KR20150110886A

KR20150110886A - 골 관련 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150110886A
Application number: KR1020140032886A
Authority: KR
Inventors: 민용기; 김혜주; 배수정; 최상운
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2015-10-05
Also published as: KR101594506B1

Abstract

본 발명은 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 조골세포의 분화를 효율적으로 촉진함이 다각적으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 골 조직의 형성 및 회복을 통해 골 형성 결핍 및 골질 감소에 기인하는 다양한 골 관련 질환의 근본적인 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

골 관련 질환 치료용 조성물{A Composition for Treating Bone-Related Diseases}

본 발명은 조골세포의 분화를 촉진하는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

선진화에 따른 생활수준 향상과 의학기술 발달에 의해 빠른 속도로 노인인구가 증가함에 따라 고령화 사회로 접어들고 있으며, 2015년까지 전세계 골다골증 시장이 12조원에 이를 것으로 예상되고 있어 골다공증 치료제를 목표로 하는 의약품 계발에 글로벌 기업 및 연구 그룹들은 골다공증 치료제 개발에 주목하고 있다.

Wnt 시그널링, TGF-β, BMP 및 IGF-1은 골형성을 유도하는 최상위 조절자이다. 조골 세포의 분화를 자극하는 상위 시그널들은 서로 상호적인 관계를 유지하고 있는데 이들 상위 시그널링에 의해 초기 조골세포 분화의 핵심 전사인자인 RUNX2가 발현 및 활성화가 조절된다. RUNX2 프로모터의 C-말단에는 p300/CBP, HDACs 및 HAT와 같은 염색질 재구성 인자(chromatin remodeler)가 상호작용할 수 있고, TGFβ/BMP, Src, PTHrP 및 WNT와 같은 매개자가 상호작용함으로써 RUNX2 기능을 조절 할 수 있다.

RUNX2의 발현은 후기 전사인자인 osterix, ALP, Osteocalcin, MSX2, Dlx3 및 Dlx5의 발현을 활성화시키며, 결과적으로 조기 조골세포(pre-osteoblast)에서 성숙한 조골세포로 분화가 이루진다. 이러한 과정을 거쳐서 완전히 성장한 조골세포는 무기질화(mineralization)된 골세포(osteocyte)를 형성한다.

뼈세포를 구성하는 파골세포와 조골세포 그리고 골세포에 있어서 WNT 시그널링은 이들 뼈를 구성하는 세포들의 네트워크에 깊이 관여하고 있다. WNT 시그널링 경로는 골대사에 있어서 중요한 핵심 조절자이다. 이는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)로부터 분화된 골아 전구세포의 골형성을 유도하며, 성숙 조골세포로부터 골세포 형성을 증가시켜 골 무기질화를 시킨다. 뼈생성이 증진되어야 할 때 성숙 조골세포와 골세포는 OPG를 분비하여 파골세포의 활성화에 중요한 RANKL의 작용을 제어 하며, 과다한 뼈세포의 증진을 막아야 할 때에는 WNT 길항제인 DKK1과 SOST를 분비하여 조골세포의 분화를 활성화시키는 WNT 시그널링을 조절할 수 있다. WNT 시그널링 돌연변이가 있는 환자군을 조사 해보면 25%는 낮은 골질 표현형(low bone mass phenotype), 75%는 높은 골질(high bone mass)을 가진다. 환자에 있어서 LRP5/6에 돌연변이가 있는 경우 골다공증-가성신경교종 증후군(osteopotosis-pseudoglioma syndrome)을 일으키며, WNT 길항제인 SOST에 돌연변이가 있는 경우 경화협착증-반 부헴 병(sclerosteosis-Van Buchem disease)을 유발한다는 보고가 있다. 동물모델에서 WNT 시그널링 경로에 관련된 각각의 분자들의 기능소실(loss-of-function) 및 기능 획득(gain-of-function) 시켰을 때 나타나는 골질의 BMD 증감을 분석해보면 WNT 시그널링이 뼈에서 일어날 수 있는 병증에 깊은 관련이 있음을 알 수 있다. 이러한 WNT의 다방면적인 작용을 고려해 볼 때 뼈세포의 항상성 유지에 있어서 WNT 시그널링의 역할은 매우 크기 때문에 골다공증 치료제 개발에 있어서 좋을 표적이 된다.

WNT 시그널링 OFF 상태일때 APC, AXIN 및 GSK3b는 세포질 내의 β-카테닌을 인산화시킴으로서 β-TRCP에 의한 유비퀴틴화를 유도한다. WNT3a에 의한 WNT 시그널링 ON 상태에서는 β-카테닌에 대한 음성 작용을 가지는 GSK3β의 기능이 불활성화 되면서 자유 β-카테닌을 형성하게 되고, 이는 핵으로 이동된다. 활성의 β-카테닌은 전사인자로써 Tcf/Lef 프로모터에 작용하게 된다. 보고에 의하면 Tcf는 RUNX2의 발현에 영향을 조절하여 조골 세포의 분화를 증진시키는 것으로 알려져 있다.

