KR20160017036A - 배양 용기 및 배양 방법 - Google Patents

Abstract

균일한 크기의 스페로이드를 고효율로 제조하고, 용이하게 배지 교환과 회수를 실시하는 마이크로 공간 구조를 설계하고, 설계한 마이크로 공간 구조를 갖는 배양 용기를 제공한다. 배양 용기는, 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 로 이루어지는 복수의 오목부 (10) 가 배열되어 있다. 바닥부 (11) 가 반구상과 원뿔대 중 어느 형상을 갖고, 개구부 (12) 가 바닥부 (11) 와의 경계로부터 오목부 (10) 의 단부까지를 둘러싸는 테이퍼각 1 도 이상 20 도 이하의 벽으로 구성된다. 게다가, 경계의 상당 직경이 50 ㎛ 이상 2 ㎜ 이하이고, 바닥부 (11) 의 바닥으로부터 단부까지의 깊이가 상당 직경의 0.6 배 이상 3 배 이하이고, 개구부 (12) 를 구성하는 벽이 바닥부 (11) 와 연속하는 면을 형성하고, 또한 연속하는 면의 경사가 경계에서 변화한다.

Description

배양 용기 및 배양 방법{CULTURE VESSEL AND CULTURE METHOD}

본 발명은 세포의 배양 및 그 회수에 관한 것이다.

최근의 세포 공학의 발전에 수반하여, 생체 내의 세포 주위 환경이나 형태를 모방하여 보다 생체 내에 가까운 기능을 갖는 세포를 취득하는 새로운 배양 방법이 개발되고 있다. 이와 같은 방법으로 배양한 세포를 치료나 생체 반응의 시뮬레이터로서 사용하는 시도가 이루어지기 시작하였다. 스펀지나 섬유 등으로 구성된 배양 담체를 사용하여 배양하는 방법, 배지 중에 세포를 부유시켜 자연스럽게 스페로이드를 형성시키는 부유 배양, 종래의 배양 용기 (플라스크 등) 에 세포 비접착 처리를 실시하여 스페로이드를 형성시키는 방법 등 여러 가지 방법이 개발되고 있다. 특히 스페로이드 배양은 세포의 상호 작용을 유지할 수 있는 우수한 방법으로서, 췌도 세포, 간세포, 줄기 세포, 암세포 등 여러 가지 세포에 응용되고 있다. 최근, 스페로이드의 크기에 주목한 연구가 이루어지게 되었으며, 예를 들어 암세포를 사용한 의약품 스크리닝 시험에서는, 스페로이드의 직경이나 체적을 지표로 하고 있다 (비특허문헌 1). 또, 스페로이드의 크기에 의존하여 세포가 갖는 기능이 상이한 것 (비특허문헌 2, 3) 이 나타나 있다. 이와 같이 스페로이드를 형성시키는 기술에 더하여, 스페로이드의 크기를 컨트롤하는 기술이 주목받기 시작하였다. 또한, 이와 같이 세포의 특이적인 기능을 재현할 수 있는 점에서, 인공 장기나 바이오 리액터 등의 분야에 있어서 이용되는 것이 기대되고 있다. 이와 같은 용도에 있어서, 대량으로 스페로이드를 제조하고 회수하는 기술이 중요해진다.

균일한 직경의 스페로이드를 제조하는 수단으로서, 특허문헌 1 에 친수성 막을 형성한 U 자 보텀을 갖는 96WP 에 파종하는 세포수의 개수를 변경함으로써 형성되는 스페로이드의 크기를 컨트롤하는 방법이 있다. 그러나, 배양 면적당의 스페로이드수의 수는 적어, 대량의 스페로이드를 제조하는 것은 곤란하다. 다른 방법으로서, 특허문헌 2-4 에 개시되어 있는 마이크로 공간 내에서 스페로이드를 형성하는 방법이 있다.

일본 공개특허공보 평8-131153호 일본 공개특허공보 2010-88347호 국제 공개 제2012/036011호 국제 공개 제2013/042360호

Juergen Friedrich1 외 저, "Spheroid-based drug screen : considerations and practical approach", PROTOCOL, 2009년 2월 12일 (Published online) pp.309-324 Franziska Hirschhaeuser 외 저, "Multicellular tumor spheroids : An underestimated tool is catching up again", Journal of Biotechnology 148, 2010년, pp.3-15 C′ELINE LIU BAUWENS 외 저, "Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories", STEM CELL, 2008년, pp.2300-2310

그러나, 특허문헌 1 의 배양 방법은, 배양의 효율이 매우 낮아 대량 배양을 실시할 때의 보틀넥이 되고 있다. 또, 특허문헌 2, 3 의 배양 방법은, 단위 면적당의 스페로이드 형성 효율은 높지만, 배지 교환시에 스페로이드가 공간 내로부터 이탈할 우려가 있다. 이 때문에, 배지 교환시에 주의를 요한다. 또한, 스페로이드의 이탈을 방지한기 위해 스페로이드의 일부를 마이크로 공간 내에 접착시키는 방법이 검토되어 있다 (특허문헌 4). 그러나, 세포의 접착성은 각종 세포마다 상이하기 때문에, 사용하는 세포마다 표면 처리 방법을 검토할 필요가 있어 실용성이 부족하다.

본 발명은, 이와 같은 사정을 감안하여 이루어진 것으로서, 균일한 크기의 스페로이드를 고효율로 또는 고효율이면서 대량으로 제조하는 것을 가능하게 하기 때문에, 배지 교환과 세포 회수를 용이하게 실시할 수 있게 되는 마이크로 공간 구조를 설계하고, 설계한 마이크로 공간 구조를 갖는 배양 용기 및 그것을 사용하는 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 실시형태에 관련된 배양 용기의 일 양태는, 바닥부와 개구부로 이루어지는 복수의 오목부가 배열되는 것이다. 상기 바닥부가 반구상과 원뿔대 중 어느 형상을 갖고, 상기 개구부가 상기 바닥부와의 경계로부터 상기 오목부의 단부까지를 둘러싸는 테이퍼각 1 도 이상 20 도 이하의 벽으로 구성된다. 게다가, 상기 경계의 상당 직경이 50 ㎛ 이상 2.5 ㎜ 이하이고, 상기 바닥부의 바닥으로부터 상기 단부까지의 깊이가 상기 상당 직경의 0.6 배 이상 3 배 이하이고, 상기 개구부를 구성하는 벽이 상기 바닥부와 연속하는 면을 형성하고, 또한 상기 연속하는 면의 경사가 상기 경계에서 변화한다.

