JP4724854B2 - 細胞培養容器 - Google Patents
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
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Description
(1)個別管理が必要とされる細胞を培養するための、底壁と側壁とを有する培養容器であって、
底壁に、凹部を有する細胞収容部が配置されており、
凹部が4個以上近接しており、
凹部の壁面が、凹部の最も低い位置から凹部の外縁に進むに従って高くなるような傾斜面を有し、
近接する凹部間のピッチが1mm以下である、
前記培養容器。
(3)傾斜面の表面粗さについて、最大高さRyが1.0μm未満である、(2)に記載の培養容器。
(4)凹部の開口部の開口幅が100μm〜300μmである、(1)〜(3)のいずれかに記載の培養容器。
(6)凹部の開口部が円形である、(1)〜(5)のいずれかに記載の培養容器。
(7)凹部の壁面が円錐状又は円錐台状の部分を有する、(6)に記載の培養容器。
(9)近接する凹部が、1mm2あたり1個以上の密度で配置されている、(1)〜(8)のいずれかに記載の培養容器。
(10)近接する4個以上の凹部が正方格子状又は最密充填状に配置されている、請求項(1)〜(9)のいずれかに記載の培養容器。
(12)細胞が、受精卵、卵細胞、ES細胞及びiPS細胞からなる群から選択される、(1)〜(11)のいずれかに記載の培養容器。
(13)細胞が、ウシの受精卵である、(12)に記載の培養容器。
(15)培養容器の外周部であって細胞収容部を有しない部分に液体収容部を有する、(14)に記載の培養容器。
(16)培養細胞の自動判別に使用するための、(1)〜(15)のいずれかに記載の培養容器。
(18)培養細胞の判別方法であって、(1)〜(17)のいずれかに記載の培養容器の細胞収容部の凹部に、受精卵、卵細胞、ES細胞及びiPS細胞からなる群から選択される細胞をそれぞれ導入して培養し、顕微鏡により取得した培養細胞の画像を検出装置によって撮像し、得られた像を輪郭抽出処理に付すことを含む、前記判別方法。
底壁に、凹部を有する細胞収容部が配置されており、
凹部が4個以上近接しており、
凹部の壁面が、凹部の最も低い位置から凹部の外縁に進むに従って高くなるような傾斜面を有し、
近接する凹部間のピッチが1mm以下である、
前記培養容器に関する。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
図2aに示す培養容器を、一般的な射出成形加工により製造した。まず、図2aの逆パターンの鋳型を加工し、該鋳型上へ加熱溶融したポリスチレン材料を流し込み、冷却、離型して傾斜付き培養容器Aを得た。該傾斜付き培養容器Aは、バイオクリーンベンチ内のUVライト下に40分程度置いて滅菌してから培養に用いた。
直径約35mmのポリスチレン製ディッシュを用意し、その底面へ直径0.4mmの貫通口を1mm間隔で加工して貫通口付きディッシュを得た。次に、貫通口付きディッシュの底面へ、ディッシュの外側からカバーガラスを接着して培養容器Bを得た(図4)。貫通孔の側面はカバーガラス接着には、接着剤を用いた。該培養容器Bは、バイオクリーンベンチ内のUVライト下に40分程度置いて滅菌してから培養に用いた。
図11〜16に示す培養容器Cを、一般的な射出成形加工により製造した。まず、図11の逆パターンの鋳型を加工し、磨き加工により平滑性を高めた。該鋳型上へ加熱溶融したポリスチレン材料を流し込み、冷却、離型して傾斜付き培養容器Cを得た。この培養容器Cの細胞収容部3には、5×5の正方格子状に配置された25個の凹部4が形成されている。製造した培養容器Cの外観写真を図17に示す。該傾斜付き培養容器Cは、エタノール中に1時間浸漬して洗浄した後、バイオクリーンベンチ内のUVライト下に40分程度置いて滅菌してから培養に用いた。なお、図12において、内壁5で囲まれた領域の直径dは7mmであり、図13及び14で示す凹部4のピッチaは420μmである。また、図15及び16において、凹部の直径rは270μm、深さLは150μmに設定した。さらに、円錐状に形成した壁面7について、円錐の中心線と母線とのなす角度αは83°に設定した。
鋳型の製造時に、磨き処理を施さない以外は上記製造例3と同様の手順で培養容器Dを製造した。図21に培養容器Dの凹部4の断面形状計測結果を示す。また、図22には、図21の右側傾斜面に対して、線形フィッティングを行い、さらに傾きを補正した図を示す。図22から、最大高さRyは4.9μmと求められた。
図23〜図28に示す培養容器Eを、上記製造例3と同様の手順で製造した。なお、培養容器Eでは、凹部4の壁面7を、凹部の最深部から凹部の外縁13へ向かって曲線状に高くなるような傾斜面としている。培養容器Eのその他の寸法は図11〜16に示す培養容器Cと同一である。
