K2 위의 동일한 영역에 결합하는 것으로 예상대로 밝혀졌다. 주새 리본 자취가 K2/TFPI4F36 Fab 및 K2/HzTFPI4F36 Fab 복합체에 대하여 씌워졌을 때, 두 가지 복합체의 구조 사이의 전체적 유사성은 도 11에서 분명히 나타난다. K2 위의 에피토프(4 컷-오프를 사용하여 결정됨)는 HzTFPI4F36에 대하여 잔기 E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, K36 및 L50를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 설치류 기원의 K2/MuTFPI4F36 Fab의 구조와의 비교에서 D12, F24, N26 및 C32는 F35가 바깥쪽에 있을 때, 4 컷-오프 내에 인간화 K2/HzTFPI4F36 복합체가 있었다. MuTFPI4F36 및 HzTFPI4F36에서의 CDR 영역이 동일하다는 사실에도 불구하고, 이것은 K2/MuTFPI4F36 Fab 및 K2/HzTFPI4F36 Fab 복합체의 결합 경계면 내의 곁쇄 방위에서 미미한 차이를 반영한다.
실시예 6 내지 8
HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)의 기능을 그들 중 일부는 TFPI의 K2 도메인에 결합하는 것으로 보이고; 그들 중 일부는 결합에 대하여 설명하지 않는, 모든(4개) 시판하는 단일 클론 항체의 기능과 비교하였다.
실시예 6: TFPI 중화 분석: FXa 억제
사용한 물질은 분석에서 BSA 버퍼(50 mM Hepes; 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 mg/ml BSA, pH 7.4)였고, 시약은 표 5에서 보여준다.
사용한 물질
시약 회사/참고문헌 원료 농도 최종 농도 (BSA 버퍼에 희석)
Human FXa Enzyme Research Laboratory 21.7 mM 5 nM
Human TFPI 참고문헌: Pedersen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, p. 16786-16793 10 mM 글리실글리신에서 동결 건조함, 100 mM NaCl; 165 mM 만니톨 버퍼 pH 7.0. 물에서 재구성. 6 nM
mAbTFPI4F36
mAb0281
mAb4904
mAb2974
mAb29741		 본 발명
Ab systems
AD
R&D systems
R&D systems
5-150 nM
S2765 Chromogenix 20 mM 1 mM
방법:
재조합 전장 인간 TFPI(최종 농도 6 nM))을 30분 동안 흥미있는 mAb의 증가하는 농도(최종 농도: 5-150 nM)를 BSA 버퍼에 혼합하였다. FXa를 첨가하여 30분 배양하였고, 혼합물과 함께 30분 더 배양하였다. 발색 기질 S2765을 첨가하였고, 405 nm에서의 흡광도를 Spectramax에서 15분 동안 측정하였다. 100% 활성은 TFPI의 첨가 없이 FXa의 활성을 나타낸다.
FXa의 TFPI의 중화
회사 mAb ID IC 50 nM 150 nM에서 TFPI의 % 중화
본 발명 HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021) 12.6 100%
AbNova mAb0281 nd < 10%
American Diagnotica mAb4904 nd < 10%
R&Dsystems mAb2974 29.4 90%
R&Dsystems mAb29741 nd < 10%
결론:
150 nM에서, HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)는 FXa의 TFPI 억제를 완전히 중화시켰다. mAb0281, mAb4904 및 mAb29741에 대하여 거의 활성이 검출되지 않았다.
실시예 7: TFPI 중화 분석: FVIIa / TF / FXa 억제
사용한 물질은 BSA 버퍼(50 mM Hepes; 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 mg/ml BSA, pH 7.4) EDTA: 50 mM였고, 시약은 표 7에서 나열하였다.
