KR20150134414A - 베타7 인테그린 길항제를 사용하는 위장 염증성 장애의 치료를 평가하기 위한 바이오마커의 사용 - Google Patents

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Abstract

위장 염증성 장애의 치료를 위한 치료제, 예컨대 인테그린 베타7 길항제의 효과, 효능, 이를 사용하는 치료에 대한 반응성의 평가 또는 모니터링 방법, 및/또는 상기 치료제의 투약 또는 투여 요법의 결정 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 위장 염증성 장애의 치료를 위한 치료제, 예컨대 베타7 인테그린 길항제의 효과, 효능, 또는 이를 사용하는 치료에 대한 반응성의 지표 ("바이오마커")로서, 및/또는 상기 치료제의 투약 또는 투여 요법을 결정하기 위한 수단으로서 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율을 사용하는 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드, 림프구 유전자, 시토카인 유전자의 유전자 발현 수준, 또는 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수를 측정하여 베타7 인테그린 길항제 치료의 효과, 효능 또는 이에 대한 반응성을 평가하는 방법이 제공된다.

Description

베타7 인테그린 길항제를 사용하는 위장 염증성 장애의 치료를 평가하기 위한 바이오마커의 사용{USE OF BIOMARKERS FOR ASSESSING TREATMENT OF GASTROINTESTINAL INFLAMMATORY DISORDERS WITH BETA7 INTEGRIN ANTAGONISTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 12월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 61/914,619 및 2013년 3월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 61/805,860을 우선권 주장하며, 이들은 둘 다 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본원은 EFS-Web을 통해 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2014년 3월 17일에 생성된 상기 ASCII 카피는 P5599R1WO_PCTSequenceListing.txt로 명명되고, 크기는 20,255 바이트이다.
기술분야
위장 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환의 치료를 위한 치료제, 예컨대 인테그린 베타7 길항제의 효과, 효능, 이를 사용하는 치료에 대한 반응성의 평가 또는 모니터링 방법, 및/또는 상기 치료제의 투약 또는 투여 요법의 결정 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 위장 염증성 장애의 치료를 위한 치료제, 예컨대 베타7 인테그린 길항제의 효과, 효능, 또는 이를 사용하는 치료에 대한 반응성의 지표 ("바이오마커")로서, 및/또는 상기 치료제의 투약 또는 투여 요법을 결정하기 위한 수단으로서 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율을 사용하는 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드, 림프구 유전자, 시토카인 유전자의 유전자 발현 수준, 또는 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수를 측정하여 베타7 인테그린 길항제 치료의 효과, 효능 또는 이에 대한 반응성을 평가하는 방법이 제공된다.
염증성 장 질환 (IBD)은 위장 (GI) 관의 만성 염증성 자가면역 상태이고, 이는 임상적으로 궤양성 결장염 (UC) 또는 크론병 (CD)으로서 나타난다. CD는 전체 GI관의 임의의 부분에 영향을 미치는 잠재력을 갖는 만성 경벽성 염증성 질환이고, UC는 결장의 점막 염증이다. 두가지 상태는 모두 임상적으로 일상의 활동에서의 곤란과 함께 빈번한 장 운동, 영양실조 및 탈수를 특징으로 한다. CD는 빈번하게 흡수장애, 협착 및 누공의 발생으로 인한 합병증이 나타나고, 반복적인 수술을 요구할 수 있다. UC는 덜 빈번하게 중증 혈성 설사 및 독성 거대결장증으로 인한 합병증이 나타날 수 있고, 또한 수술을 요구할 수 있다. IBD 상태는 둘 다 GI관의 악성종양에 대한 증가된 위험과 연관된다. IBD의 병인은 복합적이며, 발병기전의 다수의 측면은 분명하지 않은 채로 남아 있다.
코르티코스테로이드를 사용하는 통상의 요법 및 면역조절제 요법 (예를 들어, 아자티오프린, 6 메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트)이 부작용 및 불내성과 연관되고, 유지 요법 (스테로이드)에서 입증된 이익을 나타내지 않았기 때문에, 중등도 내지 중증의 IBD의 치료는 치료하는 의사에게 중요한 도전과제를 제시한다. 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)를 표적화하는 모노클로날 항체, 예컨대 인플릭시맙 (키메라 항체) 및 아달리무맙 (완전 인간 항체)은 현재 CD의 관리에 사용된다. 인플릭시맙은 또한 UC에서 효능을 나타내었으며, 사용에 대해 승인을 받았다. 그러나, CD를 갖는 환자의 대략 10%-20%는 항 TNF 요법에 대한 일차 무반응자이고, CD 환자의 또 다른 ~20%-30%는 시간이 지남에 따라 반응을 상실한다 (Schnitzler et al., Gut 58:492-500 (2009)). 항 TNF와 연관된 다른 유해 사례 (AE)는 상승된 비율의 박테리아 감염 (결핵 포함), 및 보다 드물게는 림프종 및 탈수초화를 포함한다 (Chang et al., Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatology 3:220 (2006); Hoentjen et al., World J. Gastroenterol. 15(17):2067 (2009)). 어떠한 현재 이용가능한 요법도 만성 질환을 갖는 IBD 환자의 20%-30% 초과에서 지속적인 완화를 달성하지 못하였다 (Hanauer et al., Lancet 359:1541-49 (2002); Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)). 또한, 대부분의 환자는 지속적인 무스테로이드 완화 및 점막 치유, 진정한 질환 변경과 상관된 임상 결과를 달성하지 못한다. 따라서, 장기 사용에 대해 최적화된, IBD에서의 보다 표적화된 요법: 항 TNF 치료제에 전혀 반응하지 않거나 또는 시간이 지남에 따라 반응을 상실하는 환자를 비롯한 환자의 보다 큰 비율에서의 지속적인 완화, 특히 무스테로이드 완화 및 장기 합병증의 예방을 갖는 개선된 안전성 프로파일을 개발할 필요가 있다.
인테그린은 백혈구 부착, 신호전달, 증식 및 이동을 비롯한 다수의 세포 과정 뿐만 아니라 유전자 조절에서 역할을 하는 알파/베타 이종이량체 세포 표면 당단백질 수용체이다 (Hynes, R. O., Cell, 1992, 69:11-25; 및 Hemler, M. E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8:365-368). 이들은 내피, 상피 및 세포외 매트릭스 단백질 상의 특징적인 세포 부착 분자 (CAM)에 특이적으로 결합하는 2개의 이종이량체의 비-공유적으로 상호작용하는 α 및 β 막횡단 서브유닛으로 구성된다. 이 방식으로, 인테그린은 고도로 조절된 방식으로 혈액으로부터 거의 모든 조직 부위로의 백혈구의 동원을 보조하여 정상 조직 및 염증 부위로의 백혈구의 귀소에서 역할을 하는 조직-특이적 세포 부착 수용체로서 기능할 수 있다 (von Andrian et al., N Engl J Med 343:1020-34 (2000)). 면역계에서, 인테그린은 염증 과정 동안 백혈구 트래픽킹, 부착 및 침윤에 관여한다 (Nakajima, H. et al., J. Exp. Med., 1994, 179:1145-1154). 인테그린의 차등 발현은 세포의 부착 특성을 조절하고, 상이한 인테그린은 상이한 염증 반응에 관여한다 (Butcher, E. C. et al., Science, 1996, 272:60-66). 베타7 함유 인테그린 (즉, 알파4베타7 및 알파E베타7)은 주로 단핵구, 림프구, 호산구, 호염기구 및 대식세포 상에서 발현되지만, 호중구 상에서는 발현되지 않는다 (Elices, M. J. et al., Cell, 1990, 60:577-584).
α4β7 인테그린은 장 점막 및 연관된 림프성 조직, 예컨대 소장에서의 파이어스(Peyer's) 패치, 대장에서의 림프성 여포 및 장간막 림프절로의 세포의 이동에 중요한 백혈구-귀소 수용체이다. 장에서, 점막 내피에 대한 백혈구 회전 및 정지 부착은 케모카인으로부터의 신호에 의해 개시되고, 점막 어드레신 세포 부착 분자 (MAdCAM)-1-연관된 시알릴 루이스 X를 통해 매개된다. 케모카인 신호전달은 α4β7 인테그린을 낮은 MAdCAM-1 결합 친화도에서 높은 MAdCAM-1 결합 친화도로의 변화를 겪도록 유도한다. 이어서, 백혈구는 혈관 내피를 통한 기저 조직으로의 혈관외유출의 과정을 저지하고 시작한다. 이 혈관외유출 과정은 정상 면역 세포 재순환 상태 및 염증성 상태 둘 다에서 발생한 것으로 여겨진다 (문헌 [von Andrian et al., 상기 문헌]). 침윤물 중 α4β7+ 세포의 수 및 리간드 MAdCAM-1의 발현은 만성 염증의 부위에서, 예컨대 UC 또는 CD를 갖는 환자의 장관에서 보다 높다 (Briskin et al., Am J Pathol 151:97-110 (1997); Souza et al., Gut 45:856-63 (1999)). α4β7은 MAdCAM-1 및 혈관 세포 부착 분자 (VCAM)-1을 발현하는 고내피 세정맥에 우선적으로 결합하고, 뿐만 아니라 세포외 매트릭스 분자 피브로넥틴 단편 CS-1에 결합한다 (Chan et al., J Biol Chem 267:8366-70 (1992); Ruegg et al., J Cell Biol 17:179-89 (1992); Berlin et al., Cell 74:185-95 (1993)). 장 점막 혈관에서 구성적으로 발현되는 MAdCAM-1과 함께, α4β7 인테그린은 백혈구 장 향성에서 선택적 역할을 하지만, 말초 조직 또는 CNS로의 백혈구의 귀소에 기여하는 것으로 보이지는 않는다. 대신에, 말초 림프성 트래픽킹은 VCAM-1과의 α4β1 상호작용과 연관되었다 (Yednock et al., Nature 356:63-6 (1992); Rice et al., Neurology 64:1336-42 (2005)).
T 림프구 상에서 배타적으로 발현되고 점막 조직과 연관되는 β7 인테그린 패밀리의 또 다른 구성원은 αEβ7 인테그린이고, 이는 달리 CD103으로 공지되어 있다. αEβ7 인테그린은 상피 세포 상의 E-카드헤린에 선택적으로 결합하고, 상피내 림프구 구획 내 점막 조직에서의 T 세포의 체류에서 역할을 하는 것으로 제안되었다 (Cepek et al., J Immunol 150:3459-70 (1993); Karecla et al. Eur J Immunol 25:852-6 (1995)). 고유판에서의 αEβ7+ 세포는 스트레스를 받거나 감염된 상피 세포에 대해 세포독성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Hadley et al., J Immunol 159:3748-56 (1997); Buri et al., J Pathol 206:178-85 (2005)). αEβ7의 발현은 CD에서 증가되고 (Elewaut et al., Acta Gastroenterol Belg 61:288-94 (1998); Oshitani et al., Int J Mol Med 12:715-9 (2003)), 항-αEβ7 항체 치료는 마우스에서 실험적 결장염을 감쇠시키는 것으로 보고되었고, 이는 IBD의 실험 모델에서의 αEβ7+ 림프구에 대한 역할을 시사한다 (Ludviksson et al., J Immunol 162:4975-82 (1999)).
알파E베타7에 대한 모노클로날 항체의 투여는 보고에 따르면 IL-2-/- 마우스에서 면역화 유발 결장염을 예방 및 개선하며, 이는 염증성 장 질환의 발병 및 유지가 알파E베타7을 발현하는 고유판 CD4+ 림프구의 결장 국재화에 의존한다는 것을 시사한다 (Ludviksson et al., J Immunol. 1999, 162(8):4975-82). 항-α4 항체 (나탈리주맙)는 보고에 따르면 CD를 갖는 환자의 치료에서 효능을 가지며 (Sandborn et al., N Engl J Med 2005;353:1912-25), 항-α4β7 항체 (MLN-02, MLN0002, 베돌리주맙)는 보고에 따르면 UC를 갖는 환자에서 효과적이다 (Feagan et al., N Engl J Med 2005;352:2499-507). 이러한 발견은 치료 표적으로서의 α4β7을 검증하고, α4β7과 MAdCAM-1 사이의 상호작용이 IBD의 발병기전을 매개한다는 발상을 뒷받침한다. 따라서, 베타7 인테그린의 길항제는 IBD를 치료함에 있어 치료제로서 큰 잠재력을 갖는다.
β7 인테그린 서브유닛에 대해 표적화된 인간화 모노클로날 항체는 이전에 기재되었다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO2006/026759를 참조한다. 하나의 이러한 항체인 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)은 래트 항-마우스/인간 모노클로날 항체 FIB504로부터 유래된다 (Andrew et al. 1994). 이는 인간 IgG1-중쇄 및 κ1-경쇄 프레임워크를 포함하도록 조작되었다. 국제 특허 공개 번호 WO2006/026759.
rhuMAb 베타7은 α4β7 (Holzmann et al., Cell 56:37-46 (1989); Hu et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:8254-8 (1992)) 및 αEβ7 (Cepek et al., J Immunol 150:3459-70 (1993))에 결합하고, 이는 장 점막에서 각각 림프구 하위세트의 트래픽킹 및 체류를 조절한다. 임상 연구는 CD의 치료에 대한 항-α4 항체 (나탈리주맙)의 효능을 입증하였고 (Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)), UC의 치료에서의 항 α4β7 항체 (LDP02/MLN02/MLN0002/베돌리주맙)에 대한 고무적인 결과가 보고되었다 (Feagan et al., N Engl J Med 352:2499-507 (2005)). 이러한 발견은 잠재적 치료 표적으로서의 α4β7을 검증하는 것을 돕고, α4β7과 점막 어드레신 세포 부착 분자 1 (MAdCAM 1) 사이의 상호작용이 염증성 장 질환 (IBD)의 발병기전에 기여한다는 가설을 뒷받침한다.
α4에 결합하고, 이에 따라 α4β1 및 α4β7 둘 다에 결합하는 나탈리주맙과는 달리, rhuMAb 베타7은 α4β7 및 αEβ7의 β7 서브유닛에 특이적으로 결합하고, α4 또는 β1 인테그린 개별 서브유닛에 결합하지 않는다. 이는 항체가 100 nM만큼 높은 농도에서도 혈관 세포 부착 분자 1 (VCAM 1)에 대한 α4β1+α4β7- 라모스 세포의 부착을 억제하는 능력이 없는 것에 의해 입증되었다. 중요하게, rhuMAb 베타7의 이 특성은 선택성을 나타낸다: α4β1을 발현하지만 β7은 발현하지 않는 T 세포 하위세트는 rhuMAb 베타7에 의해 직접적으로 영향을 받지 않아야 한다.
백혈구 귀소에 대한 rhuMAb 베타7의 장-특이적 효과에 대한 뒷받침은 여러 생체내 비임상 연구로부터 비롯된다. CD45RB높음CD4+ T 세포로 재구성된 중증 복합 면역결핍 (SCID) 마우스 (결장염의 동물 모델)에서, rhuMAb 베타7은 염증성 결장으로의 방사성표지된 림프구 귀소를 차단하였지만 말초 림프성 기관인 비장으로의 귀소는 차단하지 않았다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO2006/026759를 참조한다. 또한, 래트-마우스 키메라 항-뮤린 β7 (항 β7, muFIB504)은 다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌염 (EAE)을 앓는 미엘린 염기성 단백질 T 세포 수용체 (MBP-TCR) 트랜스제닉 마우스에서 조직학적 중추 신경계 (CNS) 염증 정도를 감소시키거나 또는 질환 생존을 개선할 수 없었다. Id. 추가로, 시노몰구스 원숭이에서의 두 안전성 연구에서, rhuMAb 베타7은 대체로 인간에서의 장-귀소 기억/이펙터 T 세포와 표현형적으로 유사한 하위세트인 CD45RA-β7높음 말초 혈액 T 세포에서의 현저한 (대략 3 내지 6배) 증가로 인한 말초 혈액 림프구 수에서의 중간 정도의 증가를 유도하였다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO2009/140684; 문헌 [Stefanich et al., Br. J. Pharmacol. 162:1855-1870 (2011)]을 참조한다. 대조적으로, rhuMAb 베타7은 인간에서의 나이브 T 세포와 표현형적으로 유사한 하위세트인 CD45RA+β7 중간 말초 혈액 T 세포의 수에 대해 최소한의 영향을 미치거거 전혀 영향을 미치지 않았고, 인간에서의 말초 귀소 기억/이펙터 T 세포와 표현형적으로 유사한 하위세트인 CD45RA-β7낮음 말초 혈액 T 세포의 수에 대해 전혀 영향을 미치지 않았으며, 이에 의해 장 귀소 림프구 하위집단에 대한 rhuMAb 베타7의 특이성이 확인된다. (국제 특허 공개 번호 WO2009/140684; Stefanich et al., Br. J. Pharmacol. 162:1855-1870 (2011)).
원하는 효과 및/또는 효능을 갖는 요법을 설계하기 위해, 치료제, 예컨대 베타7 인테그린 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자의 반응성을 평가하는 것이 중요하다. 또한, 효능을 제공할 것이거나 또는 제공할 가능성이 있는 베타7 인테그린 길항제의 최적 투약 및 투여 요법을 결정하는 것이 중요하다. 따라서, 치료제를 사용하는 치료에 대한 환자의 반응성을 정확하게 추적하고/거나 모니터링하는데 사용될 수 있는 바이오마커를 개발하는 것이 요망된다. 이러한 바이오마커는 임상 시험 연구의 인간 환자 및 질환 치료에 효과적인 치료 및 투여 요법을 설계하는데 특히 유용할 것이다.
본원에 기재된 본 발명은 특정의 상기 기재된 필요성을 충족시키며, 다른 이익을 제공한다.
특허 출원 및 공개를 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 임의의 목적을 위해 그의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 방법은 적어도 부분적으로 인테그린 베타7 길항제 (예를 들어, 항-베타7 항체)-치료 환자의 결장 조직으로부터 수득한 림프구 상에서의 αEβ7을 비롯한 수용체를 함유하는 인테그린 베타7-서브유닛의 수용체 점유 및 세포 표면 발현을 유동 세포측정법 방법에 의해 평가할 수 있다는 발견에 기초한다. 또한, 놀랍게도, 치료받는 환자의 말초부에서 림프구 베타7 수용체를 포화시킬 수 있는 항-베타7 항체 혈청 농도는 (결장의) 질환 부위에서 림프구 베타7 수용체를 포화시킬 수 있는 항-베타7 항체 혈청 농도와 본질적으로 동일하다. 따라서, 말초 혈액에서의 베타7 수용체 점유율은 결장 조직에서의 베타7 수용체 점유율의 대용적 지표이다. 추가로, 본 발명의 방법은 적어도 부분적으로 인테그린 수용체 리간드, 림프구 유전자, 및 시토카인 유전자의 유전자 발현 수준 뿐만 아니라 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수가 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료 후에 변화한다는 발견에 기초한다.
한 측면에서, 환자에서의 위장 염증성 장애의 치료를 위한 인테그린 베타7 길항제의 효능을 결정 또는 모니터링하거나 또는 상기 효능을 결정 또는 모니터링하는 것을 돕는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 길항제를 사용하는 치료 후 또는 치료 도중의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 치료 전의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 치료 전과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 바이오마커의 양의 변화는 환자에서의 위장 장애의 치료를 위한 길항제의 효능을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 및 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 상기 바이오마커의 조합이 평가된다. 특정 실시양태에서, 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율, 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 및 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수로부터 선택된 바이오마커 중 하나 이상을 사용하는 상기 언급된 방법이 효능의 하나 이상의 추가의 바이오마커와 조합된다. 특정 실시양태에서, 효능의 하나 이상의 추가의 바이오마커는 제6주에서의 임상 완화, 제10주에서의 임상 완화, 제6주에서의 임상 반응, 제10주에서의 임상 반응, 제6주에서의 0의 내시경검사 스코어 및 직장 출혈 스코어, 제10주에서의 0의 내시경검사 및 직장 출혈 스코어, 및 반응 또는 완화를 달성한 후 UC의 급성악화까지의 시간으로부터 선택된 하나 이상의 임상 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체는 αEβ7 수용체 또는 α4β7 수용체이다. 한 실시양태에서, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율은, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율과 본질적으로 동일한 것으로 이전에 결정된 말초 혈액 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율을 측정하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체의 점유율은 림프구를 인테그린 베타7 길항제와 동일한 에피토프에 결합하는 표지된 항-베타7 항체와 인큐베이션하는 것, 림프구를 세척하는 것, 및 유동 세포측정법에 의해 표지된 림프구의 백분율을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 표지는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌 (APC), 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP), PE-Cy7, APC-Cy7 및 APC-H7로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 에트롤리주맙이고, 표지된 항-베타7 항체는 에트롤리주맙 또는 FIB504이다. 일부 실시양태에서, 인테그린 수용체 리간드, MadCAM-1의 유전자 발현 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, 인테그린 수용체 리간드, E-카드헤린의 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, CD19, CD8, 및 CD3엡실론으로부터 선택된 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, IL-1β, IL-6, IL-12-p40, IL-17A, IL-17-F, IL-23A, IFNγ 및 TNFα로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준이 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현의 수준이 결장 생검 조직에서 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현의 수준이 qPCR에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 바이오마커의 변화는 증가 또는 감소이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 100일 이내에 측정된다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 제43일 및 제71일에 측정되거나 또는 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 제6주 및 제10주에 측정된다. 한 실시양태에서, 위장 염증성 장애는 염증성 장 질환이다. 예시적인 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 및 크론병을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자는 인간이다.
또 다른 측면에서, 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료에 대한 위장 염증성 장애를 갖는 환자의 반응성을 결정 또는 모니터링하거나 또는 상기 반응성을 결정 또는 모니터링하는 것을 돕는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 길항제를 사용하는 치료 후 또는 치료 도중의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 치료 전의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 치료 전과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 바이오마커의 양의 변화는 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자의 반응성을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 및 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 상기 바이오마커의 조합이 평가된다. 특정 실시양태에서, 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율, 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 및 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수로부터 선택된 바이오마커 중 하나 이상을 사용하는 상기 언급된 방법이 효능의 하나 이상의 추가의 바이오마커와 조합된다. 특정 실시양태에서, 효능의 하나 이상의 추가의 바이오마커는 제6주에서의 임상 완화, 제10주에서의 임상 완화, 제6주에서의 임상 반응, 제10주에서의 임상 반응, 제6주에서의 0의 내시경검사 스코어 및 직장 출혈 스코어, 제10주에서의 0의 내시경검사 및 직장 출혈 스코어, 및 반응 또는 완화를 달성한 후 UC의 급성악화까지의 시간으로부터 선택된 하나 이상의 임상 바이오마커이다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체는 αEβ7 수용체 또는 α4β7 수용체이다. 한 실시양태에서, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율은, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율과 본질적으로 동일한 것으로 이전에 결정된 말초 혈액 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율을 측정하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체의 점유율은 림프구를 인테그린 베타7 길항제와 동일한 에피토프에 결합하는 표지된 항-베타7 항체와 인큐베이션하는 것, 림프구를 세척하는 것, 및 유동 세포측정법에 의해 표지된 림프구의 백분율을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 표지는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌 (APC), 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP), PE-Cy7, APC-Cy7 및 APC-H7로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 에트롤리주맙이고, 표지된 항-베타7 항체는 에트롤리주맙 또는 FIB504이다. 일부 실시양태에서, 인테그린 수용체 리간드, MadCAM-1의 유전자 발현 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, 인테그린 수용체 리간드, E-카드헤린의 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, CD19, CD8, 및 CD3엡실론으로부터 선택된 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, IL-1β, IL-6, IL-12-p40, IL-17A, IL-17-F, IL-23A, IFNγ 및 TNFα로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준이 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현의 수준이 결장 생검 조직에서 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현의 수준이 qPCR에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 바이오마커의 변화는 증가 또는 감소이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 100일 이내에 측정된다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 제43일 및 제71일에 측정되거나 또는 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 제6주 및 제10주에 측정된다. 한 실시양태에서, 위장 염증성 장애는 염증성 장 질환이다. 예시적인 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 및 크론병을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자는 인간이다.