또, 일 실시형태의 배양 용기에 있어서, 상기 단부의 형상이 반구상, 사다리꼴, 또는 역삼각형 중 어느 것인 것이 바람직하고, 이웃하는 2 개의 오목부 사이가 평탄하고, 상기 2 개의 오목부의 거리가 5 ㎛ 내지 50 ㎛ 인 것이 바람직하다.

또한, 일 실시형태의 배양용에 있어서, 상기 배양 용기가 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지 및 실리콘 수지 중 하나 또는 이들 조합으로 이루어지는 수지 성형품인 것이 바람직하다. 상기 오목부에 플라즈마 처리, 유리 코트, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 어느 것 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시키고, 물 접촉각이 45 도 이하가 되도록 처리된 것이 바람직하다.

상기 오목부에 세포 접착을 저해하는 친수성의 폴리머 사슬이 고정화되어 있는 것이 바람직하다.

상기 오목부에 인지질, 또는 인지질·고분자 복합체가 고정화되어 있는 것이 바람직하다.

상기 오목부에 플라즈마 처리, 유리 코트, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 어느 것 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시키고, 물 접촉각을 45 도 이하가 되도록 처리한 후, 세포 접착을 저해하는 친수성의 폴리머 사슬, 및 인지질, 또는 인지질·고분자 복합체 중 어느 하나의 폴리머가 고정화되어 있는 세포 비접착 표면인 것이 바람직하다.

상기 친수성의 폴리머 사슬이 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트인 것이 바람직하고, 상기 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트의 평균 분자량이 10 만 이상인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 일 실시형태에 관련된 배양 방법의 일 양태는, 상기 서술한 어느 배양 용기를 사용한다. 그리고, 이 배양 방법은, 총세포수가 상기 배양 용기가 갖는 상기 오목부의 수 (N) 이상이고, 상기 오목부가 형성하는 공간의 체적 (V1) 을 파종하는 세포의 체적 (V2) 으로 나눈 값에 상기 오목부의 수 (N) 를 곱한 수 이하인 세포를 배지에 분산시키고, 상기 배지를 상기 배양 용기에 첨가한다.

본 발명의 일 실시형태에 관련된 배양 방법의 일 양태에 있어서, 상기 오목부가 형성하는 공간 1 개에 대해 1 개의 스페로이드를 형성시키는 것이 바람직하고, 상기 공간에 스페로이드를 형성시켜 스페로이드를 성장 (증식) 시키는 것이 보다 바람직하다.

분화 유도시키는 경우에는, 상기 공간에 스페로이드를 형성시킨 상태에서 유도하는 것이 바람직하다.

상기 배양 용기 내에 형성된 스페로이드의 총수의 60 ％ 이상이, 평균 스페로이드 직경의 플러스 마이너스 5 ％ 의 범위 내의 직경인 것이 바람직하다.

상기 배지를 교반함으로써 상기 오목부 내의 세포를 회수하는 것이 바람직하고, 상기 배지의 교반이 상기 배양 용기를 진탕하여 상기 배지를 교반하는 것, 상기 배지를 흡인 및 배출하여 상기 배지를 교반하는 것, 상기 배양 용기에 교반 날개를 설치하여 배지를 교반하는 것, 상기 배양 용기에 교반자를 넣어 배지를 교반하는 것, 또는 이들 조합으로 이루어지는 방법 중 어느 것인 것이 보다 바람직하다.

상기 배지를 적어도 1 회 이상 교환하고, 교환되는 배지의 비율이 20 ％ 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시형태에 관련된 배양 방법의 다른 일 양태는, 상기 서술한 어느 배양 용기를 사용한다. 그리고, 배양 방법은, 이하의 각 공정을 실시함으로써 세포를 파종, 배양, 배지 교환, 회수한다.

a) 배양 용기에 존재하는 오목부의 수 (n) 와 동수 이상, 상기 오목부의 체적 (V) 을 파종하는 세포의 체적 (v) 으로 나눈 값에 상기 오목부의 수 (n) 를 곱한 수 이하의 세포수를 배지에 분산시키고, 상기 배지를 배양 용기에 첨가하는 공정,

b) 12 시간 이상 상기 배양 용기 내에서 상기 세포를 배양하여 스페로이드를 형성시키는 공정,

c) 상기 배지를 20 ％ 이상 흡인한 후, 동량의 신선한 배지를 주입하는 공정,

d) 상기 a) 내지 c) 의 공정을 복수 회 실시하여 스페로이드를 성장시키는 공정,

e) 상기 스페로이드를 원하는 크기로 성장시킨 후, 상기 배지를 교반하여 각 오목부 내의 세포를 상기 배지 중에 부유시키는 공정, 및

f) 상기 배지마다 상기 세포를 흡인기로 빨아 들여 상기 세포를 회수하는 공정.

본 발명에 의하면, 균일한 크기의 스페로이드를 고효율 또한 대량으로 제조하는 것이 가능한 데다가, 용이하게 배지 교환과 회수의 실시를 가능하게 하는 마이크로 공간 구조를 설계하고, 설계한 마이크로 공간 구조를 갖는 배양 용기 및 그것을 사용하는 배양 방법을 제공하는 것이 가능해진다.

도 1 은, 일 실시형태의 배양 용기의 일례를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 실시형태 1 의 오목부를 옆에서 본 형상예를 나타내는 단면도이다.
도 3 은, 실시형태 1 의 오목부를 위에서 본 형상예를 나타내는 도면이다.
도 4 는, 실시형태 2 의 구형상의 일부분을 사용하는 오목부의 형상예를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 실시형태 2 의 구형상의 일부분을 사용하는 오목부의 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 6 은, 실시형태 2 의 원뿔대를 사용하는 오목부의 형상예를 나타내는 도면이다.
도 7 은, 실시형태 2 의 오목부의 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 8 은, 실시형태 3 의 개구부의 형상예를 나타내는 도면이다.
도 10 은, 실시형태 4 의 배양 용기의 구성예를 나타내는 도면이다.
도 11 은, 실시형태 4 의 다른 배양 용기의 구성예를 나타내는 도면이다.
도 12 는, 실시형태 4 의 또 다른 배양 용기의 구성예를 나타내는 도면이다.
도 13 은, 실시예 및 비교예의 배지 교환시의 스페로이드의 잔존율을 나타내는 도면이다.
도 14 는, 실시예 및 비교예의 배지 교환 전후의 스페로이드의 화상을 나타내는 사진이다.
도 15 는, 실시예의 세포를 회수한 전후의 화상을 나타내는 사진이다.
도 16 은, 실시예의 배양 용기로부터 회수한 스페로이드의 사진이다.

