KR20140146616A - 부타놀로겐용 배지의 아세테이트 보충물 - Google Patents

부타놀로겐용 배지의 아세테이트 보충물 Download PDF

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KR20140146616A
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로리 앤 마지오-홀
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부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 산업용 미생물학 및 알코올 생산 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 조작된 부탄올 경로 및 발효 동안 부산물 생산에 대한 경로에서 유전자의 파괴된 활성을 포함하는 재조합 미생물이 아세테이트 함유 발효 배지 중에서 배양되는 경우, 그 미생물에 의한 부탄올 이성질체의 개선된 생산에 관한 것이다. 실시양태에서, 재조합 미생물은, C2 보충물로서 아세테이트를 함유하는 발효 배지 중에서 증가된 성장 속도를 갖는다.

Description

부타놀로겐용 배지의 아세테이트 보충물{ACETATE SUPPLEMENTION OF MEDIUM FOR BUTANOLOGENS}
본 발명은 산업용 미생물학 및 알코올 생산 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 조작된(engineered) 부탄올 경로를 포함하는 재조합 미생물이 아세테이트 함유 발효 배지 중에서 배양되는 경우, 그 미생물에 의한 부탄올 이성질체의 발효 생산에서의 개선에 관한 것이다.
관련-출원과의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 의거하여, 2012년 3월 23일 출원된, 미국 가출원 일련번호 제 61/615,174호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
EFS-웹을 통하여 전자 제출된 서열 목록의 언급
전자 제출된 서열 목록의 내용(20120315_CL5681USNP_SEQLIST_ST25; 크기: 294,486; 생성일: 2013년 3월 14일)은 본 명세서와 함께 제출되며, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
부탄올은 다양한 적용을 갖는 중요한 산업적 화학물질이며, 이러한 적용에서 연료 또는 연료 첨가제로서의 그의 잠재력은 특히 중요하다. 부탄올은 표준 내연기관(internal combustion engine)에서 연소시, CO2만을 생산하고 SOx 또는 NOx는 거의 생산하지 않거나 또는 전혀 생산하지 않기 때문에, 연료 또는 연료 첨가제로서 선호된다. 부탄올은 4-탄소 알코올이지만, 가솔린의 에너지 함량과 유사한 에너지 함량을 가지며, 어떤 화석 연료와도 배합될 수 있다. 추가로, 부탄올은 지금까지 가장 바람직한 연료 첨가제인 에탄올보다 덜 부식성이다.
부탄올은 연료 전지 산업에서 수소 분포 문제에 영향을 미치는 잠재력도 갖는다. 연료 전지는 오늘날 수소 수송 및 유통과 연관된 안정성 염려에 의해 골치가 되고 있다. 그러나, 부탄올은 그의 수소 함량에 대하여 쉽게 개량될 수 있고, 연료 전지 또는 차량 중 어느 하나에서 요구되는 순도로 기존 주유소를 통해 유통될 수 있다. 부탄올은 또한 플라스틱 산업에서 공급원료 (feedstock) 화학물질로서, 그리고 식품 및 향료 산업에서 식품 등급의 추출제로서 유용하다. 매해, 45억 내지 54억 ㎏ (100억 내지 120억 파운드)의 부탄올이 석유화학적 수단에 의해 생산되며, 이러한 원자재 화학 물질에 대한 요구는 미래에도 아마 증가할 것이다.
아이소부탄올의 화학적 합성 방법, 예컨대 옥소 합성, 일산화탄소의 촉매적 수소화 (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th edition, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co., Weinheim, Germany, Vol. 5, pp. 716-719 (2003)) 및 메탄올의 n-프로판올과의 게르베 (Guerbet) 축합 (Carlini et al., J. Molec. Catal. A. Chem., 220:215-220 (2004))이 알려져 있다. 이들 공정은 석유화학물질 유래의 출발 물질을 사용하며, 일반적으로 비용이 많이 들고, 친환경적이지 않다. 식물-유래의 원료로부터의 아이소부탄올의 생산은 화석 연료의 사용을 최소화시킬 수 있을 것이다.
아이소부탄올은 효모 발효의 부산물로서 생물학적으로 극미량으로 생산된다. 이는 효모에 의한 아미노산의 불완전 대사의 결과로서 형성되는 "퓨젤유 (fusel oil)"의 미량 성분이다. 아이소부탄올은 L-발린의 이화작용으로부터 특이적으로 생성된다. L-발린의 아민 기가 질소 공급원으로서 수확된 후에, 생성된 α-케토산은 소위 에를리히 경로(Ehrlich pathway)의 효소들에 의해 탈카르복실화되고 환원되어 아이소부탄올이 된다 (Dickinson et al., J. Biol. Chem. 273:25752-25756, 1998) ("Dickinson"). 외생의 L-발린의 발효 배지에의 첨가는 아이소부탄올의 산출을 증가시키며, 이는 Dickinson에 의하여 설명된 바와 같고, 여기에서 3 g/L의 아이소부탄올의 산출은 발효 배양액 중 20 g/L 농도의 L-발린을 제공함에 의해 수득된다는 것이 보고되었다. 그러나, 공급원료로서 발린의 이용은 산업적 규모의 아이소부탄올 생산에서는 비용이 높아 엄두를 낼 수 없다.
당으로부터 직접적으로, 아이소부탄올을 포함하는, 부탄올 생산을 위해 조작된 생합성 경로를 발현하는 미생물은 이전에 예를 들어, 미국 특허 제 7,851,188호 및 제 7,993,889호에 기재되었다. 그러한 부타놀로겐(butanologen)은 부탄올 이성질체의 산출을 최대화하기 위하여 발효 동안 부산물의 형성에 관련된 특정 유전자들의 파괴를 추가로 포함할 수 있다. 부산물 형성에 관련된 유전자에는 에탄올 형성 (미국 특허출원 공개 번호 제 20090305363호 참조) 및 아이소부티르산 형성에 필요한 유전자가 포함된다. (PCT 국제 출원 공개 번호. 제 WO2012/129555호 참조). 에탄올 형성에 필요한 유전자 (예로서, PDC 유전자)가 파괴된 미생물은 적절한 성장을 위한 외생의 C2 보충물을 필요로 한다. 이러한 C2 보충물에 대한 필요는 대개 배양 배지에 소량의 에탄올을 첨가함으로써 충족된다. 예로서, 본 명세서에 참고로서 통합된, 미국 특허 출원 공개 번호 제 20090305363호는 PDC 넉아웃 (knockout) 효모 균주를 기재하고 있는데, 이는 탄소 공급원으로서 2% 글루코스 함유 배지 중에서는 성장할 수 없지만, 소량의 에탄올로 보충된 글루코스 함유 배지에서는 매우 잘 성장하는 것으로 발견되었다.
이러한 상황하에서, PDC 유전자 파괴에 더하여 아이소부티르산 생산에 필요한 유전자의 파괴를 갖는 부타놀로겐 (예로서, ALD6)은, 에탄올이 C2 보충물로서 사용되는 경우에도, 성장하여 부탄올을 생산하는 변경된 능력을 가질 수 있다. 예로서 감소된 C2 의존성을 위해 균주를 조작함에 의한 그러한 도전에 대한 시도들이 설명되어 왔으나 (예로서, 미국 출원 공개 번호 제 20120156735호 참조), 그러한 전략을 대체 또는 보충하기 위한 대안적 또는 보충적 방법들은 본 기술분야에서의 진보를 나타내는 것일 것이다.
본 명세서에서는 하기 단계들을 포함하는 부탄올 생산 방법이 제공된다:
a. i. 조작된 부탄올 생합성 경로
를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
b. a)의 숙주 세포를,
i. 발효가능한 탄소 기질; 및
ii. 아세테이트
를 포함하는 발효 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 재조합 숙주 세포는 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성, 및 선택적으로 알데하이드 탈수소효소 활성이 감소 또는 제거되도록 조작되었으며; 이에 의하여 부탄올은 조작된 부탄올 생합성 경로를 통하여 발효가능한 탄소 기질로부터 직접 생산된다. 실시양태에서, 아세테이트가 발효 배지에 첨가된다. 실시양태에서, 아세테이트는 숙주 세포의 성장에 대해 충분한 양으로 존재한다. 실시양태에서, 아세테이트는 개선된 부탄올 생산에 대해 충분한 양으로 존재한다. 실시양태에서, 아세테이트가 발효 배지에 첨가된다. 실시양태에서, 아세테이트는 재생가능한 공급원료 공급원으로부터의 것이다.
본 발명의 한 실시양태는 하기 단계들을 포함하는 부탄올의 생산 방법에 관한 것이다:
a. i. 조작된 부탄올 생합성 경로
를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
b. a)의 숙주 세포를,
i. 발효가능한 탄소 기질; 및
ii. a)의 숙주 세포의 성장 및 부탄올 생산에 대해 충분한 양의, C2 1보충물로서, 아세테이트와 접촉시키는 단계로, 여기에서 아세테이트는 발효 배지에 첨가되고;
상기 재조합 숙주 세포는 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성, 및 알데하이드 탈수소효소 활성이 감소 또는 제거되도록 조작되었으며; 이에 의하여 부탄올은 조작된 부탄올 생합성 경로를 통하여 발효가능한 탄소 기질로부터 직접 생산된다.
본 발명의 한 실시양태는 하기 기질에서 생성물로의 전환을 포함하는 아이소부탄올의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 피루베이트에서 아세토락테이트 (경로 단계 a);
b) a)로부터의 아세토락테이트에서 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트 (경로 단계 b);
c) b)로부터의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트에서 α-케토아이소발레레이트 (경로 단계 c);
d) c)로부터의 α-케토아이소발레레이트에서 아이소부티르알데하이드 (경로 단계 d); 및
e) d)로부터의 아이소부티르알데하이드에서 아이소부탄올 (경로 단계 e);
여기에서
i) 단계 a)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세토락테이트 신타제 (synthase) 효소에 의하여 수행되고;
ii) 단계 b)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세토하이드록시산 이성질화환원 효소 (isomeroreductase enzyme)에 의하여 수행되고;
iii) 단계 c)의 기질에서 생성물로의 전환은 다이하이드록시산 탈수효소에 의하여 수행되고;
iv) 단계 d)의 기질에서 생성물로의 전환은 α-케토산 탈카르복실화효소에 의하여 수행되고;
v) 단계 e)의 기질에서 생성물로의 전환은 알코올 탈수소효소에 의하여 수행되고;
이에 의하여 아이소부탄올은 조작된 생합성 경로를 통해 피루베이트로부터 직접 생산된다.
본 발명의 한 실시양태는 하기 기질에서 생성물로의 전환을 포함하는 아이소부탄올의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 피루베이트에서 아세토락테이트 (경로 단계 a);
b) a)로부터의 아세토락테이트에서 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트 (경로 단계 b);
c) b)로부터의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트에서 α-케토아이소발레레이트 (경로 단계 c);
d) c)로부터의 α-케토아이소발레레이트에서 아이소부티릴-CoA (경로 단계 f);
e) d)로부터의 아이소부티릴-CoA에서 아이소부티르알데하이드 (경로 단계 g); 및
f) e)로부터의 아이소부티르알데하이드에서 아이소부탄올 (경로 단계 e);
여기에서
i) 단계 a)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세토락테이트 신타제 효소에 의하여 수행되고;
ii) 단계 b)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세토하이드록시산 이성질화환원 효소에 의하여 수행되고;
iii) 단계 c)의 기질에서 생성물로의 전환은 다이하이드록시산 탈수효소에 의하여 수행되고;
iv) 단계 d)의 기질에서 생성물로의 전환은 분지쇄 케토산 탈수소효소에 의하여 수행되고;
v) 단계 e)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세틸화 알데하이드탈수소효소에 의하여 수행되고;
vi) 단계 f)의 기질에서 생성물로의 전환은 알코올 탈수소효소에 의하여 수행되고;
이에 의하여 아이소부탄올은 조작된 생합성 경로를 통해 피루베이트로부터 직접 생산된다.
본 발명의 한 실시양태는 하기를 포함하는 조성물에 관한 것이다:
a) i) 조작된 부탄올 생합성 경로
를 포함하는 재조합 숙주 세포; 및
b) i) 발효가능한 탄소 기질; 및
ii) a)의 숙주 세포의 성장 및 부탄올 생산에 대해 충분한 양의 아세테이트
를 포함하는 발효 배지,
여기에서 상기 재조합 숙주 세포는 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성 및 알데하이드 탈수소효소 활성이 감소 또는 제거되도록 조작되었다.
