KR20150003739A - 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법 - Google Patents

검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법 Download PDF

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Abstract

빌리루빈의 영향이 억제된, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법을 제공한다. 검체 중의 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하고, 생성된 과산화수소를 페록시다아제의 존재하, 산화 발색형 색원체와 반응시켜, 정색된 반응액의 흡광도를 측정함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 방법에 있어서, 지방산 혹은 그 염을 공존시키는 것을 특징으로 하는 측정 대상 성분의 측정 방법. 본 발명의 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법은 임상 진단에 유용하다.

Description

검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법{METHOD FOR ASSAYING COMPONENT TO BE ASSAYED IN SPECIMEN}
본 발명은 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법, 및, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약에 관한 것이다.
혈청 등의 생체 시료 중의 측정 대상 성분을, 산화 효소를 사용하여 과산화수소를 생성시키고, 생성된 과산화수소를 측정함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 임상 검사가 일상적으로 실시되고 있다. 특히, 생성된 과산화수소를 페록시다아제 존재하, 산화 발색형 색원체와 반응시켜 색소를 생성시키고, 생성된 색소를 함유하는 정색 (呈色) 된 반응액의 흡광도를 측정함으로써, 생체 시료 중의 측정 대상 성분을 측정하는 비색 분석이 임상 검사에 있어서 일상적으로 사용되고 있다.
이 과산화수소 측정에 기초하는 비색 분석에 있어서, 생체 시료 중에 함유되는 아스코르브산, 빌리루빈 등의 방해 물질의 영향이 종종 문제가 된다. 특히, 빌리루빈은, 페록시다아제 존재하에서의 과산화수소와 산화 발색형 색원체의 반응에 영향을 미치고, 그 환원 작용에 의해 부 (負) 의 영향을 준다는 문제가 있다.
이 문제를 해결하는 방법으로는, 지금까지 페로시안화물 이온을 사용하는 방법 (특허문헌 1 참조), EDTA 철 착물을 사용하는 방법 (특허문헌 2 참조), 페로시안화물 이온 및 알부민을 사용하는 방법 (특허문헌 3 참조), 카티온성 계면 활성제 및/또는 양쪽성 계면 활성제를 사용하는 방법 (특허문헌 4 참조), 양쪽성 계면 활성제를 사용하는 방법 (특허문헌 5 참조), 양쪽성 계면 활성제 및 페로시안화물을 사용하는 방법 (특허문헌 6 참조), HLB 13 이상의 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 페로시안화 이온을 사용하는 방법 (특허문헌 7 참조), 철 착물 및 스테로이드 화합물을 사용하는 방법 (특허문헌 8 참조), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 축합물을 사용하는 방법 (특허문헌 9 참조) 등이 알려져 있다.
일본 공개특허공보 소49-050991호 일본 공개특허공보 소57-071398호 일본 공개특허공보 소60-228963호 일본 공개특허공보 평3-010696호 일본 공개특허공보 평7-039394호 일본 공개특허공보 평7-155196호 일본 공개특허공보 평11-103888호 일본 공개특허공보 평11-243993호 일본 공개특허공보 2004-037431호
본 발명의 목적은, 빌리루빈의 영향이 억제된, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법, 및, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 본 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 검체 중의 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하고, 생성된 과산화수소를 페록시다아제의 존재하, 산화 발색형 색원체와 반응시켜, 정색된 반응액의 흡광도를 측정함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 방법에 있어서, 지방산 혹은 그 염을 공존시킴으로써 빌리루빈의 영향이 억제된다는 지견을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은, 이하의 [1] ∼ [6] 에 관한 것이다.
[1] 검체 중의 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하고, 생성된 과산화수소를 페록시다아제의 존재하, 산화 발색형 색원체와 반응시켜, 정색된 반응액의 흡광도를 측정함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 방법에 있어서, 지방산 혹은 그 염을 공존시키는 것을 특징으로 하는 측정 대상 성분의 측정 방법.
[2] 지방산이 탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산인 [1] 에 기재된 측정 방법.
[3] 탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산이, 옥탄산, 데칸산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코사트리엔산, 아라키드산, 이코산산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산, 도코산산, 도코사헥사엔산, 테트라도코산산, 및, 테트라코사펜타엔산으로 이루어지는 군에서 선택되는 지방산인 [2] 에 기재된 측정 방법.
