KR20150065871A - Tec 패밀리 키나제 억제제 요법을 위한 동반 진단 - Google Patents

Tec 패밀리 키나제 억제제 요법을 위한 동반 진단 Download PDF

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KR20150065871A
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베티 와이 창
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파마시클릭스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 표적 키나제에 대한 TEC 패밀리 키나제 억제제의 효능을 결정하기 위한 방법, 검정 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법, 검정 및 시스템은 TEC 패밀리 키나제 억제제(예를 들어, BTK 억제제)에 의한 표적 키나제의 점유율을 결정하는 것에 관한 것이다. 그러한 정량적 측정치는 대상체의 치료학적 치료 및 전반적인 건강 보호 관리를 알려주는 데 사용된다. 예를 들어, TEC 패밀리 키나제 억제제에 의한 치료로부터 효과를 얻는 질병 또는 적응증을 진단, 예후, 및 모니터링하기 위한 진단 키트가 제공된다. 다른 예에서, TEC 패밀리 키나제 억제제 요법에 대한 응답자(responder)를 확인하고, 치료 계획을 결정하고, TEC 패밀리 키나제 억제제에 대한 내성을 검출하기 위한 진단 키트가 또한 제공된다.

Description

TEC 패밀리 키나제 억제제 요법을 위한 동반 진단{COMPANION DIAGNOSTICS FOR TEC FAMILY KINASE INHIBITOR THERAPY}
관련 출원
본 출원은 2012년 10월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/712,675호로부터의 우선권의 이득을 주장하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여를 포함하는 요법과 조합하여 사용하기 위한 동반 진단 방법 및 키트가 본 명세서에 기재된다.
TEC 키나제 패밀리는 비수용체 단백질-티로신 키나제(PTK)의 서브패밀리이다. TEC 키나제 패밀리는 5개의 구성원, 즉 TEC, BTK(브루톤의 티로신 키나제(Bruton's Tyrosine Kinase)), ITK(인터루킨-2-유도성 T-세포 키나제(interleukin-2-inducible T-cell kinase))/EMT/TSK, BMX 및 TXK/RLK로 구성된다. 이 패밀리의 특유의 특징은 플렉스트린 상동(pleckstrin homology, PH) 도메인의 존재로, 이 도메인은 포스포이노시타이드와 결합되는 것으로 알려져 있다. TEC 패밀리 키나제는 포스포티로신-매개 및 인지질-매개 신호전달 시스템에 참여한다. 많은 TEC 패밀리 단백질은 조혈 조직 내에서 풍부하게 발현되고, 혈구의 성장 및 분화 과정에서 중요한 역할을 한다. BTK 유전자에서의 돌연변이는, 인간에서는 X 염색체-연관 무감마글로불린혈증(XLA)을, 그리고 마우스에서는 X 염색체-연관 면역결핍(Xid)을 일으키는데, 이는 BTK 활성이 B-세포 개체발생에 있어 필수적이라는 것을 나타낸다. ITK는 Th2 및 Th17 세포의 발달 및 이펙터(effector) 기능에 있어 기능상 중요하다. 게다가, TEC 패밀리 키나제는 사이토킨 수용체, 림프구 표면 항원, 헤테로삼량체 G-단백질-결합 수용체 및 인테그린 분자의 세포내 신호전달 기전에 관여하는 것으로 밝혀져 왔다. 암, 자가면역 장애, 및 염증성 질병을 포함한, TEC 패밀리 키나제의 활성화와 관련된 다양한 질병의 치료를 위해 TEC 키나제의 억제제가 개발되어 왔다.
TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여를 포함하는 요법과 조합하여 사용하기 위한 동반 진단 방법 및 키트가 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, 제공된 동반 진단 방법은 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 억제제에 대한 단백질 점유율 검정을 포함한다. 따라서, TEC 키나제 패밀리의 키나제 억제제에 대한 단백질 점유율 검정이 본 명세서에 기재된다. TEC 키나제 패밀리의 비가역적 키나제 억제제에 대한 단백질 점유율 검정이 본 명세서에 추가로 기재된다. TEC 키나제 패밀리의 가역적 키나제 억제제에 대한 단백질 점유율 검정이 본 명세서에 추가로 기재된다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 BTK, ITK, BMX, TXK, TEC, 또는 이들의 임의의 조합의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 하나 이상의 구조적으로 상동인 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 하나 이상의 구조적으로 상동인 티로신 키나제(예를 들어, 구조적으로 상동인 활성 부위를 갖는 키나제)의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 EGFR 패밀리의 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 HER1(EGFR, ErbB1), HER2/c-neu(ErbB2), HER3(ErbB3) 및 HER4(ErbB4), 또는 JAK3의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 SRC 패밀리 티로신 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 B 림프양 키나제(B lymphoid kinase, BLK)의 억제제이다. 제공된 단백질 점유율 검정에서 사용하기 위한 예시적인 시약 및 프로브가 본 명세서에 추가로 기재된다.
소정 실시 형태에서, ELISA 프로브 검정인 단백질 점유율 검정이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, ELISA 프로브 검정은 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은 TEC 패밀리 키나제의 상대량을 결정하기 위한 플레이트 기반 전기화학발광 검정이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 비가역적 TEC 패밀리 키나제 억제제이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 TEC 패밀리 키나제의 활성 부위에 결합하고 시스테인 잔기와의 이황화물 결합을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 검정은 프로브를 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은 TEC 패밀리 키나제에 결합시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 링커(예를 들어, 장쇄 링커)를 통해 검출가능한 표지(예를 들어, 비오틴)에 부착된 TEC 패밀리 키나제 억제제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 비가역적 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 이브루티닙(ibrutinib)이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 본 명세서에 기재된 화합물 I-5인데, 이 화합물은 장쇄 링커를 통해 비오틴에 연결된 이브루티닙으로 이루어진다. 프로브에 의한 샘플의 표지화는 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 점유되지 않은 BTK의 검출을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제와 접합된 프로브(즉, 프로브-결합된 키나제)는 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 의해 포획된다. 일부 실시 형태에서, 과량의 비접합된 프로브가 스트렙타비딘에 결합하기 위하여 프로브-결합된 키나제와 경쟁한다.
또한, TEC 키나제 패밀리의 억제제의 효능을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 기재된다. TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 구성원의 억제가 질병을 갖는 환자에게 치료 효과(therapeutic benefit)를 제공하는 질병을 포함한, TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 구성원의 활성화와 관련된 질병의 진단, 예후, 및 그러한 질병의 치료에서의 치료 계획(therapeutic regimen)의 결정 및 수정에서 단백질 점유율 검정을 사용하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 기재된다. 일부 실시 형태에서, 환자는 TEC 패밀리 키나제의 비정상 활성화와 관련된 질병 또는 장애, 예컨대 암, 자가면역 장애, 및/또는 염증성 질병을 갖는 것으로 진단된다.
일 태양에서, 플레이트-기반 시스템을 포함하는 단백질 점유율 검정이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시 형태에서, 플레이트-기반 단백질 점유율 검정은 전기화학발광 검정을 포함한다.
TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 TEC 패밀리 키나제(예를 들어, 억제제에 의해 점유되지 않은 활성 부위)의 양을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, 방법은 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BTK의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 이브루티닙이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 AVL-292이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 ONO-WG-307이다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 TEC 패밀리 키나제의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BTK의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 ITK의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BMX의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 TEC의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 TXK의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BLK의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BTK 키나제 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 ITK 키나제 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BMX 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 TXK 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 TEC 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BLK 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 2개 이상의 구성원을 억제한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 BTK, ITK, BMX, TXK, TEC 또는 이들의 임의의 조합을 억제한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 EGFR 또는 SRC 패밀리 티로신 키나제를 억제한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BTK 키나제 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 ITK 키나제 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BMX 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 TXK 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 TEC 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이브루티닙에 의해 결합되지 않은, 샘플 중의 BLK 활성 부위의 수를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 단백질 점유율 검정은 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계 - 여기서, 프로브는 링커를 통해 표지에 부착된 TEC 패밀리 키나제 억제제를 포함함 -; 및 프로브에 결합된 TEC 패밀리 키나제(즉, 프로브-결합된 키나제)를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 이브루티닙의 유도체이며, 이브루티닙은 링커를 통해 표지에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 표지는 비오틴 또는 그의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 또는 화학식 III의 프로브로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 본 명세서에 기재된 바와 같은 프로브 화합물 I-1, I-2, I-3, I-4, 또는 I-5로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 프로브 화합물 I-5이다.
일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제가 투여된 환자로부터의 샘플에서의 단백질 점유율을 검출하기 위한 동반 진단 키트가 본 명세서에 개시된다. 일부 실시 형태에서, 키트는 TEC 패밀리 키나제 억제제에 결합되지 않은 TEC 패밀리 키나제에 결합하는 프로브를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 TEC 패밀리 키나제에 결합하는 억제제를 포함한다(예를 들어, 프로브는 TEC 패밀리 키나제 억제제의 유도체이다). 일부 실시 형태에서, 억제제는 표지에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 링커를 추가로 포함하며, 여기서 링커는 표지를 억제제에 부착시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 TEC 패밀리 키나제 억제제의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 링커를 통해 표지에 부착된 TEC 패밀리 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 이브루티닙의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 링커를 통해 표지에 부착된 이브루티닙으로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 링커를 통해 비오틴에 부착된 이브루티닙으로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 화합물 I-1, I-2, I-3, I-4 또는 I-5이다. 일부 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 고형 지지체를 추가로 포함한다.
방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제 또는 상동 티로신 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 프로브-결합된 키나제의 양을 검출하는 단계; 및 (c) 샘플 중의 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 키나제의 점유율을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
치료 계획을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 프로브-결합된 키나제의 양을 검출하는 단계; (c) 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 키나제의 점유율을 결정하는 단계; 및 (d) 키나제의 점유율에 기초하여 치료 계획을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 치료 계획을 결정하는 단계는 TEC 패밀리 키나제 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 치료 계획을 결정하는 단계는 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의한 치료 계획을 수정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 치료 계획을 수정하는 단계는 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의한 치료 계획을 증가, 감소, 개시, 또는 종료시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제에 의한 치료 계획은 표적의 점유율이 증가할 때 수정된다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제에 의한 치료 계획은 표적의 점유율이 감소할 때 수정된다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
TEC 패밀리 키나제 억제제의 효능을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 프로브-결합된 키나제의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; (c) 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 키나제의 점유율을 결정하는 단계; 및 (d) 키나제의 점유율에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 억제제의 효능을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 표적의 점유율이 약 70% 이상일 때 유효하다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 표적의 점유율이 약 50% 미만일 때 유효하지 않다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
TEC 패밀리 키나제 억제제 요법의 응답자(responder)를 확인하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계 - 여기서, 샘플은 TEC 패밀리 키나제 억제제의 적어도 1회의 투여를 받은 대상체로부터의 것임 -; (b) 프로브-결합된 키나제의 양을 검출하는 단계; (c) 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 TEC 패밀리 키나제의 점유율을 결정하는 단계; 및 (d) 키나제의 점유율에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 억제제 응답자로서 또는 TEC 패밀리 키나제 억제제 비응답자로서 대상체를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 표적의 점유율이 약 70% 이상일 때 TEC 패밀리 키나제 억제제 응답자로서 확인된다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 표적의 점유율이 약 50% 미만일 때 TEC 패밀리 키나제 억제제 비응답자로서 확인된다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
TEC 패밀리 키나제 억제제 내성을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 프로브-결합된 키나제의 양을 검출하는 단계; (c) 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 TEC 패밀리 키나제의 점유율을 결정하는 단계; 및 (d) TEC 패밀리 키나제의 점유율에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 억제제 내성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제 내성은 표적의 점유율이 약 50% 미만일 때 결정된다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
TEC 패밀리 키나제 억제제를 검증하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시켜 프로브-결합된 키나제를 형성하는 단계; (b) 프로브-결합된 키나제의 양을 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 표적의 양에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의한 키나제의 점유율을 결정하는 단계; 및 (d) TEC 패밀리 키나제의 점유율에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 억제제를 검증하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제를 검증하는 단계는 TEC 패밀리 키나제에 대한 TEC 패밀리 키나제 억제제의 효능을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제에 의한 TEC 패밀리 키나제의 점유율을 결정하는 단계는 프로브-결합된 키나제의 양을 정량화하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 TEC 패밀리 키나제의 점유율이 약 70% 이상일 때 유효하다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
TEC 패밀리 키나제에 결합하는 TEC 패밀리 키나제 조절제를 확인하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 프로브-결합된 키나제의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 조절제를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 추정상의 TEC 패밀리 키나제 조절제로 사전처리된 샘플이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 시험관내에서(in vitro) 사전처리된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 추정상의 TEC 패밀리 키나제 조절제가 투여된 대상체(예를 들어, 환자)로부터의 샘플이다.
TEC 패밀리 키나제 억제제를 확인하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 프로브-결합된 키나제의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 억제제를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 추정상의 TEC 패밀리 키나제 억제제로 사전처리된 샘플이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 시험관내에서 사전처리된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 추정상의 TEC 패밀리 키나제 억제제가 투여된 대상체(예를 들어, 환자)로부터의 샘플이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 또는 조성물은 TEC 패밀리 키나제 억제제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 비가역적 TEC 패밀리 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 TEC 패밀리 키나제에 공유적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 TEC 패밀리 키나제의 시스테인 잔기에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 소분자, 폴리펩티드, 항체, 또는 핵산이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 억제제는 이브루티닙이다. 일부 실시 형태에서, 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 억제제는 AVL-292, AVL-291, AVL-101, CNX-774, ONO-WG-307이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 ITK의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 TEC 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 BMX 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 BLK의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 HER1, HER2, HER3, HER4 및 JAK3로부터 선택되는 키나제의 억제제이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 또는 조성물은 표적 키나제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 키나제는 TEC 패밀리 키나제이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK)이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 ITK이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 BLK이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 TEC 키나제이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 TXK이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 BMX 키나제이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 ITK이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 HER1, HER2, HER3, HER4, 또는 JAK3이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 또는 조성물은 하나 이상의 고형 지지체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 고형 지지체는 플레이트이다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 고형 지지체는 비드 또는 복수의 비드들이다. 일부 실시 형태에서, 키트는 2개 이상의 고형 지지체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 2개 이상의 고형 지지체는 (a) 플레이트; 및 (b) 비드 또는 복수의 비드들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 플레이트는 마이크로플레이트이다. 일부 실시 형태에서, 마이크로플레이트는 스트렙타비딘-코팅된 마이크로플레이트이다. 일부 실시 형태에서, 마이크로플레이트는 MSD 마이크로플레이트이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 스트렙타비딘 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 자성 비드이다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 코팅되어서 코팅된 고형 지지체를 형성한다. 일부 실시 형태에서, 코팅된 고형 지지체는 스트렙타비딘으로 코팅된다. 일부 실시 형태에서, 코팅된 고형 지지체는 항체로 코팅된다. 일부 실시 형태에서, 코팅된 고형 지지체는 프로브를 포획할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 코팅된 고형 지지체는 표지를 포획할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 코팅된 고형 지지체는 표적(예를 들어, TEC 패밀리 키나제)을 포획할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 프로브-결합된 표적을 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 항체, 비드, 염료, 표지, 태그, 형광단, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-BTK 항체이다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 전기화학발광 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 트리스(바이피리딘)루테늄(II) 다이클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드이다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 설포(SULFO) 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 비드이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 2차 검출제는 항체, 비드, 염료, 표지, 태그, 형광단, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 2차 검출제는 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-IgG 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-IgA 항체이다. 일부 실시 형태에서, 2차 검출제는 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 2차 검출제는 전기화학발광 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 트리스(바이피리딘)루테늄(II) 다이클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드이다. 일부 실시 형태에서, 2차 검출제는 설포 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 2차 검출제는 비드이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 또는 조성물은 1차 검출제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 또는 조성물은 2차 검출제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 검출제는 항체, 비드, 염료, 표지, 태그, 형광단, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 검출제는 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 검출제는 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 검출제는 전기화학발광 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 트리스(바이피리딘)루테늄(II) 다이클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드이다. 일부 실시 형태에서, 검출제는 설포 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 검출제는 비드이다. 일부 실시 형태에서, 검출제는 효소에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 항체는 고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP) 또는 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase, AP)에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-BTK 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 TEC 패밀리 키나제를 표적으로 한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-ITK 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-TEC 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-BMX 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-BLK 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-HER1 항체, 항-HER2 항체, 항-HER3 항체, 또는 항-HER4 항체이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 또는 조성물은 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표지는 비오틴이다. 일부 실시 형태에서, 표지는 형광단이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 표적 키나제를 포획하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 프로브-결합된 표적 키나제를 포획하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적은 항체에 의해 포획된다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-표적 항체이다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적은 비드에 의해 포획된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 또는 조성물은 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 고형 지지체에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 비드는 고형 지지체에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 마이크로플레이트이다. 일부 실시 형태에서, 마이크로플레이트는 MSD 마이크로플레이트이다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 비드이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 비드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비드는 스트렙타비딘 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 자성 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 코팅된 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 코팅된 스트렙타비딘 비드이다. 일부 실시 형태에서, 코팅된 비드는 태그로 코팅된다. 일부 실시 형태에서, 태그는 전기화학발광 태그이다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 트리스(바이피리딘)루테늄(II) 다이클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 설포 태그 스트렙타비딘 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 설포 태그 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 프로브와 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비드는 표지와 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, 표지는 비오틴을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비드는 프로브-결합된 표적과의 접합을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 비드는 프로브에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 프로브-결합된 표적 또는 그의 일부분의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 프로브-결합된 표적 또는 그의 일부분을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 비드 또는 그의 일부분을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 코팅된 비드를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 전기화학발광 태그를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 트리스(바이피리딘)루테늄(II) 다이클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드이다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 설포 태그를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 발광을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 전기화학발광을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적은 비점유 표적이다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적은 약물-점유 표적이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 프로브-결합된 표적의 정제를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 정제는 프로브-비결합된 표적으로부터의 프로브-결합된 표적의 자성 분리(magnetic separation)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 사전처리된 샘플이며, 여기서 사전처리된 샘플은 프로브와 접촉되기 전에 TEC 패밀리 키나제 억제제와 접촉된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 비처리 샘플이며, 여기서 샘플은 표지와 접촉되기 전에 TEC 패밀리 키나제 억제제와 접촉되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 TEC 패밀리 키나제 억제제가 투여된 환자로부터의 샘플이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 TEC 패밀리 키나제 억제제가 투여되지 않은 환자로부터의 대조군 샘플이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 전혈 샘플, 말초 혈액 샘플, 림프 샘플, 조직 샘플, 종양 생검 샘플, 또는 골수 샘플이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 전혈 샘플, 말초 혈액 샘플, 림프 샘플, 조직 샘플, 종양 생검 샘플, 또는 골수 샘플로부터 유래된 하나 이상의 세포 유형 또는 그의 용해물(lysate)을 함유하는 샘플이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 프로브를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 억제제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 표적에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 비가역적 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 표적에 공유적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 표적의 시스테인 잔기에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 소분자, 폴리펩티드, 항체, 또는 핵산이다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 TEC 패밀리 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 시스테인 잔기에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 억제제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 시스테인 481에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 억제제는 이브루티닙이다. 일부 실시 형태에서, 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 억제제는 AVL-292, AVL-291, AVL-101, CNX-774, ONO-WG-307이다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 ITK의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 TEC 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 BMX 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 BLK의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 HER1, HER2, HER3, HER4 및 JAK3로부터 선택되는 키나제의 억제제이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 표적을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적은 키나제이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK)이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 ITK, BLK, TEC, TXK, 또는 BMX이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 HER1, HER2, HER3, HER4, 또는 JAK3이다. 일부 실시 형태에서, 표적은 단백질이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 샘플을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 암을 앓고 있는 대상체로부터의 것이다. 일부 실시 형태에서, 암은 육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 암종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 림프종이다. 일부 실시 형태에서, 림프종은 호지킨 림프종이다. 일부 실시 형태에서, 림프종은 비호지킨 림프종(NHL)이다. 일부 실시 형태에서, 암은 백혈병이다. 일부 실시 형태에서, 암은 만성 림프구성 백혈병이다. 일부 실시 형태에서, 암은 소림프구성 백혈병이다. 일부 실시 형태에서, 암은 발덴스트룀 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia)이다. 일부 실시 형태에서, 암은 여포성 림프종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 외투 세포 림프종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 미만성 대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma)이다. 일부 실시 형태에서, 암은 다발성 골수종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 자가면역 또는 염증성 장애를 앓고 있는 대상체로부터의 것이다.
특정 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제 요법을 받은 환자에서 약물 표적 점유율(drug target occupancy)을 결정하기 위한 키트가 본 명세서에 기재되며, 본 키트는 하기를 포함하는 화학식 II의 구조를 갖고 TEC 패밀리 키나제에 결합하는 프로브를 포함한다:
[화학식 II]
Figure pct00001
(여기서,
La는 CH2, O, NH 또는 S이고;
Ar은 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
Y는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
Z는 C(O), OC(O), NHC(O), C(S), S(O)n, OS(O)n, NHS(O)n(여기서, n은 1 또는 2임);
R6 및 R8은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬로부터 선택되고;
L1은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고;
L2는 결합, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 -N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)(여기서, m은 2 내지 6임);
L3은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고; X는 검출가능한 표지임). 일부 실시 형태에서, X는
Figure pct00002
이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는
Figure pct00003
의 구조를 갖는다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK), ITK, TEC, BMX, 또는 TXK이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 BLK,HER1, HER2, HER3, HER4 또는 JAK3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 고형 지지체를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 고형 지지체는 플레이트, 마이크로플레이트, 비드 또는 복수의 비드들로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 포획제(capture agent)로 코팅되어서 코팅된 고형 지지체를 형성하며, 여기서 포획제는 프로브에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 포획제는 스트렙타비딘 또는 항체이다. 일부 실시 형태에서, 키트는 1차 검출제, 및 선택적으로, 1차 검출제에 결합하는 2차 검출제를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제 또는 2차 검출제는 항체, 비드, 염료, 표지, 태그, 형광단, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 항-BTK 항체, 항-ITK 항체, 항-TEC 항체, 항-TXK 항체, 항-BMX 항체, 또는 항-BLK 항체인 항체이다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 항-HER1 항체, 항-HER2 항체, 항-HER3 항체, 또는 항-HER4 항체인 항체이다. 일부 실시 형태에서, 1차 또는 2차 검출제는 전기화학발광 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드 태그이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 억제제 요법은 비가역적 TEC 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 억제제 요법은 비가역적 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 억제제 요법은 이브루티닙이다.
