KR20150047538A

KR20150047538A - 망막 색소 상피 세포 시트의 제조 방법

Info

Publication number: KR20150047538A
Application number: KR1020157007102A
Authority: KR
Inventors: 마사요 다카하시; 히로유키 가마오
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 리가가쿠 겐큐소
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2015-05-04
Also published as: AU2013306720B2; EP2889374B1; JP6292557B2; KR102254082B1; BR112015003839B1; US11033586B2; JPWO2014030749A1; HK1210496A1; CA2882802C; SG11201501319PA; US20150250828A1; AU2013306720A1; CA2882802A1; EP2889374A4; CN104755611A; WO2014030749A1; CN113088481A; ZA201501976B; EP2889374A1; BR112015003839A2

Abstract

본 발명은 망막 색소 상피 세포층과, 혈관 형성능을 갖는 줄기 세포 또는 혈관 구성 세포로 구성되는 혈관 형성 세포층을 적층하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포층 및 혈관 형성 세포층을 포함하는 세포 시트의 제조 방법, 및 상기 방법에 의해 얻어진 세포 시트를 제공한다. 또한, 본 발명은 생체 외에서 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 얻어진 망막 색소 상피 세포로 형성된 세포층, 상기 세포로부터 분비된 기저막 및 혈관 형성능을 갖는 줄기 세포 또는 혈관 구성 세포로 구성되는 혈관 형성 세포층을 포함하는 이식용 세포 시트를 제공한다.

Description

망막 색소 상피 세포 시트의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING RETINAL PIGMENT EPITHELIAL CELL SHEET}

본 발명은 망막 색소 상피 세포층과 이식 후에 혈관을 구성하는 세포의 층을 적층하는 것을 특징으로 하는 세포 시트의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 망막 색소 상피 세포로 형성된 세포층, 기저막 및 이식 후에 혈관을 구성하는 세포의 층을 포함하는 이식용 세포 시트에 관한 것이다.

망막 색소 상피 세포를 생체 내에 있어서의 형태에 가까운 세포 시트 상태로 이식하여 망막 변성 질환을 치료하는 방법이 시도되고 있다. 예를 들어, 가령황반 변성 환자의 망막 조직으로부터 망막 색소 상피 세포를 (맥락막을 수반하는 층으로서) 절출한 세포 시트를, 장애를 받은 황반 부분에 이식하는 자가 조직 이식이 실시되고 있다 (예를 들어 비특허문헌 1 - 3). 이 환자 조직 유래의 세포 시트는, 이식 수술 외에 환자 망막의 절제 수술에 의한 침습 리스크가 더해져 합병증의 발증률이 높고, 이식 후의 황반 기능의 개선이나 안정 유지의 효과가 인정되는 비율이 낮은 등의 문제가 있었다.

또, 환자 망막의 채취에 의하지 않고, 생체 외에서 배양한 망막 색소 상피 세포를 이용하는 방법으로서, 매우 무른 단층 상피의 강성 부족을 보충하기 위해, 인공막이나 양막 상에서 망막 색소 상피 세포를 배양한 세포 시트를 이식에 사용하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 인공막은, 생체 내에서 망막 색소 상피 세포 자체가 만드는 기저막과는 조성이나 성질, 강성 등이 상이하고, 염증이나 그것에 수반되는 거부 반응을 쉽게 야기하기 때문에, 이식 용도에는 적합하지 않았다. 이것에 대하여, 본 발명자들은, 생체 외에서 배양한 망막 색소 상피 세포와 당해 세포 자체가 만드는 기저막으로 구성된 세포 시트를 간이하게 제조하는 방법을 보고하고 있다 (예를 들어 특허문헌 1 등). 이 방법에 의해 얻어지는 세포 시트는, 생체와 동일한 성분의 기저막을 수반하기 때문에, 생착되기 쉽고, 강성이 있어 취급성이 우수하여, 이식 치료 용도에 바람직하다.

여기서, 망막 색소 상피의 장애는, 맥락막의 섬유화나 위축을 병발하고, 맥락막 모세 혈관이 부족하여, 망막 색소 상피나 시세포로의 영양 공급이 불능이 되어 있는 경우가 있다. 이와 같은 증상에 대해서는, 기저막을 수반하는 망막 색소 상피 세포의 시트를 이식하여도, 맥락막 모세 혈관이 부족하기 때문에, 이식 후의 망막 색소 상피로 영양이나 산소가 충분히 공급되지 않기 때문에, 이식된 세포가 생체 내에서 기능을 충분히 발휘하지 못하여, 본래의 치료 효과가 얻어지기 어렵다는 문제가 있었다.

한편, 혈관 재생을 이용한 치료법으로서, 내피 전구 세포를 이식하고, 생체 내에서 혈관을 형성하여 망막 질환을 치료하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어 특허문헌 2 는, 유리체 내에 주입한 골수 유래 내피 전구 세포가 망막의 성상 세포에 국재하고, 맥관에 주입됨으로써 정상적인 망막 혈관을 형성한 것을 보고하고 있다. 그러나, 내피 전구 세포가 성상 세포에 국재하는 성질을 이용한 망막 혈관을 재생하는 특허문헌 2 의 방법에 의해서는, 위치적으로도 격리되어 있는 망막 색소 상피 세포나 시세포를 보호하는 맥락막 혈관을 형성할 수 없었다.

특허문헌 1: WO2011/142364 특허문헌 2: JP-A 2005-538742호

비특허문헌 1: Am J Ophthalmol. 2012 Jan；153 (1)：120-7 비특허문헌 2: Acta Ophthalmol. 2011 Sep；89 (6)：e490-5 비특허문헌 3: Br J Ophthalmol. 2011 Mar；95 (3)：370-5

본 발명의 과제는, 인공막을 사용하지 않고, 간편하고 안정적으로 망막 색소 상피 세포 시트를 제조하는 새로운 방법을 개발하고, 이로써 망맥락막 변성 질환, 특히 망맥락막의 위축을 수반하는 강도 근시나 중증의 포도막염 등의 질환 환자에 대해서도 생착률 (engraftment rate)이 높은, 기능성이 우수한 이식용 망막 색소 상피 세포 시트를 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 망막 색소 상피 세포층과 이식 후에 혈관을 형성하는 능력을 갖는 세포를 적층하는 것을 포함하는 세포 시트의 제조 방법을 개발하였다. 이러한 방법에 의해 얻어지는 세포 시트는, 망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층의 양방을 포함하기 때문에, 환자에게 이식하면 망막 조직을 재구축할 뿐만 아니라, 맥관 형성을 통해서 맥락막도 재구축하기 때문에, 망맥락막 변성 질환, 특히 맥락막의 장애를 수반하는 망막 변성 질환의 치료에 유용한 것을 알아냈다. 또한, 망막 색소 상피 세포층을, 콜라겐 겔층 상에 망막 색소 상피 세포를 파종하고 배양함으로써 조제하면, 얻어지는 망막 색소 상피 세포층은, 콜라겐 겔과 망막 색소 상피 세포 시트간에 기저막을 유지하고 있고, 생체 내의 망막 색소 상피 세포와 동일한 사이토카인 분비능 및 세포간의 밀착성을 갖고, 콜라게나아제로 콜라겐 겔을 분해함으로써 기저막을 유지한 채로 망막 색소 상피 세포층을 용이하게 세포 배양 기재로부터 박리할 수 있었다. 또, 망막 색소 상피 세포층을 구성하는 세포는, 망막 색소 상피 세포 특이적 마커의 발현을 유지하고 있었다. 이들의 지견에 기초하여 더욱 검토를 더한 결과, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하를 제공한다：

[1] 망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층을 적층하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포층 및 혈관 형성 세포층을 포함하는 세포 시트의 제조 방법.

[2] 혈관 형성 세포층이 망막 색소 상피 세포층의 기저면과 접촉하도록, 망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층을 적층하는 [1] 에 기재된 제조 방법.

[3] 혈관 형성 세포층이 혈관 아세포, 혈관 내피 전구 세포 및 혈관 내피 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 세포로 이루어져 있는 [1] 또는 [2] 에 기재된 제조 방법.

[4] 혈관 형성 세포층이 세포 시트가 이식될 환자 유래 조직 혹은 세포, 또는 환자의 HLA 형과 매칭되는 HLA 형을 가지는 도너 (donor) 유래 세포로 이루어져 있는 [1] 또는 [2] 에 기재된 제조 방법.

[5] 망막 색소 상피 세포층이 이하의 공정을 포함하는 방법에 의해 제조되는 세포 시트인 [1] - [4] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법：

(1) 콜라겐 겔 상에 망막 색소 상피 세포를 파종, 배양하여, 망막 색소 상피 세포로 이루어진 세포 시트를 형성시키는 공정,

(2) 콜라겐 겔을 콜라게나아제로 분해하여, 망막 색소 상피 세포로 이루어진 세포 시트를 박리하는 공정.

[6] 망막 색소 상피 세포가 ES 세포, iPS 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 얻어진 세포인 [1] - [5] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

[7] [1] - [6] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조된 세포 시트.

[8] 생체 외 (ex vivo)에서 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 얻어진 망막 색소 상피 세포로 형성된 세포층, 상기 세포로부터 분비된 기저막 및 혈관 형성 세포층을 포함하는 이식용 세포 시트.

본 발명에 의해, 생체 내의 결손된 맥락막 혈관을 보충하고, 이식 후에 산소나 양분을 망막에 보급할 수 있는 혈관 구성 세포층을 갖는 망막 색소 상피 세포의 적층 시트를 간이하고 안정적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 세포 시트는, 생착률 및 기능성이 우수하기 때문에, 망맥락막 변성 질환, 특히 망맥락막 위축을 수반하는 강도 근시나 중증의 포도막염 등, 망막 색소 상피 세포 이식만으로는 충분한 치료 효과를 얻기 어려운 위독한 망맥락막 변성 질환도 치료의 대상으로 할 수 있기 때문에 매우 유용하다.

도 1 은 본 발명의 세포 시트를 이식한 숙주의 조직 절편의 면역 조직 화학 염색을 나타내는 도면이다.
도 2(A) 는 배지마다의 혈관 내피 전구 세포의 맥관 형성수를 나타내는 그래프이고, 도 2(B) 는 마트리겔을 사용한 경우의 배지마다의 혈관 내피 전구 세포의 맥관 형성수를 나타내는 그래프이다.
도 3 은 망막 색소 상피 세포 시트의 사이토카인 분비능을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.

이하에, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층을 적층하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포층 및 혈관 형성 세포층을 포함하는 세포 시트의 제조 방법 (본 발명의 제조 방법) 을 제공한다.

1. 혈관 형성 세포층

본 발명에 있어서의 혈관 형성 세포층은, 혈관 형성능을 갖는 세포 (혈관 형성 세포) 로 구성되어 있다. 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 시트를 망막 변성증 환자의 맥락막 결손 부위에 이식하면, 이식 부위에 있어서 당해 세포 시트에 포함되는 혈관 형성 세포가 혈관 (바람직하게는, 맥락막 혈관) 을 재구성함으로써 망막 색소 상피 세포로의 산소나 영양분의 공급 등을 담당한다. 그 때문에, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 시트는, 특히 맥락막 결손을 수반하는 망막 변성 질환의 환자의 맥락막 결손 부위에 이식함으로써 우수한 치료 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명에 있어서의 혈관 형성 세포는, 포유 동물 (예：인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트 등) 유래의 세포이면, 어느 포유 동물 유래의 세포여도 되는데, 바람직하게는 인간 유래의 세포이다.

본 발명에 사용되는 혈관 형성 세포로는, 예를 들어 혈관 아세포, 혈관 내피 전구 세포, 혈관 내피 세포 등을 들 수 있다. 그 중에서도 혈관 형성 세포로는, 이식 후에 생체 내에서 맥관 형성하는 과정에서 기존의 혈관망에 쉽게 주입된다고 생각되는 점에서, 혈관 내피 전구 세포 등이 바람직하다. 혈관 형성 세포층에는 혈관 형성 세포 이외의 세포 및 세포 이외의 성분이 포함되어 있어도 되고, 혈관 형성 세포를 포함하는 세포 집단 또는 조직으로 구성되어 있어도 된다. 혈관 형성 세포층을 구성하는 세포의 통상 70 ％ 이상 (바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 가장 바람직하게는 100 ％) 이 혈관 형성 세포 (바람직하게는 혈관 내피 전구 세포) 이다.