또 다른 측면에서, 위약-대조 임상 시험 중인 길항제-치료 환자에서의 위장 염증성 장애의 치료를 위한 인테그린 베타7 길항제의 효능을 결정 또는 모니터링하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 길항제를 사용하는 치료 후 또는 치료 도중의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 위약-치료 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 위약-치료 환자에서의 바이오마커의 양과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 길항제-치료 환자에서의 바이오마커의 양의 변화는 길항제-치료 환자에서의 위장 장애의 치료를 위한 길항제의 효능을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 및 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체는 αEβ7 수용체 또는 α4β7 수용체이다. 한 실시양태에서, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율은, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율과 본질적으로 동일한 것으로 이전에 결정된 말초 혈액 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율을 측정하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체의 점유율은 림프구를 인테그린 베타7 길항제와 동일한 에피토프에 결합하는 표지된 항-베타7 항체와 인큐베이션하는 것, 림프구를 세척하는 것, 및 유동 세포측정법에 의해 표지된 림프구의 백분율을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 표지는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌 (APC), 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP), PE-Cy7, APC-Cy7 및 APC-H7로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 에트롤리주맙이고, 표지된 항-베타7 항체는 에트롤리주맙 또는 FIB504이다. 일부 실시양태에서, 인테그린 수용체 리간드, MadCAM-1의 유전자 발현 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, 인테그린 수용체 리간드, E-카드헤린의 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, CD19, CD8, 및 CD3엡실론으로부터 선택된 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, IL-1β, IL-6, IL-12-p40, IL-17A, IL-17-F, IL-23A, IFNγ 및 TNFα로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준이 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현의 수준이 결장 생검 조직에서 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현의 수준이 qPCR에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 바이오마커의 변화는 증가 또는 감소이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 100일 이내에 측정된다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 제43일 및 제71일에 측정되거나 또는 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 제6주 및 제10주에 측정된다. 특정 실시양태에서, 상기 바이오마커의 조합이 평가된다. 특정 실시양태에서, 방법은 제6주에서의 임상 완화, 제10주에서의 임상 완화, 제6주에서의 임상 반응, 제10주에서의 임상 반응, 제6주에서의 0의 내시경검사 스코어 및 직장 출혈 스코어, 제10주에서의 0의 내시경검사 및 직장 출혈 스코어, 및 반응 또는 완화를 달성한 후 UC의 급성악화까지의 시간으로부터 선택된 효능의 하나 이상의 임상 바이오마커를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 위장 염증성 장애는 염증성 장 질환이다. 예시적인 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 및 크론병을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자는 인간이다.
또 다른 측면에서, 위약-대조 임상 시험 중인 위장 염증성 장애를 갖는 환자의 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료에 대한 반응성을 결정 또는 모니터링하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 길항제를 사용하는 치료 후 또는 치료 도중의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 위약-치료 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 위약-치료 환자에서의 바이오마커의 양과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 길항제-치료 환자에서의 바이오마커의 양의 변화는 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자의 반응성을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 및 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체는 αEβ7 수용체 또는 α4β7 수용체이다. 한 실시양태에서, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율은, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율과 본질적으로 동일한 것으로 이전에 결정된 말초 혈액 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율을 측정하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체의 점유율은 림프구를 인테그린 베타7 길항제와 동일한 에피토프에 결합하는 표지된 항-베타7 항체와 인큐베이션하는 것, 림프구를 세척하는 것, 및 유동 세포측정법에 의해 표지된 림프구의 백분율을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 표지는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌 (APC), 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP), PE-Cy7, APC-Cy7 및 APC-H7로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 에트롤리주맙이고, 표지된 항-베타7 항체는 에트롤리주맙 또는 FIB504이다. 일부 실시양태에서, 인테그린 수용체 리간드, MadCAM-1의 유전자 발현 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, 인테그린 수용체 리간드, E-카드헤린의 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, CD19, CD8, 및 CD3엡실론으로부터 선택된 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, IL-1β, IL-6, IL-12-p40, IL-17A, IL-17-F, IL-23A, IFNγ 및 TNFα로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준이 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현의 수준이 결장 생검 조직에서 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현의 수준이 qPCR에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 바이오마커의 변화는 증가 또는 감소이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 100일 이내에 측정된다. 특정 실시양태에서, 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 제43일 및 제71일에 측정되거나 또는 바이오마커는 길항제의 제1 용량을 투여한 후 제6주 및 제10주에 측정된다. 특정 실시양태에서, 상기 바이오마커의 조합이 평가된다. 특정 실시양태에서, 방법은 제6주에서의 임상 완화, 제10주에서의 임상 완화, 제6주에서의 임상 반응, 제10주에서의 임상 반응, 제6주에서의 0의 내시경검사 스코어 및 직장 출혈 스코어, 제10주에서의 0의 내시경검사 및 직장 출혈 스코어, 및 반응 또는 완화를 달성한 후 UC의 급성악화까지의 시간으로부터 선택된 효능의 하나 이상의 임상 바이오마커를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 위장 염증성 장애는 염증성 장 질환이다. 예시적인 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 및 크론병을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자는 인간이다.
또 다른 측면에서, 환자에서의 위장 염증성 장애의 치료를 위한 인테그린 베타7 길항제의 투약법을 결정하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 길항제의 투약 또는 투여 요법을 이용하는 치료 후 또는 치료 도중의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 치료 전의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교한 결과에 기초하여 길항제의 투약법을 조정하는 단계를 포함하며, 여기서 치료 전과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 바이오마커의 양의 변화는 환자에서의 위장 장애의 치료를 위한 길항제의 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 그에 대한 반응성을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체는 αEβ7 수용체 또는 α4β7 수용체이다. 한 실시양태에서, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율은, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율과 본질적으로 동일한 것으로 이전에 결정된 말초 혈액 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율을 측정하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체의 점유율은 림프구를 인테그린 베타7 길항제와 동일한 에피토프에 결합하는 표지된 항-베타7 항체와 인큐베이션하는 것, 림프구를 세척하는 것, 및 유동 세포측정법에 의해 표지된 림프구의 백분율을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 표지는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌 (APC), 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP), PE-Cy7, APC-Cy7 및 APC-H7로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 에트롤리주맙이고, 표지된 항-베타7 항체는 에트롤리주맙 또는 FIB504이다. 한 실시양태에서, 점유율의 변화는 증가 또는 감소이다. 한 실시양태에서, 점유율은 길항제의 제1 용량을 투여한 후 100일 이내에 측정된다. 한 실시양태에서, 점유율은 제43일 및 제71일에 측정된다. 한 실시양태에서, 위장 염증성 장애는 염증성 장 질환이다. 예시적인 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 및 크론병을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자는 인간이다. 한 실시양태에서, 길항제는 항-베타7 항체이고, 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 그에 대한 반응성을 나타내는 것으로 결정된 투약 또는 투여 요법은 420 mg 항-베타7 항체의 제1 부하 용량의 피하 투여, 이어서 2주 후에 315 mg 항-베타7 항체의 제1 유지 용량 (또는 300 mg의 공칭 용량)의 피하 투여, 이어서 315 mg 항-베타7 항체의 하나 이상의 후속 유지 용량 (또는 300 mg의 공칭 용량)의 피하 투여를 포함하고, 여기서 각각의 후속 유지 용량은 이전 유지 용량 4주 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 그에 대한 반응성을 나타내는 것으로 결정된 투약 또는 투여 요법은 4주마다 105 mg 항-베타7 항체 (또는 100 mg의 공칭 용량) 또는 2주마다 50 mg 항-베타7 항체 (공칭 용량)의 피하 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-베타7 항체는 에트롤리주맙이다.
또 다른 측면에서, 환자에서의 위장 염증성 장애의 치료를 위한 인테그린 베타7 길항제의 투여 요법을 결정하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 길항제의 투여 요법을 이용하는 치료 후 또는 치료 도중의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 치료 전의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교한 결과에 기초하여 길항제의 투여 요법을 조정하는 것을 포함하며, 여기서 치료 전과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 바이오마커의 양의 변화는 환자에서의 위장 장애의 치료를 위한 길항제의 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 그에 대한 반응성을 나타내고, 여기서 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체는 αEβ7 수용체 또는 α4β7 수용체이다. 한 실시양태에서, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율은, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율과 본질적으로 동일한 것으로 이전에 결정된 말초 혈액 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율을 측정하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체의 점유율은 림프구를 인테그린 베타7 길항제와 동일한 에피토프에 결합하는 표지된 항-베타7 항체와 인큐베이션하는 것, 림프구를 세척하는 것, 및 유동 세포측정법에 의해 표지된 림프구의 백분율을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 표지는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌 (APC), 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP), PE-Cy7, APC-Cy7 및 APC-H7로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 인테그린 베타7 길항제는 에트롤리주맙이고, 표지된 항-베타7 항체는 에트롤리주맙 또는 FIB504이다. 한 실시양태에서, 점유율의 변화는 증가 또는 감소이다. 한 실시양태에서, 점유율은 길항제의 제1 용량을 투여한 후 100일 이내에 측정된다. 한 실시양태에서, 점유율은 제43일 및 제71일에 측정된다. 한 실시양태에서, 위장 염증성 장애는 염증성 장 질환이다. 예시적인 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 및 크론병을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자는 인간이다. 한 실시양태에서, 길항제는 항-베타7 항체이고, 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 그에 대한 반응성을 나타내는 것으로 결정된 투약 또는 투여 요법은 420 mg 항-베타7 항체의 제1 부하 용량의 피하 투여, 이어서 2주 후에 315 mg 항-베타7 항체의 제1 유지 용량 (또는 300 mg의 공칭 용량)의 피하 투여, 이어서 315 mg 항-베타7 항체의 하나 이상의 후속 유지 용량 (또는 300 mg의 공칭 용량)의 피하 투여를 포함하고, 여기서 각각의 후속 유지 용량은 이전 유지 용량 4주 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 그에 대한 반응성을 나타내는 것으로 결정된 투약 또는 투여 요법은 4주마다 105 mg 항-베타7 항체 (또는 100 mg의 공칭 용량) 또는 2주마다 50 mg 항-베타7 항체 (공칭 용량)의 피하 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-베타7 항체는 에트롤리주맙이다.
상기 기재된 방법의 특정 측면에서, 인테그린 베타7 길항제는 모노클로날 항-베타7 항체이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 항-베타7 항체는 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하며, 여기서
(i) HVR-L1은 아미노산 서열 A1-A11을 포함하고, 여기서 A1-A11은 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8), 또는 RASESVDDLLH (서열 9) 또는 서열 1, 7, 8 또는 9의 변이체 (서열 26)이고, 여기서 아미노산 A2는 A, G, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A3은 S, G, I, K, N, P, Q, R, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되거/거나 A4는 E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N, 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A5는 S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A6은 V, R, I, A, G, K, L, M, 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A7은 D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A8은 D, G, N, E, T, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A9는 L, Y, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A10은 L, A, I, M, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A11은 H, Y, F, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(ii) HVR-L2는 아미노산 서열 B1-B8을 포함하고, 여기서 B1-B8은 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 20), 또는 XaaYASQSIS (서열 21, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄) 또는 서열 2, 20 또는 21의 변이체 (서열 27)이고, 여기서 아미노산 B1은 K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 및 Xaa (여기서 Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 B4는 S 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 B5는 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 B6은 S, D, L, 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 B7은 I, V, E, 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(iii) HVR-L3은 아미노산 서열 C1-C9를 포함하고, 여기서 C1-C9는 QQGNSLPNT (서열 3) 또는 서열 3의 변이체 (서열 28)이고, 여기서 아미노산 C8은 N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(iv) HVR-H1은 아미노산 서열 D1-D10을 포함하고, 여기서 D1-D10은 GFFITNNYWG (서열 4)이고;
(v) HVR-H2는 아미노산 서열 E1-E17을 포함하고, 여기서 E1-E17은 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5), 또는 서열 5의 변이체 (서열 29)이고, 여기서 아미노산 E2는 Y, F, V, 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 E6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 E10은 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 E12는 N, T, A, 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 13은 P, H, D, 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 E15는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 E17은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(vi) HVR-H3은 아미노산 서열 F2-F11을 포함하고, 여기서 F2-F11은 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 19)이거나; 또는 아미노산 서열 F1-F11을 포함하고, 여기서 F1-F11은 AMTGSSGYFDF (서열 16), ARTGSSGYFDF (서열 17), 또는 AQTGSSGYFDF (서열 18), 또는 서열 6, 16, 17, 18, 또는 19의 변이체 (서열 30)이고, 여기서 아미노산 F2는 R, M, A, E, G, Q, S이고/거나 아미노산 F11은 F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1-H3) 서열 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1-L3) 서열을 포함하며, 여기서
(i) HVR-L1은 서열 7, 서열 8 또는 서열 9를 포함하고;
(ii) HVR-L2는 서열 2를 포함하고;
(iii) HVR-L3은 서열 3을 포함하고;
(iv) HVR-H1은 서열 4를 포함하고;
(v) HVR-H2는 서열 5를 포함하고;
(vi) HVR-H3은 서열 6 또는 서열 16 또는 서열 17 또는 서열 19를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-베타7 항체는 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서 항-베타7 항체는 에트롤리주맙 (또한, rhuMAb 베타7로 지칭됨)이다.
도 1a 및 1b는 하기 컨센서스 서열 및 항-베타7 서브유닛 항체 서열에 대한 가변 경쇄 및 중쇄의 서열의 정렬을 보여준다: 경쇄 인간 하위군 카파 I 컨센서스 서열 (도 1a, 서열 12), 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 서열 (도 1b, 서열 13), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 경쇄 (도 1a, 서열 10), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 중쇄 (도 1b, 서열 11), 및 인간화 항체 변이체: 인간화 hu504K 이식편 가변 경쇄 (도 1a, 서열 14), 인간화 hu504K 이식편 가변 중쇄 (도 1b, 서열 15), 변이체 hu504-5, hu504-16, 및 hu504-32 (인간화 hu504K 이식편으로부터의 아미노산 변이는 도 1a에 나타냄) (경쇄) (출현 순서대로 각각 서열 22-24), 및 도 1b (중쇄)에서, 변이체 hu504-5, hu504-16, 및 hu504-32 (서열 25).
도 2a는 실시예 1에 기재된 점유 검정의 개략도를 보여준다.
도 2b는 실시예 1에 기재된 발현 검정 (또한, MOA 검정으로 지칭됨)의 개략도를 보여준다.
도 3a는 실시예 1에 기재된 바와 같은 말초 혈액 T 세포의 표현형 세부분류를 보여준다.
도 3b는 실시예 1에 기재된 바와 같은 말초 혈액 B 세포의 표현형 세부분류를 보여준다.
도 4a는 실시예 1에 기재된 바와 같은 2가지 상이한 투여 요법에 따른 위약 (pbo) 또는 에트롤리주맙 투여 후의 환자 샘플에서 말초 혈액 T 세포 (CD3+, CD4+, CD45RA-, 베타7높음) 상에서의 인테그린 베타7 점유율을 보여준다. 기준선의 백분율 (%BL)로 표현된 군 평균 절대 계수치는 평균으로부터의 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 제시된다. 개방형 원이 있는 실선 (pbo), 점묘 원이 있는 점-파선 (100 mg 에트롤리주맙), 폐쇄형 원이 있는 파선 (300mg + LD 에트롤리주맙). 실선 화살표는 치료 아암에 따른 에트롤리주맙 또는 pbo 투여를 나타내고; 파선 화살표는 모든 아암에서의 위약 투여를 나타낸다.
도 4b는 실시예 1에 기재된 바와 같은 2가지 상이한 투여 요법에 따른 위약 (pbo) 또는 에트롤리주맙 투여 후의 환자 샘플에서 말초 혈액 T 세포 (CD3+, CD4-, CD45RA-, 베타7높음) 상에서의 인테그린 베타7 점유율을 보여준다. 기준선의 백분율 (%BL)로 표현된 군 평균 절대 계수치는 평균으로부터의 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 제시된다. 개방형 원이 있는 실선 (pbo), 점묘 원이 있는 점-파선 (100 mg 에트롤리주맙), 폐쇄형 원이 있는 파선 (300mg + LD 에트롤리주맙). 실선 화살표는 치료 아암에 따른 에트롤리주맙 또는 pbo 투여를 나타내고; 파선 화살표는 모든 아암에서의 위약 투여를 나타낸다.
도 4c는 실시예 1에 기재된 바와 같은 2가지 상이한 투여 요법에 따른 위약 (pbo) 또는 에트롤리주맙 투여 후의 환자 샘플에서 말초 혈액 B 세포 (CD19+, IgD-, 베타7높음) 상에서의 인테그린 베타7 점유율을 보여준다. 기준선의 백분율 (%BL)로 표현된 군 평균 절대 계수치는 평균으로부터의 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 제시된다. 개방형 원이 있는 실선 (pbo), 점묘 원이 있는 점-파선 (100 mg 에트롤리주맙), 폐쇄형 원이 있는 파선 (300mg + LD 에트롤리주맙). 실선 화살표는 치료 아암에 따른 에트롤리주맙 또는 pbo 투여를 나타내고; 파선 화살표는 모든 아암에서의 위약 투여를 나타낸다.
도 5는 실시예 1에 기재된 바와 같은 2가지 상이한 투여 요법에 따른 위약 (pbo) 또는 에트롤리주맙 투여 후의 환자 샘플에서 말초 혈액 점막 (장) 귀소 T 및 B 세포 상에서의 인테그린 베타7 발현을 보여준다. 기준선으로부터의 변화로 표현된 군 중앙 절대 계수치는 중앙값으로부터의 절대 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 제시된다. (a) 점막 (장) 귀소 CD3+CD4+ T 세포; (b) 점막 (장) 귀소 CD3+ CD4- T 세포; (c) 점막 (장) 귀소 CD19+ B 세포. 개방형 원이 있는 실선 (pbo), 점묘 원이 있는 점-파선 (100 mg 에트롤리주맙), 폐쇄형 원이 있는 파선 (300mg + LD 에트롤리주맙). 실선 화살표는 치료 아암에 따른 에트롤리주맙 또는 pbo 투여를 나타내고; 파선 화살표는 모든 아암에서의 위약 투여를 나타낸다.
도 6은 실시예 1에 기재된 바와 같은 에트롤리주맙을 사용하는 치료 전의 환자로부터의 결장 생검 샘플로부터 수득한 CD45+, CD3+, CD4- T 림프구 상에서의 세포 표면 αEβ7 발현의 대표적인 FACS 도트 플롯을 보여준다. 에트롤리주맙을 투여하기 전의 환자로부터의 T 림프구의 FACS 플롯: αE 수준이 수직 축 상에 제시되고, 표지된 FIB504 항체 (경쟁 항체)를 사용하여 결정된 바와 같은 β7 수준은 수평 축 상에 제시되고, 박스표시된 상부 우측 사분면은 αE+ 및 β7+ 둘 다 인 세포로부터의 신호를 보여준다.
도 7은 실시예 1에 기재된 바와 같은 100 mg의 에트롤리주맙의 단일 용량 또는 위약을 사용하는 치료 전 및 치료 후의 환자로부터 수득한 결장 생검 샘플로부터 수득한 CD45+, CD3+, CD4- T 림프구 상에서의 세포 표면 αEβ7 점유율의 대표적인 FACS 도트 플롯을 보여준다. αE 수준은 수직 축 상에 제시되고, 표지된 FIB504 항체 (경쟁 항체)를 사용하여 결정된 바와 같은 β7 수준은 수평 축 상에 제시되고, 상부 우측 사분면은 αE+ 및 β7+ 둘 다인 세포로부터의 신호를 보여주고; 두 마커에 대해 양성인 세포 염색의 백분율을 나타낸다. 좌측 상의 플롯은 에트롤리주맙을 투여한 환자에 대한 FACS 도트 플롯을 보여주고; 우측 상의 플롯은 위약을 투여한 환자에 대한 FACS 도트 플롯을 보여준다. 상부 플롯은 투여 전을 보여주고; 중간 플롯은 제43일을 보여주고, 하부 플롯은 제71일을 보여준다. 여기서 제시된 바와 같은 유사한 결과를 에트롤리주맙 또는 위약을 투여한 다른 환자로부터 얻었다.
도 8a-e는 실시예 1에 기재된 바와 같은 에트롤리주맙 또는 위약을 사용하는 치료 전, 치료 도중 및/또는 치료 후의 환자로부터 얻은 결장 생검 샘플로부터 수득한 CD45+, CD3+, CD4- T 림프구 상에서의 베타7 수용체 점유율을 보여준다. 검출가능한 T 림프구의 상실이 점유를 나타낸다. (a) 지시된 바와 같이, "100 mg" 투여 아암, "300 mg + LD" 투여 아암 또는 위약으로 치료받는 환자에 대한 검출가능한 αEβ7+, CD45+, CD3+, CD4- T 림프구의 코호트 중앙 백분율, 개방형 원이 있는 실선 (pbo), 점묘 원이 있는 점-파선 (100 mg 에트롤리주맙), 폐쇄형 원이 있는 파선 (300mg + LD 에트롤리주맙); (b) 지시된 바와 같이, "100 mg" 투여 아암, "300 mg + LD" 투여 아암 또는 위약으로 치료받는 환자에 대한 검출가능한 α4β7+, CD45+, CD3+, CD4- T 림프구의 코호트 중앙 백분율, 개방형 원이 있는 실선 (pbo), 점묘 원이 있는 점-파선 (100 mg 에트롤리주맙), 폐쇄형 원이 있는 파선 (300mg + LD 에트롤리주맙); (c) "100 mg" 용량의 에트롤리주맙 아암에서의 7명의 환자 각각에 대한 검출가능한 αEβ7+, CD45+, CD3+, CD4- T 림프구의 백분율; 오직 단일 용량 (SD)을 제공받은 2명의 환자는 파선으로 나타내고, 이들 중 1명은 항-치료 항체 (ATA) 반응을 갖는다; (d) "300 mg + LD" 아암에서의 7명의 환자 각각에 대한 검출가능한 αEβ7+, CD45+, CD3+, CD4- T 림프구의 백분율; 및 (e) 위약 아암에서의 9명의 환자 각각에 대한 검출가능한 αEβ7+, CD45+, CD3+, CD4- T 림프구의 백분율. 각각의 (c)-(e)에서, TNF-IR 환자는 (*)로 표시된다.
