ES2640320T3

ES2640320T3 - Composición inmunogénica que comprende 1 o más conjugados de sacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y un componente proteico que comprende proteína E y/o PilA de Haemophilus influenzae

Info

Publication number: ES2640320T3
Application number: ES13779190.1T
Authority: ES
Inventors: Francesca CEDDIA; WilliamPaul HAUSDORFF; Vincent Verlant; Carine YSEBAERT
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2017-11-02
Anticipated expiration: 2033-10-15
Also published as: EA201590491A1; SG11201502635SA; CN104853768B; CN104968366B; BR112015008419A8; MX2015005002A; SG11201502634TA; CN104853768A; JP2015534962A; KR20150072444A; CA2888300A1; CA2888310A1; AU2013331781A1; AU2013331781A8; BR112015008417A2; JP2015534964A; EA201590490A1; EP2908854A2; BR112015008419B1; EP2908856A1

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende conjugados de sacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y un componente proteico que comprende PilA o un fragmento inmunogénico de PilA de Haemophilus influenzae, en el que el número de serotipos de sacáridos de Streptococcus pneumoniae es menor que o igual a 23.

Description

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Composicion inmunogenica que comprende 1 o mas conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y un componente proteico que comprende protefna E y/o PilA de Haemophilus influenzae

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a composiciones inmunogenicas que comprenden uno o mas conjugados sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y un componente proteico que comprende protefna E y/o PilA de Haemophilus influenzae.

Antecedentes

Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) es un patogeno respiratorio importante y comun que causa otitis media en lactantes y ninos. La NTHi es, despues de Streptococcus pneumoniae, la causa mas comun de otitis media aguda en ninos (J. Immunology 183: 2593-2601 (2009), Pediatrics 113:1451-1465 (2004)). Es una causa importante de sinusitis en ninos y adultos (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Se ha asociado con un mayor riesgo de exacerbaciones en la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) en adultos (Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115 (2006)). Ademas, H. influenzae no tipificable causa neumonfa adquirida en la comunidad en adultos, y puede causar neumonfa en ninos en pafses en desarrollo (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)).

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) tambien conocido como neumococo, es una bacteria Gram positiva. S. pneumoniae es un gran problema de salud publica en todo el mundo y es responsable de una considerable morbilidad y mortalidad, especialmente en lactantes, ancianos y personas inmunocomprometidas. S. pneumoniae causa una amplia variedad de importantes patologfas en seres humanos, incluyendo la neumonfa adquirida en la comunidad, sinusitis aguda, otitis media, meningitis bacteriana, septicemia, osteomielitis, artritis septica, endocarditis, peritonitis, pericarditis, celulitis, y abcesos cerebrales. Se estima que S. pneumoniae es el agente causal de 3.000 casos de meningitis, 50.000 casos de bacteriemia, 500.000 casos de neumonfa y 7.000.000 de casos de otitis media anualmente, solo en Estados Unidos (Reichler, M. R. y col., 1992, J. Infect. Dis. 166: 1346; Stool, S. E. and Field, M. J., 1989 Pediatr. Infect. Dis J. 8: S11). Las tasas de mortalidad causada por enfermedades neumococicas son especialmente altas en ninos menores de 5 anos de edad, tanto en pafses desarrollados como en pafses en desarrollo. Los ancianos, personas inmunocomprometidas y pacientes con otras enfermedades subyacentes (diabetes, asma), tambien son particularmente susceptibles a la enfermedad.

Los principales sfndromes clfnicos causados por S. pneumoniae son ampliamente reconocidos y se discuten en los libros de texto medicos convencionales (Fedson D S, Muscher D M. En: Plotkin S A, Orenstein W A, editores. Vaccines. 4a edicion. Philadelphia WB Saunders Co, 2004a: 529-588). Por ejemplo, la enfermedad neumococica invasiva (ENI) esta definida por cualquier infeccion en la cual S. pneumoniae se afsla de la sangre o de otro sitio normalmente esteril (Musher D M. Streptococcus pneumoniae. En Mandell G L, Bennett J E, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious diseases (5a ed). New York, Churchill Livingstone, 2001, p. 2128-2147).

La enfermedad pulmonar obstructiva cronica es una enfermedad inflamatoria cronica de los pulmones y una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Aproximadamente una de cada 20 muertes en el 2005 en los Estados Unidos, tenia EPOc como causa subyacente (Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). Se proyecta que en el 2020, la EPOC se elevara a la quinta causa que lleva a la discapacidad en anos de vida, a enfermedades cronicas invalidantes, y a la tercera causa mas importante de mortalidad (Lancet 349:1498-1504 (1997)).

Por lo tanto, existe la necesidad de vacunas combinadas contra Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae.

La protefna E (PE) es una lipoprotefna de membrana externa con propiedades adhesivas. Desempena una funcion en la adhesion/invasion de Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) a las celulas epiteliales (J. Immunology 183: 2593-2601 (2009); The Journal of Infectious Diseases 199:522-531 (2009), Microbes and Infection 10:87-96 (2008)). Esta altamente conservada tanto en Haemophilus influenzae encapsulado como en H. influenzae no tipificable y tiene un dominio de union epitelial conservado (The Journal of Infectious Diseases 201:414-419 (2010)). Se han descrito trece diferentes mutaciones puntuales en diferentes especies de Haemophilus, cuando se comparan con Haemophilus influenzae Rd como cepa de referencia. Se ha observado su expresion tanto en la fase de crecimiento logarftmica como en la fase de crecimiento estacionaria de la bacteria (WO2007/084053).

La protefna E tambien esta involucrada en la resistencia al complemento humano, a traves de la union a vitronectina (Immunology 183: 2593-2601 (2009)). La PE, mediante el dominio de union PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR (SEQ ID NO. 1, que corresponde a los aminoacidos 84-108 de la SEQ ID NO: 4), se une a la vitronectina, la cual es un importante inhibidor de la ruta terminal del complemento (J. Immunology 183:2593-2601 (2009)).

La pilina A (PilA) posiblemente es la principal subunidad de pilina de H. influenzae tipo IV Pilus (Tfp) involucrada en la motilidad nerviosa (Infection and Immunity, 73: 1635-1643 (2005)). La PilA de NTHi es una adhesina conservada expresada in vivo. Se ha demostrado que participa en la adherencia, colonizacion y formacion de biopelfculas de

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NTHi (Molecular Microbiology 65: 1288-1299 (2007)).PRYMULA R Y COL: “Pneumococcal capsular polysaccharides conjugated to protein D for prevention of acute otitis media caused by both Streptococcus pneumoniae and non- typable Haemophilus influenzae: a randomised double-blind efficacy study”, THE LANCET LIMITED LONDON, GB, vol. 367 n.°9512 4 de marzo de 2006 (), paginas 740-748, y PRYMULA Y COL.: “Effect of vaccination with pneumococcal capsular polysaccharides conjugated to Haemophilus influenzae-derived protein D on nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae and H. influenzae in children under 2 years of age”, VACCNIE, ELSEVIER KTD, GB, vol. 28, n,°1, 10 de diciembre de 2009 (), paginas 71-78 desvela composiciones inmunogenicas que comprenden polisacaridos capsulares de serotipos neumococicos conjugados con protefna D derivada de Haemophilus influenzae.

Los inventores han descubierto que la PilA y PE pueden estar beneficamente presentes en una composicion inmunogenica para la prevencion de H. influenzae, y ademas que la PilA y la protefna E se pueden agregar a una composicion que comprenda sacaridos capsulares de S. pneumoniae, con el fin de proporcionar una composicion inmunogenica que pueda prevenir la infeccion por H. influenzae y S. pneumoniae. El experto en la materia sera consciente del efecto de la supresion epitopica inducida por el vehfculo, y sabra que generalmente la exposicion simultanea a multiples antfgenos conjugados, puede dar como resultado una respuesta inmunitaria intensificada o disminuida (Plotkin y col., Vaccines cuarta edicion, 2003).

Breve sumario

Los inventores han descubierto que las protefnas PilA, PE (o fragmentos de las mismas) y los sacaridos de Streptococcus pneumoniae se pueden combinar de manera beneficiosa en una composicion inmunogenica, para proporcionar una proteccion eficaz contra H. influenzae y S. pneumoniae.

Por consiguiente, en un primer aspecto, se proporciona una composicion inmunogenica que comprende 1 o mas (por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) conjugados sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y un componente proteico que comprenda PilA (o un fragmento inmunogenico de PilA) de Haemophilus influenzae.

En un segundo aspecto, se proporciona una vacuna que comprende una composicion inmunogenica de la invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

En un tercer aspecto, se proporciona un procedimiento para inmunizar un sujeto contra enfermedades causadas por infecciones por Streptococcus pneumoniae, que comprende administrarle al sujeto una dosis terapeuticamente eficaz de la composicion inmunogenica de la invencion o la vacuna de la invencion.

En un cuarto aspecto, se proporciona un procedimiento de inmunizacion de un sujeto contra enfermedades causadas por infecciones por Haemophilus influenzae, que comprende administrarle al sujeto una dosis terapeuticamente eficaz de la composicion inmunogenica de la invencion o la vacuna de la invencion.

En un quinto aspecto, se proporciona una composicion inmunogenica de la invencion o una vacuna de la presente invencion, para su uso en el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infecciones por Streptococcus pneumoniae.

En un sexto aspecto, se proporciona una composicion inmunogenica de la invencion, o una vacuna de la invencion, para su uso en el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infecciones por Haemophilus influenzae.

En un septimo aspecto, se proporciona el uso de una composicion inmunogenica de la invencion o la vacuna de la invencion, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infecciones por Streptococcus pneumoniae.

En un octavo aspecto, se proporciona el uso de una composicion inmunogenica de la invencion o la vacuna de la invencion, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infecciones por Haemophilus influenzae.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos por construcciones de protefna de fusion LVL291, LVL268 y LVL269. Se cargaron la fraccion insoluble (I), fraccion soluble (S) y fraccion de medio de cultivo (M) para LVL291, LVL268 y LVL269, antes y despues de la induccion (ind).

Figura 2. SDS-PAGE y transferencia de Western relacionadas con extractos de purificacion para las construcciones de protefnas de fusion LVL291, LVL268 y LVL269. Se cargaron la fraccion de flujo a traves (Ft), la fraccion de lavado (L) y la fraccion de elucion (E) para la purificacion de LVL291, LVL268 y LVL269. Se utilizaron marcadores anti-his para sondear los extractos.

Figura 3. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos y de purificacion para construcciones de las protefnas de fusion LVL291 y LVL315. Se cargaron la fraccion de medio de cultivo (M), la fraccion soluble (Sol), la fraccion insoluble (Ins), la fraccion de flujo a traves (Ft), la fraccion de lavado n.° 1 (W1), fraccion de lavado n.° 2 (W2) y la

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fraccion de elucion (E), para LVL291 y LVL315.

Figura 4. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos y de purificacion, para la construccion de protefna de fusion LVL312. Se cargaron la fraccion de medio de cultivo (M), la fraccion soluble (Sol), la fraccion insoluble (Ins), la fraccion de flujo a traves (Ft), la fraccion de lavado n.° 1 (W1), la fraccion de lavado n.° 2 (W2) y la fraccion de elucion (E), para LVL312.

Figura 5. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos (IPTG 1 mM y 10 pM) para la construccion de protefna de fusion LVL317. Extractos de antes (NI) y despues de la induccion (In), fraccion soluble (S), fraccion insoluble

(I).

Figura 6. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos (IPTG 1 mM y 10 pM) para la construccion de protefna de fusion LVL318. Extractos de antes (NI) y despues de la induccion (In), fraccion de medio de cultivo (M), fraccion soluble (S), fraccion insoluble (I).

Figura 7. Espectros de CD de las protefnas de fusion PE, PilA y PE-PilA.

Figura 8. Combinacion del espectro de CD de PE y PilA.

Figura 9. Curva de desnaturalizacion termica de la PilA.

Figura 10. Curva de desnaturalizacion de PE.

Figura 11. Curva de desnaturalizacion termica de la protefna de fusion PE-PilA.

Figura 12. Cromatograma de flujo rapido tfpico de SP Sepharose™.

Figura 13. Cromatograma de flujo rapido tfpico de Q Sepharose™.

Figura 14. SDS-PAGE de muestras en proceso, provenientes del proceso de purificacion de la protefna de fusion PE-PilA.

Figura 15. Transferencia de Western de muestras en proceso, provenientes del proceso de purificacion de la protefna de fusion PE-PilA. En la transferencia de Western se utilizo un anticuerpo policlonal de conejo anti-PE.

Figura 16. Transferencia de Western de muestras en proceso, provenientes del proceso de purificacion de la protefna de fusion PE-PilA. La inmunoelectrotransferencia utilizo anticuerpos policlonales de conejo anti-E. coli (BLR).

Figura 17. Transicion termica de la protefna de fusion PE-PilA y de las protefnas PE y PilA. Curvas: PilA (1), protefna E (Prot E, PE) (2), preparacion purificada de PE-PilA no diluida, 737 pg/ml (3), y preparacion purificada de PE-PilA diluida a una concentracion final en el recipiente de 60 pg/ml (4).

Figura 18. Respuestas de anticuerpos contra la protefna de fusion PE-PilA LVL291 y contra PE y PilA monovalentes, en un modelo en ratones Balb/c.

Figura 19. Efecto de la vacunacion con protefna de fusion PE-PilA sobre la depuracion bacteriana de la cepa de NTHi 86-028NP, en el modelo de nasofaringe de raton.

Figura 20. Efecto de la vacunacion con protefna de fusion PE-PilA sobre la depuracion bacteriana de la cepa de NTHi 3224A, en nasofaringe de raton.

Figura 21. Efecto de la vacunacion con PilA sobre la depuracion bacteriana en nasofaringe de raton.

Figura 22. Efecto de la vacunacion con PE sobre la depuracion bacteriana en nasofaringe de raton.

Figura 23. (a) Union de la protefna de fusion PE-PilA LV317 a la vitronectina y (b) union de las protefnas de fusion PE-PilA LVL317 y LVL735 a la vitronectina.

Figura 24. Inhibicion de la union a vitronectina por anticuerpos policlonales contra la protefna de fusion PE-PilA.

Figura 25. SDS-PAGE de fracciones solubles de extractos bacterianos inducidos por las construcciones de protefna de fusion LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 y el vector pET26b (control negativo). (a) Experimento 1, (b) experimento 2, (c) experimento 3. La protefna de fusion PE-PilA esta indicada por la flecha.

Figura 26. Porcentaje de banda promedio de la protefna de fusion en la fraccion soluble de los experimentos 1, 2 y 3.

Figura 27. Respuesta de anticuerpos de PE y PilA para las construcciones LVL317 y LVL735.

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Figura 28. Efecto de la vacunacion con LVL735 y LVL317 sobre la depuracion bacteriana en un modelo de raton de colonizacion nasofarfngea por Haemophilus influenzae no tipificable.

Figura 29. Grafica comparativa de la inmunogenicidad de una composicion que comprende 12 conjugados de sacaridos, PhtD, dPly y PE-PilA (12V + prot), con una composicion que comprende 12 conjugados de sacaridos (12V) y una composicion que comprende 10 conjugados de sacaridos (10V), tal como se mide despues de la inyeccion de ratones, mediante un ensayo de ELISA de anti-sacaridos. CGP = concentracion geometrica promedio. IC = intervalos de confianza.

Figura 30. Grafica comparativa de la inmunogenicidad de una composicion que comprende 12 conjugados de sacaridos, PhtD, dPly y PE-PilA (12V + prot), con una composicion que comprende 12 conjugados de sacaridos (12V) y una composicion que comprende 10 conjugados de sacaridos (10V), tal como se mide despues de la inyeccion de ratones, mediante un ensayo de opsonofagocitosis. TGP = tftulo geometrico promedio.

Figura 31. Grafica comparativa de la inmunogenicidad de una composicion que comprende 12 conjugados de sacaridos, PhtD, dPly y PE-PilA (12V + prot), con una composicion que comprende PhtD, dPly y PE-PilA sola (prot), tal como se mide despues de la inyeccion de ratones, mediante un ensayo ELISA de antiprotefnas. CGP = concentracion geometrica promedio. IC = intervalos de confianza.

Figura 32. Grafica comparativa de la inmunogenicidad de una composicion que comprende 12 conjugados de sacaridos, PhtD, dPly y PE-PilA (12V + prot), con una composicion que comprende 12 conjugados sacaridos (12V) y una composicion que comprende 10 conjugados sacaridos (10V), tal como se mide despues de la inyeccion de cobayas, mediante un ensayo de opsonofagocitosis. TGP = tftulo geometrico promedio.

Figura 33. Grafica comparativa de la inmunogenicidad de una composicion que comprende 12 conjugados de sacaridos, PhtD, dPly y PE-PilA (12V + prot), con una composicion que comprende 12 conjugados de sacaridos (12V) y una composicion que comprende 10 conjugados sacaridos (10V), tal como se mide despues de la inyeccion de cobayas, mediante un ELISA de anti-sacaridos. CGP = concentracion geometrica promedio. IC = intervalos de confianza.

Figura 34. Grafica comparativa de la inmunogenicidad de una composicion que comprende 12 conjugados de sacaridos, PhtD, dPly y PE-PilA (12V + prot), con una composicion que comprende PhtD, dPly y PE-PilA sola (prot), tal como se mide despues de la inyeccion de cobayas, mediante un ELISA de anti-protefnas. CGP = concentracion geometrica promedio. IC = intervalos de confianza.

Descripcion detallada

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion inmunogenica que comprende uno o mas (por ejemplo 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y un componente proteico que comprende PilA (o un fragmento inmunogenico de la misma) de Haemophilus influenzae. En una realizacion, el componente proteico comprende protefna E o un fragmento inmunogenico de protefna E y PilA o u fragmento inmunogenico de PilA de Haemophilus influenzae. En otra realizacion, el componente proteico comprende Protefna E y PilA de Haemophilus influenzae.

El termino “componente proteico” se refiere a una secuencia de aminoacidos que comprende la protema E (o un fragmento inmunogenico de la misma) y/o PilA (o un fragmento inmunogenico de la misma), el componente proteico puede comprender la protefna E sola, la protefna PilA sola, un fragmento inmunogenico de la protefna E solo, un fragmento inmunogenico de la PilA solo, las protefnas E y PilA, un fragmento inmunogenico de las protefnas E y PilA, un fragmento inmunogenico de la protefna E y un fragmento inmunogenico de la protefna PilA, o protefna E y un fragmento inmunogenico de la PilA (por ejemplo, como una protefna de fusion). El componente proteico ademas puede comprender secuencias adicionales.

Protefna E

Tal como se utiliza en el presente documento “Protema E”, “protema E”, “Prot E” y “PE”, significan la protema E de H. influenzae. La protefna E puede consistir o comprender la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 4 (MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK), asf como secuencias que tienen al menos o exactamente un 75 %, 77 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad, sobre la longitud completa de la SEQ ID NO. 4. La comparacion de 53 secuencias de la protefna E de Haemophilus influenzae (Tabla 1, SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 57) demostro de aproximadamente el 77 % a aproximadamente el 100 % de identidad con la protefna E, tal como se establece en la SEQ ID NO. 4. Por ejemplo, en la secuencia de aminoacidos de la Protefna E, el aminoacido n.° 20 puede ser isoleucina (I) o treonina (T); el aminoacido n.° 23 puede ser alanina (A) o valina (V); el aminoacido n.° 24 puede ser lisina (K) o acido glutamico (E); el aminoacido n.° 31 puede ser alanina (A) o treonina (T); el aminoacido n.° 32 puede ser prolina (P) o alanina (A); el aminoacido n.° 34 puede ser treonina (T) o alanina (A); el aminoacido n.° 37 puede ser arginina (R) o glutamina (Q); el aminoacido n.° 47 puede ser valina (V) o alanina (A); el aminoacido n.° 57 puede ser triptofano (W) o puede estar ausente (-); el aminoacido n.° 70 puede ser alanina (A) o treonina (T); el aminoacido

n.° 93 puede ser glutamina (Q) o estar ausente (-); el aminoacido n.° 109 puede ser treonina (T) o isoleucina (I); el aminoacido n.° 119 puede ser glicina (G) o serina (S); el aminoacido n.° 153 puede ser acido glutamico (E) o lisina (K); el aminoacido n.° 156 puede ser serina (S) o leucina (L); el aminoacido n.° 160 puede ser lisina (K) o asparagina (N); el aminoacido n.° 161 puede ser lisina (K), isoleucina (I) o estar ausente (-); los aminoacidos n.° 162 - n.° 195 5 pueden estar ausentes, o pueden ser como se establece en la SEQ ID NO. 15 (con (-) indicando que el aminoacido

n.° 166 esta ausente), o tal como se establece en la SEQ ID NO. 16; o cualquier combinacion de los mismos.

La protefna E puede consistir en o comprender una secuencia de aminoacidos que difiere de la SEQ ID NO. 4 en uno cualquiera o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste de: el aminoacido n.° 20, el aminoacido n.° 23, el aminoacido n.° 24, el aminoacido n.° 31, el aminoacido n.° 32, el aminoacido n.° 34, el aminoacido n.° 37, el 10 aminoacido n.° 47, el aminoacido n.° 57, el aminoacido n.° 70, el aminoacido n.° 93, el aminoacido n.° 109, el

aminoacido n.° 119, el aminoacido n.° 153, el aminoacido n.° 156, el aminoacido n.° 160, el aminoacido n.° 161 y los aminoacidos n.° 162-195, en la que el aminoacido n.° 20 es treonina (T); el aminoacido n.° 23 es valina (V); el aminoacido n.° 24 es lisina (K); el aminoacido n.° 31 es treonina (T); el aminoacido n.° 32 es alanina (A); el aminoacido n.° 34 es alanina (A); el aminoacido n.° 37 es glutamina (Q); el aminoacido n.° 47 es alanina (A); el 15 aminoacido n.° 57 esta ausente (-); el aminoacido n.° 70 es treonina (T); el aminoacido n.° 93 esta ausente (-); el aminoacido n.° 109 es isoleucina (I); el aminoacido n.° 119 es serina (S); el aminoacido n.° 153 es lisina (K); el aminoacido n.° 156 es leucina (L); el aminoacido n.° 160 es asparagina (N); el aminoacido n.° 161 es lisina (K) o isoleucina (I); o los aminoacidos n.° 162 - n.° 195 son tal como se establece en la SEQ ID NO. 15 (con (-) indicando que el aminoacido n.° 166 esta ausente), o tal como se establece en la SEQ ID NO. 16.

20 Tabla 1: Secuencias de aminoacidos de la protefna E de 53 cepas de Haemophilus influenzae (SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57). - indica que el aminoacido esta ausente.

Nombre de la Cepa: Secuencia de la protefna E

3224A: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.5)

RdKW20: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDRGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.6)

86-028NP: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.7)

R2846: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.8)

R2866: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSES

: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.9)

3655: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.10)

PittAA: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.11)

PittEE: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI- VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYD EFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.12)

Nombre de la Cepa: Secuencia de la protefna E

PittHH: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.13)

Pittll: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.14)

R3021: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLTPPTDVQSGYVRLVKNVNYYIDSESIW VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRIDFYD EFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKNKKICT- LISLNFIQLLGCREYSIFLQLLLFYC WHF (SEQ ID NO.15)

22.4-21: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKKIKKICTLISLNFI QLLGCREYSIFLQLLLFYCWHF (SEQ ID NO.16)

3219C: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.17)

3185: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.18)

3241A: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.19)

038144S1: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTAPTDVRSGFVRLVKNVNYYIDSES SIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTD FYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFLVDKK (SEQ ID NO.20)

810956: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.21)

821246: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.22)

840645: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.23)

902550Z19: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIW VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYD EFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.24)

Nombre de la Cepa: Secuencia de la protefna E

A840177: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.25)

A860514: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTAPTDVRSGYVRLVKNANYYIDSESIW VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYD EFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.26)

A950014: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRIDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.27)

306543X4: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SEQ ID NO.28)

A930105: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SEQ ID NO.29)

901905U: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.30)

A920030: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.31)

3221B: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.32)

27W116791N: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIW VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYD EFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.33)

N218: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.34)

N163: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.35)

N162: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.36)

N107: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID

Nombre de la Cepa: Secuencia de la protefna E NO.37)

N91: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTAPADVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIW VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYD EFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.38)

D211PG: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVR- YKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.39)

D211 PD: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVR- YKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.40)

D201PG: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.41)

D201PD: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.42)

D198PG: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.43)

D198PD: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.44)

D195PD: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQSLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.45)

D189PG: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIW VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYD EFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTVYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.46)

D189PD: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIW VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYD EFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTVYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.47)

D129CG: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.48)

D124PG: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.49)

Nombre de la Cepa: Secuencia de la protefna E

D124PD: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SEQ ID NO.50)

D58PG: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLTPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.51)

D33OD: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.52)

BS433: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.53)

BS432: MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQI

: RTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SE Q ID NO.54)

1714: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.55)

1128: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWV DNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDE FWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.56)

BS430: MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI- VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYD EFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.57)

La protefna E puede ser protefna E de H. influenzae cepa 3224A, RdKW20, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittEE, PittHH, PittII, R3021, 22.4-21, 3219C, 3185, 3241A, 038144S1, 810956, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A860514, A950014, 306543X4, A930105, 901905U, A920030, 3221B, 27W116791N, N218, N163, N162, 5 N107, N91, D211PG, D211PD, D201PG, D201PD, D198PG, D198PD, D195PD, D189PG, D189PD, D129CG,

D124PG, D124PD, D58PG, D33OD, BS433, BS432, 1714, 1128 o BS430. La protefna E puede ser la protefna E tal como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57.

La protefna E puede ser una secuencia con al menos el 95 % o el 98 %, 99 % de identidad sobre la longitud completa, para cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 57. La protefna E puede ser una 10 secuencia con al menos el 95 % de identidad, sobre la longitud completa, para cualquiera de las secuencias establecidas en la Tabla 1, de la SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 57.

Los fragmentos inmunogenicos de la protefna E comprenden fragmentos inmunogenicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoacidos contiguos de la SEQ ID NO. 4. En una realizacion, el fragmento es de menos de 150, 125, 100, 75 o 60 aminoacidos de la protefna E, por ejemplo, en una realizacion, la composicion inmunogenica de la 15 invencion comprende menos de 150, 125, 100, 75 o 60 aminoacidos de la protefna E. Los fragmentos inmunogenicos pueden inducir anticuerpos que se pueden unir a la SEQ ID NO: 4. El fragmento inmunogenico puede comprender un epftopo de linfocitos B y/o T de la SEQ ID NO: 4.

Los fragmentos inmunogenicos de la protefna E pueden comprender fragmentos inmunogenicos de al menos 7, 10,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

15, 20, 25, 30 o 50 aminoacidos contiguos de cualquiera de la SEQ ID NO. 4 a la SEQ ID NO. 57. Los fragmentos inmunogenicos pueden inducir anticuerpos que se pueden unir a la secuencia de longitud completa a partir de la cual se deriva el fragmento. El fragmento inmunogenico puede comprender un epftopo de linfocitos B y/o T de la SEQ ID NO: 4 a la SEQ ID NO. 57. En una realizacion, el fragmento inmunogenico de la protefna E se selecciona del grupo que consiste en los aminoacidos 17-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoacidos 18-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoacidos 19-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125) y los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126). En otra realizacion, el fragmento inmunogenico de la protefna E se selecciona del grupo que consiste en los aminoacidos 17-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoacidos 18-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoacidos 19-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), los aminoacidos 23-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) y los aminoacidos 24-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). En otra realizacion, el fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae, se selecciona del grupo que consiste en los aminoacidos 17-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoacidos 18-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), los aminoacidos 23-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) y los aminoacidos 24-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Mas especfficamente, en una realizacion, el fragmento inmunogenico es la SEQ ID NO: 124, los aminoacidos 19-160 de la SEQ ID NO: 4. En una realizacion adicional, el fragmento inmunogenico es la SEQ ID NO: 125, los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO: 5. En otra realizacion, el fragmento inmunogenico es un fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae que se selecciona del grupo que consiste de los aminoacidos del 23-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) y los aminoacidos 24-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180).

La protefna E contiene una region de union a celulas epiteliales (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR, SEQ ID NO. 128) que se ha comunicado que esta conservada entre mas de 100 aislamientos clfnicos de NTHi, H. influenzae encapsulado, y cepas de colecciones de cultivos analizadas (Singh y col., J. Infect. Dis. 201(3):414-9 (2010)). Singh y col. comunicaron que la protefna E estaba altamente conservada tanto en NTHi como en H. influenzae encapsulado (del 96,9 % al 100 % de identidad, sin el peptido senal). En una realizacion, el fragmento de protefna E comprende la region de union de la SEQ ID NO: 128 (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR).

Protefna E - SEQ ID NO: 4

MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

Aminoacidos 17-160 de la protefna E de la SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO. 122

SAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

Aminoacidos 18-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 123

AQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

Aminoacidos 19-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 124

QI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

Aminoacidos 20-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 125

I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

Aminoacidos 22-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 126

KAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY

IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

Aminoacidos 23-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 179

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

AEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY

IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL

RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

Aminoacidos 24-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 180 EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY

IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL

RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK

En una realizacion, la protefna E o un fragmento inmunogenico de la misma, es capaz de inducir una respuesta inmunitaria que reconoce a la SEQ ID NO: 4. El hecho de si una primera protefna es capaz de inducir o no una respuesta inmunitaria que reconozca a una segunda protefna se puede determinar usando un ensayo ELISA (por ejemplo, el ensayo ELISA descrito en el Ejemplo 22).

PilA

Tal como se usa en el presente documento, “PilA” significa Pilina A de H. influenzae. La PilA puede consistir en o comprender la secuencia proteica de la SEQ ID NO. 58 (MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ), asf como secuencias con un 80 % a un 100 % de identidad para la SEQ ID NO. 58. Por ejemplo, la PilA puede tener al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 % o el 100 % de identidad con la SEQ ID NO. 58. La comparacion de la longitud completa de 64 secuencias de PilA de Haemophilus influenzae (Tabla 2, SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121), demostro una identidad de aproximadamente el 80 % al 100 % a la PilA, tal como se establece en la SEQ ID NO. 58. Por ejemplo, en la secuencia de aminoacidos de la PilA, el aminoacido n.° 6 puede ser glutamina (Q) o leucina (L); el aminoacido n.° 7 puede ser glutamina (Q) o treonina (T); el aminoacido n.° 37 puede ser glutamina (Q) o lisina (K); el aminoacido n.° 44 puede ser alanina (A) o serina (S); el aminoacido n.° 57 puede ser alanina (A) o serina (S); el aminoacido n.° 67 puede ser asparagina (N) o glicina (G); el aminoacido n.° 68 puede ser acido glutamico (E) o lisina (K); el aminoacido n.° 69 puede ser treonina (T) o prolina (P); el aminoacido n.° 71 puede ser lisina (K), asparagina (N), serina (S) o treonina (T); el aminoacido n.° 73 puede ser treonina (T), serina (S) o metionina (M); el aminoacido n.° 76 puede ser lisina (K), serina (S) o asparagina (N); el aminoacido n.° 84 puede ser treonina (T) o lisina (K); el aminoacido n.° 86 puede ser alanina (A) o valina (V); el aminoacido n.° 91 puede ser lisina (K) o alanina (A); el aminoacido n.° 94 puede ser treonina (T), isoleucina (I) o lisina (K); el aminoacido n.° 96 puede ser serina (S) o glutamina (Q); el aminoacido n.° 97 puede ser asparagina (N) o serina (S); el aminoacido n.° 99 puede ser alanina (A) o glicina (G); el aminoacido n.° 103 puede ser alanina (A) o lisina (K); el aminoacido n.° 109 puede ser acido aspartico (D), alanina (A) o treonina (T); el aminoacido n.° 110 puede ser glicina (G), asparagina (N), o arginina (R); el aminoacido n.° 112 puede ser serina (S) o acido glutamico (E); el aminoacido n.° 114 puede ser treonina (T) o isoleucina (I); el aminoacido n.° 116 puede ser treonina (T) o glutamina (Q); el aminoacido n.° 118 puede ser acido glutamico (E), treonina (T), alanina (A), lisina (K) o serina (S); el aminoacido n.° 121 puede ser serina (S) o alanina (A); el aminoacido n.° 122 puede ser alanina (A) o treonina (T); el aminoacido n.° 123 puede ser lisina (K), treonina (T) o alanina (A); el aminoacido n.° 128 puede ser lisina (K) o treonina (T); el aminoacido n.° 135 puede ser acido aspartico (D) o acido glutamico (E); el aminoacido n.° 136 puede ser alanina (A) o treonina (T); el aminoacido n.° 145 puede ser glicina (G) o arginina (R); el aminoacido n.° 149 puede ser glutamina (Q) o lisina (K); o cualquier combinacion de los mismos.

