KR20150110886A - A Composition for Treating Bone-Related Diseases - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a composition for preventing or treating bone-related diseases. A compound of the present invention is multilaterally confirmed that the compound efficiently promotes osteoblast differentiation. Therefore, a composition including the compound of the present invention can be helpful for use in the fundamental treatment of various bone-related diseases caused by osteopenia and reduction in ossein through formation and recovery of bone tissue.

Description

골 관련 질환 치료용 조성물{A Composition for Treating Bone-Related Diseases}[0001] The present invention relates to a composition for Treating Bone-Related Diseases,

본 발명은 조골세포의 분화를 촉진하는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for treating a bone-related disease comprising a compound that promotes osteoblast differentiation as an active ingredient.

선진화에 따른 생활수준 향상과 의학기술 발달에 의해 빠른 속도로 노인인구가 증가함에 따라 고령화 사회로 접어들고 있으며, 2015년까지 전세계 골다골증 시장이 12조원에 이를 것으로 예상되고 있어 골다공증 치료제를 목표로 하는 의약품 계발에 글로벌 기업 및 연구 그룹들은 골다공증 치료제 개발에 주목하고 있다. As the elderly population is rapidly increasing due to the advancement of living standards and medical technology, the aging society is on its way. By 2015, the global osteoporosis market is estimated to reach 12 trillion won, so that drugs targeting osteoporosis treatment Global companies and research groups are paying attention to the development of osteoporosis medicine.

Wnt 시그널링, TGF-β, BMP 및 IGF-1은 골형성을 유도하는 최상위 조절자이다. 조골 세포의 분화를 자극하는 상위 시그널들은 서로 상호적인 관계를 유지하고 있는데 이들 상위 시그널링에 의해 초기 조골세포 분화의 핵심 전사인자인 RUNX2가 발현 및 활성화가 조절된다. RUNX2 프로모터의 C-말단에는 p300/CBP, HDACs 및 HAT와 같은 염색질 재구성 인자(chromatin remodeler)가 상호작용할 수 있고, TGFβ/BMP, Src, PTHrP 및 WNT와 같은 매개자가 상호작용함으로써 RUNX2 기능을 조절 할 수 있다. Wnt signaling, TGF- [beta], BMP and IGF-1 are top-level modulators that induce bone formation. Upper signals that stimulate osteoblast differentiation maintain mutual interrelationship. RUNX2, the key transcription factor of early osteoblast differentiation, is regulated by these higher signaling. Chromatin remodeling such as p300 / CBP, HDACs and HAT can interact with the C-terminus of the RUNX2 promoter and mediate RUNX2 function by interacting with mediators such as TGFβ / BMP, Src, PTHrP and WNT .

RUNX2의 발현은 후기 전사인자인 osterix, ALP, Osteocalcin, MSX2, Dlx3 및 Dlx5의 발현을 활성화시키며, 결과적으로 조기 조골세포(pre-osteoblast)에서 성숙한 조골세포로 분화가 이루진다. 이러한 과정을 거쳐서 완전히 성장한 조골세포는 무기질화(mineralization)된 골세포(osteocyte)를 형성한다. Expression of RUNX2 activates the expression of late transcription factors osterix, ALP, osteocalcin, MSX2, Dlx3 and Dlx5, resulting in differentiation into mature osteoblasts from pre-osteoblasts. Through this process, fully grown osteoblasts form mineralized osteocytes.

뼈세포를 구성하는 파골세포와 조골세포 그리고 골세포에 있어서 WNT 시그널링은 이들 뼈를 구성하는 세포들의 네트워크에 깊이 관여하고 있다. WNT 시그널링 경로는 골대사에 있어서 중요한 핵심 조절자이다. 이는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)로부터 분화된 골아 전구세포의 골형성을 유도하며, 성숙 조골세포로부터 골세포 형성을 증가시켜 골 무기질화를 시킨다. 뼈생성이 증진되어야 할 때 성숙 조골세포와 골세포는 OPG를 분비하여 파골세포의 활성화에 중요한 RANKL의 작용을 제어 하며, 과다한 뼈세포의 증진을 막아야 할 때에는 WNT 길항제인 DKK1과 SOST를 분비하여 조골세포의 분화를 활성화시키는 WNT 시그널링을 조절할 수 있다. WNT 시그널링 돌연변이가 있는 환자군을 조사 해보면 25%는 낮은 골질 표현형(low bone mass phenotype), 75%는 높은 골질(high bone mass)을 가진다. 환자에 있어서 LRP5/6에 돌연변이가 있는 경우 골다공증-가성신경교종 증후군(osteopotosis-pseudoglioma syndrome)을 일으키며, WNT 길항제인 SOST에 돌연변이가 있는 경우 경화협착증-반 부헴 병(sclerosteosis-Van Buchem disease)을 유발한다는 보고가 있다. 동물모델에서 WNT 시그널링 경로에 관련된 각각의 분자들의 기능소실(loss-of-function) 및 기능 획득(gain-of-function) 시켰을 때 나타나는 골질의 BMD 증감을 분석해보면 WNT 시그널링이 뼈에서 일어날 수 있는 병증에 깊은 관련이 있음을 알 수 있다. 이러한 WNT의 다방면적인 작용을 고려해 볼 때 뼈세포의 항상성 유지에 있어서 WNT 시그널링의 역할은 매우 크기 때문에 골다공증 치료제 개발에 있어서 좋을 표적이 된다.In osteoclasts, osteoblasts and osteocytes constituting bone cells, WNT signaling is deeply involved in the network of cells constituting these bones. The WNT signaling pathway is an important key regulator of bone metabolism. This induces bone formation of osteoprogenitor cells differentiated from Mesenchymal Stem Cell (MSC), and increases bone cell formation from mature osteoblasts to bone mineralization. When bone formation should be promoted, mature osteoblasts and osteocytes secrete OPG to regulate the action of RANKL, which is important for osteoclast activation. When it is necessary to prevent excessive bone cell growth, secretion of WNT antagonists, DKK1 and SOST, Lt; RTI ID = 0.0 > WNT < / RTI > signaling to activate cell differentiation. A study of patients with WNT signaling mutations revealed that 25% had a low bone mass phenotype and 75% had a high bone mass. Mutations in LRP5 / 6 in patients lead to osteoporosis-pseudoglioma syndrome and mutations in the WNT antagonist SOST lead to sclerosteosis-Van Buchem disease . Analysis of bone mineral BMD changes in the animal model of loss-of-function and gain-of-function of the respective molecules involved in the WNT signaling pathway suggests that WNT signaling may be a cause of bone pain Which is the most important factor. Considering the multifaceted action of WNT, the role of WNT signaling in maintaining homeostasis of bone cells is a very good target for development of osteoporosis therapeutics.

WNT 시그널링 OFF 상태일때 APC, AXIN 및 GSK3b는 세포질 내의 β-카테닌을 인산화시킴으로서 β-TRCP에 의한 유비퀴틴화를 유도한다. WNT3a에 의한 WNT 시그널링 ON 상태에서는 β-카테닌에 대한 음성 작용을 가지는 GSK3β의 기능이 불활성화 되면서 자유 β-카테닌을 형성하게 되고, 이는 핵으로 이동된다. 활성의 β-카테닌은 전사인자로써 Tcf/Lef 프로모터에 작용하게 된다. 보고에 의하면 Tcf는 RUNX2의 발현에 영향을 조절하여 조골 세포의 분화를 증진시키는 것으로 알려져 있다. When WNT signaling is OFF, APC, AXIN and GSK3b induce ubiquitination by β-TRCP by phosphorylating β-catenin in the cytoplasm. In the ON state of WNT signaling by WNT3a, the function of GSK3? Having a negative action on? -Catenin is inactivated to form free? -Catenin, which is transferred to the nucleus. The active β-catenin acts as a transcription factor on the Tcf / Lef promoter. According to reports, Tcf is known to modulate the effect of RUNX2 on osteoblast differentiation.

조골세포의 성장과 분화에 있어서 중요한 역할을 하는 BMP는 TGF-β상과(superfamily)에 속한다. BMP2에 의한 수용체 활성화는 SMAD 인산화를 유도하여 pSMAD 1/5/8의 핵내 유입을 가능하게 한다. 이는 뼈세포의 형성과, 리모델링, 성장과 발달 과정에 중요한 RUNX2와 상호작용하여 하위인자들의 조절능력을 향상 시키는 것으로 알려져 있다. 또한 BMP 경로에 의해 활성화되는 MAPK인 ERK, p38 및 JNK는 RUNX2의 안정성 및 전사인자로서의 기능에 있어 중요한 p300에 대한 조절에 관여함으로써 조골세포의 분화능을 증진시키는 것으로 알려져 있다.BMP, which plays an important role in osteoblast growth and differentiation, belongs to the TGF-β phase (superfamily). Receptor activation by BMP2 induces SMAD phosphorylation and allows intracavitary infusion of pSMAD 1/5/8. It is known that it interacts with RUNX2, which is important for bone cell formation, remodeling, growth and development processes, thereby enhancing the control of the downstream factors. In addition, ERK, p38 and JNK, which are activated by BMP pathway, are involved in the regulation of p300, which is important for RUNX2 stability and function as a transcription factor, thereby enhancing osteoblast differentiation potential.

본 발명자들은 골다공증의 주원인인 골형성 능률저하로 인한 골밀도와 골질 감소를 개선하기 위해 조골세포의 증식 및 분화를 활성화시키는 선도물질을 발굴하고 이의 약리활동 기작을 규명하여, 골다공증에 대한 효율적인 치료 조성물을 발굴하고자 하였다.
In order to improve the bone mineral density and bone quality due to the lowering of osteoporosis efficiency, which is a main cause of osteoporosis, the inventors of the present invention discovered a leading substance that activates the proliferation and differentiation of osteoblasts and identified its pharmacological action mechanism, I want to dig.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 골밀도 및 골질 감소를 원인으로 하는 다양한 골 관련 질환에 대한 신규한 치료 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물이 조기 근원세포주(pre-myoblast)를 골 조직의 형성 및 복원에 필수적인 조골세포(osteoblast)로 효율적으로 분화시킨다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made extensive efforts to develop a novel therapeutic composition for various bone related diseases caused by bone density and bone loss. As a result, it has been found that the compound represented by Chemical Formula 1 or Chemical Formula 2 efficiently differentiates the pre-myoblast into osteoblasts essential for the formation and restoration of bone tissue. .