혈관 내피 전구 세포란, 혈관 내피 세포로 분화하는 능력을 갖고, 혈관 내피 세포로의 분화가 커밋팅된 세포를 말한다. 또한, 혈관 내피 전구 세포에 대해서는, 복수의 세포 표면 마커의 발현 패턴이 보고되어 있고, 적어도 세포 표면 마커의 발현 패턴에 의한 통일된 정의는 곤란하다는 것이 알려져 있다. 과거에 보고된 혈관 내피 전구 세포의 표면 마커의 발현 패턴에는, 말초혈 단핵세포 유래 CD34 양성 혈관 내피 세포 CD34^＋, CD44^＋, VEGFR2^＋(KDR) (Science. 1997 Feb 14；275 (5302)：964-7)；제대혈 단핵세포 유래 혈관 내피 전구 세포 CD31^＋, VEGFR2^＋, eNOs^＋, CD105^＋, CD34^＋／-, CD133^-, CD45^-, CD14^-, CD117^- (인간 내피 콜로니 형성 세포 (ECFCs (등록 상표), 다카라 바이오사 제조))；등을 들 수 있다. 이들은, 각각 유래하는 조직, 분화 스테이지, 채취 방법 등의 차이에서 기인되는 것이라고 생각되는데, 모두 혈관 내피 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포인 점에 있어서 공통된다. 따라서, 본원 명세서에 있어서는, 혈관 내피 전구 세포를 "혈관 내피 세포로 분화하는 능력을 갖고, 혈관 내피 세포로의 분화가 커밋팅된 세포"라고 정의하는 것으로 하고, 세포 표면 마커의 발현 패턴은 복수의 조합의 존재를 허용하는 것으로 한다.

혈관 내피 전구 세포는, 난황낭, 말초혈, 골수, 제대혈 및 이들의 단핵세포 등에 포함되는 것이 알려져 있고, 이들 조직 또는 세포로부터 공지된 단리 방법을 사용하여 조제할 수 있다. 단리 방법으로는, 예를 들어 CD34, VEGF 수용체 2 (KDR) 등의 세포 표면 마커의 발현을 지표로 하여 자기 비즈나 FACS 를 사용하여 단리하는 방법；시판되는 내피 세포 콜로니 형성 유닛 (CFU-ECs；endothelial cell colony-forming units) 을 이용하는 방법 (N Engl J Med. 2003；348：593-600) 등을 들 수 있다. 말초혈 단핵세포 또는 골수 단핵세포 유래 혈관 내피 전구 세포의 제법의 구체예로는, 말초혈이나 골수로부터 관용의 방법에 의해 분리한 단핵세포를, VEGF 등의 사이토카인을 포함하는 혈관 내피 분화 촉진 배지를 사용하여 배양하고, 혈관 내피 전구 세포를 부착 세포로서 회수하는 방법；G-CSF 를 사용하여 골수로부터 동원한 혈관 내피 전구 세포를, 말초혈 중에서 CD34 양성 세포로서 분리 회수하는 방법 (Yakugaku Zasshi 2007 125 (5) 841-845 등) 등이 알려져 있다.

또, 혈관 내피 전구 세포는, 여러 가지 세포로부터 분화 유도할 수도 있고, 예를 들어 섬유아 세포로부터 탈분화를 거쳐 분화 유도하는 방법；ES 세포, iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 혈관 내피 전구 세포를 분화 유도하는 방법 (WO2008/056779, WO2009/035217 등) 등이 알려져 있다. 이들 혈관 내피 전구 세포는, 단일로 또는 복수의 종류를 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 혈관 내피 전구 세포로서 다른 세포를 포함하는 세포 혼합물을 사용할 수도 있고, 예를 들어 혈관 내피 전구 세포를 포함하는 골수 세포, 말초혈 단핵세포, 골수 단핵세포 등을 그대로 사용할 수도 있다.

혈관 내피 세포는, 생체 내의 혈관 조직으로부터 CD31 등의 세포 표면 마커의 발현을 지표로 하여 자기 비즈나 FACS 를 사용하여 분리하는 방법；상기 혈관 내피 전구 세포를 VEGF 등의 유도 인자의 존재하에서 배양하여 분화 유도하는 방법 등의 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 또, 혈관 내피 세포는, 여러 가지 세포로부터 분화 유도할 수도 있고, 예를 들어 간엽계 줄기 세포, 지방 조직 유래 줄기 세포 등의 체성 줄기 세포；심근 전구 세포, 신경 전구 세포 등의 전구 세포；ES 세포, iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포 등으로부터 분화 유도할 수 있는 것이 알려져 있다. 또한, 혈관 내피 세포의 시판품으로서, 인간 미소 혈관 내피 세포 (HMVEC), 인간 제대 정맥 혈관 내피 세포 (HUVEC), 인간 대동맥 혈관 내피 세포 (HAEC, HAOEC) 등이 입수 가능하다.

혈관 아세포는, 혈관 내피 전구 세포와 조혈계 줄기 세포의 공통의 조상이 되는 세포로서, 생체 내의 혈관 조직으로부터 CD133, CD144, CD45 등의 세포 표면 마커의 발현을 지표로 하여 자기 비즈나 FACS 를 사용하여 분리하는 방법 등의 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 혈관 아세포의 세포 표면 마커의 발현 패턴으로서, 예를 들어 CD133^＋, CD144^＋, CD45^＋, CD34^＋, VEGFR2^＋, CD31^- 의 조합이 보고되어 있다 (Stem Cells Dev. 2004 Jun；13 (3)：229-42).

본 발명에 사용되는 혈관 형성 세포로는, 예를 들어 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 시트의 이식 대상이 되는 환자 유래 조직 혹은 세포, 또는 환자의 HLA 형과 매칭되는 HLA 형을 가지는 도너 유래 세포 등을 이용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 혈관 형성 세포로는, 특히 혈관 내피 전구 세포가 바람직하다.

자가 이식 용도에 바람직한 혈관 형성 세포로는, 환자로의 부담이 적은 점에서, 예를 들어 환자 조직, 이것으로부터 채취한 세포, 환자 체세포로부터 수립된 iPS 세포 (환자 iPS 세포) 유래 세포가 바람직하게 사용된다. 침습이 적은 점에서, 환자 말초혈, 그것으로부터 채취한 단핵세포, 환자 말초혈 단핵세포 유래 세포, 환자 iPS 세포 유래 세포 등이 바람직하게 사용된다. 이들은, 환자 유래 세포를 사용하여 상기 서술한 방법에 의해 조제할 수 있다.

타가 이식 용도에 바람직한 혈관 형성 세포로는, 거부 반응을 억제하는 점에서, 예를 들어 환자의 HLA 형과 매칭되는 HLA 형을 가지는 도너 유래 세포가 바람직하게 사용된다. 환자의 HLA 형과 매칭되는 HLA 형을 가지는 도너 유래 세포에는, 환자의 HLA 형과 매칭되는 도너 조직, 이것으로부터 채취한 세포, 환자의 HLA 형과 매칭되는 HLA 형을 가지는 도너 체세포로부터 수립된 iPS 세포 (HLA 매칭 도너 iPS 세포) 에서 유래하는 세포 등이 포함된다. HLA 형이 매칭되는 도너 조직 및 세포는, 골수 뱅크나 세포 뱅크 등에서 입수할 수도 있다. 특히, 다른 HLA 형과의 거부 반응이 낮은 3 좌 (HLA-A, HLA-B, HLA-DR) 호모 접합형을 갖는 세포는, 많은 환자에게 적합하기 때문에 도너 세포로서 바람직하다.

혈관 형성 세포층은, 혈관 형성 세포층이 망막 색소 상피 세포층의 기저면과 접촉하도록, 망막 색소 상피 세포층에 적층되어 있는 것이 바람직하다. 망막 색소 상피 세포층의 적어도 일부에 혈관 형성 세포층이 적층되어 있으면 된다. 망막 색소 상피 세포층에 대한 혈관 형성 세포의 밀도는 특별히 한정되지 않고, 이식 부위의 맥락막의 장애 상황이나 기존의 혈관망과의 친화성 등을 고려하여, 적절히 선택하여 설정할 수 있다. 혈관 형성 세포가 저밀도이면, 혈관 형성 세포를 생체 내의 기존의 혈관에 주입하기 쉽다는 관점에서, 망막 색소 상피 세포층에 대한 혈관 형성 세포의 밀도는, 예를 들어 1 x 10² - 1 x 10⁶ 세포/㎠ 정도, 바람직하게는 1 x 10³ - 1 x 10⁵ 세포/㎠ 정도이다. 맥락막의 손상이 크고 잔존 혈관이 현저히 적은 환자로의 이식을 목적으로 하는 경우에는, 혈관 형성 세포가 고밀도인 혈관 형성 세포층이 바람직하다.

망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층을 적층하는 공정 (적층 공정) 으로는, 복수의 세포층을 적층하는 방법으로서 공지된 방법을 이용할 수 있다. 이와 같은 방법에는, 예를 들어 복수의 시트상의 세포층을 적층하는 방법, 일방의 시트상의 세포층 상에 타방의 세포층을 구성하는 세포를 파종하는 방법, 배양 용기 중에서 배양한 일방의 세포층 상에 타방의 시트상의 세포층을 중첩하는 방법, 배양 용기 중에서 배양한 일방의 세포층 상에 타방의 세포층을 구성하는 세포를 파종하는 방법 등이 포함된다. 본 발명에 있어서는, 혈관 형성 세포층이 망막 색소 상피 세포층의 기저면과 접촉하도록, 2 개의 세포층을 적층하는 것이 바람직하다. 예를 들어 배양 용기 중에서 배양한 혈관 형성 세포층 상에 시트상의 망막 색소 상피 세포층을 중첩함으로써, 혈관 형성 세포층이 망막 색소 상피 세포층의 기저면과 접촉한다. 배양 용기 내에서 적층하여 얻어진 세포 시트는, 그대로 이용에 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서의 적층 공정의 바람직한 양태로는, 예를 들어 배지를 사용하여 혈관 형성 세포를 배양 용기에 파종하고, 배양함으로써 혈관 형성 세포층을 배양 용기 중에 형성시킨 후, 별도 형성한 망막 색소 상피 세포 시트를 혈관 형성 세포층 상에 중첩하고 배지를 흡인함으로써, 혈관 형성 세포층이 망막 색소 상피 세포층의 기저면과 접촉하도록 양 세포층을 적층할 수 있다. 상기 배지로는, 혈관 형성 세포와 망막 색소 상피 세포를 유지 배양할 수 있는 조성이면 특별히 한정되지 않지만, 통상적으로 혈관 형성 세포 배양용 배지, 혈관 내피 전구 세포 배양용 배지 양쪽 모두 사용 가능하다. 예를 들어 혈관 내피 전구 세포 배양용 배지로서 다카라 바이오사 제조의 EGM-2 배지 등의 시판품을 이용할 수 있다. 혈관 형성 세포를 파종한 후, 적어도 배양 용기 표면에 세포가 접착하고, 혈관 형성 세포층을 형성하기 위해서 필요한 시간 (예를 들어 10 시간 - 24 시간 정도) 정치하는 것이 바람직하고, 필요에 따라 원하는 세포수까지 증식시키기 위해서 1 일 - 3 일 정도 배양 기간을 형성해도 된다.

