JP6379529B2 - 細胞培養容器 - Google Patents

Description

本発明は、受精卵などの個別管理が必要な細胞を培養するための細胞培養容器に関する。

培養系で***と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製して、さらに受精卵を卵割、桑実胚、胚盤胞の段階を経て、透明帯から孵化した脱出胚盤胞の段階まで培養することが可能となり、この卵割から胚盤胞の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る補助的生殖技術（ＡＲＴ）が、家畜領域のみならずヒトの不妊医療でも確立されている。

しかし、体外受精による妊娠成功率は必ずしも高くはなく、たとえばヒトにおいては、その妊娠成功率は、依然として２５〜３５％程度に留まっている。その原因の一つとして、培養において子宮への移植に適した良質な受精卵を得られる確率が高くないことが挙げられる。培養された受精卵は、専門家が顕微鏡で個別に観察することにより、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否か判別されている。

体外受精においては、容器中に培養液のドロップを作り、この中に受精卵を入れて体外培養するマイクロドロップ法が用いられることが多い。従来、このマイクロドロップ法には、細胞培養容器として、底面が単一平面であり、直径が３０〜６０ｍｍのシャーレが使用され、シャーレの底面に、培養液のドロップを、間隔をあけて複数個作製し、その中で細胞を培養する方法が使用されてきた。

通常のシャーレでドロップを作成すると、受精卵自身の細胞運動やドロップ内の対流によって受精卵の位置が変わってしまい、その中で培養して観察していた受精卵の特定が難しくなるという問題があった。したがって、受精卵の位置を制御できる手段が求められていた。

受精卵の培養効果をより効率的にするためには受精卵同士の相互作用（パラクライン効果）を利用することが好ましいとされている。これらの効果を利用しつつ、受精卵の位置を制御する目的で、シャーレの底面に受精卵のサイズと同程度のマイクロウェルを形成し、複数個のマイクロウェルを覆うように培養液のドロップを添加し、培養液で満たされたマイクロウェルに受精卵を配置して培養を行うシステムが知られている（特許文献１）。それにより複数の受精卵の位置を制御して個別観察を可能としつつ、少量の培養液の中で複数の受精卵の培養を行うことができ、パラクライン効果を利用できる。

特許第４７２４８５４号公報

マイクロウェルは小さいほど、細胞から分泌された物質が分泌した細胞自身に作用するオートクライン効果が期待されるが、小さすぎると受精卵等の細胞の配置が困難で作業性が悪化する。また、マイクロウェルは培養対象である細胞を保持するためにある程度の深さが必要であるが、保持性を確保すると作業性が悪くなる。作業性と培養対象の保持性の両者を改善する培養容器が求められていた。

本発明は、細胞を収容するためのマイクロウェルを有する培養容器を用いた細胞培養において、培養時の作業性と培養対象の保持性を向上させることが可能な細胞培養容器を提供することを目的とする。

本発明者らは、底部と、傾斜角度の異なる２種類の傾斜側面とを有するマイクロウェルをその底面に形成した細胞培養容器を用いることにより、上記課題が解決できることを見出した。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。

（１）底面と側面とを有する細胞培養容器であって、
底面に細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
マイクロウェルは、底部と、底部に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第１側面と、第１側面に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第２側面とを有し、
細胞培養容器の底面に平行な面と第１側面とが成す傾斜鋭角θ１と細胞培養容器の底面に平行な面と第２側面とが成す傾斜鋭角θ２の関係がθ１＞θ２であり、θ２＞０°である、
細胞培養容器。
（２）マイクロウェルの底部が円錐面を形成している、（１）に記載の細胞培養容器。
（３）第１側面と第２側面の接続部が形成する開口部の開口幅Ｘ１が１００〜５００μｍであり、第２側面が形成する開口部の開口幅Ｘ２が１ｍｍ未満であり、Ｘ１＜Ｘ２である、（１）又は（２）に記載の細胞培養容器。
（４）第１側面と第２側面の接続部からマイクロウェル最深部までの深さＬ１が５０〜２００μｍであり、マイクロウェル開口端からマイクロウェル最深部までの深さＬ２が１００〜５００μｍであり、Ｌ１＜Ｌ２である、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（５）底面に複数のマイクロウェルが形成されており、かつ複数のマイクロウェルを囲む内壁が形成されている、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（６）マイクロウェルの第１側面と第２側面が、それぞれ円錐台の側面を形成している、（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養容器。