La PilA puede consistir en, o comprender una secuencia de aminoacidos que difiere de la SEQ ID NO. 58 en uno cualquiera o mas aminoacidos que se seleccionan del grupo que consiste en el aminoacido n.° 6, el aminoacido n.° 7, el aminoacido n.° 37, el aminoacido n.° 44, el aminoacido n.° 57, el aminoacido n.° 67, el aminoacido n.° 68, el aminoacido n.° 69, el aminoacido n.° 71, el aminoacido n.° 73, el aminoacido n.° 76, el aminoacido n.° 84, el

aminoacido n.° 86, el aminoacido n.° 91, el aminoacido n.° 94, el aminoacido n.° 96, el aminoacido n.° 97, el

aminoacido n.° 99, el aminoacido n.° 103, el aminoacido n.° 109, el aminoacido n.° 110, el aminoacido n.° 112, el

aminoacido n.° 114, el aminoacido n.° 116, el aminoacido n.° 118 aminoacido, n.° 121, el aminoacido n.° 122, el

aminoacido n.° 123, el aminoacido n.° 128, el aminoacido n.° 135, el aminoacido n.° 136, el aminoacido n.° 145 y el aminoacido n.° 149, en la que el aminoacido n.° 6 es leucina (L); el aminoacido n.° 7 es treonina (T); el aminoacido n.° 37 es lisina (K); el aminoacido n.° 44 es serina (S); el aminoacido n.° 57 es serina (S); el aminoacido n.° 67 es glicina (G); el aminoacido n.° 68 es lisina (K); el aminoacido n.° 69 es prolina (P); el aminoacido n.° 71 es lisina (K), serina (S) o treonina (T); el aminoacido n.° 73 es serina (S) o metionina (M); el aminoacido n.° 76 es serina (S) o asparagina (N); el aminoacido n.° 84 es lisina (K); el aminoacido n.° 86 es valina (V); el aminoacido n.° 91 es alanina (A); el aminoacido n.° 94 es isoleucina (I) o lisina (K); el aminoacido n.° 96 es glutamina (Q); el aminoacido n.° 97 es serina (S); el aminoacido n.° 99 es glicina (G); el aminoacido n.° 103 es alanina (A); el aminoacido n.° 109 es acido aspartico (D) o treonina (T); el aminoacido n.° 110 es glicina (G) o arginina (R); el aminoacido n.° 112 es serina (S); el aminoacido n.° 114 es treonina (T); el aminoacido n.° 116 es treonina (T); el aminoacido n.° 118 es acido glutamico (E), alanina (A), lisina (K) o serina (S); el aminoacido n.° 121 es serina (S); el aminoacido n.° 122 es treonina (T); el aminoacido n.° 123 es lisina (K) o alanina (A); el aminoacido n.° 128 es lisina (K); el aminoacido n.° 135 es acido glutamico (E); el aminoacido n.° 136 es treonina (T); el aminoacido n.° 145 es arginina (R); el aminoacido n.° 149 es lisina (K).

Tabla 2: Secuencias de aminoacidos de la pilina A de 64 cepas de Haemophilus influenzae (SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121).

Nombre de la cepa: Secuencia de la PilA

86-028NP: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.58)

NTHi3219C: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYT LTAEGDSAKGVTWKTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.59)

NTHi3224A: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.60)

NTHi12: MKLTT QQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYKNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVASVITQSGGITVKGDGTLANMEYIL QAAGNAAAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.61)

NTHi44: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.62)

NTHi67: MKLTT QQTLKKGFTLIELM IVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKSDV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTVKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYT LTAEGDSAKGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.63)

1054MEE: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.64)

1729MEE: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.65)

1728MEE: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.66)

1885MEE: MKLTT QQTLKKGFTLIELM IVIAIIAILATIAIPSYKNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNEITNCMGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAAAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSITQ (SEQ ID NO.67)

1060MEE: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYIL QAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.68)

RdKW20: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTNETTSCTGGKNGIAADIKTAKGYVASVITQSGGITVKGNGTLANMEYILQ AKGNAAAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTK (SEQ ID NO.69)

214NP: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.70)

1236MEE: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTNETTSCTGGKNGIAADIKTAKGYVASVITQSGGITVKGNGTLANMEYILQ AKGNAAAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTK (SEQ ID NO.71)

Nombre de la cepa: Secuencia de la PilA

1714MEE: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.72)

1128MEE: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKSDV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYI LQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.73)

R2846: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.74)

R2866: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.75)

3655: MKLTT QQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYIL QAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.76)

PittAA: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.77)

PittGG: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYI LQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.78)

PittII: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.79)

R3021: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.80)

22.4-21: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKSDV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYT LTAEGDSAKGVTWKTTCKGTDASLFPANFCGSVTK (SEQ ID NO.81)

3185A: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.82)

3221B: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.83)

3241A: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.84)

038144S1: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAISELLQASAPYKSDVE LCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYIL QAKGNATAGVTWTTT CKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.85)

821246: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.86)

Nombre de la cepa: Secuencia de la PilA

840645: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.87)

902550Z19: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKSDV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTVKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYT LTAEGDSAKGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.88)

A840177: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.89)

A920030: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.90)

A950014: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDRMSYT LTAEGDSAKGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.91)

901905U: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.92)

A920029: MKLTTQTTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKSDVE LCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVITQSGGITVKGNGTLTNMEYILQ ATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSITQ (SEQ ID NO.93)

A930105: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.94)

306543X4: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.95)

N218: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QASGNAATGVTWTTTCKGTDTSLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.96)

N163: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.97)

N162: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.98)

N120: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYI LQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.99)

N107: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYI LQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.100)

N92: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.101)

Nombre de la cepa: Secuencia de la PilA

N91: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYI LQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.102)

D219PG: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.103)

D211PG: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.104)

D211PD: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.105)

D204CD: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL XATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.106)

D198PG: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.107)

D198PD: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.108)

D195PD: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.109)

D195CD: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.110)

D189PG: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTSCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYT LTAEGDSAKGVTWKTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.111)

D189PD: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTSCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYT LTAEGDSAKGVTWKTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.112)

D124PG: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.113)

D124PD: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.114)

D124CG: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.115)

D58PG: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.116)

5

10

15

20

25

30

Nombre de la cepa: Secuencia de la PilA

BS433: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.117)

BS432: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYI LQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.118)

BS430: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADV ELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLAN

: MEYILQASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.119)

1714: MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVE LCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYIL QATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.120)

1128: MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKSDV ELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYI LQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.121)

La PilA puede ser una PilA de H. influenzae cepa NTHi3219C, NTHi3224A, NTHi12, NTHi44, NTHi67, 1054MEE, 1729MEE, 1728MEE, 1885MEE, 1060MEE, RdKW20, 214NP, 1236MEE, 1714MEE, 1128MEE, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittGG, PittII, R3021, 22.4-21, 3185A, 3221B, 3241A, 038144S1, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A920030, A950014, 901905U, A920029, A930105, 306543X4, N218, N163, N162, N120, N107, N92, N91, D219PG, D211PG, D211PD, D204CD, D198PG, D198PD, D195PD, D195CD, D189PG, D189PD, D124PG, D124PD, D124CG, D58PG, BS433, BS432, BS430, 1714 u 1128. Una secuencia de aminoacidos para la PilA de H. influenzae cepa D204CD, se establece en la SEQ ID NO: 106, en la que X en la posicion n.° 116 es glutamina (Q) o bien leucina (L); la ambiguedad con respecto al aminoacido en la posicion n.° 116, se puede aclarar mediante resolucion tecnica del segundo nucleotido que codifica el aminoacido n.° 116, aclarando la secuencia de la PilA de la cepa D204CD. La PilA puede ser la PilA que se establece en cualesquiera de las SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.

La PilA puede ser una secuencia con al menos el 95 %, el 98 % o el 99 % de identidad, sobre la longitud completa de cualquiera de la SEQ ID NO. 58-SEQ ID NO. 121 (tal como se establecen en Tabla 2).

Los fragmentos inmunogenicos de PilA comprenden fragmentos inmunogenicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoacidos contiguos de la SEQ ID NO. 58-SEQ ID NO. 121. Los fragmentos inmunogenicos pueden inducir anticuerpos que pueden unirse a la secuencia de longitud completa de la cual deriva el fragmento. Los fragmentos inmunogenicos pueden comprender un epftopo de linfocitos B y/o T de la SEQ ID NO: 58-SEQ ID NO: 121.

Por ejemplo, los fragmentos inmunogenicos de la PilA comprenden fragmentos inmunogenicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoacidos contiguos de la SEQ ID NO. 58. En una realizacion, el fragmento inmunogenico de la PilA comprende menos de 150, 125, 100, 75 o 60 aminoacidos de PilA; en una realizacion adicional, la composicion inmunogenica comprende menos de 150, 125, 100, 75 o 60 aminoacidos de PilA. Los fragmentos inmunogenicos pueden inducir anticuerpos que se pueden unir a la SEQ ID NO. 58. Los fragmentos inmunogenicos pueden comprender epftopos de linfocitos B y/o T de la SEQ ID NO: 58.

En una realizacion, el fragmento inmunogenico de PilA es un fragmento de H. influenzae cepa 86-028NP, en el que la PilA es la SEQ ID NO. 58.

PilA de H. influenzae cepa 86-028NP - SEQ ID NO. 58

MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQL

En otra realizacion, el fragmento inmunogenico de PilA tiene aproximadamente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO. 127. Mas especfficamente, en una realizacion, el fragmento inmunogenico de la PilA es la SEQ ID NO. 127, un fragmento que consiste de los aminoacidos del 40-149 de la SEQ ID NO. 58.

Aminoacidos del 40-149 de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP - SEQ ID NO. 127.

T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ

En otra realizacion, el fragmento inmunogenico de PilA consiste en los aminoacidos 40-149 de cualquiera de las secuencias SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. En una realizacion adicional, el fragmento inmunogenico tiene al 5 menos el 95 % de identidad con los aminoacidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO: 58-SEQ ID NO. 121.

La identidad entre polipeptidos se puede calcular mediante diversos algoritmos. Por ejemplo, se puede utilizar el programa Needle del paquete EMBOSS (software gratuito; EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276-277) y el programa Gap del paquete GCG® (Accelrys Inc.). Este programa Gap es una implementacion del algoritmo de Needleman-Wunsch descrito en: Needleman, S. B. and 10 Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de puntuacion BLOSUM62 se ha utilizado, y los huecos abiertos y las sanciones por extension, fueron respectivamente de 8 y 2.

Buscando en la alineacion computarizada, los restos identicos entre dos secuencias comparadas se pueden observar. Un porcentaje de la identidad se puede calcular mediante (1) el calculo del numero de identidades dividido entre la longitud de la alineacion, multiplicado por 100 (por ejemplo, para el analisis del programa Neddle), (2) el 15 calculo del numero de identidades dividido entre la longitud de la secuencia mas larga, multiplicado por 100, (3) el calculo del numero de identidades dividido entre la longitud de la secuencia mas corta, multiplicado por 100, o (4) el calculo del numero de identidades dividido entre el numero de restos alineados, multiplicado por 100 (un resto esta alineado si se encuentra enfrente de otro) (por ejemplo, para el analisis del programa Gap).

En una realizacion, la PilA es capaz de inducir una respuesta inmunitaria que reconoce la SEQ ID NO: 58.

20 Proteina de fusion Proteina E/PilA

En una realizacion, la proteina E y la PilA estan presentes en una proteina de fusion. En otra realizacion, la proteina de fusion tiene la Formula (I):

L(X)m - (R1)n - A - (Y)o - B - (Z)p (Formula I)

en la que:

25 X es un peptido senal o MHHHHHH (SEQ ID NO. 2); m es0 o 1;

R1 es un aminoacido; n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6.;

A es la proteina E de Haemophilus influenzae o un fragmento inmunogenico de la misma, o PilA de Haemophilus 30 influenzae o un fragmento inmunogenico de la misma;

Y se selecciona del grupo que consiste en GG, SG, SS y (G)h, en el que h es 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; o es 0 o 1;

B es PilA de Haemophilus influenzae o un fragmento inmunogenico de la misma, o la proteina E de Haemophilus influenzae o un fragmento inmunogenico de la misma;

35 Z es GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3); y p es 0 o 1.

En una realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en donde X se selecciona del grupo que consiste de la secuencia senal de CcmH (proteina H de membrana del citocromo C), DsbA (proteina disulfuro isomerasa I periplasmica), DsbB (proteina B de membrana enlazada con disulfuro), FlgI (proteina de anillo de 40 peptidoglicano flagelar), FocC (proteina chaperona F1c), MalE (subunidad E de transporte de maltosa), NadA (subunidad A de la quinolinato sintetasa), NikA (componente A del transportador de nfquel ABC), NspA (proteina A de superficie de Neisseria), Omp26 (proteina 26 de membrana externa), OmpA (proteina A de membrana externa), OspA (proteina A de superficie externa), pelB (pectato de liasa B), PhoA (fosfatasa alcalina bacteriana), PhtD (proteina D de trfada de polihistidina), PhtE (proteina E de trfada de polihistidina), SfmC (chaperona de pilina 45 periplasmica), Sip1 (proteina inmunogenica de superficie), TolB (Componente B del Complejo de Envoltura Celular Tol-Pal), TorA (sistema trimetilamina N-oxido reductasa, subunidad A), TorT (proteina T periplasmica del sistema trimetilamina N-oxido reductasa) y Yral (chaperona de pilina periplasmica putativa); o cualquier subgrupo de las mismas. En una realizacion, X es un peptido senal cotraduccional o un peptido senal postraduccional. En una realizacion, X es la secuencia de senal de Flgl (flgl sp). En otra realizacion particular, X es la secuencia de senal de 50 pelB (pelB sp). En otra realizacion, X es un peptido senal postraduccional. En otra realizacion, X se selecciona del grupo que consiste en la secuencia senal de FlgI, NadA y pelB.

En una realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I), se definen en las que m es 1. En otra realizacion, m es 0.

En una realizacion particular, R1 y n se definen en donde (R1)n esta enriquecido de 1 a 6 aminoacidos, en 55 aminoacidos pequenos normalmente hidrofflicos. Los aminoacidos hidrofflicos incluyen el acido glutamico (E), acido aspartico (D) y asparagina (N).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

En una realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que n se selecciona del grupo que consiste de 0, 1, 2 y 6. En una realizacion particular, R1 y n se definen en donde (R1)n se selecciona del grupo que consiste en D, E, ATNDDD (SEQ ID NO. 178) y MD, o cualquier subconjunto de las mismas.

En una realizacion particular, n se selecciona del grupo que consiste de 1, 2 y 6. En una realizacion particular, n es 0.

En una realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que A es protefna E de H. influenzae. En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que A es la protefna E tal como se codifica por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ

ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ

ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ

ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ

ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ

ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; o cualquier subconjunto de las secuencias de la SEQ ID NO. 5 a la SEQ ID NO. 57. En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que A es la protefna E, en la que la protefna E es aproximadamente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 % 99 % identica con la secuencia de aminoacidos de la protefna E que se establece en la SEQ ID NO: 4. En otra realizacion, A es la protefna E en la que la protefna E es aproximadamente del 90 % al 100 % identica a la secuencia de aminoacidos de la protefna E que se establece en la SEQ ID NO: 4. En otra realizacion, A es la protefna E, en la que la protefna E es al menos el 95 % identica a la secuencia de aminoacidos de la protefna E que se establece en la SEQ ID NO: 4. En una realizacion adicional, A es la protefna E en la que la Protefna E es al menos el 95 % identica a la Protefna E tal como se establece en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:57. En una realizacion particular, A es la Protefna E que tiene la secuencia de aminoacidos que se establece en la SEQ ID NO:4.

En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que A es un fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae. En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en la que la protefna E tiene una secuencia de aminoacidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID

NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID

NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID

NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID

NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID

NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO. 4 a la SEQ ID NO. 57. En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en la que la protefna E es aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia de aminoacidos que se establece en la SEQ ID NO: 4. En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en la que la protefna E es aproximadamente del 90 % al 100 % identica con la SEQ ID NO. 4. En una realizacion adicional, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en la que la protefna E es al menos el 95 % identica con cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO. 4 a la SEQ ID NO. 57. Mas especfficamente, en una realizacion, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en la que la protefna E es al menos el 93 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % identica con la SEQ ID NO. 124. En una realizacion particular, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en la que la protefna E es la SEQ ID NO. 4.

En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae, que se selecciona del grupo que consiste en los aminoacidos 17-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoacidos 18-160 de la sEq ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoacidos 19-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125) y los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126). En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae que se selecciona del grupo que consiste en los aminoacidos 17-160 de la SEQ ID nO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoacidos 18-160 de la SeQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoacidos 19-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), los aminoacidos 23-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) y los aminoacidos 24-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae que se selecciona del grupo que consiste en los aminoacidos 17-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoacidos 18-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), los aminoacidos 23-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) y los aminoacidos 24-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Mas especfficamente, en una realizacion, A es la SEQ ID NO. 124, los aminoacidos 19-160 de la SEQ ID NO. 4. En una realizacion adicional, A es la SEQ ID NO.125, los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO. 4. En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae que se selecciona del grupo que consiste de los aminoacidos 23-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

179) y los aminoacidos 24-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180).

Protefna E - SEQ ID NO. 4

Aminoacidos 17-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 122

Aminoacidos 18-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 123

Aminoacidos 19-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 124

Aminoacidos 20-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 125

Aminoacidos 22-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 126 KAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY

Aminoacidos 23-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 179

AEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY

Aminoacidos 24-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 180

EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY

En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que A es PilA de H. influenzae que tiene una secuencia de aminoacidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO.

66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO.

73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO.

80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO.

87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO.

94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 y SEQ ID NO. 121; o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO. 58 a la SEQ ID NO. 121. En otra realizacion, A es PilA en la que PilA es aproximadamente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 % o 99 % identica con la SEQ ID NO. 58. En otrarealizacion, A es PilA en la que PilA es al menos el 95 % identica a cualquiera de las SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.121. En una realizacion particular, A es PilA de la SEQ ID NO. 58.

En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que A es un fragmento inmunogenico de PilA de H. influenzae. En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de PilA, en el que PilA es aproximadamente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 % o 99 % identico con la SEQ ID NO. 58.

Por ejemplo, A es un fragmento inmunogenico de PilA, en el que PilA tiene una secuencia de aminoacidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID

NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID

5 NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID

NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID

NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID

NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID 10 NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116,

SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 y SEQ ID NO. 121; o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO. 58 a la SEQ ID NO. 121. En una realizacion adicional, A es un fragmento inmunogenico de PilA, en el que PilA es al menos el 95 % identica con cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. En una realizacion particular, A es un fragmento inmunogenico de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP, en 15 donde PilA es la SEQ ID NO. 58.

PilA de H. influenzae cepa 86-028NP - SEQ ID NO. 58

20 En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de PilA que aproximadamente es al menos el 75 %, 80 %, 85

%, 90 %, 92 %, 95 %, 98 % o 99 % identico con la SEQ ID NO. 127. Mas especfficamente, en una realizacion, A es la SEQ ID NO. 127, un fragmento que consiste en los aminoacidos 40-149 de la SEQ ID NO. 58.

Aminoacidos 40-149 de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP - SEQ ID NO. 127.

T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI 25 TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ

En otra realizacion, A es un fragmento inmunogenico de PilA que consiste en los aminoacidos 40-149 de cualquiera de las SEQ ID NO. 58-SEQ ID NO. 121. En una realizacion adicional, A es un fragmento inmunogenico que es al menos el 95 % identico a los aminoacidos 40-149 de cualquiera de las SEQ ID NO. 58-SEQ ID NO. 121.

En una realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que Y se selecciona del grupo que 30 consiste en GG, SG y SS. En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que Y es GG o SG. En una realizacion particular, Y es GG.

En una realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que o es 1. En otra realizacion, o es 0.

En una realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que B es PilA de H. influenzae o un fragmento inmunogenico de PilA de H. influenzae, en el que A es la protefna E de H. influenzae o un fragmento 35 inmunogenico de la protefna E de H. influenzae. Por ejemplo, B es PilA de H. influenzae cepa 86-028NP. En otra realizacion, B es PilA de H. influenzae que tiene una secuencia de aminoacidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70,

SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77,

40 SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84,

SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91,

SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98,

SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, 45 SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID

NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 y SEQ ID NO. 121; o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO. 58 a la SEQ ID NO. 121. En otra realizacion, B es PilA, en la que PilA es aproximadamente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 % o 99 % identica a la SEQ ID NO. 58. En otra realizacion, B es PilA, en la que PilA es al menos el 95 %, 98 % o 99 % identica a cualquiera de las SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. En una realizacion 50 particular, B es PilA de la SEQ ID NO. 58.

En otra realizacion, B es PilA, en la que PilA es al menos el 95 %, 98 % o 99 % identica a cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO. 58 a la SEQ ID NO. 121, y A es PE, en la que PE es al menos el 95 %, 98 % o 99 % identica a cualquiera de las SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57.

En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que B es un fragmento inmunogenico 55 de PilA de H. influenzae, en el que A es un fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae. Por ejemplo, B es un fragmento inmunogenico de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP. En otra realizacion, B es un fragmento inmunogenico de PilA, en el que PilA es aproximadamente al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %

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identico a la SEQ ID NO: 58. En otra realizacion, B es un fragmento inmunogenico de PilA, en el que PilA tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO.

67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO.

74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO.

81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO.

88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO.

95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 y SEQ ID NO. 121; o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO. 58 a la SEQ ID NO. 121. En otra realizacion, B es un fragmento inmunogenico de PilA, en el que PilA es al menos el 95 %, 98 % o 99 % identico a cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO. 58 - SEQ ID No. 121. En una realizacion particular, B es un fragmento inmunogenico de PilA de H. influenzae, en el que PilA tiene la secuencia de aminoacidos que se establece en la SEQ ID NO. 58. En otra realizacion, B es un fragmento inmunogenico de PilA que consiste en los aminoacidos 40-149 de cualquiera de las SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Mas especfficamente, en una realizacion, B es el fragmento de PilA tal como se establece en la SEQ ID NO. 127. En una realizacion adicional, B es un fragmento inmunogenico al menos el 95 %, 98 % o 99 % identica a los aminoacidos 40-149 de cualquiera de las SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.

En una realizacion particular, B es el fragmento de PilA tal como se establece en la SEQ ID NO. 127, y A es un fragmento inmunogenico de la protefna E que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 y SEQ ID NO. 126. Mas particularmente, B es el fragmento de PilA tal como se establece en la SEQ ID NO. 127, y A es el fragmento de la protefna E tal como se establece en la SEQ ID NO. 124, aminoacidos 19-160 de la Protefna E de la SEQ ID NO. 4. En otra realizacion, B es el fragmento de PilA tal como se establece en la SEQ ID NO. 127, y A es el fragmento de la protefna E tal como se establece en la SEQ ID NO. 125.

En otra realizacion, B es un fragmento inmunogenico de PilA, en el que PilA es al menos el 95 % identico a cualquiera de las SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121, y A es un fragmento inmunogenico de la PE, en la que PE es al menos el 95 % identica a cualquiera de las SEQ ID nO. 4 - SEQ ID NO. 57.

En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que B es la protefna E de H. influenzae, en la que A es PilA de H. influenzae. Por ejemplo, B es la protefna E que tiene una secuencia de aminoacidos que se selecciona del grupo que consiste de la SeQ ID NO. 4, SEQ ID nO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO.

21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO.

28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO.

35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO.

49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO.

56 y SEQ ID NO. 57; o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO. 4 a la SEQ ID NO. 57. En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que B es la protefna E, en la que la protefna E es aproximadamente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia de aminoacidos de la protefna E que se establece en la SEQ ID NO: 4. En otra realizacion, B es la protefna E, en la que la protefna E es aproximadamente el 90 %, 95 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia de aminoacidos de la protefna E que se establece en la SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, B es la protefna E, en la que la protefna E es al menos el 95 % identica a la Protefna E tal como se establece en la SEQ ID NO. 4. En otra realizacion, B es la protefna E, en la que la protefna E es al menos el 95 % identica a cualquiera de las SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. En una realizacion particular, B es la protefna E que tiene la secuencia de aminoacidos que se establece en la SEQ ID NO. 4.

En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que B es un fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae, en el que A es un fragmento inmunogenico de la protefna PilA de H. influenzae. Por ejemplo, B es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en el que la Protefna E tiene una secuencia de aminoacidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO.

35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO.

56 y SEQ ID NO. 57; o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO. 4 a la SEQ ID NO. 57. En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que B es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en el que la protefna E es aproximadamente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % identica a la la secuencia de aminoacidos de la Protefna E que se establece en la SEQ ID NO. 4. En otra realizacion, B es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en el que la protefna E es aproximadamente del 90 % al 100 % identica a

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la secuencia de aminoacidos de la protefna E que se establece en la SEQ ID NO: 4. En una realizacion particular, B es un fragmento inmunogenico de la protefna E que tiene la secuencia de aminoacidos que se establece en la SEQ ID NO. 4. En una realizacion adicional, B es un fragmento inmunogenico de la protefna E, en el que la protefna E es al menos el 95 % identica a cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57.

En otra realizacion, B es un fragmento de la Protefna E de H. influenzae que se selecciona del grupo que consiste en los aminoacidos 17-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoacidos 18-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoacidos 19-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125) y los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126). En otra realizacion, B es un fragmento inmunogenico de la protefna E de H. influenzae que se selecciona del grupo que consiste en los aminoacidos 17-160 de la SEQ ID nO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoacidos 18-160 de la SeQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoacidos 19-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), los aminoacidos 20-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), los aminoacidos 23-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) y los aminoacidos 24-160 de la SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Mas especfficamente, en una realizacion, B es el fragmento de la protefna E tal como se establece en la SEQ ID NO. 123, aminoacidos 18-160 de la SEQ ID NO. 4.

En una realizacion particular, B es un fragmento inmunogenico de la protefna E tal como se establece en la SEQ ID NO. 123, aminoacidos 18-160 de la SEQ ID NO. 4, en el que A es un fragmento inmunogenico de la PilA tal como se establece en la SEQ ID NO. 127.

En una realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que p es 0. En otra realizacion, las protefnas de fusion de la Formula (I) se definen en las que p es 1.

En una realizacion, la protefna de fusion de la Formula (I) se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 136, SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 y SEQ ID NO. 204; o cualquier subconjunto de las mismas. En otra realizacion, la protefna de fusion de la Formula (I) es aproximadamente el 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 % o 98 % identica a cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO. 136, SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 o SEQ ID NO. 204.

En una realizacion, la protefna de fusion de la Formula (I) es la protefna de fusion de la SEQ ID NO.148, en la que el peptido senal se ha retirado, SEQ ID NO. 177 (QIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT

GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF

CGSVTQ).

En una realizacion, la protefna de fusion de la Formula (I) es la protefna de fusion de la SEQ ID NO.194, en la que el peptido senal se ha retirado, SEQ ID NO. 219 (IQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG

GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC

GSVTQ).

Conjugados de sacarido capsular de Streptococcus pneumoniae

La expresion sacarido capsular incluye los polisacaridos capsulares y oligosacaridos capsulares derivados del polisacarido capsular. Un oligosacarido contiene al menos 4 restos de azucares. Los terminos conjugado (sustantivo) y conjugado (adjetivo) se refieren a un sacarido capsular enlazado covalentemente a una protefna de vehfculo.

En una composicion inmunogenica, el numero total de serotipos de sacaridos opcionalmente es menor o igual que 23. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende menos de 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14 o 13 sacaridos de Streptococcus pneumoniae, comprendiendo opcionalmente la composicion inmunogenica 10-23 serotipos, 10-16 serotipos, 10-15 serotipos, 10-14 serotipos, 10-13 serotipos, o 10-12 serotipos.

En una realizacion, los conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae derivaran de los siguientes serotipos: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F, aunque se observa que uno o dos de otros serotipos podrfan sustituirse, dependiendo de la edad del receptor de la vacuna y de la localizacion geografica en donde se administrara la composicion inmunogenica. Por ejemplo, una composicion inmunogenica heptavalente (7-valente) puede comprender sacaridos provenientes de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. Una composicion inmunogenica decavalente (10-valente) puede ademas comprender sacaridos derivados de los serotipos 1, 5 y 7F. Una composicion inmunogenica dodecavalente (12-valente) puede

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comprender ademas sacaridos derivados de los serotipos 6A, 19A. Una composicion inmunogenica

pentadecavalente (15-valente) puede ademas comprender sacaridos derivados de los serotipos 22F y 33F.

Otros antfgenos sacaridos, por ejemplo el 23-valente (tal como los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F), tambien se contemplan en la presente invencion.

La expresion “protema de vehroulo” pretende abarcar tanto los pequenos peptidos como los polipeptidos grandes (>10 kDa). La protefna de vehfculo puede ser cualquier peptido o protefna. Puede comprender uno o mas epftopos de linfocitos T cooperadores. La protefna de vehfculo puede ser el toxoide tetanico (TT), el fragmento C del toxoide tetanico, mutantes no toxicas de la toxina tetanica [notese que todas estas variantes de la TT se consideran del mismo tipo de protefna de vehfculo para los propositos de la presente invencion], polipeptidos que comprenden epftopos de linfocitos T de la toxina tetanica, tales como el N19 (WO2006/067632), el toxoide difterico (DT), CRM197 (material 197 de reaccion cruzada), otras mutantes no toxicas de la toxina difterica [tales como CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida y col. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 y CRM107 (en los que CRM significa material de reaccion cruzada) y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle, en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleciones o mutaciones de Glu-148 a Asp, Gln o Ser, y/o Ala 158 a Gly, y otras mutaciones desveladas en la rlos documentos US 4709017 o US 4950740; la mutacion de al menos uno o mas restos Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones desveladas en los documentos US 5917017 o US 6455673; o fragmentos desvelados en el documento US 5843711] (notese que todas estas variantes de DT se considera que son el mismo tipo de protefna de vehfculo, para los propositos de la presente invencion), neumolisina neumococica (Kuo y col. (1995) Infect Immun 63; 2706-13), OMPC (protefna de membrana externa C de meningococo, normalmente extrafda de N. meningitidis serogrupo B -EP0372501), peptidos sinteticos (EP0378881, EP0427347), protefnas de choque termico (Publicaciones Internacionales de Patente WO 93/17712, WO 94/03208), protefnas de pertussis (WO 98/58668, EP0471177), citocinas, linfocinas, factores de crecimiento u hormonas (Publicacion Internacional de Patente WO 91/01146), protefnas artificiales que comprenden multiples epftopos de linfocitos T CD4+ humanas de diversos antfgenos derivados de patogenos (Falugi y col. (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824), tales como la protefna N19 (Baraldoi y col. (2004) Infect Immun 72; 4884-7), protefna de superficie neumococica PspA (WO 02/091998), protefnas de incorporacion de hierro (WO 01/72337), toxina A o toxina B de Clostridium difficile (WO 00/61761), protefna D de H. influenzae (EP594610 y WO 00/56360), PhtA neumococica (WO 98/18930, tambien referida como Sp36), PhtD neumococica (trfada de polihistidina D, desvelada en el documento WO 00/37105, tambien referida como Sp036D), PhtB neumococica (trfada de polihistidina B desvelada en el documento WO 00/37105, y tambien referida como Sp036B), o PhtE (trfada de polihistidina E, desvelada en el documento WO00/30299 y referida como BVH-3).