도 9는 실시예 1에 기재된 바와 같은 에트롤리주맙 또는 위약을 사용하는 치료 전 및 치료 후의 임상 완화를 달성하지 못한 환자와 비교하여 임상 완화를 달성한 환자의 결장 생검에서의 인테그린 발현을 보여준다. (a) 스크리닝 (Scr), 제6주 및 제10주에서의 qPCR에 의한 인테그린-β7 발현; (b) 스크리닝 (Scr), 제6주 및 제10주에서의 qPCR에 의한 인테그린-β1 발현; (c) 스크리닝 (Scr), 제6주 및 제10주에서의 qPCR에 의한 인테그린-α4 발현; (d) 스크리닝 (Scr), 제6주 및 제10주에서의 qPCR에 의한 인테그린-αE 발현. 데이터는 군 중앙값 ± 중앙 절대 편차로서 기준선으로부터의 배수 변화 (2- ΔΔCt)로 나타낸다. 단색 원이 있는 파선, 위약 비-완화자; 개방형 원이 있는 실선, 에트롤리주맙-치료 완화자; 점묘 원이 있는 점-파선, 에트롤리주맙-치료 비-완화자.
도 10는 실시예 1에 기재된 바와 같은 장음와 상피의 αE+ 세포에 대한 에트롤리주맙의 효과를 보여준다. (a) 에트롤리주맙 (줄무늬 박스) 또는 위약 (점묘 박스)을 사용하는 치료 전 및 치료 후의 장음와 상피에서의 중앙 αE+ 세포; (b) 장음와 상피에서의 αE+ 세포의 대표적인 IHC 염색.
도 11은 실시예 1에 기재된 바와 같은 장 고유판에서의 αE+ 세포에 대한 에트롤리주맙의 효과를 보여준다. (a) 에트롤리주맙 (줄무늬 박스) 또는 위약 (점묘 박스)을 사용하는 치료 전 및 치료 후의 모든 환자의 장 고유판에서의 평균 αE+ 세포; (b) 임상 완화를 달성하지 못한 환자와 비교한 임상 완화를 달성한 환자에서 에트롤리주맙 또는 위약을 사용하는 치료 전 및 치료 후의 장 고유판에서의 평균 αE+ 세포. 평균, 사분위수 범위 (IQR) 및 범위는 박스 플롯 상에 제시된다: 점묘 박스, 위약 비-완화자; 줄무늬 박스, 에트롤리주맙-치료 완화자; 개방형 박스, 에트롤리주맙-치료 비-완화자.
도 12a는 에트롤리주맙 또는 위약으로 치료받는 비-완화자와 비교하여 완화자의 장음와 상피에서의 αE+ 세포의 면역조직화학 정량화를 보여준다; 평균, 사분위간 범위 (IQR) 및 범위는 박스 플롯 상에 제시된다: 점묘 박스, 에트롤리주맙-치료 완화자; 줄무늬 박스, 에트롤리주맙-치료 비-완화자; 개방형 박스, 위약 비-완화자; 도 12b는 실시예 1에 기재된 바와 같이 임상 완화 상태에 의해 에트롤리주맙 또는 위약을 사용하는 치료 전 및 치료 후의 결장 조직에서의 E-카드헤린 수준을 보여준다; 단색 원이 있는 파선, 위약 비-완화자; 개방형 원이 있는 실선, 에트롤리주맙-치료 완화자; 점묘 원이 있는 점-파선, 에트롤리주맙-치료 비-완화자.
도 13은 실시예 1에 기재된 바와 같은 에트롤리주맙 또는 위약을 사용하는 치료 전 및 치료 후의 임상 완화를 달성하지 못한 환자와 비교하여 임상 완화를 달성한 환자의 결장 생검에서의 림프구 하위세트에 대한 MAdCAM-1, 시토카인 및 마커의 발현을 보여준다. 발현은 qPCR에 의해 정량화하였고, 데이터는 배수 변화 (2- Δ ΔCt) 군 중앙값 ± 중앙 절대 편차 (MAD)로 제시된다. (a) IL-17F; (b) IL-1β; (c) IL-12p40; (d) IL-6; (e) TNFα; (f) CD19; (g) CD4; (h) CD8; (i) CD3ε; (j) MAdCAM-1; (k) IL-17A; (l) IL-23A; (m) IFNγ. 단색 원이 있는 파선, 위약 비-완화자; 개방형 원이 있는 실선, 에트롤리주맙-치료 완화자; 점묘 원이 있는 점-파선, 에트롤리주맙-치료 비-완화자.
도 14는 실시예 1에 기재된 바와 같이 100 mg 에트롤리주맙 q4w 또는 300 mg 에트롤리주맙 q4w + 제43일 및 제71일에 부하 용량으로 치료받는 환자에서 결장 림프구 베타7 수용체 점유에 비교한 에트롤리주맙의 혈청 농도를 보여준다. TNF-IR 환자는 오직 단일 용량을 제공받은 2명의 환자를 나타낸다. 화살표는 오직 2회 용량을 제공받은 1명의 환자를 가리킨다.
도 15는 에트롤리주맙의 가변 경쇄 영역 (a) (서열 31) 및 가변 중쇄 영역 (b) (서열 32)을 보여준다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 및 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 통상의 기술자에게 본원에 사용된 다수의 용어에 대한 일반적 지침을 제공한다.
I. 특정 정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "단백질"에 대한 언급은 복수형의 단백질을 포함하고; "세포"에 대한 언급은 세포의 혼합물을 포함하는 등이다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 제공된 범위는 양쪽 종점 및 이들 종점 사이의 모든 점을 포함한다. 따라서, 예를 들어 2.0 내지 3.0의 범위는 2.0, 3.0, 및 2.0 및 3.0 사이의 모든 점을 포함한다.
"치료"는 치료하고자 하는 개체 또는 세포의 자연 과정을 변경시키기 위한 시도로 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 예방을 위해 수행하거나 임상 병리상태 과정 동안에 수행할 수 있다. 원하는 치료 효과는 질환의 발병 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 예후의 완화 또는 개선을 포함한다.
"치료 요법"은 제2 의약을 부가하거나 부가하지 않으면서, 투여량, 투여 빈도 또는 치료의 지속시간의 조합을 지칭한다.
"유효 치료 요법"은 해당 치료를 받고 있는 환자에게 유익한 반응을 제공하게 될 치료 요법을 지칭한다.
"치료 변형"은 투여량, 투여 빈도, 또는 치료의 지속시간을 변화시키고/거나 제2 의약을 부가하는 것을 포함하여, 치료 요법을 변화시키는 것을 지칭한다.
"환자 반응" 또는 "환자 반응성"은 (1) 질환 진행의 어느 정도까지의 억제, 예컨대 지연 및 완전한 정지; (2) 질환 에피소드 및/또는 증상의 수에서의 감소; (3) 병변 크기에서의 감소; (4) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (5) 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (6) 질환 병변의 퇴행 또는 제거를 일으킬 수 있으나 그래야만 하는 것은 아닌, 자가면역 반응의 감소; (7) 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감; (8) 치료 후 질환 표출이 없는 기간의 증가; 및/또는 (9) 치료 후 주어진 시점에서의 사망률의 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 환자에 대한 이익을 나타내는 임의의 종점을 사용하여 평가될 수 있다. 용어 "반응성"은 완전 반응 (CR) 및 부분 반응 (PR)을 비롯한 측정가능한 반응을 지칭한다.
"완전 반응" 또는 "CR"은 치료에 반응하여 염증의 모든 증상이 사라지거나 완화되는 것을 의도한다. 이는 해당 질병이 치유되는 것을 항상 의미하지는 않는다.
"부분 반응" 또는 "PR"은 치료에 반응하여 염증 중증도가 50% 이상의 감소하는 것을 지칭한다.
인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자의 "유익한 반응" 및 유사한 단어는 항-베타7 인테그린 항체와 같은 길항제를 사용하는 치료로부터 또는 이러한 치료의 결과로서, 위장 염증성 장애에 걸릴 위험이 있거나 이러한 장애를 앓고 있는 환자에게 임상 또는 치료적 이익을 부여하는 것을 지칭한다. 이러한 이익은 길항제를 사용하는 치료로부터 또는 그의 결과로서의 세포 또는 생물학적 반응, 완전 반응, 부분 반응, 안정 질환 (진행 또는 재발이 없음), 또는 환자의 후속 재발이 있는 반응을 포함한다.
환자의 반응성이 치료 과정 동안의 시간에 따라 감소되지 않는 경우에, "이러한 환자는 치료에 대한 반응성을 유지한다".
본원에 사용된 "비-반응" 또는 "반응 결여" 또는 유사한 어구는 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료에 대한 완전 반응, 부분 반응 또는 유익한 반응이 부재함을 의미한다.
용어 "인테그린 베타7 길항제 요법의 효능의 모니터링"은 샘플이 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 요법 전, 요법 도중 및/또는 요법 후의 환자로부터 적어도 1회 (연속 포함) 수득되고, 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율, 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 및 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수로부터 선택된 바이오마커가 이러한 샘플에서 측정되고, 요법 이전, 요법 도중 및/또는 요법 후의 결과를 비교하여, 요법이 효과가 있는지 또는 아닌지 여부에 대한 지표를 수득한다는 것을 나타내는데 사용된다. 요법의 효능의 모니터링에 있어서, 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율, 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 및 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수로부터 선택된 바이오마커의 수준이 측정되고, 이는 한 실시양태에서 동일한 바이오마커에 대한 참조 값과 비교되거나, 또는 추가 실시양태에서 환자가 요법을 받고 있는 동안 또는 요법을 시작하기 전에 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 샘플에서의 동일한 바이오마커의 수준과 비교된다. 한 실시양태에서, 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율, 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 및 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 감소된 수준 또는 증가된 수준, 환자가 이미 요법을 받고 있는 동안 또는 요법을 시작하기 전에 보다 이른 시점에서의 동일한 환자로부터 수득한 샘플에서의 동일한 바이오마커의 수준과 비교하여 바이오마커의, 특히 본원에 추가로 기재된 바와 같이 평가된 바이오마커에 따라, 감소된 수준 또는 증가된 수준은 환자가 요법에 반응한다는 것을 나타낸다.
용어 "진단"은 분자 또는 병리학적 상태, 질환 또는 상태의 확인 또는 분류를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "진단"은 조직/기관 연루 (예를 들어, 염증성 장 질환) 또는 다른 특징 (예를 들어, 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료와 같은 치료에 대한 반응성을 특징으로 하는 환자 하위집단)에 의한, 특정한 유형의 위장 염증성 장애의 확인, 보다 특히 특정한 하위유형의 위장 염증성 장애의 분류를 지칭할 수 있다.
용어 "예후"는, 예를 들어 위장 염증성 장애의 재발, 확산 및 약물 내성을 포함한 질환 증상 가능성을 예측하는 것을 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "샘플" 또는 "시험 샘플"은 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징에 기초하여 특성화 및/또는 확인되는 세포성 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는 관심 대상체로부터 얻거나 상기 대상체로부터 유래된 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 어구 "질환 샘플" 및 그의 변형 표현은 특성화되는 세포성 및/또는 분자 엔티티를 함유하는 것으로 예상되거나 공지된 관심 대상으로부터 얻은 임의의 샘플을 의미한다. 이러한 샘플은 관심 대상체에 대한 조직 또는 대상체의 말초 혈액으로부터 수득할 수 있다.
본원에 사용된 "참조 샘플"은 비교 목적으로 사용되는 임의의 샘플, 표준물, 또는 수준을 지칭한다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 환자 신체의 건강하고/거나 질환에 걸리지 않은 부분 (예를 들어, 조직 또는 세포)으로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 환자 신체의 비처리 조직 및/또는 세포로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 신체의 건강하고/거나 질환에 걸리지 않은 부분 (예를 들어, 조직 또는 세포)으로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포 부분으로부터 수득한다.
"베타7 인테그린 길항제" 또는 "베타7 길항제"는 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하거나 또는 베타7 인테그린과 이와 연관된 하나 이상의 분자와의 결합을 차단하는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명의 길항제를 사용하여 베타7 관련 효과의 하나 이상의 측면, 예를 들어 비제한적으로 알파4 인테그린 서브유닛과의 회합, 알파E 인테그린 서브유닛과의 회합, 알파4베타7 인테그린의 MAdCAM, VCAM-1 또는 피브로넥틴에 대한 결합, 및 알파E베타7 인테그린의 E-카드헤린에 대한 결합을 조절할 수 있다. 이들 효과는 베타7 서브유닛 또는 알파4베타7 또는 알파E베타7 이량체성 인테그린에 대한 리간드 결합성을 붕괴시키는 것을 비롯한, 생물학적으로 관련된 모든 기전에 의해 조절할 수 있고/있거나 알파 인테그린 서브유닛과 베타 인테그린 서브유닛 사이의 회합을 붕괴시켜 이량체성 인테그린의 형성이 억제되도록 함으로써 조절할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 베타7 길항제는 항-베타7 인테그린 항체 (또는 항-베타7 항체)이다. 한 실시양태에서, 항-베타7 인테그린 항체는 인간화 항-베타7 인테그린 항체이고, 보다 특히 재조합 인간화 모노클로날 항-베타7 항체 (또는 rhuMAb 베타7 (또한 에트롤리주맙으로 지칭됨))이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-베타7 항체는 베타7 서브유닛과 알파4 인테그린 서브유닛과의 결합, 알파E 인테그린 서브유닛과의 회합, 알파4베타7 인테그린의 MAdCAM, VCAM-1 또는 피브로넥틴에 대한 결합, 및 알파E베타7 인테그린의 E-카드헤린에 대한 결합을 억제 또는 차단하는 항-인테그린 베타7 길항성 항체이다.
"베타7 서브유닛" 또는 "β7 서브유닛"은 인간 β7 인테그린 서브유닛을 의미한다 (Erle et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:11009-11016). 베타7 서브유닛은 알파4 인테그린 서브유닛, 예를 들어 인간 α4 서브유닛과 회합한다 (Kilger and Holzmann (1995) J. Mol. Biol. 73:347-354). 알파4베타7 인테그린은 보고에 따르면 성숙 림프구의 대부분, 뿐만 아니라 흉선세포, 골수 세포 및 비만 세포의 작은 집단 상에서 발현된다. (Kilshaw and Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21:2591-2597; Gurish et al., (1992) 149: 1964-1972; 및 Shaw, S. K. and Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol. 7:335). 베타7 서브유닛은 또한 알파E 서브유닛, 예컨대 인간 알파E 인테그린 서브유닛과 회합한다 (Cepek, K. L, et al. (1993) J. Immunol. 150:3459). 알파E베타7 인테그린은 장내 상피 림프구 (iIEL) 상에서 발현된다 (문헌 [Cepek, K. L. (1993), 상기 문헌]).
"알파E 서브유닛" 또는 "알파E 인테그린 서브유닛" 또는 "αE 서브유닛" 또는 "αE 인테그린 서브유닛" 또는 "CD103"은 상피내 림프구 상의 베타7 인테그린과 회합되는 것으로 밝혀진 인테그린 서브유닛을 의미하며, 이 알파E베타7 인테그린은 E-카드헤린을 발현하는 장 상피에 대한 iEL의 결합을 매개한다 (Cepek, K. L. et al. (1993) J. Immunol. 150:3459; Shaw, S. K. and Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol. 7:335).
"MAdCAM" 또는 "MAdCAM-1"은 본 발명의 문맥에서 교환가능하게 사용되고, 이는 짧은 세포질 꼬리, 막횡단 영역, 및 3개의 이뮤노글로불린-유사 도메인으로 구성된 세포외 서열을 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드인 단백질 점막 어드레신 세포 부착 분자-1을 지칭한다. 뮤린, 인간 및 마카크 MAdCAM-1에 대한 cDNA를 클로닝하였다 (Briskin, et al., (1993) Nature, 363:461-464; Shyjan et al., (1996) J. Immunol. 156:2851-2857).
"VCAM-1" 또는 "혈관 세포 부착 분자-1" 또는 "CD106"은 활성화 내피 상에서 발현되고 내피-백혈구 상호작용, 예컨대 염증 동안 백혈구의 결합 및 이행에 있어서 중요한 알파4베타7 및 알파4베타1의 리간드를 지칭한다.
"CD45"는 단백질 티로신 포스파타제 (PTP) 패밀리의 단백질을 지칭한다. PTP는 세포 성장, 분화, 유사분열 주기 및 종양원성 형질전환을 비롯한 다양한 세포 과정을 조절하는 신호전달 분자인 것으로 공지되어 있다. 이러한 PTP는 세포외 도메인, 단일 막횡단 절편 및 2개의 직렬 세포질내 촉매 도메인을 함유하므로, 수용체 유형 PTP에 속한다. 이러한 유전자는 조혈 세포에서 특이적으로 발현된다. 이러한 PTP는 T- 및 B-세포 항원 수용체 신호전달의 필수적 조절인자인 것으로 밝혀졌다. 이는 항원 수용체 복합체의 성분과의 직접적인 상호작용을 통해 기능하거나, 또는 항원 수용체 신호전달을 위해 요구되는 다양한 Src 패밀리 키나제를 활성화시킴으로써 기능한다. 이러한 PTP는 또한 JAK 키나제를 억제하므로, 시토카인 수용체 신호전달의 조절인자로서 기능한다. 특징적 이소형을 코딩하는 이 유전자의 4종의 대안적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 보고되었다. (Tchilian EZ, Beverley PC (2002). "CD45 in memory and disease." Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 50 (2): 85-93. Ishikawa H, Tsuyama N, Abroun S, et al. (2004). "Interleukin-6, CD45 and the src-kinases in myeloma cell proliferation." Leuk. Lymphoma 44 (9):1477-81).
CD45의 다양한 이소형이 존재한다: CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, CD45R (ABC). CD45는 또한 고도로 글리코실화된다. CD45R은 가장 긴 단백질이고, T 세포로부터 단리된 경우에 200 kDa에서 이동한다. B 세포는 또한 보다 많이 글리코실화된 CD45R를 발현하여, 분자량이 220 kDa이 되고, 이에 따라 B220 (220 kDa의 B 세포 이소형)으로 명명된다. B220 발현은 B 세포로 제한되지 않고, 또한 활성화 T 세포, 수지상 세포의 하위세트 및 다른 항원 제시 세포 상에서 발현될 수 있다. (Stanton T, Boxall S, Bennett A, et al. (2004). "CD45 variant alleles: possibly increased frequency of a novel exon 4 CD45 polymorphism in HIV seropositive Ugandans." Immunogenetics 56 (2): 107-10).
"장-귀소 림프구"는 장 림프절 및 조직으로는 선택적으로 귀소하지만, 말초 림프절 및 조직으로는 귀소하지 않는 특성을 지닌 림프구 하위군을 지칭한다. 이러한 림프구 하위군은 CD4, CD45RA 및 베타7의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수 세포 표면 분자 조합의 독특한 발현 패턴을 특징으로 한다. 전형적으로, 말초 혈액 CD4+ 림프구의 2종 이상의 하위세트는 CD45RA 및 베타7의 마커에 기초하여 CD45RA-β7높음, 및 CD45RA-β7낮음 CD4+ 세포로 세분될 수 있다. CD45RA-β7높 음 CD4+ 세포는 우선적으로 장 림프절 및 조직으로 귀소하고, 반면에 CD45RA-β7낮음 CD4+ 세포는 우선적으로 말초 림프절 및 조직으로 귀소한다 (Rott et al. 1996; Rott et al. 1997; Williams et al. 1998; Rose et al. 1998; Williams and Butcher 1997; Butcher et al. 1999). 따라서, 장-귀소 림프구는 유동 세포측정법 검정에서 CD45RA-β7높음 CD4+로 확인된 특징적 림프구 하위군이다. 이러한 림프구 군을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 또한 본원의 실시예에 상세히 개시되어 있다.
세포 표면 마커와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 부호 "+"는 세포 표면 마커의 양성 발현을 표시한다. 예를 들어, CD4+ 림프구는 그의 세포 표면 상에 발현된 CD4를 갖는 림프구 군이다.
세포 표면 마커와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 부호 "-"는 세포 표면 마커의 음성 발현을 표시한다. 예를 들어, CD45RA- 림프구는 그의 세포 표면 상에 발현된 CD45RA를 갖지 않는 림프구 군이다.
세포 표면 마커의 발현과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 부호 "낮음"은 세포 표면 마커가 림프구 상에 비교적 낮은 수준으로 발현되는 것을 나타내는 반면, "높음"은 세포 표면 마커가 림프구 상에 비교적 높은 수준으로 발현되는 것을 나타낸다. 유동 세포측정법에서, β7높음의 강도는 β7낮음의 강도보다 적어도 약 10배 또는 100배 더 높다. 따라서, 본원의 예시적 실시양태에서 제공된 바와 같이, CD45RA-β7낮음 CD4+ 및 CD45RA-β7높음 CD4+ 림프구는, X-축이 CD45RA의 발현 강도이고 Y-축이 베타7의 발현 강도인 유동 세포측정법 분석의 도트 플롯 또는 히스토그램의 별개의 부분에 위치한다.
"말초-귀소 림프구"는 말초 림프절 및 조직으로 귀소하며, 장 림프절 및 조직으로는 귀소하지 않는 특성을 갖는 림프구 하위군을 지칭한다. 예시적 실시양태에서, 상기 설명된 바와 같이, 말초-귀소 림프구는 유동 세포측정법 검정에서 CD45RA-β7낮음 CD4+ 세포로서 확인된 특징적인 림프구 군이다. 이러한 림프구 군을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 상세히 기재되어 있다.
바이오마커의 "양" 또는 "수준"은 관련 기술분야에 공지되고 본원에 개시된 방법, 예컨대 유동 세포측정법 분석을 이용하여 결정될 수 있다.
"바이오마커의 양 또는 수준의 변화"는 바이오마커의 참조/비교 양과 비교한 것이다. 특정 실시양태에서, 변화는 기준 또는 비교 양에 대한 값의 함수로서 약 10% 초과, 또는 약 30% 초과, 또는 약 50% 초과, 또는 약 100% 초과, 또는 약 300% 초과이다. 예를 들어, 기준 또는 비교 양은 치료 전의 바이오마커의 양일 수 있고, 보다 특히는 기준선 또는 투여전 양일 수 있다.
본원에 사용된 어구 "와 실질적으로 동일한"은 통상의 기술자가 변화를 상기 값 (예를 들어, 약물 표적 수용체를 포화시키는데 필요한 약물 혈청 수준)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 통계적으로 유의하거나 또는 생물학적으로 의미있는 변화로 간주하지 않도록 하는 무시할 만한 정도의 변화를 의미한다. 서로 약 2배 미만 상이하거나, 또는 약 3배 미만 상이하거나, 또는 약 4배 미만 상이한 수용체 포화에 필요한 혈청 약물 농도는 본질적으로 동일한 것으로 간주된다.
"위장 염증성 장애"는 점막에서 염증 및/또는 궤양화를 유발하는 만성 장애 군이다. 이들 장애는, 예를 들어 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염, 불확정 결장염 및 감염성 결장염), 점막염 (예를 들어, 구강 점막염, 위장 점막염, 비강 점막염 및 직장염), 괴사성 소장결장염 및 식도염을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 위장 염증성 장애는 염증성 장 질환이다.
"염증성 장 질환" 또는 "IBD"는 염증 및/또는 궤양화를 유발하는 장의 질환을 지칭하기 위해 본원에서 교환가능하게 사용되고, 이는 비제한적으로 크론병 및 궤양성 결장염을 포함한다.
