KR20160015227A - 항-세포벽 테이코산 항체 및 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-세포벽 테이코산 항체 및 그의 항생제 접합체, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-세포벽 테이코산 항체 및 접합체{ANTI-WALL TEICHOIC ANTIBODIES AND CONJUGATES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 그 전부가 본원에 참고로 포함된, 2013년 5월 31일 출원된 미국 특허 가출원 61/829,461의 35 USC §119(e) 하의 우선권을 주장하는, 37 CFR §1.53(b) 하에 출원된 정규 출원인 미국 특허 출원 14/284,609 (2014년 5월 22일 출원)을 기초로 한 우선권을 주장한다.
ASCII 텍스트 파일 형태의 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일로 다음과 같이 제출된 내용은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다:
서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) (파일명: P4960R2WO_PCTSequenceListing.txt, 기록일: 2014년 5월 30일, 크기: 195,240 바이트).
발명의 분야
본 발명은 리파마이신-유형 항생제에 접합된 항-세포벽 테이코산 ("항-WTA") 항체 및 생성되는 항체-항생제 접합체의 감염성 질환 치료에서의 용도에 관한 것이다.
병원성 박테리아는 인간과 동물 모두에서 질병과 사망의 주요 원인이다. 이들 중에서 세계적으로 인간에서의 박테리아 감염의 주요 원인인 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (에스. 아우레우스; SA)가 유명하다. 에스. 아우레우스는 작은 피부 감염으로부터 치명적인 질환, 예컨대 폐렴, 수막염, 골수염, 심내막염, 독성 쇼크 증후군 (TSS), 균혈증 및 패혈증까지 다양한 질병을 야기할 수 있다. 그의 발생 범위는 피부, 연부 조직, 호흡기, 뼈, 관절, 혈관내 감염부터 상처 감염까지 포함한다. 이것은 아직도 병원성 감염의 가장 흔한 5가지 원인 중 하나이고, 종종 수술후 상처 감염을 유발한다. 매년 미국 병원에서 대략 500,000명의 환자가 스타필로코쿠스 감염에 걸린다.
지난 수십 년에 걸쳐서 에스. 아우레우스 감염은 모든 알려진 베타-락탐 항생제에 내성인 메티실린-내성 에스. 아우레우스 (MRSA)의 출현 때문에 치료가 점점 더 어려워지고 있다 (Boucher, H.W. et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 48, 1-12 (2009)). 상황은 매우 급박하여, 2005년도까지 MRSA 감염은 미국에서 15,000명을 초과하는 사망의 원인이 되는, 단일 감염성 물질에 의한 주된 원인으로 보고되었다 (DeLeo, F.R. & Chambers, H.F. Reemergence of antibiotic-resistant Staphylococcus aureus in the genomics era. The Journal of Clinical Investigation 119:2464-2474 (2009)). 반코마이신, 리네졸리드 및 답토마이신은 침습성 MRSA 감염의 치료를 위해 선택되는 항생제가 되고 있다 (Boucher, H., Miller, L.G. & Razonable, R.R. Serious infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 51 Suppl 2, S183-197 (2010)). 그러나, 반코마이신에 대한 감수성 저하 및 리네졸리드 및 답토마이신에 대한 교차 내성이 또한 MRSA 임상 균주에서 보고되었다 (Nannini, E., Murray, B.E. & Arias, C.A. Resistance or decreased susceptibility to glycopeptides, daptomycin, and linezolid in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Current opinion in pharmacology 10, 516-521 (2010)). 시간이 흐르면서, 내성을 극복하기 위해 필요한 반코마이신 용량은 신독성 발생 수준까지 조금씩 상승하였다. 따라서, 침습성 MRSA 감염으로 인한 사망률 및 이환율은 이들 항생제에도 불구하고 높게 유지되고 있다.
SA는 일반적으로 세포외 병원체인 것으로 생각되지만, 적어도 50년을 거슬러 올라간 조사는 이것이 다양한 종류의 숙주 세포, 전문적인 포식세포 및 비-포식 세포 모두에서 감염 및 생존하는 능력을 보여주었다 ([Gresham, H.D. et al. Survival of Staphylococcus aureus inside neutrophils contributes to infections. J Immunol 164, 3713-3722 (2000)]; [Anwar, S., Prince, L.R., Foster, S.J., Whyte, M.K. & Sabroe, I. The rise and rise of Staphylococcus aureus: laughing in the face of granulocytes. Clinical and Experimental Immunology 157, 216-224 (2009)]; [Fraunholz, M. & Sinha, B. Intracellular staphylococcus aureus: Live-in and let die. Frontiers in cellular and infections microbiology 2, 43 (2012)]; [Garzoni, C. & Kelley, W.L. Return of the Trojan horse: intracellular phenotype switching and immune evasion by Staphylococcus aureus. EMBO molecular medicine 3:115-117 (2011)]). 이러한 능력이 세포내에서 지속되면 숙주 면역 회피, 장기간의 숙주 정착, 만성적으로 감염된 상태의 유지가 가능하게 되며, 이것이 통상적인 항생제 요법 후의 임상 실패 및 재발의 원인인 것으로 보인다. 또한, 세포내 박테리아가 최적 미만 농도의 항생제에 노출되면 항생제 내성 균주의 출현이 촉진되고, 이에 따라 상기 임상 문제가 보다 심각해질 수 있다. 이러한 관찰과 일치하게, 반코마이신 또는 답토마이신을 사용한 침습성 MRSA 감염, 예컨대 균혈증 또는 심내막염 환자의 치료는 50% 초과의 실패율과 연관되었다 ([Kullar, R., Davis, S.L., Levine, D.P. & Rybak, M.J. Impact of vancomycin exposure on outcomes in patients with methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia: support for consensus guidelines suggested targets. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 52, 975-981 (2011)]; [Fowler, V.G., Jr. et al. Daptomycin versus standard therapy for bacteremia and endocarditis caused by Staphylococcus aureus. The New England journal of medicine 355, 653-665 (2006)]; [Yoon, Y.K., Kim, J.Y., Park, D.W., Sohn, J.W. & Kim, M.J. Predictors of persistent methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia in patients treated with vancomycin. The Journal of antimicrobial chemotherapy 65:1015-1018 (2010)]). 따라서, 보다 성공적인 항-스타필로코쿠스 요법은 세포내 박테리아의 제거를 포함하여야 한다.
대부분의 현재의 항박테리아제는 다양한 천연 화합물의 반합성 (semisynthetic) 변형물이다. 이들은 예를 들어 페니실린 (페니실리움(Penicillium) 속의 진균에 의해 생산됨), 세팔로스포린, 및 카르바페넴을 포함하는 베타-락탐 항박테리아제이다. 살아있는 유기체로부터 계속 단리되는 항미생물 화합물은 아미노글리코시드를 포함하는 반면, 다른 항박테리아제 - 예를 들어 술폰아미드, 퀴놀론, 및 옥사졸리디논은 화학적 합성에 의해서만 생산된다. 이에 따라, 많은 항박테리아 화합물은 화학적/생합성 기원에 기초하여 천연, 반합성, 및 합성으로 분류된다. 또 다른 분류 시스템은 생물학적 활성에 기초하고; 이 분류에서, 항박테리아제는 미생물에 대한 그의 생물학적 효과에 따라 2개의 넓은 군으로 분류된다: 살박테리아제는 박테리아를 죽이고, 정균제는 박테리아 성장을 느리게 하거나 멈추게 한다.
안사마이신은 박테리아 RNA 폴리머라제를 억제하고 그람 양성 및 선택적 그람 음성 박테리아에 대해 예외적인 효능을 갖는, 리파마이신, 리팜핀, 리팜피신, 리파부틴, 리파펜틴, 리팔라질, ABI-1657 및 그의 유사체를 포함하는 항생제의 클래스이다 ([Rothstein, D.M., et al. (2003) Expert Opin. Invest. Drugs 12(2):255-271]; US 7342011; US 7271165).
에스. 아우레우스 (MRSA 포함) 감염의 예방 및 치료를 위한 면역요법이 보고되었다. US2011/0262477은 MRSA에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 백신으로서 박테리아 부착 단백질 Eap, Emp 및 AdsA의 용도에 관한 것이다. WO2000/071585에는 특이적인 에스. 아우레우스 균주 단리물에 대해 반응성인 단리된 모노클로날 항체가 기재되어 있다. US20110059085 A1은 하나 이상의 SA 피막 항원에 특이적인 IgM Ab를 이용하는 Ab-기반 전략을 제시하지만, 실제 항체는 기재되어 있지 않다.
테이코산 (TA)은 SA를 포함하는 그람 양성 박테리아의 세포벽 내에서 발견되는 박테리아 다당류이다. 세포벽 테이코산 (WTA)은 세포벽의 펩티도글리칸 (PDG) 층에 공유 연결되는 것인 반면, 리포테이코산 (LTA)은 세포질 막의 지질에 공유 연결되는 것이다 (Xia et al. (2010) Intl. J. Med. Microbiol. 300:148-54). 이들 당고분자는 불리한 조건 하에 및 다른 기본적인 세포 과정에서 박테리아 생존에서 중대한 역할을 수행한다. 알려진 WTA 구조는 박테리아 종마다 크게 상이하다. 에스. 아우레우스 TA는 반복적인 폴리올 포스페이트 하위단위, 예컨대 리비톨 포스페이트 또는 글리세롤 포스페이트로 이루어진다. 그의 구조적 다양성 및 가변성을 고려할 때, WTA는 항체에 대한 매력적인 표적 및 백신으로 고려된다 (상기 문헌).
면역접합체로도 알려진 항체-약물 접합체 (ADC)는, 효능있는 세포독성 약물을 항원-발현 종양 세포에 표적화시키고 (Teicher, B.A. (2009) Curr. Cancer Drug Targets 9:982-1004), 이에 의해 효능을 최대화하고 표적을 벗어난 독성을 최소화하여 치료 지수를 향상시킴으로써 ([Carter, P.J. and Senter P.D. (2008) The Cancer J.. 14(3):154-169]; [Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107]), 항체 및 세포독성 약물 둘 모두의 이상적인 특성을 조합한 표적화된 화학요법 분자이다. ADC는 링커 단위를 통해 세포독성 약물 모이어티에 공유 부착된 표적화 항체를 포함한다. 비접합된 약물의 전신 투여가 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 대해 허용되지 않는 독성 수준을 야기할 수 있는 경우에, 면역접합체는 약물 모이어티의 종양으로의 표적화된 전달, 및 세포내 축적을 허용한다 (Polakis P. (2005) Curr. Opin. Pharmacol. 5:382-387). 제시된 표적 항원에 대한 효과적인 ADC의 개발은 파라미터, 예컨대 표적 항원 발현 수준, 종양 접근가능성 (Kovtun, Y.V. and Goldmacher V.S. (2007) Cancer Lett. 255:232-240), 항체 선택 (US 7964566), 링커 안정성 (Erickson et al. (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433]; [Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124]; [Alley et al. (2008) Bioconjugate Chem. 19:759-765), 세포독성 약물 작용 메카니즘 및 효력, 약물 로딩 (Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070) 및 항체에 대한 링커-약물 접합 방식 ([Lyon, R. et al. (2012) Methods in Enzym. 502:123-138]; [Xie et al. (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291]; [Kovtun et al. (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121]; [Law et al. (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337]; [Wu et al. (2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145]; [Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549]; [Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9): 1087-1103]; [Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212]; [Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337]; [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Res. 19:605-614])의 최적화에 따라 결정된다.
암 요법에서 ADC의 개념은 또한 항박테리아 요법으로 확장되었고, 이 경우에 약물 부분은 항생제이고, 항체-항생제 접합체 (AAC)를 생성한다. US 5545721 및 US 6660267에는 항생제를 통해 표적 박테리아의 표면에 결합하는 비-특이적 이뮤노글로불린-항생제 접합체 및 그의 패혈증 치료를 위한 용도가 기재되어 있다. US 7569677 및 관련 특허는 박테리아 항원 (예컨대, SA 피막 다당류)에 특이적인 항원-결합 부분을 갖지만 박테리아 Fc-결합 단백질 (예를 들어, 스타필로코쿠스 단백질 A)과 반응하는 불변 영역이 결여된 항생제-접합된 항체를 예언적으로 제시한다.
본 발명은 공유 부착에 의해 하나 이상의 리파마이신-유형 항생제 모이어티에 접합된 항체를 포함하는, "항체-항생제 접합체", 또는 "AAC"로 언급되는 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 측면은 경쇄 및 H 쇄를 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체이고, 여기서 L 쇄는 CDR L1, CDR L2, 및 CDR L3을 포함하고, H 쇄는 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함하고, CDR L1, CDR L2 및 CDR L3 및 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3은 표 6A 및 6B에 제시된 바와 같이 각각의 Ab 4461 (서열 1-6), 4624 (서열 7-12), 4399 (서열 13-18), 및 6267 (서열 19-24)의 CDR의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 VH는 각각 항체 4461, 4624, 4399, 및 6267의 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32의 VH 서열로부터 선택된 VH 영역의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 L 쇄 가변 영역 (VL)을 추가로 포함하고, 여기서 VL은 각각 항체 4461, 4624, 4399, 및 6267의 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31의 VL 서열로부터 선택된 VL 영역의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 L 쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VL은 각각 항체 4461, 4624, 4399, 및 6267의 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31의 VL 서열로부터 선택된 VL 영역의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다. 임의의 선행 실시양태에서, 서열 동일성은 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다.
보다 구체적인 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다:
(i) 서열 25의 VL 및 서열 26의 VH;
(ii) 서열 27의 VL 및 서열 28의 VH;
(iii) 서열 29의 VL 및 서열 30의 VH; 또는
(iv) 서열 31의 VL 및 서열 32의 VH.
일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA (세포벽 테이코산) 모노클로날 항체는 경쇄 (L) 및 중쇄 (H)를 포함하고, 여기서
(a) L 쇄는 KSSQSVLSRANNNYYVA (서열 1)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTREF (서열 2)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYYTSRRT (서열 3)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 DYYMH (서열 4)의 서열을 포함하는 CDR H1, WINPKSGGTNYAQRFQG (서열 5)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DCGSGGLRDF (서열 6)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(b) L 쇄는 RSNQNLLSSSNNNYLA (서열 7)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTRES (서열 8)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYYANPRT (서열 9)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 DYYIH (서열 10)의 서열을 포함하는 CDR H1, WINPNTGGTYYAQKFRD (서열 11)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DCGRGGLRDI (서열 12)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(c) L 쇄는 KSNQNVLASSNDKNYLA (서열 13)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASIRES (서열 14)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYYTNPRT (서열 15)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 DYYIH (서열 16)의 서열을 포함하는 CDR H1, WINPNTGGTNYAQKFQG (서열 17)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DCGNAGLRDI (서열 18)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나; 또는
(d) L 쇄는 KSSQNVLYSSNNKNYLA (서열 19)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTRES (서열 20)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYYTSPPYT (서열 21)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYWIG (서열 22)의 서열을 포함하는 CDR H1, IIHPGDSKTRYSPSFQG (서열 23)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 LYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGV (서열 24)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함한다.
임의의 하나의 선행 실시양태에서, 항체는 Fc 영역이 결여된 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 F(ab) 또는 F(ab')2이다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 여기서 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역은 시스테인 잔기로 치환된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 아미노산 치환 A118C 및/또는 S400C를 포함하고/하거나, 경쇄 불변 영역은 아미노산 치환 V205C를 포함하고, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 149의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 경쇄 불변 영역은 서열 151의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 149의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 불변 영역은 서열 150의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 148의 아미노산 서열을 포함하고,경쇄 불변 영역은 서열 151의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 임의의 하나의 선행 실시양태의 Ab는 WTA 알파에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 경쇄 및 H 쇄를 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체를 제공하고, L 쇄는 CDR L1, CDR L2, 및 CDR L3을 포함하고/하거나 H 쇄는 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함하고, 여기서 CDR L1, CDR L2, 및 CDR L3 및 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3은 도 14에 제시된 각각의 Ab의 대응하는 CDR의 아미노산 서열 (서열 33-110)을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 경쇄 및 H 쇄를 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체를 제공하고, 여기서 L 쇄는 CDR L1, CDR L2, 및 CDR L3을 포함하고/하거나 H 쇄는 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함하고, 여기서 CDR L1, CDR L2, 및 CDR L3 및 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3은 도 15a, 15b, 16a 및 16b에 제시된 각각의 Ab의 대응하는 CDR의 아미노산 서열을 포함한다 (항체 6078, 6078.v2HC-Cys, 6078.v2LC-Cys, 6078.v3HC-Cys, 6078.v3LC-Cys, 6078.v4HC-Cys, 6078.v4LC-Cys, 6078.v4HCLC-Cys, 4497, 4497.v8HC-Cys, 4497.v8LC-Cys, 및 4497.v8HCLC-Cys). 구체적인 실시양태에서, 이들 Ab는 WTA 베타에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 L 쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체, 구체적으로 항-WTA 베타 모노클로날 항체를 제공하고, 여기서 VL은 각각 카바트 위치 1-107에서 도 17aa 내지 17ab에 제시된 바와 같이, 각각의 항체 6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253, 4497, 및 4487에 대응하는 VL 서열로부터 선택된 VL 영역의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 항체는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, 여기서 VH는 각각 카바트 위치 1-113에서 도 17ba 내지 17bb에 제시된 바와 같이, 각각의 항체 6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253, 4497, 및 4487에 대응하는 VH 서열로부터 선택된 VH 영역의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다. 임의의 선행 실시양태에서, 서열 동일성은 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 항체의 보다 구체적인 실시양태에서, VH는 서열 112의 서열을 포함하고, VL은 서열 111을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 L 쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체, 구체적으로 항-WTA 베타 모노클로날 항체를 제공하고, 여기서 VL은 카바트 위치 1-107에서 도 15a 또는 16a에 제시된 바와 같이, 각각의 항체 (항체 6078, 6078.v2HC-Cys, 6078.v2LC-Cys, 6078.v3HC-Cys, 6078.v3LC-Cys, 6078.v4HC-Cys, 6078.v4LC-Cys, 6078.v4HCLC-Cys, 4497, 4497.v8HC-Cys, 4497.v8LC-Cys, 및 4497.v8HCLC-Cys)에 대응하는 VL 서열로부터 선택된 VL 영역의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 항체는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, 여기서 VH는 카바트 위치 1-113에서 도 15b 및 16b에 제시된 바와 같이, 각각의 항체 (항체 6078, 6078.v2HC-Cys, 6078.v2LC-Cys, 6078.v3HC-Cys, 6078.v3LC-Cys, 6078.v4HC-Cys, 6078.v4LC-Cys, 6078.v4HCLC-Cys, 4497, 4497.v8HC-Cys, 4497.v8LC-Cys, 및 4497.v8HCLC-Cys)에 대응하는 VH 서열로부터 선택된 VH 영역의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다. 임의의 선행 실시양태에서, 서열 동일성은 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다.
특정 실시양태에서, 단리된 항-WTA 베타 항체는 경쇄가 서열 115의 서열을 포함하고 조작된 시스테인을 갖는 H 쇄가 서열 116의 서열을 포함하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 경쇄가 서열 115의 서열을 포함하고 조작된 시스테인을 갖는 H 쇄가 서열 117의 서열을 포함하는 것이고, 여기서 X는 M, I 또는 V이다. 상이한 실시양태에서, 서열 113의 서열을 포함하는 L 쇄는 서열 117의 Cys-조작된 H 쇄 변이체와 쌍을 이루고; 변이체는 X가 M, I 또는 V인 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 또 다른 단리된 항-WTA 베타 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열 120에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열 119에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 추가로 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 항-WTA 베타 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서 L 쇄는 서열 119의 VL 서열을 포함하고, H 쇄는 서열 120의 VH 서열을 포함한다. 추가의 보다 구체적인 실시양태에서, WTA 베타에 결합하는 단리된 항체는 서열 121의 L 쇄 및 서열 122의 H 쇄를 포함한다.
항-WTA 베타 Cys-조작된 H 및 L 쇄 변이체는 본 발명의 항-WTA AAC를 생성하기 위해 링커-Abx 중간체에 접합시키기 위한 전체 Ab를 형성하기 위해 임의의 다음 조합으로 쌍을 이룰 수 있다. 한 실시양태에서, L 쇄는 서열 121의 서열을 포함하고, H 쇄는 서열 124의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 항체는 서열 123의 L 쇄 및 서열 124 또는 서열 157의 서열을 포함하는 H 쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-WTA 베타 항체 및 항-WTA 베타 AAC는 서열 123의 L 쇄를 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태는 도 13a 및 도 13b의 각각의 항-WTA 알파 Ab와 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한, 도 14, 도 15a 및 15b, 도 16a 및 16b, 및 도 17a 및 17b의 각각의 항-WTA 베타 Ab와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-WTA 베타 및 항-WTA 알파 항체는 Fc 영역이 결여된 항원-결합 단편, 바람직하게는 F(ab')2 또는 F(ab)이다. 따라서, 본 발명은 WTA 항체가 F(ab')2 또는 F(ab)인 항체-항생제 접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 WTA 베타에 결합하는 항-WTA 모노클로날 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA (세포벽 테이코산) 모노클로날 항체는 경쇄 (L) 및 중쇄 (H)를 포함하고, 여기서
(a) L 쇄는 RASQTISGWLA (서열 33)의 서열을 포함하는 CDR L1, KASTLES (서열 34)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYKSYSFN (서열 35)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYDIN (서열 36)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNANSGNTGYAQKFQG (서열 37)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 SSILVRGALGRYFDL (서열 38)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(b) L 쇄는 RASQTISGWLA (서열 39)의 서열을 포함하는 CDR L1, KASTLES (서열 40)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYKSYSFN (서열 41)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYDIN (서열 42)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNANSGNTGYAQKFQG (서열 43)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 SSILVRGALGRYFDL (서열 44)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(c) L 쇄는 RASQFVSRTSLA (서열 45)의 서열을 포함하는 CDR L1, ETSSRAT (서열 46)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 HKYGSGPRT (서열 47)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 NYDFI (서열 48)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNPNSYNTGYGQKFQG (서열 49)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 AVRGQLLSEY (서열 50)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(d) L 쇄는 RASQSVSSSYLA (서열 51)의 서열을 포함하는 CDR L1, DASSRAT (서열 52)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QKYGSTPRP (서열 53)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYDIN (서열 54)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNPNSGNTNYAQRFQG (서열 55)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 ERWSKDTGHYYYYGMDV (서열 56)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(e) L 쇄는 RASLDITNHLA (서열 57)의 서열을 포함하는 CDR L1, EASILQS (서열 58)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 EKCNSTPRT (서열 59)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 NYDIN (서열 60)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNPSSGRTGYAPKFRG (서열 61)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 GGGYYDSSGNYHISGLDV (서열 62)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(f) L 쇄는 RASQSVGAIYLA (서열 63)의 서열을 포함하는 CDR L1, GVSNRAT (서열 64)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QLYTSSRALT (서열 65)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 AYAMN (서열 66)의 서열을 포함하는 CDR H1, SITKNSDSLYYADSVKG (서열 67)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 LAARIMATDY (서열 68)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(g) L 쇄는 RASQGIRNGLG (서열 69)의 서열을 포함하는 CDR L1, PASTLES (서열 70)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 LQDHNYPPT (서열 71)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 YYSMI (서열 72)의 서열을 포함하는 CDR H1, SIDSSSRYLYYADSVKG (서열 73)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DGDDILSVYRGSGRPFDY (서열 74)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(h) L 쇄는 RASQGIRNGLG (서열 75)의 서열을 포함하는 CDR L1, PASTLES (서열 76)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 LQDHNYPPS (서열 77)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 YYSMI (서열 78)의 서열을 포함하는 CDR H1, SIDSSSRYRYYTDSVKG (서열 79)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DGDDILSVYQGSGRPFDY (서열 80)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(i) L 쇄는 RASQSVRTNVA (서열 81)의 서열을 포함하는 CDR L1, GASTRAS (서열 82)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 LQYNTWPRT (서열 83)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 TNDMS (서열 84)의 서열을 포함하는 CDR H1, TIIGIDDTTHYADSVRG (서열 85)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 NSGIYSF (서열 86)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(j) L 쇄는 RASQDIGSSLA (서열 87)의 서열을 포함하는 CDR L1, ATSTLQS (서열 88)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQLNNYVHS (서열 89)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 DYAMG (서열 90)의 서열을 포함하는 CDR H1, VVTGHSYRTHYADSVKG (서열 91)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 RIWSYGDDSFDV (서열 92)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(k) L 쇄는 RASQSIGDRLA (서열 93)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASNLEG (서열 94)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYKSQWS (서열 95)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYAMN (서열 96)의 서열을 포함하는 CDR H1, YISSIETIYYADSVKG (서열 97)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DRLVDVPLSSPNS (서열 98)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(l) L 쇄는 KSSQSIFRTSRNKNLLN (서열 99)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTRKS (서열 100)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYFSPPYT (서열 101)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SFWMH (서열 102)의 서열을 포함하는 CDR H1, FTNNEGTTTAYADSVRG (서열 103)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 GDGGLDD (서열 104)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
(m) L 쇄는 RASQFTNHYLN (서열 105)의 서열을 포함하는 CDR L1, VASNLQS (서열 106)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQSYRTPYT (서열 107)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SGYYN (서열 108)의 서열을 포함하는 CDR H1, YILSGAHTDIKASLGS (서열 109)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 SGVYSKYSLDV (서열 110)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나; 또는
(n) L 쇄는 KSSQSIFRTSRNKNLLN (서열 99)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTRKS (서열 100)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYFSPPYT (서열 101)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SFWMH (서열 102)의 서열을 포함하는 CDR H1, FTNNEGTTTAYADSVRG (서열 103)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 GEGGLDD (서열 118)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 112의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 112의 위치 1의 아미노산 Xaa는 Q 또는 E이고, 서열 112의 위치 2의 아미노산 Xaa는 M, I 또는 V이다. 일부 실시양태에서, 항체는 경쇄 가변 영역 (VL)을 추가로 포함하고, 여기서 VL은 서열 111의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 111의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 선행 실시양태에서, 서열 동일성은 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 VH는 서열 112의 서열을 포함하고, 항체의 VL은 서열 111의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 120 또는 서열 156의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 경쇄 가변 영역 (VL)을 추가로 포함하고, 여기서 VL은 서열 119의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 119의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 선행 실시양태에서, 서열 동일성은 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 119의 서열을 포함하고, VH는 서열 120 또는 서열 156의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 158, 서열 159, 서열 160, 서열 161, 서열 162, 서열 163, 서열 164, 서열 165, 서열 166, 서열 167, 및 서열 168의 VL 서열로부터 선택된 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 서열 127, 서열 133, 서열 134, 서열 169, 서열 170, 서열 171, 서열 172, 서열 173, 서열 174, 서열 175, 및 서열 176의 VH 서열로부터 선택된 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 임의의 선행 실시양태에서, 서열 동일성은 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서
(a) 항체의 VL은 서열 158의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 169의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
(b) 항체의 VL은 서열 159의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 170의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
(c) 항체의 VL은 서열 160의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 171의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
(d) 항체의 VL은 서열 161의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 172의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
(e) 항체의 VL은 서열 162의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 173의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
(f) 항체의 VL은 서열 163의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 174의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
(g) 항체의 VL은 서열 164의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 175의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
(h) 항체의 VL은 서열 165의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 176의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
(i) 항체의 VL은 서열 166의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 133의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
(j) 항체의 VL은 서열 167의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 134의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(k) 항체의 VL은 서열 168의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 127의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서
(a) 항체의 VL은 서열 158의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 169의 VH 서열을 포함하거나;
(b) 항체의 VL은 서열 159의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 170의 VH 서열을 포함하거나;
(c) 항체의 VL은 서열 160의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 171의 VH 서열을 포함하거나;
(d) 항체의 VL은 서열 161의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 172의 VH 서열을 포함하거나;
(e) 항체의 VL은 서열 162의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 173의 VH 서열을 포함하거나;
(f) 항체의 VL은 서열 163의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 174의 VH 서열을 포함하거나;
(g) 항체의 VL은 서열 164의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 175의 VH 서열을 포함하거나;
(h) 항체의 VL은 서열 165의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 176의 VH 서열을 포함하거나;
(i) 항체의 VL은 서열 166의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 133의 VH 서열을 포함하거나;
(j) 항체의 VL은 서열 167의 VL 서열을 포함하고, VH는 서열 134의 VH 서열을 포함하거나;
(k) 항체의 VL은 서열 168의 VL 서열을 포함하고, VH는 서열 127의 VH 서열을 포함하거나;
(l) 항체의 VL은 서열 113의 VL 서열을 포함하고, VH는 서열 114의 VH 서열을 포함하거나; 또는
(m) 항체의 VL은 서열 121의 VL 서열을 포함하고, VH는 서열 138의 VH 서열을 포함한다.
상기한 항체의 일부 실시양태에서, 항체는 Fc 영역이 결여된 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 F(ab) 또는 F(ab')2이다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 여기서 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역은 시스테인 잔기로 치환된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 아미노산 치환 A118C 또는 S400C를 포함하고/하거나, 경쇄 불변 영역은 아미노산 치환 V205C를 포함하고, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 149의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 경쇄 불변 영역은 서열 151의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 149의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 불변 영역은 서열 150의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 148의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 불변 영역은 서열 151의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서 항체의 중쇄는 서열 114, 서열 116, 또는 서열 117의 서열을 포함하고, 항체의 경쇄는 서열 113의 서열을 포함하고; 서열 116 또는 서열 117의 위치 2의 아미노산 Xaa는 M, I 또는 V이다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서 항체의 중쇄는 서열 114, 서열 116, 또는 서열 117의 서열을 포함하고, 항체의 경쇄는 서열 115의 서열을 포함하고; 서열 116 또는 서열 117의 위치 2의 아미노산 Xaa는 M, I 또는 V이다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서 항체의 중쇄는 서열 139, 서열 140, 서열 141, 서열 142, 서열 143, 및 서열 144로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고; 항체의 경쇄는 서열 113의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서 항체의 중쇄는 서열 139, 서열 140, 서열 141, 서열 142, 서열 143, 및 서열 144로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고; 항체의 경쇄는 서열 115의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열 146, 서열 147, 서열 157 또는 서열 124의 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 121의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열 146, 서열 147, 서열 157 또는 서열 124의 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 123의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열 146, 서열 147, 서열 157 또는 서열 124의 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 145의 서열을 포함한다.
상기한 임의의 항체의 일부 실시양태에서, 항체는 IgM 이소형이 아니다. 상기한 임의의 항체의 일부 실시양태에서, 항체는 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgE, IgD, 또는 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2) 이소형이다. 상기한 임의의 항체의 일부 실시양태에서, 항체는 세포 배양액 내의 숙주 세포에서 생산된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 비-인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물 세포)이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 임의의 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 임의의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물 세포)이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명은 핵산의 발현에 적합한 조건 하에 본원에 개시된 임의의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고; 세포에 의해 생산되는 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체의 생산 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체의 정제를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 펩티드 링커에 의해 리파마이신-유형 항생제에 공유 부착된 본 발명의 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체를 포함하는 항체-항생제 접합체 (AAC) 화합물이다. 본원에 개시된 항체-항생제 접합체의 일부 실시양태에서, 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체는 스타필로코쿠스 아우레우스에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-세포벽 테이코산 항체는 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA)에 결합한다.
본원에 개시된 항체-항생제 접합체의 일부 실시양태에서, 항체는 i) 서열 99-104의 L 쇄 및 H 쇄 CDR 또는 서열 33-38의 L 쇄 및 H 쇄 CDR; 또는 ii) 서열 120 또는 서열 156의 VH와 쌍을 이룬 서열 119 또는 서열 123의 VL; 또는 iii) 서열 112의 VH와 쌍을 이룬 서열 111의 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리파마이신-유형 항생제는 리팔라질-유형 항생제이다. 일부 실시양태에서, 리파마이신-유형 항생제는 펩티드 링커에 부착된 4급 아민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항생제는 항-WTA 항체의 조작된 시스테인에 부착된 펩티드 링커를 통해 항체에 부착된다. 조작된 시스테인은 변형된 항체의 L 또는 H 쇄에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 잔기는 L 쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, 시스테인 잔기는 H 쇄에 존재한다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물은 에스. 아우레우스 시스테인 프로테아제 절단가능한 링커인 펩티드 링커를 포함할 수 있고; 상기 링커는 스타포파인 B 또는 스타포파인 A 절단가능한 링커를 포함한다. 한 실시양태에서, 에스. 아우레우스 프로테아제는 엔도펩티다제이다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 숙주 프로테아제 절단가능한 링커, 바람직하게는 인간 프로테아제 카텝신 B 절단가능한 링커 (예를 들어, val-cit 디펩티드 링커)이다.
항체-항생제 접합체 화합물의 예시적인 실시양태는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00001
상기 식에서,
Ab는 항-세포벽 테이코산 항체이고;
L은 화학식 로 표시되는 펩티드 링커이고,
여기서, Str은 스트레처 (stretcher) 단위이고; Pep는 2 내지 12개 아미노산 잔기의 펩티드이고, Y는 스페이서 단위이고;
abx는 리파마이신-유형 항생제이고;
p는 1 내지 8의 정수이다.
한 실시양태에서, 임의의 선행 실시양태의 항체-항생제 접합체 화합물의 항생제 항체 비 (AAR)는 2 또는 4이다.
일부 실시양태에서, 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식 I로 표시된다:
<화학식 I>
Figure pct00003
상기 식에서,
파선은 임의의 결합을 나타내고;
R은 H, C1-C12 알킬, 또는 C(O)CH3이고;
R1은 OH이고;
R2는 CH=N-(헤테로시클릴)이고, 여기서 헤테로시클릴은 C(O)CH3, C1-C12 알킬, C1-C12 헤테로아릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 및 C3-C12 카르보시클릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환되거나;
또는 R1 및 R2는 5원 또는 6원의 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴을 형성하고, 임의로 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리를 형성하고, 여기서 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 또는 OH로 임의로 치환되고;
L은 R2에 부착된 펩티드 링커 또는 R1 및 R2에 의해 형성된 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;
Ab는 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체이다.
일부 상기 실시양태에서, 화학식 I의 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00004
상기 식에서,
R3은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고;
n은 1 또는 2이고;
R4는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 및 OH로부터 선택되고;
Z는 NH, N(C1-C12 알킬), O 및 S로부터 선택된다.
일부 상기 실시양태에서, 화학식 I의 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00005
상기 식에서, R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; n은 0 또는 1이다.
일부 상기 실시양태에서, 화학식 I의 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00006
상기 식에서, R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; n은 0 또는 1이다.
일부 상기 실시양태에서, 화학식 I의 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00007
상기 식에서, R5는 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; n은 0 또는 1이다.
일부 상기 실시양태에서, 화학식 I의 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00008
상기 식에서, R3은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; n은 1 또는 2이다.
일부 특정 실시양태에서, 화학식 I의 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00009
일부 실시양태에서, 펩티드 링커에 의해 리파마이신-유형 항생제에 공유 부착된 본 발명의 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체를 포함하는 항체-항생제 접합체 (AAC) 화합물이 제공되고, 여기서 펩티드 링커는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00010
상기 식에서, Str은 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체에 공유 부착된 스트레처 단위이고; Pep는 2 내지 12개 아미노산 잔기의 펩티드이고, Y는 리파마이신-유형 항생제에 공유 부착된 스페이서 단위이다. 일부 상기 실시양태에서, Str은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00011
상기 식에서, R6은 C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 카르보시클로, -O-(C1-C8 알킬)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보시클로)-, -(C3-C8 카르보시클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로시클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로시클로)-, -(C3-C8 헤테로시클로)-C1-C10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로 이루어지는 군으로부터 선택되고; r은 1 내지 10의 정수이다. 한 변형에서, R6은 -(CH2)5-이다. 일부 상기 실시양태에서, Pep는 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 리신, 아르기닌, 발린, 및 시트룰린으로부터 독립적으로 선택되는 2 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함한다. 한 변형에서, Pep는 발린-시트룰린 (val-cit, vc); 페닐알라닌-리신 (fk); GGAFAGGG (서열 126); tpm-cit; GPImeLFF (서열 129); 발린-시트룰린-페닐알라닌 (val-cit-phe); GGAFA (서열 131); 및 LAFG (서열 128)로부터 선택된다. 일부 상기 실시양태에서, Y는 파라-아미노벤질 또는 파라-아미노벤질옥시카르보닐을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00012
상기 식에서, Ab, Str, Y 및 abx는 본원에 정의된 바와 같고, AA1 및 AA2는 아미노산 측쇄로부터 독립적으로 선택된다. 일부 상기 실시양태에서, 아미노산 측쇄는 H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, 및 -CH2CH2CH2NHC(O)NH2로부터 독립적으로 선택된다. 일부 상기 실시양태에서, 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다.
Figure pct00013
Figure pct00014
일부 상기 실시양태에서, 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00015
상기 식에서, R7은 H 및 C1-C12 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 일부 상기 실시양태에서, 항체-항생제 접합체 화합물은 하기 화학식으로 표시된다.
Figure pct00016
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물을 포함하는 제약 조성물이다.
본 발명의 또 다른 측면은 환자에게 치료 유효량의 임의의 상기 실시양태의 항체-항생제 접합체 화합물을 투여함으로써 박테리아 감염을 치료하는 방법이다. 한 실시양태에서, 환자는 인간이다. 한 실시양태에서, 박테리아 감염은 스타필로코쿠스 아우레우스 감염이다. 일부 실시양태에서, 환자는 스타필로코쿠스 아우레우스 감염으로 진단되었다. 일부 실시양태에서, 박테리아 감염의 치료는 박테리아 로드를 감소시키는 것을 포함한다.
본 발명은 임의의 상기 실시양태의 항-WTA-항생제 접합체 화합물을 투여함으로써 숙주 세포를 사멸시키지 않으면서 스타필로코쿠스 아우레우스 감염 환자의 숙주 세포에서 세포내 스타필로코쿠스 아우레우스를 사멸시키는 방법을 추가로 제공한다. 지속 생존 (persister) 박테리아를 임의의 선행 실시양태의 AAC와 접촉시킴으로써 생체내에서 지속 생존 박테리아 세포 (예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스)를 사멸시키기 위한 또 다른 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 치료 방법은 제2 치료제의 투여를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 제2 치료제는 일반적으로 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 특히 MRSA에 대한 항생제를 포함하는 항생제이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물과 조합하여 투여되는 제2 항생제는 다음과 같은 구조 클래스로부터 선택된다: (i) 아미노글리코시드; (ii) 베타-락탐; (iii) 마크롤리드/시클릭 펩티드; (iv) 테트라시클린; (v) 플루오로퀴놀린/플루오로퀴놀론; (vi) 및 옥사졸리디논.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물과 조합하여 투여되는 제2 항생제는 클린다마이신, 노보비오신, 레타파물린, 답토마이신, GSK-2140944, CG-400549, 시타플록사신, 테이코플라닌, 트리클로산, 나프티리돈, 라데졸리드, 독소루비신, 암피실린, 반코마이신, 이미페넴, 도리페넴, 겜시타빈, 달바반신, 및 아지트로마이신으로부터 선택된다.
본원의 일부 실시양태에서, 대상체 내의 박테리아 로드는 치료 후에 검출가능하지 않은 수준으로 감소되었다. 한 실시양태에서, 환자의 혈액 배양액은 치료 전의 양성 혈액 배양액에 비해 치료 후에 음성이다. 본원의 일부 실시양태에서, 대상체 내의 박테리아 내성은 검출가능하지 않거나 낮다. 본원의 일부 실시양태에서, 대상체는 메티실린 또는 반코마이신 치료에 반응하지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 리파마이신-유형 항생제를 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체에 접합시키는 것을 포함하는, 본 발명의 항체 또는 항체-항생제 접합체 화합물의 제조 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 제약 조성물 및 사용 설명서를 포함하는, 박테리아 감염 치료용 키트이다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 화학식 II의 링커-항생제 중간체이다:
<화학식 II>
Figure pct00017
상기 식에서,
파선은 임의의 결합을 나타내고;
R은 H, C1-C12 알킬, 또는 C(O)CH3이고;
R1은 OH이고;
R2는 CH=N-(헤테로시클릴)이고, 여기서 헤테로시클릴은 C(O)CH3, C1-C12 알킬, C1-C12 헤테로아릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 및 C3-C12 카르보시클릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환되거나;
또는 R1 및 R2는 5원 또는 6원의 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴을 형성하고, 임의로 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리를 형성하고, 여기서 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 또는 OH로 임의로 치환되고;
L은 R2에 부착된 펩티드 링커 또는 R1 및 R2에 의해 형성된 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고; 화학식
Figure pct00018
로 표시되고,
여기서, Str은 스트레처 단위이고; Pep는 2 내지 12개 아미노산 잔기의 펩티드이고, Y는 스페이서 단위이고;
X는 말레이미드, 티올, 아미노, 브로마이드, 브로모아세트아미도, 아이오도아세트아미도, p-톨루엔술포네이트, 아이오다이드, 히드록실, 카르복실, 피리딜 디술피드, 및 N-히드록시숙신이미드로부터 선택되는 반응성 관능기이다.
화학식 II의 링커-항생제 중간체의 일부 실시양태에서, X는
Figure pct00019
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 링커-항생제 중간체는 다음 식으로 표시된다:
Figure pct00020
상기 식에서,
R3은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고;
n은 1 또는 2이고;
R4는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 및 OH로부터 선택되고;
Z는 NH, N(C1-C12 알킬), O 및 S로부터 선택된다.
일부 상기 실시양태에서, 화학식 II의 링커-항생제 중간체는 다음 식으로 표시된다.
Figure pct00021
또한, 본원에서 상세히 설명되는 항-WTA-항생제 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 스타필로코쿠스 아우레우스 감염 환자의 숙주 세포에서 숙주 세포는 사멸시키지 않으면서 세포내 스타필로코쿠스 아우레우스를 사멸시키는 방법이 제공된다.
본원에서 설명되는 다양한 실시양태의 특성의 하나, 일부 또는 전부는 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 발명의 이들 및 다른 측면은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
도 1은 반코마이신 또는 리팜피신에 대한 노출이 MRSA를 점진적으로 사멸시킴을 보여준다. 반코마이신은 2 ㎍/mL (열린 정사각형) 및 20 ㎍/mL (닫힌 정사각형)로 시험하였다. 리팜피신은 0.02 ㎍/mL (열린 삼각형) 및 0.2 ㎍/mL (닫힌 삼각형)로 시험하였다.
도 2는 감염된 복막 세포가 반코마이신의 존재 하에 골모세포로 감염을 전파할 수 있음을 보여준다.
도 3은 그람 양성 박테리아, 예컨대 에스. 아우레우스의 세포벽을 보여주고, 세포 막을 안정화하고 부착 부위를 제공하는 세포벽 테이코산 (WTA), 지질 테이코산 (LTA) 및 펩티도글리칸 (PGN) 외피의 그림이 제시된다.
도 4는 정의 부분에서 상세히 설명되는 세포벽 테이코산 (WTA)의 화학적 구조 및 글리코실 변형을 보여준다.
도 5는 항체-항생제 접합체 (AAC)에 대한 약물 활성화의 가능한 메카니즘을 보여준다. 활성 항생제 (Abx)는 AAC의 포유동물 세포 내로의 내재화 후에 방출된다.
도 6a 및 6b는 실시예 21에서 설명되는 USA300 또는 Wood46 균주 에스. 아우레우스 균주로부터의 세포벽 제제에 결합하는 양성 ELISA를 보여주는 mAb의 라이브러리의 1차 스크리닝으로부터 Ab의 특징을 요약한 것이다. WTA에 결합하는 Ab 중에서, 4개가 WTA 알파에 특이적이고, 13개는 WTA 베타에 특이적으로 결합한다.
도 7a는 AAC가 세포내 MRSA를 사멸시킴을 제시하는 시험관내 대식세포 검정을 보여준다.
도 7b는 네이키드 비접합된 항-WTA 항체 S4497에 비해, 대식세포, 골모세포 (MG63), 기도 상피 세포 (A549), 및 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에서 50 ㎍/mL의 티오-S4497-HC-A118C-pipBOR 102를 사용한 MRSA (USA300 균주)의 세포내 사멸을 보여준다. 파선은 검정 검출 한계를 나타낸다.
도 7c는 링커-항생제 중간체 LA-51 및 LA-54로 제조된 AAC의 비교를 보여준다 (표 2). MRSA를 S4497 항체 단독으로 또는 10 ㎍/mL 내지 0.003 ㎍/mL의 다양한 농도의 AAC, 즉 AAC-102 또는 AAC-105 (표 3)와 함께 옵소닌화시킨다.
도 7d는 대식세포를 해롭게 하지 않으면서 AAC가 세포내 박테리아를 사멸시킴을 보여준다.
도 7e는 상기 대식세포 세포 용해로부터 대식세포 내부로부터 살아있는 USA300의 회수를 보여준다. 네이키드 항체 처리 대조군에 비해 매우 적은 (10,000배 더 적은) 살아있는 에스. 아우레우스가 S-4497-AAC 옵소닌화된 박테리아로 감염된 대식세포로부터 회수되었다.
도 8a는 A/J 마우스의 복강내 감염 모델에서 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC의 생체내 효능을 보여준다. 마우스를 복강내 주사에 의해 MRSA로 감염시키고, 50 mg/Kg의 S4497 항체 단독으로 또는 50 mg/Kg의 102 AAC (HC-A114C 카바트 = HC-A118C EU)로 복강내 주사에 의해 처리하였다. 마우스를 감염 2일 후에 희생시키고, 총 박테리아 로드를 복막 상청액 (세포외 박테리아), 복막 세포 (세포내 박테리아) 또는 신장에서 평가하였다.
도 8b는 A/J 마우스의 정맥내 생체내 감염 모델을 보여준다. 마우스를 정맥내 주사에 의해 MRSA로 감염시키고, 50 mg/Kg의 S4497 항체, 50 mg/Kg의 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC 또는 50 mg/Kg의 S4497 항체 + 0.5 mg/Kg의 자유 리파마이신의 간단한 혼합물로 처리하였다. 회색 파선은 각각의 장기에 대한 검출 한계를 나타낸다.
도 9a는 정맥내 감염 모델에서 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC의 효능을 S4497-pipBOR AAC의 적정에 의해 보여준다.
도 9b는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105 AAC가 정맥내 감염 모델에서 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC보다 더 효능이 크다는 것을 적정에 의해 보여준다. S4497 항체, 102 AAC 또는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸-pipBOR 112 AAC를 감염 30분 후에 나타낸 용량으로 투여하였다. 마우스를 감염 4일 후에 희생시키고, 마우스당 생존 박테리아의 총수 (2개의 신장에서 모음)를 플레이팅에 의해 결정하였다.
도 9c는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105 AAC가 정맥내 감염 모델에서 S4497 항체 또는 디메틸pipBOR 7 항생제 단독의 경우보다 효능이 더 크다는 것을 보여준다. CB17.SCID 마우스를 2x107 CFU의 MRSA로 정맥내 주사에 의해 감염시켰다. 감염 1일 후에, 마우스를 50 mg/Kg의 S4497 항체, 50 mg/Kg의 AAC 105 또는 0.5 mg/Kg의 디메틸-pipBOR 7 (동등한 용량의 항생제가 50 mg/Kg의 AAC에 함유됨)로 처리하였다. 마우스를 감염 4일 후에 희생시키고, 마우스당 생존 박테리아의 총수 (2개의 신장에서 모음)를 플레이팅에 의해 결정하였다.
도 10a는 인간 혈청에서 항-에스. 아우레우스 항체의 우세한 존재를 보여준다. 에스. 아우레우스 감염 환자 또는 정상 대조군은 항-WTA S4497과 동일한 특이성을 갖는 다량의 WTA 특이적 혈청 항체를 함유한다. S4497 항원을 발현한 MRSA에 대한 다양한 야생형 (WT) 혈청 샘플의 결합을 S4497 항체에 의해 인식되는 당 변형이 결여된 MRSA 균주 TarM/TarS DKO (이중 낙아웃 (knockout)) 돌연변이체에 대한 결합과 비교하여 조사하였다.
도 10b는 AAC가 MRSA의 USA300 균주를 사용한 시험관내 대식세포 검정에서 생리학적 수준의 인간 IgG (10 mg/mL)의 존재 하에 효능을 나타냄을 보여준다. 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105는 10 mg/mL의 인간 IgG의 존재 하에 효능을 나타낸다. MRSA의 USA300 균주를 AAC 단독으로, 또는 10 mg/mL의 인간 IgG에 희석한 AAC로 옵소닌화하였다. 생존 세포내 박테리아의 총수를 감염 2일 후에 평가하였다.
도 10c는 AAC가 생리학적 수준의 인간 IgG의 존재 하에 효능을 나타냄을 제시하는 생체내 감염 모델을 보여준다. 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105 또는 112 AAC의 2개의 개별 제제를 사용한 3회의 독립적인 실험으로부터 얻은 데이타를 합하였다. AAC로 처리된 마우스는 박테리아 로드의 4-log 초과의 감소를 보였다 (스튜던트 (Student) t-시험 p=0.0005).
도 11a는 AAC가 정상 수준의 인간 IgG로 재구성된 마우스에서 현재 치료 기준 (SOC) 항생제 반코마이신보다 큰 효능을 나타냄을 제시하는 생체내 감염 모델을 보여준다. 마우스를 S4497 항체 (50 mg/Kg), 반코마이신 (100 mg/Kg), 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105 AAC (50 mg/Kg), 또는 MRSA를 인식하지 않는 이소형 대조군 항체로 제조된 AAC, 티오-hu-항 gD 5B5-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 110 AAC (50 mg/Kg)로 처리하였다.
도 11b는 FACS에 의해 결정되는, 생체내 감염 모델에서 신장으로부터 단리된 USA300 균주에 대한 항-스타필로코쿠스 아우레우스 항체의 상대적인 결합을 보여준다. S4497 항체는 에스. 아우레우스의 세포벽 상의 베타-아노머 결합을 통해 세포벽 테이코산 (WTA)에 연결된 N-아세틸글루코사민 변형을 인식한다. S7578 항체는 알파-아노머 결합을 통해 WTA에 연결된 유사한 N-아세틸글루코사민 변형에 결합한다. rF1 항체는 세포벽 고정 단백질을 함유하는 SDR-반복부의 패밀리에서 발견되는 당 변형을 인식하는 양성 대조군 항-MRSA 항체이다. gD 항체는 에스. 아우레우스를 인식하지 않는 음성 대조군 인간 IgG1이다.
도 11c는 AAC, 티오-S6078-HC A114C-LCWT-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 129가 정상 수준의 인간 IgG로 재구성된 마우스에서 도 11a과 동일한 방식에 따라 네이키드 항-WTA 항체 S4497보다 효능이 더 크다는 것을 제시하는 생체내 감염 모델을 보여준다. 마우스를 S4497 항체 (50 mg/Kg), 또는 티오-S6078-HC A114C-LCWT-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 129 AAC (50 mg/Kg)로 처리하였다.
도 12는 링커가 카텝신 B에 의해 절단되지 않으면 AAC가 에스. 아우레우스에 독성을 보이지 않음을 제시하는 성장 억제 검정을 보여준다. 카텝신 방출 검정 (실시예 20) 모식도는 좌측에 제시된다. AAC는 카텝신 B로 처리하여 자유 항생제를 방출시킨다. 무손상 대 카텝신 B 처리 AAC의 항생제 활성의 총량은 생성되는 반응물의 연속 희석액을 제조하고 에스. 아우레우스의 성장을 억제할 수 있는 AAC의 최소 용량을 결정함으로써 결정된다. 우측 상부 그래프는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102에 대한 카텝신 방출 검정을 보여주고, 우측 하부 그래프는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105에 대한 카텝신 방출 검정을 보여준다.
도 13a는 4개의 인간 항-WTA 알파 항체의 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열 정렬 (나타나는 순서대로, 각각 서열 25, 27, 29 및 31)을 보여준다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 서열 CDRL1, L2 및 L3은 밑줄로 표시한다.
도 13b는 도 13a의 4개의 인간 항-WTA 알파 항체의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 서열 CDR H1, H2 및 H3은 밑줄로 표시한다 (나타나는 순서대로, 각각 서열 26, 28, 30 및 32).
도 14는 13개의 인간 항-WTA 베타 항체의 L 및 H 쇄의 CDR 서열 (서열 33-110)을 보여준다.
도 15aa 및 15ab는 항-WTA 베타 Ab 6078 (비변형된) 및 그의 변이체, v2, v3, v4의 전장 L 쇄 (경쇄)의 정렬 (나타나는 순서대로, 각각 서열 113, 113, 115, 113, 115, 113, 115 및 115)을 보여준다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 서열 CDRL1, L2 및 L3은 밑줄로 표시한다. 박스는 카바트 및 코티아 (Chothia)에 따른 접촉 잔기 및 CDR 잔기를 보여준다. 조작된 Cys을 함유하는 L 쇄 변이체는 불변 영역의 말단부 근처의 흑색 박스 내의 C로 표시된다 (이 경우에 EU 잔기 번호 205에). 변이체 명칭, 예를 들어, v2LC-Cys는 L 쇄 내에 조작된 Cys를 포함하는 변이체 2를 의미한다. HCLC-Cys는 각각의 H 및 L 쇄가 조작된 Cys를 포함함을 의미한다. 변이체 2, 3 및 4는 도 15b에 도시된 바와 같이 H 쇄의 시작부에 변형을 갖는다.
도 15ba, 15bb, 15bc, 15bd는 항-WTA 베타 Ab 6078 (비변형된) 및 H 쇄의 시작부에 변형을 갖는 그의 변이체, v2, v3, v4의 전장 H 쇄 (중쇄)의 정렬 (나타나는 순서대로, 각각 서열 114, 139-144 및 143)을 보여준다. 조작된 Cys을 함유하는 H 쇄 변이체는 불변 영역의 말단부 근처의 흑색 박스 내의 C로 표시된다 (이 경우에 EU 잔기 번호 118에).
도 16aa 및 16ab는 항-WTA 베타 Ab 4497 (비변형된) 및 Cys 조작된 L 쇄의 정렬 (나타나는 순서대로, 각각 서열 121, 123, 145 및 145)을 보여준다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 서열 CDRL1, L2 및 L3은 밑줄로 표시한다. 박스는 카바트 및 코티아에 따른 접촉 잔기 및 CDR 잔기를 보여준다. 조작된 Cys을 함유하는 L 쇄 변이체는 불변 영역의 말단부 근처의 점선 박스 내의 C로 표시된다 (이 경우에 EU 잔기 번호 205에).
도 16ba, 16bb, 16bc는 항-WTA 베타 Ab 4497 (비변형된) 및 CDR H3 위치 96에서 D가 E로 변경되고 조작된 Cys를 갖거나 갖지 않는 그의 v8 변이체의 전장 H 쇄의 정렬 (나타나는 순서대로, 각각 서열 146-147, 157 및 147)을 보여준다. 조작된 Cys을 함유하는 H 쇄 변이체는 불변 영역의 말단부 근처의 흑색 박스 내의 C로 표시된다 (이 경우에 EU 잔기 번호 118에).
도 17aa, 17ab, 17ac는 13개의 인간 항-WTA 베타 항체의 전장 경쇄의 아미노산 서열 정렬 (나타나는 순서대로, 각각 서열 113, 158-167, 121 및 168)을 보여준다. 가변 영역 (VL)은 카바트 아미노산 위치 1 내지 107에 걸쳐 이어진다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 서열 CDRL1, L2 및 L3은 밑줄로 표시한다.
도 17ba 내지 17bf은 도 17aa, 17ab, 17ac의 13개의 인간 항-WTA 베타 항체의 전장 중쇄의 아미노산 서열 정렬 (나타나는 순서대로, 각각 서열 114, 169-176, 133-134, 138 및 127)을 보여준다. 가변 영역 (VH)은 카바트 아미노산 위치 1-113에 걸쳐 이어진다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 서열 CDR H1, H2 및 H3은 밑줄로 표시한다. 별표로 표시된 H 쇄 EU 위치 118은 약물 접합을 위해 Cys로 변경될 수 있다. 흑색으로 강조된 잔기는 탈아미드화, 아스파르트산 이성질체화, 산화 또는 N-연결된 글리코실화를 방지하기 위해 항원 결합에 영향을 주지 않는 다른 잔기로 교체될 수 있다.
도 18a는 ELISA에 의해 분석된, 에스. 아우레우스 세포벽에 대한 Ab 4497 돌연변이체의 결합을 보여준다.
도 18b는 Ab 4497 및 강조된 아미노산 위치에서의 그의 돌연변이체 (나타나는 순서대로, 각각 서열 177, 177, 177-178, 178-179, 179-180, 180 및 180)의 비교 및 ELISA에 의해 시험된 그의 상대적인 항원 결합 강도를 보여준다.
도 19는 실시예 23에서 설명되는 바와 같은, USA300의 단백질 A 결핍 균주 (USA300-SPA)에 대한 Ab 6078 WT 및 돌연변이체의 FACS 분석의 결과를 보여준다. 돌연변이체는 에스. 아우레우스에 대한 손상되지 않은 결합을 보였다.
도 20은 50 mg/Kg의 자유 항체를 사용한 전처리가 정맥내 감염 모델에서 효능을 나타내지 않음을 보여준다. Balb/c 마우스에게 2x107 CFU의 USA300 감염 30분 전에 단일 용량의 비히클 대조군 (PBS) 또는 50 mg/Kg의 항체를 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 처리군은 에스. 아우레우스에 결합하지 않는 이소형 대조군 항체 (gD), 세포벽 테이코산의 베타 변형에 대해 작용하는 항체 (4497) 또는 세포벽 테이코산의 알파 변형에 대해 작용하는 항체 (7578)를 포함하였다. 대조군 마우스에게는 110 mg/Kg의 반코마이신을 복강내 주사에 의해 1일 2회 처리하였다 (반코).
도 21 및 도 22는 세포벽 테이코산의 베타 변형 또는 세포벽 테이코산의 알파 변형에 대해 작용하는 AAC가 정상 수준의 인간 IgG로 재구성된 마우스를 사용한 정맥내 감염 모델에서 효능을 나타냄을 보여준다. CB17.SCID 마우스는 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 일정한 수준을 생성하기 위해 최적화된 투여 요법을 사용하여 인간 IgG로 재구성하고, 2x107 CFU의 USA300으로 정맥내 주사에 의해 감염시켰다. 처리는 감염 1일 후에 완충제 단독 대조군 (PBS), 60 mg/Kg의 베타-WTA AAC (136 AAC) 또는 60 mg/Kg의 알파-WTA AAC (155 AAC)로 개시하였다.