[4] 검체 중의 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하는 성분, 페록시다아제, 산화 발색형 색원체, 및, 지방산 혹은 그 염을 함유하는, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약.
[5] 지방산이 탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산인 [4] 에 기재된 측정용 시약.
[6] 탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산이, 옥탄산, 데칸산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코사트리엔산, 아라키드산, 이코산산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산, 도코산산, 도코사헥사엔산, 테트라도코산산, 및, 테트라코사펜타엔산으로 이루어지는 군에서 선택되는 지방산인 [5] 에 기재된 측정용 시약.
본 발명에 의해, 빌리루빈의 영향이 억제된 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법, 및, 측정용 시약이 제공된다.
본 발명의 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법은, 검체 중의 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하고, 생성된 과산화수소를 페록시다아제의 존재하, 산화 발색형 색원체와 반응시켜, 정색된 반응액의 흡광도를 측정함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 방법에 있어서, 지방산 혹은 그 염을 공존시키는 것을 특징으로 하는 방법이다.
본 발명에 있어서의 지방산은, 본 발명의 측정 방법을 가능하게 하는 지방산이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산을 들 수 있고, 탄소수 8 ∼ 18 의 포화 또는 불포화 지방산이 바람직하다. 탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산으로는, 예를 들어 옥탄산, 데칸산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코사트리엔산, 아라키드산, 이코산산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산, 도코산산, 도코사헥사엔산, 테트라도코산산, 테트라코사펜타엔산 등을 들 수 있다. 또, 본 발명에 있어서의 지방산은 염이어도 되고, 염으로는 예를 들어 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 암모늄염, 칼슘염, 마그네슘염 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 지방산을 2 종 이상 조합하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 측정 방법에 있어서의 지방산의 농도는, 본 발명의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상, 0.1 ∼ 15 m㏖/ℓ 이며, 0.2 ∼ 10 m㏖/ℓ 가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 검체는, 본 발명의 측정 방법을 가능하게 하는 검체이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청 등을 들 수 있고, 혈장 및 혈청이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 측정 대상 성분은, 효소 반응에 의해 유도되는 과산화수소를 측정함으로써 측정되는 측정 대상 성분이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 총 콜레스테롤 (TC), 고밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (HDL-C), 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (LDL-C), 초저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (VLDL-C), 렘난트형 리포단백질 중의 콜레스테롤 (RLP-C), 글루코오스, 요산, 트리글리세리드 (TG), 인지질, 콜린, 크레아틴, 크레아티닌, 락트산, 피루브산 등의 기질 외에, 콜린에스테라아제, 구아나아제 등의 효소 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 측정 대상 성분은 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도되는데, 측정 대상 성분과 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하는 성분의 조합으로는, 예를 들어 이하의 조합을 들 수 있다.
·TC, HDL-C, LDL-C, VLDL-C, RLP-C : 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 및, 콜레스테롤 산화 효소
·글루코오스 : 글루코오스 산화 효소
·요산 : 우리카아제
·TG : 리포프로테인 리파아제, 글리세롤 키나아제, 및, 글리세롤-3-인산 산화 효소
·인지질 : 포스포리파아제 D, 및, 콜린 산화 효소
·콜린 : 콜린 산화 효소
·크레아틴 : 크레아티나아제, 및, 사르코신 산화 효소
·크레아티닌 : 크레아티니나아제, 크레아티나아제, 및, 사르코신 산화 효소
·락트산 : 락트산 산화 효소
·피루브산 : 피루브산 산화 효소
·콜린 에스테라아제 : 2,4-디메톡시벤조일콜린, 및, 콜린 산화 효소
·구아나아제 : 구아닌, 잔틴 옥시다아제, 및, 우리카아제
본 발명에 있어서의 페록시다아제는, 본 발명의 측정 방법을 가능하게 하는 페록시다아제이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물, 미생물 유래의 페록시다아제 외에, 유전자 공학적 수법에 의해 제작된 페록시다아제 등을 들 수 있다. 본 발명의 측정 방법에 있어서의 페록시다아제의 농도로는, 통상, 1 ∼ 100 kU/ℓ 이다.