본 발명의 제조 방법은, 추가로 망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층이 적층된 세포 시트를 회수하는 공정 (회수 공정) 을 포함하고 있어도 된다. 세포 시트를 회수하는 방법으로는, 시트 구조를 유지한 상태에서 회수할 수 있는 방법이면 특별히 한정되지 않고, 공지된 방법을 이용할 수 있다. 이와 같은 방법으로서, 예를 들어 효소 처리에 의해 배양 용기로부터 세포 시트를 박리하는 방법, 세포 비접착성 배양 용기를 사용하는 방법, 세포 접착성이 되도록 표면 처리된 배양 용기를 사용하여 세포층을 적층한 후에 효소 등으로 처리하여 형성된 세포 시트를 박리하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 적층 공정 중, 배양 용기 표면에 혈관 형성 세포가 접착하고, 세포가 고정됨으로써, 혈관 형성 세포층 상에 망막 색소 상피 세포층을 적층하기 쉬워지므로, 세포 접착성이 되도록 표면 처리된 배양 용기를 사용하여 세포층을 적층한 후에, 당해 배양 용기로부터 형성된 세포 시트를 박리하는 방법이 바람직하다. 일 양태에 있어서, 온도 응답성 폴리머로 표면 처리된 배양 용기 중에서 세포 시트를 형성한 후, 온도 변화에 의한 처리로 세포 시트를 박리한다. 온도 응답성 폴리머란, 온도 의존적으로 수화력 (hydration force)이 변화하는 폴리머를 말하고, 예를 들어 JP-A 2-211865호에 0 - 80 ℃ 의 온도 범위에서 수화력이 변화하는 온도 응답성 폴리머가 기재되어 있다. 구체적으로는, 예를 들어 이하의 모노머의 단독 중합 또는 공중합에 의해 얻어진다. 사용할 수 있는 모노머로는, 예를 들어 (메트)아크릴아미드 화합물, N-(혹은 N,N-디)알킬 치환 (메트)아크릴아미드 유도체, 또는 비닐에테르 유도체를 들 수 있고, 코폴리머의 경우에는, 이들 중에서 임의의 2 종 이상을 사용할 수 있다. 나아가서는, 상기 모노머 이외의 모노머류, 세포의 부착성이나 증식성을 향상시키기 위한 이온성 모노머와의 공중합, 폴리머끼리의 그래프트 또는 공중합, 혹은 폴리머, 코폴리머의 혼합물을 사용해도 된다. 온도 응답성 폴리머는, 온도를 바꿈으로써 수화, 탈수화를 일으키는 것으로, 그 온도역은 0 ℃ - 80 ℃, 바람직하게는 10 ℃ - 50 ℃, 더욱 바람직하게는 20 ℃ - 45 ℃ 이다. 바람직한 온도 응답성 폴리머로서 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 를 들 수 있다. 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 는 31 ℃ 에서 하한 임계 용해 온도를 갖는 폴리머이고, 유리 상태이면, 수중에서 31 ℃ 이상의 온도에서 탈수화를 일으켜 폴리머 사슬이 응집되어, 백탁된다. 반대로 31 ℃ 미만의 온도에서는 폴리머 사슬은 수화되어, 물에 용해된 상태가 된다. 이 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 를 배양 용기의 표면에 고정시키면, 31 ℃ 이상의 온도이면, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 가 탈수화됨으로써 배양 용기 표면이 소수성을 나타내게 되고, 세포 (예를 들어 혈관 형성 세포, 망막 색소 상피 세포) 에 대해 접착성이 되는 데에 반하여, 31 ℃ 미만의 온도에서는, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 가 수화되어, 배양 용기 표면이 친수성을 나타내게 되고, 세포에 대해 비접착성이 된다. 이 온도 응답성을 이용하여, 적층 공정에 있어서는, 하한 임계 용해 온도 (폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 의 경우 31 ℃) 이상의 온도 (예를 들어 37 ℃) 에서 세포를 배양하여, 세포 시트를 배양 용기에 접착시키고, 회수 공정에 있어서는, 하한 임계 용해 온도 미만의 온도 (예를 들어 20 ℃) 로 함으로써, 효소 처리를 필요로 하지 않고 세포 시트를 배양 용기로부터 박리하여, 단리하는 것이 가능하다. 이와 같은 온도 응답성 폴리머로 피복한 배양 용기에 대해서는, JP-A 2-211865호, JP-A 05-192138호, JP-A 2008-220354호 등에 기재되어 있다. 또, 이와 같은 배양 용기는 온도 감수성 배양 용기 (셀시드사 제조, UpCell (등록 상표)) 로서 시판품이 입수 가능하다. 배양 용기에 파종한 혈관 형성 세포는, 망막 색소 상피 세포층에 확실하게 전사되도록 하기 위해서는, 배양 용기 상에 접착되어 있는 것이 바람직하다.

바람직한 양태에 있어서, 혈관 형성 세포를, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 로 피복된 온도 응답성 배양 용기 중, 하한 임계 용해 온도 (31 ℃) 이상의 온도 (예를 들어 37 ℃) 에서 접착 배양함으로써 혈관 형성 세포층을 형성한다. 다음으로, 하한 임계 용해 온도 이상의 온도 (예를 들어 37 ℃) 를 유지한 채로, 별도 조제한 망막 색소 상피 세포층 (망막 색소 상피 세포 시트) 을 혈관 형성 세포층이 망막 색소 상피 세포층의 기저면과 접촉하도록, 혈관 형성 세포층 상에 적층한다. 혈관 형성 세포층과 망막 색소 상피 세포층이 접착하는 데에 충분한 시간, 하한 임계 용해 온도 이상의 온도 (예를 들어 37 ℃) 에서 인큐베이션한 후, 배양물을 하한 임계 용해 온도 미만 (예를 들어 20 ℃) 까지 냉각시킴으로써, 형성된 세포 시트를 배양 용기로부터 박리한다. 냉각 및 박리는, 예를 들어 배지를 흡인한 후, 하한 임계 용해 온도 미만 (예를 들어 20 ℃) 의 배지를 배양 용기에 첨가하고, 배양 용기로부터 세포 시트를 박리하기 위해서 필요한 시간 (예를 들어 30 분 이상) 정치한 후, 적층 세포 시트를 회수함으로써 실시한다. 배지는 적층 공정의 바람직한 양태로서 예시한 것과 동일하다. 냉각용 배지를 첨가한 후의 정치 시간은, 지나치게 길면 세포 시트가 벗겨지기 어려워지기 때문에, 배지를 첨가하면, 1 일 이내에 시트를 회수하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조 방법은, 또한 혈관 형성 세포층에 맥관 형성 처리를 실시하는 공정을 포함하고 있어도 된다. 맥관 형성 처리 공정은, 망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층을 적층시키는 공정의 전공정 및 후공정 중 어느 쪽이어도 된다. 맥관 형성 처리는, 공지된 방법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들어 혈관 형성 세포를 콜라겐 겔 중에서 VEGF, IGF-1, PDGF 등의 인자의 존재하에서 배양하는 방법, 혈관 형성 세포층을 마트리겔과 접촉시키는 방법 등의 튜브 형성을 유도하는 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 망막 색소 상피 세포는, VEGF 를 분비하는 점에서 망막 색소 상피 세포의 배양 상청을 맥관 형성에 사용할 수도 있다.

맥관 형성 처리를 실시한 경우, 혈관 형성 세포층은, 구성하는 모든 혈관 형성 세포가 맥관 구조를 갖고 있어도 되고, 일부만 맥관 구조를 갖고 있어도 된다. 혈관 형성 세포층은 생체 내에서 이식 부위의 환경에 있던 구조의 혈관이 구성되는 것이 바람직하다. 예를 들어 생체 외에서 맥관 형성 처리를 실시하지 않고, 맥관 구조를 나타내지 않은 상태에서, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 시트를 이식하면, 이식된 혈관 형성 세포가 생체 내에서 자발적으로 맥관을 형성하고, 그 과정에서 기존의 혈관과 연결되어 기능적인 혈관망이 형성되기 쉽다고 생각된다. 한편, 맥락막의 손상이 크고, 잔존 혈관이 현저히 적은 경우에는, 혈관 형성 세포층에 맥관 형성 처리를 실시함으로써, 이식된 맥관 구조를 기초로 하여 혈관망의 재구축을 촉진시킬 수 있어 바람직하다.

혈관 형성 세포층은, 혈관 형성 세포 이외의 세포, 예를 들어 조혈 줄기 세포 등의 맥관 형성·혈관 신생을 지지하는 세포나, 혈관 평활근 세포, 혈구 세포 등의 혈관 내피 세포 이외의 혈관 구성 세포 등을 1 종 또는 복수 종 포함하고 있어도 된다. 혈관 형성 세포층은, 추가로 세포 이외의 성분, 예를 들어 혈관 형성을 촉진시키는 인자 등을 포함하고 있어도 된다.

2. 망막 색소 상피 세포층

본 발명에 있어서 사용되는 망막 색소 상피 세포는, 안구로부터 직접 채취한 초대 세포여도 되고, 혹은 그것들을 몇 대 계대시킨 것이어도 된다. 초대 망막 색소 상피 세포는 공지된 방법으로 단리할 수 있고, 예를 들어 안구 유래의 망막 색소 상피 세포는 사체 안구 적출 후, 신속하게 적도부에서 안구를 분할하고, 유리체와 망막을 제거한 후, 필요에 따라 콜라게나아제나 히알루로니다아제 등으로 처리하고, 셀 스크레이퍼에 의한 찰과 또는 트립신이나 EDTA 용액으로 세포를 부르크막으로부터 유리시켜 회수한 후, 배양액 중에서 정치함으로써 배양 접시로의 접착, 증식을 유도함으로써 필요량의 세포를 증식시키고, 트립신 처리 등으로 적절히 계대하여 충분한 세포수를 확보할 수 있다.

또한, 이들 세포는, 미분화 세포인 배성 줄기 세포 (ES 세포) 나 인공 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 등의 다능성 줄기 세포, 신경 줄기 세포 등의 체성 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포, 혹은 신경 전구 세포, 망막 전구 세포를 포함하는 전구 세포를 분화 유도함으로써 얻어지는 세포여도 된다. ES 세포는 체세포로부터 핵초기화되어 생긴 ES 세포여도 된다. 또, 줄기 세포로는, 최근 보고된 인공 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 를 분화 유도함으로써 목적으로 하는 세포를 조제해도 된다. iPS 세포는, 어느 특정 핵초기화 물질 (핵산, 단백질, 저분자 화합물 등) 을 체세포에 도입함으로써 제조할 수 있는, ES 세포와 동등한 특성을 갖는 체세포 유래의 인공의 줄기 세포이다 [Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126：663-676 (2006)；Takahashi, K. et al., Cell, 131：861-872 (2007)]. 상기 줄기 세포를 목적으로 하는 분화 세포로 분화시키는 조건·배지는 종래 공지된 조건·배지에 따라도 되고, 당업자가 적절히 설정해도 된다. 본 발명에 있어서는, 세포 시트에 사용하는 망막 색소 상피 세포로서, 줄기 세포 또는 전구 세포, 바람직하게는 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 얻어진 세포를 사용하는 것이, 적절한 성숙 단계의 망막 색소 상피 세포를 조제할 수 있는 점에서 바람직하고, 특히 비교적 미숙한 망막 색소 상피 세포를 조제하고, 세포 시트를 형성할 수 있는 점에서 유리하다. 또, 본 발명에 의해 제조되는 세포 시트를 이식용으로 하는 경우, 이식하는 대상의 체세포를 iPS 세포의 소스로서 사용함으로써, 얻어지는 세포 시트는 대상에 대해 항원성을 갖지 않는 세포 시트가 되는 점에서 iPS 세포의 사용은 바람직하다. 줄기 세포를 분화 유도시키는 경우에는, 예를 들어 ES 세포나 iPS 세포 등의 인간 다능성 줄기 세포를, Dkk-1 이나 CKI-7 등의 Wnt 안타고니스트 및 Lefty A 나 SB-431542 등의 Nodal 안타고니스트를 첨가한 ES 세포 분화 배지에서 배양을 실시한다. 일정 기간 배양함으로써 망막 전구 세포 마커인 Rx, Pax6, Mitf 가 발현하고, 광학 현미경 관찰에 의한 형태 관찰로부터 다각성 형태와 색소를 갖는 세포를 확인함으로써 인간 망막 색소 상피 세포를 얻을 수 있다 [Neuroscience Letters 2009 Jul 24 458 (3) 126-31, Journal of Cell Science 2009 Sep 1 122 (Pt 17) 3169-79].

본 발명에 있어서의 망막 색소 상피 세포층은, 망막 색소 상피 세포가 평면 상에 배열되어 층으로 구성된 것으로서, 예를 들어 공지된 방법에 의해 제조되는 망막 색소 상피 세포를 포함하는 세포 시트로서 구성할 수 있다. 이와 같은 세포 시트 (망막 색소 상피 세포층) 를 제조하는 방법으로서, 예를 들어 WO2011/142364 에 기재된 방법이 알려져 있다.

본 발명의 세포 시트의 바람직한 양태로는, 망막 색소 상피 세포층이 이하의 공정을 포함하는 방법 (이하, "콜라겐법"이라고 칭한다) 으로 제조된 세포 시트이다：

(1) 콜라겐 겔 상에 망막 색소 상피 세포를 파종, 배양하여, 망막 색소 상피 세포로 이루어진 세포 시트를 형성시키는 공정；및

공정 (1) 에 있어서, 파종되는 망막 색소 상피 세포로는, 포유 동물 (예：인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트 등) 유래의 세포이면, 어느 포유 동물 유래의 세포여도 되는데, 바람직하게는 인간 유래의 세포이다.

콜라겐법에 있어서, 망막 색소 상피 세포는 콜라겐 겔 상에 파종됨으로써 배양된다. 콜라겐 겔에 사용되는 콜라겐은, 포유 동물 (예：인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트 등) 유래의 콜라겐이면 어느 것이어도 되는데, 예를 들어 인간, 돼지 유래의 콜라겐을 사용하는 것을 들 수 있다. 또, 콜라겐이 유래하는 조직으로는, 힘줄, 피부 등을 들 수 있다. 또, 콜라겐의 종류로는 어느 형태의 콜라겐이어도 되는데, 인간의 기저막을 구성하는 콜라겐과 상이한 것이 바람직하고, 구체적으로는 IV 형 콜라겐 이외의 콜라겐이 바람직하며, 그 중에서도 I 형 콜라겐을 사용하는 것이 바람직하다. 콜라겐 겔은, 예를 들어 종래 공지된 제조 방법에 의해 제조할 수 있지만, 본 발명에 있어서는, 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이, 콜라겐의 섬유화를 유발시켜, 콜라겐 섬유 네트워크로 구성되는 겔을 제조하고 있다. 섬유화된 콜라겐은, 강도 및 유연성을 겸비하기 때문에 취급이 용이하고, 세포 증식 및 세포 분화의 유지에 양호하여, 본 발명에서 사용되는 콜라겐 겔로서 바람직하다. 또, 본 발명에 사용되는 콜라겐은, 콜라겐 겔 상에 세포를 파종했을 때, 겔의 층에 가라앉지 않고, 겔 표면에 유지되어 있을 필요가 있다. 따라서, 콜라겐으로는, 겔이 세포 증식에 필요한 강도를 갖는 것이 바람직하고, 예를 들어 분자간 가교량이 많은 콜라겐이 바람직하다. 이와 같은 콜라겐으로서 힘줄 유래의 콜라겐을 들 수 있다.