이하, 실시형태에 대해 도면을 참조하면서 설명한다. 설명의 명확화를 위해 이하의 기재 및 도면은 적절히 생략 및 간략화가 이루어져 있다. 각 도면에 있어서 동일한 구성 또는 기능을 갖는 구성 요소 및 상당 부분에는 동일한 부호를 부여하고, 그 설명은 생략한다.

실시형태 1.

＜배양 용기＞

도 1 은, 일 실시형태의 배양 용기의 일례를 나타내는 도면이다. 도 1 에서는, 복수의 배양 용기 (1) 를 갖는 배양 플레이트 (3) 의 일부분을 나타낸다. 도 1 의 상단에는, 배양 용기 (1) 의 바닥에 형성되는 복수의 오목부 (10) 의 일부분을 배양 플레이트 (3) 위에서 본 도면을 나타낸다. 배양 용기 (1) 는 복수의 오목부 (10) 가 배치된다. 복수의 오목부 (10) 는, 배양 용기 (1) 의 제조나 세포 배양 효율의 관점에서 규칙적으로 배치되는 것이 바람직하다. 배양 용기 (1) 는 예를 들어 복수의 웰을 갖는 웰 플레이트 중 하나의 웰에 상당한다. 바꾸어 말하면, 웰 플레이트의 각 웰에 복수의 오목부 (10) 가 배치되게 된다.

웰 플레이트는, 다수의 패임 (구멍 또는 웰) 이 형성된 평판으로 이루어지는 실험·검사 기구로서, 각 웰을 시험관 혹은 샬레로서 이용하는 것을 말한다. 웰의 수에는 예를 들어 6, 24, 96, 384 등이 있고, 그 이상의 수의 것도 있다. 웰의 바닥은 평평한 것, 둥근 것 외에, 길고 가는 마이크로 튜브를 다수 조합한 형식의 것 (딥웰 플레이트) 도 있다.

또, 오목부 (10) 는, 세포를 배양하기 위한 미소한 공간인 마이크로 공간을 형성하는 점에서 마이크로 용기라고 할 수도 있다.

도 2, 3 은, 실시형태 1 의 오목부의 형상예를 나타내는 도면이다. 도 2 에서는 하나의 오목부 (10) 를 옆에서 보았을 때의 단면도를 나타내고, 도 3 은 하나의 오목부 (10) 를 위에서 보았을 때의 도면을 나타낸다. 도 3 에 나타내는 오목부 (10) 는, 도 1 의 상단의 오목부 (10) 의 상세한 구성예가 된다.

각 오목부 (10) 는 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 로 구성된다. 바닥부 (11) 는 배양 용기 (1) 의 바닥이 되는 부분이고, 개구부 (12) 는 바닥부 (11) 의 상부에 배치되는 부분이다. 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 가 접하는 부분을 경계라고 기재한다. 도 2 에서는, 부호 R 의 화살표로 나타내는 길이의 부분이 경계의 위치에 대응한다. 또, 도 3 에서는, 경계의 위치를 이점 파선으로 나타내고 있다. 단, 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 는 연속한 면으로 구성되고, 일체적으로 제조된다.

도 2, 3 에서는, 배양 용기 (1) 에 형성되는 복수의 오목부 (10) 에 관하여, 상당 직경 (R), 깊이 (높이) (D) 를 나타낸다.

상당 직경 (R) 은, 오목부 (10) 의 바닥부 (11) 에 내접하는 내접원의 직경을 말한다. 여기서는, 바닥부 (11) 와 개구부 (12) 의 경계에 있어서 내접하는 내접원의 직경을 말한다. 보다 상세하게는, 상당 직경 (R) 은, 경계에 있어서의 오목부 (10) 의 높이 H 의 방향과 수직이 되는 면의 형상의 내접원의 직경을 말한다.

깊이 (D) 는, 바닥부 (11) 의 내측의 바닥으로부터 오목부 (10) 의 상단까지의 길이이다. 오목부 (10) 의 상단은 개구부 (12) 의 단부 (상단) 와 동일하다. 깊이 (D) 는 오목부 (10) 가 형성하는 공간의 깊이이다. 바꾸어 말하면, 바닥부 (11) 가 형성하는 공간의 바닥으로부터 개구부 (12) 가 형성하는 공간의 상단까지의 깊이이다. 도 2 에서는 오목부 (10) 의 깊이 (D) 에 더하여, 바닥부 (11) 의 깊이 (D1) 및 개구부 (12) 의 깊이 (D2) 를 나타내고 있다.

바닥부 (11) 는 세포를 배양하는 공간 (제 1 공간) 을 형성한다. 바닥부 (11) 는, 예를 들어, 반구상의 형상을 갖는다. 예를 들어, 상당 직경 (R) 을 직경으로 하는 구형을 절반으로 한 형상을 사용할 수 있다. 바닥부 (11) 의 형상에 대해 반구상에 한정되는 것은 아니다. 다른 구체예에 대해서는 실시형태 2 에서 설명한다.

개구부 (12) 는, 세포의 배양 및 회수를 보조하도록 기능하는 공간 (제 2 공간) 을 형성한다. 개구부 (12) 는, 바닥부 (11) 와의 경계로부터 오목부 (10) 의 단부 (선단) 까지를 둘러싸는 테이퍼각이 1 도 이상 20 도 이하인 벽으로 구성된다. 개구부 (12) 를 구성하는 벽의 테이퍼각이 5 도 이상 15 도 이하인 것이 바람직하고, 10 도가 보다 바람직하다. 그 이유는, 테이퍼각이 지나치게 작으면 회수할 때에 세포가 오목부로부터 배지로 이행되지 못하고, 반대로 지나치게 크면 배지 교환 중에 세포가 이탈하기 때문이다.

도 2 에서는 테이퍼각을 부호 θ1, θ2 로 나타낸다. 도 2, 3 에 나타내는 오목부 (10) 의 형상예에서는, 테이퍼각 (θ1, θ2) 은 대략 동일한 경우를 나타내고 있다.

바닥부 (11) 와 개구부 (12) 의 경계는, 상당 직경 (R) 이 50 ㎛ 이상 1 ㎜ 이하가 되도록 형성된다. 스페로이드의 중심부까지 영양을 공급하고 싶은 경우에는 상당 직경 50 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 100 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하가 바람직하다. 그 이유는, 영양분이나 산소는 확산에 의해서만 세포 내로 이행되는데, 중심부가 괴사하지 않는 크기는 300 ㎛ 라고 일컬어지고 있으며 (Efrem Curcio et al., "Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system", Biomaterials 28 (2007) 5487-5497), 그 크기 이상이 되지 않게 하기 위해서는 상기 직경이 바람직하다.