조골세포의 성장과 분화에 있어서 중요한 역할을 하는 BMP는 TGF-β상과(superfamily)에 속한다. BMP2에 의한 수용체 활성화는 SMAD 인산화를 유도하여 pSMAD 1/5/8의 핵내 유입을 가능하게 한다. 이는 뼈세포의 형성과, 리모델링, 성장과 발달 과정에 중요한 RUNX2와 상호작용하여 하위인자들의 조절능력을 향상 시키는 것으로 알려져 있다. 또한 BMP 경로에 의해 활성화되는 MAPK인 ERK, p38 및 JNK는 RUNX2의 안정성 및 전사인자로서의 기능에 있어 중요한 p300에 대한 조절에 관여함으로써 조골세포의 분화능을 증진시키는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 골다공증의 주원인인 골형성 능률저하로 인한 골밀도와 골질 감소를 개선하기 위해 조골세포의 증식 및 분화를 활성화시키는 선도물질을 발굴하고 이의 약리활동 기작을 규명하여, 골다공증에 대한 효율적인 치료 조성물을 발굴하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 골밀도 및 골질 감소를 원인으로 하는 다양한 골 관련 질환에 대한 신규한 치료 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물이 조기 근원세포주(pre-myoblast)를 골 조직의 형성 및 복원에 필수적인 조골세포(osteoblast)로 효율적으로 분화시킨다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:

화학식 1

상기 화학식에서, R₁및 R₂는 각각 독립적으로 수소, C₁-C₃ 알킬 또는

(A₁내지 A₃는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C₁-C₃ 알콕시, 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C₁-C₃ 알킬이거나, 또는 A₁및 A₂또는 A₂및 A₃가 서로 연결되어 1,3-디옥솔렌(dioxolene) 고리구조를 형성한다)이며;

는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않고; R₃는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우 산소이고 단일결합을 형성하는 경우 -NH₂이며, R₄는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우 (B₁은 비치환되거나 C₁-C₃ 알킬 아민, 하이드록시 또는 C₁-C₃ 알콕시로 치환된 페닐 또는 비치환되거나 C₁-C₃ 알킬, C₁-C₃ 알킬 아민 또는 할로 페닐로 치환된 5각-9각 고리의 헤테로 아릴이고; n은 0-1의 정수이다)이고 단일결합을 형성하는 경우

이다;

화학식 2

상기 화학식에서, D₁ 및 D₂는 각각 독립적으로 C₁-C₃알킬이고; D₃및 D₄는 각각 독립적으로 C₁-C₃ 알킬, 페닐 또는 페닐 C₁-C₃ 알킬이다.

본 발명자들은 골밀도 및 골질 감소를 원인으로 하는 다양한 골 관련 질환에 대한 신규한 치료 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물이 조기 근원세포주(pre-myoblast)를 골 조직의 형성 및 복원에 필수적인 조골세포(osteoblast)로 효율적으로 분화시킨다는 사실을 발견하였다.

본 명세서에서 용어 “알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등을 포함한다. C₁-C₃알킬은 탄소수 1 내지 3의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C₁-C₃ 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.

본 명세서에서 용어“할로겐”은 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.

명세서에서 용어“알콕시”는 알코올에서 수소가 제거되어 형성된 라디칼을 의미하며, 예를 들어 C₁-C₃알콕시는 탄소수 1 내지 3의 알코올에서 수소가 제거되어 형성된 라디칼을 의미한다.

본 명세서에서 용어“알킬아민”은 알킬기로 치환된 아민기를 의미하며, “C₁-C₃ 알킬 아민”은 C₁-C₃ 알킬기가 1개(모노알킬아민) 또는 2개(디알킬아민) 치환된 경우를 포함한다.

본 명세서에서 용어“헤테로아릴”은 헤테로원자로서 고리 내에 산소, 황 또는 질소를 포함하는 헤테로사이클릭 방향족기를 의미한다. 구체적으로는, 헤테로원자는 산소 또는 질소이다. 헤테로원자의 개수는 1-3이며, 구체적으로는 1-2이다. “5각-9각 고리의 헤테로아릴”은 탄소 및 헤테로 원자를 모두 포함하여 고리를 이루는 원자의 수가 5개-9개인 헤테로아릴을 의미하며, 고리는 단일고리(monocycle) 또는 2개 고리(bicycle)일 수 있다.

본 명세서에서 용어“페닐 알킬”은 페닐기가 치환된 알킬기를 의미하며,“페닐 C₁-C₃ 알킬”은 페닐기가 결합한 C₁-C₃ 알킬을 의미한다.

본 명세서에서 용어“골 관련 질환”은 골밀도가 감소되어 발생하는 모든 질환을 의미한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하는 RUNX2의 전사를 활성화하며, 골형성에 관여하는 SMAD 경로와 WNT 시그널링을 활성화한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 골 형성 결핍 및 골질 감소에 기인하는 다양한 골 관련 질환에 있어서 골 조직의 형성 및 회복을 통한 근본적인 치료를 제공할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 골 관련 질환은 골다공증, 골수염, 골연화증, 암세포의 골전이에 의한 골 손상, 추간판 탈출증, 섬유성 골이형성증, 클리펠-파일 증후군, 낭성 섬유뼈염, 베제트병 및 고칼슘혈증으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 구체적으로는 골다공증이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 화학식 1의 R₁은 수소 또는 C₁-C₃ 알킬이고; R₂는

(A₁내지 A₃는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메톡시, C₁-C₂ 알킬, 트리플루오로메틸이거나, 또는 A₁및 A₂또는 A₂및 A₃가 서로 연결되어 1,3-디옥솔렌(dioxolene) 고리구조를 형성한다) 또는 C₁-C₃ 알킬이다.