상기 콜라겐 겔의 콜라겐 농도는, 망막 색소 상피 세포가 정착하여 증식할 수 있는 강도가 있고, 콜라게나아제로 용이하게 분해할 수 있는 용해성, 취급 용이한 점성 등이 만족된 겔을 제조할 수 있는 농도이면 어떠한 범위여도 되지만, 바람직하게는 0.1 ％ (W/V) - 0.5 ％ (W/V), 보다 바람직하게는 0.2 ％ (W/V) - 0.3 ％ (W/V) 이다. 콜라겐 겔의 콜라겐 농도가 0.1 ％ (W/V) 미만인 경우에는, 콜라겐 겔의 강도가 부족하기 때문에, 망막 색소 상피 세포의 정착률, 세포 증식 속도가 저하된다. 또, 콜라겐 겔의 콜라겐 농도가 0.5 ％ (W/V) 를 초과하는 경우에는, 콜라겐 겔을 분해하기 위한 콜라게나아제 처리 시간이 길어져, 세포에 악영향을 줄 것이 우려된다.

상기 콜라겐 겔 제조에 사용되는 콜라겐 겔 혼합 용액의 용량은, 세포 배양에 사용하는 배양용 기재의 배양 면적, 형상에 따라 다르기도 하지만, 단위 면적 (㎠) 당 약 100 ㎕ - 약 250 ㎕ 가 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 150 ㎕ - 약 200 ㎕ 이다. 콜라겐 겔 혼합 용액량이 지나치게 적은 경우에는, 겔 표면에 작용하는 표면 장력의 영향에 의해 중앙 부분이 얇은 콜라겐 겔층이 형성되고, 망막 색소 상피 세포의 배양에 수반하여, 세포가 직접 배양용 기재에 접촉하기 때문에, 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포 시트의 절출시에, 시트에 데미지가 발생하기 쉽다. 또, 콜라겐 겔 혼합 용액량이 과잉인 경우에는, 배양용 기재에 두께가 있는 콜라겐 겔층이 형성되어, 상대적으로 배양액량이 적어지기 때문에, 유지 배양이 실시되기 어렵고, 또 콜라게나아제 처리에 시간이 걸려, 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포 시트로의 데미지가 우려된다.

공정 (1) 에 있어서, 상기 망막 색소 상피 세포를 세포 배양 기재의 콜라겐 겔 상에 파종하고 배양함으로써, 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포 시트를 제조할 수 있다. 본 명세서에 있어서의 세포 배양 기재로는, 세포 배양용이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 트랜스웰 등의 다공질막을 갖는 배양용 용기, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 페트리디쉬, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀을 들 수 있지만, 콜라게나아제 처리나 세포 시트의 절제 조작의 간편성으로부터 다공질막을 갖는 배양용 용기가 바람직하고, 예를 들어 시판되고 있는 트랜스웰을 사용하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서의 세포 배양 기재의 재질로는, 예를 들어 금속, 유리, 세라믹, 실리콘 등의 무기 재료, 엘라스토머, 플라스틱 (예를 들어 폴리에스테르 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, ABS 수지, 나일론, 아크릴 수지, 불소 수지, 폴리카보네이트 수지, 폴리우레탄 수지, 메틸펜텐 수지, 페놀 수지, 멜라민 수지, 에폭시 수지, 염화비닐 수지) 으로 대표되는 유기 재료를 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다.

파종되는 망막 색소 상피 세포의 세포수는, 세포 시트를 형성시킬 수 있는 세포 밀도이면 어떠한 범위여도 된다. 그러나, 세포 밀도가 지나치게 성긴 경우에는, 세포의 형태가 나쁘고, 세포가 컨플루언트한 상태에 이를 때까지의 배양 시간이 길고, 또한 세포가 성숙하여 착색되기까지 걸리는 시간도 길어지며, 또 지나치게 조밀한 경우에도 동일하게 세포 증식을 억제하고, 컨플루언트한 상태에 이를 때까지의 배양 시간이 길어지는 경향이 있는 것 외에, 과밀하기 때문에 세포가 죽어 버리는 경우도 있다. 따라서 파종되는 세포 밀도는, 바람직하게는 약 4.5 x 10⁴ 세포/㎠ - 약 8.5 x 10⁵ 세포/㎠, 보다 바람직하게는 약 8.5 x 10⁴ 세포/㎠ - 약 8.5 x 10⁵ 세포/㎠, 가장 바람직하게는 약 4.5 x 10⁵ 세포/㎠ 이다.

콜라겐 겔 상에 파종한 망막 색소 상피 세포를 배양액 중에서 배양함으로써 그 망막 색소 상피 세포로 구성된 단층상의 세포 집단 (세포 시트) 을 형성할 수 있다. 배양액으로는, 당기술 분야에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어 F-10 배지, F12 배지, MEM, BME 배지, DMEM, αMEM, IMD 배지, ES 배지, DM-160 배지, Fisher 배지, WE 배지 및 RPMI1640 배지 등, 아사쿠라 서점 발행 "일본 조직 배양 학회편 조직 배양의 기술 제 3 판"581 페이지에 기재되어 있는 기초 배지를 사용할 수 있다. 또한, 기초 배지에 혈청 (소 태아 혈청 등), 각종 증식 인자 (EGF, FGF, HGF, PDGF 등), 항생 물질, 아미노산 등을 첨가해도 된다. 배지의 pH 는, 바람직하게는 약 6 - 약 8 이다. 배양은, 예를 들어 통상적으로 약 30 - 약 40 ℃ 에서, 약 15 - 약 60 시간, 망막 색소 상피 세포가 컨플루언트한 상태가 될 때까지 1 차 배양이 실시된다. 그 후 배지를 교환하면서 약 1 주일 - 약 2 개월간 2 차 배양을 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 실시하면서 세포 시트의 형성까지 배양이 실시된다. 이러한 배양에 의해 얻어지는 세포 시트를 구성하는 세포는, 망막 색소 상피 세포로서 유지된다. 세포가 망막 색소 상피 세포로서 유지되고 있는 것은, 특이적인 분화 마커로서 BEST1, RPE65, MERTK, 또는 CRALBP 등을 검출함으로써 확인할 수 있다.

공정 (1) 에서 형성된 세포 시트는 콜라겐 겔에 접착되어 있기 때문에, 예를 들어 이식 등의 용도에 직접 사용하는 경우, 그 자체로는 콜라겐 겔이 피이식자로의 정착을 방해할 것이 우려된다. 또, 혈관 형성 세포층과 망막 색소 상피 세포층의 결합이나 접착을 콜라겐 겔이 방해할 것도 우려된다. 콜라겐 겔을 미리 제거할 수 있으면, 이러한 문제의 해결에 이바지한다. 본 발명의 공정 (2) 에 있어서는, 공정 (1) 에서 형성된 세포 시트에 접착되어 있는 콜라겐 겔을 콜라게나아제로 분해한다. 콜라겐 겔의 조제시에 사용된 콜라겐의 종류에 따라, 당업자라면 적절한 콜라게나아제를 선택할 수 있다. 콜라겐 겔의 분해에 사용되는 콜라게나아제로는, 콜라겐 겔을 소화할 수 있는 활성을 갖는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 인간 기저막을 구성하는 콜라겐 (예를 들어 IV 형 콜라겐 등) 을 분해하기 어려운 것이 바람직하고, 예를 들어 상업 레벨로 입수 가능하고, 안전하고 높은 효소 활성을 갖는 클로스트리듐 (Clostridium histolyticum) 이나 스트렙토마이세스 (Streptomyces parvulus) 에서 유도되는 미생물 유래의 콜라게나아제를 사용할 수 있다.

상기 콜라게나아제의 활성으로는, 그 단위 질량당 활성이나 콜라게나아제 수용액의 단위 용적당 활성보다, 오히려 콜라겐 겔 중의 콜라겐 질량에 대한 비활성 (specific activity) 이 중요하다. 콜라겐 겔 용해에 사용되는 콜라게나아제의 비활성 (콜라게나아제 활성/콜라겐 질량) 으로는 0.1 U/㎎ 이상인 것이 바람직하다. 콜라게나아제의 비활성이 0.1 U/㎎ 미만이면, 콜라겐 겔의 용해에 시간이 지나치게 걸리는 경우, 혹은 겔이 충분히 용해되지 않는 경우가 있어 바람직하지 않다. 보다 바람직하게는 0.1 - 10,000 U/㎎, 더욱 바람직하게는 1 - 3,000 U/㎎ 의 범위이다.

콜라겐법에 있어서, 콜라겐 겔에 콜라게나아제를 작용시키는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니다. 배지 또는 완충능을 갖는 등장액을 용매로 하여 조제한 콜라게나아제 용액을 배지에 첨가해도 되고, 세포 배양 디쉬로부터 박리한 세포 부착 콜라겐 겔을 상기 콜라게나아제 용액에 침지해도 된다. 본 발명에서는, 세포 배양 기재로서 트랜스웰을 사용하고 있기 때문에, 인서트를 회수하고, 그 인서트 바닥면의 멤브레인을 제거함으로써 콜라겐 겔층을 노출시킬 수 있으며, 노출시킨 콜라겐 겔에 직접 상기 콜라게나아제 용액을 침지시키는 것이 바람직하다.

콜라겐법에 있어서, 콜라게나아제에 의해 콜라겐 겔을 용해시키는 경우의 시간에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 콜라게나아제를 작용시키는 시간이 지나치게 길면, 접착능, 증식능 등의 세포 기능이 저하되는 경우가 있어 바람직하지 않다. 콜라게나아제 용해를 실시하는 시간은, 콜라게나아제의 비활성, 온도, 콜라겐 겔의 형상, 콜라게나아제 처리 방법 등의 영향을 받는데, 통상적으로 15 분 - 60 분이다. 또, 콜라게나아제 처리는 단회 처리여도 되고, 복수 회로 나누어 실시해도 된다.

콜라겐법에 있어서의 콜라겐 겔의 콜라게나아제 처리시의 온도는, 세포에 있어서는 일반적으로 생체 내 온도보다 10 ℃ 이상 낮아 (인간에게서는 약 30 ℃) 지면, 세포질의 유동성이 저하되어 대사능이 저하되고, 온도가 42 ℃ 를 초과하면 단백질이 변성되어 세포 기능이 저하되는 경우가 있고, 또, 콜라게나아제의 지적 온도는 37 ℃ 인 것이 많으며, 이 이하의 온도에서는 용해 시간이 길어지는 경우가 있으므로, 10 - 42 ℃ 의 범위에서 설정하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 30 - 40 ℃, 더욱 바람직하게는 36 - 38 ℃ 이다.

콜라겐법에 있어서, 콜라겐 겔의 용해가 진행되면, 세포 시트가 겔로부터 서서히 박리되어, 마침내는 콜라게나아제 용액 중에 유리된다. 세포 시트를 회수하기 위해서, 세포 시트를 잔존 겔로부터 기계적으로 박리해도 되고, 겔이 완전히 용해되고 나서 세포 시트를 회수해도 된다. 기계적으로 박리시킴으로써 세포 시트를 회수할 때까지의 시간이 단축되지만, 세포 시트가 파괴되는 경우가 있기 때문에, 겔이 완전히 용해되고 나서 세포 시트를 회수하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 회수된 세포 시트는, 그대로 혈관 형성 세포층과의 적층 공정에 사용할 수 있는데, 혈관 형성 세포층과의 접착성을 잔류 콜라게나아제가 저해하는 경우가 있으므로, 배지 또는 완충능을 갖는 등장액으로 세정하는 것이 바람직하다. 세정시의 온도는 콜라겐 겔의 콜라게나아제 용해 처리에 준해 설정할 수 있다. 잔류 콜라게나아제를 충분히 제거하기 위해서, 배지 또는 완충능을 갖는 등장액으로 1 회 이상 세정하는 것이 바람직하다.

콜라겐법에 의해 얻어지는 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포 시트는, 망막 색소 상피 세포 특유의 사이토카인이 생체 내와 동일한 극성을 갖고 분비되고 있고, 또 세포간의 밀착 결합의 지표가 되는 경상피 전기 저항 (TER) 이 생체 내 와 동일하게 상승하고 있었던 점에서 생체 내와 동일한 세포층의 배리어 기능을 갖고 있다. 콜라겐법에 의하면, 이와 같이, 생체 내와 동일한 기능을 갖는 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포 시트를 얻을 수 있다.

