JP2015536446A - Tecファミリーキナーゼ阻害剤療法のためのコンパニオン診断 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許仮出願番号第61/712,675号(2012年10月11日出願)の利益に関する優先権を請求し、前記仮出願特許は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本明細書には、TECファミリーキナーゼ阻害剤の投与を含む治療と組み合わせて使用するための、コンパニオン診断法及びキットが記載される。
(式中、
LaはCH2、O、NH又はSであり、
Arは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Yは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
ZはC(O)、OC(O)、NHC(O)、C(S)、S(O)n、OS(O)n、NHS(O)nであり、式中、nは1又は2であり、
R6及びR8は、独立して、H、場合により置換されたアルキル又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
L1は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
L2は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)であり、式中、mは2〜6であり、
L3は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、Xは検出可能な標識である)。いくつかの実施形態では、Xは
(式中、
LaはCH2、O、NH又はSであり、
Arは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Yは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
ZはC(O)、OC(O)、NHC(O)、C(S)、S(O)n、OS(O)n、NHS(O)nであり、式中、nは1又は2であり、
R6及びR8は、独立して、H、場合により置換されたアルキル又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
L1は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
L2は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)であり、式中、mは2〜6であり、
L3は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつXは検出可能な標識である)。いくつかの実施形態では、Xは
本明細書において言及される全ての出版物及び特許出願は、それぞれの個別の出版物又は特許出願が、参照により援用されることが具体的にかつ個別に記載されているのと同等に、参照によりその全体が本明細書に援用される。本明細書で説明される開示は、本開示の出願日よりも先に開示されているという意味合いでのみ提供される。本明細書では、本発明者らによる本明細書における記載は、先行技術の効力により、又は任意のその他の理由から、係る開示を先行するものとして認めることを承認するものと解釈されない。
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、請求される主題の属する技術分野の者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本明細書に記載の用語について複数の定義が存在する場合、用語の節に記載のものが優先される。URL又はその他のこのような識別子若しくはアドレスに対し参照がなされた場合、このような識別子は変化し得るものであり、インターネット上の個々の情報は掲載された後に非掲載とされ得るものの、インターネットを検索すれば等価な情報を発見できることは理解されたい。それらに対する参照は、このような情報の可用性及び公共への普及度の証拠となる。
本明細書では、標的(例えば、標的プロテインキナーゼ)に対するタンパク質モジュレータ(例えば、阻害剤)の有効性を決定するための方法が開示される。いくつかの実施形態では、標的キナーゼ(例えば、TECファミリーキナーゼ又は相同キナーゼ)に対するTECファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、(a)TECファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させて、プローブの結合している標的キナーゼを形成させることと、(b)サンプル中の、プローブの結合している標的キナーゼの量を検出することと、(c)プローブの結合している標的キナーゼの量に基づき、TECファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程(a)の前にサンプルをTECファミリーキナーゼ阻害剤と接触させる(例えば、サンプルをプローブと組み合わせる)ことを更に含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的キナーゼの量を検出することは、化合物、試薬又は緩衝剤を投与して、プローブの結合しているキナーゼを検出することを含む。いくつかの実施形態では、化合物、試薬又は緩衝剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、検出抗体緩衝液、読み取り緩衝液、洗浄緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的キナーゼの存在又は非存在を検出することは、プローブの結合している標的キナーゼの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、定量する工程は、蛍光、免疫蛍光、化学発光、又は電気化学発光を含む。いくつかの実施形態では、TECファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定することは、TECファミリーキナーゼ阻害剤による標的キナーゼの占有率を決定することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的キナーゼの量は、TECファミリーキナーゼ阻害剤の有効性と逆相関する。例えば、図8及び10に示される通り、薬剤処理されたサンプル(例えば、プローブと接触させる前に薬剤と接触させたサンプル)をプローブと接触させた後、検出される、プローブの結合している標的キナーゼ(例えば、未占有の標的キナーゼ)の量が増加した場合、薬剤の有効性は減少する。別の例では、薬剤処理されたサンプルをプローブと接触させた後、検出される、プローブの結合している標的キナーゼの量(例えば、未占有の標的キナーゼ)が減少した場合、薬剤の有効性は増加する。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的キナーゼの量は、薬剤の有効性と直接相関する。例えば、図9に示す通り、未処理サンプル(例えば、プローブと接触させる前に薬剤と接触させていないサンプル)をプローブと接触させた後、検出される、プローブの結合している標的キナーゼの量が増加した場合、薬剤の有効性も増加する。別の例では、未処理サンプル(例えば、プローブと接触させる前に薬剤と接触させていないサンプル)をプローブと接触させた後、検出される、プローブの結合している標的キナーゼの量が減少した場合、薬剤の有効性は減少する。いくつかの実施形態では、標的キナーゼの少なくとも約50%に薬剤が結合したとき、薬剤は有効であるものとして決定される。あるいは、標的キナーゼの少なくとも約60%に薬剤が結合したとき、薬剤は有効であるものとして決定される。いくつかの実施形態では、標的の少なくとも約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99%に薬剤が結合したとき、薬剤は有効であるものとして決定される。
本明細書では、標的キナーゼ(例えば、TECファミリーキナーゼ又はチロシンキナーゼ相同体)に対するTECファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定するための方法、アッセイ及びシステムが開示される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞周期制御因子、受容体、配位子、転写調節因子、転写開始因子、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、及びその他のプロテインキナーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない、その他の標的タンパク質のために構成することができる。特定の実施形態では、標的キナーゼはチロシンキナーゼである。特定の実施形態では、標的キナーゼは、セリン/スレオニンキナーゼである。
本明細書では、標的に対する薬剤の有効性を決定するための方法、アッセイ及びシステムが開示される。本明細書で開示される好適な薬剤はタンパク質モジュレータを含む。タンパク質モジュレータは、タンパク質阻害剤、タンパク質拮抗剤、及びタンパク質刺激剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤はタンパク質阻害剤である。タンパク質阻害剤の例としては、プロテインキナーゼ阻害剤が挙げられるがこれに限定されない。