En una realizacion, los conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae se conjugan con una protefna de vehfculo seleccionada independientemente del grupo que consiste en toxoide tetanico (TT), fragmento C del TT, toxoide difterico, CRM197 (material de reaccion cruzada 197), neumolisina detoxificada, protefna D (de H. influenzae), PhtD, PhtDE (una protefna que contiene la trfada D de protefna polihistidina y trfada E de protefna polihistidina E), y N19. En una realizacion adicional, los conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae se conjugan independientemente con CRM197.

La expresion “conjugado con” en este contexto, significa que la protema esta enlazada de manera covalente a un sacarido; en esta situacion, la protefna esta actuando como protefna de vehfculo.

En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende al menos un conjugado de sacarido capsular de Streptococcus pneumoniae con la protefna D. En una realizacion, una minorfa de los sacaridos de Streptococcus pneumoniae conjugados, estan conjugados con la protema D, en donde el termino “minona” se refiere a menos de la mitad del numero total de sacaridos en la composicion que se esta conjugando con la protefna D. En una realizacion adicional, la composicion inmunogenica comprende entre 1-20, 1-18, 1-16, 1-14, 1-12, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 o 1-2 sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae conjugados con la protefna D. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende al menos un sacarido capsular de Streptococcus pneumoniae conjugado con el toxoide difterico. En otra realizacion, la composicion inmunogenica comprende 19F conjugada con el toxoide difterico. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende al menos un sacarido capsular de Streptococcus pneumoniae conjugado con el toxoide tetanico. En una realizacion adicional, la composicion inmunogenica comprende 18C conjugado con el toxoide tetanico.

En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado de serotipo 1, conjugado con la protefna D o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado de serotipo 4, conjugado con la protefna D o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado de serotipo 5, en el que el sacarido de serotipo 5 esta conjugado con la protefna D o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado de serotipo 6B, en el que el sacarido de serotipo 6B esta conjugado con la protefna D o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado de serotipo 7F, en el que el sacarido de serotipo 7F esta conjugado con la protefna D o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado de serotipo 9V, en el que el sacarido 9V esta conjugado con la protefna D o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado de serotipo 14, en el que el sacarido de serotipo 14 esta conjugado con la protefna D o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un

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sacarido conjugado de serotipo 18C, en el que el sacarido de serotipo 18C esta conjugado con el toxoide tetanico o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado 19F, en el que el sacarido de serotipo 19F esta conjugado con el toxoide difterico o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado 23F, en el que el sacarido de serotipo 23F esta conjugado con la protefna D o CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado 6A, conjugado con CRM197. En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido conjugado 19A, conjugado con CRM197.

En una realizacion, la composicion inmunogenica comprende un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 1, conjugado con la protefna D, un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 4 conjugado con la protefna D, un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 5, conjugado con la protefna D, un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 6B conjugado con la protefna D, un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 7F conjugado con la protefna D, un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 9V conjugado con la protefna D, un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 14 conjugado con la protefna D, un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 23F conjugado con la protefna D, un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 18c conjugado con el toxoide tetanico, y un sacarido de Streptococcus pneumoniae 19F conjugado con el toxoide difterico. En una realizacion, la composicion inmunogenica ademas comprende un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 6A conjugado con CRM197, y un sacarido de Streptococcus pneumoniae de serotipo 19A conjugado con CRM197.

Opcionalmente, la proporcion de protefna de vehfculo con respecto al sacarido de S. pneumoniae, esta entre 1:5 y 5:1; 1:2 y 2.5:1; 1:1 y 2:1 (p/p). En una realizacion, la mayorfa de los conjugados, por ejemplo 6, 7, 8, 9 o mas de los conjugados, tienen una proporcion de protefna de vehfculo con respecto al sacarido, que es mayor de 1:1, por ejemplo 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1 o 1.6:1.

En general, la composicion inmunogenica de la invencion puede comprender una dosis de cada conjugado de sacarido de entre 0,1 y 20 pg, entre 1 y 5 pg, entre 1 y 10 pg o entre 1 y 3 pg de sacarido.

En una realizacion, la composicion inmunogenica de la invencion contiene cada conjugado de sacarido capsular de S. pneumoniae a una dosis entre 0,1-20 pg; entre 0,5-10 pg; entre 0,5-5 pg o entre 1-3 pg de sacarido. En una realizacion, los sacaridos capsulares pueden estar presentes a diferentes dosis, por ejemplo algunos sacaridos capsulares pueden estar presentes a una dosis de exactamente 1 pg, o algunos sacaridos capsulares pueden estar presentes a una dosis de exactamente 3 pg. En una realizacion, los sacaridos de los serotipos 3, 18C y 19F (o 4, 18C y 19F), estan presentes a una dosis mayor que los demas sacaridos. En un aspecto de esta realizacion, los serotipos 3, 18C y 19F (o 4, 18C y 19F), estan presentes a una dosis de aproximada o exactamente 3 pg, mientras que los demas sacaridos en la composicion inmunogenica estan presentes a una dosis de aproximada o exactamente 1 pg. En una realizacion, los serotipos 1, 5, 6B, 7F, 9V, 14 y 23F, estan presentes a una dosis de aproximada o exactamente 1 pg.

El termino “sacarido” a lo largo de la presente memoria descriptiva, puede indicar un polisacarido o un oligosacarido, e incluye ambos. Los polisacaridos se afslan de bacterias, y su tamano se puede determinar en algun grado por procedimientos conocidos (veanse por ejemplo los documentos EP497524 y EP497525) y opcionalmente, por microfluidizacion. Se puede determinar el tamano de los polisacaridos con el fin de reducir la viscosidad en las muestras de polisacarido y/o para mejorar la filtrabilidad de los productos conjugados. Los oligosacaridos tienen un numero bajo de unidades repetidas (tfpicamente, 5-30 unidades repetidas), y normalmente son polisacaridos hidrolizados.

Los polisacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae comprenden unidades de oligosacarido repetidas, que pueden contener hasta 8 restos de azucar. Para una revision de las unidades de oligosacarido para los principales serotipos de Streptococcus pneumoniae, vease JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Cienc., Junio 2005, vol. 77, n.° 2, p. 293-324. ISSN 00013765. En una realizacion, un antfgeno de sacarido capsular puede ser un polisacarido de longitud completa, sin embargo, en otras puede ser una unidad de oligosacarido, o un sacarido mas corto que la longitud de la cadena natural de sacaridos de unidades de oligosacaridos repetidos. En una realizacion, la totalidad de los sacaridos presentes en la vacuna, son polisacaridos. Los polisacaridos de longitud completa pueden ser “de tamano ajustado”; es decir, su tamano se puede reducir mediante diversos procedimientos, tales como un tratamiento por hidrolisis acida, un tratamiento con peroxido de hidrogeno, regulacion de tamano por Emulsiflex®, seguido por un tratamiento con peroxido de hidrogeno para generar fragmentos oligosacaridos, o por microfluidizacion.

En una realizacion, la composicion inmunogenica ademas comprende sacaridos de S. penumoniae no conjugados de serotipos diferentes a los conjugados, de manera que el numero de serotipos de sacaridos conjugados y no conjugados, sea menor o igual que 23.

Conjugacion

Los conjugados sacaridos presentes en las composiciones inmunogenicas de la invencion, se pueden conjugar con una protefna de vehfculo utilizando cualquier tecnica de conjugacion.

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En una realizacion, el sacarido de Streptococcus pneumoniae se conjuga con la protefna de vehfculo mediante un ligando, por ejemplo un ligando bifuncional. El ligando opcionalmente es heterobifuncional u homobifuncional, teniendo por ejemplo un grupo amino reactivo y un grupo acido carboxflico reactivo, dos grupos amino reactivos o dos grupos acido carboxflico reactivos. El ligando, por ejemplo, tiene entre 4 y 20, entre 4 y l2, entre 5 y 10 atomos de carbono. Un posible ligando es una dihidrazida de acido adfpico (ADH). Otros ligandos incluyen el B- propionamido (wO 00/10599), nitrofeniletilamina (Gever y col. (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), haluros de haloalquilo (US4057685), ligandos glucosfdicos (US4673574, US4808700), hexadiamina y acido 6- aminocaproico (US4459286). En una realizacion, se utiliza ADH como ligando para conjugar el sacarido del serotipo 18C.

Los conjugados de sacaridos presentes en las composiciones inmunogenicas de la invencion, se pueden preparar mediante cualquier tecnica de acoplamiento conocida. El procedimiento de conjugacion se puede basar en la activacion del sacarido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP), para formar un ester de cianato. El sacarido activado, entonces, puede acoplarse directamente o a traves de un grupo separador (ligando), a un grupo amino de la protefna de vehfculo. Por ejemplo, el separador puede ser cistamina o cisteamina, para dar un polisacarido tiolado, el cual se puede acoplar con el vehfculo mediante un enlace tioeter obtenido despues de una reaccion con la protefna de vehfculo activada con maleimida (por ejemplo, utilizando GMBS), o una protefna de vehfculo haloacetilada (por ejemplo, utilizando yodoacetimida [por ejemplo, etil yodoacetimida HCl] o N-succinimidil bromoacetato o SIAB, o SIA, o SBAP). Opcionalmente, el ester de cianato (opcionalmente preparado por la qufmica de CDAP), se acopla con hexanodiamina o ADH, y el sacarido amino-derivado se conjuga con la protefna de vehfculo utilizando qufmica de carbodiimida (por ejemplo, EDAC o EDC), a traves de un grupo carboxilo en la protefna de vehfculo. Tales conjugados se describen en la Solicitud de Patente PCT publicada WO 93/15760, Uniformed Services University y en los documentos WO 95/08348 y WO 96/29094.

Otras tecnicas adecuadas utilizan carbodiimidas, carbiimidas, hidrazidas, esteres activos, norborano, acido p- nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muchos se describen en el documento WO 98/42721. La conjugacion puede involucrar un ligando carbonilo, el cual se puede formar mediante la reaccion de un grupo hidroxilo libre del sacarido, con CDI (Bethell y col. J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn y col. J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18), seguido por una reaccion con una protefna, para formar un enlace carbamato. Esto puede incluir la reduccion del termino anomerico hasta un grupo hidroxilo primario, la opcional proteccion/desproteccion del grupo hidroxilo primario, la reaccion del grupo hidroxilo primario con CDI para formar un intermediario CDI carbamato y el acoplamiento del CDI carbamato intermediario con un grupo amino en una protefna.

Los conjugados tambien se pueden preparar por procedimientos directos de aminacion reductiva, tal como se describe en los documentos US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson). Otros procedimientos se describen en los documentos EP-0-161-188, EP-208375 y EP-0-477508.

Un procedimiento adicional implica el acoplamiento de un derivado sacarido activado con bromuro de cianogeno (o CDAP) con dihidrazida del acido adfpico (ADH) a la protefna de vehfculo por condensacion de carbodiimida (Chu C. y col. Infect. Immunity, 1983 245 256), por ejemplo utilizando EDAC (clorhidrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida.

En una realizacion, un grupo hidroxilo (opcionalmente un grupo hidroxilo activado, por ejemplo un grupo hidroxilo activado para producir un ester de cianato [por ejemplo, utilizando CDAP]) en un sacarido, es ligado a un grupo amino o carboxflico en una protefna, ya sea de manera directa o indirecta (a traves de un ligando). Cuando hay presente un ligando, un grupo hidroxilo en un sacarido es opcionalmente ligado a un grupo amino en un ligando, por ejemplo utilizando la conjugacion CDAP. Otro grupo amino en el ligando, por ejemplo ADH, puede estar conjugado con un grupo de acido carboxflico en una protefna, por ejemplo utilizando la qufmica de la carbodiimida, por ejemplo usando EDAC. En una realizacion, el o los sacaridos capsulares neumococicos se conjugan con el primer ligando, antes de que el ligando sea conjugue con la protefna de vehfculo. Como alternativa, el ligando se puede conjugar con el vehfculo antes de la conjugacion con el sacarido.

Tambien se puede emplear una combinacion de tecnicas, con algunos conjugados sacarido-protefna que son preparados por CDAP, y algunos por aminacion reductiva.

En general, se pueden usar los siguientes tipos de grupos qufmicos en una protefna de vehfculo para el acoplamiento/conjugacion:

A) carboxilo (por ejemplo, por medio de acido aspartico o acido glutamico). En una realizacion, este grupo se liga a grupos amino en los sacaridos directamente o a un grupo amino en un ligando, con la qufmica de la carbodiimida, por ejemplo con EDAC.

B) Grupo amino (por ejemplo por medio de lisina). En una realizacion, este grupo se une a grupos carboxilo en los sacaridos directamente o a un grupo carboxilo en un ligando, con la qufmica de la carbodiimida, por ejemplo con EDAC. En otra realizacion, este grupo se une a grupos hidroxilo activados con CDAP o CNBr en sacaridos directamente, o a tales grupos en un ligando; a sacaridos o ligandos que tienen un grupo aldehfdo; a sacaridos o ligandos que tienen un grupo ester de succinimida.

C) Sulfhidrilo (por ejemplo por medio de cistefna). En una realizacion, este grupo se une a un sacarido

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bromoacetilado o cloroacetilado, o a un ligando, con la qufmica de la maleimida. En una realizacion, este grupo se activa/modifica con bis-diazobenzidina.

D) Grupo hidroxilo (por ejemplo por medio de tirosina). En una realizacion, este grupo se activa/modifica con bis- diazobenzidina.

E) Grupo imidazolilo (por ejemplo por medio de histidina). En una realizacion, este grupo se activa/modifica con bis-diazobenzidina.

F) Grupo guanidilo (por ejemplo por medio de arginina).

G) Grupo indolilo (por ejemplo, por medio de triptofano).

En un sacarido, se pueden usar en general los siguientes grupos para un acoplamiento: OH, COOH o NH2. Se pueden generar grupos aldehfdo despues de diferentes tratamientos conocidos en la tecnica, tales como: peryodato, hidrolisis acida, peroxido de hidrogeno, etcetera.

Estrategias de acoplamiento directo:

Sacarido-OH + CNBr o CDAP----> ester de cianato + NH2-Prot-------->conjugado

Sacarido-aldehfdo + NH2-Prot —> Base de Schiff + NaCNBH3------------->conjugado

Sacarido-COOH + NH2-Prot + EDAC —>conjugado

Sacarido-NH2 + COOH-Prot + EDAC —> conjugado

Estrategias de acoplamiento indirecto por medio de separador (ligando):

Sacarido-OH + CNBr o CDAP —> ester de cianato + NH2—NH2 —> Sacarido—NH2 + COOH-Prot + EDAC — -> conjugado

Sacarido-OH + CNBr o CDAP —> ester de cianato + NH2----SH —> Sacarido—SH + SH-Prot (protefna natural

con una cistefna expuesta u obtenida despues de una modificacion de los grupos amino de la protefna, por ejemplo por SPDP)----> Sacarido-S-S-Prot

Sacarido-OH + CNBr o CDAP —> ester de cianato + NH2—SH ----> Sacarido—SH + maleimida-Prot

(modificacion de grupos amino) —> conjugado

Sacarido-OH + CNBr o CDAP —> ester de cianato + NH2----SH —> Sacarido-SH + Prot haloacetilada—>

conjugado

Sacarido-COOH + EDAC + NH2----NH2 —> Sacarido-----NH2 + EDAC + COOH-Prot —> conjugado

Sacarido-COOH + EDAC + NH2—SH----> Sacarido—SH + SH-Prot (protefna natural con cistefna expuesta u

obtenida despues de una modificacion de los grupos amino de la protefna, por ejemplo por SPDP) ---->

Sacarido-S-S-Prot

Sacarido-COOH + EDAC + NH2—SH----> Sacarido—SH + maleimida-Prot (modificacion de grupos amino) —

> conjugado

Sacarido-COOH + EDAC + NH2—SH —> Sacarido-SH + Prot haloacetilada —> conjugado

Sacarido-aldehfdo + NH2----NH2 —> Sacarido—NH2 + EDAC + COOH-Prot —> conjugado

Nota: en vez del EDAC anterior, se puede utilizar cualquier carbodiimida adecuada.

En resumen, los tipos de grupos qufmicos de la protefna de vehfculo que en general se pueden usar para acoplarla con un sacarido, son grupos amino (por ejemplo, en restos de lisina); grupos COOH (por ejemplo en restos de acido aspartico y acido glutamico) y grupos SH (si son accesibles) (por ejemplo en restos de cistefna).

En una realizacion, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, o 23 sacaridos de S.pneumoniae se conjugan con una protefna de vehfculo mediante una aminacion reductiva. En una realizacion, menos de 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sacaridos de S.pneumoniae se conjugan con una protefna de vehfculo mediante una aminacion reductiva. En una realizacion, entre 1 y 23, 2 y 22, 3 y 21, 4 y 20, 5 y 19, 6 y 18, 7 y 17, 8 y 16, 9 y 15, 10 y 14, 11 y 13, 1 y 23, y 22, 1 y 21, 1 y 20, 1 y 19, 1 y 18, 1 y 17, 1 y 16, 1 y 15, 1 y 14, 1 y 13, 1 y 12, 1 y 11, 1 y 10, 1 y 9, 1 y 8, 1 y 7, 1 y 6, 1 y 5, 1 y 4, 1 y 3, o 1 o 2 sacaridos de S.pneumoniae se conjugan con una protefna de vehfculo mediante una aminacion reductiva. En una realizacion adicional, la totalidad de sacaridos capsulares de S.pneumoniae se conjugan con una protefna de vehfculo mediante una aminacion reductiva.

En una realizacion, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, o 23 sacaridos de S.pneumoniae se conjugan con una protefna de vehfculo mediante la qufmica CDAP. En una realizacion, menos de 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sacaridos de S.pneumoniae se

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conjugan con una protefna de vehfculo mediante la qufmica CDAP. En una realizacion, entre 1 y 23, 2 y 22, 3 y 21, 4 y 20, 5 y 19, 6 y 18, 7 y 17, 8 y 16, 9 y 15, 10 y 14, 11 y 13, 1 y 23, y 22, 1 y 21, 10 y 23, 10 y 22, 10 y 21, 10 y 20, 10 y 19, 10 y 18, 10 y 17, 10 y 16, 10 y 15, 10 y 14, 10 y 13, 10 y 12, 10 y 11, 1 y 20, 1 y 19, 1 y 18, 1 y 17, 1 y 16, 1 y 15, 1 y 14, 1 y 13, 1 y 12, 1 y 11, 1 y 10, 1 y 9, 1 y 8, 1 y 7, 1 y 6, 1 y 5, 1 y 4, 1 y 3, o 1 o 2 sacaridos de S.pneumoniae son conjugados con una protefna de vehfculo mediante la qufmica CDAP. En otra realizacion, la totalidad de los sacaridos capsulares de S. pneumoniae se conjugan con una protefna de vehfculo mediante la qufmica CDAP.

En una realizacion, la composicion inmunogenica de la presente invencion comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 sacaridos conjugados con una protefna de vehfculo mediante una aminacion reductiva y comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,

0 22 sacaridos conjugados con una protefna de vehfculo mediante una qufmica diferente de la aminacion reductiva, por ejemplo la qufmica CDAP.

En una realizacion, los sacaridos capsulares de al menos uno de los serotipos que se seleccionan del grupo que consiste en los serotipos 1, 3, 19A y 19F, se conjugan mediante una qufmica diferente de la aminacion reductiva, y al menos uno de los serotipos que se seleccionan del grupo que consiste en los serotipos 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 9V, 14, 18C y 23F, se conjugan mediante una aminacion reductiva. En una realizacion, la composicion inmunogenica de la presente invencion comprende uno o mas sacaridos capsulares de S. pneumoniae del serotipo 1 o 3 o 19A o 19F;

1 y 3; 1 y 19A; 1 y 19F; 3 y 19A; 3 y 19F; 19A y 19F; 1, 3 y 19A; 1, 3 y 19F, 1, 19A y 19F; 3, 19A y 19F o 1, 3, 19A y 19F, conjugados con una protefna de vehfculo mediante una qufmica diferente de la aminacion reductiva. En una realizacion, el 19F se conjuga con una protefna de vehfculo mediante una qufmica diferente de la aminacion reductiva. En una realizacion, la composicion inmunogenica de la invencion comprende un sacarido capsular de S. pneumoniae del serotipo 1 o 3 o 19A o 19F; 1 y 3; 1 y 19A; 1 y 19F; 3 y 19A; 3 y 19F; 19A y 19F; 1, 3 y 19A; 1, 3 y 19F, 1, 19A y 19F; 3, 19A y 19F o 1, 3, 19A y 19F, conjugados con una protefna de vehfculo mediante una qufmica de cianilacion, tal como la qufmica CDAP. En una realizacion, el 19F se conjuga con una protefna de vehfculo mediante la qufmica CDAP. En una realizacion de la invencion, los siguientes sacaridos capsulares de S. pneumoniae estan conjugados con una protefna de vehfculo mediante una aminacion reductiva; serotipo 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C o 23F, 4 y 5, 4 y 6A, 4 y 6B, 4 y 7F, 4 y 9V, 4 y 14, 4 y 18C, 4 y 23F, 5 y 6A, 5 y 6B, 5 y 7F, 5 y 9V, 5 y 14, 5 y 18C, 5 y 23F, 6A y 6B, 6A y 7F, 6A y 9V, 6A y 14, 6A y 18C, 6A y 23F, 6B y 7F, 6B y 9V, 6B y 14, 6B y 18C, 6B y 23F, 7F y 9V, 7F y 14, 7F y 18C, 7F y 23F, 9V y 14, 9V y 18C, 9V y 23F, 14 y 18C, 14 y 23F o 18C y 23F. En una realizacion, el serotipo 23F se conjuga con una protefna de vehfculo mediante la qufmica de la aminacion reductiva.

Protefna de Streptococcus pneumoniae conjugada o no conjugada

Las composiciones inmunogenicas de la invencion, pueden comprender al menos una protefna de S. pneumoniae conjugada o no conjugada. En una realizacion, la al menos una protefna de S. pneumoniae conjugada o no conjugada, se selecciona del grupo que consiste en la familia trfada de polihistidina (PhtX), neumolisina detoxificada (dPly), Familia de protefnas de union a colina (CbpX), CbpX truncadas, familia LytX (enzimas autolfticas), LytX truncadas, Protefnas quimericas CbpX truncada-LytX truncada, PcpA (Protefna A de union a colina neumococica), PspA (Protefna A de superficie neumococica), PsaA (Protefna A adhesina de superficie neumococica), Sp128, Sp101 (Streptococcus pneumoniae 101), Sp130 (Streptococcus pneumoniae 130), SP125 (Streptococcus pneumoniae 125) y SP133 (Streptococcus pneumoniae 133).

La familia Pht (trfada de polihistidina) comprende la familia de protefnas PhtA, PhtB, PhtD, y PhtE. Notese que la familia Pht puede citarse como la familia de trfada de polihistidina o la familia de trfada de histidina neumococica; por lo tanto, los terminos “tnada de polihistidina” y “tnada de histidina neumococica”, se pueden considerar intercambiables. La familia esta caracterizada por una secuencia de lipidacion, dos dominios separados por una region rica en prolina y varias trfadas de histidina, posiblemente involucradas en la union a metales o nucleosidos, o en la actividad enzimatica, regiones (3-5) de superhelice, un extremo N-terminal conservado y un extremo C-terminal heterogeneo. Esto esta presente en todas las cepas de neumococos probadas. Tambien se han encontrado protefnas homologas en otros estreptococos y neiserias. En una realizacion de la invencion, la protefna Pht de la invencion es la PhtD. Sin embargo, debe entenderse que los terminos PhtA, PhtB, PhtD y PhtE, se refieren a protefnas que tienen secuencias descritas en las citas de las referencias que se encuentran mas adelante, asf como variantes de origen natural (y hechas por el hombre) de las mismas, que tienen una homologfa de secuencia que es al menos el 90 % identica con las protefnas referidas. Opcionalmente, tiene una identidad de al menos el 95 %, o una identidad de al menos el 97 %.

Con respecto a las protefnas PhtX, la PhtA se desvela en el documento WO 98/18930, y tambien se cita como Sp36. Tal como se indico anteriormente, es una protefna proveniente de la familia PhT y tiene el motivo de senal tipo II de LXXC. La PhtD se desvela en el documento WO 00/37105, y tambien se cita como Sp036D. Tal como se indico anteriormente, tambien es una protefna proveniente de la familia Pht y tiene un motivo de senal tipo II de LXXC. En una realizacion, el termino “PhtD” se refiere a la SEQ ID NO: 220. La PhtB se desvela en el documento WO 00/37105, y tambien se cita como Sp036B. Otro miembro de la familia PhtB, es el polipeptido de degradacion C3, tal como se desvela en el documento WO 00/17370. Esta protefna tambien proviene de la familia Pht y tiene el motivo de senal tipo II de LXXC. Por ejemplo, un equivalente inmunologicamente funcional es la protefna Sp42 desvelada

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en el documento WO 98/18930. Una PhtB truncada (de aproximadamente 79 kD) se desvela en el documento WO99/15675, la cual tambien se considera como miembro de la familia Pht. La PhtE se desvela en el documento WO00/39299, y se cita como BVH-3. Cuando se hace referencia a cualquier protefna Pht en el presente documento, esto significa que se pueden usar fragmentos inmunogenicos o fusiones de la misma. Por ejemplo, una referencia a la PhtX incluye los fragmentos inmunogenicos o fusiones de la misma, a partir de cualquier protefna Pht. Una referencia a la PhtD o PhtB, no excluye a la PhtDE (una protefna de fusion que comprende la PhtD y la PhtE), o la PhtBE (una protefna de fusion que comprende la PhtB y la PhtE), respectivamente, tal como se encuentra, por ejemplo, en el documento WO0198334.

En una realizacion, la al menos una protefna de Streptococcus pneumoniae conjugada o no conjugada, comprende al menos una protefna de la familia de la trfada de polihistidina (por ejemplo, la protefna se puede seleccionar del grupo que consiste de la protefna PhtD, y las protefnas de fusion PhtBD PhtDE). En unaa realizacion adicional, la al menos una protefna de Streptococcus pneumoniae conjugada o no conjugada, es una protefna PhtD. En una realizacion adicional, la protefna PhtD comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoacidos del 21-838 de la secuencia ID No.4 del documento WO00/37105.

En una realizacion, la al menos una protefna de Streptococcus pneumoniae conjugada o no conjugada, es la neumolisina detoxificada (dPly). En una realizacion, la neumolisina se ha detoxificado qufmicamente. En una realizacion adicional, la neumolisina se ha detoxificado qufmicamente. En otra realizacion mas, la neumolisina se ha detoxificado tanto qufmica como geneticamente.

En una realizacion adicional, la composicion inmunogenica de la invencion comprende neumolisina detoxificada (dPly) y PhtD. En una realizacion adicional, la composicion inmunogenica de la invencion comprende una neumolisina detoxificada no conjugada (dPly) y una PhtD no conjugada.

Con respecto a la familia de protefnas de union a colina (CbpX), los miembros de esa familia se identificaron originalmente como protefnas neumococicas que se podfan purificar mediante cromatograffa de afinidad a colina. Las protefnas de union a colina se enlazan de manera no covalente a restos de fosforilcolina del acido teicoico de la pared celular y el acido lipoteicoico asociado a la membrana. Estructuralmente, tienen varias regiones en comun sobre toda la familia, aunque la naturaleza exacta de las protefnas (la secuencia de aminoacidos, su longitud, etc.) puede variar. En general, las protefnas de union a colina comprenden una region N-terminal (N), regiones repetidas conservadas (R1 y/o R2), una region rica en prolina (P) y una region de union a colina conservada (C), conformada por multiples repeticiones, que comprende aproximadamente la mitad de la protefna. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresion “familia de protemas de union a colina (CbpX)” incluye protemas provenientes del grupo que consiste en las protefnas de union a la colina tal como se identifican en el documento WO97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD y CbpG. La CbpA se desvela en el documento WO97/41151. La CbpD y la CbpG se desvelan en el documento wO00/29434. La PspC se desvela en el documento WO97/09994. La PbcA se desvela en el documento WO98/21337. La SpsA es una protefna de union a colina desvelada en el documento WO 98/39450. Opcionalmente, las protefnas de union a colina se seleccionan del grupo que consiste en CbpA, PbcA, SpsA y PspC.

Una realizacion de la invencion comprende CbpX truncadas, en las que “CbpX” se definio anteriormente, y “truncado” se refiere a las protemas CbpX que carecen del 50 % o mas de la region de union a la colina (C). Opcionalmente, tales protefnas carecen por completo de la region de union a colina. Opcionalmente, la protefna truncada carece de: (i) la region de union a colina y (ii) una porcion de la mitad N-terminal de la protefna, pero aun reteniendo al menos una region repetida (R1 o R2). Opcionalmente, la truncada retiene 2 regiones repetidas (R1 y R2). Ejemplos de tales realizaciones son la NR1xR2 y R1xR2, tal como se ilustra en los documentos WO99/51266 o WO99/51188; sin embargo, otras protefnas de union a colina que carecen de una region de union a colina similar, tambien se contemplan dentro del alcance de la presente invencion.

La familia de LytX son protefnas asociadas a la membrana, relacionadas con la lisis celular. El dominio N-terminal comprende los dominios de union a la colina. Sin embargo, la familia LytX no tiene todas las caracterfsticas halladas en la familia CbpX anteriormente mencionada. Para la presente invencion, la familia LytX se considera distinta de la familia CbpX. En contraste con la familia CbpX, el dominio C-terminal de la familia LytX contiene el dominio catalftico de la protefna LytX. La familia comprende LytA, LytB y LytC. Con respecto a la familia LytX, la LytA se desvela en Ronda y col., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). La LytB se desvela en el documento WO 98/18930, y tambien se cita como Sp46. La LytC tambien se desvela en el documento WO 98/18930, y tambien se cita como Sp91. Una realizacion de la invencion comprende LytC.

Otra realizacion comprende LytX truncada, en la que “LytX” se definio anteriormente, y “truncado” se refiere a protefnas LytX que carecen del 50 % o mas de la region de union a colina. Opcionalmente, tales protefnas carecen por completo de la region de union a colina. Otra realizacion mas de la invencion, comprende protefnas quimericas CbpX truncada-LytX truncada, o protefnas de fusion. Opcionalmente, la protefna de fusion comprende NR1xR2 (o R1xR2) de CbpX y la porcion C-terminal (Cterm, es decir, la protefna sin los dominios de union a colina) de la LytX (por ejemplo, LytCCterm o Sp91Cterm). Opcionalmente, la CbpX se selecciona del grupo que consiste en CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Opcionalmente, es la CbpA. Opcionalmente, la LytX es la LytC (tambien citada como Sp91).

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Otra realizacion de la presente invencion, es la PspA o PsaA truncada que carece del dominio de union a la colina (C) y es expresada como una protefna de fusion con LytX. Opcionalmente, LytX es la LytC.