실시양태에서, 아세테이트가 발효 배지에 첨가된다. 실시양태에서, 아세테이트는 재생가능한 공급원료 공급원으로부터의 것이다. 실시양태에서, 아세테이트 및 탄소 기질은 모두 재생가능한 공급원료 공급원으로부터의 것이다.
본 발명의 한 실시양태는 조성물에 관한 것으로, 여기에서 발효 배지는 부탄올을 더 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는, 조작된 부탄올 생합성 경로를 통하여 발효가능한 탄소 기질로부터 부탄올이 직접 생산되는 조건하에서, 상기 조성물을 유지하는 것을 포함하는 부탄올의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태는 본 명세서에 개시된 방법으로부터 생산된 부탄올에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 피루베이트 탈카르복실화효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 PDC1, PDC5, PDC6 또는 이의 조합이다. 일부 실시양태에서, 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6 또는 이의 조합이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 그의 성장을 위해, 외생의 2-탄소 기질 보충물에 대해 감소된 또는 제거된 필요를 포함하도록 조작 또는 발달된다 (evolved).
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포스포케톨라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드, 포스포트랜스아세틸라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들 모두를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 박테리아 또는 효모이다.
일부 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 아이소부탄올 생산을 위한 조건에 투입되는 전세포 (whole cell) 촉매이다.
일부 실시양태에서, 생산되는 부탄올은 아이소부탄올이다. 일부 실시양태에서, 생산되는 부탄올은 1-부탄올이다.
일부 실시양태에서, 방법은 부탄올의 회수를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 회수는 증류, 액체-액체 추출, 흡착, 경사 분리 (decantation), 투과증발 (pervaporation) 또는 이의 조합에 의한다. 일부 실시양태에서, 방법은 발효 배지로부터 고형분의 제거도 포함한다. 일부 실시양태에서, 제거 단계는 회수 단계 전에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제거는 원심분리, 여과 또는 경사 분리에 의한다.
<도 1>
도 1은 상이한 아이소부탄올 생합성 경로를 묘사한다. "a", "b", "c", "d", "e", "f" 및 "g"로 표시된 단계들은 하기 기재된 기질에서 생성물로의 전환을 나타낸다. 단계 "a"는, 예로서 아세토락테이트 신타제에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "b"는, 예로서 아세토하이드록시산 환원이성질화효소에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "c"는, 예로서 다이하드록시산 탈수효소에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "d"는, 예로서 분지쇄 케토산 탈카르복실화효소에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "e"는, 예로서 분지쇄 알코올 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "f"는, 예로서 분지쇄 케토산 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "g"는, 예로서 아세틸화 알데하이드탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있다.
<도 2>
도 2는 1-부탄올 생합성 경로를 묘사한다. "a", "b", "c", "d", "e", 및 "f" 로 표시된 단계들은 하기 기재된 기질에서 생성물로의 전환을 나타낸다. 단계 "a"는, 예로서 아세틸-CoA 아세틸 전이효소에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "b"는, 예로서 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "c"는, 예로서 크로토나제 (crotonase)에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "d"는, 예로서 부티릴-CoA 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "e"는, 예로서 부티르알데하이드 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있다. 단계 "f"는, 예로서 부탄올 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있다.
학술지 논문 또는 요약, 공개된 또는 대응 미국 또는 외국 특허출원, 특허된 또는 외국 특허, 또는 임의의 기타 문헌을 포함하여, 본 명세서에서 인용된 모든 문헌들은 각각 본 명세서에 참고로서 그 전체로서 통합되며, 이는 그 인용된 문헌에 제시된 모든 데이터, 표, 도면 및 본문을 포함한다.
본 기술분야의 당업자는, 단지 통상의 실험을 이용하여, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 균등물들을 인식 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 특허청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
본 명세서는, 조작된 부탄올 생합성 경로를 발현하고 발효 공정 동안 부산물 형성에 관련된 유전자들 중 하나 이상의 파괴를 갖는 재조합 미생물을 이용하는 부탄올 이성질체의 발효 생산 방법으로, 여기에서 아세테이트가 발효 배지에 첨가되는 방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 출원인은, PDC 유전자 결실 (및 선택적으로 ALD6 유전자 결실)을 갖는 부타놀로겐이 그들이 외생의 C2 보충물로서 아세테이트를 갖는 발효 배지 내에서 배양되는 경우 개선된 성장 속도 또는 부탄올 이성질체 생산을 갖는다는 것을 발견하였다. 아세테이트는 에탄올보다 덜 비싸기 때문에, C2 보충물로서 아세테이트의 이용은 부탄올 이성질체의 생산비를 감소시킨다.
실시양태에서, PDC-KO 표현형을 갖는 숙주 세포는, 그의 성장을 위하여 외생의 2-탄소 기질 보충물에 대하여 감소된 또는 제거된 필요를 가질 수 있다. 예로서, PDC-KO 표현형을 갖는 숙주 세포는, 성장을 위해 C2 보충물에 대하여 감소된 또는 제거된 필요를 갖도록 조작 (예로서, 이에 제한되지는 않지만, 포스포케톨라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 포스포트랜스아세틸라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록) 또는 발달될 수 있다. 그러한 실시양태에서는 적어도 이론상으로, 아세테이트가 C2 영양요구성을 만족시키는데 절대적으로 요구되지 않을 수 있지만, 실시예에서 예증되는 바와 같이, 본 명세서에서 제공되는 방법은 그러한 숙주 세포를 이용하여 부탄올 생산에서 개선을 제공할 수 있다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충될 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 좌우할 것이다. 또한, 문맥에 의해 다르게 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이며, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 기타 참조문헌은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
본 명세서에 개시된 것과 유사하거나 또는 균등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 하기에 개시되어 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다. 본 발명을 추가로 정의하기 위하여, 하기의 용어 및 정의가 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "구성하다," "구성하는," "포함하다," "포함하는," "갖다," "갖는," "함유하다," "함유하는" 또는 이의 임의의 다른 변형은 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹의 배제가 아닌, 언급된 정수 또는 정수의 그룹의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 예로서, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소만으로 제한되지는 않고, 명시적으로 열거되지 않거나 또는 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치에 내재한 다른 요소를 포함할 수도 있다. 더욱이, 명백히 반대로 언급되지 않는한, "또는"은 포괄적인 "또는"을 말하는 것이지, 배타적인 "또는"을 지칭하는 것은 아니다. 예로서, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나에 의해 충족된다: A는 참 (또는 존재함)이고 B는 거짓 (또는 존재하지 않음), A는 거짓 (또는 존재하지 않음)이고 B는 참 (또는 존재함), A 및 B 둘 모두가 참 (또는 존재함).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 명세서 및 특허청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "이루어지다", 또는 "이루어진다" 또는 "이루어지는"과 같은 변형은, 임의의 기재된 정수 또는 정수의 그룹의 포함을 나타내지만, 추가의 정수 또는 정수의 그룹이 특정 방법, 구조 또는 조성물에 첨가될 수 없음을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 명세서 및 특허청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "본질적으로 이루어지다", 또는 "본질적으로 이루어진다" 또는 "본질적으로 이루어지는"과 같은 변형은 임의의 기재된 정수 또는 정수의 그룹의 포함, 및 특정 방법, 구조 또는 조성물의 기본 또는 신규 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 임의의 기재된 정수 또는 정수의 군의 선택적 포함을 나타낸다. 문헌[M.P.E.P. § 2111.03]을 참조한다.
또한, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 "하나의"("a" 및 "an")는, 요소 또는 성분의 경우의 수, 즉, 출현의 수에 관해서는 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, "하나의"는 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형 단어는 그 수가 명백하게 단수를 의미하는 것이 아니라면, 복수도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비제한적인 용어이며, 특정 발명의 임의의 단일의 실시양태를 언급하는 것으로 의도되지 않고, 출원서에 기재된 바와 같은 모든 가능한 실시양태들을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 발명의 성분 또는 반응물의 양 또는 본 명세서에 기재된 반응 조건을 한정하는 용어 "약"은, 예를 들어, 현실에서 농축물 또는 용액을 제조하는데 사용되는 전형적인 측정 및 액체 취급 과정을 통하여; 이들 과정에서의 우발적인 오차를 통하여; 조성물을 제조하거나 또는 방법을 실시하기 위해 이용되는 성분의 제조, 공급원 또는 순도에서의 차이를 통하여; 등으로 일어날 수 있는 수치적 양의 변동을 말한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 혼합물로부터 유발되는 조성물에 대한 상이한 평형 조건으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의한 수식 여부를 불문하고, 특허청구범위는 분량의 균등물을 포함한다. 한 실시양태에서, 용어 "약"은 보고된 수치 값의 10% 이내, 및 보고된 수치 값의 5% 이내를 종종 의미한다.
일부 경우에, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "바이오매스(biomass)"는, 발효 생성물-생산 미생물의 세포 바이오매스를 지칭하며, 이는 전형적으로 g/L의 건조 세포 중량 (dcw) 단위로 제공된다.
용어 "발효 생성물"로는, 이에 제한되지는 않지만 1-부탄올, 아이소부탄올 등을 포함하는 관심 대상의 임의의 원하는 생성물이 포함된다.
용어 "부탄올 이성질체" 또는 "부탄올"은 1-부탄올, 아이소부탄올 또는 그 혼합물을 지칭한다. 아이소부탄올은 2-메틸-1-프로판올로도 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "부탄올 생합성 경로"는 1-부탄올 또는 아이소부탄올을 생산하는 효소 경로를 지칭한다. 예로서, 부탄올 생합성 경로는 미국 특허 제 7,993,889호에 개시되어 있으며, 이는 참고로서 본 명세서에 포함된다.
용어 "아이소부탄올 생합성 경로"는 아이소부탄올을 생산하는 효소적 경로를 말한다. 때때로 "아이소부탄올 생합성 경로"는 "아이소부탄올 생산 경로"와 동의어로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "1-부탄올 생합성 경로"는 1-부탄올을 생산하는 효소 경로를 지칭한다.
"재조합 숙주 세포"는 생합성 생산 경로를 발현하도록 유전적으로 조작된 숙주 세포로서 정의되며, 여기에서 숙주 세포는 변경되지 않은 숙주 세포에 비하여 생합성 생성물을 더욱 많은 양으로 생산하거나, 또는 변경되지 않은 숙주 세포에 의해서는 일반적으로 생산되지 않는 생합성 생성물을 생산한다.
부탄올 생합성 경로에 적용되는 바와 같은 용어 "조작된"은, 조작된 부탄올 생합성 경로를 통하여 피루베이트로부터의 탄소 흐름이 최대화되어, 발효가능한 탄소 기질로부터 증가된 양의 부탄올이 직접적으로 생산되도록 조종된 (manipulated) 부탄올 생합성 경로를 지칭한다. 그러한 조작에는, 이종성 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현, 내생의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 과발현, 사이토졸(cytosol)에 천연적으로 국지화되지는 않는 단백질의 사이토졸 국지화(localization), 증가된 보조인자 이용성, 경쟁적 경로의 감소된 활성 등이 포함된다.
용어 "발효가능한 탄소 기질"은 본 명세서에 개시된 것들과 같은 미생물에 의해 대사될 수 있는 탄소 공급원을 지칭한다. 적합한 발효가능한 탄소 기질에는, 이에 제한되지는 않지만, 글루코스, 프룩토스, 아라비노스 또는 자일로스와 같은 단당류; 락토스 또는 수크로스와 같은 올리고당류; 전분, 셀룰로스, 리그노셀룰로스 또는 헤미셀룰로스와 같은 다당류를 포함하는 당류; 1-탄소 기질, 지방산; 및 이들의 조합이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "발효 배지"는 물, 발효가능한 탄소 기질, 용해된 고형분, 발효 생성물 및 발효 용기 내에서 담긴 재료의 다른 모든 구성성분의 혼합물을 의미하며, 여기에서 발효 생성물은, 존재하는 미생물에 의하여, 발효가능한 탄소 기질에서 발효 생성물, 물 및 이산화탄소 (CO2)로의 반응에 의하여 제조되고 있다. 때때로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "발효 배양액" 및 "발효 혼합물"은 "발효 배지"와 동의어로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "호기성 조건"은 산소 존재 하에서의 성장 조건을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "미세호기성 조건"은 낮은 수준의 용해된 산소를 갖는 성장 조건을 의미한다. 예로서, 산소 수준은 약 1% 미만의 공기-포화일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "혐기성 조건"은 산소 부재 하에서의 성장 조건을 의미한다.