콜라겐법에 의해 얻어지는 세포 시트에서는, 망막 색소 상피 세포간에 타이트 정크션 (tight junction)이 형성되고, 또한 콜라겐 겔과의 접촉면에 기저막이 형성된다. 본 명세서에 있어서 "기저막"이란, 망막 색소 상피 세포로부터 생산된 성분으로 형성된 막으로서, 기저막 성분의 적어도 일부를 포함하는 막 (이하, "망막 색소 상피 세포의 기저막"이라고 한다) 을 의미하고 있다. 생체 내에 있어서의 망막 색소 상피 세포의 기저막은, 망막 색소 상피 세포층과 부르크막을 구성하는 내콜라겐층의 사이에 얇은 막상으로 존재하고, IV 형 콜라겐, 라미닌, 헤파린 황산 프로테오글리칸 (perlecan), 니도겐 등을 대표적인 성분으로 하는 세포외 매트릭스이다. 또한, 부르크막이란, 망막 색소 상피 세포층과 맥락막의 사이에 있는 얇은 막으로, 망막 색소 상피 세포의 기저막, 내콜라겐층, 엘라스틴층, 외콜라겐층, 맥락막 모세관판의 기저막의 5 층 구조로 이루어지는 막으로, 콜라겐법에 의해 얻어지는 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포 시트는 당해 부르크막의 구조의 일부 (망막 색소 상피 세포의 기저막) 를 포함하고 있다. 타이트 정크션 형성은, 6 각 형상의 서로 밀착하는 세포 형태와, 면역 염색에 의한 세포간의 오클루딘이나 ZO-1 등의 발현을 관찰함으로써 확인할 수 있다. 기저막의 형성은, 면역 염색에 의해 라미닌, 헤파린 황산 프로테오글리칸 (perlecan), 니도겐, 또는 IV 형 콜라겐 등의 기저막 마커의 세포 표면에서의 발현을 관찰하는 것이나, 주사형 전자 현미경에 의한 관찰에 의해 확인할 수 있다.

일반적으로, 망막 색소 상피 세포는 배양 접시 위에서 배양한 경우, 기저막 성분을 생산시키는데, 배양 접시로부터 박리하여 사용 가능한 상태의 망막 색소 상피 세포 시트로서 박리하는 것이 매우 곤란하지만 (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36 (2), 1995, 381-390), 콜라겐법에 의하면, 인공막을 이용하지 않고, 망막 색소 상피 세포로부터 생산된 기저막을 수반하는 망막 색소 상피 세포를 시트로서 회수하는 것이 가능하다. 또, 망막 색소 상피 세포는 단층 구조이기 때문에, 그것 단독으로 취급하고자 하면 시트 구조가 붕괴되고, 세포 단위로 뿔뿔이 흩어지게 되어 시트로서 이식하는 것이 매우 곤란하였다. 한편, 콜라겐법에 의해 얻어지는 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포 시트는, 기저막을 수반하여 충분한 강성을 갖기 때문에, 시트의 회수시에 잘 구겨지지 않아 취급이 매우 용이해진다. 그 때문에, 혈관 형성 세포층과의 적층 조작을 원활히 실시할 수 있다. 또, 세포 이식 디바이스로의 탑재나 이식 조작을 원활히 실시할 수 있기 때문에, 세포 이식을 최소한의 침습으로 실시할 수 있어, 효과, 예후 모두 향상될 것이 기대된다. 또, 콜라겐법에 의해 얻어지는 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포 시트가 기저막을 수반하는 것은, 기저막도 동시에 장애를 받고 있는 질환에 대한 이식 용도로서 매우 유리하다. 예를 들어 가령 황반 변성은, 부르크막도 장애를 받고 있는 경우가 있는데, 콜라겐법에 의해 얻어지는 망막 색소 상피 세포 시트를 상기 본 발명의 제조 방법에 있어서의 망막 색소 상피 세포층으로서 사용함으로써, 당해 방법에 의해 제조되는 세포 시트가 갖는 기저막이 그 장애 부분을 보충함으로써 세포 시트의 생착률을 향상시킬 수 있고, 그것에 따른 치료 효과도 기대할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 제조 방법에 있어서, 콜라겐법에 의해 얻어지는 망막 색소 상피 세포 시트를 망막 색소 상피 세포층으로서 사용하면, 제조되는 세포 시트는 기저막의 장애를 수반하는 질환을 대상으로 하는 이식용 시트로서 바람직하고, 특히 가령 황반 변성을 대상으로 하는 이식용 시트로서 바람직하게 이용할 수 있다.

콜라겐법은 이하의 공정 (3) 을 추가로 포함해도 된다.

(3) 박리된 세포 시트의 콜라겐 겔과의 접촉면에 기저막의 유무를 확인하는 공정

공정 (3) 에 있어서, 세포 시트에 있어서의 기저막의 유무를 확인함으로써, 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포층과 기저막으로 이루어지는 세포 시트의 형성을 판정할 수 있다. 기저막 유무의 확인은 기저막 마커의 발현이나 주사형 전자 현미경에 의한 관찰 등 상기 서술한 기저막 형성의 확인과 동일한 방법에 의해 실시할 수 있다. 기저막의 검출은 기저막 마커의 발현을 세포의 임의의 지점 (예를 들어 세포질, 세포막, 핵막 등) 에서 확인해도 되는데, 바람직하게는 콜라겐 겔과의 접촉면에서 발현하고 있는 마커를 대상으로 한다.

본 명세서에 있어서의 기저막 마커로는, 기저막에 있어서 특이적으로 발현하고 있는 유전자의 전사 산물, 번역 산물 또는 그 분해 산물이 포함된다. 그러한 유전자로는, 예를 들어 라미닌, 헤파린 황산 프로테오글리칸 (perlecan), 니도겐 또는 IV 형 콜라겐 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 기저막의 주성분인 라미닌, IV 형 콜라겐 등이 바람직하게 사용된다.

"박리된 세포 시트의 콜라겐 겔과의 접촉면에 기저막 유무의 확인"에 사용되는 시료로는, 공정 (2) 에서 박리된 세포 시트 (또는 세포) 유래의 기저막 마커 (예, RNA, 단백질, 그 분해 산물 등) 를 함유하는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

상기 시료가 RNA 인 경우에 있어서의 기저막 마커 유전자의 발현은, 공정 (2) 에서 박리된 세포 시트의 세포로부터 RNA (예：전체 RNA, mRNA) 획분을 조제하고, 그 획분 중에 포함되는 그 마커 유전자의 전사 산물을 검출하거나, 혹은 그 세포로부터 RNA 를 추출하지 않고 직접 세포 중의 마커 유전자 산물을 검출함으로써 조사할 수 있다.

세포로부터 RNA (예：전체 RNA, mRNA) 획분을 조제하는 경우, RNA 획분의 조제는, 구아니딘-CsCl 초원심법, AGPC 법 등 공지된 수법을 사용하여 실시할 수 있는데, 시판되는 RNA 추출용 키트 (예：RNeasy Mini Kit； QIAGEN 제조 등) 를 사용하여, 미량 시료로부터 신속 또한 간편하게 고순도의 전체 RNA 를 조제할 수 있다. RNA 획분 중의 기저막 마커 유전자의 전사 산물을 검출하는 수단으로는, 예를 들어 하이브리다이제이션 (노던 블랏, 도트 블랏, DNA 칩 해석 등) 을 사용하는 방법, 혹은 PCR (RT-PCR, 경합 PCR, 리얼타임 PCR 등) 을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 미량 시료로부터 신속 또한 간편하게 양호한 정량성으로 기저막 마커 유전자의 발현 변동을 검출할 수 있는 점에서 경합 PCR 이나 리얼타임 PCR 등의 정량적 PCR 법이, 또 복수의 마커 유전자의 발현 변동을 일괄 검출할 수 있고, 검출 방법의 선택에 의해 정량성도 향상시킬 수 있다는 등의 점에서 DNA 칩 해석이 바람직하다.

노던 블랏 또는 도트 블랏 하이브리다이제이션에 의한 경우, 기저막 마커 유전자의 검출은, 그 유전자의 전사 산물과 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 (프로브) 을 사용하여 실시할 수 있다. 그러한 핵산으로는, 기저막 마커 유전자의 전사 산물과 하이 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 핵산을 들 수 있다. "하이 스트린젠트 조건"이란, 예를 들어 6 x SSC (sodium chloride/sodium citrate) 중 45 ℃ 에서의 하이브리다이제이션 반응 후, 0.2 x SSC/0.1 ％ SDS 중 65 ℃ 에서의 1 회 이상의 세정 등을 들 수 있다. 당업자는, 하이브리다이제이션 용액의 염 농도, 하이브리다이제이션 반응의 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 미스매치의 수, 하이브리다이제이션 반응의 시간, 세정액의 염 농도, 세정의 온도 등을 적절히 변경함으로써 원하는 스트린젠시로 용이하게 조절할 수 있다. 그 핵산은 DNA 여도 되고 RNA 여도 되며, 혹은 DNA/RNA 키메라여도 된다. 바람직하게는 DNA 를 들 수 있다.

프로브로서 사용되는 핵산은 2 개 사슬이어도 되고, 1 개 사슬이어도 된다. 2 개 사슬인 경우에는, 2 개 사슬 DNA, 2 개 사슬 RNA 또는 DNA：RNA 의 하이브리드여도 된다. 1 개 사슬인 경우에는, 안티센스 사슬을 사용할 수 있다. 그 핵산의 길이는 표적 핵산과 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 한 특별히 제한은 없고, 예를 들어 약 15 염기 이상, 바람직하게는 약 30 염기 이상이다. 그 핵산은, 표적 핵산의 검출·정량을 가능하게 하기 위해, 표지제에 의해 표지되어 있는 것이 바람직하다. 표지제로는, 예를 들어 방사성 동위 원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등이 사용된다. 방사성 동위 원소로는, 예를 들어〔³²P〕,〔³H〕,〔¹⁴C〕등이 사용된다. 효소로는, 안정적이고 비활성이 큰 것이 바람직하고, 예를 들어, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산 탈수소 효소 등이 사용된다. 형광 물질로는, 예를 들어 플루오레사민, 플루오레세인이소티오시아네이트 등이 사용된다. 발광 물질로는, 예를 들어 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 사용된다. 또한, 프로브와 표지제의 결합에 비오틴-(스트렙토)아비딘을 사용할 수도 있다.

노던 하이브리다이제이션에 의한 경우에는, 상기와 같이 하여 조제한 RNA 획분을 겔 전기 영동으로 분리한 후, 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리비닐리덴디플루라이드 등의 멤브레인에 전사하고, 상기와 같이 하여 조제된 표지 프로브를 포함하는 하이브리다이제이션 완충액 중, 상기 "하이 스트린젠트 조건하에서"하이브리다이제이션시킨 후, 적당한 방법으로 멤브레인에 결합된 표지량을 밴드마다 측정함으로써, 각 기저막 마커 유전자의 발현량을 측정할 수 있다. 도트 블랏의 경우에도, RNA 획분을 스팟팅한 멤브레인을 동일하게 하이브리다이제이션 반응에 제공하고 (각 마커 유전자에 대해 각각 실시한다), 스팟의 표지량을 측정함으로써 각 마커 유전자의 발현량을 측정할 수 있다.

DNA 칩 해석에 의한 경우, 예를 들어 상기와 같이 하여 조제한 RNA 획분으로부터, 역전사 반응에 의해 T7 프로모터 등의 적당한 프로모터를 도입한 cDNA 를 합성하고, 또한 RNA 폴리메라아제를 사용하여 cRNA 를 합성한다 (이 때 비오틴 등으로 표지한 모노뉴클레오타이드를 기질로서 사용함으로써, 표지된 cRNA 가 얻어진다). 이 표지 cRNA 를, 상기한 프로브를 고상화한 칩과 접촉시켜 하이브리다이제이션 반응시키고, 고상 상의 각 프로브에 결합된 표지량을 측정함으로써, 각 기저막 마커 유전자의 발현량을 측정할 수 있다. 당해 방법은, 검출하는 분화 마커 유전자 (따라서, 고상화되는 프로브) 의 수가 많아질수록 신속성 및 간편성의 면에서 유리하다.

한편, 세포로부터 RNA 를 추출하지 않고 마커 유전자를 검출하는 경우, 그 검출 수단으로서 in situ 하이브리다이제이션을 사용할 수 있다. 그 방법에서는, 세포로부터 RNA 를 추출하는 대신에 세포를 고정제, 바람직하게는 침전 고정제, 예를 들어 아세톤으로 처리하거나, 또는 완충 포름알데히드 용액 중에 짧은 시간 인큐베이션함으로써 세포를 고정시킨다. 고정화 후, 세포를 파라핀 중에 포매하여 블록을 형성하고, 박편을 잘라냄으로써 시료로서 사용할 수 있다. 양호하게 조제한 파라핀 포매 샘플은 실온에서 몇년이나 보존할 수 있다. 프로브로서 사용되는 핵산은, 상기한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다. in situ 하이브리다이제이션은, 세포의 콜라겐 겔과의 접촉면에 기저막 마커의 발현을 직접 확인할 수 있다는 점에서, 본 발명에 있어서 바람직하게 사용된다.