"크론병 (CD)" 또는 "궤양성 결장염 (UC)"은 병인이 공지되지 않은 만성 염증성 장 질환이다. 크론병은 궤양성 결장염과는 달리, 장의 어떠한 부분에도 영향을 미칠 수 있다. 크론병의 가장 두드러진 양상은 장 벽에 과립형의 적색빛-자주색 부종이 비대해지는 것이다. 염증이 발생함에 따라, 이들 육아종은 종종 자신의 국한성 경계를 상실하고 주위 조직과 통합된다. 설사 및 장 폐쇄가 주요 임상 양상이다. 궤양성 결장염과 같이, 크론병의 과정은 지속적이거나 재발성, 경도이거나 중증일 수 있지만, 궤양성 결장염과는 달리, 크론병은 병의 원인이 되는 장 절편을 절제함으로써 치유될 수 없다. 크론병을 갖는 대부분의 환자는 몇몇 시점에서는 수술이 필요하지만, 후속 재발이 흔하기 때문에 지속적인 의료 치료가 통상적이다.
크론병은 구강에서부터 항문까지의 모든 장 부분에서 발병할 수 있지만, 이는 전형적으로, 회결장, 소장 또는 결장-항문직장 영역에서 나타난다. 조직병리학적으로, 상기 질환은 불연속적인 육아종성, 음와 농양, 열구 및 아프타성 궤양 징후가 나타난다. 염증성 침윤물은 림프구 (T 세포 및 B 세포 둘 다), 형질 세포, 대식세포 및 호중구로 이루어진 혼합 형태이다. IgM- 및 IgG-분비 형질 세포, 대식세포 및 호중구에서의 불균형적 증가가 있다.
항염증 약물 술파살라진 및 5-아미노살리실산 (5-ASA)은 경미한 활동성 결장성 크론병을 치료하는 데 유용하고, 이러한 질환의 완화를 유지하기 위해 흔히 처방되고 있다. 메트로니다졸 및 시프로플록사신은 술파살라진과 효능 면에서 유사하고, 항문주위 질환을 치료하는데 특히 유용한 것으로 여겨진다. 보다 중증의 경우에는, 코르티코스테로이드가 활동성 악화를 치료하는 데 유효하고, 심지어 완화를 유지시킬 수 있다. 아자티오프린 및 6-메르캅토퓨린은 또한, 코르티코스테로이드를 만성 투여해야 하는 환자에서 성공적으로 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 약물은 장기간 예방에 있어서 소정의 역할을 할 수 있다는 것이 가능하다. 불행하게도, 몇몇 환자에서는 작용이 발생하기 전에 극히 장기간 (6개월까지) 지연될 수 있다. 항설사 약물은 또한, 몇몇 환자에서 증상 완화를 제공할 수 있다. 영양 요법 또는 기본식은 환자의 영양 상태를 개선할 수 있고, 급성 질환의 증상 개선을 유도하지만, 지속적인 임상 완화는 유도하지 않는다. 항생제는 속발성 소장 박테리아 과도성장을 치료하고 화농성 합병증을 치료하는데 사용된다.
"궤양성 결장염 (UC)"은 대장에 침범한다. 질환 과정은 연속적 또는 재발성, 경증 또는 중증일 수 있다. 가장 초기 병변은 리베르쿤 음와의 기저부에 농양이 형성되는 염증 침윤이다. 이들 팽창되고 파열된 음와의 유착은 위에 가로놓인 점막을 그의 혈액 공급으로부터 분리시켜 궤양화를 유발하는 경향이 있다. 이러한 질환의 증상은 경련, 하복부통, 직장 출혈, 및 희박한 대변 입자와 함께 혈액, 고름 및 점액으로 주로 이루어진 빈번하고 무른 배설물을 포함한다. 급성, 중증 또 만성, 끊임없는 궤양성 결장염에는 전체 결장절제술이 요구될 수 있다.
UC의 임상 양상은 고도로 가변적이고, 그 발병은 잠행성이거나 돌연성일 수 있고, 설사, 이급후중 및 재발성 직장 출혈을 포함할 수 있다. 전체 결장의 전격성 병발에 따라, 생명을 위협하는 응급 상황인 독성 거대결장증이 생겨날 수 있다. 장외 징후는 관절염, 괴저성 농피증, 포도막염 및 결절성 홍반을 포함한다.
UC에 대한 치료는 경도인 경우에 술파살라진 및 관련 살리실레이트-함유 약물을 포함하고, 중증인 경우에 코르티코스테로이드 약물을 포함한다. 살리실레이트 또는 코르티코스테로이드를 국소 투여하는 것이 종종 유효한데, 특히 상기 질환이 말단부 장에 한정되고 전신 용도에 비해 부작용을 감소시키는 것과 연관되는 경우에 유효하다. 철 및 항설사제를 투여하는 것과 같은 보완 조치가 종종 치료에 적용된다. 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트가 종종 또한, 난치성 코르티코스테로이드-의존성 사례에 사용하도록 처방된다.
"유효 투여량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "환자"는 치료가 요망되는 임의의 단일 동물, 보다 바람직하게는 포유동물 (비-인간 동물, 예를 들어 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류 포함)을 지칭한다. 가장 바람직하게는, 본원의 환자는 인간이다.
용어 "비-인간 대상체"는 임의의 단일 비-인간 동물, 보다 바람직하게는 포유동물 (상기 비-인간 동물, 예를 들어 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 암소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류 포함)를 지칭한다.
용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 가장 넓은 의미에서 교환가능하게 사용되고, 이는 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이중특이적 항체)를 포함하고, 이는 또한 특정의 항체 단편 (본원에 보다 상세히 기재된 바와 같음)을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
"항체 단편"은 단지 무손상 항체의 일부만을 포함하며, 여기서 일부는 바람직하게는, 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 그 일부와 통상적으로 연관된 기능들 중 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 모든 기능을 보유한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 항원과 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은, 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 Fc 영역과 통상적으로 연관된 생물학적 기능들, 예를 들어 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나의 기능을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질성인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 이러한 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대해 지시된다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 사항은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한 하기 종설 논문 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/거나 본원에 개시된 바와 같은 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 이러한 기술은 인간-유래 조합 라이브러리, 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 기술 (예를 들어, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) 및 Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)] 참조); 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주를 사용하는 기술 (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조); 및 내인성 이뮤노글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)에서 모노클로날 항체를 생성하는 기술 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al.,Year in Immunol., 7: 33 (1993)] 참조)을 포함한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 동물로부터의 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명백하게 제외한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정 시 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하며, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열 내에서 초가변적이고/거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하는데; VH에 3개가 있고 (H1, H2, H3), VL에 3개가 있다 (L1, L2, L3). 다수의 초가변 영역 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충을 나타내고, 이는 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되고 있다. "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한 것이다. 각각의 이들 HVR로부터의 잔기가 하기 기재된다.
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초가변 영역은 하기와 같은 "확장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL 내의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 49-56 또는 50-56 또는 52-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내의 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 나타내지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선하는, 그의 하나 이상의 CDR 내에서의 하나 이상의 변경들을 수반한 항체이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화도 성숙에 기재되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 하기 문헌에 기재되어 있다: [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1996); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)].
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯하여, 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫 동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 목적을 위해 이들 중 임의의 방법이 사용될 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하며, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역이라 지칭되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 이들 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
항체를 파파인으로 소화시키면, "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 긴밀하게, 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 배위에서 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정한다. 총괄적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 오직 3개의 초가변 영역을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 낮은 친화도에서도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇몇 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1개의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 종류 중 하나로 할당될 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 칭해진다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있고, 일반적으로 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000)]에 기재되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는, 하기 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 실질적으로 무손상 형태인 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원의 목적상 "네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체이다.
용어 "Fc 영역"은 본원에서 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지의 범위로 경계지어진다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합적 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에서 이뮤노글로불린 중쇄 내의 잔기에 관한 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] (명백히 본원에 참조로 포함됨)에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것이다. "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능을 위해서는 일반적으로, Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 합해야만 하고, 이는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 1개의 아미노산 변형, 바람직하게는 1개 이상의 아미노산 치환(들)을 통해 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환을 갖고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%의 상동성을 보유할 것이다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체는 상이한 "부류"로 할당될 수 있다. 5가지 주요 부류의 무손상 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇몇은 "하위부류" (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다. 이뮤노글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후에 이러한 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 1개 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 그의 천연 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 추가로, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (감마 수용체)이고, 이러한 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 비롯하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 검토). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것들을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어는 또한, 모계 IgG를 태아에게 전이시키는 것을 담당하고 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), 이뮤노글로불린의 생체 항상성을 조절하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체가 WO00/42072 (Presta, L.) 및 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, Fc 영역은 위치 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 또는 434 (잔기의 EU 넘버링) 중 1개 이상에서 치환을 가질 수 있다. 개선된 FcRn 결합을 갖는 바람직한 Fc 영역-포함 항체 변이체는 그의 Fc 영역의 위치 307, 380 및 434 (잔기의 EU 넘버링) 중 1개, 2개 또는 3개에서의 아미노산 치환을 포함한다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 단편의 검토를 위해, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. HER2 항체 scFv 단편은 WO93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458에 기재되어 있다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 가변 경쇄 도메인 (VL)과 연결된 가변 중쇄 도메인 (VH) (VH - VL)을 포함한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 나타내지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선하는, 그의 하나 이상의 초가변 영역 내에서의 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 하기 문헌에 기재되어 있다: [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)].
"아미노산 서열 변이체" 항체는 본원에서 주요 종 항체와 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 통상적으로, 아미노산 서열 변이체는 주요 종 항체와 적어도 약 70％의 상동성을 가질 것이고, 바람직하게는 주요 종 항체와 적어도 약 80％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90％ 상동성일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 주요 종 항체의 아미노산 서열 내의 또는 이러한 서열에 인접한 특정 위치에서 치환, 결실 및/또는 부가를 보유한다. 본원에서 아미노산 서열 변이체의 예는 산성 변이체 (예를 들어, 탈아미드화 항체 변이체), 염기성 변이체, 그의 1개 또는 2개의 경쇄 상에 아미노-말단 리더 연장부 (예를 들어, VHS-)를 갖는 항체, 그의 1개 또는 2개의 중쇄 상에 C-말단 리신 잔기를 갖는 항체 등을 포함하며, 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열에 대한 변이 조합물을 포함한다. 본원에서 특별히 관심을 갖는 항체 변이체는 1개 또는 2개 경쇄 상에 아미노-말단 리더 연장부를 포함하고, 주요 종 항체와 비교해서 다른 아미노산 서열 및/또는 글리코실화 차이를 임의로 추가로 포함하는 항체이다.
"글리코실화 변이체" 항체는 본원에서 그에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 주요 종 항체에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티와 상이한 항체이다. 본원의 글리코실화 변이체의 예는 그의 Fc 영역에 부착된, G0 올리고사카라이드 구조 대신에 G1 또는 G2 올리고사카라이드 구조를 갖는 항체, 그의 1개 또는 2개의 경쇄에 부착된 1개 또는 2개의 탄수화물 모이어티를 갖는 항체, 항체의 1개 또는 2개의 중쇄에 부착된 탄수화물이 전혀 없는 항체, 및 글리코실화 변경들의 조합물을 포함한다. 항체가 Fc 영역을 갖는 경우에, 올리고사카라이드 구조는, 예를 들어 잔기 299 (298, 잔기의 EU 넘버링)에서 항체의 1개 또는 2개의 중쇄에 부착될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)를 포함하도록 의도된다.
용어 "시토카인"은 세포간 매개자로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어이다. 이러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 이러한 시토카인에 포함되는 것은 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체화 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 다른 폴리펩티드 인자 (LIF 및 키트 리간드 (KL) 포함)이다. 본원에서 사용된 용어 시토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
보조 요법에 대해 본원에 사용된 용어 "면역억제제"는 본원에서 치료할 대상체의 면역계를 억제하거나 차폐하는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이는 시토카인 생산을 억제하거나 자기-항원 발현을 하향-조절 또는 억제하거나 MHC 항원을 차폐하는 물질을 포함한다. 이러한 작용제의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (미국 특허 번호 4,665,077 참조); 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID); 간시클로비르; 타크롤리무스; 글루코코르티코이드, 예컨대 코르티솔 또는 알도스테론; 항염증제, 예컨대 시클로옥시게나제 억제제; 5-리폭시게나제 억제제; 또는 류코트리엔 수용체 길항제; 퓨린 길항제, 예컨대 아자티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸 (MMF); 알킬화제, 예컨대 시클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드 (이는 미국 특허 번호 4,120,649에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 차폐함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 시클로스포린; 6 메르캅토퓨린; 스테로이드, 예컨대 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드 유사체, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 (솔루-메드롤(SOLU-MEDROL)™ 메틸프레드니솔론 나트륨 숙시네이트 포함) 및 덱사메타손; 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예컨대 메토트렉세이트 (경구 또는 피하); 항말라리아제, 예컨대 클로로퀸 및 히드록시클로로퀸; 술파살라진; 레플루노미드; 시토카인 또는 시토카인 수용체 항체 또는 길항제 (항-인터페론-알파, -베타 또는 -감마 항체 포함), 항-종양 괴사 인자 (TNF)-알파 항체 (인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)™) 또는 아달리무맙), 항-TNF-알파 이뮤노어드헤신 (에타네르셉트), 항-TNF-베타 항체, 항-인터류킨-2 (IL-2) 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 및 항-인터류킨-6 (IL-6) 수용체 항체 및 길항제; 항-LFA-1 항체 (항-CD11a 및 항-CD18 항체 포함); 항-L3T4 항체; 이종 항림프구 글로불린; 범-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (1990년 7월 26일자로 공개된 WO 90/08187); 스트렙토키나제; 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타); 스트렙토도마제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 클로람부실; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (미국 특허 번호 5,114,721 (Cohen et al.)); T-세포 수용체 단편 (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); 및 WO 91/01133); BAFF 길항제, 예컨대 BAFF 또는 BR3 항체 또는 이뮤노어드헤신 및 zTNF4 길항제 (검토를 위해 문헌 [Mackay and Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002)] 참조; 및 또한 하기 정의 참조); T 세포 헬퍼 신호를 방해하는 생물학적 작용제, 예컨대 항-CD40 수용체 또는 항-CD40 리간드 (CD154), 예를 들어 CD40-CD40 리간드에 대한 차단 항체 (예를 들어, 문헌 [Durie et al., Science, 261: 1328-30 (1993); Mohan et al., J. Immunol., 154: 1470-80 (1995)]) 및 CTLA4-Ig (Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994)); 및 T 세포 수용체 항체 (EP 340,109), 예컨대 T10B9를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "개선하다" 또는 "개선"은 상태, 질환, 장애 또는 표현형, 예컨대 이상 또는 증상의 감소, 축소 또는 제거를 지칭한다.
질환 또는 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)의 "증상"은 대상체가 경험하고 질환을 나타내는 임의의 병적 현상, 또는 구조, 기능 또는 감각에서 정상을 벗어나는 것이다.
표현 "치료 유효량"은 질환 또는 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 효과적인 양을 지칭한다. 예를 들어, 항체의 "치료 유효량"은 특정된 질환 또는 장애를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 효과적인 항체의 양을 지칭한다. 유사하게, 항체 및 제2 화합물의 조합물의 "치료 유효량"은, 특정된 질환 또는 장애를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 효과적인 조합물 중 항체의 양 및 제2 화합물의 양을 지칭한다.
용어 2종의 화합물"의 조합"은 화합물이 서로 혼합물로 투여되어야 한다는 것을 의미하지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 이러한 조합을 사용하는 치료 또는 이러한 조합의 사용은 화합물의 혼합물 또는 화합물의 개별 투여를 포함하며, 동일한 날 또는 상이한 날의 투여를 포함한다. 따라서, 용어 "조합"은 2종 이상의 화합물이 치료를 위해 개별적으로 또는 서로 혼합물로 사용된다는 것을 의미한다. 항체 및 제2 화합물이, 예를 들어 대상체에게 조합되어 투여되는 경우에, 항체는 항체 및 제2 화합물이 대상체에게 개별적으로 투여되든지 혼합물로 투여되든지, 제2 화합물이 또한 대상체 내에 존재하는 시점에 대상체 내에 존재한다. 특정 실시양태에서, 항체 이외의 화합물은 항체 전에 투여된다. 특정 실시양태에서, 항체 이외의 화합물은 항체 후에 투여된다.
본원에서의 목적을 위해, "종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파)"는 문헌 [Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) 또는 Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985)]에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNF-알파 분자를 지칭한다.
본원에서 "TNF-알파 억제제"는 일반적으로 TNF-알파에 결합하여 그의 활성을 중화함으로써 TNF-알파의 생물학적 기능을 어느 정도 억제시키는 작용제이다. 본원에서 구체적으로 고려되는 TNF 억제제의 예는 에타네르셉트 (엔브렐(ENBREL)®), 인플릭시맙 (레미케이드®), 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)®), 골리무맙 (심포니(SIMPONI)™) 및 세톨리주맙 페골 (심지아(CIMZIA)®)이다.
"코르티코스테로이드"는 자연 발생 코르티코스테로이드의 효과를 모방하거나 증대시키는, 스테로이드의 일반적 화학 구조를 갖는 여러 합성 또는 자연 발생 물질 중 임의의 것을 지칭한다. 합성 코르티코스테로이드의 예는 프레드니손, 프레드니솔론 (메틸프레드니솔론 포함), 덱사메타손, 트리암시놀론 및 베타메타손을 포함한다.
"길항제"는 특정한 또는 특정된 단백질의 활성, 예컨대 리간드의 경우에는 하나 이상의 수용체에 대한 그의 결합, 또는 수용체의 경우에는 하나 이상의 리간드에 대한 그의 결합을 중화하거나, 차단하거나, 억제하거나, 없애거나, 감소시키거나, 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 길항제는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 핵산, 생물유기 분자, 펩티드모방체, 약리학적 작용제 및 그의 대사물, 전사 및 번역 제어 서열 등을 포함한다. 길항제는 또한 단백질의 소분자 억제제, 및 단백질에 특이적으로 결합하여 그것이 그의 표적에 결합하는 것을 봉쇄하는 융합 단백질, 수용체 분자 및 유도체, 단백질의 길항제 변이체, 단백질에 대해 지시된 안티센스 분자, RNA 압타머, 및 단백질에 대한 리보자임을 포함한다.
용어 "검출"은 직접 및 간접 검출을 비롯한 임의의 검출 수단을 포함한다.
다양한 추가의 용어는 본원에 정의되거나 또는 달리 특성화된다.
II. 조성물 및 방법
A. 베타7 인테그린 길항제
본 발명은 베타7 인테그린 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자의 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다. 잠재적 길항제의 예는 이뮤노글로불린과 베타7 인테그린의 융합물에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 특히 비제한적으로 폴리- 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일-쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 이러한 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 버전, 뿐만 아니라 인간 항체 및 항체 단편을 포함하는 항체를 포함한다. 대안적으로, 잠재적 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 리간드를 인식하지만 어떠한 영향력도 미치지 않음으로써, 베타7 인테그린의 작용을 경쟁적으로 억제하는 베타7 인테그린의 돌연변이 형태일 수 있다.
또 다른 잠재적 베타7 인테그린 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구축물이며, 이러한 기술에서는, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자가 표적화 mRNA와 혼성화하고 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 이용하여 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이러한 방법은 둘 다 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합을 기준으로 하여 한다. 예를 들어, 본원의 베타7 인테그린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분을 사용하여, 길이가 약 10 내지 40개 염기 쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자의 영역에 대해 상보적이도록 설계됨으로써 (삼중 나선 -- 문헌 [Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)] 참조), 베타7 인테그린의 전사 및 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA와 혼성화하고, 이러한 mRNA 분자가 베타7 인테그린 단백질로 번역되는 것을 차단한다 (안티센스 -- 문헌 [Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, Fla., 1988)]). 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 또한 세포에 전달하여, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 PRO 폴리펩티드의 생성을 억제하도록 할 수 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 번역-개시 부위로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 위치 내지 +10 위치 사이가 바람직하다.
다른 잠재적 길항제는 베타7 인테그린의 활성 부위, 리간드 또는 결합 분자 결합 부위에 결합함으로써 베타7 인테그린의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자를 포함한다. 소분자의 예는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 표적 RNA에 대한 서열-특이적 혼성화에 이은 핵산내부분해 절단에 의해 작용한다. 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 공지된 기술에 의해 확인할 수 있다. 추가의 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994)] 및 PCT 공개 번호 WO 97/33551 (1997년 9월 18일에 공개됨)을 참조한다.
전사 억제에 사용되는 삼중-나선 형성에 있어서의 핵산 분자는 단일-가닥이어야 하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 이것이 후그스틴 염기-쌍 형성 규칙을 통해 삼중-나선 형성을 촉진하도록 설계되는데, 여기서 일반적으로 듀플렉스 중 한쪽 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 필요하다. 추가의 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 97/33551을 참조한다. 이러한 소분자는 임의의 하나 이상의 상기 논의된 스크리닝 검정 및/또는 통상의 기술자에게 널리 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인될 수 있다.
길항제에 대한 스크리닝 검정은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 베타7 인테그린과 결합하거나 이와 복합체를 형성하거나, 또는 그 밖에 상기 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포성 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하도록 설계된다. 이러한 스크리닝 검정은 화학적 라이브러리의 고처리량 스크리닝이 가능한 검정을 포함하여, 소분자 약물 후보를 확인하는데 특히 적합하다.
검정은 관련 기술분야에 널리 특성화되어 있는 다양한 포맷, 예를 들어 단백질-단백질 결합 검정, 생화학적 스크리닝 검정, 면역검정 및 세포-기반 검정으로 수행될 수 있다.
B. 항-베타7 인테그린 항체
한 실시양태에서, 베타7 인테그린 길항제는 항-베타7 항체이다. 예시적인 항체는 하기 기재된 바와 같은 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 인간, 이중특이적 및 이종접합체 항체 등을 포함한다.
1. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서 R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어 단백질 또는 접합체 100 μg 또는 5 μg (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후에 프로인트 완전 아주반트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 다중 부위에 피하로 주사하여 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅시킨다. 바람직하게는, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합되었으나 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제가 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.
2. 모노클로날 항체
모노클로날 항체를 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 상기 기재된 바와 같이 면역화시켜서, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발한다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 면역화 후에 림프구를 단리한 후에 적합한 융제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모 골수종 세포 (또한, 융합 파트너라 지칭되기도 함)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직한 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마를 위한 선택 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 저해하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다 (HAT 배지).
바람직한 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하는 세포이며, 융합되지 않은 모 세포에 대해 선택하는 선택 배지에 감수성이 있다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능한 SP-2 및 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생산과 관련하여 기재되어 있다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐차드 분석으로 결정할 수 있다. 일단 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 희석 절차를 제한하여 서브클로닝하고 표준 방법으로 배양할 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 예를 들어 하이브리도마 세포를 마우스에게 i.p. 주사함으로써 상기 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스의 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)를 이용하여 용이하게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이후에 이를 달리 항체 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
추가 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체를 각각 단리시키는 방법이 기재되어 있다. 후속 공개 문헌에는 쇄 셔플링 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))에 의한 고 친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산, 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))이 기재되어 있다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
항체를 코딩하는 DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열로 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 융합시켜서 변형시킴으로써 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인을 교체할 수 있거나, 또는 이것이 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 교체하여 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.