용어 "탄소 기질"은 본 명세서에 개시된 재조합 숙주 세포에 의하여 대사될 수 있는 탄소 공급원을 지칭한다. 탄소 기질의 비제한적인 예는 본 명세서에서 제공되며, 이에 제한되지는 않지만, 단당류, 올리고당류, 다당류, 에탄올, 락테이트, 석시네이트, 글리세롤, 이산화탄소, 아세테이트, 메탄올, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 자일로스, 아라비노스, 덱스트로스 및 그 혼합물이 포함된다.
용어 "C2 보충물"은, 2 개의 탄소 원자를 갖는 탄소 공급원을 지칭하며, 발효 배지에 첨가된 경우, C2 보충물은 발효 공정 동안 부산물의 생성에 관련된 단백질의 활성의 파괴를 갖는 부타놀로겐의 성장 및/또는 부탄올 생산을 증가시킨다. C2 보충물의 비제한적인 예로는 아세테이트 및 에탄올이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, 용어 "부타놀로겐"은 부탄올 이성질체를 생산할 수 있는 미생물을 지칭한다. 그러한 미생물은 전형적으로, 조작된 부탄올 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물이다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "아이소부타놀로겐"은 아이소부탄올 이성질체를 생산할 수 있는 미생물을 지칭한다. 그러한 미생물은 전형적으로, 조작된 아이소부탄올 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물이다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "PDC 넉-아웃"은, PDC 활성이 제거 또는 감소되도록, PDC 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자에서, 또는 PDC1, PDC5 또는 PDC6 활성을 갖는 내생의 폴리펩타이드에서, 또는 이의 임의의 조합에서 파괴, 결실, 돌연변이, 및/또는 치환을 포함하는 숙주 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "ALD 넉-아웃"은, ALD 활성이 제거 또는 감소되도록, 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자에서, 또는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5 또는 ALD6 활성을 갖는 내생의 폴리펩타이드에서 또는 이의 임의의 조합에서 파괴, 결실, 돌연변이, 및/또는 치환을 포함하는 숙주 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "개선된 부탄올 생산"은, 이에 제한되지는 않지만, 수율, 유효 속도, 유효 적정농도 (effective titer) 또는 비 생산성 (specific productivity) 중 하나 이상에서의 증가, 또는 예로서 아이소부티르산과 같은 하나 이상의 부산물의 수율에서의 감소를 포함하는, 부탄올 생산 변수에서의 개선을 지칭한다. 아세테이트와 관련된 증가 또는 감소는 아세테이트 부재 하의 적절한 대조구 방법에 관하여 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "수율"은, g/g 단위의, 탄소 공급원의 양 당 생성물의 양을 지칭한다. 수율은 탄소 공급원으로서 글루코스에 대해 예시될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 수율은 이론적 수율의 퍼센트로서 표시되는 것으로 이해된다. 미생물 또는 대사 경로를 참고하여, "이론적 수율"은 생성물을 제조하기 위해 사용된 대사 경로의 화학양론에 의해 좌우되는 바와 같은 기질의 총 양 당 생성될 수 있는 생성물의 최대 양으로서 정의된다. 예로서, 글루코스에서 아이소프로판올로의 하나의 전형적인 전환에 대한 이론적 수율은 0.33 g/g이다. 이와 같이, 글루코스로부터 아이소프로판올의 수율 0.297 g/g은 90%의 이론 또는 90% 이론적 수율로서 표시될 것이다. 본 발명의 개시내용에서, 수율은 탄소 공급원으로서 글루코스에 대하여 예시되지만, 본 발명은 다른 탄소 공급원에 적용될 수 있으며, 그 수율은 사용된 탄소 공급원에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해된다. 당업자는 각종 탄소 공급원에 따라 수율을 계산할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "유효 글루코스"는 발효 배지 1리터 당 발효에 의해 생산되는 부탄올 이성질체의 총 양을 지칭한다. 부탄올 이성질체의 총 양은: (i) 발효 배지 중 부탄올의 양; (ii) 유기 추출제로부터 회수된 부탄올 이성질체의 양; 및 (iii) 가스 스트리핑 (stripping)이 이용될 경우, 가스 상으로부터 회수되는 부탄올 이성질체의 양을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "유효 속도"는 발효 시간 당 발효 배지 1리터 당 발효에 의해 생산되는 부탄올 이성질체의 총 양을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "비 생산성"은 단위 시간 당 세포의 건조 세포 중량 1g 당 생산된 부탄올 이성질체의 g을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "성장 속도"는 미생물이 배양 배지 중에서 성장하는 속도를 지칭한다. 재조합 미생물의 성장 속도는 예로서, 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 배가 시간(doubling time)은 성장 곡선의 로그 부분으로부터 계산되고, 성장 속도의 척도로서 사용될 수 있다.
본 발명에서의 이용을 위한 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 단수의 "폴리펩타이드" 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드들"을 포함하고자 하는 것이며, 아미드 결합 (펩타이드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형적으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 특정 길이의 생성물을 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하는데 사용된 임의의 다른 용어는, "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되는 것이며, 이들 용어 대신 또는 이들 용어 중 임의의 것과 상호교환가능하게 "폴리펩타이드"라는 용어가 사용될 수 있다. 폴리펩타이드는 천연의 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있으나, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 이는 화학적 합성에 의한 것을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다. 본 발명에서 사용된 폴리펩타이드는 전장 폴리펩타이드 및 그의 단편을 포함한다.
"분리된" 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 그의 천연 환경에서는 존재하지 않는 폴리펩타이드를 의도한다. 특정 정제 수준은 필요하지 않다. 예로서, 분리된 폴리펩타이드는 그의 고유 또는 천연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현되는 재조합적으로 생산된 폴리펩타이드 및 단백질은, 임의의 적합한 기술에 의하여 분리, 분획화, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩타이드와 같이, 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 여겨진다.
본 발명에서의 이용에 적합한 폴리펩타이드 및 기타 효소, 및 그의 단편은 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화된다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 핵산 뿐만 아니라 복수의 핵산도 포괄하는 것으로 의도되며, 분리된 핵산 분자 또는 구축물, 예로서 메신저 RNA (mRNA), 바이러스-유래 RNA, 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 통상의 인산다이에스테르 결합 또는 통상적이지 않은 결합 (예로서, 펩타이드 핵산 (PNA)에서 발견되는 것과 같은, 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드 중에 존재하는, 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예로서 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 합성으로 생산된 이러한 분자를 더 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에 대하여 천연 또는 이종성일 수 있다. 추가적으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은, 프로모터, 리보솜 결합 자리, 또는 전사 종결자와 같은, 조절 성분일 수 있거나 또는 조절 성분을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우에서, 폴리펩타이드를 암호화하는, 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 정상적으로는 하나 이상의 코딩 영역과 작동적으로 연합된(operably associated) 프로모터 및/또는 기타 전사 또는 번역 제어 성분을 포함할 수 있다. 작동적 연합은, 유전자 생성물, 예로서 폴리펩타이드에 대한 코딩 영역이, 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에서 유전자 생성물의 발현을 위치시키도록 하는 방식으로, 하나 이상의 조절 서열과 연관되는 경우이다. 2개의 DNA 단편 (예컨대, 폴리펩타이드 코딩 영역 및 그와 연관된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 생성물을 암호화하는 mRNA의 전사를 결과로서 생성하는 경우, 그리고 두 DNA 단편간의 연결의 성질이, 발현 조절 서열이 유전자 생성물의 발현을 지시하는 능력을 간섭하지 않거나 또는 DNA 주형의 전사되는 능력을 간섭하지 않는 경우, "작동적으로 연합된" 것이다. 따라서, 프로모터 영역은, 프로모터가 핵산의 전사를 실현할 수 있다면, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동적으로 연합된 것일 것이다. 프로모터 외에, 기타 전사 제어 성분, 예로서 인핸서(enhancer), 오퍼레이터(operator), 리프레서(repressor) 및 전사 종결 신호가 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연합될 수 있다. 적합한 프로모터 및 기타 전사 제어 영역은 본 명세서에 개시된다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 "분리된" 것으로서 지칭될 수 있으며, 여기에서 이는 그의 천연 환경으로부터 제거된 것이다. 예로서, 벡터 내에 포함된 효소 활성 (예로서, 기질을 자일룰로스로 전환하는 능력)을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 목적을 위하여 분리된 것으로 여겨진다. 분리된 폴리뉴클레오타이드의 추가의 예는 이종성 숙주 세포에 유지된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 중의 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성으로 생성된 이러한 분자를 더 포함한다. DNA의 중합체 형태인 분리된 폴리뉴클레오타이드 단편은 cDNA, 게놈 DNA, 또는 합성 DNA 중 하나 이상의 절편으로 구성될 수 있다.
용어 "유전자"는, 선택적으로 코딩 서열에 앞서는 조절 서열(5' 비코딩 서열) 및 코딩 서열에 뒤따르는 조절 서열(3' 비코딩 서열)을 포함하는, 특정 단백질로 발현될 수 있는 핵산 단편을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은 "코딩 영역" 또는 "ORF"는, 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어진 핵산의 부분이다. "종결 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않으나, 존재하는 경우 코딩 영역의 일부로서 여겨질 수 있지만, 임의의 플랭킹(flanking) 서열, 예로서 프로모터, 리보솜 결합 자리, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 비-번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 업스트림 (5' 비-코딩 서열), 이의 내부, 또는 이의 다운스트림 (3' 비-코딩 서열)에 위치하고, 전사, RNA 가공 또는 안정성 또는 연관된 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열 (translation leader sequence), 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 자리, 이펙터 (effector) 결합 자리 및 스템-루프 구조 (stem-loop structure)를 포함할 수 있다.
각종 번역 제어 성분은 당업자에게 알려져 있다. 이들에는, 이에 제한되지 않지만, 리보솜 결합 자리, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 성분들 (특히, 내부 리보솜 도입 자리 또는 IRES)이 포함된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 예로서 메신저 RNA (mRNA)의 형태이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같은, 용어 "형질전환"은 유전적으로 안정적인 유전성을 결과로서 야기하는, 숙주 생물체의 게놈 내로의 핵산 단편의 전달을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 생물체는 "재조합" 또는 "형질전환된" 생물체로서 지칭된다.
용어 "플라스미드," "벡터," 및 "카세트"는 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 운반하며, 대개 원형의 이중 가닥 DNA 단편의 형태인 염색체 외의 성분 (extra chromosomal)을 지칭한다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래되는 자체적으로 복제하는 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오타이드 서열, 선형 또는 환형의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 여기에서, 다수의 뉴클레오타이드 서열은 적절한 3' 미번역 서열과 함께, 프로모터 단편 및 선택된 유전자 생성물에 대한 DNA 서열을 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구축물로 결합되거나 재조합된다. "형질전환 카세트"는 외래 유전자를 함유하고, 그 외래 유전자에 더하여 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소들을 갖는 특정 벡터를 말한다. "발현 카세트"는 외래 유전자를 함유하며, 외래 유전자에 더하여 외래 숙주에서 그 유전자의 발현이 향상되게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "천연"은 존재하는 경우, 그 자신의 조절 서열을 포함하는, 자연에서 발견되는, 폴리뉴클레오타이드, 유전자 또는 폴리펩타이드의 형태를 지칭한다.
폴리뉴클레오타이드, 유전자 또는 폴리펩타이드에 관하여 사용하는 경우, 용어 "내생"은 생물체의 게놈 내의 그의 천연의 위치 내의 천연의 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자를 지칭하거나, 천연 폴리펩타이드의 경우 게놈 내의 이러한 위치로부터 전사 및 번역된다.
폴리뉴클레오타이드, 유전자 또는 폴리펩타이드에 관하여 사용되는 경우, 용어 "이종성"은 숙주 생물 내에서 보통 관찰되지 않는 폴리뉴클레오타이드, 유전자 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 또한, "이종성"은 상응하는 천연 유전자와 상이한 형태로, 예로서, 생물체의 게놈 내의 그의 천연의 위치에 있지 않게, 공급원 생물체 내에 재도입되는 천연의 코딩 영역 또는 그의 부분을 포함한다. 이종성 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자는 예로서, 유전자 전달에 의하여 숙주 생물체 내로 도입될 수 있다. 이종성 유전자는 천연의 숙주 내로 재도입되는 비-천연 조절 영역을 갖는 천연 코딩 영역을 포함할 수 있다. "트랜스유전자 (transgene)"는 형질전환 과정에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.