따라서 본 발명의 목적은 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating bone-related diseases.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다: According to one aspect of the present invention, there is provided a composition for preventing or treating bone related diseases, comprising a compound represented by the following formula (1) or (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:

화학식 1Formula 1

Figure pat00001
Figure pat00001

상기 화학식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C3 알킬 또는

Figure pat00002
(A1 내지 A3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C3 알콕시, 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C1-C3 알킬이거나, 또는 A1 및 A2 또는 A2 및 A3가 서로 연결되어 1,3-디옥솔렌(dioxolene) 고리구조를 형성한다)이며;
Figure pat00003
는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않고; R3는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우 산소이고 단일결합을 형성하는 경우 -NH2이며, R4는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우 (B1은 비치환되거나 C1-C3 알킬 아민, 하이드록시 또는 C1-C3 알콕시로 치환된 페닐 또는 비치환되거나 C1-C3 알킬, C1-C3 알킬 아민 또는 할로 페닐로 치환된 5각-9각 고리의 헤테로 아릴이고; n은 0-1의 정수이다)이고 단일결합을 형성하는 경우
Figure pat00005
이다;In the above formulas, R 1 and R 2 are each independently hydrogen, C 1 -C 3 alkyl or
Figure pat00002
(A 1 to A 3 are each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 3 alkoxy, unsubstituted or substituted by halogen, C 1 -C 3 alkyl, or A 1 and A 2 or A 2 and A 3 each other To form a 1,3-dioxolene ring structure;
Figure pat00003
Represents a single bond or a double bond, the single bond or the double bond is not continuously present; R 3 is oxygen when forming a double bond with adjacent ring carbon and -NH 2 when forming a single bond and R 4 is a double bond with adjacent ring carbon (B 1 is furnished with unsubstituted or C 1 -C 3 alkyl amine, hydroxy or C 1 -C phenyl, or unsubstituted or C 1 -C 3 alkyl, C 1 -C 3 alkylamine or halophenyl substituted with 3 alkoxy ≪ / RTI > is a heteroaryl of substituted five-membered-nine rings, and n is an integer of 0-1) and when forming a single bond
Figure pat00005
to be;

화학식 2(2)

Figure pat00006
Figure pat00006

상기 화학식에서, D1 및 D2는 각각 독립적으로 C1-C3 알킬이고; D3 및 D4는 각각 독립적으로 C1-C3 알킬, 페닐 또는 페닐 C1-C3 알킬이다. In the above formulas, D 1 and D 2 are each independently C 1 -C 3 alkyl; D 3 and D 4 are each independently C 1 -C 3 alkyl, phenyl or phenyl C 1 -C 3 alkyl.

본 발명자들은 골밀도 및 골질 감소를 원인으로 하는 다양한 골 관련 질환에 대한 신규한 치료 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물이 조기 근원세포주(pre-myoblast)를 골 조직의 형성 및 복원에 필수적인 조골세포(osteoblast)로 효율적으로 분화시킨다는 사실을 발견하였다. The present inventors have made extensive efforts to develop a novel therapeutic composition for various bone related diseases caused by bone density and bone loss. As a result, it has been found that the compound represented by Chemical Formula 1 or Chemical Formula 2 efficiently differentiates the pre-myoblast into an osteoblast essential for the formation and restoration of bone tissue.

본 명세서에서 용어 “알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등을 포함한다. C1-C3 알킬은 탄소수 1 내지 3의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1-C3 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. As used herein, the term " alkyl " means a straight or branched saturated hydrocarbon group, including, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl and the like. C 1 -C 3 alkyl means an alkyl group having an alkyl unit having 1 to 3 carbon atoms, and when C 1 -C 3 alkyl is substituted, the number of carbon atoms of the substituent is not included.

본 명세서에서 용어“할로겐”은 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.As used herein, the term " halogen " refers to a halogen group element and includes, for example, fluoro, chloro, bromo and iodo.

명세서에서 용어“알콕시”는 알코올에서 수소가 제거되어 형성된 라디칼을 의미하며, 예를 들어 C1-C3 알콕시는 탄소수 1 내지 3의 알코올에서 수소가 제거되어 형성된 라디칼을 의미한다.The term " alkoxy " in the specification means a radical formed by removing hydrogen from an alcohol. For example, C 1 -C 3 alkoxy means a radical formed by removing hydrogen from an alcohol having 1 to 3 carbon atoms.

본 명세서에서 용어“알킬아민”은 알킬기로 치환된 아민기를 의미하며, “C1-C3 알킬 아민”은 C1-C3 알킬기가 1개(모노알킬아민) 또는 2개(디알킬아민) 치환된 경우를 포함한다. As used herein, the term " alkylamine " means an amine group substituted with an alkyl group, " C 1 -C 3 alkylamine " refers to an alkyl group having one C 1 -C 3 alkyl group (monoalkylamine) Substituted < / RTI >

본 명세서에서 용어“헤테로아릴”은 헤테로원자로서 고리 내에 산소, 황 또는 질소를 포함하는 헤테로사이클릭 방향족기를 의미한다. 구체적으로는, 헤테로원자는 산소 또는 질소이다. 헤테로원자의 개수는 1-3이며, 구체적으로는 1-2이다. “5각-9각 고리의 헤테로아릴”은 탄소 및 헤테로 원자를 모두 포함하여 고리를 이루는 원자의 수가 5개-9개인 헤테로아릴을 의미하며, 고리는 단일고리(monocycle) 또는 2개 고리(bicycle)일 수 있다. As used herein, the term " heteroaryl " means a heterocyclic aromatic group containing a hetero atom, oxygen, sulfur or nitrogen, in the ring. Specifically, the hetero atom is oxygen or nitrogen. The number of heteroatoms is 1-3, specifically 1-2. &Quot; Heteroaryl of each of the five-to-nine rings " means heteroaryl having 5 to 9 ring atoms comprising both carbon and heteroatoms, wherein the ring may be a monocycle or a bicycle ).

본 명세서에서 용어“페닐 알킬”은 페닐기가 치환된 알킬기를 의미하며,“페닐 C1-C3 알킬”은 페닐기가 결합한 C1-C3 알킬을 의미한다. The term means "phenyl-alkyl" is an alkyl group a phenyl group is substituted in the present specification, "phenyl C 1 -C 3 alkyl" means a C 1 -C 3 alkyl group is bonded.

본 명세서에서 용어“골 관련 질환”은 골밀도가 감소되어 발생하는 모든 질환을 의미한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하는 RUNX2의 전사를 활성화하며, 골형성에 관여하는 SMAD 경로와 WNT 시그널링을 활성화한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 골 형성 결핍 및 골질 감소에 기인하는 다양한 골 관련 질환에 있어서 골 조직의 형성 및 회복을 통한 근본적인 치료를 제공할 수 있다. As used herein, the term " bone related disease " means any disease that occurs due to a decrease in bone density. According to the present invention, the compound of the present invention activates transcription of RUNX2 promoting osteoblast differentiation and activates SMAD pathway and WNT signaling involved in bone formation. Accordingly, the composition of the present invention can provide a fundamental treatment through the formation and recovery of bone tissue in various bone related diseases caused by osteogenesis deficiency and bone loss.

본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 골 관련 질환은 골다공증, 골수염, 골연화증, 암세포의 골전이에 의한 골 손상, 추간판 탈출증, 섬유성 골이형성증, 클리펠-파일 증후군, 낭성 섬유뼈염, 베제트병 및 고칼슘혈증으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 구체적으로는 골다공증이다.
According to a specific embodiment of the present invention, the bone-related diseases that can be prevented or treated by the composition of the present invention include osteoporosis, osteomyelitis, osteomalacia, bone damage due to bone metastasis of cancer cells, herniated disc, fibrous dysplasia, Dysmenorrhea, palsy syndrome, cystic fibrotic bone disease, vesicle disease, and hypercalcemia, more specifically osteoporosis.

본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 화학식 1의 R1은 수소 또는 C1-C3 알킬이고; R2는

Figure pat00007
(A1 내지 A3는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메톡시, C1-C2 알킬, 트리플루오로메틸이거나, 또는 A1 및 A2 또는 A2 및 A3가 서로 연결되어 1,3-디옥솔렌(dioxolene) 고리구조를 형성한다) 또는 C1-C3 알킬이다. According to a specific embodiment of the present invention, R 1 in formula (1) of the present invention is hydrogen or C 1 -C 3 alkyl; R 2 is
Figure pat00007
Wherein A 1 to A 3 are each independently hydrogen, fluoro, chloro, methoxy, C 1 -C 2 alkyl, trifluoromethyl, or A 1 and A 2 or A 2 and A 3 are connected to each other to form 1 , Form a 3-dioxolene ring structure) or C 1 -C 3 alkyl.

본 발명의 보다 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 화학식 1의 R4는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우

Figure pat00008
(B1은 비치환되거나 디메틸아민, 하이드록시 또는 메톡시로 치환된 페닐 또는 비치환되거나 메틸, 디메틸아민 또는 플루오로페닐로 치환된 5각-9각 고리의 헤테로 아릴이고; n은 0-1의 정수이다)이고 단일결합을 형성하는 경우
Figure pat00009
이다. 보다 더 구체적으로는, 상기 5각-9각 고리의 헤테로 아릴은 퓨란, 피롤 또는 벤조피롤이다. According to a more specific embodiment of the present invention, R < 4 > in formula (1) of the present invention forms a double bond with the adjacent ring carbon
Figure pat00008
(B 1 is unsubstituted or phenyl substituted by dimethylamine, hydroxy or methoxy, or heteroaryl of unsubstituted or quaternary-9-membered ring substituted by methyl, dimethylamine or fluorophenyl; n is 0-1 And when forming a single bond
Figure pat00009
to be. More specifically, the heteroaryl of the pentane-9 each ring is furan, pyrrole or benzopyrrole.