本明細書において、リンカー、標識、製剤、又はこれらの任意の組み合わせを含むタンパク質占有率アッセイキットが開示される。一態様は、リンカー及び標識を含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、リンカーは、標識を製剤に付加し得るものであり、製剤はタンパク質モジュレータである。別の態様は、製剤、リンカー及び標識を含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、リンカーは、製剤と標識とに付加することにより製剤を標識に付加させ得るものである。いくつかの実施形態は、プローブを含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、プローブは標識に付加されている製剤を含む。いくつかの実施形態は、プローブを含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、プローブはリンカーに付加されている製剤を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は、プローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブは製剤及び標識を含む。いくつかの実施形態では、製剤及び標識は付加されている。他の実施形態では、プローブは製剤及びリンカーを含む。いくつかの実施形態では、製剤及びリンカーは付加されている。別の実施形態では、プローブは製剤、リンカー及び標識を含む。いくつかの実施形態では、製剤、リンカー及び/又は標識は互いに付加されている。いくつかの実施形態では、プローブは標識を含む。別の実施形態では、プローブは標識及びリンカーを含む。いくつかの実施形態では、標識及びリンカーは付加されている。いくつかの実施形態では、付加は化学的方法、酵素による方法、又は架橋による方法によるものである。いくつかの実施形態では、プローブを固体支持体に付着させる。製剤、リンカー、標識、及び固体支持体の例示的な実施形態が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は製剤を含む。好適な製剤はタンパク質モジュレータ(例えば、阻害剤、拮抗剤、及び刺激剤)を含む。いくつかの実施形態では、製剤は薬剤である。本明細書で開示される好適な製剤はタンパク質モジュレータを含む。タンパク質モジュレータは、タンパク質阻害剤、タンパク質拮抗剤、及びタンパク質刺激剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤はタンパク質阻害剤である。タンパク質阻害剤の例としては、プロテインキナーゼ阻害剤が挙げられるがこれに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物はリンカーを含む。好適なリンカーは、本明細書で開示される標識及び/又は製剤に付加され得る任意の化学的又は生物学的化合物を含む。リンカーが標識及び製剤の両方に付加される場合、好適なリンカーは、標識及び製剤を十分に分離させ得るものである。好適なリンカーは、製剤の標的(例えば、タンパク質)結合能に著しく干渉しない。好適なリンカーは、標識の被検出能に著しく干渉しない。いくつかの実施形態では、リンカーは剛体である。他の実施形態では、リンカーは可動性である。別の実施形態では、リンカーは半剛体である。いくつかの実施形態では、リンカーはタンパク質分解に安定性である(例えば、タンパク質切断に耐性を示す)。別の実施形態では、リンカーはタンパク質分解に不安定性である(例えば、タンパク質切断を受けやすい)。いくつかの実施形態では、リンカーはらせん状である。いくつかの実施形態では、リンカーはらせん状ではない。いくつかの実施形態では、リンカーはコイル状である。いくつかの実施形態では、リンカーはβ−ストランド化されている。いくつかの実施形態では、リンカーはターン構造を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは単一鎖である。いくつかの実施形態では、リンカーは長鎖である。いくつかの実施形態では、リンカーは短鎖である。いくつかの実施形態では、リンカーは少なくとも約5残基、少なくとも約10残基、少なくとも約15残基、少なくとも約20残基、少なくとも約25残基、少なくとも約30残基、又は少なくとも約40残基からなる。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は標識を含む。例示的な標識としては、当該技術分野において周知の、化学的、生化学的、生物学的、比色的、酵素的、蛍光、発光標識、化学発光標識、及び電気化学発光標識が挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、標識は、染料、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬剤、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、抗体又は抗体断片、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的又は非共有結合的相互作用する基、光ケージド部分、化学線励起性部分、配位子、光異性化部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子を取り込んでいる部分、化学分解性基、光分解性基、酸化還元活性剤、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基(intercalating group)、発色団、エネルギー移動剤、生物活性物質、検出可能な標識、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は固体支持体を含む。固体支持体は、プローブ又は抗体を付着させることのできる任意の固体プラットフォームを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、プレート、及びアレイを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体はプレートに付着しているビーズを含む。例えば、図11Bに示す通り、ストレプトアビジンビーズがプレートに付着している。いくつかの実施形態では、固体支持体はプレートを含む。別の実施形態では、固体支持体はプレートに付着している抗体を含む。例えば、図11Aに示す通り、抗BTK抗体がプレートに付着している。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は、製剤、リンカー、標識、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、製剤、リンカー、及び/又は標識は付加されている。製剤、リンカー、及び/又は標識を付加させるための方法としては、化学標識及び酵素標識が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、プローブ又は標的(例えば、タンパク質)を固体支持体に付着させるための方法としては、化学的及び/又は酵素学的方法が挙げられる。本明細書におけるいくつかの実施形態では、化学的方法が開示される。本明細書におけるいくつかの実施形態では、酵素学的方法が開示される。いくつかの実施形態では、プローブ又は標的を固体支持体に付着させるための方法は、固体支持体を、プローブ又は標的によりコートすることを含む。マイクロプレートを抗体によりコートするための方法は当該技術分野において周知であり、かつコート緩衝液に抗体を希釈し、希釈した抗体をマイクロプレートにおけるウェルに加えることを含み得る。未結合の抗体は、プレートを洗浄緩衝液で洗浄することにより除去することができる。
本明細書に記載のTECファミリーキナーゼプローブ化合物は、TECファミリーキナーゼ阻害剤を含む部分、リンカー部分、及び検出可能な標識から構成される。いくつかの実施形態では、TECファミリーキナーゼ阻害剤は不可逆的TECファミリーキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、TECファミリーキナーゼ阻害剤はBtk阻害剤である。いくつかの実施形態では、Btk阻害剤は不可逆的阻害剤である。別の実施形態では、Btkの不可逆的阻害剤は、BtkのATP結合ポケットの非触媒残基に結合する。更なる実施形態では、非触媒残基はシステイン残基である。いくつかの実施形態では、Btkプローブは、Btkの少なくとも1つの非触媒残基と共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、TECファミリーキナーゼプローブ化合物は、不可逆的Btk阻害剤の誘導体である。いくつかの実施形態では、TECファミリーキナーゼプローブ化合物はイブルチニブの誘導体である。いくつかの実施形態では、TECファミリーキナーゼプローブ化合物はイブルチニブの誘導体である。いくつかの実施形態では、TECファミリーキナーゼプローブ化合物は、リンカーにより標識が付加されたイブルチニブからなる。いくつかの実施形態では、TECファミリーキナーゼプローブ化合物は、AVL−292、AVL−291、AVL−101、CNX−774、又はONO−WG−307の誘導体である。いくつかの実施形態では、TECファミリーキナーゼプローブ化合物は、リンカーにより標識が付加されたAVL−292、AVL−291、AVL−101、CNX−774、又はONO−WG−307からなる。