"조절 서열"은 코딩 서열의 업스트림 (5' 비-코딩 서열), 그의 내부 또는 그의 다운스트림 (3' 비-코딩 서열)에 위치하고, 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 전사 종결 신호, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 자리, 이펙터 결합 자리 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.
용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 작용성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는, 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수도 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수도 있거나, 또는 심지어는 합성 핵산 절편을 포함할 수도 있다. 상이한 프로모터는 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 대부분의 경우에 대부분의 세포 유형에서 유전자의 발현을 유발하는 프로모터를 통상적으로 "구조성(constitutive) 프로모터"라고 지칭한다. 한면, "유도성 프로모터"는 프로모터가 프로모터-특이적 신호 또는 분자에 의하여 유도되거나 켜지는 경우 유전자가 발현되게 한다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계는 완전하게 규정되지 않은 것이므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 더욱 인식된다. 예로서, "FBA1 프로모터"는 FBA1 유전자의 프로모터 영역으로부터 유래된 단편을 지칭하는데 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "종결자 (terminator)"는 코딩 서열의 하류에 위치하는 DNA 서열을 지칭한다. 이는 폴리아데닐화 인식 서열 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 암호화하는 다른 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 대개 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙트(tract)를 부가하는 데에 영향을 미치는 것에 의해 특징된다. 3' 영역은 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 관련 코딩 서열의 번역에 영향을 미칠 수 있다. 대부분의 경우에 조절 서열들의 정확한 경계는 완전히 정의된 것은 아니기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편들이 동일한 종결자 활성을 가질 수 있는 것으로 인식된다. 예로서, "CYC1 종결자"는 CYC1 유전자의 종결자 영역으로부터 유래된 단편을 지칭하는데 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
용어 "작동적으로 연결된"은, 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편상에서 핵산 서열들이 연합됨을 지칭한다. 예로서, 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우에, 프로모터는 그 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다 (즉, 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있다). 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "발현"은, 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 지칭한다. 또한, 발현은 mRNA의 폴리펩타이드로의 번역을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당 업계에서 공지되며, Sambrook 등 (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) (이후, "Maniatis"로 지칭); 및 Silhavy 등 (Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY, 1984); 및 Ausubel, F. M. 등 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. 및 Wiley-Interscience 출판, 1987)에 기재되어 있다.
부탄올 생합성 경로
탄수화물 이용 미생물은 엠덴-마이어호프-파르나스 (Embden-Meyerhof-Parnas: EMP) 경로, 엔트너-도우도르프 (Entner-Doudoroff) 경로 및 펜토오스 인산 회로를, 중심 대사 경로로서 이용하여 성장 및 유지를 위한 에너지 및 세포 전구체를 제공한다. 이들 경로는 중간체 글리세르알데하이드-3-인산을 공통으로 가지며, 최종적으로는, 직접적으로 또는 EMP 경로와 조합하여 피루베이트가 형성된다. 그 후, 피루베이트는 다양한 수단을 통하여 아세틸-조효소 A (아세틸-CoA)로 변형된다. 아세틸-CoA는, 예로서 지방산, 아미노산 및 2차 대사산물의 생성에서 주요 중간체로서 제공된다. 피루베이트로의 당 전환의 조합된 반응은 에너지 (예로서, 아데노신-5'-삼인산, ATP) 및 환원 균등물 (예로서, 환원된 니코틴아미드 아데노신 다이뉴클레오타이드, NADH, 및 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산, NADPH)을 생산한다. NADH 및 NADPH는 그의 산화된 형태 (각각, NAD+ 및 NADP+)로 재활용되어야만 한다. 무기 전자 수용체 (예로서, O2, NO3 - 및 SO4 2-)의 존재 하에, 환원 균등물은 에너지 풀을 증강시키는데 사용될 수 있으며; 대안적으로, 환원된 탄소 생성물이 형성될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 발효가능한 탄소 공급원으로부터의 부탄올 이성질체의 생산을 위한 조작된 생합성 경로는, 예로서, 본 명세서에 참고문헌으로 통합된, 미국 특허 제 7,851,188호 및 제 7,993,889호에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 조작된 부탄올 생합성 경로는 아이소부탄올 생합성 경로로, 이는 하기 기질에서 생성물로의 전환을 포함한다:
a) 예로서, 아세토락테이트 신타제에 의해 촉매작용될 수 있는, 피루베이트에서 아세토락테이트로의 전환;
b) 예로서, 아세토하이드록시산 이성질화환원효소에 의하여 촉매작용될 수 있는, 아세토락테이트에서 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 전환;
c) 예로서, 다이하드록시산 탈수효소에 의하여 촉매작용될 수 있는, 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트에서 α-케토아이소발레레이트로의 전환;
d) 예로서, α-케토산 탈카르복실화효소에 의하여 촉매작용될 수 있는, α-케토아이소발레레이트에서 아이소부티르알데하이드로의 전환; 및
e) 예로서, 알코올 탈수소효소에 의하여 촉매작용될 수 있는, 아이소부티르알데하이드에서 아이소부탄올로의 전환.
다른 실시양태에서, 아이소부탄올 생합성 경로는 하기의 기질에서 생성물로의 전환을 포함한다:
a) 예로서, 아세토락테이트 신타제에 의해 촉매작용될 수 있는, 피루베이트에서 아세토락테이트로의 전환;
b) 예로서, 아세토하이드록시산 이성질화환원효소에 의하여 촉매작용될 수 있는, 아세토락테이트에서 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 전환;
c) 예로서, 다이하드록시산 탈수효소에의하여 촉매작용될 수 있는, 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트에서 α-케토아이소발레레이트로의 전환;
d) 예로서, 분지쇄 케토산 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있는, α-케토아이소발레레이트에서 아이소부티릴-CoA로의 전환;
e) 예로서, 아실화 알데하이드 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있는, 아이소부티릴-CoA에서 아이소부티르알데하이드로의 전환; 및
f) 예로서, 알코올 탈수소효소에 의하여 촉매작용될 수 있는, 아이소부티르알데하이드에서 아이소부탄올로의 전환.
사용될 수 있는 1-부탄올의 생산을 위한 조작된 생합성 경로는, 본 명세서에서 참고로 통합된, 미국 출원 공개 번호 제 20080182308호에 기재된 것들이 포함된다. 한 실시양태에서, 1-부탄올 생합성 경로는 하기의 기질에서 생성물로의 전환을 포함한다:
a) 예로서, 아세틸-CoA 아세틸 전이효소에 의하여 촉매작용될 수 있는, 아세틸-CoA에서 아세토아세틸-CoA로의 전환;
b) 예로서, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있는, 아세토아세틸-CoA에서 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환;
c) 예로서, 크로토나제에 의해 촉매작용될 수 있는, 3-하이드록시부티릴-CoA에서 크로토닐-CoA로의 전환;
d) 예로서, 부티릴-CoA 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있는, 크로토닐-CoA에서 부티릴-CoA로의 전환;
e) 예로서, 부티르알데하이드 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있는, 부티릴-CoA에서 부티르알데하이드로의 전환; 및
f) 예로서, 부탄올 탈수소효소에 의해 촉매작용될 수 있는, 부티르알데하이드에서 1-부탄올로의 전환.
한 실시양태에서, 본 발명은 부탄올 생산을 위한 표준 석유화학 공정과 관련된 부정적인 환경적 영향은 피하면서, 식물 유래의 탄소 공급원으로부터 부탄올을 생산한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 조작된 부탄올 생합성 경로를 포함하는 재조합 산업 숙주 세포를 이용하는 부탄올의 생산 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 부탄올 생합성 경로는, 숙주 세포에 대하여 이종성인, 1 이상의 폴리뉴클레오타이드, 2 이상의 폴리뉴클레오타이드, 3 이상의 폴리뉴클레오타이드, 또는 4 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 숙주 세포 내에서 부탄올 생합성 경로 중 각각의 기질에서의 생성물로의 전환은 이종성 폴리펩타이드에 의하여 촉매작용된다. 실시양태들에서, 아세토락테이트에서 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 기질에서 생성물로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드 및/또는 아이소부티르알데하이드에서 아이소부탄올로의 기질에서 생성물로의 전환을 촉매작용시키는 폴리펩타이드는 NADH를 보조인자로 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 부타놀로겐의 조작된 부탄올 경로는 하기 효소 협회 번호(Enzyme Commission Numbers)를 갖는 효소들의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다 : EC 2.2.1.6, EC 1.1.1.86, EC 4.2.1.9, EC 4.1.1.72, EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.265, EC 1.1.1.2, EC 1.2.4.4, EC 1.3.99.2, EC 1.2.1.10, EC 2.3.1.9, EC 2.3.1.16, EC 1.1.1.35, EC 1.1.1.157, EC 1.1.1.36, EC 4.2.1.17, EC 4.2.1.55, EC 1.3.1.44, EC 1.3.1.38, 및 EC 1.2.1.57.
일부 실시양태에서, 부타놀로겐의 조작된 부탄올 경로는 하기 효소들의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다: 아세토락테이트 신타제, 아세토하이드록시산 이성질화환원효소, 다이하드록시산 탈수효소, 분지쇄 알파-케토산 탈카르복실화효소, 분지쇄 알코올 탈수소효소, 아실화 알데하이드 탈수소효소, 분지쇄 케토산 탈수소효소, 부티릴-CoA 탈수소효소, 부티르알데하이드 탈수소효소, 아세틸-CoA 아세틸 전이효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 크로토나제, 부티릴-CoA 탈수소효소, 부탄올 탈수소효소, 및 부티르알데하이드 탈수소효소.
용어 "아세토하이드록시산 신타제," "아세토락테이트 신타제" 및 "아세토락테이트 신테타제 (synthetase)" ("ALS"로 약기)는, 아세토락테이트 신타제의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭하기 위하여 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 폴리펩타이드는 피루베이트에서 아세토락테이트 및 CO2로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예시적인 아세토락테이트 신타제는 EC 번호 2.2.1.6 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego)으로 공지되어 있다. 이들 변형되지 않은 효소는, 이에 제한되지는 않지만, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) (각각 GenBank 번호: CAB15618 및 Z99122, NCBI (국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)) 아미노산 서열, NCBI 뉴클레오타이드 서열), 클렙시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pneumoniae) (GenBank 번호: AAA25079 및 M73842), 및 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) (GenBank 번호: AAA25161 및 L16975)를 포함하여, 다수의 공급원으로부터 입수가능하다.
용어 "케톨-산 환원이성질화효소" ("KARI"),"아세토하이드록시산 이성질화환원효소" 및 "아세토하이드록시산 환원이성질화효소"는 상호교환가능하게 사용될 것이며, 케톨-산 환원이성질화효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드로는 (S)-아세토락테이트에서 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트의 반응을 촉매작용할 수 있는 폴리펩타이드가 포함된다. 예시적인 KARI 효소는 EC 번호 EC 1.1.1.86 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego)으로서 분류될 수 있으며, 이에 제한되지는 않지만 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) (서열번호 1) (GenBank 번호: NP_418222 및 NC_000913), 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) (GenBank 번호: NP_013459 및 NC_001144), 메타노코커스 마리팔루디스 (Methanococcus maripaludis) (GenBank 번호: CAF30210 및 BX957220), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) (서열번호 2) 및 바실러스 서브틸리스 (GenBank 번호: CAB14789 및 Z99118)를 포함하는 막대한 미생물들의 모음으로부터 입수가능하다. KARI는 아나에로스티페스 칵캐 (Anaerostipes caccae) KARI 변이체 "K9G9" (서열번호 132), "K9D3" (서열번호 133), "K9JBP4P" (서열번호 130), 및 "K9SB2-SH" (서열번호 126)를 포함한다. 케톨-산 환원이성질화효소 (KARI)는 미국 특허 제 7,910,342호 및 제 8,129,162호; 미국 특허 출원 공개 번호 제 20100197519호; 및 국제 출원 공개 번호 제 WO/2011/041415호에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참고로서 통합된다. 거기 개시된 예시적인 KARI는 락토코커스 락티스, 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) PAO1 및 슈도모나스 플루오레센스 PF5 돌연변이체로부터의 것들이다. 일부 실시양태에서, KARI는 NADH를 보조인자로서 이용한다. 일부 실시양태에서, KARI는 NADPH를 보조인자로서 이용한다. PCT 특허 출원 공개 번호 제 WO2012/129555호는 본 발명에 유용한 KARI 돌연변이체를 추가로 기재하며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
용어 "아세토하이드록시산 탈수효소" 및 "다이하드록시산 탈수효소" ("DHAD")는 다이하드록시산 탈수효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드에는 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트에서 α-케토아이소발레레이트로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드가 포함된다. 예시적인 다이하이드록시산 탈수효소는 EC 번호 4.2.1.9로 알려져 있다. 이러한 효소는, 이에 제한되지는 않지만, E. 콜라이 (GenBank 번호: YP_026248 및 NC_000913), S. 세레비시에 (GenBank 번호: NP_012550 및 NC_001142), M. 마리팔루디스 (GenBank 번호: CAF29874 및 BX957219), B. 서브틸리스 (GenBank 번호: CAB14105 및 Z99115), 락토코커스 락티스 (서열번호 3), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) (서열번호 4) 및 N. 크라사 (N. crassa)를 포함하는 막대한 미생물들의 모음으로부터 입수가능하다. 미국 특허 공개 번호 제 20100081154 A1호 및 미국 특허 제 7,993,889호는, 본 명세서에 참고문헌으로 통합되며, 다이하드록시산 탈수효소 (DHAD)를 기재하고 있으며, 이는 스트렙토코커스 뮤탄스로부터의 DHAD (서열번호 131)를 포함한다. 적합한 DHAD는 "L2V4"와 같은 스트렙토코커스 뮤탄스의 변이체도 포함한다 (서열번호 134).