본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 본 발명의 화학식 2의 D1 및 D2는 메틸이고; D3 및 D4는 각각 독립적으로 메틸, 페닐 또는 페닐 메틸이다.
According to a specific embodiment of the present invention, D 1 and D 2 of formula (2) of the present invention are methyl; D 3 and D 4 are each independently methyl, phenyl or phenylmethyl.

본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 3 내지 23으로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다:According to a specific embodiment of the present invention, the compound represented by Formula 1 is selected from the group consisting of compounds represented by the following Chemical Formulas 3 to 23:

화학식 3 화학식 4      (3)

Figure pat00010
Figure pat00011

Figure pat00010
Figure pat00011

화학식 5 화학식 6     (5)

Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00012
Figure pat00013

화학식 7 화학식 8     (7)

Figure pat00014
Figure pat00015

Figure pat00014
Figure pat00015

화학식 9 화학식 10     (9)

Figure pat00016
Figure pat00017

Figure pat00016
Figure pat00017

화학식 11 화학식 12    (11)

Figure pat00018
Figure pat00019

Figure pat00018
Figure pat00019

화학식 13 화학식 14   (13)

Figure pat00020

Figure pat00020

화학식 15 화학식 16   (15)

Figure pat00022
Figure pat00023

Figure pat00022
Figure pat00023

화학식 17 화학식 18   (17)

Figure pat00024
Figure pat00025

Figure pat00024
Figure pat00025

화학식 19 화학식 20   (19)

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화학식 21 화학식 22  (21)

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화학식 23Formula 23

Figure pat00030

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본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 24 또는 25로 표시되는 화합물이다:According to a specific embodiment of the present invention, the compound represented by the formula (2) is a compound represented by the following formula (24) or (25)

화학식 24 화학식 25  (24)

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Figure pat00032

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본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 상기 화학식 3 또는 22로 표시되는 화합물이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물 중 화학식 3(CGC-26) 및 화학식 22(CGC-26H-20) 화합물은 가장 우수한 조골세포 분화유도 활성을 가지며, 아울러 화학식 22 화합물은 높은 안정성을 가져 효율적인 골 관련 질환 치료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
According to a more specific embodiment of the present invention, the compound represented by Formula 1 is the compound represented by Formula 3 or 22. According to the present invention, the compound of formula (CGC-26) and the compound of formula (22) (CGC-26H-20) have the best osteoblast differentiation inducing activity and the compound of formula (22) May be useful as therapeutic compositions for treating related diseases.

본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. The compound of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful. As the free acid, inorganic acid and organic acid can be used.

바람직하게는, 본 발명의 화합물의 약제학적 허용 가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 구연산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 젖산염, 주석산염, 말레인산염, 푸마린산염, 글루콘산염, 메탄설폰산염, 글리콘산염, 숙신산염, 4-톨루엔설폰산염, 글루투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 또는 아스파트산염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 무기산 및 유기산을 이용하여 형성되는 염이 모두 포함된다. 또한, 본 발명의 화합물은 용매화물(예를 들면 수화물)의 형태로도 존재할 수 있다. Preferably, the pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention are selected from the group consisting of hydrochloride, bromate, sulfate, phosphate, citrate, acetate, trifluoroacetate, lactate, tartrate, maleate, fumarate, But are not limited to, methanesulfonate, glycolate, succinate, 4-toluenesulfonate, gluturonate, ebonate, glutamate, or aspartate salts, And salts formed using various inorganic acids and organic acids. The compounds of the present invention may also exist in the form of solvates (e.g., hydrates).

본 발명의 조성물은 골 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The composition of the present invention can be provided in the form of a pharmaceutical composition for preventing or treating bone related diseases. When the composition of the present invention is manufactured from a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, transdermal administration or the like.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 ㎎/㎏이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . The daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 0.001-100 mg / kg.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 통상적인 제제로 제형화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 통상적인 제형이라 함은 예를 들면 경구(정제, 캡슐제, 분말제), 구강 내, 혀 밑, 직장 내, 질 내, 비강 내, 국소 또는 비경구(정맥 내, 해면체 내, 근육 내, 피하 및 관 내를 포함) 투여 제형을 일컫는다. 예를 들면, 본 발명에 따른 화합물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다. 액체 제제는 현탁제(예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제조된다. 또한, 비경구적으로 예를 들면, 정맥 내, 해면체 내, 근육 내, 피하 및 관내를 통하여 주사되는 경우 무균의 수용액 형태로서 사용하는 것이 가장 바람직하며, 이때 상기 용액은 혈액과의 등장성을 갖기 위하여 다른 물질들(예를 들면 염(salt) 또는 만니톨, 글루코오스와 같은 단당류)를 함유할 수도 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a conventional preparation using pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs May be prepared in unit dosage form or may be manufactured by intrusion into a multi-dose container. Typical formulations are, for example, oral (tablets, capsules, powders), intraoral, sublingual, rectal, vaginal, intranasal, topical or parenteral (intravenous, intracameral, intramuscular, subcutaneous And intravenous) administration formulations. For example, a compound according to the present invention may be in the form of tablets containing starch or lactose, in the form of capsules containing the active ingredient alone or in an excipient, or in the form of an elixir or suspension containing a chemical that tastes or colors For example, orally, buccally or sublingually. Liquid preparations may contain suspending agents (e. G., A mixture of a semisynthetic glyceride such as methylcellulose, witepsol or apricot kernel oil and a PEG-6 ester or a mixture of PEG-8 and caprylic / Such as a glyceride mixture, such as a mixture of glycerides (e.g., a mixture of glycerides). It is also most preferred to use it as a sterile aqueous solution form when injected parenterally, for example, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, and intratracheally, wherein the solution is administered in order to have isotonicity with the blood It may contain other substances (for example, salts or monosaccharides such as mannitol, glucose).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.(a) The present invention provides a composition for preventing or treating bone-related diseases.

(b) 본 발명의 화합물은 조골세포의 분화를 효율적으로 촉진함이 다각적으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 골 조직의 형성 및 회복을 통해 골 형성 결핍 및 골질 감소에 기인하는 다양한 골 관련 질환의 근본적인 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
(b) The compound of the present invention has been variously confirmed to efficiently promote osteoblast differentiation. Accordingly, the composition containing the compound of the present invention can be usefully used for the fundamental treatment of various bone related diseases caused by osteogenesis deficiency and bone loss through formation and recovery of bone tissue.

도 1은 화합물 라이브러리로부터 최종 히트 화합물의 도출과정을 보여주는 간략한 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2는 C2C12 6xOSE-luc 세포주에서 루시퍼라아제 어세이를 통해 RUNX2 활성을 스크리닝한 결과를 나타낸 그림이다. 도 2a는 화합물 라이브러리를 10μM로 처리 한 후 루시퍼라아제 어세이 결과. RUNX2의 전사활성(trsnscription activity)에 대한 배수(fold) 값을 표시한 그림이다. 도 2b는 1차 스크리닝에서 발굴된 히트 화합물에 대한 농도 의존도 시험결과를 보여준다. 도 2c는 2차 스크리닝에서 얻어진 98개 히트 화합물의 루시퍼라아제 어세이 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 98종의 히트 화합물에 대한 골 형성 관련 단백질의 변화를 관찰하기 위한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 화합물들이 C2C12 세포주에서 조골세포의 분화를 자극함을 보여주는 그림이다. 도 4a는 3개의 히트 화합물의 조골세포 분화능을 관찰하기 위해 BMP와 화합물의 투여에 따른 ALP 염색 결과 및 ALP 활성측정 결과를 나타낸 그림이다. 도 4b는 본 발명의 화합물에 의한 조골세포 분화 촉진시 활성화되는 바이오마커의 단백질 수준에서의 변화를 측정한 웨스턴 블롯팅 분석결과를 나타낸다. 도 4c는 본 발명의 화합물에 의해 핵심 전사인자인 RUNX2와 BMP 경로가 자가-조절됨을 확인하기 위한 실시간-PCR 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 화합물이 C2C12 세포주의 조골세포로의 분화에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 도 5a 및 5b는 ALP 염색을 이용하여 히트 화합물 유도체의 조골세포 분화증진 활성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 히트 화합물에 대한 조골세포 분화능 실험으로써 분화 6일차에 실시한 ALP 염색 결과를 나타낸다.
도 7은 CGC-26에 의한 RUNX2와 TCF1의 상호작용을 확인하기 위해 면역침강을 한 후 웨스턴 블롯팅을 한 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 본 발명의 화합물인 CGC-26H-20가 C2C12 세포주의 조골세포로의 분화에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 도 8a 및 도 8b는 CGC-26H-20 처리 30분 후(도 8a) 및 1일 후(도 8b) 단백질 수준에서의 변화를 분석하기 위한 웨스턴 블롯팅을 한 결과를 나타낸다. 도 8c 및 8d는 CGC-26H-20에 의한 RUNX2의 기능에 중요하다고 알려진 라이신 잔기의 아세틸화 변화를 확인하기 위해 면역침강을 한 후 웨스턴 블롯팅을 실시한 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 MC3T3-E1 세포주에서 CGC-26 및 CGC-26H-20의 효과를 보여주는 그림이다. 도 9a는 CGC-26 및 CGC-26H-20가 BMP2 없는 최소한의 분화조건에서 조골세포 분화능을 가지고 있는지를 관찰하기 위해 ALP 염색 및 ALP 활성측정을 수행한 결과를 나타낸 그림이다. 도 9b는 CGC-26 및 CGC-26H-20에 의한 활성-β 카테닌의 핵내 유입을 관찰하기 위하여 화합물을 4시간 동안 처리하고 형광현미경으로 관찰한 결과를 보여준다.FIG. 1 is a schematic diagram showing a derivation process of a final heat compound from a compound library. FIG.
FIG. 2 is a graph showing the results of screening for RUNX2 activity in a C2C12 6xOSE-luc cell line through a luciferase assay. Figure 2a shows the result of luciferase assay after treating the compound library with 10 [mu] M. Figure 3 shows the fold values for the trsnscription activity of RUNX2. FIG. 2B shows concentration dependence test results for the heat compounds unearthed in the first screening. 2C is a graph showing the results of luciferase assay of 98 heat compounds obtained in the secondary screening.
FIG. 3 is a graph showing the results of western blotting analysis for observing changes in osteogenic-related proteins for 98 kinds of heat compounds.
FIG. 4 is a graph showing that the compounds of the present invention stimulate osteoblast differentiation in a C2C12 cell line. FIG. FIG. 4A is a graph showing results of ALP staining and ALP activity according to administration of BMP and compound to observe osteoblast differentiation ability of three heat compounds. FIG. 4B shows Western blotting analysis results of measuring changes in the level of the biomarker activated at the time of promoting osteoblast differentiation by the compound of the present invention. Figure 4c shows the real-time PCR results to confirm that the key transcription factors RUNX2 and BMP pathways are self-regulated by the compounds of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the effect of the compound of the present invention on osteoblast differentiation of a C2C12 cell line. FIG. FIGS. 5A and 5B show the results of analyzing osteoblast differentiation promoting activity of heat compound derivatives using ALP staining.
6 shows the result of ALP staining performed on the 6th day of differentiation as an experiment of osteoblast differentiation ability against a heat compound.
FIG. 7 is a graph showing the results of Western blotting after immunoprecipitation to confirm the interaction between RUNX2 and TCF1 by CGC-26. FIG.
8 is a graph showing the effect of the compound of the present invention, CGC-26H-20, on osteoblast differentiation of the C2C12 cell line. Figures 8a and 8b show the results of western blotting for analyzing changes at the protein level after 30 minutes of treatment with CGC-26H-20 (Figure 8a) and one day later (Figure 8b). Figures 8c and 8d show the results of Western blotting after immunoprecipitation to confirm acetylation changes of lysine residues known to be important for RUNX2 function by CGC-26H-20.
Fig. 9 is a graph showing the effect of CGC-26 and CGC-26H-20 on MC3T3-E1 cell line. FIG. 9A is a graph showing the results of ALP staining and ALP activity measurement to observe whether CGC-26 and CGC-26H-20 have osteoblast differentiation ability under the minimum differentiation condition without BMP2. Figure 9b shows the results of treatment of compounds for 4 hours and observation with fluorescence microscopy to observe the intracellular entry of active-beta catechins by CGC-26 and CGC-26H-20.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