（７）細胞培養方法であって、
底面と側面とを有する細胞培養容器であって、
底面に細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
マイクロウェルは、底部と、底部に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第１側面と、第１側面に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第２側面とを有し、
細胞培養容器の底面に平行な面と第１側面とが成す傾斜鋭角θ１と細胞培養容器の底面に平行な面と第２側面とが成す傾斜鋭角θ２の関係がθ１＞θ２であり、θ２＞０°である、細胞培養容器を準備する工程、及び
前記細胞培養容器のマイクロウェルに細胞と培養液とを添加して細胞培養する工程、
を含む前記方法。

本発明により、培養時の作業性と培養対象の保持性が向上した細胞培養容器が提供される。

細胞培養容器の一実施形態の上面図を示す概略図である。 細胞培養容器の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。 一実施形態のマイクロウェルの垂直断面図を示す概略図である。 細胞培養容器を用いた細胞培養方法の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。 比較例のマイクロウェルの垂直断面図を示す概略図である。

以下、本発明について説明する。
細胞培養容器の一実施形態の概略図を図１〜３に示す。図１は上面図を、図２は垂直断面図を、図３はマイクロウェルの拡大図を示す。図１〜３に示されるように、一実施形態において細胞培養容器は、
底面２と側面１とを有する細胞培養容器であって、
底面２に細胞を収容するためのマイクロウェル３が一つ以上配置されており、
マイクロウェル３は、底部４と、底部に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第１側面５と、第１側面に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第２側面６とを有し、
細胞培養容器の底面に平行な面と第１側面とが成す傾斜鋭角θ１と細胞培養容器の底面に平行な面と第２側面とが成す傾斜鋭角θ２の関係がθ１＞θ２であり、θ２＞０°である。

本実施形態の細胞培養容器は、細胞を収容するためのマイクロウェルが、傾斜角度の異なる第１側面と第２側面とを有する。第１側面は、底部に接続し、外縁に進むに従って高くなるように形成されており、第２側面は、第１側面の外縁端に接続して形成される。第２側面も、第１側面との接続部からさらに外縁に進むに従って高くなるように形成されるが、その勾配は、第１側面よりも緩やかである。

細胞培養容器のサイズは、特に制限されないが、開口部が好ましくは円形で、開口幅（例えば、図２のｒ）が、好ましくは３０〜６０ｍｍ、特に３５ｍｍのものが用いられる。これは従来の細胞培養に用いられているシャーレと同等のサイズであり、汎用のシャーレから簡便に作製できること、及び既存の培養装置等に適合しやすいことから、上記のようなサイズのものが好ましい。

図３にマイクロウェルの垂直切断面の拡大図を示す。マイクロウェルの垂直切断面は、細胞培養容器の底面に垂直でマイクロウェルの中心を通る切断面をさす。マイクロウェルの中心は、マイクロウェルの開口部が形成する図形の重心をさす。マイクロウェルは、細胞培養容器の底面に形成され、底部と、第１側面５と、第２側面６とを有する。細胞培養容器は、通常、その底面が水平となる状態で配置されて使用される。マイクロウェルの開口部の外縁の形状は特に制限されないが、好ましくは円状（円形、略円形、楕円形、略楕円形、及び半円形を含む）であり、特に好ましくは円形である。

マイクロウェルの第１側面５は、底部の外縁端に接続して形成されており、底部との接続部８からさらに外縁に進むに従って高くなるように形成される。外縁に進むに従って高くなるとは、図３に示すような垂直切断面において、底部との接続部８から、第２側面との接続部９の方へ外周方向に向かって所定の傾斜構造をもって高くなっていることをいう。

マイクロウェルの第１側面が、細胞培養容器の底面に平行な面となす傾斜鋭角θ１は、好ましくは８９°以下、より好ましくは８５°以下、さらに好ましくは８３°以下であり、好ましくは５５°以上、より好ましくは６０°以上、さらに好ましくは６５°以上である。マイクロウェルの第１側面の傾斜鋭角θ１を９０°より小さくすることで、垂直のものと比べると成形時に成形品を金型から剥離しやすくなり、加工精度が向上する。またマイクロウェル中に培養液を添加したときに、マイクロウェル内に気泡が残りにくくなる。一方、θ１を５５°以上とすることにより、細胞がマイクロウェルから飛び出すのを防止することができ、多少の振動や横揺れを与えても細胞をマイクロウェル内に保持することができる。