용어 "분지쇄 α-케토산 탈카르복실화효소" 또는 "α-케토산 탈카르복실화효소" 또는 "α-케토아이소발레레이트 탈카르복실화효소" 또는 "2-케토아이소발레레이트 탈카르복실화효소" ("KIVD")는 2-케토아이소발레레이트 탈카르복실화효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는 α-케토아이소발레레이트에서 아이소부티르알데하이드 및 CO2로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예시적인 분지쇄 α-케토산 탈카르복실화효소는 EC 번호 4.1.1.72로 알려져 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 락토코커스 락티스 (GenBank 번호: AAS49166, AY548760, CAG34226 및 AJ746364), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) (GenBank 번호: NP_461346 및 NC_003197), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (GenBank 번호: NP_149189 및 NC_001988), 매크로코커스 카세올리티쿠스 (Macrococcus caseolyticus) (서열번호 5), 및 리스테리아 그라이이 (Listeria Grayi) (서열번호 6)를 포함하는 다수의 공급원으로부터 입수가능하다.
용어 "분지쇄 알코올 탈수소효소" 또는 "알코올 탈수소효소" ("ADH")는 알코올 탈수소효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는 아이소부티르알데하이드의 아이소부탄올로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예시적인 분지쇄 알코올 탈수소효소는 EC 번호 1.1.1.265로 알려져 있으나, 또한 다른 알코올 탈수소효소 (구체적으로, EC 1.1.1.1 또는 1.1.1.2) 하에 분류될 수도 있다. 알코올 탈수소효소는 NADPH 또는 NADH를 보조인자로서 사용할 수 있다. 이러한 효소는, 이에 제한되지는 않지만, S. 세레비시에 (GenBank 번호: NP_010656, NC_001136, NP_014051 및 NC_001145), E. 콜라이 (GenBank 번호: NP_417484 및 NC_000913), C. 아세토부틸리쿰 (GenBank 번호: NP_349892, NC_003030, NP_349891 및 NC_003030), B. 인디카 (서열번호 7) 및 A. 자일로족시단스 (A. xylosoxidans) (서열번호 8)를 포함하는 다수의 공급원으로부터 입수가능하다. 미국 특허 공개 번호 제 20090269823 A1호는, 본 명세서에 참고문헌으로서 통합되며, 아크로모박터(Achromobacter) 자일록시단스로부터의 알코올 탈수소효소 (ADH)인, SadB를 기재하고 있다. 알코올 탈수소효소는 말의 간 ADH 및 베이제린키아 (Beijerinkia) 인디카 ADH도 포함한다 (이는 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된, 미국 특허 출원 공개 번호 제 20110269199호에 기재된 바와 같음).
용어 "부탄올 탈수소효소"는 부탄올 탈수소효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는 아이소부티르알데하이드에서 아이소부탄올로의 전환 또는 2-부타논에서 2-부탄올로의 전환을 촉매하는 폴리펩타이드를 포함한다. 부탄올 탈수소효소는 광범위한 알코올 탈수소효소 패밀리의 서브셋 (subset)이다. 부탄올 탈수소효소는 NADH 또는 NADPH 의존성일 수 있다. NADH 의존성 효소는 EC 1.1.1.1로서 알려져 있으며, 예로서 로도코커스 루버 (Rhodococcus ruber) (GenBank 번호: CAD36475 및 AJ491307)로부터 입수가능하다. NADPH 의존성 효소는 EC 1.1.1.2로서 알려져 있으며, 예로서 파이로코커스 푸리오서스 (Pyrococcus furiosus) (GenBank 번호: AAC25556 및 AF013169)로부터 입수가능하다. 추가적으로, 부탄올 탈수소효소는 에스케리키아 콜라이(GenBank 번호: NP_417484 및 NC_000913)로부터 입수가능하고, 사이클로헥산올 탈수소효소는 아시네토박터 종 (Acinetobacter sp.) (GenBank 번호: AAG10026 및 AF282240)으로부터 입수가능하다. 또한, 용어 "부탄올 탈수소효소"는 NADH 또는 NADPH 중 어느 하나를 보조인자로 사용하여 부티르알데하이드에서 1-부탄올로의 전환을 촉매작용하는 효소를 말한다. 부탄올 탈수소효소는 예로서, C. 아세토부틸리쿰 (GenBank 번호: NP_149325 및 NC_001988 (주: 이 효소는 알데하이드 및 알코올 탈수소효소 활성을 모두 갖는다), NP_349891, NC_003030, NP_349892 및 NC_003030) 및 E. 콜라이 (GenBank 번호: NP_417484 및 NC_000913)로부터 입수가능하다.
용어 "분지쇄 케토산 탈수소효소"는 분지쇄 케토산 탈수소효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는, 전형적으로 NAD+ (니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드)를 전자 수용체로서 이용하여, α-케토아이소발레레이트에서 아이소부티릴-CoA (아이소부티릴-조효소A)로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예시적인 분지쇄 케토산 탈수소효소는 EC 번호 1.2.4.4로 공지되어 있다. 이러한 분지쇄 케토산 탈수소효소는 4개의 서브유닛으로 구성되며, 모든 서브유닛으로부터의 서열은, 이에 제한되지는 않지만, B. 서브틸리스 (GenBank 번호: CAB14336, Z99116, CAB14335, Z99116, CAB14334, Z99116, CAB14337 및 Z99116) 및 슈도모나스 푸티다 (GenBank 번호: AAA65614, M57613, AAA65615, M57613, AAA65617, M57613, AAA65618 및 M57613)을 포함하는 막대한 미생물의 모음으로부터 입수가능하다.
용어 "아실화 알데하이드 탈수소효소"는 아실화 알데하이드 탈수소효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는, 전형적으로 NADH 또는 NADPH를 전자 수용체로서 이용하여, 아이소부티릴-CoA에서 아이소부티르알데하이드로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예시적인 아실화 알데하이드 탈수소효소는 EC 번호 1.2.1.10 및 1.2.1.57로 알려져 있다. 이러한 효소는, 이에 제한되지는 않지만, 클로스트리듐 베이제린키이 (Clostridium beijerinckii) (GenBank 번호: AAD31841 및 AF157306), C. 아세토부틸리쿰 (GenBank 번호: NP_149325, NC_001988, NP_149199 및 NC_001988), P. 푸티다 (P. putida) (GenBank 번호: AAA89106 및 U13232), 및 테르무스 써모필러스 (Thermus thermophilus) (GenBank 번호: YP_145486 및 NC_006461)를 포함하는 다수의 공급원으로부터 입수가능하다.
용어 "아세틸-CoA 아세틸전이효소"는 아세틸-CoA 아세틸전이효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는 두 분자의 아세틸-CoA에서 아세토아세틸-CoA 및 조효소 A (CoA)로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 아세틸-CoA 아세틸전이효소의 예에는 단쇄 아실-CoA 및 아세틸-CoA에 대한 기질 선호 (순방향에서의 반응)가 있는 아세틸-CoA 아세틸전이효소가 있으며, E.C. 2.3.1.9 [Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego]로 분류되지만; 보다 광범위한 기질 범위를 갖는 효소 (E.C. 2.3.1.16)도 또한 작용성일 것이다. 아세틸-CoA 아세틸전이효소는 다수의 공급원, 예로서 에스케리키아 콜라이(GenBank 번호: NP_416728 및 NC_000913), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) (GenBank 번호: NP_349476.1, NC_003030, NP_149242 및 NC_001988), 바실러스 서브틸리스 (GenBank 번호: NP_390297 및 NC_000964), 및 사카마이세스 세레비시에 (GenBank 번호: NP_015297 및 NC_001148)로부터 입수가능하다.
용어 "3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소"는 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는 아세토아세틸-CoA에서 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예시적인 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 (S)-3-하이드록시부티릴-CoA 또는 (R)-3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 기질 선호성을 갖고, 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 (NADH)-의존성일 수 있다. 예들은 각각 E.C. 1.1.1.35 및 E.C. 1.1.1.30으로 분류될 수 있다. 추가로, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 (S)-3-하이드록시부티릴-CoA 또는 (R)-3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 기질 선호성을 갖고, 환원형 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트 (NADPH)-의존성일 수 있으며, 각각 E.C. 1.1.1.157 및 E.C. 1.1.1.36으로 분류된다. 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 다수의 공급원, 예로서, C. 아세토부틸리쿰 (GenBank 번호: NP_349314 및 NC_003030), B. 서브틸리스 (GenBank 번호: AAB09614 및 U29084), 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) (GenBank 번호: YP_294481 및 NC_007347), 및 알칼리제네스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus) (GenBank 번호: AAA21973 및 J04987)로부터 입수가능하다.
용어 "크로토나제"는 크로토나제의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는 3-하이드록시부티릴-CoA에서 크로토닐-CoA 및 H2O로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 크로토나제의 예는 (S)-3-하이드록시부티릴-CoA 또는 (R)-3-하이드록시부티릴-CoA에 대한 기질 선호를 가질 수 있으며, 각각 E.C. 4.2.1.17 및 E.C. 4.2.1.55로 분류될 수 있다. 크로토나제는 다수의 공급원, 예로서, E. 콜라이 (GenBank 번호: NP_415911 및 NC_000913), C. 아세토부틸리쿰 (GenBank 번호: NP_349318 및 NC_003030), B. 서브틸리스 (GenBank 번호: CAB13705 및 Z99113), 및 에어로모나스 카비에 (Aeromonas caviae) (GenBank 번호: BAA21816 및 D88825)로부터 입수가능하다.
용어 "부티릴-CoA 탈수소효소"는 부티릴-CoA 탈수소효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는 크로토닐-CoA에서 부티릴-CoA로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예시적인 부티릴-CoA 탈수소효소는 NADH-의존성, NADPH-의존성 또는 플라빈-의존성일 수 있으며, 각각 E.C. 1.3.1.44, E.C. 1.3.1.38 및 E.C. 1.3.99.2로 분류될 수 있다. 부티릴-CoA 탈수소효소는 다수의 공급원, 예로서, C. 아세토부틸리쿰 (GenBank 번호: NP_347102 및 NC_ 003030), 유글레나 그라실리스 (Euglena gracilis) (GenBank 번호: Q5EU90 및 AY741582), 스트렙토마이세스 콜리누스 (Streptomyces collinus) (GenBank 번호: AAA92890 및 U37135), 및 스트렙토마이세스 코엘리컬러 (Streptomyces coelicolor) (GenBank 번호: CAA22721 및 AL939127)로부터 입수가능하다.
용어 "부티르알데하이드 탈수소효소"는 부티르알데하이드 탈수소효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는, NADH 또는 NADPH를 보조인자로서 이용하여, 부티릴-CoA에서 부티르알데하이드로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. NADH에 대하여 선호성을 갖는 부티르알데하이드 탈수소효소는 E.C. 1.2.1.57로 공지되어 있으며, 예로서, 클로스트리듐 베이제린키이 (GenBank 번호: AAD31841 및 AF157306) 및 C. 아세토부틸리쿰 (GenBank 번호: NP_149325 및 NC_001988)으로부터 입수가능하다.