시약 회사/참고문헌 원료 농도 최종 농도 (BSA 버퍼에 희석)
MAB2974
mAbTFPI4F36		 R&D systems
본 발명 		3330 nM
75300 nM		 다양함(5-150 nM)
NovoSeven Novo Nordisk 27 1 pM
vesicles HTI Phospholipids vesicles cat#PCPS-02 #W1115-75% PC-25% PS 2.0 mM 10 mM
S-2765 Chromogenix 35 mM 0.5 mM
FX American Diagnostica inc. 소 인자 X 제품 번호 510 Lot 번호 050920 50% 글리세롤/물에 용해함 165 160 nM
TFPI 참고문헌: Pedersen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, p. 16786-16793 18.6 1 nM
TF (Innovin) Dade Behring#2010-01-11#536975 vial diss. in 10ml H2O 2.8 nM (6nM) 1 pM
방법:
모든 구성 요소를 표에서 지시한 최종 농도로 첨가한다. 미세적정 웰에서 25 FX, 다양한 농도의 25 TFPI mAb, 25 인간 TFPI, 25 FVIIatF(innovin)를 첨가한다. 상온에서 40분간 배양한다. 50 EDTA에 이어 50 S-2765를 첨가한다. 혼합하고, Mix 및 Spectramax에서 405 nm로 15분 간 플레이트를 읽는다. 100% 활성은 TFPI가 존재하지 않을 때 얻어진 FVIIa/TF/FX의 활성이다.
FVIIa/TF/FX의 TFPI 억제의 중화
회사 mAb ID IC 50 150 nM에서 TFPI의 % 중화
본 발명 HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021) 3.8 nM 100%
AbNova mAb0281 nd Nd
American Diagnotica mAb4904 nd Nd
R&Dsystems mAb2974 45.6 nM 53%
R&Dsystems mAb29741 nd Nd
결론:
150 nM의 mAb 농도에서 TFPI는 mAbTFPI2021에 의해 완전히 중화되었다. 또한, mAb2974는 포화에 도달했지만, TFPI를 완전히 중화시키지 않았다(53% 중화).
실시예 8: 결합 상호작용 분석
사용한 물질은 표 9에서 나열한 바와 같다.
시약 회사
TFPI 10 mM 글리실글리신에서 동결 건조함, 100 mM NaCl; 165 mM 만니톨 버퍼 pH 7.0. 물에서 재구성.
mAbTFPI2021
mAb0281
mAb4904
mAb2974
mAb29741		 본 발명
Ab systems
AD
R&D systems
R&D systems
All other 시약s Biacore
방법:
결합 상호작용 분석을 Biacore T-100 기계에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 얻었다. 고정된 농도에서 상응하는 단일클론 항체의 포획을 10 mM 아세트산 나트륨 pH 4.5-5.0에서 500-1000 RU의 수준으로 mAb를 CM5 칩에 직접 고정화시키는 것에 의해 얻었다. 200 nM 내지 0.2 nM의 재조합 인간 전장 TFPI 또는 인간 TFPI 약식(1-161 아미노산 잔기)의 4배 희석을 고정된 mAb에 대한 결합을 위해 시험하였다. 러닝 및 희석 버퍼: 10 mM HEPES, 150 mM, 0.005% p20, pH 7.4. 재생성은 10 mM 글리신, pH 1.7에 의해 얻었다. 동역학 및 결합 상수(kon, koff, KD)의 결정은 Biacore T100 평가 소프트웨어를 사용하여 관심있는 항체와 TFPI의 1:1 상호작용을 가정하여 얻었다. 결과는 표 10에서 보여준다. mAbTFPI2021("mAb2021", HzTFPI4F36)에 결합했을 때 TFPI에 대한 결합에 대하여 다른 mAb의 경쟁을 CM5 칩에서 5000RU로 mAbTFPI2021의 고정화에 이어 경쟁을 위해 시험될 다양한 농도의 mAbs(2974, 0281, 4904, 29741)에서 얻었다. 결과는 표 11에서 보여준다. 칩의 재생성은 10 mM 글리신, pH 1.7에서 얻었다.
표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석. 전장 인간 TFPI의 결합. 동력학 및 결합 상수.