도 23a 및 도 23b는 2-니트로벤젠-1,3-디올 1로부터 링커-항생제 중간체 51의 합성을 보여준다.
도 24는 TBS-보호된 벤즈옥사지노 리파마이신 4로부터 링커-항생제 중간체 MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 54의 합성을 보여준다.
도 25a 및 도 25b는 (5-플루오로-2-니트로-1,3-페닐렌)비스(옥시)비스(메틸렌)디벤젠 9로부터 디메틸 pipBOR 7의 합성을 보여준다.
도 26은 절단 확인을 위한 FRET 펩티드 기질인, REPLi 프로테아제 활성 스크린으로부터 P1, P2, 및 P3에 가장 풍부한 잔기를 함유하는 mal-K(TAMRA)GGAFAGGGK(플루오레세인) (서열 125)의 구조를 보여준다. REPLi FRET 펩티드 구조로부터의 인접하는 Gly 잔기는 보존되었다. N-말단 상의 티올-반응성 말레이미드기는 반응성 시스테인을 갖는 항체에 대한 접합을 허용하였다. FRET 펩티드의 절단시에, 켄칭 (quenching) 효과는 상실되고, 형광의 증가가 관찰된다.
도 27은 관심있는 프로테아제를 함유하는 활성 분획을 확인하기 위해 사용되는 도구 화합물인 티오FAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) (서열 126으로서 개시된 "코어 펩티드")의 구조를 보여준다. Mal-GGAFAGGG-DNA31 (서열 126으로서 개시된 "코어 펩티드")을 티오FAB 4497에 접합시켰다. 티오FAB는 하나의 반응성 시스테인을 함유한다. 에스. 아우레우스 프로테아제는 Ala의 C-말단에 위치하는 링커를 절단하여 Gly-Gly-Gly-(pipBOR)을 방출하였다.
도 28 및 도 29는 Mal-K(tamra)GGAFAGGGK(플루오레세인) (서열 125) AAC가 에스. 아우레우스에 결합하는 항체 (티오-S4497)에 접합될 때 Wood46 (도 28) 및 USA300 (도 29) 둘 모두에서 절단되지만, 에스. 아우레우스에 결합하지 않는 항체 (티오-트라스투주맙)에 접합될 때는 그렇지 않음을 보여준다. Wood46 및 USA300 MRSA의 대수기 (log phase) 배양액과 함께 인큐베이션한 티오MAB 4497 mal-K(tamra)GGAFAGGGK(플루오레세인) (서열 125)의 형광 강도를 시간에 걸쳐 측정하였다. 도 26의 mal-K(TAMRA)GGAFAGGGK(플루오레세인) (서열 125)로 제조된 티오MAB 4497 FRET 펩티드 접합체는 두 균주 모두에서 형광의 증가를 보이고, 이것은 실험 링커가 에스. 아우레우스 프로테아제에 의해 절단되고 프로테아제가 MRSA의 임상적으로 관련되는 균주인 USA300에 존재함을 나타낸다 (도 29). 세포 밀도는 절단 비율에 영향을 주고, 절단은 보다 높은 세포 밀도 (108 세포/ml)의 배양액에서 보다 먼저 발생한다. 동위원소 대조군 접합체 (티오-트라스투주맙)는 임의의 조건에서 형광의 증가를 보이지 않았다.
도 30은 AAC에서 스타포파인 B 절단을 위한 2개의 최적화된 링커를 보여준다. 링커는 P4 및 P1'에 대한 잔기 선호를 비롯하여 스타포파인 B에 의한 절단을 위해 최적화된다. 링커는 REPLi 스크린으로부터의 데이타를 사용하여 설계하였다. QSY7은 항생제 대용물로서 작용하도록 각각의 링커의 C-말단에 부가되었다.
도 31은 스타포파인 절단가능한 AAC가 세포내 박테리아를 사멸시킬 수 있음을 제시하는 대식세포 검정의 결과를 보여준다. 에스. 아우레우스의 USA300 균주를 AAC의 박테리아에 대한 결합을 허용하기 위해 다양한 용량 (100 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 또는 0.1 ㎍/mL)의 S4497 항체 단독, 티오-S4497 HC WT (v8), LC V205C-MC-vc-PAB-(디메틸pipBOR) AAC-192 또는 티오-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") AAC-193과 함께 인큐베이션하였다 (도 31). 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 옵소닌화된 박테리아를 뮤린 대식세포에 공급하고, 포식작용을 허용하기 위해 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 포식작용이 완료된 후, 감염 혼합물을, 임의의 잔류하는 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 50 ㎍/mL의 겐타마이신을 보충한 정상 성장 배지로 교체하고, 생존 세포내 박테리아의 총수를 대식세포 용해물의 연속 희석액을 트립틱 소이 아가 (Tryptic Soy Agar) 플레이트 상에 플레이팅함으로써 2일 후에 결정하였다. 스타포파인 절단가능한 AAC는 카텝신 B 절단가능한 AAC와 비교시 유사한 효력으로 세포내 USA300을 사멸시킬 수 있었다. 회색 파선은 검정 검출 한계를 나타낸다 (10 CFU/웰).
도 32는 스타포파인 절단가능한 AAC가 세포내 박테리아를 사멸시킬 수 있음을 제시하는 대식세포 검정의 결과를 보여준다. AAC는 항체의 항원 특이적 결합을 통한 에스. 아우레우스에 대한 항생제 사멸을 표적화한다. 에스. 아우레우스의 Wood46 균주가 상기 실험을 위해 선택되었고, 그 이유는 이 균주가 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하는 분자인 단백질 A를 발현하지 않기 때문이다. 에스. 아우레우스의 Wood46 균주를 AAC의 박테리아에 대한 결합을 허용하기 위해 1시간 동안 10 ㎍/mL 또는 0.5 ㎍/mL의 S4497 항체, 카텝신 B 절단가능한 링커를 함유하는 이소형 대조군-AAC, 티오-트라스투주맙 HC A118C-MC-vc-PAB-(디메틸-pipBOR) AAC-101, 티오-S4497 HC WT (v8), LC V205C-MC-vc-PAB-(디메틸pipBOR) AAC-192, 스타포파인 절단가능한 링커를 함유하는 이소형 대조군-AAC, 티오-트라스투주맙 HC A118C-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드"), 또는 티오-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") AAC-193와 함께 인큐베이션하였다. AAC의 비-특이적 결합을 제한하기 위해, 옵소닌화된 박테리아를 원심분리하고, 1회 세척하고, 뮤린 대식세포에 공급하기 전에 완충제에 재현탁시켰다. 포식작용이 완료된 후, 감염 혼합물을, 임의의 잔류하는 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 50 ㎍/mL의 겐타마이신을 보충한 정상 성장 배지로 교체하고, 생존 세포내 박테리아의 총수를 대식세포 용해물의 연속 희석액을 트립틱 소이 아가 플레이트 상에 플레이팅함으로써 2일 후에 결정하였다. 스타포파인 절단가능한 링커를 함유하는 4497-AAC는 모든 검출가능한 세포내 박테리아를 사멸시킬 수 있는 반면에, 이소형 대조군 AAC는 활성을 보이지 않았다.
도 33 및 34는 스타포파인 AAC가 뮤린 정맥내 감염 모델에서 생체내에서 활성을 나타냄을 보여준다. CB17.SCID 마우스는 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 일정한 수준을 생성하기 위해 최적화된 투여 요법을 사용하여 인간 IgG로 재구성하였다. 마우스를 4497 항체 (50 mg/kg), 스타포파인 절단가능한 링커를 갖는 AAC-215 (50 mg/kg), 또는 이소형 대조군, 스타포파인 절단가능한 링커를 갖는 항-gD AAC (50 mg/kg)로 처리하였다. 마우스에게 단일 용량의 AAC-215를 감염 후 제1일에 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 2개의 신장 (도 33) 또는 심장 (도 34) 내의 생존 박테리아의 총수를 플레이팅에 의해 결정하였다.
도 35 및 36은 티오-S6078 AAC에 대한 시험관내 대식세포 검정의 결과를 보여준다. 도 35에서, 티오-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(디메틸pipBOR) AAC는 티오-S6078 항체 당 2.0 (AAC-173) 또는 3.9 (AAC-171) 디메틸pipBOR 항생제 (LA-54)의 항생제 로딩과 함께 0.5 ㎍/mL의 용량에서 세포내 박테리아의 사멸에 효과적이었다. 도 36에서, 티오-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(피페라즈BOR)은 티오-S6078 항체 당 1.8 (AAC-174) 또는 3.9 (AAC-172) 피페라즈BOR 항생제 (LA-65)의 항생제 로딩과 함께 0.5 ㎍/mL의 용량에서 세포내 박테리아의 사멸에 효과적이었다.
도 37 및 38은 뮤린 정맥내 감염 모델에서 티오-S6078 AAC의 생체내 효능의 결과를 보여준다. CB17.SCID 마우스는 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 일정한 수준을 생성하기 위해 최적화된 투여 요법을 사용하여 인간 IgG로 재구성하였다. 마우스를 USA300으로 감염시키고, 티오-S6078 항체 당 2.0 (AAC-173) 또는 3.9 (AAC-171) 디메틸pipBOR 항생제 (LA-54)의 항생제 로딩과 함께 비히클 대조군 (PBS), 티오-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(디메틸pipBOR) AAC로 처리하고 (도 37), 티오-S6078 항체 당 1.8 (AAC-174) 또는 3.9 (AAC-172) 피페라즈BOR 항생제 (LA-65)의 항생제 로딩과 함께 티오-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(피페라즈BOR)로 (도 38) 처리하였다. 마우스에게 단일 용량의 AAC를 감염 후 제1일에 정맥내 주사에 의해 투여하고, 감염 후 제4일에 희생시켰다. 2개의 신장 내의 생존 박테리아의 총수를 플레이팅에 의해 결정하였다. 보다 낮은 항생제 로딩을 함유하는 AAC를 사용한 처리는 박테리아 존재량 (burden)을 약 1,000배 감소시키고, 보다 높은 항생제 로딩을 함유하는 AAC를 사용한 처리는 박테리아 존재량을 10,000배 초과 수준으로 감소시켰다.
이제 본 발명의 특정 실시양태를 상세하게 참고할 것이고, 그 예는 수반되는 구조 및 화학식에서 예시된다. 본 발명을 방법, 물질 및 예를 포함하는 열거된 실시양태와 함께 설명하지만, 상기 설명은 비제한적인 것으로서, 본 발명은, 일반적으로 알려져 있는지 또는 본원에 포함되는지의 여부와 상관없이 모든 대체물, 변형 및 동등물을 포괄하는 것으로 의도된다. 규정된 용어, 용어 사용, 설명된 기술 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 포함된 문헌, 특허 및 유사한 물질이 본원과 상이하거나 모순되는 경우에는, 본원이 우선하여 적용된다. 달리 규정되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 통상의 기술자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에서 설명되는 바와 유사하거나 동등한 많은 방법 및 물질을 알 것이다. 본 발명은 설명되는 방법 및 물질로 어떠한 방식으로도 제한되지 않는다.
본원에서 언급되는 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전부가 보누언에 참고로 포함된다.
I. 일반적인 기술
본원에서 설명되거나 언급되는 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고 있고, 예를 들어 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 다음 문헌에 기재된 널리 이용되는 방법과 같은 통상적인 방법을 사용하여 통상적으로 사용된다: [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))]; [the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))], [Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)].
본원에서 사용되는 명명법은 달리 나타내지 않으면 IUPAC 체계 명명법을 기초로 한다. 달리 규정되지 않으면, 본원에서 사용되는 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술 분유의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖고, 문헌 [Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY]; 및 [Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York]과 일치한다.
II. 정의
치환기의 수를 나타낼 때, 용어 "하나 이상의"는 하나의 치환기 내지 가장 높은 가능한 수의 치환, 즉 하나의 수소 내지 모든 수소의 치환기에 의한 교체를 의미한다. 용어 "치환기"는 모 분자 상의 수소 원자를 교체하는 원자 또는 원자의 군을 나타낸다. 용어 "치환된"은 특정된 기가 하나 이상의 치환기를 보유함을 나타낸다. 임의의 기가 다수의 치환기를 보유하고 다양한 가능한 치환기가 제공될 경우, 치환기는 독립적으로 선택되고, 동일할 필요는 없다. 용어 "비치환된"은 특정된 기가 치환기를 보유하지 않음을 의미한다. 용어 "임의로 치환된"은 특정된 기가 비치환되거나 또는 가능한 치환기의 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환됨을 의미한다. 치환기의 수를 나타낼 대, 용어 "하나 이상의"는 하나의 치환기 내지 가장 높은 가능한 수의 치환, 즉 하나의 수소 내지 모든 수소의 치환기에 의한 교체를 의미한다.
용어 "세포벽 테이코산" (WTA)은 N-아세틸 무람산 당의 C6 히드록실에 대한 포스포디에스테르 연결을 통해 펩티도글리칸에 공유 부착된 음이온성 글리코폴리머 (glycopolymer)를 의미한다. 정확한 화학적 구조는 유기체마다 상이할 수 있지만, 한 실시양태에서, WTA는 위치 2에 D-리비톨 및 D-알라닐 에스테르의 1,5-포스포디에스테르 연결의 반복 단위 및 위치 4에 글리코실 치환기를 갖는 리비톨 테이코산이다. 글리코실기는 에스. 아우레우스에 존재하는 N-아세틸글루코사미닐 α (알파) 또는 β (베타)일 수 있다. 알디톨/당 알콜 포스페이트 반복부 상의 히드록실은 양이온성 D-알라닌 에스테르 및 단당류, 예컨대 N-아세틸글루코사민으로 치환된다. 한 측면에서, 히드록실 치환기는 D-알라닐 및 알파 (α) 또는 베타 (β) GlcNHAc를 포함한다. 한 구체적인 측면에서, WTA는 하기 화학식의 화합물을 포함한다:
Figure pct00022
여기서, 물결선은 반복 연결 단위 또는 폴리알디톨-P 또는 펩티도글리칸의 부착 부위를 나타내고, 여기서 X는 D-알라닐 또는 -H이고; Y는 α(알파)-GlcNHAc 또는 β (베타)-GlcNHAc이다.
Figure pct00023
에스. 아우레우스에서, WTA는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)-1-P 및 N-아세틸만노스아민 (ManNAc)으로 이루어진 이당류, 이어서 2 또는 3 단위의 글리세롤-포스페이트를 통해 N-아세틸 무람산 (MurNAc)의 6-OH에 공유 연결된다. 실제 WTA 중합체는 11-40개의 리비톨-포스페이트 (Rbo-P) 반복 단위로 이루어진다. WTA의 단계적인 합성은 TagO로 불리는 효소에 의해 먼저 개시되고, TagO 유전자가 결여된 에스. 아우레우스 균주 (유전자의 인공적인 결실에 의한)는 임의의 WTA를 생산하지 않는다. 반복 단위는 C2-OH에서 D-알라닌 (D-Ala)으로 및/또는 C4-OH 위치에서 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)으로 α- (알파) 또는 β-(베타) 글리코시드 연결을 통해 추가로 조정될 수 있다. 에스. 아우레우스 균주, 또는 박테리아의 성장기에 따라, 박테리아 글리코시드 연결은 α-, β-, 또는 두 아노머의 혼합물일 수 있다.
용어 "항생제" (abx 또는 Abx)는 미생물, 예컨대 박테리아의 성장을 특이적으로 억제하거나 사멸시키지만, 투여되는 농도 및 투여 간격에서 숙주에 비치사성인 임의의 분자를 포함한다. 구체적인 측면에서, 항생제는 투여되는 농도 및 투여 간격에서 숙주에 비독성이다. 박테리아에 대해 효과적인 항생제는 살박테리아제 (즉, 직접 사멸시키는) 또는 정균제 (즉, 분열을 억제하는)로서 넓게 분류될 수 있다. 항-살박테리아 항생제는 협역 (narrow-spectrum) 또는 광역으로서 추가로 하위분류될 수 있다. 광역 항생제는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 둘 모두를 포함하는 넓은 범위의 박테리아에 대해 효과적인 것인 반면, 협역 항생제는 박테리아의 보다 작은 범위 또는 특정 패밀리에 대해서만 효과적이다. 항생제의 예는 다음을 포함한다: (i) 아미노글리코시드, 예를 들어, 아미카신, 겐타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 파로마이신, (ii) 안사마이신, 예를 들어, 겔다나마이신, 헤르비마이신, (iii) 카르바세펨, 예를 들어, 로라카르베프, (iv), 카르바페넴, 예를 들어, 에르타페넴, 도리페넴, 이미페넴/실라스타틴, 메로페넴, (v) 세팔로스포린 (제1 세대), 예를 들어, 세파드록실, 세파졸린, 세팔로틴, 세팔렉신, (vi) 세팔로스포린 (제2 세대), 예를 들어, 세파클로르, 세파만돌, 세폭시틴, 세프프로질, 세푸록심, (vi) 세팔로스포린 (제3 세대), 예를 들어, 세픽심, 세프디니르, 세프디토렌, 세포페라존, 세포탁심, 세프포독심, 세프타지딤, 세프티부텐, 세프티족심, 세프트리악손, (vii) 세팔로스포린 (제4 세대), 예를 들어, 세페핌, (viii), 세팔로스포린 (제5 세대), 예를 들어, 세프토비프롤, (ix) 당펩티드, 예를 들어, 테이코플라닌, 반코마이신, (x) 마크롤리드, 예를 들어 악시트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 트롤레안도마이신, 텔리트로마이신, 스펙티노마이신, (xi) 모노박탐, 예를 들어, 악스트레오남, (xii) 페니실린, 예를 들어, 아목시실린, 암피실린, 악슬로실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린, 피페라실린, 티카르실린, (xiii) 항생제 폴리펩티드, 예를 들어, 바시트라신, 콜리스틴, 폴리믹신 B, (xiv) 퀴놀론, 예를 들어, 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 레보플록사신, 레메플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오르플록사신, 트로바플록사신, (xv) 술폰아미드, 예를 들어, 마페니드, 프론토실, 술파세타미드, 술파메티졸, 술파닐아미드, 술파살라진, 술피속사졸, 트리메토프림, 트리메토프림-술파메톡사졸 (TMP-SMX), (xvi) 테트라시클린, 예를 들어, 데메클로시클린, 독시시클린, 미노시클린, 옥시테트라시클린, 테트라시클린 및 (xvii) 기타, 예컨대 아르스페나민, 클로람페니콜, 클린다마이신, 링코마이신, 에탐부톨, 포스포마이신, 푸시드산, 푸라졸리돈, 이소니아지드, 리네졸리드, 메트로니다졸, 무피로신, 니트로푸란토인, 플라텐시마이신, 피라진아미드, 퀴누프리스틴/달포프리스틴, 리팜핀/리팜피신 또는 이미다졸.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "WTA 항체"는 WTA 알파 또는 WTA 베타 여부와 상관없이 WTA에 결합하는 임의의 항체를 의미한다. 용어 "항-세포벽 테이코산 알파 항체" 또는 "항-WTA 알파 항체" 또는 "항-αWTA" 또는 "항-αGlcNac WTA 항체"는 세포벽 테이코산 (WTA) 알파에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하기 위해 교환가능하게 사용된다. 유사하게, 용어 "항-세포벽 테이코산 베타 항체" 또는 "항-WTA 베타 항체" 또는 "항-βWTA" 또는 "항-βGlcNac WTA 항체"는 세포벽 테이코산 (WTA) 베타에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하기 위해 교환가능하게 사용된다. 용어 "항-Staph 항체" 및 "Staph에 결합하는 항체"는 항체가 Staph를 표적화할 때 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 하기에 충분한 친화도로 스타필로코쿠스 아우레우스 ("Staph" 또는 "에스. 아우레우스") 상의 항원에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 한 실시양태에서, 항-Staph 항체가 관련되지 않은 비-Staph 단백질에 결합하는 정도는 예를 들어 방사성 면역검정 (RIA)에 의해 측정시에 항체의 MRSA에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, Staph에 결합하는 항체의 해리 상수 (Kd)는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤5 nM, ≤4 nM, ≤3 nM, ≤2 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 또는 그 미만, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)이다. 특정 실시양태에서, 항-Staph 항체는 상이한 종의 Staph에서 보존된 Staph의 에피토프에 결합한다.
다중 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 옥사실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (ORSA)로도 알려진 용어 "메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스" (MRSA)는 페니실린 (예를 들어, 메티실린, 디클록사실린, 나프실린, 옥사실린 등) 및 세팔로스포린을 포함하는 베타-락탐 항생제에 내성인 스타필로코쿠스 아우레우스의 임의의 균주를 의미한다. "메티실린-감수성 스타필로코쿠스 아우레우스 "(MSSA)는 베타-락탐 항생제에 감수성인 스타필로코쿠스 아우레우스의 임의의 균주를 의미한다.
용어 "최소 억제 농도" ("MIC")는 밤새 인큐베이션한 후에 미생물의 가시적인 성장을 억제할 항미생물제의 최저 농도를 의미한다. MIC의 결정을 위한 검정은 알려져 있다. 한 방법은 아래 실시예 18에서 설명된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그의 항원 결합 항체 단편을 포괄한다 (Miller et al. (2003) J. of Immunology 170:4854-4861). 항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라이거나, 또는 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 항체는 특정 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의해 생성되는 단백질이다 (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의해 인식되는, 에피토프로도 불리는 많은 결합 부위를 갖는다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 한 항원은 하나 초과의 대응하는 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있다. 항체는 전장 이뮤노글로불린 분자 또는 전장 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 관심있는 표적의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위 또는 그의 일부를 포함하는 분자를 포함하고, 상기 표적은 암세포 또는 자가면역 질환과 연관된 자가면역 항체를 생산하는 세포, 감염된 세포 또는 미생물, 예컨대 박테리아를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본원에 개시된 이뮤노글로불린 (Ig)은 IgM을 제외한 임의의 이소형 (예를 들어, IgG, IgE, IgD, 및 IgA) 및 하위클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 이뮤노글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, Ig는 인간, 뮤린, 또는 토끼 기원의 것이다. 구체적인 실시양태에서, Ig는 인간 기원의 것이다.
항체의 "클래스"는 그의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 종류를 의미한다. IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5개의 주요 항체 클래스가 존재하고, 이 중 몇몇은 하위클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나눌 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 클래스에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.
"천연 항체"는 상이한 구조를 갖는 천연 생성 이뮤노글로불린 분자를 의미한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드 결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH), 이어서 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VL), 이어서 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 종류 중의 하나로 지정될 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체", 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조에 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에 정의되는 Fc 영역을 포함하는 중쇄르르 갖는 항체를 나타내기 위해 본원에서 교환가능하게 사용된다.
항체의 "항원-결합 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는 무손상 항체 이외의 다른 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로 형성되는 다중특이적 항체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 이루는 개개의 항체는 예를 들어 천연 생성 돌연변이를 포함하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (예를 들어, 글리코실화의 천연 변이)를 제외하고 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하고, 상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. IgG1 항체에 대한 상기 가능한 한 변이체는 중쇄 불변 영역의 C-말단 리신 (K)의 절단이다. 일반적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 비해, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 작용한다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내는 것이고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 상기 방법 및 다른 예시적인 모노클로날 항체 제조 방법이 본원에서 설명된다. 그의 특이성 이외에, 모노클로날 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있기 때문에 유리하다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래하고 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래하는 것인 항체를 의미한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 (repertoire) 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 상기 인간 항체의 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 분명히 배제한다.
"인간화 항체"는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 의미한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 나타낸다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; [Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 본원에서 사용될 때 서열에서 초가변이고/이거나 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR"), 구조상 규정된 루프를 형성하고/하거나, 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉")를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; 즉, VH 내에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3이 6개의 HVR의 대부분의 다양성을 제시하고, H3은 특히 항체에 대한 양호한 특이성을 부여할 때 특유한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)];. [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 구성된 천연 생성 낙타류 (camelid) 항체가 기능성이고, 경쇄 부재 하에 안정하다 ([Hamers-Casterman et al., (1993) Nature 363:446-448]; [Sheriff et al., (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736]).
많은 HVR 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 변동성에 기초하고, 가장 흔히 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 코티아는 그 대신 구조 루프의 위치를 나타낸다 (Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). 항원 접촉에 대해서는, 문헌 [MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]을 참조한다. AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라 (Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다. 각각의 상기 HVR의 잔기를 아래에 나타낸다.
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HVR은 다음과 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65, 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 달리 나타내지 않으면, HVR 잔기, CDR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 본원에서 넘버링된다.
표현 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변형은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서 항체 편집물의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 그러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제적인 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 그 내로의 삽입에 상응하여 아미노산이 더 적을 수 있거나, 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따라 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 확인된 4개의 FR 도메인으로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)의 다음 서열에 보인다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
본원에서의 목적을 위한 "수용자 인간 프레임워크"는 아래에서 규정되는 바와 같은 인간 이뮤노글로불린 프레임워크로부터, 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔하게 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같이 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같이 하위군 III이다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용될 때 "결합 친화도"는 결합쌍의 멤버 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다.
"친화도 성숙" 항체는 변경을 보유하지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 분자 상의 특정 부위를 의미한다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 의미하고, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
"네이키드 항체"는 이종성 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되지 않은 항체를 의미한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예컨대, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비형 Ig가 상기 세포독성 이펙터 세포를 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합시킨 후에, 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있는 것인 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포의 "아암 (arm)"이고 상기 메카니즘에 의한 표적 세포의 사멸에 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 Fc 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, US 5,500,362 또는 US 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"포식작용"은 병원체가 숙주 세포 (예를 들어, 대식세포 또는 호중구)에 의해 삼켜지거나 내재화되는 과정을 의미한다. 포식세포는 다음 3개의 경로에 의해 포식작용을 매개한다: (i) 직접적인 세포 표면 수용체 (예를 들어, 렉틴, 인테그린 및 스캐빈저 (scavenger) 수용체), (ii) 보체 향상 - 보체 옵소닌화된 병원체에 결합하여 삼키기 위해 보체 수용체 (CRI, C3b, CR3 및 CR4에 대한 수용체 포함) 사용, 및 (iii) 항체 향상 - 내재화되고 리소솜과 융합되어 파고리소솜 (phagolysosome)이 되는 항체 옵소닌화된 입자에 결합하기 위해 Fc 수용체 (FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIIA) 사용. 본 발명에서, 경로 (iii)은 감염된 백혈구, 예를 들어, 호중구 및 대식세포에 대한 항-MRSA AAC 치료제의 전달에서 유의한 역할을 수행하는 것으로 생각된다 (Phagocytosis of Microbes: complexity in Action by D. Underhill and A Ozinsky. (2002) Annual Review of Immunology, Vol 20:825).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적 세포의 용해를 의미한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 그의 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위클래스의)에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 검정을 수행할 수 있다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위하여 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대체로 위치 Cys226, 또는 위치 Pro230의 아미노산 잔기로부터 그의 카르복실-말단으로 확장되도록 규정된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 지수로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아의 수용체 FcRn을 포함한다 ([Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)]. FcRn에 대한 결합의 측정 방법은 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology 15(7): 637-40 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조). 생체내에서 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고 친화도 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 예를 들어 인간 FcRn를 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 검정할 수 있다. WO 2004/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합을 개선하거나 감소시키는 항체 변이체가 설명되어 있다. 또한, 예를 들어, 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]을 참조한다.
Fc 영역에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고당을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32]을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 및 이중안테나 올리고당 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, IgG 내의 올리고당의 변형은 추가로 개선된 특정 특성을 갖는 IgG를 생성하기 위해 이루어질 수 있다. 예를 들어, Fc 영역에 부착된 (직접 또는 간접적으로) 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변형이 제공된다. 상기 변형체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 하꼬 고교 컴퍼니 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변형에 관련된 간행물의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; [Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lee 13 CHO 세포 ([Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 특허 출원 공개 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al.), 특히 실시예 11), 및 낙아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 낙아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107)를 포함한다.
"단리된 항체"는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정시에 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된 핵산"은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 포함하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 더 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외부에 존재하거나 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-WTA 베타 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분자(들), 및 숙주 세포 내의 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자(들)을 비롯하여 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에 특이적으로 결합하다" 또는 "에 특이적인"은 생물학적 분자를 포함하는 불균일한 분자 집단의 존재 하에 표적의 존재를 결정하는, 표적과 항체 사이의 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대 결합을 의미한다. 예를 들어, 표적 (에피토프일 수 있는)에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰친화도, 결합력으로, 더 쉽게 및/또는 더 긴 기간 동안 상기 표적에 결합하는 항체이다. WTA-베타에 관련되지 않는 표적에 대한 항체의 결합 정도는 예를 들어 방사성 면역검정 (RIA)으로 측정시에 표적에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, WTA 베타에 특이적으로 결합하는 항체의 해리 상수 (Kd)는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤0.1 nM이다. 특정 실시양태에서, 항체는 상이한 종으로부터 보존된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만, 이를 필요로 하지는 않는다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용될 때 "결합 친화도"는 결합쌍의 멤버 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 빠르게 결합하고 보다 오래 결합된 상태로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화도의 측정을 위한 구체적인 실증적이고 예시적인 실시양태가 아래에서 설명된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 검정에서 설명되는 바와 같이 관심 대상 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성 표지된 항원-결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 연속 적정물의 존재하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 후에, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정된다 (문헌 [Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터 플레이트 (다이넥스 테크놀로지스, 인크. (Dynex Technologies, Inc.))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스 (Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (약 23℃)에서 차단하였다. 비흡착 플레이트 (넝크 (Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 대상 Fab의 연속 희석액과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 대상 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형이 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서의 인큐베이션 (예를 들어, 1시간 동안)을 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 트윈(TWEEN)-20™으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조할 때, 150 ㎕/웰의 섬광제 (마이크로신트 (MicroScint)-20™; 팩커드 (Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트 (Topcount)™ 감마 계수기 (팩커드) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 ~10의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 기기 (비아코어, 인크. (BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이))을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용함으로써 측정한다. 간략하게 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/ml (~0.2 μM)로 희석한 후, 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유량으로 주입한다. 항원 주입 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 ㎕/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 트윈 20™ 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 내에서 주입한다. 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 온-레이트 (on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 S-1을 초과하면, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠 (Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계 (써모스펙트로닉 (ThermoSpectronic))에서 측정시 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "회합의 속도" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"은 또한 비아코어®-2000 또는 비아코어®-3000 시스템 (비아코아, 인크., 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 상기한 바와 같이 결정할 수 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양액"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 그 내로 도입된 세포를 의미하고, 상기 세포의 자손체를 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 1차 형질전환 세포 및 계대배양 횟수와 상관없이 그로부터 유래된 자손체를 포함한다. 자손체는 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 처음 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손체는 본원에 포함된다.
용어 "벡터"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 그와 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 이 용어는 자가 복제성 핵산 구조로서의 벡터 및 도입되는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 언급된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율 (%)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 백분율을 달성하도록 갭을 도입한 후, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성 부분으로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술 범위 내의 다양한 방법, 예컨대 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 통상의 기술자는 비교될 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 동일성 값 (%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크. (Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (Copyright Office) (미국 20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코)로부터 공개적으로 입수가능하거나 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 구동 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있고, 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 x X/Y의 분율. 여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않으면, 본원에서 설명되는 모든 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 설명된 바와 같이 얻는다.
용어 "리파마이신-유형 항생제"는 리파마이신의 구조 또는 이와 유사한 구조를 갖는 항생제의 클래스 또는 군을 의미한다.
용어 "리팔라질-유형 항생제"는 리팔라질의 구조 또는 이와 유사한 구조를 갖는 항생제의 클래스 또는 군을 의미한다.
치환기의 수를 나타낼 때, 용어 "하나 이상의"는 하나의 치환기로부터 가장 많은 가능한 치환의 수, 즉 치환기에 의한 하나의 수소의 교체 내지 모든 수소의 교체를 의미한다. 용어 "치환기"는 모 분자 상의 수소 원자를 교체하는 원자 또는 원자의 군을 나타낸다. 용어 "치환된"은 제시된 기가 하나 이상의 치환기를 보유함을 나타낸다. 임의의 기가 여러 치환기를 보유하고 다양한 가능한 치환기가 제공될 경우, 치환기는 독립적으로 선택되고, 동일할 필요는 없다. 용어 "비치환된"은 제시된 기가 치환기를 보유하지 않음을 의미한다. 용어 "임의로 치환된"은 제시된 기가 가능한 치환기의 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 치환 또는 비치환됨을 의미한다. 치환기의 수를 나타낼 때, 용어 "하나 이상의"는 하나의 치환기로부터 가장 많은 가능한 치환의 수, 즉 치환기에 의한 하나의 수소의 교체 내지 모든 수소의 교체를 의미한다.
용어 "알킬"은 본원에서 사용될 때 1 내지 12개의 탄소 원자 (C1-C12)의 포화 직쇄 또는 분지쇄 1가 탄화수소 라디칼을 나타내고, 여기서 알킬 라디칼은 임의로 아래에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 알킬 라디칼은 1 내지 8개의 탄소 원자 (C1-C8), 또는 1 내지 6개의 탄소 원자 (C1-C6)이다. 알킬기의 예는 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-헵틸, 1-옥틸 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"알킬렌"은 1-12개 탄소 원자 (C1-C12)의 포화 직쇄 또는 분지쇄 2가 탄화수소 라디칼을 의미하고, 여기서 알킬렌 라디칼은 임의로 아래에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 알킬렌 라디칼은 1 내지 8개의 탄소 원자 (C1-C8), 또는 1 내지 6개의 탄소 원자 (C1-C6)이다. 알킬렌 라디칼의 예는 메틸렌 (-CH2-), 에틸렌 (-CH2CH2-), 프로필렌 (-CH2CH2CH2-) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 "알케닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는 2 내지 8개의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지쇄 1가 탄화수소 라디칼을 나타내고, 여기서 알케닐 라디칼은 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환될 수 있고, "시스" 및 "트랜스" 배향, 또는 대안적으로, "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다. 그 예는 에틸레닐 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2) 등을 포함한다.
용어 "알케닐렌"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는 2 내지 8개의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지쇄 2가 탄화수소 라디칼을 나타내고, 여기서 알케닐렌 라디칼은 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환될 수 있고, "시스" 및 "트랜스" 배향, 또는 대안적으로, "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다. 그 예는 에틸레닐렌 또는 비닐렌 (-CH=CH-), 알릴 (-CH2CH=CH-) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"알키닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 2 내지 8개의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지쇄 1가 탄화수소 라디칼을 나타내고, 여기서 알키닐 라디칼은 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환될 수 있다. 그 예는 에티닐 (-C≡CH), 프로피닐 (프로파르길, -CH2C≡CH) 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
용어 "알키닐렌"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 2 내지 8개의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지쇄 2가 탄화수소 라디칼을 나타내고, 여기서 알키닐렌 라디칼은 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환될 수 있다. 그 예는 에티닐렌 (-C≡C-), 프로피닐렌 (프로파르길렌, -CH2C≡C-) 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
용어 "카르보사이클", "카르보시클릴", "카르보시클릭 고리" 및 "시클로알킬"은 모노시클릭 고리로서 3 내지 12개의 탄소 원자 (C3-C12) 또는 비시클릭 고리로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 1가의 비-방향족 포화 또는 부분 불포화 고리를 의미한다. 7 내지 12개의 원자를 갖는 비시클릭 카르보사이클은 예를 들어 비시클로[4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열될 수 있고, 9 또는 10개의 고리 원자를 갖는 비시클릭 카르보사이클은 비시클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서, 또는 가교 시스템, 예를 들어 비시클로[2.2.1]헵탄, 비시클로[2.2.2]옥탄 및 비시클로[3.2.2]노난으로서 배열될 수 있다. 스피로 모이어티도 본 정의의 범위 내에 포함된다. 모노시클릭 카르보사이클의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 1-시클로펜트-1-에닐, 1-시클로펜트-2-에닐, 1-시클로펜트-3-에닐, 시클로헥실, 1-시클로헥스-1-에닐, 1-시클로헥스-2-에닐, 1-시클로헥스-3-에닐, 시클로헥사디에닐, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로노닐, 시클로데실, 시클로운데실, 시클로도데실 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 카르보시클릴기는 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환된다.
"아릴"은 모 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 6-20개의 탄소 원자 (C6-C20)의 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 아릴기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 표시된다. 아릴은 포화, 부분 불포화 고리, 또는 방향족 카르보시클릭 고리에 융합된 방향족 고리를 포함하는 비시클릭 라디칼을 포함한다. 일반적인 아릴기는 벤젠으로부터 유도된 라디칼 (페닐), 치환 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐, 인데닐, 인다닐, 1,2-디히드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아릴기는 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환된다.
"아릴렌"은 모 방향족 고리계의 2개의 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 6-20개의 탄소 원자 (C6-C20)의 2가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 아릴기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 표시된다. 아릴렌은 포화, 부분 불포화 고리, 또는 방향족 카르보시클릭 고리에 융합된 방향족 고리를 포함하는 비시클릭 라디칼을 포함한다. 일반적인 아릴기는 벤젠으로부터 유도된 라디칼 (페닐렌), 치환 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐렌, 인데닐렌, 인다닐렌, 1,2-디히드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아릴렌기는 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환된다.
용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릴" 및 "헤테로시클릭 고리"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 하나 이상의 고리 원자가 질소, 산소, 인 및 황으로부터 선택되는 헤테로원자이고 나머지 고리 원자는 C인 3 내지 약 20개의 고리 원자의 포화 또는 부분 불포화 (즉, 고리 내에 하나 이상의 이중 및/또는 삼중 결합을 갖는) 카르보시클릭 라디칼을 의미하고, 여기서 하나 이상의 고리 원자는 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환된다. 헤테로사이클은 3 내지 7개의 고리 원자를 갖는 모노사이클 (탄소 원자 2 내지 6개, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 4개)일 수 있거나, 또는 7 내지 10개의 고리 원자를 갖는 비사이클 (탄소 원자 4 내지 9개, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 6개), 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다. 헤테로사이클은 문헌 [Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), 특히 1, 3, 4, 6, 7, 및 9장]; ["The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 제13, 14, 16, 19 및 28권]; 및 [J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기재되어 있다. "헤테로시클릴"은 또한 헤테로사이클 라디칼이 포화, 부분 불포화 고리, 또는 방향족 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리에 융합된 라디칼을 포함한다. 헤테로시클릭 고리의 예는 모르폴린-4-일, 피페리딘-1-일, 피페라지닐, 피페라진-4-일-2-온, 피페라진-4-일-3-온, 피롤리딘-1-일, 티오모르폴린-4-일, S-디옥소티오모르폴린-4-일, 아조칸-1-일, 아제티딘-1-일, 옥타히드로피리도[1,2-a]피라진-2-일, [1,4]디아제판-1-일, 피롤리디닐, 테트라히드로푸라닐, 디히드로푸라닐, 테트라히드로티에닐, 테트라히드로피라닐, 디히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 피페리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 티옥사닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 호모피페리디닐, 옥세파닐, 티에파닐, 옥사제피닐, 디아제피닐, 티아제피닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 인돌리닐, 2H-피라닐, 4H-피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 피라졸리닐, 디티아닐, 디티올라닐, 디히드로피라닐, 디히드로티에닐, 디히드로푸라닐, 피라졸리디닐이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 3-아자비시클로[3.1.0]헥사닐, 3-아자비시클로[4.1.0]헵타닐, 아자비시클로[2.2.2]헥사닐, 3H-인돌릴 퀴놀리지닐 및 N-피리딜 우레아를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 스피로 모이어티가 상기 정의 내에 포함된다. 2개의 고리 탄소 원자가 옥소 (=O) 모이어티로 치환된 헤테로시클릭기의 예는 피리미디노닐 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐이다. 본원에서 헤테로사이클기는 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환된다.
용어 "헤테로아릴"은 5원, 6원, 또는 7원 고리의 1가 방향족 라디칼을 의미하고, 질소, 산소, 및 황 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는, 5-20개 원자의 융합 고리계 (이 중 적어도 하나는 방향족임)를 포함한다. 헤테로아릴기의 예는 피리디닐 (예를 들어 2-히드록시피리디닐 포함), 이미다졸릴, 이미다조피리디닐, 피리미디닐 (예를 들어 4-히드록시피리미디닐 포함), 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 푸리닐, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐, 및 푸로피리디닐이다. 헤테로아릴기는 임의로 본원에서 설명되는 하나 이상의 치환기로 독립적으로 치환된다.
헤테로사이클 또는 헤테로아릴기는 가능한 경우에 탄소 (탄소-연결), 또는 질소 (질소-연결) 결합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 탄소 결합되는 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5, 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6, 푸란, 테트라히드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라히드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5, 이속사졸, 피라졸, 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8에 결합된다.
비제한적인 예로서, 질소 결합되는 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌, 또는 이소인돌린의 위치 2, 모르폴린의 위치 4, 및 카르바졸, 또는 β-카르볼린의 위치 9에 결합된다.
"대사물질"은 특정 화합물 또는 그의 염의 신체 내의 대사를 통해 생산된 산물이다. 화합물의 대사물질은 관련 기술 분야에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 확인할 수 있고, 그 활성은 본원에서 설명되는 바와 같은 시험을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 산물은 예를 들어 투여된 화합물의 산화, 환원, 가수분해, 아미드화, 탈아미드화, 에스테르화, 탈에스테르화, 효소에 의한 절단 등에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화학식 I의 화합물을 그의 대사 산물 생성에 충분한 시간 동안 포유동물과 접촉시키는 것을 포함하는 과정에 의해 생산된 화합물을 포함하는, 본 발명의 화합물의 대사물질을 포함한다.
용어 "제약 제제"는 그 내에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과를 보이도록 하는 형태이고 제제가 투여되는 대상체에게 허용되지 않은 독성을 보이는 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
"멸균" 제제는 무균 상태이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 존재하지 않는다.
"안정한" 제제는 그 내의 단백질이 보관시에 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 일체성을 본질적으로 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 관련 기술 분야에 이용가능하고, 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs. (1991)] 및 [Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에 검토되어 있다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 신속한 스크리닝을 위해, 제제는 2주 내지 1개월 동안 40℃에서 유지될 수 있고, 이때 안정성이 측정된다. 제제가 2-8℃에서 보관될 경우, 일반적으로 제제는 30℃ 또는 40℃에서 적어도 1개월 동안 및/또는 2-8℃에서 적어도 2년 동안 안정하여야 한다. 제제가 30℃에서 보관될 경우, 일반적으로 제제는 적어도 2년 동안 30℃에서 및/또는 40℃에서 적어도 6개월 동안 안정하여야 한다. 예를 들어, 보관 동안 응집 정도는 단백질 안정한의 지표로서 사용될 수 있다. 따라서, "안정한" 제제는 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만의 단백질이 제제 내에 응집체로서 존재하는 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, 제제의 보관 동안 응집체 형성의 임의의 증가가 결정될 수 있다.
"등장성" 제제는 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 것이다. 등장성 제제의 삼투압은 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm일 것이다. 용어 "저장성"은 인간 혈액의 삼투압 미만의 삼투압을 갖는 제제를 설명한다. 이에 대응하여, 용어 "고장성"은 인간 혈액의 삼투압 초과의 삼투압을 갖는 제제를 설명하기 위해 사용된다. 등장성은 예를 들어 증기압 또는 빙냉형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 제제는 염 및/또는 완충제의 첨가의 결과로서 고장성이다.
본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 그에 노출된 세포 또는 포유동물에 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종 생리학상 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈®, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 플루로닉스(PLURONICS)™을 포함한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 의미한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. "제약상 허용되는 산"은 제제화되는 농도 및 방식에서 비독성인 무기 및 유기 산을 포함한다. 예를 들어, 적합한 무기 산은 염산, 과염소산, 브롬화수소산, 아이오드화수소산, 질산, 황산, 술폰산, 술핀산, 술파닐, 인산, 탄산 등을 포함한다. 적합한 유기 산은 직쇄 및 분지쇄 알킬, 방향족, 시클릭, 지환족, 아릴지방족, 헤테로시클릭, 포화, 불포화, 모노-, 디- 및 트리카르복실산, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 2-히드록시아세트산, 트리플루오로아세트산, 페닐아세트산, 트리메틸아세트산, t-부틸 아세트산, 안트라닐산, 프로판산, 2-히드록시프로판산, 2-옥소프로판산, 프로판디오산, 시클로펜탄프로피온산, 시클로펜탄 프로피온산, 3-페닐프로피온산, 부탄산, 부탄디오산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 아스코르브산, 신남산, 라우릴 황산, 스테아르산, 무콘산, 만델산, 숙신산, 엠본산, 푸마르산, 말산, 말레산, 히드록시말레산, 말론산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 글리콜산, 글리콘산, 글루콘산, 피루브산, 글리옥살산, 옥살산, 메실산, 숙신산, 살리실산, 프탈산, 팔모산, 팔메산, 티오시안산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, p-톨루엔술폰산, 캄포르술폰산, 4-메틸비시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-3-(히드록시-2-엔-1-카르복실산), 히드록시나프토산을 포함한다.
"제약상 허용되는 염기"는 제제화되는 농도 및 방식에서 비독성인 무기 및 유기 염기를 포함한다. 예를 들어, 적합한 염기는 무기 염기 형성 금속, 예컨대 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄, N-메틸글루카민, 모르폴린, 피페리딘으로부터 형성된 것 및 유기 비독성 염기, 예를 들어 1급, 2급 및 3급 아민, 치환된 아민, 시클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지 [예를 들어, N(R')4 + (여기서, R'는 독립적으로 H 또는 C1-4 알킬, 예를 들어, 암모늄, 트리스임)], 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸 아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디에틸아미노에탄올, 트리메타민, 디시클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등을 포함한다. 특히 바람직한 유기 비-독성 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메타민, 디시클로헥실아민, 콜린, 및 카페인이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 추가의 제약상 허용되는 산 및 염기는 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 글리신, 페닐알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 리신 및 아스파라긴으로부터 유래된 것을 포함한다.
"제약상 허용되는" 완충제 및 염은 상기 나타낸 산 및 염기의 산 및 염기 부가 염 둘 모두로부터 유래된 것을 포함한다. 특정 완충제 및/또는 염은 히스티딘, 숙시네이트 및 아세테이트를 포함한다.
"제약상 허용되는 당"은 관심있는 단백질과 조합될 때 단백질의 보관시 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 유의하게 방지하거나 감소시키는 분자이다. 제제가 동결건조된 후 재구성되는 것이 의도될 때, "제약상 허용되는 당"은 "동결보호제"로도 알려질 수 있다. 예시적인 당 및 그의 대응하는 당 알콜은 다음을 포함한다: 아미노산, 예컨대 모노나트륨 글루타메이트 또는 히스티딘; 메틸아민, 예컨대 베타인; 이액성 (lyotropic) 염, 예컨대 황산마그네슘; 폴리올, 예컨대 3가 이사상의 고분자량 당 알콜, 예를 들어 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉스®; 및 이들의 조합물. 추가의 예시적인 동결보호제는 글리세린 및 젤라틴, 및 당 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스 및 스타키오스를 포함한다. 환원 당의 예는 글루코스, 말토스, 락토스, 말툴로스, 이소-말툴로스 및 락툴로스를 포함한다. 비-환원 당의 예는 당 알콜 및 다른 직쇄 폴리알콜로부터 선택되는 폴리히드록시 화합물의 비-환원 글리코시드를 포함한다. 바람직한 당 알콜은 모노글리코시드, 특히 이당류, 예컨대 락토스, 말토스, 락툴로스 및 말툴로스의 환원에 의해 얻어지는 화합물이다. 글리코시드 측기는 글루코시드 또는 갈락토시드일 수 있다. 당 알콜의 추가의 예는 글루시톨, 말티톨, 락티톨 및 이소-말툴로스이다. 바람직한 제약상 허용되는 당은 비-환원 당 트레할로스 또는 수크로스이다. 제약상 허용되는 당은 단백질이 보관 동안 (예를 들어, 재구성 및 보관 후에) 그의 물리적 및/또는 화학적 안정성 및 일체성을 본질적으로 보유함을 의미하는 "보호량" (예를 들어 동결건조 전)으로 제제에 첨가된다.
본원에서 관심있는 "희석제"는 제약상 허용되고 (인간 투여를 위해 안전하고 비-독성임) 액체 제제, 예컨대 동결건조 후에 재구성되는 제제의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 희석제는 멸균수, 주사용 정균수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어 포스페이트 완충 염수), 링거 (Ringer)액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 대체 실시양태에서, 희석제는 염 및/또는 완충제의 수용액을 포함할 수 있다.
"보존제"는 박테리아 활성을 감소시키기 위해 본원에서 제제에 첨가될 수 있는 화합물이다. 보존제의 첨가는 예를 들어 다수 사용 (다중 용량) 제제의 생산을 촉진할 수 있다. 효과적인 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 종류의 보존제는 방향족 알콜, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다. 본원에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알콜이다.
"개체" 또는 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료" (및 그의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")은 임상적 병리 과정 동안 치료되는 개체, 조직 또는 세포의 천연 과정을 변경하기 위해 설계된 임상적 개입을 나타낸다. 바람직한 치료 효과는 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하고, 이로 제한되지 않고, 이들은 모두 의사와 같은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 측정가능하다. 한 실시양태에서, 치료는 증상의 완화, 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 감염성 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 예후의 차도 또는 개선을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 감염성 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "와 함께"는 또 다른 치료 방식과 더불어 한 치료 방식의 실시를 나타낸다. 따라서, "와 함께"는 개체에게 다른 치료 방식의 실시 전, 동안 또는 후에 한 치료 방식의 실시를 나타낸다.
용어 "파고솜 (phagosome)"은 포식 세포의 내재화된, 막으로 둘러싸인 세포내이입 소포이다. 이것은 직접-, 항체- 또는 보체-향상된 포식작용에 의해 개시될 수 있다. 용어 "파고리소솜"은 하나 이상의 리소솜과 융합된 내재화된 세포 소포를 의미한다.
박테리아는 전통적으로 그의 그람 염색 보유를 기초로 하여 2개의 주요 군, 즉 그람 양성 (Gm+) 및 그람 음성 (Gm-)으로 나뉜다. 그람 양성 박테리아는 단일 단위 지질 막에 의해 결합되고, 일반적으로 그람 염색을 보유하기 위한 펩티도글리칸의 두꺼운 층 (20-80 nm)을 포함한다. 그람 양성 박테리아는 그람 염색에 의해 암청색 또는 보라색으로 염색된다. 이와 대조적으로, 그람 음성 박테리아는 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) 염색을 보유할 수 없고, 대신에 역염색 (사프라닌 또는 푹신 (fuchsine))을 흡수하고 적색 또는 분홍색으로 보인다. 그람 양성 세포벽은 일반적으로 그람 음성 박테리아에서 발견되는 외부막이 결여된다.
용어 "균혈증"은 혈액 배양액을 통해 가장 흔하게 검출되는 혈류 내의 박테리아의 존재를 의미한다. 박테리아는 감염 (예를 들어, 폐렴 또는 수막염)의 심한 합병증으로서, 수술 동안 (특히 점막, 예컨대 위장관이 관련된), 또는 카테터 및 정맥 또는 동맥에 들어가는 다른 외부 물체에 의해 혈류에 들어갈 수 있다. 균혈증은 심각한 결과를 야기할 수 있다. 박테리아에 대한 면역 반응은 패혈증 및 패혈성 쇼크를 야기할 수 있고, 이것은 비교적 사망률이 높다. 박테리아는 또한 신체의 다른 부분으로 전파하기 위해 혈액을 이용하고, 이것은 감염을 본래의 감염 부위로부터 확산시킨다. 그 예는 심내막염 또는 골수염을 포함한다.
"치료 유효량"은 특정 장애의 측정가능한 개선을 달성하기에 필요한 최소 농도이다. 본원에서 치료 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 요구되는 반응을 유도하는 항체의 능력과 같은 요인에 따라 다를 수 있다. 치료 유효량은 또한 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료상 유익한 효과가 더 큰 것이다. 한 실시양태에서, 치료 유효량은 생체내 감염에서 균혈증을 감소시키기에 효과적인 양이다. 한 측면에서, "치료 유효량"은 적어도 환자 샘플, 예컨대 혈액으로부터 단리된 박테리아 로드 또는 콜로니 형성 단위 (CFU)를 약물 투여 전에 비해 적어도 1 로그 감소시키기에 효과적인 양이다. 보다 구체적인 측면에서, 감소는 적어도 2 로그이다. 또 다른 측면에서, 감소는 3, 4, 5 로그이다. 추가의 또 다른 측면에서, 감소는 검출가능한 수준 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 감염된 환자의 치료 전 또는 치료 개시시에 비해 음성 혈액 배양액 (즉, AAC의 표적인 박테리아의 성장을 허용하지 않는)을 달성하는, 치료 기간에 걸쳐 제시된 하나 이상의 용량 내의 AAC의 양이다.
"예방 유효량"은 요구되는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 시간에 효과적인 양을 의미한다. 일반적으로, 반드시는 아니지만, 예방 용량은 질환 발생 전에, 질환의 보다 이른 시기에, 또는 심지어 감염 위험이 상승하는 상태에 노출되기 전에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 수 있다. 한 실시양태에서, 예방 유효량은 적어도 감염의 발생 또는 한 세포로부터 또 다른 세포로의 전파를 감소시키거나 억졔하기에 효과적인 양이다.
"만성" 투여는 급성 방식과 달리 연장된 기간 동안 초기 치료 효과 (활성)를 유지하기 위해 연속적인 방식으로 물질(들)을 투여하는 것을 의미한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 행해지지는 않지만, 특성상 주기적인 치료이다.
용어 "포장 삽입물"은 적응증, 사용, 투여량, 투여, 조합 요법에 대한 정보, 금기사항 및/또는 치료 제품 사용에 대한 경고를 포함하는, 치료 제품의 상업적 포장에 통상적으로 포함되는 사용 지시물을 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너에 겹쳐질 수 없는 특성을 갖는 분자를 의미하고, 용어 "아키랄 (achiral)"은 그의 거울상 파트너에 겹쳐질 수 있는 분자를 의미한다.
용어 "입체 이성질체"는 동일한 화학적 구성을 갖지만, 공간의 원자 또는 기의 배열에서 상이한 화합물을 의미한다.
"부분 입체 이성질체"는 2 이상의 키랄 중심이 있고 이들 분자가 서로 거울상이 아닌 입체 이성질체를 의미한다. 부분 입체 이성질체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어, 융점, 비점, 스펙트럼 성질, 및 반응성을 갖는다. 부분 입체 이성질체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고 분해능 분석 절차 하에 분리될 수 있다.
"거울상 이성질체"는 서로 겹쳐질 수 없는 거울상인 화합물의 2개의 입체 이성질체를 의미한다.
본원에서 사용된 입체화학 정의 및 규약은 일반적으로 문헌 [S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York]; 및 [Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc. New York]을 따른다. 많은 유기 화합물은 광학 활성 형태로 존재하고, 즉, 이들은 평면 편광의 평면을 회전하는 능력을 갖는다. 광학 활성 화합물을 설명할 때, 접두어 D 및 L, 또는 R 및 S는 그의 키랄 중심(들)에 대해 분자의 절대적 입체형태를 표시하기 위해 사용된다. 접두어 d 및 l 또는 (+) 및 (-)은 화합물에 의한 평면 평광의 회전 표시를 나타내기 위해 사용되는데, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. 접두어 (+) 또는 d로 표시된 화합물은 우선성이다. 주어진 화학적 구조에서, 이 입체 이성질체는 이들이 서로 거울상이라는 것만 제외하고는 동일하다. 특정 입체 이성질체는 또한 거울상 이성질체로 불릴 수 있고, 이러한 이성질체의 혼합물은 종종 거울상 이성질체 혼합물로 불린다. 거울상 이성질체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로 불리는데, 이들은 화학적 반응 또는 과정에 있어, 임의의 입체선택성 또는 입체특이성도 존재하지 않은 경우가 있을 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 두 개의 거울상 이성질체 종의 등몰 혼합물을 의미한다.
용어 "보호기"는 화합물 상의 다른 관능기와 반응하면서 특정 관능기를 차단 또는 보호하기 위해 통상적으로 사용되는 치환기를 의미한다. 예를 들어, "아미노-보호기"는 화합물 내의 아미노 관능기를 차단 또는 보호하는, 아미노기에 부착된 치환기이다. 적합한 아미노-보호기는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc)을 포함한다. 보호기 및 그의 용도에 대한 일반적인 설명에 대해서는, 문헌 [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991], 또는 후속 판을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 특정 값 또는 파라미터는 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 실시양태를 포함한다 (설명한다).
본원에서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 분명하게 나타내지 않으면 복수의 참조물을 포함한다. 예를 들어, "항체"라는 언급은 하나의 항체로부터 많은 항체, 예컨대 몰량까지 언급하는 것이고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 그의 동등물 등을 포함한다.
III. 조성물 및 방법
항체-항생제 접합체 ( AAC )
본 발명의 AAC 화합물은 스타필로코쿠스를 포함하는, 많은 인간 및 가축 그람 양성, 그람 음성 병원체에 대해 효과적인 항박테리아 활성을 갖는 것을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, AAC 화합물은 리파마이신-유형 항생제 모이어티에 접합된, 즉 링커에 의해 공유 부착된 시스테인-조작된 항체를 포함한다. 리파마이신-유형 항생제 모이어티의 생물학적 활성은 항체에 대한 접합에 의해 조절된다. 본 발명의 항체-항생제 접합체 (AAC)는 효과적인 용량의 항박테리아를 감염 부위에 선택적으로 전달하고, 이에 의해 치료 지수 ("치료 윈도우 (therapeutic window)")를 증가시키면서 보다 큰 선택성, 즉 효능있는 보다 낮은 용량이 달성될 수 있다.