Con respecto a la PsaA y PspA, ambas se tratan en la tecnica. Por ejemplo, la PsaA y las variantes por delecion transmembrana de la misma, se han sido descrito por Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12):5255-62. La PspA y las variantes por delecion transmembranal de la misma, se han descrito, por ejemplo, en los documentos US 5804193; WO 92/14488, y WO 99/53940.

Con respecto a la PcpA, esta protefna se ha descrito en la tecnica. Por ejemplo la PcpA se ha descrito en el documento WO2011/075823. El termino “PcpA” se refiere a una protema que comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 o 7 del documento WO2011/075823, o fragmentos de al menos 100, 150, 200, 25 o mas aminoacidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2 o 7 del documento WO2011/075823.

La Sp128 y Sp130 se desvelan en el documento WO00/76540. La Sp125 es un ejemplo de una protefna de superficie neumococica, con un motivo anclado a la pared celular de LPXTG (en la que X es cualquier aminoacido). Se ha descubierto que las protefnas de esta clase de protefnas de superficie neumococica con este motivo son utiles en el contexto de la presente invencion, y por lo tanto se considera como una protefna adicional de la invencion. La propia Sp125 se desvela en el documento WO 98/18930, y tambien es conocida como ZmpB -que es una metaloproteinasa de zinc. La Sp101 se desvela en el documento WO 98/06734 (en el que tiene la referencia n.° y85993). Esta caracterizada por una secuencia de senal de tipo I. La Sp133 se desvela en el documento WO 98/06734 (en el que tiene la referencia n.° y85992). Tambien se caracteriza por una secuencia de senal de tipo I.

Cualquiera de estas protefnas adicionales de S. pneumoniae puede estar presente en forma conjugada o no conjugada. Una o mas protefnas de S. pneumoniae opcionalmente estan conjugadas con un sacarido de S. pneumoniae (descrito en la seccion anterior titulada conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae). Opcionalmente, una o mas protefnas de S. pneumoniae estan conjugadas con un sacarido de una bacteria diferente.

La expresion “conjugado con” en el presente contexto, significa que la protema esta enlazada covalentemente a un sacarido, en esta situacion, la protefna actua como protefna de vehfculo.

En una realizacion, la al menos una protefna de S. pneumoniae adicional conjugada o no conjugada, comprende una protefna de la familia polihistidina (PhtX), que se selecciona del grupo que consiste en PhtB, PhtE, PhtA, PhtBD y PhtDE.

Adyuvantes

En una realizacion, la composicion inmunogenica ademas comprende un adyuvante.

Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio (por ejemplo, aluminofosfato o hidroxido de aluminio), monofosforil lfpido A (por ejemplo, 3D-MPL), saponinas (por ejemplo, QS21), emulsiones de aceite en agua, vesfculas o preparaciones de vesfculas de membrana externa de cepas de bacterias Gram negativas (tales como aquellas ensenadas en el documento WO02/09746), lfpido A o derivados del mismo, alquilglucosamida fosfatos, o combinaciones de dos o mas de estos adyuvantes. En una realizacion, el adyuvante es fosfato de aluminio. En otra realizacion, el adyuvante comprende 100-750, 150-600, 200-500, 250-450, 300-400, o alrededor de 350 pg de aluminio en forma de fosfato de aluminio, por dosis humana.

Vacunas

La presente invencion proporciona una vacuna que comprende las composiciones inmunogenicas de la invencion. Las realizaciones del presente documento referentes a “composiciones inmunogenicas” de la invencion, tambien son aplicables a realizaciones que se refieren a “vacunas” de la invencion, y viceversa. En una realizacion, la vacuna comprende la composicion inmunogenica de la presente invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Las vacunas de la presente invencion se pueden administrar por cualquier via de administracion adecuada, tal como la via intradermica, mucosal, por ejemplo intranasal; oral, intramuscular o subcutanea. Otras vfas de administracion son conocidas en la tecnica. La preparacion de la vacuna generalmente se describe en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York).

En un aspecto, la composicion inmunogenica de la presente invencion se administra por via intramuscular. La administracion intramuscular puede ser en el muslo o en el brazo. La inyeccion tfpicamente es a traves de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodermica), pero tambien se puede usar, de manera alternativa, una inyeccion sin aguja. Una dosis intramuscular tfpica es de 0,5 ml.

Otro aspecto de la invencion, es un procedimiento para producir una vacuna de la invencion que comprende los pasos de mezclar protefna de S. pneumoniae no conjugada con la composicion adyuvante.

En un aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento para inmunizar a un sujeto frente a enfermedades

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causadas por infecciones por Streptococcus pneumoniae, que comprende administrate al sujeto una dosis terapeuticamente eficaz de la composicion inmunogenica o vacuna de la invencion. En otro aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento para inmunizar a un sujeto frente a enfermedades causadas por infecciones por Haemophilus influenzae, que comprende administrarle al sujeto una dosis terapeuticamente eficaz de la composicion inmunogenica o vacuna de la invencion. En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para inmunizar a un sujeto frente a enfermedades causadas por Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae, que comprende administrarle al sujeto una dosis terapeuticamente eficaz de la composicion inmunogenica o vacuna de la invencion. En una realizacion, las enfermedades comprenden al menos una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en neumonfa, enfermedad neumococica invasiva (ENI), exacerbaciones de la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), otitis media, meningitis, bacteriemia, y conjuntivitis. En una realizacion, el sujeto es un sujeto mamffero. En una realizacion adicional, el sujeto mamffero se selecciona del grupo que consiste en un raton, una cobaya y un ser humano. En una realizacion, el sujeto es un ser humano adulto, opcionalmente un ser humano anciano. En otra realizacion, el sujeto es un ser humano lactante.

En un aspecto adicional de la invencion, se proporciona una composicion inmunogenica o vacuna de la invencion, para su uso en el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infecciones por Streptococcus pneumoniae. En un aspecto adicional de la invencion, se proporciona una composicion inmunogenica o vacuna de la invencion, para su uso en el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por Haemophilus influenzae. En una realizacion adicional, se proporciona una composicion inmunogenica o vacuna de la invencion para su uso en el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infecciones por Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae. En una realizacion, el uso comprende la administracion de la composicion inmunogenica a un hospedador humano, opcionalmente un hospedador humano anciano. En una realizacion adicional, el uso comprende la administracion de la composicion inmunogenica a un hospedador lactante. En una realizacion adicional, las enfermedades comprenden al menos una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en neumonfa, enfermedad neumococica invasiva (ENI), exacerbaciones de la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), otitis media, meningitis, bacteriemia, y conjuntivitis.

En un aspecto adicional de la invencion, se proporciona el uso de la composicion inmunogenica o vacuna de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infecciones por Streptococcus pneumoniae. En un aspecto adicional de la invencion se proporciona el uso de la composicion inmunogenica o vacuna de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infecciones por Haemophilus influenzae. En una realizacion adicional, se proporciona el uso de la composicion inmunogenica o vacuna de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infecciones por Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae. En una realizacion, las enfermedades comprenden al menos una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en neumonfa, enfermedad neumococica invasiva (ENI), exacerbaciones de la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), otitis media, meningitis, bacteriemia, y conjuntivitis.

En una realizacion, el uso comprende la administracion de la composicion inmunogenica o vacuna de la invencion a un hospedador que se selecciona del grupo que consiste en un hospedador humano adulto, un hospedador humano anciano y un hospedador humano lactante.

Las protefnas de fusion de la Formula (I) y los conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, son utiles como inmunogenos en sujetos tales como mamfferos, particularmente seres humanos. En particular, las protefnas de fusion de la Formula (I) y los conjugados de sacarido capsular de Streptococcus pneumoniae, son utiles para introducir una respuesta inmunitaria frente a H. influenzae en sujetos, particularmente en seres humanos. Adicionalmente, las protefnas de fusion de la Formula (I) y los conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, son utiles para inducir una respuesta inmunitaria frente a Streptococcus pneumoniae en sujetos, particularmente en seres humanos. Mas especfficamente, las protefnas de fusion de la Formula (I) son utiles en el tratamiento o prevencion de la otitis media y/o EAEPOC y/o neumonfa.

En una realizacion, la invencion proporciona adicionalmente un procedimiento para el tratamiento o prevencion de la otitis media, en un sujeto que lo necesite, comprendiendo dicho procedimiento la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion inmunogenica que comprende las protefnas de fusion de la Formula (I) y conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, tal como se describen en el presente documento. En otra realizacion, la invencion proporciona un procedimiento para el tratamiento o prevencion de exacerbaciones agudas de la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EAEPOC) en un sujeto que lo necesite, en el que el procedimiento comprende la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion inmunogenica que comprende las protefnas de fusion de la Formula (I) y conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, tal como se describen en el presente documento.

En una realizacion adicional, la invencion proporciona un procedimiento para el tratamiento o prevencion de la neumonfa en un sujeto que lo necesite, en el que el procedimiento comprende la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion inmunogenica que comprende las protefnas de fusion de la Formula (I) y conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, tal como se describen en el presente documento.

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En una realizacion adicional, la invencion proporciona un procedimiento para el tratamiento o prevencion de una infeccion por H. influenzae o una enfermedad en un sujeto que lo necesite, en el que el procedimiento comprende la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion inmunogenica que comprende las protefnas de fusion de la Formula (I) y conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, tal como se describen en el presente documento.

En una realizacion adicional, la invencion proporciona un procedimiento para el tratamiento o prevencion de una infeccion o enfermedad por S. pneumoniae en un sujeto que lo necesite, en el que el procedimiento comprende la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion inmunogenica que comprende las protefnas de fusion de la Formula (I) y conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, tal como se describen en el presente documento.

Otras definiciones

A menos que se explique o se defina de otra manera en el presente documento, todos los terminos tecnicos y cientfficos empleados en el presente documento tienen el mismo significado que comunmente entienden los expertos en la materia a la cual pertenece la presente divulgacion. Por ejemplo, las definiciones de los terminos comunes en biologfa molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew y col. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Los terminos singulares “un”, “una” y “la” o “el”, incluyen sus respectivos plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De modo similar, la palabra “o” incluye “y”, a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Ademas debe entenderse que todos los tamanos de bases o aminoacidos y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para acidos nucleicos o polipeptidos, son aproximados, y se proporcionan con fines descriptivos. Adicionalmente, las limitaciones numericas dadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, tal como un antfgeno, pueden ser aproximadas. Por lo tanto, cuando una concentracion se indica que (por ejemplo) es de aproximadamente 200 pg, debe entenderse que la concentracion incluye valores ligeramente mayores o ligeramente menores que (“aproximadamente” o “~”) 200 pg.

Aunque se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, en la practica o prueba de la presente divulgacion, se describen los procedimientos y materiales adecuados a continuacion.

El termino “comprende” significa “incluye”. Asf pues, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra “comprende” y variaciones tales como “comprenden” y “que comprende”, debera entenderse que implican la inclusion de un compuesto o composicion establecido (por ejemplo, un acido nucleico, polipeptido, antfgeno) o una etapa establecida, o un grupo de compuestos o etapas, pero no la exclusion de ningun otro compuesto, composicion, etapa o grupos de los mismos. La abreviatura “e.g.” se deriva del latm exempli gratia, y se utiliza en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. Por lo tanto, la abreviatura “e.g.” es sinonimo del termino “por ejemplo”.

El termino “sujeto” tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un mamffero, incluyendo seres humanos, primates no humanos, y animales no primates, tales como miembros del genero de roedores (incluyendo, pero no limitandose a ratones y ratas) y miembros del orden Lagomorpha (incluyendo, pero no limitandose a conejos).

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “adyuvante” significa un compuesto o sustancia que, cuando se administra a un sujeto en conjunto con una vacuna, composicion inmunoterapeutica, u otra composicion que contiene un antfgeno o inmunogeno, aumenta o intensifica la respuesta inmunitaria del sujeto frente al antfgeno o inmunogeno administrado (en comparacion con la respuesta inmunitaria que se obtendrfa en ausencia del adyuvante). Esto debe distinguirse de la “terapia adyuvante”, la cual se define por el Instituto Nacional del Cancer de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, en el contexto del tratamiento de cancer como un tratamiento adicional que se administra despues del primer tratamiento para reducir el riesgo de recurrencia del cancer.

Las sustituciones conservadoras son conocidas y generalmente consideradas como las matrices de definicion tfpicas en los programas de alineacion de secuencias por ordenador. Estos programas incluyen el PAM250 (Dayhoft M.O. y col., (1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, En “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, y Blosum 62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matrices from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919. La invencion ademas proporciona protefnas de fusion de la Formula (I) que contienen sustituciones conservadoras de aminoacidos. Por ejemplo, las protefnas de fusion de la Formula (I) pueden contener una sustitucion conservadora de cualquier aminoacido de las protefnas PE o PilA de H. influenzae, tal como se describe en cualquiera de las secuencias establecidas en el presente documento (por ejemplo, cualquier secuencia de PE establecida en la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57 y/o cualquier secuencia de PilA establecida en la SEQ ID

NO. 58 - SEQ ID NO. 121).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion “peptido de senal” se refiere a un polipeptido corto (menor de 60 aminoacidos, por ejemplo de 3-60 aminoacidos), presente en protefnas precursoras (tfpicamente, en el extremo N-terminal), y que normalmente esta ausente en la protefna madura. El peptido de senal (ps) tfpicamente es 5 rico en aminoacidos hidrofobicos. El peptido de senal dirige el transporte y/o la secrecion de la protefna traducida a traves de la membrana. Los peptidos de senal tambien se pueden denominar como senales de direccionamiento, peptidos de transito, senales de localizacion, o secuencias de senal. Por ejemplo, la secuencia de senal puede ser un peptido de senal cotraduccional o postraduccional.

Un peptido de senal heterologo se puede desprender de una construccion de protefna de fusion, mediante 10 peptidasas de peptido de senal, durante o despues del transporte o la secrecion de la protefna. Por ejemplo, la

peptidasa de peptido de senal es la peptidasa de peptido de senal I. Un peptido de senal “heterologo” es aquel que no esta asociado con la protefna como se da en la naturaleza.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “tratamiento” significa prevenir que ocurran smtomas del trastorno o enfermedad en un sujeto, prevenir la recurrencia de los smtomas del trastorno o enfermedad en un 15 sujeto, retrasar la recurrencia de los sfntomas del trastorno o enfermedad en un sujeto, disminuir la gravedad o

frecuencia de los sfntomas del trastorno o enfermedad en un sujeto, hacer mas lento o eliminar el progreso del trastorno o enfermedad y eliminar parcial o totalmente los sfntomas de dicho trastorno o enfermedad en un sujeto.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “opcionalmente” significa que el o los eventos descritos posteriormente pueden o no ocurrir, e incluye tanto eventos que ocurren como eventos que no ocurren.

20 Todas las referencias o solicitudes de patente citadas en la presente memoria descriptiva de la patente se incorporan como referencia en el presente documento.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “lactante”, se refiere a un ser humano de 0 a 2 anos de edad.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “adulto”, se refiere a un ser humano mayor de 18 anos de 25 edad.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “anciano”, se refiere a un ser humano mayor de 60 anos de edad, opcionalmente mayor de 65 anos de edad.

Ejemplos

En los Ejemplos, los siguientes terminos tienen el significado designado:

30 6xhis = seis histidinas;

xg = fuerza centrffuga (numero de gravedades);

ATP = adenosfn trifosfato;

ABC = acido bicinconfnico;

BSA = albumina serica bovina;

35 °C = grados Celsius;

CaCl2 = cloruro de calcio;

VC = volumen de columna;

ADN = acido desoxirribonucleico;

CDB = calorimetrfa diferencial de barrido;

40 DTT = ditiotreitol;

dNTP = trifosfato de desoxinucleosido;

AEDT = acido etilendiaminotetraacetico;

FT = caudal;

HCl = cloruro de hidrogeno;

45 His = his = histidina;

HEPES = acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetansulfonico;

IMAC = cromatograffa de afinidad con metal inmovilizado;

IPTG = isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosido;

KCl = cloruro de potasio;

50 K2HPO4 = fosfato dibasico de potasio;

KH2PO4 = fosfato monobasico de potasio;

DSL = dodecilsulfato de litio; l = litro;

MES = acido 2-(N-morfolino)etansulfonico;

55 MgCl2 = cloruro de magnesio; ml = mililitro;

rpm = revoluciones por minuto;

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min. = minuto; mM = milimolar;

|j| = microlitro;

NaCI = cloruro de sodio;

Na2HPO4 = fosfato dibasico de sodio;

NaH2PO4 = fosfato monobasico de sodio; ng = nanogramo; nm = nanometro;

U/N = durante una noche;

PBS = solucion salina tamponada con fosfato;

PCR = reaccion en cadena de la polimerasa;

SB = tampon de la muestra; seg = segundo; p/v = peso/volumen

PS = polisacarido, y se puede utilizar indistintamente con el termino “sacarido”.

1. Ejemplos

Ejemplo 1: protefnas de fusion

Se produjeron protefnas de fusion con diferentes peptidos de senal y secuencias de ligando de aminoacidos. Estas protefnas de fusion permitieron la secrecion tanto de la protefna E como de la protefna PilA (o fragmentos de las mismas), sin estar restringidos a una sola cepa bacteriana. La protefna de fusion se libero al periplasma despues de la retirada del peptido de senal heterologo, mediante una peptidasa de peptido de senal. La protefna de fusion purificada de la bacteria no contiene el peptido de senal heterologo. Las protemas “purificadas” se retiran de la bacteria y carecen del peptido de senal.

La siguiente tabla describe las construcciones de protefnas de fusion preparadas.

Tabla 3: Construcciones de protefna de fusion que contienen PilA y protefna E

ID de la construccion

N-terminal

-C-Terminal

A.A

LVL312: flgI E Fragmento PilA GG fragmento ProtE GGHHHHHH

: sp (A.A.: 40-149 de la SEQ ID (A.A.: 18 al 160 de la SEQ ID NO. 4,



: NO. 58, SEQ ID NO. 127) SEQ ID NO.123)

1 19

21

130

133

275 276 283

A.A.

LVL291: pelB sp Fragmento Prot E G Fragmento PilA GGHHHH



: G HH


: (A.A.: 19 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID (A.A.: 40-149 de la SEQ ID


: NO. 124) NO. 58, SEQ ID NO. 127)

1 22 23

164

167

276 277 284

A.A.

LVL268: pelB sp D Fragmento Prot E G Fragmento PilA GGHHHH




: G HH



: (A.A.: 20 al 160 de la SEQ ID NO. 4, (A.A.: 40-149 de la SEQ ID



: SEQ ID NO. 125) NO. 58, SEQ ID NO. 127)

22 24

164 167

276 277 284

LVL269

NadA sp: ATN Fragmento Prot E GG Fragmento PilA

GGHHHH

1

: DDD (A.A.: 22 al 160 de la SEQ ID NO. 4, (A.A.: 40-149 de la HH


: SEQ ID NO. 126) SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)

A.A. 1 23 24-29 30 168 171 280 281 288

LVL270: MH Fragmento Prot E G Fragmento PilA

: HH G

: HH (A.A.: 17 al 160 de la SEQ ID NO. 4, (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO.

: H SEQ ID NO. 122) 58, SEQ ID NO. 127)

A.A. 1 7 8 151 154 263

LVL315: pelB M Fragmento Prot E G Fragmento PilA GGHHHHHH


: D G

: sp (A.A.: 22 al 160 de la SEQ ID NO. 4, (A.A.: 40-149 de la



: SEQ ID NO. 126) SEQ ID NO. 58, SEQ





: ID NO. 127)

: 1 22 25 163 166 275 276 283

LVL317: pelB sp Fragmento Prot E G Fragmento PilA




: G


: (A.A.: 19 al 160 de la SEQ ID NO. 4 (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58,


: SEQ ID NO. 124) SEQ ID NO. 127)

A.A.: 1 22 23 164 167 276

LVL318: pelB sp M Fragmento Prot E G Fragmento PilA


: D G



: (A.A.: 22 al 160 de la SEQ ID NO. 4, (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ



: SEQ ID NO. 126) ID NO. 127)

A.A.: 1 22 25 163 166 275

LVL702: pelB sp Fragmento Prot E G Fragmento PilA GGHHHHHH




: G


: (A.A.: 20 al 160 de la SEQ ID NO. 4, (A.A.: 40-149 de la SEQ


: SEQ ID NO. 125) ID NO. 58, SEQ ID NO





: 127)

A.A.: 22 23 163 166 275 283

LVL736: pelB sp Fragmento Prot E GG Fragmento PilA GG








: HH


: (A.A.: 17 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. HH


: ID NO. 122) 58, SEQ ID NO. 127) HH

A.A.: 22 23 166 169 278 286

LVL737: pelB sp Fragmento Prot E G G Fragmento PilA GGH


: (A.A.: 18 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO.123) (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) HHH



: HH

A.A.: 1 22 23 165 168 277 285

LVL738: pelB sp Fragmento Prot E (A.A.: 22 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 126) G G Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) GGHHHHHH

A.A. 1: 22 23 161 164 273 281

LVL739: pelB sp Fragmento Prot E GG Fragmento PilA GGHHHHHH


: (A.A.: 23 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 179) (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)

A.A. 1 22 23 160 163 272 280

LVL740: pelB sp Fragmento Prot E GG Fragmento PilA GGHHHHHH


: (A.A.: 24 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 180) (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)

A.A.: 22 23 159 162 271 279

LVL735: pelB sp Fragmento Prot E (A.A.: 20 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 125) G G Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)

A.A.: 1 22 23 163 166 275

LVL778: pelB sp Fragmento Prot E (A.A.: 17 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 122) G G Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)

A.A. 1: 22 23 166 169 278

LVL779: pelB sp Fragmento Prot E (A.A.: 18 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO.123) G G Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)

A.A. 1: 22 23 165 168 277

5

10

15

20

25

LVL780: pelB sp Fragmento Prot E (A.A.: 22 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 126) G G Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)

A.A. 1 22 23 161 164 273

LVL781: pelB sp Fragmento Prot E (A.A.: 23 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 179) G G Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)

A.A.: 1 22 23 160 163 272

LVL782: pelB sp Fragmento Prot E (A.A.: 24 al 160 de la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 180) G G Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)

A.A. 1 22 23 159 162 271

ps = peptido de senal; A.A. = aminoacido

Las secuencias de ADN y de aminoacidos para cada uno de los peptidos de senal y plasmidos listados en la Tabla 3, se listan a continuacion.

SECUENCIAS DE SENAL:

peptido de senal pelB (ADN) - SEQ ID NO. 129:

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcc

peptido de senal pelB (aminoacido) - SEQ ID NO. 130.

MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MA

peptido de senal FlgI (ADN) - SEQ ID NO. 131: atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggct

peptido de senal FlgI (aminoacido) - SEQ ID NO. 132:

MIKFLSALIL LLVTTAAQA

peptido de senal NadA (ADN) - SEQ ID NO. 133:

atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggca

peptido de senal NadA (aminoacido) - SEQ ID NO. 134:

MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALA

SECUENCIAS DE CONSTRUCCION DE PROTEINAS DE FUSION:

La porcion simple no subrayada de las secuencias de aminoacidos, proviene de la protefna PilA de Haemophilus influenzae cepa 86-028NP. La porcion subrayada en letra negrilla de la secuencia de aminoacidos, se derivo de la protefna E de Haemophilus influenzae cepa 772.

LVL312 (ADN) - SEQ ID NO. 135:

atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggctgagactaaaaaagcagcggtatct

gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgta

cgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacg

gtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacag

gtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaagg

cggcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatata

cgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacatttt

gatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataaga

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

tcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagc

acctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcga

actatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggccaccaccaccaccaccactaa

LVL312 (proteins): (flgl sp)(E)(PilA aa 40-149)(GG)(ProtE aa 18-160)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 136

MIKFLSALIL: LLVTTAAQAE TKKAAVSELL QASAPYKADV ELCVYSTNET

TNCTGGKNGl: AADITTAKGY VKSVTTSNGA ITVKGDGTLA NMEYILQATG

NAATGVTWTT: T CKGTDASLF PANFCGSVT Q GGAQIQKAEQ NDVKLAPPTD

VRSGYIRLVK: NVNYYIDSES IWVDNQEPQI VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK

RYARSVRQYK: ___ILNCANYHLT QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT

PDTTLYNAAQ: IICANYGEAF SVDKKGGHHH HHH

LVL291 (ADN) - SEQ ID NO. 137:

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcccagattcagaag

gctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaat

tattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagat

aagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatca

tttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaa

catacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagt

tgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtgg

aattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccaca

gcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaat

atggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcc

tctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa

LVL291 (proteins) (pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 138

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQP A MAQIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIR LVKN

VNYYIDSESI: WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI

LNCANYHLTQ: VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI

ICANYGEAFS: VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT

GGKNGIAADI: TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLAN MEY I L Q AT G N AAT

GVTWTTTCKG TDASLFPAN F CGSVTQGGHH HHHH LVL268 (ADN) - SEQ ID NO. 139:

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgatattcagaagg

ctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaatt

attacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagat

tttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaa

tgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtgg

aattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccaca

gcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaat

atggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcc

tctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac

LVL268 (proteins): (pelB sp)(D)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 140:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MADIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN

VNYYIDSESI: WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI

LNCANYHLTQ: VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI

ICANYGEAFS: VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT

GGKNGIAADI: TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLAN MEY I L Q AT G N AAT

GVTWTTTCKG TDASLFPAN F CGSVT QGGHH HHHH LVL269 (ADN) - SEQ ID NO. 141:

atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggcagccacaaac

gacgacgataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggt

aaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgca

gtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaa

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ttgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaa

aaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatg

gtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgcctt

ataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcag

cagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatg

gcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaa

aggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccacta

a

LVL269 (proteins): (nadA sp)(ATNDDD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa 40-

149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO.142

MKHFPSKVLT: TAILATFCSG ALAATNDDDK AEQNDVKLAP PTDVRSGYIR

LVKNVNYYID: SESIWVDNQE PQIVHFDAVV NLDKGLYVYP EPKRYARSVR

QYKILNCANY: HLTQVRTDFY DEFWGQGLR A APKKQKKHTL SLTPDTTLYN

AAQIICANYG: EAFSVDKKGG TKKAAVSELL QASAPYKADV ELCVYSTNET

TNCT GGKNGI: AADITTAKGY VKSVTTSNGA ITVKGDGTLA NMEYILQATG

NAATGVTWTT TCKGTDASLF PANFCGSVTQ GGHHHHHH

LVL270 (ADN) - SEQ ID NO. 143:

atgcaccaccaccaccaccacagcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgact

gatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataacca

agagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgc

acgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttg

gggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttata

atgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggt

atctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaac

tgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagca

acggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaa

caggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacaca

ataa

LVL270 (proteins): (MHHHHHH)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa 40-149) - SEQ ID NO.

1 44:

M H H H H H H S AQ: IQKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD

NQEPQIVHFD: AVVN LDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT

DFYDEFWGQG: LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQ IICA NYGEAFSVDK

KGGTKKAAVS: ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK NGIAADITT A

KGYVKSVTTS: NGAITVKGDG TLANMEYILQ AT GNAAT GVT WTTTCKGTDA

SLFPANFCGS VTQ LVL315 (ADN) - SEQ ID NO. 145:

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccatggataaggctg

aacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattatta

catcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataag

ggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcattta

actcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacat

acgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttga

taaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaatt

atgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaa

aaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatgga

atatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttat

ttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa

LVL315 (proteins): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 146:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQP A MAMDKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV

NYYIDSESIW: VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL

NCANYHLTQV: RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII

CANYGEAFSV: DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCT G

GKNGIAADIT: TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG

VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH LVL317 (ADN) - SEQ ID NO. 147:

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcccagattcagaag

gctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaat

tttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaa

tgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtgg

aattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccaca

gcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaat

atggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcc

tctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa

LVL317 (proteins): (pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa 40-149) - SEQ ID NO. 148:

: MKYLLPTAAA GLLLLAAQP A MAQIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN

: VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI

15: LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI

: ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT

: GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLAN MEY ILQATGNAAT

GVTWTTTCKG TDASLFPAN FCGSVTQ

LVL318 (ADN) - SEQ ID NO. 149:

20 atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccatggataaggctg

aacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattatta catcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataag ggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcattta actcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacat 25 acgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttga

taaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaatt atgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaa aaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatgga atatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttat 30 ttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa

LVL318 (proteins): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa 40-149) - SEQ ID NO.