생산자 mAb ID ka (1/Ms) kd (1/s) K D (M) K D nM
본 발명 mAb2021 2.39E+06 3.58E-05 1.50E-11 0.015
AbNova mAb0281 3.99E+05 0.001436 3.60E-09 3.60
American Diagnotica mAb4904 1.42E+05 00.1294 9.14E-09 9.14
R&Dsystems mAb2974 1.39E+06 0.001202 8.64E-10 0.864
R&Dsystems mAb29741 9.51E+05 0.003165 3.33E-09 3.33
SPR 분석. 전장 인간 TFPI 및 TFPI161(K1 및 K2 도메인)에 대한 결합에 대한 결합 상수. mABTFPI 2021과 경쟁.
생산자 mAb ID K D (M)TFPI K D (M)TFPI 161 mAB 4F36과의 경쟁
본 발명 mAbTFPI2021 1.50E-11 4.55E-11 Yes
AbNova mAb0281 3.60E-09 7.28E-09 No
American Diagnotica mAb4904 9.14E-09 결합 없음 No
R&Dsystems mAb2974 8.64E-10 3.12E-09 Yes
R&Dsystems mAb29741 3.33E-09 결합 없음 No
결론
mAbTFPI2021는 임의의 다른 시험 mAb보다 높은 친화성으로 TFPI에 결합한다(KD 15 pM). 오직 mAb2974가 mAb TFPI4F36과 같이 동일한 부위로의 결합에 대하여 경쟁한다.
실시예 9: 인간 배꼽 혈관 내피 세포(HUVEC)에서 TFPI의 중화
내피 세포는 글리코실포스파티딜인노시톨(GPI) 앵커(anchor)를 통해 세포 표면에 부착된 형태에서 TFPI를를 구조적으로 발현한다. GPI-앵커 TFPI는 TF가 TFPI와 같이 동일한 세포에 발현되었을 때, TF-매개 활성을 특이적으로 억제한다. HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)가 본 발명자들이 인간 배꼽 혈관 내피 세포 HUVEC에 적용했던 mAb 2974보다 세포가 TFPI에 더욱 효율적으로 결합하는 것에 의해 억제를 중성화하는 것을 증명하기 위하여; TF 발현을 유도하기 위하여, 이들 세포는 FX의 FVIIa/TF 촉매 활성화를 시험하기 전에 TNFα(Sigma RBI) 및 IL1β(Roche)로 자극된다.
HUVEC 세포를 96 웰 플레이트 in EBM-2 배지(Clonetics)로 96웰 플레이트에서 꽉차도록 배양하였고, 시험 전 2시간 동안 20 ng/ml TNFα 및 20 ng/ml IL1β로 자극하였다. 시험은 25 mM HEPES, 137 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 5 mM CaCl, 1 mg/ml BSA(0.1%) ph 7.4에서 수행되었고, FX 활성화는 50 pM FVIIa 및 50 nM FX를 첨가한 항체(0-20 nM)의 존재 하에서 이어졌다. FXa의 생성은 0.6 mM의 발색 기질, S-2765(Chromogenix)에서 측정하였고, FXa 표준 곡선에 대하여 계산되었다.
도 12는 세포 결합 TFPI에 의한 억제가 0-20 nM의 HzTFPI4F36 또는 mAb 2974에 의해 폐지되었을 때의 결과를 보여준다. TX의 TF/FVIIa매개 활성화는 절반의 효과 농도, (EC50 ~ nM)의 HzTFPI4F36에 의해 촉진된데 반하여, FXa 생성의 임의의 자극은 20 nM의 2974 mAb에서 관찰되었다.
따라서, 이 실시예는 mAb 2974와 대조적으로, HzTFPI4F36가 세포 결합 TFPI에 의한 TF/FVIIa매개 FX 활성화의 억제를 효과적으로 중화시키는 것을 나타낸다.
실시예 10: MDamB 231 인간 유방 암종 세포에서 TF / FVIIa 활성의 TFPI 억제 의 중화.