본 발명은 통상적인 항생제 요법을 회피한 박테리아 집단을 표적화함으로써 항생제 회피를 방지하는 것을 돕는 신규한 항박테리아 요법을 제공한다. 신규한 항박테리아 요법은 에스. 아우레우스 (MRSA 포함)에서 발견되는 세포벽 성분에 특이적인 항체가 강력한 항생제 (리파마이신의 유도체)에 화학적으로 연결된 항체 항생제 접합체 (AAC)를 사용하여 달성된다. 항생제는 대부분의 포유동물 세포 종류에서 발견되는 리소솜 프로테아제인 카텝신 B에 의해 절단되도록 설계된 프로테아제 절단가능한 펩티드 링커를 통해 항체에 연결된다 (Dubowchik et al. (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869). AAC는 링커가 절단될 때까지 항생제가 불활성인 (항체의 큰 크기에 의해) 전구약물로서 작용한다. 천연 감염에서 발견되는 유의한 비율의 에스. 아우레우스가 숙주 세포, 주로 호중구 및 대식세포에 의해 흡수되기 때문에, 숙주 내의 감염 경로 동안 몇몇 지점에서 및 숙주 세포 내에서 경과된 시간은 박테리아가 항생제 활성을 회피할 기회를 제공한다. 본 발명의 AAC는 에스. 아우레우스에 결합하고 박테리아가 숙주 세포에 의해 흡수된 후 파고리소솜 내에 항생제를 방출하도록 설계된다. 이 메카니즘에 의해, AAC는 활성 항생제를 에스. 아우레우스가 통상적인 항생제에 의해 불량하게 처리되는 위치에 특이적으로 집중시킬 수 있다. 본 발명이 특정 작용 메카니즘으로 제한되거나 한정되지 않지만, AAC는 다음 3개의 가능한 메카니즘을 통해 항생제 활성을 개선한다: (1) AAC는 박테리아를 흡수한 포유동물 세포 내에 항생제를 전달하여, 박테리아가 격리된 파고리소솜 내에 불량하게 확산하는 항생제의 효력을 증가시킨다. (2) AAC는 박테리아를 옵소닌화하고 - 이에 의해, 포식 세포에 의한 자유 박테리아의 흡수가 증가하고 - 이들이 파고리소솜에 격리되면서 박테리아를 사멸시키기 위해 항생제를 국소 방출한다. (3) AAC는 항생제를 항체에 연결함으로써 생체내에서 항생제의 반감기를 개선한다 (개선된 약동학). AAC의 개선된 약동학을 통해, 전신 투여를 필요로 하는 항생제의 총 용량을 제한하면서 에스. 아우레우스가 집중되는 영역에 충분한 항생제를 전달할 수 있다. 상기 특성은 최소의 항생제 부작용을 보이면서 AAC를 사용한 장기 요법이 지속 감염을 표적화하도록 허용하여야 한다.
본원은 신규한 접합된 항-WTA 항체 치료제 및 에스. 아우레우스 감염을 포함하는 그람 양성 (Gm+) 박테리아 감염의 치료에서 그의 용도를 설명한다. 상기 항체는 통상적인 항생제 요법을 회피하는 Gm+ 박테리아 집단을 표적화할 수 있다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물은 펩티드 링커에 의해 리파마이신-유형 항생제에 공유 부착된 항-세포벽 테이코산 베타 (WTA 베타) 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체-항생제 접합체는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00025
상기 식에서,
Ab는 항-세포벽 테이코산 항체이고;
L은 화학식
Figure pct00026
로 표시되는 펩티드 링커이고,
여기서, Str은 스트레처 단위이고; Pep는 2 내지 12개 아미노산 잔기의 펩티드이고, Y는 스페이서 단위이고;
abx는 리파마이신-유형 항생제이고;
p는 1 내지 8의 정수이다.
반응성 링커 모이어티를 통해 항체 분자에 접합될 수 있는 항생제 모이어티의 수는 본원에서 설명되는 방법에 의해 도입되는 자유 시스테인 잔기의 수에 의해 제한될 수 있다. 따라서, 화학식 I의 예시적인 AAC는 1, 2, 3, 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함한다 (Lyon, R. et al. (2012) Methods in Enzym. 502: 123-138).
항-세포벽 테이코산 ( WTA ) 항체
스타필로코쿠스 아우레우스를 포함하는 많은 Gm+ 박테리아 상에 발현되는 WTA에 결합하는 특정 항-WTA Ab 및 접합된 항-WTA 항체가 본원에 개시된다. 항-WTA 항체는 US 8283294; 문헌 [Meijer PJ et al. (2006) J Mol Biol. 358(3):764-72]; [Lantto J, et al. (2011) J Virol. 85(4): 1820-33], 및 하기 실시예 21에서 개시되는 방법에 의해 선택되고 생산될 수 있다. 본 발명은 상기 항-WTA Ab의 조성물을 제공한다.
그람 양성 박테리아의 세포벽은 세포막을 안정화할 뿐만 아니라 다른 분자가 부착할 수 있는 많은 부위를 제공하는 다중 펩티도글리칸 (PGN) 외피의 두꺼운 층을 포함한다 (도 3). 이들 세포 표면 당단백질의 주요 클래스는 테이코산 ("TA")이고, 이것은 많은 글리칸-결합 단백질 (GPB)에서 발견되는 포스페이트-풍부 분자이다. TA는 다음 두 종류로 분류된다: (1) 원형질막에 고정되고 세포 표면으로부터 펩티도글리칸 층으로 연장되는 지질 테이코산 ("LTA"); 및 (2) 펩티도글리칸에 공유 부착되고 세포벽을 통과하여 그 너머로 연장되는 세포벽 TA (WTA) (도 3). WTA는 GPB 내의 총 세포벽 질량의 60%나 되는 많은 부분을 차지할 수 있다. 그 결과, 고도로 발현된 세포 표면 항원을 제시한다.
WTA의 화학적 구조는 유기체마다 상이하다. 에스. 아우레우스에서, WTA는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)-1-P 및 N-아세틸만노스아민 (ManNAc)으로 이루어진 이당류, 이어서 약 2 또는 3 단위의 글리세롤-포스페이트를 통해 N-아세틸 무람산 (MurNAc)의 6-OH에 공유 연결된다 (도 4). 실제 WTA 중합체는 약 11-40개의 리비톨-포스페이트 (Rbo-P) 반복 단위로 이루어진다. WTA의 단계적인 합성은 TagO로 불리는 효소에 의해 먼저 개시되고, TagO 유전자가 결여된 에스. 아우레우스 균주 (유전자의 인공적인 결실에 의한)는 임의의 WTA를 생산하지 않는다. 반복 단위는 C2-OH에서 D-알라닌 (D-Ala)으로 및/또는 C4-OH 위치에서 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)으로 α-(알파) 또는 β-(베타) 글리코시드 연결을 통해 추가로 조정될 수 있다. 에스. 아우레우스 균주, 또는 박테리아의 성장기에 따라, 박테리아 글리코시드 연결은 α-, β-, 또는 두 아노머의 혼합물일 수 있다. 상기 GlcNAc 당 변형은 2개의 특이적인 에스. 아우레우스-유래 글리코실트랜스퍼라제 (Gtf)에 의해 조정된다: TarM Gtf는 α-글리코시드 연결을 매개하고, TarS Gtf는 β-(베타)글리코시드 연결을 매개한다.
MRSA의 세포내 저장이 항생제로부터 보호된다는 유의한 증거를 감안하여, 본 발명의 신규한 치료 조성물은 박테리아가 숙주 세포에 의해 생체내에서 삼켜지거나 내재화될 때 항생제를 숙주 세포 내로 함께 도입하도록 항생제를 박테리아에 묶기 위해 에스. 아우레우스 특이적 항체를 사용함으로써 상기 항생제 회피 방법을 억제하기 위해 개발되었다.
한 측면에서, 본 발명은 항-WTAα 또는 항-WTAβ인 항-WTA 항체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 항-에스. 아우레우스 Ab를 제공한다. 예시적인 Ab는 에스. 아우레우스 감염 환자로부터의 B 세포로부터 클로닝하였다 (실시예 21에서 개시된 바와 같이). 한 실시양태에서, 항-WTA 및 항-에스. 아우레우스 Ab는 인간 모노클로날 항체이다. 본 발명은 본 발명의 WTA Ab의 CDR을 포함하는 키메라 Ab 및 인간화 Ab를 포함한다.
치료 용도를 위해, AAC를 생성하기 위해 항생제에 접합시키기 위한 본 발명의 WTA Ab는 IgM을 제외한 임의의 이소형일 수 있다. 한 실시양태에서, WTA Ab는 인간 IgG 이소형이다. 보다 구체적인 실시양태에서, WTA Ab는 인간 IgG1이다.
도 6a 및 6b는 항-WTAα 또는 항-WTAβ인 Ab를 제시한다. 명세서 및 도면 전체에 걸쳐서, 4자리 숫자 (예를 들어, 4497)로 표시된 Ab는 또한 앞의 "S"와 함께, 예를 들어, S4497로 언급될 수 있고; 두 명칭은 모두 항체의 야생형 (WT) 비변형 서열인 동일한 항체를 나타낸다. 항체의 변이체는 "v", 이어서 항체 번호, 예를 들어, 4497.v8로 표시된다. 특정되지 않으면 (예를 들어 변이체 번호에 의해), 제시된 아미노산 서열은 본래의 비변형된/비변경된 서열이다. 이들 Ab는 야생형의 비변형된 항체에 비해 항원에 대한 실질적으로 거의 동일한 또는 개선된 결합 친화도를 유지하면서, 예를 들어 pK, 안정성, 발현, 제조성 (예를 들어, 아래 실시예에서 설명되는 바와 같은)을 개선하기 위해 하나 이상의 잔기에서 변경될 수 있다. 보존적 아미노산 치환을 갖는 본 발명의 WTA 항체의 변이체는 본 발명에 포함된다. 아래에서 달리 특정되지 않으면, CDR 넘버링은 카바트에 따르고, 불변 도메인 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
도 13a 및 도 13b는 4개의 인간 항-WTA 알파 항체의 각각의 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열 정렬을 제공한다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 서열 CDR L1, L2, L3 및 CDR H1, H2, H3은 밑줄로 표시한다.
<표 6A>: 항-WTAα의 경쇄 CDR 서열
Figure pct00027
<표 6B>: 항-WTAα의 중쇄 CDR 서열
Figure pct00028
VL 및 VH의 각각의 쌍의 서열은 다음과 같다:
4461 경쇄 가변 영역
Figure pct00029
4461 중쇄 가변 영역
Figure pct00030
4624 경쇄 가변 영역
Figure pct00031
4624 중쇄 가변 영역
Figure pct00032
4399 경쇄 가변 영역
Figure pct00033
4399 중쇄 가변 영역
Figure pct00034
6267 경쇄 가변 영역
Figure pct00035
6267 중쇄 가변 영역
Figure pct00036
본 발명은 경쇄 및 H 쇄를 포함하는, 세포벽 테이코산 (WTA)에 결합하는 단리된 모노클로날 항체를 제공하고, L 쇄는 CDR L1, CDR L2, 및 CDR L3을 포함하고 H 쇄는 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함하고, 여기서 CDR L1, L2, L3 및 H1, H2, H3은 표 6A 및 6B에 제시된 바와 같이 각각의 Ab 4461 (서열 1-6), 4624 (서열 7-12), 4399 (서열 13-18), 및 6267 (서열 19-24)의 CDR의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
또 다른 실시양태에서, WTA에 결합하는 단리된 모노클로날 Ab는 H 쇄 가변 영역 (VH) 및 L 쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VH는 각각의 항체 4461, 4624, 4399, 및 6267의 VH 영역 서열의 길이에 걸쳐 각각 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 구체적인 측면에서, 서열 동일성은 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
본 발명은 또한 도 14에 제시된 L 및 H 쇄 CDR 서열을 포함하는 항-WTA 베타 Ab을 제공한다. 한 실시양태에서, 단리된 항-WTA 베타 모노클로날 Ab는 도 14의 각각의 13개의 Ab의 CDR로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR L1, L2, L3 및 H1, H2, H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 각각의 13개의 항체의 V 영역 도메인의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 항-WTA 베타 Ab를 제공한다. 또 다른 구체적인 측면에서, 서열 동일성은 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
13개의 항-WTA 베타 Ab 중에서, 6078 및 4497은 i) 링커-항생제 중간체에 대한 접합을 위해 L 및 H 쇄 중 하나 또는 둘 모두에 조작된 Cys을 갖고; ii) H 쇄 Q 내의 제1 잔기가 E로 변경되거나 (v2) 또는 처음 2개의 잔기 QM이 EI 또는 EV로 변경된 (v3 및 v4) 변이체를 생성하도록 변형되었다.
도 15aa 및 15ab는 항-WTA 베타 Ab 6078 (비변형된) 및 그의 변이체, v2, v3, v4의 전장 L 쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 조작된 Cys을 포함하는 L 쇄 변이체는 불변 영역의 말단부 근처의 흑색 박스 내의 C로 표시된다 (이 경우 EU 잔기 번호 205에). 변이체 명칭, 예를 들어, v2LC-Cys는 L 쇄 내에 조작된 Cys를 포함하는 변이체 2를 의미한다. HCLC-Cys는 H 및 L 쇄 둘 모두가 조작된 Cys를 포함함을 의미한다. 도 15ba 내지 15bd는 항-WTA 베타 Ab 6078 (비변형된) 및 H 쇄의 제1 또는 처음 2개의 잔기에 변화를 갖는 그의 변이체 v2, v3, v4의 전장 H 쇄의 정렬을 보여준다. 조작된 Cys을 함유하는 H 쇄 변이체는 불변 영역의 말단부 근처의 흑색 박스 내의 C로 표시된다 (이 경우에 EU 잔기 번호 118에).
6078 경쇄 가변 영역 (VL)
Figure pct00037
6078 중쇄 가변 영역 (VH)
Figure pct00038
여기서, X는 Q 또는 E이고; X1은 M, I 또는 V이다.
6078 경쇄
Figure pct00039
6078 시스테인-조작된 경쇄
Figure pct00040
6078 WT 전장 중쇄
Figure pct00041
6078 변이체 (v2, v3, 또는 v4) 전장 중쇄
Figure pct00042
여기서, X는 M, I 또는 V일 수 있다.
6078 변이체 (v2, v3 또는 v4), Cys-조작된 중쇄
Figure pct00043
여기서, X는 M, I 또는 V이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항-WTA 베타 항체를 제공하고, 여기서 중쇄는 서열 112에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열 111에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 항-WTA 베타 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서 L 쇄는 서열 111의 VL을 포함하고, H 쇄는 서열 112의 VH를 포함한다. 추가의 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 항-WTA 베타 항체는 서열 113의 L 쇄 및 서열 114의 H 쇄를 포함한다.
6078 Cys-조작된 H 및 L 쇄 변이체는 본 발명의 항-WTA AAC를 생성하기 위해 링커-Abx 중간체에 접합시키기 위한 전체 Ab를 형성하기 위해 임의의 다음 조합으로 쌍을 이룰 수 있다. 비변형된 L 쇄 (서열 113)은 서열 117의 Cys-조작된 H 쇄 변이체와 쌍을 이룰 수 있고; 변이체는 X가 M, I 또는 V인 것일 수 있다. 서열 115의 Cys-조작된 L 쇄는 서열 114의 H 쇄; 서열 116의 H 쇄 변이체; 또는 서열 117의 Cys-조작된 H 쇄 변이체 (이 버전에서, H 및 L 쇄 둘 모두가 Cys 조작된다)와 쌍을 이룰 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-WTA 베타 항체 및 항-WTA 베타 AAC는 서열 115의 L 쇄 및 서열 116의 H 쇄를 포함한다.
도 16aa 및 16ab는 항-WTA 베타 Ab 4497 (비변형된) 및 그의 v8 변이체의 전장 L 쇄를 제공한다. 조작된 Cys을 포함하는 L 쇄 변이체는 불변 영역의 말단부 근처의 흑색 박스 내의 C로 표시된다 (이 경우 EU 잔기 번호 205에). 도 16ba, 16bb, 16bc는 항-WTA 베타 Ab 4497 (비변형된) 및 CDR H3 위치 96에서 D가 E로 변경되고 조작된 Cys를 갖거나 갖지 않는 그의 v8 변이체의 전장 H 쇄의 정렬을 보여준다. 조작된 Cys을 함유하는 H 쇄 변이체는 불변 영역의 말단부 근처의 흑색 박스 내의 C로 표시된다 (이 경우에 EU 잔기 번호 118에). 비변형된 CDR H3은 GDGGLDD (서열 104)이고; 4497v8 CDR H3은 GEGGLDD (서열 118)이다.
4497 경쇄 가변 영역
Figure pct00044
4497 중쇄 가변 영역
Figure pct00045
4497.v8 중쇄 가변 영역
Figure pct00046
4497 경쇄
Figure pct00047
4497 v.8 중쇄
Figure pct00048
4497 -Cys 경쇄
Figure pct00049
4497.v8- 중쇄
Figure pct00050
(서열 122와 동일)
4497.v8 -Cys 중쇄
Figure pct00051
본 발명에 의해 제공되는 또 다른 단리된 항-WTA 베타 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열 120에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열 119에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 추가로 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 항-WTA 베타 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서 L 쇄는 서열 119의 VL을 포함하고, H 쇄는 서열 120의 VH를 포함한다. 추가의 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 항-WTA 베타 항체는 서열 121의 L 쇄 및 서열 122의 H 쇄를 포함한다.
4497 Cys-조작된 H 및 L 쇄 변이체는 본 발명의 항-WTA AAC를 생성하기 위해 링커-Abx 중간체에 접합시키기 위한 전체 Ab를 형성하기 위해 임의의 다음 조합으로 쌍을 이룰 수 있다. 비변형된 L 쇄 (서열 121)은 서열 124의 Cys-조작된 H 쇄 변이체와 쌍을 이룰 수 있다. 서열 123의 Cys-조작된 L 쇄는 서열 157의 H 쇄 변이체; 또는 서열 124의 Cys-조작된 H 쇄 변이체 (이 버전에서, H 및 L 쇄 둘 모두가 Cys 조작된다)와 쌍을 이룰 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-WTA 베타 항체 및 항-WTA 베타 AAC는 서열 123의 L 쇄를 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태는 도 13a 및 도 13b의 각각의 항-WTA 알파 Ab와 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한, 도 14, 도 15a 및 15b, 및 도 16a 및 16b의 각각의 항-WTA 베타 Ab와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
항-WTA 항체의 WTA에 대한 결합은 WTA에 대한 GlcNAc-당 변형의 아노머 배향에 의해 영향받는다. WTA는 각각 TarM 글리코실트랜스퍼라제 또는 TarS 글리코실트랜스퍼라제에 의한, α- 또는 β-글리코시드 연결을 통한 C4-OH 위치에서의 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 당 변형에 의해 변형된다. 따라서, TarM (ΔTarM), TarS (ΔTarS), 또는 TarM 및 TarS 둘 모두 (ΔTarM/ΔTarS)가 결여된 글리코실트랜스퍼라제 돌연변이체 균주로부터의 세포벽 제제를 WTA에 대한 항체를 사용하는 면역블로팅 (immunoblotting) 분석에 적용하였다. WTA에 대한 α-GlcNAc 변형에 특이적인 WTA 항체 (S7574)는 ΔTarM 균주로부터의 세포벽에 결합하지 않는다. 그 반대로, WTA에 대한 β-GlcNAc 변형에 특이적인 WTA 항체 (S4462)는 ΔTarS 균주로부터의 세포벽에 결합하지 않는다. 예상되는 바와 같이, 이들 항체는 모두 두 글리코실트랜스퍼라제가 결여된 결실 균주 (ΔTarM/ΔTarS) 및 또한 임의의 WTA에 결여된 균주 (ΔTagO)로부터의 세포벽 제제에 결합하지 않는다. 상기 분석에 따라, 항체는 도 6a 및 6b의 표에 제시된 바와 같이 항-α-GlcNAc WTA mAb로서, 또는 항-β-GlcNAc WTA mAb로서 특성화되었다.
시스테인 아미노산은 항체 내의 반응성 부위에서 조작될 수 있고 쇄내 또는 분자간 디술피드 연결을 형성하지 않는다 ([Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932]; [Dornan et al. (2009) Blood 114(13):2721-2729]; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249, [Shen et al. (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191]; [Junutula et al. (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52]). 조작된 시스테인 티올은 티올-반응성, 친전자성 기, 예컨대 말레이미드 또는 알파-할로 아미드를 갖는 본 발명의 링커 시약 또는 링커-항생제 중간체와 반응하여 시스테인 조작된 항체 (티오Mab) 및 항생제 (abx) 모이어티를 갖는 AAC를 형성할 수 있다. 항생제 모이어티의 위치는 따라서 설계되고, 제어되고, 알려질 수 있다. 항생제 로딩은 조작된 시스테인 티올기가 일반적으로 고수율로 티올-반응성 링커 시약 또는 링커-항생제 중간체와 반응하기 때문에 제어될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 상의 단일 부위에서 치환에 의해 시스테인 아미노산을 도입하기 위한 항-WTA 항체의 조작은 대칭적인 사량체 항체에 2개의 새로운 시스테인을 제공한다. 약 2의 항생제 로딩은 접합 산물 AAC의 균일성 근처에서 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항-WTA 항체, 예를 들어, "티오MAb"을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 항체의 접근가능 부위에 위치하고, 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이, 면역접합체를 생성하기 위해 항체를 다른 모이어티, 예컨대 항생제 모이어티 또는 링커-항생제 모이어티에 접합시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링)을 포함하는 임의의 하나 이상의 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다. 항-WTA 항체의 비제한적인 예시적인 시스테인 조작된 중쇄 A118C (서열 149) 및 경쇄 V205C (서열 151) 돌연변이체가 제시된다. 시스테인 조작된 항-WTA 항체는 문헌에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다 ([Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932]; US 7521541; US-2011/0301334).
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항-WTA 항체에 관한 것이고, 여기서 중쇄는 야생형 중쇄 불변 영역 서열 또는 시스테인-조작된 돌연변이체 (티오Mab)를 포함하고, 경쇄는 야생형 경쇄 불변 영역 서열 또는 시스테인-조작된 돌연변이체 (티오Mab)를 포함한다. 한 측면에서, 중쇄는 다음 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖고:
중쇄 (IgG1) 불변 영역, 야생형
Figure pct00052
중쇄 (IgG1) 불변 영역, A118C "티오Mab"
Figure pct00053
경쇄는 다음 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다:
경쇄 (카파) 불변 영역, 야생형
Figure pct00054
경쇄 (카파) 불변 영역, V205C "티오Mab"
Figure pct00055
본 발명의 AAC는 야생형 또는 모 항-WTA 항체의 하나 이상의 아미노산이 시스테인 아미노산으로 교체된 시스테인 조작된 항-WTA 항체를 포함한다. 임의의 형태의 항체가 그와 같이 조작, 즉 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 모 Fab 항체 단편은 본원에서 "티오Fab"으로 언급되는 시스테인 조작된 Fab를 형성하도록 조작될 수 있다. 이와 유사하게, 모 모노클로날 항체는 "티오Mab"을 형성하도록 조작될 수 있다. 단일 부위 돌연변이는 티오Fab에 단일 조작된 시스테인 잔기를 생성하는 반면, IgG 항체의 이량체 특성 때문에 단일 부위 돌연변이는 티오Mab에 2개의 조작된 시스테인 잔기를 생성함을 유의하여야 한다. 교체된 ("조작된") 시스테인 (Cys) 잔기를 갖는 돌연변이체는 새로 도입된, 조작된 시스테인 티올기의 반응성에 대해 평가된다.
본원에서 설명되는 항체는 배양액에서 숙주 세포를 사용하여 생산될 수 있다. 숙주 세포는 본원에서 설명되는 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터 (발현 또는 클로닝 벡터)로 형질전환될 수 있다. 세포는 항체 생산에 적합한 조건 하에 배양될 수 있고, 세포에 의해 생산된 항체는 추가로 정제될 수 있다. 항체 생산에 적합한 세포는 원핵, 효모, 또는 고등 진핵 (예를 들어, 포유동물) 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포 (인간 또는 비-인간 포유동물 세포)가 사용된다. 일부 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary) (CHO) 세포가 사용된다.
포유동물 세포는 배양될 수 있고, 배양 (조직 배양)에서 포유동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되고 있다. 포유동물 숙주 세포주의 예는 다음을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다: SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 (Sertoli) 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 사바나 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2). 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 흑색종 세포주, 예컨대 NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268]을 참조한다.
면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 개구리밥 (레니나세아에(Leninaceae)), 알팔파 (엠. 트룬카툴라(M. truncatula)), 및 담배의 식물 세포 배양액도 숙주로서 이용할 수 있다.
이를 위해 적합한 원핵 세포는 진정세균, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 메르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 및 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예컨대 이. 콜라이 비, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 예시적인 것으로, 이로 제한되지 않는다.
원핵생물에 추가로, 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트형 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 제빵 효모가 저등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종, 및 균주, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 필라멘트형 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 통상적으로 이용가능하고, 본원에서 유용하다.
리파마이신 -유형 항생제 모이어티
본 발명의 항체-항생제 접합체 (AAC)의 항생제 모이어티 (abx)는 세포독성 또는 세포 증식 억제 효과를 갖는 리파마이신-유형 항생제 또는 군이다. 리파마이신은 박테리아, 노카르디아 메디테라네이(Nocardia mediterranei), 아밀콜라톱시스 메디테라네이(Amycolatopsis mediterranei)에 의해 천연적으로 또는 인공적으로 얻은 일군의 항생제이다. 이들은 박테리아 RNA 폴리머라제를 억제하고 ([Fujii et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1489-1492]; [Feklistov, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105(39): 14820-5]) 그람 양성 및 선택적 그람 음성 박테리아에 대한 효력을 갖는 보다 큰 안사마이신 패밀리의 하위클래스이다. 리파마이신이 특히 박테리아에 대해 효과적이고, 따라서 결핵, 나병, 및 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 복합체 (MAC) 감염을 치료하기 위해 사용된다. 리파마이신-유형 군은 "전통적인" 리파마이신 약물 및 리파마이신 유도체 리팜피신 (리팜핀, CA Reg. No. 13292-46-1), 리파부틴 (CA Reg. No. 72559-06-9; US 2011/0178001), 리파펜틴 및 리팔라질 (CA Reg. No. 129791-92-0를 포함한다 [Rothstein et al. (2003) Expert Opin. Investig. Drugs 12(2):255-271]; [Fujii et al. (1994) Antimicrob. Agents Chemother. 38:1118-1122]). 많은 리파마이신-유형 항생제는 내성 발생의 유해한 특성을 공유한다 (Wichelhaus et al. (2001) J. Antimicrob. Chemother. 47: 153-156). 리파마이신은 스트렙토미세스 메디테라네이(Streptomyces mediterranei)의 발효 배양액으로부터 1957년도에 처음 단리되었다. 리파마이신 A, B, C, D, E, S, 및 SV로 명명된 약 7개의 리파마이신이 발견되었다 (US 3150046). 리파마이신 B가 처음 상업적으로 도입되었고, 1960년대에 약물-내성 결핵 치료에 유용하였다. 리파마이신은 많은 질환의 치료를 위해 사용되었고, 그 중 가장 중요한 것은 HIV-관련 결핵이었다. 이용가능한 유사체 및 유도체의 많은 수 때문에, 리파마이신은 통상적으로 사용되는 항생제에 내성으로 된 병원성 박테리아의 제거에 널리 사용되어 왔다. 예를 들어, 리팜피신은 그의 강력한 효과 및 약물 내성을 방지하는 능력에 대해 알려져 있다. 이것은 신속하게 분열하는 바실루스 균주 및 항생제 활성을 회피할 수 있도록 하는 긴 시간 동안 생물학적으로 불활성 상태로 유지되는 "지속 생존" 세포를 빠르게 사멸시킨다. 또한, 리파부틴 및 리파펜틴은 모두 HIV-양성 환자에서 얻은 결핵에 대해 사용되었다.
화학식 I의 항체-항생제 접합체의 항생제 모이어티 (abx)는 다음 구조를 갖는 리파마이신-유형 모이어티이다:
Figure pct00056
상기 식에서,
파선은 임의의 결합을 나타내고;
R은 H, C1-C12 알킬, 또는 C(O)CH3이고;
R1은 OH이고;
R2는 CH=N-(헤테로시클릴)이고, 여기서 헤테로시클릴은 C(O)CH3, C1-C12 알킬, C1-C12 헤테로아릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 및 C3-C12 카르보시클릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환되거나;
또는 R1 및 R2는 5원 또는 6원의 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴을 형성하고, 임의로 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리를 형성하고, 여기서 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 또는 OH로 임의로 치환되고;
펩티드 링커 L은 R2에 공유 부착된다.
리파마이신-유형 모이어티의 한 실시양태는 다음과 같다:
Figure pct00057
상기 식에서, R3은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; R4는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 및 OH로부터 선택되고; Z는 NH, N(C1-C12 알킬), O 및 S로부터 선택되고, 펩티드 링커 L은 N(R3)2의 질소 원자에 공유 부착된다.
리팜피신-유형 모이어티의 한 실시양태는 다음과 같다:
Figure pct00058
상기 식에서, R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; 펩티드 링커 L은 NR5의 질소 원자에 공유 부착된다.
리파부틴-유형 모이어티의 한 실시양태는 다음과 같다:
Figure pct00059
상기 식에서, R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; 펩티드 링커 L은 NR5의 질소 원자에 공유 부착된다.
벤즈옥사지노리파마이신-유형 모이어티의 한 실시양태는 다음과 같다:
Figure pct00060
상기 식에서, R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; 펩티드 링커 L은 NR5의 질소 원자에 공유 부착된다.
본원에서 pipBOR로 언급되는 벤즈옥사지노리파마이신-유형 모이어티의 한 실시양태는 다음과 같다:
Figure pct00061
상기 식에서, R3은 H 및 C1-C12 알킬로부터 독립적으로 선택되고; 펩티드 링커 L은 N(R3)2의 질소 원자에 공유 부착된다.
디메틸 pipBOR로 언급되는 벤즈옥사지노리파마이신-유형 모이어티의 한 실시양태는 다음과 같다:
Figure pct00062
상기 식에서, 펩티드 링커 L은 N(CH3)2의 질소 원자에 공유 부착된다.
반-합성 유도체 리파마이신 S, 또는 환원된, 나트륨염 형태 리파마이신 SV는 도 9-11에 예시된 바와 같이 몇 단계에서 리팔라질-유형 항생제로 전환될 수 있고, 여기서 R은 H, 또는 Ac이고, R3은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; R4는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 및 OH로부터 선택되고; Z는 NH, N(C1-C12 알킬), O 및 S로부터 선택된다. 벤즈옥사지노 (Z = O), 벤즈티아지노 (Z = S), 벤즈디아지노 (Z = NH, N(C1-C12 알킬)) 리파마이신을 제조할 수 있다 (US 7271165). 치환기를 포함하는 벤즈옥사지노리파마이신 (BOR), 벤즈티아지노리파마이신 (BTR), 및 벤즈디아지노리파마이신 (BDR) 유사체는 참고로 포함되는 US 7271165의 컬럼 28의 화학식 A에 제시된 넘버링 방식에 따라 넘버링된다. "25-O-데아세틸" 리파마이신은 25-위치의 아세틸기가 제거된 리파마이신 유사체를 의미한다. 상기 위치가 추가로 유도체화된 유사체는 "25-O-데아세틸-25-(치환기)리파마이신"으로 언급되고, 여기서 유도체화 기에 대한 명명법은 완전한 화합물 명칭에서 "치환기"를 교체한다.
리파마이신-유형 항생제 모이어티는 각각 본원에 참고로 포함된 US 4610919; US 4983602; US 5786349; US5981522; US 4859661; US 7271165; US 2011/0178001; [Seligson, et al., (2001) Anti-Cancer Drugs 12:305-13]; [Chem. Pharm. Bull., (1993) 41:148]에 개시된 바와 유사한 방법에 의해 합성할 수 있다. 리파마이신-유형 항생제 모이어티는 표준 최소 억제 농도 (MIC) 시험관내 검정을 사용하여 그의 MIC를 측정함으로써 항미생물 활성에 대해 스크리닝될 수 있다 (Tomioka et al., (1993) Antimicrob. Agents Chemother. 37:67).
Figure pct00063
펩티드 링커
"펩티드 링커" (L)은 하나 이상의 항생제 모이어티 (abx) 및 항체 단위 (Ab)에 공유 부착되어 화학식 I의 항체-항생제 접합체 (AAC)를 형성하는 이기능성 또는 다기능성 모이어티이다. AAC에서 펩티드 링커는 리소솜 조건을 비롯하여 세포내 프로테아제에 의한 절단을 위한 기질이다. 프로테아제는 다양한 카텝신 및 카스파제를 포함한다. 세포 내의 AAC의 펩티드 링커의 절단은 항-박테리아 효과를 갖는 리파마이신-유형 항생제를 방출할 수 있다.
AAC의 절단에 의해 방출되는 활성 항생제의 양은 실시예 20의 카스파제 방출 검정에 의해 측정될 수 있다.
항체-항생제 접합체 (AAC)는 항생제 (abx)에 및 항체 (Ab)에 결합하기 위한 반응성 관능기를 갖는 링커 시약 또는 링커-항생제 중간체를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다. 한 예시적인 실시양태에서, 시스테인 조작된 항체 (Ab)의 시스테인 티올은 링커 시약, 항생제 모이어티 또는 항생제-링커 중간체의 관능기와 결합을 형성할 수 있다.
한 측면에서, AAC의 펩티드 링커 모이어티, 링커 시약 또는 링커-항생제 중간체는 항체에 존재하는 친핵성 시스테인에 반응성인 친전자성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체의 시스테인 티올은 링커 시약 또는 링커-항생제 상의 친전자성 기와 반응성이고, 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기는 말레이미드 및 할로아세트아미드기를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
시스테인 조작된 항체는 문헌 [Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773]의 766 페이지의 접합 방법에 따라, 및 실시예 19의 프로토콜에 따라 링커 시약 또는 링커-항생제 중간체와, 친전자성 관능기, 예컨대 말레이미드 또는 α-할로 카르보닐과 반응한다.
또 다른 실시양태에서, 링커 시약 또는 링커-항생제 중간체의 반응성 기는 항체의 유리 시스테인 티올과 결합을 형성할 수 있는 티올-반응성 관능기를 함유한다. 티올-반응 관능기의 예는 말레이미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르, 예컨대 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 안히드라이드 (anhydride), 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 링커 시약 또는 항생제-링커 중간체는 항체에 존재하는 친전자성 기에 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응성 관능기를 갖는다. 항체 상의 유용한 친전자성 기는 피리딜 디술피드, 알데히드 및 케톤 카르보닐기를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 링커 시약 또는 항생제-링커 중간체의 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체 단위에 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 시약 또는 항생제-링커 중간체 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 티올, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항체 상의 친전자성 기는 링커 시약 또는 항생제-링커 중간체에 대한 편리한 부착 부위를 제공한다.
펩티드 링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 링커 성분은 펩티드 단위, 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), 및 p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), 및 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("MCC")를 포함한다. 다양한 링커 성분이 관련 기술 분야에 알려져 있고, 그 중 몇몇을 아래에서 설명한다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 용해도 또는 반응성을 조정하는 기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 하전된 치환기, 예컨대 술포네이트 (-SO3 -) 또는 암모늄은 시약의 수용해도를 증가시키고, 링커 시약과 항체 또는 항생제 모이어티의 커플링 반응을 용이하게 하거나, 또는 AAC를 제조하기 위해 사용되는 합성 경로에 따라 Ab-L (항체-링커 중간체)과 abx의, 또는 abx-L (항생제-링커 중간체)과 Ab의 커플링 반응을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 AAC는 다음 링커 시약을 사용하여 제조된 것을 분명히 고려하고, 이로 제한되지 않는다: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 술포-SMPB, SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트), 및 비스-말레이미드 시약, 예컨대 DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEG)2, 및 BM(PEG)3. 비스-말레이미드 시약은 순차적 또는 집중적 방식으로 티올-함유 항생제 모이어티, 표지, 또는 링커 중간체에 대한 시스테인 조작된 항체의 티올기의 부착을 허용한다. 시스테인 조작된 항체, 항생제 모이어티, 또는 링커-항생제 중간체의 티올기와 반응성인 말레이미드 이외의 다른 관능기는 아이오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
Figure pct00064
유용한 링커 시약은 또한 다른 상업적 공급원, 예컨대 몰레큘라 바이오사이언시스 인크. (Molecular Biosciences Inc., 미국 콜로라도주 보울더)로부터 얻거나, 또는 문헌 [Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1872]; [Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60]; [Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355]; [Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186]; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828에 설명된 절차에 따라 합성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, AAC의 펩티드 링커 모이어티는 분지형 다기능성 링커 모이어티를 통한 항체에 대한 하나 초과의 항생제 모이어티의 공유 부착을 위한 수지상 타입 링커를 포함한다 ([Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215]; [Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768]). 수지상 링커는 AAC의 효력과 관련된, 항생제 대 항체의 몰비, 즉 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 시스테인 조작된 항체가 단지 하나의 반응성 시스테인 티올기를 함유할 경우, 다수의 항생제 모이어티가 수지상 링커를 통해 부착될 수 있다.
화학식 I의 AAC의 특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00065
상기 식에서, Str은 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체에 공유 부착된 스트레처 단위이고; Pep는 2 내지 12개 아미노산 잔기의 펩티드이고, Y는 리파마이신-유형 항생제에 공유 부착된 스페이서 단위이다. 상기 링커의 예시적인 실시양태는 명백하게 본원에 참고로 포함된 US 7498298에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 스트레처 단위 "Str"은 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00066
상기 식에서, R6은 C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 카르보시클로, -O-(C1-C8 알킬)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보시클로)-, -(C3-C8 카르보시클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로시클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로시클로)-, -(C3-C8 헤테로시클로)-C1-C10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로 이루어지는 군으로부터 선택되고; r은 1 내지 10의 정수이다.
예시적인 스트레처 단위가 아래에 제시된다 (여기서, 물결선은 항체에 대한 공유 부착 부위를 나타낸다):
Figure pct00067
펩티드 단위 "Pep"는 생화학 분야에 잘 알려진 20개의 주요 아미노산 및 소수의 (minor) 아미노산, 예컨대 시트룰린을 포함하는 2 이상의 천연 생성 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노산은 그의 측쇄에 의해 구별된다. 펩티드 단위는 따라서 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는 2 이상의 아미노산 측쇄를 포함한다: -CH3 (알라닌), -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2 (아르기닌), -CH2C(O)NH2 (아스파라긴), -CH2CO2H (아스파르트산), -CH2CH2CH2NHC(O)NH2 (시트룰린), -CH2SH (시스테인), -CH2CH2CO2H (글루탐산), -CH2CH2C(O)NH2 (글루타민), -H (글리신), -CH2(이미다졸릴) (히스티딘), -CH(CH3)CH2CH3 (이소류신), -CH2CH(CH3)CH3 (류신), -CH2CH2CH2CH2NH2 (리신), -CH2CH2SCH3 (메티오닌), -CH2(C6H5) (페닐알라닌), -CH2CH2CH2- (프롤린), -CH2OH (세린), -CH(OH)CH3 (트레오닌), -CH2(인돌) (트립토판), -CH2(p-C6H4OH) (티로신), -CHCH(CH3)CH3 (발린). 문헌 ["Organic Chemistry" 5th Ed. John McMurry, Brooks/Cole pub. (2000)]의 1076-1077 페이지를 참조한다. 펩티드 단위의 아미노산 잔기는 모든 입체 이성질체를 포함하고, D 또는 L 입체형태일 수 있다. 한 실시양태에서, Pep는 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 리신, 아르기닌, 발린, 및 시트룰린으로부터 독립적으로 선택되는 2 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함한다. 한 상기 실시양태에서, 아미노산 단위는 프로테아제에 의한 링커의 절단을 허용하여, 세포내 프로테아제, 예컨대 리소솜 효소에 대한 노출시에 AAC로부터 항생제의 방출을 촉진한다 (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). 예시적인 아미노산 단위는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 및 헥사펩티드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예시적인 디펩티드는 다음을 포함한다: 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-리신 (fk 또는 phe-lys); 또는 N-메틸-발린-시트룰린 (Me-val-cit). 예시적인 트리펩티드는 다음을 포함한다: 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit), 발린-시트룰린-페닐알라닌 (val-cit-phe), 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly). 추가의 펩티드 링커는 GGAFAGGG (서열 126); tpm-cit; GPImeLFF (서열 129); 및 LAFG (서열 128)를 포함한다. 펩티드 링커는 2 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 상기 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 잘 알려진 액상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다 (E. Schroder and K. Lubke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press). 아미노산 단위는 특정 효소, 예를 들어, 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위한 그의 선택성 측면에서 설계되고 최적화될 수 있다.
한 실시양태에서, 스페이서 단위 Y는 파라-아미노벤질 또는 파라-아미노벤질옥시카르보닐을 포함한다. "비-자가 희생적 (self-immolative)" 스페이서 단위는 그의 일부 또는 모두가 AAC의 효소에 의한 (예를 들어, 단백질 분해에 의한) 절단시에 항생제 모이어티에 결합된 상태로 유지되는 단위이다. 비-자가 희생적 스페이서 단위의 예는 글리신 스페이서 단위 및 글리신-글리신 스페이서 단위를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 서열-특이적 효소에 의한 절단에 감수성인 펩티드 스페이서의 다른 조합도 또한 고려된다. 예를 들어, 종양 세포 관련 프로테아제에 의한, 글리신-글리신 스페이서 단위를 함유하는 AAC의 효소에 의한 절단은 AAC의 나머지로부터 글리신-글리신-항생제 모이어티를 방출시킬 것이다. 이어서, 하나의 이러한 양태에서, 글리신-글리신-항생제 모이어티는 종양 세포 내에서 별도의 가수분해 단계를 거치고, 이에 의해 글리신-글리신 스페이서 단위를 항생제 모이어티로부터 절단한다.
스페이서 단위는 별도의 가수분해 단계를 거치지 않으면서 항생제 모이어티의 방출을 허용한다. 스페이서 단위는 "자가 희생적" 또는 "비-자가 희생적" 단위일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커의 스페이서 단위는 p-아미노벤질 단위 (PAB)를 포함한다. 하나의 이러한 양태에서, p-아미노벤질 알콜은 아미드 결합을 통해 아미노산 단위에 부착되고, 카르바메이트, 메틸카르바메이트, 또는 카르보네이트가 p-아미노벤질기와 항생제 모이어티 사이에 형성된다 (예를 들어, 문헌 [Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103] 참조). 한 실시양태에서, 스페이서 단위는 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB)이다.
한 실시양태에서, 항생제는 펩티드 링커의 PAB 스페이서 단위에 부착될 때 4급 아민, 예컨대 디메틸아미노피페리딜기를 형성한다. 링커-항생제 중간체 (LA)에서 상기 4급 아민의 예는 표 2의 54, 61, 66, 67, 73, 74, 76, 78, 79, 83, 84이다. 4급 아민기는 AAC의 항박테리아 효과를 최적화하기 위해 항생제 모이어티의 절단을 조정할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항생제는 펩티드 링커의 PABC 스페이서 단위에 연결되어, AAC에 카르바메이트 관능기를 형성한다. 상기 카르바메이트 관능기는 또한 AAC의 항박테리아 효과를 최적화할 수 있다. PABC 카르바메이트 링커-항생제 중간체 (LA)의 예는 표 2의 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 62, 63, 64, 65, 72, 75, 80, 81, 87이다. 다른 링커-항생제 중간체 (LA)는 아미드 (59, 69, 70, 71, 77, 82, 85) 또는 페놀 (60, 68, 86) 기를 이용한다.
자가 희생적 스페이서의 다른 예는 PAB 기에 전기적으로 유사한 방향족 화합물, 예컨대 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (US 7375078; [Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237]) 및 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아미드 결합 가수분해시에 고리화되는 스페이서, 예를 들어 치환 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 [Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223]; 적절하게 치환된 비시클로[2.2.1] 및 비시클로[2.2.2] 고리계 [Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815]; 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 [Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867]가 사용될 수 있다. 글리신에서 치환된 아민-함유 약물의 제거 [Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27:1447]도 AAC에 유용한 자가 희생적 스페이서의 예이다.
AAC를 위해 유용한 링커-항생제 중간체
화학식 II 및 표 2의 링커-항생제 중간체 (LA)는 도 23-25 및 실시예 1-17에 예시된 바와 같이 리파마이신-유형 항생제 모이어티를 펩티드-링커 시약과 커플링시킴으로써 제조하였다. 다음을 포함하는 링커 시약은 WO 2012/113847; US 7659241; US 7498298; US 20090111756; US 2009/0018086; US 6214345; [Dubowchik et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13(4):855-869]에 기재된 방법에 의해 제조하였다:
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6
Figure pct00068
6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)헥산아미드 8
Figure pct00069
N-((S)-1-((S)-1-(4-(클로로메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9
Figure pct00070
<표 2> 링커-항생제 중간체 (LA)
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
항체-항생제 접합체의 실시양태
S4497 항체는 프로테아제 절단가능, 펩티드 링커를 통해 pipBOR 및 다른 용어로 명명된, 표 3의 리파마이신의 유도체에 연결되었다. 링커는 발린-시트룰린 (val-cit, vc) 디펩티드를 포함하는 펩티드 단위를 인식하는 카텝신 B, D 등을 포함하는 리소솜 프로테아제에 의해 절단되도록 설계된다 (Dubowchik et al. (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869). 항생제 및 MC-vc-PAB 링커 등으로 이루어진 링커-항생제 중간체의 생성은 실시예 1-17에서 상세히 설명된다. 링커는 PAB 모이어티에서 아미드 결합의 절단이 항체를 항생제로부터 활성 상태로 분리하도록 설계된다.
S4497-디메틸-pipBOR로 명명된 AAC는 항생제 상의 디메틸화된 아미노 및 링커 상의 옥시카르보닐기를 제외하고 S4497-pipBOR AAC와 동일하다.
도 5는 항체-항생제 접합체 (AAC)에 대한 약물 활성화의 가능한 메카니즘을 보여준다. 활성 항생제 (Ab)는 AAC의 포유동물 세포 내로의 내재화 후에만 방출된다. AAC 내의 항체의 Fab 부분은 에스. 아우레우스에 결합하고, AAC의 Fc 부분은 호중구 및 대식세포를 포함하는 포식 세포에 대한 Fc-수용체 매개 결합에 의해 박테리아의 흡수를 향상시킨다. 파고리소솜 내로의 내재화 후에, Val-Cit 링커는 리소솜 프로테아제에 의해 절단되어 파고리소솜 내에 활성 항생제를 방출한다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 (AAC) 화합물의 실시양태는 다음을 포함하고,
Figure pct00090
여기서, AA1 및 AA2는 H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, 및 -CH2CH2CH2NHC(O)NH2를 포함하는 아미노산 측쇄로부터 독립적으로 선택되고;
다음 화학식을 포함한다:
Figure pct00091
Figure pct00092
.
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물의 실시양태는 다음을 포함한다:
<화학식 I>
Figure pct00093
상기 식에서, 파선은 임의의 결합을 나타내고;
R은 H, C1-C12 알킬, 또는 C(O)CH3이고;
R1은 OH이고;
R2는 CH=N-(헤테로시클릴)이고, 여기서 헤테로시클릴은 C(O)CH3, C1-C12 알킬, C1-C12 헤테로아릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 및 C3-C12 카르보시클릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환되거나;
또는 R1 및 R2는 5원 또는 6원의 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴을 형성하고, 임의로 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리를 형성하고, 여기서 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 또는 OH로 임의로 치환되고;
L은 R2에 부착된 펩티드 링커 또는 R1 및 R2에 의해 형성된 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;
Ab는 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체이다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물의 실시양태는 다음을 포함한다:
Figure pct00094
상기 식에서, R3은 H 및 C1-C12 알킬로부터 독립적으로 선택되고; n은 1 또는 2이고; R4는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 및 OH로부터 선택되고; Z는 NH, N(C1-C12 알킬), O 및 S로부터 선택된다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물의 실시양태는 다음 리팜핀형 항생제 모이어티를 포함한다:
Figure pct00095
상기 식에서, R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; n은 0 또는 1이다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물의 실시양태는 다음 리파부틴형 항생제 모이어티를 포함한다:
Figure pct00096
상기 식에서, R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고; n은 0 또는 1이다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물의 실시양태는 다음 리팔라질-유형 항생제 모이어티를 포함한다:
Figure pct00097
상기 식에서, R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 독립적으로 선택되고; n은 0 또는 1이다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물의 실시양태는 다음 pipBOR형 항생제 모이어티를 포함한다:
Figure pct00098
상기 식에서, R3은 H 및 C1-C12 알킬로부터 독립적으로 선택되고; n은 1 또는 2이다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물의 실시양태는 다음을 포함한다:
Figure pct00099
본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물의 추가의 실시양태는 다음을 포함한다.
Figure pct00100
AAC의 항생제 로딩
항생제 로딩은 화학식 I의 분자에서 항체 당 항생제 (abx) 모이어티의 평균 수인 p로 표시된다. 항생제 로딩은 항체 당 1 내지 20개의 항생제 모이어티 (D)일 수 있다. 화학식 I의 AAC는 1 내지 20개의 항생제 모이어티와 접합된 항체의 집합체 또는 풀 (pool)을 포함한다. 접합 반응에 의한 AAC의 제조에서 항체 당 항생제 모이어티의 평균 수는 통상적인 수단, 예를 들어 질량 분광분석법, ELISA 분석, 및 HPLC에 의해 특성화될 수 있다. 또한, p의 측면에서 AAC의 정량적 분포를 결정할 수 있다. 일부 경우에, p가 다른 항생제 로딩을 갖는 AAC로부터의 특정 값인 균질 AAC의 분리, 정제 및 특성 결정은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성할 수 있다.
일부 항체-항생제 접합체에 대해, p는 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 상기 예시적인 실시태양에서와 같이 부착이 시스테인 티올인 경우에, 항체는 단지 하나 또는 여러 개의 시스테인 티올기를 가질 수 있거나, 또는 그를 통해 링커가 부착될 수 있는 충분히 반응성인 티올기를 단지 하나 또는 여러 개 가질 수 있다. 특정 실시태양에서, 보다 큰 항생제 로딩, 예를 들어 p>5는 특정 항체-항생제 접합체의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과도 손실을 일으킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 AAC에 대한 항생제 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 약 2 내지 약 4; 또는 약 3 내지 약 5; 약 4; 또는 약 2이다.
특정 실시태양에서, 이론적 최대치 미만의 항생제 모이어티가 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는 예를 들어, 아래에서 논의되는 바와 같이 항생제-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 리신 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 항체는 항생제 모이어티에 연결될 수 있는 많은 자유 및 반응성 시스테인 티올기를 함유하지 않고; 실제로 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디술피드 브릿지로서 존재한다. 특정 실시태양에서, 항체를 부분 또는 완전 환원 조건 하에 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 환원시켜 반응성 시스테인 티올기를 생성할 수 있다. 특정 실시태양에서, 항체는 변성 조건에 적용되어 반응성 친핵성 기, 예를 들어 리신 또는 시스테인을 제시한다.
AAC의 로딩 (항생제/항체 비, "AAR")은 상이한 방식, 예를 들어 (i) 항체에 비해 몰 과량의 항생제-링커 중간체 또는 링커 시약의 제한, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도의 제한, 및 (iii) 시스테인 티올 변형에 대한 부분 또는 제한 환원 조건에 의해 제어할 수 있다.
하나 초과의 친핵성 기가 항생제-링커 중간체 또는 링커 시약과, 이어서 항생제 모이어티 시약과 반응하는 경우, 생성되는 생성물은 항체에 부착된 하나 이상의 항생제 모이어티의 분포를 갖는 AAC 화합물의 혼합물임을 이해하여야 한다. 항체 당 항생제의 평균 수는 항체에 특이적이고 항생제에 특이적인 이중 ELISA 항체 검정에 의해 혼합물로부터 계산할 수 있다. 개별 AAC 분자는 질량 분광분석법에 의해 혼합물 내에서 확인하고, HPLC, 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [McDonagh et al. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307]; [Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070]; [Hamblett, K. J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004]; [Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004] 참조). 특정 실시태양에서, 단일 로딩 값을 갖는 균질 AAC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리할 수 있다. 본 발명의 시스테인-조작된 항체는 항체 상의 반응성 부위가 1차적으로 조작된 시스테인 티올로 제한되기 때문에 보다 균일한 제제를 만들 수 있게 한다. 한 실시양태에서, 항체 당 항생제 모이어티의 평균 수는 약 1 내지 약 20이다. 일부 실시양태에서, 범위는 약 1 내지 4로부터 선택되고 제어된다.
항체-항생제 접합체의 제조 방법
화학식 I의 AAC는 다음을 포함한, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하는 몇몇 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 항체의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통해 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 항생제 모이어티 (abx)와 반응시키는 방법; 및 (2) 항생제 모이어티의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통해 L-abx를 형성시킨 후, 이를 항체의 친핵성 기와 반응시키는 방법. 후자의 경로를 통해 화학식 I의 AAC를 제조하는 예시적인 방법은 본원에 참고로 분명하게 포함되는 US 7498298에 기재되어 있다.
항체 상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체는 글리코실화됨)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 항체가 완전히 또는 부분적으로 환원되도록 환원제, 예컨대 DTT (디티오트레이톨) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 처리함으로써 링커 시약과의 접합을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성 기는 리신 잔기의 변형을 통해, 예를 들어 리신 잔기와 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut) 시약)을 반응시킴으로써 아민을 티올로 전환시켜 항체 내로 도입될 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3 또는 4개 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 항체를 제조함으로써) 항체 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-항생제 접합체는 또한 항체 상의 친전자성 기, 예를 들어 알데히드 또는 케톤 카르보닐기와 링커 시약 또는 항생제 상의 친핵성 기 사이의 반응에 의해 생성할 수 있다. 링커 시약 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 항체를 변형시켜 링커 시약 또는 항생제 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입한다. 또 다른 실시태양에서, 글리코실화된 항체의 당은 예를 들어 퍼아이오데이트 산화 시약으로 산화시켜, 링커 시약 또는 항생제 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 (Schiff) 염기 기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어 수소화붕소 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 연결을 형성할 수 있다. 한 실시태양에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 반응시키면, 항생제 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 항체 내에 생성될 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또 다른 실시태양에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 항체를 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신에 알데히드를 생성할 수 있다 ([Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852). 그러한 알데히드는 항생제 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
항생제 모이어티 상의 친핵성 기는, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
표 3의 항체-항생제 접합체 (AAC)는 설명된 항-WTA 항체 및 표 2의 링커-항생제 중간체의 접합에 의해, 및 실시예 24에서 설명되는 방법에 '따라 제조하였다. AAC는 시험관내 대식세포 검정 (실시예 18) 및 생체내 마우스 신장 모델 (실시예 19)에 의해 효능에 대해 시험하였다.
<표 3> 항체-항생제 접합체 (AAC)
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
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*AAR = 항생제/항체 비 평균
야생형 ("WT"), 시스테인 조작된 돌연변이체 항체 ("티오"), 경쇄 ("LC"), 중쇄 ("HC"), 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질 ("PAB"), 및 p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PABC")
tbd = 결정될 예정
HC-A114C (카바트) = HC-A118C (EU)
AAC가 세포내 MRSA를 사멸시킴을 보여주는 시험관내 분석
시험관내 실험은 AAC가, 항체 및 항생제 사이의 링커가 적절한 효소, 예컨대 카텝신 B에 의해 절단된 후에만 활성 항생제를 방출함을 확인해준다. MRSA를 밤새 정상 박테리아 성장 배지에서 10 ㎍/mL까지의 AAC로 배양하였다. MRSA와 S4497-pipBOR 또는 S4497-디메틸-pipBOR AAC의 인큐베이션은 AAC를 카텝신 B로 예비-처리하여 활성 항생제를 방출시키지 않는 한, 박테리아 성장을 억제하지 않았다. 뮤린 복막 대식세포를 이용한 시험관내 검정은 AAC가 활성 항생제를 방출하고 포식 세포 내의 MRSA를 사멸시킴을 확인해 주었다 (실시예 18). 세포벽 연관 단백질의 패밀리에 결합하는 항체 rF1을 포함하는 AAC를 리파마이신 유도체에 접합시켰다. 에스. 아우레우스 (뉴먼 (Newman) 균주)를 박테리아에 대한 항체 결합 (옵소닌화)을 허용하기 위해 다양한 용량의 rF1-AAC 또는 동등한 용량의 항체 단독, 리팜피신 단독 또는 항체와 자유 리팜피신의 혼합물로 처리하고, 1시간 동안 인큐베이션한 후에 옵소닌화된 박테리아를 대식세포에 공급하였다 (도 7a).
도 7a는 AAC가 세포내 MRSA를 사멸시킴을 제시하는 시험관내 대식세포 검정을 보여준다. 에스. 아우레우스 (뉴먼)를 rF1 항체 단독, 자유 리팜피신 단독, AAC에서 발견되는 항체 대 항생제의 동일한 비의 rF1 항체 + 자유 리팜피신의 간단한 혼합물, 또는 rF1-AAC과 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 뮤린 대식세포에 첨가하였다. 대식세포를 포식작용을 허용하기 위해 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 포식작용이 완료된 후, 감염 혼합물을 세포외 박테리아의 성장을 억제하기 위해 50 ㎍/mL의 겐타마이신을 보충한 정상 성장 배지로 교체하고, 생존 세포의 총수를 플레이팅에 의한 감염 2일 후에 결정하였다.
대식세포를 2시간 동안 감염시키고, 감염을 제거하고, 대식세포에 의해 흡수되지 않은 임의의 잔류하는 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 겐타마이신을 함유하는 배지로 교체하였다. 2일 후에, 대식세포를 용해시키고, 생존 세포내 박테리아의 총수를 아가 플레이트 상의 플레이팅에 의해 결정하였다. 분석은 AAC 처리가, AAC에서 발견되는 동일한 항체 대 항생제 비로 조합된 rF1 항체 + 자유 리팜피신의 간단한 혼합물의 처리에 비해 세포내 박테리아의 수의 100배 초과의 감소를 유도함을 보여주었다 (도 7a).
MRSA는 골모세포 및 다양한 상피 및 내피 세포 종류를 비롯한 많은 비-포식 세포 종류를 침범할 수 있다 (Garzoni and Kelly, (2008) Trends in Microbiology). MRSA는 골모세포 세포주 (MG63), 기도 상피 세포주 (A549) 및 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)의 1차 배양액을 감염시킬 수 있다. 도 7b는 대식세포, 골모세포 (MG63), 기도 상피 세포 (A549), 및 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에서 50 ㎍/mL의 S4497-pipBOR AAC 102를 사용한 MRSA (USA300 균주)의 세포내 사멸을 보여주고, 여기서 네이키드 비접합 항체 S4497은 그렇지 않다. 이들 세포 종류는 전문적인 포식 세포, 예컨대 대식세포보다 낮은 카텝신 B의 총 수준을 발현하는 것으로 보이지만, 50 ㎍/mL로 처리된 MRSA는 모든 3개의 이들 세포주 내로의 내재화 후에 효과적으로 사멸되었다. 파선은 검정 검출 한계를 나타낸다.
항체를 항생제에 연결하는 링커 내에 변이가 존재하는 AAC의 활성을 비교하기 위해 시험관내 분석을 수행하였다. S4497-디메틸-pipBOR AAC는 대식세포 세포내 사멸 검정에서 S4497-pipBOR AAC보다 더 큰 효능을 보인다. S4497-pipBOR AAC 및 S4497-디메틸-pipBOR AAC를 본 발명자들의 대식세포 세포내 사멸 검정에서 최소 유효 용량을 결정하기 위해 적정하였다 (도 7c). 세포내 박테리아의 최적 청소를 달성하기 위해 적어도 2 ㎍/mL의 AAC를 사용한 처리가 필요할 수 있다.
도 7c는 pipBOR 51 대 디메틸-pipBOR (diMe-pipBOR) 54로 제조된 AAC의 비교를 보여준다. MRSA를 S4497 항체 단독으로 또는 10 ㎍/mL 내지 0.003 ㎍/mL의 다양한 농도의 AAC, 즉 S4497-pipBOR 102 또는 S4497-디메틸-pipBOR 105와 함께 옵소닌화시켰다. 이들 데이타는 두 AAC에 대해 AAC가 2 ㎍/mL 초과의 용량에서 시험될 때 최적 사멸이 발생하고, 활성의 용량 의존적 상실이 0.4 ㎍/mL에서 분명해짐을 보여주었다. 총 사멸 수준은 S4497 디메틸-pipBOR AAC 105에 유의하게 더 우수하였다. 보다 많은 용량의 S4497-디메틸-pipBOR AAC 105는 세포내 박테리아를 검출 한계 미만으로 제거하였고, 0.4 ㎍/mL의 AAC의 최적 미만의 용량을 사용할 때 300배 초과의 사멸이 관찰되었다.
도 7d는 대식세포를 해롭게 하지 않으면서 AAC가 세포내 박테리아를 사멸시킴을 보여준다. 에스. 아우레우스의 USA300 균주를 항체의 박테리아에 대한 결합을 허용하기 위해 50 ㎍/mL의 S4497 항-에스. 아우레우스 항체 (항체) 또는 50 ㎍/mL의 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105 AAC와 함께 1시간 동안 예비 인큐베이션하였다. 옵소닌화된 박테리아를 뮤린 대식세포에 대식세포당 10-20개 박테리아의 감염 다중도로 공급하고, 포식작용을 허용하기 위해 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 포식작용이 완료된 후, 자유 박테리아를 제거하고, 비-내재화된 박테리아를 사멸시키기 위해 50 ㎍/mL의 겐타마이신을 보충한 정상 성장 배지에서 2일 동안 배양하였다. 배양 기간 종료시에, 대식세포의 생존을 배양 상청액 내로 세포질 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 방출을 검출함으로써 평가하였다. 각각의 웰로부터 방출된 LDH의 총량을 웰에 세제를 첨가하여 용해시킨 대식세포가 존재하는 대조군 웰과 비교하였다. 세제, 비감염된 대식세포, S4497 항체로 예비-옵소닌화된 USA300으로 감염된 대식세포, 또는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105 AAC로 예비-옵소닌화된 USA300로 감염된 대식세포로 처리된 웰 내의 대식세포 세포 용해 정도를 측정하였다.
도 7e는 상기 대식세포 세포 용해로부터 대식세포 내부로부터 살아있는 USA300의 회수를 보여준다. 대식세포를 용해시키고, 세포 용해물의 연속 희석액을 생존 세포내 박테리아의 수의 수를 측정하기 위해 플레이팅하였다.
도 9는 링커가 카텝신 B에 의해 절단되지 않으면 AAC가 에스. 아우레우스에 독성을 보이지 않음을 제시하는 성장 억제 검정을 보여준다. 카텝신 방출 검정 (실시예 20) 모식도는 좌측에 제시된다. AAC는 카텝신 B로 처리하여 자유 항생제를 방출시킨다. 무손상 대 카텝신 B 처리 AAC의 항생제 활성의 총량은 생성되는 반응물의 연속 희석액을 제조하고 에스. 아우레우스의 성장을 억제할 수 있는 AAC의 최소 용량을 결정함으로써 결정된다. 우측 상부 그래프는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102에 대한 카텝신 방출 검정을 보여주고, 우측 하부 그래프는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105에 대한 카텝신 방출 검정을 보여준다.
항체 항생제 접합체의 생체내 효능:
AAC의 효능을 시험하기 위해 마우스 내에서 생체내 복막염 모델을 확립하였다. 상기 모델에서, 마우스를 MRSA의 복강내 주사 (I.P.)에 의해 감염시키고, 박테리아 로드를 복막액 및 신장 내에서 감염 후 2일 동안 모니터링한다. 복막으로부터 수거한 박테리아는 자유 유동하는 세포외 박테리아, 또는 감염 부위로 동원되는 복막 세포 내부에 내재한 것 - 주로 호중구 및 대식세포 -으로서 발견될 수 있다. 상기 모델에서 확인된 세포외 박테리아는 항생제 치료에 대해 감수성인 것으로 보였지만, 세포내 박테리아는 리팜핀을 비롯한 많은 임상 관련 항생제를 사용한 치료에 비반응성인 것으로 나타났고 (Sandberg et al. (2009) Antimicrobial Agents Chemother), 따라서 본 발명자들의 AAC의 효능을 시험하기 위한 뛰어난 표적인 것으로 보였다.
도 8a는 A/J 마우스의 복강내 감염 모델에서 S4497-pipBOR 102 AAC의 생체내 효능을 보여준다. 마우스를 복강내 주사에 의해 5x107 CFU의 MRSA로 감염시키고, 50 mg/Kg의 S4497 항체 단독으로 또는 50 mg/Kg의 S4497-pipBOR AAC 102로 복강내 주사에 의해 처리하였다 (프로토콜 11-2032A). 마우스를 감염 2일 후에 희생시키고, 총 박테리아 로드를 복막 상청액 (세포외 박테리아), 복막 세포 (세포내 박테리아) 또는 신장에서 평가하였다.
A/J 마우스를 USA300으로 감염시키고, 감염 30분 후에 50 mg/Kg의 S4497 항체 또는 S4497-pipBOR AAC 102를 투여하였다. 2일 후에, 마우스를 희생시키고, 박테리아 로드를 복막 세척액 및 신장에서 모니터링하였다. 세포외 및 세포내 박테리아를 구별하기 위해, 복막 세척액을 부드럽게 원심분리하여 세포외 박테리아를 함유한 상청액과 복막 세포를 분리하였다. 복막 세포를 임의의 오염 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 리소스타핀으로 처리하고, 수거 시간에 세포내 박테리아의 총수를 측정하기 위해 용해시켰다. 항체 단독으로 처리한 마우스는 복막 세척액 내에 105 내지 106 CFU의 세포내 및 세포외 박테리아 둘 모두를, 신장 내에 104 내지 106 개의 박테리아를 보유하였지만, S4497-pipBOR AAC로 처리한 마우스는 감염을 검출 한계 미만으로 청소하였다. 이들 데이타는 AAC가 활성 항생제를 파고리소솜 내에 방출하도록 설계되지만, 세포내 및 세포외 풀 둘 모두의 MRSA의 우수한 청소가 관찰됨을 보여주었다. 세포외 박테리아는 AAC에 의해 직접 사멸되지 않기 때문에, 이들 박테리아가 AAC 처리에 의해서도 청소된다는 사실은 세포외 박테리아의 유의한 분획이 감염 동안 일부 시간에 세포에 의해 흡수되거나, 또는 AAC가 세포외 박테리아의 흡수를 향상시켜, AAC에 의해 효과적으로 사멸되는 세포 내 박테리아의 상대적인 비율을 증가시킬 수 있음을 시사한다.
정맥내 감염 모델에서 AAC의 효능을 또한 조사하였다. 상기 모델에서, 에스. 아우레우스는 혈액에서 발견되는 대다수의 박테리아가 감염 수 분 내에 숙주 세포와 회합하도록 감염 직후에 순환 호중구에 의해 흡수된다 (Rogers, et al. (1956) J. Exp. Med. 103:713-742). A/J 마우스를 정맥내 주사에 의해 2x106 CFU의 MRSA로 감염시킨 후, 감염 30분 후에 정맥내 주사에 의해 50 mg/Kg의 AAC로 처리하였다. 상기 모델에서, 1차 감염 부위는 신장이고, 마우스에서 감염 2일 후에 검출가능한 큰 농양이 발생하고, 처리 부재시에 30일까지의 시간 동안 청소되지 않는다. 50 mg/Kg의 S4497-pipBOR AAC 102를 사용한 처리는 시험한 모든 마우스에서 감염을 청소하였다 (도 8b).
도 8b는 A/J 마우스의 정맥내 감염 모델을 보여준다. 마우스를 정맥내 주사에 의해 2x106 CFU로 감염시키고, 50 mg/Kg의 S4497 항체, 50 mg/Kg의 S4497-pipBOR 102 AAC 또는 50 mg/Kg의 S4497 항체 + 0.5 mg/Kg의 자유 리파마이신의 간단한 혼합물로 처리하였다. 처리제는 감염 30분 후에 IV 주사에 의해 전달하고, 신장을 감염 4일 후에 수거하였다. 회색 파선은 각각의 장기에 대한 검출 한계를 나타낸다. 50 mg/Kg의 S4497 항체 단독, 또는 50 mg/Kg의 S4497 항체와 0.5 mg/kg 자유 리파마이신의 간단한 혼합물 (50 mg/Kg의 AAC에 존재하는 항생제의 동등한 용량)로 처리한 대조군은 효능을 보이지 않았다.
pipBOR 및 디메틸-pipBOR 항생제 모이어티로 제조된 AAC의 효능을 A/J 마우스에서 정맥내 감염 모델에서 생체내에서 비교하였다. S4497-pipBOR AAC 102 (도 9a) 또는 S4497-디메틸-pipBOR AAC 105 (도 9b)를 감염 30분 후에 50 mg/Kg 내지 2 m/Kg의 다양한 용량으로 투여하고, 총 박테리아 로드를 결정하기 위해 신장을 감염 4일 후에 조사하였다. 도 9a는 정맥내 감염 모델에서 pipBOR 102 AAC의 효능을 S4497-pipBOR AAC 102의 적정에 의해 보여준다. 7주령 암컷 A/J 마우스를 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사에 의해 2x106 CFU의 MRSA (USA300 균주)로 감염시켰다. 도 9b는 정맥내 감염 모델에서 디메틸pipBOR 105 AAC의 효능을 S4497-디메틸-pipBOR AAC 105의 적정에 의해 보여준다. S4497 항체, AAC 102 또는 AAC 105를 감염 30분 후에 나타낸 용량으로 투여하였다. 마우스를 감염 4일 후에 희생시키고, 마우스당 생존 박테리아의 총수 (2개의 신장에서 모음)를 플레이팅에 의해 결정하였다.
두 AAC 모두 50 mg/Kg의 최고 용량에서 효과적이었지만, S4497-pipBOR AAC 102는 보다 낮은 용량에서는 단지 부분적으로 효과를 보였다. S4497-디메틸-pipBOR AAC 105는 10 mg/Kg 초과의 용량에서 완전한 박테리아 청소를 보였다. 후속 실험은 15 mg/Kg를 초과하는 용량이 지속적인 박테리아 청소에 필요함을 나타내었다. 도 9a 및 9b는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 105 AAC가 정맥내 감염 모델에서 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC보다 더 효능이 있음을 보여주고, 이것은 각각 102와 105 사이의 카르바메이트 (51) 및 디메틸피페리딜 (54) 구조적 차이의 효과를 나타낸다.
마우스를 감염 30분 후에 AAC로 처리하였다. 치료를 필요로 하는 MRSA 환자에서 발생할 것으로보이는 조건을 보다 잘 모방하기 위해, AAC가 확립된 감염의 청소시에 효과적인지 및 항생제의 항-에스. 아우레우스 항체에 대한 연결이 항생제 단독 처리보다 분명한 이점을 제공하는지 결정하였다. 이를 위해, 동등한 용량의 항생제 디메틸-pipBOR를 갖는 AAC의 효능을 비교하였다.
도 9c는 2x107 CFU의 MRSA로 정맥내 주사에 의해 감염된 CB17.SCID 마우스를 보여준다 (프로토콜 12-2418). 감염 1일 후에, 마우스를 50 mg/Kg의 S4497 항체, 50 mg/Kg의 S4497 디메틸-pipBOR AAC 105 또는 0.5 mg/Kg의 디메틸-pipBOR 항생제 7 (동등한 용량의 항생제가 50 mg/Kg의 AAC에 함유됨)로 처리하였다. 마우스를 감염 4일 후에 희생시키고, 마우스당 생존 박테리아의 총수 (2개의 신장에서 모음)를 플레이팅에 의해 결정하였다. 50 mg/Kg의 S4497-디메틸-pipBOR AAC를 사용한 처리는 감염 1일 후에 명백하게 효과적인 반면, 동등한 용량의 디메틸-pipBOR 단독은 감염 청소에 실패하였다.
AAC 처리는 인간 항체의 존재 하에 효능을 보이고, 현재 치료 기준 (SOC) 반코마이신 처리보다 우수하다.
S4497 항체를 에스. 아우레우스 감염된 환자로부터 유래된 B 세포로부터 클로닝하였다. 이것은 정상 인간 혈청, 또는 MRSA 감염 환자에 존재하는 혈청이 본 발명자들의 AAC와 결합하기 위해 경쟁하는 항-MRSA 항체를 함유할 수 있다는 우려를 불러일으켰다. 이를 해결하기 위해, 정상의 건강한 공여자 및 일군의 MRSA 환자로부터 유래된 인간 혈청을 AAC와 동일한 항원을 인지하는 항-MRSA 항체의 전체 수준을 추정하기 위해 시험하였다. MRSA로부터의 세포벽 제제를 사용한 ELISA 기반 검정을 개발하였다. 이들 검정에서 세포벽 제제에 대한 비-항원 특이적 결합을 제한하기 위해, 단백질 A에 대한 유전자가 결핍된 MRSA의 균주를 이용하였다. 단백질 A는 IgG 항체의 Fc 영역에 결합한다. S4497 항원을 발현한 MRSA에 대한 다양한 야생형 (WT) 혈청 샘플의 결합 (도 10a, WT)을 S4497 항체에 의해 인식되는 당 변형이 결여된 MRSA 균주 TarM/TarS DKO (이중 낙아웃) 돌연변이체에 대한 결합과 비교하여 조사하였다. 도 10a는 인간 혈청에서 항-에스. 아우레우스 항체의 우세한 존재를 보여준다. 에스. 아우레우스 감염 환자 또는 정상 대조군은 항-WTA S4497과 동일한 특이성을 갖는 다량의 WTA 특이적 혈청 항체를 함유한다.