조골세포의 전사인자인 RUNX2 활성화 측정Measurement of RUNX2 activation, a transcription factor of osteoblast

1) 세포배양  1) Cell culture

조기-근원세포(pre-myoblast)인 C2C12와 C2C12 6xOSE-luc 세포주를 37℃ 인큐베이터에서 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 8mM HEPES, 2mM L-글루타민이 포함된 DMEM 으로 배양하였다. 약물에 대한 실험은 5% FBS DMEM에 BMP2 25ng/ml의 존재 또는 부재 하에서 진행하였다.The pre-myoblast C2C12 and C2C12 6xOSE-luc cell lines were cultured in a 37 ° C incubator with 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 8 mM HEPES, 2 mM L- And cultured in DMEM containing glutamine. Experiments on the drug were carried out in 5% FBS DMEM with or without 25 ng / ml of BMP2.

조기 조골세포(pre-osteoblast)인 MC3T3-E1는 37℃ 인큐베이터에서 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신, 8mM HEPES, 2mM L-글루타민이 포함된 α-MEM으로 배양하였다. 약물에 대한 실험은 10% FBS α-MEM에 50μg/ml L-아스코르빈산, 10mM β-GP(분화배지)의 존재 또는 부재 하에서 진행하였다.
MC3T3-E1, a pre-osteoblast, was cultured in α-MEM containing 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 8 mM HEPES, 2 mM L-glutamine in a 37 ° C. incubator . Experiments on the drug were carried out in the presence or absence of 50 μg / ml L-ascorbic acid, 10 mM β-GP (differentiation medium) in 10% FBS α-MEM.

2) 루시퍼라아제 분석 2) Luciferase assay

C2C12 6xOSE-luc 세포주를 4x103/웰로 96 웰-플레이트에 씨딩하였다. 24시간 후에 화합물을 세포에 처리하였다. 다시 24시간 후에 세포를 수동 라이시스 완충액(passive lysis buffer)으로 용해한 후, 그 파쇄물과 루시퍼라아제 기질을 1 : 2.5 비율로 반응 시킨 후 Envision 700nm 파장에서 반응 값을 측정하였다. 전사 활성을 루시퍼라아제 값으로 분석하였다. HDAC 억제제인 MS275는 RUNX2의 전사를 활성화시키는 것으로 익히 알려져 있어, 이를 양성 대조군으로 하였다.
C2C12 6xOSE-luc cell lines were seeded at 4x10 < 3 > / well into 96 well-plates. After 24 hours, the compound was treated on the cells. Twenty-four hours later, the cells were lysed with a passive lysis buffer. The lysate and luciferase substrates were reacted at a ratio of 1: 2.5, and the reaction was measured at a wavelength of 700 nm. The transcriptional activity was analyzed by luciferase value. The HDAC inhibitor, MS275, is well known for activating transcription of RUNX2, which is a positive control.

조골세포의 분화 유도 약물 발굴Drug discovery to induce differentiation of osteoblast

1) ALP 염색 1) ALP staining

C2C12 세포주를 4x103/웰로 96 웰-플레이트에 씨딩하였다. 24시간 후에 화합물과 BMP2 25 ng/ml을 세포에 처리하였다. 분화 3일 차에 동일한 화합물과 BMP2를 다시 처리하고 6일까지 분화시켰다. MC3T3-E1 세포주는 4 x 104/웰로 24웰-플레이트에 씨딩하였다. 24시간 후에 화합물과 5μg/ml L-아스코르빈산, 10mM β-GP를 넣어서 분화시킨 후 3일에 한번씩 동일량을 처리하였다. 6일부터 ALP 염색이 가능하다. 분화시킨 세포는 ALP(Alkaline Phosphatase) 염색 킷으로 분화된 조골세포를 염색하여 약물의 분화능을 확인하였다.
C2C12 cell lines were seeded at 4x10 < 3 > / well into 96 well-plates. After 24 hours, the cells were treated with 25 ng / ml of the compound and BMP2. The same compound and BMP2 were reprocessed on day 3 of differentiation and differentiated for up to 6 days. The MC3T3-E1 cell line was seeded in 24 well-plates at 4 x 10 < 4 > / well. After 24 hours, the compound was inoculated with 5 μg / ml L-ascorbic acid, 10 mM β-GP, and treated with the same amount every 3 days. It is possible to dye ALP from 6th day. The differentiated cells were stained with osteoblast differentiated with an ALP (Alkaline Phosphatase) staining kit to confirm the ability of the drug to differentiate.

2) 실시간 PCR 2) Real-time PCR

총 RNA는 구아니딘 이소사이아네이트-페놀-클로로포름 추출물과 TRIzol 시약에 기초한 단일 단계 방법(single-step method)에 의해 분리되며 분리된 RNA 농도는 260nm의 흡광도에서 읽어 정량하였다. 총 RNA 2μg으로부터 OmniscriptTM 역전사 킷을 이용하여 역전사 시킴으로써 cDNA를 생성시켰다. 실시간 PCR을 수행하기 위해 cDNA와 SYBR Master Mix를 프라이머와 혼합하여 전체 부피가 20㎕이 되게 하였다. RT-PCR 반응은 94℃에서 5분간의 최초 변성 후 94℃, 40초 (변성), 60℃, 40초(어닐링), 72℃, 60초(연장) 조건에서 35 사이클을 수행하였다. 그 이후 증폭 산물(10㎕)을 EtBr(Ethidium bromide)로 염색을 한 아가로스 겔에 전기영동을 하고 UV 트랜실루미네이터에 촬영하여 이미지를 폴라로이드 필름으로 캡쳐하였다. 유전자 발현은 GAPDH로 표준화하였다. cDNA 증폭을 위해 사용되는 프라이머 서열은 NCBI에서 제공하는 뉴클레오타이드 정보를 토대로 설계하였다. RT-PCR을 위해 사용된 프라이머는 RUNX, ALP, osterix, TAZ, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9 및 GAPDH이다.
Total RNA was isolated by a single-step method based on guanidine isocyanate-phenol-chloroform extract and TRIzol reagent, and the separated RNA concentration was quantified by reading at an absorbance of 260 nm. CDNA was generated from 2 쨉 g of total RNA by reverse transcription using an Omniscript TM reverse transcription kit. For real-time PCR, cDNA and SYBR Master Mix were mixed with the primers to make the total volume 20 μl. The RT-PCR reaction was carried out at 94 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles at 94 ° C for 40 seconds (denaturation), 60 ° C for 40 seconds (annealing) and 72 ° C for 60 seconds (extension). After that, the amplified product (10 μl) was electrophoresed on an agarose gel stained with EtBr (Ethidium bromide) and photographed on a UV transilluminator to capture an image with a polaroid film. Gene expression was normalized to GAPDH. The primer sequence used for cDNA amplification was designed based on the nucleotide information provided by NCBI. The primers used for RT-PCR are RUNX, ALP, osterix, TAZ, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9 and GAPDH.