(式中、
Laは、CH2、O、NH又はSであり、
Arは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Yは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Zは、C(O)、OC(O)、NHC(O)、C(S)、S(O)n、OS(O)n、NHS(O)nであり、式中、nは1又は2であり、
R6及びR8は、独立して、H、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
L1は、結合、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリール、場合により置換されたヘテロアリール、場合により置換されたアミド部分、場合によりケトン部分、場合により置換されたカルバマート部分、及び場合によりエステル部分、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、かつXは検出可能な標識である)。
(式中、
Laは、CH2、O、NH又はSであり、
Arは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Yは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Zは、C(O)、OC(O)、NHC(O)、C(S)、S(O)n、OS(O)n、NHS(O)nであり、式中、nは1又は2であり、
R6及びR8は、独立して、H、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
L1は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
L2は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)−であり、式中、mは2〜6であり、
L3は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつ
Xは検出可能な標識である)。
(式中、
LaはOであり、
Arは場合により置換されたフェニルであり、
Yは、場合により置換されたシクロアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロシクロアルキルであり、
ZはC(O)又はNHC(O)であり、
R6及びR8は、独立して、H、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
L1は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
L2は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)−であり、式中、mは2〜6であり、
L3は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつ
Xは
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、標的(例えば、標的キナーゼ)の検出を含む。いくつかの例では、標的はプローブの結合している標的である。いくつかの例では、プローブの結合している標的は、薬剤に占有されている標的である。他の例では、プローブの結合している標的は、未占有の標的である。
薬剤の探索及び検証
本明細書で開示されるアッセイ及びシステムは、いずれも薬剤の探索及び検証において有用であり得る。本明細書では、(a)標的を含むサンプルをプローブと接触させて、プローブの結合している標的を形成させることと、(b)プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することと、(c)プローブの結合している標的の存在又は非存在に基づき、薬剤による標的の占有率を決定することにより、薬剤を検証することと、を含む、薬剤を検証するための方法が提供される。
任意の方法、アッセイ及びシステムを使用して、対象者の治療法及び全体的なヘルスケアマネジメントについての情報を提供でき、治療レジメンを決定するための方法についての情報を提供する。いくつかの実施形態は、(a)標的を含むサンプルをプローブと組み合わせることと、(b)プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することと、(c)プローブの結合している標的の存在又は非存在に基づき治療レジメンを決定することと、を含む、治療レジメンを決定するための方法である。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法、アッセイ、及びシステムは、標的を含むサンプルをプローブと接触させることを含む。本明細書で開示される任意の方法、アッセイ、及びシステムで使用される好適なサンプルは、限定するものではないが、全血サンプル、末梢血サンプル、リンパ液サンプル、組織サンプル、腫瘍生検サンプル、骨髄サンプル、又はその他の体液サンプルを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血サンプル、末梢血サンプル、リンパ液サンプル、組織サンプル、腫瘍生検サンプル、骨髄サンプル、又はその他の体液サンプルに由来する1種以上の細胞型、又はそれらの溶解物を含むサンプルである。体液の例としては、なすりつけ標本、痰、生検、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、唾液、及び尿が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルの細胞がサンプルのその他の成分から単離される。いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルの特定の細胞型が、サンプルのその他の細胞型から単離される。例えば、いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、血液サンプルの末梢血単核細胞(PBMC、例えば、リンパ球、単球及びマクロファージ)が、血液サンプルのその他の細胞型から単離される。例えば、いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルのリンパ球(例えば、B細胞、T細胞又はNK細胞)が、サンプルのその他の細胞型から単離される。例えば、いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルのB細胞が、サンプルのその他の細胞型から単離される。いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルの細胞が可溶化される。例えば、いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、癌細胞がサンプルの正常な細胞から単離される。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるサンプルは、いずれも、疾患又は徴候に罹患している対象者から得られる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるサンプルは、いずれも、TECファミリーキナーゼにより介在される疾患又は徴候に罹患している対象者から得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、自己免疫疾患、炎症性障害、又は癌などの増殖性疾患に罹患している対象者に由来する。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。
本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムのその他の特徴が本明細書において開示される。本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムの有効性は、現在のタンパク質占有率に関する方法、アッセイ、及びシステム(例えば、ゲル系のアッセイ)にほぼ匹敵する。いくつかの実施形態では、方法、アッセイ、及びシステムの有効性は、現在のタンパク質占有率法よりも良好である。いくつかの例では、方法、アッセイ、及びシステムは、現在のタンパク質占有率法と比較した場合に改良されている特異性を提供する。例えば、プローブにより標識した陰性対照Jurkat溶解物のシグナルが、試験した全ての溶解物のバックグラウンド程度であったとき、アッセイは、良好な特異性を提供する。いくつかの例では、特異性は、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99%である。
既存のゲルベースのBTK占有率アッセイを、プレートベースの電気化学発光アッセイに変更して、アッセイのスループットを増加させることを試験の目的とした。アッセイの目的は、以降「薬剤」又はイブルチニブとして参照する共有結合阻害剤(イブルチニブ)の結合していないBTKの相対量を定量することである。この薬剤はBTKの活性部位に結合し、システイン残基によりジスルフィド結合を形成する。以降「プローブ」として参照とする化合物I−5は、長鎖リンカーによりビオチンに連結されているイブルチニブからなる。ゲル系アッセイにおいて、プローブは蛍光レポーターにより標識される。プローブにより標識されたサンプルを標識することで、製剤により占有されていないBTKを検出できる。2つの有望なアッセイフォーマットを図11に示す。