S4497에 의해 인식되는 것과 동일한 항원에 잘 결합하는 모노클로날 항체를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 혈청 샘플의 결합 수준을 표준 곡선을 생성하기 위해 사용된 항체로부터 얻은 신호와 비교함으로써, 정상의 건강한 공여자 또는 MRSA 환자로부터 유래된 혈청 샘플에, 또는 정상 혈청으로부터 단리된 총 IgG 제제에 존재하는 항-MRSA 항체의 수준을 추정하였다 (도 10a). 정상 인간 혈청은 10-15 mg/mL의 총 IgG를 함유한다 (Manz et al. (2005) Annu Rev. Immunol. 23:367). 상이한 혈청 샘플 내의 항-MRSA 반응성의 분석은 300 ㎍/mL까지의 이들 항체가 S4497에 의해 인식되는 것과 동일한 항원과 잠재적으로 반응성이고 따라서 AAC와 결합하기 위해 경쟁할 가능성이 있음을 보여주었다.
S4497 항체를 사용하여 MRSA에 대한 매우 높은 결합 (박테리아당 50,000개의 결합 부위가 추정됨)을 포함하는 특성의 AAC를 생성하였다. 충분한 수의 AAC는 인간 혈청에서 발견되는 경쟁 항체의 존재 하에서도 MRSA에 결합할 수 있다. 이를 직접적으로 시험하기 위해, 10 mg/mL의 인간 IgG를 보충한 완충제 내의 S4497-디메틸-pipBOR AAC (도 10b, +IGIV)를 적정하고, 세포내 사멸 수준을 대식세포 세포내 사멸 검정에서 측정하였다.
도 10b는 AAC가 생리학적 수준의 인간 IgG의 존재 하에 효능이 있음을 제시하는 생체내 감염 모델을 보여준다. MRSA의 USA300 균주를 사용한 시험관내 대식세포 검정은 S4497-디메틸-pipBOR AAC 105가 10 mg/mL의 인간 IgG의 존재 하에 효능을 나타낸다. MRSA의 USA300 균주를 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 AAC 단독으로, 또는 10 mg/mL의 인간 IgG에 희석한 AAC로 옵소닌화하였다. 옵소닌화된 박테리아를 뮤린 복막 대식세포에 직접 첨가하고, 포식작용을 허용하기 위해 2시간 동안 인큐베이션하였다. 감염 후에, 대식세포 배양액을 겐타마이신을 보충한 완전 배지 내에 유지시키고, 생존 세포내 박테리아의 총수를 감염 2일 후에 평가하였다. 이들 데이타는 인간 IgG가 보다 낮은 용량에서 AAC 사멸을 억제하였지만, 우수한 사멸은 생체내에서 쉽게 달성가능한 10 ㎍/mL 초과의 용량을 사용하여 달성되었음을 보여주었다. 정상 혈청 IgG는 105 AAC의 기능적 효과를 감소시킬 수 있다. AAC의 최대 대식세포 세포내 사멸 활성은 높은 항원 결합 및 FcR과의 효율적인 상호작용 (옵소닌 포식작용 (opsonophagocytosis)을 위해) 둘 모두를 필요로 할 수 있기 때문에, 기존재하는 혈청 항체는 WTA에 대한 결합을 위해 경쟁할 수 있고 또한 대응하는 형성된 면역 복합체가 대식세포 상의 FcR에 대한 결합을 위해 경쟁할 수 있다.
AAC가 생체내에서 경쟁 인간 항체의 존재 하에 효과적일 것인지 확인하기 위해, 생체내 감염 모델을 변형시켜, 혈청 내에 정상 수준의 인간 IgG를 발현하는 마우스를 생성하였다. T 세포 및 B 세포가 모두 결여되고 따라서 혈청 내에 항체를 갖지 않는 CB17:SCID 마우스 (Bosna & Carroll, (1991) Ann Rev Immunol. 9:323)를 고 농축된 인간 IgG (IGIV)의 매일 투여에 의해 10 mg/mL의 인간 IgG로 재구성하였다. 예비 연구를 통해, SCID:huIgG로 명명된 이들 마우스는 실제로 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 유지된 수준을 가졌고, 이들 마우스는 비처리 대조군에 비해 MRSA를 사용한 감염에 대해 동일하게 감수성임이 확인되었다. SCID:huIgG 마우스를 MRSA로 감염시키고, 감염 1일 후에 S4497 항체 또는 S4497-디메틸-pipBOR AAC (50 mg/Kg)로 처리하였다. 감염 4일 후에, 신장 내의 감염 박테리아 로드 (도 10c)를 평가하였다.
도 10c는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸-pipBOR 105 또는 112 AAC의 2개의 개별 제제를 사용한 3회의 독립적인 실험으로부터 합한 데이타를 보여준다. CB17.SCID 마우스는 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 일정한 수준을 생성하기 위해 최적화된 투여 요법을 사용하여 인간 IgG로 재구성하였다. 마우스를 S4497 항체 (50 mg/Kg), 또는 S4497-디메틸-pipBOR AAC (50 mg/Kg)로 처리하였다. AAC로 처리된 마우스는 박테리아 로드의 4-log 초과의 감소를 보였다 (스튜던트 t-시험, p=0.0005). 박테리아 로드는 S4497 항체 대조군으로 처리된 마우스에 비해 S4497-디메틸-pipBOR AAC로 처리된 마우스에서 평균 10,000배 더 낮았고, 이것은 AAC가 높은 수준의 경쟁 인간 항-MRSA 항체의 존재에도 불구하고 명백하게 효과적이었음을 나타낸다.
AAC의 효능을 MRSA 감염에 대한 현재 치료 기준 치료제인 반코마이신을 사용한 치료와 비교하였다. 도 11a는 AAC가 정상 수준의 인간 IgG로 재구성된 마우스에서 현재 치료 기준 (SOC) 항생제인 반코마이신보다 큰 효능을 나타냄을 제시하는 생체내 감염 모델을 보여준다. CB17.SCID 마우스는 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 일정한 수준을 생성하기 위해 최적화된 투여 요법을 사용하여 인간 IgG로 재구성하였다. 마우스를 S4497 항체 (50 mg/Kg), 반코마이신 (100 mg/Kg), S4497-디메틸pipBOR AAC (50 mg/Kg), 112 또는 MRSA를 인식하지 않는 이소형 대조군 항체로 제조된 AAC, 티오-hu-항 gD 5B5-HC-A118C-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 110 AAC (50 mg/Kg)로 처리하였다. AAC를 투여받은 마우스에게 감염 후 제1일에 정맥내 주사에 의해 단일 용량의 AAC를 제공하였다. 반코마이신 처리를 한 마우스에게 복강내 주사에 의해 항생제를 매일 2회 투여하였다. 모든 마우스를 감염 후 제4일에 희생시키고, 마우스당 생존 박테리아의 총수 (2개의 신장에서 모음)를 플레이팅에 의해 결정하였다.
반코마이신 처리는 처리가 감염 30분 후에 개시될 경우 본 발명자들의 뮤린 정맥내 감염 모델에서 MRSA 감염 치료에 효과적이다. 100 mg/Kg의 반코마이신의 1일 2회 투여는 감염 청소에 실패하였고, 치료가 감염 1일 초과 후에 개시될 때 박테리아 로드를 단지 약 50배 감소시킬 수 있었다 (도 11a). 놀랍게도, 감염 1일 후에 단일 용량의 S4497-디메틸-pipBOR AAC 처리는 대다수의 마우스에서 감염을 청소할 수 있었다. 놀랍게도, 에스. 아우레우스를 인식하지 않는 인간 IgG 항체로 제조된 대조군 AAC (gD-AAC)의 처리는 상기 모델에서 일부 효능을 보였다. gD 항체는 그의 항원 결합 부위를 통해 에스. 아우레우스를 인식하지 않지만, 항체는 에스. 아우레우스에서 발견되는 단백질 A에 결합할 수 있다.
도 11c는 AAC, 티오-S6078-HC A114C-LCWT-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 129가 정상 수준의 인간 IgG로 재구성된 마우스에서, 도 11a과 동일한 방식에 따라 네이키드 항-WTA 항체 S4497보다 효능이 더 크다는 것을 제시하는 생체내 감염 모델을 보여준다. CB17.SCID 마우스는 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 일정한 수준을 생성하기 위해 최적화된 투여 요법을 사용하여 인간 IgG로 재구성하였다. 마우스를 S4497 항체 (50 mg/Kg), 또는 티오-S6078-HC A114C-LCWT-MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 129 AAC (50 mg/Kg)로 처리하였다.
FACS 분석은 생체내 감염으로부터 단리된 박테리아에 대한 높은 농도의 gD 항체를 사용한 염색이, 감염된 신장으로부터 단리된 MRSA에 대한 항-MRSA 항체의 결합에 비해 에스. 아우레우스에 대한 낮은 결합 수준을 생성함을 보여주었다 (도 11b). 마우스를 정맥내 주사에 의해 MRSA로 감염시키고, 감염된 신장을 감염 3일 후에 제거하고, 균질화하였다. 항-MRSA 또는 대조군 항체를 알렉사 (Alexa)-488로 표지하고, 0.08 ㎍/mL 내지 50 ㎍/mL의 농도 범위에서 시험하였다. S4497 항체는 에스. 아우레우스의 세포벽 상의 베타-아노머 결합을 통해 세포벽 테이코산 (WTA)에 연결된 N-아세틸글루코사민 변형을 인식한다. S7578 항체는 알파-아노머 결합을 통해 WTA에 연결된 유사한 N-아세틸글루코사민 변형에 결합한다. rF1 항체는 세포벽 고정된 단백질을 함유하는 SDR-반복부의 패밀리에서 발견되는 당 변형을 인식하는 양성 대조군 항-MRSA 항체이다. gD 항체는 에스. 아우레우스를 인식하지 않는 음성 대조군 인간 IgG1이다. gD 항체의 총 결합 수준은 S4497 항체를 사용하여 얻은 것보다 유의하게 더 낮지만 (FACS 분석에 의해 적어도 30배 더 낮은 것으로 추정됨, 도 11b), gD-AAC 사용시 관찰된 제한된 효능은 심지어 생체내에서 AAC의 MRSA에 대한 낮은 수준 결합이 반코마이신 사용시 얻어지는 CFU 감소와 동등한 것으로 보이는 효능을 달성하기에 충분함을 나타낸다.
상기 데이타는 AAC가 세포내 MRSA를 사멸시키고 S4497-pipBOR, 및 S4497 디메틸-pipBOR AAC가 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 MRSA의 감염 제한에 효과적임을 명백하게 입증한다. 본 발명의 AAC는 포유동물 세포 내의 박테리아를 사멸시킴으로써 작용하고, 이에 의해 반코마이신 처리에 내성인 박테리아의 집단 사멸에 더 효과적인 특유한 치료제를 제공한다.
도 20은 50 mg/Kg의 자유 항체를 사용한 전처리가 정맥내 감염 모델에서 효능을 나타내지 않음을 보여준다. Balb/c 마우스에게 2x107 CFU의 USA300의 감염 30분 전에 단일 용량의 비히클 대조군 (PBS) 또는 50 mg/Kg의 항체를 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 처리군은 에스. 아우레우스에 결합하지 않는 이소형 대조군 항체 (gD), 세포벽 테이코산의 베타 변형에 대해 작용하는 항체 (4497) 또는 세포벽 테이코산의 알파 변형에 대해 작용하는 항체 (7578)를 포함하였다. 대조군 마우스에게는 110 mg/Kg의 반코마이신을 복강내 주사에 의해 1일 2회 처리하였다 (반코). 모든 마우스를 감염 후 제4일에 희생시키고, 신장 내의 생존 박테리아의 총수 (2개의 신장에서 모음)를 플레이팅에 의해 결정하였다. 반코마이신을 사용한 예비-처리가 시험한 모든 마우스에서 감염을 청소하였지만, 에스. 아우레우스의 세포벽에 대해 작용하는 항체를 사용한 예비-처리는 박테리아 로드에 대한 효과를 보이지 않았다.
도 21 및 도 22는 세포벽 테이코산의 베타 변형 또는 세포벽 테이코산의 알파 변형에 대해 작용하는 AAC가 정상 수준의 인간 IgG로 재구성된 마우스를 사용한 정맥내 감염 모델에서 효능을 나타냄을 보여준다. CB17.SCID 마우스는 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 일정한 수준을 생성하기 위해 최적화된 투여 요법을 사용하여 인간 IgG로 재구성하고, 2x107 CFU의 USA300으로 정맥내 주사에 의해 감염시켰다. 처리는 감염 1일 후에 완충제 단독 대조군 (PBS), 60 mg/Kg의 베타-WTA AAC (136 AAC) 또는 60 mg/Kg의 알파-WTA AAC (155 AAC)로 개시하였다. 마우스를 감염 후 제4일에 희생시키고, 신장 (2개의 신장에서 모음, 도 21) 및 심장 (도 22) 내의 생존 박테리아의 총수를 플레이팅에 의해 결정하였다. 베타-WTA AAC 처리는 비히클 대조군으로 처리된 마우스에 비해 신장 내의 박테리아 로드를 100,000배 감소시켰다. 알파-WTA AAC 처리는 신장 내의 박테리아 로드를 평균 9,000배 감소시켰다.
현재까지, 현재 이용가능한 항생제가 종종 박테리아의 세포내 저장소 (store)를 사멸시킬 때 비효과적인 이유는 여전히 불명확하다. 항생제는 세포 내에서 충분한 농도에 도달하지 못하기 때문에, 박테리아의 세포내 저장소가 존재하는 파고리소솜 구획에 들어가지 못하기 때문에, 또는 포유동물 세포로부터 항생제를 제거하는 유출 펌프의 활성에 적용될 수 있기 때문에 실패할 수 있다. 항생제는 포식작용된 박테리아를 특이적으로 사멸시키기 위해 방출된 낮은 pH, 환원제 및 산화제를 포함하는 포식리소솜 내에서 발견되는 가혹한 조건에 의해 손상될 수 있다. 대안적으로, 항생제는 박테리아가 방어 메카니즘을 상향조절하거나 또는 포식리소솜 내에서 분열하지 못하고 따라서 항생제에 대해 일시적으로 비감수성으로 되기 때문에 실패할 수 있다. 항생제 내성의 이들 메카니즘의 상대적인 중요성은 상이한 병원체 및 각각의 항생제에 대해 상이할 것이다. 본 발명자들의 AAC, pipBOR 및 디메틸-pipBOR의 항생제 성분은 자유 항생제로서 시험될 때 세포내 MRSA의 사멸시키는 리팜피신보다 실제로 더 강력하다. 이들 항생제의 항체에 대한 연결은 생체내에서 분명한 효능의 실제 용량 의존성 증가를 제공한다 (도 9c). 이 경우, 항생제 단독보다 AAC의 개선된 효능은 박테리아를 옵소닌화하고 AAC의 약동학을 개선하는 그의 능력의 조합 때문인 것으로 보인다. 대부분의 자유 항생제는 생체내에서 신속하게 청소되고, 혈청 내에 충분한 항생제 농도를 유지하기 위해 고농도의 항생제의 반복 투여를 필요로 한다. 이와 대조적으로, AAC는 분자의 항체 부분 때문에 혈청 내에서 긴 반감기를 갖는다. AAC는 에스. 아우레우스에 결합하고 박테리아와 함께 파고리소솜의 한정된 공간 내로 전송된 후에만 항생제를 방출하므로, 적은 용량의 항생제를 대부분의 항생제가 실패하는 거점 (niche) 내에 특이적으로 농축시킨다. 따라서, 세포내 박테리아의 보호된 저장소를 표적화하는 것 이외에, AAC는 가장 필요로 하는 부위로 항생제의 방출을 제한함으로써 단일 작용제로서 사용하기 위해 과도한 독성을 갖는 것으로 증명될 수 있는 보다 강력한 항생제의 사용을 용이하게 할 수 있다.
도 35 및 36은 티오-S6078 AAC에 대한 시험관내 대식세포 검정의 결과를 보여준다. 에스. 아우레우스 (USA300 NRS384)를 항체의 박테리아에 대한 결합을 허용하기 위해 1시간 동안 50 ㎍/mL의 비접합된 S6078 항체 및 50 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL 또는 0.05 ㎍/mL의 AAC와 함께 인큐베이션하였다 (도 31). 생성되는 옵소닌화된 박테리아를 뮤린 대식세포에 공급하고, 포식작용을 허용하기 위해 37℃에서 인큐베이션하였다. 2시간 후에, 감염 혼합물을 제거하고, 임의의 잔류하는 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 50 ㎍/mL의 겐타마이신을 보충한 정상 성장 배지로 교체하였다. 생존 세포내 박테리아의 총수를 대식세포 용해물의 연속 희석액을 트립틱 소이 아가 플레이트 상에 플레이팅함으로써 2일 후에 결정하였다. 도 35에서, 티오-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(디메틸pipBOR) AAC는 티오-S6078 항체 당 2.0 (AAC-173) 또는 3.9 (AAC-171) 디메틸pipBOR 항생제 (LA-54)의 항생제 로딩과 함께 0.5 ㎍/mL 또는 그 초과의 용량에서 세포내 박테리아의 사멸에 효과적이었다. 도 36에서, 티오-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(피페라즈BOR)은 티오-S6078 항체 당 1.8 (AAC-174) 또는 3.9 (AAC-172) 피페라즈BOR 항생제 (LA-65)의 항생제 로딩과 함께 0.5 ㎍/mL 또는 그 초과의 용량에서 세포내 박테리아의 사멸에 효과적이었다.
도 37 및 38은 뮤린 정맥내 감염 모델에서 티오-S6078 AAC의 생체내 효능의 결과를 보여준다. CB17.SCID 마우스는 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 일정한 수준을 생성하기 위해 최적화된 투여 요법을 사용하여 인간 IgG로 재구성하였다. 마우스를 USA300으로 감염시키고, 티오-S6078 항체 당 2.0 (AAC-173) 또는 3.9 (AAC-171) 디메틸pipBOR 항생제 (LA-54)의 항생제 로딩과 함께 비히클 대조군 (PBS), 티오-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(디메틸pipBOR) AAC로 (도 37) 및 티오-S6078 항체 당 1.8 (AAC-174) 또는 3.9 (AAC-172) 피페라즈BOR 항생제 (LA-65)의 항생제 로딩과 함께 티오-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(피페라즈BOR)로 (도 38) 처리하였다. 마우스에게 단일 용량의 AAC를 감염 후 제1일에 정맥내 주사에 의해 투여하고, 감염 후 제4일에 희생시켰다. 2개의 신장 내의 생존 박테리아의 총수를 플레이팅에 의해 결정하였다. 보다 낮은 항생제 로딩을 함유하는 AAC를 사용한 처리는 박테리아 존재량을 약 1,000배 감소시키고, 보다 높은 항생제 로딩을 함유하는 AAC를 사용한 처리는 박테리아 존재량을 10,000배 초과의 수준으로 감소시켰다.
항체-항생제 접합체에 대한 스타포파인 B 절단가능한 링커
프로테아제 절단가능한 링커는 분비된 에스. 아우레우스 엔도펩티다제인 스타포파인 B에 의해 절단된다고 본원에서 설명된다. 스타필로코쿠스 아우레우스 박테리아에 의해 특이적으로 절단되는 링커를 설계하기 위해, 에스. 아우레우스 배양 상청액의 프로테아제 활성을 FRET 펩티드 라이브러리를 사용하여 특성화하였다. 상기 스크린으로부터, 특유한 기질 특이성을 확인하였다. 상기 기질을 사용하여, 활성을 책임지는 효소를 배양 상청액으로부터 정제하고, 스타포파인 B로서 확인하였다. 상기 확인을 기초로 하여, 스타포파인 B 최적화된 링커를 생성하고, 피페라지노-리파마이신에 연결하였다:
Figure pct00109
피페라지노-리파마이신은 강력한 리팔라질-유사 항생제이다. 생성되는 AAC는 MRSA 감염의 시험관내 및 생체내 모델에서 효능을 보였고, 이것은 그에 의해 표적 MRSA 감염을 표적화하는 신규한 메카니즘을 제공한다. 스타포파인 B는 엔도펩티다제의 파파인 패밀리로부터의 분비된 시스테인 프로테아제이고 (CAS Reg. No. 347841-89-8, 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) #S3951, [Filipek et al. (2005) J. Biol. Chem. 280 (15): 14669-74]), P2 위치에 부피가 큰 방향족 측쇄를 선호하는, 특유한 기질 특이성을 갖도록 진화하였다. 스타포파인 B의 발현은 스타필로코쿠스 단백질 분해 캐스케이드 (SCP)의 일부로서 agr (또는 보조 유전자 조절제) 쿼럼 센싱 (quorum sensing) 시스템 (Janzon, L. and S. Arvidson (1990) The EMBO journal 9(5): 1391-1399)에 의해 제어된다. Agr은 분비형 프로테아제 및 아우레올리신, V8, 및 스타포파인 A를 포함하는 에스. 아우레우스의 다른 병독성 인자의 발현을 조절한다 (Shaw, L., E. Golonka, et al. (2004) Microbiology 150(Pt 1): 217-228). 스타포파인 B는 숙주 연결 조직을 분해하고 몇 개의 면역계 단백질을 증가시키는 그의 능력에 의해 강력한 병독성 인자로 제시되었다 ([Imamura, T., S. Tanase, et al. (2005) Journal of experimental medicine 201(10): 1669-1676]; [Potempa, J., A. Dubin, et al. (1988) Journal of biological chemistry 263(6): 2664-2667]; [Ohbayashi, T., A. Irie, et al. (2011) Microbiology 157(Pt 3): 786-792]; [Smagur, J., K. Guzik, et al. (2009); Biological chemistry 390(4): 361-371]; [Smagur, J., K. Guzik, et al. (2009); Journal of innate immunity 1(2): 98-108]; [Kulig, P., B. A. Zabel, et al. (2007); Journal of immunology 178(6): 3713-3720]). 중요한 병독성 인자로서 스타포파인 B의 역할 때문에, 이것은 프로테아제 매개 항생제 방출을 위한 매력적인 표적이 된다.
스타필로코쿠스 아우레우스 프로테아제에 의해 절단되는 기질의 확인:
에스. 아우레우스 엔도펩티다제에 의해 쉽게 절단되는 기질을 확인하기 위해, Wood46 균주 에스. 아우레우스의 밤새 배양액으로부터의 상청액을 상업적으로 이용가능한 FRET 펩티드 라이브러리와 함께 인큐베이션하였다. Wood46 균주는 구성적으로 활성인 agr 유전자좌를 갖고, 따라서 Wood46 균주는 야생형에 비해 증가된 프로테아제 발현을 보인다. FRET 펩티드 라이브러리, 신속한 엔도펩티다제 프로파일링 라이브러리 또는 PepSets™ REPLi (미모토페스 (Mimotopes, 호주 빅토리아))는 96-웰 플레이트 방식으로 웰당 8개의 내부 켄칭된 형광 펩티드를 갖는 512개의 웰로 이루어진다. 펩티드는 절단시 형광을 내고, 이것은 단백질 분해 활성의 실시간 모니터링을 허용한다. 각각의 펩티드는 한 측면에 일련의 글리신 잔기 및 용해도를 위해 C-말단에 추가의 2개의 리신 잔기를 갖는 트리펩티드 가변 코어를 갖는다. Wood46 배양액으로부터의 상청액을 라이브러리에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 형광의 15배 초과의 증가를 보이는 웰 (총 512개 웰 중 12개)을 절단 생성물을 결정하기 위해 LC-MS (애질런트 (Agilent) Q-TOF)에 의해 분석하였다. 절단 부위는 빈도를 기초로 하여 평가하였다 (표 4). 상위 히트 (top hit) 중에서, 기질 특이성의 패턴이 관찰되었고, 특히 P2 위치에 Phe 및 Tyr의 부피가 큰 소수성 측쇄가 선호된다.
<표 4> Wood46 분비 프로테아제에 의해 절단되는 REPLi 서열의 아미노산 선호도. 각각의 위치에서의 풍부도 (%)
Figure pct00110
웰의 FRET 펩티드에 존재하는 아미노산 잔기의 각각의 위치에서의 풍부도는 형광의 가장 큰 증가를 보였다. REPLi 펩티드는 서열 MCA-Gly-Gly-Gly-Xaa-Yaa-Zaa-Gly-Gly-DPA-Lys-Lys (서열 132)을 포함하고, 여기서 Xaa, Yaa, 및 Zaa는 상이하다. 표에 존재하는 글리신 잔기는 가변 코어에 인접하는 Gly 잔기를 나타낸다. Gly 잔기가 여러 위치에서 가장 풍부하지만, 이들은 기질 특이성에 대한 통찰력을 거의 제시하지 않는다. 링커를 설계할 때, 가변 코어로부터의 아미노산에 대해 선호도가 제시되었다. 임의의 상위 히트에 존재하지 않는 아미노산은 표에서 생략되었다.
시험관내에서 MRSA 프로테아제에 의해 절단되는 FRET 기질의 설계 및 접합:
P1, P2, 및 P3에 대한 특이성 정보를 사용한 REPLi 스크린으로부터, 절단된 펩티드 내의 가장 빈도 높은 잔기를 사용하여 펩티드를 설계하고 합성하였다. 펩티드는 서열 GGAFAGGG (서열 126)를 가졌고, GGAFA (서열 131)와 GGG 사이에서 절단이 예상되었다. 항체 시스테인 잔기에 대한 접합을 허용하기 위해 N-말단에 부가된 말레이미도-프로피온산을 갖는 FRET 쌍으로서 형광 염료 테트라메틸로다민 (TAMRA) 및 플루오레세인을 포함하는 고체상 합성을 사용하여 펩티드를 합성하였다 (도 26). 생성되는 mal-FRET-펩티드, 즉 말레이미도-프로피온산 (MP)-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(플루오레세인) (서열 125로서 개시된 "코어 펩티드")을 시스테인-조작된 티오Mab 항체인 티오-S4497에 접합시켰다. mal-FRET-펩티드를 또한 비결합 대조군인 시스테인-조작된 항-Her2 티오Mab 트라스투주맙에 접합시켰다.
티오-S4497-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(플루오레세인) (서열 125로서 개시된 "코어 펩티드") FRET 접합체 및 비-결합 대조군 FRET 접합체 티오-트라스투주맙-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(플루오레세인) (서열 125로서 개시된 "코어 펩티드")을 트립틱 소이 브로쓰 (TSB) 내에 108 세포/ml 및 107 세포/ml의 세포 밀도로 Wood46 (도 28) 및 야생형 USA300 (도 29)의 대수기 배양액과 함께 인큐베이션하였다. 모든 웰에 대한 MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(플루오레세인) (서열 125로서 개시된 "코어 펩티드")의 최종 농도는 2 μM이었다. 형광을 37℃, 여기 λ495 nm/방출 λ518 nm에서 시간에 따라 모니터링하였다. 형광의 증가는 Wood46 및 USA300 둘 모두에서 4497-mal-FRET-펩티드 접합체 사용시에 관찰되었고, 이것은 FRET 펩티드가 에스. 아우레우스 프로테아제에 의해 절단되고 프로테아제가 두 균주에 존재함을 나타낸다. 링커 단위 MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(플루오레세인) (서열 125로서 개시된 "코어 펩티드")은 에스. 아우레우스에 결합하는 항체에 접합될 때 Wood46 및 USA300 둘 모두에서 절단된다. USA300에서 상기 모델 링커의 절단의 확인은 잠재적인 치료적 항체-항생제 접합체 (AAC)가 표적화할 MRSA의 임상 균주에 대한 그의 관련성 때문에 매우 중요하였다. 티오-S4497-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(플루오레세인) (서열 125로서 개시된 "코어 펩티드") FRET 접합체는 두 균주 모두에서 형광의 증가를 보이고, 이것은 링커가 에스. 아우레우스 프로테아제에 의해 절단되고 프로테아제가 MRSA의 임상적으로 관련되는 균주인 USA300에 존재함을 나타낸다. 세포 밀도는 절단 비율에 영향을 주고, 절단은 보다 높은 세포 밀도의 배양액에서 보다 조기에 발생한다. 비-결합 대조군 티오-트라스투주맙-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(플루오레세인) (서열 125로서 개시된 "코어 펩티드") 접합체는 시험된 임의의 조건에서 형광의 증가를 보이지 않았다.
세포 기반 검정으로부터 절단된 기질을 기초로 하여, 링커-항생제 중간체 LA-59 (표 2)를 제조하고, 항체에 접합하여 표 3의 항-MRSA 중쇄, 시스테인 조작된 티오-S4497 (AAC-113) 및 티오-S4462 (AAC-114), 및 항-HER2 경쇄 티오-트라스투주맙 (AAC-115)을 형성하였다. GGAFAGGG (서열 126) 연결된 AAC는 Wood46 밤새 배양액으로부터의 농축된 상청액과 함께 인큐베이션될 때 FRET-펩티드보다 더 양호한 절단 비율을 보였고, 이것은 링커-항생제가 관심있는 미지의 프로테아제에 대한 더 우수한 기질임을 나타낸다. 절단은 GGAFAGGG-연결된 (서열 126로서 개시된 "코어 펩티드") AAC (AAC-113, AAC-114, AAC-115) 내의 알라닌과 글리신 사이의 예상된 부위에서 발생하였다. 이 링커-항생제 (LA-59)는 절단시에 자유 리파마이신이 아니라 GGG-리파마이신이 방출되기 때문에 항생제에 대한 최적 전달 시스템이 아니다. 상기 링커-항생제의 치료 잠재력은 불명확할 수 있지만, 프로테아제에 의해 효율적으로 절단되는 그의 능력 때문에, 이것은 관심있는 활성 프로테아제를 함유하는 분획을 확인하기 위한 유용한 도구 화합물이 될 수 있다. 링커-항생제 중간체 LA-59를 티오-S4497 항체의 Fab 부분에 접합시켰다 (Scheer, J. M., W. Sandoval, et al. (2012). PloS one 7(12): e51817). 시스테인-조작된 Fab 항체인 "티오FAB"는 하나의 티올 반응성 화합물의 부위-특이적 접합을 가능하게 하는 하나의 반응성 시스테인을 갖는다. 티오FAB S-4497을 실온에서 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl 내에서 1 hr 동안 티오FAB에 비해 3배 몰 과량의 LA-59와 반응시켰다. 과량의 LA-59를 PBS 내에서 투석여과에 의해 AAC로부터 분리하였다. 생성되는 접합체인 티오FAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) (서열 126로서 개시된 "코어 펩티드") (도 27)를 활성 분획을 확인하기 위한 도구 화합물로서 사용하였고, 링커의 절단은 LC-MS 분석에 의해 검출된다.
스타포파인 B에 의한 효율적인 절단을 위한 링커의 최적화:
링커-항생제 중간체 LA-59, MC-GGAFAGGG-(pipBOR) (서열 126로서 개시된 "코어 펩티드")는 P1, P2, 및 P3 위치에 최적화된 기질 잔기를 갖는다. REPLi 스크린으로부터의 결과를 사용하여, P4에 대한 잔기 선호를 포함시킨 2개의 새로운 링커를 설계하고 합성하였다 (도 30). 말레이미도-프로피오닉-Leu-Ala-Phe-Ala-Ala (서열 136으로서 개시된 "코어 펩티드") 및 말레이미도-프로피오닉-Leu-Ala-Phe-Gly-Ala (서열 135로서 개시된 "코어 펩티드")을 고체상 합성을 사용하여 합성하였다. 이소류신 및 류신은 REPLi 스크린 (글리신 무시)에서 P4에서 가장 빈도 높은 잔기이었다. 합성되는 링커의 수를 제한하기 위해 단지 하나의 잔기 류신을 선택하였다. Ala 및 Gly이 절단성에 대한 효과를 조사하기 위해 P1 위치에 교대로 존재하였다. P1'의 잔기 Ala이 또한 포함되었다. QSY®7 (잔틸륨, 9-[2-[[4-[[(2,5-디옥소-1-피롤리디닐)옥시] 카르보닐]-1-피페리디닐]술포닐]페닐]-3,6-비스(메틸페닐아미노)-NHS 에스테르, 클로라이드, CAS Reg. No. 304014-12-8, 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies))이 항생제 대용물로서 작용하도록 두 링커의 C-말단에 부가되었다 (도 30). QSY®7을 도입함으로써, 비싸고 노동력이 많이 필요한 항생제를 소비하지 않으면서 이들 링커의 절단성을 평가할 수 있다.
실험적 mal-펩티드-QSY7 링커를 티오FAB S4497에 접합하여 이들 링커의 절단성을 평가하였다. 접합은 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다. 생성되는 티오FAB S4497 링커-QSY7 접합체를 pH 7.2에서 스타포파인 B, 스타포파인 A, 및 인간 카텝신 B에 의한 절단성에 대해 평가하였다 (표 5). 스타포파인 B처럼, 스타포파인 A는 프로테아제의 파파인 패밀리의 에스. 아우레우스로부터 분비된 시스테인 프로테아제이다. 이것은 스타포파인 B와 구조적으로 유사하지만, 더 넓은 기질 특이성을 갖는다 (Filipek, R., M. Rzychon, et al. (2003). The Journal of biological chemistry 278(42): 40959-40966). 포유동물 시스테인 리소솜 프로테아제인 카텝신 B도 엔도펩티다제의 파파인 패밀리의 멤버이다. 이것은 본원에서 설명되는 다른 AAC 링커에서 사용되는 발린-시트룰린 링커를 절단하는 것으로 생각된다.
<표 5> 스타포파인 및 인간 카텝신 B에 의한 최적화된 링커의 절단
Figure pct00111
표 5는 티오FAB에 접합된 최적화된 링커의 스타포파인 A, 스타포파인 B, 및 카텝신 B에 의한 절단으로부터의 데이타를 보여준다. 최종 링커-항생제 MP-LAFG-피페라지노-리파마이신 (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드")은 3개의 모든 프로테아제에 의해 효율적으로 절단된다. 스타포파인에 의한 절단은 자유 리파마이신의 방출을 유도한다. 카텝신 B에 의한 절단은 Phe-Gly-피페라지노-리파마이신을 방출한다 (실시예 26).
자유 항생제를 방출하는 스타포파인 B 절단가능한 링커의 설계 및 접합:
시험된 실험 링커의 절단 검정으로부터, mal-LAFGA (서열 135로서 개시된 "코어 펩티드")를 항생제 부착을 위해 선택하였다. 상기 링커의 추가의 최적화는 단백질 분해 절단시에 자유 항생제 방출을 달성하기 위해 필요하였다. 이를 달성하기 위해, P1'의 Ala을 p-아미노벤질 (PAB) 또는 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PABC)로 교체하였다. 피페라지노-리파마이신을 상기 링커의 C-말단에 부가하여 링커-항생제 중간체 LA-88 MC-LAFG-PAB-(디메틸아미노-3-피롤로BOPv) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") 및 LA-104, MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOPv) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드")를 완성하였다. P1 위치의 Gly 다음에서 절단시에, PAB 및 PABC 기는 자가 희생되어 자유 항생제를 방출하도록 설계된다. LA-88은 접합되어 티오-S4497-v8-LCV205C-MC-LAFG-PAB-(디메틸아미노-3-피롤로BOR) AAC-163 (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") (표 3)를 형성하였다. LA-104는 접합되어 AAC-193, AAC-215, 및 AAC-222를 형성하였다. 스타포파인 A, 스타포파인 B, 및 카텝신 B를 사용한 AAC 193의 절단 검정을 pH 7.2 및 pH 5에서 수행하였다. 이들 pH 값은 혈장 (pH 7.2) 또는 포식리소솜의 환경 (pH 5)을 모방하기 위해 선택하였다. 스타포파인 B는 pH 5 및 7.2 둘 모두에서 100% 절단을 달성하였다. 스타포파인 A는 pH 5에서 100% 절단을, pH 7.2에서 64% 절단을 보였다.
P1' 기에서 Ala에 대한 PABC의 치환은 카텝신 B가 링커를 절단하는 위치를 변경하였다. 카텝신 B에 의한 절단시에, Phe-Gly-PABC-(피페라지노BOPv)가 방출되었다. 치료제로서, 카텝신 B에 의한 상기 링커의 잠재적인 절단은 대식세포의 리소솜 구획에서 발생할 가능성이 가장 크다. 이들 환경 하에서, 스타포파인 B를 포함하는 다른 프로테아제는 FG-PABC-피페라지노-리파마이신을 추가로 처리하여 자유 항생제를 방출할 수 있다.
링커-항생제 중간체 MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") LA-104를 티오MAB S4497에 접합하여 생성되는 AAC인 AAC-193, AAC-215, AAC-222의 시험관내 및 생체내 효능을 평가하였다. LA-104를 티오MAB 항-Her2 및 티오MAB 항-gD (둘 모두 이소형 대조군임)에 접합하여 2개의 대조군 접합체도 제조하였다. 경쇄 연결된, 티오MAB 4497 MP-LAFG-PABC-피페라지노-리파마이신 접합체 (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") AAC-215의 약물 대 항체 비 (DAR)는 티오MAB 항-gD 대조군 접합체처럼 1.6이었다. 티오MAB 항-Her2 mal-LAFG-PABC-피페라지노-리파마이신 (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") 접합체의 DAR은 1.5이었다.
분비된 프로테아제에 의해 쉽게 절단된 기질을 확인하기 위해 FRET 펩티드 라이브러리를 사용하여 에스. 아우레우스 배양 상청액을 스크리닝하였다. 상기 스크리닝의 결과는 압도적인 대다수의 측정된 프로테아제 활성이 에스. 아우레우스의 하나의 분비된 시스테인 프로테아제인 스타포파인 B에 의한 것일 수 있음을 보여주었다. 스타포파인 B에 의한 절단을 위해 설계된 펩티드 링커를 최적화하고, 자유 항생제를 방출한, 효율적으로 절단된 기질을 확인하였다. 생성되는 링커는 또한 에스. 아우레우스 프로테아제 스타포파인 A 및 인간 프로테아제 카텝신 B (둘 모두 역시 시스테인 프로테아제임)에 의해 절단된다.
에스. 아우레우스에 결합하는 항체에 접합될 때, 생성되는 AAC는 시험관내에서 및 생체내에서 모두 효능을 보인다. MRSA의 내인성 엔도펩티다제는 MRSA 감염을 표적화하기 위한 메카니즘을 제공하고, 질환 특이적 방식으로 페이로드 (payload)를 방출한다. 에스. 아우레우스의 분비된 프로테아제에 의해 절단되는 상기 링커의 능력은 숙주 혈장/조직에서 인간 호중구에 및 세포 외에 모두 존재하는 MRSA의 표적화를 허용한다. 상기 이중 표적화는 세포내 및 세포외 감염 부위 둘 모두에서 고농도의 항생제의 방출을 가능하게 할 수 있다.
스타포파인 A 및 B 발현은 인간 호중구에서 상향-조절되고, 이들을 프로테아제 매개 항생제 방출을 위한 매력적인 표적으로 만드는 중요한 병독성 인자로 생각된다 (Burlak, C., et al. (2007) Cellular microbiology 9(5):1172-1190). 인간 카텝신 B도 링커를 절단하고, 다른 방출 경로를 제시한다. AAC의 관찰된 효능은 아마도 항생제 또는 항생제 모이어티의 방출에 관여하는, 에스. 아우레우스 및 숙주 둘 모두로부터의 다중 프로테아제의 결과로 보인다. 여러 프로테아제에 의해 절단된 혈청-안정성 링커는 박테리아의 내성 돌연변이를 압도할 수 있는 방출 메카니즘을 제공한다.
항체-항생제 접합체를 사용하여 감염을 치료하고 예방하는 방법
본 발명의 AAC는 스타필로코쿠스, 예를 들어 에스. 아우레우스, 에스. 사프로피티쿠스(S. saprophyticus) 및 에스. 시물란스(S. simulans); 리스테리아(Listeria), 예를 들어 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes); 엔테로코커스(Enterococci), 예를 들어 이. 파에칼리스(E. faecalis); 스트렙토코커스(Streptococci), 예를 들어 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae); 클로스트리듐(Clostridium), 예를 들어 씨. 디피실레(C. difficile)를 포함하는, 많은 인간 및 가축 그람 양성, 그람 음성 병원체에 대해 효과적인 항미생물제로서 유용하다.
지속적인 균혈증은 숙주 세포 내로의 내재화에 의해 발생할 수 있다. 완전히 이해되는 것은 아니지만, 내재화된 병원체는 숙주 세포 내부에서 생존함으로써 면역 인지를 벗어날 수 있다. 상기 유기체는 에스. 아우레우스, 살모넬라 (예를 들어, 에스. 티피(S. typi), 에스 콜레라에수이스(S. choreraesuis) 및 에스. 엔테리티디스(S. enteritidis)), 레지오넬라(Legionella) (예를 들어, 엘. 뉴모필라(L. pneumophila)), 리스테리아(Listeria) (예를 들어, 엘. 모노시토게네스(L. monocytogenes)), 브루셀라(Brucella) (예를 들어, 비. 아보르투스(B. abortus), 비. 멜리텐시스(B. melitensis), 비. 수이스(B. suis)), 클라미디아(Chlamydia) (씨. 뉴모니아에(C. pneumoniae), 씨. 트라코마티(C. trachomati)), 리케치아(Rickettsia) 종, 시겔라 (예를 들어, 에스. 플렉스네리(S. flexneri)), 및 미코박테리아(mycobacteria)를 포함한다.
혈류 내에 들어온 후, 에스. 아우레우스는 거의 모든 장기에서 전이성 감염을 유발할 수 있다. 2차 감염은 요법 개시 전에 약 1/3의 환자에서 (Fowler et al., (2003) Arch. Intern. Med. 163:2066-2072), 및 심지어 요법 개시 후 10%의 환자에서 발생한다 (Khatib et al., (2006) Scand. J. Infect. Dis., 38:7-14). 감염의 특징은 큰 고름 저장소, 조직 파괴, 및 농양 형성 (이 모두는 다량의 호중구를 포함함)이다. 균혈증이 48시간 이내에 사라지면 단지 약 5%의 환자에서만 합병증이 발생하지만, 균혈증이 3일 초과로 지속되면 그 수준은 40%로 상승한다.
에스. 아우레우스는 일반적으로 독소를 분비하는 세포외 병원체로 간주되지만, 이것이 내피 세포, 각질세포, 섬유모세포, 및 파골세포 내에서 생존할 수 있다는 증거가 존재한다 ([Alexander et al., (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:361-366]; [Garzoni et al., (2009) Trends Microbiol. 17:59-65]). 호중구 및 대식세포는 박테리아 감염에 대한 숙주 선천 면역 반응의 핵심 성분이다. 이들 세포는 포식작용에 의해 에스. 아우레우스를 내재화하고, 이것은 병원체 및 호중구, 대식세포, 및 다른 전문적인 포식세포에 동시에 결합할 수 있는 항체, 보체, 또는 숙주 렉틴, 예컨대 만노스 결합 단백질에 의해 향상될 수 있다. 이전에 언급된 바와 같이, 에스. 아우레우스는 리소솜 환경에서 생존할 뿐만 아니라, 이를 숙주에서 지속 발생을 위한 메카니즘으로서 실제로 이용할 수 있다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 (AAC)는 파고리소솜에 존재하는 것을 비롯한 세포내 병원체의 치료를 위한 유의한 치료상 이점을 갖는다. 한 실시양태에서, 병원체는 백혈구 세포 내로 내재화되고, 세포내 성분은 파고리소솜이다. 무손상 AAC에서, 항체 가변 영역은 박테리아 상의 세포 표면 항원에 결합한다 (옵소닌화). 임의의 하나의 이론으로 제한되지 않지만, 한 메카니즘에서, 박테리아 세포 표면에 결합하는 AAC의 항체 성분에 의해, 포식세포는 박테리아로 유인된다. 항체의 Fc 부분은 포식세포 상의 Fc 수용체에 결합하여, 포식작용을 용이하게 한다. AAC-박테리아 복합체가 포식작용된 후, 리소솜에 융합될 때, AAC 링커는 파고리소솜 효소에 대한 노출에 의해 절단되어 활성 항생제를 방출한다. 한정된 공간 및 비교적 높은 국소 Abx 농도 (약 104/박테리아) 때문에, 그 결과는 포식리소솜이 세포내 병원체의 생존을 더 이상 지지하지 않는다는 것이다 (도 5). AAC는 본질적으로 불활성 전구약물이기 때문에, 항생제의 치료 지수는 자유 (비접합된) 형태에 비해 연장될 수 있다. 항체는 병원체 특이적 표적화를 제공하고, 절단가능한 링커는 병원체의 세포내 위치에 특이적인 조건 하에 절단된다. 효과는 옵소닌화된 병원체 및 파고리소솜에 동시에 위치하는 다른 병원체 둘 모두에 직접 작용할 수 있다. 구체적인 측면에서, 병원체는 에스. 아우레우스이다.
항생제 내성은 항생제 및 다른 항미생물제에 의한 사멸에 저항하는 질환-유발 병원체의 능력이고, 다중 내성과는 메카니즘이 구별된다 (Lewis K (2007). "Persister cells, dormancy and infectious disease". Nature Reviews Microbiology 5(1): 48-56. doi: 10.1038/nrmicro 1557). 오히려, 상기 내성 형태는 지속 생존으로 불리는 미생물 세포의 작은 하위 집단에 의해 유발된다 (Bigger JW (14 October 1944). "Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilization". Lancet 244 (6320): 497-500). 이들 세포는 전통적인 의미에서 다중 내성이 아니고, 오히려 그의 유전적으로 동일한 형제 (sibling)를 사멸시킬 수 있는 항생제 처리에 내성인 우성 세포이다. 상기 항생제 내성은 비-분열 또는 극히 느리게 분열하는 생리학적 상태에 의해 유도된다. 항미생물제 처리가 이들 지속 생존 세포를 근절시키지 못할 때, 이들은 재발하는 만성 감염의 저장소가 된다. 본 발명의 항체-항생제 접합체는 이들 지속 생존 세포를 사멸시키고 다중 내성 박테리아 집단의 출현을 억제하는 특유한 특성을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 AAC는 병원체가 생존하는 세포내 구획과 무관하게 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, AAC는 플랑크톤 또는 생물막 형태 (예: 에스. 아우레우스, 케이. 뉴모니아(K. pneumonia), 이. 콜라이, 에이. 바우만니이(A. baumannii), 피. 아에루기노사 및 엔테로박테리아세아에)의 박테리아를 항체-매개 옵소닌화에 의해 표적화하여, 포식세포에 의한 내재화를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 파고솜이 리소솜과 융합할 때, 충분히 높은 농도의 자유 항생제가 포식작용된 병원체를 사멸시키기 위해 포식리소솜의 산성 또는 단백질 분해 환경에서 AAC로부터 방출될 것이다.
본 발명의 항체-항생제 접합체 (AAC)를 사용하여 감염을 치료하는 방법은 박테리아 폐 감염, 예컨대 에스. 아우레우스 폐렴 또는 결핵 감염, 박테리아 눈 감염, 예컨대 과립성 결막염 (trachoma) 및 결막염, 심장, 뇌 또는 피부 감염, 위장관 감염, 예컨대 여행자 설사병, 골수염, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군 (IBS), 크론 (Crohn) 병, 및 IBD (염증성 장 질환), 박테리아 수막염, 및 임의의 장기, 예컨대 근육, 간, 수막, 또는 폐의 농양을 치료하는 것을 포함한다. 박테리아 감염은 요로, 혈류, 상처 또는 카테터 삽입 부위와 같은 신체의 다른 부분에서 발생할 수 있다. 본 발명의 AAC는 생물막, 임플란트 (implant) 또는 성소 (sanctuary) 부위를 수반하는 난치성 감염 (예를 들어, 골수염 및 보철 관절 감염), 및 높은 사망률 감염, 예컨대 병원 획득 폐렴 및 균혈증에 유용하다. 스타필로코쿠스 아우레우스 감염을 예방하기 위해 치료할 수 있는 취약 환자군은 혈액투석 환자, 면역억제 환자, 집중치료실의 환자, 및 특정 수술 환자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 동물에게 본 발명의 AAC 또는 AAC의 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서 미생물의 사멸, 미생물 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 미생물 감염과 연관된 또는 이 감염에 의해 기회적으로 발생하는 질환의 치료 또는 예방을 특징으로 한다. 상기 치료 또는 예방 방법은 본 발명의 조성물의 경구, 국소, 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 수술 또는 IV 카테터의 삽입 전에, ICU 간호시에, 이식 의약에서, 암 화학요법과 함께 또는 그 후에, 또는 감염 위험이 높은 다른 활동 전에, 본 발명의 AAC는 감염의 발생 또는 확산을 방지하기 위해 투여될 수 있다.
박테리아 감염은 활성 및 불활성 형태의 박테리아에 의해 야기될 수 있고, AAC는 활성 및 불활성 잠복 형태 둘 모두의 치료에 충분한 양으로, 충분한 기간 동안 투여되고, 이 기간은 박테리아 감염의 활성 형태 치료에 필요한 것보다 더 길다.
다양한 그람+ 박테리아의 분석은 WTA 베타가 MRSA 및 MSSA 균주, 및 비-에스. 아우레우스 균주, 예컨대 에스. 사프로피티쿠스 및 에스. 시물란스를 비롯한 모든 에스. 아우레우스에서 발현됨을 보여준다. WTA 알파 (알파-GLcNAc 리비톨 WTA)는 전부는 아니지만, 대부분의 에스. 아우레우스에 존재하고, 또한 리스테리아 모노시토게네스에도 존재한다. WTA는 그람- 박테리아에는 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 치료 유효량의 본 발명의 항-WTA 베타-AAC를 투여함으로써 에스. 아우레우스 또는 에스. 사프로피티쿠스 또는 에스. 시물란스로 감염된 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 측면은 치료 유효량의 본 발명의 항-WTA 알파-AAC를 투여함으로써 에스. 아우레우스 또는 리스테리아 모노시토게네스로 감염된 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명은 또한 병원 환경, 예컨대 수술, 화상 환자, 및 장기 이식에서 치료 유효량의 본 발명의 항-WTA 베타-AAC를 투여함으로써 에스. 아우레우스 또는 에스. 사프로피티쿠스 또는 에스. 시물란스에 의한 감염을 예방하는 방법을 고려한다.
관련 기술 분야의 통상의 의사에 의해 결정시에 박테리아 감염의 치료를 필요로 하는 환자는 이미 감염된 박테리아의 종류로 진단되었을 수 있고, 현재 진단될 필요는 없다. 박테리아 감염 환자는 수 시간 내에 매우 빠르게 악화될 수 있기 때문에, 환자는 병원에 이송된 후에 하나 이상의 치료 기준 Abx, 예컨대 반코마이신과 함께 본 발명의 항-WTA-AAC가 투여될 수 있다. 진단 결과가 이용가능하고, 예를 들어 에스. 아우레우스 감염의 존재를 나타낼 때, 환자는 항-WTA AAC를 사용한 치료를 계속할 수 있다. 따라서, 박테리아 감염 또는 구체적으로 에스. 아우레우스 감염의 치료 방법의 한 실시양태에서, 환자에게 치료 유효량의 항-WTA 베타 AAC가 투여된다. 본 발명의 치료 또는 예방의 방법에서, 본 발명의 AAC는 유일한 치료제 또는 아래에서 설명되는 바와 같은 다른 작용제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 AAC는 전-임상 모델에서 MRSA의 치료시에 반코마이신보다 우수한 효능을 보인다. AAC의 SOC에 대한 비교는 예를 들어 사망률의 감소에 의해 측정될 수 있다. 치료되는 환자는 다양한 측정가능한 인자에 의해 AAC 치료에 대한 반응성에 대해 평가될 것이다. 의사가 환자의 개선을 평가하기 위해 사용할 수 있는 징후 및 증상의 예는 다음을 포함한다: 진단시 상승한 경우 백혈구 계수의 정상화, 진단시 상승한 경우 (열) 체온의 정상화, 혈액 배양액의 정화, 홍반의 완화 및 배농을 포함하는 상처의 가시적인 개선, 산소를 공급한 환자에서 보다 적은 산소 또는 감소된 산소 공급 속도를 필요로 하는 바와 같은 산소호흡기 필요성 감소, 환자가 진단시에 산소를 공급한 경우 산소호흡기의 완전한 제거, 의약이 진단시에 필요한 경우 안정한 혈압을 지지하기 위한 보다 적은 상기 약물의 사용, 말단 장기 부전, 예컨대 크레아티닌 상승을 시사하는 실험실 검사치 이상 또는 진단시에 비정상인 경우 간 기능 시험의 정상화, 및 방사선 영상 (예를 들어, 이전에 폐렴을 보여주는 분석을 제시한 흉부 x-선)의 개선. ICU의 환자에서, 이들 인자는 적어도 매일 측정될 수 있다. 절대 호중구 계수를 비롯한 백혈구 계수 및 "좌방 이동 (left shift)" (활성 감염에 반응한 호중구 생산 증가를 나타내는 모세포의 출현)이 해결되었다는 증거처럼 열을 긴밀하게 모니터링한다.
본 발명의 치료 방법의 측면에서, 박테리아 감염 환자는 치료 개시 전 또는 개시시 또는 진단시의 값, 징후 또는 증상에 비해 상기 인자 중 적어도 2 이상에서 관련 기술 분야의 통상의 의사에 의해 평가될 때 유의한 측정가능한 개선이 존재할 경우 치료된 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 상기 인자 중 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과에서 측정가능한 개선이 존재한다. 일부 실시양태에서, 측정된 인자는 치료 전의 값에 비해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 개선된다. 일반적으로, 환자는 환자의 측정가능한 개선이 다음을 포함할 경우 박테리아 감염 (예를 들어, 에스. 아우레우스 감염)이 완전히 치료된 것으로 간주될 수 있다: i) 본래 확인된 박테리아를 성장시키지 않는 반복적인 혈액 또는 조직 배양 (일반적으로 수 회); ii) 열이 정상화됨; iii) WBC가 정상화됨; 및 iv) 환자의 기존재하는 동반질환 (co-morbidity)을 고려하여, 말단 장기 부전 (폐, 간, 신장, 혈관 허탈 (collapse))이 완전히 또는 부분적으로 해결되었다는 증거.
투여
임의의 상기 측면에서, 감염된 환자의 치료시에, AAC의 용량은 보통 약 0.001 내지 1000 mg/kg/일이다. 한 실시양태에서, 박테리아 감염 환자는 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 일반적으로 약 5 mg/kg 내지 약 90 mg/kg, 보다 구체적으로 10 mg/kg 내지 50 mg/kg의 AAC 용량으로 치료된다. AAC는 매일 (예를 들어, 단일 용량의 5 내지 50 mg/kg/일) 또는 이보다 덜 빈번하게 (예를 들어, 단일 용량의 5, 12.5, 또는 25 mg/kg/주) 투여될 수 있다. 단일 용량은 2일에 걸쳐, 예를 들어, 첫날 25 mg/kg, 다음날 25 mg/kg으로 투여될 수 있다. 환자에게 용량을 1-8주의 기간 동안 3일마다 1회 (q3D), 매주 내지 격주 (qOW) 1회 투여할 수 있다. 한 실시양태에서, 환자에게 박테리아 감염, 예컨대 staph A 감염을 치료하기 위한 치료 기준 (SOC)과 함께 본 발명의 AAC를 2-6주 동안 매주 1회 IV를 통해 투여한다. 치료 기간은 환자의 상태 또는 감염 정도에 따라 좌우될 것이고, 예를 들어 합병증이 없는 균혈증은 2주, 또는 심내막염이 있는 균혈증은 6주이다.
한 실시양태에서, AAC는 1 내지 7일 동안 연속적으로 2.5 내지 100 mg/kg의 초기 용량으로 투여된 후, 1개월 동안 1 내지 7일마다 0.005 내지 10 mg/kg의 유지 용량으로 1회 투여된다.
투여 경로
박테리아 감염의 치료를 위해, 본 발명의 AAC는 임의의 상기 투여량으로 정맥 내 (i.v.) 또는 피하 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, WTA-AAC는 정맥 내로 투여된다. 구체적인 실시양태에서, i.v.로 투여되는 WTA-AAC는 보다 구체적으로 WTA-베타 AAC이고, 여기서 WTA-베타 항체는 도 14, 도 15a, 도 15b, 도 16a, 및 도 16b에 개시된 아미노산 서열을 갖는 Ab의 군으로부터 선택된다.
조합 요법
AAC는 환자를 치료하는 의사의 결정에 따라 적절한 하나 이상의 추가의, 예를 들어 제2의 치료 또는 예방제와 함께 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물과 조합하여 투여되는 제2 항생제는 다음과 같은 구조 클래스로부터 선택된다: (i) 아미노글리코시드; (ii) 베타-락탐; (iii) 마크롤리드/시클릭 펩티드; (iv) 테트라시클린; (v) 플루오로퀴놀린/플루오로퀴놀론; 및 (vi) 옥사졸리디논 ([Shaw, K. and Barbachyn, M. (2011) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1241:48-70]; [Sutcliffe, J. (2011) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1241: 122-152] 참조).
한 실시양태에서, 본 발명의 항체-항생제 접합체 화합물과 조합하여 투여되는 제2 항생제는 클린다마이신, 노보비오신, 레타파물린, 답토마이신, GSK-2140944, CG-400549, 시타플록사신, 테이코플라닌, 트리클로산, 나프티리돈, 라데졸리드, 독소루비신, 암피실린, 반코마이신, 이미페넴, 도리페넴, 겜시타빈, 달바반신, 및 아지트로마이신으로부터 선택된다.
상기 추가의 치료제 또는 예방제의 추가의 예는 소염제 (예를 들어, 비-스테로이드성 소염 약물 (NSAID; 예를 들어, 데토프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페나메에이트, 메페남산, 멜록시캄, 나부메온, 나프록센 나트륨, 옥사프로진, 피록시캄, 술린닥, 톨메틴, 셀레콕시브, 로페콕시브, 아스피린, 콜린 살리실레이트, 살살레이트, 및 나트륨 및 마그네슘 살리실레이트) 및 스테로이드 (예를 들어, 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론)), 항박테리아제 (예를 들어, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 가티플록사신, 레보플록사신, 아목시실린, 메트로니다졸, 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 나프실린, 암피실린, 카르베니실린, 티카르실린, 메즐로실린, 피페라실린, 아즐로실린, 테모실린, 세팔로틴, 세파피린, 세프라딘, 세팔로리딘, 세파졸린, 세파만돌, 세푸록심, 세팔렉신, 세프로질, 세파클로르, 로라카르베프, 세폭시틴, 세프마토졸, 세포탁심, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세픽심, 세프포독심, 세프티부텐, 세프디니르, 세프피롬, 세페핌, BAL5788, BAL9141, 이미페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아스트레오남, 클라불라네이트, 술박탐, 타조박탐, 스트렙토마이신, 네오마이신, 카나마이신, 파로마이신, 겐타미신, 토브라마이신, 아미카신, 네틸미신, 스펙티노마이신, 시소미신, 디베칼린, 이세파미신, 테트라시클린, 클로르테트라시클린, 데메클로시클린, 미노시클린, 옥시테트라시클린, 메타시클린, 독시시클린, 텔리트로마이신, ABT-773, 린코마이신, 클린다마이신, 반코마이신, 오리타반신, 달바반신, 테이코플라닌, 퀴누프리스틴 및 달포프리스틴, 술파닐아미드, 파라-아미노벤조산, 술파디아진, 술피속사졸, 술파메톡사졸, 술파탈리딘, 리네졸리드, 날리딕산, 옥솔린산, 노르플록사신, 퍼플록사신, 에녹사신, 오플록사신, 시프로플록사신, 테마플록사신, 로메플록사신, 플레록사신, 그레파플록사신, 스파르플록사신, 트로바플록사신, 클린다플록사신, 목시플록사신, 게미플록사신, 시타플록사신, 답토마이신, 가르에녹사신, 로모플라닌, 파로페넴, 폴리믹신, 티게시클린, AZD2563, 또는 트리메토프림), AAC 표적화된 Ag로부터의 동일한 또는 상이한 항원에 결합하는 항체를 포함하는 항박테리아 항체, 혈소판 응집 억제제 (예를 들어, 압시믹시맙, 아스피린, 실로스타졸, 클로피도그렐, 디피리다몰, 에프티피바티드, 티클로피딘, 또는 티로피반), 항응고제 (예를 들어, 달테파린, 다나파로이드, 에녹사파린, 헤파린, 틴자파린, 또는 와파린), 해열제 (예를 들어, 아세트아미노펜), 또는 지질 저하제 (예를 들어, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 니코틴산, 겔피브로질, 프로부콜, 에제티미베, 또는 스타틴, 예컨대 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 세리바스타틴, 및 플루바스타틴)이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 AAC는 에스. 아우레우스 (메티실린-내성 및 메티실린-감수성 균주 포함)에 대한 치료 기준 (SOC)과 조합하여 투여된다. MSSA는 대체로 나프실린 또는 옥사실린으로 일반적으로 치료되고, MRSA는 일반적으로 반코마이신 또는 세파졸린으로 치료된다.
이들 추가의 치료제는 AAC 투여 14일, 7일, 1일, 12시간, 또는 1시간 내에, 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 AAC와 동일하거나 상이한 제약 조성물에 존재할 수 있다. 상이한 제약 조성물에 존재할 때, 상이한 투여가 사용될 수 있다. 예를 들어, AAC는 정맥 내로 또는 피하 투여될 수 있는 반면, 제2 작용제는 경구 투여될 수 있다.
제약 제제
본 발명은 또한 AAC를 함유하는 제약 조성물, 및 AAC를 함유하는 제약 조성물을 사용하여 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 조성물은 적합한 부형제, 예컨대 제약상 허용되는 부형제 (담체), 예를 들어 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고 본원에서 설명되는 완충제, 산, 염기, 당, 희석제, 활택제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 단독으로 또는 감염성 질환의 치료를 위한 다른 종래의 방법 및/또는 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 항체 및/또는 그의 적어도 하나의 항체-항생제 접합체 (AAC)를 포함하는 제약 제제를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 제제는 1) 본 발명의 항체 및/또는 그의 AAC, 및 2) 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 제제는 1) 본 발명의 항체 및/또는 그의 AAC, 및 임의로, 2) 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 AAC를 포함하는 제약 제제는 목적하는 순도를 갖는 항체 또는 AAC를 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여 수용액 또는 동결건조된 또는 다른 건조된 제제의 형태로 보관을 위해 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드); 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 생체내 투여를 위해 사용되는 제약 제제는 일반적으로 멸균되고, 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 미세캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체 또는 본 발명의 AAC를 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 항체 또는 AAC가 장기간 동안 체내에 남아있을 때, 이들은 37℃에서 습기에 노출된 결과로서 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 가능하게는 면역원성의 변화가 일어날 수 있다. 관련된 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성할 수 있다.
항체는 표적 세포/조직으로 전달하기 위한 임의의 적합한 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 항체는 약물의 포유동물에 대한 전달에 유용한 다양한 종류의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 이루어지는 작은 소포인 리포좀으로서 제제화될 수 있다. 리포좀의 성분은 통상 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층으로 배열된다. 항체를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688]; [Hwang et al., (1980) Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030]; US 4485045; US 4544545; WO 97/38731; US 5013556에 기재된 바와 같이, 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 제조된다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 생성하기 위해 규정된 세공 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 쇄간 반응을 통해 문헌 [Martin et al., (1982) J. Biol. Chem. 257:286-288]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 포함된다 (Gabizon et al., (1989) J. National Cancer Inst. 81(19): 1484).
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 임의의 항체는 생물학적 샘플에서 MRSA의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. "생물학적 샘플"은 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 가래, 흡인물, 면봉채취물 등을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출에 사용하기 위한 항-WTA 항체가 제공된다. 추가의 측면에서, 생물학적 샘플에서 WTA의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-WTA 항체의 WTA에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에서 설명되는 항-WTA 항체와 접촉시키고, 항-WTA 항체와 생물학적 샘플 내의 WTA 사이에 복합체가 형성되는지 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-MRSA 항체는 항-MRSA 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하기 위해 사용되고, 예를 들어 MRSA는 환자의 선택을 위한 바이오마커이다.
한 예시적인 실시양태에서, 항-WTA 항체는 예를 들어 감염을 진단 또는 예측하거나 감염 치료를 시행하기 위해, 적절한 치료 과정을 결정하기 위해, 또는 요법에 대한 감염의 반응을 모니터링하기 위한 목적으로, 대상체에서 MRSA-양성 감염을, 예를 들어 생체내 영상화에 의해 검출하기 위해 생체내에서 사용된다. 생체내 검출을 위해 관련 기술 분야에 공지된 하나의 방법은 예를 들어 문헌 [Dongen et al., (2007) The Oncologist 12:1379-1389] 및 [Verel et al., (2003) J. Nucl. Med. 44: 1271-1281]에 기재된 면역-양전자 방출 단층촬영법 (면역-PET)이다. 상기 실시양태에서, 대상체에서 Staph-양성 감염을 검출하는 방법이 제공되고, 이 방법은 표지된 항-Staph 항체를 Staph-양성 감염이 존재하거나 존재하는 것으로 의심되는 대상체에 투여하고, 대상체에서 표지된 항-Staph 항체를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 표지된 항-Staph 항체의 검출은 대상체의 Staph-양성 감염을 나타낸다. 특정 상기 실시양태에서, 표지된 항-Staph 항체는 양전자 방출기, 예컨대 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I에 접합된 항-Staph 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 양전자 방출기는 89Zr이다.
추가의 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법은 기재에 고정된 제1 항-Staph 항체를 Staph의 존재에 대해 시험할 생물학적 샘플과 접촉시키고, 기재를 제2 항-Staph 항체에 노출시키고, 제2 항-Staph 항체가 제1 항-Staph 항체와 생물학적 샘플 내의 Staph 사이의 복합체에 결합하는지 검출하는 것을 포함한다. 기재는 임의의 지지 매체, 예를 들어, 유리, 금속, 세라믹, 중합체 비드, 슬라이드, 칩, 및 다른 기재일 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적 암성 결직장, 자궁내막, 췌장 또는 난소 조직을 포함하는 생검 물질)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 또는 제2 항-Staph 항체는 본원에서 설명되는 임의의 항체이다. 상기 실시양태에서, 제2 항-WTA 항체는 항-WTA 항체 S4497, S4462, S6978, S4487, 또는 본원에서 설명되는 바와 같이 이들로부터 유래된 항체일 수 있다.
면역조직화학 (IHC) 또는 계내 혼성화 (ISH)와 같은 시험을 사용하여 임의의 상기 실시양태에 따라 진단 또는 검출될 수 있는 예시적인 질환은 MRSA-양성 감염을 포함한다. 일부 실시양태에서, Staph-양성 감염은 Staph mRNA를 검출하는 역전사효소 PCR (RT-PCR) 검정에 따라 Staph를 발현하는 감염이다. 일부 실시양태에서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR (Francois P and Schrenzel J (2008). "Rapid Diagnosis and Typing of Staphylococcus aureus". Staphylococcus: Molecular Genetics. Caister Academic Press; Mackay IM, ed. (2007)), 및 실시간 PCR ("Real-Time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization. Caister Academic Press)이다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체가 제공된다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자 고밀도, 화학발광, 및 방사성 표지), 및 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (US 4737456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화하기 위해 과산화수소를 이용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 표지는 양전자 방출기이다. 양전자 방출기는 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 양전자 방출기는 89Zr이다.
임상적으로, MRSA 감염 증세는 메티실린-감수성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MSSA)의 증세와 유사하고, 농양 및 봉와직염을 포함한다. 종종, 농양에는 중심성 괴사 영역이 수반된다. 절종 (부스럼)이 또한 특히 MRSA 발생 측면에서 흔하다. 병변은 또한 괴사 중심으로 진행하는 일반적인 적열 상태 때문에 거미가 문 것으로 잘못 보고될 수 있다. 추가로, 감염은 농가진, 모낭염, 고질적인 농양, 화농성 근염, 골수염, 괴사성 근막염, 스타필로코쿠스 독성-쇼크 증후군, 폐렴 및 패혈증으로서 보일 수 있다. 심각한 전신 감염은 주사 약물 사용력, 당뇨 또는 다른 면역손상 상태가 존재하는 사람에서 보다 흔하다.
MRSA 감염에 대한 표준 치료 방법은 보존적, 기계적 방법, 예컨대 (i) 온습포, (ii) 절개 및 배농, 및 (iii) 감염을 유발하는 외부 장비 (예를 들어, 카테터)의 제거를 포함한다. 보다 심각한 감염, 특히 봉와직염을 보이는 것에 대해, 항생제 (Abx)가 처방된다. 경도 내지 중등도 감염에 대해, 항생제는 트리메토프림-술파메톡사졸 (TMP-SMX), 클린다마이신, 독시시클린, 미노시클린, 테트라시클린, 리팜핀, 반코마이신, 리네졸리드를 포함한다. 일반적으로, 치료 요법은 5-10일 동안 시행하고, 주기적 재검사 및 치료 기간 동안 및 후 둘 다의 평가를 실시한다.
추가의 치료 방법은 특히 환자가 재발하는 감염을 경험하거나 또는 MRSA 발생이 진행되는 환경에 존재하는 상황에서 탈집락화 (decolonization)를 포함한다. 탈집락화는 환자의 콧구멍을 저해하는 세균총 (flora)이 제거되는 절차이다. 이것은 5-10일 동안 두 콧구멍 내에 충분한 2% 무피로신 연고의 국소 도포, 이어서 5일 동안 클로르헥시딘 글루코네이트 4%를 사용한 국소 세정을 통해 수행한다.
제조품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 설명된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 포함하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기 및 용기 위에 있거나 용기에 부속된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 홀로 또는 또 다른 조성물과 조합되어 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하기 위해 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근구를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체 또는 면역접합체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태의 치료를 위해 사용됨을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 조성물이 그 내에 담긴 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 그 내에 담긴 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태의 제조품은 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 감안하면 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있음이 이해된다.
실시예 1. MC-vc-PAB-pipBOR 51
2-니트로벤젠-1,3-디올 1을 에탄올 용매 내에서 팔라듐/탄소 촉매를 사용하여 수소 기체 하에 수소화하여 2-아미노벤젠-1,3-디올 2를 얻고, 염산염으로서 단리하였다 (도 23a 및 23b). 2를 디클로로메탄/테트라히드로푸란 중의 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 및 트리에틸아민으로 1가-보호하여 2-아미노-3-(tert-부틸디메틸실릴옥시)페놀 3을 얻었다. 리파마이신 S (켐셔틀 인크. (ChemShuttle Inc., 미국 캘리포니아주 프레몬트), US 7342011; US 7271165; US 7547692)을 실온에서 톨루엔 내에서 산화마그네슘 또는 산소 기체를 사용한 산화적 응축에 의해 3과 반응시켜 TBS-보호된 벤즈옥사지노 리파마이신 4를 얻었다. 4를 피페리딘-4-아민 및 산화마그네슘과 반응시켜 피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (pipBOR) 5를 얻었다.
피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (pipBOR) 5 (0.02 mmol) 및 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6 (0.02 mmol)을 실온 (RT)에서 DMF (0.4 ml) 내에서 혼합하였다. 여기에 2.5 당량의 N,N'-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 용액을 1 내지 약 12시간 동안 교반하고, LC/MS에 의해 모니터링하였다. 완료 시에, 용액을 DMF로 희석하고 HPLC 상에 주입하고 산성 조건 하에 정제하여 MC-vc-PAB-pipBOR 51 (M/Z = 1498.9. 수율 40%)을 얻었다
실시예 2. MC-fk-PAB-pipBOR 52
실시예 1의 절차에 따라, 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-((S)-5-구아니디노-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소펜탄-2-일아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)헥산아미드 12를 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-페닐프로판아미도)-5-구아니디노펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 13으로 전환시켰다.
Figure pct00112
피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (pipBOR) 5 (0.02 mmol) 및 13 (0.02 mmol)을 실온 (RT)에서 DMF (0.4 ml) 내에서 혼합하였다. 여기에 2.5 당량의 N,N'-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 용액을 1 내지 약 12시간 동안 교반하고, LC/MS에 의해 모니터링하였다. 완료 시에, 용액을 DMF로 희석하고 HPLC 상에 주입하고, 산성 조건 하에 정제하여 MC-fk-PAB-pipBOR 52 (M/Z = 1545.8. 수율 32%)를 얻었다
실시예 3. MP-vc-PAB-pipBOR 53
실시예 1의 절차에 따라, 6-(2-(2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에톡시)아세트아미도)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)헥산아미드 14를 4-((17S,20S)-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-이소프로필-8,15,18-트리옥소-20-(3-우레이도프로필)-3,6-디옥사-9,16,19-트리아자헤니코사나미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 15로 전환시켰다.
Figure pct00113
피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (pipBOR) 5 (0.02 mmol) 및 15 (0.02 mmol)를 실온 (RT)에서 DMF (0.4 ml) 내에서 혼합하였다. 여기에 2.5 당량의 N,N'-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 용액을 1 내지 약 12시간 동안 교반하고, LC/MS에 의해 모니터링하였다. 완료 시에, 용액을 DMF로 희석하고 HPLC 상에 주입하고, 산성 조건 하에 정제하여 MP-vc-PAB-pipBOR 53을 얻었다 (M/Z = 1644.8, 수율 57%).
실시예 4. MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 54
N,N-디메틸피페리딘-4-아민과 TBS-보호된 벤즈옥사지노 리파마이신 4를 반응시켜 디메틸피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (디메틸 pipBOR) 7을 얻었다 (도 24).
대안적으로, (5-플루오로-2-니트로-1,3-페닐렌)비스(옥시)비스(메틸렌)디벤젠 9를 벤질기를 제거하기 위해 테트라히드로푸란/메탄올 용매 내에서 팔라듐/탄소 촉매를 사용하여 수소 기체 하에 수소화하여 2-아미노-5-플루오로벤젠-1,3-디올 10을 얻었다. 시판 리파마이신 S 또는 리파마이신 SV 나트륨염 (켐셔틀 인크., 미국 캘리포니아주 프레몬트)을 60℃에서 에틸아세테이트 내에서 칼륨 시안화제2철 또는 공기 내에서 산화적 응축에 의해 2-아미노-5-플루오로벤젠-1,3-디올 10과 반응시켜 플루오로 벤즈옥사지노 리파마이신 11을 얻었다. 플루오로를 N,N-디메틸피페리딘-4-아민으로 교체하여 디메틸 pipBOR 7을 얻었다 (도 25a 및 25b).
WO 2012113847; US 7659241; US 7498298; US 20090111756; US 20090018086; US 6214345; 문헌 [Dubowchik et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13(4):855-869]의 절차에 따라 제조된 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)헥산아미드 8 (1.009 g, 1.762 mmol, 1.000, 1009 mg)을 N,N-디메틸포름아미드 (6 mL, 77 mmol, 44, 5700 mg) 내에 용해시켰다. 여기에, 디클로로메탄 (DCM) (1 mL, 15.44 mmol, 8.765, 1325 mg) 내의 티오닐 클로라이드 (1.1 당량, 1.938 mmol, 1.100, 231 mg)의 용액을 일부씩 적가하여 첨가하였다 (1/2을 1시간에 걸쳐 첨가하고, 실온 (RT)에서 1시간 동안 교반한 후 추가의 1시간 동안 다른 절반을 첨가하였다). 용액은 황색으로 남았다. 추가의 0.6 eq의 티오닐 클로라이드를 0.5 mL DCM 내의 용액으로서 조심스럽게 적가하였다. 반응액은 황색으로 남았고, RT에서 밤새 밀봉 상태에서 교반하였다. 반응을 LC/MS에 의해 88% 생성물 벤질 클로라이드 9까지 모니터링하였다. 추가의 0.22 eq의 티오닐 클로라이드를 0.3 mL DCM 내의 용액으로서 적가하였다. 반응이 92% 벤질 클로라이드 9에 도달할 때, 반응액을 N2로 발포시켰다. 농도가 0.3 M에서 0.6 M로 감소되었다. 생성물 N-((S)-1-((S)-1-(4-(클로로메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9를 0.6 M 용액으로서 냉장고 내에 저장하고 그대로 사용하였다 (M/Z 591.3, 92% 수율).
플라스크 내에서, N-((S)-1-((S)-1-(4-(클로로메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9 (0.9 mmol)를 0℃로 냉각시키고, 디메틸피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (디메틸 pipBOR) 7 (0.75 g, 0.81 mmol, 0.46, 750 mg)을 첨가하였다. 혼합물을 추가의 1.5 mL의 DMF로 0.3 M에 도달하도록 희석하였다. 공기 중에 열린 상태로 30분 동안 교반하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 (3.5 mmol, 3.5 mmol, 2.0, 460 mg)을 첨가하고, 반응액을 공기 중에 열린 상태로 밤새 교반하였다. 4일에 걸쳐, 반응액을 반응 진행이 중단하는 것으로 보일 때까지 공기 중에 열린 상태로 교반하면서 0.2 eq N,N-디이소프로필에틸아민 염기를 4회 첨가하였다. 반응액을 DMF로 희석하고, 몇몇 배치 (batche)에서 HPLC (20-60% ACN/FAㆍH2O) 상에서 정제하여 MC-vc-PAB-디메틸pipBOR 54를 얻었다 (M/Z=1482.8, 수율: 32%).
실시예 5. MC-vc-PAB-모노메틸pip, 데스아세틸BOR 55
실시예 1의 절차에 따라, N-메틸피페리딘-4-아민 및 TBS-보호된 데스아세틸, 벤즈옥사지노 리파마이신을 산화마그네슘과 반응시켜 모노메틸피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (pipBOR) 16을 얻었다.
Figure pct00114
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6 및 16을 반응시켜 MC-vc-PAB-모노메틸pip, 데스아세틸BOR 55을 얻었다 (26% 수율, M/Z = 1456.5).
실시예 6. MC-vc-PAB-모노메틸pipBOR 56
실시예 1의 절차에 따라, N-메틸피페리딘-4-아민 및 TBS-보호된, 벤즈옥사지노 리파마이신 4를 산화마그네슘과 반응시켜 모노메틸피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (pipBOR) 17을 얻었다.
Figure pct00115
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6 및 17을 반응시켜 MC-vc-PAB-모노메틸pipBOR 56를 얻었다 (25% 수율, M/Z = 1471.0).
실시예 7. MC-vc-PAB-pip, 데스아세틸BOR 57
실시예 1의 절차에 따라, 피페리딘-4-아민 및 TBS-보호된 데스아세틸, 벤즈옥사지노 리파마이신 18을 산화마그네슘과 반응시켜 피페리딜, 데스-아세틸 벤즈옥사지노 리파마이신 (pip 데스아세틸 BOR) 19를 얻었다.
Figure pct00116
피페리딜, 데스-아세틸 벤즈옥사지노 리파마이신 19 (0.02 mmol) 및 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6 (0.02 mmol)을 반응시켜 MC-vc-PAB-pip, 데스아세틸BOR 57을 얻었다 (M/Z = 1456.6. 수율 13%).
실시예 8. MC-vc-PAB-리파부틴 58
Figure pct00117
실시예 1의 절차에 따라, 데스-이소부틸 리파부틴 20 (0.02 mmol) 및 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6 (0.02 mmol)을 반응시켜 MC-vc-PAB-리파부틴 58을 얻었다 (M/Z=1389.6, 수율 21%).
실시예 9. MC-GGAFAGGG-pipBOR (서열 126으로서 개시된 "코어 펩티드") 59
Figure pct00118
실시예 1의 절차에 따라, 말레이미드 펩티드 21을 표준 아미드 결합 형성 조건 하에 피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (pipBOR) 5와 커플링시켜 MC-GGAFAGGG-pipBOR (서열 126로서 개시된 "코어 펩티드") 59를 얻었다 (M/Z=1626.0, 수율 13%).
실시예 10. MC-vc-PAB-rif 60
Figure pct00119
작은 바이알 내에서, 실시예 4의 절차에 의해 제조한 N-((S)-1-((S)-1-(4-(클로로메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9의 0.6 M 용액 0.05 mL을 0℃로 냉각시키고, 1 당량의 벤즈옥사지노 리파마이신 22을 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 상기 0℃ 용액에 K2CO3 (15 eq)을 첨가하고, 바이알의 측벽을 0.05 mL의 DMF로 세척하였다. 반응액을 1-4시간 동안 실온으로 공기 중에 열린 상태로 교반하였다. 모든 9가 소비될 때, 고체를 여과 제거하고, 수집한 여액을 DMF로 희석하였다. HPLC에 의해 정제하여 MC-vc-PAB-rif 60을 얻었다 (11% 수율, M/Z = 1356.9).
실시예 11. MC-vc-PAB-디메틸pip, 데스아세틸BOR 61
Figure pct00120
실시예 4의 절차에 따라, N-((S)-1-((S)-1-(4-(클로로메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9를 디메틸피페리딜, 데스아세틸 벤즈옥사지노 리파마이신 (디메틸, 데스아세틸 pipBOR) 23과 반응시켜 MC-vc-PAB-디메틸pip, 데스아세틸BOR 61을 얻었다 (M/Z = 1440.66).
실시예 12. MC-vc-PAB-피페라즈BTR 62
Figure pct00121
실시예 1의 절차에 따라, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6을 피페라지노 벤즈티아지노 리파마이신 (피페라즈BTR) 24와 반응시켜 MC-vc-PAB-피페라즈BTR 62을 얻었다 (M/Z = 1483.7).
실시예 13. MC-vc-PAB-피페라즈, 데스아세틸BTR 63
Figure pct00122
실시예 1의 절차에 따라, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6을 피페라지노, 데스아세틸 벤즈티아지노 리파마이신 (pipBTR) 25와 반응시켜 MC-vc-PAB-피페라즈, 데스아세틸BTR 63을 얻었다 (M/Z = 1441.6).