조골세포 분화 촉진 효과 약물에 있어 작용 기전 연구 및 약물타겟 규명Study on the mechanism of action of drugs promoting osteoblast differentiation promotion and identification of drug targets

1) 단백질 추출 및 웨스턴 블롯팅 분석 1) Protein extraction and western blotting analysis

C2C12 와 MC3T3-E1을 6-웰 플레이트에 배양 배지로 씨딩 후 24시간 동안 배양하고, 분화배지의 존재 및 부재 하에서 화합물을 처리하고 30분, 1일 및 3일 시점에서 세포를 Ripa 라이시스 완충액(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC (deoxycholic acid), 0.1% SDS, 1 mM PMSF, 단백질 분해효소 억제제 및 포스파타아제 억제제)로 용해하였다. 파쇄물을 14000rpm으로 15분 간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브로 옮겨 단백질을 BCA 시약을 이용해 정량하였다. 단백질(20㎍)은 10% 아크릴아마이드가 포함된 SDS-PAGE(SDS polyacrylamide gel)에 로딩하고, SDS 전기영동용 완충액을 이용하여 Mini Gel Protein system(Bio-Rad)으로 분석하였다. 로딩이 끝난 단백질은 폴리비닐리덴 디플로라이드 막(Amersham Pharmacia Biotech, Korea)에 옮겨 250mA로 트랜스퍼 완충액 (PH 8.3)(25mM Tris-HCl, 192mM 글리신 및 20% 메탄올 함유)에서 트랜스퍼 시켰다. 트랜스퍼가 끝나면 PVDF 막을 1시간 동안 상온에서 블로킹 시약(5% 탈지분유(Amersham Pharmacia Biotech, Korea) 및 TBS-T 함유)로 블로킹시키고 세척 후 1차 항체를 BSA/TBS-T 완충액에 1:2000 으로 희석해서 섞은 후 4℃에서 O/N으로 인큐베이션하였다. 그 후 세척을 하고 2차 항체를 BSA/TBS-T 완충액에 1 : 5000로 희석하여 혼합해준 다음 상온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 후 세척을 하고 막을 ECL에 노출시켰다.
C2C12 and MC3T3-E1 were seeded in 6-well plates in culture medium for 24 hours, treated with the compound in the presence and absence of differentiation medium, and cells were harvested at 30 minutes, 1 day, and 3 days in Ripa lysis buffer And then dissolved in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC (deoxycholic acid), 0.1% SDS, 1 mM PMSF, protease inhibitor and phosphatase inhibitor. The lysate was centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube and the protein was quantified using BCA reagent. Protein (20 μg) was loaded on SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel) containing 10% acrylamide and analyzed by Mini Gel Protein system (Bio-Rad) using SDS electrophoresis buffer. The loaded protein was transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Korea) and transferred at 250 mA in Transfer Buffer (PH 8.3) (containing 25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine and 20% methanol). After transfer, the PVDF membrane was blocked with blocking reagent (containing 5% skim milk powder (Amersham Pharmacia Biotech, Korea) and TBS-T) for 1 hour at room temperature. After washing, the primary antibody was added to BSA / TBS- Diluted and mixed, followed by incubation with O / N at 4 ° C. After washing, the secondary antibody was diluted 1: 5000 in BSA / TBS-T buffer, mixed, and then incubated at room temperature for 1 hour or more. Thereafter, the membrane was washed and exposed to ECL.

2) 면역침강 2) Immunoprecipitation

C2C12 와 MC3T3-E1을 10cm 디쉬에 배양배지로 씨딩한 후 24시간 동안 배양하고, 분화배지가 있고 없는 조건에서 화합물을 처리하고 1일 경과 시점에서 세포를 Ripa 라이시스 완충액(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC(deoxycholic acid), 0.1% SDS, 1 mM PMSF, 단백질 분해효소 억제제 및 포스파타아제 억제제)로 용해하였다. 파쇄물을 14000rpm으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브로 옮겨 단백질을 BCA 시약을 이용해 정량하였다. 시료 500μg을 새 튜브에 옮긴 후 면역침강을 하고자 하는 항체를 2μg 넣고 4℃에서 O/N으로 인큐베이션하였다. 단백질 분해효소 억제제 및 포스파타아제 억제제가 포함된 PBS로 10분 간 3번 세척한 후에 아가로스 A 비드로 2시간 면역침강 반응을 시켰다. 또 다시 10분간 3번 세척한 후 샘플 버퍼를 40μl 넣고 100℃에서 끓였다. 4000rpm으로 1분간 원심분리 한 후 비드가 따라 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 채취하여 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
C2C12 and MC3T3-E1 were seeded in a 10 cm dish in a culture medium, cultured for 24 hours, treated with the compound in the absence or presence of differentiation medium, and the cells were rinsed with Ripa lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC (deoxycholic acid), 0.1% SDS, 1 mM PMSF, protease inhibitor and phosphatase inhibitor). The lysate was centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube and the protein was quantified using BCA reagent. After transferring 500 μg of the sample to a new tube, 2 μg of the antibody to be immunoprecipitated was added and incubated with O / N at 4 ° C. After washing three times for 10 minutes with PBS containing protease inhibitor and phosphatase inhibitor, the cells were immersed in agarose A beads for 2 hours. After washing three times for 10 minutes again, 40 μl of sample buffer was added and boiled at 100 ° C. After centrifugation at 4000 rpm for 1 min, the supernatant was carefully collected so that the beads would not come up, and analyzed by Western blotting.

약리활성을 가지는 화합물의 선정Selection of compounds having pharmacological activity

1) 연구의 설계  1) Design of research

본 발명에서는 9,939개의 chem banks 화합물에 대한 약리활성을 평가하기 위해 BMP(bone morphogenetic protein)-2의 존재 유무에 따라 조골세포로 분화하는 조기 근원세포주(pre-myoblast)인 C2C12를 사용하였다. 조골세포의 분화를 촉진할 수 있는 RUNX2의 전사 활성을 조사하기 위한 루시퍼라아제 시스템을 도입하여 약물에 대한 1차 및 2차(용량 의존성) 활성평가를 통해 히트(히트) 화합물을 선정하였고, 선정된 후보 약물에 대하여 pSMAD1/5/8과 β-카테닌 단백질 증가 유무를 확인함으로써 골형성 촉진물질의 가능성을 평가, 히트 화합물을 도출하였다. In the present invention, to evaluate the pharmacological activity of 9,939 chem banks, C2C12, an early osteoblast differentiating into osteoblasts, was used depending on the presence or absence of bone morphogenetic protein (BMP) -2. A heat (heat) compound was selected by evaluating the primary and secondary (dose-dependent) activity of the drug by introducing a luciferase system to examine the transcription activity of RUNX2, which can promote osteoblast differentiation. The presence of pSMAD1 / 5/8 and β-catenin protein was assessed for potential candidates for osteogenesis, and heat compounds were obtained.

그리고 이들 히트 화합물이 미분화 상태에서 완전한 조골세포로 분화를 촉진할 수 있는지를 확인하는 분화능 테스트를 ALP 염색과 활성을 조사하여 최종 히트 후보화합물을 선정하였다. The final heat candidate compound was selected by investigating the ALP staining and activity of the differentiation ability test to confirm whether these heat compounds could promote differentiation into complete osteoblasts in undifferentiated state.

골다공증 치료제 선도 약물을 개발하고자 조골세포의 분화를 촉진할 수 있는 RUNX2의 전사를 활성화시키는지 시험하기 위해 RUNX2가 결합하는 부위인 OSE-allel이 6개 들어 있는 루시퍼라아제 프로모터를 안정적으로 넣은 C2C12 6xOSE-luc 세포주에 9,939개의 화합물을 10μM 농도로 처리 하였다. 약물에 의해 RUNX2의 발현이 증가하게 되면 OSE에 대한 프로모터의 전사가 일어나게 되고 룻루시퍼라아제가 생성되게 된다. 생성된 루시퍼라아제를 기질과 반응시켜 envision으로 수치화 하고, 대조군에 비해 MS275 처리 군이 21.5배 증가한 것으로 보아 전사반응이 잘 이루어 졌다고 판단하고 스크리닝 결과를 분석하였다. 1차 실험을 통하여 RUNX2의 전사활성이 대조군보다 1.6배 증가시키는 화합물 384개를 도출하였고(도 5a), 용량 의존성을 확인한 2차 실험을 통해 히트 화합물 98개를 선정하였다 (도 5b 및 5c).
In order to test the activation of transcription of RUNX2 which promotes osteoblast differentiation in order to develop a leading drug for osteoporosis treatment, C2C12 6xOSE, which stably contains a luciferase promoter containing 6 OSE-allel, -luc cell line treated with 9,939 compounds at a concentration of 10 μM. When the expression of RUNX2 is increased by the drug, transcription of promoter to OSE occurs and rut luciferase is produced. The resulting luciferase was quantitated by envisioning the reaction with the substrate. The MS275-treated group was 21.5-fold increased compared to the control group, and the screening results were analyzed. In the first experiment, 384 compounds whose RUNX2 transcription activity was increased 1.6 times as compared to the control group were obtained (FIG. 5A) and 98 heat compounds were selected through the second experiment confirming the dose dependency (FIGS. 5B and 5C).

선발된 후보 화합물이 골형성에 관여하는 pSMAD1/5/8과 β-카테닌 단백질을 증가시키는지를 확인하여, 두 개의 시그널링을 동시에 증가시키는 4개의 히트 화합물을 도출하였으며(도 6), 이를 하기의 표 1에 나타냈다.
Four heat compounds that simultaneously increased two signaling were identified by confirming that the selected candidate compound increased pSMAD1 / 5/8 and β-catenin protein involved in bone formation (FIG. 6) 1.