本実験では、感度、特異性、レンジに関しアッセイフォーマットを試験し、最も好適な抗BTK抗体を決定した。
陽性対照:DOHH2細胞溶解物(1mg/mL)のアリコートを1μMイブルチニブで阻害し、次にプローブ(1μM)で標識した。
標準ストレプトアビジンプレート(5パック)カタログ番号L15SA−2;読み取り緩衝液T(50mL)、カタログ番号R92TC−3;SULFO−TAGヤギ抗マウス(50μg)、カタログ番号R32AC−5;SULFO−TAGヤギ抗ウサギ(50μg)、カタログ番号R32AB−5;SULFO−TAGストレプトアビジン(50ug)、カタログ番号R32AD−5;MSD標準プレート、カタログ番号L15XA−3;MSD Blocker A、カタログ番号R93AA−2;プロテアーゼ阻害剤カクテル(例えば、Thermo/Pierce Halt(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテルEDTA不含、カタログ番号87785、又はRoche Complete Mini Protease inhibitor tablet、カタログ番号1836170);BTK発現細胞株(DOHH2)由来の陽性対照可溶化液;陰性対照可溶化液(Jurkat);イブルチニブ(PCI);プローブ化合物I−5(ビオチン化プローブ)
次の抗体を試験した:
ブロッキング溶液:3%(w/v)MSD Blocker A/1x Tris洗浄緩衝液:3g Blocker A+100mL 1x Tris洗浄緩衝液4℃で最大14日間保管する。PBS−Tでブロッキング溶液も調製できる。
洗浄緩衝液:1x MSD Tris洗浄緩衝液:50mL 10x Tris洗浄緩衝液+450mL H2O(150mM NaCl/50mM Tris−HCl(pH7.5)/0.02% Tween−20)洗浄緩衝液としてはPBS−Tも使用できる。
捕捉抗体希釈緩衝液:PBS(Ca2+及びMg2+不含有)
検出抗体希釈緩衝液:1% MSD Blocker A/1x Tris洗浄緩衝液:10mLブロッキング溶液+20mL 1x Tris洗浄緩衝液又は10mLブロッキング溶液+20mL PBS−T
読み取り緩衝液:1x MSD読み取り緩衝液T:プレート当たり5mL 4x読み取り緩衝液T+15mL H2O;2x MSD読み取り緩衝液T:プレート当たり10mL 4x読み取り緩衝液T+10mL H2O
細胞溶解物:複数回凍結融解させた細胞ペレットをPBS+プロテアーゼ阻害剤に再懸濁することにより溶解物を調製した。PCI及びプローブ標識反応をPBS−T+1% BSA(アッセイ緩衝液)で実施した。溶解物をアッセイ緩衝液+プロテアーゼ阻害剤で希釈した。
図11Aは、ストレプトアビジン検出アッセイ(例えば、アッセイフォーマット1)の概略図である。簡潔に述べると、方法は、標的(例えば、BTKキナーゼ)を含む、薬剤処理されたサンプルを、抗BTK抗体コートプレートと接触させることを含み、BTKキナーゼは抗BTK抗体により捕捉される。抗BTK抗体により捕捉されたBTKキナーゼは、薬剤により占有されたBTKキナーゼと、未占有のBTKキナーゼとを含む。捕捉されたBTKキナーゼをプローブと接触させる。プローブは、未占有のBTKキナーゼに結合する製剤を含む。この実施例では、プローブは、薬剤により占有されたBTKキナーゼに結合できない。プローブを、未占有のBTKキナーゼと結合させて、プローブの結合しているBTKキナーゼを検出する。この実施例では、プローブは、プローブの結合しているBTKキナーゼを検出可能な標識を含む。プローブの結合しているBTKキナーゼは、標識化ビーズ(例えば、SULFO−TAGストレプトアビジン)を加えることにより検出する。プローブの結合しているキナーゼの量は、電気化学発光により定量する。プローブの結合しているキナーゼの定量により、BTKキナーゼの占有率及び薬剤の有効性を決定できる。より詳細なプロトコルが本明細書で開示される。
1.MSD標準プレートを、各ウェル30μLの抗BTK捕捉抗体溶液(PBSで2μg/mLに希釈)でコートする。抗体溶液をウェル底部の隅に配置した後、プレートを軽く叩き、各ウェルの底部全体に確実に均一に分散させる。粘着性プレートシールでシールし、4℃で一晩インキュベートする。プレートは振盪させない。
2.プレートを軽く叩いて中身を除去し、ウェル当たり150μLのブロッキング溶液(3%[w/v]Blocker A)を加える。シールし、室温で1時間以上振盪しながらインキュベートする。
3.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを1回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
4.プレートのレイアウトに従い、30μLの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで1時間振盪させる。
5.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
6.プレートのレイアウトに従い、各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで0.5μg/mLに希釈したSULFO−TAGストレプトアビジンを25μL加える。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで30〜60分間振盪させる。
7.ウェル当たり150μL以上の1x Tris洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
8.各ウェルに150μLの1x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で読み取る。
全3種の被検捕捉抗体に関し、陽性対照(DOHH2+プローブ)のシグナルを溶解物の濃度により定量する。抗BTK捕捉抗体BD611116及びBD611117を使用したときに最も高いシグナルが得られた。抗BTK捕捉抗体BD611116及びBD611117は同等であった。
図11B及び14Aは、ストレプトアビジンコートしたプレートアッセイ(例えば、アッセイフォーマット2)の概略図を示す。簡潔に述べると、方法は、MSD標準ストレプトアビジンプレートをプローブでブロッキングすること、又はプローブの結合しているプレートを提供することを含む。この実施例では、プローブは、標識及び製剤を含み、この標識(例えば、ビオチン)がストレプトアビジンにより捕捉され、プローブがプレートに付加される。標的(例えば、BTK)を含むサンプルをプレートに適用する。標的は製剤(例えば、BTK阻害剤などの薬剤)を介しプローブに結合し又は付加され、プローブの結合している化合物を形成する。プローブの結合している標的は、抗標的(例えば、抗BTK)抗体などの一次検出剤により検出できる。一次検出試薬を標識し、続いて直接検出できる。図11Bに示す通り、一次検出試薬をSULFO−TAGと複合させて、標識付加一次検出試薬を生成する。しかしながら、図14Aに示す通り、一次検出試薬は未標識としてもよい。方法には、図14Aに示す通り、二次検出剤(例えば、抗種抗体)の付加を更に含ませることができる。二次検出剤は標識し(例えば、SULFO−TAG抗種抗体)、続いて検出できる。SULFO標識付加検出剤は、プローブの結合しているキナーゼの定量を可能にする電気化学発光により検出できる。プローブの結合しているキナーゼの定量により、BTKキナーゼの占有率及び薬剤の有効性を決定できる。より詳細なプロトコルが本明細書で開示される。
1.MSD標準ストレプトアビジンプレートの各ウェルに、150μLのブロッキング溶液(3%[w/v]Blocker A)を加える。シールし、室温で1時間以上振盪しながらインキュベートするか、又は4℃で一晩ブロッキングする。
2.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを1回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
3.プレートのレイアウトに従い、30μLの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで1時間振盪させる。
4.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
5.プレートのレイアウトに従い、各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで0.5μg/mLに希釈した抗BTK抗体を25μL加える。シールし室温で1時間振盪する。
6.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。プレートのレイアウトに従い、各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで1μg/mLに希釈したSULFO−TAG複合抗種抗体を25μL加える。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
7.ウェル当たり150μL以上の1x Tris洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