MDamB 231 세포는 표면에서 높은 수준의 TF 및 TFPI의 무의미한 양을 구조적으로 발현한다. FX의 세포 표면 TF/FVIIa 매개 활성화를 외재적으로 첨가한 TFPI에 의해 억제시킬 수 있다. 이런 형태의 TFPI 억제가 HzTFPI4F36를 mAb 2974보다 더 효과적으로 중화시키는지 증명하기 위하여, 본 발명자들은 MDamB 231 세포에 적용시켰고, FVIIa/TF 촉진된 FX 활성화의 TFPI 억제를 폐지하기 위하여 다양한 농도의 항체의 능력을 시험하였다.
MDamB 231 세포를 10 % FCS 및 1 % P/S를 보충한 DMEM Gibco cat# 31966-021으로 96 웰 플레이트에서 꽉 차도록 배양하였다. 테스트는 25 mM HEPES, 137 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 5 mM CaCl, 1 mg/ml BSA(0.1%) ph 7.4에서 수행되었고, FX 활성화는 2.5 nM 전장 인간 재조합 TFPI, 100 pM FVIIa 및 50 nM FX를 첨가한 항체(0-20 nM)의 존재 하에서 이어졌다. FXa의 생성은 0.6 mM의 발색 기질, S-2765(Chromogenix)에서 측정하였다. 405 nm에서의 흡광도를 계속 측정하였고, FXa 활성을 반응의 개시 후 15분에서의 증가 곡선의 기울기를 측정하는 것에 의해 결정하였다.
도 13은 TFPI의 억제가 0-20 nM의 HzTFPI4F36 또는 mAb 2974에 의해 폐지되었을 때의 결과를 보여준다. FX의 TF/FVIIa매개 활성화는 절반의 효과 농도, (EC50 ~ 2 nM)의 HzTFPI4F36에 의해 촉진된데 반하여, FXa 생성의 임의의 자극은 실질적으로 더 높은 농도의 2974 mAb(EC50 > 20 nM)에서 관찰되었다.
실시예 11: ELISA를 사용한 항- TFPI 단일클론 항체, HzTFPI4F36 및 mAb2974 의 결합 에피토프의 매핑.
TFPI Kunitz-도메인 2(K2) 위의 HzTFPI4F36에 대한 결합 에피토프는 TFPI-K2/ HzTFPI4F36 복합체의 결정 구조를 푸는 것에 의해 매핑하였다. HzTFPI4F36 및 mAb2974(R&Dsystems)에 대한 결합 친화성에서 HzTFPI4F36에 대하여 TFPI 내부(E10, R17 및 Y19) 및 외부(D5) 결합 에피토프에서 단일 아미노산 잔기의 돌연변이의 효과를 ELISA에 의해 분석하였다. TFPI 변이체를 HEK293-F 세포에서 발현시켰고, ELISA를 세포 배양으로부터 나온 조건 배지를 사용하여 수행하였다.
TFPI K1(MAb4903, American Diagnostica) 및 K3(MAb4F110, in-house)에 결합하는 TFPI-WT 및 TFPI 돌연변이의 농도를 ELISA에 의해 평가하였고, 따라서 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다. HzTFPI4F36에 대한 결합에서 돌연변이의 효과는 ELISA에서 MAb4903 및 HzTFPI4F36를 사용하여 분석하였다. MAb2974 결합에서의 효과는 MAb2974 및 MAb4F110과 함께 ELISA를 사용하여 결정하였다.
HzTFPI4F36 및 MAb2974 각각에 대한 결합에서 TFPI-Kunitz 2에서의 돌연변이의 효과를 TFPI-WT(100% 결합)에 대하여 계산하였고, 도 14에 나타내었다. 수는 발현 수준의 차이에 대하여 정정하였다.
결론:
HzTFPI4F36에 대한 결합 에피토프 내의 3개 아미노산 잔기의 알라닌 돌연변이는 HzTFPI4F36에 대한 결합을 감소시켰지만, 에피토프(TFPId5A) 바같에 위치한 잔기의 알라닌 치환은 효과가 없었다. 4개 돌연변이 중 오직 하나의 알라닌 돌연변이, TFPI-Y19A가 MAb2974에 대한 결합을 감소시켰다.