150:

: MKYLLPTAAA GLLLLAAQP A MAMDKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV

: NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL

35: NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQ11

: CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCT G

: GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG

VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ LVL702 (ADN) - SEQ ID NO. 181:

40 atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccattcagaaggctgaacaaaa

tgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatc gatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagccta aacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaatttt ggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgc

45 tcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgca

agcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggt attgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatg gcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacg gatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac

50 LVL702 (proteins): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 182:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MAIQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW

VDNQEPQIVH: FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG

QGLRAAPKKQ: KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP

YKADVELCVY: STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI

55 LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH

LVL736 (ADN) - SEQ ID NO. 183:

10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccagcgcccagattcagaaggctgaacaaa

atgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggt

ggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgtt

cgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcaccta

aaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttg

ataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcaca

aatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagca

acggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggaca

acaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac

LVL736 (proteins): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 184:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MASAQIQKAE QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV KNVNYYIDSE

SIWVDNQEPQ: IVHFDAVVNL DKGLYVYPEP KRYARSVRQY KILNCANYHL TQVRTDFYDE

FWGQGLRAAP: KKQKKHTLSL TPDTTLYNAA QIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA

SAPYKADVEL: CVYSTNETTN CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT VKGDGTLANM

EYILQATGNA ATGVTWTTTC KGTDASLFPA NFCGSVTQGG HHHHHH

LVL737 (ADN) - SEQ ID NO. 185:

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgcccagattcagaaggctgaacaaaatg

atgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtgga

taaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtc

agtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaa

agcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgata

aaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaat

gaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacg

gtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaaca

acttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac

LVL737 (proteins): (pelB sp)(ProtE ss 18-160)(GG)(PilA ss 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 186:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK

NVNYYIDSES: IWVDNQEPQI VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK

ILNCANYHLT: QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ

IICANYGEAF: SVDKKGGTKK AAVSELLQAS APYKADVELC VYSTNETTNC

TGGKNGIAAD: ITT AKGYVKS VTTSNGAITV KGDGTLANME YILQATGNAA

TGVTWTTTCK GTDASLFPAN FCGSVTQGGH HHHHH

LVL738 (ADN) - SEQ ID NO. 187:

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggc

accgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagcc

acaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttg

aattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaac

atacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcac

taaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaact

gtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagta

aaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaa

cggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac

LVL738 (proteins): (pelB sp)(ProtE ss 22-160)(GG)(PilA ss 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 188:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD

NQEPQIVHFD: AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG

LRAAPKKQKK: HTLSLTPDTT LYNAAQIICA NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK

ADVELCVYST: NETTNCTGGK NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ

ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQGGHHHHH H LVL739 (ADN) - SEQ ID NO. 189:

stgssstscctgctgccgsccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccsgccggcgstggccgctgsscsssst

gstgtgssgctggcsccgccgsctgstgtscgssgcggstststscgtttggtsssgsstgtgssttsttscstcgsts

gtgsstcgstctgggtggstssccssgsgccscsssttgtscsttttgstgcsgtggtgsstttsgstssgggsttgtst

gtttstcctgsgcctssscgttstgcscgttctgttcgtcsgtstssgstcttgssttgtgcsssttstcstttssctcssgts

cgssctgstttctstgstgssttttggggscsgggtttgcgggcsgcscctsssssgcssssgssscstscgttssgtt

tsscscctgstscsscgctttstsstgctgctcsgsttstttgtgcgssctstggtgssgcsttttcsgttgstssssssg

gcggcsctssssssgcsgcggtstctgssttsctgcssgcgtcsgcgccttstssggctgstgtggssttstgtgtsts

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

tagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctat

gtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatatttt

gcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagc

aaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac

LVL739 (protefna): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 190:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL APPTDVRSGY I R LVKN VN YY

IDSESIWVDN: QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA

NYHLTQVRTD: FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN

YGEAFSVDKK: GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN ETTNCTGGKN

GIAADITTAK: GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQA TGNAAT GVTW

TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQGGHHHHHH

LVL740 (ADN) - SEQ ID NO. 191:

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgcc

gactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaatt

gtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtg

caaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgtt

aagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaa

aagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgg

gtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaagg

ggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatg

cctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac

LVL740 (protefna): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 192:

M KYLLPT AAA: GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI

DSESIWVDNQ: EPQIVHFDAV VNLDKGLYVY PEPKRYARSV RQYKILNCAN

YHLTQVRTDF: YDEFWGQGLR AAPKKQKKHT LSLTPDTTLY NAAQIICANY

GEAFSVDKKG: GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE TTNCTGGKNG

IAADITT AKG: YVKSVTTSNG AITVKGDGTL ANMEYILQAT GNAATGVTWT

TTCKGTDASL: FPANFCGSVT QGGHHHHHH

LVL735 (ADN) - SEQ ID NO. 193:

atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccattcagaaggctg

aacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattatta

catcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataag

actcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacat

taaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaatt

atgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaa

aaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatgga

ttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa

LVL735 (protefna): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa 40-149) - SEQ ID NO. 194:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQP A MAIQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV

NYYIDSESIW: VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL

NCANYHLTQV: RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII

CANYGEAFSV: DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCT G

GKNGIAADIT: TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAAT G

VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ LVL778 (ADN) - SEQ ID NO. 195:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

LVL778 (proteins): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa 40-149) - SEQ ID NO. 196:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MASAQIQKAE QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV KNVNYYIDSE

SIWVDNQEPQ: IVHFDAVVNL DKGLYVYPEP KRYARSVRQY KILNCANYHL TQVRTDFYDE

FWGQGLRAAP: KKQKKHTLSL TPDTTLYNAA QIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA

SAPYKADVEL: CVYSTNETTN CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT VKGDGTLANM

EYILQATGNA ATGVTWTTTC KGTDASLFPA NFCGSVTQ

LVL779 (ADN) - SEQ ID NO. 197:

acttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa

LVL779 (protefna): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa 40-149) - SEQ ID NO. 198:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES

IWVDNQEPQI: VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK ILNCANYHLT QVRTDFYDEF

WGQGLRAAPK: KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ IICANYGEAF SVDKKGGTKK AAVSELLQAS

APYKADVELC: VYSTNETTNC TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITV KGDGTLANME

YILQATGNAA TGVTWTTTCK GTDASLFPAN FCGSVTQ

LVL780 (ADN) - SEQ ID NO. 199:

cggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa

LVL780 (protefna): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa 40-149) - SEQ ID NO. 200:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIR LVKNVNY

YIDSESIWVD: NQEPQIVHFD AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC

ANYHLTQVRT: DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA

NYGEAFSVDK: KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK

NGIAADITT A: KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ AT GNAATGVT

WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQ LVL781 (ADN) - SEQ ID NO. 201:

Atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgctgaacaaaatgatgtgaagctggcacc

gccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccaca

aattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaatt

gtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacata

cgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaa

aaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtac

gggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaa

ggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacgg

atgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa

LVL781 (protefna): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa 40-149) - SEQ ID NO. 202:

MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH__TLSLTPDTTI__YNAAQIICAN YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE___LLQASAPYKA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DVELCVYSTN ETTNCTGGKN GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQA TGNAATGVTW TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQ

LVL782 (ADN) - SEQ ID NO. 203:

cctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa

LVL782 (proteins): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa 40-149) - SEQ ID NO. 204:

MKYLLPTAAA: GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI DSESIWVDNQ

EPQIVHFDAV: VNLDKGLYVY PEPKRYARSV RQYKILNCAN YHLTQVRTDF YDEFWGQGLR

AAPKKQKKHT: LSLTPDTTLY NAAQIICANY GEAFSVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD

VELCVYSTNE: TTNCTGGKNG IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL ANMEYILQAT

GNAATGVTWT TTCKGTDASL FPANFCGSVT Q

La secuencia de longitud completa para las protefnas PE y PilA a partir de las cuales se obtuvieron las secuencias anteriores, se establecen en la SEQ ID NO: 4 (para la protefna PE) y en la SEQ ID NO: 58 (para la protefna PilA), respectivamente.

Ejemplo 2: Construccion y transformacion de vectores

Se disenaron los cebadores para amplificacion de PE de H. influenzae cepa 772, basandose en la secuencia de H. influenzae cepa Hi Rd. La secuencia del cebador 5' contiene una diferencia de nucleotidos, en comparacion con la secuencia de NTHi 772, introduciendo una diferencia de aminoacidos en la posicion 24, cuando se compara con la secuencia genomica de NTHi 772 reportada en la actualidad. El aminoacido n.° 24 en la construccion de protefna de fusion es E (acido glutamico) en vez de K (lisina), tal como se encuentra en la NTHi 772.

Secuencia de ADN para PE de H. influenzae cepa Rd - SEQ ID NO: 151

atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttaccgcttgttctgctcaaatccaaaaggctgaacaaaatgat

gtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtg

aatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgctgtggtgaatttagataggggattgtatgttt

atcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagattttgaattgtgcaaattatcatttaactcaaatacga

actgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaa

cacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcaaattatggtaaagcattttcagttgataaaaaataa

Secuencia de Protefna para la PE de H. influenzae cepa Rd. - SEQ ID NO. 152

MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDRGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQIRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGKAFSVDKK

Secuencia de ADN de PE de H. influenzae cepa 772 (tal como se establece en: Microbes & Infection, Corrigendum to “Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells” [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponible en internet Julio 6, 2010, “Art'iculo en prensa’’)) - SEQ ID NO. 153

atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttactgcctgttctgctcaaatccaaaaggctaaacaaaatgatgtgaagctggcaccgcc

aagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaa

Secuencia de Protefna para la PE de H. influenzae cepa 772 (tal como se establece en: Microbes & Infection, Corrigendum to “Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells” [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponible en internet Julio 6, 2010, “Art'iculo en prensa”)) - SEQ ID NO. 154

MKKI ILTLSL GLLT ACSAQI QKAKQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Construction del vector:

Para generar LVL312, LVL291, LVL268, LVL269, LVL270, LVL702, LVL735, LVL778, LVL779, LVL780, LVL781 y LVL782, se produjo una preparacion de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) de los siguientes componentes (los componentes especfficos se ejemplifican posteriormente): se formularon 36,6 pl de agua desionizada, 5 pl de amortiguador n.° 1 10X, 5 pl de dNTPs 2 mM, 2 pl de MgCl2 25 mM, 0,4 pl del cebador n.° 1 (50 pM), 0,4 pl del cebador n.° 2 (50 pM), 0,5 pl del molde (100 ng/pl) y 0,4 pl de KOD HiFi ADN polimerasa 2,5 unidades/pl (NOVAGEN®). La reaccion en cadena de la polimerasa incluyo 25 ciclos de 15 segundos de desnaturalizacion a 98 °C, 2 segundos de apareamiento a 55 °C y 20 segundos de extension del cebador a 72 °C. Los productos de la PCR se purificaron con un paquete de purificacion de PCR QIAQUICK® (QIAGEN®). Este producto se empleo en las condiciones recomendadas por el fabricante, las cuales eran: la adicion de 5 volumenes de tampon PB, proporcionado en el paquete de purificacion por PCR QIAQUICK®, a 1 volumen de la preparacion de PCR. La preparacion de PCR con PB amortiguador, posteriormente, se mezclo en un vortex. Una columna QIAQUICK® se coloco en un tubo recolector de 2 ml. Para unir el ADN a la preparacion de PCR en la columna, la muestra mezclada se aplico a la columna QIAQUICK® y se centrifugo durante 30-60 segundos a 14.000 rpm. El flujo a traves de la columna se desecho, y la columna QIAQUICK® se puso de nuevo en el mismo tubo. Para lavar el ADN unido, se agregaron 0,75 mL de tampon PE, proporcionado en el paquete de purificacion por PCR de QIAQUICK®, a la columna QIAQUICK® y esta se centrifugo durante 30-60 segundos a 14.000 rpm. El flujo a traves de la columna se desecho y dicha columna QIAQUICK® se coloco nuevamente en el mismo tubo. La columna QIAQUICK® se centrifugo otra vez en el tubo recolector de 2 ml durante 1 minuto, para remover el tampon de lavado residual. Cada columna QIAQUICK® se coloco en un tubo limpio de microcentrffuga de 1,5 ml. Para eluir el ADN, se anadieron 33 pl de agua al centro de la membrana QIAQUICK® y la columna se centrifugo durante 1 minuto a 14.000 rpm. Las enzimas de restriccion y el tampon relacionado se obtuvieron de New England BioLabs. Por ejemplo, aproximadamente 5 pl del vector pET26b (100 ng/pl), 2 pl de NEBuffer 2 (New England Biolabs, 1X NEBuffer 2: 50 mM NaCl, Tris-HCl 10 mM, MgCh 10 mM, ditriotreitol 1 mM, pH 7,9 a 25 °C), 1 pl de la enzima de restriccion Ndel (20.000 unidades/ml), 1 pl de HindIII (20.000 unidades/ml) y 11 pl de agua desionizada se mezclaron y se incubaron durante dos horas a 37 °C para la digestion del ADN. Despues, se llevo a cabo una segunda etapa de purificacion utilizando el paquete de purificacion PCR QIAQUICK® (QIAGEN®), utilizando el procedimiento anteriormente descrito.

El ligamiento se realizo utilizando la T4 ADN ligasa Quick y tampon de reaccion de ligamiento Quick de New England BioLabs. Por ejemplo, aproximadamente 10 ng del vector y 30 ng del inserto en 10 pl de agua desionizada, se mezclaron con 10 pl de tampon de reaccion de ligamiento Quick 2X (New England BioLabs, Tris-HCl 132 mM, MgCh 20 mM, ditiotreitol 2 mM, ATP 2 mM, polietilenglicol al 15 %, pH 7,6, a 25 °C) y 1 pl de T4 ADN ligasa Quick (New England BioLabs). La reaccion enzimatica se incubo durante 5 minutos a temperatura ambiente, antes de la transformacion.

Para generar LVL315, LVL317, LVL318, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 y LVL740, se produjo una preparacion de PCR de los siguientes componentes: se formularon 40 pl de agua desionizada, 5 pl de tampon de reaccion 10X, 1 pl de mezcla dNTPs, 1 pl del cebador n.° 1 (10 pM), 1 pl del cebador n.° 2 (10 pM), 1 pl del molde (25 ng/pl) y 1 pl de ADN polimerasa de alta fidelidad PfuUltra, 2,5 unidades/pl (paquete de mutagenesis dirigida al sitio QuikChange II, Agilent Technologies, Stratagene Division). La reaccion en cadena de la polimerasa incluyo un ciclo de desnaturalizacion a 95 °C durante 30 segundos; 18 ciclos de 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, 1 minunto de apareamiento a 55 °C y 5 minutos, 30 segundos de extension del cebador a 68 °C. Los productos de la PCR se sometieron a digestion con 1 pl de la enzima de restriccion DpnI, a 37 °C durante una hora, antes de la transformacion.

En la Tabla 4 se presenta una lista detallada de las secuencias de los cebadores de PCR utilizados para las amplificaciones.

Para generar el plasmido pRIT16711, el fragmento genico PE que codifica los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO: 4, que excluye la secuencia codificadora de su senal de secrecion correspondiente, se amplifico por PCR a partir de ADN genomico de NTHi cepa 772. Los cebadores de amplificacion se disenaron en base a la secuencia de la cepa Hi Rd disponible (en ese momento, la secuencia de la cepa 772 era desconocida). La secuencia del cebador 5' contiene una mutacion comparada con la secuencia de NTHi 772 (secuencia en la actualidad ya disponible), introduciendo una diferencia de aminoacido en la secuencia codificadora de PE en la posicion 24, acido glutamico (E) en vez de lisina (K). Despues de la amplificacion, el inserto se clono en el vector de expresion pET-26(+) (NOVAGEN®), empleando los sitios de restriccion BamHI y XhoI.

Para generar el plasmido pRIT16671, un fragmento de ADN que codificaba para un fragmento genico de PilA (de los aminoacidos 40-149 de la SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 127), que excluye su peptido lfder, asf como una porcion de la helice alfa hidrofobica predicha, se amplifico a partir de ADN genomico de NTHi cepa 86-

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028NP y se clono en el vector de expresion pET15. El vector pRIT16790 (que contenfa los aminoacidos 40149 de NTHi cepa 86-028NP), se utilizo como molde para generar el vector pRIT16671. El fragmento genico PilA se amplifico por PCR utilizando un vector pRIT16790 y los cebadores MDES PILA-3 y MDES PILA-4. El fragmento PilA se clono en el vector de expresion pET-26, utilizando los sitios de restriccion NdeI/XhoI. La secuencia de ADN codificadora de seis histidinas (his) se incorporo en el cebador 5', para agregar seis histidinas (6xhis) en el extremo N-terminal de la secuencia PilA (MDES PILA-3).

Para generar LVL312 (peptido de senal Flg/-E-fragmento PilA-GG-fragmento PE-GGHHHHHH), se realizo una reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoacidos 40-149/cepa 86-028NP), utilizando el vector pRIT16671 como molde y los cebadores CAN534 y CAN537. Se incorporo la secuencia de ADN que corresponde al peptido de senal Flg/ (ps) y al aminoacido acido glutamico (E), en el cebador 5' (CAN534). Para ligar la secuencia PilA a la secuencia PE, se incorporo ADN de la secuencia que corresponde a los dos aminoacidos glicina (GG) de ligando y los aminoacidos de PE N-terminal en el cebador 3' (CAN537). Se realizo otra reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoacidos 18-160) utilizando el vector pRIT16711 como plantilla y los cebadores CAN536 y CAN538. Se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos PilA C-terminales y los aminoacidos GG en el cebador 5', para ligar la secuencia PilA a la PE (CAN536). La secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos GG ligandos y los aminoacidos 6xhis, se incorporo en el cebador 3' (CAN538). Finalmente, para generar el LVL312, se llevo a cabo una tercera reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar los genes PilA y PE en fusion con el peptido de senal Flg/, en el extremo N-terminal se incorporo un aminoacido acido glutamico (E) entre Flg/ y PilA, un ligando GG entre las secuencias PilA y PE, y un ligando GG entre PE y los aminoacidos 6xhis en el extremo C-terminal. Para lograr esta amplificacion, los productos de las dos reacciones en cadena catalizadas con polimerasa anteriormente descritas, se utilizaron como molde con los cebadores CAN534 y CAN538. Se incorporo ADN de la secuencia que correspondfa al sitio de restriccion Ndel en el cebador 5' y se incorporo el sitio de restriccion HindIII en el extremo 3'. El producto de la RCP generado, entonces, se inserto en el vector de clonacion pET-26b(+) (NOVAGEN®).

Para generar LVL291 (peptido de senal pelB-fragmento PE-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), se llevo a cabo una reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoacidos 19-160), utilizando el vector pRIT16711 como molde y los cebadores CAN544 y CAN546. Se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos del peptido de senal (ps) pelB en el cebador 5' (CAN544). Para ligar la secuencia PilA a la secuencia PE, el ADN que correspondfa a los aminoacidos del ligando GG y los aminoacidos del extremo N-terminal de PilA, se incorporaron en el cebador 3' (CAN546). Se llevo a cabo otra reaccion en cadena de la polimerasa, para amplificar el gen PilA (aminoacidos 40-149 de la SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 127), utilizando el vector pRIT16671 como molde, con los cebadores CAN545 y CAN535. La secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos del extremo C-terminal de PE y los aminoacidos GG se incorporaron en el cebador 5' (CAN545), para ligar la secuencia PilA con la secuencia PE. La secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos GG del ligando y los aminoacidos 6xhis se incorporarn en el cebador 3' (CAN535). Finalmente, para generar LVL291, se llevo a cabo una tercera reaccion en cadena de la polimerasa, para amplificar los genes PE y PilA en fusion con el peptido de senal pelB, en el extremo N- terminal se incorporo el ligando GG entre las secuencias PE y PilA y un ligando GG entre PilA y los aminoacidos 6xhis, en el extremo C-terminal. Para lograr esta amplificacion, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa anteriormente descritas, se utilizaron como molde con los cebadores CAN544 y CAN535. La secuencia de ADN que correspondfa al sitio de restriccion NdeI se incorporo en el extremo 5', y el sitio de restriccion HindIII se incorporo en el extremo 3'. El producto de la PCR generado, entonces, se inserto en el vector de clonacion pET-26b(+) (NOVAGEN®).

Para generar LVL268 (peptido de senal pelB-D-fragmento PE-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), se llevo a cabo una reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoacidos del 20 al 160) utilizando el vector pRIT16711 como molde, con los cebadores CAN547 y CAN546. Se inserto la secuencia de ADN que correspondfa al peptido de senal pelB (ps) y el aminoacido acido aspartico (D) en el cebador 5' (CAN547). Para ligar la secuencia PilA a la secuencia PE, se incorporo ADN de la secuencia que correspondfa a los aminoacidos ligando GG y los aminoacidos del extremo N-terminal de PilA, en el cebador 3' (CAN546). Se realizo otra reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoacidos 40-149/cepa NTHi 86-208NP), utilizando el vector pRIT16671 como molde, con CAN545 y CAN535. Se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos del extremo C-terminal de PE y los aminoacidos GG en el cebador 5' (CAN545), para ligar la secuencia PilA a la secuencia PE. Se incorporo ADN de la secuencia que correspondfa a los aminoacidos del ligando GG y los aminoacidos 6xhis en el cebador 3' (CAN535). Finalmente, para generar LVL268, se llevo a cabo una tercera reaccion en cadena de la polimerasa, para amplificar los genes PE y PilA en fusion con el peptido de senal pelB, en el extremo N-terminal se inserto el aminoacido D entre el peptido de senal pelB y PE, un ligando GG entre las secuencias PE y PilA, y un ligando GG entre PilA y los aminoacidos 6xhis, en el extremo C-terminal. Para lograr esta amplificacion, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa anteriormente descritas, se utilizaron como molde con los cebadores CAN547 y CAN535. La secuencia de ADN que correspondfa al sitio de restriccion NdeI se incorporo en el cebador 5' y el sitio de restriccion HindIII se incorporo en el cebador 3'. El producto de la PCR generado, entonces, se inserto en el vector de clonacion pET-26b(+) (NOVAGEN®).

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Para generar LVL269 (peptido de serial NadA-fragmento ATNDDD-PEGG-fragmento PilA-GG-6xhis), se realizo una reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO. 4), utilizando el vector pRIT16711 como molde, con los cebadores CAN548 y CAN546. Se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa al peptido de serial pelB (ps) y los aminoacidos ATNDDD en el cebador 5' (CAN548). Para ligar la secuencia PilA a la secuencia PE, se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos del ligando GG y los aminoacidos del extremo N-terminal de PilA en el cebador 3' (CAN546). Se llevo a cabo otra reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoacidos 40-149 de la SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127), utilizando el vector pRIT16671 como molde, con los cebadores CAN545 y CAN535. La secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos del extremo C-terminal de PE y los aminoacidos GG, se incorporaron en el cebador 5' para ligar la sec uencia PilA a la secuencia PE (CAN545). Se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos del ligando GG y los aminoacidos 6xhis en el cebador 3' (CAN535). Finalmente, para generar LVL269, se llevo a cabo una tercera reaccion en cadena de la polimerasa, para amplificar el gen PE y PilA en fusion con el peptido de serial NadA en el extremo N-terminal, se incorporaron los aminoacidos ATNDDD entre el peptido de serial pelB y PE, un ligando GG entre las secuencias PE y PilA, y el ligando GG entre PilA y los aminoacidos 6xhis en el extremo C-terminal. Para lograr esta amplificacion, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa anteriormente descritas, se utilizaron como molde con los cebadores CAN548 y CAN535. Se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa al sitio de restriccion NdeI en el cebador 5' y se incorporo el sitio de restriccion Hindlll en el cebador 3'. El producto de la RCP generado, entonces, se inserto en el vector de clonacion pET-26b(+) (NOVAGEN®).

Para generar LVL270 (M-6xHis-fragmento PE-GG-fragmento PilA), se realizo una reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoacidos 17-160), utilizando el vector pRIT16711 como molde, con los cebadores CAN540 y CAN542. Se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos 6xhis en el cebador 5' (CAN540). Para ligar la secuencia PilA a la secuencia PE, se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa a los aminoacidos del ligando GG y los aminoacidos del extremo N-terminal de PilA en el cebador 3' (CAN542). Se llevo a cabo otra reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoacidos 40-149/NTHi cepa 86-028NP), utilizando el vector pRIT16671 como molde, con los cebadores CAN541 y CAN543. Se incorporo ADN de la secuencia que correspondfa a los aminoacidos del extremo C- terminal de PE y los aminoacidos GG en el cebador 5' (CAN541), para ligar la secuencia PilA a la secuencia PE. Finalmente, para generar LVL270, se llevo a cabo una tercera reaccion en cadena de la polimerasa, para amplificar el gen 6-his-PE-GG-PilA en fusion. Para lograr esta amplificacion, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa anteriormente descritas, se utilizaron como molde con los cebadores CAN540 y CAN543. Se incorporo la secuencia de ADN que correspondfa al sitio de restriccion NdeI en el cebador 5', y se incorporo el sitio de restriccion Hindlll en el cebador 3'. El producto de la PCR generado, entonces, se inserto en el vector de clonacion pET-26b(+) (NOVAGEN®).

Para generar LVL315 (peptido de serial pelB-MD-fragmento PE-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), se realizo una mutagenesis de sitio dirigido para cambiar la secuencia de aminoacidos del extremo N-terminal de PE de QIQ a MD, utilizando LVL291 como molde, con los cebadores CAN670 y CAN671, y utilizando el paquete de mutagenesis de sitio dirigido QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

Para generar LVL317 (peptido de serial pelB-fragmento PE-GG-fragmento PilA), se realizo una mutagenesis de sitio dirigido para incorporar un codon de paro entre el gen PilA y la secuencia de ADN que correspondfa a los restos de aminoacido GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3), utilizando LVL291 como molde, con los cebadores CAN678 y CAN679, y utilizando el paquete de mutagenesis de sitio dirigido QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

Para generar LVL318 (peptido de serial pelB-MD-PE-GG-PilA), se realizo una mutagenesis de sitio dirigido para incorporar un codon de paro entre el gen PilA y la secuencia de ADN que correspondfa a los restos de aminoacido GGHHHHHH (sEq ID NO: 3), utilizando LVL315 como molde, con los cebadores CAN678 y CAN679, y utilizando el paquete de mutagenesis de sitio dirigido QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

Para generar LVL702 (LVL291 AQ), se realizo una reaccion en cadena de la polimerasa utilizando el vector LVL291 como molde y los cebadores CAN1517 y CAN1518. Se realizo una delecion de tres nucleotidos que correspondfan al aminoacido Q en la posicion 23 de la secuencia LVL291, en el cebador 5'. La unica diferencia entre LVL702 y LVL291, es la delecion del aminoacido Q en la posicion 23 de la secuencia LVL291. Se incorporaron los sitios de restriccion NdeI y Hindlll en los cebadores 5' y 3', respectivamente. El producto de la PCR generado, entonces, se inserto en el vector de clonacion pET-26b(+) (NOVAGEN®).

Para generar LVL735 (LVL317 AQ), se realizo una reaccion en cadena de la polimerasa utilizando el vector LVL317 como molde y los cebadores CAN1517 y CAN1519. Se realizo una delecion de tres nucleotidos que correspondfan al aminoacido Q en la posicion 23 de la secuencia LVL317, en el cebador 5'. La unica diferencia entre LVL735 y LVL317 es la delecion del aminoacido Q en la posicion 23 de la secuencia LVL317. Se incorporaron los sitios de restriccion NdeI y Hindlll en los cebadores 5' y 3', respectivamente. El producto de la PCR generado, entonces, se inserto en el vector de clonacion pET-26b(+) (NOVAGEN®).

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Para generar LVL736 (LVL291 + SA), se realizo una mutagenesis de sitio dirigido para agregar los aminoacidos S y A entre el aminoacido 22 y el 23 en la secuencia LVL291. Se utilizo LVL291 como molde con los cebadores CAN1531 y CAN1532, utilizando el paquete de mutagenesis de sitio dirigido QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

Para generar LVL737 (LVL291 + A), se realizo una mutagenesis de sitio dirigido para agregar el aminoacido A entre el aminoacido 22 y el 23 en la secuencia LVL291. Se utilizo LVL291 como molde con los cebadores CAN1529 y CAN1530, utilizando el paquete de mutagenesis de sitio dirigido QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

Para generar LVL738 (LVL291 AQIQ), se realizo una mutagenesis de sitio dirigido para eliminar los aminoacidos Q, I y Q en las posiciones 23 a 25 de la secuencia LVL291. Se utilizo LVL291 como molde con los cebadores CAN1523 y CAN1524, y utilizando el paquete de mutagenesis de sitio dirigido QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

Para generar LVL739 (LVL291 AQIQK), se realizo una mutagenesis de sitio dirigido para eliminar los aminoacidos Q, I, Q y K en las posiciones 23 a 26 de la secuencia LVL291. Se utilizo LVL291 como molde con los cebadores CAN1525 y CAN1526, y utilizando el paquete de mutagenesis de sitio dirigido QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

Para generar LVL740 (LVL291 AQIQKA), se realizo una mutagenesis de sitio dirigido para eliminar los aminoacidos Q, I, Q, K y A en las posiciones 23 a 27 de la secuencia LVL291. Se utilizo LVL291 como molde con los cebadores CAN1527 y CAN1528, y utilizando el paquete de mutagenesis de sitio dirigido QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

Para generar LVL778 (LVL736 A6xHis marcador), LVL779 (LVL737 A6xHis marcador), LVL780 (LVL738 A6xHis marcador), LVL781 (LVL739 AxHis marcador) y LVL782 (LVL740 A6xHis marcador), se realizo una reaccion en cadena de la polimerasa utilizando los vectores LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 y LVL740 como molde, respectivamente, con los cebadores CAN1669 y CAN543. La delecion del marcadpr 6xHis corresponde a la secuencia de aminoacidos GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3), en la secuencia del extremo C- terminal. Esta delecion se incorporo en el cebador 3'. Se incorporaron los sitios de restriccion NdeI y HindIII en los cebadores 5' y 3', respectivamente. El producto de la PCR generado, entonces, se inserto en el vector de clonacion pET-26b(+) (NOVAGEN®).

ID del cebador: Secuencia de ADN S’-3’

CAN534: CACACACATATGATTAAATTTCTCTCTGCATTAATTCTTCTACTGGTCACGACGGCGGCTCAGGCTGAGACTAAAAAAGCAG CGGTATCTG (SEQ ID NO. 155)

CAN535: TGTGTGAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGCCTTGTGTGACACTTCCGCAAAAATTTGC (SEQ ID NO. 156)

CAN536: TTTGCGGAAGTGTCACACAAGGCGGCGCGCAGATTCAGAAGGCTGAACAAAATGATGT (SEQ ID NO. 157)

CAN537: ACATCATTTTGTTCAGCCTTCTGAATCTGCGCGCCGCCTTGTGTGACACTTCCGCAAA (SEQ ID NO. 158)

CAN538: TGTGTGAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGCCTTTTTTATCAACTGAAAATG (SEQ ID NO. 159)

CAN540: CACACACATATGCACCACCACCACCACCACAGCGCGCAGATTCAGAAGGCTGAACAAAATGATGT (SEQ ID NO. 160)

CAN541: CATTTTCAGTTGATAAAAAAGGCGGCACTAAAAAAGCAGCGGTATC (SEQ ID NO. 161)

CAN542: GATACCGCTGCTTTTTTAGTGCCGCCTTTTTTATCAACTGAAAATG (SEQ ID NO. 162)

CAN543: TG T GTG AAG C TTTT ATT GT GTG AC AC TTCC G C AAA (SEQ ID NO. 163)

CAN544: CACACACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCCAGAT TCAGAAGGCTGAACAAAATGATGT (SEQ ID NO. 164)

CAN545: G C ATTTT C AGTT GAT AAAAAAG G C G G C ACT AAAAAAG C AGCG GT AT CT G (SEQ ID NO. 165)

CAN54S: CAGATACCGCTGCTTTTTTAGTGCCGCCTTTTTTATCAACTGAAAATGC (SEQ ID NO. 166)

CANS47: CACACACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGATAT TCAGAAGGCTGAACAAAATGATGT(SEQ ID NO. 167)

CAN548: CACACACATATGAAACACTTTCCATCCAAAGTACTGACCACAGCCATCCTTGCCACTTTCTGTAGCGGCGCACTGGCAGCC ACAAACGACGACGATAAGGCTGAACAAAATGATG (SEQ ID NO. 168)

CAN670: GCCGGCGATGGCCATGGATAAGGCTGAACAAAATG (SEQ ID NO. 169)

CANG71: CATTTTGTTCAGCCTTATCCATGGCCATCGCCGGC (SEQ ID NO. 170)

ID del cebador: Secuencia de ADN 5’-3’

CAN678: GGAAGTGTCACACAATAAGGCGGCCACCACCACC (SEQ ID NO. 171)

CAN679: GGTGGTGGTGGCCGCCTTATTGTGTGACACTTCC (SEQ ID NO. 172)

: GATATACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATTCA

CAN1517: GAAGGCTGAACAAAA(SEQ ID NO. 205)

CAN1518: GGCCGCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGCC(SEQ ID NO. 206)

CAN1519: GGCCGCAAGCTTTTATTGTGTGACACTTCC(SEQ ID NO. 207)

CAN1523: GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCAAGGCTGAACAAAATGATGTG (SEQ ID NO. 208)

CAN1524: CACATCATTTTGTTCAGCCTTGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO. 209)

CAN1525: GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGCTGAACAAAATGATGTGAAGC (SEQ ID NO. 210)

CAN1520: GCTTCACATCATTTTGTTCAGCGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO. 211)

CAN1527: GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGAACAAAATGATGTGAAGCTGG (SEQ ID NO. 212)

CAN 1 528: CCAGCTTCACATCATTTTGTTCGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO. 213)

CAN1529: GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGCCCAGATTCAGAAGGCTGAAC (SEQ ID NO. 214)

CAN1530: GTTCAGCCTTCTGAATCTGGGCGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO. 215)

CAN1531: GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCAGCGCCCAGATTCAGAAGGCTGAAC (SEQ ID NO. 216)

CAN1532: GTTCAGCCTTCTGAATCTGGGCGCTGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO. 217)

CAN1SG9: CACACACATATGAAATACCTGCTGCCGACC (SEQ ID NO. 218)

MDesPILA-3: GAATTCCATATGCACCATCACCATCACCATACTAAAAAAGCAGCGGTATCTGAA (SEQ ID NO. 173)

MDesPILA-4: GCGCCGCTCGAGTCATTGTGTGACACTTCCGC (SEQ ID NO. 174)

ID delcebador: Secuencia de ADN S’ -3’

MnoNTHi-44: GCCCAGCCGGCGATGGCCCAGATCCAGAAGGCTGAACAAAATG (SEQ ID NO. 175)

MnoNTHi-45: CATTTTGTTCAGCCTTCTGGATCTGGGCCATCGCCGGCTGGGC (SEQ ID NO. 176)

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Transformation

Se transformaron celulas de Escherichia coli BLR (DE3) o E. coli HMS (DE3) con ADN plasmfdico de acuerdo con los procedimientos convencionales, con celulas tratadas con CaCU (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Ed), ADN cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135). Brevemente, se descongelaron con suavidad celulas BLR (DE3) o HMS174(DE3) competentes, en hielo. Se mezclaron aproximadamente 4 pl del plasmido (10-100 ng) utilizando 50-100 pl de celulas competentes. Posteriormente, esta formulacion se incubo en hielo durante 30 minutos. Para realizar la reaccion de transformacion, la formulacion se calento por pulsos hasta 42 °C durante 45 segundos, y despues se incubo en hielo durante 2 minutos.