8.各ウェルに150μLの1x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で読み取る。
プレートのレイアウト及び結果を図14B〜Cに示す。
更なる最適化にはアッセイフォーマット2(例えば、ストレプトアビジンコートしたプレートによるストレプトアビジン捕捉法−図14Aを参照されたい)を使用した。プローブ濃度>62nM及び溶解物濃度>62μg/mLでフック効果が観察されたことから、チェッカーボード実験を実施して、フック効果が過剰なプローブに関係するのか又は過剰なタンパク質濃度に関係するのかを判定した。プレートの結合能が飽和すれば、複合体を形成していない過剰なプローブは、ストレプトアビジン表面に対する結合に関し、BTK結合プローブと競合し得る。
必要とされる最適プローブ濃度を決定する
様々なプローブ:溶解物比を比較する
陽性対照:アッセイ緩衝液を用い1mg/mL DOHH2溶解物を調製する。
陰性対照:1μM PCIにより1mg/mL DOHH2溶解物のアリコートを処理し、BTKにPCIが最大限に結合するよう過剰量のPCIを含有させる。
1.MSD標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり150μLの3% Blocker Aにより室温で1時間又は4℃で一晩ブロッキングする。
2.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを1回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
3.プレートのレイアウトに従い、50μLの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで1時間振盪させる。
4.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
5.各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで0.5μg/mLに希釈した抗BTK抗体BD611117を25μL加える。シールし室温で1時間振盪する。
6.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
7.各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで1μg/mLに希釈したSULFO−TAG複合抗マウス抗体を25μL加える。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
8.ウェル当たり150μL以上の1x Tris洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
9.各ウェルに150μLの2x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で読み取る。
最適化実験の結果を図17に示す。
目的:一連のPCI滴定と、それに続いて最終プローブ濃度25nMでプローブを用いることによる溶解物の標識により、阻害実験を実施する。
陽性対照:アッセイ緩衝液中1mg/mL DOHH2溶解物
陰性対照:アッセイ緩衝液中1mg/mL Jurkat溶解物
溶解物を、アッセイ緩衝液で300、150、及び75μg/mLに希釈する。
1.MSD標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり150μLの3% Blocker Aにより室温で1時間又は4℃で一晩ブロッキングする。
2.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを1回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
3.プレートのレイアウトに従い、30μLの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
4.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
5.各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで0.5μg/mLに希釈した抗BTK抗体BD611117を25μL加える。シールし室温で1時間振盪する。
6.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで1μg/mLに希釈したSULFO−TAG複合抗マウス抗体を25μL加える。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
7.ウェル当たり150μL以上の1x Tris洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
8.ウェル当たり150μLの1x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で読み取る。
結果を図18〜19に示す。
代替的なタンパク質占有率アッセイプロトコルを提供する。
1.最終濃度25nMとなるよう、アッセイ緩衝液中サンプルにプローブを加え(2μLの1.25μMプローブストック+100μLサンプル)、振盪しながらインキュベートする。
2.MSD標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり150μLの3% Blocker Aにより室温で1時間又は4℃で一晩ブロッキングする。
3.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを1回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
4.各ウェルに30μLの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
5.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
6.各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで0.5μg/mLに希釈した抗BTK抗体BD611117又はBD611116を25μL加える。シールし室温で1時間振盪する。
7.各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで1μg/mLに希釈したSULFO−TAG複合抗マウス抗体を25μL加える。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
8.ウェル当たり150μL以上の1x Tris洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
9.各ウェルに150μLの1x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で読み取る。
抗タンパク質抗体コートプレート又はストレプトアビジンコートプレートアッセイフォーマットのいずれかを使用し、選択されたビオチン化プローブを、標的占有率アッセイにおける使用に関し試験した。次のプローブを試験した:
化合物I−1,MW=808.01(合計80mg)
化合物I−2,MW=793.38(合計60mg)
化合物I−3,MW=780.98(合計32mg)
化合物I−4,MW=766.95(合計27mg)
化合物I−5,MW=1097.37(合計24mg)
試験したプローブの構造を図21に示す。
1)50xプローブを50μL溶解物に加え(1ug/μl)、37℃で1時間インキュベートする。
2)ストレプトアビジンコートプレートを1% BSAにより室温で1時間ブロッキングし、PBSTで3回洗浄する。
3)サンプルを氷上に移し10分間反応を停止させた後、室温に戻す。
4)プローブ標識したDOHH2溶解物の希釈系列を調製する。1% BSAを用いて500μLとし、1ug、0.5μg、0.25ug、125ng、62.5ng、31.25ng、15.6ng/μLの順に調製する。
5)プローブ処理した溶解物100μLを各ウェルに三つ組で加える。
6)室温で2時間インキュベートする。
7)PBSTで7回洗浄する。
8)二次抗体−HRPを加え、室温で1時間インキュベートする。
9)200μL PBSTで5回洗浄する。
10)100μL TMBを加え、室温で15分間インキュベートする。
11)50μL 停止液を加える。
12)450nmで読み取る。
1)最終用量(500μL)になるよう、溶解物をPBSにより所望の濃度に希釈する。
2)ビオチン化プローブ(最終濃度2.5μM)を溶解物に加え、37℃で1時間置く。
3)ストレプトアビジンプレートを1% BSAで室温で1時間ブロッキングし、PBSTで3回洗浄する。
4)サンプルを氷上に移し10分間反応を停止させた後、室温に戻す。
5)100uL処理溶解物(三つ組)をストレプトアビジンプレートに加え、室温で2時間静置する。
6)200μL PBSTで5回洗浄する。
7)100μL二次抗体−HRPを加え、室温で1時間インキュベートする。
8)200μL PBSTで3回洗浄する。
9)100μL TMBを加え、室温で10分間インキュベートする。
10)50μL停止液を加える。
11)450nmで読み取る。
1)96ウェルプレートを、100μL抗BTK(1:1000PBS)で4℃で一晩コートする。
2)プレートをPBSTで5回洗浄する。