본 발명에 있어서의 산화 발색형 색원체는, 본 발명의 측정 방법을 가능하게 하는 산화 발색형 색원체이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 류코형 색원체, 산화 커플링 발색형 색원체 등을 들 수 있다. 류코형 색원체는, 과산화수소 및 페록시다아제의 존재하, 단독으로 색소로 변환되는 물질이며, 테트라메틸벤지딘, o-페닐렌디아민, 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨염 (DA-64), 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 나트륨염 (DA-67), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.
산화 커플링 발색형 색원체는, 과산화수소 및 페록시다아제의 존재하, 2 개의 화합물이 산화적 커플링되어 색소를 생성하는 물질이다. 2 개의 화합물의 조합으로는, 커플러와 아닐린류의 조합, 커플러와 페놀류의 조합 등을 들 수 있다.
커플러로는, 예를 들어 4-아미노안티피린 (4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라존 등을 들 수 있다.
아닐린류로는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 등을 들 수 있다.
페놀류로는, 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-하이드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서의 산화 발색형 색원체의 농도는, 과산화수소의 측정에 적합한 농도이면 특별히 제한은 없지만, 통상, 0.01 ∼ 10 g/ℓ 이다.
본 발명에 있어서의 측정 대상 성분의 측정은, 통상, pH 4.0 ∼ 10.0 의 수성 매체 중에서 실시되고, pH 6.0 ∼ 8.0 의 수성 매체 중에서 실시되는 것이 바람직하다. 수성 매체로는, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있고, 완충액이 바람직하다. 완충액으로는, 예를 들어 인산 완충액, 시트르산 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 굿 완충액 등을 들 수 있다. 굿 완충액에 사용되는 완충제로는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (Tris), 비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스(하이드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노이아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산) (POPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다.
또, 본 발명의 측정 방법에 있어서는, 계면 활성제, 방부제 등을 공존시켜도 된다. 계면 활성제로는, 예를 들어 비이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양쪽성 계면 활성제 등을 들 수 있다. 방부제로는, 예를 들어 아지화물, 킬레이트제, 바이오에이스 (BioAce) 등을 들 수 있다. 아지화물로는, 예를 들어 아지화나트륨 등을 들 수 있다. 킬레이트제로는, 예를 들어 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA) 혹은 그 염 등을 들 수 있다. 염으로는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 등을 들 수 있다. 이 외에, 빌리루빈의 영향 억제제로서 알려져 있는 페로시안화물이나 소 혈청 알부민 (BSA) 등의 단백질을 공존시켜도 된다.
본 발명의 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약은, 본 발명의 측정 방법에 사용되는 시약으로, 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하는 성분, 페록시다아제, 산화 발색형 색원체, 및, 지방산 혹은 그 염을 함유한다. 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하는 성분, 페록시다아제, 산화 발색형 색원체, 및, 지방산 혹은 그 염으로는, 예를 들어 각각, 전술한 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하는 성분, 페록시다아제, 산화 발색형 색원체, 및, 지방산 혹은 그 염 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정용 시약은, 동결 건조 상태이어도 되고 액상이어도 되며, 동결 건조 상태의 시약인 경우에는, 수성 매체로 용해시켜 측정에 사용할 수 있다. 수성 매체로는, 예를 들어 전술한 수성 매체 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 측정용 시약은 키트의 형태를 취할 수도 있고, 키트로는, 예를 들어 2 시약계 키트, 3 시약계 키트 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정용 시약에 있어서, 지방산은, 본 발명의 측정 방법이 가능해지는 농도가 되는 함량으로 함유되어 있으면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가, 통상, 0.1 ∼ 60 m㏖/ℓ 가 되는 함량으로 함유되고, 0.2 ∼ 40 m㏖/ℓ 가 되는 함량으로 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 측정용 시약에 있어서, 페록시다아제는 본 발명의 측정 방법이 가능해지는 농도가 되는 함량으로 함유되어 있으면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가, 통상, 0.01 ∼ 40 g/ℓ 가 되는 함량으로 함유된다.
본 발명의 측정용 시약에 있어서, 산화 발색형 색원체는, 본 발명의 측정 방법이 가능해지는 농도가 되는 함량으로 함유되어 있으면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가, 통상, 0.01 ∼ 40 g/ℓ 가 되는 함량으로 함유된다.