혹은, 공정 (2) 에 있어서의 박리된 세포 시트에 있어서의 기저막 마커 유전자 발현의 확인은, 그 세포 시트 (또는 세포) 로부터 단백질 획분을 조제하고, 그 획분 중에 포함되는 그 마커 유전자의 번역 산물 (즉, 마커 단백질) 을 검출하거나 혹은 그 세포 시트 (또는 세포) 로부터 단백질을 추출하지 않고 직접 세포 시트 (또는 세포) 중의 마커 유전자의 번역 산물을 검출함으로써 조사할 수 있다. 마커 단백질의 검출은, 각 단백질에 대한 항체를 사용하여, 면역학적 측정법 (예：ELISA, FIA, RIA, 웨스턴 블랏 등) 에 의해 실시할 수도 있고, 효소 등의 측정 가능한 생리 활성을 나타내는 단백질에 있어서는, 그 생리 활성을 각 마커 단백질에 대해 공지된 수법을 사용하여 측정함으로써도 실시할 수 있다. 혹은 또한, 마커 단백질의 검출은 MALDI-TOF MS 등의 질량 분석법을 사용해서도 실시할 수 있다.

또한, 각 마커 단백질에 대한 항체는, 그 마커 단백질 또는 그 단백질, 혹은 그 부분 펩티드를 감작 항원으로 하여, 통상적으로 사용되는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 제조 기술에 따라 취득할 수 있다.

개개의 면역학적 측정법을 본 발명에 적용할 때에는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요해지지 않는다. 각각의 방법에 있어서의 통상적인 조건, 조작법에, 당업자의 통상적인 기술적 배려를 더하여 기저막 마커 단백질의 측정계를 구축하면 된다. 이들의 일반적인 기술 수단의 상세한 것에 대해서는, 총설, 성서 등을 참조할 수 있다. 예를 들어 이리에 히로시편 "Radioimmunoassay" (코단샤, 1974년 발행), 이리에 히로시편 "cont. Radioimmunoassay" (코단샤, 1979년 발행), 이시카와 에이지 등 편 "효소 면역 측정법" (의학서원, 1978년 발행), 이시카와 에이지 등 편 "효소 면역 측정법" (제2판) (의학서원, 1982년 발행), 이시카와 에이지 등 편 "효소 면역 측정법" (제3판) (의학서원, 1987년 발행), "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), 동서 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 동서 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), 동서 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D：Selected Immunoassays)), 동서 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E：Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 동서 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I：Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (이상, 아카데믹 프레스사 발행) 등을 참조할 수 있다.

상기 망막 색소 상피 세포층에는, 혈관 형성 세포층을 직접 적층해도 되고, 다른 층을 개재하여 혈관 형성 세포층을 적층시켜도 된다. 본 발명에 있어서는, 바람직하게는 망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층을 직접 적층한다.

본 발명은 또한 상기 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 망막 색소 상피 세포층 및 혈관 형성 세포층을 포함하는 세포 시트에 관한 것이다. 본 발명의 세포 시트는, 바람직하게는 생체 외에서 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 얻어진 망막 색소 상피 세포로 형성된 세포층과 혈관 형성 세포층을 포함한다. 또, 망막 색소 상피 세포층을 상기 콜라겐법에 의해 제조한 경우, 본 발명의 세포 시트는 망막 색소 상피 세포층으로부터 분비된 기저막을 추가로 포함한다. 본 발명의 세포 시트는 안질환 환자로의 망막 치료용 이식 재료로서 바람직하다. 안질환으로는, 예를 들어 가령 황반 변성, 망막 색소 변성, 당뇨병성 망막증, 망막 박리, 망막 중심 동맥 폐색, 망막 중심 정맥 폐색, 망맥락막 위축증, 망막 색소 상피 박리, 포도막염 (베체트병, 하라다병 등), 고도 근시 (병적 근시) 등의 망맥락막 변성 질환을 들 수 있다.

본 발명의 세포 시트는 혈관 형성 세포층을 수반하기 때문에, 맥락막도 동시에 장애를 받은 질환에 대해서도 높은 생착률로 이식할 수 있다. 그 때문에, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 시트는, 상기에 예시한 망맥락막 변성 질환 가운데, 특히 망막 색소 상피 세포 단독의 이식으로는 치료 효과가 나타나기 어려웠던 망맥락막 위축을 수반하는 안질환 (가령 황반 변성, 망막 색소 변성증, 망맥락막 위축증, 망막 색소 상피 박리, 포도막염 (베체트병, 하라다병 등), 고도 근시 (병적 근시) 등) 에 대한 치료 용도에 바람직하게 사용된다.

또, 본 발명의 세포 시트는 생체와 동일한 성분으로 이루어지는 기저막을 갖기 때문에 상기 안질환에 대한 약효 스크리닝이나 독성 평가 등의 각종 스크리닝 용도로서도 이용할 수 있다. 상기 안질환에 대한 약효 스크리닝으로는, 예를 들어 JP-A 2007-500509호에 기재된 방법에 따라, 상기 안질환에 대해 약효를 갖는 물질의 스크리닝에 본 발명의 세포 시트를 적용할 수 있다. 구체적으로는, 약효를 갖는 후보 물질의 존재하 또는 비존재하에 있어서, 본 발명의 세포 시트를 상기 안질환의 원인이 될 수 있는 스트레스 조건하 (예를 들어 광 (예를 들어 백색광, 청색광；광은 망막 세포, 특히 광 수용체 세포의 죽음을 일으켜, 황반 변성 유발 인자가 될 수 있다), A2E [레티노이드N-레티닐리덴-N-레티닐-에탄올아민] (A2E 의 축적은 가령성의 망막 세포의 신경 변성, 특히 황반 변성의 발현에 기여한다고 생각되고 있다), 담배 연기 응집물 (흡연은 황반 변성의 위험 인자라고 생각되고 있다), 외압 (예를 들어 정수압；안압의 상승은 녹내장과의 관련이 의심되고 있다)) 에서 배양하고, 로돕신 발현하는 광 수용체의 수, 항카스파아제 3 항체를 사용한 면역 염색에 의해 평가할 수 있다. 또, 독성 평가로는, 예를 들어 JP-A 2007-517210호에 기재된 방법에 따라, 독성 물질의 스크리닝에 본 발명의 세포 시트를 적용할 수 있다. 구체적으로는, 독성 후보 물질의 존재하 또는 비존재하에 있어서, 본 발명의 세포 시트를 JP-A 2007-517210호에 기재된 인테그린 마커 펩티드를 사용하여 배양하고, 488 ㎚ 파장의 레이저로 여기하고, 520 ㎚ 에서 형광을 검출함으로써 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 시트는, 시세포 외절의 탐식능이나 신경 보호 작용 등의 시세포의 유지에 관련된 기능, 펌프 작용, 타이트 정크션에 의한 망막 혈관 배리어 기능 등의, 생체 내에 있어서의 망막 색소 상피 세포가 구비하는 여러 가지의 다양한 기능을 평가하기 위한 in vitro 모델로서 이용할 수도 있다.

본 발명의 이식용 세포 시트는, 인간, 인간 이외의 포유 동물 (예：원숭이, 마우스, 래트, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트 등) 에 있어서의 상기 질환을 치료하기 위해서 사용할 수 있다.

본 발명의 이식용 세포 시트의 적용 가능한 질환 부위의 범위는, 대상 질환, 투여 대상의 동물종, 연령, 성별, 체중, 증상 등에 의존하여 적절히 선택된다.

본 발명의 이식용 세포 시트는, 1 회 또는 수 회로 나누어 이식해도 된다. 이식의 적용 횟수는 질환에 따라 의료 종사자, 가이드라인에 따라 결정되는데, 예를 들어 질환이 가령 황반 변성 질환인 경우에는, 본 발명의 이식용 세포 시트를 그 위독한 정도에 따라 2 회 이상 이식해도 된다. 또 복수 회 이식을 실시하는 경우, 인터벌은 특별히 한정되지 않지만, 수일 - 수 주일의 기간을 두어도 된다.

본 발명의 이식용 세포 시트는, 의료 종사자, 가이드 라인을 따른 적절한 이식 방법에 따라 이식된다. 망막하에 본 발명의 망막 색소 상피 세포 시트를 이식하는 경우, 안구 망막하의 이식 부위까지 자입한 주사 바늘로부터 수류 상에 시트를 전달하는 것을 포함하는 이식 방법 외에, 전용 운반용 치료 기구에 의해서도 실시할 수 있다.

실시예

이하에 실시예를 나타내고, 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 단순한 예시로서 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다.

제조예 1. 망막 색소 상피 세포의 조제

하기 제조예 2 에 사용하는 망막 색소 상피 세포로서, Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131 에 기재된 방법에 준하여, 인간 iPS 세포로부터 분화 유도된 성숙 망막 색소 상피 세포 (253G1, K11PD2, 59M8, 59SV2, 59SV3, 59SV9, 46a, K21EV15, 101EV3, K11EV9, 454E2), 및 ES 세포로부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포 (hES, CMK6) 를 사용하였다.

＜인간 iPS 유래 망막 색소 상피 세포＞

253G1 은, Nature Biotechnology 26, 101-106, 2008 에 기재된 정상인에서 유래하는 인간 iPS 세포 (253G1) 로부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포이다.

59SV2, 59SV3, 59SV9 는 동일한 망막 색소 변성증 환자에서 유래하는 인간 iPS 세포로부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포이고, 동 iPS 세포는 Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85 (2009) 348-362 에 기재된 방법에 준하여, 센다이 바이러스를 사용하여, 인간 피부 유래 섬유아 세포에 Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 를 도입하는 방법에 의해 수립된 세포이다.

K21EV15, 101EV3, K11EV9, 454E2 는 서로 상이한 망막 색소 변성증 환자에서 유래하는, 인간 iPS 세포로부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포이고, 동 iPS 세포는 Nat Methods. 2011 May；8 (5)：409-12 에 기재된 방법에 준하여, 에피소말 (episomal) 벡터를 사용하여, 인간 피부 유래 섬유아 세포에 인간 Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, LIN28 을 도입하는 방법에 의해 수립된 세포이다.

＜원숭이 iPS 유래 망막 색소 상피 세포＞

46a 는 Jpn. J. Transplant. 44 (2009) 231-235 에 기재된 방법에 따라 원숭이 (cynomolgus monkey) iPS 세포로부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포이다.

＜ES 유래 망막 색소 상피 세포＞

hES 는 인간 ES 세포주 khES-1 로부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포이다. CMK6 은 Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131 에 기재된 방법에 준하여, 원숭이 ES 세포로부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포이다.

제조예 2. 망막 색소 상피 세포 시트의 제조 방법

＜콜라겐 겔 혼합 용액의 조제＞

이하의 A 액, B 액 및 C 액을 조제하였다.

A 액：돼지 힘줄 유래 산 가용성

Type-I 콜라겐 Cellmatrix I-A (닛타 젤라틴) 3.0 ㎎/㎖

B 액：5 배 농도의 농축 배양액

DMEM/F12 (Invitrogen, 12500-062) 3 g 을 MilliQ 수에 용해시키고, 총 부피 50 ㎖ 를 필터 처리

C 액：재구성용 완충액

1N NaOH (50 mM) 5 ㎖, NaHCO₃ (260 mM) 2.2 g, HEPES (200 mM) 4.77 g 을 MilliQ 수에 용해시키고, 총 부피 100 ㎖ 를 필터 처리

냉각시키면서 A 액 (7 용량) 에 B 액 (2 용량) 을 기포가 생기지 않도록 혼합 (옅은 황색) 하였다. 다음으로, C 액 (1 용량) 을 첨가하고 혼합 (옅은 핑크색) 하여, 0.21 ％ 콜라겐 겔 혼합 용액으로 하였다.

＜망막 색소 상피 세포 시트의 제조＞

12 ㎜ 트랜스웰 인서트 (0.4 ㎛ Pore Polyester 멤브레인；Corning, 3460) 의 인서트 내에 0.21 ％ 콜라겐 겔 혼합 용액을 200 ㎕ 첨가하고 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션하였다. 다음으로, F10-10 ％ FBS (F-10 (Sigma, N6908) 445 ㎖, FBS 50 ㎖, Penicilin-Streptomycin (Invitrogen, 15140-122) 5 ㎖) 를 인서트 외에 1500 ㎕, 인서트 내에 500 ㎕ 첨가하고, 37 ℃ 에서 24 hr 인큐베이션하였다. 그 후, 인서트 내 및 인서트 외를 F10-10 ％ FBS 로 1 회 세정하고, 인서트 내에 제조예 1 에서 얻은 망막 색소 상피 세포를 5 x 10⁵ 개 (F10-10 ％ FBS, 500 ㎕) 가 되도록 파종하고, 인서트 외에 F10-10 ％ FBS 를 1500 ㎕ 첨가하였다. 망막 색소 상피 세포가 컨플루언트해질 때까지 F10-10 ％ FBS 에서 배양하고, 컨플루언트 후, 배지를 SFRM-B27 (DMEM (Sigma, D6046) 350 ㎖, F12 HAM (Sigma, N6658) 150 ㎖, B27 (Invitrogen, 17504-044) 10 ㎖, 200 mM L-Glutamine (Sigma, G7513) 5 ㎖, Penicilin-Streptomycin (Invitrogen, 15140-122) 5 ㎖, bFGF (wako, 060-04543) 10 ng/㎖) 로 교환하고 (인서트 외 1500 ㎕, 인서트 내 500 ㎕, 배지 교환은 3 회/week), 망막 색소 상피 세포의 색이나 형태가 적당해질 때까지 배양하였다.