예시적인 항-베타7 항체는 Fib504, Fib 21, 22, 27, 30 (Tidswell, M. J Immunol. 1997 Aug 1;159(3):1497-505) 또는 그의 인간화 유도체이다. Fib504의 인간화 항체는 미국 특허 공개 번호 20060093601 (미국 특허 번호 7,528,236으로 허여됨; 그의 내용은 전문이 참조로 포함됨)에 상세히 개시되어 있다 (또한, 하기 논의 참조).
3. 인간 및 인간화 항체
본 발명의 항-베타7 인테그린 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 바람직한 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 교체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 최적으로는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 필수적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써, 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 인간화 항체의 제조에 사용되는 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항체가 인간 치료용으로 의도된 경우에 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적-맞춤" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 그 내에 있는 인간 프레임워크 영역 (FR)을 인간화 항체에 대해 허용한다 (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크를 여러 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)). 추가로, 항체가 항원에 대해 높은 친화도를 보유하고 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화하는 것이 중요하다. 이 목적을 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 자신의 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 바람직한 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
다양한 형태의 인간화 항-베타7 인테그린 항체가 고려된다. 예를 들어 인간화 항체는 면역접합체를 생성하기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)와 임의로 접합된 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있다. 대안적으로, 인간화 항체는 무손상 항체, 예컨대 무손상 IgG1 항체일 수 있다.
예시적인 인간화 항-베타7 항체는 인테그린 서브유닛 β7에 대한 인간화 모노클로날 항체이고 래트 항-마우스/인간 모노클로날 항체 FIB504로부터 유래된 rhuMAb 베타7을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (Andrew et al., 1994 J Immunol 1994;153:3847-61). 이는 인간 이뮤노글로불린 IgG1 중쇄 및 κ1 경쇄 프레임워크를 포함하도록 조작되었고, 차이니즈 햄스터 난소 세포에 의해 생산된다. 상기 항체는 위장관에서의 림프구 하위세트의 트래픽킹 및 체류를 조절하고, 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어 궤양성 결장염 (UC) 및 크론병 (CD)에 관여하는 2개의 인테그린인 α4β7 (Holzmann et al. 1989 Cell, 1989;56:37-46; Hu et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:8254-8) 및 αEβ7 (Cepek et al., 1993 J Immunol 1993;150:3459-70)에 결합한다. rhuMAb 베타7은 α4β7과 그의 리간드 (점막 어드레신 세포 부착 분자-1 [MAdCAM-1], 혈관 세포 부착 분자 [VCAM]-1, 및 피브로넥틴) 사이의 세포 상호작용 뿐만 아니라 αEβ7과 그의 리간드 (E-카드헤린) 사이의 상호작용의 강력한 시험관내 차단제이다. rhuMAb 베타7은 토끼, 시노몰구스 원숭이 및 인간으로부터의 림프구 상의 β7에 유사한 고친화도로 가역적으로 결합한다. 이는 또한 마우스 β7에 고친화도로 결합한다. rhuMAb 베타7 및 그의 변이체의 아미노산 서열 및 그의 제조 및 사용은 미국 특허 출원 공개 번호 20060093601 (미국 특허 번호 7,528,236으로서 허여됨; 그의 내용은 전문이 포함됨)에 상세히 개시되어 있다.
도 1a 및 1b는 하기에 대한 가변 경쇄 및 중쇄의 서열의 정렬을 도시한다: 경쇄 인간 하위군 카파 I 컨센서스 서열 (도 1a, 서열 12), 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 서열 (도 1b, 서열 13), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 경쇄 (도 1a, 서열 10), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 중쇄 (도 1b, 서열 11), 및 인간화 항체 변이체: 인간화 hu504K 이식편 가변 경쇄 (도 1a, 서열 14), 인간화 hu504K 이식편 가변 중쇄 (도 1b, 서열 15), 변이체 hu504-5, hu504-16, 및 hu504-32 (인간화 hu504K 이식편으로부터의 아미노산 변이는 도 1a (경쇄)에 표시됨) (출현 순서대로 각각 서열 22-24), 및 도 1b (중쇄)에서, 변이체 hu504-5, hu504-16, 및 504-32 (서열 25).
4. 인간 항체
인간화에 대한 대안으로서 인간 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 면역화시, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 기재되어 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 젠팜(GenPharm)); 미국 특허 번호 5,545,807; 및 WO 97/17852를 참조한다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990])을 사용하여, 비면역화된 공여체로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 단백질 유전자로 인-프레임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기반으로 한 선택에 의해 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선택된다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에서 검토된다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991)]에서는 면역시킨 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 의해 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 참조).
5. 항체 단편
특정 상황에서는, 전체 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 제거가 신속하고, 고형 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다.
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되어 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술들이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 5,641,870에서 개시된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
6. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중-특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같은 베타7 인테그린의 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 이러한 다른 항체는 TAT 결합 부위를 또 다른 단백질에 대한 결합 부위와 조합시킬 수 있다. 대안적으로, 항-베타7 인테그린 아암을, TAT-발현 세포에 대한 세포성 방어 메카니즘에 집중하고 국재화되도록, 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (Fc.γ.R), 예컨대 Fc.γRI (CD64), Fc.γRII (CD32) 및 Fc.γ.RIII (CD16)에 결합하는 아암과 조합할 수 있다. 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를, TAT를 발현하는 세포에 국재화시킬 수도 있다. 이들 항체는 TAT-결합성 아암과, 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항인터페론-α, 빈카 알카로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)와 결합하는 아암을 보유하고 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 종래의 전장 이중특이적 항체의 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 공-발현시키는 것을 기반으로 하며, 상기 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 산물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)이 있는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 바람직하게는, 융합은 힌지의 적어도 일부, CH2, 및 CH3 영역을 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인을 이용한다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 세포로 공-형질감염시킨다. 이는, 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 바람직한 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비를 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 유도하거나 상기 비가 바람직한 쇄 조합의 수율에 유의한 영향을 갖지 않는 경우에는 단일 발현 벡터 내에 2종 또는 3종 모두의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터의 바람직한 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이러한 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 것에 관한 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 번호 5,731,168에 기재된 또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자들 사이의 인터페이스는 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화되도록 조작될 수 있다. 바람직한 인터페이스는 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터의 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동"이 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 바람직하지 않은 최종-산물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 본래의 항체를 단백질 분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성하는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편은 이웃자리 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원된다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재한다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내에서 지시된 화학 커플링에 적용하였다. 이에 따라 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수도 있었다. 재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 이러한 단편은 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 간에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인을 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍형성함으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성시킨다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).
7. 이종접합체 항체
이종접합체 항체가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이종접합체 항체는 2개의 공유 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 항체는 가교제를 사용하는 것을 포함하는, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트, 및 예를 들어 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된 것을 포함한다.
8. 다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 (예를 들어 4가 항체) 다가 항체 (IgM 부류 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노-말단의 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서의 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서의 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 영역의 1개 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내며, n은 0 또는 1임)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 더 포함한다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 더 포함한다.
9. 이펙터 기능 조작
본 발명의 항체를 예를 들어 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)이 증진되도록 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입하여, 이 영역 내에서의 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이로써 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 항종양 활성이 증진된 동종이량체 항체는 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이관능성 가교제를 사용하여 제조할 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작할 수 있고, 이에 의해 보체 용해 및 ADCC 능력이 증진될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 생체내 혈청 반감기 증가를 담당하는 IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
10. 면역접합체
본원의 방법에 사용된 길항제 또는 항체는 또 다른 작용제, 예컨대 세포독성제 또는 시토카인에 임의로 접합된다.
접합은 통상적으로, 공유 연결을 통해 달성할 것인데, 그의 정확한 종류는 인테그린 베타7 길항제 또는 항체 폴리펩티드 상의 연결성 부위 및 표적화 분자에 의해 결정될 것이다. 전형적으로, 비-펩티드성 작용제는 화학적 변형에 의해 항체 상으로 도입된 그의 아미노산 측쇄, 탄수화물 쇄 또는 반응성 기를 통해 항-베타7 인테그린 항체와 접합시키는 링커를 부가함으로써 변형시킨다. 예를 들어, 약물은 리신 잔기의 ε-아미노 기를 통해, 유리 α-아미노 기를 통해, 시스테인 잔기로의 디술피드 교환에 의해, 또는 과아이오딘산을 이용하는 탄수화물 쇄 중의 1,2-디올의 산화에 의해 부착되어, 쉬프(Schiff)-염기 연결을 통해 다양한 친핵체를 함유하는 약물의 부착을 허용할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 4,256,833을 참조한다. 단백질 개질제는 아민-반응성 시약 (예를 들어, 반응성 에스테르, 이소티오시아네이트, 알데히드 및 술포닐 할라이드), 티올-반응성 시약 (예를 들어, 할로아세틸 유도체 및 말레이미드), 및 카르복실산-반응성 및 알데히드-반응성 시약을 포함한다. 인테그린 베타7 길항제 또는 항체 폴리펩티드는 이관능성 가교결합성 시약을 사용함으로써 펩티드성 작용제에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 이종이관능성 시약이 보다 통상적으로 사용되고 있고, 이는 두가지 상이한 반응성 모이어티 (예를 들어, 아민-반응성 플러스 티올, 아이오도아세트아미드 또는 말레이미드)의 사용을 통해 두가지 상이한 단백질의 제어 커플링을 허용하여 제공하였다. 이러한 연결제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 [Brinkley, 상기 문헌] 및 미국 특허 번호 4,671,958을 참조한다. 펩티드성 링커를 또한 이용할 수 있다. 대안적으로, 항-베타7 인테그린 항체 폴리펩티드를, 융합 폴리펩티드의 제조를 통해 펩티드성 모이어티에 연결시킬 수 있다.
추가의 이관능성 단백질 커플링제의 예는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 포함한다.
11. 이뮤노리포솜
본원에 기재된 항-베타7 인테그린 항체는 또한 이뮤노리포솜으로서 제제화될 수 있다. "리포솜"은 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용한, 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 통상적으로, 리포솜의 성분들은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545; 및 WO97/38731 (1997년 10월 23일에 공개됨)에 기재된 것과 같은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법으로 생성될 수 있다. 한정된 기공 크기의 필터를 통해 리포솜을 압출하여 바람직한 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.
본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 접합될 수 있다. 임의로, 화학요법제를 리포솜 내에 함유시킨다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989)]을 참조한다.
12. 항체 생산을 위한 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
또한, 본원에 기재된 항-베타7 항체 또는 폴리펩티드 작용제를 코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 이러한 항체의 생산을 위한 재조합 기술이 제공된다.
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리하여, 추가적인 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 5,204,244 (본원에 구체적으로 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 상동 재조합에 의해 항체를 생산할 수 있다. 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써), 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 용이하게 단리되고 서열분석된다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,534,615 (1996년 7월 9일자로 허여되고 본원에 구체적으로 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같음).
본원에서 벡터에 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리움, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주 예컨대 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항-베타7 인테그린 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 제빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종, 및 균주가 본원에서 일반적으로 이용가능하며 유용한데, 예를 들어 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다; 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈완니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 있다.
글리코실화 항-베타7 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 다수의 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스들은, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포가 가장 흥미롭고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 통상적인 절차가 되어 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양물 중에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항-베타7 인테그린 항체 생산을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적당하도록 변형시킨 통상적인 영양 배지 중에서 배양한다.
본 발명의 항-베타7 인테그린 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지 중에서 배양할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄의 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제가 통상의 기술자에게 공지된 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현에 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포 내에서 생산되거나, 주변세포질 공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우에, 제1 단계로서 입자형 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 절차가 기재되어 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축한다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (J. T. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질을 정제하기 위한 다른 기술, 예컨대 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전을 또한 회수하고자 하는 항체에 따라 이용할 수 있다. 임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심있는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 pH가 약 2.5-4.5인 용리 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
C. 제약 제제
본 발명의 치료제, 길항제 또는 항체를 포함하는 치료 제제는, 목적하는 순도를 갖는 항체를 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여, 수용액, 동결건조 또는 다른 건조 제제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원의 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 하나 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 이뮤노글로불린을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산의 공중합체 및 γ 에틸-L-글루타메이트, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일을 초과하여 분자를 방출할 수 있는 반면, 특정 히드로겔은 단백질을 보다 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 이뮤노글로불린이 체내에 장시간 동안 잔존하는 경우에, 이들은 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성이 상실될 수 있고 면역원성 상의 변화가 가능해진다. 관련 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S--S 결합 형성인 것으로 밝혀지는 경우에, 술프히드릴 잔기를 변형시키는 것, 산성 용액으로부터 동결건조시키는 것, 수분 함량을 제어하는 것, 적합한 첨가제를 사용하는 것, 및 특정한 중합체 매트릭스 조성물을 개발하는 것에 의해 안정화를 달성할 수 있다.
D. 치료 방법
본 발명의 인테그린 베타7 길항제, 예컨대 항-베타7 항체 (및 보조 치료제)는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내에 의해 투여하고, 경우에 따라 국부 치료를 위해 병변내 투여한다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 특히 항체의 용량을 감소시킨 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 투약은 부분적으로 투여가 단기 투여인지 아니면 장기 투여인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 치료제는 우수한 의료 행위에 부합되는 방식으로 제제화 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 요인은 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 요인을 포함한다. 본 발명의 치료제를, 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 하나 이상의 작용제와 함께 반드시 제제화할 필요는 없지만, 임의로 제제화한다.
중등도-중증 활동성 UC를 갖는 대상체에 대한 표준 치료는 아미노살리실레이트, 경구 코르티코스테로이드, 6-메르캅토퓨린 (6-MP) 및/또는 아자티오프린의 표준 용량을 이용한 요법을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 인테그린 베타7 길항제, 예컨대 항-베타7 인테그린 항체를 사용하는 요법은 이러한 대상체에 대한 표준 치료를 이용하여 달성된 것보다 탁월한, 질환 완화 상의 개선 (질환의 신속한 제어 및/또는 연장된 완화), 및/또는 임상 반응 상의 개선을 가져다 줄 것이다.
한 실시양태에서, 염증성 장 질환 (IBD)을 갖는 인간 대상체에서의 IBD에 대한 본 발명의 치료는 이러한 대상체에게 유효량의 치료제, 예를 들어 항-베타7 인테그린 항체를 투여하는 것을 포함하고, 대상체에게 유효량의 제2 의약, 즉 면역억제제, 통증 제어제, 항설사제, 항생제 또는 그의 조합물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
예시적 실시양태에서, 상기 제2 의약은 아미노살리실레이트, 경구 코르티코스테로이드, 6-메르캅토퓨린 (6-MP) 및 아자티오프린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 제2 의약은 또 다른 인테그린 베타7 길항제, 예를 들어 또 다른 항-베타7 인테그린 항체 또는 시토카인에 대한 항체이다.
이들 제2 의약 모두는 서로 조합하여 사용할 수 있거나 또는 그 자체를 제1 의약과 조합하여 사용할 수 있기 때문에, 본원에서 사용된 바와 같은 표현 "제2 의약"은 이것이 각각 제1 의약 이외의 유일한 약물이라는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 제2 의약이 1종의 의약일 필요는 없고, 1종 초과의 이러한 약물로 이루어지거나 이것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 이들 제2 의약은 일반적으로 이전에 사용되던 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나 또는 지금까지 사용되던 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다. 적어도 이러한 제2 의약을 임의로 사용하는 경우에, 이는 유발되는 부작용을 없애거나 저하시키기 위해, 특히 제1 의약을 이용한 초기 용량을 벗어난 후속 용량에 제1 의약이 존재하지 않았을 경우에 보다 적은 양으로 사용된다. 예를 들어, 본원의 항-베타7 인테그린 항체를 이용한 요법으로, 스테로이드의 양을 점점 감소시킬 수 있거나 불연속적으로 투여할 수 있다.
본원에서의 조합 투여는 개별 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 공-투여, 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 여기서 바람직하게는 둘 다의 (또는 모든) 활성 작용제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다.
제2 의약의 조합 투여는 개별 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 공-투여 (동시 투여), 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 여기서 바람직하게는 둘 다의 (또는 모든) 활성 작용제 (의약)가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다.
E. FACS 분석
다양한 림프구 집단은 관련 기술분야에서 이용가능한 기술, 예를 들어 유동 세포측정법 분석 (FACS) 등을 이용하여 바이오마커, 비제한적으로 예를 들어 CD4, CD45RA 및 베타7의 조합물의 발현 수준에 의해 확인된다. 이들 마커의 상이한 발현 패턴을 나타내는 림프구의 하위세트 집단은 관련 기술분야에 사용되고 있는 표준 기술, 예를 들어 유동 세포측정법 (FACS)을 이용하여 확인된다.
형광-활성화 세포 분류 (FACS)는 생물학적 세포의 불균질 혼합물을 2개 이상의 용기 내로 분류시키는 방법을 제공하는데, 이는 각 세포의 특이적 광 산란 및 형광성 특징을 기초로 하여 한번에 1개 세포를 분류한다. 이는 개별 세포로부터 형광성 신호를 신속하고, 객관적이며 정량적으로 기록할 수 있게 할 뿐만 아니라 특별히 관심있는 세포를 물리적으로 분리시켜 주기 때문에 유용한 과학적 기기이다. 세포 현탁액이 협소하고 신속하게 유동하는 액체 스트림의 중앙에 혼입된다. 유동은 세포들이 그의 직경을 기준으로 하여 세포 간에 큰 분리가 존재하도록 배열된다. 진동 기전은 세포 스트림이 개별 액적으로 나뉘게 한다. 하나 초과의 세포가 비말될 확률이 낮도록 시스템을 조정한다. 스트림이 액적으로 나눠지기 직전에, 유동은 형광 측정 스테이션 내로 통과하는데, 여기서 각 세포의 관심있는 형광성 특성을 측정한다. 전기적 전하 링을 스트림이 액적으로 나눠지는 지점에 바로 놓아둔다. 전하를 바로 직전의 형광 세기 측정치를 기준으로 하여 링 위에 놓아두고, 반대 전하는 액적이 스트림으로부터 나눠짐에 따라 액적 상에 트랩핑된다. 이때, 하전된 액적은 그의 전하를 기준으로 하여 액적을 용기 내로 돌려 주는 정전기 편향 시스템으로 끝난다. 몇몇 시스템에서는, 전하를 스트림에 직접 적용하고, 갑자기 중단되는 액적은 스트림과 동일한 부호의 전하를 유지하고 있다. 이때, 액적이 갑자기 중단된 후에 스트림은 중성으로 돌아온다.
유동-세포측정기에 의해 생성된 데이터를 1차원으로 플롯팅하여 히스토그램을 생성시키거나, 또는 2차원 도트 플롯 또는 심지어 3차원으로 플롯팅할 수 있다. "게이트(gate)"로 지칭되는 일련의 하위세트 추출을 생성시킴으로써, 형광 강도를 기초로 이러한 도표 상의 영역들을 순차적으로 분리할 수 있다. 진단용 및 임상용으로 구체적인 게이팅 프로토콜이 존재한다. 플롯은 종종 로그 스케일로 만들어진다. 상이한 형광성 염료의 방출 스펙트럼이 검출기에서의 신호와 중복되기 때문에, 전기적으로 뿐만 아니라 연산적으로 보완되어야 한다. 종종, 유동 세포측정기를 이용하여 축적된 데이터는 다른 사람이 사용하기 위해 다른 곳에 마련된 기계를 재분석할 수 있다 (Loken MR. "Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry and Sorting": 341-53. Wiley. (1990)).
다양한 림프구의 양은 관련 기술분야에서 다양한 방식으로 정량화할 수 있다. 투여전 기준선 수준의 백분율로서의 절대 계수치를, 환자로부터 수집한 샘플에서 각 시점에서 림프구 하위세트에 대해 계산할 수 있다. 또한, 림프구의 각각의 하위세트에 대한 절대 계수치를 계산할 수 있는데, 이는 절대 림프구 계수치 (말초혈 1 마이크로리터당 림프구로서 표현된 혈액학 측정치로부터 수득한 값) X 각 하위세트에 대한 게이팅 림프구의 백분율이다 (유동 세포측정법 분석으로부터 수득함).
F. 치료 요법 설계
약물 개발은 복잡하고 비용이 많이 드는 공정이다. 신규 약물을 시장에 내놓는데 드는 비용은 1십억 달러 이상인 것으로 추정된다. I상 임상 시험 중인 약물의 10% 미만이 승인 단계에 있다. 약물이 후기 단계에서 실패하는 두가지 주요 이유는 용량-농도 반응과 예측치 못한 안전성 현상 사이의 관계에 관한 이해 부족이다. 이러한 시나리오를 고려해 볼 때, 약물이 생체 내에서 어떻게 수행되고 임상적 치료 후보의 성공을 어떻게 도와 줄 것인지를 예측하는 데에 도움을 주는 가능한 도구를 갖는 것이 중요하다 (Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)).
약동학 (PK)은 약물의 흡수성, 분포도, 대사 및 제거 특성을 특성화한다. 약역학 (PD)은 투여된 약물에 대한 생리학적 및 생물학적 반응을 규정한다. PK/PD 모델링은 이들 두가지 과정 사이의 수학적 및 이론적 연관성을 확립하고, 보다 우수한 약물 작용을 예측하는데 도움을 제공하였다. 시뮬레이션을 통한 컴퓨터-이용 시험 설계 및 통합형 PK/PD 모델링을 많은 약물 개발 프로그램에 도입하고 있고, 그 영향력은 점차적으로 커지고 있다 (Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)).
PK/PD 시험은 전형적으로, 약물 개발 과정의 모든 단계에서 수행한다. 개발은 점차적으로 복잡해지고, 시간 소모적이며 비용이 많이 들기 때문에, 개발 회사들은 시작시 결함이 있는 후보를 없애기 위해 PK/PD 데이터를 보다 잘 이용하고, 임상적으로 성공할 기회가 가장 높은 후보를 확인하고자 한다 (문헌 [Lakshmi Kamath, 상기 문헌]).
PK/PD 모델링 접근 방식은 바이오마커 반응, 약물 수준 및 투여 요법 사이의 관계를 결정하는데 유용한 것으로 입증되고 있다. 약물 후보의 PK/PD 프로파일 및 이에 대한 환자의 반응을 예측할 수 있는 능력은 임상 시험의 성공에 있어 중요하다. 분자 생물학 기술에 있어서의 최근의 진보 및 다양한 질환에 대한 표적의 보다 나은 이해는 바이오마커를 약물의 치료적 효능의 우수한 임상 지표로서 검증해 주었다. 바이오마커 검정은 약물 후보에 대한 생물학적 반응을 확인하는데 도움을 제공하였다. 일단 바이오마커가 임상적으로 검증되면, 시험 시뮬레이션을 효과적으로 모델링할 수 있다. 바이오마커는 언젠가 약물 개발에 있어서의 임상 결과를 대신할 수 있는 대용의 지위를 달성할 수 있는 잠재력을 갖는다. (문헌 [Lakshmi Kamath, 상기 문헌]).
본 발명의 추가 상세내용은 하기의 비제한적 실시예에 의해 예시된다.