본 발명의 측정용 시약에는, 전술한 계면 활성제, 방부제 등이 함유되어 있어도 된다. 이 외에, 빌리루빈의 영향 억제제로서 알려져 있는 페로시안화물이나 소 혈청 알부민 (BSA) 등의 단백질이 함유되어 있어도 된다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다. 한편, 본 실시예, 비교예 및 시험예에 있어서는, 하기 메이커의 시약 및 효소를 사용하였다.
MOPS (도진 화학 연구소사 제조), 아세트산나트륨·3 수화물 (칸토 화학사 제조), EMSE (다이토 케믹스사 제조), 4-AA (악텍사 제조), 붕산 (와코 쥰야쿠 공업사 제조), 아지화나트륨 (와코 쥰야쿠 공업사 제조), 노니온 HS-210 (니치유사 제조), EDTA·2Na (도진 화학 연구소사 제조), 덱스트란황산나트륨 (분자량 50 만) (PK 케미컬즈사 제조), 황산나트륨 (칸토 화학사 제조), BSA (밀리포어사 제조), 에마르겐 L-40 (카오사 제조), 플루로닉 L121 (ADEKA 사 제조), 페로시안화칼륨 (FCK ; 칸토 화학사 제조), 테트라데실트리메틸암모늄 클로라이드 (와코 쥰야쿠 공업사 제조), 옥탄산나트륨 (토쿄 화성사 제조), 데칸산나트륨 (토쿄 화성사 제조), 라우르산나트륨 (토쿄 화성사 제조), 올레산나트륨 (토쿄 화성사 제조), 리놀레산나트륨 (토쿄 화성사 제조), 리놀렌산 (토쿄 화성사 제조), 도데실황산나트륨 (SDS ; 와코 쥰야쿠 공업사 제조), 페록시다아제 (POD ; 토요 방적사 제조), 아스코르브산옥시다아제 (AOD ; 아사히 화성사 제조), 우리카아제 (토요 방적사 제조), LPL311 (리포프로테인 리파아제 ; 토요 방적사 제조), CHO-CE (콜레스테롤옥시다아제 ; 키코만사 제조).
실시예 1
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 요산 측정용 키트 (키트 A1 ∼ A6) 를 조제하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
아세트산나트륨·3 수화물 15 g/ℓ
EMSE 0.2 g/ℓ
붕산 0.1 g/ℓ
아지화나트륨 0.2 g/ℓ
노니온 HS-210 1 g/ℓ
POD 5 kU/ℓ
AOD 3 kU/ℓ
지방산 (제 1 표 참조)
제 2 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
아세트산나트륨·3 수화물 12.5 g/ℓ
4-AA 0.35 g/ℓ
EDTA·2Na 0.5 g/ℓ
노니온 HS-210 0.5 g/ℓ
아지화나트륨 0.2 g/ℓ
POD 10 kU/ℓ
우리카아제 0.75 kU/ℓ
[비교예 1]
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 요산 측정용 키트 (키트 a1) 를 조제하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
아세트산나트륨·3 수화물 15 g/ℓ
EMSE 0.2 g/ℓ
붕산 0.1 g/ℓ
아지화나트륨 0.2 g/ℓ
노니온 HS-210 1 g/ℓ
POD 5 kU/ℓ
AOD 3 kU/ℓ
제 2 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
아세트산나트륨·3 수화물 12.5 g/ℓ
4-AA 0.35 g/ℓ
EDTA·2Na 0.5 g/ℓ
노니온 HS-210 0.5 g/ℓ
아지화나트륨 0.2 g/ℓ
POD 10 kU/ℓ
우리카아제 0.75 kU/ℓ
[비교예 2]
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 요산 측정용 키트 (키트 a2) 를 조제하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
아세트산나트륨·3 수화물 15 g/ℓ
EMSE 0.2 g/ℓ
붕산 0.1 g/ℓ
아지화나트륨 0.2 g/ℓ
노니온 HS-210 1 g/ℓ
POD 5 kU/ℓ
AOD 3 kU/ℓ
SDS 1 m㏖/ℓ
제 2 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
아세트산나트륨·3 수화물 12.5 g/ℓ
4-AA 0.35 g/ℓ
EDTA·2Na 0.5 g/ℓ
노니온 HS-210 0.5 g/ℓ
아지화나트륨 0.2 g/ℓ
POD 10 kU/ℓ
우리카아제 0.75 kU/ℓ
실시예 2
실시예 1 의 키트 A1 을 사용하여, 이하의 순서에 의해 검체 중의 요산을 측정하였다.