반대로 암세포와 같이 세포의 중심부에 네크로시스를 제조하고 싶은 경우 (Franziska Hirschhaeuser et al., "Multicellular tumor spheroids : An underestimated tool is catching up again", Journal of Biotechnology 148 (2010) 3-15, Fig1) 에는, 상당 직경 (R) 이 400 ㎛ 이상 2 ㎜ 미만인 것이 바람직하다. 그 이유는, 상기 서술한 바와 같이 300 ㎛ 에서는 중심부까지 영양이 널리 퍼져 네크로시스를 일으키지 않는 경우가 생각되기 때문이다. 따라서 300 ㎛ 이상의 직경의 스페로이드를 얻기 위해서는, 400 ㎛ 이상이어야 한다.

게다가, 바닥부의 바닥으로부터 단부까지의 깊이 (D) 가 상당 직경 (R) 의 0.6 배 이상 3 배 이하가 되도록 형성된다. 바람직하게는 깊이 (D) 가 상당 직경 (R) 의 0.7 배 이상 1.2 배 이하이고, 보다 바람직하게는 0.8 ∼ 1 배이다.

또, 배양 용기 (1) 는, 이웃하는 2 개의 오목부 (10) 사이가 평탄한 것이 바람직하다. 예를 들어, 2 개의 오목부 (10) 의 거리가 5 ㎛ 내지 50 ㎛ 의 범위인 것이 바람직하다. 그 이유는, 대량의 스페로이드를 효율적으로 얻기 위해서는, 단위 면적당의 스페로이드수를 많게 하여 고밀도로 배양하는 것이 바람직하기 때문이다. 그러기 위해서는 스페로이드가 형성되지 않는 벽의 상면은 작을수록 좋다. 단, 테이퍼각이 작은 경우에는 벽이 얇으면 세포 파종시나 배지 교환시의 진동에 의해 용이하게 균열이 발생할 가능성이 있다. 그 때문에 5 ㎛ 이상인 것이 바람직하다. 이와 같은 관점에서 5 ∼ 20 ㎛ 가 바람직하다.

이에 반해, 이웃하는 2 개의 오목부 (10) 가 접촉하는 경우여도 된다. 예를 들어, 2 개의 오목부 (10) 의 단부의 일부분이 접촉하고, 개구부 (12) 의 테이퍼각의 경사면이 접촉하여 산형의 형상으로 되어 있어도 된다.

상기 서술한 형상에 더하여, 배양 용기 (1) 는 이하와 같이 제조되는 것이 바람직하다.

배양 용기 (1) 가 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지 및 실리콘 수지 중 하나 또는 이들 조합으로 이루어지는 수지 성형품인 것이 바람직하다.

배양 용기 (1) 가 갖는 각 오목부 (10) 에 플라즈마 처리, 유리 코트, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 어느 것 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시키고, 물 접촉각이 45 도 이하가 되도록 처리되는 것이 바람직하다.

게다가, 각 오목부 (10) 에 세포 접착을 저해하는 친수성의 폴리머 사슬이 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 친수성의 폴리머 사슬은, 상기 서술한 물 접촉각이 45 도 이하가 되도록 처리된 각 오목부 (10) 에 고정화되는 것이 보다 바람직하다.

그리고 또한, 각 오목부 (10) 에 인지질, 또는 인지질·고분자 복합체가 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 이 고정화의 처리는, 상기 서술한 물 접촉각이 45 도 이하가 되도록 처리된 각 오목부 (10), 친수성의 폴리머 사슬이 고정화된 각 오목부 (10), 또는 이들을 조합한 각 오목부 (10) 에 실시되는 것이 보다 바람직하다.

또한, 각 오목부 (10) 에 플라즈마 처리, 유리 코트, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 어느 것 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시키고, 물 접촉각을 45 도 이하가 되도록 처리한 후, 세포 접착을 저해하는 친수성의 폴리머 사슬, 및 인지질, 또는 인지질·고분자 복합체 중 어느 하나의 폴리머가 고정화되어 있는 세포 비접착 표면인 것이 바람직하다. 이 처리는, 상기 서술한 각 처리, 또는 각 처리를 조합한 처리와 함께 실시되는 것이 보다 바람직하다.

또, 상기 서술한 친수성의 폴리머 사슬이 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트인 것이 바람직하고, 또한 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트의 평균 분자량이 10 만 이상인 것이 보다 바람직하다.

＜배양 방법＞

다음으로, 도 1 내지 3 에 나타내는 배양 용기 (1) 를 사용하는 세포의 배양 방법에 대해 설명한다.

세포의 배양은 다음의 각 공정에 의해 실시한다.

a) 세포를 분산시킨 배지를 배양 용기 (1) 에 첨가하는 공정

b) 세포를 배양하는 공정

c) 배지를 교환하는 공정

d) 스페로이드를 성장시키는 공정

e) 스페로이드를 배지 중에 부유시키는 공정

f) 세포를 회수하는 공정

상기 서술한 각 공정은, a) 내지 d) 가 세포를 배양하는 공정 (세포 배양 공정) 이고, e), f) 가 세포를 회수하는 공정 (세포 회수 공정) 으로 구분할 수도 있다.

여기서, 스페로이드는 세포가 다수 응집하여 세포 덩어리를 형성하고, 3 차원 상태가 된 것이다.

이하에 각 공정에 대해 설명한다.

a) 세포를 분산시킨 배지를 배양 용기 (1) 에 첨가하는 공정

세포를 배양할 준비를 실시하는 공정으로서, 배지에 이하의 총수의 세포를 분산시키고, 배양 용기 (1) 에 첨가한다.

총세포수의 하한은, 배양 용기 (1) 에 존재하는 오목부 (10) 의 수 (n) 와 동수 이상으로 한다.

총세포수의 상한은, 배양 용기 (1) 가 갖는 오목부 (10) 의 체적 (V) 을 파종하는 세포의 체적 (v) 으로 나눈 값에 오목부의 수 (n) 를 곱한 수 이하로 한다. 기호를 사용한 수식으로 나타내면, 세포 총수의 상한값 ＝ V/v × n 으로 나타낼 수 있다. 여기서, 복수의 오목부 (10) 의 체적 (V) 은 동일한 것을 전제로 한다. 상이한 경우에는 평균값을 사용한다.