マイクロウェルの第１側面は、なだらかな傾斜面を形成し、好ましくは円錐台の側面を形成する。第１側面が円錐台の側面を形成する場合、円錐台の上面及び下面のうち面積の狭いほうがマイクロウェルの底側に該当するように円錐台が配置されるような構成となる（例えば、図３）。マイクロウェルの第１側面が円錐台の側面を形成する場合、θ１は、中心線と母線とのなす角度と９０°との差に相当する。

マイクロウェルの第２側面６は、第１側面の外縁端に接続して形成されており、第１側面との接続部９からさらに外縁に進むに従って高くなるように形成される。外縁に進むに従って高くなるとは、図３に示すような垂直切断面において、第１側面との接続部９から、マイクロウェルの開口端１０の方へ外周方向に向かって所定の傾斜構造をもって高くなっていることをいう。

マイクロウェルの第２側面が、細胞培養容器の底面に平行な面となす傾斜鋭角θ２は、好ましくは５５°以下、より好ましくは５０°以下、さらに好ましくは４５°以下であり、好ましくは５°以上、より好ましくは１５°以上、さらに好ましくは３５°以上である。マイクロウェルの第２側面の傾斜鋭角θ２を上記角度範囲内にすることにより、マイクロウェル内へ培養液を入りやすくすることが可能となる。角度が大きすぎると第２側面と培養容器底面が形成する角度部分が大きくなってしまい、培養液が入りにくくなるおそれがある。また、角度が小さすぎると第１側面と第２側面が形成する角度部分が大きくなってしまい、やはり培養液が入りにくくなるためマイクロウェル内に気泡が残りやすくなってしまい、作業性が悪化するおそれがある。

細胞培養容器のマイクロウェルは、傾斜角度の異なる第１側面と第２側面を有し、θ２はθ１よりも小さいことから、細胞をマイクロウェル内に容易に配置し、取出すことができるとともに、細胞がマイクロウェルから飛び出すのを防止することができ、多少の振動や横揺れを与えても細胞をマイクロウェル内に保持することができる。すなわち、培養時の作業性と培養対象の保持性を両立させることができる。

一実施形態において、細胞培養容器のマイクロウェルは、例えば、図３に示すように、底部が最深部７から外縁に進むに従って高くなるように傾斜した傾斜面を形成する。外縁に進むに従って高くなるとは、図３に示すような垂直切断面において、マイクロウェルの最深部７から、第１側面５との接続部８の方へ外側に向かって所定の傾斜構造をもって高くなっていることをいう。

図３に示すような垂直切断面において、このマイクロウェル底部の傾斜面が、細胞培養容器の底面に平行な面と成す傾斜鋭角θ３は、９０°未満であり、好ましくは８９°以下、より好ましくは８５°以下、さらに好ましくは４５°以下であり、好ましくは１°以上、より好ましくは３°以上、さらに好ましくは５°以上である。

このように底部が傾斜面を形成することにより、細胞をマイクロウェルの最深部に維持することができ、すなわち多少の揺れを与えても細胞が移動しないため、顕微鏡下において細胞を探す必要がなく観察しやすいという利点がある。すなわち、θ３を一定の角度以上とすることにより、重力を駆動源として、細胞を配置したい場所（最深部）へ移動させやすく、一定の角度以下とすることにより、顕微鏡で透過観察する際の傾斜面での反射、散乱が起こりにくくなり、鮮明な観察像を得ることができる。

マイクロウェルの底部は、好ましくは円錐面を形成する。その場合、マイクロウェルの最深部７は円錐の頂点に該当するように円錐が配置されるような構成となる（例えば、図３）。この場合、マイクロウェルの最深部、すなわち円錐の頂点は丸みを帯びていてもよい。マイクロウェルの底部が円錐面を形成する場合、θ３は、中心線と母線とのなす角度と９０°との差に相当する。