3)プレートを固定して、室温で1時間ブロッキングし、PBSTで3回洗浄する。
4)最終用量(500μL)になるよう、溶解物をPBSにより所望の濃度に希釈する。
5)ビオチン化プローブ(最終濃度2.5μM)を溶解物に加え、37℃で1時間置く。
6)サンプルを氷上に移し10分間反応を停止させた後、室温に戻す。
7)100μL処理溶解物(三つ組)をストレプトアビジンプレートに加え、室温で2時間静置する。
8)200μL PBSTで5回洗浄する。
9)ストレプトアビジン−HRPを加え、固定して室温で1時間インキュベートする。
10)200μL PBSTで3回洗浄する。
11)100μL TMBを加え、室温で15分間インキュベートする。
12)50μL停止液を加える。
13)450nmで読み取る。
高及び低プローブ濃度ストレプトアビジンアッセイに関し、各種プローブを比較する占有率アッセイから得られた結果を、図22に示す。データは、アッセイに使用したプローブの中では、化合物I−5が、BTKに対する結合に関し最も高いシグナルを示したことを示す。
Nanosynにより実施された標準キナーゼ阻害アッセイを用い、化合物I−5のTECファミリーキナーゼ及び相同性チロシンキナーゼ阻害能を生体外でアッセイした。次の表4に従い以降のキナーゼをアッセイした。
本実験では、臨床サンプル中の総BLKをMSDプラットフォームで定量するためのサンドウィッチイムノアッセイ法を開発するために、抗BLK抗体を選別する方法を示すことを目的とした。
ブロッキング溶液:1x PBS中3%(w/v)MSD Blocker A:3g Blocker A+100mL PBS4℃で最大14日間保管する。
洗浄緩衝液:PBS−T(PBS+0.05% Tween−20)
捕捉抗体希釈緩衝液:PBS(Ca2+及びMg2+不含有)
捕捉抗体:捕捉抗体希釈緩衝液で各抗体の4μg/mL溶液1mLを調製する。
検出抗体希釈緩衝液:1x PBS中1% MSD Blocker A:10mLブロッキング溶液+20mL 1x PBS
検出抗体:1% MSD Blocker A/1x PBSで、各抗体の2μg/mL 溶液1〜2mLを調製する。
SULFO−TAG標識二次抗体:それぞれ1μg/mLの抗マウス及び抗ウサギSULFO−TAG抗体の、1% MSD Blocker A/1x PBSを3mL調製する。
読み取り緩衝液:1x MSD読み取り緩衝液T:プレート毎に5mL 4x読み取り緩衝液T+15mL H2Oを反転混和し、ボルテックス処理はしない。
標準法:1% Blocker Aを用い、組み換え型BLKの10μg/mL原液を調製する。次に、検量線用に以降の希釈液を調製する。それぞれの希釈には新しいチップを使用する。それぞれの希釈後に十分にボルテックスする。
実験1
目的:更なるアッセイ構築のための好適な抗体対を特定するために抗体を選別する。
1.MSD高結合プレート及び標準プレートのそれぞれを、プレートレイアウトの通りにウェル当たり25μLの捕捉抗体溶液(4μg/mL)で溶液コートする(工程1)。ウェルの隅に抗体溶液を加え、プレートを優しく叩いて液体を均一に分散させ、プレートをシールし、振盪はせずに4℃で一晩インキュベートする。
2.翌日、プレートの中身を除去し、ウェル当たり150μLのブロッキング溶液(3%[w/v]Blocker A)を加える。シールし、室温で1時間以上振盪しながらインキュベートする。
3.ウェル当たり150μL以上のPBS−Tによりプレートを1回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
4.プレートレイアウトに従い、25μLの希釈した組み換えタンパク質を加える(工程2)。溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで1〜2時間振盪させる。
5.ウェル当たり150μL以上のPBS−Tによりプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
6.プレートレイアウトに従い、25μL検出抗体溶液を加える(工程3)。抗体溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで1時間振盪させる。
7.ウェル当たり150μL以上のPBS−Tによりプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
8.25μLのSULFO−TAG抗種検出抗体を1μg/mL検出抗体希釈液に希釈し、工程3のプレートレイアウトに従い加える。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで30分間振盪させる。
9.ウェル当たり150μL以上のPBS−Tによりプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
10.ウェル当たり150μLの1x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で直接読み取る。
それぞれの抗体対の生シグナルを図23に示す。それぞれの抗体対のバックグラウンドに対するシグナル(S/B)を図24に示す。H00000640−M02で最も高いS/B比が観察された。BLK用の4種の抗体対に関し、タンパク質濃度に伴う、シグナル及びS/Bの良好な定量が観察された。総BLKアッセイを更に最適化するために、抗体対(捕捉用としてAF2679、及び検出用としてH00000640−MO2)及び最も高いS/B比を有する配向(orientation)を選別した。標準プレートでは、同様の抗体対、高S/B比が観察された。
目的:
1)捕捉抗体としてAF2679、及び検出抗体としてH00000640−M02を使用し、BLKアッセイのためのアッセイ条件を構築する。
2)BLKの発現について、陽性(DOHH2)及び陰性(Jurkat)細胞溶解物を試験する。
1.MSD標準プレートを、プレートレイアウトの通りにウェル当たり25μLの捕捉抗体溶液(4μg/mL)で溶液コートする。ウェルの隅に抗体溶液を加え、プレートを優しく叩いて液体を均一に分散させ、プレートをシールし、振盪はせずに4℃で一晩インキュベートする。2.翌日、プレートの中身を除去し、ウェル当たり150μLのブロッキング溶液(5%[w/v]Blocker A)を加える。シールし、室温で1時間以上振盪しながらインキュベートする。
3.ウェル当たり150μL以上のPBS−Tによりプレートを1回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
4.プレートレイアウトに従い、25μLの希釈した組み換えタンパク質を加える。溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで1〜2時間振盪させる。
5.ウェル当たり150μL以上のPBS−Tによりプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
6.プレートレイアウトに従い25μL検出抗体溶液を加える。抗体溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで1時間振盪させる。
7.ウェル当たり150μL以上のPBS−Tによりプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
8.プレート2の各ウェルに1x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)150μLを加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で直接読み取る。
9.25μLのSULFO−TAG抗種検出抗体を1μg/mL検出抗体希釈液に希釈し、プレートレイアウトに従いプレート1に加える。プレートをシールし、室温で300〜500rpmで30分間振盪させる。
10.ウェル当たり150μL以上のPBS−Tによりプレート1を3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
11.ウェル当たり150μLの1x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で直接読み取る。
アッセイの生シグナルを図25に示す。本アッセイのバックグラウンドに対するシグナル(S/B)を図26に示す。BLKアッセイは、タンパク質濃度に伴うシグナル定量を示す。1μg/mL捕捉抗体及び0.5μg/mL検出抗体を使用して、組み換え型BLKタンパク質のシグナル値を図27にプロットする。細胞溶解物中のBLKに関し、陽性対陰性比を以降の表に示す。
MSDストレプトアビジンプレートでのITK及びBLK占有率アッセイに必要とされるプローブを最適化すること、及び溶解物の薬剤処理を用いアッセイ性能を実証することをこの実験の目的とした。アッセイの目的は、以降「薬剤」として参照する共有結合阻害剤の結合していないITK及びBLKの相対量を定量することである。「プローブ」は、長鎖リンカーによりビオチンに結合させた薬剤からなる。プローブによるサンプル標識は、製剤により占有されないITK及びBLKの検出を可能にする。BTKについてこれまでに首尾よく使用されてきたアッセイフォーマットは、ストレプトアビジンプレート上で、プローブ標識されたタンパク質を補足し、抗タンパク質抗体を使用し検出を行うものである。ITK及びBLK占有率アッセイと類似のフォーマットを試験した。