배지는 배양하는 세포에 따라 조정한다.

b) 세포를 배양하는 공정

배양 용기 (1) 내에서 12 시간 이상 세포를 배양하여 스페로이드를 형성시킨다. 배지에 분산시킨 세포는, 배양 용기 (1) 에 배지를 첨가하면, 오목부 (10) 에 흡수되고, 각 오목부 (10) 내에서 배양된다. 각 오목부 (10) 에 세포가 1 개 흡수되는 것이 바람직하고, 바닥부 (11) 가 형성하는 공간에 1 개의 스페로이드가 형성되는 것이 바람직하다. 각 오목부 (10) 내에서는, 세포가 오목부 (10) 의 바닥부 (11) 내에서 증식한다. 배양 파종시에 세포가 최저 1 개 없으면, 배양 중에 이웃한 오목부 (10) 로부터 세포가 이동하지 않으므로, 그 오목부 (10) 에 스페로이드는 형성되지 않는다. 스페로이드를 고밀도로 배양하기 위해서는, 모든 오목부 (10) 에 스페로이드가 형성되는 것이 바람직한 점에서, 최저 1 개의 세포가 오목부 (10) 에 존재하는 것이 바람직하다. 생산 효율의 관점에서 초기의 세포수는 가능한 한 적게 하는 한편으로 많은 스페로이드를 회수할 수 있는 것이 바람직하기 때문에, 오목부 (10) 에 존재하는 세포수는 적을수록 좋다. 그 때문에 1 개의 세포가 오목부 (10) 에 존재하는 것이 바람직하다.

c) 배지를 교환하는 공정

배지 교환에서는, 배양 용기 (1) 내의 배지를 20 ％ 이상 흡인한 후, 동량의 신선한 배지를 주입한다. 배지 교환은, 세포 배양 중 적어도 1 회 이상 실시되는 것이 바람직하다.

d) 스페로이드를 성장시키는 공정

상기 서술한 a) 내지 c) 의 공정을 복수 회 실시하여 스페로이드를 성장시킨다. 분화 유도시키는 경우에는, 오목부 (10) 의 바닥부 (11) 가 형성하는 공간에 있어서, 스페로이드가 커지지 않는 상태까지 성장시킨 후, 분화 유도 배지로 교환하여 분화시키는 것이 바람직하다. 게다가, 배양 용기 (1) 내에 형성된 스페로이드의 총수의 60 ％ 이상이, 평균 스페로이드 직경의 플러스 마이너스 5 ％ 의 범위 내의 직경인 것이 보다 바람직하다.

e) 스페로이드를 배지 중에 부유시키는 공정

스페로이드를 원하는 크기로 성장시킨 후, 배양 용기 (1) 의 배지를 교반하여 각 오목부 (11) 내에서 배양한 세포를 배지 중에 부유시킨다. 예를 들어, 배지를 교반함으로써 실시한다. 구체적으로는, 배지의 교반은, (1) 배양 용기 (1) 를 진탕하여 배지를 교반하는 것, (2) 배지를 흡인 및 배출 (피펫팅 조작) 하여 배지를 교반하는 것, (3) 배양 용기 (1) 에 교반 날개를 설치하여 배지를 교반하는 것, (4) 배양 용기 (1) 에 교반자를 넣어 배지를 교반하는 것, (5) 상기 서술한 (1) 내지 (4) 중 2 개 이상을 조합하여 배지를 교반하는 것 중 어느 방법을 사용할 수 있다.

f) 세포를 회수하는 공정

배양 용기 (1) 내의 세포를 포함하는 배지를 흡인기로 빨아 들여, 배지에 부유시킨 세포 (스페로이드) 를 회수한다.

이상 설명한 바와 같이, 실시형태 1 에서는 세포의 파종, 배지 교환, 회수를 동일한 용기에서 실시할 수 있는 것에 더하여, 스페로이드를 회수 가능한 양 용기에 관하여 설명하였다.

실시형태 1 의 배양 용기 (1) 를 사용하여 세포를 배양함으로써, 바닥부 (11) 에 원하는 크기의 스페로이드를 형성할 수 있다. 그리고, 배양한 스페로이드를 효율적으로 회수할 수 있다. 구체적으로는, 오목부 (10) 가 바닥부 (11) 에 더하여 개구부 (12) 를 가짐으로써, 배지 교환에서는 배지를 빨아 들일 때에 세포가 바닥부 (11) 에 접착 또는 부유되어 있지만 이탈하지 않는 상태를 유지하기 쉽게 하고, 바닥부 (11) 로부터의 세포의 이탈을 억제하는 것을 기대할 수 있다. 한편, 세포의 회수에서는, 바닥부 (11) 의 배지를 흡인 및 배출할 때에, 개구부 (12) 에 의해 배지의 흐름을 발생시키기 쉽게 하는 것을 기대할 수 있다. 게다가, 바닥부 (11) 에 반구상의 형상을 사용함으로써, 스페로이드의 형상, 크기를 균일하게 하는 것에 기여하는 것을 기대할 수 있다.

실시형태 2.

실시형태 1 에서는, 바닥부 (11) 가 반구상의 형상을 갖는 구성예를 설명하였지만, 실시형태 2 에서는 다른 형상에 대해 설명한다. 바닥부는, 구형상의 일부분으로 이루어지는 형상, 원뿔대의 형상, 혹은 선상으로 형성되어 있는 양태여도 된다. 바닥부가 선상이란, 실질적인 바닥부가 없고, 오목부가 개구부만으로 형성되어 있는 양태이다. 도 4 내지 도 7 에 본 실시형태의 오목부의 형상예를 나타낸다. 도 4 내지 도 7 은, 실시형태 1 의 바닥부 (11) 와 상이한 바닥부 (21A ∼ 21D) 를 갖는 오목부 (20A ∼ 20D) 를 나타내지만, 개구부 (12) 에 대해서는 실시형태 1 과 동일한 형상으로 실현할 수 있기 때문에 동일한 것을 조합한 오목부의 형상예를 나타낸다.

도 4, 5 는, 실시형태 1 이 바닥부 (11) 에 구를 절반으로 한 반구상을 사용하는 반면, 바닥부에 사용하는 반구형의 형상이 상이한 예를 나타내고 있다. 도 4 는, 구형의 절반보다 더욱 적은 부분을 사용하는 바닥부 (21A) 를 나타낸다. 바꾸어 말하면, 바닥부 (21A) 가 반구상의 일부분을 사용하는 경우이다. 도 5 는, 바닥이 반구형인 통형의 형상을 사용하는 바닥부 (21B) 를 나타낸다. 도 5 에 나타내는 바닥부 (21B) 의 형상의 경우, 통 부분이 길어지면 세포를 회수할 때에 세포가 바닥부 (21B) 로부터 배지에 부유되지 않게 되기 때문에, 통 부분의 길이를 조정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 바닥부 (21B) 와 개구부 (12) 의 깊이 (높이) 가 동일한 비율 (1 : 1) 이 되도록 구성하는 것이 바람직하다.

도 6 은, 원뿔대를 사용하는 바닥부 (21C) 를 나타낸다. 바닥부가 평평한 경우, 광의 굴절·간섭을 경감시킬 수 있어 현미경 관찰을 실시할 때에는 유용하다.