소정 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제 요법을 받은 환자에서 약물 표적 점유율을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 기재되며, 본 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시켜 프로브-결합된 키나제를 형성하는 단계 - 여기서, 샘플은 비가역적 TEC 패밀리 키나제 억제제의 적어도 1회의 용량을 투여한 후의 환자로부터 얻어짐 -; (b) 샘플 중의 프로브-결합된 키나제의 양을 검출하는 단계; 및 (c) 샘플 중에서 검출된 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 TEC 패밀리 키나제의 표적 점유율을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 프로브는 하기를 포함하는 화학식 II의 구조를 갖고 TEC 패밀리 키나제에 결합한다:
[화학식 II]
Figure pct00004
(여기서,
La는 CH2, O, NH 또는 S이고;
Ar은 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
Y는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
Z는 C(O), OC(O), NHC(O), C(S), S(O)n, OS(O)n, NHS(O)n(여기서, n은 1 또는 2임);
R6 및 R8은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬로부터 선택되고;
L1은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고;
L2는 결합, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 -N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)(여기서, m은 2 내지 6임);
L3은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고; X는 검출가능한 표지임). 일부 실시 형태에서, X는
Figure pct00005
이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는
Figure pct00006
의 구조를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 표적 점유율을 결정하는 단계는 i) 샘플 중에서 검출된 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 억제제에 결합되지 않은 결합 부위의 수를 결정하는 단계, 및 ii) 상기 수를 샘플 중의 활성 TEC 패밀리 키나제의 총량과 비교하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대조군은, 방법이 비처리 샘플에 대해 수행될 때 존재하는 프로브-결합된 키나제의 양이다. 일부 실시 형태에서, 방법은 TEC 패밀리 키나제의 표적 점유율에 기초하여 치료 계획을 결정 또는 수정하는 단계를 추가로 포함한다. TEC 패밀리 키나제 억제제 요법을 받은 환자에서 약물 표적 점유율을 모니터링하기 위한 방법이 본 명세서에 기재되며, 본 방법은 요법 시행 동안에 걸쳐 2회 이상의 시점에서, 키나제의 단백질 점유율을 결정하기 위한 본 명세서에 제공된 방법을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 표적 점유율이 요법 시행 동안에 걸쳐 증가 또는 감소하는 경우 치료 계획을 수정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 i) 표적 점유율이 약 50% 미만인 경우 TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여의 투여량 또는 빈도를 증가시키는 단계, ii) 표적 점유율이 약 70% 이상을 초과하는 경우 TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여의 투여량 또는 빈도를 감소시키는 단계, iii) TEC 패밀리 키나제 억제제의 동일한 치료 계획을 유지하는 단계, 또는 iv) 치료 계획을 중단시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여량은 표적 점유율이 약 50% 미만인 경우 증가된다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여량은 표적 점유율이 약 70% 이상 초과하는 경우 감소된다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여량은 표적 점유율이 약 70% 이상 초과하는 경우 유지된다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여의 빈도는 표적 점유율이 약 50% 미만인 경우 증가된다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여의 빈도는 표적 점유율이 약 70% 이상 초과하는 경우 감소된다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여의 빈도는 표적 점유율이 약 70% 이상 초과하는 경우 유지된다. 일부 실시 형태에서, 방법은 표적 점유율에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 억제제 요법의 효능을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 TEC 패밀리 키나제의 점유율이 약 70% 이상일 때 유효하다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 TEC 패밀리 키나제의 점유율이 약 50% 미만일 때 유효하지 않다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 이브루티닙, AVL-292, AVL-291, AVL-101, CNX-774, 또는 ONO-WG-307이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 이브루티닙이다. 일부 실시 형태에서, 이브루티닙의 적어도 1회의 투여량은 약 10 mg 내지 약 2000 mg, 예컨대 이를 테면 140 mg, 420 mg, 560 mg 또는 840 mg이다. 일부 실시 형태에서, 단백질 점유율이 요법 시행 동안에 걸쳐 모니터링되는 경우, 환자는 약 10 mg/day 내지 약 2000 mg/day의 이브루티닙의 일일 투여량, 예컨대 이를 테면 약 140 mg/day, 420 mg/day, 560 mg/day 또는 840 mg/day의 일일 투여량을 받는다. 특정 실시 형태에서, 환자는 약 420 mg/day의 이브루티닙의 유지 투여량(maintenance dosage)을 받는다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 포획제로 포획하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 포획제는 스트렙타비딘 또는 항체이다. 일부 실시 형태에서, 포획제는 고형 지지체에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 플레이트, 마이크로플레이트, 비드 또는 복수의 비드들이다. 일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제, 및 선택적으로, 1차 검출제에 결합하는 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제 또는 2차 검출제는 항체, 비드, 염료, 표지, 태그, 형광단, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 TEC 패밀리 키나제에 결합하는 항체이다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 항-BTK 항체, 항-ITK 항체, 항-TXK 항체, 항-TEC 항체, 항-BMX 항체, 또는 항-BLK 항체인 항체이다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 항-HER1 항체, 항-HER2 항체, 항-HER3 항체, 또는 항-HER4 항체인 항체이다. 일부 실시 형태에서, 방법은 1차 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 2차 검출제는 항체, 비드, 염료, 표지, 태그, 형광단, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 또는 2차 검출제는 화학발광 태그에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드 태그이다. 일부 실시 형태에서, 환자는 암, 자가면역 질병 또는 염증성 장애를 앓고 있다. 일부 실시 형태에서, 암은 육종, 암종, 골수종, 백혈병 또는 림프종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 호지킨 림프종 또는 비호지킨 림프종(NHL)이다. 일부 실시 형태에서, 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 외투 세포 백혈병(MCL), 여포성 림프종(FL), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 발덴스트룀 거대글로불린혈증 또는 다발성 골수종(MM)이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 혈액 샘플, 림프 샘플 또는 종양 생검 샘플이다.
참고에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참고로 포함된 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 지시된 것처럼 그와 동일한 정도로 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전에 그들의 개시를 위해서만 제공된다. 본 명세서에서는 어떤 것도, 본 출원의 발명자들이 종래 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시보다 선행되지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
숙련된 기술자는 하기에 설명된 도면들이 단지 예시를 목적으로 함을 이해할 것이다. 이들 도면은 어떠한 식으로든 본 교시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1은 단백질 점유율 검정(Protein Occupancy Assay)의 개관을 예시한다.
도 2는 단백질 점유율 검정 키트의 구성요소들을 예시한다.
도 3은 약물-결합된 표적의 검출을 위한 단백질 점유율 검정 방법의 개관을 예시한다.
도 4는 비점유 표적의 검출을 위한 단백질 점유율 검정의 개관을 예시한다.
도 5는 약물-결합된 표적의 검출을 위한 플레이트-기반 단백질 점유율 검정의 개관을 예시한다.
도 6은 프로브-결합된 표적의 검출을 위한 플레이트-기반 단백질 점유율 검정의 개관을 예시한다.
도 7은 약물-결합된 표적의 검출을 위한 플레이트-기반 단백질 점유율 검정의 개관을 예시한다.
도 8은 비점유 표적의 검출을 위한 플레이트-기반 단백질 점유율 검정의 개관을 예시한다.
도 9는 프로브-결합된 표적의 검출을 위한 프로브-코팅된 플레이트-기반 단백질 점유율의 개관을 예시한다.
도 10은 비점유 표적의 검출을 위한 프로브-코팅된 플레이트-기반 단백질 점유율 검정의 개관을 예시한다.
도 11은 예시적인 BTK 점유율 검정 포맷을 예시한다. 도 11a는 스트렙타비딘 검출 방법의 예시적인 개관을 제공한다. 도 11b는 스트렙타비딘 포획 방법의 예시적인 개관을 제공한다.
도 12는 스트렙타비딘 검출 BTK 점유율 검정을 예시한다. 도 12a는 예시적인 플레이트 레이아웃을 제공한다. 도 12b는 스트렙타비딘 검출 방법에 대한 결과를 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다.
도 13은 2개의 상이한 BTK 포획 항체들을 사용하는 스트렙타비딘 검출 BTK 점유율 검정에 대한 예시적인 결과를 제공한다.
도 14는 스트렙타비딘-포획 BTK 점유율 검정을 예시한다. 도 14a는 스트렙타비딘-포획 방법의 개관을 제공한다. 도 14b는 예시적인 플레이트 레이아웃을 제공한다. 도 14c는 스트렙타비딘-포획 방법에 대한 결과를 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다.
도 15는 2개의 상이한 BTK 검출 항체들을 사용하는 스트렙타비딘-포획 BTK 점유율 검정에 대한 예시적인 결과를 제공한다.
도 16은 스트렙타비딘 검출과 스트렙타비딘 포획 방법의 비교를 예시한다.
도 17은 스트렙타비딘 포획 BTK 점유율 검정을 위한 프로브 최적화 실험에 대한 예시적인 결과를 제공한다.
도 18은 스트렙타비딘 포획 BTK 점유율 검정을 위한 적정 실험에 대한 결과를 예시한다.
도 19는 스트렙타비딘 포획 BTK 점유율 검정을 위한 적정 실험에 대한 결과를 예시한다.
도 20은 SI2400 MSD 섹터 이미저(SECTOR IMAGER) 플레이트를 예시한다.
도 21은 예시적인 프로브 화합물 I-1, I-2, I-3, I-4 및 I-5를 예시한다.
도 22는 스트렙타비딘 포획 BTK 점유율 검정을 위한 프로브 최적화 실험을 위한 예시적인 프로브 화합물 I-1, I-2, I-3, I-4 및 I-5에 대한 예시적인 결과를 제공한다.
도 23은 총 BLK를 정량하기 위해 시험된 다양한 포획 항체/검출 항체 쌍들에 대한 원시 신호 데이터를 예시한다. 상측, MSD 고결합 플레이트. 하측, MSD 표준 플레이트.
도 24는 총 BLK를 정량하기 위해 시험된 상이한 포획 항체/검출 항체 쌍들에 대한 신호 대 백그라운드의 비를 예시한다. 상부, MSD 고결합 플레이트. 하측, MSD 표준 플레이트.
도 25는 총 BLK를 정량하기 위해 시험된 포획 항체/검출 항체 쌍들의 용량 적정에 대한 원시 신호 데이터를 예시한다.
도 26은 총 BLK를 정량하기 위해 시험된 포획 항체/검출 항체 쌍들의 용량 적정에 대한 신호 대 백그라운드의 비를 예시한다.
도 27은 1 ㎍/ml의 포획 항체와 0.5 ㎍/ml의 검출 항체를 사용하는 재조합 BLK 단백질에 대한 신호 값의 도표를 예시한다.
도 28은 스트렙타비딘 포획 BLK 점유율 검정(A) 및 ITK 점유율 검정(B)을 위한 프로브 적정 실험에 대한 결과를 예시한다.
도 29는 스트렙타비딘 포획 ITK 점유율 검정을 위한 약물 적정 실험에 대한 결과(A) 및 %ITK 억제율(B)을 예시한다.
도 30은 PBMC 용해물을 사용하는 스트렙타비딘 포획 ITK 점유율 검정을 위한 약물 적정 실험에 대한 결과를 예시한다. 결과는 %ITK 억제율로서 표현된다.
TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여를 포함하는 요법과 조합하여 사용하기 위한 동반 진단 방법 및 키트가 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, 제공된 동반 진단 방법은 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 억제제에 대한 단백질 점유율 검정을 포함한다. 따라서, TEC 키나제 패밀리의 키나제 억제제에 대한 단백질 점유율 검정이 본 명세서에 기재된다. TEC 키나제 패밀리의 비가역적 키나제 억제제에 대한 단백질 점유율 검정이 본 명세서에 추가로 기재된다. TEC 키나제 패밀리의 가역적 키나제 억제제에 대한 단백질 점유율 검정이 본 명세서에 추가로 기재된다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 BTK, ITK, BMX, TXK, TEC, 또는 이들의 임의의 조합의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 하나 이상의 구조적으로 상동인 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 하나 이상의 구조적으로 상동인 티로신 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 EGFR 패밀리의 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 HER1(EGFR, ErbB1), HER2/c-neu(ErbB2), HER3(ErbB3) 및 HER4(ErbB4), 또는 JAK3의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 SRC 패밀리 티로신 키나제의 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 키나제 패밀리 억제제는 TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 키나제의 억제제이며, 또한 B 림프양 키나제의 억제제이다. 제공된 단백질 점유율 검정에서 사용하기 위한 예시적인 시약 및 프로브가 본 명세서에 추가로 기재된다.
소정 실시 형태에서, ELISA 프로브 검정인 단백질 점유율 검정이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, ELISA 프로브 검정은 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은 TEC 패밀리 키나제의 상대량을 결정하기 위한 플레이트 기반 전기화학발광 검정이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 비가역적 TEC 패밀리 키나제 억제제이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 TEC 패밀리 키나제의 활성 부위에 결합하고 시스테인 잔기와의 이황화물 결합을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 검정은 활성 프로브를 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의해 결합되지 않은 유리(free) TEC 패밀리 키나제에 결합시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 활성 프로브는 링커(예를 들어, 장쇄 링커)를 통해 검출가능한 표지(예를 들어, 비오틴)에 부착된 TEC 패밀리 키나제 억제제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 비가역적 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 이브루티닙이다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 화합물 I-5인데, 이 화합물은 장쇄 링커를 통해 비오틴에 연결된 이브루티닙으로 이루어진다. 프로브에 의한 샘플의 표지화는 약물에 의해 점유되지 않은 BTK의 검출을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제와 접합된 프로브는 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 의해 포획된다. 일부 실시 형태에서, 과량의 비접합된 프로브가 스트렙타비딘에 결합하기 위하여 프로브 표지화된 BTK와 경쟁한다.
또한, TEC 키나제 패밀리의 억제제의 효능을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 기재된다. TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 구성원의 억제가 질병을 갖는 환자에게 치료 효과를 제공하는 질병을 포함한, TEC 키나제 패밀리의 하나 이상의 구성원의 활성화와 관련된 질병의 진단, 예후, 및 그러한 질병의 치료에서의 치료 계획의 결정 및 수정에서 단백질 점유율 검정을 사용하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 기재된다. 일부 실시 형태에서, 환자는 TEC 패밀리 키나제의 비정상 활성화와 관련된 질병 또는 장애, 예컨대 암, 자가면역 장애, 및/또는 염증성 질병을 갖는 것으로 진단된다.
TEC 패밀리 키나제 억제제에 의한 치료로부터 효과를 얻는 질병 또는 질환을 진단, 예후, 및 모니터링하기 위한 진단 검정이 본 명세서에 추가로 개시된다. 또한, TEC 패밀리 키나제 억제제 요법에 대한 응답자(responder)를 확인하고, 치료 계획을 결정하고, TEC 패밀리 키나제 억제제 요법에 대한 내성을 검출하기 위한 진단 검정이 본 명세서에 기재된다.
소정 용어
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 청구된 주제가 속한 본 기술분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서의 용어에 대해 복수의 정의가 있는 경우에는, 이 섹션에서의 정의가 우선한다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소를 참고하는 경우에, 그러한 식별자는 변경될 수 있고 인터넷 상에서의 특정 정보가 변동될 수 있지만, 인터넷을 검색함으로써 등가의 정보를 찾을 수 있음이 이해된다. 그에 대한 참고는 그러한 정보의 이용가능성 및 공공 전파를 입증한다.
상기의 개관적 설명 및 하기의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적이며 청구된 어떠한 주제에 대해서도 제한적이지 않음이 이해되어야 하다. 본 출원에서, 단수의 사용은 구체적으로 달리 언급되지 않는 한 복수를 포함한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한 복수의 지시대상을 포함함에 유의해야 한다. 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 다른 형태들, 예컨대 "포함하다", "포함한다", 및 "포함되는"의 사용은 제한적이지 않다.
본 명세서에 사용되는 섹션 제목은 단지 체계적인 목적을 위한 것이며, 기재된 주제를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 본 출원에 인용된, 특허, 특허 출원, 논문, 서적, 매뉴얼, 및 조약을 포함하지만 이로 한정되지 않는 모든 문헌, 또는 문헌의 일부분은 임의의 목적을 위해 전체적으로 본 명세서에 명시적으로 참고로 포함된다.
표준 화학 용어에 대한 정의는 문헌[Carey and Sundberg "Advanced Organic Chemistry 4th Ed." Vols. A (2000) and B (2001), Plenum Press, New York]을 포함한 참고문헌에서 찾을 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 본 기술분야의 기술 내에 있는 질량 분석, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 종래의 방법이 사용된다. 구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 이들의 실험 절차 및 기술은 본 기술분야에서 알려진 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 조제, 제형화, 및 전달, 그리고 환자의 치료를 위해 표준 기술이 사용될 수 있다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천동, 리포펙션(lipofection))에 표준 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어 제조업체의 사양서의 키트를 사용하거나 또는 본 기술분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 반응 및 정제 기술이 수행될 수 있다. 전술된 기술 및 절차는, 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의된 개관적이고 더 구체적인 다양한 참고문헌에 기재된 바와 같은 종래의 방법으로 일반적으로 수행될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은, 본 명세서에 기재되고 그 자체로서 변할 수 있는 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 작제물, 및 시약으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어가 단지 특정 실시 형태만을 설명하려는 것을 목적으로 하고, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 이러한 범주는 단지 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것임이 이해되어야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 화합물과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 기재된 작제물 및 방법을 설명 및 개시하려는 목적으로 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전에 그들의 개시를 위해서만 제공된다. 본 명세서에서는 어떤 것도, 본 명세서에 기재된 본 발명자들이 종래 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시보다 선행되지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
"알킬"은, 탄소 및 수소 원자로만 이루어지고, 불포화를 함유하지 않고, 1 내지 15개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬 라디칼(예를 들어, C1-C15 알킬)을 지칭한다. 소정 실시 형태에서, 알킬은 1 내지 13개의 탄소 원자(예를 들어, C1-C13 알킬)를 포함한다. 소정 실시 형태에서, 알킬은 1 내지 8개의 탄소 원자(예를 들어, C1-C8 알킬)를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 알킬은 5 내지 15개의 탄소 원자(예를 들어, C5-C15 알킬)를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 알킬은 5 내지 8개의 탄소 원자(예를 들어, C5-C8 알킬)를 포함한다. 알킬은 단일 결합에 의해 분자의 나머지 부분에 부착되며, 예를 들어 메틸(Me), 에틸(Et), n-프로필, 1-메틸에틸(iso-프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-다이메틸에틸(t-부틸), 3-메틸헥실, 2-메틸헥실 등이다. 본 명세서에 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 알킬 기는 하나 이상의 하기의 치환체에 의해 선택적으로 치환된다: 할로, 시아노, 니트로, 옥소, 티옥소, 트라이메틸실라닐, -ORa, -SRa, -OC(O)-Ra, -N(Ra)2, -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)N(Ra)2, -N(Ra)C(O)ORa, -N(Ra)C(O)Ra, -N(Ra)S(O)tRa(여기서, t는 1 또는 2임), -S(O)tORa(여기서, t는 1 또는 2임) 및 -S(O)tN(Ra)2(여기서, t는 1 또는 2임) - 여기서, 각각의 Ra는 독립적으로 수소, 알킬, 플루오로알킬, 카르보사이클릴, 카르보사이클릴알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬임.
알킬 기는 또한 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 "저급 알킬"일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, C1-Cx에는 C1-C2, C1-C3... C1-Cx가 포함된다.
"아릴"은 고리 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 방향족 단환식 또는 다환식 탄화수소 고리 시스템으로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 방향족 단환식 또는 다환식 탄화수소 고리 시스템은 단지 수소 및 탄소만을 함유하고 탄소 원자가 6 내지 18개이며, 여기서 고리 시스템 내의 고리들 중 적어도 하나는 완전 불포화되며, 즉 이는 휘켈(
Figure pct00007
) 이론에 따라 환형의 비편재화 (4n+2) p-전자 시스템을 함유한다. 아릴 기에는 페닐, 플루오레닐, 및 나프틸과 같은 기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 용어 "아릴" 또는 접두사 "아르-"(예컨대, "아르알킬"에서의 "아르")는 하기로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환된 아릴 라디칼을 포함하는 것으로 되어 있다: 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 플루오로알킬, 시아노, 니트로, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아르알킬, 선택적으로 치환된 아르알케닐, 선택적으로 치환된 아르알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴알킬, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴알킬, -Rb-ORa, -Rb-OC(O)-Ra, -Rb-N(Ra)2, -Rb-C(O)Ra, -Rb-C(O)ORa, -Rb-C(O)N(Ra)2, -Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2, -Rb-N(Ra)C(O)ORa, -Rb-N(Ra)C(O)Ra, -Rb-N(Ra)S(O)tRa(여기서, t는 1 또는 2임), -Rb-S(O)tORa(여기서, t는 1 또는 2임) 및 -Rb-S(O)tN(Ra)2(여기서, t는 1 또는 2임) - 여기서, 각각의 Ra는 독립적으로 수소, 알킬, 플루오로알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴(하나 이상의 할로 기로 선택적으로 치환됨), 아르알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이고, 각각의 Rb는 독립적으로 직접 결합 또는 직쇄 또는 분지형 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이고, Rc는 직쇄 또는 분지형 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이며, 상기 치환체들 각각은 달리 나타내지 않는 한 비치환됨.
"카르보사이클릴"은, 단지 탄소 및 수소 원자로만 이루어지고 3 내지 15개의 탄소 원자를 갖는 안정한 비방향족 단환식 또는 다환식 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 이는 융합 또는 가교된 고리 시스템을 포함한다. 소정 실시 형태에서, 카르보사이클릴은 3 내지 10개의 탄소 원자를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 카르보사이클릴은 5 내지 7개의 탄소 원자를 포함한다. 카르보사이클릴은 단일 결합에 의해 분자의 나머지 부분에 부착된다. 카르보사이클릴은 선택적으로 포화되거나(즉, 단일 C-C 결합만을 함유하거나) 또는 불포화된다(즉, 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 함유한다). 완전 포화 카르보사이클릴 라디칼은 "사이클로알킬"로도 지칭된다. 단환식 사이클로알킬의 예에는, 예를 들어 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸이 포함된다. 불포화 카르보사이클릴은 "사이클로알케닐"로도 지칭된다. 단환식 사이클로알케닐의 예에는, 예를 들어 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐, 사이클로헵테닐, 및 사이클로옥테닐이 포함된다. 다환식 카르보사이클릴 라디칼에는, 예를 들어 아다만틸, 노르보르닐(즉, 바이사이클로[2.2.1]헵타닐), 노르보르네닐, 데칼리닐, 7,7-다이메틸-바이사이클로[2.2.1]헵타닐 등이 포함된다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 용어 "카르보사이클릴"은 하기로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환된 카르보사이클릴 라디칼을 포함하는 것으로 되어 있다: 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 플루오로알킬, 옥소, 티옥소, 시아노, 니트로, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아르알킬, 선택적으로 치환된 아르알케닐, 선택적으로 치환된 아르알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴알킬, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴알킬, -Rb-ORa, -Rb-SRa, -Rb-OC(O)-Ra, -Rb-N(Ra)2, -Rb-C(O)Ra, -Rb-C(O)ORa, -Rb-C(O)N(Ra)2, -Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2, -Rb-N(Ra)C(O)ORa, -Rb-N(Ra)C(O)Ra, -Rb-N(Ra)S(O)tRa(여기서, t는 1 또는 2임), -Rb-S(O)tORa(여기서, t는 1 또는 2임) 및 -Rb-S(O)tN(Ra)2(여기서, t는 1 또는 2임) - 여기서, 각각의 Ra는 독립적으로 수소, 알킬, 플루오로알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이고, 각각의 Rb는 독립적으로 직접 결합 또는 직쇄 또는 분지형 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이고, 및 Rc는 직쇄 또는 분지형 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이며, 상기 치환체들 각각은 달리 나타내지 않는 한 비치환됨.
"할로" 또는 "할로겐"은 브로모, 클로로, 플루오로 또는 요오도 치환체를 지칭한다.
용어 "할로알킬", "할로알케닐", "할로알키닐" 및 "할로알콕시"에는 적어도 하나의 수소가 할로겐 원자로 대체된 알킬, 알케닐, 알키닐 및 알콕시 구조가 포함된다. 2개 이상의 수소 원자가 할로겐 원자로 대체된 소정 실시 형태에서, 할로겐 원자들은 서로 모두 동일하다. 2개 이상의 수소 원자가 할로겐 원자로 대체된 다른 실시 형태에서, 할로겐 원자들은 서로 모두 동일한 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비방향족 헤테로사이클", "헤테로사이클로알킬" 또는 "헤테로지환족"은 고리를 형성하는 하나 이상의 원자가 헤테로원자인 비방향족 고리를 지칭한다. "비방향족 헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클로알킬" 기는 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 사이클로알킬 기를 지칭한다. 이들 라디칼은 아릴 또는 헤테로아릴과 융합될 수 있다. 헤테로사이클로알킬 고리는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 9개 초과의 원자에 의해 형성될 수 있다. 헤테로사이클로알킬 고리는 선택적으로 치환될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 비방향족 헤테로사이클은 하나 이상의 카르보닐 또는 티오카르보닐 기, 예컨대 이를 테면 옥소- 및 티오-함유 기를 함유한다. 헤테로사이클로알킬의 예에는 락탐, 락톤, 환형 이미드, 환형 티오이미드, 환형 카르바메이트, 테트라하이드로티오피란, 4H-피란, 테트라하이드로피란, 피페리딘, 1,3-다이옥신, 1,3-다이옥산, 1,4-다이옥신, 1,4-다이옥산, 피페라진, 1,3-옥사티안, 1,4-옥사티인, 1,4-옥사티안, 테트라하이드로-1,4-티아진, 2H-1,2-옥사진, 말레이미드, 석신이미드, 바르비투르산, 티오바르비투르산, 다이옥소피페라진, 하이드란토인, 다이하이드로우라실, 모르폴린, 트라이옥산, 헥사하이드로-1,3,5-트라이아진, 테트라하이드로티오펜, 테트라하이드로푸란, 피롤린, 피롤리딘, 피롤리돈, 피롤리디온, 피라졸린, 피라졸리딘, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 1,3-다이옥솔, 1,3-다이옥솔란, 1,3-다이티올, 1,3-다이티올란, 이속사졸린, 이속사졸리딘, 옥사졸린, 옥사졸리딘, 옥사졸리디논, 티아졸린, 티아졸리딘, 및 1,3-옥사티올란이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 비방향족 헤테로사이클로도 지칭되는 헤테로사이클로알킬 기의 예시적인 예에는
Figure pct00008
등이 포함된다. 용어 헤테로지환족은 또한, 단당류, 이당류 및 올리고당류를 포함하지만 이로 한정되지 않는 탄수화물의 모든 고리 형태를 포함한다. 구조에 따라, 헤테로사이클로알킬 기는 모노라디칼 또는 다이라디칼(즉, 헤테로사이클로알킬렌 기)일 수 있다.