標準ストレプトアビジンプレート(5パック)カタログ番号L15SA−2、読み取り緩衝液T(50mL)カタログ番号R92TC−3、SULFO−TAGヤギ抗マウス(50μg)カタログ番号R32AC−5、SULFO−TAGヤギ抗ウサギ(50μg)カタログ番号R32AB−5、SULFO−TAGストレプトアビジン(50ug)カタログ番号R32AD−5、MSD Blocker Aカタログ番号R93AA−2、プロテアーゼ阻害剤カクテル(例えば、Thermo/Pierce Halt(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテルEDTA不含カタログ番号87785又はRoche Complete Mini Protease inhibitor tablet、カタログ番号1836170)、ITK及びBLK発現細胞株由来の陽性対照溶解物細胞株(DOHH2及びJURKAT)、陰性対照溶解物(THP−1細胞)、BLK、ITK阻害薬剤イブルチニブ「PCI」;ビオチン化プローブ化合物I−5「プローブ」。
ブロッキング溶液:3%(w/v)MSD Blocker A/1x Tris洗浄緩衝液:3g Blocker A+100mL 1x Tris洗浄緩衝液4℃で最大14日間保管する。PBS−Tでブロッキング溶液も調製できる。
洗浄緩衝液:1x MSD Tris洗浄緩衝液:50mL 10x Tris洗浄緩衝液+450mL H2O(150mM NaCl/50mM Tris−HCl(pH7.5)/0.02% Tween−20)洗浄緩衝液としてはPBS−Tも使用できる。
検出抗体希釈緩衝液:1% MSD Blocker A/1x Tris洗浄緩衝液:10mLブロッキング溶液+20mL 1x Tris洗浄緩衝液又は10mLブロッキング溶液+20mL PBS−T
読み取り緩衝液:1x MSD読み取り緩衝液T:プレート毎に5mL 4x読み取り緩衝液T+15mL H2O
細胞溶解物:複数回凍結融解させた細胞ペレットをPBS+プロテアーゼ阻害剤に再懸濁することにより溶解物を調製した。
アッセイ緩衝液:1% blocker/Tris洗浄緩衝液+プロテアーゼ阻害剤
目的:必要とされる最適プローブ濃度を決定し、異なるプローブ:溶解物比で比較する
陽性対照:DOHH2及びJurkat細胞溶解物
陰性対照:1uM PCIで処理したDOHH2及びJurkat細胞
1)Block MSDプレートを、900rpmで振盪しながら室温で1〜3時間、150μL 3% Blocker Aでブロッキングする。
2)96ウェルポリプロピレンプレートにおいて、50uL用量で、定量したタンパク質溶解物と定量したプローブとを、振盪しながら1時間インキュベートする。
3)MSDプレートを洗浄緩衝液で2回洗浄する。
4)それぞれのプレートレイアウトの通りにプローブ溶解混合物30uLをMSDプレートに移し、1時間インキュベートする。
5)プレートを150μL洗浄緩衝液で3回洗浄する。
6)1% Blocker Aで2ug/mLに希釈した25uLの抗BLK又は抗ITK抗体を加える。900rpmで振盪しながら室温で2時間インキュベートする。
7)プレートを150μL洗浄緩衝液で3回洗浄する。
8)1% Blocker Aで1ug/mLに希釈した25uL SULFO−TAG標識抗ウサギ抗体を加える。900rpmで振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
9)プレートをMSD洗浄緩衝液で3回洗浄し、150μL 1x読み取り緩衝液を加え、sectorイメージャーで直接読み取る。
BLK及びITKプローブアッセイの結果を図28に示す。BTK及びITKアッセイの両方に関し、シグナルは、使用した溶解物中のタンパク質濃度により定量されることが観察された。陽性対照の溶解物に関しては、プローブ濃度の増加に伴いシグナルは増加し、約30nM超でプラトーに達する。陰性対照(細胞溶解物+薬剤)サンプルに関しては、120nMプローブでも上昇は非常に僅かであり、バックグラウンドシグナルは低い。以降の実験に関してはプローブ濃度は50nMが推奨された。
目的:一連の薬剤を定量し、次に溶解物を50nMプローブで標識して、阻害実験を実施する
陽性対照:DOHH2及びJurkat溶解物(アッセイ緩衝液中1mg/mL)
陰性対照:THP−1溶解物(アッセイ緩衝液中1mg/mL)
1)MSD標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり150μLの3% Blocker Aにより室温で1時間又は4℃で一晩ブロッキングする。
2)各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを1回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
3)プレートのレイアウトに従いプローブ標識溶解物30μLを加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
4)各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
5)各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで2μg/mLに希釈した抗ITK抗体を25μL加える。シールし、900rpmで振盪しながら室温で2時間インキュベートする。
6)各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで2μg/mLに希釈したSULFO−TAG複合抗種抗体を25μL加える。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
7)ウェル当たり150μL以上の1x Tris洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
8)ウェル当たり150μLの1x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で読み取る。
ITKプローブアッセイの結果を、以下の図29及び表8に示す。全ての薬剤濃度において、観察された陰性対照細胞株DOHH2のシグナルはバックグラウンド程度であった。薬剤処理陽性対照のJurkat細胞溶解物は、薬剤濃度の増加に伴いシグナルの低下を示した。阻害率(%)は使用した溶解物濃度と関連しなかった。アッセイの再現性は非常に良好であり、平均CV%は<5%であった。
目的:一連の薬剤を定量し、次に溶解物を50nMプローブで標識して、阻害実験を実施する。
陽性対照:DOHH2、Jurkat及びPBMC溶解物(アッセイ緩衝液中1mg/mL)
陰性対照:THP−1溶解物(アッセイ緩衝液中1mg/mL)
1)MSD標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり150μLの3% Blocker Aにより室温で1時間又は4℃で一晩ブロッキングする。
2)各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを1回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
3)プレートのレイアウトに従いプローブ標識溶解物30μLを加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
4)各ウェル150μL以上の洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
5)各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで2μg/mLに希釈した抗ITK抗体を25μL加える。シールし、900rpmで振盪しながら室温で2時間インキュベートする。
6)プレートを150μL洗浄緩衝液で3回洗浄する。
7)各ウェルに、1%(w/v)Blocker Aで2μg/mLに希釈したSULFO−TAG複合抗種抗体を25μL加える。プレートをシールし室温で1時間振盪する。
8)ウェル当たり150μL以上の1x Tris洗浄緩衝液を用いプレートを3回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
9)ウェル当たり150μLの1x読み取り緩衝液T(H2Oに希釈)を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをSI2400で読み取る。
ITKプローブアッセイの結果を、以下の図30及び表9に示す。PBMC溶解物では用量依存性のITKシグナルの減少が観察されたことから、薬剤によるPBMC溶解物におけるITK阻害が示唆される。ITKアッセイの再現性は非常に良好であり、こちらもCV%<5%であった。
電気化学的刺激に基づくELISA SULFO−TAG ITKプローブアッセイを使用して、イブルチニブの結合していないITKの相対量を定量することもできるであろう。イブルチニブは、ITKの活性部位に結合し、システイン残基(ITK−Cys442)とのジスルフィド結合を形成する。化合物I−5は、長鎖リンカーによりビオチンに結合しているイブルチニブからなるプローブである。回収したタンパク質溶解物を化合物I−5により標識する。プローブによるサンプル標識は、薬剤により占有されないITKの検出を可能にする。ITKと複合しているプローブ(及び複合していないプローブ)をストレプトアビジン(SA)プレートにより捕捉し、次にマウス抗ITK(BD番号550503)及びSULFO−TAG複合抗マウス抗体(MSD、カタログ番号R32AC−5)とともにインキュベートする。各ウェルにおいて電極で電気化学的な刺激を開始し、SULFO−TAG標識を発光させ、シグナルを測定する。より大きいシグナルはサンプルのITK部位がより未占有であることと相関する一方、より小さいシグナルはITK部位がよりイブルチニブにより占有されていることと相関する。