Se agregaron aproximadamente 0,5 ml de medio SOC (caldo superoptimo con represion de catabolitos) a las celulas transformadas, y el cultivo celular se incubo a 37 °C durante una hora antes de inocular las placas en agar Luria-Bertani (LB) con 50 pg/ml de kanamicina. Aproximadamente 100 pl del cultivo de celulas transformadas, se inocularon y se incubaron durante una noche a 37 °C.

El BLR (DE3): BLR es un derivado recA- de BL21 (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3). Esta cepa de E. coli utilizada para la expresion de protefnas recombinantes, mejora el rendimiento de monomeros plasmfdicos, y puede ayudar a estabilizar los plasmidos diana que contienen secuencias repetitivas o cuyos productos pueden causar la perdida del profago DE3 (Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44). El genotipo detallado de E. coli BLR (DE3) ha sido publicado por NOVAGEN® (F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm A(srl- recA)306::Tn10 (TetR) (DE3).

HMS174 (DE3): las cepas HMS174 proporcionan la mutacion recA en un fondo K-12. Al igual que la cepa BLR, estas cepas pueden estabilizar ciertos genes diana cuyos productos pueden causar la perdida del profago DE3. El genotipo detallado de E. coli HMS174 (DE3), ha sido publicado por NOVAGEN® (F- recA1 hsdR(rK12- mK12+) (DE3) (Rif R ).

La production utilizando BLR (DE3) y caracterizacion de construcciones marcadas con His, se describen del Ejemplo 3 al Ejemplo 6

Ejemplo 3: Expresion de protefnas en matraz de agitacion

Generalmente, una placa de agar confluente inoculada con Escherichia coli BLR (DE3) transformada con el plasmido recombinante, se cultivo, se resuspendio en medio de cultivo y se utilizo para incubar 800 ml de caldo LB (Becton, Dickinson y Company) ± 1 % (peso/volumen, p/v) de glucosa (Laboratoire MAT, No. de catalogo: GR-0101) y 50 pg/ml de kanamicina (Sigma) hasta obtener una DO600 nm de entre 0,1 y 0,2. Los cultivos se incubaron a 37 °C con una agitacion de 250 rpm, hasta alcanzar una DO600 nm de ~0,8.

Despues, se recogio 1 ml de cada cultivo, se centrifugo a 14.000 rpm durante 5 minutos, y los sobrenadantes y sedimentos se congelaron a -20 °C por separado.

A una DO600 nm ~0,8, los cultivos de BLR (DE3) se enfriaron (-20 °C, 20 minutos o 4 °C, 1 hora, preferentemente a 4 °C durante 1 hora) antes de inducir la expresion de la protefna recombinante, mediante la adicion de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosido 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., N.° de catalogo: 5815) y se incubo durante una noche a 16, 22 y 30 °C, o durante 3 horas a 37 °C con una agitacion de 250 rpm, preferentemente durante una noche a 22°C. Despues del periodo de induccion, los cultivos se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos o a 6.000 rpm durante 15 minutos, y los sobrenadantes (muestra de fraccion del medio) y los sedimentos (que contenfan las fracciones soluble e insoluble), se congelaron a -20 °C por separado.

Estas condiciones se utilizaron para la expresion de protefnas periplasmicas.

Ejemplo 4: Purificacion de protefnas utilizando matraces de agitacion, agregados celulares, construcciones marcadas con His

Cada sedimento bacteriano obtenido despues de la induccion se resuspendio en tampon acido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinetansulfonico 20 mM (HEPES) (pH 8,0), que contiene NaCl 500 mM, imidazol 10 mM y coctel inhibidor de proteasa Roche COMPLETE® (1 comprimido/50 ml de tampon HEPES que contiene NaCl 500 mM, comprimidos ULTRA Roche COMPLETE®, Roche Diagnostics Corporation).

Como alternativa, se pueden usar de 20 a 50 mM de tampon bicina en vez de tampon HEPES que contiene NaCl. Por ejemplo, se puede usar tampon bicina 20 mM. Las bacterias se lisaron utilizando un sistema constante 1.1 KW 2 X 30.000 psi (libras por pulgada cuadrada). Los componentes solubles (sobrenadante) e insoluble (sedimento) se separaron por centrifugacion a 20.000g durante 20 minutos a 4 °C.

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Las protefnas marcadas con 6-His se purificaron en condiciones naturales en cromatograffa de afinidad con metal inmovilizado (IMAC), utilizando el protocolo de purificacion de protefnas PROFINIATM (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Los componentes solubles se cargaron en una columna His Trap de 5 ml (Bio-Rad Laboratories, Inc.) preequilibrada con el mismo tampon utilizado para la resuspension bacteriana; los componentes solubles se agregaron hasta 5 ml/min. (produciendo una “fraccion de flujo a traves”). Despues de cargar en la columna, la columna se lavo con 10 volumenes de columna del mismo tampon a una velocidad de 10 ml/min. (produciendo una “fraccion de lavado n.° 1”). Se realizo un segundo lavado utilizando tampon bicina 20 mM o tampon HEPES 20 mM (pH 8,0) que contiene NaCl 500 mM e imidazol 20 mM, produciendo una “fraccion de lavado n.° 2”). La elucion se realizo utilizando 2 volumenes de columna de amortiguador HEPES 20 mM o amortiguador bicina 50 mM (pH 8,0), que contiene NaCl 500 mM e imidazol 250 mM, a una caudal de 10 ml/min., produciendo una “fraccion de elucion”).

Para mejorar la pureza de la protefna, se combinaron fracciones de elucion positivas de IMAC y se cargaron en una columna de cromatograffa por exclusion de tamano (CET) (HILOADTM SUPERDEXTM 200 26/60 de GE Healthcare), preequilibrada con solucion salina tamponada con fosfatos sin calcio o magnesio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4). Las muestras de las fracciones de elucion se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Las muestras se concentraron utilizando Centricon 10.000 MW (Millipore).

La concentracion de protefnas se determino utilizando un espectrometro.

Ejemplo 5: SDS-PAGE y analisis por transferencia de Western de construcciones marcadas con His, y analisis de SDS-PAGE de construcciones LVL317 y LVL318 no marcadas con His

Preparacion de fracciones soluble e insoluble

Por ejemplo, 1 ml de cultivo despues de la induccion (vease, por ejemplo, el Ejemplo 3 anterior) se centrifugo a 14.000 rpm durante 2 minutos. El sedimento se resolubilizo utilizando 40 pl de reactivo de extraccion de protefnas BUGBUSTER® (NOVAGEN®, EMD4 Biosciences, Merck), creando una suspension celular. La suspension celular se incubo en una plataforma giratoria durante 10 minutos a temperatura ambiente. La suspension celular, entonces, se centrifugo a 14.000 rpm durante 2 minutos para separar la fraccion soluble. El sedimento resultante (fraccion insoluble) se redisolvio utilizando 70 pl de agua desionizada, 5 pl de ditiotreitol (DTT) 1 M y 25 pl de NUPAGE® DSL (dodecilsulfato de litio) como tampon para la muestra 4X (INVITROGENTM). La fraccion soluble (sobrenadante de la suspension celular del sedimento resolubilizado) se agrego a 30 pl de agua desionizada, se anadieron 5 pl de DTT 1M y 25 pl de tampon para muestra DSL 4X.

Preparacion de la fraccion del medio

Por ejemplo, para preparar la fraccion de medio, 100 pl del sobrenadante del cultivo de celulas completas inducido despues de la centrifugacion (vease, por ejemplo el Ejemplo 3 anterior), se concentraron agregando 500 pl de reactivo RC I (Bio-Rad Laboratories, Inc.); la muestra se mezclo y se incubo durante 1 minuto a temperatura ambiente. Despues, se anadieron 500 pl de Reactivo II (Bio-Rad Laboratories, Inc.) a la muestra, y se mezclo. Esta formulacion se centrifugo a 14.000 rpm durante 10 minutos. El sedimento se resolubilizo utilizando 28 pl de agua desionizada, 2 pl de DTT 1 M y 10 pl de DSL SB 4X.

Preparacion de la fraccion de purificacion

Por ejemplo, las protefnas purificadas (por ejemplo, obtenidas de la manera descrita en el Ejemplo 4), se prepararon para analisis SDS-PAGE agregando 70 pl de muestra, 5 pl de DTT 1 M y 25 pl de amortiguador para muestra DSL 4X.

Analisis por SDS-PAGE y transferencia a membranas de nitrocelulosa

El analisis de SDS-PAGE y la transferencia a membranas de nitrocelulosa se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen), utilizando geles NUPAGE® Bis-Tris al 4-12 %. La preparacion de las muestras, tampones y condiciones de migracion, se llevaron a cabo en las condiciones recomendadas por los fabricantes.

En un ejemplo, el gel se cargo con una muestra de 20 pl de mezcla principal que comprendfa 70 pl de una fraccion proteica purificada, 5 pl de DTT 1 M y 25 pl de DSL SB 4X.

Despues de que las muestras se dejasen correr en los geles NUPAGE® Bis-Tris al 4-12 %, las protefnas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa.

Las membranas de ntirocelulosa se bloquearon durante 30 minutos a 37 °C, 60 rpm, utilizando leche al 3 %/PBS 1X, solucion recien preparada. Despues de la incubacion de bloqueo, se agregaron Anticuerpos Primarios (anticuerpo 6X His Tag®, Abcam PLC, N.° de catalogo: ab9108), a una dilucion de 1:1.000 en leche

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Vease en la Figura 1 la SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos para construcciones de las protefnas de fusion LVL291, LVL268 y LVL269. La fraccion insoluble (I), fraccion soluble (S) y la fraccion de medio de cultivo (M) se cargaron para LVL291, LVL268 y LVL269, antes y despues de la induccion (ind).

Vease en la Figura 2 el analisis por SDS-PAGE y por trasnferencia de Western relacionado con la purificacion de extractos para las construcciones de protefna de fusion LVL291, LVL268 y LVL269. Se cargaron la fraccion de flujo a traves (Ft), la fraccion de lavado (L) y la fraccion de elucion (E) para la purificacion de LVL291, LVL268 y LVL269. Se utilizaron anticuerpos contra el marcador his para sondear los extractos.

Vease en la Figura 3 la SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos y de purificacion, para las construcciones de protefna de fusion LVL291 y LVL315. Se cargaron la fraccion de medio de cultivo (M), fraccion soluble (Sol), fraccion insoluble (Ins), fraccion de flujo a traves (Ft), fraccion de lavado n.° 1 (W1), fraccion de lavado n.° 2 (W2) y fraccion de elucion (E) para la LVL291 y LVL315.

Vease en la Figura 4 la SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos y de purificacion, para la construccion de protefna LVL312. Se cargaron la fraccion de medio de cultivo (M), fraccion soluble (Sol), fraccion insoluble (Ins), fraccion de flujo a traves (Ft), fraccion de lavado n.° 1 (W1), fraccion de lavado n.° 2 (W2) y fraccion de elucion (E) para la LVL312.

Vease en la Figura 25 la SDS-PAGE de fracciones solubles de extractos bacterianos inducidos para las construcciones de protefna de fusion LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 y el vector pET26b (control negativo). (a) Experimento 1 (b) Experimento 2 (c) Experimento 3. La protefna de fusion PE- PilA esta indicada con una flecha.

Vease en la Figura 26 el porcentaje de banda promedio de las protefnas de fusion en la fraccion soluble de los Experimentos 1, 2 y 3.

Los extractos bacterianos LVL317 y LVL318 utilizados en el analisis de SDS-PAGE en la Figura 5 y en la Figura 6, respectivamente, se prepararon generalmente de la manera anteriormente descrita.

Figura 5. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos (IPTG 1 mM y 10 pM) para la construccion de protefna de fusion LVL317. Extractos de antes (NI) y despues de la induccion (In), fraccion soluble (S), fraccion insoluble (I).

Se transfirieron protefnas por separado por SDS-PAGE a una membrana de Immobilon-P. Las bandas de protefna tenidas con azul de Coomassie, se cortaron y se colocaron en un reactor secuenciador. La secuenciacion se llevo a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando un secuenciador de protefnas PROCISE®, modelo 494-cLC de Applied Biosystems.

Tabla 5: Perfiles de expresion de protefnas en matraz de agitacion y separacion del peptido de senal de las

construcciones de protefna de fusion

ID de la construe-: Descripcion Perfil de Separacion del

cion de protefna: expresion de la peptido de

de fusion: Extremo N-term ^ C-term protefna senal

LVL312: FlgI ps - E - fragmento PilA - GG - fragmento PE - GGHHHHHH In: +++ So: + Se: + Confirmada

ID de la construc- cion de protefna de fusion: Descripcion Extremo N-term ^ C-term Perfil de expresion de la protefna Separacion del peptido de senal

LVL291: PelB ps - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: + Confirmada

LVL268: PelB ps - D - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: + Confirmada

LVL269: NadA ps - ATNDDD - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: + Confirmada

LVL270: MHHHHHH - fragmento PE - GG - fragmento PilA In : + So : - Se: - No probada

LVL315: PelB ps - MD - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: + Confirmada

LVL317: PelB - fragmento PE - GG - Fragmento PilA In : +++ So : + Se: Nt Confirmada

LVL318: PelB ps - MD - fragmento PE - GG - fragmento PilA In : +++ So : + Se: -

LVL702: PelB ps - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Np Confirmada

LVL736: PelB ps - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Np Confirmada

LVL737: PelB ps - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Np Confirmada

LVL738: PelB ps - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Np Confirmada

LVL739: PelB ps - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Nt Confirmada

LVL740: PelB ps - fragmento PE - GG - fragmento PilA - GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Nt Confirmada

So = Fraccion soluble. In = Fraccion insoluble. Se = Protefna secretada en la fraccion del medio. Np = No probada. La siguiente clasificacion se baso en una inspeccion visual (Coomassie); +: baja expresion; ++: mediana expresion; +++: alta expresion; -: sin expresion

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Ejemplo 6: Caracterizacion de la protefna de fusion LVL291

PROPIEDADES FISICAS DE LVL291: Plegamiento de PE y PilA en LVL291 y Punto de Fusion Dicrofsmo Circular:

Analisis de la Estructura Secundaria

El dicrolsmo circular (DC) se utiliza para determinar la composicion de la estructura secundaria de una protefna, al medir la diferencia en la absorcion de la luz polarizada a la izquierda frente a la luz polarizada a la derecha, lo cual se debe a una asimetrla estructural. La forma y magnitud de los espectros de DC en la region UV lejano (190-250 nm) son diferentes si una protefna presenya una estructura en beta laminar, en helice alfa, o en helicoidal aleatoria. La abundacia relativa del tipo de estructura secundaria en una muestra de protefna dada se puede calcular mediante una comparacion con espectros de referencia.

Los espectros de UV lejano se miden utilizando una ruta optica de 0,01 cm desde 178 hasta 250 nm, con una resolucion de 1 nm y un ancho de banda en un espectropolarfmetro Jasco J-720. La temperatura de la celda se mantiene a 23 °C en un bloque de celdas termico Peltier RTE-111. Se mantiene un flujo de nitrogeno de 10 l/minuto durante las mediciones.

Resultados:

Los espectros de UV lejano de DC obtenidos para la protefna PE (proveniente de la construccion pRIT16762), la protefna PilA (proveniente de la construccion pRIT16790) y las protefnas PE-PilA, son caracterfsticos de protefnas plegadas que contienen una mezcla de estructuras alfa y beta, pero la PE es significativamente mas rica en helices alfa que la protefna PilA y la PE-PilA (Figura 7, espectros DC de las protefnas de fusion PE, PilA y PE-PilA).

Con el fin de evaluar la integridad del plegamiento de las protefnas individuales PE y PilA, se calculo la diferencia de espectros una vez unidas las protefnas formando una protefna quimerica y despues se verifico la posible interaccion entre ambas.

Cuando se combinan los espectros de UV lejano de las protefnas PE y PilA, el espectro resultante se superpone al espectro de la quimera PE-PilA (Figura 8, combinacion del espectro DC de PE y PilA). Este resultado sugiere que la protefna quimerica PE-PilA contiene la totalidad de las estructuras secundarias que se detectan en los componentes individuales. Tambien sugiere que la fusion de las protefnas no tiene ningun impacto mayor sobre las estructuras secundarias de los componentes individuales y, en consecuencia, que el plegamiento de la PE y la PilA no es significativamente diferente, ya sea si las protefnas estan separadas o estan en fusion.

Evaluacion del Punto de Fusion:

Con el fin de evaluar si la expresion en fusion tenia un impacto sobre las propiedades termodinamicas de las protefnas individuales, los puntos de fusion de las protefnas PE, PilA y PE-PilA se evaluaron al controlar el desdoblamiento de la helice alfa con la temperatura, mediante el dicrofsmo circular.

La presencia de la helice alfa esta caracterizada por una serial de dicrofsmo circular minima a 222 nm, de modo que un aumento significativo en la serial de DC a 222 nm durante un aumento de la temperatura, es una indicacion de desnaturalizacion de la protefna. La determinacion de la temperatura a la cual la protefna sufre una perdida de estructura secundaria, permite determinar el punto de fusion (Tm), el cual corresponde a la temperatura a la cual la mitad de las protefnas pierden su estructura.

El punto de fusion puede determinarse al identificar el punto de inflexion de la curva de desnaturalizacion termica obtenida a partir de la grafica de temperatura frente a DC a 222 nm.

Los puntos de fusion de las protefnas PilA y PE determinados por DC UV lejano, respectivamente son de 52 °C y 68 °C (Figura 9, curva de desnaturalizacion termica de la protefna PilA; Figura 10, curva de desnaturalizacion termica de la protefna PE).

La protefna de fusion PE-PilA presenta dos Tm distintas a 48 °C y 71 °C (Figura 11, curvas de desnaturalizacion termica de la protefna de fusion PE-PilA). Estos valores indican que las protefnas PE y PilA todavfa estan plegadas independientemente cuando se unen para formar una quimera, y que se desdoblan a una temperatura similar, ya sea si estan separadas o se encuentran en fusion. La observacion de que el desdoblamiento de la porcion PilA a 48 °C no causa precipitacion o impacto sobre la Tm de la protefna PE a 71 °C, es una fuerte indicacion de que la interaccion entre las protefnas PE y PilA en la fusion es minima, y que no tienen ningun impacto mayor observable una sobre la otra. Los puntos de fusion de las protefnas son sensibles a varias condiciones externas, incluyendo la composicion del tampon o la presencia de moleculas interactuantes; el hecho de que no se haya observado una variacion mayor tras la fusion de las protefnas PE y PilA, es una fuerte indicacion de la conservacion de la mayor parte de

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la estructura y las propiedades tanto de la protefna PE como de la protefna PilA, cuando estas se unen.

Ejemplo 7: Proceso de fermentacion

Las protefnas de fusion de la invencion se pueden preparar por procedimientos conocidos por los expertos en la materia.

Ejemplo 8: Purificacion de las protefnas PE, PilA y LVL317

Purification de la protefna PE de pRIT16762:

Para generar el vector de expresion pRIT16762, el vector pRIT16711 fue sometido a digestion utilizando las enzimas de restriccion BamHI y Ncol, con el fin de eliminar 6 restos de aminoacido entre la secuencia de serial (pelB) y la PE. El vector obtenido se nombro pRIT16712. En este vector, hay 3 aminoacidos entre la secuencia de serial pelB y la PE: MDP. En una segunda etapa, se realizo una mutagenesis de sitio dirigido para cambiar la secuencia de aminoacidos de MDP a QIQ, utilizando el pRIT16712 como molde con los cebadores MnoNTHi-44 y MnoNTHi-45 (que se describen en la Tabla 4) y utilizando el paquete de mutagenesis de sitio dirigido QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).

La cepa de trabajo de E. coli BLR(DE3) que contenfa la PE QIQ (de la construccion pRIT16762), se descongelo desde -80 °C y se utilizo para preparar 100 ml de precultivo en caldo LB mediante una incubacion durante una noche a 37 °C, bajo agitacion a 215 rpm. Despues de incubar durante una noche, se inocularon ocho matraces que contenfan 800 ml de LB APS con 12,5 ml de precultivo y se midio la DO600 a aproximadamente 0,06. Los cultivos se incubaron durante 3 h a 37 °C con agitacion. A una DO600 de aproximadamente 0,9, se anadio IPTG 1 mM para iniciar la induccion. Durante la induccion, los cultivos se incubaron durante 19 h a 22 °C con agitacion. Despues de la induccion, la DO600 era de aproximadamente 2,2. Los cultivos celulares se transfirieron a bolsas de centrffuga de 1 l colocadas en el interior de botellas de 1 l y se centrifugaron a 4 °C durante 30 minutos, a 6.000xg y el sobrenadante se desecho. Se conservaron alfcuotas de 1 ml del cultivo preinduccion y posinduccion y del sobrenadante, para su analisis futuro.

Lisis de la BLR(DE3) inducida con PE QIQ

Las bolsas de centrffuga se retiraron de las botellas de centrifugacion, se abrieron y se sacaron los sedimentos de la bolsa e introdujeron en un vaso de precipitados. Los ocho sedimentos se combinaron y resuspendieron en 100 ml de tampon de union (HEPES 20 mM, imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, pH 8,01). La cepa de E. coli BLR (DE3) que contenfa la construccion PE QIQ, se altero con el Bench Top cell disrupter Serie TS de Constant Systems Ltd. (1x30 kPsi; 1x15kPsi). El lisado se centrifugo durante 30 minutos a 6.000 rpm, a 4 °C. El sobrenadante se conservo y se cargo en una columna de IMAC.

Purification por IMAC de PE QIQ

La columna IMAC (cartucho IMAC Bio-Scale Mini Profinity de BioRad, 5 ml) se equilibro con 5 VC de tampon de union (HEPES 20 mM, imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, pH 8,01) a razon de 5 ml/minuto. Se cargaron 100 ml del sobrenadante lisado en la columna IMAC a razon de 2,5 ml/minuto. El flujo a traves se colecto en fracciones de 50 ml para su analisis futuro. La columna se lavo con 3 VC de tampon de union para retirar la protefna que no se unio. La muestra que contenfa protefnas no unidas se recogio en una alfcuota de 15 ml, en un tubo de 50 ml. La columna se lavo con 2 VC de tampon de lavado (HEPES 20 mM, imidazol 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,01), se recogio en fracciones de 2 ml en una placa de 96 pocillos. La protefna unida, entonces, se eluyo con 6 vC de tampon de elucion al 100 % (HEPES 20 mM, imidazol 250 mM, NaCl 500 mM, pH 8,01). La protefna eluida se recogio en fracciones de 2 ml, en placas de 96 pocillos. El lavado y la elucion se realizaron a 5 ml/minuto.

Cromatografia por exclusion de tamano (CET) en el combinado IMAC de la protefna PE QIQ

Se equilibro una columna de CET (HILOADTM 26/60 SUPERDEXTM 75 grado prep, 60 cm de altura aprox. 319 ml de volumen, de GE Healthcare) con 3 VC de tampon de CET (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,49). Se cargaron 11 ml del eluato de IMAC en la columna, a un caudal de 2,5 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 2 ml desde 0,3 VC hasta 0,9 VC. Se dejaron correr dos veces, y despues las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones de las dos veces que contenfan protefna Prot E, se combinaron (“combinado CET”, volumen total de aproximadamente 48 ml). Se agrego arginina 500 mM al combinado CET.

Dosificacion de las muestras combinadas PE QIQ generadas en el protocolo CET anterior

El combinado CET se dosifico con el procedimiento ARDC (Agente Reductor y Detergente Compatible) del paquete de RC DC™ de Bio-Rad, siguiendo el protocolo del fabricante:

De cada muestra ensayada y estandar, se distribuyeron 25 pl en tubos de microcentrffuga, por duplicado. Se anadieron 125 pl del reactivo RC de Bio-Rad a cada tubo; los tubos se agitaron en vortex y se

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incubaron durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se agregaron 125 pi de reactivo RC II de Bio-Rad a cada tubo; ios tubos se agitaron en vortex y despues se centrifugaron a 14.000xg durante 5 minutos. Los sobrenadantes se desecharon mediante inversion sobre papei absorbente iimpio, dejando que ei liquido se drenara por compieto de ios tubos. Se anadieron 25,4 pi dei reactivo A (ya preparado mezciando 20 pi dei reactivo S por cada 1 mi de Reactivo A) a cada tubo; ios tubos se agitaron en vortex y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos, o hasta que ei precipitado se hubiera disueito por compieto. Los tubos se agitan en vortex antes de ia siguiente etapa. Se agregan 200 pi de reactivo B de DC a cada tubo y se agita en vortex de inmediato. Se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se transfieren todas ias muestras a una piaca de 96 pociiios y ia adsorbancia se iee a 750 nm para determinar ia concentracion de protefna de cada muestra de protefna desconocida.

La concentracion de ProtE fue de 1,069 mg/mi.

Purification de la protefna PilA marcada con His:

La protefna PiiA se purifico siguiendo ei procedimiento generai que se presenta a continuacion:

Se suspendieron ceiuias de E. coli que contenfan una construccion que codificaba PiiA o un fragmento de ia misma, en BUGBUSTER® y BENZONASE® nucieasa (NOVAGEN®), por ejempio 10 mi de BUGBUSTER® y 10 pi de BENZONASE® nucieasa. Ei iisado ceiuiar se mezcio a temperatura ambiente en una piataforma giratoria, por ejempio durante 15 minutos. Ei iisado ceiuiar se centrifugo a 4 °C, por ejempio a 16.000g durante 20 minutos. Ei sobrenadante que contenfa ia protefna, se agrego a una coiumna de Ni NTA conteniendo Ni NTA HIS-resina BIND® y se mezcio a 4 °C durante, por ejempio, 1 hora. La coiumna puede consistir en 2 mi de Ni NTA HIS-resina BIND® (NOVAGEN®) y 10 mi de tampon de union 1X (dei paquete de tampon Ni-NTA de NOVAGEN®). Despues se recogio ei fiujo a traves de ia coiumna. La resina se iavo dos veces con tampon de iavado 1X, por ejempio conteniendo NaCi 300 mM, NaH2PO4 50 mM, imidazona 25 mM, pH 8,0). Ei iavado se recogio por gravedad. La protefna se eiuyo de ia coiumna con tampon de eiucion 1X, por ejempio NaCi 30 mM, NaH2PO4 50 mM, imidazona 250 mM, pH 8,0. La protefna se puede purificar adicionaimente por diaiisis con ei tampon de union y se vueive a dejar correr por ia coiumna Ni NTA, de ia misma manera que ia anteriormente descrita.

Escision de PilA con trombina

Despues, ia PiiA se incubo con trombina (diiuida a 1/50) a temperatura ambiente durante 16 h, para retirar ei marcador de histidina.

Cromatografia por exclusion de tamano (CET) de la PilA escindida con trombina

Una coiumna CET (HILOADTM 26/60 SUPERDEXTM 75 grado prep de GE Heaithcare, 60 cm de aitura y aproximadamente 319 mi de voiumen) se equiiibro con 5 VC de tampon CET (HEPES 20 mM, NaCi 150 mM, pH 8,52). Se cargaron aproximadamente 10 mi de ia protefna PiiA degradada, en una coiumna a una razon de fiujo de 2,5 mi/minuto. Se recogieron fracciones de 2 mi, desde 0,3 VC hasta 0,9 VC. Se dejaron correr dos veces y despues ias fracciones se anaiizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones de ias dos veces que se dejo correr que contenfan la protema PilA degradada, se combinaron (“combinado CET”, aprox. 52 ml del voiumen totai).

Dosis de PilA, combinado de CET

Ei combinado de CET se dosifico por ei procedimiento RCDC de ia manera anteriormente descrita. La concentracion de ia protefna PiiA degradada fue de 5,37 mg/mi.

Dialisis del combinado de CET de PilA con PBS 1x, pH 7,4 (factor de dfalisis = 1.600) y dosificacion por RCDC

Se determino ia concentracion tras ia diaiisis por RCDC, ia cuai fue de 3,0 mg/mi.

Purification de LVL317

Choque osmotico

Como ia protefna de fusion LVL317 se expresa y procesa en ei peripiasma bacteriano, ia protefna se extrajo por choque osmotico.

Un agregado de ceiuias E. coli B2448 recoiectadas, congeiadas (-20 °C) que contenfan LVL317 de un cuitivo en fermentador de 4 i, se combinaron y se resuspendieron en un tampon hipertonico que consistfa en Tris-HCi 24 mM, sacarosa ai 16 % (p/v), giucosa ai 9,9 % (p/v), AEDT 10 mM, pH 8,0, hasta un voiumen finai de 4 iitros. La suspension se mezcio suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente, utiiizando una heiice de 3 hojas instaiada en un agitador basico RW 16, a veiocidad media. La suspension se centrifugo a 15.900xg durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ei sobrenadante (SN1) se conservo para su anaiisis en gei.

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El sedimento resultante se resuspendio en una solucion hipotonica; MgCl2 38 mM, y se mezclo durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugo a 15.900xg durante 30 minutos a temperatura ambiente, y el antfgeno se recupero en el sobrenadante (SN2).

Se realizo una clarificacion del SN2 mediante filtracion a traves de un filtro MidiCap Sartopore 2 de polietersulfona de 0,45/0,2 pm de Sartorius, a 600 ml/min de caudal.

El SN2 se diluyo a 1:3 con NaH2PO4/Na2HPO4 20 mM, pH 7,0, el pH se ajusto a 7,0 si era necesario, con otra clarificacion por filtracion a traves de un filtro MidiCap Sartopore 2 de polietersulfona de 0,45/0,2 pm de Sartorius, a 600 ml/min.

Cromatografia de Flujo Rapido (SP FF) en SP SEPHAROSE™

El SN2 diluido/filtrado se cargo en la columna y se capturo en una resina de intercambio cationico fuerte (SP SEPHAROSE™ FF - GE Healthcare) en una columna de 14 cm DI (diametro interno) x 20 cm de longitud (volumen de la columna 3.100 ml), equilibrada con 2 VC de amortiguador NaH2PO4 / Na2HPO4 20 mM, pH 7,0. Despues de lavar la columna con 5 VC de tampon NaH2PO4/Na2HPO4 20 mM, pH 7.0, el antfgeno (contenido en la LVL317) se eluyo al aumentar la concentracion de NaCl hasta 100 mM, en el mismo tampon de lavado.

Vease en la Figura 12 un cromatograma tfpico de cromatografia de flujo rapido en SP SEPHAROSETM. Cromatografia de Flujo Rapido en Q SEPHAROSE™ (Q FF)

El antfgeno presente en el eluato de la SP FF, se diluyo a 1:4 con Tris 20 mM, a pH 8,5, el pH se ajusto a 8,5 si era necesario, y se hizo pasar a traves de una resina de intercambio anionico fuerte (Q S EPHAROSE™ FF - GE Healthcare), en una columna de 14 cm DI x 11,8 cm de longitud (volumen de columna 1.800 ml), equilibrada con 2 VC de tampon Tris 20 mM, pH 8.5. El antfgeno se recupero en la fraccion de flujo a traves.

Vease en la Figura 13 un cromatograma tfpico de una cromatografia de flujo rapido Q SEPHAROSETM.