"헤테로아릴"은 2 내지 17개의 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 1 내지 6개의 헤테로원자를 포함하는 3원 내지 18원 방향족 고리 라디칼로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 헤테로아릴 라디칼은 단환식, 이환식, 삼환식 또는 사환식 고리 시스템이며, 여기서 고리 시스템 내의 고리들 중 적어도 하나는 완전 불포화되며, 즉 이는 휘켈 이론에 따라 환형의 비편재화 (4n+2) π-전자 시스템을 함유한다. 헤테로아릴은 융합 또는 가교된 고리 시스템을 포함한다. 헤테로아릴 라디칼 내의 헤테로원자(들)는 선택적으로 산화된다. 존재한다면, 하나 이상의 질소 원자는 선택적으로 4차화된다. 헤테로아릴은 고리(들)의 임의의 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된다. 헤테로아릴의 예에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: 아제피닐, 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈인돌릴, 1,3-벤조다이옥솔릴, 벤조푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조[d]티아졸릴, 벤조티아다이아졸릴, 벤조[b][1,4]다이옥세피닐, 벤조[b][1,4]옥사지닐, 1,4-벤조다이옥사닐, 벤조나프토푸라닐, 벤족사졸릴, 벤조다이옥솔릴, 벤조다이옥시닐, 벤조피라닐, 벤조피라노닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐(벤조티오페닐), 벤조티에노[3,2-d]피리미디닐, 벤조트라이아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 사이클로펜타[d]피리미디닐, 6,7-다이하이드로-5H-사이클로펜타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6-다이하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 5,6-다이하이드로벤조[h]신놀리닐, 6,7-다이하이드로-5H-벤조[6,7]사이클로헵타[1,2-c]피리다지닐, 다이벤조푸라닐, 다이벤조티오페닐, 푸라닐, 푸라노닐, 푸로[3,2-c]피리디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[d]피리미디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[d]피리다지닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[d]피리디닐, 아이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 인다졸릴, 아이소인돌릴, 인돌리닐, 아이소인돌리닐, 아이소퀴놀릴, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 5,8-메타노-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 나프티리디닐, 1,6-나프티리디노닐, 옥사다이아졸릴, 2-옥소아제피닐, 옥사졸릴, 옥시라닐, 5,6,6a,7,8,9,10,10a-옥타하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 1-페닐-1H-피롤릴, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 푸리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피라졸로[3,4-d]피리미디닐, 피리딜, 피리도[3,2-d]피리미디닐, 피리도[3,4-d]피리미디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로벤조[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 6,7,8,9-테트라하이드로-5H-사이클로헵타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6,7,8-테트라하이드로피리도[4,5-c]피리다지닐, 티아졸릴, 티아다이아졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 트라이아지닐, 티에노[2,3-d]피리미디닐, 티에노[3,2-d]피리미디닐, 티에노[2,3-c]피리디닐, 및 티오페닐(즉, 티에닐). 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 용어 "헤테로아릴"은 하기로부터 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴 라디칼을 포함하는 것으로 되어 있다: 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 플루오로알킬, 할로알케닐, 할로알키닐, 옥소, 티옥소, 시아노, 니트로, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아르알킬, 선택적으로 치환된 아르알케닐, 선택적으로 치환된 아르알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴알킬, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴알킬, -Rb-ORa, -Rb-SRa, -Rb-OC(O)-Ra, -Rb-N(Ra)2, -Rb-C(O)Ra, -Rb-C(O)ORa, -Rb-C(O)N(Ra)2, -Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2, -Rb-N(Ra)C(O)ORa, -Rb-N(Ra)C(O)Ra, -Rb-N(Ra)S(O)tRa(여기서, t는 1 또는 2임), -Rb-S(O)tORa(여기서, t는 1 또는 2임) 및 -Rb-S(O)tN(Ra)2(여기서, t는 1 또는 2임) - 여기서, 각각의 Ra는 독립적으로 수소, 알킬, 플루오로알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이고, 각각의 Rb는 독립적으로 직접 결합 또는 직쇄 또는 분지형 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이고, 및 Rc는 직쇄 또는 분지형 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이며, 상기 치환체들 각각은 달리 나타내지 않는 한 비치환됨.
"설파닐"은 -S- 라디칼을 지칭한다.
"설피닐"은 -S(=O)- 라디칼을 지칭한다.
"설포닐"은 -S(=O)2- 라디칼을 지칭한다.
"아미노"는 -NH2 라디칼을 지칭한다.
"시아노"는 -CN 라디칼을 지칭한다.
"니트로"는 -NO2 라디칼을 지칭한다.
"옥사"는 -O- 라디칼을 지칭한다.
"옥소"는 =O 라디칼을 지칭한다.
"알콕시" 기는 (알킬)O- 기를 지칭하며, 여기서 알킬은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"아릴옥시" 기는 (아릴)O- 기를 지칭하며, 여기서 아릴은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로알킬", "헤테로알케닐" 및 "헤테로알키닐"은 하나 이상의 골격 사슬 원자가 헤테로원자, 예를 들어 산소, 질소, 황, 규소, 인 또는 이들의 조합인 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐 및 알키닐 라디칼을 포함한다. 헤테로원자(들)는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 또는 헤테로알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착된 위치에 배치될 수 있다. 예에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: -CH2-O-CH3, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3. 게다가, 최대 2개의 헤테로원자가 연속될 수 있는데, 예로서 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3와 같은 것이다.
용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소 이외의 원자를 지칭한다. 헤테로원자들은 전형적으로 독립적으로 산소, 황, 질소, 규소 및 인 중에서 선택되지만, 이들 원자로 한정되지 않는다. 2개 이상의 헤테로 원자가 존재하는 실시 형태에서, 2개 이상의 헤테로원자는 모두 서로 동일할 수 있거나, 또는 2개 이상의 헤테로원자 중 일부 또는 전부는 각각 다른 것들과 상이할 수 있다.
용어 "결합" 또는 "단일 결합"은 2개의 원자 또는 2개의 모이어티(moiety) 사이의 화학 결합에 의해 연결된 원자들이 더 큰 구조의 부분인 것으로 여겨질 때 이러한 화학 결합을 지칭한다.
용어 "모이어티"는 분자의 특정 세그먼트 또는 작용기를 지칭한다. 화학 모이어티는 종종 분자 내에 매립되거나 그에 부가된 화학 독립체(chemical entity)로 인식된다.
"카르복시"는 -C(O)OH 라디칼을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 숫자 지정 없이 자체만으로 나타낸 치환체 "R"은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합됨) 및 비방향족 헤테로사이클(고리 탄소를 통해 결합됨)로부터 선택되는 치환체를 지칭한다.
"아미드"는 화학식 -C(O)NHR 또는 -NHC(O)R을 갖는 화학 모이어티이며, 여기서 R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합됨) 및 헤테로지환족(고리 탄소를 통해 결합됨) 중에서 선택된다. 아미드 모이어티는 아미노산 또는 펩티드 분자와 본 명세서에 기재된 화합물 사이에 결합(linkage)을 형성하며, 그럼으로써 전구약물을 형성할 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물 상의 임의의 아민, 또는 카르복실 측쇄가 아미드화될 수 있다. 그러한 아미드를 제조하기 위한 절차 및 특정 기는 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있으며, 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]과 같은 참고문헌 소스에서 용이하게 찾을 수 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
"에스테르"는 화학식 -COOR을 갖는 화학 모이어티이며, 여기서 R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합됨) 및 헤테로지환족(고리 탄소를 통해 결합됨) 중에서 선택된다. 본 명세서에 기재된 화합물 상의 임의의 하이드록시, 또는 카르복실 측쇄가 에스테르화될 수 있다. 그러한 에스테르를 제조하기 위한 절차 및 특정 기는 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있으며, 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]과 같은 참고문헌 소스에서 용이하게 찾을 수 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "고리"는 임의의 공유결합적으로 닫힌(covalently closed) 구조를 지칭한다. 고리에는, 예를 들어 카르보사이클(예를 들어, 아릴 및 사이클로알킬), 헤테로사이클(예를 들어, 헤테로아릴 및 비방향족 헤테로사이클), 방향족(예를 들어, 아릴 및 헤테로아릴), 및 비방향족(예를 들어, 사이클로알킬 및 비방향족 헤테로사이클)이 포함된다. 고리는 선택적으로 치환될 수 있다. 고리는 단환식 또는 다환식일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "고리 시스템"은 하나, 또는 하나 초과의 고리를 지칭한다.
용어 "원(membered) 고리"는 임의의 환형 구조를 포괄할 수 있다. 용어 "원"은 고리를 구성하는 골격 원자들의 수를 나타내는 것으로 되어 있다. 따라서, 예를 들어 사이클로헥실, 피리딘, 피란 및 티오피란은 6원 고리이고, 사이클로펜틸, 피롤, 푸란, 및 티오펜은 5원 고리이다.
용어 "융합(fused)"은 2개 이상의 고리가 하나 이상의 결합을 공유하는 구조를 지칭한다.
용어 "선택적으로 치환된" 또는 "치환된"은 언급된 기가 하나 이상의 추가 기(들)로 치환될 수 있음을 의미하는데, 이러한 추가 기는 개별적으로 및 독립적으로 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로지환족, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 알킬티오, 아릴티오, 알킬설폭사이드, 아릴설폭사이드, 알킬설폰, 아릴설폰, 시아노, 할로, 아실, 니트로, 할로알킬, 플루오로알킬, 아미노 - 일치환 및 이치환된 아미노 기를 포함함 -, 및 이들의 보호된 유도체로부터 선택된다. 예로서, 선택적인 치환체는 LsRs일 수 있으며, 여기서 각각의 Ls는 독립적으로 결합, -O-, -C(=O)-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, S(=O)2NH-, -NHS(=O)2, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -(치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬), 또는 -(치환 또는 비치환된 C2-C6 알케닐)로부터 선택되고; 및 각각의 Rs는 독립적으로 H, (치환 또는 비치환된 C1-C4알킬), (치환 또는 비치환된 C3-C6사이클로알킬), 헤테로아릴, 또는 헤테로알킬로부터 선택된다. 상기 치환체의 보호 유도체를 형성할 수 있는 보호기는 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있으며, 상기의 문헌[Greene and Wuts]과 같은 참고문헌에서 찾을 수 있다.
용어 "표적"은 단백질 조절제(protein modulator)가 상호작용할 수 있는 생물학적 분자를 지칭한다. 표적의 비제한적인 예에는 단백질, 예컨대 세포 주기 조절인자, 전사 인자, 번역 개시 인자, 사이클린, 수용체, 세포 신호전달 단백질, 리간드, 효소, 및 키나제가 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약물"은 단백질 조절제를 지칭한다. 단백질 조절제의 비제한적인 예에는 키나제 억제제, 키나제 길항제(antagonist), 및 키나제 효능제(agonist)가 포함된다. 예를 들어, 약물은 BTK 억제제일 수 있다. 다른 예에서, 약물은 BMK 길항제이다.
용어 "작용제(agent)"는 표적과 상호작용하는 화합물을 지칭한다. 일부 경우에, 작용제는 약물과 동일하다. 다른 경우에, 작용제는 약물과 유사하다. 다른 경우에, 작용제는 약물과 상이하다.
용어 "프로브"는 표적 검출용 화합물 또는 분자를 지칭한다. 일부 경우에, 프로브는 작용제, 링커, 표지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 프로브는 작용제를 포함한다. 다른 경우에, 프로브는 작용제 및 링커를 포함한다. 다른 경우에, 프로브는 작용제 및 표지를 포함한다. 다른 경우에, 프로브는 표지를 포함한다. 일부 경우에, 프로브는 표지 및 링커를 포함한다. 일부 경우에, 프로브는 작용제, 링커, 및 표지를 포함한다. 일부 경우에, 작용제는 링커에 부착된다. 다른 경우에, 표지는 링커에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 링커를 통해 표지에 부착된다. 대안적으로, 작용제는 표지에 부착된다.
용어 "비점유 표적"은 약물이 결합되지 않은 표적을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약물-점유 표적" 또는 "약물-결합된 표적"은 하나 이상의 약물이 결합된 표적을 지칭한다. 결합은, 공유 결합, 비공유 결합, 이온 결합, 수소 결합, 이황화 결합, 또는 반데르발스 결합을 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 유형의 결합을 포함한다. 결합은 또한 친수성 또는 소수성 상호작용을 포함할 수 있다.
용어 "프로브-결합된 표적" 또는 "프로브-결합된 키나제"는 하나 이상의 프로브가 결합된 표적 또는 키나제를 지칭한다. 결합은, 공유 결합, 비공유 결합, 이온 결합, 수소 결합, 이황화 결합, 반데르발스 결합을 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 유형의 결합을 포함한다. 결합은 또한 친수성 또는 소수성 상호작용을 포함할 수 있다. 일부 경우에, "프로브-결합된 표적"은 프로브가 부착된 약물-점유 표적을 포함한다. 다른 경우에, "프로브-결합된 표적"은 프로브가 부착된 비점유 표적을 포함한다.
"처리된 샘플"은 하나 이상의 약물이 투여된 샘플을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 환자로부터의 처리된 샘플은, 그러한 샘플이 하나 이상의 약물(예를 들어, TEC 패밀리 키나제 억제제)이 투여된 환자로부터의 것임을 의미한다.
"비처리 샘플"은 약물이 투여되지 않은 샘플을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 환자로부터의 비처리 샘플은, 그러한 샘플이 하나 이상의 약물(예를 들어, TEC 패밀리 키나제 억제제)이 투여되지 않은 환자로부터의 것임을 의미한다.
단백질 점유율 검정
표적(예를 들어, 표적 단백질 키나제)에 대한 단백질 조절제(예를 들어, 억제제 약물)의 효능을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시 형태에서, 표적 키나제(예를 들어, TEC 패밀리 키나제 또는 상동 키나제)에 대한 TEC 패밀리 키나제 억제제의 효능을 결정하기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 방법은 (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시켜 프로브-결합된 표적 키나제를 형성하는 단계; (b) 샘플 중의 프로브-결합된 표적 키나제의 양을 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 표적 키나제의 양에 기초하여 TEC 패밀리 키나제 억제제의 효능을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 단계 (a) (예를 들어, 샘플을 프로브와 배합하는 단계) 전에 샘플을 TEC 패밀리 키나제 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적 키나제의 양을 검출하는 단계는 화합물, 시약 또는 완충제를 투여하여 프로브-결합된 키나제를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 화합물, 시약 또는 완충제는 고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 검출 항체 완충제, 판독 완충제(read buffer), 세척 완충제(wash buffer)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적 키나제의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 프로브-결합된 표적 키나제의 양을 정량화하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 정량화 단계는 형광, 면역형광, 화학발광, 또는 전기화학발광을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제의 효능을 결정하는 단계는 TEC 패밀리 키나제 억제제에 의한 표적 키나제의 점유율을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적 키나제의 양은 TEC 패밀리 키나제 억제제의 효능과 역의 상관관계가 있다. 예를 들어, 도 8 및 도 10에 도시된 바와 같이, 약물-처리된 샘플(예를 들어, 프로브와 접촉되기 전에 약물과 접촉된 샘플)이 프로브와 접촉되는 경우, 이때에는 검출된 프로브-결합된 표적 키나제(예를 들어, 비점유 표적 키나제)의 양이 증가함에 따라, 약물의 효능이 감소한다. 다른 예에서는, 약물-처리된 샘플이 프로브와 접촉되는 경우, 이때에는 검출된 프로브-결합된 표적 키나제(예를 들어, 비점유 표적 키나제)의 양이 감소함에 따라, 약물의 효능이 증가한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적 키나제의 양은 약물의 효능과 직접적인 상관관계가 있다. 예를 들어, 도 9에 도시된 바와 같이, 비처리 샘플(예를 들어, 프로브와 접촉되기 전에 약물과 접촉되지 않은 샘플)이 프로브와 접촉되는 경우, 이때에는 검출된 프로브-결합된 표적 키나제의 양이 증가함에 따라, 약물의 효능 또한 증가한다. 다른 예에서는, 비처리 샘플(예를 들어, 프로브와 접촉되기 전에 약물과 접촉되지 않은 샘플)이 프로브와 접촉되는 경우, 이때에는 검출된 프로브-결합된 표적 키나제의 양이 감소함에 따라, 약물의 효능 또한 감소한다. 일부 실시 형태에서, 약물이 표적 키나제의 약 50% 이상과 결합될 때 약물은 유효한 것으로 결정된다. 대안적으로, 약물이 표적 키나제의 약 60% 이상과 결합될 때 약물은 유효한 것으로 결정된다. 일부 실시 형태에서, 약물이 표적의 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 이상과 결합될 때 약물은 유효한 것으로 결정된다.
일부 실시 형태에서, 검정은 TEC 패밀리 키나제가 투여된 환자로부터 얻어진 샘플에 대해 수행된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여 후 약 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주 또는 그 이상의 시간째에 얻어진다.
일부 실시 형태에서, 프로브는 작용제 및 표지를 포함한다. 일부 경우에, 작용제는 표지에 융합된다. 다른 경우에, 작용제는 표지에 부착된다. 다른 경우에, 작용제는 링커에 의해 표지에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 작용제와 약물은 본질적으로 동일하다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 표지 및 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제와 약물은 약 20% 이상 동일하거나, 약 30% 이상 동일하거나, 약 40% 이상 동일하거나, 약 50% 이상 동일하거나, 약 60% 이상 동일하거나, 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하다. 다른 실시 형태에서, 작용제와 약물은 상이하다. 일부 실시 형태에서, 작용제와 약물은 약 5% 이상 상이하거나, 약 10% 이상 상이하거나, 약 20% 이상 상이하거나, 약 30% 이상 상이하거나, 약 40% 이상 상이하거나, 약 50% 이상 상이하거나, 약 60% 이상 상이하거나, 약 70% 이상 상이하거나, 약 80% 이상 상이하거나, 약 90% 이상 상이하거나, 약 95% 이상 상이하다.
표적
표적 키나제(예를 들어, TEC 패밀리 키나제 또는 상동 티로신 키나제)에 대한 TEC 패밀리 키나제 억제제의 효능을 결정하기 위한 방법, 검정 및 시스템이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 세포 주기 조절인자, 수용체, 리간드, 전사 조절인자, 전사 개시 인자, 효소, 세포 신호전달 단백질, 및 다른 단백질 키나제와 같은, 그러나 이로 한정되지 않는 다른 표적 단백질에 적합하게 될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 표적 키나제는 티로신 키나제이다. 특정 실시 형태에서, 표적 키나제는 세린/트레오닌 키나제이다.
일부 실시 형태에서, 표적 키나제는 비수용체 티로신 키나제의 TEC 패밀리의 구성원이다. TEC 키나제 패밀리는 TEC, BMX(X 염색체 상의 골수 키나제; Etk라고도 명명됨), BTK(브루톤의 티로신 키나제), ITK(IL-2-유도성 T 세포 키나제; Emt라고도 알려짐), 및 Rlk(휴면 림프구 키나제(Resting lymphocyte kinase); TXK라고도 지명됨)를 포함한다. 일부 경우에, 표적 키나제는 BTK이다. 다른 경우에, 표적 키나제는 ITK이다. 다른 경우에, 표적 키나제는 TXK이다. 다른 경우에, 표적 키나제는 BMX이다. 다른 경우에, 표적 키나제는 TEC이다.
일부 실시 형태에서, 표적 키나제는 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 표적 키나제는 HER1(EGFR, ErbB1), HER2/c-neu(ErbB2), HER3(ErbB3) 및 HER4(ErbB4), 또는 JAK3이다.
일부 실시 형태에서, 표적 키나제는 SRC 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 표적 키나제는 BLK이다.
제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 추가의 예시적인 표적 키나제에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: Abl, 활성화 Cdc42-관련 키나제-1(ACK1), Akt/PKB, Abl-관련 유전자(Arg), 아폽토시스 신호-조절 키나제(Ask-1), 오로라(Aurora) A, 오로라 B, 오로라 C, Axl, 칼슘/칼모듈린 의존성 키나제-Iδ(CaMKIδ), 칼슘/칼모듈린 의존성 키나제 IIβ(CaMKIIβ), CaMKIIγ, CaMKIIδ, 카세인 키나제(CK, CK1γ1, CK1γ2, CK1γ3), 사이클린-의존성 키나제(Cdk), 사이클린-의존성 단백질 키나제-9/사이클린 T1(CDK9/사이클린 T1), 카세인 키나제-2α2(CK2α2), Chk, c-kit, cdc-유사 키나제-2(CLK2), Cot1, C-말단 c-Src 키나제(Csk), 죽음-관련 단백질 키나제-1(DAPK1), 더블코르틴 및 CAM 키나제-유사-2(DCAMKL2), 디스코이딘(Discoidin) 도메인 수용체 1 및 2(DDR1 및 DDR2), Eph 수용체, 국소 부착 키나제(Focal adhesion kinase, FAK), Fer, 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR), Fgr, Fns-유사 티로신 키나제(Flt), Fms-유사 티로신 키나제-4(Flt4), Fms/CSF-1 R, Fyn, G 단백질-결합 수용체 키나제(GRKs), G 단백질-결합 수용체 키나제-7(GRK7), 글리코겐 신타제 키나제(GSK), 조혈 세포 키나제(Hck), 호메오도메인-상호작용성 단백질 키나제-1(HIPK1), HIPK2, HIPK3, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IKB 키나제(IKK), 인슐린 수용체, IL-1 수용체 관련 키나제(IRAK), 스트레스-활성화 단백질 키나제 1(SAPK), 키나제 불활성 도메인-함유 수용체(KDR), c-Kit, Lck, LIM 키나제(LIMK), 림프구-배향 키나제(LOK), Lyn, MAPK/Erk, MAPK-활성화 단백질 키나제(MAPKAP K 또는 MK), MAP 키나제/Erk 키나제(MEK), 모성 배아 류신 지퍼 키나제(Maternal embryonic leucine zipper kinase, MELK), Met, Mer, 기형/NIK-관련 키나제(MINK), 미토겐 활성화 단백질 키나제 키나제(MKK), 혼합 계통 키나제-1(MLK1), 근긴장성 이영양증 키나제-관련 Cdc42-결합성 키나제α(MRCKα), 미토겐-및-스트레스-활성화 단백질 키나제 1(MSK1), 포유류 STE20-유사 키나제(MST), 포유류 STE20-유사 단백질 키나제-3(MST3), 라파마이신의 표적(mTOR, FRAP, RAFT), mTor/FKBP12, NIMA-관련 단백질 키나제-3(NEK3), NEK9, P21-활성화 키나제(PAK), PAK3, PAR-1 키나제, 혈소판-유래 성장 인자 수용체(PDGFR), PI (3,4,5) P3-의존성 키나제 1(PDK1), 포스포릴라제 키나제(PhK), 포스파티딜이노시톨(PI) 3-키나제, 폴로(Polo)-유사 키나제-1(PLK1), PIM 키나제, 단백질 키나제 C, PKD2, cGMP-의존성 단백질 키나제-1α(PKG1α), 이중-가닥 RNA-활성화 단백질 키나제(PKR), P38-조절/활성화 단백질 키나제(PRAK), 단백질 티로신 키나제-5(PTK5), 프롤린 풍부 키나제(Pyk)2, Raf 키나제(Raf-1, A-Raf, B-Raf), Ret, 수용체-상호작용성 세린/트레오닌 키나제 2(RIPK2), Ron, Ros, Rse(Brt, BYK, Dtk, Etk3, Sky, Tif, 또는 sea-관련 수용체 티로신 키나제), 리보솜 단백질 S6 키나제-4(Rsk4), P70 S6 키나제, SAPK, 혈청- 및 글루코코르티코이드-유도 키나제(SGK), c-Src, Syk, TGF-β 활성화 키나제(TAK1), 수많은 아미노산 단백질 키나제-1(thousand and one amino acid protein kinase-1, TAO1), Ig- 및 EGF-상동 도메인-2를 갖는 티로신 키나제(Tie2/TEK), 토우슬레드(Tousled)-유사 키나제(TLK), Trk, 테스티스(Testis) 특이적 세린 키나제(TSSK), Unc-51-유사 키나제-2(ULK2), ULK3, 우두(Vaccinia)-관련 키나제-2, Wee, Yes, ZAP-70, 및 지퍼 상호작용성 단백질 키나제(ZIPK).
약물
표적에 대한 약물의 효능을 결정하기 위한 방법, 검정, 및 시스템이 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에 개시된 적합한 약물은 단백질 조절제를 포함한다. 단백질 조절제는 단백질 억제제, 단백질 길항제, 및 단백질 효능제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 단백질 억제제이다. 단백질 억제제의 예에는 단백질 키나제 억제제가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 약물은 단백질 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 단백질 키나제 억제제는 티로신 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 티로신 키나제 억제제는 다사티닙, 이마티닙, 닐로티닙, 수니티닙, 게피티닙, 에를로티닙 중 임의의 하나이다.
일부 실시 형태에서, 티로신 키나제 억제제는 TEC 패밀리 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 티로신 키나제 억제제는 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 가역적 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 가역적 BTK 억제제는 LFM-A13 또는 테레산이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 비가역적 BTK 억제제이다. 비가역적 BTK 억제제의 예에는 이브루티닙, AVL-291, AVL-101, AVL-292, 또는 ONO-WG-307이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 비가역적 BTK 억제제는 이브루티닙이다. 일부 경우에, BTK 억제제는 RN486이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 ITK 억제제이다. 일부 경우에, ITK 억제제는 CTA056이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 TEC 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 TXK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 BMX 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 BLK 억제제이다.