도 7 은, 바닥부 (21D) 가 선상, 바꾸어 말하면 바닥부 (21D) 가 공간을 형성하지 않는 오목부 (20D) 의 형상예를 나타낸다. 오목부 (20D) 는, 다른 형상의 배양 용기에 비해 세포의 배양·회수의 효율은 떨어지지만, 배양 용기의 제조 공정이 용이하다는 이점이 있다.

또한, 본 실시형태에서는 상기 서술한 바와 같이 개구부 (12) 를 실시형태 1 과 동일한 형상으로 실현하는 경우를 설명하였지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 실시형태의 배양 용기를 사용하는 세포의 배양 방법은 실시형태 1 과 동일하기 때문에 설명을 생략한다.

본 실시형태의 배양 용기도 실시형태 1 과 동일한 효과를 발휘할 수 있다.

실시형태 3.

상기 서술한 각 실시형태에서는, 개구부 (12) 의 형상을 원형 또는 대략 원형인 양태를 설명하였지만, 다른 형상의 개구부를 갖는 배양 용기에 대해 설명한다. 개구부의 단부의 형상은 반구상, 사다리꼴 또는 삼역삼각형 등의 다른 형상이어도 된다. 한편, 개구부가 바닥부와 접하는 경계의 형상 (개구부의 경계 부분) 은, 바닥부의 경계 부분과 동일한 형상인 것이 필요하다. 도 8, 9 는, 실시형태 1 의 개구부 (12) 와 상이한 단부의 형상을 갖는 오목부 (30A, 30B) 를 나타내고 있다. 도 8, 9 에서는, 실시형태 1 과 동일한 바닥부 (11) 를 나타내고 있지만, 실시형태 2 의 바닥부 (21A ∼ 21D) 중 어느 것과 조합하는 것도 가능하며, 다른 형상의 바닥부여도 된다. 바닥부 및 개구부의 형상은, 그 경계에 있어서 경사면을 연속해서 형성할 수 있는 조합이면 된다.

도 8 은, 개구부 (32A) 의 단부가 곡선을 그리는 형상의 일례를 나타내고 있다. 도 8 은, 오목부 (30A) 를 위에서 본 도면으로서, 바닥부 (11) 의 단부를 상당 직경 (R) 의 원으로 나타내고, 개구부 (32A) 의 외주를 곡선으로 나타내고 있다. 개구부 (32A) 의 단부는 좌우 및 상하가 대칭이 되지 않는 곡선이지만, 좌우 대칭, 또는 상하 대칭이 되는 형상이어도 상관없다. 도 9 는, 개구부 (32B) 의 단부가 사각형인 예를 나타내고 있다. 도 9 에서는, 정방형의 예를 나타내고 있지만, 다른 다각형, 곡선과 직선의 조합이어도 된다. 도 9 는, 오목부 (30B) 를 위에서 본 도면으로서, 바닥부 (11) 의 단부를 상당 직경 (R) 의 원으로 나타내고, 개구부 (32B) 의 외주를 정방형의 실선으로 나타내고 있다. 예를 들어, 인접하는 오목부와의 사이의 공간의 면적을 조정하기 위해 단부의 형상을 변형시켜도 된다. 개구부의 단부의 형상은 세포의 부유를 촉진시키는 역할을 완수하는 것이 필요하기 때문에, 테이퍼각이 중요해진다.

도 8, 9 의 형상예에서는, 테이퍼각은 개구부 (32A, 32B) 의 형상에 따라 상이한 값이 된다. 이것은, 개구부 (32A, 32B) 의 형상에 따라 벽을 형성하는 경사면의 경사가 상이하기 때문이다.

본 실시형태에서 나타낸 개구부의 각 형상은, 실시형태 1 의 바닥부 (11) 또는 실시형태 2 에서 설명한 바닥부의 각 형상과 조합할 수 있다. 게다가, 상기 서술한 실시형태에서 나타내는 바닥부 이외의 형상과 조합도 가능한 것은 말할 것도 없다.

본 실시형태의 배양 용기를 사용하는 세포의 배양 방법은 실시형태 1 과 동일하기 때문에 설명을 생략한다.

본 실시형태의 배양 용기도 실시형태 1 과 동일한 효과를 발휘할 수 있다.

실시형태 4.

도 1 에서는, 일 실시형태의 배양 용기 (1) 를 배양 플레이트 (3) (웰 플레이트) 에 배치한 양태를 설명하였다. 일 실시형태의 배양 용기 (1) 는, 도 1 의 배양 플레이트 (3) 이외의 용기 (기구) 에도 형성할 수 있다. 도 10 내지 12 에 실시형태 4 의 배양 용기의 구성예를 나타낸다. 도 10 은, 플라스크 형상의 배양 플라스크를 사용하는 구성예를 나타내는 개략도이다. 도 11 은, 배양 플레이트의 프레임을 사용하는 구성예를 나타내는 개략도이다. 도 12 는, 도 11 에 나타내는 배양 플레이트를 스택 형상으로 하여 사용하는 구성예를 나타내는 개략도이다.

도 10 에서는, 배양 플라스크 (4) 의 바닥의 면을 배양면 (4A) (배양 바닥면) 으로 한다. 배양면 (4A) 은 도 1 에 나타내는 배양 용기 (1) 에 상당하기 때문에, 배양 용기라고 할 수도 있다. 배양면 (4A) 은, 도 1 의 배양 용기 (1) 와 마찬가지로, 동일한 배지를 사용하는 단위가 된다. 배양 플라스크 (4) 는 캡 (4B) 을 갖는다. 배양면 (4A) 의 면적은 용도에 따라 설계하면 된다. 일반적인 배양 플라스크는 25, 75, 225 ㎠ 가 있다. 배양 플라스크 (4) 의 배양면 (4A) 에는 복수의 오목부 (40) 가 형성된다. 예를 들어, 배양 플라스크 (4) 의 바닥의 면 중, 망점 부분을 배양면 (4A) 으로서 설계하고, 배양면 (4A) 에 복수의 오목부 (40) 를 형성한다. 오목부 (40) 의 형상 (바닥부 및 개구부의 형상) 은, 상기 각 실시형태 중 어느 것이어도 된다.