실시예
실시예 1
중등도 내지 중증 궤양성 결장염을 갖는 환자에서 rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)의 효능 및 안전성을 평가하기 위한 II상 무작위 이중-맹검 위약-대조 연구
임상 연구의 설명
rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)의 설명
rhuMAb 베타7 (에트롤리주맙)은 인간 IgG1 하위군 III VH, κ 하위군-I VL 컨센서스 서열에 기초한 인간화 모노클로날 항체이며, 인테그린 이종이량체의 β7 서브유닛에 대해 특이적으로 지시된다. 도 1a 및 b를 참조한다. 이는 α4β7에 고친화도 (약 116 pM의 Kd)로 및 αEβ7에 고친화도 (약 1800 pM의 Kd)로 결합하는 것으로 나타났다.
이 재조합 항체는 IgG1 항체의 전형적인 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합에 의해 공유 연결된 2개의 중쇄 (446개 잔기) 및 2개의 경쇄 (214개 잔기)를 갖는다. 본원에 기재된 작업에서, 이는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산되었다. 무손상의 비-글리코실화 rhuMAb 베타7 분자의 분자 질량은 대략 144 kDa이었다. rhuMAb 베타7의 각각의 중쇄는 Asn297에 1개의 보존된 N 연결된 글리코실화 부위를 갖는다. 이 부위에 존재하는 올리고사카라이드는 전형적으로 CHO 세포에서 발현된 재조합 항체에서 관찰된 것이고, 우세한 당형태는 아시알로, 이중안테나 G0 및 G1 글리칸이었다. 2개의 G0 글리칸을 함유하고 C 말단 리신 잔기를 함유하지 않는 가장 보편적인 rhuMAb 베타7 형태의 질량은 대략 147 kDa이었다.
rhuMAb 베타7 약물 제품 및 위약은 제넨테크에 의해 제조되었다. 이들은 투명 내지 약간 유백색, 무색 내지 약간 황색의 수용액이었다. 용액은 둘 다 IV 및 SC 투여를 위해 의도된 멸균 및 보존제-무함유 액체였다.
연구 설계
연구의 설명
이 II상 연구는 중등도 내지 중증 UC를 갖는 환자에서 위약과 비교하여 2가지 rhuMAb 베타7 용량 수준에 걸쳐 효능 및 안전성을 평가하기 위한 무작위 이중-맹검 위약-대조 다기관 연구였다. 일차 효능 종점은 제10주 (연구 약물의 최종 용량이 투여된지 2주 후)에 평가되었으며, 이차 효능 종점은 제6주에 평가되었다.
환자는 제0, 4 및 8주 (100 mg 용량)에서 rhuMAb 베타7 100 mg SC (균일 용량) 및 제0주에서 420 mg SC (균일 부하 용량), 이어서 제2, 4 및 8주에서 300 mg SC (본원에서 "300 mg + LD"로 지칭됨, LD = 부하 용량) 또는 매칭 위약 SC의 용량 범위에 걸쳐 1:1:1 비로 무작위화되었다. 연구 개략도는 도 2에 도시된다. 연구는 0-35일의 스크리닝 기간, 10주의 이중-맹검 치료 기간, 18주의 안전성 추적관찰 기간, 및 17개월 (무작위화 2년 후)의 진행성 다초점성 백질뇌병증 (PML) 추적관찰 기간으로 나뉘었다.
상기 단락에 제공된 용량 값은 공칭 용량이다. II상 용량 투여는 150 mg/ml의 바이알 농도로 바이알 및 시린지를 이용하였다. 지속적인 정확한 용량 투여를 가능하게 하기 위해, 피하 (SC) 주사당 0.7 ml 부피가 선택되었다. 이에 따라, 공칭 100 mg 용량 아암에서 실제 약물 양은 105 mg (1 x 0.7 ml SC 주사)이고, 공칭 300 mg 용량에서는 315 mg (3 x 0.7 ml SC 주사)이었다. 420 mg의 실제 부하 용량은 420 mg (4 x 0.7 ml SC 주사)이었다. 모든 SC 주사는 복부에 투여하였다. 따라서, "100 mg"의 용량 및 "105 mg"의 용량은 본원에서 교환가능하게 사용된다. 또한, "300 mg"의 용량 및 "315 mg"의 용량이 본원에서 교환가능하게 사용된다.
적격 환자는 아메리칸 컬리지 오브 가스트로엔터롤로지(American College of Gastroenterology) (ACG) 실시 가이드라인; 즉, 특정 경우에 ≥ 5의 MCS, 또는 특정 경우에 ≥ 6의 MCS (≥ 2의 내시경검사 하위점수 포함)에 의해 증명된 바와 같은 중등도 내지 중증 질환의 증거와 함께, 조직병리학 보고에 의해 확증된 임상 및 내시경 증거; ≥ 1의 직장 출혈 하위점수 (표 1 참조); 및 항문 가장자리로부터 최소 25 cm의 질환 활동성의 내시경 증거에 따라 진단된 UC의 지속기간이 최소 12주가 되어야 한다. 이 연구에 대한 추가의 포함 및 배제 기준은 국제 특허 공개 번호 WO/2012/135589에서 제공된다.
<표 1> 궤양성 결장염 활동성의 평가를 위한 메이요 클리닉 점수화 시스템.
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a 각각의 환자는 대변 빈도수의 이상의 정도를 확립하기 위해 그 또는 그녀 자신의 대조군으로서의 역할을 한다.
b 1일 출혈 점수는 그날의 가장 심한 출혈을 나타낸다.
c 의사의 전반적 평가는 3가지 다른 기준, 환자의 복부 불편 및 전반적 행복감의 1일 기억, 및 다른 관찰, 예컨대 신체적 소견 및 환자의 수행 상태를 확인한다.
무작위화 전에, 환자는 UC에 대한 병용 의약의 안정한 용량을 투여중이어야 한다. 경구 5-아미노살리실산 (5-ASA) 및 면역억제제 (아자티오프린 [AZA], 6-메르캅토퓨린 [6-MP] 또는 메토트렉세이트) 용량은 제1일의 무작위화 전에 적어도 4주 동안 안정하게 유지되어야 한다. 국소 5-ASA 또는 코르티코스테로이드를 투여받는 환자는 제1일의 무작위화 2주 전에 중지되어야 한다. 경구 코르티코스테로이드 용량은 제1일의 무작위화 전에 2주 동안 안정하게 유지되어야 한다. 고용량 스테로이드를 투여받는 환자는 제1일의 무작위화 전에 2주 동안 ≤ 20 mg/일로 용량 감소되어야 한다. 연구 치료 기간 동안 경구 코르티코스테로이드를 투여받는 환자의 경우에, 스테로이드의 감량은 2주 동안 1주일당 5 mg 프레드니손 또는 프레드니손 등가물의 속도로, 이어서 중지까지 1주일당 2.5 mg 프레드니손 또는 프레드니손 등가물의 속도로 제10주에 시작되어야 한다. 경구 면역억제제 (경구 코르티코스테로이드 이외의 것)를 투여받는 환자의 경우에, 면역억제제의 감량은 제8주에 시작되어야 하고, 환자는 제10주까지 면역억제제를 완전히 중지하여야 한다. 이전에 항-TNF 요법을 투여받은 환자는 제1일의 연구 약물을 투여받기 위한 무작위화 전에 최소 8주 동안 요법을 중지하여야 한다. 환자가 연구 동안 임의의 시점에서 지속적인 또는 증가하는 질환 활동성을 경험한 경우, 스테로이드 및/또는 면역억제제 용량 증가 형태의 구조 요법이 연구자의 임상 판단에 따라 증가되거나 개시될 수 있다. 구조 요법을 필요로 하는 환자는 연구에 남도록 허용되었지만, 연구 치료를 중지하였고, 데이터 분석 동안 치료 실패를 경험한 것으로 분류되었다.
환자는 이들이 적어도 하나의 항-TNF 작용제를 비롯한 통상의 요법에 반응하는데 실패했는지의 여부를 결정하기 위해 평가되었다. 본원에 사용된 바와 같이, 항-TNF 작용제 및 면역억제제에 대한 반응의 상실 및/또는 불내성은 하기를 의미한다. 항-TNF 작용제와 관련하여, 반응의 상실 및/또는 불내성은 활동성 질환의 증상이 하기 중 하나 이상을 사용한 이전의 치료에도 불구하고 지속됨을 의미한다: (a) 인플릭시맙: 6주에 걸쳐 5 mg/kg IV, 3회 용량 및 제8주에 평가; (b) 아달리무맙: 제0주에 1회 160 mg SC 용량, 이어서 제2주에 1회 80 mg 용량 및 그 다음 제4 및 6주에 40 mg, 이와 함께 제8주에 평가; 또는 이전의 반응 후에 정기적으로 예정된 유지 투여 동안 재발 활동성 증상 (반응하였고 반응을 상실하지 않은 환자에서의 치료의 선택적 중지는 자격이 없음); 또는 적어도 하나의 항-TNF 항체에 대한 불내성의 병력 (주입-관련 반응 또는 주사-부위 반응, 감염, 울혈성 심부전, 탈수초화를 포함하나, 이에 배타적이거나 제한되지는 않음). 면역억제제와 관련하여, 반응의 상실 및/또는 불내성은 활동성 질환의 증상이 적어도 8주 동안 1주일당 25 mg SC/근육내 (또는 나타낸 바와 같음)의 아자티오프린 (≥ 1.5 mg/kg) 또는 등가 용량 (mg/kg)의 6-메르캅토퓨린 (≥ 0.75 mg/kg) 또는 메토트렉세이트 중 하나 이상을 사용한 이전의 치료에도 불구하고 지속되는 것; 또는 하나 이상의 면역억제제의 불내성의 병력 (췌장염, 약물 열, 발진, 오심/구토, 간 기능 검사 상승, 티오퓨린 S-메틸트랜스퍼라제 유전자 돌연변이, 감염을 포함하나, 이에 배타적이지는 않음)을 의미한다.
연구 치료에 대한 무작위화는 코르티코스테로이드를 사용한 병용 치료 (예/아니오), 면역억제제를 사용한 병용 치료 (예/아니오), 이전 항-TNF 노출 (예/아니오) (미국에서 무작위화된 환자 제외) 및 연구 장소에 의해 계층화되었다.
UC 질환 활동성은 스크리닝 (및 이것이 기준선 MCS로 간주됨), 제6주 (제4주에서의 투여 2주 후) 및 제10주 (연구 약물의 최종 투여 2주 후)에서의 MCS를 이용하여 평가되었다. 결장의 생검은 이들 동일한 시점에 수행된 연성 S상결장경검사 동안 수득되었다. 부분적 MCS는 또한 연구 전반에 걸쳐 수집되었다. 환자 보고 결과 (PRO)는 또한 간단한 염증성 장 질환 설문지 (SIBDQ) 및 MCS를 이용하여 평가되었으며, 이는 제1일 및 제6주 및 제10주에 환자에 의해 완성되었다. 또한, 질환 활동성, 1일 증상 및 UC의 영향은 스크리닝으로부터 (대략 제1일 7일 전에서 제1일까지) 및 제6주 및 제10주에서의 연구 방문 적어도 7일 전에서 연구 방문까지 환자에 의해 매일 완성된 환자 다이어리에서 수집되었다. 혈청 및 분변 샘플이 또한 바이오마커 분석을 위해 수득되었다. 대변은 바이오마커의 측정을 위해 스크리닝시 및 제6주, 제10주 및 제28주에 수득되었다. 측정을 위해 고려된 예시적인 바이오마커는 리포칼린, 칼프로텍틴 및 락토르페린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 혈청 및 혈장은 탐색적 바이오마커의 측정을 위해 스크리닝시, 제1일, 및 제4주, 제6주, 제10주, 제16주 및 제28주에 수득되었다.
본 연구에서의 일차 효능 종점은 임상 완화를 달성한 환자의 비율이었으며, 이는 제10주까지의 MCS의 ≤ 2로의 절대 감소 (개별 하위점수가 1점을 초과하지 않음)로 규정된다. 추가의 이차 종점은 하기 기재된 바와 같은 연구 결과 척도에 열거되어 있다.
결과 척도
일차 효능 결과 척도
일차 효능 결과 척도는 제10주에서의 임상 완화였다. 임상 완화는 MCS ≤ 2 (개별 하위점수는 1점을 초과하지 않음)에 의해 규정된다 (표 1 참조).
이차 효능 결과 척도
이 연구에 대한 이차 효능 결과 척도는 (1) 제6주 및 제10주에서의 임상 반응 (여기서 임상 반응은 MCS의 기준선으로부터의 적어도 3점 감소 및 30% 감소 및 직장 출혈 하위점수의 ≥ 1점 감소 또는 0 또는 1의 절대 직장 출혈 점수로 규정됨); (2) 제6주에서의 임상 완화 (상기 정의됨); 및 (3) 제6주 및 제10주에서의 0의 내시경검사 점수 및 직장 출혈 점수에 대한 지표였다.
탐색적 결과 척도
이 연구에 대한 탐색적 결과 척도는 반응 또는 완화를 달성한 환자에서 UC의 급성악화까지의 시간이었다. 이 결과 척도의 경우에, 급성악화는 3일의 연속 직장 출혈을 동반하는 부분적 MCS에서의 2점 증가, 및 연성 S상결장경검사 상에서의 내시경검사 점수 2로 정의된다.
안전성 결과 척도
rhuMAb 베타7의 안전성 및 내약성을 하기 척도를 이용하여 평가하였다: (1) 유해 사례에 대한 미국 국립 암 연구소 공통 용어 기준 (NCI CTCAE) 버전 4.0에 따라 등급화된 유해 사례 및 심각한 유해 사례의 발생률; (2) 활력 징후 및 안전성 실험실 척도에서의 임상적으로 유의한 변화; (3) 유해 사례(들)로 인한 중단; (4) 주사-부위 반응 및 과민증의 발생률 및 특성; (5) 감염성 합병증의 발생률; 및 (6) ATA의 발생률에 의해 측정된 면역원성.
약동학적 검정
rhuMAb 베타7의 PK의 결정 및 특성화를 위한 혈청 샘플을 모든 환자로부터 수득하였다. 혈청 PK 샘플을 12.5 ng/mL의 최소 정량화가능한 농도로, 검증된 가교 ELISA를 이용하여 분석하였다. 검정 방법은 이전에 기재되었다 (예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2012/135589 참조). 간략하게, 비색 검출 시스템을 이용하는 샌드위치 ELISA를 인간 혈청에서 rhuMAb 베타7 (PRO145223)을 정량화하기 위해 검증하였다. 마이크로타이터 플레이트를 rhuMAb 베타7을 포획하기 위해 1.0 μg/mL의 항-rhuMAb 베타7 항체로 코팅하였다. 희석된 샘플, 표준물 및 대조군을 플레이트에 첨가하고, 인큐베이션하였다. 후속적으로, 검출을 위해 비오티닐화 항-rhuMAb 베타7 및 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 스트렙타비딘을 첨가하고, 인큐베이션하였다. 퍼옥시다제 기질 (테트라메틸 벤지딘)을 첨가하여 색을 발현시키고, 1 M 인산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 플레이트를 검출 흡광도를 위해 450 nm에서, 참조 흡광도를 위해 620 또는 630 nm에서 판독하였다.
약역학적 검정
에트롤리주맙 약역학적 (PD) 효과를 평가하기 위해, 각각 항-베타7 항체를 사용하는 2가지 상이한 검정을 이용하였다. 제1 검정 (본원에서 "점유 검정"으로 지칭되고, 도 2a에 개략적으로 도시됨)을, rhuMab베타7 대신에 다른 경쟁 항-베타7 항체인 FIB504 (rhuMAb 베타7과 동일한 에피토프에 결합함)를 사용하는 것을 제외하고는, 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2012/135589 참조). 간략하게, 각각의 환자로부터의 말초 혈액 샘플을 연구 전반에 걸쳐 특정 시점에 수집하였다. 샘플을 나트륨 헤파린 바큐테이너 튜브에 수집하고, 실온에서 밤새 평가를 위해 협정된 시험 설비로 수송하였다. 샘플을 분취하고, 용해시키고, 세척하고, 에트롤리주맙의 존재 하에서는 β7 인테그린에 결합하지 않는 형광 표지된 항-베타7 항체인 FIB504 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 산호세)로 염색하였다. CD3, CD4, CD45RA, CD19, CD38 및 IgD에 대한 항체를 또한 첨가하여 T 및 B 림프구의 특정 하위세트를 확인하였다. 이어서, BD 팩스 칸토(FACS Canto)에 의해 샘플을 얻고, 림프구의 하위세트 상에서의 게이팅에 의해 분석하였다. 이 하위세트가 하기 표 2에 추가로 기재된다.
<표 2> 림프구의 하위세트.
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상기 표 2에 기재된 바와 같은 T 림프구를 특정 실험에서 CD4+ 또는 CD4-로서 추가로 분석하였다.
형광 표지된 FIB504의 결합을 2개의 별개의 투여전 시점 (스크린, 및 투여 1일전) 및 연구 전반에 걸쳐 특정 투여후 시점에 평가하였다. β7 인테그린에 의해 점유되지 않은 T 및 B 세포 하위세트의 절대 수를 각각의 연구 시점에서 평가하고, 각각의 투여전 기준선의 백분율 (%BL) 또는 기준선으로부터의 변화로 표현하였다. 기준선은 투여전 (스크리닝 및 투여 1일전) 값의 평균으로 규정하였다. 각각의 코호트에서, 에트롤리주맙 또는 위약으로 치료받는 환자의 평균 절대 계수치를 계산하였다.
에트롤리주맙 또는 위약을 사용하는 치료 전에, 그 도중에 및/또는 그 후에 림프구의 표면 상에 제시된 인테그린 베타7의 수준을 평가하기 위한 제2 검정 (도 2b에 개략적으로 도시되고, 본원에서 "세포 표면 베타7 인테그린 검출 검정" 또는 "발현 검정"으로 지칭됨)을 설계하였다. 발현 검정은 또한 에트롤리주맙 작용 메카니즘 (MOA)을 평가하기 위한 방법이다. 이는 말초부에서 인테그린 알파4베타7에 대한 에트롤리주맙의 결합이 리간드 MAdCAM-1과의 상호작용을 차단하며, 이에 따라 장 귀소 림프구의 장으로의 트래픽킹이 차단되고, 이에 수반하여 말초부에서 장 귀소 림프구가 상승하는 것으로 가정되기 때문이다. 실제로, 이는 관찰된 적이 있으며, 전임상 및 임상 연구 둘 모두에서 이전에 기재된 바 있다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 2009/140684 및 문헌 [Stefanich et al., Br. J. Pharmacol. 162:1855-1870 (2011)]을 참조한다. 따라서, 검정은 또한 "MOA 검정"으로 지칭된다. 또한, 인테그린 알파E베타7에 대한 에트롤리주맙의 결합은 리간드 E-카드헤린과의 상호작용을 차단하고, 장에서 림프구의 장내 체류를 억제할 것으로 가정된다. 림프성 조직 내의 염증유발 백혈구의 귀소 및 체류의 에트롤리주맙-매개된 중단이 위장관에서의 염증을 감소시키고, 이에 의해 UC 및 CD와 연관된 것을 비롯하여 IBD의 특징적인 질환 증상이 하향-조정될 것으로 가정된다.
베타7 발현 검정 (MOA 검정)은 이전에 기재되었다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2009/140684를 참조한다. 간략하게, β7 발현 T 세포의 수를 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 검정은, 형광 표지된 FIB504를 비-경쟁 항-베타7 항체인 (즉, 에트롤리주맙의 존재 하에 β7 인테그린에 결합할 수 있음) 9D8로 공지되어 있는 형광 접합된 항-베타7 항체로 대체하는 것을 제외하고는, 상기 기재된 바와 같은 점유 검정과 유사하게 수행하였다. 세포 표면 상에서 발현된 β7 인테그린을 갖는 T 및 B 세포 하위세트의 절대 수를 각각의 연구 시점에서 평가하고, 세포 하위세트 투여전 기준선의 백분율 (%BL) 또는 기준선으로부터의 변화로 표현하였다.
T 및 B 림프구 하위세트의 표면 상에서의 β7 인테그린 발현의 수준을 평가하기 위해, 세포 표면 β7 발현의 중앙 형광 강도 (MFI)를 유동 세포측정법에 의해 평가하고, 공지된 형광단 농도의 형광 표지된 마이크로비드 표준에 대해 정규화하였다. T 및 B 세포 하위세트의 세포 표면 상에서의 형광 9D8의 등가의 가용성 형광색소 분자 (MESF)를 투여전에 및 후속 투여후 시점에 평가하였다. T 및 B 세포 하위세트의 표면 상에서 발현된 β7 인테그린의 MESF를 각각의 연구 시점에서 평가하고, 그 하위세트의 투여전 기준선의 백분율 (%BL) 또는 기준선으로부터의 변화로 표현하였다.
결장 조직 분석
에트롤리주맙은 이종이량체 인테그린 α4β7 및 αΕβ7의 β7 서브유닛에 결합한다. α4β7은 혈액 및 점막 조직 둘 모두에서 백혈구 하위세트 상에서 발현되는 반면, αΕβ7은 주로 점막 조직에서의 상피내 림프구 및 수지상 세포로 한정된다. 이에 따라, 작용 부위에서 뿐만 아니라 순환 중인 에트롤리주맙의 약리학 및 작용 메카니즘을 평가하기 위해, 말초 혈액에 더하여 결장 조직을 평가하였다. 결장 조직 생검을 23명의 사전 동의한 연구-등록 환자로부터 투여전 (스크린)에 및 특정 투여후 시점 (제43일 및 제71일)에 표준 외과적 절차를 이용하여 수집하였다. 수집된 샘플 조직은, 전체 생검을 멸균 HBSS에서 세척하고, HBSS+ 5mM DTT로 환원시킨 후에, 배양 배지에서 세척하고, 콜라게나제 VIII (1.5 mg/ml)로 소화시킴으로써 현장에서 처리하였다. 이어서, 샘플을 40 μM 나일론 필터를 통해 여과하여 조직 잔해물을 제거하였다. 세포 현탁액을 배양 배지로 세척한 후에, 유동 세포측정법에 의한 평가를 위해 형광 표지된 항체 (하기 언급됨)로 염색하였다.
말초 혈액 세포에 대해 수행된 유동 세포측정법 검정과 유사하게, 결장 조직 T 림프구 하위세트 상에서의 β7 인테그린 수용체의 점유를 형광 표지된 (PE 표지) FIB504로의 염색에 의해 평가하였고, 한편 β7 인테그린 수용체의 발현은 형광 표지된 9D8 (PE 표지)을 사용하여 평가하였다. CD3 (APC 표지), CD4 (PerCP 표지), CD45RA (FITC 표지), αE 인테그린 (CD103) 및 α4 인테그린 (CD49d)에 대한 항체를 또한 첨가하여 결장 조직 T 림프구의 특정 하위세트를 확인하였다. 이어서, 샘플을 BD 팩스 칸톨(FACS Cantoll)™ 또는 BD 팩스칼리버(FACSCalibur)™ (BD 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세) 상에서 얻고, αEβ7-발현 및 α4β7-발현 CD3+CD45+의 하위세트, αEβ7-발현 및 α4β7-발현 CD3+CD4+CD45+의 하위세트, 및 αEβ7-발현 및 α4β7-발현 CD3+CD4-CD45+ T 세포 하위세트 상에서의 게이팅에 의해 분석하였다. FIB504 (비-점유 β7을 검출하기 위함) 또는 9D8 (전체 세포 표면 β7을 검출하기 위함)에 의해 결정시에, αEβ7+ 및 α4β7+ T 세포 하위세트의 백분율을 각각의 샘플 수집 시점에서 평가하고, 세포 하위세트 투여전 기준선의 백분율 (%BL) 또는 기준선으로부터의 변화로 표현하였다.