일부 실시 형태에서, 약물은 키나제를 억제한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 티로신 키나제를 억제한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 수용체 티로신 키나제를 억제한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 비수용체 티로신 키나제를 억제한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 세린/트레오닌 키나제를 억제한다.
일부 경우에, 키나제는 AGC 키나제 패밀리의 구성원이다. 다른 경우에, 키나제는 CaM 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 TK 키나제 패밀리의 구성원이다. 대안적으로, 키나제는 CKI 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 CMGC 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 경우에, 키나제는 STE 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 STK 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 경우에, 키나제는 TKL 키나제 패밀리의 구성원이다.
단백질 점유율 검정 키트
링커, 표지, 작용제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 단백질 점유율 검정 키트가 본 명세서에 개시된다. 일 태양은 링커 및 표지를 포함하는 단백질 점유율 검정 키트이며, 여기서 링커는 표지를 작용제에 부착시킬 수 있고, 작용제는 단백질 조절제이다. 다른 태양은 작용제, 링커, 및 표지를 포함하는 단백질 점유율 검정 키트이며, 여기서 링커는 작용제 및 표지에 부착될 수 있으며, 그럼으로써 작용제를 표지에 부착시킬 수 있다. 일부 실시 형태는 프로브를 포함하는 단백질 점유율 검정 키트이며, 여기서 프로브는 표지에 부착된 작용제를 포함한다. 일부 실시 형태는 프로브를 포함하는 단백질 점유율 검정 키트이며, 여기서 프로브는 링커에 부착된 작용제를 포함한다.
일부 실시 형태는 작용제 및 고형 지지체를 포함하는 단백질 점유율 검정 키트이며, 여기서 작용제는 고형 지지체에 부착된다. 다른 실시 형태는 표지 및 고형 지지체를 포함하는 단백질 점유율 검정 키트이며, 여기서 표지는 고형 지지체에 부착된다. 다른 실시 형태는 프로브 및 고형 지지체를 포함하는 단백질 점유율 검정 키트이며, 여기서 프로브는 작용제, 링커, 표지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태는 표적(예를 들어, 단백질) 및 고형 지지체를 포함하는 단백질 점유율 검정 키트이며, 여기서 표적은 고형 지지체에 부착된다.
일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 키트들 중 임의의 것은 표지를 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 키트들 중 임의의 것은 링커를 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 키트들 중 임의의 것은 작용제를 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 키트들 중 임의의 것은 복수의 링커를 추가로 포함하며, 여기서 링커는 다른 링커, 작용제, 표지, 또는 이들의 임의의 조합에 부착될 수 있다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 키트들 중 임의의 것은 프로브를 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 프로브는 작용제, 링커, 표지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 키트들 중 임의의 것은 표적(예를 들어, 단백질)을 추가로 포함한다. 작용제, 링커, 표지, 프로브, 고형 지지체, 및 표적의 예시적인 실시 형태가 본 명세서에 개시된다. 프로브 또는 표적을 고형 지지체에 부착시키기 위한 예시적인 방법이 본 명세서에 추가로 개시된다.
프로브
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 프로브를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 작용제 및 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제와 표지는 부착된다. 다른 실시 형태에서, 프로브는 작용제 및 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제와 링커는 부착된다. 다른 실시 형태에서, 프로브는 작용제, 링커, 및 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제, 링커 및/또는 표지는 서로 부착된다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 표지를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 프로브는 표지 및 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표지와 링커는 부착된다. 일부 실시 형태에서, 부착은 화학적 방법, 효소적 방법, 또는 가교결합 방법에 의한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 고형 지지체에 부착된다. 작용제, 링커, 표지, 및 고형 지지체의 예시적인 실시 형태가 본 명세서에 개시된다.
작용제
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 작용제를 포함한다. 적합한 작용제는 단백질 조절제(예를 들어, 억제제, 길항제, 및 효능제)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 약물이다. 본 명세서에 개시된 적합한 약물은 단백질 조절제를 포함한다. 단백질 조절제는 단백질 억제제, 단백질 길항제, 및 단백질 효능제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 단백질 억제제이다. 단백질 억제제의 예에는 단백질 키나제 억제제가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 약물은 단백질 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 단백질 키나제 억제제는 티로신 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 티로신 키나제 억제제는 다사티닙, 이마티닙, 닐로티닙, 수니티닙, 게피티닙, 에를로티닙 중 임의의 하나이다.
일부 실시 형태에서, 티로신 키나제 억제제는 TEC 패밀리 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 티로신 키나제 억제제는 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 가역적 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 가역적 BTK 억제제는 LFM-A13 또는 테레산이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 비가역적 BTK 억제제이다. 비가역적 BTK 억제제의 예에는 이브루티닙, AVL-291, AVL-101, AVL-292, 또는 ONO-WG-307이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 비가역적 BTK 억제제는 이브루티닙이다. 일부 경우에, BTK 억제제는 RN486이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 ITK 억제제이다. 일부 경우에, ITK 억제제는 CTA056이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 TEC 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 TXK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 BMX 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 약물은 BLK 억제제이다.
일부 실시 형태에서, 약물은 키나제를 억제한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 티로신 키나제를 억제한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 수용체 티로신 키나제를 억제한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 비수용체 티로신 키나제를 억제한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 세린/트레오닌 키나제를 억제한다.
일부 경우에, 키나제는 AGC 키나제 패밀리의 구성원이다. 다른 경우에, 키나제는 CaM 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 TK 키나제 패밀리의 구성원이다. 대안적으로, 키나제는 CKI 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 CMGC 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 경우에, 키나제는 STE 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 STK 키나제 패밀리의 구성원이다. 일부 경우에, 키나제는 TKL 키나제 패밀리의 구성원이다.
링커
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 링커를 포함한다. 적합한 링커는 본 명세서에 개시된 표지 및/또는 작용제에 부착할 수 있는 임의의 화학적 또는 생물학적 화합물을 포함한다. 링커가 표지 및 작용제 둘 모두에 부착하는 경우, 이때에는 적합한 링커가 표지와 작용제를 충분히 분리시킬 수 있을 것이다. 적합한 링커는, 작용제가 표적(예를 들어, 단백질)에 결합하는 능력을 크게 방해하지 않을 것이다. 적합한 링커는, 표지가 검출되는 능력을 크게 방해하지 않을 것이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 강성이다. 다른 실시 형태에서, 링커는 가요성이다. 다른 실시 형태에서, 링커는 반강성이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 단백질 분해에 안정하다(예를 들어, 단백질 분해 절단에 내성이 있다). 다른 실시 형태에서, 링커는 단백질 분해에 불안정하다(예를 들어, 단백질 절단에 민감하다). 일부 실시 형태에서, 링커는 나선형(helical)이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 비나선형이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 코일형(coiled)이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 β-가닥형(β-stranded)이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 회전 형태(turn conformation)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 단일 사슬이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 장쇄이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 단쇄이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 적어도 약 5개의 잔기, 적어도 약 10개의 잔기, 적어도 약 15개의 잔기, 적어도 약 20개의 잔기, 적어도 약 25개의 잔기, 적어도 약 30개의 잔기, 또는 적어도 약 40개의 잔기를 포함한다.
링커의 예에는 하이드라존, 다이설파이드, 티오에테르, 및 펩티드 링커가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 프롤린 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 아르기닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 글루타민, 글루타메이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 헤테로이작용성 가교결합제이다. 일부 실시 형태에서, 헤테로이작용성 가교결합제는 설포(Sulfo)-SMCC이다.
표지
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 표지를 포함한다. 표지의 예에는 화학적, 생화학적, 생물학적, 비색분석용, 효소적, 형광, 발광 표지, 화학발광 표지, 및 전기화학발광 표지가 포함되지만 이로 한정되지 않으며, 이들은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 표지는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 염료, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 항체 또는 항체 단편, 바이오재료, 나노입자, 스핀 표지, 형광단, 금속-함유 모이어티, 방사능 모이어티, 신규한 작용기, 다른 분자들과 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 상호작용하는 기, 광케이징된(photocaged) 모이어티, 화학 방사선 여기성 모이어티, 리간드, 광이성화성 모이어티, 비오틴, 비오틴 유사체, 중원자(heavy atom)를 도입한 모이어티, 화학적으로 절단가능한 기, 광절단성 기, 레독스-활성제, 동위원소로 표지화된 모이어티, 생물물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자 고밀도 기(electron dense group), 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 또는 이들의 조합.
일부 실시 형태에서, 표지는 화학적 표지이다. 화학적 표지의 예에는 비오틴 및 방사성 동위원소(예를 들어, 요오드, 탄소, 인산염, 수소)가 포함될 수 있지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 생물학적 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 생물학적 표지는 생물직교(bioorthogonal) 아지드-개질된 아미노산, 당, 및 다른 화합물을 포함하지만 이로 한정되지 않는 대사성 표지(metabolic label)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 효소적 표지를 포함한다. 효소적 표지에는 고추냉이 과산화수소(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP), 글루코스 옥시다제, 및 β-갈락토시다제가 포함될 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 효소적 표지는 루시페라제이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 형광 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 형광 표지는 유기 염료(예를 들어, FITC), 생물학적 형광단(예를 들어, 녹색 형광 단백질), 또는 양자점(quantum dot)이다. 형광 표지의 비제한적인 목록에는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC), 다이라이트(DyLight) 형석, 플루오레세인, 로다민(테트라메틸 로다민 아이소티오시아네이트, TRITC), 쿠마린, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 및 보디피(BODIPY)가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 표지는 형광단이다. 예시적인 형광단에는 인도카르보시아닌(C3), 인도다이카르보시아닌(C5), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 텍사스 레드(Texas Red), 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 알렉사 플루어(Alexa Fluor)®-355, 알렉사 플루어 488, 알렉사 플루어 532, 알렉사 플루어 546, 알렉사 플루어-555, 알렉사 플루어 568, 알렉사 플루어 594, 알렉사 플루어 647, 알렉사 플루어 660, 알렉사 플루어 680, JOE, 리사민(Lissamine), 로다민 그린(Rhodamine Green), 보디피, 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC), 카르복시-플루오레세인(FAM), 피코에리트린, 로다민, 다이클로로로다민(d로다민(dRhodamine)), 카르복시 테트라메틸로다민(TAMRA), 카르복시-X-로다민(록스(ROX)™), LIZ™, VIC™, NED™, PET™, SYBR, 피코그린(PicoGreen), 리보그린(RiboGreen) 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 형광 표지는 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질, 피코빌리단백질(예를 들어, 알로피코시아닌, 피코시아닌, 피코에리트린, 및 피코에리트로시아닌)이다.
고형 지지체
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 고형 지지체를 포함한다. 고형 지지체는 프로브 또는 항체가 부착될 수 있는 임의의 고형 플랫폼을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 비드, 플레이트, 및 어레이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 플레이트에 부착된 비드를 포함한다. 예를 들어, 도 11b에 도시된 바와 같이, 스트렙타비딘 비드가 플레이트에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 플레이트를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 고형 지지체는 플레이트에 부착된 항체를 포함한다. 예를 들어, 도 11a에 도시된 바와 같이, 항-BTK 항체가 플레이트에 부착된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 비드를 포함한다. 비드의 예에는 스트렙타비딘 비드, 아가로스 비드, 자성 비드, 다이나비즈(Dynabeads)®, MACS® 마이크로비드, 항체 접합된 비드(예를 들어, 항-면역글로불린 마이크로비드), 단백질 A 접합된 비드, 단백질 G 접합된 비드, 단백질 A/G 접합된 비드, 단백질 L 접합된 비드, 올리고-dT 접합된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-형광색소 마이크로비드, 및 비씨맥(BcMag)™ 카르복시-종결된 자성 비드가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 플레이트를 포함한다. 플레이트의 예에는 MSD 멀티-어레이 플레이트, MSD 멀티-스폿(Multi-Spot)® 플레이트, 마이크로플레이트, 프로트온(ProteOn) 마이크로플레이트, 알파플레이트(AlphaPlate), 델피아(DELFIA) 플레이트, 아이소플레이트(IsoPlate), 및 루마플레이트(LumaPlate)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
작용제, 링커, 및/또는 표지를 부착시키기 위한 방법
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 작용제, 링커, 표지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제, 링커, 및/또는 표지는 부착된다. 작용제, 링커, 및/또는 표지를 부착시키기 위한 방법에는 화학적 표지화 및 효소적 표지화가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 표지를 링커 및/또는 작용제에 부착시키는 방법은 화학적 표지화 기술을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 화학적 표지화 기술은 화학 반응성 기를 포함한다. 일반적인 반응성 기에는 아민-반응성 아이소티오시아네이트 유도체가 포함되지만 이로 한정되지 않으며, 이러한 유도체에는 FITC, 아민-반응성 석신이미딜 에스테르, 예컨대 NHS-플루오레세인 또는 NHS-로다민, 및 설프하이드릴-반응성 말레이미드-활성화 형석, 예컨대 플루오레세인-5-말레이미드가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 이들 반응성 염료 중 임의의 것과 다른 분자의 반응은 형광단과 링커 및/또는 작용제 사이에 안정한 공유 결합이 형성되게 한다. 일부 실시 형태에서, 반응성 기는 아이소티오시아네이트이다. 일부 실시 형태에서, 표지는 리신 측쇄의 1차 아민을 통해 작용제에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 화학적 표지화는 NHS-에스테르 화학 방법을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 표지를 링커 및/또는 작용제에 부착시키는 방법은 효소적 표지화 및 친화성 표지화를 포함한다. 효소적 표지화에는 하기가 포함될 수 있지만 이로 한정되지 않는다: 아실 캐리어 단백질/포스포판테테인 트랜스퍼라제(ACP/PPTase), Q-태그/트랜스글루타미나제(TGase)(문헌[Lin, C.W. and Ting, A.Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 4542-4543]), 비오틴 억셉터 펩티드/비오틴 리가제(AP/Bir A)(문헌[Chen, I., et al., Site-specific labeling of cell surface proteins with biophysical probes using biotin ligase. Nat. Meth. 2005, 2, 99-104.]), 파르네실화 모티브/단백질 파르네실트랜스퍼라제(PFTase)(문헌[Duckworth, B.P., et al., Selective labeling of proteins by using protein farnesyltransferase. ChemBioChem 2007, 8, 98-105]), 알데하이드 태그/포르밀글리신-생성 효소(문헌[Carrico, I.S., et al., Introducing genetically encoded aldehydes into proteins. Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 321-322]), 인간 O 6-알킬구아닌 트랜스퍼라제(hAGT)(문헌[Keppler, A., et al., A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 86-89]; 문헌[Keppler, A., et al., Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 9955-9959]), 및 돌연변이된 원핵생물 데할로게나제(HaloTagTM) 방법(문헌[Los, G., et al., HalotagTM technology: cell imaging and protein analysis. Cell Notes 2006, 14, 10-14]). 친화성 표지화에는 하기가 포함될 수 있지만 이로 한정되지 않는다: 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 이용하는 비공유결합 방법(문헌[Miller, L.W., et al., Methotrexate conjugates: a molecular in vivo protein tag. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2004, 43, 1672-1675]; 문헌[Miller, L.W., et al., In vivo protein labeling with trimethoprim conjugates: a flexible chemical tag. Nat. Meth. 2005, 2, 255-257]) 및 FK506-결합성 단백질 12의 Phe36Val 돌연변이체(FKBP12(F36V))(문헌[Marks, K.M., Braun, P.D., Nolan, G.P., A general approach for chemical labeling and rapid, spatially controlled protein inactivation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 9982-9987]), 및 금속-킬레이트화 방법.
일부 실시 형태에서, 가교결합 시약이 표지, 링커, 및/또는 작용제를 부착시키는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, 가교결합 시약은 글루타르알데하이드이다. 일부 실시 형태에서, 글루타르알데하이드는 여러 경로들 중 하나에 의해 아민 기와 반응하여 가교결합을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 환원성 조건 하에서, 글루타르알데하이드의 양쪽 말단 상에 있는 알데하이드는 아민과 커플링하여 2차 아민 결합을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 표지, 링커, 및/또는 작용제의 부착은 과옥소산염-활성화에 이어지는 환원적 아미노화를 포함한다. 예를 들어, 과옥소산염-활성화에 이어지는 환원적 아미노화는 링커 및/또는 작용제에 대한 HRP 및 다른 당단백질의 접합에 사용된다. 일부 경우에, 과옥소산염에 의한 글리코실화 효소의 처리는 당 시스-다이올 기(특히, 당단백질 다당류에서 공통인 시알산)의 산화를 가져오며, 이는 알데하이드 기의 형성을 가져온다. 일부 경우에, 이들 알데하이드 기는 (약한 환원제인 시아노붕수소화물의 존재 하에서) 첨가된 항체 또는 다른 분자의 1차 아민과 반응한다.
일부 실시 형태에서, 설포-SMCC 또는 다른 헤테로이작용성 가교결합제가, 표지를 링커 및/또는 작용제에 접합시키는 데 사용된다. 예를 들어, 설포-SMCC가, 효소를 약물에 접합시키는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, 효소는 한 단계로 활성화 및 정제되고, 이어서 제2 단계에서 약물에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 가교결합의 방향성(directionality)은 하나의 특정 배향(예를 들어, 항체 상의 설프하이드릴 기 쪽으로의 효소 상의 아민)으로 제한된다.
일부 실시 형태에서, 링커와 표지 및/또는 작용제 사이에 결합이 형성된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "결합(linkage)"은 링커의 작용기와 다른 분자(예를 들어, 표지, 작용제) 사이의 화학 반응으로부터 형성된 결합(bond) 또는 화학 모이어티를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 그러한 결합에는 공유 결합 및 비공유 결합이 포함되지만 이로 한정되지 않으며, 반면 그러한 화학 모이어티에는 에스테르, 카르보네이트, 이민, 인산 에스테르, 하이드라존, 아세탈, 오르토에스테르, 펩티드 결합, 및 올리고뉴클레오티드 결합이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 가수분해에 안정한 결합은, 그러한 결합이, 장기간 동안, 아마도 심지어는 무기한까지의 생리학적 조건 하에서를 포함하지만 이로 한정되지 않는 유용한 pH 값에서, 물에서 사실상 안정하고 물과 반응하지 않음을 의미한다. 가수분해에 불안정한 또는 분해가능한 결합은, 그러한 결합이 물에서 또는, 예를 들어 혈액을 포함한 수용액에서 분해가능함을 의미한다. 다른 실시 형태에서, 효소에 불안정한 또는 분해가능한 결합은, 그러한 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해됨을 의미한다. 단지 예로서, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격 내에 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기들 중 하나 이상 사이의 링커 기 내에 분해가능한 결합을 포함한다. 그러한 분해가능한 결합에는 생물학적 활성제 상에서의 PEG 카르복실산 또는 활성화 PEG 카르복실산과 알코올 기의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합이 포함되지만 이로 한정되지 않으며, 여기서 그러한 에스테르 기는 일반적으로 생리학적 조건 하에서 가수분해되어 생물학적 활성제를 방출시킨다. 다른 가수분해에 분해가능한 결합에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: 카르보네이트 결합; 아민과 알데하이드의 반응으로부터 생성된 이민 결합; 알코올을 포스페이트 기와 반응시킴으로써 형성된 인산 에스테르 결합; 하이드라지드와 알데하이드의 반응 생성물인 하이드라존 결합; 알데하이드와 알코올의 반응 생성물인 아세탈 결합; 포르메이트와 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합; PEG와 같은 중합체의 말단을 포함하지만 이로 한정되지 않는 위치에 있는 아민 기와 펩티드의 카르복실 기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 중합체의 말단을 포함하지만 이로 한정되지 않는 위치에 있는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 기와 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합.
프로브 또는 표적(예를 들어, 단백질)을 고형 지지체에 부착시키기 위한 방법
일부 실시 형태에서, 프로브 또는 표적(예를 들어, 단백질)을 고형 지지체에 부착시키기 위한 방법에는 화학적 및/또는 효소적 방법이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 화학적 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시 형태에서, 효소적 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시 형태에서, 프로브 또는 표적을 고형 지지체에 부착시키기 위한 방법은 고형 지지체를 프로브 또는 표적으로 코팅하는 단계를 포함한다. 마이크로플레이트를 항체로 코팅하기 위한 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 코팅 완충제 중에 항체를 희석시키는 단계 및 희석된 항체를 마이크로플레이트 내의 웰에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 비결합된 항체는 플레이트를 세척 완충제로 세척함으로써 제거될 수 있다.
TEC 패밀리 키나제 프로브 화합물
본 명세서에 기재된 TEC 패밀리 키나제 프로브 화합물은 TEC 패밀리 키나제 억제제를 포함하는 모이어티, 링커 모이어티, 및 검출가능한 표지로 구성된다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 비가역적 TEC 패밀리 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 억제제는 Btk 억제제이다. 일부 실시 형태에서, Btk의 억제제는 비가역적 억제제이다. 다른 실시 형태에서, Btk의 비가역적 억제제는 Btk의 ATP 결합성 포켓 내의 비촉매 잔기(non-catalytic residue)에 결합한다. 추가 실시 형태에서, 비촉매 잔기는 시스테인 잔기이다. 일부 실시 형태에서, Btk 프로브는 Btk의 적어도 하나의 비촉매 잔기와 공유 결합을 형성한다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 프로브 화합물은 비가역적 Btk 억제제의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 프로브 화합물은 이브루티닙의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 프로브 화합물은 이브루티닙의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 프로브 화합물은 링커를 통해 표지에 부착된 이브루티닙으로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 프로브 화합물은 AVL-292, AVL-291, AVL-101, CNX-774, 또는 ONO-WG-307의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, TEC 패밀리 키나제 프로브 화합물은 링커를 통해 표지에 부착된 AVL-292, AVL-291, AVL-101, CNX-774, 또는 ONO-WG-307로 이루어진다.
일 태양은 하기를 포함하는 화학식 I의 TEC 패밀리 키나제 프로브이다:
[화학식 I]
Figure pct00009
(여기서,
La는 CH2, O, NH 또는 S이고;
Ar은 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
Y는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
Z는 C(O), OC(O), NHC(O), C(S), S(O)n, OS(O)n, NHS(O)n(여기서, n은 1 또는 2임)이고;
R6 및 R8은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬로부터 선택되고;
L1은 결합, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 아미드 모이어티, 선택적으로 케톤 모이어티, 선택적으로 치환된 카르바메이트 모이어티, 및 선택적으로 에스테르 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 검출가능한 표지임).
일부 실시 형태에서, La는 CH2, O, 또는 NH이다. 다른 실시 형태에서, La는 O 또는 NH이다. 일부 실시 형태에서, La는 O이다. 일부 실시 형태에서, Ar은 치환 또는 비치환된 아릴이다. 일부 실시 형태에서, Ar은 6원 아릴이다. 일부 다른 실시 형태에서, Ar은 페닐이다. 일부 실시 형태에서, Z는 C(=O), OC(=O), NHC(=O), S(=O)x, OS(=O)2, 또는 NHS(=O)2이다. 일부 실시 형태에서, Z는 C(=O), NHC(=O), 또는 S(=O)2이다. 일부 실시 형태에서, Z는 C(=O)이다. 일부 실시 형태에서, Z는 NHC(=O)이다. 일부 실시 형태에서, Y는 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 및 헤테로사이클로알킬로부터 선택되는 선택적으로 치환된 기이다. 일부 실시 형태에서, Y는 C1-C6알킬, C1-C6헤테로알킬, 4원, 5원, 6원 또는 7원 사이클로알킬, 및 4원, 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클로알킬로부터 선택되는 선택적으로 치환된 기이다. 일부 실시 형태에서, Y는 C1-C6알킬, C1-C6헤테로알킬, 5원 또는 6원 사이클로알킬, 및 1개 또는 2개의 N 원자를 함유하는 5원 또는 6원 헤테로사이클로알킬로부터 선택되는 선택적으로 치환된 기이다. 일부 실시 형태에서, Y는 5원 또는 6원 사이클로알킬, 또는 1개 또는 2개의 N 원자를 함유하는 5원 또는 6원 헤테로사이클로알킬이다. 일부 실시 형태에서, Y는 피롤리딘 고리이다. 일부 실시 형태에서, Y는 피페리딘 고리이다. 일부 실시 형태에서, R6 및 R8은 독립적으로 H, 비치환된 C1-C4 알킬, 치환된 C1-C4알킬, 비치환된 C1-C4헤테로알킬, 및 치환된 C1-C4헤테로알킬로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, R6 및 R8은 각각 H이다.