결론적으로, HzTFPI4F36 및 MAb2974는 별개지만, 중복 결합 에피토프가 TFPI-Kunitz 2에 위치한다.
실시예 12: 생체 내 연구
토끼에게 2000 RBU/kg의 단일클론 항-fVIII-항체의 정맥 퉁에 의해 일시적으로 혈우병을 만들었다. 10분 후, 토끼는 12000 U/kg의 항-TFPI-항체(4F36; 1.93 mg/kg)를 맞았다. 큐티클 출혈을 항-fVIII-항체 투여 후 45분에 유도하였다.
4F36 항체는 큐티클 출혈 시간에서 유의한 감소를 일으켰다(도 15). 4F36 항체의 투여는 혈소판 수의 유의한 하락으로 이어지지 않았다(도 18).
유사한 실험을 아이소타입 대조군 항체(음성 대조군 그룹), 2 mg/kg 항-TFPI(mAb 4F36) 또는 9 mg/kg NovoSeven(양성 대조군 그룹) 중 어느 하나를 받은 8마리의 일시적인 혈우병 토끼의 3개 그룹에서 큐티클 출혈을 유도한지 5분 후 반복하였다. 결과는도 16에서 나타낸다: mAB 4F36의 투여는 모든 수령자에서 상당한 혈액 손실의 감소(대락 85%)를 나타냈고, 이것은 mAb4F36이 "요구가 있는 즉시" 사용될 수 있음을 증명한다.
실시예 13: 토끼에서 투여량-효과 관계의 평가
인간화 mAb HzTFPI4F36의 투여량-효과 관계를 토끼 혈우병 모델에서 시험하였다. 토끼에게 단일클론 항-fVIII-항체의 iv 투여에 의해 일시적 혈우병을 만들었다. 10분 후, 토끼는 0.5, 1, 2 mg/kg HzTFPI4F36 또는 아이소타입 대조군 항체를 맞았다. 35분 후 큐티클 출혈을 유도하였고, 60분간의 관찰이 이어졌다. HzTFPI4F36는 0.5 내지 2 mg/kg으로 투여량이 증가하였을 때, 유의하게 그리고 투여량-의존적으로 출혈 시간뿐만 아니라 혈액 손실을 감소시켰다(도 17). 따라서, 출혈 시간 및 혈액 손실에서의 유의한 감소는 18780 ng/ml HzTFPI4F36의 혈장 농도에 상응하는, 1 mg/kg HzTFPI4F36에서 달성되었다. 출혈의 표준화는 30980 ng/ml HzTFPI4F36의 혈장 농도에 상응하는 2 mg/kg에서 달성되었다.
이들 데이터는 '효과있는 농도', 예컨대, HzTFPI4F36가 18780 및 30980 ng/ml의 범위에 있는 본 모델에서 표준화에 필요한 혈장 농도를 가리킨다.
실시예 14: 토끼에서 PK/PD - '작용의 지속'
20 mg/kg으로 투여된 토끼에서 HzTFPI4F36의 약동학적 연구를 수행하였다. 연구 동안 미리 결정된 시점에서 자유 HzTFPI4F36의 ELISA 측정에 의해 약동학적 프로파일을 위하여 토끼로부터 혈액 샘플을 얻었다(도 3 아래에서 보여줌). 효과 연구를 투여 후 4일(96시간), 7일(168시간) 및 10일(240시간)에서 일시적 혈우병 토끼의 큐티클 출혈 모델을 사용하여 수행하였고, 효과 시점은 도 19에서 나타내었다.
약동학적 프로파일은 표적 매개 클리어런스를 가리키는 2상이다. 따라서, 곡선의 상기 밴드 초과 자유 mAb가 존재하고(자유mAB>전체TFPI), 아래 밴드: 자유mAb< 전체TFPI. 약동학적 프로파일과의 좋은 일치에서, both 출혈 시간 및 혈액 손실은 20 mg/kg HzTFPI4F36 정맥 투여 후 4 및 7일 모두에서 유의하게 감소되었지만, 10일 이후에는 유의한 효가를 관찰되지 않았다(도 20).