Claims (32)
- 式(II)の構造を有するプローブを含むTECファミリーキナーゼ阻害剤療法を受けている患者における薬剤標的の占有率を決定するためのキットであって、式(II)の構造は
からなり、
(式中、
Laは、CH2、O、NH又はSであり、
Arは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Yは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Zは、C(O)、OC(O)、NHC(O)、C(S)、S(O)n、OS(O)n、NHS(O)nであり、式中、nは1又は2であり、
R6及びR8は、独立して、H、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
L1は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
L2は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)−であり、式中、mは2〜6であり、
L3は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつXは検出可能な標識である)、前記プローブはTECファミリーキナーゼに結合する、キット。 - Xが
- 前記プローブが、
- 前記プローブは、ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)、ITK、TEC、BMX、TXK、又はBLKに結合する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキット。
- プレート、マイクロプレート、ビーズ、又は複数のビーズから選択される1つ以上の固体支持体を更に含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のキット。
- 前記固体支持体を捕捉剤によりコートしてコート固体支持体を作製し、ここで、前記捕捉剤はプローブに結合するものである、請求項5に記載のキット。
- 前記捕捉剤がストレプトアビジン又は抗体である、請求項6に記載のキット。
- 一次検出剤、及び場合により、前記一次検出剤に結合する二次検出剤を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のキット。
- 前記一次検出剤又は二次検出剤が、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項8に記載のキット。
- 前記一次検出剤が、抗BTK抗体、抗ITK抗体、抗TEC抗体、抗TXK抗体、抗BMX抗体、又は抗BLK抗体である、請求項9に記載のキット。
- 前記一次又は二次検出剤に電気化学発光タグを複合させる、請求項8〜10のいずれか一項に記載のキット。
- TECファミリーキナーゼ阻害剤療法を受けている患者における薬剤標的の占有率を決定するための方法であって、
(a)TECファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させて、プローブの結合しているキナーゼを形成させることと、
(b)前記サンプル中の、プローブの結合しているキナーゼの量を検出することと、
(c)前記サンプルにおいて検出されたプローブの結合しているキナーゼの量に基づき前記TECファミリーキナーゼの標的占有率を決定することと、を含み、
前記サンプルは、不可逆的TECファミリーキナーゼ阻害剤の少なくとも一回量を投与された患者から得たものであり、前記プローブは、式(II)
の構造を含む
(式中、
Laは、CH2、O、NH又はSであり、
Arは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Yは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Zは、C(O)、OC(O)、NHC(O)、C(S)、S(O)n、OS(O)n、NHS(O)nであり、式中、nは1又は2であり、
R6及びR8は、独立して、H、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
L1は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
L2は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−N(H)C(O)(CH2)mC(O)N(H)−であり、式中、mは2〜6であり、
L3は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつ
Xは検出可能な標識である)、方法。 - Xが
- 前記プローブが
- 標的占有率を決定することが、i)前記サンプル中に検出された前記プローブの結合しているキナーゼの量に基づき、前記TECファミリーキナーゼ阻害剤の結合していない結合部位の数を求めることと、ii)前記サンプル中の活性型TECファミリーキナーゼの総量に対し前記数を比較することと、を含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TECファミリーキナーゼの標的占有率に基づき治療レジメンを決定すること又は修正することを更に含む、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- TECファミリーキナーゼ阻害剤療法を受けている患者における薬剤標的の占有率をモニタリングする方法であって、治療過程の2つ以上の時点で、請求項12〜16のいずれか一項に記載の方法を実施する、方法。
- i)前記標的占有率が約50%未満の場合に、前記TECファミリーキナーゼ阻害剤の投与量を増加させることと、ii)前記標的占有率が少なくとも約70%を上回る場合に、前記TECファミリーキナーゼ阻害剤の投与量を減少させることと、iii)前記TECファミリーキナーゼ阻害剤の同等の治療レジメンを維持すること、又はiv)前記治療レジメンを中断することと、を更に含む、請求項16又は17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的占有率に基づき前記TECファミリーキナーゼ阻害剤療法の有効性を決定することを更に含み、前記TECファミリーキナーゼ阻害剤が、i)前記TECファミリーキナーゼの占有率が少なくとも約70%であるとき有効であり、又はii)前記TECファミリーキナーゼの占有率が約50%未満であるとき有効ではない、請求項12〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TECファミリーキナーゼ阻害剤がブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)の阻害剤である、請求項12〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TECファミリーキナーゼ阻害剤がイブルチニブである、請求項12〜20のいずれか一項に記載の方法。
- プローブの結合しているキナーゼを捕捉剤により捕捉することを更に含む、請求項12〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉剤がストレプトアビジン又は抗体である、請求項22に記載の方法。
- 前記捕捉剤が固体支持体に付加されている、請求項22又は23に記載の方法。
- 前記固体支持体がプレート、マイクロプレート、ビーズ、又は複数のビーズである、請求項24に記載の方法。
- 前記プローブの結合しているキナーゼを、一次検出剤、及び場合により、該一次検出剤に結合する二次検出剤と接触させることを更に含む、請求項12〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一次検出剤又は二次検出剤が、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記一次検出剤が、抗BTK抗体、抗ITK抗体、抗TXK抗体、抗TEC抗体、抗BMX抗体、又は抗BLK抗体である、請求項26又は27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一次又は二次検出剤に化学発光タグを複合させる、請求項26〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 患者が癌に罹患している、請求項12〜29のいずれか一項に記載の方法
- 癌が、ホジキンリンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫(NHL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又は多発性骨髄腫(MM)である、請求項30に記載の方法。
- 前記サンプルが血液サンプル、リンパ液サンプル、又は腫瘍生検サンプルである、請求項12〜31のいずれか一項に記載の方法。
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