일부 실시 형태에서, L1은 결합, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 아미드 모이어티, 선택적으로 케톤 모이어티, 선택적으로 치환된 카르바메이트 모이어티, 및 선택적으로 에스테르 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, L1은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 아미드 모이어티, 선택적으로 케톤 모이어티, 선택적으로 치환된 카르바메이트 모이어티, 및 선택적으로 에스테르 모이어티로부터 선택되는 적어도 2개의 기의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, L1은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 아미드 모이어티, 선택적으로 케톤 모이어티, 선택적으로 치환된 카르바메이트 모이어티, 및 선택적으로 에스테르 모이어티로부터 선택되는 적어도 3개의 기의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, L1은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 아미드 모이어티, 선택적으로 케톤 모이어티, 선택적으로 치환된 카르바메이트 모이어티, 및 선택적으로 에스테르 모이어티로부터 선택되는 적어도 4개의 기의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, X는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 표지이다: 염료, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 항체 또는 항체 단편, 바이오재료, 나노입자, 스핀 표지, 형광단, 금속-함유 모이어티, 방사능 모이어티, 신규한 작용기, 다른 분자들과 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 상호작용하는 기, 광케이징된 모이어티, 화학 방사선 여기성 모이어티, 리간드, 광이성화성 모이어티, 비오틴, 비오틴 유사체, 중원자를 도입한 모이어티, 화학적으로 절단가능한 기, 광절단성 기, 레독스-활성제, 동위원소로 표지화된 모이어티, 생물물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자 고밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 또는 이들의 조합. 일부 실시 형태에서, X는 형광단이다. 일부 실시 형태에서, X는 비오틴이다. 일부 실시 형태에서, X는 비오틴 유사체이다.
다른 실시 형태는 하기를 포함하는 화학식 II의 TEC 패밀리 키나제 프로브이다:
[화학식 II]
Figure pct00010
(여기서,
La는 CH2, O, NH 또는 S이고;
Ar은 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
Y는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
Z는 C(O), OC(O), NHC(O), C(S), S(O)n, OS(O)n, NHS(O)n(여기서, n은 1 또는 2임)이고;
R6 및 R8은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬로부터 선택되고;
L1은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고;
L2는 결합, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 -N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)-(여기서, m은 2 내지 6임)이고;
L3은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고;
X는 검출가능한 표지임).
일부 실시 형태에서, La는 CH2, O, 또는 NH이다. 다른 실시 형태에서, La는 O 또는 NH이다. 일부 실시 형태에서, La는 O이다. 일부 실시 형태에서, Ar은 치환 또는 비치환된 아릴이다. 일부 실시 형태에서, Ar은 6원 아릴이다. 일부 다른 실시 형태에서, Ar은 페닐이다. 일부 실시 형태에서, Z는 C(=O), OC(=O), NHC(=O), S(=O)x, OS(=O)2, 또는 NHS(=O)2이다. 일부 실시 형태에서, Z는 C(=O), NHC(=O), 또는 S(=O)2이다. 일부 실시 형태에서, Z는 C(=O)이다. 일부 실시 형태에서, Z는 NHC(=O)이다. 일부 실시 형태에서, Y는 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 및 헤테로사이클로알킬로부터 선택되는 선택적으로 치환된 기이다. 일부 실시 형태에서, Y는 C1-C6알킬, C1-C6헤테로알킬, 4원, 5원, 6원 또는 7원 사이클로알킬, 및 4원, 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클로알킬로부터 선택되는 선택적으로 치환된 기이다. 일부 실시 형태에서, Y는 C1-C6알킬, C1-C6헤테로알킬, 5원 또는 6원 사이클로알킬, 및 1개 또는 2개의 N 원자를 함유하는 5원 또는 6원 헤테로사이클로알킬로부터 선택되는 선택적으로 치환된 기이다. 일부 실시 형태에서, Y는 5원 또는 6원 사이클로알킬, 또는 1개 또는 2개의 N 원자를 함유하는 5원 또는 6원 헤테로사이클로알킬이다. 일부 실시 형태에서, Y는 피롤리딘 고리이다. 일부 실시 형태에서, Y는 피페리딘 고리이다. 일부 실시 형태에서, R6 및 R8은 독립적으로 H, 비치환된 C1-C4 알킬, 치환된 C1-C4알킬, 비치환된 C1-C4헤테로알킬, 및 치환된 C1-C4헤테로알킬로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, R6 및 R8은 각각 H이다.
일부 실시 형태에서, L1은 선택적으로 치환된 알킬이다. 일부 실시 형태에서, L1은 선택적으로 치환된 헤테로알킬이다. 일부 실시 형태에서, L2는 결합이다. 일부 실시 형태에서, L2는 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이다. 일부 실시 형태에서, L2는 선택적으로 치환된 피페라진이다. 일부 실시 형태에서, L2는 선택적으로 치환된 피페리딘이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)2C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)3C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)4C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)5C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)6C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L3은 선택적으로 치환된 알킬이다. 일부 실시 형태에서, L3은 선택적으로 치환된 헤테로알킬이다.
일부 실시 형태에서, X는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 표지이다: 염료, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 항체 또는 항체 단편, 바이오재료, 나노입자, 스핀 표지, 형광단, 금속-함유 모이어티, 방사능 모이어티, 신규한 작용기, 다른 분자들과 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 상호작용하는 기, 광케이징된 모이어티, 화학 방사선 여기성 모이어티, 리간드, 광이성화성 모이어티, 비오틴, 비오틴 유사체, 중원자를 도입한 모이어티, 화학적으로 절단가능한 기, 광절단성 기, 레독스-활성제, 동위원소로 표지화된 모이어티, 생물물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자 고밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 또는 이들의 조합. 일부 실시 형태에서, X는 형광단이다. 일부 실시 형태에서, X는 비오틴이다. 일부 실시 형태에서, X는 비오틴 유사체이다.
다른 실시 형태는 하기를 포함하는 화학식 III의 TEC 패밀리 키나제 프로브이다:
[화학식 III]
Figure pct00011
(여기서,
La는 O이고;
Ar은 선택적으로 치환된 페닐이고;
Y는 선택적으로 치환된 사이클로알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이고;
Z는 C(O) 또는 NHC(O)이고;
R6 및 R8은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬로부터 선택되고;
L1은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬;
L2는 결합, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 -N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)-(여기서, m은 2 내지 6임)이고;
L3은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고;
X는
Figure pct00012
임).
일부 실시 형태에서, Z는 C(=O)이다. 일부 실시 형태에서, Z는 NHC(=O)이다. 일부 실시 형태에서, Y는 선택적으로 치환된 사이클로알킬이다. 일부 실시 형태에서, Y는 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이다. 일부 실시 형태에서, Y는 5원 또는 6원 사이클로알킬, 또는 1개 또는 2개의 N 원자를 함유하는 5원 또는 6원 헤테로사이클로알킬이다. 일부 실시 형태에서, Y는 사이클로헥실 고리이다. 일부 실시 형태에서, Y는 피롤리딘 고리이다. 일부 실시 형태에서, Y는 피페리딘 고리이다. 일부 실시 형태에서, R6 및 R8은 독립적으로 H, 비치환된 C1-C4 알킬, 치환된 C1-C4알킬, 비치환된 C1-C4헤테로알킬, 및 치환된 C1-C4헤테로알킬로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, R6 및 R8은 각각 H이다.
일부 실시 형태에서, L1은 선택적으로 치환된 알킬이다. 일부 실시 형태에서, L1은 선택적으로 치환된 헤테로알킬이다. 일부 실시 형태에서, L2는 결합이다. 일부 실시 형태에서, L2는 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이다. 일부 실시 형태에서, L2는 선택적으로 치환된 피페라진이다. 일부 실시 형태에서, L2는 선택적으로 치환된 피페리딘이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)2C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)3C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)4C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)5C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L2는 -N(H)C(O)(CH2)6C(O)N(H)-이다. 일부 실시 형태에서, L3은 선택적으로 치환된 알킬이다. 일부 실시 형태에서, L3은 선택적으로 치환된 헤테로알킬이다.
일부 실시 형태에서, 프로브는 링커를 통해 이브루티닙에 부착된 비오틴(즉, 비오티닐화 이브루티닙)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 하기로부터 선택된다:
Figure pct00013
검출 방법
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템은 표적(예를 들어, 표적 키나제)의 검출을 포함한다. 일부 경우에, 표적은 프로브-결합된 표적이다. 일부 경우에, 프로브-결합된 표적은 약물-점유 표적이다. 다른 경우에, 프로브-결합된 표적은 비점유 표적이다.
일부 실시 형태에서, 표적의 검출은 샘플을 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 표지화된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 전기화학발광 태그로 표지화된다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 트리스(바이피리딘)루테늄(II) 다이클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드이다. 일부 실시 형태에서, 표지화된 항체는 설포 태그 표지화된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 표지화된 항체는 고추냉이 퍼옥시다제 표지화된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 1차 항체로서 사용된다. 다른 실시 형태에서, 항체는 2차 항체로서 사용된다.
일부 실시 형태에서, 표적의 검출은 화학발광, 발광, 형광, 면역형광, 열량측정, 또는 전기화학발광 방법을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적의 검출은 형광 검출 기기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 여기광원(excitation light source)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 광원은 레이저, 포토다이오드, 또는 램프이다. 일부 실시 형태에서, 램프는 제논 아크 또는 수은이다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 형광단을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 필터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 필터는 특정 파장들을 분리하여 상이한 형광단들을 여기시킨다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 출력을 기록하는 검출기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 출력은 전자 신호이다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 형광 현미경이다. 일부 실시 형태에서, 형광 현미경은 국소화된 형석을 검출한다. 일부 실시 형태에서, 검출은 2개 및/또는 3개의 치수에서 일어난다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 형광 스캐너이다. 일부 실시 형태에서, 형광 스캐너는 마이크로어레이 리더(microarray reader)이다. 일부 실시 형태에서, 마이크로어레이 리더는 2개의 치수에서 국소화된 형석을 검출한다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 형광분광계이다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 마이크로플레이트 리더이다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 평균 형광을 기록한다. 일부 실시 형태에서, 형광 검출 기기는 유세포분석기(flow cytometer)이다. 일부 실시 형태에서, 유세포분석기는 샘플 집단 내의 개별 세포들의 형광을 분석한다.
일부 실시 형태에서, 표적의 검출은 마이크로플레이트 리더의 사용을 포함한다. 일부 경우에, 마이크로플레이트 리더는 엑스마크(xMark)™ 마이크로플레이트 흡광 분광광도계, 아이마크(iMark) 마이크로플레이트 흡광도 리더, 엔스파이어(EnSpire)® 다중모드 플레이트 리더, 엔비전(EnVision) 다중표지 플레이트 리더, 빅터(VICTOR) X 다중표지 플레이트 리더, 플루오로스칸 어센트 FL 마이크로플레이트 형광측정기 및 조도계(Fluoroskan Ascent FL Microplate Fluoremeter and Luminometer), 플루오로스칸 어센트 마이크로플레이트 형광측정기(Fluoroskan Ascent Microplate Fluoremeter), 루미노스칸 어센트 마이크로플레이트 조도계(Luminoskan Ascent Microplate Luminometer), 멀티스칸 EX 마이크로플레이트 광도계(Multiskan EX Microplate Photometer), 멀티스칸 FC 마이크로플레이트 광도계, 및 멀티스칸 GO 마이크로플레이트 광도계이다. 일부 경우에, 마이크로플레이트 리더는 흡광도, 형광, 발광, 시간-분해 형광, 및 광 산란을 검출한다. 일부 실시 형태에서, 마이크로플레이트 리더는 동적 광 산란을 검출한다. 대안적으로, 마이크로플레이트 리더는 정적 광 산란을 검출한다.
일부 실시 형태에서, 표적의 검출은 마이크로플레이트 이미저의 사용을 포함한다. 일부 경우에, 마이크로플레이트 이미저는 뷰럭스(ViewLux) uHTS 마이크로플레이트 이미저 및 바이오라드(BioRad) 마이크로플레이트 이미징 시스템을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 단백질 점유율을 결정하기 위한 검출 방법에서 컴퓨터-기반 시스템이 사용된다. 일부 실시 형태에서, 컴퓨터-기반 시스템은 멀티웰 플레이트 검정과 같은 디바이스 또는 기기로부터 얻어진 데이터 및 신호를 분석하는 디지털 처리 디바이스를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 단백질 점유율을 결정하기 위한 검출 방법의 수행을 위해 디지털 처리 디바이스에 의해 실행가능한 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램으로 암호화된 컴퓨터 판독가능 저장 매체가 본 명세서에 제공된다.
추가 실시 형태에서, 디지털 처리 디바이스는 디바이스의 기능을 수행하는 하나 이상의 하드웨어 중앙 처리 장치(central processing unit, CPU)를 포함한다. 더 추가의 실시 형태에서, 디지털 처리 디바이스는 실행가능한 명령어를 수행하도록 구성된 운영 체제를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 디지털 처리 디바이스는 선택적으로 컴퓨터 네트워크에 접속된다. 추가 실시 형태에서, 디지털 처리 디바이스는 월드 와이드 웹(World Wide Web)에 액세스하도록 선택적으로 인터넷에 접속된다. 더 추가의 실시 형태에서, 디지털 처리 디바이스는 선택적으로 클라우드 컴퓨팅 인프라구조(cloud computing infrastructure)에 접속된다. 다른 실시 형태에서, 디지털 처리 디바이스는 선택적으로 인트라넷에 접속된다. 다른 실시 형태에서, 디지털 처리 디바이스는 선택적으로 데이터 저장 디바이스에 접속된다.
일부 실시 형태에서, 표적 키나제의 단백질 점유율을 결정하기 위한 분석 시스템이 본 명세서에 제공되며, 본 시스템은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 프로브 및 표적 키나제를 포함하는 환자 샘플을 포함하는 프로브 ELISA 검정; (b) 단백질 점유율을 결정하기 위한 프로브-결합된 표적 키나제를 검출하기 위한 분석 기기; (c) 메모리 및 실행가능한 명령어를 수행하도록 구성된 운영 체제를 포함하는 디지털 처리 디바이스; 및 (d) (i) 표적 점유율에 대한 역치 수준의 데이터베이스; (ii) 분석 기기로부터 신호 데이터를 수신하도록 구성된 소프트웨어 모듈; (iii) 알고리즘을 신호 데이터에 적용하여 샘플에서의 표적 키나제 점유율의 수준을 확인하도록 구성된 소프트웨어 모듈을 포함하는 표적 점유율 애플리케이션을 생성하는 실행가능한 명령어를 포함하는, 디지털 처리 디바이스에 제공되는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
응용
약물 연구 및 검증
본 명세서에 개시된 검정들 및 시스템들 중 임의의 것이 약물을 연구 및 검증하는 데 유용할 수 있다. 약물을 검증하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 방법은 (a) 표적을 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시켜 프로브-결합된 표적을 형성하는 단계; (b) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재에 기초하여 약물에 의한 표적의 점유율을 결정함으로써 약물을 검증하는 단계를 포함한다.
표적의 점유율을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 제공되며, 본 방법은 a) 표적을 포함하는 샘플을 프로브와 배합하는 단계; b) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및 c) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재에 기초하여 약물에 의한 표적의 점유율을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계인 단계 (a) 전에 표적을 포획하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적은 항체에 의해 포획된다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-표적 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 고형 지지체에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 마이크로플레이트이다. 일부 실시 형태에서, 마이크로플레이트는 MSD 마이크로플레이트이다.
일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 표적을 1차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 항체, 비드, 염료, 또는 형광단을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 항-BTK 항체이다. 일부 실시 형태에서, 방법은 이 검출제를 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 2차 검출제는 항체, 비드, 염료, 또는 형광단을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 검출제는 표지화된다. 일부 실시 형태에서, 2차 검출제는 표지화된다. 일부 실시 형태에서, 표지는 전기화학발광 태그이다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 트리스(바이피리딘)루테늄(II) 다이클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드이다. 일부 실시 형태에서, 표지는 설포 태그이다.
일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 샘플을 고형 지지체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고형 지지체는 비드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비드는 스트렙타비딘 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 자성 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 표지화된 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 표지화된 스트렙타비딘 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 전기화학발광 태그로 표지화된다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 트리스(바이피리딘)루테늄(II) 다이클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 설포 태그 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는 설포 태그 스트렙타비딘 비드이다.
일부 실시 형태에서, 비드는 프로브와 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표지는 비오틴을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비드는 비오틴과 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, 비드는 프로브-결합된 표적과의 접합을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 비드는 프로브에 접합된다.
일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 프로브-결합된 표적 또는 그의 일부분을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 비드 또는 그의 일부분을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 표지화된 비드를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 전기화학발광 태그를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 트리스(바이피리딘)루테늄(II) 다이클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전기화학발광 태그는 루테늄(II) 트리스-바이피리딘, N-하이드록시석신이미드이다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 설포 태그를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 검출하는 단계는 발광을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 검출하는 단계는 전기화학발광을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 방법은 프로브-결합된 표적의 정제를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적은 비점유 표적이다. 일부 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적은 약물-점유 표적이다. 다른 실시 형태에서, 프로브-결합된 표적의 정제는 프로브-비결합된 표적으로부터의 프로브-결합된 표적의 자성 분리를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 사전처리된 샘플이며, 여기서 사전처리된 샘플은 프로브와 접촉되기 전에 약물과 접촉된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 비처리 샘플이며, 여기서 샘플은 표지와 접촉되기 전에 약물과 접촉되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 프로브는 작용제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 작용제 및 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 표지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로브는 표지 및 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 가역적 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 비가역적 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 선택적인 공유결합성 BTK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 시스테인 잔기와의 공유결합을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 시스테인 잔기는 시스테인 481이다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 LFM-A13, AVL-291, AVL-101, AVL-292, 및 ONO-WG-307을 포함하는 목록으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 이브루티닙이다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 ITK 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 BMX 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 TEC 키나제 억제제이다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 BLK 억제제이다.
일부 실시 형태에서, 작용제는 약물과 동일하다. 예를 들어, 약물 및 작용제는 둘 모두 BTK 억제제(예를 들어, 이브루티닙, AVL-292, ONO-WG-307)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 약물과 유사하다. 예를 들어, 약물은 BTK 억제제일 수 있고, 작용제는 BTK 억제제의 염 유도체일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 약물과 상이하다. 예를 들어, 약물은 이브루티닙일 수 있고, 작용제는 AVL-292일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 표적은 수용체이다. 일부 실시 형태에서, 표적은 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적은 키나제이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 BTK이다. 일부 경우에, 키나제는 ITK이다. 다른 실시 형태에서, 키나제는 BMX 또는 BLK이다. 일부 경우에, 키나제는 TEC 또는 TXK이다. 일부 실시 형태에서, 키나제는 HER1, HER2, HER3, 또는 HER4이다. 대안적으로, 키나제는 JAK3이다.
일부 실시 형태에서, 약물을 검증하는 단계는 표적에 대한 약물의 효능을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 약물에 의한 표적의 점유율을 결정하는 단계는 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 정량화하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 약물은 표적의 점유율이 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 이상일 때 유효하다.
진단학
치료 계획을 결정하기 위한 방법을 알려주면서 대상체의 치료학적 치료 및 전반적인 건강 보호 관리를 알려주기 위해 본 방법들, 검정들 및 시스템들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 일부 실시 형태는 치료 계획을 결정하기 위한 방법이며, 본 방법은 (a) 표적을 포함하는 샘플을 프로브와 배합하는 단계; (b) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재에 기초하여 치료 계획을 결정하는 단계를 포함한다.
시험제(test agent)의 효능을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) 표적을 포함하는 샘플을 프로브와 배합하는 단계; (b) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재에 기초하여 시험제의 효능을 결정하는 단계를 포함한다.
약물 응답자를 확인하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) 표적을 포함하는 샘플을 프로브와 배합하는 단계; (b) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재에 기초하여 약물 응답자를 확인하는 단계를 포함한다.
키나제 조절제를 확인하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 개시되며, 본 방법은 (a) 표적을 포함하는 샘플을 프로브와 배합하는 단계; (b) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재에 기초하여 키나제 조절제를 확인하는 단계를 포함한다.
약물 내성을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 개시되며, 본 방법은 (a) 표적을 포함하는 샘플을 프로브와 배합하는 단계; (b) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및 (c) 프로브-결합된 표적의 존재 또는 부재에 기초하여 약물 내성을 결정하는 단계를 포함한다.
샘플
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템은 표적을 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법들, 검정들, 및 시스템들 중 임의의 것에서 사용하기에 적합한 샘플에는 전혈 샘플, 말초 혈액 샘플, 림프 샘플, 조직 샘플, 종양 생검 샘플, 골수 샘플, 또는 다른 체액 샘플이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 전혈 샘플, 말초 혈액 샘플, 림프 샘플, 조직 샘플, 종양 생검 샘플, 골수 샘플, 또는 다른 체액 샘플로부터 유래된 하나 이상의 세포 유형 또는 그의 용해물을 함유하는 샘플이다. 체액의 예에는 도말(smear), 가래, 생검, 분비물, 뇌척수액, 담즙, 혈액, 림프액, 타액, 및 소변이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 샘플의 세포가, 제공된 방법에서 사용하기 전에 샘플의 다른 성분들로부터 단리된다. 일부 실시 형태에서, 샘플의 특정 세포 유형이, 제공된 방법에서 사용하기 전에 샘플의 다른 세포 유형들로부터 단리된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 혈액 샘플의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC, 예를 들어 림프구, 단핵구 및 대식세포)가, 제공된 방법에서 사용하기 전에 혈액 샘플의 다른 세포 유형들로부터 단리된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 샘플의 림프구(예를 들어, B 세포, T 세포 또는 NK 세포)가, 제공된 방법에서 사용하기 전에 샘플의 다른 세포 유형들으로부터 단리된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 샘플의 B 세포가, 제공된 방법에서 사용하기 전에 샘플의 다른 세포 유형들로부터 단리된다. 일부 실시 형태에서, 샘플의 세포가, 제공된 방법에서 사용하기 전에 용해된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 암 세포가, 제공된 방법에서 사용하기 전에 샘플의 정상 세포로부터 단리된다.
본 명세서에 개시된 샘플들 중 임의의 것은 복잡한 세포 집단들을 포함하며, 이들 집단은 집단으로서 검정되거나, 또는 하위집단들로 분리될 수 있다. 그러한 세포 및 무세포 샘플은 원심분리, 수력분급(elutriation), 밀도 구배 분리, 성분채집술(apheresis), 친화성 선택, 패닝(panning), FACS, 여과, 하이파큐(Hypaque)에 의한 원심분리 등에 의해 분리될 수 있다. 특정 세포 유형을 갖는 것으로 확인된 마커에 특이적인 항체를 사용함으로써, 비교적 균질한 세포 집단이 얻어질 수 있다. 대안적으로, 불균질한 세포 집단이 사용될 수 있다.
일단 샘플이 얻어지면, 이는 직접 사용되거나, 냉동된 상태로 사용되거나, 또는 단기간 동안 적절한 배양 배지 중에 유지될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위하여 하나 이상의 세포들을 단리하는 방법은 본 기술분야에서 잘 확립된 표준 기술 및 프로토콜에 따라 수행된다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 대상체로부터 얻어진다. 그러한 대상체는 인간 또는 가축, 예컨대 소, 닭, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 또는 염소일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 사용되는 세포는 환자로부터 채취된다. 동물, 예를 들어 인간으로부터 유래된 샘플에는, 예를 들어 전혈, 땀, 눈물, 타액, 귀 유출물(ear flow), 가래, 림프, 골수 현탁액, 림프, 소변, 타액, 정액, 질 유출물, 뇌척수액, 뇌액, 복수, 젖, 기도, 장관 또는 비뇨생식관 액의 분비물, 조직 또는 기관(예를 들어, 폐) 또는 기관으로부터 제거된 조직, 예컨대 가슴, 폐, 장, 피부, 경부(cervix), 전립선, 췌장, 심장, 간 및 위의 세척액(lavage)이 포함될 수 있다.
혈액 샘플을 얻기 위하여, 본 기술분야에서 알려진 임의의 기술이 사용될 수 있는데, 예를 들어 시린지 또는 다른 진공 흡인 디바이스이다. 샘플은 농축(enrichment) 전에 선택적으로 사전처리되거나 또는 처리(process)될 수 있다. 사전처리 단계의 예에는 안정제, 방부제, 고정제, 용해 시약, 희석제, 약물, 항-아폽토시스 시약, 항응고 시약, 항혈전 시약, 자기 특성(magnetic property) 조절 시약, 완충 시약, 삼투압 조절 시약, pH 조절 시약, 및/또는 가교결합 시약과 같은 시약의 첨가가 포함된다. 예를 들어, 혈액 샘플이 얻어질 때, 방부제, 예컨대 항응고제 및/또는 안정제가 농축 전에 샘플에 첨가될 수 있다.
샘플, 예컨대 혈액 샘플은, 샘플이 얻어진 시간으로부터 1주, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일, 12시간, 6시간, 3시간, 2시간, 또는 1시간 이내에 본 명세서에 개시된 방법들, 검정들 및 시스템들 중 임의의 것 하에서 분석될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 샘플 중의 하나 이상의 세포들 또는 성분들을 선택적으로 용해시키는 효소 또는 화합물과 배합될 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플 중에서, 혈소판 및/또는 제핵(enucleated) 적혈구를 선택적으로 용해시켜 유핵 세포들이 농축된 샘플을 생성한다. 이어서, 관심 대상의 세포들이 본 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 샘플로부터 분리될 수 있다.