본 발명의 보다 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 화학식 1의 R₄는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우

(B₁은 비치환되거나 디메틸아민, 하이드록시 또는 메톡시로 치환된 페닐 또는 비치환되거나 메틸, 디메틸아민 또는 플루오로페닐로 치환된 5각-9각 고리의 헤테로 아릴이고; n은 0-1의 정수이다)이고 단일결합을 형성하는 경우

이다. 보다 더 구체적으로는, 상기 5각-9각 고리의 헤테로 아릴은 퓨란, 피롤 또는 벤조피롤이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 화학식 2의 D₁ 및 D₂는 메틸이고; D₃및 D₄는 각각 독립적으로 메틸, 페닐 또는 페닐 메틸이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 3 내지 23으로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다:

화학식 3 화학식 4

화학식 5 화학식 6

화학식 7 화학식 8

화학식 9 화학식 10

화학식 11 화학식 12

화학식 13 화학식 14

화학식 15 화학식 16

화학식 17 화학식 18

화학식 19 화학식 20

화학식 21 화학식 22

화학식 23

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 24 또는 25로 표시되는 화합물이다:

화학식 24 화학식 25

본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 상기 화학식 3 또는 22로 표시되는 화합물이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물 중 화학식 3(CGC-26) 및 화학식 22(CGC-26H-20) 화합물은 가장 우수한 조골세포 분화유도 활성을 가지며, 아울러 화학식 22 화합물은 높은 안정성을 가져 효율적인 골 관련 질환 치료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 화합물의 약제학적 허용 가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 구연산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 젖산염, 주석산염, 말레인산염, 푸마린산염, 글루콘산염, 메탄설폰산염, 글리콘산염, 숙신산염, 4-톨루엔설폰산염, 글루투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 또는 아스파트산염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 무기산 및 유기산을 이용하여 형성되는 염이 모두 포함된다. 또한, 본 발명의 화합물은 용매화물(예를 들면 수화물)의 형태로도 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 골 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 통상적인 제제로 제형화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 통상적인 제형이라 함은 예를 들면 경구(정제, 캡슐제, 분말제), 구강 내, 혀 밑, 직장 내, 질 내, 비강 내, 국소 또는 비경구(정맥 내, 해면체 내, 근육 내, 피하 및 관 내를 포함) 투여 제형을 일컫는다. 예를 들면, 본 발명에 따른 화합물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다. 액체 제제는 현탁제(예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제조된다. 또한, 비경구적으로 예를 들면, 정맥 내, 해면체 내, 근육 내, 피하 및 관내를 통하여 주사되는 경우 무균의 수용액 형태로서 사용하는 것이 가장 바람직하며, 이때 상기 용액은 혈액과의 등장성을 갖기 위하여 다른 물질들(예를 들면 염(salt) 또는 만니톨, 글루코오스와 같은 단당류)를 함유할 수도 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 화합물은 조골세포의 분화를 효율적으로 촉진함이 다각적으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 골 조직의 형성 및 회복을 통해 골 형성 결핍 및 골질 감소에 기인하는 다양한 골 관련 질환의 근본적인 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 화합물 라이브러리로부터 최종 히트 화합물의 도출과정을 보여주는 간략한 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2는 C2C12 6xOSE-luc 세포주에서 루시퍼라아제 어세이를 통해 RUNX2 활성을 스크리닝한 결과를 나타낸 그림이다. 도 2a는 화합물 라이브러리를 10μM로 처리 한 후 루시퍼라아제 어세이 결과. RUNX2의 전사활성(trsnscription activity)에 대한 배수(fold) 값을 표시한 그림이다. 도 2b는 1차 스크리닝에서 발굴된 히트 화합물에 대한 농도 의존도 시험결과를 보여준다. 도 2c는 2차 스크리닝에서 얻어진 98개 히트 화합물의 루시퍼라아제 어세이 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 98종의 히트 화합물에 대한 골 형성 관련 단백질의 변화를 관찰하기 위한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 화합물들이 C2C12 세포주에서 조골세포의 분화를 자극함을 보여주는 그림이다. 도 4a는 3개의 히트 화합물의 조골세포 분화능을 관찰하기 위해 BMP와 화합물의 투여에 따른 ALP 염색 결과 및 ALP 활성측정 결과를 나타낸 그림이다. 도 4b는 본 발명의 화합물에 의한 조골세포 분화 촉진시 활성화되는 바이오마커의 단백질 수준에서의 변화를 측정한 웨스턴 블롯팅 분석결과를 나타낸다. 도 4c는 본 발명의 화합물에 의해 핵심 전사인자인 RUNX2와 BMP 경로가 자가-조절됨을 확인하기 위한 실시간-PCR 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 화합물이 C2C12 세포주의 조골세포로의 분화에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 도 5a 및 5b는 ALP 염색을 이용하여 히트 화합물 유도체의 조골세포 분화증진 활성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 히트 화합물에 대한 조골세포 분화능 실험으로써 분화 6일차에 실시한 ALP 염색 결과를 나타낸다.
도 7은 CGC-26에 의한 RUNX2와 TCF1의 상호작용을 확인하기 위해 면역침강을 한 후 웨스턴 블롯팅을 한 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 본 발명의 화합물인 CGC-26H-20가 C2C12 세포주의 조골세포로의 분화에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 도 8a 및 도 8b는 CGC-26H-20 처리 30분 후(도 8a) 및 1일 후(도 8b) 단백질 수준에서의 변화를 분석하기 위한 웨스턴 블롯팅을 한 결과를 나타낸다. 도 8c 및 8d는 CGC-26H-20에 의한 RUNX2의 기능에 중요하다고 알려진 라이신 잔기의 아세틸화 변화를 확인하기 위해 면역침강을 한 후 웨스턴 블롯팅을 실시한 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 MC3T3-E1 세포주에서 CGC-26 및 CGC-26H-20의 효과를 보여주는 그림이다. 도 9a는 CGC-26 및 CGC-26H-20가 BMP2 없는 최소한의 분화조건에서 조골세포 분화능을 가지고 있는지를 관찰하기 위해 ALP 염색 및 ALP 활성측정을 수행한 결과를 나타낸 그림이다. 도 9b는 CGC-26 및 CGC-26H-20에 의한 활성-β 카테닌의 핵내 유입을 관찰하기 위하여 화합물을 4시간 동안 처리하고 형광현미경으로 관찰한 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