실시예 14. MC-vc-PAB-피페라즈, 데스아세틸BOR 64
Figure pct00123
실시예 1의 절차에 따라, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6을 피페라질, 데스아세틸 벤즈옥사지노 리파마이신 (데스아세틸 pipBOR) 26과 반응시켜 MC-vc-PAB-피페라즈, 데스아세틸BOR 64를 얻었다 (M/Z = 1441.6).
실시예 15. MC-vc-PAB-피페라즈BOR 65
Figure pct00124
실시예 1의 절차에 따라, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6을 피페라질 벤즈옥사지노 리파마이신 (피페라질BOR) 27과 반응시켜 MC-vc-PAB-피페라즈BOR 65를 얻었다 (M/Z = 1482.7).
실시예 16. MC-vc-비스PAB-디메틸pipBOR 66
바이알 내에서, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 6 (1.56 g, 2.11 mmol, 100 질량%)를 DMF (55 당량, 116 mmol, 55.0, 8.5 g) 내에 용해시키고 RT에서 교반하였다. 상기 흐린 황색 혼합물에 (4-아미노페닐)메탄올 (PAB, 1.1 당량, 2.33 mmol, 1.10, 286 mg) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (0.37 당량, 0.782 mmol, 0.370, 106 mg)에 이어서 N,N'-디이소프로필에틸아민 (1 당량, 2.11 mmol, 1.00, 276 mg)을 첨가하였다. 반응액을 2시간 동안 교반하고 LC/MS에 의해 모니터링하였다. 추가의 1 당량의 N,N'-디이소프로필에틸아민 (휘니그 (Hunigs) 염기) 및 100 mg의 (4-아미노페닐)메탄올을 첨가하였다. 반응액을 RT에서 밀봉 상태로 밤새 교반하였다. 약 0.5 L의 디에틸 에테르를 적가하여 생성물을 침전시켰다. 에테르를 따라내고, 고체를 DMF 내에 재용해시키고, 몇몇 배치에서 HPLC 상으로 직접 정제하여 다음 구조를 갖는 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-(히드록시메틸)페닐카르바메이트 28 (0.435g)을 28% 총 단리된 수율로 얻었다 (M/Z: 722.5):
Figure pct00125
실시예 4의 절차에 따라, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-(히드록시메틸)페닐카르바메이트 28을 티오닐 클로라이드와 반응시켜 다음 구조를 갖는 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-(클로로메틸)페닐카르바메이트 29를 47% 단리된 수율로 얻었다 (M/Z: 740.4):
Figure pct00126
실시예 4의 절차에 따라, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 4-(클로로메틸)페닐카르바메이트 29를 디메틸피페리딜 벤즈옥사지노 리파마이신 (디메틸 pipBOR) 7과 반응시켜 MC-vc-비스PAB-디메틸pipBOR 66을 5% 수율로 얻었다 (M/Z: 1632.1).
실시예 17. MC-vc-PAB-메틸피페라즈 BOR 67
Figure pct00127
실시예 4의 절차에 따라, N-((S)-1-((S)-1-(4-(클로로메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9를 메틸피페라지노 벤즈옥사지노 리파마이신 (메틸 피페라즈BOR) 30과 반응시켜 MC-vc-PAB-메틸피페라즈 BOR 67을 얻었다 (M/Z = 1454.68).
실시예 18. 세포내 MRSA는 항생제로부터 보호된다.
본 실시예는 MRSA가 생체내에서 세포 내에서 생존할 수 있다는 증거를 제공한다. 감염 시에, 세포내 MRSA는 항생제 치료 (예컨대, SOC 반코마이신)로부터 보호되고 생존할 수 있어서, 감염을 하나의 세포로부터 다른 세포로 전달시킬 수 있다.
세포외 박테리아에 대한 MIC 결정: 세포외 박테리아에 대한 MIC는 트립틱 소이 브로쓰 내에 항생제의 연속 2배 희석액을 제조하여 결정하였다. 항생제의 희석액은 96 웰 배양 접시 내에 4중으로 제조하였다. MRSA (USA300의 NRS384 균주)를 지수 성장 배양액으로부터 취하고 1x104 CFU/mL로 희석하였다. 박테리아를 항생제의 존재 하에 18-24시간 동안, 37℃에서 진탕하면서 배양하고, 박테리아 성장은 630 nM에서 광학 밀도 (OD)를 판독함으로써 결정하였다. MIC는 박테리아 성장을 >90% 억제한 항생제의 용량인 것으로 결정하였다.
세포내 박테리아에 대한 MIC 결정: 세포내 MIC는 마우스 복막 대식세포 내부에서 격리된 박테리아 상에서 결정하였다. 대식세포를 24 웰 배양 접시 내에 4x105 세포/mL의 밀도로 플레이팅하고, 대식세포 당 10-20 박테리아의 비로 MRSA (USA300의 NRS384 균주)로 감염시켰다. 대식세포 배양액을, 세포외 박테리아의 성장을 억제하기 위해 50 ㎍/mL의 겐타마이신을 보충한 성장 배지 내에 유지하고, 시험 항생제를 감염 1일 후에 성장 배지에 첨가하였다. 세포내 박테리아의 생존을 항생제 첨가의 24시간 후에 평가하였다. 대식세포를 0.1% 소 혈청 알부민 및 0.1% 트리톤 (Triton)-X를 보충한 행크 (Hanks) 완충 염수 용액으로 용해시키고, 용해물의 연속 희석액을 0.05% 트윈-20을 함유하는 포스페이트 완충 염수 용액 내에 제조하였다. 생존 세포내 박테리아의 수는 5% 탈섬유소 양 혈액을 갖는 트립틱 소이 아가 플레이트 상에 플레이팅함으로써 결정하였다.
복막 대식세포의 단리: 복막 대식세포를 6-8주령 Balb/c 마우스 (챨스 리버 래보러토리스 (Charles River Laboratories), 미국 캘리포니아주 홀리스터)의 복막으로부터 단리하였다. 대식세포의 수율을 증가시키기 위해, 마우스를 1 mL의 티오글리콜레이트 배지 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson))의 복강내 주사에 의해 예비-처리하였다. 티오글리콜레이트 배지를 물 중 4%의 농도로 제조하고, 고압멸균 (autoclaving)에 의해 멸균시키고, 사용하기에 앞서 20일 내지 6개월 동안 숙성시켰다. 복막 대식세포는, 복막을 냉 포스페이트 완충 염수로 세척함으로써 티오글리콜레이트를 사용한 처리의 4일 후에 수거하였다. 대식세포를 24 웰 배양 접시 내에서 항생제 없이 10% 태소 혈청 및 10 mM HEPES를 보충한 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 내에 4x105 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이트에 부착을 허용하도록 대식세포를 밤새 배양하였다. 본 검정은 비-포식 세포 종류 내에서 세포내 사멸을 시험하기 위해 또한 이용되었다. MG63 (CRL-1427) 및 A549 (CCL185) 세포주를 ATCC로부터 입수하여, 10 mM Hepes 및 10% 태소 혈청을 보충한 RPMI 1640 조직 배양 배지 (RPMI-10) 내에 유지하였다. HUVEC 세포를 론자 (Lonza)로부터 입수하고, EGM 내피 세포 완전 배지 (론자, 미국 메릴랜드주 워커스빌) 내에 유지하였다.
옵소닌화된 MRSA를 사용한 대식세포의 감염: MRSA의 USA300 균주 (NRS384)를 NARSA repository (미국 버지니아주 샹티이)로부터 입수하였다. 몇몇 실험에서는 에스. 아우레우스의 뉴먼 균주 (ATCC25904)를 이용하였다. 모든 실험에서, 박테리아를 트립틱 소이 브로쓰 내에서 배양하였다. AAC를 사용한 세포내 사멸을 평가하기 위해, USA300을 지수 성장 배양액으로부터 취하고, HB (10 mM HEPES 및 0.1% 소 혈청 알부민을 보충한 행크 균형 염 용액) 내에 세척하였다. AAC 또는 항체를 HB 내에 희석하고, 박테리아와 함께 1시간 동안 인큐베이션하여 박테리아에 대한 항체 결합 (옵소닌화)을 허용하고, 옵소닌화된 박테리아를 사용하여 대식세포 당 10-20 박테리아의 비 (웰 당 250 ㎕의 HB 내에 4x106 박테리아)로 대식세포를 감염시켰다. 대식세포를 감염 직전에 혈청 비함유 DMEM 배지로 예비-세척하고, 박테리아의 포식작용을 허용하기 위해 5% CO2를 함유하는 습윤 조직 배양 인큐베이터 내에서 37℃에서 인큐베이션에 의해 감염시켰다. 2시간 후에, 감염 혼합물을 제거하고, 정상 성장 배지 (10% 태소 혈청, 10 mM HEPES를 보충하고, 세포외 박테리아의 성장을 방지하기 위해 겐타마이신을 50 ㎍/ml로 첨가한 DMEM)로 교체하였다. 인큐베이션 기간의 끝에, 대식세포를 혈청 비함유 배지로 세척하고, 세포를 0.1% 트리톤-X (세포내 박테리아를 손상시키지 않으면서 대식세포를 용해시킨다)를 보충한 HB 내에서 용해시켰다. 몇몇 실험에서, LDH 세포독성 검출 키트 (제품 11644793001, 로슈 다이아그노스틱스 코프 (Roche Diagnostics Corp, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 사용하여 배양 상청액 내로 세포질 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 방출을 검출함으로써 배양 기간의 끝에 대식세포의 생존율을 평가하였다. 상청액을 수집하고 제조자의 지시에 따라 즉시 분석하였다. 용해물의 연속 희석액을 0.05% 트윈-20을 보충한 포스페이트 완충 염수 용액 내에 제조하고 (박테리아의 응집체를 파괴하기 위해), 생존 세포내 박테리아의 총수는 5% 탈섬유소 양 혈액을 갖는 트립틱 소이 아가 상에 플레이팅함으로써 결정하였다.
MRSA 감염된 복막 세포의 생성. 6-8주령 암컷 A/J 마우스 (JAX™ 마우스, 잭슨 래보러토리스 (Jackson Laboratories))를 복막 주사에 의해 1x108 CFU의 USA300의 NRS384 균주로 감염시켰다. 복막 세척액을 감염 1일 후에 수거하고, 감염된 복막 세포를 37℃에서 30분 동안 0.1% BSA를 보충한 Hepes 완충제 (HB 완충제) 내에 희석시킨 50 ㎍/mL의 리소스타핀으로 처리하였다. 이어서, 복막 세포를 빙냉 HB 완충제로 2x 세척하였다. 복막 세포를 10 mM Hepes 및 10% 태소 혈청, 및 5 ㎍/mL 반코마이신을 보충한 RPMI 1640 조직 배양 배지 내에 1x106 세포/mL로 희석하였다. 1차 감염으로부터 유리 MRSA를 호중구 사멸을 시키지 않은 세포외 박테리아에 대한 대조군으로서 포스페이트 완충 염수 용액 내에 4℃에서 밤새 저장하였다.
복막 세포로부터 골모세포로 감염의 전파: MG63 골모세포 세포주를 ATCC (CRL-1427)로부터 입수하고, 10 mM Hepes 및 10% 태소 혈청을 보충한 RPMI 1640 조직 배양 배지 (RPMI-10) 내에 유지하였다. 골모세포를 24 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 배양하여 융합층을 얻었다. 실험일에, 골모세포를 RPMI (보충물 없이) 내에 1회 세척하였다. MRSA 또는 감염된 복막 세포를 완전 RPMI-10에 희석시키고, 반코마이신을 감염 직전에 5 ㎍/mL로 첨가하였다. 복막 세포를 골모세포에 1x106 복막 세포/mL로 첨가하였다. 감염 시간에 살아있는 세포내 박테리아의 실제 농도를 결정하기 위해, 세포의 샘플을 0.1% 트리톤-x로 용해시켰다. 모든 감염에 대한 실제 역가는 박테리아의 연속 희석액을 5% 탈섬유소 양 혈액을 갖는 트립틱 소이 아가 상에 플레이팅함으로써 결정하였다.
MG63 골모세포를 4 웰 유리 챔버 슬라이드 (chamber slide)에 플레이팅하고, 융합층을 형성할 때까지 10 mM Hepes 및 10% 태소 혈청을 보충한 RPMI 1640 조직 배양 배지 (RPMI-10) 내에서 배양하였다. 감염 일에, 웰을 혈청 비함유 배지로 세척하고, 감염된 복막 세포의 현탁액으로, 또는 5 ㎍/mL의 반코마이신을 보충한 완전 RPMI-10 내에 희석시킨 MRSA의 USA300 균주로 감염시켰다. 감염 1일 후에, 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척하고, 2% 파라포름알데히드를 사용하여 PBS 내에서 실온에서 30분 동안 고정시켰다. 웰을 PBS 내에 3X 세척하고, 실온에서 30분 동안 0.1% 사포닌을 함유한 PBS로 투과화하였다.
면역형광: MRSA는 20 ㎍/mL의 토끼 항-Staph 20920 (에이빔 (Abeam), 미국 매사추세츠주 캠브리지)에 이어 항-토끼 로다민 (잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch), 711-026-152)로 염색함으로써 확인하였다. 복막 세포의 세포막을 콜레라-독소-베타 하위단위-비오틴 (인비트로겐 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드)에 이어서 스트렙타비딘 Cy5 (비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산호세)로 염색하였다. 복막 세포에 대한 콜레라-독소의 결합은 항-CD11b 알렉사 488 클론 M1/70 (비디 바이오사이언시스)로 동시-염색함으로써 확인하였다. 슬라이드를 DAPI를 갖는 프로롱 골드 (Prolong Gold) (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)에 탑재하였다. 슬라이드를 레이카 (Leica) SPE 공초점 현미경을 사용하여 시각화하였다. 영상을 일련의 Z-스택 (stack)으로서 수집하고 컴파일링하여 제시된 최대 프로젝션 영상을 생성하였다.
포유동물 세포 내에서 에스. 아우레우스의 생존은 항생제 요법의 존재 하에 지속적 감염을 허용하는 생존가능 거점을 제공한다. 에스. 아우레우스는 호중구, 대식세포, 골모세포 및 상피 세포를 포함한 많은 포유동물 세포 종류를 감염시키고 그 내부에서 생존할 수 있다 (Garzoni, C. and W. L. Kelley (2009) Trends Microbiol 17(2):59-65). 세포내 MRSA가 항생제로부터 보호되는지 여부를 직접 시험하기 위해, 많은 임상적으로 승인된 항생제를 뮤린 대식세포 내에서 격리된 세포내 MRSA를 사멸시키는 능력과 함께, 표준 박테리아 성장 배지 내에서 배양된 세포외 MRSA를 사멸시키는 그들의 능력에 대해 비교하였다 (표 1). 뮤린 복막 대식세포를 상기 분석을 위해 선택하였고, 이것은 이들 세포가 에스. 아우레우스에 대한 선천 면역 반응의 천연 성분인 유전적으로 정상적인 일차 세포 종류를 나타내기 때문이다. 분석은 이들 세포가 시험관내에서 쉽게 감염되고 배양됨을 확인하였다. MRSA는 대식세포 감염 후에 6일까지 세포내 생존할 수 있다 (Kubica, M., K. Guzik, et al. (2008) PLoS One 3(1): e1409). 항생제의 세포내 효과를 시험하기 위해, 대식세포를 MRSA로 감염시키고, 항생제의 불량한 세포 흡수 때문에 포식리소솜 내에서 불활성인 것으로 공지된 항생제인 겐타마이신의 존재 하에 배양하였다 (Vaudaux, P. and F.A. Waldvogel (1979) Antimicrob Agents Chemother 16(6): 743-749). 시험 항생제를, 임상적으로 달성가능한 혈청 수준 (표 1에서 혈청 Cmax로서 제시됨)을 포함하도록 선택된 용량의 범위에서 감염 1일 후에 배양 배지에 첨가하였다 (겐타마이신에 추가로). 상기 분석으로, 세포외 MRSA가 액체 배양액 내에서 낮은 용량의 반코마이신, 답토마이신, 리네졸리드 또는 리팜피신에 의한 성장 억제에 대해 고도로 감수성이지만, 4가지 모든 항생제는 대식세포 내에서 격리된 세포내 MRSA의 동일한 균주를 사멸시키지 못하였음이 밝혀졌다. 현저하게, 심지어, 결핵과 같은 세포내 감염을 치료하기 위한 최상의 항생제 중 하나인 것으로 보고된 리팜피심도 실험 기간 및 용량 범위에 걸쳐 세포내 MRSA의 최소의 사멸을 일으켰다.
[표 1]
몇몇 항생제의 최소 억제 농도 (MIC)
Figure pct00128
상기 데이타는 세포내 박테리아가 세포 내에서 격리된 시간 동안 항생제로부터 보호됨을 확인하였다. 그러나, MRSA는 직접적 세포 대 세포 전파에 의해 이웃 세포를 감염시킬 수 없는 점에서 진정한 세포내 병원체인 것으로 생각되지 않고, 대다수의 감염된 세포는 궁극적으로 세포내 박테리아를 용해 방출시킬 것이다. 따라서, 세포내 풀은 일단 방출되면, 박테리아가 이웃 세포에 의해 즉시 흡수되더라도 불가피하게 적어도 일시적으로 세포외 항생제에 노출될 것임이 여전히 가능하다. 대식세포에 의한 자유 MRSA의 흡수에는 15 내지 90분이 필요하고 (데이타를 제시하지 않음), 이것은 박테리아가 항생제에 대한 단시간 노출에 저항할 수 있으면, 죽어가는 세포로부터 새로운 숙주로 순차적으로 이동함으로써 세포내 거점 내에서 여전히 보호될 수 있음을 제안한다. 항생제에 대한 단시간 노출이 MRSA를 사멸시키기 위해 충분한지 여부를 결정하기 위해, MRSA 감염에 대한 현재 치료 기준인 반코마이신, 및 리팜핀을 시험하였다. MRSA를 활성적으로 성장하는 배양액으로부터 취하고, 정상 성장 배지 내에 1x106 박테리아/mL로 희석하였다. 항생제를 예상된 최소 억제 농도 (MIC)의 2x 내지 10x를 나타내는 2가지 용량으로 첨가하였다. 샘플을 30분 내지 5시간의 다양한 시간에서 제거하고, 항생제를 원심분리 및 희석에 의해 제거하였다. 배양액 내의 생존 박테리아의 총수는 아가 플레이트 상의 플레이팅에 의해 결정하였다.
도 1은 활성적으로 분할하는 MRSA에 대한 반코마이신 (반코) 및 리팜피신 (Rifa)에 대한 사멸 시간의 비교를 보여준다. MRSA를 5시간 동안 TSB 배지 내에서 항생제의 존재 하에 배양하였다. 지시된 시간에, 배양액의 샘플을 취하고, 항생제를 원심분리에 의해 제거하였다. 생존 박테리아의 총수는 플레이팅에 의해 각각의 시점에 결정하였다. 반코마이신을 2 ㎍/mL (열린 정사각형) 및 20 ㎍/mL (닫힌 정사각형)에서 시험하였다. 리팜핀을 0.02 ㎍/mL (열린 삼각형) 및 0.2 ㎍/mL (닫힌 삼각형)에서 시험하였다. 이들 데이타 (도 1)는 두 항생제가 모두 박테리아 성장을 효과적으로 억제할 수 있고 5시간에 생존가능한 박테리아의 100배 손실이 관찰되었지만, 박테리아는 5시간의 관찰 기간에 걸쳐 점진적으로 사멸되었고 90%의 박테리아가 숙주 세포에 의한 잠재적인 흡수에 대한 샘플 시간을 허용하는 항생제 처리의 처음 2시간 동안 여전히 생존가능하였음을 밝혔다.
MRSA의 세포내 저장소를 반코마이신의 존재 하에 증식허용 세포내 거점으로의 감염의 전파에 대해 검정하였다. 에스. 아우레우스는 골모세포 내부에서 생존할 수 있고, 에스. 아우레우스의 세포내 저장소가 에스. 아우레우스의 만성 감염이 항생제 치료에 대해 저항성인 것으로 알려져 있는 상태인 골수염의 환자에서 관찰되었다 ([Thwaites and Gant, (2011) Nature Reviews Microbiology 9:215-222]; [Ellington et al., (2006) J. Orthopedic Research 24(1): 87-93]; [Bosse et al., (2005) J. Bone and Joint Surgery, 87(6): 1343-1347]). 골모세포 세포주 MG63을 사용하는 시험관내 검정을 개발하였고, 이것은 상기 세포주가 세포내 에스. 아우레우스를 보유할 수 있는 것으로 보고되었기 때문이다 (Garzoni and Kelly, (2008) Trends in Microbiology). 상기 검정은 MRSA는 MG63 세포를 감염시킬 수 있고, 생존가능한 세포내 박테리아가 시험관내에서 6일 이내 동안 감염된 MG63 세포로부터 회복될 수 있음을 확인하였다. 세포내 에스. 아우레우스의 풀을 생성하기 위해, MRSA의 복막 주사에 의해 감염시킨 마우스로부터 복막 세포를 수거하였다 (도 2).
도 2는 반코마이신의 존재 하에 감염된 복막 세포로부터 골모세포로 감염의 전파를 보여준다. 세포내 에스. 아우레우스의 풀을 생성하기 위해, A/J 마우스를 MRSA로 감염시키고, 감염된 복막 세포를 감염 1일 후에 취하였다. 유사하게 생성된 세포는 생체내 감염 모델에서 감염을 전파시킬 수 있는 생존가능한 세포내 박테리아를 보유하는 것으로 보고되었다 (Gresham et al. J Immunol 2000; 164:3713-3722). 감염된 복막 세포는 주로 호중구 및 대식세포의 혼합물로 이루어지고, 대략 10%의 세포가 세포내 박테리아를 보유하였다. 세포외 박테리아를 제거하기 위해 세포를 리소스타핀으로 처리하고, 5 ㎍/mL의 반코마이신을 보충한 성장 배지 내에 현탁시켰다. 감염이 개시된 시간에 생존가능한 세포내 MRSA의 정확한 용량을 결정하기 위해, 감염을 위해 사용된 복막 세포의 샘플을 용해시키고, 다양한 용량의 자유 세포외 MRSA를 또한 비교를 위해 반코마이신을 함유한 배지에서 희석하였다. 이어서, 복막 세포 (세포내 MRSA), 또는 자유 박테리아 (세포외 MRSA를)를 MG63 골모세포의 단층에 첨가하고, 4시간 (열린 막대) 또는 1일 (닫힌 막대) 동안 배양하였다. 각각의 웰 내의 생존하는 세포내 박테리아의 총수를 세포 용해물을 아가 플레이트 상에 플레이팅함으로써 결정하였다. 세포외 MRSA 대조군에 비해 세포내 MRSA는 반코마이신으로부터 보호되었다. 3x104개의 세포내 박테리아로 감염시킨 웰은 감염 1일 후에 8,750개의 세포내 박테리아 (감염 용량의 약 1/3)를 생성하였지만, 유사한 용량의 자유 MRSA를 사용한 감염은 감염 1일 후에 단지 375개 세포내 박테리아를 생성하였으므로 세포외 박테리아는 효율적으로 사멸되었다.
면역형광 현미경은 또한 복막 세포로부터 MG63 골모세포로 감염의 전파를 입증하였다. 복막 세포를 MRSA로 감염의 1일 후에 마우스로부터 수집하고, 임의의 오염 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 리소스타핀으로 처리하였다 (세포내 감염). 자유 MRSA를 활성적으로 성장하는 배양액으로부터 취하고 PBS 내에 세척하였다 (세포외 감염). 세포내 및 세포외 감염 샘플 내의 생존가능 박테리아의 총수는 아가 플레이트 상에 플레이팅함으로써 확인하였고, 두 샘플을 모두 챔버 슬라이드에서 배양한 MG63 골모세포의 융합 층에 첨가 직전에 5 ㎍/mL의 반코마이신을 보충한 배지 내에 현탁시켰다. 감염 1일 후에, MG63 세포를 세척하여 세포외 박테리아를 제거하고, 투과화하고, 복막 세포막에 우선적으로 결합된 콜레라 독소 및 세포내 MRSA를 확인하기 위해 항-에스. 아우레우스 항체로 염색하였다. MG63 단층이 무손상임을 확인하기 위해 모든 세포핵을 DAPI로 동시-염색하였다. 슬라이드를 공초점 현미경에 의해 검사하였다.
복막 세포로 감염시킨 웰은 MG63 세포의 융합 단층을 함유하였고, 복막 대식세포는 MG63 층의 상단에서 명백하게 가시적이었다. 많은 대식세포는 MRSA로 명백하게 감염되었고, 이것은 단색 영상에서 적색 박테리아의 클러스터 (cluster) 또는 중첩 영상에서 백색 입자로서 가시적이다. 감염된 대식세포에 추가로, 단지 MG63 세포와 연관된 박테리아의 명백한 예가 관찰되었다. 이들 감염된 MG63 세포는 또한 자유 MRSA로 감염된 웰에서 가시적이었다. 자유 MRSA의 감염은 MG63 세포에서 유사한 수준의 감염을 달성하기 위해 훨씬 더 많은 접종물을 필요로 하였다.
상기 결과는 자유 MRSA 및 세포내 MRSA가 모두 반코마이신의 존재 하에 생존하고 MG63 세포를 감염시킬 수 있음을 확립하였다. 세포내 감염으로부터 박테리아는 이들 조건 하에 자유 박테리아보다 반코마이신 처리에 유의하게 더 잘 생존할 수 있었다. 3x104 CFU의 세포내 박테리아의 감염은 감염 1일 후 8.7x103 CFU의 세포내 박테리아를 생성시켰다. 유사한 용량의 자유 박테리아의 감염은 감염 1일 후에 단지 375개 세포내 박테리아를 생성하였고, 이것은 세포내 박테리아가 자유 박테리아보다 20배까지 더 잘 생존할 수 있었음을 나타낸다. 모든 감염 용량이 웰을 감염의 1일후 대 4시간 후 수거할 때 보다 많은 세포내 박테리아 (1.5 내지 6배)를 회수하였다. 반코마이신은 자유 MRSA에 첨가할 때 성장을 완전히 억제하였으므로 (도 1), 이들 데이타는 MRSA가 배양 배지 내에서 반코마이신에 대한 일정한 노출에도 불구하고 언젠가 복제될 것임을 제안한다. MRSA는 뮤린 대식세포 내에서 유의하게 복제하지 않지만 (본 발명자들의 공개되지 않은 관찰), 에스. 아우레우스가 포식 리소솜을 벗어나고 비-포식 세포 종류의 세포질 내에서 복제할 수 있다는 상당한 증거가 존재한다 (Jarry, T.M., G. Memmi, et al. (2008) Cell Microbiol 10(9): 1801-1814). 상기 관찰들은 함께, 심지어 반코마이신에 대한 일정한 노출 하에서도 자유 MRSA는 세포를 감염시킬 수 있고, 세포내 MRSA는 하나의 세포로부터 다른 세포로 전파할 수 있음을 제안한다. 이들 관찰은 일정한 항생제 요법의 존재 하에 일어날 수 있는 감염의 유지 및 심지어 확산을 위한 잠재적인 메카니즘을 밝혔다.
실시예 19. 생체내 감염 모델.
복막염 모델. 7주령 암컷 A/J 마우스 (잭슨 래보러토리스)를 5x107 CFU의 USA300의 복막 주사로 감염시켰다. 마우스를 감염 2일 후에 희생시키고, 복막을 5 mL의 냉 포스페이트 완충 염수 용액 (PBS)로 씻어냈다. 신장을 정맥내 감염 모델에 대해 아래 설명한 바와 같이 5 mL의 PBS 내에 균질화하였다. 복막 세척액을 탁상용 (table top) 원심분리기에서 4℃에서 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 세포외 박테리아로서 수집하고, 복막 세포를 함유하는 세포 펠렛을 세포내 분획으로서 수집하였다. 세포를 오염 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 37℃에서 20분 동안 50 ㎍/mL의 리소스타핀으로 처리하였다. 분석에 앞서 리소스타핀을 제거하기 위해 복막 세포를 빙냉 PBS 내에서 3x 세척하였다. 세포내 CFU의 수를 계산하기 위해, 복막 세포를 0.1% 트리톤-X를 갖는 HB (10 mM HEPES 및 0.1% 소 혈청 알부민을 보충한 행크 균형 염 용액) 내에 용해시키고, 용해물의 연속 희석액을 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 내에 제조하였다.
정맥내 감염 모델: 모든 생체내 실험을 위해 7주령 암컷 마우스를 사용하였고, 감염은 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사에 의해 수행하였다. A/J 마우스 (잭슨 랩 (Jackson Lab))를 2x106 CFU의 용량으로 감염시켰다. Balb/c 마우스 (챨스 리버 래보러토리스, 미국 캘리포니아주 홀리스터)를 2x107 CFU의 용량으로 감염시켰다. 경쟁하는 인간 IgG의 역할을 조사하는 연구를 위해 (SCID IVIG 모델), CB17.SCID 마우스 (챨스 리버 래보러토리스, 미국 캘리포니아주 홀리스터)를 >10 mg/mL의 일정 혈청 수준의 인간 IgG를 달성하기 위해 최적화된 투여 요법을 이용하여 감마가드 (GammaGard) S/D IGIV 면역 글로불린 (에이에스디 헬스케어 (ASD Healthcare), 미국 켄터키주 브룩스)로 재구성하였다. IGIV를 30 mg/마우스의 초기 정맥내 용량에 이어서, 6시간 후에 복강내 주사에 의해 15 mg/마우스의 제2 용량으로, 및 연속 3일 동안 복강내 주사에 의해 15 mg/마우스의 후속적인 매일 투여에 의해 투여하였다. 마우스를 제1 용량의 IGIV의 4시간 후에 정맥내 주사에 의해 포스페이트 완충 염수 내에 희석시킨 2x107 CFU의 MRSA로 감염시켰다. 반코마이신을 투여받은 마우스를 연구 기간 동안 감염의 6 내지 24시간 후에 시작하여 100 mg/Kg의 반코마이신의 매일 2회 복강내 주사로 처리하였다. 실험 치료제 (AAC, 항-MRSA 항체 또는 자유 디메틸-pipBOR 항생제)를 포스페이트 완충 염수 내에 희석하고, 감염의 30분 내지 24시간 후에 단일 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 감염 4일 후에 모든 마우스를 희생시키고, 신장을 5 mL의 포스페이트 완충 염수 내에 수거하였다. 조직 샘플을 GentleMACS 분해기™ (밀테나이이 바이오텍 (Miltenyi Biotec), 미국 캘리포니아주 오번)를 사용하여 균질화하였다. 마우스 (2개의 신장) 당 회수된 박테리아의 총수는 조직 균질액 연속 희석액을 5% 탈섬유소 양 혈액을 갖는 트립틱 소이 아가 상에서 PBS 0.05% 트윈 내에 플레이팅함으로써 결정하였다.
실시예 20. 카텝신/카스파제 방출 검정
카텝신 B를 사용한 처리 후에 AAC로부터 방출된 활성 항생제의 양을 정량하기 위해, AAC를 카텝신 완충제 (20 mM 아세트산나트륨, 1 mM EDTA, 5 mM L-시스테인) 내에 200 ㎍/mL로 희석하였다. 본 검정의 목적을 위해 참조로 포함된 문헌 [Dubowchik et al. (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869]의 페이지 863을 참조한다. 카텝신 B (소 비장으로부터, 시그마 (SIGMA) C7800)를 10 ㎍/mL로 첨가하고, 샘플을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서, AAC를 완충제 단독 내에서 인큐베이션하였다. 10 부피의 박테리아 성장 배지, 트립틱 소이 브로쓰 pH 7.4 (TSB)를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 활성 항생제의 총 방출을 추정하기 위해, 반응 혼합물의 연속 희석액을 96 웰 플레이트에서 TSB 내에 4중으로 제조하고, 에스. 아우레우스의 USA300 균주를 각각의 웰에 2x103 CFU/mL의 최종 밀도로 첨가하였다. 배양액을 진탕하면서 3℃에서 밤새 인큐베이션하고, 박테리아 성장을, 플레이트 판독기를 사용하여 630 nM에서 흡광도를 판독함으로써 측정하였다.
실시예 21. 항-WTA 항체의 생산
항체 생성, 스크리닝 및 선택
약어: MRSA (메티실린-내성 에스. 아우레우스); MSSA (메티실린-감수성 에스. 아우레우스); VISA (반코마이신 중간체-내성 에스. 아우레우스); LTA (리포테이코산); TSB (트립틱 소이 브로쓰); CWP (세포벽 제제).
인간 IgG 항체를, US 8,283,294 ("Method for cloning cognate antibodies"); [Meijer PJ et al. Journal of Molecular Biology 358:764-772 (2006)]; 및 [Lantto J et al. J Virol. 85(4): 1820-33 (Feb 2011)]에 설명된 바와 같이 항체 중쇄 및 경쇄의 동족 쌍형성 (pairing)을 보존하는 심플렉스 (Symplex)™ 기술 (심포겐 (Symphogen), 덴마크 륑비)을 이용하여 에스. 아우레우스 감염 후 환자로부터 말초 B 세포로부터 클로닝하였고; 형질 및 기억 세포를 재조합 전장 IgG 레퍼토리를 위한 유전자 공급원으로서 사용하였다. 개별 항체 클론을 문헌 [Meijer PJ, et al. Methods in Molecular Biology 525: 261-277, xiv.(2009)]에 설명된 바와 같이 포유동물 세포의 형질감염에 의해 발현시켰다. 전장 IgG1 항체를 함유하는 상청액을 7일 후에 수거하고, 1차 스크리닝에서 간접적 ELISA에 의해 항원 결합에 대해 스크리닝하기 위해 사용하였다. USA300 또는 Wood46 균주 에스. 아우레우스 균주로부터의 세포벽 제제에 대해 양성 ELISA 결합을 보이는 mAb의 라이브러리를 생성하였다. 항체를 200-ml 일시적 형질감염에서 후속적으로 생산하고, 추가의 시험을 위해 단백질 A 크로마토그래피 (MabSelect SuRe, 지이 라이프 사이언시즈 (GE Life Sciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이)로 정제하였다. 보다 대규모 항체 생산을 위해, 항체를 CHO 세포에서 생산하였다. VL 및 VH를 코딩하는 벡터를 CHO 세포 내로 형질감염시키고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지로부터 IgG를 정제하였다.
[표 7]
Ab를 단리하기 위해 사용된 항원의 목록
Figure pct00129
CW#1 및 CW#3은 ELISA 코팅을 제조하는데 있어서 항상 함께 혼합하였다:
도 6은 ELISA에 의한 항체의 1차 스크리닝을 요약한다. 모두 (4569 제외)가 USA300 세포벽 prep 혼합물 (96:4 비의 철 고갈:TSB)을 사용하여 스크리닝할 때 단리되었다. 모든 GlcNAc 베타 (6259 제외), SDR, 및 PGN (4479) mAb는 또한 1차 스크리닝에서 PGN 및 WTA에 대해 양성이었다. 모든 GlcNAc 알파는 USA300 CW 혼합물과의 결합에 대한 스크리닝에 의해 독점적으로 발견되었다. 4569 (LTA 특이적)은 Wood46 CWP 상의 스크리닝에 의해 발견되었다.
생체외 유동 세포측정법을 이용하는 라이브러리로부터 항- WTA mAb의 선택
본 라이브러리 내에서 각각의 mAb를 3개의 선택 기준에 대해 문의하였다: (1) 높은 항생제 전달에 유리할 대응하는 동족 항원의 높은 발현의 표시로서 MRSA 표면에 대한 mAb 결합의 상대적인 강도; (2) 감염 동안 생체내에서 MRSA 표면에서 동족 항원의 안정한 발현의 표시로서 매우 다양한 감염된 조직으로부터 단리된 MRSA에 결합하는 mAb의 일관성; 및 (3) 동족 표면 항원의 발현의 보존의 표시로서 임상 에스. 아우레우스 균주의 패널에 대한 mAb 결합 능력. 이를 위해, 상이한 에스. 아우레우스 균주로부터 및 다양한 감염된 조직으로부터 에스. 아우레우스와의 반응성에 대해 라이브러리 내의 mAb의 이들 모든 예비-선택된 배양 상청액을 시험하기 위해 유동 세포측정법을 이용하였다.
라이브러리 내의 모든 mAb를 MRSA USA300로 감염시킨 마우스로부터의 감염된 신장, 비장, 간, 및 폐로부터의; 및 토끼 심내막염 모델에서 USA300 COL로 감염시킨 토끼로부터 심장 또는 신장 내의 MRSA에 결합하는 그들의 능력에 대해 분석하였다. 다양한 감염된 조직으로부터 에스. 아우레우스를 인지하는 항체의 능력은 치료적 항체가 에스. 아우레우스의 매우 다양한 상이한 임상 감염에서 활성일 가능성을 상승시킨다. 박테리아를 시험관내 배양 조건에 의해 유발된 표현형 변화를 방지하기 위해 장기의 수거 시에 즉시, 즉, 계대 배양 없이 분석하였다. 본 발명자들은 몇몇 에스. 아우레우스 표면 항원이 시험관내 배양 동안 발현되는 한편 감염된 조직에서 발현을 상실함을 이전에 관찰하였다. 그러한 항원에 대해 생성된 항체는 감염을 치료하기 위해 유용할 것 같지 않다. 다양한 감염된 조직 상의 상기 mAb 라이브러리의 분석 동안, 상기 관찰은 유의한 수의 항체에 대해 확인되었고, 이것은 배양액으로부터 에스. 아우레우스 박테리아에 대해 유의한 결합을 보였지만, 시험된 모든 감염된 조직으로부터 박테리아에 대한 결합은 부재하였다. 몇몇 항체는 몇몇 감염된 조직으로부터 박테리아에 결합하였지만 시험된 모든 감염된 조직으로부터 박테리아에는 그렇지 않았다. 따라서, 본 발명에서, 본 발명자들은 모든 시험된 감염 조건으로부터 박테리아를 인식할 수 있는 항체를 선택하였다. 평가된 파라미터는 (1) 항원 존재비에 대한 척도로서 상대적인 형광 강도; (2) 항원 발현의 안정성에 대한 척도로서 양성 염색된 장기의 수; 및 (3) 동족 표면 항원의 발현의 보존의 표시로서 임상 에스. 아우레우스 균주의 패널에 대한 mAb 결합 능력이었다. 시험 항체의 형광 강도는 비-관련 항원, 예를 들어, IgG1 mAb 항-헤르페스 바이러스 gD:5237 (아래 참조됨)에 대해 생성된 이소형 대조군 항체에 대한 상대치로서 결정하였다. WTA-베타에 대한 mAb는 최고 항원 존재비를 보여줄 뿐만 아니라, 또한 상기 명시된 시험된 모든 감염된 조직으로부터의 MRSA에 대해 매우 일관된 결합을 보여주었다.
추가로, 본 발명자들은 TSB 내에서 시험관내에서 배양된 다음 에스. 아우레우스 균주에 결합하는 이들 mAb의 능력을 시험하였다: USA300 (MRSA), USA400 (MRSA), COL (MRSA), MRSA252 (MRSA), Wood46 (MSSA), 로젠바흐 (Rosenbach) (MSSA), 뉴먼 (MSSA), 및 Mu50 (VISA). 항-WTA 베타 mAb는 이들 모든 균주와 반응성인 것으로 밝혀졌지만 항-WTA 알파 mAb는 그렇지 않았다. 상이한 균주에 대한 결합의 분석은 WTA 베타가 WTA 알파보다 더 잘 보존되고, 따라서 AAC에 더 적합함을 지시하였다.
실시예 22. 에스. 아우레우스 상의 세포벽 테이코산에 대해 특이성을 갖는 항체의 특성화.
i) Ab의 WTA 특이성의 확인
에스. 아우레우스 야생형 (WT) 균주, 및 WTA가 결여되는 에스. 아우레우스 돌연변이체 균주 (ΔTagO; WTA-없는 균주)로부터 세포벽 제제 (CWP)를, 40 mg의 펠렛화된 에스. 아우레우스 균주를 30% 라피노스, 100 ㎍/ml의 리소스타핀 (셀 사이언시즈 (Cell Sciences, 미국 매사추세츠주 캔턴), 및 EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 (Roche), 미국 캘리포니아주 플레전턴)을 보충한 1 mL의 10 mM 트리스-HCl (pH 7.4)와 함께 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션함으로써 생성하였다. 용해물을 11,600 x g에서 5 min 동안 원심분리하고, 세포벽 성분을 함유하는 상청액을 수집하였다. 이뮤노블롯 분석을 위해, 단백질을 4-12% 트리스-글리신 겔 상에서 분리하고, 니트로셀룰로스막 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)으로 옮긴 후, WTA에 대한 지시된 시험 항체, 또는 PGN 및 LTA에 대한 대조군 항체를 사용하여 블로팅하였다.
면역블로팅은 WTA에 대한 항체가 WT 에스. 아우레우스로부터 WT 세포벽 제제에 결합하지만, WTA가 결여되는 ΔTagO 균주로부터 세포벽 제제에는 결합하지 않음을 보여준다. 펩티도글리칸 (항-PGN) 및 리포테이코산 (항-LTA)에 대한 대조군 항체는 두 세포벽 제제 모두에 잘 결합한다. 이들 데이타는 WTA에 대한 시험 항체의 특이성을 지시한다.
ii) MRSA 표면에 대한 mAb 결합의 정도를 결정하기 위한 유동 세포측정법
감염된 조직으로부터의 전체 박테리아 상의 표면 항원 발현을 다음 프로토콜을 이용하는 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 감염된 마우스 조직으로부터 박테리아의 항체 염색을 위해, 6-8주령 암컷 C57Bl/6 마우스 (챨스 리버 (Charles River), 미국 매사추세츠주 윌밍턴)에게 PBS 내의 108 CFU의 대수기-성장된 USA300으로 정맥내 주사하였다. 마우스 장기를 감염 2일 후에 수거하였다. 토끼 감염성 심내막염 (IE)을 문헌 [Tattevin P. et al. Antimicrobial agents and chemotherapy 54: 610-613 (2010)]에서 이전에 설명된 바와 같이 확립하였다. 토끼에게 5x107 CFU의 정지상 성장된 MRSA 균주 COL을 정맥내 주사하고, 심장 증식종 (vegetation)을 18시간 후에 수거하였다. 30 mg/Kg의 반코마이신을 7x107 CFU 정지상의 감염 18 h 후에 b.i.d.로 정맥내 제공하였다.
마우스 또는 토끼 세포를 용해시키기 위해, 조직을 gentleMACS 세포 분해기 (밀테나이이)를 사용하여 M 튜브 (밀테나이이, 미국 캘리포니아주 오번) 내에서 균질화한 후, 0.1% 트리톤-X100 (써모 (Thermo)), 10 ㎍/mL의 DNAseI (로슈) 및 완전 미니 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈)를 함유하는 PBS 내에서 RT에서 10 min 동안 인큐베이션하였다. 현탁액을 40 미크론 필터 (비디)를 통해 통과시키고, 0.1% IgG 비함유 BSA (시그마) 및 10 mM Hepes, pH 7.4 (HB 완충제)를 보충한, 페놀 레드가 없는 HBSS로 세척하였다. 이어서, 비특이적 IgG 결합을 차단하기 위해 박테리아 현탁액을 300 ㎍/mL의 토끼 IgG (시그마)와 함께 HB 완충제 내에서 실온 (RT)에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 박테리아를 rF1 또는 이소형 대조군 IgG1 mAb 항-헤르페스 바이러스 gD:5237 (Nakamura GR et al., J Virol 67: 6179-6191 (1993))를 비롯한 2 ㎍/mL의 1차 항체, 및 이어서 형광 항-인간 IgG 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치, 미국 펜실베니아주 웨스트그루브)로 염색하였다. 마우스 또는 토끼 장기 파편 (debris)으로부터 박테리아의 구분을 가능하게 하기 위해, 20 ㎍/mL 마우스 mAb 702 항-에스. 아우레우스 펩티도글리칸 (에이빔, 미국 매사추세츠주 캠브리지) 및 형광색소-표지된 항-마우스 IgG 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 이중 염색을 수행하였다. 박테리아를 세척하고, FACSCalibur (비디)에 의해 분석하였다. 유동 세포측정법 분석 동안, 박테리아를 이중 형광 그래프로부터 mAb 702를 사용한 양성 염색에 대해 게이팅하였다 (gating).
iii) 에스 . 아우레우스에 대한 결합 친화도 및 MRSA 상의 항원 밀도의 측정
표 8은 뉴먼-ΔSPA 균주에 결합하는 MRSA 항체의 평형 결합 분석, 및 박테리아 상의 항원 밀도를 보여준다.
[표 8]
Figure pct00130
KD 및 항원 밀도는 다음 검정 조건 하에 방사성리간드 세포 결합 검정을 이용하여 유도하였다: DMEM + 2.5% 마우스 혈청 결합 완충제; 실온 (RT)에서 2 hr 동안 용액 결합; 및 400,000 박테리아/웰을 사용함.
Ab 6263은 서열이 매우 유사한 점에서 6078-유사이다. CDR H3에서 제2 잔기 (R 대 G)를 제외하고, 다른 모든 L 및 H 쇄 CDR 서열은 동일하다.
실시예 23. WTA 항체 돌연변이체의 조작
요약하면, Ab를 IgG1으로서 발현하기 위해 각각의 항-WTA 베타 Ab의 VH 영역을 클로닝하고 인간 H 쇄 감마1 불변 영역에 연결하고, VL을 카파 불변 영역에 연결시켰다. 몇몇 경우에, 아래 설명된 바와 같이 항체 안정성을 개선하기 위해 야생형 서열을 특정 위치에서 변경시켰다. 이어서, 시스테인 조작된 Ab (티오Mab)을 생성하였다.
i. 가변 영역을 불변 영역에 연결함.
상기 인간 항체 라이브러리로부터 확인된 WTA 베타 Ab의 VH 영역을 인간 γ1 불변 영역에 연결시켜 전장 IgG1 Ab를 제조하였다. L 쇄를 카파 L 쇄가었다.
ii. 안정성 변이체의 생성
도 14의 WTA Ab (특히 도 15a, 15b, 16a, 16b 참조)를 특정 특성을 개선하기 위해 (예컨대, 탈아미드화, 아스파르트산 이성질체화, 산화 또는 N-연결된 글리코실화를 피하기 위해) 조작하고, 항원 결합의 보유 및 아미노산 교체 후 화학적 안정성에 대해 시험하였다. 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 클론의 단일쇄 DNA를, QIAprep Spin M13 키트 (퀴아젠 (Qiagen))를 사용하여 이. 콜라이 CJ236 세포에서 성장시킨 M13KO7 파지 입자로부터 정제하였다. 다음 서열 152, 153, 154 및 155를 갖는 5' 인산화 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 문헌 [Kunkel, T.A. (1985). Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 82(2): 488-492]에 설명된 방법론에 따라 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 설명되니 바와 같이 올리고뉴클레오티드-지정 부위 돌연변이유발에 의해 항체를 코딩하는 클론을 돌연변이시켰다:
Figure pct00131
돌연변이유발된 DNA를 사용하여 이. 콜라이 XL1-Blue 세포 (애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies))를 형질전환시키고, 50 ㎍/ml 카르베니실린을 함유하는 루리아 (Luria) 브로쓰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 콜로니를 개별적으로 집어서 50 ㎍/ml 카르베니실린을 함유하는 액체 루리아 브로쓰 배지 내에서 성장시켰다. 돌연변이의 존재를 확인하기 위해, 미니프렙 (Miniprep) DNA를 서열결정하였다.
Ab 6078에 대해, VH의 제2 아미노산, met (met-2)은 산화되기 쉽다. 따라서, 잔기의 산화를 피하기 위해 met-2를 Ile 또는 Val로 돌연변이시켰다. met-2의 변경은 결합 친화도에 영향을 미칠 수 있으므로, 돌연변이체를 ELISA에 의해 Staph CWP에 대한 결합에 대해 시험하였다.
CDR H3 "DG" 또는 "DD" 모니프는 이소-아스파르트산으로 변환하기 쉬운 것으로 밝혀졌다. Ab 4497은 CDR H3 위치 96 및 97에 DG를 함유하고 (도 18b 참조), 안정성을 위해 변경되었다. CDR H3은 일반적으로 항원 결합을 위해 중요하고, 따라서 몇몇 돌연변이체를 항원 결합 및 화학적 안정성에 대해 시험하였다 (도 18a 참조). 돌연변이체 D96E (v8)은 야생형 Ab 4497에 유사한, 항원에 대한 결합을 보유하고 (도 18a; 도 18b), 안정하고 이소-아스파르트산을 형성하지 않는다.
Staph CWP ELISA
6078 항체 돌연변이체의 분석을 위해, 1X109 bug/ml로 이루어진 리소스타핀-처리한 USA300 ΔSPA 에스. 아우레우스 세포 웰 제제 (WT)를 0.05 탄산나트륨 pH 9.6 내에 1/100 희석하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션 동안 384-웰 ELISA 플레이트 (넝크; 미국 뉴저지주 넵튠) 상으로 코팅하였다. 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈-20으로 세척하고, PBS + 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA)과 함께 2시간 인큐베이션 동안 차단하였다. 상기 및 모든 후속 인큐베이션은 부드럽게 교반하면서 실온에서 수행하였다. 항체 샘플을 샘플/표준 희석 완충제 (PBS, 0.5% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.25% CHAPS, 5 mM EDTA, 0.35 M NaCl, 15 ppm 프로클린 (pH 7.4)) 내에 희석하고, 세척한 플레이트에 첨가하고, 1.5 - 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트-결합된 항-에스. 아우레우스 항체를, 검정 완충제 (PBS, 0.5% BSA, 15 ppm 프로클린, 0.05% 트윈 20) 내에 40 ng/mL로 희석한 퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 IgG(Fc) F(ab')2 단편 (잭슨 이뮤노리서치; 미국 펜실베니아주 웨스트그루브)와 함께 1-시간 인큐베이션 동안 검출하였다. 최종 세척 후에, 테트라메틸 벤지딘 (케이피엘 (KPL), 미국 메릴랜드주 게이터스버그)를 첨가하고, 색상을 5-10분 동안 발색시키고, 1 M 인산을 사용하여 반응을 중지하였다. 플레이트를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 620 nm 참조로 450 nm에서 판독하였다.
iii. Cys 조작된 돌연변이체 ( 티오Mab )의 생성
전장 티오Mab은 링커-항생제 중간체에 대한 항체의 접합을 허용하기 위해 앞서 교시되고 아래 설명된 바와 같이 시스테인을 예정된 위치에서 H 쇄 (CH1 내에) 또는 L 쇄 (Cκ) 내에 도입함으로써 생산하였다. 이어서, H 및 L 쇄를 개별 플라스미드 내로 클로닝하고, H 및 L 코딩 플라스미드를 293 세포 내로 동시-형질감염시키고, 여기서 이들은 발현되고 무손상 Ab로 조립된다. 또한, H 및 L 쇄는 모두 동일한 발현 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 2개의 조작된 Cys (각각의 H 쇄 내에 1개), 또는 2개의 조작된 Cys (각각의 L 쇄 내에 1개)를 갖는 IgG1이 제조되거나, 또는 각각 조작된 Cys를 갖는 2H 및 2L 쇄의 조합 (HCLCCys)이 cys 돌연변이체 쇄 및 야생형 쇄의 목적하는 조합을 발현함으로써 생성되었다.
도 15a 및 15b는 6078 WT, 및 HC Cys 및 LC Cys의 조합을 갖는 돌연변이체 Ab를 보여준다. 6078 돌연변이체를 또한 밤새 배양액으로부터 단백질 A 결핍 USA300 Staph A에 결합하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 도 19에 제시된 바와 같은 FACS 분석의 결과로부터, 돌연변이체 Ab는 6078 WT (비변경된) 항체와 유사하게 USA300에 결합하였고; 돌연변이체 내의 아미노산 변경은 Staph A에 대한 결합을 손상시키지 않았다. gD는 비-특이적 음성 대조군 항체이다.
실시예 24. 항-WTA 항체-항생제 접합체의 제조
항-세포벽 테이코산 항체-항생제 접합체 (AAC) (표 3)은 항-WTA 항체를 표 2로부터의 것을 비롯한 링커-항생제 중간체에 접합시킴으로써 제조하였다. 접합에 앞서, 그 교시내용이 본 목적을 위해 참조로 포함되는 WO 2004/010957에 기재된 방법론에 따라 표준 방법을 이용하여 TCEP로 항-WTA 항체를 부분적으로 환원시켰다. 부분적으로 환원된 항체는 예를 들어, 문헌 [Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784] 및 US 2005/0238649 A1에 기재된 방법론에 따라 표준 방법을 이용하여 링커-항생제 중간체에 접합시켰다. 간단히 설명하면, 부분적으로 환원된 항체를 링커-항생제 중간체와 합하여, 항체의 환원된 시스테인 잔기에 대한 링커-항생제 중간체의 접합을 허용하였다. 접합 반응을 켄칭시키고, AAC를 정제하였다. 각각의 AAC에 대한 항생제 로드 (항체 당 항생제 모이어티의 평균 수)를 결정하였고, 단일 시스테인 돌연변이체 부위를 갖도록 조작된 항-세포벽 테이코산 항체에 대해 약 1 내지 약 2이었다.
접함을 위한 티오Mab의 환원/산화: CHO 세포 내에서 발현시킨 전장의 시스테인 조작된 모노클로날 항체 (티오Mab - ([Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932]; [Dornan et al. (2009) Blood 114(13):2721-2729]; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249, [Shen et al. (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191]; [Junutula et al. (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52])를 2 mM EDTA를 함유한 50 mM 트리스 (pH 7.5) 내에서 약 20-40배 과량의 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염) 또는 DTT (디티오트레이톨)로 37℃에서 3 hr 동안 또는 실온에서 밤새 환원시켰다 (Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; 솔텍 벤쳐스 (Soltec Ventures), 미국 매사추세츠주 베벌리). 환원된 티오Mab을 희석하고, 10 mM 아세트산나트륨 (pH 5) 내에서 HiTrap S 컬럼 상에 로딩하고, 0.3 M 염화나트륨을 함유하는 PBS로 용리하였다. 대안적으로, 항체를 1/20th 부피의 10% 아세트산을 첨가하여 산성화하고, 10 mM 숙시네이트 (pH 5)로 희석하고, 컬럼 상에 로딩한 후, 10 컬럼 부피의 숙시네이트 완충제로 세척하였다. 컬럼을 50 mM 트리스 (pH 7.5), 2 mM EDTA로 용리하였다.
용리한 환원된 티오Mab을 15배 몰 과량의 DHAA (데히드로아스코르브산) 또는 200 nM 수성 황산구리 (CuSO4)로 처리하였다. 쇄간 디술피드 결합의 산화는 약 3시간 또는 그 이상 내에 완료되었다. 주변 공기 산화가 또한 효과적이었다. 재-산화된 항체를 20 mM 숙신산나트륨 (pH 5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA 내로 투석하고, -20℃에서 냉동 저장하였다.
티오-Mab과 링커-항생제 중간체의 접합: 탈차단된 재산화시킨 티오-항체 (티오Mab)를 반응 혼합물의 LC-MS 분석에 의해 결정할 때 반응이 완료될 때까지 (16-24시간) 50 mM 트리스 (pH 8) 내에서 표 2의 6-8배 몰 과량의 링커-항생제 중간체 (20 mM의 농도에서 DMSO 원액으로부터)와 반응시켰다.
이어서, 조질 항체-항생제 접합체 (AAC)를 20 mM 숙신산나트륨 (pH 5)으로 희석한 후 양이온 교환 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 적어도 10 컬럼 부피의 20 mM 숙신산나트륨 (pH 5)으로 세척하고, 항체를 PBS로 용리시켰다. AAC를 겔 여과 컬럼을 이용하여 240 mM 수크로스와 함께 20 mM His/아세테이트 (pH 5) 내로 제제화하였다. AAC를 단백질 농도를 결정하기 위해 UV 분광분석법에 의해, 응집 분석에 대해 분석적 SEC (크기-배제 크로마토그래피)에 의해, 및 리신 C 엔도펩티다제를 사용한 처리 전후에 LC-MS에 의해 특성화하였다.
크기 배제 크로마토그래피는 0.75 ml/min의 유속으로 0.25 mM 염화칼륨 및 15% IPA를 함유하는 0.2 M 인산칼륨 (pH 6.2) 내에서 소덱스 (Shodex) KW802.5 컬럼을 사용하여 수행하였다. AAC의 응집 상태는 280 nm에서 용리된 피크 면적 흡광도의 통합에 의해 결정하였다.
LC-MS 분석은 애질런트 QTOF 6520 ESI 기기를 사용하여 수행하였다. 예로서, 상기 화학을 이용하여 생성한 AAC를 37℃에서 30 min 동안 트리스 (pH 7.5) 내에서 1:500 w/w 엔도프로테이나제 Lys C (프로메가 (Promega))로 처리하였다. 생성되는 절단 단편을 80℃로 가열한 1000A, 8 ㎛ PLRP-S 컬럼 상에 로딩하고, 5분 내에 30% B 내지 40% B의 구배로 용래시켰다. 이동상 A: 0.05% TFA를 함유하는 H2O. 이동상 B: 0.04% TFA를 함유하는 아세토니트릴. 유속: 0.5ml/min. 단백질 용리는 전기분무 이온화 및 MS 분석에 앞서 280 nm에서 UV 흡광도 검출에 의해 모니터링하였다. 비접합된 Fc 단편, 잔류 비접합된 Fab 및 항생제-Fab의 크로마토그래피 분해가 대체로 달성되었다. 얻어진 m/z 스펙트럼을 매스 헌터 (Mass Hunter)™ 소프트웨어 (애질런트 테크놀로지스)를 이용하여 데컨벌루션 (deconvolution)하여 항체 단편의 질량을 계산하였다.
실시예 25. 절단을 담당하는 프로테아제로서 스타포파인 B의 확인 및 정제
Wood46의 3 리터 밤새 배양액으로부터 상청액을 농축하고, TFF (10kDa)를 사용하여 50 mM 인산나트륨 (pH 7) 내로 완충제 교환하였다. 샘플을 Q 세파로스 FF 상에 로딩하고, 단백질을 50 mM 인산나트륨 (pH 7) 내에서 0-300 mM NaCl의 구배를 이용하여 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 활성 분획은 도 27의 티오FAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) (서열 126으로서 개시된 "코어 펩티드")와 함께 인큐베이션하고, LC-MS 분석에 의해 예상된 부위에서 링커의 절단에 대해 평가함으로써 확인하였다. 활성 분획을 모으고, 황산암모늄을 2 M의 농도로 보충하였다. 단백질을 50 mM 트리스 (pH 7.5) 내에서 2-0 M 황산암모늄의 구배를 사용하여 페닐 세파로스 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 다시, 활성 분획은 툴 (tool) 화합물을 사용하여 확인하였다. 이들 분획을 모으고, 0-1 M NaCl의 염 구배를 이용하여 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5) 내에서 Mono Q 상에서 추가로 정제하였다. 상기 크로마토그래피 단계로부터 활성 분획을 앞서와 같이 확인하고, 모으고, PBS 내에서 크기 배제 크로마토그래피에 적용하였다. 활성 분획을 확인하고, SDS-PAGE에 의해 관심있는 단일 단백질을 함유하는 것을 결정하였다.
Q 세파로스 정제로부터 풍부화된 활성 분획을 활성을 책임지는 프로테아제의 클래스를 확인하기 위해 특성화하였다. 프로테아제는 N-에틸말레이미드에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌고, 이것은 효소가 아마도 시스테인 프로테아제임을 나타낸다. 스타필로코쿠스 아우레우스의 공지의 분비형 시스테인 프로테아제를 검토한 후, 스타포파인 B는 REP Li 스크린에서 관찰된 특이성과 유사한 기질 특이성을 갖는 것으로 확인되었다 (Kalinska, M., T. Kantyka, et al. (2012). Biochimie 94(2):318). 정제된 스타포파인 B를 구입하고 (시그마-알드리치), 도 27로부터 티오FAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) (서열 126으로서 개시된 "코어 펩티드")와 함께 인큐베이션하였다. 스타포파인 B는 Wood46 상청액으로부터 정제된 활성 프로테아제와 동일한 부위에서 링커를 절단하는 것으로 밝혀졌다. 스타포파인 B 및 배양 상청액으로부터 활성 프로테아제를 활성-부위 시스테인을 표지하기 위해 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor)® 488 C5 말레이미드 (인비트로겐, 라이프 테크놀로지스, 써모 피셔 사이언티픽 인크. (Thermo Fisher Scientific Inc.))와 함께 인큐베이션하였다. 프로테아제를 스타포파인 B로서 확인하기 위해, 샘플을 SDS-PAGE 상에서 진행시켰다. SEC 정제로부터 활성 분획의 SDS-PAGE 겔을 알렉사 플루오르 488과 함께 또는 그 없이, 정제된 스타포파인 B과 나란히 진행시켰다.
Q 세파로스 정제를 위한 풍부화된 활성 분획을 또한 단백질체 질량 분광법에 의해 분석하였다. 10 마이크로그램의 활성 분획 B11, B12, 및 C02 및 10 마이크로그램의 활성 분획, 1, 2, 3, 및 10 마이크로그램의 불활성 분획을 SDS-PAGE 상에서 진행시켰다. 밴드를 절제하고 트립신에 의해 밤새 소화시켰다. 소화된 샘플을 LC-MS/MS에 의해 분석하였고, 탠덤 (tandem) 질량 스펙트럼 결과를 마스코트 (Mascot) 탐색 알고리즘을 이용하여 데이타베이스 탐색을 위해 제출하였다. 스타포파인 B는 활성 분획 내에 존재하는 시스테인 프로테아제에 대해 상위 히트였다. 또한 시스테인 프로테아제인 오토리신이 불활성 분획 내에 발생하는 최고 풍부도의 특유한 펩티드를 가져서 또한 상위 히트로서 보이고, 음성 대조군, 따라서 오토리신을 고려하지 않았다. Q 세파로스 정제로부터 활성 분획의 질량 스펙트럼 단백질체 분석은 스타포파인 B의 높은 풍부도를 보여준다. 데이타를 에스. 아우레우스 단백질에 대해 여과하고 활성 분획 1 내의 펩티드의 수에 의해 순위를 매겼다.
활성 프로테아제를 Wood46 에스. 아우레우스 배양 상청액으로부터 정제하였다. 세포를 3 리터의 TSB 내에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 10,000 x g에서 10 min 동안 원심분리에 의해 제거하였다. 상청액을 수집하고, 2개의 0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시켰다. 이어서, 이를 농축시키고, 10 kD 막을 갖는 TFF를 사용하여 50 mM 인산나트륨 (pH 7) 내로 완충제 교환하였다. 샘플을 300 ml의 부피로 10배 농축시켰다. 샘플을 Q 세파로스 FF (지이 헬쓰케어 바이오사이언시스 아베 (GE Healthcare Biosciences AB)) 상에 로딩하고, 단백질을 50 mM 인산나트륨 (pH 7) 내의 0-300 mM NaCl의 구배를 사용하여 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 활성 분획을 모으고, 황산암모늄을 2 M 농도로 보충하였다. 단백질을 50 mM 트리스 (pH 7.5) 내의 2-0 M 황산암모늄의 구배를 사용하여 페닐 세파로스 (지이 헬쓰케어 바이오사이언시스 아베) 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 활성 분획을 모으고, 0-1 M NaCl의 염 구배를 이용하여 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5) 내에서 Mono Q (지이 헬쓰케어 바이오사이언시스 아베) 상에서 추가로 정제하였다. 상기 크로마토그래피 단계로부터 활성 분획을 앞서와 같이 확인하고, 모으고, PBS 내에서 크기 배제 크로마토그래피 (제닉스 (Zenix)-150, 세팍스 테크놀로지스 (Sepax Technologies))에 적용하였다.
본 발명자들의 관심있는 활성 프로테아제를 함유하는 분획을 확인하기 위해, 각각의 분획으로부터 100 ㎕를 96-웰 플레이트에 옮기고, 여기서, 25 ㎍의 티오FAB 4497 mal-GGAFAGGG-DNA31 (서열 126으로서 개시된 "코어 펩티드")와 함께 인큐베이션하였다. 각각의 크로마토그래피 단계로부터 분획을 활성에 대해 분석하고, 단백질 농도에 무관하게 100 ㎕를 사용하였다. 샘플을 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 링커-항생제의 프로테아제 절단이 일어난 분획을 확인하기 위해 후속적으로 LC-MS에 의해 분석하였다. Q 세파로스 FF 크로마토그래피로부터 모아진 활성 분획을 14 mg/ml의 총 단백질 농도을 갖도록 측정하였다. 200 ㎍의 풀을 PBS 내에 2 mg/ml로 희석하고, 0.1 mM 최종 농도로 N-에틸말레이미드 (NEM, 시그마)와 함께 및 그 없이 인큐베이션하였다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 25 ㎍의 티오FAB 4497 mal-GGGAFAGGG-DNA31 (서열 126으로서 개시된 "코어 펩티드")를 두 샘플 모두에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간에, 링커-항생제의 프로테아제 절단이 일어났는지 여부를 확인하기 위해 샘플을 LC-MS에 의해 분석하였다. SEC로부터 약 50 ㎕의 활성 분획을 표지를 위해 단백질 농도에 무관하게 1시간 동안 0.1 mM 알렉사 플루오르 488 C5 말레이미드 (인비트로겐)와 함께 인큐베이션하였다. 정제된 프로테아제를 사용한 절단 검정은 5 μM의 티오FAB 접합체를 50 nM 프로테아제와 함께 100 ㎕의 최종 부피에서 인큐베이션함으로써 수행하였다. 검정은 PBS (pH 7.2), 4 mM L-Cys, 2.5 mM EDTA 내에서 또는 100 mM 시트르산나트륨 (pH 5), 100 mM NaCl, 4 mM L-Cys, 2.5 mM EDTA 내에서 수행하였다. 샘플을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후에, 1% TFA로 1:1 희석함으로써 절단 반응을 켄칭시켰다. % 링커 절단을 결정하기 위해, 샘플을 후속적으로 LC-MS 상에서 진행시켰다. % 절단은 절단된 종 및 무손상 종의 A280 크로마토그램을 통합함으로써 결정하였다. 링커의 C-말단에 부가된 항생제 또는 발색단 모이어티는 유의한 소수성을 부가하고, 따라서, 무손상 링커를 갖는 티오FAB 및 절단된 링커를 갖는 티오FAB은 기준선이 분할된다.
풍부화된 분획의 단백질체 분석을 위해, Q 세파로스® (지이 헬스케어 라이프 사이언시즈 (GE Healthcare Life Sciences)) 정제로부터 10 마이크로그램의 풍부화된 활성 분획을 4-12% 비스-트리스 겔 (라이프 테크놀로지스) 상으로 로딩하였다. 전체 겔 레인을 절제하고, 상단부터 하단까지 11개의 밴드로 나누었다. 겔 밴드를 50% 아세토니트릴/50 mM 중탄산암모늄으로 탈색시키고, 50℃에서 30분 동안 디티오트레이톨 (50 mM 최종 농도)로 환원시키고, 30분 동안 암소에서 실온에서 아이오도아세트아미드 (50 mM 최종 농도)로 알킬화하였다. 이어서, 샘플을 37℃에서 50 mM 중탄산암모늄 내에서 0.02 ㎍/㎕ 트립신 (프로메가)로 밤새 소화시켰다. 소화된 샘플을 100 ㎛ 내경 모세관 컬럼 (나노액퀴티(NanoAcquity) UPLC 컬럼, 100 ㎛ x 100 mm, 1.7 ㎛, BEH130 C18, 워터스 코프 (Waters Corp)) 상에 주입하고, NanoAcquity UPLC 시스템 (워터스 코프) 상에서 모세관 역상 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 샘플을 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 내에 로딩하고, 45분의 총 분석 시간에 2-90% 완충제 B의 구배 (여기서 완충제 A는 0.1% 포름산/2% 아세토니트릴/98% 물이고, 완충제 B는 0.1% 포름산/2% 물/98% 아세토니트릴이다)로 1.00 ㎕/min로 용리하였다. 펩티드를 LTQ-오비트랩(Orbitrap) XL (써모피셔) 질량 분광계 내로 직접 용리하고, 1.4 kV의 분무 전압을 갖는 ADVANCE 광원 (미크롬-브루커 (Michrom-Bruker))을 이용하여 이온화하였다. 질량 스펙트럼 데이타는 m/z 400에서 60,000 M/ΔM의 해상도에서 오비트랩 내의 1회의 전체 MS 스캔 (375-1600 m/z), 이어서 선형 이온 트랩에서 LC 구배 전체에 걸쳐 반복된 사이클에서 전체 MS 스캔에서 검출된 상위 8개의 가장 풍부한 이온의 충동 유도 (CID)를 포함하는 방법을 사용하여 획득하였다. 탠덤 질량 스펙트럼 결과는 에스. 아우레우스 단백질 및 통상적인 실험 오염물을 포함하는 종속 (concatenated) 표적-디코이(decoy) 데이타베이스, 유니프롯(Uniprot) 버전 2010_12에 대해 마스코트® 탐색 알고리즘 버전 2.3.02 (매트릭스 바이오사이언시스 (Matrix Sciences))를 사용하여 데이타베이스 탐색을 위해 제출하였다. 트립신 특이성, 시스테인 카르바미도메틸화의 가변 변형 (+57.0215 Da) 및 메티오닌 산화 (+15.995 Da) (2개의 오류절단 허용), 20 ppm 전구체 이온 질량, 및 특정된 0.5 Da 단편 이온 질량 허용성을 사용하여 데이타를 탐색하였다. 펩티드 스펙트럼 일치는 선형 판별 알고리즘 (LDA)을 사용하여 1%의 위발견율 (FDR)로 여과하였다.
실시예 26 티오Fab FRET 펩티드 및 AAC의 스타포파인 절단
5 μM의 티오FAB 4497 MP-LAFGA-QSY7 (서열 135로서 개시된 "코어 펩티드") 및 티오FAB 4497 MP-LAFAA-QSY7 (서열 136으로서 개시된 "코어 펩티드") (도 30)을 2시간 동안 37℃에서 PBS pH 7.2, 4 mM L-Cys, 2.5 mM EDTA 내에서 50 nM의 프로테아제와 함께 인큐베이션하였다. 2시간 인큐베이션한 후, 절단 반응물을 1% TFA로 1:1 희석함으로써 켄칭하였다. 샘플을 후속적으로 % 링커 절단을 결정하기 위해 LC-MS 상에서 진행시켰다. 시험된 모든 프로테아제는 정도와 위치는 상이하였지만 2개의 링커를 절단하였다 (표 4). 스타포파인 A 및 스타포파인 B는 링커를 동일한 부위에서 절단한다: MP-LAFG↓A-QSY7 (서열 135로서 개시된 "코어 펩티드") 및 MP-LAFA↓A-QSY7 (서열 136으로서 개시된 "코어 펩티드"). 스타포파인 B는 시험된 농도에서 두 링커의 100% 절단을 달성하였다. 카텝신 B는 또한 절단 부위는 혼합되었지만 이들 조건 하에서 두 링커의 100% 절단을 달성하였다. 카텝신 B는 mal-LAFGA-QSY7 (서열 135로서 개시된 "코어 펩티드")을 MP-LAFG↓A-QSY7 (서열 135로서 개시된 "코어 펩티드")에서만 절단한 반면, mal-LAFAA-QSY7 (서열 136으로서 개시된 "코어 펩티드")은 MP-LAFA↓A-QSY7 (서열 136으로서 개시된 "코어 펩티드") 및 MP-LAFAA↓-QSY7 (서열 136으로서 개시된 "코어 펩티드") 둘 모두에서 절단하였다. 스타포파인 A에 의한 MP-LAFAA-QSY7 (서열 136으로서 개시된 "코어 펩티드") 절단은 23%인 반면, m MP-LAFGA-QSY7 (서열 135로서 개시된 "코어 펩티드")의 절단은 38%이었다.
5 μM의 AAC-193을 2시간 동안 37℃에서 PBS pH 7.2, 4 mM L-Cys, 2.5 mM EDTA 또는 100 mM 시트르산나트륨 pH 5, 100 mM NaCl, 4 mM L-Cys, 2.5 mM EDTA 내에서 50 nM의 프로테아제와 함께 인큐베이션하였다. 2시간 인큐베이션한 후, 절단 반응물을 1% TFA로 1:1 희석함으로써 켄칭하였다. 샘플을 후속적으로 % 링커 절단을 결정하기 위해 LC-MS 상에서 진행시켰다. 최적화된 링커-항생제는 시험된 모든 프로테아제에 의해 효율적으로 절단되었다. 스타포파인 A 및 스타포파인 B에 의한 절단시에, 자유 피페라지노-리파마이신이 방출되었다. 스타포파인 B는 pH 5 및 7.2 모두에서 100% 절단을 달성하였다. 스타포파인 A는 pH 5에서 100% 절단 및 pH 7.2에서 64% 절단을 보여주었다.
실시예 27. 항체-항생제 접합체, 티오-S4497 LC v8-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") AAC-215는 시험관내에서 에스. 아우레우스를 억제한다:
1x108 정지상 Wood46 박테리아를 100 ㎍/mL의 티오-S4497 LC v8-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") AAC-215 또는 티오-S4497-HC-A118C-MC-vc-PABC-(피페라즈BOR) AAC-126을 함유하는 10 ㎕의 HB 완충제 (0.1% 소 혈청 알부민을 보충한 행크 균형 염 용액) 내에 현탁시켰다. 후자는 동일한 항생제를 전달하기 위해 발린-시트룰린 (vc) 카텝신 B 절단가능한 링커를 사용한다.
1시간 후에, 샘플을 90 ㎕의 HB, 또는 90 ㎕의 카텝신 B (20 mM 아세트산나트륨, 1 mM EDTA, 5 mM L-시스테인 pH 5 내의 10 ㎍/mL의 카텝신 B)의 첨가에 의해 10배 희석하고, 37℃에서 추가로 3시간 동안 인큐베이션하였다. 활성 항생제의 방출은 박테리아와 함께 AAC의 인큐베이션이 후속적인 박테리아 성장을 억제할 수 있는지 결정함으로써 추정하였다. 박테리아/AAC 현탁액을 트립틱 소이 아가 플레이트에 직접 접종하고, 박테리아 성장을 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후 시각화하였다. 활성 약물은 MC-LAFG-PAB-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") 링커-항생제 중간체와 접합된 AAC로부터 방출된다.
AAC 부재 하에 인큐베이션된 박테리아는 잘 성장하였고, 카텝신 B 처리에 의해 영향받지 않았다. 카텝신 B 절단가능한 링커인 발린-시트룰린 (vc)을 함유하는 AAC-126으로 처리된 박테리아는 HB 완충제 단독에서 인큐베이션한 후 잘 성장하였지만, AAC-126 + 카텝신 B 처리 후에는 성장하지 못하였고, 이것은 활성 항생제를 방출하기 위해 효소 처리가 필요함을 나타낸다. 이와 대조적으로, 스타포파인 절단가능한 링커 LAFG (서열 128)를 함유하는 AAC-215와 함께 인큐베이션된 박테리아는 HB 완충제 단독과 함께 인큐베이션한 후 성장하지 못하였고, 이것은 박테리아 현탁액이 스타포파인 절단가능한 링커 AAC로부터 활성 항생제를 방출하기에 충분한 효소 활성을 보유함을 시사한다.
실시예 28. 항체-항생제 접합체, 티오-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") AAC-193은 대식세포 검정에서 세포내 MRSA를 사멸시킨다:
에스. 아우레우스의 USA300 균주를 AAC의 박테리아에 대한 결합을 허용하기 위해 다양한 용량 (100 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 또는 0.1 ㎍/mL)의 S4497 항체 단독, 티오-S4497 HC WT (v8) (서열 137), LC V205C-MC-vc-PAB-(디메틸pipBOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") AAC-192, 또는 티오-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) AAC-193과 함께 인큐베이션하였다 (도 31).
S4497 HC WT (v8) 446aa
Figure pct00132
1시간 동안 인큐베이션한 후에, 옵소닌화된 박테리아를 뮤린 대식세포에 공급하고, 포식작용을 허용하기 위해 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 포식작용이 완료된 후, 감염 혼합물을, 임의의 잔류하는 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 50 ㎍/mL의 겐타마이신을 보충한 정상 성장 배지로 교체하고, 생존 세포내 박테리아의 총수를 대식세포 용해물의 연속 희석액을 트립틱 소이 아가 플레이트 상에 플레이팅함으로써 2일 후에 결정하였다 (도 31). 스타포파인 절단가능한 AAC는 카텝신 B 절단가능한 AAC와 비교시 유사한 효력으로 세포내 USA300을 사멸시킬 수 있었다. 회색 파선은 검정 검출 한계를 나타낸다 (10 CFU/웰).
실시예 29. AAC는 항체의 항원 특이적 결합을 통한 에스. 아우레우스의 항생제 사멸을 표적화한다.
에스. 아우레우스의 Wood46 균주를 선택하였고, 그것은 상기 균주가 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하는 분자인 단백질 A를 발현하지 않기 때문이다. 에스. 아우레우스의 Wood46 균주를 AAC의 박테리아에 대한 결합을 허용하기 위해 1시간 동안 10 ㎍/mL 또는 0.5 ㎍/mL의 S4497 항체, 카텝신 B 절단가능한 링커를 함유하는 이소형 대조군-AAC, 티오-트라스투주맙 HC A118C-MC-vc-PAB-(디메틸-pipBOR) AAC-101, 티오-S4497 HC WT (v8), LC V205C-MC-vc-PAB-(디메틸pipBOR) AAC-192, 스타포파인 절단가능한 링커를 함유하는 이소형 대조군-AAC, 티오-트라스투주맙 HC A118C-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드"), 또는 티오-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") AAC-193과 함께 인큐베이션하였다 (도 32). AAC의 비-특이적 결합을 제한하기 위해, 옵소닌화된 박테리아를 원심분리하고, 1회 세척하고, 뮤린 대식세포에 공급하기 전에 완충제에 재현탁시켰다. 포식작용이 완료된 후, 감염 혼합물을, 임의의 잔류하는 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해 50 ㎍/mL의 겐타마이신을 보충한 정상 성장 배지로 교체하고, 생존 세포내 박테리아의 총수를 대식세포 용해물의 연속 희석액을 트립틱 소이 아가 플레이트 상에 플레이팅함으로써 2일 후에 결정하였다 (도 32). 스타포파인 절단가능한 링커를 함유하는 AAC인 AAC-193은 모든 검출가능한 세포내 박테리아를 사멸시킬 수 있는 반면에, 이소형 대조군 AAC는 활성을 보이지 않았다. 대식세포 검정은 스타포파인 절단가능한 AAC가 세포내 박테리아를 사멸시킬 수 있음을 보여준다. 항체-항생제 접합체, 티오-S4497 LC v8-MP-LAFG-PABC-(피페라지노BOR) (서열 128로서 개시된 "코어 펩티드") AAC-215는 MRSA 감염 모델에서 생체내에서 효과적이다:
CB17.SCID 마우스는 혈청 내에 적어도 10 mg/mL의 인간 IgG의 일정한 수준을 생성하기 위해 최적화된 투여 요법을 사용하여 인간 IgG로 재구성하였다. 마우스를 4497 항체 (50 mg/kg), 스타포파인 절단가능한 링커를 갖는 AAC-215 (50 mg/kg), 또는 이소형 대조군, 스타포파인 절단가능한 링커를 갖는 항-gD AAC (50 mg/kg)로 처리하였다. 마우스에게 정맥내 주사에 의해 감염 후 제1일에 단일 용량의 AAC-215를 투여하였다. 모든 마우스를 감염 후 제4일에 희생시키고, 2개의 신장 (도 33) 또는 심장 (도 34) 내의 생존 박테리아의 총수를 플레이팅에 의해 결정하였다. 스타포파인 절단가능한 링커를 함유하는 AAC-215를 사용한 처리는 시험한 8마리 마우스 중 6마리에서 박테리아 로드를 검출 한계 미만으로 감소시킨 반면, 이소형 대조군 AAC는 제한된 활성을 보였다. 파선은 검정 검출 한계를 나타낸다 (333 CFU/마우스).
실시예 30. 에스. 아우레우스의 성장 및 프로테아제 활성 프로파일링:
스타필로코쿠스 아우레우스 균주 Wood46 (ATCC 10832)을 진탕하면서 트립틱 소이 브로쓰 (TSB) 내에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 10,000 x g에서 10 min 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 2개의 0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시켰다.
에스. 아우레우스 프로테아제 활성 프로파일링: 150 ml의 배양 상청액을 농축시키고, 1 mg/ml의 최종 총 단백질 농도를 갖는 38 ml의 최종 부피로 TFF (밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) XL 카세트 바이오맥스 (Biomax) 10 kDa)를 사용하여 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내로 완충제 교환하였다. Wood46 상청액의 프로테아제 활성 검정은 신속한 엔도펩티다제 프로파일링 라이브러리 또는 REPLi (미모토페스, 호주 빅토리아)를 사용하여 수행하였다. 라이브러리는 512개 군으로 배열된 96-웰 방식으로 3375개의 내부 켄칭된 형광 펩티드로 이루어진다. 라이브러리 펩티드는 서열 MCA-Gly-Gly-Gly-Xaa-Yaa-Zaa-Gly-Gly-DPA-Lys-Lys (서열 132)를 함유하고, 여기서 MCA는 7-메톡시쿠마린-4-아세트산 (형광 공여자)에 대응하고, DPA는 Nb-(2,4-디니트로페닐)-L-2,3-디아미노프로피온산 (형광 수용자)에 대응한다. 5 nmol의 FRET 펩티드를 함유하는 웰을 5 ㎕의 50% 아세토니트릴 (시그마) 내에 가용화시켰다. 50 ㎕ (마이크로리터)의 농축된 Wood46 상청액 및 50 ㎕의 PBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고, 0, 30, 60, 140, 및 170분에 형광 측정을 수행하였다. 형광 데이타를 테칸 사파이어 (Tecan Saphire, 여기 λ320nm/방출 λ400nm) 상에서 얻었다. 종점 형광 강도 변화 배수를 F최종/F초기로서 계산하였다.
기질 절단 부위는 ESI 전원을 이용하여 애질런트 Q-TOF를 사용하여 수행한 LC-MS에 의해 결정하였다. 각각의 웰로부터 10 ㎕을 주입하고, 애질런트 1260 HPLC 시스템을 사용하여 워터스 엑스브릿지(Xbridge) OST C18 2.5 ㎛ 컬럼 (4.6 x 50 mm) 상의 역상 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 샘플을 2-90% 완충제 B의 구배 (여기서, 완충제 A는 0.05% 트리플루오로아세트산/99.95% 물이고, 완충제 B는 20분의 총 분석 시간으로 0.04% 트리플루오로아세트산/99.96% 아세토니트릴이다)로 500 ㎕/min에서 용리하였다. 펩티드를 Q-TOF 질량 분광계 내로 직접 용리하였다. 절단 생성물은 관찰된 분자량을 각각의 가능한 부위에서 절단에 대응하는 계산된 질량과 비교한 것에 기초하여 배정하였다.
실시예 31. 말레이미도 FRET 펩티드 링커의 합성:
도 26의 말레이미도 FRET 펩티드 (MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly- Gly-Lys(플루오레세인) (서열 125로서 개시된 "코어 펩티드")는 PS3 펩티드 합성기 (프로테인 테크놀로지스, 인크. (Protein Technologies, Inc.))를 사용하여 표준 Fmoc 고체상 화학에 의해 합성하였다. 0.1 mmol의 Fmoc-Lys(Boc)-Rink 아미드 수지 (노바비오켐 (Novabiochem))를 사용하여 C-말단 카르복사미드를 생성하였다. Fmoc-Lys(Mtt)-OH (노바비오켐)를 Mtt기의 제거 후에 추가의 측쇄 화학을 허용하기 위해 제1 N-말단 잔기에 첨가하였다. 형광 수용자, 5(6)-카르복시 테트라메틸로다민, 또는 TAMRA (노바비오켐)을, 3% 트리이소프로필실란 (TIS)을 갖는 디클로로메탄 내의 1% TFA의 3회의 연속 30 min 세척에 의해 Mtt기를 제거한 후 수지 상의 상기 측쇄 아민에 부착시켰다. 반응을 20시간 동안 진행하도록 허용하였다. 상기 단계 후에, 말단 Fmoc기를 DMF 내의 20% 피페리딘에 의해 제거하고, HBTU에 의해 말레이미도-프로피온산 (바켐 아게 (Bachem AG))와 결합시켰다. TAMRA-표지된 중간체 펩티드를, 부드럽게 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 95:2.5:2.5 트리플루오로아세트산 (TFA)/TIS/물 (v/v/v)을 사용하여 수지로부터 절단하였다. 절단 용액을 여과하고, TFA를 제거하기 위해 질소 기류 하에 증발시켰다. 물 및 아세토니트릴의 혼합물 내에 용해시킨 조질 중간체를 주피터 (Jupiter) 5 μ C4 컬럼 (5 ㎛, 10 mm x 250 mm: 페노메넥스 (Phenomenex))를 사용하는 역상 HPLC에 의해 추가로 정제하였다. 이어서, 동결건조 후에, 정제된 중간체를 C-말단 리신에서 유리 아민을 표지하기 위해 20시간 동안 50/50 포스페이트 완충 염수 (PBS)/디메틸포름아미드 (DMF) (v/v) 내에서 10 eq. NHS-플루오레세인 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))과 반응시켰다. 이어서, FRET 펩티드를 정제하고 상기 설명된 바와 같이 동결건조시켰다. 모든 반응 혼합물 및 최종 생성물은 분석하고 LC-MS에 의해 확인하였다.
링커의 고체상 합성: 설명된 모든 링커는 PS3 펩티드 합성기 (프로테인 테크놀로지스, 인크.) 상에서 표준 Fmoc 고체상 화학을 이용하여 합성하였다. 0.1 mM의 Fmoc-아미노산-Wang 수지 (노바비오켐)를 모든 링커에 대해 사용하여 C-말단 카르복실을 생성하였다. 링커를 상기 설명된 바와 같이 정제하였다. QSY7 아민 (인비트로겐) 부착은 정제된 링커를 DMF 내에서 1.1배 몰 과량의 QSY7 아민, 1.1배 몰 과량의 HATU, 및 2.2배 몰 과량의 DIEA와 실온에서 밤새 반응시킴으로써 달성하였다. 이어서, 링커-QSY7 종을 상기 설명된 바와 같이 정제하였다. 모든 반응 혼합물 및 최종 생성물을 LC-MS에 의해 분석하고 확인하였다.
실시예 32. 세포 기반 FRET 절단 검정:
Wood46 및 USA300의 배양액에 TSB 내의 밤새 배양액의 1:200 희석액 (20 ml 중의 0.1 ml)을 접종하고, 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 균주를 지수 성장기로 배양하고, 트립틱 소이 브로쓰 (TSB) 내에 108개 세포/ml 및 107개 세포/ml의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 티오MAB FRET 펩티드 접합체를 2 μM의 최종 FRET 펩티드 농도로 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고, 형광을 210분 동안 여기 λ495 nm/방출 λ518 nm에서 시간에 따라 모니터링하였다.
농축된 활성 상청액에 의한 티오FAB FRET 펩티드 및 티오FAB mal-GGAFAGGG-DNA31 (서열 126로서 개시된 "코어 펩티드")의 절단: MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(플루오레세인) (서열 125로서 개시된 "코어 펩티드") 또는 MP-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-(pipBOR) LA-59 (서열 126로서 개시된 "코어 펩티드")를 접합시킨 티오FAB S4497을 상기 설명된 바와 같이 처리된 농축된 Wood46 상청액과 함께 인큐베이션하였다. 티오FAB S4497 및 상청액을 PBS 내에서 밀리그램 기초로 1:1 혼합하였다 (25 ㎍의 티오FAB S4497과 25 ㎍의 단백질성 상청액). 샘플을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간에, 반응물을 0.1% TFA로 1:1 희석함으로써 켄칭하였다. 샘플을 절단의 양 및 절단 생성물을 결정하기 위해 LC-MS에 의해 분석하였다.
상기 본 발명은 명료한 이해를 위해 예시 및 실시예에 의해 다소 상세하게 설명되지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 본원에서 언급되는 모든 특허 및 학술 문헌은 명백하게 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> ANTI-WALL TEICHOIC ANTIBODIES AND CONJUGATES <130> P4960R2-WO <140> <141> <150> 14/284,609 <151> 2014-05-22 <150> 61/829,461 <151> 2013-05-31 <160> 180 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Arg Ala Asn Asn Asn Tyr Tyr Val 1 5 10 15 Ala <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Gln Gln Tyr Tyr Thr Ser Arg Arg Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Asp Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 5 <211> 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Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 177 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 177 Ala Arg Gly Asp Gly Gly Leu 1 5 <210> 178 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 178 Ala Arg Gly Asp Ala Gly Leu 1 5 <210> 179 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 179 Ala Arg Gly Glu Gly Gly Leu 1 5 <210> 180 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 180 Ala Arg Gly Ala Gly Gly Leu 1 5