マイクロウェルは、その開口部が、細胞を１つずつ収容するのに好適な開口幅を有するウェルをさし、通常１ｍｍ未満の開口幅を有する。ここで、マイクロウェルの開口部の開口幅は、マイクロウェルの開口部の外縁が形成する図形の最短径の長さをさす。一実施形態において、マイクロウェルの開口部の開口幅は、第２側面が形成する開口部の開口幅である。マイクロウェルの開口部の外縁が円形である場合、開口幅は円の直径に等しく、その直径は、培養する細胞の最大寸法より大きいものとなる。マイクロウェルの開口部の外縁が円形以外である場合、マイクロウェルの開口部の開口幅は、マイクロウェルの開口部の外縁が形成する図形の最短径をさす。細胞培養容器により受精卵を培養する場合、胚盤胞の段階まで培養することが望ましいため、円形の開口部の直径は、胚盤胞の段階の細胞の最大寸法より大きいものであることが望ましい。また、マイクロウェルの開口部の外縁が円形である場合、開口幅は、マイクロウェル間のピッチより小さい。

マイクロウェルの開口部の開口幅（例えば図３のＸ２、マイクロウェルの開口部の外縁が円形である場合はその直径）は、好ましくは０．１５ｍｍ以上、より好ましくは０．３ｍｍ以上、さらに好ましくは０．５２ｍｍ以上であり、好ましくは１ｍｍ未満、より好ましくは０．７ｍｍ以下である。０．５２ｍｍ以上とすることにより、培養対象を扱うピペット等の外径の２倍以上となり、作業が容易となる。０．１５ｍｍ以上であれば、想定される培養対象のサイズ０．１ｍｍ程度に対して約５０μｍ大きいため、培養対象物をマイクロウェル内に狙って落とすことが容易になる。また、０．３ｍｍ以上であれば、培養対象を扱うピペットの先端の最外径よりも約５０μｍほど大きいため、マイクロウェル内にピペット先端を入れて作業ができる。さらに、０．５２ｍｍ以上であれば、ピペット先端径の２倍以上のサイズであり、先端をマイクロウェル内にしっかりと入れて、作業時に１００μｍほどピペットの先端が揺れてもマイクロウェルにあたりにくく、作業性において優れる。一方、１ｍｍ未満であれば、パラクライン効果を期待でき、マイクロウェルをより密に配置して小さい面積内で複数個の細胞を培養可能であり、顕微鏡観察時にもより多くの対象を観察しやすくなる。

マイクロウェルの第１側面と第２側面の接続部が形成する開口部の開口幅（例えば、図３の接続部９が形成する開口部の開口幅Ｘ１、円形である場合は直径）は、Ｘ２より小さく、好ましくは１００μｍ以上、より好ましくは２５０μｍ以上であり、好ましくは７００μｍ以下、より好ましくは５２０μｍ以下、さらに好ましくは４５０μｍ以下である。開口幅Ｘ１を上記範囲とすることにより、オートクライン効果と細胞保持性の向上が期待できる。

マイクロウェルの深さは、マイクロウェルの開口端から最深部までを垂直に測った深さをいい、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１５０μｍ以上であり、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下である。一実施形態において、マイクロウェルの深さは、第２側面の開口端１０からマイクロウェル最深部７までを垂直に測った深さ（例えば、図３のＬ２）である。

マイクロウェルの深さは、浅過ぎると、培養容器の輸送時や細胞の***時などに細胞が動き、細胞がマイクロウェルの範囲外に出てしまう恐れがあるため、確実に細胞をマイクロウェル内に保持できるように設定される。一方、深過ぎると、マイクロウェル内に培養液や細胞を導入することが難しくなるため、細胞をマイクロウェル内に保持しつつ、深過ぎない値になるよう適宜設定される。例えば、深さの上限をマイクロウェルの開口部の開口幅に対して３倍以下とすることができる。さらに、培養液の導入を容易にするためには、深さはマイクロウェルの開口幅の１倍以下であることが好ましく、１／２以下であることが特に好ましい。

Ｌ２の部分は、Ｌ１の設計値に対してさらに深さが追加されるためより内容物の保持性能を向上させることができる。一方、マイクロウェルの深さは、深過ぎると、マイクロウェル内に培養液や細胞を導入することが難しくなるため、細胞をマイクロウェル内に保持しつつ、深過ぎない値になるよう適宜設定される。マイクロウェル深さが５００μｍ以下であれば作業性は問題ないが、深すぎる場合は成形加工時に高アスペクト比の成形加工になり、成形精度が下がる可能性がある。したがって、マイクロウェルの開口幅に対して、深さは１倍、もしくは０．７５倍以下になっていることが好ましい。