주요 화합물의 Runx2 활성Runx2 activity of major compounds 번호number 구조rescue 활성(fold)/농도Fold / concentration 비고Remarks 1One CGC-26CGC-26

Figure pat00033
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2.3 / 10 μM2.3 / 10 μM 22 CGC-27CGC-27
Figure pat00034
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 2.8 / 10 μM2.8 / 10 μM 33 CGC-51CGC-51
Figure pat00035
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 2.1 / 10 μM2.1 / 10 μM 44 CGC-63CGC-63
Figure pat00036
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 2.2 / 10 μM2.2 / 10 μM

상기 활성검사를 통해서 발굴해낸 히트 화합물인 CGC-26과 CGC-27은 SMAD 경로와 WNT 시그널링을 이중으로 활성화시키는 것으로 나타났다. 분자수준에서 이들 두 화합물이 골형성에 주요한 신호전달경로의 교차전달(cross-talk)에 어떤 영향을 주어 조골세포의 분화를 증진하게 되었는지 약리활성 및 기전연구를 하고, 이 두 약물의 유도체를 비교 분석 해 봄으로써 보다 구조적으로 안전하고 골형성 촉진에 대한 분화능이 좋은 약물을 발굴하고자 하였다. The activity of the heat compound CGC-26 and CGC-27 were shown to double activate SMAD path and WNT signaling. At the molecular level, the effect of these two compounds on the cross-talk of the major signal transduction pathways in osteogenesis was studied to investigate the pharmacological activity and mechanism of osteoblast differentiation, and the derivatives of these two drugs were compared By analyzing the results, we sought to find drugs that are more structurally safe and have better differentiation potential for promoting bone formation.

조기-근원세포인 C2C12는 BMP2가 있는 조건에서 조골세포로 분화하게 되며 분화가 진행됨에 따라 세포내의 ALP 양이 증가하게 된다. 이를 탐지하는 ALP 염색과 ALP 활성실험을 통해 히트 화합물의 분화능 시험을 수행하였다. ALP 염색을 관찰 할 수 있는 최소한 BMP2 25 ng/ml를 사용하여 대조군 대비 염색된 세포를 관찰하여 분화의 유무를 판별하였다. 그 결과, 4개의 히트 화합물 중에 CGC-26, CGC-27 및 CGC-51이 조골세포 분화 증진능력을 가졌다는 것을 확인하였다(도 7a 하단). 세포 내의 ALP 양을 수치화시킨 ALP 활성도 염색 결과와 연관성 있게 나타났다(도 7a 상단).C2C12, an early-myoblast cell, differentiates into osteoblasts in the presence of BMP2, and the amount of ALP in cells increases as the differentiation proceeds. ALP staining and ALP activity tests were performed to test the ability of heat compounds to differentiate. At least BMP2 25 ng / ml was used to observe ALP staining, and stained cells were observed to determine the presence or absence of differentiation. As a result, it was confirmed that CGC-26, CGC-27 and CGC-51 had the ability to promote osteoblast differentiation among the four heat compounds (the bottom of FIG. 7A). ALP activity, which quantified the amount of ALP in the cells, was associated with the result of staining (top of FIG. 7A).

본 발명자들은 조골세포로의 분화를 자극한다고 알려진 MAPK, SMAD 경로, WNT 시그널링의 대표 인자에 대하여 웨스턴 블롯팅으로 단백질 수준에서 분석하였다(도 7b). CGC-27은 SMAD1/5/8과 ERK를 인산화시킴으로써 SMAD 경로와 MAPK를 활성화시킴을 알 수 있었고 활성의 β-카테닌과 핵 내에서 RUNX2의 전사활동에 관여한다고 알려진 p300의 단백질량을 증가시켰다. We analyzed the MAPK, SMAD pathway known to stimulate osteoblast differentiation, and representative factors of WNT signaling at the protein level by Western blotting (Figure 7b). CGC-27 was found to activate SMAD pathway and MAPK by phosphorylating SMAD1 / 5/8 and ERK, and increased the amount of p300 protein known to be involved in the transcriptional activity of RUNX2 in the active β -catenin and nucleus.

CGC-26과 CGC-63은 SMAD1/5/8과 p38을 인산화시킴으로써 SMAD 경로와 MAPK를 활성화시켰다. CGC-26은 CGC-63에 비하여 활성의 β-카테닌과 p300을 더 많이 증가시키는 것으로 확인되었다. 다음으로 조골세포의 분화가 개시될 때에 BMP 경로는 자가 조절(auto-regulation)될 수 있다는 보고가 있으므로 이들 히트 화합물에 의한 BMP 패밀리들의 RNA 수준에서의 변화를 실시간 PCR로 분석 하였다(도 7c). 그 결과 CGC-27은 BMP2와 BMP7의 증가시켰고, CGC-26과 CGC-63은 BMP2, BMP7 및 BMP9의 RNA 양을 증가시킴으로써 BMP 경로를 활성화 시키는 것을 알 수 있었다. 또한 화합물에 의해 조골세포 분화 전기 전사인자인 RUNX2의 RNA 증가와 조골세포 후기분화 마커인 ALP RNA가 증가함을 알 수 있었다. 조골세포 분화능 시험, RNA와 단백질 수준에서 시행한 실험을 종합적으로 분석한 결과 CGC-26과 CGC-27이 우수한 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
 CGC-26 and CGC-63 activated SMAD pathway and MAPK by phosphorylating SMAD1 / 5/8 and p38. CGC-26 was found to increase the activity of β-catenin and p300 more than CGC-63 . Next, since there is a report that the BMP pathway can be auto-regulated when osteoclast differentiation is initiated, the change in the RNA level of the BMP family by these heat compounds was analyzed by real time PCR (Fig. 7C). As a result, it was found that CGC-27 increased BMP2 and BMP7, and CGC-26 and CGC-63 increased the amount of BMP2, BMP7 and BMP9 RNA, thereby activating the BMP pathway. In addition, the increase of RUNX2 RNA and osteoblast differentiation marker ALP RNA were increased by the compound. Comprehensive analysis of osteoblastic differentiation activity, RNA and protein levels showed that CGC-26 and CGC-27 had superior activities.

유도체의 스크리닝Screening of derivatives

그 다음으로 두 히트 화합물 CGC-26과 CGC-27의 유도체 중 조골세포 분화능이 뛰어난 유도체를 발굴하고자 하였다. 이 실험을 통해 CGC-27의 유도체로 선정된 화합물 CGC-27H-21은 CGC-27 보다 우수한 점이 관찰되지 않았고, CGC-26의 유도체 중에서는 CGC-26H-20이 우수한 활성을 나타냈다(도 8). 조골세포 분화능이 CGC-27 보다 CGC-26과 CGC-26H-20 이 더 뛰어나기 때문에 이들 두 화합물의 작용기전 연구를 수행하였다.
Next, we sought to derive derivatives of two heat compounds CGC-26 and CGC-27 with superior osteoblast differentiation ability. Derivative from the compound CGC-27H-21 selected from a derivative of CGC-27 This experiment was not observed point is superior to CGC-27, CGC-26 exhibited a CGC-26H-20 a good activity (Figure 8) . Because osteoblast differentiation ability is superior to that of CGC-27 , CGC-26 and CGC-26H-20 are superior to osteoblast differentiation.

CGC-26과 CGC-27의 유도체 화합물의 구조 Structure of derivative compounds of CGC-26 and CGC-27 번호number 코드번호Code number 구조rescue 1One CGC-26
CGC-26

Figure pat00037
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22 CGC-26H-1
CGC-26H-1
Figure pat00038
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 33 CGC-26H-2CGC-26H-2
Figure pat00039
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 44 CGC-26H-3CGC-26H-3
Figure pat00040
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 55 CGC-26H-4CGC-26H-4
Figure pat00041
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 66 CGC-26H-5CGC-26H-5
Figure pat00042
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 77 CGC-26H-6CGC-26H-6
Figure pat00043
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 88 CGC-26H-7CGC-26H-7
Figure pat00044
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 99 CGC-26H-8CGC-26H-8
Figure pat00045
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 1010 CGC-26H-10CGC-26H-10
Figure pat00046
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 1111 CGC-26H-11CGC-26H-11
Figure pat00047
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 1212 CGC-26H-12CGC-26H-12
Figure pat00048
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 1313 CGC-26H-13CGC-26H-13
Figure pat00049
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 1414 CGC-26H-14CGC-26H-14
Figure pat00050
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 1515 CGC-26H-15CGC-26H-15
Figure pat00051
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 1616 CGC-26H-16CGC-26H-16
Figure pat00052
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 1717 CGC-26H-17CGC-26H-17
Figure pat00053
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 1818 CGC-26H-18CGC-26H-18
Figure pat00054
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 1919 CGC-26H-19CGC-26H-19
Figure pat00055
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 2020 CGC-26H-20CGC-26H-20
Figure pat00056
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 2121 CGC-27CGC-27
Figure pat00057
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 2222 CGC-27H-21CGC-27H-21
Figure pat00058
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CGC-26과 CGC-26H-20의 ALP 염색을 통한 약리활성 비교실험을 진행하였을 때 CGC-26H-20은 CGC-26이 가지는 조골세포 분화 촉진에 대한 약리활성을 유지할 뿐만 아니라 화합물의 안전성이 높다는 장점을 가지고 있었다(도 9). When CGC-26 and CGC-26H-20 were tested for their pharmacological activity by ALP staining, CGC-26H-20 not only maintained the pharmacological activity for promoting osteoblast differentiation of CGC-26 , (Fig. 9).

CGC-26은 용량 의존적으로 SMAD 1/5/8과 p38의 인산화를 증가시켰다. 또한 WNT 신호가 증가할 때 나타나는 LRP의 인산화가 관찰되었고, GSK3β가 인산화됨으로써 활성 β-카테닌의 양을 증가시켰으며, 이로 인해 하위 인자인 TCF1이 증가된 것을 알 수 있었다. RUNX2의 조절자로 알려진 p300과 TAZ 단백질 수준의 증가도 반복적으로 나타났다. 또한 RUNX2, ALP, TAZ, ostrix의 RNA가 증가되는 것을 실시간 PCR로 확인하였다. 이 실험을 통해 CGC-26은 BMP 경로와 WNT 시그널링을 동시에 조절한다는 것을 알 수 있었다(도 10). CGC-26 increased phosphorylation of SMAD 1/5/8 and p38 in a dose-dependent manner. In addition, LRP phosphorylation was observed when the WNT signal was increased, and GSK3β was phosphorylated to increase the amount of active β-catenin, thereby increasing TCF1. Increases in p300 and TAZ protein levels, known as RUNX2 modulators, were also repeated. In addition, the increase of RUNX2, ALP, TAZ and ostrix RNA was confirmed by real time PCR. This experiment showed that CGC-26 simultaneously regulates BMP pathway and WNT signaling (FIG. 10).