조골세포의 전사인자인 RUNX2 활성화 측정

1) 세포배양

조기-근원세포(pre-myoblast)인 C2C12와 C2C12 6xOSE-luc 세포주를 37℃ 인큐베이터에서 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 8mM HEPES, 2mM L-글루타민이 포함된 DMEM 으로 배양하였다. 약물에 대한 실험은 5% FBS DMEM에 BMP2 25ng/ml의 존재 또는 부재 하에서 진행하였다.

조기 조골세포(pre-osteoblast)인 MC3T3-E1는 37℃ 인큐베이터에서 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신, 8mM HEPES, 2mM L-글루타민이 포함된 α-MEM으로 배양하였다. 약물에 대한 실험은 10% FBS α-MEM에 50μg/ml L-아스코르빈산, 10mM β-GP(분화배지)의 존재 또는 부재 하에서 진행하였다.

2) 루시퍼라아제 분석

C2C12 6xOSE-luc 세포주를 4x10³/웰로 96 웰-플레이트에 씨딩하였다. 24시간 후에 화합물을 세포에 처리하였다. 다시 24시간 후에 세포를 수동 라이시스 완충액(passive lysis buffer)으로 용해한 후, 그 파쇄물과 루시퍼라아제 기질을 1 : 2.5 비율로 반응 시킨 후 Envision 700nm 파장에서 반응 값을 측정하였다. 전사 활성을 루시퍼라아제 값으로 분석하였다. HDAC 억제제인 MS275는 RUNX2의 전사를 활성화시키는 것으로 익히 알려져 있어, 이를 양성 대조군으로 하였다.

조골세포의 분화 유도 약물 발굴

1) ALP 염색

C2C12 세포주를 4x10³/웰로 96 웰-플레이트에 씨딩하였다. 24시간 후에 화합물과 BMP2 25 ng/ml을 세포에 처리하였다. 분화 3일 차에 동일한 화합물과 BMP2를 다시 처리하고 6일까지 분화시켰다. MC3T3-E1 세포주는 4 x 10⁴/웰로 24웰-플레이트에 씨딩하였다. 24시간 후에 화합물과 5μg/ml L-아스코르빈산, 10mM β-GP를 넣어서 분화시킨 후 3일에 한번씩 동일량을 처리하였다. 6일부터 ALP 염색이 가능하다. 분화시킨 세포는 ALP(Alkaline Phosphatase) 염색 킷으로 분화된 조골세포를 염색하여 약물의 분화능을 확인하였다.

2) 실시간 PCR

총 RNA는 구아니딘 이소사이아네이트-페놀-클로로포름 추출물과 TRIzol 시약에 기초한 단일 단계 방법(single-step method)에 의해 분리되며 분리된 RNA 농도는 260nm의 흡광도에서 읽어 정량하였다. 총 RNA 2μg으로부터 Omniscript^TM 역전사 킷을 이용하여 역전사 시킴으로써 cDNA를 생성시켰다. 실시간 PCR을 수행하기 위해 cDNA와 SYBR Master Mix를 프라이머와 혼합하여 전체 부피가 20㎕이 되게 하였다. RT-PCR 반응은 94℃에서 5분간의 최초 변성 후 94℃, 40초 (변성), 60℃, 40초(어닐링), 72℃, 60초(연장) 조건에서 35 사이클을 수행하였다. 그 이후 증폭 산물(10㎕)을 EtBr(Ethidium bromide)로 염색을 한 아가로스 겔에 전기영동을 하고 UV 트랜실루미네이터에 촬영하여 이미지를 폴라로이드 필름으로 캡쳐하였다. 유전자 발현은 GAPDH로 표준화하였다. cDNA 증폭을 위해 사용되는 프라이머 서열은 NCBI에서 제공하는 뉴클레오타이드 정보를 토대로 설계하였다. RT-PCR을 위해 사용된 프라이머는 RUNX, ALP, osterix, TAZ, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9 및 GAPDH이다.