대상체로부터 샘플(예를 들어, 혈액 샘플)을 얻을 때, 양은 대상체 크기 및 스크리닝되는 질환에 따라 변할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 최대 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 mL의 샘플이 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 1 내지 50, 2 내지 40, 3 내지 30, 또는 4 내지 20 mL의 샘플이 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mL 초과의 샘플이 얻어진다.
질병 및 적응증
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 샘플들 중 임의의 것은 질병 또는 적응증을 앓고 있는 대상체로부터 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 샘플들 중 임의의 것은 TEC 패밀리 키나제에 의해 매개된 질병 또는 적응증을 앓고 있는 대상체로부터 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 자가면역 질병, 염증성 장애, 또는 증식성 질병, 예컨대 암을 앓고 있는 대상체로부터의 것이다. 일부 실시 형태에서, 암은 고형 종양이다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 암을 앓고 있는 대상체로부터의 것이다. 암에는 육종, 암종, 및 혈액암이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 혈액암은 백혈병, 림프종, 또는 골수종이다.
일부 실시 형태에서, 암은 육종이다. 육종은 골, 연골, 지방, 근육, 혈관, 또는 다른 결합 또는 지지 조직의 암이다. 육종에는 골암, 섬유육종, 연골육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 악성 혈관내피종, 악성 슈반세포종, 양측성 전정 슈반세포종, 골육종, 연조직 육종(예를 들어, 포상 연부 육종, 혈관육종, 엽상 낭육종, 피부섬유육종, 인대양 종양, 상피양 육종, 골외성 골육종, 섬유육종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 림프육종, 악성 섬유성 조직구종, 신경섬유육종, 횡문근육종, 및 활막 육종)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 암은 암종이다. 암종은 상피 세포에서 시작되는 암이며, 이때 상피 세포는 신체의 표면을 덮고 호르몬을 생산하고 선(gland)을 만들어내는 세포이다. 비제한적인 예로서, 암종에는 유방암, 췌장암, 폐암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 신장암, 방광암, 위암, 전립선암, 간암, 난소암, 뇌암, 질암, 외음부암, 자궁암, 구강암, 음경암, 정소암, 식도암, 피부암, 난관암, 두경부암, 위장관 기질 암, 선암종, 피부 또는 안구내 흑색종, 항문 부위 암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 요도암, 신우암, 요관암, 자궁내막암, 경부암, 뇌하수체암, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 뇌간 교종, 및 척수축(spinal axis) 종양이 포함된다. 일부 경우에, 암은 피부암, 예컨대 기저 세포 암종, 편평세포암, 흑색종, 비흑색종, 또는 광선(일광) 각화증이다. 일부 실시 형태에서, 암은 췌장암, 결장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 갑상선암, 방광암, 또는 근위 또는 원위 담관 암종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 유방암이다.
일부 경우에, 암은 폐암이다. 폐암은, 폐(기관지) 또는 폐의 작은 기낭(폐포)을 공급하도록 기관으로부터 갈라져 나온 기도에서 시작할 수 있다. 폐암에는 비소세포 폐 암종(non-small cell lung carcinoma, NSCLC), 소세포 폐 암종, 및 중피종이 포함된다. NSCLC의 예에는 편평 세포 암종, 선암종, 및 대세포 암종이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 중피종은 폐 및 가슴 공동의 내층(흉막) 또는 복부의 내층(복막)의 암성 종양이다. 일부 경우에, 암은 뇌암, 예컨대 교아세포종이다.
일부 실시 형태에서, 암은 중추 신경계(CNS) 종양이다. CNS 종양은 교종 또는 비-교종으로 분류될 수 있다. 일부 경우에, 교종은 악성 교종, 고등급 교종, 미만성 내인성 교뇌 교종이다. 교종의 예에는 성상세포종, 핍지교종(또는 핍지교종과 성상세포종 요소들의 혼합), 및 뇌실막종이 포함된다. 성상세포종에는 저등급 성상세포종, 역형성 성상세포종, 교아세포종 홍반, 털모양 성상세포종, 다형 황색성상세포종, 및 뇌실막하 거대 세포 성상세포종이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 핍지교종에는 저등급 핍지교종(또는 핍지교성상세포종) 및 역형성 핍지교종이 포함된다. 비-교종에는 수막종, 뇌하수체 선종, 원발성 CNS 림프종, 및 수아세포종이 포함된다. 일부 경우에, 암은 수막종이다.
일부 경우에, 암은 백혈병이다. 일부 경우에, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 전구체 B-세포 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 전골수성 백혈병(APL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML) 또는 급성 단핵구성 백혈병(AMoL)이다. 백혈병의 추가 유형에는 모발상 세포 백혈병, 만성 골수단핵구성 백혈병, 및 소아 골수단핵구성-백혈병이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 경우에, 암은 림프종이다. 일부 경우에, 림프종은 호지킨 림프종이다. 다른 경우에, 림프종은 비호지킨 림프종(NHL)이다. 일부 실시 형태에서, 림프종은 B-세포 NHL이다. B-세포 NHL의 비제한적인 목록에는 하기가 포함된다: 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)(예를 들어, 지방병성 버킷 림프종 및 산발성 버킷 림프종), 피부 B-세포 림프종, 피부 번연대 림프종(MZL), 미만성 대세포 림프종(DLBCL), 미만성 혼합성 대소세포 림프종, 미만성 소분할 세포, 미만성 소림프구성 림프종, 절외성 번연대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 여포성 소분할 세포(등급 1), 여포성 혼합성 소분할 및 대세포(등급 2), 여포성 대세포(등급 3), 혈관내 대 B-세포 림프종, 혈관내 림프종증, 대세포 면역아구성 림프종, 대세포 림프종(LCL), 림프아구성 림프종, MALT 림프종, 외투 세포 림프종(MCL), 면역아구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, 외투 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), 절외성 번연대 B-세포 림프종-점막-관련 림프양 조직(MALT) 림프종, 종격 대 B-세포 림프종, 결절성 번연대 B-세포 림프종, 비장성 번연대 B-세포 림프종, 원발성 종격 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, 전구체 B-세포 림프아구성 림프종, 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종, 및 AIDS-관련 림프종. 추가의 비호지킨 림프종이 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되며, 이러한 림프종은 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 명백하다.
일부 실시 형태에서, 암은 T 세포 림프종이다. 일부 실시 형태에서, T 세포 림프종은 절외성 T 세포 림프종, 피부 T 세포 림프종(CTCL), 말초성 T-세포 림프종(PTCL), 세자리 증후군(
Figure pct00014
), 균상 식육종(mycosis fungoides), 역형성 대세포 림프종, 또는 혈관면역아구성 T 세포 림프종이다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 자가면역 질병, 예를 들어 염증성 장 질병, 관절염, 루푸스, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 스틸병(Still's disease), 소아 관절염, 당뇨병, 중증 근무력증, 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 오드 갑상선염(Ord's thyroiditis), 그레이브병(Graves' disease), 쇼그렌 증후군(
Figure pct00015
), 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군(Guillain-
Figure pct00016
syndrome), 급성 파종성 뇌척수염, 애디슨병(Addison's disease), 안간대성-근간대성 증후군(opsoclonus-myoclonus syndrome), 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군, 무형성 빈혈, 자가면역 간염, 복강 질병, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 특발성 혈소판감소성 자반병, 시신경염, 피부경화증, 원발성 담즙성 간경병증, 레이터 증후군(Reiter's syndrome), 타카야수 동맥염(Takayasu's arteritis), 측두 동맥염, 온난 자가면역 용혈성 빈혈, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 건선, 전신 탈모증, 베체트병(
Figure pct00017
), 만성 피로, 자율신경기능이상, 자궁내막증, 간질성 방광염, 신경근긴장증, 피부경화증, 또는 외음부통(vulvodynia)을 앓고 있다.
다른 실시 형태에서, 대상체는 이종면역 질환 또는 질병, 예를 들어 이식편 대 숙주 질병, 이식, 수혈, 아나필락시스, 알러지, I형 과민증, 알러지성 결막염, 알러지성 비염, 또는 아토피성 피부염을 앓고 있다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 염증성 질병, 예를 들어 천식, 충수염, 안건염, 세기관지염, 기관지염, 활액낭염, 자궁경부염, 담관염, 담낭염, 결장염, 결막염, 방광염, 누선염, 피부염, 피부근염, 뇌염, 심내막염, 자궁내막염, 장염, 소장결장염, 상과염, 부고환염, 근막염, 섬유염, 위염, 위장염, 간염, 화농성 한선염, 후두염, 유방염, 수막염, 골수염, 심근염, 근염, 신장염, 난소염, 고환염, 골염, 이염, 췌장염, 이하선염, 심막염, 복막염, 인두염, 흉막염, 정맥염, 간질성 폐렴, 폐렴, 직장염, 전립선염, 신우신염, 비염, 이관염, 동염, 구내염, 활막염, 건염, 편도염, 포도막염, 질염, 혈관염, 또는 외음염을 갖는다.
추가 실시 형태에서, 대상체는 혈전색전성 장애, 예를 들어 심근 경색, 협심증, 혈관성형술 후 재폐색, 혈관성형술 후 재협착, 대동맥관상동맥 우회술 후 재폐색, 대동맥관상동맥 우회술 후 재협착, 뇌졸증, 일과성 허혈증, 말초 동맥 폐색성 장애, 폐색전증, 또는 심부 정맥 혈전증을 앓고 있다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 질병 또는 질환을 치료하기 위하여 하나 이상의 치료제를 투여받거나 또는 투여받아 왔다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 질병 또는 질환을 치료하기 위하여 BTK 억제제를 투여받거나 또는 투여받아 왔다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 질병 또는 질환을 치료하기 위하여 BTK 억제제에 더하여 하나 이상의 치료제를 투여받거나 또는 투여받아 왔다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 암을 치료하기 위하여 하나 이상의 화학치료제를 투여받거나 또는 투여받아 왔다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 암을 치료하기 위하여 BTK 억제제를 투여받거나 또는 투여받아 왔다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 암을 치료하기 위하여 BTK 억제제에 더하여 하나 이상의 화학치료제를 투여받거나 또는 투여받아 왔다. 일부 실시 형태에서, BTK 억제제는 이브루티닙이다.
방법, 검정, 및 시스템의 추가의 특징
본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템의 추가의 특징이 본 명세서에 개시되다. 본 명세서에 개시된 방법, 검정 및 시스템의 효능은 현재의 단백질 점유율 방법, 검정 및 시스템(예를 들어, 겔-기반 검정)에 대략적으로 비견된다. 일부 실시 형태에서, 방법, 검정 및 시스템의 효능은 현재의 단백질 점유율 방법보다 더 우수하다. 일부 경우에, 방법, 검정 및 시스템은 현재의 단백질 점유율 방법과 비교할 때 개선된 특이성을 제공한다. 예를 들어, 검정은, 프로브로 표지화된 음성 대조군 주르카트 용해물에 대한 신호가, 시험된 모든 용해물 농도에 대해 백그라운드 수준이었을 때, 우수한 특이성을 제공한다. 일부 경우에, 특이성은 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 이상이다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템은 개선된 감도를 제공한다. 일부 경우에, 개선된 감도는 필요한 샘플의 양으로부터 결정될 수 있다. 일부 경우에, 방법, 검정, 및 시스템은 현재의 방법보다 적어도 약 2배 더 적은 용해물, 적어도 약 3배 더 적은 용해물, 적어도 약 4배 더 적은 용해물, 적어도 약 5배 더 적은 용해물, 적어도 약 6배 더 적은 용해물, 적어도 약 7배 더 적은 용해물, 적어도 약 8배 더 적은 용해물, 적어도 약 9배 더 적은 용해물, 또는 적어도 약 10배 더 적은 용해물의 사용을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, 현재의 방법보다 약 2 내지 10배 더 적은 용해물, 약 3 내지 7배 더 적은 용해물, 약 3 내지 6배 더 적은 용해물이 사용된다. 예를 들어, 검정의 개선된 감도는 웨스턴 블롯/ELISA보다 3 내지 5배 더 적은 용해물의 사용을 가능하게 하고 귀중한 샘플을 절약할 수 있게 한다.
본 명세서에 개시된 방법, 검정 및 시스템은 간결하다. 본 명세서에 개시된 방법, 검정 및 시스템은 현재의 방법(예를 들어, 웨스턴 블롯)보다 더 신속하다. 본 명세서에 개시된 방법, 검정 및 시스템은 약 10시간 미만, 약 8시간 미만, 약 7시간 미만, 약 6시간 미만, 약 5시간 미만, 약 4시간 미만 이내인 것으로 고려될 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 방법, 검정 및 시스템은 약 2 내지 7시간 미만, 약 3 내지 6시간 미만, 약 3 내지 5시간 미만 이내인 것으로 고려될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법, 검정 및 시스템은 또한 증가된 처리량을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 처리량은 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 또는 약 60% 이상 증가된다.
본 명세서에 개시된 방법, 검정 및 시스템은 또한 더 균일한 시험 조건을 제공한다. 예를 들어, 단일 겔 상에서보다 플레이트-기반 검정 상에서 더 많은 샘플이 실시될 수 있다. 따라서, 단일 플레이트 상의 샘플은 다수의 겔 상의 샘플보다 균일한 시험 조건을 가질 것이다. 더욱이, 다수의 플레이트-기반 검정의 균일성은 다수의 겔의 균일성보다 더 크다. 일부 경우에, 시험 조건의 균일성은 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 적어도 약 90% 이상이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템은 현재의 방법(예를 들어, 겔-기반 포맷)보다 더 적은 프로브의 사용을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, 현재의 방법(예를 들어, 겔-기반 포맷)보다 적어도 약 10x, 20x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x 더 적은 프로브가 사용된다. 예를 들어, 검정은 겔-기반 포맷보다 40x 더 적은 프로브를 필요로 하며, 그럼으로써 시약에 대한 절약을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템은 대신호 범위(large signal window)를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 대신호 범위는 9 ㎍/웰의 용해물에 대하여 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1, 1000:1을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템은 우수한 재현성을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 재현성은 대략적으로 약 10% CV 미만, 약 8% CV 미만, 약 6% CV 미만, 약 5% CV 미만, 약 4% CV 미만, 약 3% CV 미만이다. 바람직하게는, 재현성은 약 4 내지 6% CV 미만이다.
본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템을 최적화하기 위한 기술 및 제안에는 섹터에서의 플레이트의 이미징, 섹터의 1회 활성화, 및 샘플, 검출 항체 및 판독 완충 용액 내에의 기포 도입의 회피가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템을 최적화하는 추가의 방법은 암소(dark)에 검출 항체 스톡을 유지하는 것을 포함한다. 그러나, 작업 용액은 광으로부터 차폐될 필요가 없다. 더욱이, 25 μL 정도로 작은 부피를 첨가할 때에는, 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 검정, 및 시스템은 블로킹(blocking), 샘플 인큐베이션, 검출 항체 인큐베이션 동안 플레이트를 진탕(shaking)하는 것을 포함한다. 최적화를 위하여, 장기간 동안 세척 완충제 또는 판독 완충제 중에 검정물을 있는 채로 두지 않는다. 그러나, 추가 시간이 필요하다면, 샘플 또는 검출 항체 중에 있는 채로 둔다. 바람직하게는, 폴리프로필렌 플레이트 및 튜브가 샘플 취급에 사용된다. 바람직하게는, 샘플을 취급하는 데 있어 폴리스티렌은 피해야 한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 프로브와 접촉되기 전에 와동(vortex) 및/또는 원심분리될 수 있다. 샘플의 와동 및/또는 원심분리는 샘플 중의 임의의 잔해(debris)의 제거를 보장할 수 있다. 일부 경우에, 플레이트는 4℃에서 하룻밤 블로킹될 수 있다. 일부 경우에, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 블로킹될 수 있다. 하룻밤 블로킹된다면, 검정을 진행하기 전에 플레이트가 실온으로 평형을 이루게 할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 검정 및 시스템은 부분적 플레이트(partial plate)의 사용을 포함한다. 일부 경우에, 부분적 플레이트에 대한 사용설명서가 제공될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 방법, 검정 및 시스템은, 플레이트 패키지를 개봉하기 전에, 플레이트가 실온으로 평형을 이루게 할 수 있는 것을 포함한다. SI2400 MSD 섹터 이미저의 경우, MSD 플레이트는 24개의 섹터로 분할된다(2 x 2 = 4 웰/섹터 - 도 20 참조). 섹터들은 1회 활성화될 수 있으며, 그와 같이 부분적 플레이트를 사용할 때, 샘플은 섹터들에 할당되어야 한다. 일부 경우에, 모든 시약에 대한 부피는 사용되는 플레이트의 부분에 기초하여 조정된다. 일부 경우에, 미사용 섹터는 플레이트 시일로 커버되고 검정 과정 동안 건조 상태로 유지되어야 한다. 일부 경우에, 플레이트 시일은 플레이트를 판독하기 전에 제거되어야 한다.
실시예
실시예 1. 항-단백질 항체 코팅된 플레이트와 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 검정 포맷의 비교
이 연구의 목적은 기존의 겔-기반 BTK 점유율 검정을 플레이트-기반 전기화학발광 검정으로 변환시켜 검정 처리량을 증가시키는 것이었다. 이 검정의 목적은 공유결합성 억제제(이브루티닙) - 이하, "약물" 또는 이브루티닙으로 지칭됨 - 에 의해 결합되지 않은 BTK의 상대량을 결정하는 것이다. 이 약물은 BTK의 활성 부위에 결합하고 시스테인 잔기와의 이황화물 결합을 형성한다. 화합물 I-5 - 이하, "프로브"로 지칭됨 - 는 장쇄 링커를 통해 비오틴에 연결된 이브루티닙으로 이루어진다. 겔-기반 검정에서, 프로브는 형광 리포터로 표지화된다. 프로브에 의해 표지화된 샘플의 표지화는 약물에 의해 점유되지 않은 BTK의 검출을 가능하게 한다. 2개의 잠재적인 검정 포맷이 도 11에 도시되어 있다.
실험 1
이 연구에서는, 검정 포맷들을 감도, 특이성, 범위에 대해, 그리고 가장 적합한 항 BTK 항체를 결정하기 위해 시험하였다.
샘플
양성 대조군: DOHH2 세포 용해물의 분취물(1 mg/mL)을 1 μM 이브루티닙으로 억제하고, 이어서 프로브(1 μM)로 표지화하였다.
음성 대조군들: 비처리 DOHH2 및 주르카트 세포 용해물(1 mg/mL)을 프로브(1 μM) 및 비처리 DOHH2 세포 용해물로 표지화하였다.
사용된 재료:
표준 스트렙타비딘 플레이트(5-팩) 카탈로그 번호 L15SA-2; 판독 완충제 T(50 mL) 카탈로그 번호 R92TC-3, 설포 태그 염소 항-마우스(50 ㎍) 카탈로그 번호 R32AC-5; 설포 태그 염소 항-토끼(50 ㎍) 카탈로그 번호 R32AB-5; 설포 태그 스트렙타비딘(50 ug) 카탈로그 번호 R32AD-5; MSD 표준 플레이트 카탈로그 번호 L15XA-3; MSD 블로커 A 카탈로그 번호 R93AA-2; 프로테아제 억제제 칵테일(예를 들어, 써모/피어스(Thermo/Pierce) 홀트(Halt)™ 프로테아제 억제제 칵테일 EDTA 프리(free) 카탈로그 번호 87785 또는 로슈 컴플리트 미니(Roche Complete Mini) 프로테아제 억제제 정제, 카탈로그 번호 1836170); BTK 발현 세포주로부터의 양성 대조군 용해물(DOHH2); 음성 대조군 용해물(주르카트); 이브루티닙(PCI); 프로브 화합물 I-5(비오티닐화 프로브)
BTK 항체:
하기의 항체들을 시험하였다:
Figure pct00018
용액:
블로킹 용액: 1x 트리스(Tris) 세척 완충제 중 3% (w/v) MSD 블로커 A: 3 g의 블로커 A + 100 mL의 1x 트리스 세척 완충제. 4℃에서 최대 14일 동안 저장한다. 블로킹 용액은 또한 PBS-T 중에서 제조될 수 있다.
세척 완충제: 1x MSD 트리스 세척 완충제: 50 mL의 10x 트리스 세척 완충제 + 450 mL의 H2O(150 mM NaCl 50 mM 트리스-HCl pH 7.5 0.02% 트윈(Tween)-20). PBS-T가 또한 세척 완충제로서 사용될 수 있다.
포획 항체 희석 완충제: Ca2+ 및 Mg2+를 함유하지 않는 PBS
검출 항체 희석 완충제: 1x 트리스 세척 완충제 중 1% MSD 블로커 A: 10 mL의 블로킹 용액 + 20 mL의 1x 트리스 세척 완충제 또는 10 mL의 블로킹 용액 + 20 mL의 PBS-T
판독 완충제: 1x MSD 판독 완충제 T: 플레이트당 5 mL의 4x 판독 완충제 T + 15 mL의 H2O; 2x MSD 판독 완충제 T: 플레이트당 10 mL의 4x 판독 완충제 T + 10 mL의 H2O
세포 용해물: PBS + 프로테아제 억제제 중에 재현탁된 세포 펠릿의 반복된 냉동-해동에 의해 용해물을 제조하였다. PCI와 프로브 표지화 반응을 PBS-T + 1% BSA(검정 완충제) 중에서 수행하였다. 용해물을 검정 완충제 + 프로테아제 억제제 중에서 희석시켰다.
포맷 1: 스트렙타비딘 검출
도 11a는 스트렙타비딘 검출 검정(예를 들어, 검정 포맷 1)의 개략도이다. 간략히 말하면, 이 방법은 표적(예를 들어, BTK 키나제)을 포함하는 약물-처리된 샘플을 항-BTK 항체 코팅된 플레이트와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서는 BTK 키나제가 항-BTK 항체에 의해 포획된다. 항-BTK 항체에 의해 포획된 BTK 키나제는 약물-점유 BTK 키나제 및 비점유 BTK 키나제를 포함한다. 포획된 BTK 키나제를 프로브와 접촉시킨다. 프로브는 비점유 BTK 키나제에 결합하는 작용제를 포함한다. 이 예에서, 프로브는 약물-점유 BTK 키나제에 결합할 수 없다. 프로브는 비점유 BTK 키나제에 결합하여 프로브-결합된 BTK 키나제를 찾아낸다. 이 예에서, 프로브는 표지를 포함하며, 이는 프로브-결합된 BTK 키나제의 검출을 가능하게 한다. 프로브-결합된 BTK 키나제를 표지화된 비드(예를 들어, 설포 태그 스트렙타비딘)의 첨가에 의해 검출한다. 프로브-결합된 키나제의 양을 전기화학발광에 의해 정량화한다. 프로브-결합된 키나제의 정량화는 BTK 키나제의 점유율 및 약물의 효능의 결정을 가능하게 한다. 더 상세한 프로토콜이 본 명세서에 개시된다.
프로토콜 - 검정 포맷 1
1. MSD 표준 플레이트를 (PBS 중에 2 ㎍/mL로 희석된) 항-BTK 포획 항체 용액 30 μL/웰로 코팅한다. 항체 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한 후, 플레이트를 두드려서 각각의 웰의 바닥을 가로질러 용액이 골고루 분포되도록 보장한다. 플레이트 접착 시일로 밀봉하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이팅한다. 플레이트를 진탕하지 않는다.
2. 플레이트를 두드리고 150 μL/웰의 블로킹 용액(3% [w/v] 블로커 A)을 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1시간 이상 진탕하면서 인큐베이팅한다.
3. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 1x 세척한다. 두드려서 건조시킨다(tap dry).
4. 플레이트 레이아웃에 따라 30 μL의 용해물을 첨가한다. 용해물 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1시간 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
5. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
6. 플레이트 레이아웃에 따라 1% (w/v) 블로커 A 중에 0.5 ㎍/mL로 희석된 설포 태그 스트렙타비딘을 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 30 내지 60분 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
7. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 1x 트리스 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
8. (H2O 중에 희석된) 1x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅(reverse pipetting)을 사용한다. SI2400에서 플레이트를 판독한다.
플레이트 레이아웃 및 결과가 도 12에 나타나 있다.
양성 대조군(DOHH2 + 프로브)의 신호는, 시험된 3개의 모든 포획 항체에 대하여 용해물 농도에 의해 적정된다(titrate). BD611116 및 BD611117 항-BTK 포획 항체들을 사용하여 최고 신호들을 얻었다. BD611116과 BD611117 항-BTK 포획 항체들은 비견되었다.
최대 신호: BD61116 항-BTK 포획 항체를 사용하여 1 ㎍/μL 양성 대조군 용해물에 의해, 125:1의 양성 대조군(DOHH2 + 프로브)에 대한 백그라운드 비를 얻었다.