T 림프구 하위세트의 표면 상에서의 αE 및 β7 인테그린 발현 수준의 변화를 또한 혈액 (상기 언급됨)에서와 유사하게 평가하였다. 간략하게, 세포 표면 αE 및 β7 발현의 중앙 형광 강도 (MFI)를 유동 세포측정법에 의해 평가하고, 공지된 형광단 농도의 형광 표지된 마이크로비드 표준에 대해 정규화하였다. T 세포 하위세트의 세포 표면 상에서의 형광 9D8 및 항-αE의 등가의 형광 분자 (MOEF)를 투여전에 및 후속 투여후 시점에 평가하였다. T 세포 하위세트의 표면 상에서 발현된 β7 인테그린의 MOEF를 각각의 연구 시점에서 평가하고, 각각의 세포 하위세트 투여전 기준선의 백분율 (%BL)로서 표현하였다.
정량적 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 유전자 발현 분석
RNAlater® 생검을 해동시키고, 균질화하고, 리보핵산 (RNA)을 RNeasy® 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 단리하였다. RNA 완전성을 애질런트(Agilent) RNA 6000 피코 키트 (애질런트 테크놀로지스, 인크.(Agilent Technologies, Inc.), 미국 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하는 애질런트 2100 바이오분석기로 평가하였다. RNA 품질이 낮은 샘플 (RNA 완전성 수치 ≤5)을 분석에서 제외하였다 (n=9). RNA를 고성능 cDNA 역전사 키트 (라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation), 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 상보적 데옥시리보핵산으로 역전사시켰다. 유전자 발현 수준을 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (또한, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응으로도 지칭됨)에 의해 평가하였다. 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 인간 인테그린 αE (ITGAE), 인테그린 α4 (ITGA4), 인테그린 β1 (ITGB1), β7 인테그린 (ITGB7), 인터류킨 (IL) 17A, IL23A, 인터페론 γ (IFNG), IL17F, IL1B, IL12B, IL6, 종양 괴사 인자 α (TNFA), 점막 어드레신 세포 부착 분자-1 (MADCAM1), E-카드헤린 (CDH1), 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH) 프라이머 세트 (모두, 라이프 테크놀로지스 코포레이션, 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여, 택맨(TaqMan) 증폭전 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지스 코포레이션, 미국 캘리포니아주 칼스배드) 및 시약 (플루이다임(Fluidigm))을 사용하는 바이오마크(BioMark)™ HD 시스템 (플루이다임 코포레이션(Fluidigm Corporation), 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코) 상에서 진행하였다. ITGAE, ITGA4, ITGB1, ITGB7, IL17A, IL23A, IFNG, IL17F, IL1B, IL12B, IL6, TNFA, MADCAM1, 및 CDH1 발현을 ΔCt 방법을 이용하여 GAPDH 발현에 대해 정규화하였다.
면역조직화학 및 영상 정량화
포르말린-고정된 조직 샘플을 파라핀 블록에 포매시키고, 염색을 위해 4 μM 절편으로 절단하였다. 염색을 항-인테그린 αE 항체 (EPR4166; 아브캄 plc(Abcam plc), 미국 매사추세츠주 캠브리지)를 사용하여 벤치마크(Benchmark) XT (벤타나 메디컬 시스템스, 인크.(Ventana Medical Systems, Inc.), 미국 애리조나주 투산) 자동염색기 상에서 수행하고, 3,3"-디아미노벤지딘으로 발색시키고, 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
전체 슬라이드 영상을 올림푸스 나노주머(Olympus Nanozoomer) 자동화 슬라이드 스캐닝 플랫폼 (하마마츠 포토닉스 K.K.(Hamamatsu Photonics K.K.), 미국 뉴저지주 브리지워터)에 의해 200x 최종 배율에서 수득하였다. 스캐닝된 슬라이드를 24-비트 RGB 영상으로 MATLAB® 소프트웨어 패키지 (버전 R2012a; 더 매스웍스, 인크.(The MathWorks, Inc.), 미국 매사추세츠주 나티크)에서 분석하였다. 전체 세포, αE+ 세포, 및 음와 상피와 연관된 αE+ 세포를 계수하였다. 음와 상피 영역은, 개별 세포 핵을 절편화한 후에 그의 전체 영역의 ≥25%가 3,3"-디아미노벤지딘과 공동국재화된 경우에 면역조직화학 양성으로 점수화하는, 서포트 벡터 머신 및 유전자 프로그래밍의 조합을 이용하여 확인하였다.
말초 혈액에서의 PD 바이오마커 평가의 결과
PD 바이오마커 평가를 수행하기 위해, 본 발명자들은 우선 표 2 및 상기에 기재된 바와 같은 림프구의 집단을 세분하기 위한 파라미터를 결정하였다. 도 3a는 CD45RA 및 β7의 표면 발현에 기초한 말초 혈액 CD3+CD4+ T 세포의 표현형 세부분류를 보여준다. CD3+CD4+ T 세포의 표현형을 그의 귀소 특성에 따라 CD3+CD4+CD45RA-베타7높음 T 세포 (점막-귀소), CD4+CD45RA-베타7낮음 T 세포 (말초 귀소), 및 CD4+CD45RA+ T 세포 (장 및 말초 림프절 및 조직 모두로 잘 수송되는 나이브 T 세포)의 하위세트로 세분하였다. 유사한 표현형 세부분류가 또한 전체 CD3+ 및 CD3+CD4- T 세포에 대해 평가되었다 (나타내지 않음). 이러한 표현형 세부분류는 과학 문헌에서 이전에 보고된 것과 일치한다. 예를 들어, 문헌 [Rott et al., J. Immunol 156:3727-3736 (1996); Rott et al., J. Clin Invest 100:1204-1208 (1997); Williams et al., J. Immunol. 161:4227-4235 (1998); Rose et al., J. Virol. 72:726-730 (1998); Williams et al., J. Immunol 159:1746-1752 (1997); 및 Butcher et al., Adv. Immunol. 72:209-253 (1999)]을 참조한다. 본 발명자들은 또한 도 3b에 제시된 바와 같이 B 림프구 집단을 세분하였다. 여기서, 말초 혈액 CD19+ B 세포의 표현형 세부분류는 IgD 및 β7의 표면 발현에 기초한다. CD19+ B 세포의 표현형을 그의 귀소 특성에 따라 CD19+IgD-베타7높음 B 세포 (점막-귀소), CD19+IgD-베타7낮음 B 세포 (말초 귀소), 및 CD19+IgD+ B 세포 (장 및 말초 림프절 및 조직 모두로 잘 수송되는 나이브 B 세포)의 하위세트로 세분하였다. 림프구의 집단을 세분하기 위한 파라미터를 확립한 후에, 본 발명자들은 이어서 상기 기재된 에트롤리주맙의 II상 연구로부터의 환자 샘플에 대해 PD 바이오마커 평가를 수행하기 시작하였다.
점유 검정을 이용하여, 본 발명자들은 상기 기재된 임상 연구 설계에 따라 에트롤리주맙 또는 위약의 투여전 및 투여후의 말초 혈액 T 및 B 림프구 상에서의 베타7 인테그린의 점유율을 조사하였다. 도 4a는 100mg 또는 300mg+부하 용량 (LD) 에트롤리주맙 또는 위약의 피하 (SC) 투여 후의 기준선의 백분율로서 표현된, CD3+CD4+CD45RA-베타7높음 T 림프구 상에서의 β7 인테그린의 코호트 평균 (± SD) 점유율을 보여준다. 도 4b는 100mg 또는 300mg+LD 에트롤리주맙 또는 위약의 SC 투여 후의 기준선의 백분율로 표현된, CD3+CD4-CD45RA-베타7높음 T 림프구 상에서의 β7 인테그린의 코호트 평균 (± SD) 점유율을 보여준다. 그리고, 도 4c는 100mg 또는 300mg+LD 에트롤리주맙 또는 위약의 SC 투여 후의 기준선의 백분율로 표현된, CD19+ IgD-베타7높음 B 림프구 상에서의 β7 인테그린의 코호트 평균 (± SD) 점유율을 보여준다. 이들 데이터는 함께 표적 세포 상에서의 에트롤리주맙의 점유율을 나타내는, 점막 귀소 표현형 T 세포 (CD3+CD4+CD45RA-β7높음 및 CD3+CD4-CD45RA-β7높음) 및 점막 귀소 표현형 B 세포 (CD19+IgD-b7높음)의 하위세트의 평균 절대 수가 에트롤리주맙의 100 mg 또는 300 mg+LD의 4주마다 1회 (Q4W) 투여 후에 모든 연구 코호트에서 감소하였다는 것을 보여준다. 위약으로 치료받는 환자에서는 명백한 β7 점유가 나타나지 않았다. 또한, 낮은 100mg Q4W 용량으로 제공된 에트롤리주맙은 전체 투여 단계 동안 β7 수용체의 최대/최대에 가까운 점유율을 유지하기에 충분하였다.
이어서, 발현 검정을 이용하여, 본 발명자들은 말초 혈액에서 순환하는 베타7 발현 T 및 B 림프구의 수를 평가하였다. 이 결과는 도 5a (장 귀소 CD3+CD4+ T 세포), 5b (장 귀소 CD3+CD4- T 세포) 및 5c (장 귀소 CD19+ B 세포)에 제시된다. 알 수 있는 바와 같이, 표적 세포에 결합된 에트롤리주맙을 나타내는, 말초 혈액 T 세포 (CD3+CD4+CD45RA-β7높음 및 CD3+CD4-CD45RA-b7높음 "점막" 귀소 표현형) 및 B 세포 (CD19+IgD-b7높음 '점막' 귀소 표현형)의 하위세트의 중앙 절대 수는 에트롤리주맙의 100mg Q4W 또는 300mg+LD 투여 후에 모든 연구 코호트에서 증가하였다는 것을 보여준다. 위약으로 치료받는 환자에서는 실질적인 증가가 나타나지 않았다. %기준선 평가 시에, 점막-귀소 CD4+ 및 CD19+ 세포 하위세트에서의 에트롤리주맙 대 위약 사이의 차이는 제29일, 제43일, 및 제71일에 통계학적으로 유의하였다 (p < 0.05, 크루스컬 월리스(Kruskal Wallis) ANOVA). 또한, 본 발명자들은 말초 혈액에서의 점막 귀소 T 및 B 세포 하위세트의 상승이 300mg+LD 코호트와 비교하여 100mg Q4W에서 유사하였으며; CD19+ 점막 귀소 B 세포를 제외한 CD4+, CD4-, 및 CD19+ 하위세트에서 300 mg + LD 및 100 mg 투여 군 사이에 통계학적 차이가 없다는 것을 관찰하였다 (제5일에 p < 0.03, 크루스컬 월리스 ANOVA). 본 발명자들은 또한 TNF-IR 및 TNF-나이브 환자 (데이터는 나타내지 않음)에서, 데이터를 기준선으로부터의 절대 계수치 변화보다는 절대 계수치 %BL로 플롯팅하였을 때 (데이터는 나타내지 않음) 상기 기재된 하위세트의 유의한 상승을 관찰하였다. 이들 데이터는 함께 최대 증가가 낮은 100mg Q4W 용량에서 달성될 수 있었다는 것을 시사한다.
결장 조직에서의 PD 바이오마커 평가의 결과
본 발명자들은 우선 결장 생검 샘플로부터 수득한 T 림프구 상에서의 αEβ7 발현을 평가하기 위한 파라미터를 확립하였다. 대표적인 결과가 도 6에 제시된다. 도 6은 투여전 샘플에서의, αE 및 β7의 세포 표면 발현 (상단 우측 사분면, 플롯의 박스표시된 부분)에 기초한 결장 조직 CD45+CD3+CD4- T 림프구의 표현형 세부분류를 보여준다. 유사한 표현형 세부분류를 또한 결장 조직 CD45+CD3+ 및 CD45+CD3+CD4+ T 림프구 집단에 대해 수행하였으며, 본 발명자들이 모든 림프구 하위세트에서 αEβ7 발현을 관찰할 수 있었음을 나타내는 유사한 결과가 관찰되었다 (나타내지 않음).
이어서, 본 발명자들은 에트롤리주맙 (에트롤리주맙의 단일 용량, 100 mg)으로 치료받는 대표적인 환자, 또는 위약으로 치료받는 대표적인 환자로부터 얻은 결장 생검으로부터 수득한 CD45+CD3+CD4- T 림프구 상에서의 αEβ7 수용체의 점유율을 평가하였다. 각각의 치료 아암에서, 샘플을 투여전에, 제43일에 및 제71일에 수득하였다. 결과는 도 7에 제시된다. 투여전 수준과 비교하여, 에트롤리주맙을 사용하는 치료 (패널의 좌측 세트) 후 제43일 및 제71일에 αEβ7+ 세포의 백분율이 관찰가능하게 감소하였으며, 이는 최대 수용체 점유율을 확인하고 상기 기재된 결과와 일치하는 것이였다. 이러한 감소는 위약-치료 환자 (패널의 우측 세트)로부터의 세포에서 관찰되지 않았고, 이는 상기 기재된 결과와 일치한다. 이들 데이터는 에트롤리주맙이 장에서 71일의 본 연구의 지속기간 동안 그가 β7 수용체에 결합된 상태로 유지되는 질환 부위에 존재한다는 것을 입증한다. 본 발명자들은 이것이 결장 조직에서 T 세포 상에서의 αEβ7 수용체 점유를 처음 입증한 것이라고 여겼다.
상기 기재된 단일 환자 분석 뿐만 아니라, 본 발명자들은 또한 임상 연구 중인 23명의 환자 각각으로부터 얻은 결장 생검에서 수득한 CD45+ CD3+ CD4- T 림프구에서의 αEβ7 점유 및 α4β7 점유 둘 다를 평가하였다. 상기 기재된 투여 스케줄에 따라 7명의 환자에게 100 mg 에트롤리주맙을 제공하고, 7명의 환자에게 300 mg + LD 에트롤리주맙을 제공하고, 9명의 환자에게 위약을 제공하였다. 스크린 (투여전), 제43일 및 제71일에서의 코호트 중앙값의 FACS 플롯이 도 8a (αEβ7의 점유율) 및 8b (α4β7의 점유율)에 제시된다. 도 8a 및 8b 각각에서, 수용체 양성 T 세포의 백분율은 100 mg 에트롤리주맙 q4w 또는 300 mg q4w + LD의 투여 후의 모든 환자에서 감소하였으나, 이러한 감소는 위약-치료 환자에서는 나타나지 않았다. 또한, αEβ7 및 α4β7은 각각 에트롤리주맙 투여 후에 조사된 두 용량 수준 및 두 시점에서 최대로, 또는 거의 최대로 점유되었다. 본 발명자들은 TNF-나이브 환자와 비교하여 TNF-IR에서 명백한 점유의 차이를 관찰하지 못하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이에 따라, 결장 조직에서의 에트롤리주맙에 의한 표적 부착이 확인되었다.
추가의 PD 바이오마커 평가
상기 논의된 바와 같이, 에트롤리주맙은 100 mg 및 300 mg + LD 용량 둘 모두에서 CD4+β7+ T 림프구 상의 β7 수용체를 최대로 점유하였으며, 이에 상응하여 말초 혈액에서 CD4+β7+ T 림프구가 특정량 증가하였다. CD19+β7+ B 림프구에서 유사한 결과가 관찰되었다. 결장 점막에서, β7 수용체의 최대 점유율이 또한 두 용량에서 관찰되었다. 그러나, 위약과 비교하여 에트롤리주맙-치료 환자에서 β7 발현 CD4- T 세포의 전체적인 상대 빈도수의 차이는 관찰되지 않았다.
본 발명자들은 또한 결장 점막에서의 인테그린 β7 (도 9a), β1 (도 9b), α4 (도 9c) 및 αE (도 9d)의 발현을 qPCR에 의해 평가하였다. 도 9a에 나타난 바와 같이, qPCR에 의해 관찰시에 에트롤리주맙-치료 환자 및 위약 사이에서 β7 유전자 발현의 명백한 변화가 나타나지 않았으며, 임상 완화를 달성하지 못한 에트롤리주맙-치료 환자와 비교하여 임상 완화를 달성한 이들 환자 사이에서도 발현의 변화가 나타나지 않았다. 도 9b-9d는 완화자에서 에트롤리주맙 투여 후의 결장 생검에서의 β1-, α4-, 및 αE-인테그린 발현이 최소로 변화하거나 전혀 변화하지 않았다는 것을 보여준다.
장 림프구 구획의 추가의 평가시에, 위약과 비교하여 에트롤리주맙-치료 환자의 장음와 상피에서의 αE+ 세포의 백분율은 감소하였으나 (도 10a-b), 고유판에서의 αE+ 세포는 명백하게 감소하지는 않은 것으로 관찰되었다 (도 11a-b). 또한, 임상 완화를 달성하지 못한 에트롤리주맙-치료 환자와 비교하여 임상 완화를 달성한 이들 환자로부터의 생검에서 상피 세포-연관 αE+ 세포의 수는 감소하고 (도 12a), E-카드헤린의 발현은 증가하였다 (도 12b). MAdCAM-1 발현, 림프구 유전자 발현 및 염증성 시토카인 유전자 발현을 분석하여, 임상 완화를 달성하지 못한 에트롤리주맙-치료 환자와 비교하여 임상 완화를 달성한 이들 환자로부터의 생검에서 도 13에 나타낸 유전자의 발현이 감소하였다는 것을 밝혀내었다 (도 13a-m).
본 발명자들은 추가의 PD 바이오마커 평가의 결과를 다음과 같이 해석하였다. 장으로의 림프구 트래픽킹을 매개하는데 있어서의 β7 수용체의 역할과 일치하게, 말초 혈액에서는 β7-발현 림프구의 상응하는 빈도수 증가가 나타났으나 결장 점막에서는 그렇지 않았다. 모든 에트롤리주맙-치료 환자에서 최소 10주 동안 최대 β7 점유율이 관찰되었으나, 모든 환자에서 임상 이익이 관찰되지는 않았으며, 이는 β7 수용체의 차단에도 불구하고 일부 환자에서 염증 과정이 계속 진행된다는 것을 시사한다. 이는 장에 이미 체류하고 있던 면역 세포의 염증유발 활성 또는 장 점막으로의 백혈구 트래픽킹의 β7-비의존성 메카니즘에 의한 것으로 설명할 수 있다. 이를 뒷받침하여, 임상 완화를 달성한 에트롤리주맙-치료 환자와는 달리, 임상 완화를 달성하지 못한 이들 환자에서는 림프구 유전자 발현의 감소가 관찰되지 않았다. 염증의 대안적 메카니즘을 보다 잘 이해하기 위해서는 에트롤리주맙을 사용하는 장기 요법을 받고 있는 환자에서의 연구가 필요할 것이다.
임상 완화를 달성한 에트롤리주맙-치료 환자에서 점막 염증유발 시토카인 발현은 감소한 반면, E-카드헤린의 발현은 증가하였다. E-카드헤린은 건강한 대조군과 비교하여 염증성 장 질환을 갖는 환자에서 보다 낮은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌으며 (Arijs et al., Am J Gastroenterol 106:748-61 (2011)), 이는 관찰된 E-카드헤린의 증가가 이들 환자에서 점막 치유와 관련된다는 것을 시사한다. 이러한 관찰은 에트롤리주맙을 제공받은 환자에서의 조직학적 질환 활동성 점수의 개선에 의해 뒷받침된다.
투약 및 투여 요법 근거
II상 연구에서 시험된 투여 요법에 대한 근거를 I상 연구 후에 확립하였고, 이는 이전에 기재된 바와 같은 I상 환자 샘플의 PK 분석 및 집단 PK 모델링에 기초한다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2012/135589를 참조한다. 여기서, 본 발명자들은 특히 결장 조직에서의 베타7 점유율에 대해, II상 연구 중인 환자로부터 수득한 데이터에 기초하여 분석을 정밀화하고자 하였다.
연구 중인 환자 중 2명에게 오직 에트롤리주맙의 단일 용량만을 제공하고, 투여 전의, 및 하기 추가로 기재된 바와 같은 투여 후의 특정 시점에서의 결장 생검 샘플을 제공하였다. 이들 환자는 도 8c (점선)에 제시된다. 본 발명자들이 상기 기재된 바와 같이 결장 조직에서의 수용체 점유율을 분석하였을 때, 본 발명자들은 2명의 환자 중 1명이 제43일에 점유를 나타내었으나 제71일에는 점유가 나타나지 않는다는 것을 발견하였다. 이 환자에서, 혈청 약물 수준은 제43일에 4.7 μg/ml, 제71일에 0.5 μg/ml였다. 두번째 환자에서, 본 발명자들은 샘플을 이용할 수 없어서 제43일에서의 점유율을 분석할 수 없었으나, 제1 환자의 경우에서와 같이, 수용체는 제71일에 점유되지 않았다. 이 환자에서의 혈청 약물 수준은 제71일에 검출 한계 미만이었다.
이러한 결과로 인해 본 발명자들은, 결장 생검을 수득한 23명의 환자 각각에서의 에트롤리주맙의 혈청 농도를 제43일 및 제71일에서 이들 결장 생검으로부터 수득한 T 세포 상에서의 베타7 점유의 수준과 비교하였다. 그 결과가 도 14에 제시된다. 결장 조직 림프구 상에서의 베타7 수용체의 점유가 혈청 에트롤리주맙 농도가 1.7 μg/ml 이상인 모든 환자에서 관찰되었다. 오직 에트롤리주맙의 단일 용량만을 제공받고, 그의 수용체가 제71일에 점유되지 않은 2명의 환자는 1 μg/ml 미만의 혈청 농도를 나타내었다. 결장 조직에서 점유를 보이는 각 환자의 경우에, 혈장에서 상응하는 점유가 나타났다. 이에 따라, 본 발명자들은 I상 시험에서 결장 조직의 림프구 상에서의 혈청 약물 수준 및 수용체 점유 사이의 관계를 말초 혈액에서 관찰된 PK/PD 관계와 비교하였다. I상 시험에서, 수용체 점유에 대해 예측된 IC90은 이전에 기재된 바와 같이 1.3 μg/ml로 결정되었다. 이 예측된 IC90은 여기 기재된 바와 같이, 결장 조직에서의 점유에 필요한 혈청 농도와 일치하고, 본질적으로 이와 동일하다. 이들 데이터 및 II상 연구로부터의 다른 데이터를 사용하여, 본 발명자들은 집단 PK 모델링 (예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2012/135589 참조)을 이용하여 100 mg (4주마다) 또는 50 mg (2주마다)의 용량이 시험된 환자 집단의 대부분에서, 결장 조직 베타7 점유를 유지하는데 충분하게 될 1.7 μg/mL의 최소 약물 혈청 농도를 유지할 것으로 예측되지는 결정하였다.