Claims (107)

  1. 경쇄 (L) 및 중쇄 (H)를 포함하고, 여기서
    (a) L 쇄는 KSSQSVLSRANNNYYVA (서열 1)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTREF (서열 2)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYYTSRRT (서열 3)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 DYYMH (서열 4)의 서열을 포함하는 CDR H1, WINPKSGGTNYAQRFQG (서열 5)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DCGSGGLRDF (서열 6)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (b) L 쇄는 RSNQNLLSSSNNNYLA (서열 7)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTRES (서열 8)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYYANPRT (서열 9)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 DYYIH (서열 10)의 서열을 포함하는 CDR H1, WINPNTGGTYYAQKFRD (서열 11)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DCGRGGLRDI (서열 12)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (c) L 쇄는 KSNQNVLASSNDKNYLA (서열 13)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASIRES (서열 14)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYYTNPRT (서열 15)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 DYYIH (서열 16)의 서열을 포함하는 CDR H1, WINPNTGGTNYAQKFQG (서열 17)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DCGNAGLRDI (서열 18)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나; 또는
    (d) L 쇄는 KSSQNVLYSSNNKNYLA (서열 19)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTRES (서열 20)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYYTSPPYT (서열 21)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYWIG (서열 22)의 서열을 포함하는 CDR H1, IIHPGDSKTRYSPSFQG (서열 23)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 LYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGV (서열 24)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하는 것인, 단리된 항-WTA (세포벽 테이코산) 모노클로날 항체.
  2. 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 26, 서열 28, 서열 30, 및 서열 32로부터 선택되는 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  3. 제2항에 있어서, L 쇄 가변 영역 (VL)을 추가로 포함하고, 여기서 VL은 서열 25, 서열 27, 서열 29, 및 서열 31로부터 선택되는 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  4. 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 25, 서열 27, 서열 29, 및 서열 31로부터 선택되는 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  5. 제3항에 있어서,
    (i) 서열 25의 서열을 포함하는 VL 및 서열 26의 서열을 포함하는 VH;
    (ii) 서열 27의 서열을 포함하는 VL 및 서열 28의 서열을 포함하는 VH;
    (iii) 서열 29의 서열을 포함하는 VL 및 서열 30의 서열을 포함하는 VH; 또는
    (iv) 서열 31의 서열을 포함하는 VL 및 서열 32의 서열을 포함하는 VH
    를 포함하는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 결여된 항원-결합 단편인 항체.
  7. 제6항에 있어서, F(ab) 또는 F(ab')2인 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 여기서 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역은 시스테인 잔기로 치환된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것인 항체.
  9. 제8항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 아미노산 치환 A118C을 포함하고/하거나, 경쇄 불변 영역이 아미노산 치환 V205C를 포함하고, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 서열 151의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 서열 150의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 148의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 서열 151의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, WTA 알파에 결합하는 항체.
  14. 경쇄 (L) 및 중쇄 (H)를 포함하고, 여기서
    (a) L 쇄는 RASQTISGWLA (서열 33)의 서열을 포함하는 CDR L1, KASTLES (서열 34)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYKSYSFN (서열 35)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYDIN (서열 36)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNANSGNTGYAQKFQG (서열 37)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 SSILVRGALGRYFDL (서열 38)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (b) L 쇄는 RASQTISGWLA (서열 39)의 서열을 포함하는 CDR L1, KASTLES (서열 40)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYKSYSFN (서열 41)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYDIN (서열 42)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNANSGNTGYAQKFQG (서열 43)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 SSILVRGALGRYFDL (서열 44)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (c) L 쇄는 RASQFVSRTSLA (서열 45)의 서열을 포함하는 CDR L1, ETSSRAT (서열 46)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 HKYGSGPRT (서열 47)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 NYDFI (서열 48)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNPNSYNTGYGQKFQG (서열 49)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 AVRGQLLSEY (서열 50)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (d) L 쇄는 RASQSVSSSYLA (서열 51)의 서열을 포함하는 CDR L1, DASSRAT (서열 52)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QKYGSTPRP (서열 53)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYDIN (서열 54)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNPNSGNTNYAQRFQG (서열 55)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 ERWSKDTGHYYYYGMDV (서열 56)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (e) L 쇄는 RASLDITNHLA (서열 57)의 서열을 포함하는 CDR L1, EASILQS (서열 58)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 EKCNSTPRT (서열 59)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 NYDIN (서열 60)의 서열을 포함하는 CDR H1, WMNPSSGRTGYAPKFRG (서열 61)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 GGGYYDSSGNYHISGLDV (서열 62)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (f) L 쇄는 RASQSVGAIYLA (서열 63)의 서열을 포함하는 CDR L1, GVSNRAT (서열 64)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QLYTSSRALT (서열 65)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 AYAMN (서열 66)의 서열을 포함하는 CDR H1, SITKNSDSLYYADSVKG (서열 67)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 LAARIMATDY (서열 68)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (g) L 쇄는 RASQGIRNGLG (서열 69)의 서열을 포함하는 CDR L1, PASTLES (서열 70)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 LQDHNYPPT (서열 71)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 YYSMI (서열 72)의 서열을 포함하는 CDR H1, SIDSSSRYLYYADSVKG (서열 73)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DGDDILSVYRGSGRPFDY (서열 74)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (h) L 쇄는 RASQGIRNGLG (서열 75)의 서열을 포함하는 CDR L1, PASTLES (서열 76)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 LQDHNYPPS (서열 77)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 YYSMI (서열 78)의 서열을 포함하는 CDR H1, SIDSSSRYRYYTDSVKG (서열 79)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DGDDILSVYQGSGRPFDY (서열 80)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (i) L 쇄는 RASQSVRTNVA (서열 81)의 서열을 포함하는 CDR L1, GASTRAS (서열 82)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 LQYNTWPRT (서열 83)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 TNDMS (서열 84)의 서열을 포함하는 CDR H1, TIIGIDDTTHYADSVRG (서열 85)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 NSGIYSF (서열 86)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (j) L 쇄는 RASQDIGSSLA (서열 87)의 서열을 포함하는 CDR L1, ATSTLQS (서열 88)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQLNNYVHS (서열 89)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 DYAMG (서열 90)의 서열을 포함하는 CDR H1, VVTGHSYRTHYADSVKG (서열 91)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 RIWSYGDDSFDV (서열 92)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (k) L 쇄는 RASQSIGDRLA (서열 93)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASNLEG (서열 94)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYKSQWS (서열 95)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SYAMN (서열 96)의 서열을 포함하는 CDR H1, YISSIETIYYADSVKG (서열 97)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 DRLVDVPLSSPNS (서열 98)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (l) L 쇄는 KSSQSIFRTSRNKNLLN (서열 99)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTRKS (서열 100)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYFSPPYT (서열 101)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SFWMH (서열 102)의 서열을 포함하는 CDR H1, FTNNEGTTTAYADSVRG (서열 103)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 GDGGLDD (서열 104)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나;
    (m) L 쇄는 RASQFTNHYLN (서열 105)의 서열을 포함하는 CDR L1, VASNLQS (서열 106)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQSYRTPYT (서열 107)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SGYYN (서열 108)의 서열을 포함하는 CDR H1, YILSGAHTDIKASLGS (서열 109)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 SGVYSKYSLDV (서열 110)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하거나; 또는
    (n) L 쇄는 KSSQSIFRTSRNKNLLN (서열 99)의 서열을 포함하는 CDR L1, WASTRKS (서열 100)의 서열을 포함하는 CDR L2, 및 QQYFSPPYT (서열 101)의 서열을 포함하는 CDR L3을 포함하고; H 쇄는 SFWMH (서열 102)의 서열을 포함하는 CDR H1, FTNNEGTTTAYADSVRG (서열 103)의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 GEGGLDD (서열 118)의 서열을 포함하는 CDR H3을 포함하는 것
    인, 단리된 항-WTA (세포벽 테이코산) 모노클로날 항체.
  15. 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 112의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 112의 위치 1의 Xaa는 Q 또는 E이고, 서열 112의 위치 2의 Xaa는 M, I 또는 V인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  16. 제11항에 있어서, 경쇄 가변 영역 (VL)을 추가로 포함하고, 여기서 VL은 서열 111의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  17. 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 111의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  18. 제15항에 있어서, VH가 서열 112의 서열을 포함하고, VL이 서열 111의 서열을 포함하고, 여기서 서열 112의 위치 1의 Xaa가 Q 또는 E이고, 서열 112의 위치 2의 Xaa가 M, I 또는 V인 항체.
  19. 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 120 또는 서열 156의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  20. 제17항에 있어서, 경쇄 가변 영역 (VL)을 추가로 포함하고, 여기서 VL은 서열 119의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  21. 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 119의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  22. 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 119의 서열을 포함하고, VH는 서열 120 또는 서열 156의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  23. 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 158, 서열 159, 서열 160, 서열 161, 서열 162, 서열 163, 서열 164, 서열 165, 서열 166, 서열 167, 및 서열 168의 VL 서열로부터 선택된 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  24. 서열 127, 서열 133, 서열 134, 서열 169, 서열 170, 서열 171, 서열 172, 서열 173, 서열 174, 서열 175, 및 서열 176의 중쇄 가변 영역 (VH) 서열로부터 선택되는 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  25. 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서
    (a) 항체의 VL은 서열 158의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 169의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 항체의 VL은 서열 159의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 170의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 항체의 VL은 서열 160의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 171의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 항체의 VL은 서열 161의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 172의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    (e) 항체의 VL은 서열 162의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 173의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    (f) 항체의 VL은 서열 163의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 174의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    (g) 항체의 VL은 서열 164의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 175의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    (h) 항체의 VL은 서열 165의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 176의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    (i) 항체의 VL은 서열 166의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 133의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나;
    (j) 항체의 VL은 서열 167의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 134의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (k) 항체의 VL은 서열 168의 VL 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 127의 VH 서열의 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  26. 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서
    (a) 항체의 VL은 서열 158의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 169의 VH 서열을 포함하거나;
    (b) 항체의 VL은 서열 159의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 170의 VH 서열을 포함하거나;
    (c) 항체의 VL은 서열 160의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 171의 VH 서열을 포함하거나;
    (d) 항체의 VL은 서열 161의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 172의 VH 서열을 포함하거나;
    (e) 항체의 VL은 서열 162의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 173의 VH 서열을 포함하거나;
    (f) 항체의 VL은 서열 163의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 174의 VH 서열을 포함하거나;
    (g) 항체의 VL은 서열 164의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 175의 VH 서열을 포함하거나;
    (h) 항체의 VL은 서열 165의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 176의 VH 서열을 포함하거나;
    (i) 항체의 VL은 서열 166의 VL 서열을 포함하고, 항체의 VH는 서열 133의 VH 서열을 포함하거나;
    (j) 항체의 VL은 서열 167의 VL 서열을 포함하고, VH는 서열 134의 VH 서열을 포함하거나;
    (k) 항체의 VL은 서열 168의 VL 서열을 포함하고, VH는 서열 127의 VH 서열을 포함하거나;
    (l) 항체의 VL은 서열 113의 VL 서열을 포함하고, VH는 서열 114의 VH 서열을 포함하거나; 또는
    (m) 항체의 VL은 서열 121의 VL 서열을 포함하고, VH는 서열 138의 VH 서열을 포함하는 것인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 결여된 항원-결합 단편인 항체.
  28. 제27항에 있어서, F(ab) 또는 F(ab')2인 항체.
  29. 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 여기서 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역은 시스테인 잔기로 치환된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것인 항체.
  30. 제29항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 아미노산 치환 A118C를 포함하고/하거나, 경쇄 불변 영역이 아미노산 치환 V205C를 포함하고, 여기서 넘버링은 EU 넘버링을 따른 것인 항체.
  31. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 서열 151의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  32. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 서열 150의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  33. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 148의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 서열 151의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  34. 서열 114, 서열 116, 또는 서열 117의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 113의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 서열 116 또는 서열 117의 위치 2의 아미노산 Xaa는 M, I 또는 V인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  35. 서열 114, 서열 116, 또는 서열 117의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 115의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 서열 116 또는 서열 117의 위치 2의 아미노산 Xaa는 M, I 또는 V인 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  36. 서열 139, 서열 140, 서열 141, 서열 142, 서열 143, 및 서열 144로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 113의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  37. 서열 139, 서열 140, 서열 141, 서열 142, 서열 143, 및 서열 144로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 115의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  38. 서열 146, 서열 147, 서열 157 또는 서열 124의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 121 또는 서열 123의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  39. 서열 146, 서열 147, 서열 157 또는 서열 124의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 145의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항-WTA 모노클로날 항체.
  40. 제14항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, WTA 베타에 결합하는 항체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양액 내의 숙주 세포에서 생산되는 항체.
  43. 제42항에 있어서, 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 항체.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  45. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  46. 제45항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  47. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포.
  48. 제47항의 숙주 세포를 핵산의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 세포에 의해 생산된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법.
  49. 펩티드 링커에 의해 리파마이신-유형 항생제에 공유 부착된 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체를 포함하는 항체-항생제 접합체 화합물.
  50. 제49항에 있어서, 항체가 i) 서열 99-104의 L 쇄 및 H 쇄 CDR 또는 서열 33-38의 L 쇄 및 H 쇄 CDR; 또는 ii) 서열 120 또는 서열 156의 VH와 쌍을 이룬 서열 119 또는 서열 123의 VL; 또는 iii) 서열 112의 VH와 쌍을 이룬 서열 111의 VL을 포함하는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체가 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 결합하는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
  52. 제51항에 있어서, 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체가 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA)에 결합하는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 리파마이신-유형 항생제가 리팔라질-유형 항생제인 항체-항생제 접합체 화합물.
  54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 리파마이신-유형 항생제가 펩티드 링커에 부착된 4급 아민을 포함하는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 링커가 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체의 시스테인 또는 조작된 시스테인에 부착되는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 링커가 에스. 아우레우스 엔도펩티다제 또는 시스테인 프로테아제 절단가능한 링커인 항체-항생제 접합체 화합물.
  57. 제56항에 있어서, 펩티드 링커가 스타포파인 B 또는 스타포파인 A 절단가능한 링커인 항체-항생제 접합체 화합물.
  58. 제56항에 있어서, 펩티드 링커가 인간 프로테아제 카텝신 B 절단가능한 링커인 항체-항생제 접합체 화합물.
  59. 제58항에 있어서, 펩티드 링커가 val-cit 디펩티드 링커인 항체-항생제 접합체 화합물.
  60. 제49항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00133