앞선 실험을 통해 CGC-26이 BMP 경로와 WNT 시그널링을 동시에 조절한다는 것을 알 수 있었다. 화합물이 어떻게 두 주요 경로의 교차전달(cross-talk)을 할 수 있는지 알아보기 위해서 문헌조사를 해 본 결과 WNT 시그널링에 의해 활성화된 TCF는 bone 세포의 RUNX에 작용하여 분화를 촉진 시킨다는 것을 알게 되었다(J. Biol Chem., 280, 33132-40(2005)). 세포에 각각의 화합물들을 처리한지 1일이 경과한 시점에서 세포를 용해하고 RUNX2 단백질을 RUNX2 항체(아가로스-A 비드 사용)로 면역침강시킨 후에 RUNX2와 TCF간의 결합유무를 관찰하였다. 그 결과 CGC-26에 의해 활성화된 WNT 경로와 BMP 활성화는 RUNX2와 TCF의 결합을 통해서 교차전달할 수 있음을 알 수 있었다(도 11).Previous experiments have shown that CGC-26 controls both BMP path and WNT signaling simultaneously. To investigate how compounds can cross-talk between the two major pathways, a literature review has shown that TCF activated by WNT signaling acts on RUNX of bone cells to promote differentiation J. Biol. Chem. , 280, 33132-40 (2005)). One day after each compound was treated with the cells, the cells were lysed and the RUNX2 protein was immunoprecipitated with RUNX2 antibody (agarose-A beads), and then the binding between RUNX2 and TCF was observed. As a result, it was found that the WNT pathway activated by CGC-26 and BMP activation could be cross-linked through the combination of RUNX2 and TCF (FIG. 11).

CGC-26H-20에 대한 기작 연구 결과 CGC-26과 비교해 보았을 때 조골세포 분화능이 유사하며 단백질 수준에서 보여지는 SMAD 1/5/8 과 p38의 인산화를 증가시켰다. p38 인산화는 결과적으로 조골세포의 분화에 중요하다고 알려진 osterix를 증가시켰음을 이 실험을 통해 새롭게 알게 되었고 WNT 시그널링에 ON 되었을 때 나타나는 p-LRP6, 활성의 β-카테닌의 양이 증가하였다. CGC-26H-20은 CGC-26에 비해 화합물의 안정성이 높다는 장점을 가지고 있었다(도 12a).
Mechanism studies on CGC-26H-20 showed a similar osteoblast differentiation potential when compared to CGC-26, and increased phosphorylation of SMAD 1/5/8 and p38 at the protein level. We found that p38 phosphorylation increased osterix, which is known to be important for the differentiation of osteoblast cells, as a result of this experiment. The amount of p-LRP6, β-catenin, increased when WNT signaling was turned on. CGC-26H-20 had the advantage that compound stability was higher than CGC-26 (FIG. 12A).

본 발명자들은 다음으로 RUNX의 활성을 매개한다고 알려진 p300과의 연관성을 입증하기 위한 실험을 시작하였다. p300은 RUNX2의 라이신 잔기를 아세틸화시킴으로써 RUNX2 전사활성을 조절할 수 있다는 이전의 보고(J. Biol Chem. 281, 16502-11(2006), Mol Cell Biol., 23, 3339-51(2003))를 바탕으로 CGC-26H-20을 처리하고 1일이 지난 시점에서 세포를 용해하고 RUNX2 단백질을 RUNX2 항체(Agarose-A Bead 사용)로 면역침강시킨 후에 CGC-26H-20에 의한 p300의 증가가 미치는 RUNX2의 아세틸-라이신 정도를 관찰하였다. 그 결과 CGC-26H-20의 존재 유무에 따라 RUNX2 라이신 잔기의 아세틸화가 조절되는 것을 확인하였고, 면역침강을 아세틸-라이신으로 하고 IB를 RUNX로 한 반복실험을 실시했을 때도 같은 결과를 얻을 수 있었다. RUNX2의 크기와 항체의 IgG 밴드를 혼돈하지 않기 위해 2차 항체는 true blot-rabbit을 사용하였다.)We next initiated experiments to demonstrate the association with p300, which is known to mediate the activity of RUNX. p300 has been reported in a previous report ( J. Biol Chem . 281 , 16502-11 (2006), Mol Cell Biol ., 23 , 3339-51 (2003)) that RUNX2 transcriptional activity can be regulated by acetylating the lysine residues of RUNX2 based on RUNX2 handle CGC-26H-20 was dissolved in the cell at the time of 1 days, and the increase of the p300 by CGC-26H-20 after immunoprecipitation of RUNX2 protein RUNX2 antibody (Agarose-a using Bead) on Of acetyl-lysine was observed. As a result, it was confirmed that acetylation of RUNX2 lysine residues was regulated depending on the presence or absence of CGC-26H-20 , and the same results were obtained when immunoprecipitation was performed with acetyl-lysine and IB was RUNX. To avoid confusion between the size of RUNX2 and the IgG band of antibodies, true blot-rabbits were used for secondary antibodies.)

그 결과 이들 화합물들에 의해 활성화된 WNT 경로는 BMP가 활성화되었을 때 활성화되는 p300에 의해 RUNX2의 전사활성을 조절하며 이를 통해 상위 두 시그널링이 교차전달할 수 있음을 확인하였다(도 12b). As a result, it was confirmed that the WNT pathway activated by these compounds regulates the transcriptional activity of RUNX2 by p300 which is activated when BMP is activated, thereby allowing the upper two signaling to cross-transfer (Fig. 12B).

본 발명에서 스크리닝을 위해 사용한 C2C12는 BMP2의 존재 하에서만 골 형성 관련 시그널링이 활성화된다. 그러나 앞의 웨스턴 블롯팅 결과를 관찰해 보면 BMP2가 없는 환경 내에서도 골형성 관련 단백질들이 증가하는 것을 알 수 있다. 이론적으로 이런 변화는 화합물 단독으로도 골형성을 촉진 할 수 있음을 시사한다. 이에 본 발명자들은 조기 조골세포주에 대하여 최소한의 분화조건 내에서 화합물단독에 의하여 조골세포로의 분화능이 증가되는지를 확인해보았다. 그 결과, 화합물 처리 후 6일에 CGC-26과 그 유도체인 CGC-26H-20에 의한 ALP 증가를 ALP 염색 및 활성 분석을 통해 관찰 할 수 있었다(도 13a).C2C12 used for screening in the present invention activates osteogenesis-related signaling only in the presence of BMP2. However, observing the Western blotting results, we can see that the bone formation-related proteins increase even in the environment without BMP2. Theoretically, this change suggests that the compound alone may also promote bone formation. Therefore, the present inventors confirmed whether the osteoblast cell line can be differentiated into osteoblast by the compound alone in the minimum differentiation condition. As a result, the increase of ALP by CGC-26 and its derivative CGC-26H-20 could be observed through ALP staining and activity analysis 6 days after the compound treatment (Fig. 13A).

보고에 따르면 골세포에서 WNT 시그널링과 BMP 경로는 서로 교차전달하고 있고 BMP2는 WNT3a와 함께 투여할 경우 활성의 β-카테닌의 핵으로의 이동(translocation)을 증가시킴으로서 WNT 시그널링 활성을 증진시킬 수 있다(J. Bone Miner Res., 26, 718-729(2011)). 앞선 연구를 통해 화합물들에 의한 WNT 시그널링과 BMP 경로의 활성화를 p-SMAD1/5/8 과 활성의 β-카테닌을 웨스턴 블롯팅으로 알 수 있었다. 화합물들에 의해 활성의 β-카테닌의 핵으로의 유입 증진을 시각화하기 위해 후속실험으로 면역-세포화학 실험을 실시하였다(도 13b). According to reports, WNT signaling and BMP pathway cross-communicate in bone cells, and BMP2 can enhance WNT signaling activity by increasing the translocation of active β-catenin to the nucleus when administered with WNT3a ( J. Bone Miner Res ., 26 , 718-729 (2011)). Previous studies have shown that WNT signaling by the compounds and activation of the BMP pathway by Western blotting of p-SMAD1 / 5/8 and active β-catenin. Immuno-cytochemistry experiments were performed in subsequent experiments to visualize the enhancement of the entry of active beta -catenin into the nucleus by the compounds (Fig. 13b).

WNT3a와 LiCl는 활성의 β-카테닌 핵으로 이동하는지 여부를 판단하는 기준이 되었다. MC3T3-E1 세포주는 세포 크기가 크고 핵의 모습이 명확하게 구분 되는 장점이 있다. 이에, 본 발명자들은 최소한의 분화조건에서 WNT3a 50ng/ml, LiCl 25mM, BMP2 100ng/ml, 화합물 5μM을 4시간 동안 처리하여 면역-세포화학 분석을 수행하였다. 그 결과 WNT3a 와 LiCL 단독 처리에 의해 활성의 β-카테닌이 핵으로 이동되는 것을 확인하였고, 보고된 바와 같이 WNT3a 단독 처리군보다 WNT3a에 BMP2를 함께 처리하였을 때 핵내 유입된 활성의 β-카테닌을 더 많은 관찰할 수 있었다. 놀라운 것은 BMP2와는 달리 CGC-26과 CGC-26H-20는 단독처리된 WNT3a처럼 활성의 β-카테닌 이동을 일으켰으며 WNT3a 단독 처리군보다 WNT3a에 화합물들을 함께 처리하였을 때 더 많은 활성의 β-카테닌이 핵으로 이동되었음을 관찰 할 수 있었다.
WNT3a and LiCl were the criteria for judging whether they migrate to the active beta -catenin nucleus. The MC3T3-E1 cell line has the advantage that the cell size is large and the appearance of the nucleus is clearly distinguished. Therefore, the present inventors performed immuno-cytochemical analysis by treating 50 ng / ml of WNT3a, 25 nM LiCl, 100 ng / ml of BMP2 and 5 μM of compound for 4 hours under the minimum differentiation conditions. As a result, it was confirmed that the active β-catenin was transferred to the nucleus by WNT3a and LiCL alone treatment, and when the WNT3a was treated with BMP2 more than the WNT3a alone treatment, the β-catenin Many were able to observe. Surprisingly, unlike BMP2, CGC-26 and CGC-26H-20 produced active β-catenin transfer as single-treated WNT3a and more active β-catenin when treated with WNT3a than WNT3a alone It was observed that it was transferred to the nucleus.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (10)