숙주 세포
부탄올 생산을 위한 숙주 세포는 세균 및 효모로부터 선택될 수 있다. 실시양태에서, 적합한 숙주 세포로는 유전적 변형 및 재조합 유전자 발현에 유용한 임의의 세균 또는 효모 새포가 포함된다. 적합한 미생물 숙주의 선택 기준은 하기를 포함한다: 생산되는 부탄올 이성질체에 대한 고유 내성, 높은 글루코스 이용 속도, 유전자 조작을 위한 유전학적 도구의 이용가능성, 및 안정한 염색체 변경을 생성하는 능력.
숙주를 유전적으로 변형시키는 능력은 임의의 재조합 미생물의 제조에 필수적이다. 유전자 전달 기술의 양식은 엘렉트로포레이션 (electroporation), 접합, 형질도입 또는 자연적 형질전환에 의한 것일 수 있다. 광범위한 숙주 접합성 플라스미드 및 약물 내성 마커가 이용가능하다. 클로닝 벡터는, 숙주에서 기능할 수 있는 항생제 내성 마커의 성질에 기초하여 숙주 생물에 맞춰 조절된다.
또한, 미생물 숙주는 다양한 유전자를 결실시킴으로써 탄소 흐름에 대한 경쟁 경로를 비활성화시키기 위하여 조작되어야 한다. 이는, 직접적인 비활성화를 위한 트랜스포손 (transposon) 또는 염색체 통합 벡터의 이용가능성을 필요로 한다. 추가적으로, 생산 숙주는 고유 부탄올 내성을 개선시키는 돌연변이가 수득될 수 있도록 화학적 돌연변이유발될 수 있어야만 한다.
부탄올 이성질체의 생산에 사용된 미생물 숙주 세포는, 부탄올 이성질체의 수율이 부탄올 이성질체의 독성에 의하여 제한되지 않도록 생산되는 부탄올 이성질체에 대하여 내성인 것이 바람직하다. 한 실시양태에서, 아이소부탄올 생산에 사용된 숙주는 아이소부탄올에 대하여 내성이다. 아이소부탄올에 대한 내성을 갖는 적합한 숙주 균주는 미국 특허 제 7,993,889호 (본 명세서에 참고문헌으로 통합됨)에서 기재된 것과 같은 균주의 고유 내성에 기초한 스크리닝 방법에 의하여 동정될 수 있다.
아이소부탄올 생산을 위한 미생물 숙주는, 단당류, 올리고당 및 다당류를 포함하는 탄수화물도 높은 속도로 이용하여야만 한다. 대부분의 미생물은 탄수화물을 이용할 수 있다. 그러나, 특정 환경적 미생물은 탄수화물을 고효율로 이용할 수 없으며, 따라서 적합한 숙주가 될 수 없다.
상기 기재된 기준에 의거하여, 부탄올 생산에 적합한 미생물 숙주로는, 이에 제한되지는 않지만, 클로스트리듐, 자이모모나스 (Zymomonas), 에스케리키아, 살모넬라, 로도코커스, 슈도모나스, 바실러스, 락토바실러스, 엔테로코커스, 알칼리제네스, 클렙시엘라, 파에니바실러스 (Paenibacillus), 아트로박터 (Arthrobacter), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 피키아 (Pichia), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 이사첸키아 (Issatchenkia), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로이야 (Yarrowia), 피키아, 칸디다, 한세눌라 및 사카로마이세스 속의 원들이 포함된다. 바람직한 숙주로는 에스케리키아 콜라이, 알칼리제네스 유트로푸스, 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 파에니바실러스 마세란스 (Paenibacillus macerans), 로도코커스 에리쓰로폴리스 (Rhodococcus erythropolis), 슈도모나스 푸티다, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 엔테로코커스 패슘 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나리움 (Enterococcus gallinarium), 엔테로코커스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 바실러스 서브틸리스, 스키조사카로마이세스 품베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 써모톨레란스 (Kluyveromyces thermotolerans), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 피키아 스티피티스 (Pichia stipitis), 야로이야 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), E. 콜라이, L. 플란타룸 및 사카로마이세스 세레베시에가 포함된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비시에이다. S. 세레비시에 효모는 본 기술분야에 알려져 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 미국 균주보존협회 (American Type Culture Collection) (Rockville, MD 소재); Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) 진균류 생물다양성 센터 (Fungal Biodiversity Centre); LeSaffre; Gert Strand AB; Ferm Solutions; North American Bioproducts; Martrex 및 Lallemand와 같은 다양한 공급원들로부터 입수가능하다 사카로마이세스 세레비시에는, 이에 제한되지는 않지만, BY4741, CEN.PK 113-7D, Ethanol Redㄾ 효모, Ferm Pro™ 효모, Bio-Fermㄾ XR 효모, 게르트 스트랜드 프레스티지 배치 터보 (Gert Strand Prestige Batch Turbo) 알코올 효모, 게르트 스트랜드 포트 디스틸러스 (Gert Strand Pot Distillers) 효모, 게르트 스트랜드 디스틸러스 터보 (Gert Strand Distillers Turbo) 효모, FerMax™ Green 효모, FerMax™ Gold 효모, Thermosaccㄾ 효모, BG-1, PE-2, CAT-1, CBS7959, CBS7960 및 CBS7961을 포함한다.
부탄올 생산을 위한 숙주 세포
발효가능한 탄소 기질의 부탄올 이성질체로의 전환을 위한 효소 경로를 암호화하는데 필요한 유전자를 함유하는 재조합 미생물은 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 구축될 수 있다. 본 발명에서, 부탄올 생합성 경로들 중 하나의 효소, 예로서, 아세토락테이트 신타제, 아세토하이드록시산 이성질화환원효소, 다이하드록시산 탈수효소, 분지쇄 α-케토산 탈카르복실화효소, 및 분지쇄 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자는, 각종 공급원으로부터 분리될 수 있으며, 예로서 미국 특허 제 7,993,889호에 설명된 바와 같다.
일단, 관련된 경로의 유전자가 동정 및 분리되면, 부탄올 생합성 경로의 관련 효소는 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나 또는 예를 들어, 미국특허 제 7,993,889호에 설명된 바와 같이 조작되어 부타놀로겐을 생산한다. 생성된 부타놀로겐은 조작된 부탄올 생합성 경로를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부타놀로겐은 아이소부타놀로겐으로, 이는 조작된 아이소부탄올 생합성 경로를 포함한다.
일부 실시양태에서, 부타놀로겐은 효모이다. 일부 실시양태에서, 부타놀로겐은 세균이다. 일부 실시양태에서, 부타놀로겐은 사카로마이세스 세레비시에이다.
일부 실시양태에서, 조작된 부타놀로겐은 하기 효소 협회 번호를 갖는 효소들의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 함유한다: EC 2.2.1.6, EC 1.1.1.86, EC 4.2.1.9, EC 4.1.1.72, EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.265, EC 1.1.1.2, EC 1.2.4.4, EC 1.3.99.2, EC 1.2.1.10, EC 2.3.1.9, EC 2.3.1.16, EC 1.1.1.35, EC 1.1.1.157, EC 1.1.1.36, EC 4.2.1.17, EC 4.2.1.55, EC 1.3.1.44, EC 1.3.1.38, 및 EC 1.2.1.57.
일부 실시양태에서, 조작된 아이소부타놀로겐은 아세토락테이트 신타제, 아세토하이드록시산 이성질화환원효소, 다이하드록시산 탈수효소, 분지쇄 알파-케토산 탈카르복실화효소, 분지쇄 알코올 탈수소효소, 아실화 알데하이드 탈수소효소, 분지쇄 케토산 탈수소효소, 부티릴-CoA 탈수소효소, 부티르알데하이드 탈수소효소, 아세틸-CoA 아세틸전이효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 크로토나제, 부티릴-CoA 탈수소효소, 부탄올 탈수소효소, 및 부티르알데하이드 탈수소효소로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 함유한다.
일부 실시양태에서, 일반적으로 미토콘드리아에 국지화되는 부탄올 생합성 경로의 효소들은 미토콘드리아에 국지화되지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 부탄올 생합성 경로의 효소는 사이토졸에 국지화된다. 일부 실시양태에서, 생합성 경로의 효소는 미토콘드리아 타겟팅(targeting) 서열을 제거함으로써 사이토졸에 국지화된다. 일부 실시양태에서, 미토콘드리아 타겟팅은, 예로서, 본 명세서에 참고문헌으로 통합된, 미국특허 제 7,993,889호에 기재된 바와 같이, 신규 개시 코돈을 생성함으로써 제거된다. 일부 실시양태에서, 사이토졸에 국지화된 생합성 경로의 효소는 DHAD이다. 일부 실시양태에서, 사이토졸에 국지화된 생합성 경로로부터의 효소는 KARI이다.
일부 실시양태에서, 조작된 부탄올 생합성 경로의 효소는, 보조인자로서 NADH 또는 NADPH를 사용할 수 있으며, 여기에서 NADH 또는 NADPH는 전자 공여체로서 작용한다. 일부 실시양태에서, 부탄올 생합성 경로의 하나 이상의 효소는 NADH를 전자 공여체로서 사용한다. 일부 실시양태에서, 부탄올 생합성 경로의 하나 이상의 효소는 NADPH를 전자 공여체로서 사용한다.
부타놀로겐의 부가적인 변형
본 명세서에서 제공되는 바와 같은, 부타놀로겐은 하나 이상의 부가적인 변형을 더 포함할 수 있다. 이러한 변형은, 예로서 조작된 부탄올 생합성 경로를 통한 부탄올 이성질체의 발효 생산 동안 부산물의 생산에 관련된 유전자들의 활성의 파괴를 포함할 수 있다. 부탄올 이성질체의 발효 생산 동안 부산물의 생산에 관련된 유전자들의 활성의 파괴는 탄소 흐름에 대한 경쟁 경로로부터의 수율 손실을 감소시키고, 부탄올 생산을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 변형은 피루베이트 탈카르복실화효소, 알데하이드 탈수소효소 또는 이들 모두의 작용의 파괴를 포함한다.
용어 "피루베이트 탈카르복실화효소"는 피루베이트 탈카르복실화효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는 피루브산에서 아세트알데하이드 및 이산화탄소로의 탈카르복실화를 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 피루베이트 탈카르복실화효소는 EC 번호 4.1.1.1로 알려져 있다. 이러한 폴리펩타이드는 당 기술분야에서 공지된 방법에 의하여 결정될 수 있으며, PCT 특허 출원 공개 번호 제 WO2012/129555호에 개시되어 있다. 이들 효소는 사카로마이세스 세레비시에 (GenBank 번호: CAA97575, CAA97705 및 CAA97091)를 포함하는 다수의 효모에서 발견된다. PDC의 부가적인 예들이, 본 명세서에 참고문헌으로 통합된, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009035363호에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 부타놀로겐은 피루베이트 탈카르복실화효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 내생의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 유전자, 및/또는 피루베이트 탈카르복실화효소 활성을 갖는 내생의 폴리펩타이드의 변형 또는 파괴를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에서 개시된 부타놀로겐은, PDC 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 내생의 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자에서, 또는 PDC 활성을 갖는 내생의 폴리펩타이드에서의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 변형, 파괴, 결실, 돌연변이 및/또는 치환은 감소되거나 제거된 PDC 활성을 결과로서 생성할 수 있고, 예로서 PDC 넉아웃 (PDC-KO) 표현형을 결과로서 생성할 수 있다.