    상기 식에서,
    Ab는 항-세포벽 테이코산 항체이고;
    L은 화학식
    Figure pct00134
    로 표시되는 펩티드 링커이고,
    여기서, Str은 스트레처 단위이고; Pep는 2 내지 12개 아미노산 잔기의 펩티드이고, Y는 스페이서 단위이고;
    abx는 리파마이신-유형 항생제이고;
    p는 1 내지 8의 정수이다.
  61. 제60항에 있어서, p가 2 내지 4인 항체-항생제 접합체 화합물.
  62. 제49항에 있어서, 하기 화학식 I로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    <화학식 I>
    Figure pct00135

    상기 식에서,
    파선은 임의의 결합을 나타내고;
    R은 H, C1-C12 알킬, 또는 C(O)CH3이고;
    R1은 OH이고;
    R2는 CH=N-(헤테로시클릴)이고, 여기서 헤테로시클릴은 C(O)CH3, C1-C12 알킬, C1-C12 헤테로아릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 및 C3-C12 카르보시클릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환되거나;
    또는 R1 및 R2는 5원 또는 6원의 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴을 형성하고, 임의로 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리를 형성하고, 여기서 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 또는 OH로 임의로 치환되고;
    L은 R2에 부착된 펩티드 링커 또는 R1 및 R2에 의해 형성된 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;
    Ab는 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체이다.
  63. 제62항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00136