시험된 DOHH2(프로브 없음) 용해물의 모든 농도들에 대해 백그라운드가 낮았는데, 이는 용해물 단백질에 대한 설포 태그 스트렙타비딘의 비특이적 결합이 없음을 나타낸다.
양성 대조군(DOHH2 + 프로브) 용해물 신호들은, BD 611116(도 13a 참조) 및 BD611117(도 13b 참조) 항-BTK 포획 항체들을 사용할 때는 음성 대조군들(DOHH2 + PCI + 프로브) 및 (주르카트 + 프로브)와 구별될 수 있지만, 포획 항체로서 시그마 항-BTK를 사용할 때는 그렇지 않은데, 이는 시그마 항-BTK가 프로브에 의해 표지화된 세포 용해물 중의 다른 단백질들과 결합될 수 있음을 시사한다. 양성 대조군:음성 대조군의 특이성 비가 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
Figure pct00019
후속 실험에서는 시그마 항-BTK 항체를 사용하지 않았다.
포맷 2: 스트렙타비딘 포획
도 11b 및 도 14a는 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 검정(예를 들어, 검정 포맷 2)의 개략도를 도시한다. 간략히 말하면, 이 방법은 MSD 표준 스트렙타비딘 플레이트를 프로브로 블로킹하는 단계 또는 프로브-결합된 플레이트를 제공하는 단계를 포함한다. 이 예에서, 프로브는 표지 및 작용제를 포함하며, 여기서 표지(예를 들어, 비오틴)는 스트렙타비딘에 의해 포획되며, 그럼으로써 프로브를 플레이트에 부착시킨다. 표적(예를 들어, BTK)을 포함하는 샘플을 플레이트에 적용시킨다. 표적은 작용제(예를 들어, BTK 억제제와 같은 약물)를 통해 프로브에 결합되거나 또는 그것에 부착되어서 프로브-결합된 화합물을 형성한다. 프로브-결합된 표적은 1차 검출제, 예컨대 항-표적(예를 들어, 항-BTK) 항체에 의해 검출될 수 있다. 1차 검출 시약은 표지화되고, 이어서 직접 검출될 수 있다. 도 11b에 도시된 바와 같이, 1차 검출 시약은 설포 태그에 접합되어서 표지화된 1차 검출 시약을 형성한다. 그러나, 도 14a에 도시된 바와 같이, 1차 검출 시약은 비표지화될 수 있다. 이 방법은 도 14a에 도시된 바와 같이 2차 검출제(예를 들어, 항-종(anti-species) 항체)의 첨가를 추가로 포함할 수 있다. 2차 검출제는 표지화되고(예를 들어, 설포 태그 항-종 항체), 이어서 검출될 수 있다. 설포-표지화된 검출제는 전기화학발광에 의해 검출될 수 있으며, 이는 프로브-결합된 키나제의 정량화를 가능하게 한다. 프로브-결합된 키나제의 정량화는 BTK 키나제의 점유율 및 약물의 효능의 결정을 가능하게 한다. 더 상세한 프로토콜이 본 명세서에 개시된다.
프로토콜 - 검정 포맷 2
1. 150 μL/웰 블로킹 용액(3% [w/v] 블로커 A)을 MSD 표준 스트렙타비딘 플레이트에 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1시간 이상 진탕하면서 인큐베이팅거나 또는 4℃에서 하룻밤 블로킹한다.
2. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 1x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
3. 플레이트 레이아웃에 따라 30 μL의 용해물을 첨가한다. 용해물 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1시간 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
4. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
5. 플레이트 레이아웃에 따라 1% (w/v) 블로커 A 중에 0.5 ㎍/mL로 희석된 항-BTK 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 진탕한다.
6. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다. 플레이트 레이아웃에 따라 1% (w/v) 블로커 A 중에 1 ㎍/mL로 희석된 설포 태그 접합된 항-종 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
7. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 1x 트리스 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
8. (H2O 중에 희석된) 1x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅을 사용한다. SI2400에서 플레이트를 판독한다.
결과
플레이트 레이아웃 및 결과가 도 14b 및 도 14c에 나타나 있다.
양성 대조군(DOHH2 + 프로브)의 신호는, 검출 항체로서 BD611116 및 BD611117 항-BTK를 사용할 때, 용해물 농도가 62 ㎍/mL 용해물에 이르렀을 때 적정되며, 이후에 훅 효과(hook effect)가 있는데, 이는 가능하게는 스트렙타비딘 표면에 대해 프로브-표지화된 BTK와 경쟁하는 과량의 프로브의 존재로 인한 것일 수 있다. 훅은 샘플 중의 최종 프로브 농도가 62 nM 초과일 때 일어난다.
최대 신호: BD61116 항-BTK 검출 항체를 사용하여 0.06 ㎍/μL 양성 대조군 용해물에 의해, 240:1의 양성 대조군(DOHH2 + 프로브)에 대한 백그라운드 비를 얻었다.
검출 항체로서 BD611116 및 BD611117 항-BTK를 사용했을 때, 시험된 DOHH2(프로브 없음) 용해물의 모든 농도들에 대해 백그라운드가 낮았는데, 이는 용해물 단백질에 대한 이들 항체의 비특이적 결합이 없음을 나타낸다. 대조적으로, 시그마 항-BTK 항체는 시험된 모든 조건에 대해 높은 백그라운드 신호를 생성하였다.
양성 대조군(DOHH2 + 프로브) 용해물 신호들은, BD 611116(도 15a 참조) 및 BD611117(도 15b 참조) 항-BTK 검출 항체들을 사용할 때는 음성 대조군들(DOHH2 + PCI + 프로브) 및 (주르카트 + 프로브)와 구별될 수 있지만, 검출 항체로서 시그마 항-BTK를 사용할 때는 그렇지 않은데, 이는 시그마 항-BTK가 프로브에 의해 표지화된 세포 용해물 중의 다른 단백질들과 결합될 수 있음을 시사한다. 양성 대조군:음성 대조군의 특이성 비가 표 2에 나타나 있다.
[표 2]
Figure pct00020
후속 실험에서는 시그마 항-BTK 항체를 사용하지 않았다.
음성 대조군들에 대한 신호들은 1 μM 프로브 단독의 웰들로부터의 신호들에 비견된다.
BD611116과 BD611117 항-BTK 검출 항체들은 비견되었다.
도 16은 검정 포맷 1(스트렙타비딘-검출 방법) 및 검정 포맷 2(스트렙타비딘-포획 방법)의 비교를 도시한다. 도 16에 도시된 바와 같이, 검정 포맷 2는 검정 포맷보다 더 우수한 감도 및 더 우수한 특이성을 제공한다.
실험 2 - 프로브 농도의 최적화
추가의 최적화를 위해 검정 포맷 2(예를 들어, 스트렙타비딘-코팅된 플레이트, 스트렙타비딘-포획 방법 - 도 14a 참조)를 사용하였다. 훅 효과가 62 nM 초과의 프로브 농도 및 62 ㎍/mL 초과의 용해물 농도에서 관찰되었기 때문에, 체커판 실험을 수행하여, 훅 효과가 과량의 프로브 또는 과량의 단백질 농도에 연관되는지를 결정하였다. 일단 플레이트의 결합 능력에 도달하면 스트렙타비딘 표면에 결합하기 위하여, 과량의 비접합된 프로브가 BTK-결합된 프로브와 경쟁할 수 있다.
목적:
필요한 최적 프로브 농도를 결정한다.
상이한 프로브: 용해물 비들을 비교한다.
샘플
양성 대조군: 검정 완충제 중에 1 mg/mL로 DOHH2 용해물을 제조한다.
음성 대조군: DOHH2 용해물의 1 mg/mL의 분취물을 1 μM PCI로 처리하여 과량의 PCI를 갖도록 하여 BTK가 PCI에 의해 최대로 결합되게 한다.
DOHH2 단독 및 DOHH2 + PCI 용해물을 검정 완충제 중에 100; 50; 25; 12.5; 6.25 및 3.12 ㎍/mL로 희석시킨다.
프로브를 10000; 2500; 625; 156; 39; 9 및 2 nM(100x 농도)로 희석시킨다.
1 μL의 100x 프로브를 96웰 폴리프로필렌 플레이트 내에서 100 μL의 희석된 용해물에 첨가하고, 인큐베이팅한다.
프로토콜
1. 실온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 MSD 표준 스트렙타비딘 플레이트를 150 μL/웰의 3% 블로커 A로 블로킹한다.
2. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 1x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
3. 플레이트 레이아웃에 따라 50 μL의 용해물을 첨가한다. 용해물 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1시간 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
4. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
5. 1% (w/v) 블로커 A 중에 0.5 ㎍/mL로 희석된 BD611117 항-BTK 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 진탕한다.
6. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
7. 1% (w/v) 블로커 A 중에 1 ㎍/mL로 희석된 설포 태그 접합된 항-마우스 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
8. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 1x 트리스 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
9. (H2O 중에 희석된) 2x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅을 사용한다. SI2400에서 플레이트를 판독한다.
결과:
최적화 실험에 대한 결과가 도 17에 나타나 있다.
음성 대조군(DOHH2 + 1 μM PCI) 샘플의 경우 최대 25 nM 프로브까지 백그라운드가 낮다.
25 nM 프로브 초과에서, 백그라운드가 증가한다. 이러한 현상에 대해 한 가지 가능한 설명은, 겔-기반 검정에서 보여지는 바와 같은 높은 프로브 농도에서의 프로브로 또한 표지화된 용해물 중의 다른 단백질들로부터의 신호 기여 및/또는 프로브 단독으로부터의 신호 기여이다.
양성 대조군(비처리 DOHH2)의 경우, 최대 25 nM까지 프로브 농도가 증가함에 따라 신호가 증가하며, 25 nM 초과에서는 신호가 감소하거나 평탄역을 형성하는데(plateau), 이때는 프로브가 과량으로 존재한다.
25 nM의 최종 프로브 농도가 권장된다.
실험 3: 약물 적정에 의한 억제
목적: PCI의 일련의 적정으로 억제 실험을 수행하고, 이어서 25 nM 프로브의 최종 프로브 농도로 용해물을 표지화한다.
샘플:
양성 대조군: 검정 완충제 중 1 mg/mL의 DOHH2 용해물.
음성 대조군: 검정 완충제 중 1 mg/mL의 주르카트 용해물.
용해물을 검정 완충제 중에 300; 150 및 75 ㎍/mL로 희석시킨다.
PCI의 일련의 희석물을 제조한다. 100x PCI 농도는 100; 25; 6.25; 1.56; 0.39; 0.09 및 0.02 μM이다.
DOHH2 용해물을 폴리프로필렌 플레이트 내에서 PCI로 처리한다(예를 들어, 100 μL의 용해물 + 1 μL의 100x PCI 용액).
PCI 억제 후에, 프로브를 25 nM의 최종 농도로 모든 샘플에 첨가하고(2 μL의 1.25 μM 프로브 스톡 + 100 μL의 샘플), 진탕하면서 인큐베이팅한다.
프로토콜:
1. 실온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 MSD 표준 스트렙타비딘 플레이트를 150 μL/웰의 3% 블로커 A로 블로킹한다.
2. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 1x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
3. 플레이트 레이아웃에 따라 30 μL의 용해물을 첨가한다. 용해물 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
4. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
5. 1% (w/v) 블로커 A 중에 0.5 ㎍/mL로 희석된 BD611117 항-BTK 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 진탕한다.
6. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다. 1% (w/v) 블로커 A 중에 1 ㎍/mL로 희석된 설포 태그 접합된 항-마우스 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
7. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 1x 트리스 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
8. (H2O 중에 희석된) 1x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅을 사용한다. SI2400에서 플레이트를 판독한다.
결과:
결과가 도 18 및 도 19에 나타나 있다.
프로브로 표지화된 음성 대조군 주르카트 용해물의 신호는, 시험된 모든 조건에 대해 백그라운드 수준으로 유지되었다.
PCI의 일련의 적정으로 처리되고 25 nM 프로브로 표지화된 양성 대조군 DOHH2 용해물에 대해 신호에서의 용량 의존성 감소가 관찰되었다.
PCI 억제 프로파일은 시험된 DOHH2 용해물의 3개의 모든 농도(300, 150 및 75 ㎍/mL)에 비견되었으며, 참조 겔-기반 검정에 비견되었다.
이 검정은 시험된 모든 용해물 농도에서 대신호 범위를 제공한다:
[표 3]
Figure pct00021
검정 재현성은 평균 %CV < 5%로 매우 우수하였다. 이 검정은 높은 특이성(음성 대조군들과의 우수한 구별), 감도(웨스턴 블롯(Western blot) 방법과 비교하여 더 적은 용해물의 사용(0.6 ㎍ 대 50 ㎍)) 및 효능(겔-기반 포맷보다 더 적은 프로브를 필요로 함(25 nM 대 2.5 μM))을 가능하게 하였다.
실시예 2. 단백질 점유율 검정 프로토콜
대안적인 단백질 점유율 검정 프로토콜을 제공한다.
1. 프로브를 25 nM의 최종 농도로 검정 완충제 중의 샘플에 첨가하고(2 μL의 1.25 μM 프로브 스톡 + 100 μL의 샘플), 진탕하면서 인큐베이팅한다.
2. 실온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 MSD 표준 스트렙타비딘 플레이트를 150 μL/웰의 3% 블로커 A로 블로킹한다.
3. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 1x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
4. 30 μL/웰의 용해물을 첨가한다. 용해물 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
5. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
6. 1% (w/v) 블로커 A 중에 0.5 ㎍/mL로 희석된 BD611117 또는 BD611116 항-BTK 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 진탕한다.
7. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다. 1% (w/v) 블로커 A 중에 1 ㎍/mL로 희석된 설포 태그 접합된 항-마우스 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
8. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 1x 트리스 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
9. (H2O 중에 희석된) 1x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅을 사용한다. SI2400에서 플레이트를 판독한다.
필요하다면, 다음의 파라미터들이 추가로 최적화될 수 있다(예를 들어, 항-BTK 검출 항체의 농도, MSD 설포 태그 항-마우스 2차 검출 항체의 농도, 또는 단일 인큐베이션 단계에서 항-BTK 검출 항체와 MSD 설포 태그 항-마우스 2차 검출 항체의 배합).
실시예 3. 항-단백질 항체 코팅된 플레이트와 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 검정 포맷에서의 선택된 비오티닐화 프로브들의 비교
항-단백질 항체 코팅된 플레이트 또는 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 검정 포맷을 사용하여, 선택된 비오티닐화 프로브들을 표적 점유율 검정에서의 사용에 대해 시험하였다. 하기의 프로브들을 시험하였다:
화합물 I-1, MW = 808.01 (총량 80 mg)
화합물 I-2, MW = 793.38 (총량 60 mg)
화합물 I-3, MW = 780.98 (총량 32 mg)
화합물 I-4, MW = 766.95 (총량 27 mg)
화합물 I-5, MW = 1097.37 (총량 24 mg)
시험된 프로브들의 구조가 도 21에 나타나 있다.
이들 프로브의 스톡 용액(5 mM 및 10 mM)을 하기와 같이 제조하였다. 화합물 I-1, I-2, I-3, 및 I-4: 500 μl의 DMSO 중 2 또는 4 mg의 프로브, 및 화합물 I-5: 2.2 ml의 DMSO 중 12 또는 24 mg, 100 μl의 분취물들. 검정을 위하여, 50x 프로브를 검정 당일 새로 제조하였다: 39 μl의 PBS에 대해 1 μl의 5 mM 프로브.
하기의 시약을 검정을 위해 사용하였다: BTK 항체: 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences) 611117; 2차 항체: 염소 항-마우스-HRP, 산타 크루즈(Santa Cruz), SC-2302; 스트렙타비딘-HRP, 써모(Thermo), 카탈로그 번호 21130, 0.5 ml, 1-스텝 울트라 TMB-ELISA 기질(1-step Ultra TMB-ELISA Substrate), 써모, 카탈로그 번호 34028, 250 ml; 정지 용액: 0.16 M H2SO4, 써모, 카탈로그 번호 N600, 55 ml; 스트렙타비딘 코팅된 플레이트: 써모, 카탈로그 번호 15500, 5 플레이트; DOHH2 대조군 용해물; 세척 완충제: 0.05% PBST; 1% BSA.
하기의 프로토콜에 따라 표준 곡선을 수행하였다:
1) 1 μl의 50x 프로브를 50 μl의 용해물(1 ug/μl)에 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅한다.
2) 스트렙타비딘 코팅된 플레이트를 1시간 동안 실온에서 1% BSA로 블로킹하고, PBST(3x)로 세척한다.
3) 샘플을 10분 동안 얼음 상에 옮겨둠으로써 반응을 정지시키고, 이어서 다시 실온이 되게 한다.
4) 프로브 표지화된 DOHH2 용해물을 1% BSA를 사용하여 500 μl의 부피에 대해 1 ug, 0.5 ㎍, 0.25 ug, 125 ng, 62.5 ng, 31.25 ng, 15.6 ng/μl의 순서로 일련의 희석물을 제조한다.
5) 100 μl의 프로브 처리된 용해물을 3회 반복하여 각각의 웰에 첨가한다.
6) 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
7) PBST(7x)로 세척한다.
8) 2차 Ab-HRP를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
9) 200 μl의 PBST(5x)로 세척한다.
10) 100 μl의 TMB를 첨가하고, 15분 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
11) 50 μl의 정지 용액을 첨가한다.
12) 450 nm에서 판독한다.
프로토콜 포맷 1: (스트렙타비딘 코팅된 플레이트)
1) 용해물을 500 μl의 최종 부피가 될 때까지 PBS를 사용하여 원하는 농도로 희석시킨다.
2) 비오티닐화 프로브(최종 농도 2.5 μM)를 1시간 동안 37℃에서 용해물에 첨가한다.
3) 스트렙타비딘 플레이트를 1시간 동안 실온에서 1% BSA로 블로킹하고, PBST(3x)로 세척한다.
4) 샘플을 10분 동안 얼음 상에 옮겨둠으로써 반응을 정지시키고, 이어서 다시 실온이 되게 한다.
5) 100 ul의 처리된 용해물을 2시간 동안 실온에서 흔들면서 스트렙타비딘 플레이트에 (3회 반복하여) 첨가한다.
6) 200 μl의 PBST(5x)로 세척한다.
7) 100 μl의 2차 Ab-HRP를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
8) 200 μl의 PBST(3x)로 세척한다.
9) 100 μl의 TMB를 첨가하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
10) 50 μl의 정지 용액을 첨가한다.
11) 450 nm에서 판독한다.
프로토콜 포맷 2: (BTK 항체 코팅된 플레이트)
1) 96웰 플레이트를 4℃에서 하룻밤 100 μl의 항-BTK(1:1000 PBS)로 코팅한다.
2) 플레이트를 PBST(5x)로 세척한다.
3) 플레이트를 실온에서 1시간 동안 흔들면서 블로킹하고, PBST(3x)로 세척한다.
4) 용해물을 500 μl의 최종 부피가 될 때까지 PBS를 사용하여 원하는 농도로 희석시킨다.
5) 비오티닐화 프로브(최종 농도 2.5 μM)를 1시간 동안 37℃에서 용해물에 첨가한다.
6) 샘플을 10분 동안 얼음 상에 옮겨둠으로써 반응을 정지시키고, 이어서 다시 실온이 되게 한다.
7) 100 μl의 처리된 용해물을 2시간 동안 실온에서 흔들면서 스트렙타비딘 플레이트에 (3회 반복하여) 첨가한다.
8) 200 μl의 PBST(5x)로 세척한다.
9) 스트렙타비딘-HRP를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 흔들면서 인큐베이팅한다.
10) 200 μl의 PBST(3x)로 세척한다.
11) 100 μl의 TMB를 첨가하고, 15분 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
12) 50 μl의 정지 용액을 첨가한다.
13) 450 nm에서 판독한다.
결과:
다양한 프로브들을 비교하는 점유율 검정으로부터의 예시적인 결과가, 스트렙타비딘 검정을 위한 높은 프로브 농도 및 낮은 프로브 농도에 대해 도 22에 나타나 있다. 이 데이터는 화합물 I-5가 이 검정에서 시험된 프로브들 중에서 BTK에 결합하는 데 최고 신호를 나타냄을 입증하였다.
실시예 4. 화합물 I-5와 부모 화합물 이브루티닙의 키나제 억제제 활성의 비교
화합물 I-5가 TEC 패밀리 키나제 및 상동 티로신 키나제를 억제하는 능력을 나노신(Nanosyn)에 의해 수행되는 표준 키나제 억제 검정을 사용하여 시험관내에서 검정하였다. 하기의 키나제들을 하기 표 4에 따라 검정하였다:
[표 4]
Figure pct00022
10 mM 또는 1 mM의 최대 농도로 12 pt(3x-희석물들) 용량 반응 포맷을 사용하여 화합물들을 1회 시험하였다.
결과가 표 5에 제공되어 있다. 이 데이터는 화합물 I-5 프로브가 TEC 패밀리 키나제 억제에 있어서 부모 화합물 이브루티닙과 유사한 IC50 프로파일을 나타내었음을 입증한다.
[표 5]
Figure pct00023
실시예 5. 총 BLK 단백질 검정의 개발
이 연구의 목적은, BLK에 대한 항체를 스크리닝하여, MSD 플랫폼 상에서 임상 샘플 중의 총 BLK를 정량화하기 위한 샌드위치 면역검정을 개발하는 방법을 입증하는 것이었다.
사용된 재료: 하기를 함유하는 MSD ELISA 컨버전 팩 I(MSD ELISA Conversion pack I)(카탈로그 번호 K15A01-1): 96웰 고결합 플레이트, 96웰 표준 플레이트, 설포-태그(SULFO-TAG)™ NHS 에스테르, 150 nmol, 4개의 스핀 컬럼, 설포-태그 표지화된 스트렙타비딘, 50 ㎍, 설포-태그 표지화된 항-마우스 항체, 50 ㎍, 설포-태그 표지화된 항-토끼 항체, 50 ㎍, 블로커 A 키트, 1 L, 블로커 B, 2 g, 판독 완충제 T(4X), 200 mL.
하기의 BLK 항체들을 시험하였다:
[표 6]
Figure pct00024
용액:
블로킹 용액: 1x PBS 중 3% (w/v) MSD 블로커 A: 3 g의 블로커 A + 100 mL의 PBS. 4℃에서 최대 14일 동안 저장한다.
세척 완충제: PBS-T(PBS + 0.05% 트윈-20)
포획 항체 희석 완충제: Ca2+ 및 Mg2+를 함유하지 않는 PBS
포획 항체: 포획 항체 희석 완충제 중 각각의 항체의 4 ㎍/ml 용액 1 ml를 제조한다.
검출 항체 희석 완충제: 1x PBS 중 1% MSD 블로커 A: 10 mL의 블로킹 용액 + 20 mL 1x PBS
검출 항체: 1x PBS 중의 1% MSD 블로커 A 중 각각의 항체의 2 ㎍/ml 용액 1 내지 2 ml를 제조한다.
설포-태그 표지화된 2차 항체: 1x PBS 중의 1% MSD 블로커 A 중 항-마우스 및 항-토끼 설포-태그 항체 각각의 1 ㎍/ml의 용액 3 ml를 제조한다.
판독 완충제: 1x MSD 판독 완충제 T: 플레이트당 5 mL의 4x 판독 완충제 T + 15 mL의 H2O 믹스, 전도(inversion)에 의하며 와동시키지 않는다.
표준물: 1% 블로커 A 중 재조합 BLK의 10 ㎍/ml 스톡 용액을 제조한다. 이어서, 표준 곡선을 위한 하기의 희석물들을 제조한다. 각각의 희석에 대해 새로운 팁을 사용한다. 각각의 희석 후에 잘 와동시킨다.
방법:
실험 1
목적: 항체들을 스크리닝하여 추가의 검정 개발에 적합한 항체 쌍을 확인한다.
프로토콜:
1. MSD 고결합 플레이트 및 표준 플레이트 각각 하나를 플레이트 레이아웃(단계 1)에 따라 25 μl/웰의 포획 항체 용액(4 ㎍/ml)으로 용액 코팅한다. 항체 용액을 웰의 모서리에 첨가하고, 플레이트를 약하게 두드려서 액체를 골고루 분산시키고, 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 하룻밤 진탕 없이 인큐베이팅한다.
2. 다음날 플레이트를 두드리고, 150 μL/웰의 블로킹 용액(3% [w/v] 블로커 A)을 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1시간 이상 진탕하면서 인큐베이팅한다.
3. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 PBS-T로 1x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
4. 플레이트 레이아웃(단계 2)에 따라 희석된 25 μL의 재조합 단백질을 첨가한다. 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1 내지 2시간 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
5. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 PBS-T로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
6. 플레이트 레이아웃(단계 3)에 따라 25 μL의 검출 항체 용액을 첨가한다. 항체 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1시간 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
7. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 PBS-T로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
8. 플레이트 레이아웃 단계 3에 따라 검출 항체 희석제 중에 1 ㎍/mL로 희석된 25 μL의 설포-태그 항-종 검출 항체를 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 30분 동안 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
9. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 PBS-T로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다
10. (H2O 중에 희석된) 1x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅을 사용한다. SI2400에서 즉각적으로 플레이트를 판독한다.