조골세포 분화 촉진 효과 약물에 있어 작용 기전 연구 및 약물타겟 규명

1) 단백질 추출 및 웨스턴 블롯팅 분석

C2C12 와 MC3T3-E1을 6-웰 플레이트에 배양 배지로 씨딩 후 24시간 동안 배양하고, 분화배지의 존재 및 부재 하에서 화합물을 처리하고 30분, 1일 및 3일 시점에서 세포를 Ripa 라이시스 완충액(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC (deoxycholic acid), 0.1% SDS, 1 mM PMSF, 단백질 분해효소 억제제 및 포스파타아제 억제제)로 용해하였다. 파쇄물을 14000rpm으로 15분 간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브로 옮겨 단백질을 BCA 시약을 이용해 정량하였다. 단백질(20㎍)은 10% 아크릴아마이드가 포함된 SDS-PAGE(SDS polyacrylamide gel)에 로딩하고, SDS 전기영동용 완충액을 이용하여 Mini Gel Protein system(Bio-Rad)으로 분석하였다. 로딩이 끝난 단백질은 폴리비닐리덴 디플로라이드 막(Amersham Pharmacia Biotech, Korea)에 옮겨 250mA로 트랜스퍼 완충액 (PH 8.3)(25mM Tris-HCl, 192mM 글리신 및 20% 메탄올 함유)에서 트랜스퍼 시켰다. 트랜스퍼가 끝나면 PVDF 막을 1시간 동안 상온에서 블로킹 시약(5% 탈지분유(Amersham Pharmacia Biotech, Korea) 및 TBS-T 함유)로 블로킹시키고 세척 후 1차 항체를 BSA/TBS-T 완충액에 1:2000 으로 희석해서 섞은 후 4℃에서 O/N으로 인큐베이션하였다. 그 후 세척을 하고 2차 항체를 BSA/TBS-T 완충액에 1 : 5000로 희석하여 혼합해준 다음 상온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 후 세척을 하고 막을 ECL에 노출시켰다.

2) 면역침강

C2C12 와 MC3T3-E1을 10cm 디쉬에 배양배지로 씨딩한 후 24시간 동안 배양하고, 분화배지가 있고 없는 조건에서 화합물을 처리하고 1일 경과 시점에서 세포를 Ripa 라이시스 완충액(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC(deoxycholic acid), 0.1% SDS, 1 mM PMSF, 단백질 분해효소 억제제 및 포스파타아제 억제제)로 용해하였다. 파쇄물을 14000rpm으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브로 옮겨 단백질을 BCA 시약을 이용해 정량하였다. 시료 500μg을 새 튜브에 옮긴 후 면역침강을 하고자 하는 항체를 2μg 넣고 4℃에서 O/N으로 인큐베이션하였다. 단백질 분해효소 억제제 및 포스파타아제 억제제가 포함된 PBS로 10분 간 3번 세척한 후에 아가로스 A 비드로 2시간 면역침강 반응을 시켰다. 또 다시 10분간 3번 세척한 후 샘플 버퍼를 40μl 넣고 100℃에서 끓였다. 4000rpm으로 1분간 원심분리 한 후 비드가 따라 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 채취하여 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.

약리활성을 가지는 화합물의 선정

1) 연구의 설계

본 발명에서는 9,939개의 chem banks 화합물에 대한 약리활성을 평가하기 위해 BMP(bone morphogenetic protein)-2의 존재 유무에 따라 조골세포로 분화하는 조기 근원세포주(pre-myoblast)인 C2C12를 사용하였다. 조골세포의 분화를 촉진할 수 있는 RUNX2의 전사 활성을 조사하기 위한 루시퍼라아제 시스템을 도입하여 약물에 대한 1차 및 2차(용량 의존성) 활성평가를 통해 히트(히트) 화합물을 선정하였고, 선정된 후보 약물에 대하여 pSMAD1/5/8과 β-카테닌 단백질 증가 유무를 확인함으로써 골형성 촉진물질의 가능성을 평가, 히트 화합물을 도출하였다.

그리고 이들 히트 화합물이 미분화 상태에서 완전한 조골세포로 분화를 촉진할 수 있는지를 확인하는 분화능 테스트를 ALP 염색과 활성을 조사하여 최종 히트 후보화합물을 선정하였다.

골다공증 치료제 선도 약물을 개발하고자 조골세포의 분화를 촉진할 수 있는 RUNX2의 전사를 활성화시키는지 시험하기 위해 RUNX2가 결합하는 부위인 OSE-allel이 6개 들어 있는 루시퍼라아제 프로모터를 안정적으로 넣은 C2C12 6xOSE-luc 세포주에 9,939개의 화합물을 10μM 농도로 처리 하였다. 약물에 의해 RUNX2의 발현이 증가하게 되면 OSE에 대한 프로모터의 전사가 일어나게 되고 룻루시퍼라아제가 생성되게 된다. 생성된 루시퍼라아제를 기질과 반응시켜 envision으로 수치화 하고, 대조군에 비해 MS275 처리 군이 21.5배 증가한 것으로 보아 전사반응이 잘 이루어 졌다고 판단하고 스크리닝 결과를 분석하였다. 1차 실험을 통하여 RUNX2의 전사활성이 대조군보다 1.6배 증가시키는 화합물 384개를 도출하였고(도 5a), 용량 의존성을 확인한 2차 실험을 통해 히트 화합물 98개를 선정하였다 (도 5b 및 5c).