マイクロウェルの深さのうち、第１側面により形成される深さは、第１側面と第２側面の接続部９からマイクロウェル最深部７までを垂直に測った深さ（例えば、図３のＬ１）であり、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１１２．５μｍ以上であり、好ましくは２２５μｍ以下、より好ましくは１８０μｍ以下である。第１側面により形成される深さＬ１を上記範囲とすることにより、オートクライン効果と作業性を向上させることができる。

マイクロウェルの深さは、浅過ぎると、輸送時や細胞***時などに細胞が動き、細胞がマイクロウェルの範囲外に出てしまうおそれがあるため、確実に細胞をマイクロウェル内に保持できるように設定される。よって、好ましくは培養対象の３分の１以上（例えば、培養対象の径を約１５０μｍとした場合、５０μｍ以上）、より好ましくは４分の３以上（例えば、培養対象の径を約１５０μｍとした場合、１２０μｍ以上）の深さとなるように設計される。深すぎると細胞の取り出し作業が困難になるため、好ましくは培養対象のサイズの２倍以下（例えば、培養対象の径を約１５０μｍとした場合、３００μｍ以下）、より好ましくは１．２倍以下（例えば、培養対象の径を約１５０μｍとした場合、１８０μｍ以下）の深さとなるように設計される。

図３に示すような垂直切断面において、底部と第１側面の接続部８、第１側面と第２側面の接続部９、及びマイクロウェルの開口端１０は、丸みを帯びていること、すなわち曲率を有することが好ましい。その場合、曲率は、それぞれ好ましくは０．０１ｍｍ以上、より好ましくは０．０２ｍｍ以上であり、好ましくは０．１ｍｍ以下、より好ましくは０．０７ｍｍ以下である。底部と第１側面の接続部、第１側面と第２側面の接続部、及びマイクロウェルの開口端に曲率を持たせることにより、気泡がより抜けやすくなることで作業性が改善すること、及びプラスチックによる射出成形加工が容易になり歩留まりが向上するなどの効果が期待できる。

マイクロウェルの傾斜面の表面粗さは、大きい値であると、顕微鏡で透過観察を行った画像を輪郭抽出処理に付す際に、傾斜面上の凹凸に起因して明瞭な輪郭が得られない恐れがあるため、可能な限り小さい値であることが好ましい。具体的には、最大高さＲｙ（粗さ曲線からその平均線の方向に基準長さだけを抜き取り、この抜き取り部分における山頂線と谷底線との間隔をいう）が１μｍ未満、特に０．５μｍ未満であることが好ましい。なお、傾斜面の表面粗さは、培養容器の鋳型を作製する際に磨き処理を施す等して、鋳型の加工精度を高めることにより小さくすることができる。

マイクロウェルは、細胞培養容器の底面に、少なくとも１個形成され、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、より好ましくは８個以上が、近接して形成されている。マイクロウェルは、少なくとも４個が近接して形成されていればよく、さらに近接していないマイクロウェルが別途形成されていてもよい。また、４個以上近接して形成されたマイクロウェルの群が、複数群配置されていてもよく、それらの群は互いに近接していなくてもよい。近接するマイクロウェル間のピッチは１ｍｍ以下である。ただし、上記ピッチは収容する細胞の種類に依存して異なる。上記のようなピッチでマイクロウェルを密に配置することにより、細胞を個別に管理しつつ多くの細胞を同時に培養でき、さらに顕微鏡の一視野に多くの細胞が入るため、一度に多くの細胞の画像を取得することができる。また、パラクライン効果を期待できる。

４個以上近接して形成されたマイクロウェルは、それらを囲む内壁（例えば、図１及び図２の１１）により、培養容器内のその他の部分と隔てられていてもよい。当該実施形態では、近接したマイクロウェル（細胞収容部）の群ごとに内壁で囲まれており、複数のマイクロウェルの群が細胞培養容器の底面に存在する場合は、群ごとに内壁で囲まれることになる。通常、受精卵等の培養においては、培養容器に受精卵を含む培養液の液滴を形成し、液滴をオイルで覆うことにより培養液の乾燥が防止されている。４個以上近接して形成されたマイクロウェルの群をさらに内壁で囲むことにより、その内部に培養液を収容して安定なドロップを形成し、培養液の分散を防ぐことができる。培養液をミネラルオイル等のオイルで覆う場合も同様である。