효모 내의 내생의 피루베이트 탈카르복실화효소는 피루베이트를 아세트알데하이드로 전환시키고, 그 후 이는 에탄올로 또는 아세테이트를 거쳐 아세틸-CoA로 전환된다. 효모는 피루베이트 탈카르복실화효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자들을 가질 수 있다. 예로서, 사카로마이세스 내에는 PDC1, PCD5 및/또는 PDC6 유전자에 의하여 암호화되는 피루베이트 탈카르복실화효소의 3 개의 동종효소 (isozyme)가 있는 한편, 칸디다 글라브라타, 스키조사카로마이세스 품베 및 클루이베로마이세스 락티스 내에는 피루베이트 탈카르복실화효소를 암호화하는 하나의 유전자가 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 세포에는, 하나 이상의 PDC 유전자가 비활성화된다. 사용된 효모 세포가 하나 초과의 발현된 (활성) PDC 유전자를 갖는다면, 활성 PDC 유전자 각각은 변형되거나 또는 비활성화되어 이에 따라 pdc- 세포를 생산할 수 있다. 예로서, S. 세레비시에에서 PDC1, PDC5 및 PDC6 유전자는 변형 또는 비활성화될 수 있다. PDC 유전자가 사용되는 발효 조건 하에서 활성이 아니라면, 그러한 유전자는 변형 또는 비활성화될 필요가 없다. 일부 실시양태에서, 결실된 또는 하향조절된 피루베이트 탈카르복실화효소는, PDC1, PDC5, PDC6 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 미국 특허 공개 번호 제 20090305363호 및 PCT 특허 출원 공개 번호 제 WO2012/129555호 (본 명세서에 참고문헌으로 통합됨)는 내생의 피루베이트 탈카르복실화효소에서의 변형을 추가로 기재하며, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다. 미국 특허 공개 번호 제 20090305363호 (본 명세서에 참고문헌으로 통합됨)는 사이토졸-국지화된 아세토락테이트 신타제의 발현 및 피루베이트 탈카르복실화효소 활성의 실질적인 제거를 위해 효모를 조작함으로써 피루베이트에서 아세토락테이트로의 증가된 전환을 개시한다. 감소된 효소 활성을 갖는 효모는 다양한 방법을 이용하여 동정될 수 있다. 예로서, 감소된 피루베이트 탈카르복실화효소 활성을 갖는 효모는, 예로서 기체 크로마토그래피를 통한 에탄올 형성을 측정하는 것을 포함하는 일반적인 방법을 이용하여 동정될 수 있다.
다른 타겟 유전자, 예컨대 피루베이트 탈카르복실화효소에 대하여 적어도 약 70-75%, 적어도 약 75-85%, 적어도 약 80-85%, 적어도 약 85%-90%, 적어도 약 90%-95%, 또는 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 상동성을 갖는 피루베이트 탈카르복실화효소 단백질을 암호화하는 것들은, 당업자에게 공지된 문헌 및 생물정보학 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 변형된 또는 결실된 피루베이트 탈카르복실화효소를 갖는 부타놀로겐의 동정 방법과 함께, 피루베이트 탈카르복실화효소 활성의 파괴 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 제 20090305363호 및 PCT 특허 출원 공개 번호 제 WO2012/129555호에 상세히 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 부타놀로겐은 글리세롤-3-인산 탈수소효소 활성을 감소시키는 변형 및/또는 PDC 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 파괴 또는 PDC 유전자 발현을 제어하는 조절 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자에서의 파괴 [이는 미국 특허 출원 공개 번호 제 20090305363호 및 PCT 특허 출원 공개 번호 제 WO2012/129555호에 기재된 바와 같음]를 포함하며, 상기 변형은 엔트너-도우도르프 경로를 통하여 증가된 탄소 흐름을 제공할 수 있거나, 또는 균등물 수지 (balance)의 감소를 제공할 수 있으며, 이는 미국 특허 출원 공개 번호 제 20100120105호에 기재된 바와 같다 (본 명세서에 참고문헌으로 통합됨). 비활성화된 내생의 PDC 유전자를 갖고, 그리고 글루코스 억제가 감소된 경우 개선된 성장 및 생성물 수율을 갖는 조작된 생합성 경로를 갖는 효모 세포가 미국 특허 출원 공개 번호 제 20110124060호에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
용어 "알데하이드 탈수소효소"는 알데하이드 탈수소효소의 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드는, 알데하이드의 산화 (탈수소화)를 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다 (Wang et al., J. Bacteriol. 180:822-30, 1998; Navarro-Avino et al., Yeast 15:829-42, 1999; 및 Saint-Prix et al., Microbiology 150:2209-20, 2004 참조). 이러한 폴리펩타이드는 아이소부티르알데하이드의 아이소부티르산으로의 전환을 촉매작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 EC 번호 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 또는 1.2.1.5.에 대응되는 폴리펩타이드도 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 당 업계에서 공지된 방법에 의하여 결정될 수 있으며, PCT 특허출원 공개 번호 제 WO2012/129555호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 부타놀로겐은 알데하이드 탈수소효소 (ALD) 및/또는 알데하이드 산화제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 내생의 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자 중의 결실, 돌연변이 및/또는 치환, 또는 알데하이드 탈수소효소 (ALD) 및/또는 알데하이드 산화제 활성을 갖는 내생의 폴리펩타이드 중의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 재조합 숙주 세포는 S. 세레비시에이고, 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6, 또는 이의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis)이고, 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 KLLA0F00440, KLLA0E23057, KLLA0D10021, KLLA0D09999G, 또는 이의 조합일 수 있다. 다른 실시양태들에서, 재조합 숙주 세포는 피키아 스티피티스이고, 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD7, 또는 이의 조합일 수 있다. 다른 실시양태들에서, 재조합 숙주 세포는 락토바실러스 플란타룸일 수 있으며, 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 AldH일 수 있다. 다른 실시양태들에서, 재조합 숙주 세포는 E. 콜라이일 수 있으며, 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 aldA, aldB, aldH 또는 이의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 사카로마이세스 세레비시에 또는 그의 동족체 내 ALD6이다. 이러한 변형, 파괴, 결실, 돌연변이 및/또는 치환은, 감소되거나 제거된 ALD 활성을 일으켜, 예로서 ALD6 넉-아웃 (ALD6-KO) 표현형을 결과로서 생성한다. 재조합 숙주 세포 내에서 변형 또는 비활성화를 위해 타겟팅될 수 있는 알데하이드 탈수소효소 폴리뉴클레오타이드, 유전자 및 폴리펩타이드의 예가 PCT 국제 특허 출원 공개 번호 제 WO2012/129555호에 추가로 상세히 제공된다.
특정 알데하이드 탈수소효소의 파괴는, 예로서 알데하이드 탈수소효소 유전자에 대하여 내부 및 외부의 프라이머를 사용하는 PCR 스크리닝으로, 또는 알데하이드 탈수소효소 유전자 서열에 대해 설계된 프로브를 이용하는 서던 블롯 (Southern blot)에 의하여 확인될 수 있다 대안적으로, 아이소부티르산의 감소된 형성을 위하여 아이소부티르알데하이드에 노출된 균주를 스크리닝하기 위하여 기체 크로마토그래피-질량 분광법 또는 액체 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 예로서, 감소된 아이소부티르산 형성을 갖는 균주에 대한 스크리닝 방법은: a) 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에서의 변형 및/또는 알데하이드 산화효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에서의 변형을 포함하는 균주를 제공하는 단계; b) 세포를 아이소부티르알데하이드와 접촉시키는 단계; 및 c) 아이소부티르산 형성을 측정하는 단계를 포함할 수 있고, 여기에서, 아이소부티르산 형성은 변형되지 않은 대조 균주와 비교시 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 측정은 기체 크로마토그래피-질량 분광법을 이용하여 실시된다. 알데하이드 탈수소효소에 대한 폴리뉴클레오타이드, 유전자 또는 폴리펩타이드의 결실, 돌연변이 및/또는 치환 방법 및 알데하이드 탈수소효소 활성의 파괴를 동정하는 방법은, 예로서 PCT 특허 출원 공개 번호 제 WO2012/129555호에 상세히 개시되어 있다.
다른 타겟 유전자, 예컨대 알데하이드 탈수소효소에 대해 적어도 약 70-75%, 적어도 약 75-85%, 적어도 약 80-85%, 적어도 약 85%-90%, 적어도 약 90%-95%, 또는 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 상동성을 갖는 알데하이드 탈수소효소 단백질을 암호화하는 것들은, 당업자에게 공지된 문헌 및 생물정보학 데이터베이스에서 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에서 기재된 부타놀로겐은 감소된 또는 제거된 알데하이드 탈수소효소 및/또는 알데하이드 산화효소 활성을 포함할 수 있으며, 이는 PCT 특허 출원 공개 번호 제 WO2012/129555호에 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 감소된 또는 제거된 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 부타놀로겐은 조작된 생합성 경로를 통하여, 감소된 또는 제거된 알데하이드 탈수소효소 활성을 포함하지 않는 부타놀로겐에 의하여 생산된 동일한 이성질체의 수율 또는 양보다 더욱 높은 수율 또는 양으로 부탄올 이성질체를 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 부타놀로겐은, 부탄올 이성질체의 발효 생산 동안 부산물 생산에 대한 경로에 관련된 폴리펩타이드를 암호화하는 내생의 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자에서 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부타놀로겐은, 부탄올 이성질체의 발효 생산 동안 부산물의 생산에 대한 경로에 관련된 내생의 폴리펩타이드에서 하나 이상의 결실, 돌연변이, 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 변형은 FRA2 (철 리프레서 단백질), CCC1 (추정적 액포 Fe2+/Mn2+ 운반체) 또는 GPD2 (글리세롤-2-인산 탈수소효소)를 암호화하는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드, 또는 FRA2, CCC1 또는 GPD2 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 조합에 있다.
다른 실시양태에서, 변형은 피루베이트-이용 생합성 경로에서의 단계를 촉매작용하는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 통합을 포함한다. 다른 변형에는 아세토락테이트 환원효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 내생의 폴리뉴클레오타이드에서의 적어도 하나의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포함한다. 실시양태에서, 아세토락테이트 환원효소 활성을 갖는 폴리펩타이드는 YMR226C의 사카로마이세스 세레비시에 또는 그의 동족체이다.
실시양태에서, 숙주 세포는 포스포케톨라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 포스포트랜스아세틸라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드, 예로서 서열번호 262 및 263의 서열에 의해 코딩되는, 그리고 PCT 출원 공개 번호 제 WO 2011/159853호에 기재된 바와 같은 것들을 포함할 수 있다. 거기에 기재된 바와 같이, 이렇게 변경된 PDC-KO 세포들은, PDC-KO 세포들에 비해 그의 성장을 위하여, 외생의 2-탄소 기질 보충물에 대해 감소된 또는 제거된 필요를 나타낸다. 따라서, 그리고 실시예에서 예증된 바와 같이, 본 명세서에서 제공된 방법은 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성을 감소 또는 제거하도록 조작되고, 그의 성장을 위하여, 외생의 2-탄소 기질 보충물에 대해 감소된 또는 제거된 필요를 포함하는 재조합 숙주 세포에 장점을 제공한다.
발효 배지
본 발명에서 발효 배지는 적합한 발효가능한 탄소 기질을 함유해야 한다. 적합한 발효가능한 탄소 기질에는, 이에 제한되지는 않지만, 글루코스, 프룩토스, 자일로스 또는 아라비노스와 같은 단당류; 락토스, 말토스, 갈락토스, 또는 수크로스와 같은 올리고당류; 전분 또는 셀룰로스와 같은 다당류; 또는 이의 조합이 포함될 수 있다. 적합한 발효가능한 탄소 기질은 치즈 유청막 투과액 (cheese whey permeate), 옥수수 침지액, 사탕무우 당밀 및 보리 맥아와 같은 재생가능한 공급원료로부터의 미정제된 혼합물을 포함할 수 있다. 부가적으로, 발효가능한 탄소 기질은 이산화탄소와 같은 1원자 탄소 기질, 또는 주요 생화학적 중간체로의 대사적 전환이 예증된 메탄올일 수도 있다. 하나 및 두 개의 발효가능한 탄소 기질에 부가하여, 메틸로트로픽 (methylotrophic) 생물체는, 메틸아민, 글루코사민 및 각종 아미노산과 같은 수많은 다른 함탄소 화합물들을 대사 활성에 이용하는 것으로도 알려져 있다. 예로서, 메틸로트로픽 효모는 메틸아민으로부터의 탄소를 이용하여 트레할로스 또는 글리세롤을 형성하는 것으로 공지되어 있다 (Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th ed., 415-32. Editor (s): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK (1993)). 유사하게, 다양한 종의 칸디다는 알라닌 또는 올레산을 대사작용한다 (Sulter et al., Arch. Microbiol., 153:485-489 (1990)). 그러므로, 본 발명에 이용되는 탄소 공급원은 광범위한 탄소 함유 기질을 포괄할 수 있으며, 생물체의 선택에 의해서만 제한되는 것으로 생각된다. 다른 탄소 기질은 에탄올, 락테이트, 석시네이트 또는 글리세롤을 포함할 수 있다.