상기 기재된 결과로부터의 놀랍고 예상치 못한 결과는 에트롤리주맙 치료 (4주마다 100 mg)를 개시한 후 임의의 시점에서의 말초 혈액의 림프구 상에서의 베타7 수용체의 점유의 수준이 결장 조직의 림프구 상에서의 베타7 수용체의 점유의 수준과 본질적으로 동일하다는 것이었다. 이는 모노클로날 항체 (mAb)의 큰 분자량이 그의 분포 부피를 제한하기 때문에 놀랍고 예상치 못한 것이었다. 전형적으로, mAb의 분포는 그의 거대한 크기 및 친수성으로 인해 혈관 및 간질 공간으로 한정된다. 따라서, mAb에 대한 중앙 구획 (Vc)에서의 분포 부피는 일반적으로 혈장 부피와 동일하거나 또는 이보다 약간 더 크다 (Mascelli et al., J. Clin Pharmacol 47; 553-565 (2007); Lobo et al., J. of Pharmaceutical Sci. Bol 93, 2645-2668 (2004)). 이에 따라, 일반적으로 혈청에서의 mAb 농도가 조직의 작용 부위에서의 mAb의 농도를 나타내지는 않는 것으로 간주된다.
생검 또는 부검에 의해 조직 샘플을 수득한 조직에서의 mAb의 농도를 평가함으로써 보다 직접적으로 항체 분포를 조사하였다. mAb의 분포는 또한 방사성-표지된 항체를 사용하여 연구하였다. 문헌에 보고된 대부분의 항체의 경우, 조직 대 혈액 농도 비가 0.1-0.5 범위인 것으로 밝혀졌다 (Lin et al., The J. of Pharmacol and Experi Thera Vol 288, 371-378 (1999); Lobo et al., J. of Pharmaceutical Sci. Bol 93, 2645-2668 (2004)). 이는 대부분의 경우에, 조직 (뇌 조직 제외)에서의 mAb 농도가 혈액에서의 mAb 농도의 대략 10-50%인 반면, 뇌에서의 mAb 농도는 혈액 뇌 장벽에 의한 보호로 인해 훨씬 낮다는 것 (혈액에서의 mAb 농도의 0.05-0.2% 범위)을 의미한다. 일반적으로 혈청에서의 mAb 농도가 작용 부위에서의 mAb 농도를 나타내지는 않는 것으로 간주되기 때문에, 조직 내에 수용체를 포화시키기에 충분한 노출을 제공하기 위해서는 최대 10배 더 높은 혈청 농도가 요구될 수 있다. 그러나, 여기서 본 발명자들은, UC 환자에서 (N=23 환자로부터의 데이터에 기초하여), 혈액에서 β7 수용체를 포화시키기 위해 필요한 혈청 농도 (1-3 μg/mL)가 장 조직에서 β7 수용체를 포화시키기 위해 필요한 혈청 농도 (1.7 - 4 μg/mL)와 매우 유사하다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이와 같은 혈액 및 조직 구획 사이의 거의 일-대-일 관계가 관찰되고 설명되는 것이 처음이라고 생각한다. 이러한 관계에 대해 몇 가지 설명이 가능하다. 혈액에서 이용가능한 β7 수용체의 총량 (예를 들어, β7 항원을 발현하는 세포의 수)이 조직에서보다 훨씬 더 많을 수 있기 때문이라는 설명이 가능하다. 대안적으로, UC 환자의 장 조직이 정상 조직보다 "더 누출되기 쉬우므로" 동일한 혈청 농도 하에서 mAb가 조직에 더 많이 분포하기 때문일 수 있다.
요컨대, 본원에 기재된 작업에 기초하여, 말초 혈액 (용이하게 접근가능한 부위)에서의 베타7 수용체 점유는 결장 조직 (훨씬 덜 접근가능한 부위)에서의 베타7 수용체 점유의 대용적 지표로서 역할을 할 수 있다. 이는 에트롤리주맙 및 다른 인테그린 베타7 길항제에 대한 투약법 선택 및 투여 요법 설계에 적용될 수 있다. PK/PD 관계는 혈액에서 혈청 약물 농도 및 베타7 수용체 점유를 평가하여, 혈액에서 수용체를 포화시키기에 충분한 혈청 약물 표적 농도를 평가함으로써 확립될 수 있다 (이는 이후에 동일한 또는 거의 동일한 관계가 결장의 질환 부위에 적용될 수 있다는 정보와 함께 투약법 선택 또는 투여 요법의 설계에 사용되어 투약/투여 요법 선택에 훨씬 더 큰 신뢰성을 제공할 수 있음).
본 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> USE OF BIOMARKERS FOR ASSESSING TREATMENT OF GASTROINTESTINAL INFLAMMATORY DISORDERS WITH BETA7 INTEGRIN ANTAGONISTS <130> P5599R1-WO <140> <141> <150> 61/914,619 <151> 2013-12-11 <150> 61/805,860 <151> 2013-03-27 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Leu His 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Ile, Met or Val <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> His, Tyr, Phe or Ser <400> 26 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ser or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Gln or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser, Asp, Leu or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ile, Val, Glu or Lys <220> <223> see specification as filed for detailed description of substitutions and certain embodiments <400> 27 Xaa Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Asn, Val, Trp, Tyr, Arg, Ser, Thr, Ala, Phe, His, Ile, Leu or Met <400> 28 Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Xaa Thr 1 5 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Tyr, Phe, Val or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ser or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Asn, Thr, Ala or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Pro, His, Asp or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Ser or Gly <400> 29 Gly Xaa Ile Ser Tyr Xaa Gly Ser Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Lys 1 5 10 15 Xaa <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Arg, Met, Ala, Glu, Gly, Gln or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Phe or Tyr <400> 30 Ala Xaa Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Xaa 1 5 10 <210> 31 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Leu 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 32 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn 20 25 30 Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (42)

  1. 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료 후 또는 치료 도중의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 치료 전의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 치료 전과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 바이오마커의 양의 변화는, 환자에서의 위장 장애의 치료를 위한 길항제의 효능을 나타내거나, 또는 효능의 하나 이상의 추가의 바이오마커와 조합되어 상기 효능을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율, 또는 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 또는 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 또는 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 또는 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수인, 환자에서의 위장 염증성 장애의 치료를 위한 인테그린 베타7 길항제의 효능을 결정 또는 모니터링하거나, 또는 상기 효능을 결정 또는 모니터링하는 것을 돕는 방법.
  2. 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료 후 또는 치료 도중의 위장 염증성 장애를 갖는 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 치료 전의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 치료 전과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 바이오마커의 양의 변화는, 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자의 반응성을 나타내거나, 또는 반응성의 하나 이상의 추가의 바이오마커와 조합되어 상기 반응성을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율, 또는 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 또는 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 또는 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 또는 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수인, 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료에 대한 위장 염증성 장애를 갖는 환자의 반응성을 결정 또는 모니터링하거나, 또는 상기 반응성을 결정 또는 모니터링하는 것을 돕는 방법.
  3. 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료 후 또는 치료 도중의, 위약-대조 임상 시험 중인 길항제-치료 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 위약-치료 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 위약-치료 환자에서의 바이오마커의 양과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 길항제-치료 환자에서의 바이오마커의 양의 변화는 길항제-치료 환자에서의 위장 장애의 치료를 위한 길항제의 효능을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율, 또는 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 또는 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 또는 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 또는 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수인, 위약-대조 임상 시험 중인 길항제-치료 환자에서의 위장 염증성 장애의 치료를 위한 인테그린 베타7 길항제의 효능을 결정 또는 모니터링하는 방법.
  4. 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료 후 또는 치료 도중의, 위약-대조 임상 시험 중인 위장 염증성 장애를 갖는 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 위약-치료 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 위약-치료 환자에서의 바이오마커의 양과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 길항제-치료 환자에서의 바이오마커의 양의 변화는 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자의 반응성을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율, 또는 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준, 또는 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준, 또는 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준, 또는 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수인, 위약-대조 임상 시험 중인 위장 염증성 장애를 갖는 환자의 인테그린 베타7 길항제를 사용하는 치료에 대한 반응성을 결정 또는 모니터링하는 방법.
  5. 인테그린 베타7 길항제의 투여 요법을 사용하는 치료 후 또는 치료 도중의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양을 치료 전의 환자로부터 수득한 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교한 결과에 기초하여 길항제의 투여 요법을 조정하는 것을 포함하며, 여기서 치료 전과 비교하여 치료 후 또는 치료 도중의 바이오마커의 양의 변화는 환자에서의 위장 장애의 치료를 위한 길항제의 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 이에 대한 반응성을 나타내고, 바이오마커는 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율인, 환자에서의 위장 염증성 장애의 치료를 위한 인테그린 베타7 길항제의 투여 요법을 결정하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이고, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체가 αEβ7 수용체인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이고, 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체가 α4β7 수용체인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이고, 여기서 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율은, 결장 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율과 본질적으로 동일한 것으로 이전에 결정된 말초 혈액 림프구 상에서의 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율을 측정하여 결정되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 결장 림프구 상에서의 길항제에 의한 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체 점유율이고, 여기서 인테그린 베타7 서브유닛-함유 수용체의 점유율은 림프구를 인테그린 베타7 길항제와 동일한 에피토프에 결합하는 표지된 항-베타7 항체와 인큐베이션하는 것, 림프구를 세척하는 것, 및 유동 세포측정법에 의해 표지된 림프구의 백분율을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 결정되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 표지가 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌 (APC), 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP), PE-Cy7, APC-Cy7 및 APC-H7로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 인테그린 베타7 길항제가 에트롤리주맙이고, 표지된 항-베타7 항체가 에트롤리주맙 또는 FIB504인 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 점유율의 변화가 증가 또는 감소인 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준이고, 인테그린 수용체 리간드가 MadCAM-1인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 유전자 발현의 변화가 감소인 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 하나 이상의 인테그린 수용체 리간드의 유전자 발현 수준이고, 인테그린 수용체 리간드가 E-카드헤린인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 유전자 발현의 변화가 증가인 방법.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 하나 이상의 림프구 유전자의 유전자 발현 수준이고, 하나 이상의 림프구 유전자가 CD19, CD8, 및 CD3엡실론으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 유전자 발현의 변화가 감소인 방법.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 하나 이상의 시토카인의 유전자 발현 수준이고, 하나 이상의 시토카인이 IL-1β, IL-6, IL-12-p40, IL-17A, IL-17-F, IL-23A, IFNγ 및 TNFα로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 유전자 발현의 변화가 감소인 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 수준이 결장 생검 조직에서 측정되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 유전자 발현 수준이 qPCR에 의해 측정되는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 장음와 상피에서의 알파E-양성 세포의 수이고, 알파E-양성 세포의 수의 변화가 감소인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 길항제의 제1 용량을 투여한 후 100일 이내에 측정되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 바이오마커가 (a) 제43일 및 제71일에 또는 (b) 제6주 및 제10주에 측정되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 위장 염증성 장애가 염증성 장 질환인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 염증성 장 질환이 크론병 (CD) 또는 궤양성 결장염 (UC)인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  29. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 베타7 길항제가 항-베타7 항체인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 항체가 모노클로날인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항체가 키메라, 인간 또는 인간화 항체인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 항체가 항체 단편인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 항-베타7 항체가 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하고, 여기서
    (i) HVR-L1은 아미노산 서열 A1-A11을 포함하고, 여기서 A1-A11은 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8), 또는 RASESVDDLLH (서열 9) 또는 서열 1, 7, 8 또는 9의 변이체 (서열 26)이고, 여기서 아미노산 A2는 A, G, S, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A3은 S, G, I, K, N, P, Q, R, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, A4는 E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N, 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A5는 S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A6은 V, R, I, A, G, K, L, M, 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A7은 D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A8은 D, G, N, E, T, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A9는 L, Y, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A10은 L, A, I, M, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 아미노산 A11은 H, Y, F, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (ii) HVR-L2는 아미노산 서열 B1-B8을 포함하고, 여기서 B1-B8은 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 20), 또는 XaaYASQSIS (서열 21, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄) 또는 서열 2, 20 또는 21의 변이체 (서열 27)이고, 여기서 아미노산 B1은 K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 및 Xaa (여기서 Xaa는 임의의 아미노산을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B4는 S 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B5는 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B6은 S, D, L, 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B7은 I, V, E, 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iii) HVR-L3은 아미노산 서열 C1-C9를 포함하고, 여기서 C1-C9는 QQGNSLPNT (서열 3) 또는 서열 3의 변이체 (서열 28)이고, 여기서 아미노산 C8은 N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iv) HVR-H1은 아미노산 서열 D1-D10을 포함하고, 여기서 D1-D10은 GFFITNNYWG (서열 4)이고;
    (v) HVR-H2는 아미노산 서열 E1-E17을 포함하고, 여기서 E1-E17은 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5), 또는 서열 5의 변이체 (서열 29)이고, 여기서 아미노산 E2는 Y, F, V, 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E10은 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E12는 N, T, A, 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 13은 P, H, D, 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E15는 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E17은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (vi) HVR-H3은 아미노산 서열 F2-F11을 포함하고, 여기서 F2-F11은 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 19)이거나; 또는 아미노산 서열 F1-F11을 포함하고, 여기서 F1-F11은 AMTGSSGYFDF (서열 16), ARTGSSGYFDF (서열 17), 또는 AQTGSSGYFDF (서열 18), 또는 서열 6, 16, 17, 18, 또는 19의 변이체 (서열 30)이고, 여기서 아미노산 F2는 R, M, A, E, G, Q, S이고/거나, 아미노산 F11은 F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 항-베타7 항체가 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1-H3) 서열 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1-L3) 서열을 포함하고, 여기서
    (i) HVR-L1은 서열 7, 서열 8 또는 서열 9를 포함하고;
    (ii) HVR-L2는 서열 2를 포함하고;
    (iii) HVR-L3은 서열 3을 포함하고;
    (iv) HVR-H1은 서열 4를 포함하고;
    (v) HVR-H2는 서열 5를 포함하고;
    (vi) HVR-H3은 서열 6 또는 서열 16 또는 서열 17 또는 서열 19를 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 항-베타7 항체가 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 것인 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항-베타7 항체가 에트롤리주맙인 방법.
  37. 제5항에 있어서, 길항제가 항-베타7 항체이고, 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 이에 대한 반응성을 나타내는 것으로 결정된 투여 요법이 420 mg 항-베타7 항체의 제1 부하 용량의 피하 투여, 이어서 2주 후에 315 mg 항-베타7 항체의 제1 유지 용량의 피하 투여, 이어서 315 mg 항-베타7 항체의 하나 이상의 후속 유지 용량의 피하 투여를 포함하고, 여기서 각각의 후속 유지 용량은 이전 유지 용량 4주 후에 투여되는 것인 방법.
  38. 제5항에 있어서, 길항제가 항-베타7 항체이고, 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 이에 대한 반응성을 나타내는 것으로 결정된 투여 요법이 4주마다 105 mg 항-베타7 항체의 피하 투여를 포함하는 것인 방법.
  39. 제5항에 있어서, 길항제가 항-베타7 항체이고, 투약 또는 투여 요법의 효능 또는 이에 대한 반응성을 나타내는 것으로 결정된 투여 요법이 2주마다 50 mg 항-베타7 항체의 피하 투여를 포함하는 것인 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항-베타7 항체가 에트롤리주맙인 방법.
  41. 제1항 또는 제3항에 있어서, 제6주에서의 임상 완화, 제10주에서의 임상 완화, 제6주에서의 임상 반응, 제10주에서의 임상 반응, 제6주에서의 0의 내시경검사 점수 및 직장 출혈 점수, 제10주에서의 0의 내시경검사 및 직장 출혈 점수, 및 반응 또는 완화를 달성한 후 UC의 급성악화까지의 시간으로부터 선택된 효능의 하나 이상의 임상 바이오마커를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제2항 또는 제4항에 있어서, 제6주에서의 임상 완화, 제10주에서의 임상 완화, 제6주에서의 임상 반응, 제10주에서의 임상 반응, 제6주에서의 0의 내시경검사 점수 및 직장 출혈 점수, 제10주에서의 0의 내시경검사 및 직장 출혈 점수, 및 반응 또는 완화를 달성한 후 UC의 급성악화까지의 시간으로부터 선택된 반응성의 하나 이상의 임상 바이오마커를 추가로 포함하는 방법.
KR1020157030754A 2013-03-27 2014-03-26 베타7 인테그린 길항제를 사용하는 위장 염증성 장애의 치료를 평가하기 위한 바이오마커의 사용 KR102175688B1 (ko)

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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2016136716A (ru) 2014-03-27 2018-04-28 Дженентек, Инк. Способы диагностики и лечения воспалительного заболевания кишечника
JP2018504584A (ja) * 2014-12-02 2018-02-15 ネステク ソシエテ アノニム 過敏性腸疾患患者を治療するためのベドリズマブの投与計画を確立する方法
CA2916283A1 (en) * 2015-01-09 2016-07-09 Pfizer Inc. Dosage regimen for madcam antagonists
JP2018507868A (ja) * 2015-02-26 2018-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド インテグリンベータ７アンタゴニスト及びクローン病の治療方法
CN108139385A (zh) * 2015-07-27 2018-06-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于诊断和治疗炎症性肠病的方法
SG10201913748QA (en) * 2015-08-11 2020-03-30 Univ Osaka Antibody
CN115350276A (zh) 2016-04-15 2022-11-18 小利兰·斯坦福大学托管委员会 用于确定和实现抗cd47药剂治疗癌症的治疗有效剂量的方法
WO2018081580A1 (en) * 2016-10-27 2018-05-03 Geneoscopy, Llc Detection method
BR112020000698A2 (pt) 2017-07-14 2020-07-14 Pfizer Inc. anticorpos contra madcam
CN107478563A (zh) * 2017-07-19 2017-12-15 浙江省人民医院 一种基于流式细胞术检测结核特异性双细胞因子的方法
US20210214797A1 (en) 2018-06-01 2021-07-15 Geneoscopy, Llc Detection method
WO2020226498A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Rijksuniversiteit Groningen Biomarker, kit and method for predicting clinical responsiveness to therapy with an agent that targets alpha4beta7 integrin.
CA3190109A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Genentech, Inc. Anti-integrin beta7 antibody formulations and devices
CN114200143B (zh) * 2020-09-18 2024-04-02 上海透景诊断科技有限公司 血红蛋白和转铁蛋白在检测消化道出血中的应用
CA3173754A1 (en) * 2021-09-03 2024-03-02 Pliant Therapeutics, Inc. Therapeutic modulation of integrins
CN116246795B (zh) * 2023-05-12 2023-07-21 中国医学科学院北京协和医院 一种检测样本中外周血生物标志物的试剂在制备预测食管癌化疗疗效的产品中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070050986A (ko) * 2004-09-03 2007-05-16 제넨테크, 인크. 인간화 항-베타７ 길항제 및 그의 용도
KR20110018365A (ko) * 2008-05-16 2011-02-23 제넨테크, 인크. 베타7 인테그린 길항제를 이용한 위장 염증 장애의 치료를 평가하기 위한 바이오마커의 용도
WO2012135589A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 Genentech, Inc. Methods of administering beta7 integrin antagonists
KR20180018365A (ko) * 2016-08-10 2018-02-21 스미또모 가가꾸 가부시키가이샤 편광 필름

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
IL47062A (en) 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4256833A (en) 1979-01-08 1981-03-17 Majid Ali Enzyme immunoassay for allergic disorders
US4665077A (en) 1979-03-19 1987-05-12 The Upjohn Company Method for treating rejection of organ or skin grafts with 6-aryl pyrimidine compounds
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
IL85746A (en) 1988-03-15 1994-05-30 Yeda Res & Dev Preparations comprising t-lymphocyte cells treated with 8-methoxypsoralen or cell membranes separated therefrom for preventing or treating autoimmune diseases
FI891226A (fi) 1988-04-28 1989-10-29 Univ Leland Stanford Junior Reseptordeterminanter i anti-t-celler foer behandling av autoimmunsjukdom.
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
WO1990008187A1 (en) 1989-01-19 1990-07-26 Dana Farber Cancer Institute Soluble two domain cd2 protein
ES2062519T5 (es) 1989-03-21 2003-07-16 Immune Response Corp Inc Vacunacion y metodos contra enfermedades originadas a partir de respuestas patogenicas mediante poblaciones especificas de linfocitos t.
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
KR100216097B1 (ko) 1989-07-19 1999-08-16 크리스토퍼 제이. 마골린 자가면역 및 악성종양질환 치료제로서의 t세포 수용체 펩티드
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DK1136556T3 (da) 1991-11-25 2005-10-03 Enzon Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multivalente antigen-bindende proteiner
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
WO1997033551A2 (en) 1996-03-15 1997-09-18 Millennium Pharmaceuticals Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CA2561164A1 (en) 2004-04-01 2005-10-20 Elan Pharmaceuticals, Inc. Steroid sparing agents and their use
RU2015112024A (ru) * 2012-10-05 2016-11-27 Дженентек, Инк. Способы диагностики и лечения воспалительного заболевания кишечника

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070050986A (ko) * 2004-09-03 2007-05-16 제넨테크, 인크. 인간화 항-베타７ 길항제 및 그의 용도
KR20110018365A (ko) * 2008-05-16 2011-02-23 제넨테크, 인크. 베타7 인테그린 길항제를 이용한 위장 염증 장애의 치료를 평가하기 위한 바이오마커의 용도
WO2012135589A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 Genentech, Inc. Methods of administering beta7 integrin antagonists
KR20180018365A (ko) * 2016-08-10 2018-02-21 스미또모 가가꾸 가부시키가이샤 편광 필름

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
British Journal of Pharmacology (2011) 162(8):1855-1870 *
Current Immunology Reviews (2012) 8(2):118-134 *
Gastroenterology (2008) 134(4)Sup1:A-99 *
Gut (2011) 60(8):1068-1075 *
Gut (2012.06.20.) 62(8):1122-1130 *
Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (2009) 330(3):864-875 *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112015024856A2 (pt) 2018-04-17
US20160209426A1 (en) 2016-07-21
JP6615745B2 (ja) 2019-12-04
IL241185A0 (en) 2015-11-30
HK1218442A1 (zh) 2017-02-17
SG11201507974RA (en) 2015-10-29
EP3933401A2 (en) 2022-01-05
AU2014241552B2 (en) 2018-08-16
CN105143876A (zh) 2015-12-09
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CN105143876B (zh) 2018-04-20
EP3933401A3 (en) 2022-04-13
JP6740294B2 (ja) 2020-08-12
EP3495814A3 (en) 2019-07-17
EP2979087A1 (en) 2016-02-03
RU2015145610A (ru) 2017-05-04
AU2018206728B2 (en) 2020-10-22
MX2015011765A (es) 2016-01-15
IL273930A (en) 2020-05-31
JP2016515705A (ja) 2016-05-30
EP2979087A4 (en) 2017-03-15
JP2019023637A (ja) 2019-02-14
AU2014241552A1 (en) 2015-10-08
JP2020191883A (ja) 2020-12-03
IL241185B (en) 2020-05-31
KR102175688B1 (ko) 2020-11-06
WO2014160753A1 (en) 2014-10-02
US20200025775A1 (en) 2020-01-23
AU2018206728A1 (en) 2018-08-02
JP7055176B2 (ja) 2022-04-15
US20220357343A1 (en) 2022-11-10
CA2904095A1 (en) 2014-10-02

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