(1) 검량선의 작성
표준액으로서 생리 식염수 (요산 농도 : 0 ㎎/㎗) 및 액상 컨트롤 혈청 Ⅱ 와코 (요산 농도 : 9.4 ㎎/㎗ ; 와코 쥰야쿠 공업사 제조) 를, 키트로서 실시예 1 의 키트 A1 을 사용하고, 히타치 7170S 형 자동 분석 장치에 의해 이하의 반응을 실시하여, 당해 반응에 의해 얻어진 2 개의 흡광도 (E1 및 E2) 를 기초로, 요산 농도와 「흡광도」(E2 에서 E1 을 빼고 얻어진 값) 사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.
반응 셀에 표준액 (3.1 ㎕) 과 제 1 시약 (0.15 ㎖) 을 첨가하고 37 ℃ 에서 5 분간 가온하여, 반응액의 흡광도 (E1) 를 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 로 측정하고, 이어서, 이 반응액에 제 2 시약 (0.05 ㎖) 을 첨가하고 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 가온하여, 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 로 측정하였다.
(2) 측정용 검체의 조제
생화학 컨트롤 혈청 「QAP 트롤 2X」(시스멕스사 제조) 220 ㎕ 에 빌리루빈 농도 500 ㎎/㎗ 의 간섭 체크·A 플러스-빌리루빈 C (시스멕스사 제조) 30 ㎕ 를 혼합하여, 빌리루빈 농도 60 ㎎/㎗ 의 빌리루빈 첨가 검체를 조제하였다. 마찬가지로, 빌리루빈 농도 500 ㎎/㎗ 의 간섭 체크·A 플러스-빌리루빈 C 대신에, 간섭 체크·A 플러스-빌리루빈 C (블랭크) (시스멕스사 제조) 를 사용하여 빌리루빈 농도 0 ㎎/㎗ 의 대조 검체를 조제하였다.
(3) 검체와 실시예 1 의 각 키트의 반응에 의한 당해 검체에 있어서의 「흡광도」의 측정
상기 (1) 의 검량선 작성에 있어서 사용한 표준액 대신에, 상기 (2) 에서 조제한 측정용 검체, 즉, 빌리루빈 첨가 검체 및 대조 검체의 각 검체를 사용하는 것 이외에는 (1) 의 「흡광도」 산출 방법과 동일한 방법에 의해, 당해 검체에 대한 「흡광도」를 측정하였다.
(4) 측정용 검체 중의 요산 농도의 결정
상기 (3) 에서 측정한 「흡광도」와, 상기 (1) 에서 작성한 검량선으로부터, 각 검체 중의 요산 농도를 결정하였다. 대조 검체 중의 요산 농도를 100 으로 하였을 때의 빌리루빈 첨가 검체 중의 요산 농도의 상대치를 제 1 표에 나타낸다.
키트로서, 키트 A1 대신에 키트 A2 ∼ A6 의 각 키트를 사용하는 것 이외에는 상기 (1) ∼ (4) 와 동일한 방법에 의해, 빌리루빈 첨가 검체 중의 요산 농도의 상대치를 결정하였다. 결과를 제 1 표에 나타낸다.
[비교예 3]
실시예 2 의 키트 A1 대신에 비교예 1 의 키트 a1 을 사용하는 것 이외에는 실시예 2 와 동일한 방법에 의해, 빌리루빈 첨가 검체 중의 요산 농도의 상대치를 결정하였다. 결과를 제 1 표에 나타낸다.
[비교예 4]
실시예 2 의 키트 A1 대신에 비교예 2 의 키트 a2 를 사용하는 것 이외에는 실시예 2 와 동일한 방법에 의해, 빌리루빈 첨가 검체 중의 요산 농도의 상대치를 결정하였다. 결과를 제 1 표에 나타낸다.