本実施形態の細胞培養容器の材質は、特に制限されない。具体的には、金属、ガラス、及びシリコン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。本実施形態の細胞培養容器は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる培養容器を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。

本実施形態の細胞培養容器は、培養細胞の非特異的接着を防止し、また培養液のドロップが表面張力によって偏ることを防止する観点から、プラズマ処理などの表面親水化処理することが好ましい。製造後の容器に付着している菌数（バイオバーデン数）が１００ｃｆｕ／容器以下であることが好ましい。また、さらにγ線滅菌などの滅菌処理を施されていることがより好ましい。

本実施形態の細胞培養容器は、受精卵の発育を促進するような表面処理又は表面コートがなされていてもよい。特に、受精卵の発育を促進するために、他の器官の細胞（例えば、子宮内膜細胞や卵管上皮細胞）と共培養をする場合、これらの細胞をあらかじめ培養容器に接着させる必要がある。このような場合に、培養容器の表面に細胞接着性の材料をコートすると有利である。

培養対象となる細胞は、特に制限されないが、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞及び成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えていき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚及び８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞及び脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性又は全能性細胞をさす。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞をさす。すなわち、本実施形態において細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。

本実施形態の細胞培養容器は、好ましくは哺乳動物及び鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の培養に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒト及びサルなどの霊長類、マウス、ラット及びウサギなどの齧歯類、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマ及びブタなどの家畜が挙げられる。本実施形態の細胞培養容器は、ヒトの受精卵の培養に特に好適である。

通常、マイクロウェルを覆うように培養液Ａを添加した後、培養液を覆うようにオイルＣを添加し、さらに培養液中に細胞Ｂを添加する。これらの作業は、通常ピペットやガラスキャピラリー等の器具を用いて実施される。本実施形態の細胞培養容器は、開口が大きいので、これらの操作を比較的容易に実施できる（図４）。

培養は、通常、細胞培養容器を培養細胞の発育及び維持に必要なガスを含む環境雰囲気及び一定の環境温度をもたらすインキュベータに入れることにより実施される。必要なガスには、水蒸気、遊離酸素（Ｏ_２）及び二酸化炭素（ＣＯ_２）が含まれる。環境温度とＣＯ_２含有量を調節することにより、培養液のｐＨを一定時間内に安定させることができる。安定なＣＯ_２含有量と安定な温度により安定なｐＨが得られる。画像比較プログラムにより、培養中の細胞の画像を予め保存された画像と比較することにより、培養の際の温度、ガス及び培養液などの培養条件を調節することもできる。

例えば受精卵を培養する場合には、通常、培養後に、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否かが判別される。判別は自動で行ってもよいし、顕微鏡等により手動で行ってもよい。培養細胞の自動判別においては、顕微鏡により取得された培養容器内の細胞の画像をＣＣＤカメラ等の検出装置によって撮像し、得られた像を輪郭抽出処理に付し、画像中の細胞に該当する部分を抽出し、抽出された細胞の画像を画像解析装置で解析することによりその質を判別することができる。画像の輪郭抽出処理については、例えば、特開２００６−３３７１１０に記載された処理を利用できる。

マイクロウェルが細胞培養容器の底面に平行な底面とそれに垂直な側面とからなる場合は、細胞がマイクロウェル内で移動して側面に接触する場合があり、その状態で細胞の撮像を行うと、撮影された画像において輪郭抽出処理により細胞の画像を抽出することが困難であるという問題があるが、マイクロウェルの底部が、傾斜面を有する場合、好ましくは円錐状の部分を含む場合は、培養される細胞は自動的にマイクロウェルの最深部に配置されることとなり、撮像された細胞の画像の輪郭抽出処理を問題なく実施することができる。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。

実施例１及び２として、図３におけるＸ１、Ｘ２、Ｌ１、Ｌ２、θ１及びθ２がそれぞれ以下の表１に示す値であるマイクロウェルを作製した。また、比較例１〜３として、第２側面を有しないマイクロウェルであって、図５におけるＸ１、Ｌ１及びθ１がそれぞれ以下の表１に示す値であるマイクロウェルを作製した。なお、いずれのマイクロウェルにおいても、マイクロウェル底部の傾斜角度θ３は、７°とした。