선발된 후보 화합물이 골형성에 관여하는 pSMAD1/5/8과 β-카테닌 단백질을 증가시키는지를 확인하여, 두 개의 시그널링을 동시에 증가시키는 4개의 히트 화합물을 도출하였으며(도 6), 이를 하기의 표 1에 나타냈다.

주요 화합물의 Runx2 활성

번호		구조	활성(fold)/농도	비고
1	CGC-26		2.3 / 10 μM
2	CGC-27		2.8 / 10 μM
3	CGC-51		2.1 / 10 μM
4	CGC-63		2.2 / 10 μM

상기 활성검사를 통해서 발굴해낸 히트 화합물인 CGC-26과 CGC-27은 SMAD 경로와 WNT 시그널링을 이중으로 활성화시키는 것으로 나타났다. 분자수준에서 이들 두 화합물이 골형성에 주요한 신호전달경로의 교차전달(cross-talk)에 어떤 영향을 주어 조골세포의 분화를 증진하게 되었는지 약리활성 및 기전연구를 하고, 이 두 약물의 유도체를 비교 분석 해 봄으로써 보다 구조적으로 안전하고 골형성 촉진에 대한 분화능이 좋은 약물을 발굴하고자 하였다.

조기-근원세포인 C2C12는 BMP2가 있는 조건에서 조골세포로 분화하게 되며 분화가 진행됨에 따라 세포내의 ALP 양이 증가하게 된다. 이를 탐지하는 ALP 염색과 ALP 활성실험을 통해 히트 화합물의 분화능 시험을 수행하였다. ALP 염색을 관찰 할 수 있는 최소한 BMP2 25 ng/ml를 사용하여 대조군 대비 염색된 세포를 관찰하여 분화의 유무를 판별하였다. 그 결과, 4개의 히트 화합물 중에 CGC-26, CGC-27 및 CGC-51이 조골세포 분화 증진능력을 가졌다는 것을 확인하였다(도 7a 하단). 세포 내의 ALP 양을 수치화시킨 ALP 활성도 염색 결과와 연관성 있게 나타났다(도 7a 상단).

본 발명자들은 조골세포로의 분화를 자극한다고 알려진 MAPK, SMAD 경로, WNT 시그널링의 대표 인자에 대하여 웨스턴 블롯팅으로 단백질 수준에서 분석하였다(도 7b). CGC-27은 SMAD1/5/8과 ERK를 인산화시킴으로써 SMAD 경로와 MAPK를 활성화시킴을 알 수 있었고 활성의 β-카테닌과 핵 내에서 RUNX2의 전사활동에 관여한다고 알려진 p300의 단백질량을 증가시켰다.

CGC-26과 CGC-63은 SMAD1/5/8과 p38을 인산화시킴으로써 SMAD 경로와 MAPK를 활성화시켰다. CGC-26은 CGC-63에 비하여 활성의 β-카테닌과 p300을 더 많이 증가시키는 것으로 확인되었다. 다음으로 조골세포의 분화가 개시될 때에 BMP 경로는 자가 조절(auto-regulation)될 수 있다는 보고가 있으므로 이들 히트 화합물에 의한 BMP 패밀리들의 RNA 수준에서의 변화를 실시간 PCR로 분석 하였다(도 7c). 그 결과 CGC-27은 BMP2와 BMP7의 증가시켰고, CGC-26과 CGC-63은 BMP2, BMP7 및 BMP9의 RNA 양을 증가시킴으로써 BMP 경로를 활성화 시키는 것을 알 수 있었다. 또한 화합물에 의해 조골세포 분화 전기 전사인자인 RUNX2의 RNA 증가와 조골세포 후기분화 마커인 ALP RNA가 증가함을 알 수 있었다. 조골세포 분화능 시험, RNA와 단백질 수준에서 시행한 실험을 종합적으로 분석한 결과 CGC-26과 CGC-27이 우수한 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

유도체의 스크리닝

그 다음으로 두 히트 화합물 CGC-26과 CGC-27의 유도체 중 조골세포 분화능이 뛰어난 유도체를 발굴하고자 하였다. 이 실험을 통해 CGC-27의 유도체로 선정된 화합물 CGC-27H-21은 CGC-27 보다 우수한 점이 관찰되지 않았고, CGC-26의 유도체 중에서는 CGC-26H-20이 우수한 활성을 나타냈다(도 8). 조골세포 분화능이 CGC-27 보다 CGC-26과 CGC-26H-20 이 더 뛰어나기 때문에 이들 두 화합물의 작용기전 연구를 수행하였다.