＜절출＞

배양 개시부터 6 주일 경과 후, 인서트의 멤브레인을 절제하였다. 콜라게나아제 L (콜라게나아제 L：닛타 젤라틴, PBS (＋)：Sigma, 2600 U/㎖) 100 ㎕ 를 인서트하에 첨가하고, 37 ℃ 에서 60 분 인큐베이션하여 PBS (＋) 로 3 회 세정하였다. 망막 색소 상피 세포 시트가 마르지 않도록 SFRM-B27 을 적하하고, PALM MicroBeam (ZEISS) 으로 원하는 크기로 절제하였다.

＜특성＞

조직 절편에 대한 면역 조직 화학에 의해 제조한 세포 시트는, 타이트 정크션 (ZO-1 양성) 이 형성된 망막 색소 상피 세포 시트가, 기저막 (라미닌, IV 형 콜라겐 양성) 으로 언더코팅된 구조를 갖고, 시트 형성에 사용한 1 형 콜라겐의 잔존이 없는 것 (Collagen type 1 음성) 이 확인되었다.

실시예 1 혈관 내피 전구 세포층과 망막 색소 상피 세포층의 적층 세포 시트의 제조

＜혈관 내피 전구 세포의 조제＞

내피 세포 배양 키트-2 (EGM-2 배지 (2 ％ FBS 함유)；다카라 바이오사 제조, B3162) 를 사용하여, 인간 혈관 내피 전구 세포 (ECFCs；다카라 바이오사 제조, PT056) 를 1.3 x 10⁴세포/㎠ 가 되도록, 온도 응답성 배양 접시 (3.5 ㎝ 디쉬；셀시드사 제조, CS3007) 에 파종하였다.

＜혈관 내피 전구 세포의 망막 색소 상피 세포 시트로의 중층＞

15 hr 경과 후, 온도 응답성 배양 접시에 제조예 1 에서 얻은 인간 iPS 세포 유래 망막 색소 상피 세포 시트를 넣고 혈관 내피 전구 세포에 중첩해 두고, 배지를 부드럽게 흡인하여, 세포 시트가 온도 응답성 배양 접시의 중앙 부분에 오도록 배치하였다. 그 후, 건조 방지를 위해서 20 ℃ 의 EGM-2 배지를 100 ㎕ 첨가하고, 30 분간 정치함으로써, 배양 접시 표면의 온도 응답성 폴리머를 친수성으로 전환시키고, 세포 시트를 박리하였다.

EGM-2 배지로 1 회 세정하여 얻어진 세포 시트를, 부착 세포용 배양 접시 (Lumox dish 35；그라이너사 제조, 077331；바닥면을 메스로 절취 가능) 로 옮겼다. 레이저 마이크로다이섹션 (PALM MicroBeam；ZEISS 사 제조) 을 사용하여 세포 시트를 원하는 크기로 절제하여, 인간 혈관 내피 전구 세포와 인간 망막 색소 상피 세포가 적층된 세포 시트를 얻었다.

실시예 2 세포 시트 이식

실시예 1 에서 얻은 적층 세포 시트를 NOD/SCID 마우스 광배근의 피하에 이식하고, 1 주일 후에 조직 절편을 제조하였다. 항 CD31 항체 (내피 세포), 항 HLA-1 항체 (이식 인간 세포), DAPI 를 사용한 면역 조직 화학의 결과, 이식한 세포 시트의 생착과 이식 세포에서 유래하는 맥관 구조의 형성이 확인되었다 (도 1 중, 화살표 "capillary (donor)"). 이 결과로부터 혈관 내피 전구 세포가 이식 후에 내피 세포로 성숙하여, 맥관을 형성할 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 3 세포 시트 이식

실시예 1 에서 얻은 적층 세포 시트를, 부분적으로 망막 색소 상피 세포와 맥락막을 결손시킨 토끼의 망막하에 이식하고, 1 주일 후에 조직 절편을 제조한다. 항 CD31 항체 (내피 세포), 항 HLA-1 항체 (이식 인간 세포), DAPI 를 사용한 면역 조직 화학에 의해, 이식한 세포 시트의 생착과, 이식 세포에서 유래하는 맥관 형성을 확인할 수 있다.

비교예 1

제조예 2 에서 얻은 인간 망막 색소 상피 세포 시트 (인간 혈관 내피 전구 세포 없음) 를, 부분적으로 망막 색소 상피 세포와 맥락막을 결손시킨 토끼의 망막하에 이식하고, 1 주일 후에 조직 절편을 제조한다. 항 CD31 항체 (내피 세포), 항 HLA-1 항체 (이식 인간 세포), DAPI 를 사용한 면역 조직 화학에 의해, 이식 세포는 시트 구조가 파괴되고, 소수가 분산된 상태에서 검출되고, 실시예 3 과 비교하여, 이식 세포의 생착률이 현저히 저하되는 현상이 확인된다.

참고예 1. 맥관 형성

VEGF 를 포함하는 배지에서 배양한 혈관 내피 전구 세포가 맥관을 형성하는 것을 다음의 방법으로 확인하였다.

(배지)

"EM"：EGM-2 배지 (2 ％ FBS 함유；다카라 바이오사 제조, B3162)

"F10"：F10-10 ％ FBS (F-10 (Sigma, N6908) 445 ㎖, FBS 50 ㎖, Penicilin-Streptomycin (Invitrogen, 15140-122) 5 ㎖). 이 배지를 맥관 형성용 배지로서 사용한 결과를 도 2 중 "F10"으로 나타낸다.

"F10-1"：제조예 2 에서 제조한 망막 색소 상피 세포 시트를, 12 ㎜ 트랜스웰 인서트 (0.4 ㎛ Pore Polyester 멤브레인；Corning, 3460) 의 인서트 내에 두고, F10-10 ％ FBS 를 인서트 내 및 인서트 외에 각각 500 ㎕, 1500 ㎕ 첨가한 상태에서 하루 배양하고, 배양 상청을 회수하였다. 이 배양 상청을 맥관 형성용 배지로서 사용한 결과를 도 2 중 "F10-1"로 나타낸다.

"F10-2"：제조예 2 에서 제조한 망막 색소 상피 세포 시트를, 12 ㎜ 트랜스웰 인서트 (0.4 ㎛ Pore Polyester 멤브레인；Corning, 3460) 의 인서트 내에 두고, F10-10 ％ FBS 를 인서트 내 및 인서트 외에 각각 500 ㎕, 1500 ㎕ 첨가한 상태에서 이틀 배양하고, 배양 상청을 회수하였다. 이 배양 상청을 맥관 형성용 배지로서 사용한 결과를 도 2 중 "F10-2"로 나타낸다.

(맥관 형성)

상기 4 종류의 배지를 사용하여, 각각 배양 접시에 인간 혈관 내피 전구 세포 (ECFCs；다카라 바이오사 제조, PT056) 를 1.3 x 10⁴세포/㎠ 가 되도록 파종하였다. 37 ℃, 5 ％ CO₂ 에서 보온하고, 4 시간 후에 현미경 하에서 맥관 형성수를 세었다. 3 회 실험을 반복한 결과를 도 2(A) 에, 얻어진 맥관 형성수를 사용한 배지마다 나타냈다 (*P ＜ 0.001；ANOVA, Scheffe test). 각각 광학 현미경 사진 및 형광 현미경 사진에 의해 맥관 형성을 형태적으로 확인할 수 있었다.

사용한 4 종류의 배지 중의 VEGF 의 농도를 측정한 결과, EM 은 1.44 ng/㎖, F10 은 0 ng/㎖, F10-1 은 2.64 ng/㎖, F10-2 는 2.80 ng/㎖ 였다. VEGF 를 포함하지 않는 F10 은 맥관의 형성수가 현저히 낮았다. F10 이외의 배지에서는 맥관 형성수가 많이 보여진 점에서, VEGF 에 의해 혈관 내피 전구 세포의 맥관 형성이 촉진되는 것이 확인되었다. 또, 이 결과로부터 망막 색소 상피 세포의 배양 상청에 의해 맥관 형성을 촉진시킬 수 있었던 점에서, 혈관 내피 전구 세포층과 망막 색소 상피 세포층을 적층한 세포 시트 상태에서 맥관 형성 처리를 실시하는 것도 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

참고예 2. 마트리겔의 사용

마트리겔 코트한 배양 접시를 사용한 점 이외에는 참고예 1 과 동일한 방법에 의해 4 종류의 배지를 사용하여 인간 혈관 내피 전구 세포를 배양하고, 맥관 형성수를 세었다. 3 회 실험을 반복한 결과를 도 2(B) 에, 얻어진 맥관 형성수를 사용한 배지마다 나타냈다 (*P ＜ 0.01 **P ＜ 0.05；ANOVA, Scheffe test). 각각 광학 현미경 사진 및 형광 현미경 사진에 의해 맥관 형성을 형태적으로 확인할 수 있었다.

참고예 1 과 비교하여, 마트리겔을 사용한 경우에는 모든 배지에 있어서 맥관 형성수가 현저히 향상되었다. 특히, VEGF 를 포함하지 않는 F10 은 맥관의 형성수가 현저히 낮았지만 (참고예 1), 마트리겔을 사용한 경우에는 맥관 형성의 촉진이 확인되었다. 이들의 결과로부터 VEGF 의 존재에 관계없이, 마트리겔을 이용하여 맥관 형성을 촉진시킬 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

망막 색소 상피 세포 시트의 제조 조건

참고예 3. 망막 색소 상피 세포 시트의 제조 방법 (콜라겐의 종류)

제조예 2 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 을 사용한 세포 시트를 제조하는 공정에 있어서, 돼지 힘줄 유래 산 가용성의 Type-I 콜라겐 Cellmatrix I-A (닛타 젤라틴) 3 ㎎/㎖ 를 0.21 ％ 콜라겐 혼합 용액/웰 로서 사용하는 대신에, (A) 돼지 피부 유래 Type-I 콜라겐 TE (특주품：주로 I 형 콜라겐, 약간의 III 형 콜라겐을 포함한다) (닛타 젤라틴) 5 ㎎/㎖ 를 0.35 ％ 콜라겐 혼합 용액/웰, (B) 돼지 힘줄 유래 Type-I 콜라겐 T-1002 (특주품：I 형 콜라겐) (닛타 젤라틴) 5.1 ㎎/㎖ 를 0.35 ％ 콜라겐 혼합 용액/웰, (C) FITC 표지 콜라겐 I (Chondrex) 1 ㎎/㎖ 를 0.07 ％ 콜라겐 혼합 용액/웰, (D) FITC 표지 콜라겐 I (특주) (Chondrex) 3 ㎎/㎖ 를 0.21 ％ 콜라겐 혼합 용액/웰, (E) 아텔로콜라겐 (코켄) 3 ㎎/㎖ 를 0.21 ％ 콜라겐 혼합 용액/웰, (F) 세포 배양용 투과성 콜라겐막 (코켄) 으로서 각각 사용한 점 이외에는 제조예 2 와 동일한 방법으로 세포 시트를 제조하고, 절출함으로써 망막 색소 상피 세포 시트를 회수하였다.

제조예 2 와 상기의 각 콜라겐을 사용한 경우의 시험 결과를 4 개의 항목 [1.겔의 강도；2.세포의 접착；3.세포의 증식；4.안전성] 에 있어서 비교·평가하였다. 그 결과, (A) {1.열등；2.동등；3.열등；4.양호}, (B) {1.양호 (5.1 ㎎/㎖)；2.동등；3.열등；4.양호}, (C) {1.열등 (1 ㎎/㎖)；2.열등；3.불명；4.불명}, (D) {1.동등 (3 ㎎/㎖)；2.동등；3.열등；4.불명}, (E) {1.동등 (3 ㎎/㎖)；2.열등；3.불명；4.양호}, (F) {콜라게나아제로 용해되지 않아 사용할 수 없었다} 였다. 겔의 강도에 관해서, 망막 색소 상피 세포가 증식하기 위해서는 어느 정도의 단단함이 요구된다. 이와 같은 관점에서는 콜라겐의 종류와 농도는, 제조예 2 의 돼지 힘줄 유래 산 가용성의 Type-I 콜라겐 Cellmatrix I-A 와 (B) 돼지 힘줄 유래 Type-I 콜라겐 T-1002 를 상기의 농도로 사용하는 것이 특히 적합하였다. 기질이 어느 정도 단단하지 않은 경우, 망막 색소 상피가 증식하지 않기 때문에 본 발명에서 사용할 수 없다.