Concentracion, diafiltracion, adicion de polisorbato 80 y filtracion esteril

El flujo a traves de la cromatografia Q FF que contenia el antfgeno, se concentro hasta 0,7-0,8 mg/ml, basandose en el cromatograma UV y se diferencio con 5 VD de tampon KH2PO4/K2HPO4 10 mM, pH 6,5, utilizando una membrana de corte Pellicon-2™ de 10 kDa (Millipore).

Utilizando una solucion concentrada al 5 %, se agrego polisorbato 80 (por ejemplo TWEENTM 80) al retenido de la ultrafiltracion y se agito durante 30 minutos con agitacion magnetica a 130 rpm, a 4 °C. La concentracion final de polisorbato 80 fue del 0,04 %. El retenido de la ultrafiltracion se esterilizo por filtracion a traves de una membrana de acetato de celulosa de 0,45/0,2 pm (Sartobran 300, de Sartorius). El material purificado se almaceno a -20 °C o a -80 °C. La concentracion de proteina absoluta se midio por AAA (Analisis de AminoAcidos), a 0,737 mg/mililitro.

Ejemplo 9: Uso del polisorbato 80

Un experimento de titulacion indico que la adicion de polisorbato 80, espedficamente TWEEN™ 80 a una concentracion final del 0,04 % (p/v), al material purificado antes de la filtracion esteril, reducia la formacion de particulas filamentosas y la agregacion.

De acuerdo con un analisis por CDB, el TWEEN™ 80 redujo el grado de cambio estructural (30-45 °C) observado despues de ciclos de congelacion/descongelacion, despues de almacenamiento a -20 °C y posterior a un almacenamiento de 4 dias a 4 °C, -20 °C y -80 °C y 37 °C.

Ejemplo 10: Analisis de SDS-PAGE y de transferencia de Western de LVL317

Analisis de SDS-PAGE y de transferencia de Western:

Se cargo un gel de NUPAGE®, Bis-Tris al 4-12 % de la manera que se describe a continuacion, con 10 pg de muestra en tampon de muestra NUPAGE® DSL, que contenia DTT 50 mM calentado 5 minutos a 95 °C (20 pl de muestra se cargaron para muestras que tenian concentracion baja). Migracion: 35 minutos a 200 voltios a temperatura ambiente (TA), en tampon para correr NUPAGE® MES. El gel se tino durante 2 horas con instant blue (Novexin, cat.: ISB01L) y se decoloro durante una noche en agua.

Contenido de los carriles:

1: Estandar de PM (10 pl) 2: Inicio (fraccion total) (10 pg) 3: SN1 no filtrado (10 pg)

4: SN2 no filtrado (10 pg) 5: No extraido (10 pg) 6: Carga de SP FF (10 pg)

7: Flujo a traves de sP FF (6,9 pg) 8: Lavado de SP FF (20 pl) 9: Elucion de SP FF (10 pg)

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10: Depurado SP FF (10 pg) 11: Carga de Q FF (8,9 pg) 12: Elucion de Q FF (9,8 pg)

13: Depurado Q FF (4,8 pg) 14: Retenido TFF antes de TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (10 pg)

15: Material purificado no filtrado TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (10 pg)

16: Material purificado esteril filtrado TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (l0 pg)

17: Material purificado esteril filtrado TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (20 pg + cultivado con lisado de celulas de E. coli Rix (1 pg))

18: Lisado de celulas E. coli Rix (2 pg)

19: Lisado de celulas E. coli Rix (1 pg)

20: Lisado de celulas E. coli Rix (0,5 pg)

Veanse en la Figura 14 muestras en proceso de SDS-PAGE del proceso de purificacion de la protefna de fusion PE-PilA.

Para el analisis por transferencia de Western, las protefnas se transfirieron a 4 °C durante una noche a 30 voltios, en tampon de transferencia NUPAGE® + metanol al 20 %, SDS al 0,1 %, en membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 1 hora con Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 + leche desnatada al 5 %, se incubaron durante 2 horas con un anticuerpo primario policlonal de conejo diluido en tampon de bloqueo (anticuerpo anti-Prot-E 1/50.000 y anti-E. coli (BLR) 1/1.000), se lavo durante 3 x 5 minutos con Tris 50 mM, pH 7,4 + Tween 20 al 0,05 %, se incubo durante 1 hora con el anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra contra anticuerpos de conejo conjugado con fosfatasa alcalina, diluido a 1/5.000 en tampon de bloqueo), se lavo 3 x 5 minutos con tampon de lavado y se revelo con el sustrato BCIP/NBT (un comprimido por 10 ml). Todas las incubaciones se realizaron en 25 ml por membrana.

Veanse en la Figura 15 un analisis por transferencia de Western de muestras en proceso del proceso de purificacion de la protefna de fusion PE-PilA. En la inmunotransferencia se usaron anticuerpos policlonales de conejo anti-PE.


: Contenido de los carriles:

1:: Estandar de PM (10 pl) 2: Inicio (fraccion total) (10 pg) 3:

4:: SN2 no filtrado (10 pg) 5: No extrafdo (10 pg) 6:

7:: Flujo a traves de sP FF (6,9 pg) 8: Lavado de SP FF (20 pl) 9:

10: Depurado SP FF (10 pg): 11: Carga de Q FF (8,9 pg) 12

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Depurado Q FF (4,8 pg)

SN1 no filtrado (10 pg)

Carga de SP FF (10 pg) Elucion de SP FF (10 pg)

!: Elucion de Q FF (9,8 pg)

14: Retenido de TFF antes de TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (10 pg) Material purificado no filtrado TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (10 pg)

Material purificado esteril filtrado TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (10 pg)

Material purificado esteril filtrado TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (20 pg + cultivado con lisado de celulas de E. coli Rix (1 pg))

Lisado de celulas E. coli Rix (2 pg)

Lisado de celulas E. coli Rix (1 pg)

Lisado de celulas E. coli Rix (0,5 pg)

Veanse en la Figura 16 analisis por transferencia de Western de muestras en proceso del proceso de purificacion de la protefna de fusion PE-PilA. La inmunotransferencia utilizo anticuerpos policlonales de conejo anti-E. coli (BLR).

Contenido de los carriles:

1:: Estandar de PM (10 pl) 2: Inicio (fraccion total) (10 pg) 3:

4:: SN2 no filtrado (10 pg) 5: No extrafdo (10 pg) 6:

7:: Flujo a traves de sP FF (6,9 pg) 8: Lavado de SP FF (20 pl) 9:

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Depurado de SP FF (10 pg) Depurado de Q FF (4,8 pg)

SN1 no filtrado (10 pg)

Carga de SP FF (10 pg)

Elucion de SP FF (10 pg)

11: Carga de Q FF (8,9 pg) 12: Elucion de Q FF (9,8 pg)

14: Retenido de TFF antes de TWEEN™ 80 0,04 %,cultivado (10 pg) Material purificado no filtrado TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (10 pg)

Material purificado esteril filtrado TWEEN™ 80 0,04 %, cultivado (10 pg)

Lisado de celulas E. coli Rix (2 pg)

Lisado de celulas E. coli Rix (1 pg)

Lisado de celulas E. coli Rix (0,5 pg)

Comentarios acerca de las cifras de SDS-PAGE y del analisis por transferencia de Western: La protefna de fusion PE-PilA migra a 30 kDa. La extraccion por choque osmotico extrae la protefna de fusion expresada y procesada en el periplasma bacteriano y reducida de contaminacion bacteriana. Pequena perdida de protefna

de fusion durante el tratamiento hipertonico (carril 3). Una pequena proporcion no se extrae por tratamiento hipotonico y permanece asociada a las celulas (carril 5). Pequena perdida en el flujo a traves de SP FF (carril 7) y en la fraccion depurada de ambas columnas (carriles 10 y 13). Puesto que el volumen total de la fraccion depurada es bajo, la perdida de protefna de fusion no es significativa. Son visibles bandas degradadas en las 5 fracciones depuradas, pero no en el producto final. No hay ninguna contaminacion significativa por protefnas de la celula hospedadora E. coli en el material purificado (carril 16).

El analisis de LVL735 y LVL778, produjo perfiles similares al de LVL317.

Ejemplo 11: Datos del Punto de Fusion para las Protefnas PE, PilA y LVL317

La transicion termica de la protefna de fusion PE-PilA sin marcador His (LVL317), se comparo con la 10 transicion termica tanto de la PE marcada con his (tal como se describe en el Ejemplo 8) como con la protefna PilA escindida (tal como se describe en el Ejemplo 8), purificadas de la manera anteriormente descrita.

Antes de la CDB, las protefnas PE y PilA se sometieron a dialisis durante una noche en K2HPO4/KH2PO4 10 mM, pH 6,5 + Tween 80 al 0,04 % (relacion de volumen: muestra/tampon, 1:250), hasta tenerlas en el mismo tampon como protefna de fusion. Despues de la dialisis, la concentracion de las protefnas se midio por ABC y 15 se ajusto a 300 pg/ml (PE) y a 500 pg/ml (PilA).

El analisis se realizo en VPTM-DSC de MicroCal, LLC (parte de GE Healthcare). El tampon de dialisis final se utilizo como referencia y se sustrajo de los resultados del escaneo. La tasa de escaneo de CDB fue de 90 °C/hora. Con el fin de evaluar la capacidad de medir la transicion termica en el Contenedor Final (CF) despues de la formulacion, la protefna de fusion se diluyo hasta una concentracion de CF (60 pg/ml). Los 20 datos del contenedor final no se muestran.

Resultados:

Veanse en la Figura 17 la transicion termica de la protefna de fusion PE-PilA y las protefnas PE y PilA.

Curvas: PilA (1), Protefna E (Prot E, PE) (2), PE-PilA PB no diluida 737 pg/ml (3), y PE-PilA PB diluida a concentracion de CF 60 pg/ml (4).

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1 - PilA

2 - Protefna E

3 - PE-PilA PB (material purificado) no diluida, 737 pg/ml

4 - PE-PilA PB diluida a concentracion de CF 60 pg/ml

Tm: 53 °C Tm: 63

Tm1 : 53,7 °C y Tm2 : 66,1 °C Tm1: 53,2 °C y Tm2: 67,6 °C

Se detectaron dos transiciones en la protefna de fusion purificada (LVL317) (curvas 3 y 4).

La Tm1 (53,7 °C) de la protefna de fusion PE-PilA, es similar a la transicion de PilA (53 °C).

Modificacion significativa de la Tm2 en la PE-PilA (66,1 °C), en comparacion con la transicion de PE (63 °C). La fusion de ambos dominios parece estabilizar al fragmento PE.

30 La modificacion de Tm2 en la protefna de fusion diluida, en comparacion con la protefna sin diluir, es un artefacto de la concentracion que surge por la inclinada pendiente descendente tfpica de la agregacion, la cual depende de la concentracion.

El analisis de doblamiento o plegamiento del antfgeno de las protefnas LVL735 y LVL778, fue similar al de la LVL317.

35 Ejemplo 12: Construccion de la protefna de fusion PE-PilA LVL291 y respuesta de inmunogenicidad anti-PilA en ratones Balb/c

Se evaluo la respuesta inmunitaria dirigida contra la protefna de fusion de PE-PilA LVL291 (la protefna de fusion LVL291 sin el peptido de senal heterologo) formulada en AS03A, en ratones Balb/c. Los animales (20 ratones/grupo) se inmunizaron por via intramuscular en los dfas 0, 14 y 28, con 10 pg de PE (del vector 40 pRIT16762), PilA (del vector pRIT16790) o PE-PilA, cada una de ellas formulada en AS03A. El grupo de

control fue vacunado con AS03A solo. La respuesta de anticuerpos dirigidos contra cada antfgeno, se determino en sueros individuales tomados en el dfa 42. No se observo ninguna respuesta de anticuerpos con el control negativo. Tal como se muestra en la Figura 18, la respuesta de anticuerpos dirigida contra PilA fue mayor en ratones inmunizados con la protefna de fusion PE-PilA, en comparacion con la respuesta de 45 anticuerpos en ratones inmunizados con la protefna PilA monovalente. Las respuestas de anticuerpos dirigidas contra PE fueron similares en ratones inmunizados con la protefna de fusion y ratones inmunizados con la PE monovalente. TGP = tftulo geometrico promedio. Los datos se capturaron y analizaron con la ayuda del software SOFTMAX® Pro (Molecular Devices), que funciona en WINDOWS® (Microsoft); se utilizo la funcion logarftmica logfstica de cuatro parametros para calcular la curva patron. La funcion logarftmica 50 logfstica de cuatro parametros describe, con un alto grado de exactitud, la curva del suero de referencia que

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muestra una pronunciada forma sigmoidea, cuando se representa a una escala de densidad optica frente a la concentracion (log). Se calculo la concentracion de anticuerpos en cada dilucion de suero de raton, mediante la interpolacion de la curva patron. El anticuerpo en los sueros de control de calidad y en muestras de suero desconocidas, se obtuvo promediando los valores de todas las diluciones que cayeron dentro del rango de trabajo (10-80 %) de la dilucion de la curva de referencia. Los resultados se muestran en la Figura 18, la cual representa la respuesta de anticuerpos contra la protefna de fusion PE-PilA LVL291 y contra las protefnas PE y PilA monovalentes, en el modelo en ratones Balb/c.

Ejemplo 13: Modelo de colonizacion nasofarfngea murina. Inmunizacion con PE-PilA. Exposicion con NTHi cepa 86-028NP y NTHi cepa 3224A

Se inmunizaron ratones Balb/c hembra (20/grupo) por via intranasal, en los dfas 0 y 14, con 6 pg de una protefna de fusion PE-PilA purificada (LVL291 para la exposicion con la cepa 86-028NP, LVL317 para la exposicion con la cepa 3224A) formuladas con LT (toxina termolabil de Escherichia coli) y en el dfa 28 con 6 pg de una protefna de fusion PE-PilA purificada en solucion salina tamponada con fosfatos (PBS). Se vacunaron ratones de control (20/grupo) con LT sola. Posteriormente, los ratones se expusieron por via intranasal a 5 x 106 UFC de NTHi cepa 86-028NP homologa y NTHi cepa 3224A heterologa. La homologfa y heterologfa se determinaron en relacion con la cepa de NTHi con la cual se inmunizaron los ratones. Se contaron las colonias bacterianas en la cavidad nasal, retirada 1 y 2 dfas despues de la exposicion. D1 = dfa 1. D2 = dfa 2. La vacunacion con PE-PilA aumento la depuracion de la cepa NTHi 86-028NP y la cepa 3224A en la nasofaringe, en el dfa 1 y en el dfa 2 posteriores a la exposicion.

Para el experimento realizado con NTHi cepa 86-028NP: Se realizo una ANOVA fija de 2 vfas, utilizando los valores de log10 de las cuentas como respuesta, siendo los factores fijos el grupo (4 niveles) y el dfa (2 niveles). La suposicion de heterogeneidad de la varianza se rechazo y se ajusto un modelo con varianzas heterogeneas a los datos. No se detecto ninguna interaccion significativa entre los 2 factores. La protefna de fusion PE-PilA (6 pg por raton) redujo significativamente las UFC en comparacion con el grupo de control (LT); la relacion geometrica promedio fue igual a 0,06, con un intervalo de confianza del 95 % de 0,01, 0,25.

Para el experimento realizado con NTHi cepa 3224A: Se realizo una ANOVA fija de 3 vfas, utilizando los valores de log10 como respuesta, siendo los factores fijos el grupo, el dfa y el experimento. Las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene no rechazaron la suposicion de normalidad y homogeneidad de las varianzas. No se detecto ninguna interaccion significativa entre los 2 factores o entre los 3 factores, y solo los factores principales se mantuvieron en el analisis. La PE-PilA/LT redujo significativamente las uFc en comparacion con el grupo de control; la relacion geometrica promedio fue igual a 0,11, con un intervalo de confianza del 95 % de 0,02, 0,61.

Vease en la Figura 19 el efecto de la vacunacion con la protefna de fusion PE-PilA sobre la depuracion bacteriana de la cepa NTHi 86-028NP, en nasofaringe de raton.

Vease en la Figura 20 el efecto de la vacunacion con protefna de fusion PE-PilA sobre la depuracion bacteriana de la cepa NTHi 3224A, en nasofaringe de raton.

Ejemplo 14: Modelo de colonizacion nasofarfngea murina. Inmunizacion con PilA. Exposicion con NTHicepa3219C

Se inmunizaron ratones hembra OF1 (20 ratones/grupo) por via intranasal en los dfas 0 y 14, con 3 pg de PilA (del vector 16790), formulada con LT, y en el dfa 28 con 3 pg de PilA en PBS. Los ratones de control se vacunaron con LT sola. Los ratones posteriormente se expusieron por via intranasal a 5 x 106 UFC de la cepa NTHi 3219C. Se contaron las colonias bacterianas en la cavidad nasal, retirada 3 y 4 dfas despues de la exposicion. D3 = dfa 3. D4 = Dfa 4.

Vease en la Figura 21 el efecto de la vacunacion con PilA sobre la depuracion bacteriana, en nasofaringe de raton.

Ejemplo 15: Modelo de colonizacion nasofarfngea murina. Inmunizacion con PE. Exposicion con NTHi cepa 3224a

Se inmunizaron ratones Balb/c hembra (20/grupo) por via intranasal, en los dfas 0 y 14, con 3 pg de PE (del vector pRIT16762), formulada con LT, y en el dfa 28 con 3 pg de PE en PBS. Los ratones de control se vacunaron con LT sola. Posteriormente, los ratones se expusieron por via intranasal a 5 x 106 UFC de NTHi cepa 3224A. Se contaron las colonias bacterianas en la cavidad nasal, retirada 3 y 4 dfas despues de la exposicion. Se examinaron 10 ratones en el dfa 3 (D3). Se examinaron 10 ratones en el dfa 4 (D4). La vacunacion con PE aumento significativamente la depuracion de NTHi en la nasofaringe en el dfa 4 posterior a la exposicion (Figura 22), utilizando la prueba de Dunn para el analisis estadfstico.

Vease en la Figura 22 el efecto de la vacunacion con PE sobre la depuracion bacteriana, en nasafaringe de raton.

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Ejemplo 16: Union a vitronectina. Inhibicion de la union a vitronectina por la protefnas de fusion PE- PilA LVL317 y LVL735

Se evaluo la capacidad de la PE en la protefna de fusion PE-PilA LVL317 purificada, de unirse a la vitronectina. Se recubrieron microplacas (POLYSORPTM, Nunc, Thermo Fisher Scientific) con PE (del vector pRIT16762) o con la protefna de fusion PE-PilA LVL317 purificada (10 pg/mL). Las placas se lavaron cuatro veces con NaCI 150 mM/polisorbato 20 (por ejemplo TWEEN™ 20) al 0,05 % y se bloquearon durante una a dos horas con PBS-BSA al 1 %. Despues de cuatro lavados, se agrego vitronectina (vitronectina de plasma humano SIGMA-ALDRICH®) (10 pg/ml), se hizo una serie de diluciones de dos (12 diluciones), y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues, las placas se lavaron cuatro veces con NaCl 150 mM/polisorbato 20 (por ejemplo, TWEEN™ 20) al 0,05 %. Despues de los lavados, la vitronectina unida se detecto utilizando anticuerpos de oveja antivitronectina humana conjugados con peroxidasa (US Biological), seguido por la adicion del sustrato orto-fenilendiamina/H2/O2. El color desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos fijados a la vitronectina.

Vease en la Figura 23: (a) protefna de fusion PE-PilA LVL317 unida a la vitronectina. PilA = PilA proveniente de NTHi cepa 86-028NP (tal como se describe para el plasmido pRIT16790); PE = Protefna E (tal como se describe para el plasmido pRIT16762 y (b) protefnas de fusion PE-PilA LVL317 y LVL735 unidas a vitronectina.

Ejemplo 17: Union a vitronectina. Inhibicion de la union a vitronectina por anticuerpos dirigidos contra la protefna de fusion PE-PilA LVL291

Se recubrieron microplacas (POLYSORP™, Nunc, Thermo Fisher Scientific) con PE (proveniente del vector pRIT16762) o con la protefna de fusion PE-PilA purificada (10 pg/ml). Las placas se lavaron cuatro veces con NaCl 150 mM/polisorbato 20 (por ejemplo TWEEN™ 20) al 0,05 % y se bloquearon durante dos horas con PBS-BSA al 1 %. Despues de los lavados, se agrego vitronectina (vitronectina de plasma humano, SIGMA- ALDRICH®) a 50 pg/ml y los anticuerpos purificados anti-PE-PilA (producidos y purificados en el mismo laboratorio) se diluyeron en series de dos y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Despues, las placas se lavaron cuatro veces con NaCl 150 mM/polisorbato 20 (por ejemplo, TWEEN™ 20) al 0,05 %. Despues de cuatro lavados, la vitronectina unida se detecto utilizando anticuerpos de oveja antivitronectina conjugados con peroxidasa (US Biological), seguido por la adicion del sustrato orto-fenilendiamina/H2/O2. El color desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos fijados a la vitronectina.

Se observo inhibicion de la union de vitronectina a la protefna PE por los anticuerpos policlonales dirigidos contra la PE-PilA.

Vease en la Figura 24 la inhibicion de la union de vitronectina por anticuerpos policlonales contra la protefna de fusion PE-PilA.

Ejemplo 18: Antigenicidad de la protefna de fusion PE-PilA LVL291. ELISA

La protefna de fusion PE-PilA LVL291 purificada fue validada en una prueba de antigenicidad con protefnas monovalentes como control. La protefna de fusion se probo en un ensayo de ELISA de tipo sandwich, revelado con anticuerpos policlonales (de conejo y de cobaya) generados contra el fragmento genico de PE que codifica los aminoacidos 22-160 de la SEQ ID NO: 4 (tal como se describe para el vector pRIT16711) o contra la protefna PilA de NTHi cepa 86-028NP (del vector pRIT16790).

Se anadio protefna PilA o PE a 100 ng/ml y se realizaron diluciones en serie de dos. Despues de 30 minutos de incubacion y despues del lavado, el antfgeno unido se detecto con un suero policlonal de conejo obtenido despues de una inmunizacion con PE o con PilA. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante anticuerpos anti-Ig de conejo conjugados con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), seguido por la adicion del sustrato orto-fenilendiamina/H2O2. El color desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de antfgeno presente. Las lecturas de absorbancia se realizaron con un espectrofotometro para microplacas. La antigenicidad de las muestras se determino comparando con la curva patron del antfgeno PE de longitud completa o PilA de longitud completa, y se expreso en pg/ml. El patron representaba el 100 % de antigenicidad.

Como se observa en la Tabla 6: se observo antigenicidad con la protefna de fusion PE-PilA LVL291 purificada, en comparacion con los antfgenos PE y PilA monovalentes.

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 6: Antigenicidad relativa obtenida con la proteina de fusion PE-PilA LVL291, en la prueba de

antigenicidad

: Antigenicidad relativa de PE (%)

Proteina E como referencia: 100

PE-PilA: 130-148

: Antigenicidad relativa de PE (%)

PilA como referencia: 100

PE-PilA: 120-152

Ejemplo 19: Inmunogenicidad de la proteina de fusion PE-PilA LVL735

Se inmunizaron ratones hembra Balb/c (n = 34) por via intramuscular en los dfas 0, 14 y 28, con 50 pl de formulacion de vacuna que contenfa 1, 0,2 o 0,04 pg de proteina de fusion PE-PilA LVL317 o LVL735, formulada con AS01E o AlPO4 (fosfato de aluminio). Las respuestas de anticuerpos contra PE y PilA se determinaron en sueros individuales tornados en el dfa 42, y la concentracion de IgG contra PE y PilA se midio y se expreso en pg/mililitro.

Vease en la Figura 27 la respuesta de anticuerpos contra PE y PilA contra LVL317 y LVL735. CGP = concentracion geometrica promedio. TGP = tftulo geometrico promedio. IC = intervalos de confianza.

Ejemplo 20: Eficacia protectora de las protefnas de fusion LVL735 y LVL317 en un modelo murino de colonizacion nasofarfngea por Haemophilus influenzae no tipificable

Se inmunizaron por via intranasal ratones hembra Balb/c en los dfas 0 y 14, con 10 pl de formulacion de vacuna que contenfa 5,8 pg de LVL735 o LVL317, mezclados con 0,5 pg de toxina labil de E. coli (LT). Se administro una dosis de refuerzo de 5,8 pg de LVL735 o LVL317 sin adyuvante, en el dfa 28. Los ratones de control se vacunaron con LT sola en los dfas 0 y 14, y con PBS en el dfa 28. Los animales se expusieron por via intranasal a 5 x 106 UFC de NTHi cepa 3224A, en el dfa 42. Las colonias de bacterias se contaron en la cavidad nasal retirada 1 y 2 dfas despues de la exposicion (n = 10/punto temporal).

Las cavidades nasales se homogeneizaron en medio de cultivo y se realizo una cuantificacion bacteriana. Los resultados se expresan en UFC/ml.

Vease en la Figura 28 el efecto de la vacunacion con LVL735 y LVL317, sobre la depuracion bacteriana en un modelo murino de colonizacion nasofarfngea por Haemophilus influenzae no tipificable.

Ejemplo 21: Formulacion de vacunas multivalentes que comprenden una proteina de fusion PE-PilA

Se disenaron 3 vacunas:

10V: Vacuna decavalente (10V) que contiene los siguientes 10 conjugados de sacaridos capsulares de S. pneumoniae: sacarido capsular del serotipo 1 conjugado con la proteina D (1-PD), sacarido capsular del serotipo 4 conjugado con la proteina D (4-PD), sacarido capsular del serotipo 5 conjugado con la proteina D (5-PD), sacarido capsular del serotipo 6B conjugado con la proteina D (6B-PD), sacarido capsular del serotipo 7F conjugado con la proteina D (7F-PD), sacarido capsular del serotipo 9V conjugado con la proteina D (9V-PD), sacarido capsular del serotipo 14 conjugado con la proteina D (14-PD), sacarido capsular del serotipo 23F conjugado con la proteina D (23F-PD), sacarido capsular del serotipo 18C conjugado con el toxoide tetanico (18C-TT) y sacarido capsular del serotipo 19F conjugado con la toxina difterica (19F-DT).

12V: Vacuna dodecavalente (12V) que contiene los mismos diez conjugados sacaridos capsulares de S. pneumoniae que la decavalente, pero con dos conjugados sacaridos de S. pneumoniae adicionales, el 19A conjugado con CRM197 (19ACRM) y el 6A conjugado con CRM197 (6ACRM).

12V+ protefnas (12V+prot): Vacuna que contiene los mismos doce conjugados sacaridos capsulares de S. pneumoniae que la dodecavalente, con la adicion de PhtD, dPly y la proteina de fusion PE-PilA.

Preparacion de dPly: La neumolisina neumococica se preparo y detoxifico de la manera descrita en los documentos WO2004/081515 y WO2006/32499, utilizando la detoxificacion con formaldehfdo.

Expresion y purificacion de PhtD:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

EXPRESION DE PhtD: La protefna PhtD es un miembro de la familia de trfada de histidina neumococica (Pht), caracterizada por la presencia de trfadas de histidina. La PhtD es una molecula de 838 aa y es portadora de 5 trfadas de histidina (vease Medlmmune WO00/37105 SEQ ID NO: 4 para la secuencia de aminoacidos y la SEQ ID NO: 5 para la secuencia de ADN). La PhtD tambien contiene una region rica en prolina en la parte media (posicion de aminoacido 348-380). La PhtD tiene una secuencia de serial N-terminal de 20 aa. La preparacion y purificacion de la PhtD se describe en el documento WO2007/071710 (vease por ejemplo, el Ejemplo 1b). La secuencia de aminoacidos del 21-838 de la SEQ ID NO: 4 del documento WO00/37105 corresponde a la SEQ ID NO: 220.

SEQ ID NO: 220

Ser Tyr Glu Leu Gly Arg His Gln Ala Gly Gln Val Lys Lys Glu Ser Asn Arg Val Ser Tyr Ile Asp Gly Asp Gln Ala Gly Gln Lys Ala Glu Asn Leu Thr Pro Asp Glu Val Ser Lys Arg Glu Gly Ile Asn Ala Glu Gln Ile Val Ile Lys Ile Thr Asp Gln Gly Tyr Val Thr Ser His Gly Asp His Tyr His Tyr Tyr Asn Gly Lys Val Pro Tyr Asp Ala Ile Ile Ser Glu Glu Leu Leu Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gln Leu Lys Asp Ser Asp Ile Val Asn Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Ile Lys Val Asp Gly Lys Tyr Tyr Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ala His Ala Asp Asn Ile Arg Thr Lys Glu Glu Ile Lys Arg Gln Lys Gln Glu His Ser His Asn His Gly Gly Gly Ser Asn Asp Gln Ala Val Val Ala Ala Arg Ala Gln Gly Arg Tyr Thr Thr Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Asn Ala Ser Asp Ile Ile Glu Asp Thr Gly Asp Ala Tyr Ile Val Pro His Gly Asp His Tyr His Tyr Ile Pro Lys Asn Glu Leu Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ala Ala Glu Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Gln Gly Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Asn Ala Asn Pro Ala Gln Pro Arg Leu Ser Glu Asn His Asn Leu Thr Val Thr Pro Thr Tyr His Gln Asn Gln Gly Glu Asn Ile Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu Arg His Val Glu Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ala Gln Ile Thr Ser Arg Thr Ala Arg Gly Val Ala Val Pro His Gly Asn His Tyr His Phe Ile Pro Tyr Glu Gln Met Ser Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ala Arg Ile Ile Pro Leu Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val Pro Asp Ser Arg Pro Glu Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gln Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Pro Ile Asp Glu Lys Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe Glu Glu Asn Gly Val Ser Arg Tyr Ile Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu Thr Ala Ala Gly Ile Asp Ser Lys Leu Ala Lys Gln Glu Ser Leu Ser His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Arg Glu Phe Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Ala Arg Ile His Gln Asp Leu Leu Asp Asn Lys Gly Arg Gln Val Asp Phe Glu Ala Leu Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Asp Val Pro Ser Asp Lys Val Lys Leu Val Asp Asp Ile Leu Ala Phe Leu Ala Pro Ile Arg His Pro Glu Arg Leu Gly Lys Pro Asn Ala Gln Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gln Val Ala Lys Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Pro Arg Asp Ile Thr Ser Asp Glu Gly Asp Ala Tyr Val Thr Pro His Met Thr His Ser His Trp Ile Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gln Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gln Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro His Tyr Asp His Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Thr Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn Glu Arg Pro His Ser Asp Asn Gly Phe Gly Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Val Asp Gln Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gln Val Glu Asn Ser Val Ile Asn Ala Lys Ile Ala Asp Ala Glu Ala Leu Leu Glu Lys Val Thr Asp Pro Ser Ile Arg Gln Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gln Pro Ala Pro Ile

Expresion de la protefna D

La protefna D se expreso de la manera descrita en el documento WO2007/071710.

Expresion y purificacion de CRM197 de E. coli:

Con el fin de mejorar el rendimiento del proceso de produccion de CRM197, se evaluaron modos de expresion alternativos con el objetivo de aumentar en 10 veces el rendimiento del proceso. La construccion seleccionada se expreso en Escherichia coli cepa (B834 (DE3)) como una fusion entre la secuencia de serial de Flgl de E. coli (19aa) y CRM197 (537aa). La secuencia de serial se escinde al transportar la protefna al periplasma. La CRM197 se extrae por choque osmotico antes de purificarse. El proceso de purificacion es similar al descrito en el documento WO2006/100108, excepto en que se agrego una etapa cromatografica adicional (fenil sefarosa) entre las etapas de Q-sefarosa-XL e hidroxiapatita, y la ultima etapa cromatografica en octil- sefarosa 4FF se elimino.