이들 데이터는 혈우병 모델에서 큐티클 출혈 모델에서의 HzTFPI4F36의 효과있는 혈장 농도가 TFPI 포화 한계(곡선 밴드)에 가까운 18780 및 30980 ng/ml 사이 임을 확인한다. 따라서, 20 mg/kg의 HzTFPI4F36의 단일 iv. 투여량은 적어도 혈장 농고가 상기 '효과있는 농도'였던 시간과 일치하는 7일 동안 큐티클 출혈을 감소시킨다.
실시예 15: 원숭이 PK 데이터에 기초한 약동학 모델
약동학적 평가는 단일 및 다중 투여량을 투여한 원숭이에서의 약동학적 연구에 기초하여 수행되었다(도 21). 투여량 수준은 2 내지 200 mg/kg의 범위였다.
원숭이에서의 PK 프로파일(20 mgs/kg, 상위 패널)은 가용성 및 내피세포 결합 TFPI의 유사한 분포의 존재를 가리키는 토끼와 유사하다. 따라서, 이들 데이터는 토기 효과 데이터를 원숭이에서의 효과 범위를 예측하는데 사용할 수 있음을 가리킨다. 더욱이, 인간, 원숭이 및 토끼 TFPI에 대한 HzTFPI4F36의 친화성이 유사하고(동일한 에피토프), 3개 종에서의 유사한 TFPI 분포는 원숭이 및 사람에서의 투여량 예측을 허용한다.
실시예 16: 시뮬레이션
앞에서 나타낸 모델에 기초하여, 일련의 시뮬레이션을 만드는 것이 가능하였다. 시뮬레이션의 주된 목적은 다중 투여량 세팅에서 최적의 투여 요법을 서술하기 위해서였다. 표적(TFPI) 농도는 알려지지 않았지만, 앞의 토끼 효과 데이터는 만약 표적이 30000 ng/ml의 수준에서 포화에 가깝다면, 출혈 모델에서의 완전한 효과를 얻을 것으로 가정하는 것을 허용하였다. 따라서, 시뮬레이션의 주된 목적은 전 기간에 걸친 투여량 수준을 완전한 포화로 이어지도록 평가하는 것이었다. 도 22는 피하로 투여된 1 mg/kg의 시뮬레이션을 나타낸다. 도 23은 3주 마다 IV로 투여된 15 mg/kg HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)의 시뮬레이션을 나타낸다. 도 24는 2주마다 IV 투여된 20 mg/kg HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)의 시뮬레이션을 나타낸다.
요약하면, 위의 시뮬레이션에 기초하여, 하기 투여 요법이 인간에 대하여 예측될 수 있다:
투여 요법
투여 양식 투여량 투여 요법
S.c. 투여 1 mg/kg 2일에 한 번
I.v. 투여 10-20 mg/kg 2-4주에 한 번
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk Novo Nordisk A/S <120> Antibodies <130> US11P0560 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 276 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr 35 40 45 Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn 50 55 60 Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe 85 90 95 Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg 100 105 110 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly 115 120 125 Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys 130 135 140 Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys 165 170 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15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 27 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HzTFPI4F36-CDRgrafted VH nucleic acid sequence (signal peptide sequence omitted) <400> 27 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgaagc ctggcggctc cctgcggctg 60 tcctgcgctg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcggcaggcc 120 ccagggaagg gactggaatg ggtgtccacc atctcccggt ccggctccta ctcctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagccgtgt actactgcgc caggctgggc 300 ggctacgacg agggcgacgc catggacagc tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtcc 360 tcc 363 <210> 28 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HzTFPI4F36-CDRgrafted VH amino acid sequence (signal peptide sequence omitted) <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HzTFPI4F36-CDRgrafted LC amino acid sequence, human kappa chain (signal peptide sequence omitted) <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 30 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HzTFPI4F36-CDRgrafted HC amino acid sequence, human IgG4(S241P) (signal peptide sequence omitted) <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 31 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Ile His Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 32 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 33 <211> 224 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly 210 215 220 <210> 34 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220