CGC-26과 CGC-27의 유도체 화합물의 구조

번호	코드번호	구조
1	CGC-26
2	CGC-26H-1
3	CGC-26H-2
4	CGC-26H-3
5	CGC-26H-4
6	CGC-26H-5
7	CGC-26H-6
8	CGC-26H-7
9	CGC-26H-8
10	CGC-26H-10
11	CGC-26H-11
12	CGC-26H-12
13	CGC-26H-13
14	CGC-26H-14
15	CGC-26H-15
16	CGC-26H-16
17	CGC-26H-17
18	CGC-26H-18
19	CGC-26H-19
20	CGC-26H-20
21	CGC-27
22	CGC-27H-21

CGC-26과 CGC-26H-20의 ALP 염색을 통한 약리활성 비교실험을 진행하였을 때 CGC-26H-20은 CGC-26이 가지는 조골세포 분화 촉진에 대한 약리활성을 유지할 뿐만 아니라 화합물의 안전성이 높다는 장점을 가지고 있었다(도 9).

CGC-26은 용량 의존적으로 SMAD 1/5/8과 p38의 인산화를 증가시켰다. 또한 WNT 신호가 증가할 때 나타나는 LRP의 인산화가 관찰되었고, GSK3β가 인산화됨으로써 활성 β-카테닌의 양을 증가시켰으며, 이로 인해 하위 인자인 TCF1이 증가된 것을 알 수 있었다. RUNX2의 조절자로 알려진 p300과 TAZ 단백질 수준의 증가도 반복적으로 나타났다. 또한 RUNX2, ALP, TAZ, ostrix의 RNA가 증가되는 것을 실시간 PCR로 확인하였다. 이 실험을 통해 CGC-26은 BMP 경로와 WNT 시그널링을 동시에 조절한다는 것을 알 수 있었다(도 10).

앞선 실험을 통해 CGC-26이 BMP 경로와 WNT 시그널링을 동시에 조절한다는 것을 알 수 있었다. 화합물이 어떻게 두 주요 경로의 교차전달(cross-talk)을 할 수 있는지 알아보기 위해서 문헌조사를 해 본 결과 WNT 시그널링에 의해 활성화된 TCF는 bone 세포의 RUNX에 작용하여 분화를 촉진 시킨다는 것을 알게 되었다(J. Biol Chem., 280, 33132-40(2005)). 세포에 각각의 화합물들을 처리한지 1일이 경과한 시점에서 세포를 용해하고 RUNX2 단백질을 RUNX2 항체(아가로스-A 비드 사용)로 면역침강시킨 후에 RUNX2와 TCF간의 결합유무를 관찰하였다. 그 결과 CGC-26에 의해 활성화된 WNT 경로와 BMP 활성화는 RUNX2와 TCF의 결합을 통해서 교차전달할 수 있음을 알 수 있었다(도 11).

CGC-26H-20에 대한 기작 연구 결과 CGC-26과 비교해 보았을 때 조골세포 분화능이 유사하며 단백질 수준에서 보여지는 SMAD 1/5/8 과 p38의 인산화를 증가시켰다. p38 인산화는 결과적으로 조골세포의 분화에 중요하다고 알려진 osterix를 증가시켰음을 이 실험을 통해 새롭게 알게 되었고 WNT 시그널링에 ON 되었을 때 나타나는 p-LRP6, 활성의 β-카테닌의 양이 증가하였다. CGC-26H-20은 CGC-26에 비해 화합물의 안정성이 높다는 장점을 가지고 있었다(도 12a).

본 발명자들은 다음으로 RUNX의 활성을 매개한다고 알려진 p300과의 연관성을 입증하기 위한 실험을 시작하였다. p300은 RUNX2의 라이신 잔기를 아세틸화시킴으로써 RUNX2 전사활성을 조절할 수 있다는 이전의 보고(J. Biol Chem. 281, 16502-11(2006), Mol Cell Biol., 23, 3339-51(2003))를 바탕으로 CGC-26H-20을 처리하고 1일이 지난 시점에서 세포를 용해하고 RUNX2 단백질을 RUNX2 항체(Agarose-A Bead 사용)로 면역침강시킨 후에 CGC-26H-20에 의한 p300의 증가가 미치는 RUNX2의 아세틸-라이신 정도를 관찰하였다. 그 결과 CGC-26H-20의 존재 유무에 따라 RUNX2 라이신 잔기의 아세틸화가 조절되는 것을 확인하였고, 면역침강을 아세틸-라이신으로 하고 IB를 RUNX로 한 반복실험을 실시했을 때도 같은 결과를 얻을 수 있었다. RUNX2의 크기와 항체의 IgG 밴드를 혼돈하지 않기 위해 2차 항체는 true blot-rabbit을 사용하였다.)

그 결과 이들 화합물들에 의해 활성화된 WNT 경로는 BMP가 활성화되었을 때 활성화되는 p300에 의해 RUNX2의 전사활성을 조절하며 이를 통해 상위 두 시그널링이 교차전달할 수 있음을 확인하였다(도 12b).

본 발명에서 스크리닝을 위해 사용한 C2C12는 BMP2의 존재 하에서만 골 형성 관련 시그널링이 활성화된다. 그러나 앞의 웨스턴 블롯팅 결과를 관찰해 보면 BMP2가 없는 환경 내에서도 골형성 관련 단백질들이 증가하는 것을 알 수 있다. 이론적으로 이런 변화는 화합물 단독으로도 골형성을 촉진 할 수 있음을 시사한다. 이에 본 발명자들은 조기 조골세포주에 대하여 최소한의 분화조건 내에서 화합물단독에 의하여 조골세포로의 분화능이 증가되는지를 확인해보았다. 그 결과, 화합물 처리 후 6일에 CGC-26과 그 유도체인 CGC-26H-20에 의한 ALP 증가를 ALP 염색 및 활성 분석을 통해 관찰 할 수 있었다(도 13a).