Figure pct00001
요산 농도의 상대치는, 대조 검체 중의 요산 농도를 100 으로 한 경우의 빌리루빈 첨가 검체 중의 요산 농도를 나타내고, 값이 낮을수록 빌리루빈의 영향을 받고 있는 것이 된다. 제 1 표에, 키트 a 를 사용한 경우의 요산 농도의 상대치를 기준으로 하였을 때의, 각 키트에 있어서의 요산 농도의 상대치의 차를 Δ상대치로서 나타냈다. 제 1 표로부터 분명한 바와 같이, 지방산 대신에, 지방산과 마찬가지로 음이온성의 기를 갖는 SDS 를 함유하는 키트를 사용한 경우에는, SDS 및 지방산을 함유하지 않는 키트를 사용한 경우보다 빌리루빈의 영향을 받는 데에 반해, SDS 를 함유하지 않고, 지방산을 함유하는 키트를 사용한 경우에는, SDS 및 지방산을 함유하지 않는 키트를 사용한 경우보다 빌리루빈의 영향을 잘 받지 않았다. 이 결과로부터, 지방산을 사용하는 본 발명의 측정 방법은, 빌리루빈의 영향이 억제된 방법임을 알 수 있다.
실시예 3
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 LDL-C 측정용 키트 (키트 B1 ∼ B3) 를 조제하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
덱스트란황산나트륨 (분자량 50 만) 0.5 g/ℓ
황산나트륨 2 g/ℓ
EMSE 0.3 g/ℓ
BSA 4.5 g/ℓ
POD 10 kU/ℓ
지방산 (제 2 표 참조)
제 2 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
에마르겐 L40 7 g/ℓ
플루로닉 L121 3 g/ℓ
테트라데실트리메틸암모늄 클로라이드 0.06 g/ℓ
4-AA 0.5 g/ℓ
BSA 4.5 g/ℓ
FCK 0.02 g/ℓ
POD 20 kU/ℓ
LPL311 1.5 kU/ℓ
CHO-CE 1 kU/ℓ
[비교예 5]
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 LDL-C 측정용 키트 (키트 b) 를 조제하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
덱스트란황산나트륨 0.5 g/ℓ
황산나트륨 2 g/ℓ
EMSE 0.3 g/ℓ
BSA 4.5 g/ℓ
POD 10 kU/ℓ
제 2 시약
MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ
에마르겐 L40 7 g/ℓ
플루로닉 L121 3 g/ℓ
테트라데실트리메틸암모늄 클로라이드 0.06 g/ℓ
4-AA 0.5 g/ℓ
BSA 4.5 g/ℓ
FCK 0.02 g/ℓ
POD 20 kU/ℓ
LPL311 1.5 kU/ℓ
CHO-CE 1 kU/ℓ
실시예 4
실시예 3 의 키트 B1 을 사용하여, 이하의 순서에 의해 검체 중의 LDL-C 를 측정하였다.
(1) 검량선의 작성
표준액으로서 생리 식염수 (LDL-C 농도 : 0 ㎎/㎗) 및 데타미나 표준 혈청 HDL·LDL-C 측정용 (쿄와 메덱스사 제조) 을, 키트로서 실시예 3 의 키트 B1 을 사용하고, 히타치 7170S 형 자동 분석 장치에 의해 이하의 반응을 실시하여, 당해 반응에 의해 얻어진 2 개의 흡광도 (E1 및 E2) 를 기초로, LDL-C 농도와 「흡광도」(E2 에서 E1 을 빼고 얻어진 값) 사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.
반응 셀에 표준액 (3.0 ㎕) 과 제 1 시약 (0.15 ㎖) 을 첨가하고 37 ℃ 에서 5 분간 가온하여, 반응액의 흡광도 (E1) 를 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 로 측정하고, 이어서, 이 반응액에 제 2 시약 (0.05 ㎖) 을 첨가하고 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 가온하여, 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 로 측정하였다.
(2) 측정용 검체의 조제
풀 혈청 352 ㎕ 에 빌리루빈 농도 500 ㎎/㎗ 의 간섭 체크·A 플러스-빌리루빈 C (시스멕스사 제조) 48 ㎕ 를 혼합하여, 빌리루빈 농도 60 ㎎/㎗ 의 빌리루빈 첨가 검체를 조제하였다. 마찬가지로, 빌리루빈 농도 500 ㎎/㎗ 의 간섭 체크·A 플러스-빌리루빈 C 대신에, 간섭 체크·A 플러스-빌리루빈 C (블랭크) (시스멕스사 제조) 를 사용하여 빌리루빈 농도 0 ㎎/㎗ 의 대조 검체를 조제하였다.