도 11 에서는, 배양 플레이트의 프레임만을 사용하는 예이다. 도 1 에서는 배양 플레이트 (3) 에 배양 용기 (1) (웰) 가 형성되어 있지만, 도 11 에서는 배양 플레이트 (5) 의 바닥의 면을 배양면 (5A) (배양 바닥면) 으로 한다. 배양면 (5A) 은, 도 1 에 나타내는 배양 용기 (1) 에 상당하기 때문에, 배양 용기라고 할 수도 있다. 배양면 (5A) 은 동일한 배지를 사용하는 단위가 된다. 배양면 (5A) 의 구성예 (개략 단면도) 를 도 11 의 하단에 나타내고 있다. 예를 들어, 배양 플레이트 (5) 의 바닥의 면 중, 망점 부분을 배양면 (5A) 으로서 설계하고, 배양면 (5A) 에 복수의 오목부 (50) 를 형성한다. 도 11 에 나타내는 오목부 (50) 는 모식적으로 나타낸 것으로서, 오목부 (50) 의 수, 크기 등은 용도에 따라 설계되는 것이다. 오목부 (50) 의 형상 (바닥부 및 개구부의 형상) 은, 상기 각 실시형태 중 어느 것이어도 된다.

도 12 에, 도 11 에 나타내는 배양 플레이트 (5) 를 복수 쌓아 올려 구성하는 셀 스택 형태의 구성예, 바꾸어 말하면 다단식의 구성예를 나타낸다. 보다 대면적화하여 폐쇄계로 배양하는 경우에는, 셀 스택 형태를 사용하는 것이 일반적이다. 도 12 에서는, 도 11 에 나타내는 배양 플레이트 (5) 를 쌓아 올린 예를 나타내었지만, 도 1 에 나타내는 배양 플레이트 (3) 를 쌓아 올려도 된다. 도 12 중, 복수의 배양 용기를 쌓아 올린 것을 수납하고, 배지를 교환하기 위한 구조를 제공하는 용기에 대해서는 생략하였다. 복수의 배양 플레이트를 수납하는 용기는, 예를 들어, 일반적인 스택 형상의 배양 용기를 사용할 수 있다. 여기서는 설명을 생략한다.

그 밖의 실시형태.

상기 각 실시형태에서는, 바닥부와 개구부의 경계를 배양 용기의 바닥과 평행하도록 나타내고 있지만, 반드시 바닥과 평행이 아니어도 된다. 예를 들어, 경계가 바닥에 대해 경사져 있어도 되고, 경계가 곡선을 그리도록 형성되어 있어도 된다. 바닥부 (11) 에 있어서 스페로이드가 형성되도록 충분한 공간을 형성할 수 있으면 된다.

실시예

세포 응집체의 배양 용기 및 회수 방법에 대해, 다음의 실시예, 비교예의 시험을 실시하였다.

(1) 배양 용기

표 1 에 나타내는 배양 용기를 사용하였다.

실시예의 배양 용기는, 도 1-3 에 나타내는 오목부 (10) 를 갖는 웰 (배양 용기 (1)) 을 배양 플레이트에 형성한 것을 제조하였다.

표 1 중, 마이크로 용기는 도 1-3 의 오목부 (10) 에 상당하고, 마이크로 공간은 오목부 (10) (마이크로 공간) 가 형성하는 공간이다. 1 웰당의 마이크로 공간의 수는 1 웰당의 오목부의 수라고도 할 수 있다.

(2) 배양 방법

후술하는 잔존율 및 회수율을 화상 해석에 의해 산출하기 위해, GFP 로 형광 표지 (標識) 한 내배엽 세포를 사용하였다. 이 내배엽 세포, 혈관내피 세포와 인간 간엽계 줄기 세포 각각 10 : 5-10 : 2 의 비율로 혼합하고, 내피 세포 배지 키트-2 : EGM-2 BulletKit (제품 코드 CC-3162 : Lonza) 로 30 일간 배양을 실시하였다. 배지는 2 일에 1 회 교환하였다.

(3) 스페로이드 잔존율의 측정

공초점 레이저 현미경을 사용하여 웰 전체를 관찰, 화상 해석 소프트를 사용하여 스페로이드를 인식시키고, 그 수를 카운트하여 스페로이드수로 하였다. 이하의 식으로 스페로이드 잔존율을 계산하였다.

스페로이드 잔존율 (％) ＝ 스페로이드수 × 100/마이크로 공간의 수

세포 파종 후 수 시간 후 (0 일), 어느 배양 용기도 90 ％ 이상의 마이크로 공간에서 스페로이드 모양의 덩어리가 형성되어 있었다. 배양 10 일째, 20 일째의 배지 교환 후의 스페로이드의 수를 0 일째의 스페로이드수로 각각 나눈 값을 스페로이드 잔존율로 하였다.

(4) 회수 방법

배양 종료 후, 피펫 (메이커, 형번) 를 사용하여 용액을 교반하고, 부유되어 온 스페로이드를 회수하였다. 예를 들어, 24 웰 플레이트에서는 500 ㎕ ∼ 1 ㎖ 의 배지가 들어 있으므로, 최대 1 ㎖ 의 배지를 흡인할 수 있는 피펫을 사용하는 것이 적합하다.

(5) 회수 효율

회수 전후에 공초점 레이저 현미경으로 화상을 취득하였다.

(6) 결과

도 13 에 배지 교환시의 스페로이드의 잔존율을 나타낸다. 세로축에 스페로이드의 잔존율 (Sphere Number) 을, 가로축에 배양일수를 나타낸다.

도 13 에서는, 배양 개시부터 20 일까지의 데이터를 나타낸다. 도 13 에 나타내는 바와 같이, 실시예보다 비교예가 크게 감소되어 있는 것이 나타나 있다. 20 일 배양한 후, 실시예는 스페로이드의 잔존율이 60 ％ 이상이 되고, 비교예의 1.5 배로 향상되었다.

도 14 에 실시예 및 비교예의 배지 교환 전후의 스페로이드의 화상을 나타낸다. 도 14 에서는, 배양 4 일째, 2 회째의 배지 교환 전후의 배양 용기 내의 스페로이드의 화상을 나타낸다. 도 14 의 좌측이 실시예 (Kuraray p-HEMA), 우측이 비교예 (Iwaki MPC) 의 사진이다. 또, 상단에 배지 교환 전, 하단 (화살표보다 아래) 에 배지 교환 후의 화상을 나타낸다. 보다 상세하게는, 하단의 화상은, 배지 교환 전 상태로부터 배지의 반량을 교환하는 (반량 교환), 두 번의 배지 교환을 실시한 후를 나타낸다.

화상 중 백색으로 보이는 부분이 스페로이드이다. 배지 교환 전에는 전체에 스페로이드가 확인된다. 배지 교환 후에는, 실시예에서는 배지 교환 전후로 큰 차이는 없으며, 대부분의 스페로이드가 잔존하고 있지만, 비교예에서는 약 절반 정도밖에 잔존하고 있지 않다.