참고예 4. 망막 색소 상피 세포 시트의 제조 방법 (콜라겐량)

제조예 2 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 을 사용한 세포 시트를 제조하는 공정에 있어서, 콜라겐 겔 혼합 용액의 사용량을 200 ㎕ 대신에 100 ㎕, 또는 300 ㎕ 로 한 점 이외에는 제조예 2 와 동일한 방법으로 세포 시트를 제조하고, 절출함으로써 망막 색소 상피 세포 시트를 회수하였다.

제조예 2 와 비교하여, 콜라겐 겔 혼합 용액의 사용량이 100 ㎕ 인 경우에는 콜라겐 겔 혼합 용액량이 적기 때문에, 표면 장력의 영향에 의해 중앙 부분이 얇은 콜라겐 겔층이 형성되고, 배양이 진행되면, 파종한 망막 색소 상피 세포가 바닥부의 멤브레인에 직접 접촉하기 쉬워, 시트의 절출 작업시에 망막 색소 상피 세포 시트가 찢어지는 경우가 있었다. 콜라겐 겔 혼합 용액의 사용량이 300 ㎕ 인 경우에는 콜라겐 겔 혼합 용액량이 많기 때문에, 두께가 있는 콜라겐 겔의 층이 형성되고, 상대적으로 인서트 내에 유지할 수 있는 배지의 양이 적어져 유지 배양을 실시하기 어렵고, 또, 콜라게나아제 처리에 시간이 걸리기 때문에 세포 시트로의 데미지가 커질 우려가 있다.

참고예 5. 망막 색소 상피 세포 시트의 제조 방법 (콜라게나아제의 양과 처리 시간)

제조예 2 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 을 사용한 세포 시트를 제조하는 공정에 있어서, 1 ％ 콜라게나아제 L (닛타 젤라틴) 또는 I 형 콜라게나아제 (로슈) 를 30 ㎕ 사용하여 망막 색소 상피 세포 시트에 30 분 접촉하는 조건 대신에, 각각 10 ㎕ 로 10 분, 10 ㎕ 로 20 분, 10 ㎕ 로 30 분, 10 ㎕ 로 60 분, 20 ㎕ 로 20 분, 20 ㎕ 로 60 분, 30 ㎕ 로 50 분으로 한 점 이외에는 제조예 2 와 동일한 방법으로 세포 시트를 제조하고, 절출함으로써 망막 색소 상피 세포 시트를 회수하였다.

그 결과, 콜라게나아제 처리를 10 ㎕ 로 60 분 또는 20 ㎕ 로 60 분 실시한 경우, 30 ㎕ 로 30 분과 동일한 정도의 콜라겐의 분해가 확인되었다.

참고예 6. 망막 색소 상피 세포 시트의 제조 방법 (파종 세포수)

제조예 2 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 을 사용한 세포 시트를 제조하는 공정에 있어서, 인서트 내에 파종하는 세포수를 5 x 10⁵ 개/500 ㎕ 대신에, (A) 5 x 10⁴/500 ㎕, (B) 1 x 10⁵/500 ㎕, (C) 1 x 10⁶/500 ㎕ 로 한 점 이외에는 실시예 1 과 동일한 방법으로 세포 시트를 제조하고, 절출함으로써 망막 색소 상피 세포 시트를 회수하였다.

제조예 2 와 비교하여, (A), (B) 는 세포수가 적기 때문에 세포가 컨플루언트해질 때까지 시간이 길고, (C) 는 증식이 느려 역시 세포가 컨플루언트해질 때까지의 시간이 길어지는 경향이 있었다.

참고예 7. 망막 색소 상피 세포 시트에 형성된 기저막

제조예 2 에 있어서, 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 제조한 세포 시트에 대하여, cryo section (동결 절편) 을 제조하고, 면역 조직 화학 염색을 실시하였다. ZO-1 의 발현에 의해 타이트 정크션이 형성되어 있는 것, 라미닌, IV 형 콜라겐의 발현에 의해 기저막이 구성되어 있는 것을 확인하였다. 각 단백질의 검출에는, Zymed 사 제조 rabbit anti-ZO-1 (1：100 희석), Abcam 사 제조 rabbit laminin (1：200 희석), Calbiochem 사 제조 mouse anti-human collagen type IV antibody (1：40) 의 각 항체를 사용하였다. 또한, molecular Probes 사 제조 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI；1 ㎍/㎖) 을 사용한 핵염색의 상태로부터 망막 색소 상피 세포 시트는 단층 상피 형태를 취하고 있는 것이 확인되었다.

망막 색소 상피 세포 시트의 평가

평가 1. 세포 시트의 망막 색소 상피 특이적 유전자 발현 프로파일

제조예 2 에 있어서, 59SV3, 59SV9 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 세포 시트를 제조하는 공정에 있어서, 세포가 컨플루언트해지고 나서 배지를 SFRM-B27 로 교환한 날을 0 일로 하여, 1 주일, 4 주일, 2 개월 경과 후의 시트를 구성하는 세포에 대하여, RT-PCR 에 의해 BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP 의 발현을 확인한 결과, 포지티브 컨트롤 (인간 망막 색소 상피 세포 total RNA (ScienCell 사 제조, Cat NO. 6545)) 과 동일한 정도의 발현이 확인되었다. 여기서, BEST1, RPE65, MERTK 는 망막 색소 상피 세포에 특이적으로 발현하는 유전자이다. 또, CRALBP 는 망막 색소 상피 세포와 뮐러 세포에 발현하는 유전자이다.

평가 2. 망막 색소 상피 시트의 콜라겐 잔존 측정

제조예 2 에 있어서, 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 제조한 세포 시트에 대하여, 콜라게나아제 처리 전 및 후에 절출한 각 시트에 대해 cryo section (동결 절편) 을 제조하여, 면역 조직 화학 염색을 실시하였다. 핵을 molecular Probes 사 제조 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI；1 ㎍/㎖) 로 염색하고, Collagen type1 의 염색에 Calbiochem 사 제조 토끼 항-인간 콜라겐 타입 I 항체 (1：40 희석) 를 사용한 결과, 콜라게나아제 처리 후의 시트로부터는 콜라겐은 검출되지 않아, 콜라게나아제에 의해 배양 접시에 코팅한 콜라겐이 제거되어 있는 것을 확인하였다. 한편, 콜라게나아제 처리 전에 절출한 시트로부터는 콜라겐이 검출되었다.

평가 3. 망막 색소 상피 세포 시트의 사이토카인 분비능

제조예 2 에 있어서, 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 및 454E2 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 제조한 세포 시트에 대하여, 각각 망막 색소 상피 세포 시트를 절출하는 공정의 전에, 트랜스웰 내의 Apical 측 및 Basal 측의 배양액을 회수하고, Arvydas M, IOVS. 2006；47：3612-3624 에 기재된 방법에 준하여, ELISA 로 VEGF 및 PEDF 의 생산량을 검출하였다. 그 결과, Arvydas M, IOVS. 2006；47：3612-3624 에서 보고되어 있는 인간 태아 유래 망막 색소 상피와 마찬가지로, VEGF 는 Basal 측에 주로 분비되고, PEDF 는 Apical 측에 주로 분비되어 있는 것이 확인되었다 (도 4). 제조예 2 에 있어서 253G1 및 454E2 로부터 제조한 망막 색소 상피 세포 시트는 생체 내와 동일한 사이토카인 분비능을 갖고, 기능성이 우수한 것이 나타났다.

평가 4. 망막 색소 상피 세포 시트의 경상피 전기 저항

세포층의 배리어 기능과 전기 저항, 이른바 경상피/내피 전기 저항 (TER) 에는 강한 상관 관계가 보인다. 제조예 2 에 있어서, 454E2 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 제조한 세포 시트에 대하여, 망막 색소 상피 세포 시트를 절출하는 공정의 전에, MILLIPORE 사 기재된 방법 (Millicell ERS-2 를 사용) 에 준하여, 인서트의 내측과 외측의 배지 중에 프로브를 넣고, TER 을 전기적으로 측정하였다. 그 결과, TER 은 640 Ω·㎠ 이고, Nature Protocols vol 4, No 5 662-673 (2009) 의 Fig 10 에 보고되어 있는 인간 태아 유래 망막 색소 상피와 마찬가지로, 높은 TER 값을 나타냈다. 제조예 2 에 있어서 제조한 망막 색소 상피 세포 시트는 생체 내의 망막 색소 상피와 유사하게 높은 배리어 기능을 갖고 있는 것이 나타났다.

평가 5. 원숭이 ES 세포 유래 망막 색소 상피 세포 시트의 이식

제조예 2 에 있어서 원숭이 ES 세포 유래 망막 색소 상피 세포, CMK6 으로부터 제조한 원숭이 망막 색소 상피 세포 시트를, Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb；36 (2)：381-90. 에 기재된 방법에 준하여 원숭이의 한쪽 눈에 이식하였다. 이식 전에 이식 예정의 눈의 망막에 장애를 줄 목적으로 망막 광 응고술을 실시하고, 망막 광 응고반을 형성시킨 원숭이의 한쪽 눈에 이식 후 28 일째에, 안저 사진 및 OCT (Optical coherence tomograph) 광 간섭 단층계를 사용하여 안저의 단면을 조직 절편과 같이 화상화하여, 망막 상태를 확인한 결과, 형광 안저 조영 검사에 의한 형광의 누출은 없고, 이식편은 생존하였으며, 감각 망막의 얇아짐 등의 장애는 일어나지 않았다.

평가 6. 원숭이 iPS 세포 유래 망막 색소 상피 세포 시트의 이식

제조예 2 에 있어서 원숭이 iPS 세포 유래 망막 색소 상피 세포, 46a 로부터 제조한 원숭이 망막 색소 상피 세포 시트를, Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb；36 (2)：381-90. 에 기재된 방법에 준하여 자가 이식 1 안, 타가 이식 3 안의 망막하에 이식하였다. 이식 후 1 년 후까지, 안저 사진 및 OCT (Optical coherence tomograph) 광 간섭 단층계를 사용하여 안저의 단면을 조직 절편과 같이 화상화하여, 망막 상태를 경과 관찰한 결과, 타가 이식은 이식편 주위의 섬유성 변화나 형광 안저 조영 검사에 의한 형광의 누출, OCT 에서는 망막하의 고휘도 병변과 같은 분명한 거부 반응이 보였다. 한편, 자가 이식에서는 이와 같은 분명한 거부 반응은 확인되지 않고, 형광 안저 조영 검사에 의한 형광의 누출은 없고, 이식편은 생착되어 있으며, 감각 망막의 얇아짐 등의 장애는 일어나지 않았다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해 생체 내의 결손된 맥락막 혈관을 보충하고, 이식 후에 산소나 양분을 망막에 보급할 수 있는 혈관 구성 세포층을 갖는 망막 색소 상피 세포의 적층 시트를 간이하고 안정적으로 조제할 수 있다. 본 발명의 세포 시트는, 생착률 및 기능성이 우수하기 때문에, 망맥락막 변성 질환, 특히 망맥락막 위축을 수반하는 강도 근시나 중증의 포도막염 등, 망막 색소 상피 세포 이식만으로는 충분한 치료 효과가 얻어지기 어려운 위독한 망맥락막 변성 질환도 치료의 대상으로 할 수 있기 때문에 매우 유용하다.

본 명세서 중에서 예시된 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에서의 인용에 의해 그 전부가 명시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 도입된 것이다.

본 출원은 일본에서 출원된 일본 특허출원 2012-185932호 (출원일：2012년 8월 24일) 를 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.

Claims

망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층을 적층하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포층 및 혈관 형성 세포층을 포함하는 세포 시트의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 혈관 형성 세포층이 망막 색소 상피 세포층의 기저면과 접촉하도록, 망막 색소 상피 세포층과 혈관 형성 세포층을 적층하는 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 혈관 형성 세포층이 혈관 아세포, 혈관 내피 전구 세포 및 혈관 내피 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 세포로 이루어져 있는 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 혈관 형성 세포층이 세포 시트가 이식될 환자 유래 조직 혹은 세포, 또는 환자의 HLA 형과 매칭되는 HLA 형을 가지는 도너 유래 세포로 이루어져 있는 제조 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 색소 상피 세포층이 이하의 공정을 포함하는 방법에 의해 제조되는 세포 시트인 제조 방법：
(1) 콜라겐 겔 상에 망막 색소 상피 세포를 파종, 배양하여, 망막 색소 상피 세포로 이루어진 세포 시트를 형성시키는 공정,
(2) 콜라겐 겔을 콜라게나아제로 분해하여, 망막 색소 상피 세포로 이루어진 세포 시트를 박리하는 공정.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 색소 상피 세포가 ES 세포, iPS 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 얻어진 세포인 제조 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 세포 시트.
생체 외에서 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 얻어진 망막 색소 상피 세포로 형성된 세포층, 상기 세포로부터 분비된 기저막 및 혈관 형성 세포층을 포함하는 이식용 세포 시트.