(3) 검체와 실시예 1 의 각 키트의 반응에 의한 당해 검체에 있어서의 「흡광도」의 측정
상기 (1) 의 검량선 작성에 있어서 사용한 표준액 대신에, 상기 (2) 에서 조제한 측정용 검체, 즉, 빌리루빈 첨가 검체 및 대조 검체의 각 검체를 사용하는 것 이외에는 (1) 의 「흡광도」 산출 방법과 동일한 방법에 의해, 당해 검체에 대한 「흡광도」를 측정하였다.
(4) 측정용 검체 중의 LDL-C 농도의 결정
상기 (3) 에서 측정한 「흡광도」와, 상기 (1) 에서 작성한 검량선으로부터, 각 검체 중의 LDL-C 농도를 결정하였다. 대조 검체 중의 LDL-C 농도를 100 으로 하였을 때의 빌리루빈 첨가 검체 중의 LDL-C 농도의 상대치를 제 2 표에 나타낸다.
키트로서, 키트 B1 대신에 키트 B2 ∼ B3 의 각 키트를 사용하는 것 이외에는 상기 (1) ∼ (4) 와 동일한 방법에 의해, 빌리루빈 첨가 검체 중의 LDL-C 농도의 상대치를 결정하였다. 결과를 제 2 표에 나타낸다.
[비교예 6]
실시예 3 의 키트 B1 대신에 비교예 5 의 키트 b 를 사용하는 것 이외에는 실시예 4 와 동일한 방법에 의해, 빌리루빈 첨가 검체 중의 LDL-C 농도의 상대치를 결정하였다. 결과를 제 2 표에 나타낸다.
Figure pct00002
LDL-C 농도의 상대치는, 대조 검체 중의 LDL-C 농도를 100 으로 한 경우의 빌리루빈 첨가 검체 중의 LDL-C 농도를 나타내고, 값이 낮을수록 빌리루빈의 영향을 받고 있는 것이 된다. 제 2 표에, 키트 b 를 사용한 경우의 LDL-C 농도의 상대치를 기준으로 하였을 때의, 각 키트에 있어서의 LDL-C 농도의 상대치의 차를 Δ상대치로서 나타냈다. 제 2 표로부터 분명한 바와 같이, 지방산을 함유하는 키트를 사용한 경우에는, 지방산을 함유하지 않는 키트인 경우에 보다 빌리루빈의 영향을 잘 받지 않았다. 이 결과로부터, 지방산을 사용하는 본 발명의 측정 방법은, 빌리루빈의 영향이 억제된 방법임을 알 수 있다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의해, 빌리루빈의 영향이 억제된, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법, 및, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약이 제공된다. 본 발명의 측정 방법, 및, 측정용 시약은 임상 진단에 유용하다.

Claims (6)

  1. 검체 중의 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하고, 생성된 과산화수소를 페록시다아제의 존재하, 산화 발색형 색원체와 반응시켜, 정색(呈色)된 반응액의 흡광도를 측정함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 방법에 있어서, 지방산 혹은 그 염을 공존시키는 것을 특징으로 하는 측정 대상 성분의 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    지방산이 탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산인 측정 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산이, 옥탄산, 데칸산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코사트리엔산, 아라키드산, 이코산산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산, 도코산산, 도코사헥사엔산, 테트라도코산산, 및, 테트라코사펜타엔산으로 이루어지는 군에서 선택되는 지방산인 측정 방법.
  4. 검체 중의 측정 대상 성분을 효소 반응에 의해 과산화수소로 유도하는 성분, 페록시다아제, 산화 발색형 색원체, 및, 지방산 혹은 그 염을 함유하는, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약.
  5. 제 4 항에 있어서,
    지방산이 탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산인 측정용 시약.
  6. 제 5 항에 있어서,
    탄소수 8 ∼ 24 의 포화 또는 불포화 지방산이, 옥탄산, 데칸산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코사트리엔산, 아라키드산, 이코산산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산, 도코산산, 도코사헥사엔산, 테트라도코산산, 및, 테트라코사펜타엔산으로 이루어지는 군에서 선택되는 지방산인 측정용 시약.
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