도 15 에 실시예의 세포를 회수한 전후의 화상을 나타낸다. 도 15 중, 좌측 (BEFORE) 은 회수 전의 화상, 우측 (AFTER) 은 회수 후의 화상이다. 상단에 배양 용기 전체의 화상을, 하단에 배양 용기의 일부분을 확대한 화상을 나타낸다. 도 16 에 실시예의 배양 용기로부터 회수한 후의 스페로이드의 사진을 나타낸다.

흑색의 원형의 마이크로 용기 (오목부) 내의 점상의 것이 스페로이드이다. 회수 후의 화상에는 점상의 것이 없고, 거의 100 ％ 회수되어 있다. 또, 도 16 에 나타내는 바와 같이, 회수 후의 세포의 형태는 양호한 스페로이드의 형태를 하고 있고, 회수 조작에 의해 스페로이드가 파괴되는 경우는 없었다.

또한, 본 발명은 상기에 나타내는 실시형태에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 범위에 있어서, 상기 실시형태의 각 요소를 당업자라면 용이하게 생각할 수 있는 내용으로 변경, 추가, 변환하는 것이 가능하다.

본 출원은, 2013년 6월 7일에 출원된 일본 특허출원 2013-120915호를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시 전부를 여기에 받아들인다.

1 : 배양 용기
3, 5 : 배양 플레이트
4A, 5A : 배양면
5 : 배양 플라스크
10, 20A ∼ 20D, 30A, 30B, 40, 50 : 오목부
11, 21A ∼ 21D : 바닥부
12, 32A, 32B : 개구부

Claims (19)

1. 바닥부와 개구부로 이루어지는 복수의 오목부가 배열되고,
   상기 바닥부가 반구상과 원뿔대 중 어느 형상을 갖고,
   상기 개구부가 상기 바닥부와의 경계로부터 상기 오목부의 단부까지를 둘러싸는 테이퍼각 1 도 이상 20 도 이하의 벽으로 구성되고,
   상기 경계의 상당 직경이 50 ㎛ 이상 2 ㎜ 이하이고, 상기 바닥부의 바닥으로부터 상기 단부까지의 깊이가 상기 상당 직경의 0.6 배 이상 3 배 이하이고,
   상기 개구부를 구성하는 벽이 상기 바닥부와 연속하는 면을 형성하고, 또한 상기 연속하는 면의 경사가 상기 경계에서 변화하는 배양 용기.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 단부의 형상이 반구상, 사다리꼴, 또는 역삼각형 중 어느 것인 것을 특징으로 하는 배양 용기.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   이웃하는 2 개의 오목부의 사이가 평탄하고, 상기 2 개의 오목부의 거리가 5 ㎛ 내지 50 ㎛ 인 것을 특징으로 하는 배양 용기.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 배양 용기가 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지 및 실리콘 수지 중 하나 또는 이들 조합으로 이루어지는 수지 성형품인 것을 특징으로 하는 배양 용기.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 오목부에 플라즈마 처리, 유리 코트, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 어느 것 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시키고, 물 접촉각이 45 도 이하가 되도록 처리된 것을 특징으로 하는 배양 용기.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 오목부에 세포 접착을 저해하는 친수성의 폴리머 사슬이 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 용기.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 오목부에 인지질, 또는 인지질·고분자 복합체가 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 용기.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 오목부에 플라즈마 처리, 유리 코트, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 어느 것 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시키고, 물 접촉각을 45 도 이하가 되도록 처리한 후, 세포 접착을 저해하는 친수성의 폴리머 사슬, 및 인지질, 또는 인지질·고분자 복합체 중 어느 하나의 폴리머가 고정화되어 있는 세포 비접착 표면인 것을 특징으로 하는 배양 용기.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 친수성의 폴리머 사슬이 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트인 것을 특징으로 하는 배양 용기.
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트의 평균 분자량이 10 만 이상인 것을 특징으로 하는 배양 용기.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 배양 용기를 사용하고,
    총세포수가 상기 배양 용기가 갖는 상기 오목부의 수 (N) 이상이고, 상기 오목부가 형성하는 공간의 체적 (V1) 을 파종하는 세포의 체적 (V2) 으로 나눈 값에 상기 오목부의 수 (N) 를 곱한 수 이하인 세포를 배지에 분산시키고,
    상기 배지를 상기 배양 용기에 첨가하는 배양 방법.
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 오목부가 형성하는 공간 1 개에 대해 1 개의 스페로이드를 형성시키는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 공간에 스페로이드를 형성시켜 스페로이드를 성장시키는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 공간에 스페로이드를 형성시켜 분화 유도하는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
15. 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 용기 내에 형성된 스페로이드의 총수의 60 ％ 이상이, 평균 스페로이드 직경의 플러스 마이너스 5 ％ 의 범위 내의 직경인 것을 특징으로 하는 배양 방법.
16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지를 교반함으로써 상기 오목부 내의 세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
17. 제 16 항에 있어서,
    상기 배지의 교반이 상기 배양 용기를 진탕하여 상기 배지를 교반하는 것, 상기 배지를 흡인 및 배출하여 상기 배지를 교반하는 것, 상기 배양 용기에 교반 날개를 설치하여 배지를 교반하는 것, 상기 배양 용기에 교반자를 넣어 배지를 교반하는 것, 또는 이들 조합으로 이루어지는 방법 중 어느 것인 것을 특징으로 하는 배양 방법.
18. 제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지를 적어도 1 회 이상 교환하고, 교환되는 배지의 비율이 20 ％ 이상인 것을 특징으로 하는 배양 방법.
19. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 배양 용기를 사용하고,
    a) 배양 용기에 존재하는 오목부의 수 (n) 와 동수 이상, 상기 오목부의 체적 (V) 을 파종하는 세포의 체적 (v) 으로 나눈 값에 상기 오목부의 수 (n) 를 곱한 수 이하의 세포수를 배지에 분산시키고, 상기 배지를 배양 용기에 첨가하는 공정,
    b) 12 시간 이상 상기 배양 용기 내에서 상기 세포를 배양하여 스페로이드를 형성시키는 공정,
    c) 상기 배지를 20 ％ 이상 흡인한 후, 동량의 신선한 배지를 주입하는 공정,
    d) 상기 a) 내지 c) 의 공정을 복수 회 실시하여 스페로이드를 성장시키는 공정,
    e) 상기 스페로이드를 원하는 크기로 성장시킨 후, 상기 배지를 교반하여 각 오목부 내의 세포를 상기 배지 중에 부유시키는 공정, 및
    f) 상기 배지마다 상기 세포를 흡인기로 빨아 들여 상기 세포를 회수하는 공정을 실시함으로써 세포를 파종, 배양, 배지 교환, 회수하는 배양 방법.

Images