하기의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물:
화학식 1
Figure pat00059

상기 화학식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C3 알킬 또는
Figure pat00060
(A1 내지 A3는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C3 알콕시, 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C1-C3 알킬이거나, 또는 A1 및 A2 또는 A2 및 A3가 서로 연결되어 1,3-디옥솔렌(dioxolene) 고리구조를 형성한다)이며;
Figure pat00061
는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며, 상기 단일결합 또는 이중결합은 연속적으로 나타나지 않고; R3는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우 산소이고 단일결합을 형성하는 경우 -NH2이며, R4는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우
Figure pat00062
(B1은 비치환되거나 C1-C3 알킬 아민, 하이드록시 또는 C1-C3 알콕시로 치환된 페닐 또는 비치환되거나 C1-C3 알킬, C1-C3 알킬 아민 또는 할로 페닐로 치환된 5각-9각 고리의 헤테로 아릴이고; n은 0-1의 정수이다)이고 단일결합을 형성하는 경우
Figure pat00063
이다;
화학식 2
Figure pat00064

상기 화학식에서, D1 및 D2는 각각 독립적으로 C1-C3 알킬이고; D3 및 D4는 각각 독립적으로 C1-C3 알킬, 페닐 또는 페닐 C1-C3 알킬이다.
A composition for preventing or treating bone related diseases, comprising a compound represented by the following formula (1) or (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
Formula 1
Figure pat00059

In the above formulas, R 1 and R 2 are each independently hydrogen, C 1 -C 3 alkyl or
Figure pat00060
(A 1 to A 3 are each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 3 alkoxy, unsubstituted or substituted by halogen, C 1 -C 3 alkyl, or A 1 and A 2 or A 2 and A 3 each other To form a 1,3-dioxolene ring structure;
Figure pat00061
Represents a single bond or a double bond, the single bond or the double bond is not continuously present; R 3 is oxygen when forming a double bond with adjacent ring carbon and -NH 2 when forming a single bond and R 4 is a double bond with adjacent ring carbon
Figure pat00062
(B 1 is furnished with unsubstituted or C 1 -C 3 alkyl amine, hydroxy or C 1 -C phenyl, or unsubstituted or C 1 -C 3 alkyl, C 1 -C 3 alkylamine or halophenyl substituted with 3 alkoxy ≪ / RTI > is a heteroaryl of substituted five-membered-nine rings, and n is an integer of 0-1) and when forming a single bond
Figure pat00063
to be;
(2)
Figure pat00064

In the above formulas, D 1 and D 2 are each independently C 1 -C 3 alkyl; D 3 and D 4 are each independently C 1 -C 3 alkyl, phenyl or phenyl C 1 -C 3 alkyl.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R1은 수소 또는 C1-C3 알킬이고; R2는
Figure pat00065
(A1 내지 A3는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메톡시, C1-C2 알킬, 트리플루오로메틸이거나, 또는 A1 및 A2 또는 A2 및 A3가 서로 연결되어 1,3-디옥솔렌(dioxolene) 고리구조를 형성한다) 또는 C1-C3 알킬인 것을 특징으로 하는 조성물.
The method of claim 1, wherein, R 1 of Formula 1 is hydrogen or C 1 -C 3 alkyl; R 2 is
Figure pat00065
Wherein A 1 to A 3 are each independently hydrogen, fluoro, chloro, methoxy, C 1 -C 2 alkyl, trifluoromethyl, or A 1 and A 2 or A 2 and A 3 are connected to each other to form 1 , Form a 3-dioxolene ring structure) or a C 1 -C 3 alkyl.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R4는 인접한 고리탄소와 이중결합을 형성하는 경우
Figure pat00066
(B1은 비치환되거나 디메틸아민, 하이드록시 또는 메톡시로 치환된 페닐 또는 비치환되거나 메틸, 디메틸아민 또는 플루오로페닐로 치환된 5각-9각 고리의 헤테로 아릴이고; n은 0-1의 정수이다)이고 단일결합을 형성하는 경우
Figure pat00067
인 것을 특징으로 하는 조성물.
2. The method according to claim 1, wherein R < 4 > in the formula (1) forms a double bond with the adjacent ring carbon
Figure pat00066
(B 1 is unsubstituted or phenyl substituted by dimethylamine, hydroxy or methoxy, or heteroaryl of unsubstituted or quaternary-9-membered ring substituted by methyl, dimethylamine or fluorophenyl; n is 0-1 And when forming a single bond
Figure pat00067
≪ / RTI >
제 3 항에 있어서, 상기 5각-9각 고리의 헤테로 아릴은 퓨란, 피롤 또는 벤조피롤인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. The composition of claim 3, wherein the heteroaryl of the pentane-9 each ring is furan, pyrrole or benzopyrrole.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2의 D1 및 D2는 메틸이고; D3 및 D4는 각각 독립적으로 메틸, 페닐 또는 페닐 메틸인 것을 특징으로 하는 조성물.
2. The compound according to claim 1, wherein D < 1 > and D < 2 > D 3 and D 4 are each independently methyl, phenyl or phenylmethyl.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 3 내지 23으로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
화학식 3 화학식 4
Figure pat00068
Figure pat00069


화학식 5 화학식 6
Figure pat00070
Figure pat00071


화학식 7 화학식 8
Figure pat00072
Figure pat00073


화학식 9 화학식 10
Figure pat00074
Figure pat00075


화학식 11 화학식 12
Figure pat00076
Figure pat00077


화학식 13 화학식 14
Figure pat00078
Figure pat00079


화학식 15 화학식 16
Figure pat00080
Figure pat00081


화학식 17 화학식 18
Figure pat00082
Figure pat00083


화학식 19 화학식 20
Figure pat00084
Figure pat00085


화학식 21 화학식 22
Figure pat00086
Figure pat00087


화학식 23
Figure pat00088

2. The composition according to claim 1, wherein the compound represented by the formula (1) is selected from the group consisting of compounds represented by the following formulas (3) to (23)
(3)
Figure pat00068
Figure pat00069


(5)
Figure pat00070
Figure pat00071


(7)
Figure pat00072
Figure pat00073


(9)
Figure pat00074
Figure pat00075


(11)
Figure pat00076
Figure pat00077


(13)
Figure pat00078
Figure pat00079


(15)
Figure pat00080
Figure pat00081


(17)
Figure pat00082
Figure pat00083


(19)
Figure pat00084
Figure pat00085


(21)
Figure pat00086
Figure pat00087


Formula 23
Figure pat00088

 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 24 또는 25로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물:
화학식 24 화학식 25
Figure pat00089
Figure pat00090

The composition according to claim 1, wherein the compound represented by Formula 2 is a compound represented by Formula 24 or 25:
(24)
Figure pat00089
Figure pat00090

 제 5 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 상기 화학식 3 또는 22로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition according to claim 5, wherein the compound represented by Formula 1 is the compound represented by Formula 3 or Formula 22.
제 1 항에 있어서, 상기 골 관련 질환은 골다공증, 골수염, 골연화증, 암세포의 골전이에 의한 골 손상, 추간판 탈출증, 섬유성 골이형성증, 클리펠-파일 증후군, 낭성 섬유뼈염, 베제트병 및 고칼슘혈증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
The bone-related disease according to claim 1, wherein the bone-related disease is selected from the group consisting of osteoporosis, osteomyelitis, osteomalacia, osteoporosis due to cancer metastasis, intervertebral disc herniation, fibrous dysplasia, Kleffel-piles syndrome, cystic fibrosis, ≪ / RTI >
제 9 항에 있어서, 상기 골 관련 질환은 골다공증인 것을 특징으로 하는 조성물.10. The composition of claim 9, wherein the bone related disorder is osteoporosis.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105541806A (en) * 2015-12-25 2016-05-04 中国药科大学 Barbiturate compound, preparing method and application thereof
CN108383859A (en) * 2018-04-19 2018-08-10 西南大学 Imidazo benzothiazole ether compound and its officinal salt preparation method and application

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040004412A (en) * 2000-10-26 2004-01-13 화이자 프로덕츠 인크. Spiro-pyrimidine-2,4,6-trione Metalloproteinase Inhibitors
WO2007120842A2 (en) * 2006-04-13 2007-10-25 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and compositions for targeting c-rel
US20100227853A1 (en) * 2008-04-18 2010-09-09 Trustees Of Boston College Inhibitors of cyclic amp phosphodiesterases
KR20130113150A (en) * 2012-04-05 2013-10-15 부산대학교 산학협력단 Pharmaceutical composition and functional health food for prevention or treatment of diseases relating to bone mass loss including hs1792 or its pharmaceutically acceptable salts

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040004412A (en) * 2000-10-26 2004-01-13 화이자 프로덕츠 인크. Spiro-pyrimidine-2,4,6-trione Metalloproteinase Inhibitors
WO2007120842A2 (en) * 2006-04-13 2007-10-25 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and compositions for targeting c-rel
US20100227853A1 (en) * 2008-04-18 2010-09-09 Trustees Of Boston College Inhibitors of cyclic amp phosphodiesterases
KR20130113150A (en) * 2012-04-05 2013-10-15 부산대학교 산학협력단 Pharmaceutical composition and functional health food for prevention or treatment of diseases relating to bone mass loss including hs1792 or its pharmaceutically acceptable salts

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105541806A (en) * 2015-12-25 2016-05-04 中国药科大学 Barbiturate compound, preparing method and application thereof
CN108383859A (en) * 2018-04-19 2018-08-10 西南大学 Imidazo benzothiazole ether compound and its officinal salt preparation method and application

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