Claims (15)

  1. TFPI의 K2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체는 서열번호 2의 잔기 R17을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  2. TFPI의 K2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체는 서열번호 2의 E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, F35, K36 및 L50으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  3. TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서,
    상기 항체의 경쇄는
    서열번호 15의 아미노산 잔기:
    ·위치 31에 상응하는 위치에서 E,
    ·위치 32에 상응하는 위치에서 S,
    ·위치 33에 상응하는 위치에서 D,
    ·위치 37에 상응하는 위치에서 Y,
    ·위치 96에 상응하는 위치에서 A,
    ·위치 97에 상응하는 위치에서 T, 및
    ·위치 99에 상응하는 위치에서 F를 포함하고;
    상기 항체의 중쇄는
    서열번호 18의 아미노산 잔기:
    ·위치 31에 상응하는 위치에서 N,
    ·위치 53에 상응하는 위치에서 R,
    ·위치 54에 상응하는 위치에서 S,
    ·위치 57에 상응하는 위치에서 Y,
    ·위치 59에 상응하는 위치에서 Y,
    ·위치 60에 상응하는 위치에서 F,
    ·위치 61에 상응하는 위치에서 P,
    ·위치 62에 상응하는 위치에서 D,
    ·위치 65에 상응하는 위치에서 Q,
    ·위치 102에 상응하는 위치에서 Y,
    ·위치 103에 상응하는 위치에서 D, 및
    ·위치 106에 상응하는 위치에서 D를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 18의 위치 52에 상응하는 위치에서 S를 추가로 포함하고, 및/또는 상기 경쇄는 서열번호 15의 위치 98에 상응하는 위치에서 H를 추가로 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 18의 위치 56에 상응하는 위치에서 S를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  5. 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는
    ·아미노산 중 하나가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)의 CDR1 서열; 및/또는
    ·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)의 CDR2 서열; 및/또는
    ·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  6. 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 경쇄는
    ·아미노산 중 한 개, 두 개 또는 세 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)의 CDR1 서열; 및/또는
    ·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)의 CDR2 서열; 및/또는
    ·아미노산 중 한 개 또는 두 개가 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, 서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  7. 조직 인자 경로 억제자(TFPI)의 Kunitz 2(K2) 도메인에 결합할 수 있는 단일클론 항체로서, 상기 항체의 중쇄는
    ·서열번호 18의 아미노산 31 내지 35(NYAMS)의 CDR1 서열 및
    ·서열번호 18의 아미노산 50 내지 66(TISRSGSYSYFPDSVQG)의 CDR2 서열 및
    ·서열번호 18의 아미노산 99 내지 110(LGGYDEGDAMDS)의 CDR3 서열을 포함하고,
    상기 항체의 경쇄는
    ·서열번호 15의 아미노산 24 내지 39(KSSQSLLESDGKTYLN)의 CDR1 서열; 및
    ·서열번호 15의 아미노산 55 내지 61(LVSILDS)의 CDR2 서열; 및
    ·서열번호 15의 아미노산 94 내지 102(LQATHFPQT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 15를 포함하고, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 18을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 21을 포함하고, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 24를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, mAb2974보다 더 높은 친화성으로 TFPI의 K2 도메인에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI가 상기 항체로 포화되었을 때, FVIIa/TF/FXa 억제자 분석에서 측정된 바, 막-결합 FVIIa/TF/FXa의 TFPI 억제를 적어도 55%, 예를 들면, 적어도 60%, 예를 들면, 적어도 65%, 예를 들면, 적어도 70%, 예를 들면, 적어도 75%, 예를 들면, 적어도 80%, 예를 들면, 적어도 85%, 예를 들면, 적어도 90%, 예를 들면, 적어도 95%, 예를 들면, 100%까지, 예를 들면, 100% 중화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체, 또는 이의 절편을 발현하는 진핵세포.
  13. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제 11항에 따른 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 응고장애가 있는 개체의 치료를 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체의 용도.
  15. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 응고장애가 있는 개체의 치료 방법.
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