    상기 식에서,
    R3은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고;
    n은 1 또는 2이고;
    R4는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 및 OH로부터 선택되고;
    Z는 NH, N(C1-C12 알킬), O 및 S로부터 선택된다.
  64. 제62항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00137

    상기 식에서,
    R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고;
    n은 0 또는 1이다.
  65. 제62항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00138

    상기 식에서,
    R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고;
    n은 0 또는 1이다.
  66. 제62항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00139

    상기 식에서,
    R5는 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고;
    n은 0 또는 1이다.
  67. 제62항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00140

    상기 식에서,
    R3은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고;
    n은 1 또는 2이다.
  68. 제62항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00141
  69. 제49항에 있어서, 펩티드 링커가 하기 화학식으로 표시되는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00142

    상기 식에서, Str은 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체에 공유 부착된 스트레처 단위이고; Pep는 2 내지 12개 아미노산 잔기의 펩티드이고, Y는 리파마이신-유형 항생제에 공유 부착된 스페이서 단위이다.
  70. 제69항에 있어서, Str이 하기 화학식으로 표시되는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00143

    상기 식에서, R6은 C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 카르보시클로, -O-(C1-C8 알킬)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보시클로)-, -(C3-C8 카르보시클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로시클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로시클로)-, -(C3-C8 헤테로시클로)-C1-C10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로 이루어지는 군으로부터 선택되고; r은 1 내지 10의 정수이다.
  71. 제70항에 있어서, R6이 -(CH2)5-인 항체-항생제 접합체 화합물.
  72. 제69항에 있어서, Pep가 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 리신, 아르기닌, 발린, 및 시트룰린으로부터 독립적으로 선택되는 2 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
  73. 제72항에 있어서, Pep가 발린-시트룰린 (val-cit, vc); 페닐알라닌-리신 (fk); GGAFAGGG (서열 126); tpm-cit; GPImeLFF (서열 129); 발린-시트룰린-페닐알라닌 (val-cit-phe); GGAFA (서열 131); 및 LAFG (서열 128)로부터 선택되는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
  74. 제69항에 있어서, Y가 파라-아미노벤질 또는 파라-아미노벤질옥시카르보닐을 포함하는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
  75. 제49항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00144

    상기 식에서, AA1 및 AA2는 아미노산 측쇄로부터 독립적으로 선택된다.
  76. 제75항에 있어서, 아미노산 측쇄가 H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, 및 -CH2CH2CH2NHC(O)NH2로부터 독립적으로 선택되는 것인 항체-항생제 접합체 화합물.
  77. 제75항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00145
  78. 제75항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00146
  79. 제78항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00147
  80. 제75항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00148
  81. 제80항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00149
  82. 제75항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00150
  83. 제82항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00151
  84. 제75항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00152

    상기 식에서, R7은 H 및 C1-C12 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
  85. 제75항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00153
  86. 제85항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00154
  87. 제75항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00155
  88. 제87항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항체-항생제 접합체 화합물.
    Figure pct00156
  89. 제49항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 항체-항생제 접합체 화합물, 및 제약상 허용되는 담체, 활택제, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  90. 리파마이신-유형 항생제를 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체에 접합시키는 것을 포함하는, 제49항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 항체-항생제 접합체 화합물의 제조 방법.
  91. 하기 화학식 II로 표시되는 항생제-링커 중간체.
    <화학식 II>
    Figure pct00157

    여기서,
    파선은 임의의 결합을 나타내고;
    R은 H, C1-C12 알킬, 또는 C(O)CH3이고;
    R1은 OH이고;
    R2는 CH=N-(헤테로시클릴)이고, 여기서 헤테로시클릴은 C(O)CH3, C1-C12 알킬, C1-C12 헤테로아릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 및 C3-C12 카르보시클릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환되거나;
    또는 R1 및 R2는 5원 또는 6원의 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴을 형성하고, 임의로 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리를 형성하고, 여기서 스피로 또는 융합된 6원의 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 카르보시클릴 고리는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 또는 OH로 임의로 치환되고;
    L은 R2에 부착된 펩티드 링커 또는 R1 및 R2에 의해 형성된 융합된 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고; 화학식
    Figure pct00158
    로 표시되고,
    여기서, Str은 스트레처 단위이고; Pep는 2 내지 12개 아미노산 잔기의 펩티드이고, Y는 스페이서 단위이고;
    X는 말레이미드, 티올, 아미노, 브로마이드, 브로모아세트아미도, 아이오도아세트아미도, p-톨루엔술포네이트, 아이오다이드, 히드록실, 카르복실, 피리딜 디술피드, 및 N-히드록시숙신이미드로부터 선택되는 반응성 관능기이다.
  92. 제91항에 있어서, X가
    Figure pct00159

    인 항생제-링커 중간체.
  93. 제91항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항생제-링커 중간체.
    Figure pct00160

    여기서,
    R3은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택되고;
    n은 1 또는 2이고;
    R4는 H, F, Cl, Br, I, C1-C12 알킬, 및 OH로부터 선택되고;
    Z는 NH, N(C1-C12 알킬), O 및 S로부터 선택된다.
  94. 제93항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항생제-링커 중간체.
    Figure pct00161
  95. 제93항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 항생제-링커 중간체.
    Figure pct00162
  96. 펩티드 링커에 의해 리파마이신-유형 항생제에 공유 부착된 항-세포벽 테이코산 (WTA) 항체를 포함하는 항체-항생제 접합체 화합물의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 박테리아 감염의 치료 방법.
  97. 제49항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 항체-항생제 접합체 화합물의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 박테리아 감염의 치료 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, 환자가 스타필로코쿠스 아우레우스 감염으로 진단된 환자인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 환자 내의 박테리아 로드가 치료에 의해 감소되는 것인 방법.
  100. 제49항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 항-WTA-항생제 접합체 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 스타필로코쿠스 아우레우스 감염 환자의 숙주 세포에서 숙주 세포는 사멸시키지 않으면서 세포내 스타필로코쿠스 아우레우스를 사멸시키는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 지속 생존 (persister) 박테리아 세포가 사멸되는 것인 방법.
  102. 제96항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  103. 제96항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
  104. 제103항에 있어서, 제2 치료제가 항생제인 방법.
  105. 제104항에 있어서, 항생제가 (i) 아미노글리코시드; (ii) 베타-락탐; (iii) 마크롤리드/시클릭 펩티드; (iv) 테트라시클린; (v) 플루오로퀴놀린/플루오로퀴놀론; 및 (vi) 옥사졸리디논으로 이루어지는 구조 클래스로부터 선택되는 것인 방법.
  106. 제104항에 있어서, 항생제가 클린다마이신, 노보비오신, 레타파물린, 답토마이신, GSK-2140944, CG-400549, 시타플록사신, 테이코플라닌, 트리클로산, 나프티리돈, 라데졸리드, 독소루비신, 암피실린, 반코마이신, 이미페넴, 도리페넴, 겜시타빈, 달바반신, 및 아지트로마이신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  107. a) 제89항의 제약 조성물; 및
    b) 사용 설명서
    를 포함하는, 박테리아 감염 치료용 키트.
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