결과:
상이한 항체 쌍들에 대한 원시 신호들이 도 23에 나타나 있다. 상이한 항체 쌍들에 대한 신호 대 백그라운드(S/B)가 도 24에 나타나 있으며, 최고 S/B 비가 H00000640-M02에 대해 관찰되었다. 단백질 농도에 의한 신호 및 S/B의 양호한 적정이, BLK에 대해서 4개의 항체 쌍들에 대해 관찰되었다. 최고 S/B 비를 갖는 항체 쌍(포획 항체로서의 AF2679와 검출 항체로서의 H00000640-MO2) 및 배향을 총 BLK 검정의 추가의 최적화를 위해 선택하였다. 동일한 항체 쌍들의 경우, 더 높은 S/B 비가 표준 플레이트 상에서 관찰되었다.
실험 2
목적:
1) 포획 항체로서 AF2679를, 그리고 검출 항체로서 H00000640-M02를 사용하여 BLK 검정을 위한 검정 조건을 개발한다.
2) BLK 발현에 대해 양성(DOHH2) 및 음성(주르카트) 세포 용해물을 시험한다.
항체들을 제조업체 사용설명서(메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery))에 따라 설포-태그™ NHS 에스테르에 접합시켰다.
프로토콜:
1. MSD 표준 플레이트를 플레이트 레이아웃에 따라 25 μl/웰의 포획 항체 용액(4 ㎍/ml)으로 용액 코팅한다. 항체 용액을 웰의 모서리에 첨가하고, 플레이트를 약하게 두드려서 액체를 골고루 분산시키고, 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 하룻밤 진탕 없이 인큐베이팅한다.
2. 다음날 플레이트를 두드리고, 150 μL/웰의 블로킹 용액(5% [w/v] 블로커 A)을 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1시간 이상 진탕하면서 인큐베이팅한다.
3. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 PBS-T로 1x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
4. 플레이트 레이아웃에 따라 희석된 25 μL의 재조합 단백질을 첨가한다. 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1 내지 2시간 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
5. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 PBS-T로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
6. 플레이트 레이아웃에 따라 25 μL의 검출 항체 용액을 첨가한다. 항체 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 1시간 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
7. 플레이트를 150 μL/웰 이상의 PBS-T로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
8. (H2O 중에 희석된) 1x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 플레이트 2에 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅을 사용한다. SI2400에서 즉각적으로 플레이트를 판독한다.
9. 플레이트 레이아웃에 따라 검출 항체 희석제 중에 1 ㎍/mL로 희석된 설포-태그 항-종 검출 항체 25 μL를 플레이트 1에 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 30분 동안 300 내지 500 rpm으로 플레이트를 진탕한다.
10. 플레이트 1을 150 μL/웰 이상의 PBS-T로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
11. (H2O 중에 희석된) 1x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅을 사용한다. SI2400에서 즉각적으로 플레이트를 판독한다.
결과:
이 검정에 대한 원시 신호들이 도 25에 나타나 있다. 이 검정에 대한 신호 대 백그라운드(S/B)가 도 26에 나타나 있다. BLK 검정은 단백질 농도에 의한 신호 적정을 입증하였다. 1 ㎍/ml의 포획 항체 및 0.5 ㎍/ml의 검출 항체를 사용했을 때의 재조합 BLK 단백질에 대한 신호 값들이 도 27에 도시되어 있다. 세포 용해물 중의 BLK에 대한 양성 대 음성 비가 하기 표에 나타나 있다:
[표 7]
Figure pct00025
1 ㎍/ml의 포획 항체(AF2679, 알 앤 디)와 0.5 ㎍/ml의 검출 항체(H00000640-MO2, 노부스 바이올로지칼스)를 사용하는 BLK 검정에 대해 최대 46배의 신호 범위가 관찰되었다. 검정의 동적 범위는 약 3.5 로그인 것으로 나타난다. 부분 최적화된 조건을 사용하여 세포 용해물 중에서 BLK에 대해 약 2배의 P/N 비가 관찰되었다.
실시예 6: ITK 및 BLK 단백질 점유율 검정
이 연구의 목적은 MSD 스트렙타비딘 플레이트 상에서의 ITK 및 BLK 점유율 검정에 필요한 프로브를 최적화하는 것과 용해물의 약물 처리를 사용하여 검정 성능을 입증하는 것이었다. 이 검정의 목적은 공유결합성 억제제 - 이하, "약물"로 지칭됨 - 에 의해 결합되지 않은 ITK 및 BLK의 상대량을 결정하는 것이다. "프로브"는 장쇄 링커를 통해 비오틴에 연결된 약물로 이루어진다. 프로브에 의한 샘플의 표지화는 약물에 의해 점유되지 않은 ITK 및 BLK의 검출을 가능하게 한다. 앞서 BTK와 함께 성공적으로 사용되었던 검정 포맷은 스트렙타비딘 플레이트 상에 프로브 표지화된 단백질을 포획하고, 항-단백질 항체를 사용하여 검출하는 것이다. ITK 및 BLK 점유율 검정에 대해서도 유사한 포맷을 시험하였다.
재료:
표준 스트렙타비딘 플레이트(5-팩) 카탈로그 번호 L15SA-2, 판독 완충제 T(50 mL) 카탈로그 번호 R92TC-3, 설포-태그 염소 항-마우스(50 ㎍) 카탈로그 번호 R32AC-5, 설포-태그 염소 항-토끼(50 ㎍) 카탈로그 번호 R32AB-5, 설포-태그 스트렙타비딘(50 ug) 카탈로그 번호 R32AD-5, MSD 블로커 A 카탈로그 번호 R93AA-2, 프로테아제 억제제 칵테일(예를 들어, 써모/피어스 홀트™ 프로테아제 억제제 칵테일 EDTA 프리 카탈로그 번호 87785 또는 로슈 컴플리트 미니 프로테아제 억제제 정제, 카탈로그 번호 1836170), ITK 및 BLK 발현 세포주로부터의 양성 대조군 용해물(DOHH2 및 주르카트), 음성 대조군 용해물(THP-1 세포), BLK, ITK 억제제 약물 이브루티닙 "PCI"; 비오티닐화 프로브 화합물 I-5 "프로브".
용액:
블로킹 용액: 1x 트리스 세척 완충제 중 3% (w/v) MSD 블로커 A: 3 g의 블로커 A + 100 mL의 1x 트리스 세척 완충제. 4℃에서 최대 14일 동안 저장한다. 블로킹 용액은 또한 PBS-T 중에서 제조될 수 있다.
세척 완충제: 1x MSD 트리스 세척 완충제: 50 mL의 10x 트리스 세척 완충제 + 450 mL의 H2O(150 mM NaCl 50 mM 트리스-HCl pH 7.5 0.02% 트윈-20). PBS-T가 또한 세척 완충제로서 사용될 수 있다.
검출 항체 희석 완충제: 1x 트리스 세척 완충제 중 1% MSD 블로커 A: 10 mL의 블로킹 용액 + 20 mL의 1x 트리스 세척 완충제 또는 10 mL의 블로킹 용액 + 20 mL의 PBS-T
판독 완충제: 1x MSD 판독 완충제 T: 플레이트당 5 mL의 4x 판독 완충제 T + 15 mL의 H2O
세포 용해물: PBS + 프로테아제 억제제 중에 재현탁된 세포 펠릿의 반복된 냉동-해동에 의해 제조된 용해물.
검정 완충제: 트리스 세척 완충제 중 1% 블로커 + 프로테아제 억제제
실험 1 - 프로브 농도의 최적화
목적: 필요한 최적 프로브 농도를 결정하고, 상이한 프로브: 용해물 비들을 비교한다.
샘플:
양성 대조군: DOHH2 및 주르카트 세포 용해물
음성 대조군: 1 uM PCI로 처리된 DOHH2 및 주르카트 세포
DOHH2 단독 및 DOHH2 + PCI 용해물을 검정 완충제 중에 600; 300; 150; 75; 37.5; 18.75 ug/mL로 희석시킨다.
프로브를 6000; 1500; 375; 93.8; 23.4; 5.9 및 1.5 nM(50x 농도)로 희석시킨다.
1 μL의 100x 프로브를 96웰 폴리프로필렌 플레이트 내에서 50 μL의 희석된 용해물에 첨가하고, 인큐베이팅한다.
프로토콜:
1) MSD 플레이트를 실온에서 1 내지 3시간 동안 900 rpm으로 진탕하면서 150 μl의 3% 블로커 A로 블로킹한다.
2) 별도의 96웰 폴리프로필렌 플레이트 내에서 50 ul 부피의 프로브로 적정된 단백질 용해물의 적정물을 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이팅한다.
3) MSD 플레이트를 세척 완충제로 2X 세척한다.
4) 플레이트 레이아웃에 따라 30 ul의 프로브 용해물 믹스를 MSD 플레이트에 옮기고 1시간 동안 인큐베이팅한다.
5) 플레이트를 150 ul의 세척 완충제로 3X 세척한다.
6) 1% 블로커 A 중에 2 ug/ml로 희석된 25 ul의 항-BLK 또는 항-ITK 항체를 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 900 rpm으로 진탕하면서 인큐베이팅한다.
7) 플레이트를 150 μl의 세척 완충제로 3X 세척한다.
8) 1% 블로커 A 중에 1 ug/ml로 희석된 25 ul의 설포-태그 표지화된 항-토끼 항체를 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 900 rpm으로 진탕하면서 인큐베이팅한다.
9) 플레이트를 MSD 세척 완충제로 3X 세척하고, 150 μl의 1X 판독 완충제를 첨가하고, 섹터 이미저에서 즉각적으로 판독한다.
결과:
BLK 및 ITK 프로브 검정에 대한 결과가 도 28에 제공되어 있다. BTK 및 ITK 검정 둘 모두에 사용된 용해물 중의 단백질 농도에 의해 신호가 적정되는 것으로 관찰되었다. 신호는, 양성 대조군 용해물의 경우, 프로브 농도가 증가함에 따라 증가하고, 약 30 nM 넘어서는 평탄역을 형성한다. 백그라운드 신호는 음성 대조군(세포 용해물 + 약물) 샘플의 경우에 낮으며, 120 nM 프로브에서 아주 거의 증가하지 않는다. 50 nM의 프로브 농도가 추가의 실험에 대해 권장되었다.
실험 2: 일련의 약물 적정에 의한 억제
목적: 약물의 일련의 적정으로 억제 실험을 수행하고, 이어서 50 nM 프로브로 용해물을 표지화한다.
샘플:
양성 대조군: 검정 완충제 중 1 mg/mL의 DOHH2 및 주르카트 용해물.
음성 대조군: 검정 완충제 중 1 mg/mL의 THP-1 용해물.
용해물을 검정 완충제 중에 500; 250 및 125 ㎍/mL로 희석시킨다.
PCI의 일련의 희석물을 제조한다. 100x PCI 농도는 100; 25; 6.25; 1.56; 0.39; 0.09 μM이며; 용해물을 1시간 동안 폴리프로필렌 플레이트 내에서 PCI로 처리하고(예를 들어, 100 μL의 용해물 + 1 μL의 100x PCI 용액); PCI 억제 후에, 프로브를 50 nM의 최종 농도로 모든 샘플에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅한다.
프로토콜:
1) 실온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 MSD 표준 스트렙타비딘 플레이트를 150 μL/웰의 3% 블로커 A로 블로킹한다.
2) 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 1x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
3) 플레이트 레이아웃에 따라 30 μL의 프로브 표지화된 용해물을 첨가한다. 용해물 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
4) 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
5) 1% (w/v) 블로커 A 중에 2 ㎍/mL로 희석된 항-ITK 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 2시간 동안 900 rpm으로 진탕하면서 인큐베이팅한다.
6) 1% (w/v) 블로커 A 중에 2 ㎍/mL로 희석된 설포-태그 접합된 항-종 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
7) 플레이트를 150 μL/웰 이상의 1x 트리스 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
8) (H2O 중에 희석된) 1x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅을 사용한다. SI2400에서 플레이트를 판독한다.
결과:
ITK 프로브 검정에 대한 결과가 도 29 및 하기 표 8에 제공되어 있다. 음성 대조군 세포주인 DOHH2의 신호는 약물의 모든 농도에서 백그라운드 수준으로 관찰되었다. 약물 처리된 양성 대조군인 주르카트 세포 용해물은 약물 농도의 증가에 따른 신호의 감소를 입증하였다. %억제율은 사용된 용해물 농도와 무관하였다. 검정 재현성은 평균 %CV < 5%로 매우 우수하였다.
[표 8]
Figure pct00026
실험 3: PBMC 용해물 중의 ITK의 억제의 반복
목적: 약물의 일련의 적정으로 억제 실험을 수행하고, 이어서 50 nM 프로브로 용해물을 표지화한다.
샘플:
양성 대조군: 검정 완충제 중 1 mg/mL의 DOHH2, 주르카트 및 PBMC 용해물.
음성 대조군: 검정 완충제 중 1 mg/mL의 THP-1 용해물.
용해물을 검정 완충제 중에 500; 250 및 125 ㎍/mL로 희석시킨다.
PCI의 일련의 희석물을 제조한다. 100x PCI 농도는 100; 25; 6.25; 1.56; 0.39; 0.09 μM이며; 용해물을 1시간 동안 폴리프로필렌 플레이트 내에서 PCI로 처리하고(예를 들어, 100 μL의 용해물 + 1 μL의 100x PCI 용액); PCI 억제 후에, 프로브를 50 nM의 최종 농도로 모든 샘플에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅한다.
프로토콜:
1) 실온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 MSD 표준 스트렙타비딘 플레이트를 150 μL/웰의 3% 블로커 A로 블로킹한다.
2) 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 1x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
3) 플레이트 레이아웃에 따라 30 μL의 프로브 표지화된 용해물을 첨가한다. 용해물 용액을 웰의 바닥 모서리에 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
4) 플레이트를 150 μL/웰 이상의 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
5) 1% (w/v) 블로커 A 중에 2 ㎍/mL로 희석된 항-ITK 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고, 실온에서 2시간 동안 900 rpm으로 진탕하면서 인큐베이팅한다.
6) 플레이트를 150 μl 세척 완충제로 3X 세척한다.
7) 1% (w/v) 블로커 A 중에 2 ㎍/mL로 희석된 설포-태그 접합된 항-종 항체를 25 μL/웰로 첨가한다. 밀봉하고 실온에서 1시간 플레이트를 진탕한다.
8) 플레이트를 150 μL/웰 이상의 1x 트리스 세척 완충제로 3x 세척한다. 두드려서 건조시킨다.
9) (H2O 중에 희석된) 1x 판독 완충제 T를 150 μL/웰로 첨가한다. 기포를 피한다 - 판독 완충제를 첨가할 때 역피페팅을 사용한다. SI2400에서 플레이트를 판독한다.
결과:
ITK 프로브 검정에 대한 결과가 도 30 및 하기 표 9에 제공되어 있다. ITK의 신호의 용량 의존성 감소가 PBMC 용해물에 대해 관찰되었는데, 이는 PBMC 용해물에서의 약물에 의한 ITK의 억제를 나타낸다. ITK 검정의 재현성은 %CV < 5%로 역시 매우 우수하였다.
[표 9]
Figure pct00027
실시예 7: ITK 단백질 점유율 검정
전기화학적 자극에 기초한 ELISA 설포-태그 ITK 프로브 검정을 사용하여, 이브루티닙에 의해 결합되지 않은 ITK의 상대량을 결정할 것이다. 이브루티닙은 ITK의 활성 부위에 결합하고, 시스테인 잔기와의 이황화물 결합(ITK-Cys442)을 형성한다. 화합물 I-5는 장쇄 링커를 통해 비오틴에 연결된 이브루티닙으로 이루어진 프로브이다. 수집된 단백질 용해물을 화합물 I-5로 표지화한다. 프로브에 의한 샘플의 표지화는 약물에 의해 점유되지 않은 ITK의 검출을 가능하게 한다. ITK와 접합된 프로브(및 비접합된 프로브)를 스트렙타비딘(SA) 플레이트에 의해 포획하며, 이어서 이를 마우스 항-ITK(BD#550503) 및 설포-태그 접합된 항-마우스 항체(MSD, 카탈로그 번호 R32AC-5)와 함께 인큐베이팅한다. 설포-태그 표지는 각각의 웰 내의 전극들에서 개시된 전기화학적 자극시에 광을 방출하고, 신호가 측정된다. 더 큰 신호는 샘플의 더 많은 비점유 ITK 부위에 상응하며, 반면 더 낮은 신호는 더 많은 이브루티닙 점유 ITK 부위에 상응한다.
투약 전 사이클 1 일수 1(pre-dose Cycle 1 Day 1) 샘플에서 ITK 점유율에 대한 기준선을 설정하였으며, 미리 정해진 시점들에서의 ITK 점유율의 %를 기준선 값에 의해 계산하였다. 이 백분율을 약력학적 산출(pharmacodynamic output)로서 사용하였으며, 환자들의 상이한 용량 코호트(cohort)들 사이를 비교하였다. 따라서, 이브루티닙 용량 코호트와 ITK 점유율 사이의 관계를 규정하였다.
이브루티닙의 II상 임상 시험 중인 CLL 환자에서의 ITK 점유율을 결정하였다. 이브루티닙을 투여받기 직전에, 그리고 8일간의 일일 경구 투여(420 mg/day) 후에 샘플을 시험하였다. PBMC를 수집하고, 4회의 냉동-해동에 의해 용해시켰다. 최종 해동 후, 세포를 4℃에서 10분 동안 16,000 g로 원심분리하여 불용성 물질을 펠릿화하였다. 프로테아제 억제제를 단백질 용해물에 첨가하였으며, 단백질 용해물을 실온에서 1시간 동안 약물의 비오티닐화 유도체인 화합물 I-5로 표지화하고, 블로킹 용액으로 1시간 동안 블로킹된 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(MSD, 카탈로그 번호 L15SA-2)에 첨가한다. 1시간의 인큐베이션 후에, 이들 플레이트를 3x 세척하였으며, 이어서 마우스 항-ITK(BD#550503)를 추가 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이들 플레이트를 3x 세척하였으며, 설포-태그 접합된 항-마우스 항체(MSD, 카탈로그 번호 R32AC-5)와 함께 1시간 동안 인큐베이팅하고, 세척하고, 제조업체의 사용설명서에 따라 3분 동안 SI2400 상에서 판독하였다. 데이터는 ITK의 40 내지 80%가 이브루티닙에 의해 공유적으로 결합된다는 것을 밝혀내었는데, 이는 시험관내에서 달성된 것과 유사하다.

Claims (32)

  1. TEC 패밀리 키나제 억제제 요법을 받은 환자에서 약물 표적 점유율(drug target occupancy)을 결정하기 위한 키트로서, 하기를 포함하는 화학식 II의 구조를 갖고 TEC 패밀리 키나제에 결합하는 프로브를 포함하는 키트:
    [화학식 II]
    Figure pct00028

    (여기서,
    La는 CH2, O, NH 또는 S이고;
    Ar은 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
    Y는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
    Z는 C(O), OC(O), NHC(O), C(S), S(O)n, OS(O)n, NHS(O)n(여기서, n은 1 또는 2임)이고;
    R6 및 R8은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬로부터 선택되고;
    L1은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고;
    L2는 결합, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 -N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)(여기서, m은 2 내지 6임)이고;
    L3은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고; X는 검출가능한 표지임).
  2. 제1항에 있어서, X는
    Figure pct00029
    인 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로브는
    Figure pct00030
    의 구조를 갖는 키트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 브루톤의 티로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase, BTK), ITK, TEC, BMX, TXK 또는 BLK에 결합하는 키트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 플레이트, 마이크로플레이트, 비드 또는 복수의 비드들로부터 선택되는 하나 이상의 고형 지지체를 추가로 포함하는 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 고형 지지체는 포획제(capture agent)로 코팅되어서 코팅된 고형 지지체를 형성하며, 여기서 상기 포획제는 상기 프로브에 결합하는 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 포획제는 스트렙타비딘 또는 항체인 키트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 검출제, 및 선택적으로, 상기 1차 검출제에 결합하는 2차 검출제를 추가로 포함하는 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 1차 검출제 또는 2차 검출제는 항체, 비드, 염료, 표지, 태그, 형광단(fluorophore), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 1차 검출제는 항-BTK 항체, 항-ITK 항체, 항-TEC 항체, 항-TXK 항체, 항-BMX 항체, 또는 항-BLK 항체인 키트.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 또는 2차 검출제는 전기화학발광 태그에 접합되는 키트.
  12. TEC 패밀리 키나제 억제제 요법을 받은 환자에서 약물 표적 점유율을 결정하기 위한 방법으로서,
    (a) TEC 패밀리 키나제를 포함하는 샘플을 프로브와 접촉시켜 프로브-결합된 키나제를 형성하는 단계 - 여기서, 상기 샘플은 비가역적 TEC 패밀리 키나제 억제제의 적어도 1회의 용량을 투여한 후의 환자로부터 얻어짐 -;
    (b) 샘플 중의 프로브-결합된 키나제의 양을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 샘플 중에서 검출된 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 상기 TEC 패밀리 키나제의 표적 점유율을 결정하는 단계를 포함하며,
    여기서 상기 프로브는 하기를 포함하는 화학식 II의 구조를 갖는 방법:
    [화학식 II]
    Figure pct00031

    (여기서,
    La는 CH2, O, NH 또는 S이고;
    Ar은 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
    Y는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
    Z는 C(O), OC(O), NHC(O), C(S), S(O)n, OS(O)n, NHS(O)n(여기서, n은 1 또는 2임)이고;
    R6 및 R8은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬로부터 선택되고;
    L1은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고;
    L2는 결합, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 또는 -N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)(여기서, m은 2 내지 6임)이고;
    L3은 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이고;
    X는 검출가능한 표지임).
  13. 제12항에 있어서, X는
    Figure pct00032
    인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프로브는
    Figure pct00033
    의 구조를 갖는 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 점유율을 결정하는 단계는 i) 상기 샘플 중에서 검출된 프로브-결합된 키나제의 양에 기초하여 상기 TEC 패밀리 키나제 억제제에 결합되지 않은 결합 부위의 수를 결정하는 단계, 및 ii) 상기 수를 상기 샘플 중의 활성 TEC 패밀리 키나제의 총량과 비교하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TEC 패밀리 키나제의 표적 점유율에 기초하여 치료 계획(therapeutic regimen)을 결정 또는 수정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. TEC 패밀리 키나제 억제제 요법을 받은 환자에서 약물 표적 점유율을 모니터링하기 위한 방법으로서, 상기 요법 시행 동안에 걸쳐 2회 이상의 시점에서 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, i) 상기 표적 점유율이 약 50% 미만인 경우 상기 TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여량을 증가시키는 단계, ii) 상기 표적 점유율이 약 70% 이상을 초과하는 경우 상기 TEC 패밀리 키나제 억제제의 투여량을 감소시키는 단계, iii) 상기 TEC 패밀리 키나제 억제제의 동일한 치료 계획을 유지하는 단계, 또는 iv) 상기 치료 계획을 중단시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 점유율에 기초하여 상기 TEC 패밀리 키나제 억제제 요법의 효능을 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 TEC 패밀리 키나제 억제제는 i) 상기 TEC 패밀리 키나제의 점유율이 약 70% 이상일 때 유효하거나, 또는 ii) 상기 TEC 패밀리 키나제의 점유율이 약 50% 미만일 때 유효하지 않은 방법.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TEC 패밀리 키나제 억제제는 브루톤의 티로신 키나제(BTK)의 억제제인 방법.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TEC 패밀리 키나제 억제제는 이브루티닙(ibrutinib)인 방법.
  22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 포획제를 사용하여 프로브-결합된 키나제를 포획하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 포획제는 스트렙타비딘 또는 항체인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 포획제는 고형 지지체에 부착되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 고형 지지체는 플레이트, 마이크로플레이트, 비드 또는 복수의 비드들인 방법.
  26. 제12항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브-결합된 키나제를 1차 검출제, 및 선택적으로, 상기 1차 검출제에 결합하는 2차 검출제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 1차 검출제 또는 2차 검출제는 항체, 비드, 염료, 표지, 태그, 형광단, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 1차 검출제는 항-BTK 항체, 항-ITK 항체, 항-TXK 항체, 항-TEC 항체, 항-BMX 항체, 또는 항-BLK 항체인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 또는 2차 검출제는 화학발광 태그에 접합되는 방법.
  30. 제12항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 암을 앓고 있는 환자인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 암은 호지킨 림프종 또는 비호지킨 림프종(NHL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 외투 세포 백혈병(MCL), 여포성 림프종(FL), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 발덴스트룀 거대글로불린혈증(
    Figure pct00034
    ) 또는 다발성 골수종(MM)인 방법.
  32. 제12항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 혈액 샘플, 림프 샘플 또는 종양 생검 샘플인 방법.
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