ガラスビーズ（直径１５０μm）マイクロウェル内に配置する作業及び取出す作業を行い、作業の簡易性と配置後の受精卵の保持性能を評価した。結果を表２に示す。

「配置し易さ」はガラスビーズをマイクロウェル内に置きやすいかを評価した結果を示す。「良好」はピペットが震えたりしても、容易にマイクロウェルウェルに入ったことを示し、「困難」はピペットの震えなどによりビーズをマイクロウェル外に落としてしまう場合があったことを示す。

「取出し易さ」はマイクロウェル内のガラスビーズを簡単に取り出せたかを評価した結果を示す。「良好」はピペット作業で特に問題なく取り出せたことを示し、「困難」はビーズがマイクロウェルの外に出てしまう場合があったことを示す。

「保持性能１」は震度４〜６の横揺れに相当する加速度をＪＩＳ６００６８−３−３に従って加えた際にマイクロウェル内のビーズが保持できたかを評価した結果を示す。「保持可能」は１００％問題なく保持できたことを示し、「保持できないこと有」は１００％でなく、外にでているものが見られたことを示す。

「保持性能２」は、細胞培養容器自体に過度な揺れを加えた場合にマイクロウェル内のビーズが保持できたかを評価した結果を示す。具体的には、高さ約１ｃｍから机の上に細胞培養容器を３回落として評価した。「保持可能」、「保持できなこと有」は保持性能１と同じ評価基準であり、「保持できない」はビーズが完全に外に出てしまったことを示す。

１：側面
２：底面
３：マイクロウェル
４：マイクロウェルの底部
５：マイクロウェルの第１側面
６：マイクロウェルの第２側面
７：マイクロウェルの最深部
８：底部と第１側面の接続部
９：第１側面と第２側面の接続部
１０：マイクロウェルの開口端
１１：内壁
ｒ：細胞培養容器の開口幅
Ｘ１：第１側面と第２側面の接続部の開口幅
Ｘ２：マイクロウェルの開口幅
Ｌ２：マイクロウェルの深さ
Ｌ１：第１側面により形成される深さ
θ１：第１側面の傾斜角度
θ２：第２側面の傾斜角度
θ３：底部傾斜面の傾斜角度
Ａ：培養液
Ｂ：細胞
Ｃ：オイル

Claims (6)

1. 底面と側面とを有する細胞培養容器であって、
   底面に細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
   マイクロウェルは、底部と、底部に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第１側面と、第１側面に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第２側面とを有し、
   細胞培養容器の底面に平行な面と第１側面とが成す傾斜鋭角θ１と細胞培養容器の底面に平行な面と第２側面とが成す傾斜鋭角θ２の関係がθ１＞θ２であり、θ２＞０°であり、
   第１側面と第２側面の接続部が形成する開口部の開口幅Ｘ１が１００〜５００μｍであり、第２側面が形成する開口部の開口幅Ｘ２が１ｍｍ未満であり、Ｘ１＜Ｘ２である、
   細胞培養容器。
2. マイクロウェルの底部が円錐面を形成している、請求項１に記載の細胞培養容器。
3. 第１側面と第２側面の接続部からマイクロウェル最深部までの深さＬ１が５０〜２００μｍであり、マイクロウェル開口端からマイクロウェル最深部までの深さＬ２が１００〜５００μｍであり、Ｌ１＜Ｌ２である、請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
4. 底面に複数のマイクロウェルが形成されており、かつ複数のマイクロウェルを囲む内壁が形成されている、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養容器。
5. マイクロウェルの第１側面と第２側面が、それぞれ円錐台の側面を形成している、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養容器。
6. 細胞培養方法であって、
   底面と側面とを有する細胞培養容器であって、
   底面に細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
   マイクロウェルは、底部と、底部に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第１側面と、第１側面に接続しマイクロウェル開口の外周方向に傾斜した第２側面とを有し、
   細胞培養容器の底面に平行な面と第１側面とが成す傾斜鋭角θ１と細胞培養容器の底面に平行な面と第２側面とが成す傾斜鋭角θ２の関係がθ１＞θ２であり、θ２＞０°であり、
   第１側面と第２側面の接続部が形成する開口部の開口幅Ｘ１が１００〜５００μｍであり、第２側面が形成する開口部の開口幅Ｘ２が１ｍｍ未満であり、Ｘ１＜Ｘ２である、細胞培養容器を準備する工程、及び
   前記細胞培養容器のマイクロウェルに細胞と培養液とを添加して細胞培養する工程、
   を含む前記方法。

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