Preparacion de conjugados

Es bien sabido en este campo como preparar polisacaridos neumococicos purificados. Para los propositos de estos ejemplos, los polisacaridos se prepararon esencialmente de la manera descrita en el documento EP072513 o por procedimientos estrechamente relacionados. Antes de la conjugacion, los polisacaridos se pueden ajustar en tamano por microfluidizacion, de la manera que se describe mas adelante.

Las condiciones de activacion y acoplamiento son especfficas para cada polisacarido. Estas se dan en la Tabla 1. Los polisacaridos con tamano ajustado (excepto el 6B y 23F) se disolvieron en NaCl 2M, NaCl 0,2M,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

o en agua inyectable (AI). La concentracion del polisacarido optima se evaluo para todos los serotipos. Todos los serotipos, excepto el 18C, se conjugaron directamente a la protema de vehmulo, de la manera que se detalla a continuacion.

A partir de una solucion concentrada de 100 mg/ml en acetonitrilo o acetonitrilo/agua (50 % / 50 %), se agrego CDAP (tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio) (CDAP/PS, relacion 0,5-1,5 mg/mg PS), a la solucion de polisacarido. Se anadio NaOH 0,2 M - 0,3 M 1,5 minutos despues, para obtener el pH espedfico de activacion. La activacion del polisacarido se realizo a este pH durante 3 minutos a 25 °C. La protema purificada (protema D, CRM197 o DT) (la cantidad depende de la relacion inicial PS/protema de vehmulo), se agrego al polisacarido activado, y la reaccion de acoplamiento se realizo al pH espedfico durante hasta 2 horas (dependiendo del serotipo), bajo una regulacion del pH. Con el fin de desactivar los grupos ester de cianato que no reaccionaron, se agrego una solucion de glicina 2 M a la mezcla. El pH se ajusto al pH optimo para detener la reaccion (pH 9,0). La solucion se agito durante 30 minutos a 25 °C y despues se incubo durante una noche a 2-8 °C con agitacion lenta continua.

Preparacion del polisacarido 18C:

El polisacarido 18C se ligo a la protema de vehmulo mediante un ligando -dihidrazida del acido adfpico (ADH). El polisacarido de serotipo 18C se microfluidizo antes de la conjugacion.

Derivacion del toxoide tetanico con EDAC (clorhidrato de 2-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

Para la derivacion del toxoide tetanico, se diluyo TT purificado a 25 mg/ml con NaCl 0,2M y se agrego el separador ADH con el fin de alcanzar una concentracion final de 0,2 M. Cuando la disolucion del separador fue completa, el pH se ajusto a 6,2. Se anadio entonces EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) hasta alcanzar una concentracion final de 0,02 M, y la mezcla se agito durante 1 hora con regulacion del pH. La reaccion de condensacion se detuvo al aumentar el pH a 9,0 durante al menos 30 minutos, a 25 °C.

El TT derivado, posteriormente, se sometio a diafiltracion (membrana CO de 10 kDa), con el fin de retirar el ADH residual y el reactivo EDAC.

El TTah (toxoide tetanico conjugado con el ligando ADH), se esterilizo por filtracion hasta la etapa de acoplamiento, y se almaceno a -70 °C.

Acoplamiento qufmico del TTah al PS 18C

Los detalles de los parametros de la conjugacion se pueden encontrar en la Tabla 1.

Se diluyeron 2 gramos de PS microfluidizado a la concentracion definida en agua y se ajusto a NaCl 2M mediante la adicion de NaCl en polvo.

Se agrego solucion CDAP (100 mg/ml reden preparada en 50/50 v/v de acetonitrilo/AI), hasta alcanzar la proporcion de CDAP/PS apropiada.

El pH se elevo hasta el pH de activacion 9,0 mediante la adicion de NaOH 0,3 M y se estabilizo a ese pH hasta la adicion del TTah.

Despues de 3 minutos, se agrego TTah derivado (20 mg/ml en NaCl 0,2 M) hasta alcanzar una relacion de TTah/PS de 2; el pH se regulo al pH de acoplamiento 9,0. La solucion se dejo una hora bajo el pH de regulacion.

Para detener la reaccion, se anadio una solucion de glicina 2 M a la mezcla de PS/TTah/CDAP.

El pH se ajusto al pH optimo para detener la reaccion (pH 9,0).

La solucion se agito durante 30 min a 25 °C y despues durante una noche a 2-8 °C, con agitacion continua lenta.

Condiciones especificas de activacion/acoplamiento/paro de reaccion de conjugados de sacarido capsular de S. oneumon/ae/protefna D/TT/DT/PhtD/Ply

Cuando aparezca la expresion “pfluido” en el encabezado de una columna, esto indica que el sacarido fue ajustado en tamano por microfluidizacion, antes de la conjugacion. Los tamanos de los sacaridos despues de la microfluidizacion, se indican en la Tabla 2.

Tabla 1. Condiciones especi'ficas de activacion / acoplamiento / paro de reaccion de

conjugados de sacarido capsular de S. pneumon/ae/protefna D/TT/DT/CRM197

: 1 4 5 6A 7F

Serotipo: pfluido pfluido mfluido mfluido 6B pfluido

Conc. del PS (mg/ml): 2,27 2,37 7,1 10 5,0 5,0

Disolucion del PS: AI AI AI NaCl 2 M NaCl 2 M NaCl 2 M

: 10,0

Conc. del vehfculo: PD 10,0 5,0 10 5,0 10,0

(mg/ml): PD PD CRM197 PD PD

Relacion inicial PROT/PS (p/p): 1,65/1 1,60/1 1/1 1/1 1,1/1 1,2/1

Conc. de CDAP (mg/mg de PS): 0,55 0,55 0,79 1,0 0,83 0,75

pHa=pHc=pHp: 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0

Serotipo: 9V pfluido 14 pfluido 18C pfluido 19A pfluido 19F Mfluido 23F

Conc. del PS (mg/ml): 5,0 5,0 4,5 15,0 9,0 2,38

Disolucion del PS: NaCl 2 M NaCl 2 M NaCl 2 M NaCl 2 M NaCl 2 M NaCl 2 M

Conc. de la prot. Vehfculo: 10,0 10,0 20,0 (TT) 15,0 (CRM197) 20,0 (DT) 5,0

Relac. inicial Prot vehic/PS (p/p): 1,2/1 1,2/1 2/1 1,5/1 1,5/1 1/1

Conc. de CDAP (mg/mg de PS): 0,50 0,75 0,75 1,5 1,5 0,79

pHa=pHc=pH p: 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0

5 Nota: pHa,c,p corresponde al pH de activacion, acoplamiento y paro de reaccion, respectivamente. Purificacion de los conjugados:

Los conjugados se purificaron por filtracion en gel utilizando una columna de filtracion en gel Sephacryl S400HR, equilibrada con NaCl 0,15M (excepto en que se uso S500HR como tampon para el polisacarido 18C y acetato 20 mM que contiene NaCl 1,15 M, pH 6,2, para el polisacarido 19A), para retirar las moleculas 10 pequenas (incluyendo el DMAP) y el sacarido no conjugado y las protefnas. Basandose en los diferentes pesos moleculares de los componentes de la reaccion, los conjugados PS-PD, PS-TT, PS-CRM197 o PS-DT eluyeron primero, seguidos por PS libre, y despues por protefna de vehfculo libre, y finalmente DMAP y otras sales (NaCl, glicina).

Las fracciones que contenfan los conjugados se detectaron por UV280 nm. Las fracciones se combinaron de acuerdo con su Kd, se esterilizaron por filtracion (0,22 pm) y se almacenaron a +2-8 °C. Se determino la relacion PS/protefna en las preparaciones conjugadas.

Formulacion de las vacunas

5 La vacuna decavalente contiene sacaridos capsulares de S. pneumoniae de serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F adsorbidos en fosfato de aluminio, junto a una dosis humana de 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 pg (los sacaridos se adsorbieron individualmente al fosfato de aluminio, despues se mezclaron y se ajusto la concentracion de fosfato de aluminio a 500 pg).

La vacuna dodecavalente se preparo de la misma manera que la vacuna decavalente, con los serotipos 10 adicionales 19A y 6A conjugados a dosis de 2 pg, adsorbidos en fosfato de aluminio.

La vacuna dodecavalente + protefnas se preparo de la misma manera que la vacuna dodecavalente, excepto en que se agregaron las protefnas PhtD, dPly y PE-PilA. La PE-PilA se produjo de la manera descrita en el presente documento. Los 12 conjugados y las protefnas se mezclaron juntos utilizando las dosis descritas anteriormente para la vacuna dodecavalente, y las protefnas a dosis de 30 pg cada una (notese que esto se 15 refiere a 30 pg de PE-PilA, no 30 pg de PE y 30 pg de PilA).

Ejemplo 22: Comparacion de la inmunogenicidad de las vacunas 10V, 12V y 12V+protefnas, en ratones

Descripcion de la prueba de ELISA del PS (polisacarido) con anticuerpos frente al polisacarido neumococico

Se recubrieron microplacas durante 2 horas a 37 °C con polisacarido capsular (PSC) (100 pl por pocillo de 2,5 pg/ml de PS1 y PS3, 5 pg/ml de PS4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V o 14; 10 pg/ml de PS19A y 23F, o 40 pg/ml de PS18C 20 y PS19F, en PbS). Las placas se lavaron tres veces con NaCl 150 mM (al 0,9 %)-polisorbato 20 al 0,05 %. Los sueros se diluyeron (1/2 para los serotipos 6A y 6B, y 1/10 para los demas serotipos) en PBS-Polisorbato 20 al 0,05 %, que contiene PSC (1 mg de PSC/ml de suero no diluido, excepto para los serotipos 6A y 6B, los cuales fueron a 2,5 mg/ml) V/V y se incubo durante 1 hora a 37 °C, con el fin de neutralizar los anticuerpos dirigidos frente al PSC. Los sueros de ratones inmunizados de la manera descrita en la seccion de 25 “inmunogenicidad de tres formulaciones de vacuna en ratones” o una referencia (una referencia interna calibrada con IgG murina Chrompure), se agrego a los pocillos de la microplaca y se realizaron diluciones en serie de 100 pl (diluciones dobles) en PBS-polisorbato 20 al 0,05 %. Las placas se incubaron en agitacion durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de la manera anteriormente descrita y se agregaron anticuerpos anti IgG de raton conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo) y las placas se 30 incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitacion. Despues de lavar, se agregaron el sustrato (4 mg de OPDA (ortofenilendiamina) en 10 ml de citrato 0,1 M, pH 4,5-4,6, y 5 pl de H2O2) a cada pocillo (100 pl), y las placas se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad. La reaccion fue detenida mediante la adicion de HCl 1N (50 pl). La absorbancia se leyo a 490 nm o a 620 nm para la referencia, utilizando un espectrofotometro. El color desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de 35 anticuerpos presentes en el suero.

Descripcion de la prueba de ELISA para medir anticuerpos frente a PD, PE y PilA

Se recubrieron placas durante una noche a 4 °C con 100 pl por pocillo de 2 pg/ml de PD (1 mg/ml), 2 pg/ml de PE (1.500 pg/ml), 2 pg/ml de PilA (3.660 pg/ml) en tampon de carbonato, pH 9,6. Las placas se lavaron cuatro veces con NaCl al 0,9 %/polisorbato 20 al 0,05 %. Para el ELISA de PE y PilA, las placas se saturaron 40 durante 30 min a temperatura ambiente (con agitacion) con PBS-BSA al 1 %. Despues de lavar, se agrego el suero de ratones inmunizados de la manera descrita en la seccion “inmunogenicida d de formulaciones de tres vacunas en ratones” o una referencia (una referencia interna calibrada con IgG murina Chrompure) a los pocillos de las microplacas, y se realizaron diluciones en serie de 100 pl (diluciones dobles) en PBS/polisorbato 20 al 0,05 % (para el ensayo de PD) y PBS-polisorbato 20 al 0,05 %-BSA al 0,1 % (para el 45 ensayo de PE y PilA). Despues, las placas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con

agitacion. Despues de lavar, las placas se incubaron con un anticuerpo anti IgG murina conjugado con peroxidasa (100 pl por pocillo) a temperatura ambiente durante 30 minutos, con agitacion. Las placas, posteriormente, se lavaron de la manera anteriormente descrita, y se anadio el sustrato conjugado (4 mg de OPDA (ortofenilendiamina) en 10 ml de citrato 0,1 M, pH 4,5-4,6, y 5 pl de H2O2) a cada pocillo (100 pl) 50 durante 15 min, en la oscuridad. La reaccion se detuvo mediante la adicion de HCl 1N 50 pl, y se leyo la

absorbancia a 490 nm (620 nm para la referencia).

Descripcion de la pruba de ELISA para medir los anticuerpos PhtD y dPly

Se recubrieron microplacas durante 2 horas a 37 °C con 100 pl por pocillo de 1 pg/ml de PhtD (1,021 pg/ml) o 4 pg/ml de Ply (367 pg/ml). Despues, las placas se lavaron tres veces con NaCl al 0,9 %-polisorbato al 0,05 55 %. Despues de lavar, se agrego el suero de ratones inmunizados de la manera descrita en la seccion

“inmunogenicidad de formulaciones de tres vacunas en ratones” o una referencia (una referencia interna calibrada con IgG murina Chrompure) se agrego a los pocillos de las microplacas, y se realizaron diluciones

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

en serie de 100 pi (diluciones dobles) en PBS/polisorbato 20 al 0,05 %. Las placas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con agitacion. Despues de lavar, las placas se incubaron con un anticuerpo anti IgG murino conjugado con peroxidasa (100 pl por pocillo) a temperatura ambiente durante 30 minutos, con agitacion. Las placas se lavaron de la manera anteriormente descrita, y se anadio el sustrato conjugado (4 mg de OPDA en 10 ml de citrato 0,1M, pH 4,5 y 5 pl de H2O2) a cada pocillo (100 pl) durante 15 minutos, en la oscuridad. La reaccion se detuvo mediante la adicion de HCl 1N 50 pl, y se leyo la absorbancia a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia).

Descripcion del ensayo de opsonofagocitosis (EOF)

Las muestras de suero se calentaron durante 45 minutos a 56 °C, para inactivar cualquier complemento endogeno remanente. Se realizaron diluciones en serie de dos, de alfcuotas de 25 pl de cada uno de los sueros de muestra diluido 1:2, en 25 pl de tampon EOF (SSBH (solucion salina balanceada de Hank)-SFT (suero fetal de ternera) al 14,4 %) por cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos de fondo redondo. Posteriormente, se agregaron 25 pl de una mezcla de celulas HL-60 activadas (1 x 107 celulas/ml), inoculo de trabajo neumococico recien descongelado y complemento de conejo lactante recien descongelado, en una relacion, por ejemplo, de 4:2:1 (v/v/v) (excepto para los serotipos 1, 6B y 6A, para los cuales la relacion fue de 4:2:2) a los sueros diluidos, para obtener un volumen final de 50 microlitros. La placa de ensayo se incubo durante 2 h a 37 °C con agitacion orbital (210 rpm), para promover el proceso de fagocitosis. La reaccion se detuvo colocando la microplaca en hielo durante al menos 1 minuto, manteniendo la placa en hielo hasta utilizarla. Se tomo una alfcuota de 20 pl de cada pocillo de la placa y se transfirio al correspondiente pocillo de una microplaca de 96 pocillos de fondo plano y se anadieron 50 pl de caldo Todd-Hewitt/agar al 0,9 %, a cada pocillo. Despues de incubar durante una noche a 37 °C con CO2 al 5 %, las colonias de neumococos que aparecieron en el agar se contaron utilizando un sistema de analisis automatico de imagenes (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se utilizaron ocho pocillos sin suero de muestra como controles bacterianos, para determinar el numero de neumococos por pocillo. El numero promedio de UFC de los pocillos de control se determino y se uso para calcular la actividad mortal de cada muestra de suero. El tftulo de EOF de las muestras de suero se determino por dilucion recfproca del suero capaz de facilitar la muerte del 50 % de los neumococos. El tftulo de opsonofagocitosis se calculo utilizando un analisis de ajuste de curva de 4 parametros.

Inmunogenicidad de tres formulaciones de vacuna, en ratones

Se inmunizaron dos grupos de 27 ratones hembra Balb/c en 2 experimentos, por inyeccion intramuscular (IM) en los dfas 0, 14 y 28, con 1/10 la dosis humana de diferentes formulaciones, que incluyeron: las protefnas solas (PhtD, dPly y PE-PilA), lotes GMP de Prevnar 13 (TM, vacuna estreptococica disponible en el comercio - resultados no presentados) 10V, 12V (DSP2A017) y protefnas 12V+ (DSP2A012). Los ratones recibieron en una pata diferente (imitando la coadministracion en diferentes sitios en lactantes en estudios clfnicos) 1/10 de la dosis humana de Infanrix Hexa (TM una vacuna que comprende toxoide difterico, toxoide tetanico, toxoide pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina, antfgeno de superficie de hepatitis B, polio virus inactivados tipos 1, 2 y 3, y sacarido de Haemophilus influenzae b (PRP)).

La concentracion de anticuerpos anti IgG y el tftulo de opsonofagocitosis, se determinaron respectivamente en los sueros individuales y en los sueros combinados tomados en el dfa 42.

Se evaluo el potencial de la vacuna 12V + protefnas para inducir tftulos de anticuerpos IgG y actividad opsonica, y se comparo con el potencial de las vacunas 12V (dodecavalente) y 10V (decavalente).

El suero de ratones inyectados con diferentes formulaciones se ensayo mediante ELISA (tal como se describio anteriormente), frente a los serotipos de polisacarido y las protefnas, y en EOF frente a los 12 serotipos de polisacarido.

La vacuna 12V + protefnas indujo una respuesta similar a la vacuna 12V para la mayorfa de los serotipos.

Los resultados de la Figura 31 demuestran que no hay ninguna diferencia estadfstica entre la respuesta de anticuerpos frente a PE, PilA, PhtD, Ply y PD medida para la formulacion 12V+ y una formulacion que no comprende los conjugados de sacaridos de S. pneumoniae.

Ejemplo 23: Comparacion de la inmunogenicidad de las vacunas 10V, 12V y 12V+protefnas, en cobayas

Descripcion del ensayo de ELISA de PS con anticuerpos frente a polisacarido neumococico

Se recubrieron microplacas durante 2 horas a 37 °C con 100 pl por pocillo de 2,5 pg/ml de PS1, 5 pg/ml de PS4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V o 14; 10 pg/ml de PS19A y 23F, 40 pg/ml de PS18C y PS19F, o anticuerpo de cabra frente a IgG de cobaya Affinipure (2,4 mg/ml) diluido a 2 pg/ml para los pocillos de referencia, en PBS. Las placas se lavaron tres veces con NaCl 150 mM (al 0,9 %)/Polisorbato 20 al 0,05 %. Los sueros combinados de cada grupo se diluyeron (1/2 para PS 6A y 6B y 1/10 para todos los demas serotipos) en PBS/Polisorbato

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20 al 0,05 % que contine PSC (1 mg de PSC/ml de suero no diluido, excepto para 6A y 6B, a 2,5 mg/ml) V/V, y se incubo durante 1 hora a 37 °C, con el fin de neutralizar los anticuerpos dirigidos frente al PSC. Se agrego suero de cobayas inmunizadas de la manera descrita en la seccion “inmunogenicidad de tres formulaciones de vacunas en cobayas” a los micropocillos y se realizaron diluciones en serie de 100 pl (etapa de diluciones dobles) en PBS/Polisorbato 20 al 0,05 % o una referencia (IgG de cobaya Chrompure (11 mg/ml) diluida a 0,25 pg/ml con PBS-polisorbato 20 al 0,05 %). Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitacion. Las placas se lavaron de la manera anteriormente descrita, y se anadieron los anticuerpos anti IgG de cobaya conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo) y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitacion. Despues de lavar, se anadio el sustrato (4 mg de OPDA en 10 ml de citrato 0,1M, pH 4,5-4,6, y 5 pl de H2O2) a cada pocillo (100 pl) y se incubo durante 15 minutos, en la oscuridad. La reaccion se detuvo mediante la adicion de HCl 1N. La absorbancia se leyo a 490 nm (620 nm para la referencia), mediante el uso de un espectrofotometro. El color desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en el suero.

Descripcion del ensayo de ELISA para medir anticuerpos anti PD, PE y PilA

Se recubrieron microplacas durante 2 horas a 37 °C con 100 pl por pocillo de 2 pg/ml de PD (1 mg/ml), 2 pg/ml de PE (1.500 pg/ml), o 2 pg/mg de PilA (3.660 pg/ml) en tampon de carbonato, pH 9,6, en PBS, o suero de cabra anti IgG de cobaya Affinipure (2,4 mg/ml) diluido a 2 pg/ml para los pozos de referencia en PBS. Las placas se lavaron cuatro veces con NaCl al 0,9 %/Polisorbato 20 al 0,05 %. Para los ELISA de PE y PilA (esta etapa no se llevo a cabo para los ELISA de PD y Ply), las placas se saturaron 30 min a temperatura ambiente con PBS-BSA al 1 %. Despues de lavar, se agregaron sueros de cobayas inmunizadas de la manera descrita en la seccion “inmunogenicidad de tres formulaciones en cobayas” o una muestra de suero de referencia (una referencia interna calibrada con IgG de cobaya Chrompure) a los pocillos de la microplaca, y se realizaron diluciones en serie de 100 pl (etapa de dilucion doble) en PBS/polisorbato 20 al 0,05 % (para el ELISA de PD) y en PBS-Polisorbato 20 al 0,05 %/BSA al 0,1 % para las ElISA de PE y PilA. Las placas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Despues de lavar, las placas se incubaron con anticuerpos anti IgG de cobaya conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo), a temperatura ambiente durante 30 minutos, con agitacion. Las placas se lavaron de la manera anteriormente descrita, y se anadio el sustrato conjugado (4 mg de OPDA en 10 ml de citrato 0,1M, pH 4,5-4,6, y 5 pl de H2O2) a cada pocillo (100 pl) durante 15 min, en la oscuridad. La reaccion se detuvo mediante la adicion de HCl 1N 50 pl, y se leyo la absorbancia a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia).

Descripcion del ensayo de ELISA para medir los anticuerpos contra PhtD y dPly

Se recubrieron microplacas durante 2 horas a 37 °C con 100 pl por pocillo de 1 pg/ml de PhtD (1,021 pg/ml) o 2 pg/ml de Ply (376 pg/ml), en PBS. Despues, las placas se lavaron 4 veces con NaCl al 0,9 %/Polisorbato 20 al 0,05 %. Despues de lavar, se anadieron sueros de cobayas inmunizadas de la manera descrita en la seccion “inmunogenicidad de tres formulaciones de vacuna en cobayas” o una referencia (una referencia interna calibrada con IgG de cobaya Chrompure) a los pocillos de la microplaca, y se diluyeron en serie 100 pl (etapa de diluciones dobles) en PBS/Polisorbato 20 al 0,05 %. Las placas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con agitacion. Despues de lavar, las placas se incubaron con anticuerpos anti IgG de cobaya conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo), a temperatura ambiente durante 30 minutos, con agitacion. Las placas se lavaron de la manera anteriormente descrita y se agrego el sustrato conjugado (4 mg de OPDA en 10 ml de citratos 0,1 M, pH 4,5-4,6, y 5 pl de H2O2) a cada pocillo (100 pl) durante 15 min, en la oscuridad. La reaccion se detuvo mediante la adicion de HCl 1N, 50 pl, y la absorbancia se leyo a 490 nm (a 620 nm para el filtro de referencia).

Ensayo de opsonofagocitosis

Se calentaron muestras de suero durante 45 min a 56 °C, para inactivar cualquier Complemento endogeno remanente. Se tomaron alfcuotas de 25 pl de cada suero diluido a 1:2, se diluyeron en series de dos en 25 pl de amortiguador EOF (SSBH (solucion salina balanceada de Hank-SFT (suero fetal de ternera) al 14,4 % inactivado) por cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos de fondo redondo. Posteriormente, se anadieron 25 pl de una mezcla de celulas HL-60 (1 x 107 celulas/ml) activadas, suero de trabajo neumococico recien descongelado y complemento de conejo lactante recien descongelado, por ejemplo en una relacion de 4/2/1 (v/v/v) (excepto para los serotipos 1, 6B y 6A, para los cuales la relacion fue de 4/2/2) a los sueros diluidos, para obtener un volumen final de 50 pl. La placa de ensayo se incubo durante 2 h a 37 °C con agitacion orbital (210 rpm), para promover el proceso fagocftico. La reaccion se detuvo colocando la microplaca en hielo durante al menos 1 minuto (la placa se debe mantener en hielo hasta su posterior uso). Entonces, se transfirio una alfcuota de 20 pl de cada pocillo de la placa al correspondiente pocillo de una microplaca de 96 pocillos de fondo plano y se anadieron 50 pl de caldo Todd-Hewitt/agar al 0,9 % a cada pocillo. Despues de una noche de incubacion a 37 °C con CO2 al 5 %, las colonias de neumococos que aparecieron en el agar, se contaron mediante el uso de un sistema de analisis de imagenes automatico (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se utilizaron 8 pocillos sin suero como controles bacterianos, para determinar el numero de neumococos por pocillo. Se determino el numero promedio de UFC de los pocillos control y se uso para calcular la actividad mortffera de cada muestra de suero. Se determino el tftulo de EOF para las muestras de

Claims

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1. Una composicion inmunogenica que comprende conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y un componente proteico que comprende PilA o un fragmento inmunogenico de PilA de Haemophilus influenzae, en el que el numero de serotipos de sacaridos de Streptococcus pneumoniae es menor que o igual a 23.
2. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 1, en la que el componente proteico comprende PilA de Haemophilus influenzae.
3. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 1, en la que el componente proteico comprende Protefna E o un fragmento inmunogenico de Protefna E y PilA o un fragmento inmunogenico de PilA de Haemophilus influenzae.
4. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 2, en la que el componente proteico comprende Protefna E y PilA de Haemophilus influenzae.
5. La composicion inmunogenica de una cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en la que la Protefna E o el fragmento inmunogenico de la Protefna E es un polipeptido que comprende una secuencia que tiene al menos el 75 %, 77 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de indentidad, sobre la longitud completa, con la SEQ ID NO. 4.
6. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 3, 4 o 5, en la que el fragmento inmunogenico de Protefna E es un polipeptido que comprende un fragmento inmunogenico de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75 o 100 aminoacidos contiguos de la SEQ ID NO. 4.
7. La composicion inmunogenica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que PilA o el fragmento inmunogenico de PilA es un polipeptido que comprende una secuencia que tiene al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad, sobre la longitud completa, con la SEQ ID NO. 58.
8. La composicion inmunogenica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que PilA o el fragmento inmunogenico de PilA es un polipeptido que comprende un fragmento inmunogenico de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoacidos contiguos de la SEQ ID NO. 58.
9. La composicion inmunogenica de cualquier reivindicacion precedente, que comprende Protefna E o un fragmento inmunogenico de protefna E unido covalentemente a PilA o un fragmento inmunogenico de PilA para formar una protefna de fusion.
10. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 9, en la que la protefna de fusion tiene la formula I:

(X) m - (R1)n - A - (Y) o - B - (Z)p (formula I)

en la que:

X es un peptido senal o MHHHHHH (SEQ ID NO. 2); m es 0;

R1 es un aminoacido; n es 0; o es 0 o 1;

Z es GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3); p es 0 o 1;

A es un fragmento inmunogenico de Protefna E, en el que la protefna E se selecciona de una cualquiera de la SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57;

Y es GG;

y B es un fragmento inmunogenico de PilA, en el que PilA se selecciona de una cualquiera de la SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.
11. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 9 o 10, en la que la protefna de fusion es la SEQ ID NO.194.
12. La composicion inmunogenica de una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en la que la protefna de fusion es al menos el 95 %, 98 % o 99 % identica a cualquiera de la SEQ ID NO. 136, SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 o SEQ ID NO. 204, opcionalmente en la que el peptido senal se ha retirado.
13. La composicion inmunogenica de la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, en la que la protefna de fusion es la SEQ ID NO. 148 y el peptido senal se ha retirado (SEQ ID NO. 177) o en la que la protefna de fusion es

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la SEQ ID NO. 194 y el peptido serial se ha retirado (SEQ ID NO. 219).
14. La composicion inmunogenica de cualquier reivindicacion precedente, en la que los conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae comprenden un sacarido conjugado de serotipo 1, un sacarido conjugado de serotipo 4, un sacarido conjugado de serotipo 5, un sacarido conjugado de serotipo 6B, un sacarido conjugado de serotipo 7F, un sacarido conjugado de serotipo 9V, un sacarido conjugado de serotipo 14, un sacarido conjugado de serotipo 18C, un sacarido conjugado de serotipo 19F y un sacarido conjugado de serotipo 23F.
15. La composicion inmunogenica de cualquier reivindicacion precedente, en la que los conjugados de sacarido capsular de Streptococcus pneumoniae comprenden adicionalmente un sacarido conjugado de serotipo 6A y un sacarido conjugado de serotipo 19A.
16. La composicion inmunogenica de cualquier reivindicacion precedente, en la que los conjugados de sacarido capsular de Streptococcus pneumoniae comprenden adicionalmente un sacarido conjugado de serotipo 33F y un sacarido conjugado de serotipo 22F.
17. La composicion inmunogenica de cualquier reivindicacion precedente, en la que el conjugado de sacarido capsular de Streptococcus pneumoniae se conjuga con una protefna de vehfculo seleccionada de manera independiente del grupo que consiste en toxoide tetanico (TT), fragmento C de TT, toxoide difterico, CRM197 (material de reaccion cruzada 197), Pneumolisina, protefna D (de H.influenzae), PhtD (trfada de polihistidina D), PhtDE (una fusion entre la trfada de histidina neumococica D y E) y N19.
18. La composicion inmunogenica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en la que los conjugados de

sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae comprenden un sacarido de serotipo 1 conjugado con

protefna D, un sacarido de serotipo 4 conjugado con protefna D, un sacarido de serotipo 5 conjugado con

protefna D, un sacarido de serotipo 6B conjugado con protefna D, un sacarido de serotipo 7F conjugado con

protefna D, un sacarido de serotipo 9V conjugado con protefna D, un sacarido de serotipo 14 conjugado con

protefna D, un sacarido de serotipo 23F conjugado con protefna D, un sacarido de serotipo 18C conjugado con toxoide tetanico y un sacarido de serotipo 19F conjugado con toxoide difterico.
19. La composicion inmunogenica de cualquier reivindicacion precedente, en la que la composicion inmunogenica comprende adicionalmente al menos una protefna de Streptococcus pneumoniae conjugada o no conjugada seleccionada del grupo que consiste en la familia de la trfada de polihistidina (PhtX), pneumolisina detoxificada (dPly), familia de protefna de union a colina (CbpX), truncados de CbpX, familia de LytX (enzimas autolfticas), truncados de LytX, protefnas quimericas truncado de CbpX-truncado de LytX, PcpA (Protefna A de union a colina neumococica), PspA (Protefna A de superficie neumococica), PsaA (Adesina A de superficie neumococica), Sp128 (Sterptococcus pneumoniae 128), Sp101 (Streptococcus pneumoniae 101), Sp130 (Streptococcus pneumoniae 130), SP125 (Streptococcus pneumoniae 125) y SP133 (Streptococcus pneumoniae 133).
20. Una vacuna que comprende la composicion inmunogenica de cualquier reivindicacion precedente y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
21. Una composicion inmunogenica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 o una vacuna de acuerdo con la reivindicacion 20, para su uso en el tratamiento o prevencion de enfermedades causadas por infeccion por Streptococcus pneumoniae o una infeccion por Haemophilus influenzae, en la que las enfermedades comprenden al menos una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en neumonfa, enfermedad neumococica invasiva (ENI), exacerbaciones de enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), otitis media, meningitis, bacteriemia y conjuntivitis.