製造例1で製造した培養容器Aを用いて、ラット受精卵を培養し、観察した画像を用いて、受精卵の輪郭抽出処理を行った。
受精卵の輪郭を抽出するため、以下のような閾値処理を施した。
製造例3で製造した培養容器Cを用いて、マウス受精卵を培養し、観察した画像を用いて、受精卵の輪郭抽出処理を行った。
実施例2と同様に培養容器Cにウシ受精卵を導入した直後に、倍率4倍の観察装置(高倍率のレンズと撮像用カメラを備えている)で撮影し、一部を切り出した写真を図33に示す。実施例1と同様の閾値処理により、受精卵の輪郭を抽出した。図34は図33に対して閾値処理を行った画像である。製造例3の培養容器Cを用いた場合、閾値処理を施すことによって、図34に示すように、凹部の壁面の影響無くウシ受精卵の輪郭を識別することが可能であった。
実施例2と同様に培養容器Dにマウス受精卵を導入し初期の卵割をした後に、倍率10倍の観察装置(高倍率のレンズと撮像用カメラを備えている)で撮影した。実施例1と同様の閾値処理により、受精卵の輪郭を抽出したところ、凹部の壁面の影響無くマウス受精卵の輪郭を識別することが可能であった。しかしながら、細胞収容部の凹部の傾斜面が平滑化されていないため、透過率が低く、ノイズの影響があり、実施例2よりも識別が困難であった。
実施例2と同様に培養容器Eにマウス受精卵を導入し初期の卵割をした後に、倍率10倍の観察装置(高倍率のレンズと撮像用カメラを備えている)で撮影した。実施例1と同様の閾値処理により、受精卵の輪郭を抽出したところ、凹部の壁面の影響無くマウス受精卵の輪郭を識別することが可能であった。しかしながら、細胞収容部の凹部における傾斜面が培養容器Cのように直線状ではなく、曲率を有するため、受精卵が凹部の壁面に接触している確率が実施例2よりも高かった。以上の実施例2、4及び5の結果から、凹部の傾斜面は直線部分を含み且つRy値が小さいほど、細胞を凹部の中央に集めることができ、細胞の判別に有利であることが分かった。
比較例1として、製造例2で製造した培養容器Bを用いて、マウス受精卵を培養し、観察した画像を用いて、受精卵の輪郭抽出処理を行った。
Claims (15)
- 個別管理が必要とされる細胞を培養するための、底壁と側壁とを有する培養容器であって、
底壁に、凹部を有する細胞収容部が配置されており、
凹部が4個以上近接しており、
凹部の開口部が円形であり、
凹部の壁面が、凹部の最も低い位置から凹部の外縁に進むに従って高くなるような傾斜面を有し、かつ円錐状又は円錐台状の部分を有し、
近接する凹部間のピッチが1mm以下であり、
傾斜面の表面粗さについて、最大高さRyが1.0μm未満である、
前記培養容器。 - 凹部の壁面が、直線部分を含む傾斜面を有する、請求項1に記載の培養容器。
- 凹部の開口部の開口幅が100μm〜300μmである、請求項1又は2に記載の培養容器。
- 凹部の深さが50μm〜200μmである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の培養容器。
- 円錐又は円錐台の中心線と母線とのなす角度が89〜45°である、請求項1に記載の培養容器。
- 近接する凹部が、1mm2あたり1個以上の密度で配置されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の培養容器。
- 近接する4個以上の凹部が正方格子状又は最密充填状に配置されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の培養容器。
- 凹部が24個以上配置されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の培養容器。
- 細胞が、受精卵、卵細胞、ES細胞及びiPS細胞からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の培養容器。
- 細胞が、ウシの受精卵である、請求項9に記載の培養容器。
- 近接する4個以上の凹部が、それらを囲む内壁により、培養容器内のその他の部分と隔てられている、請求項1〜10のいずれか1項に記載の培養容器。
- 培養容器の外周部であって細胞収容部を有しない部分に液体収容部を有する、請求項11に記載の培養容器。
- 培養細胞の自動判別に使用するための、請求項1〜12のいずれか1項に記載の培養容器。
- 倍率4倍の対物レンズを用いて細胞収容部を顕微鏡観察したときに、観察視野内に4個以上の凹部が含まれる、請求項13に記載の培養容器。
- 培養細胞の判別方法であって、請求項1〜14のいずれか1項に記載の培養容器の細胞収容部の凹部に、受精卵、卵細胞、ES細胞及びiPS細胞からなる群から選択される細胞をそれぞれ導入して培養し、顕微鏡により取得した培養細胞の画像を検出装置によって撮像し、得られた像を輪郭抽出処理に付すことを含む、前記判別方法。
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