보고에 따르면 골세포에서 WNT 시그널링과 BMP 경로는 서로 교차전달하고 있고 BMP2는 WNT3a와 함께 투여할 경우 활성의 β-카테닌의 핵으로의 이동(translocation)을 증가시킴으로서 WNT 시그널링 활성을 증진시킬 수 있다(J. Bone Miner Res., 26, 718-729(2011)). 앞선 연구를 통해 화합물들에 의한 WNT 시그널링과 BMP 경로의 활성화를 p-SMAD1/5/8 과 활성의 β-카테닌을 웨스턴 블롯팅으로 알 수 있었다. 화합물들에 의해 활성의 β-카테닌의 핵으로의 유입 증진을 시각화하기 위해 후속실험으로 면역-세포화학 실험을 실시하였다(도 13b).

WNT3a와 LiCl는 활성의 β-카테닌 핵으로 이동하는지 여부를 판단하는 기준이 되었다. MC3T3-E1 세포주는 세포 크기가 크고 핵의 모습이 명확하게 구분 되는 장점이 있다. 이에, 본 발명자들은 최소한의 분화조건에서 WNT3a 50ng/ml, LiCl 25mM, BMP2 100ng/ml, 화합물 5μM을 4시간 동안 처리하여 면역-세포화학 분석을 수행하였다. 그 결과 WNT3a 와 LiCL 단독 처리에 의해 활성의 β-카테닌이 핵으로 이동되는 것을 확인하였고, 보고된 바와 같이 WNT3a 단독 처리군보다 WNT3a에 BMP2를 함께 처리하였을 때 핵내 유입된 활성의 β-카테닌을 더 많은 관찰할 수 있었다. 놀라운 것은 BMP2와는 달리 CGC-26과 CGC-26H-20는 단독처리된 WNT3a처럼 활성의 β-카테닌 이동을 일으켰으며 WNT3a 단독 처리군보다 WNT3a에 화합물들을 함께 처리하였을 때 더 많은 활성의 β-카테닌이 핵으로 이동되었음을 관찰 할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물:
화학식 1

상기 화학식에서, R₁및 R₂는 각각 독립적으로 수소, C₁-C₃ 알킬 또는
(A₁내지 A₃는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C₁-C₃ 알콕시, 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C₁-C₃ 알킬이거나, 또는 A₁및 A₂또는 A₂및 A₃가 서로 연결되어 1,3-디옥솔렌(dioxolene) 고리구조를 형성한다)이며;
는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않고; R₃는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우 산소이고 단일결합을 형성하는 경우 -NH₂이며, R₄는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우
(B₁은 비치환되거나 C₁-C₃ 알킬 아민, 하이드록시 또는 C₁-C₃ 알콕시로 치환된 페닐 또는 비치환되거나 C₁-C₃ 알킬, C₁-C₃ 알킬 아민 또는 할로 페닐로 치환된 5각-9각 고리의 헤테로 아릴이고; n은 0-1의 정수이다)이고 단일결합을 형성하는 경우
이다;
화학식 2

상기 화학식에서, D₁ 및 D₂는 각각 독립적으로 C₁-C₃알킬이고; D₃및 D₄는 각각 독립적으로 C₁-C₃ 알킬, 페닐 또는 페닐 C₁-C₃ 알킬이다.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R₁은 수소 또는 C₁-C₃ 알킬이고; R₂는
(A₁내지 A₃는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메톡시, C₁-C₂ 알킬, 트리플루오로메틸이거나, 또는 A₁및 A₂또는 A₂및 A₃가 서로 연결되어 1,3-디옥솔렌(dioxolene) 고리구조를 형성한다) 또는 C₁-C₃ 알킬인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R₄는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우
(B₁은 비치환되거나 디메틸아민, 하이드록시 또는 메톡시로 치환된 페닐 또는 비치환되거나 메틸, 디메틸아민 또는 플루오로페닐로 치환된 5각-9각 고리의 헤테로 아릴이고; n은 0-1의 정수이다)이고 단일결합을 형성하는 경우
인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 5각-9각 고리의 헤테로 아릴은 퓨란, 피롤 또는 벤조피롤인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2의 D₁ 및 D₂는 메틸이고; D₃및 D₄는 각각 독립적으로 메틸, 페닐 또는 페닐 메틸인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 3 내지 23으로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
화학식 3 화학식 4

화학식 5 화학식 6

화학식 7 화학식 8

화학식 9 화학식 10

화학식 11 화학식 12

화학식 13 화학식 14

화학식 15 화학식 16

화학식 17 화학식 18

화학식 19 화학식 20

화학식 21 화학식 22

화학식 23
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 24 또는 25로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물:
화학식 24 화학식 25
제 5 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 상기 화학식 3 또는 22로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 골 관련 질환은 골다공증, 골수염, 골연화증, 암세포의 골전이에 의한 골 손상, 추간판 탈출증, 섬유성 골이형성증, 클리펠-파일 증후군, 낭성 섬유뼈염, 베제트병 및 고칼슘혈증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 골 관련 질환은 골다공증인 것을 특징으로 하는 조성물.