상기 언급된 발효가능한 탄소 기질 및 이의 혼합물은 모두가 본 발명에 적합한 것으로 고려되지만, 바람직한 발효가능한 탄소 기질은 글루코스, 프룩토스 및 수크로스, 또는 자일로스 및 아라비노스와 같은 C5 당과 이들의 혼합물이다. 수크로스는 재생가능한 당 공급원, 이를 테면 사탕수수, 사탕무, 카사바 (cassava), 단수수 (sweet sorghum) 및 이들의 혼합물로부터 유래될 수 있다. 글루코스 및 덱스트로스는 옥수수, 밀, 호밀, 보리, 귀리 및 이들의 혼합물과 같은 곡물을 비롯한 전분계의 공급원료의 당화를 통하여 재생가능한 곡물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 부가적으로, 발효가능한 당은 예로서 본 명세서에 참고문헌으로 통합된 미국 특허 번호 제 7,932,063호에 기재된 바와 같이, 전처리 및 당화 공정을 통하여, 재생가능한 셀룰로오스 또는 리그노셀룰로오스계 바이오매스로부터 유래될 수 있다. 바이오매스는 셀룰로오스를 포함하는 재료, 및 선택적으로 헤미셀룰로오스, 리그닌, 전분, 올리고당류 및/또는 단당류를 추가로 포함하는 재료를 포함한다. 바이오매스는 또한 단백질 및/또는 지질과 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 바이오매스는 단일의 공급원으로부터 유래할 수 있거나, 바이오매스는 1가지 초과의 공급원으로부터 유래된 혼합물을 포함할 수 있으며; 예로서, 바이오매스는 옥수수 속대 및 옥수수 대의 혼합물, 또는 풀과 잎의 혼합물을 포함할 수 있다. 바이오매스는 바이오에너지 작물, 농업 잔류물, 도시 고형 폐기물 (municipal solid waste), 산업 고형 폐기물, 제지 제조로부터의 슬러지, 정원 폐기물 (yard waste), 나무 및 삼림지 폐기물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바이오매스의 예는, 옥수수 낟알, 옥수수 속대, 옥수수 잔류물, 이를 테면 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 밀짚, 보리, 보릿짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스 (switchgrass), 폐지, 사탕수수 버개스 (bagasse), 수수, 콩, 낟알의 제분으로부터 수득된 성분, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 나뭇조각, 톱밥, 관목 및 떨기나무, 야채, 과실, 꽃, 동물 퇴비 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 발효가능한 탄소 기질은 옥수수로부터 유래된 글루코스이다. 일부 실시양태에서, 발효가능한 탄소 기질은 밀로부터 유래된 글루코스이다. 일부 실시양태에서, 발효가능한 탄소 기질은 사탕수수로부터 유래된 수크로스이다. 일부 실시양태에서, 발효가능한 탄소 기질은 자일로스이다.
적절한 탄소 공급원에 추가하여, 발효 배지는 적합한 무기물, 염, 보조인자, 완충액, 및 배양물의 성장 및 아이소부탄올 생산에 필요한 효소 경로의 촉진에 적합한, 당업자에게 알려진 기타 성분들을 함유해야 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 발효 배지는 외생의 C2 공급원으로서 아세테이트를 함유하고, 이는 보충물로서 발효 배지에, 재조합 숙주 세포의 성장에 대해 충분한 양으로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 아세테이트는 개선된 부탄올 생산에 대해 충분한 양으로 발효 배지에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 아세테이트는 약 0.1mM 내지 약 50mM의 범위 내에서 발효 배지에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 발효 배지에 첨가된 아세테이트는 0.1mM, 0.2mM, 0.4mM, 0.5mM, 0.6mM, 0.7 mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM 또는 50mM이다. 일부 실시양태에서, 발효 배지 내에서 당 대 C2 보충물의 비는 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 또는 70:30이다. 일부 실시양태에서, 아세테이트는 성장기, 생산기, 또는 이들 모두에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 발효 배지는 부탄올을 추가로 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부탄올은 약 0.01mM 내지 약 500mM의 범위이다. 일부 실시양태에서, 부탄올은 0.01mM, 1.0mM, 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM, 200mM, 210mM, 220mM, 230mM, 240mM, 250mM, 260mM, 270mM, 280mM, 290mM, 300mM, 310mM, 320mM, 330mM, 340mM, 350mM, 360mM, 370mM, 380mM, 390mM, 400mM, 410mM, 420mM, 430mM, 440mM, 450mM, 460mM, 470mM, 480mM, 490mM 또는 500mM이다. 일부 실시양태에서, 발효 배지 내 존재하는 부탄올은, 약 0.01% 내지 약 100%의 이론적 수율의 부탄올이다. 일부 실시양태에서, 발효 배지 내 존재하는 부탄올은 0.01%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 이론적 수율의 부탄올이다.
일부 실시양태에서, 개선된 부탄올 생산은 증가된 수율, 유효 속도, 유효 적정 농도, 또는 비 생산성으로서 나타난다. 실시양태에서, 수율, 유효 속도, 유효 적정 농도 또는 비 생산성 중 하나 이상은, 약 3% 이상, 약 5% 이상, 또는 약 10% 이상 증가된다.
일부 실시양태에서, 증가된 부탄올 생산은 감소된 부산물 수율로서 나타난다. 실시양태에서, 부산물의 수율은 약 3% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 또는 약 70% 이상 감소된다. 실시양태에서, 부산물은 아이소부티르산이다.
발효 조건
전형적으로, 세포는 적절한 배지에서 약 20℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 성장시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 20℃, 22℃, 25℃, 27℃, 30℃, 32℃, 35℃, 37℃ 또는 40℃의 온도에서 성장된다. 본 발명에서 적합한 성장 배지는 일반적인 상업적으로 제조된 배지, 예컨대 루리아 베르타니 (Luria Bertani: LB) 배양액, 사브로드 덱스트로스 (Sabouraud Dextrose: SD) 배양액, 효모 배지 (YM) 배양액, 또는 효모 질소 베이스, 황산암모늄 및 덱스트로스 (탄소/에너지 공급원으로서)를 포함하는 배양액 또는 대부분의 사카로마이세스 세레비시에 균주를 성장시키는데 최적의 비율의 펩톤, 효모 추출물 및 덱스트로스의 배합물인, YPD 배지를 포함한다. 다른 규정된 또는 합성 성장 배지가 또한 사용될 수도 있으며, 특정 미생물의 성장에 적절한 배지는 미생물학 또는 발효 과학 분야의 당업자가 알고 있을 것이다. 예로서 사이클릭 아데노신 2',3'-1인산과 같이 직접적으로 또는 간접적으로 이화대사물 억제를 조정하는 것으로 공지된 제제의 사용이 발효 배지 내에 도입될 수도 있다.
발효에 적합한 pH 범위는 약 pH 3.0 내지 약 pH 9.0이다. 한 실시양태에서, 약 pH 4.0 내지 약 pH 8.0이 초기 조건을 위해 사용된다. 또다른 실시양태에서, 약 pH 3.5 내지 약 pH 9.0이 초기 조건을 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 약 pH 4.5 내지 약 pH 6.5가 초기 조건을 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0이 초기 조건을 위해 사용된다. 효모 발효에 적합한 pH 범위는 전형적으로 약 pH 3.0 내지 약 pH 9.0이다. 기타 미생물의 발효에 적합한 pH 범위는 약 pH 3.0 내지 약 pH 7.5이다.
일부 실시양태에서, 재조합 미생물과 발효 배지의 접촉은 혐기성 또는 미세호기성 조건 하에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 부탄올은 하기 성장기 중 하나 이상에서 생산된다: 고성장 대수기 (log phase), 온건한 정적 유도기 (static lag phase), 정체기 (stationary phase), 정상상태 (steady state) 성장기, 및 이의 조합.
산업적 배치 (Batch) 및 연속 발효
일부 실시양태에서, 부탄올 이성질체는 배치 또는 연속 발효를 이용하여 생산될 수 있다. 부탄올 이성잘체, 예컨대 아이소부탄올은 발효의 배치 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 고전적인 배치 발효는 배지의 조성이 발효 시작시에 정해지며, 발효 중에 인공적으로 변경되지 않는 폐쇄 시스템이다. 따라서, 발효의 시작시에 배지에 원하는 생물체(들)가 접종되며, 상기 시스템에 어떠한 것도 첨가하지 않고서 발효가 발생하게 한다. 그러나, 전형적으로 "배치" 발효는 탄소 공급원의 첨가와 관련하여 배치식이며, pH 및 산소 농도와 같은 조절 인자에 대한 시도가 종종 이루어진다. 배치 시스템에서, 이 시스템의 대사산물 및 바이오매스 조성물은 발효가 중단되는 시점까지 끊임없이 변화한다. 배치 배양 내에서 세포는 정적 유도기를 통하여 고성장 대수기로, 그리고 마지막으로 성장 속도가 감소되거나 정지되는 정체기로 조정된다. 미처리될 경우, 정체기의 세포는 결국 사멸할 것이다. 대수기의 세포는 일반적으로 최종 생성물 또는 중간체의 대량 생산에 책임이 있다.
표준 배치식 시스템의 한 변형은 유가식(Fed-Batch) 시스템이다. 유가식 발효 공정도 본 발명에 적합하며, 이는 발효가 진행됨에 따라 기질이 증분식으로 첨가된다는 것을 제외하고는 전형적인 배치 시스템을 포함한다. 유가식 시스템은 이화 대사산물 억제가 세포의 대사 작용을 저해하는 경향이 있을 때 그리고 배지 중에 제한된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 시스템 중 실제 기질 농도의 측정은 어려우며, 따라서 pH, 용존 산소 및 CO2와 같은 폐가스의 분압과 같은 측정가능한 인자의 변화를 기반으로 하여 추정된다. 배치 및 유가식 발효는 본 기술분야에서 통상적이며 공지이며, 그 예는 [Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. (1989) ("Brock")], 또는 [Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992)]에서 찾을 수 있으며, 이들은 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
부탄올 이성질체, 예컨대 아이소부탄올은 연속 발효 방법을 이용하여 생산될 수도 있다. 연속식 발효는 정의된 발효 배지가 연속적으로 생물 반응기에 첨가되고, 동일한 양의 조건화된 배지가 가공을 위하여 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속 발효는 일반적으로, 세포가 주로 대수기 성장에 있는 경우 일정한 고밀도로 배양물을 유지시킨다. 연속식 발효는 세포 성장 또는 최종 생성물 농도에 영향을 주는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조정을 허용한다. 예로서, 한 방법은 제한 영양소, 예로서 탄소 공급원 또는 질소의 수준을 고정된 비율로 유지하고 모든 다른 변수는 조정되게 할 것이다. 다른 시스템에서, 성장에 영향을 미치는 많은 인자는 계속하여 변경될 수 있는 반면, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지된다. 연속식 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하도록 노력하며, 따라서 배출되는 배지로 인한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도와 균형이 맞추어져야 한다. 연속식 발효 방법에 있어서 영양소 및 성장 인자를 조정하는 방법 뿐만 아니라, 생성물 형성 속도를 최대화하는 기술도 산업 미생물학 분야에서 주지되어 있으며, 다양한 방법이 상기 Brock의 문헌에 상술되어 있다.
아이소부탄올을 포함하여, 부탄올의 생산은 배치식, 유가식 또는 연속식 공정을 사용하여 실시될 수 있으며, 발효의 임의의 공지된 방식이 적합할 것임이 고려된다. 부가적으로, 세포는 전세포 촉매로서 기질 상에 고정되어, 아이소부탄올 생산을 위한 발효 조건에 처해질 수 있는 것으로 생각된다.
발효 배지로부터의 부탄올 분리 방법 (회수)
바이오생산된 부탄올 이성질체는 본 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 발효 배지로부터 회수될 수 있다. 예로서, [Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:639-648 (1998), Groot et al., Process. Biochem. 27:61-75 (1992)], 및 그에 기재된 참고문헌 참조. 예로서, 부탄올은 증류, 액체-액체 추출, 또는 막-기재 분리와 같은 방법을 이용하는 효소 배지로부터 분리될 수 있다. 본 명세서에 참고문헌으로 통합된, 미국 특허 공개 번호 제 20090305370호, 제 20110312043호 및 제 20110312044호는, 발효 배양액을 물과 혼화성인 추출용매와 접촉시켜 수상 및 유기상을 포함하는 2상 혼합물을 형성하는 단계를 포함하는, 액체-액체 추출을 기재하고 있다.
현장 생성물 제거 (ISPR)는 발효 배양액으로부터 부탄올을 제거하는데 사용될 수도 있다. 일부 실시양태에서, ISPR은 액체-액체 추출을 포함한다. 전형적으로, 추출용매는 포화된, 단일-포화된, 다중-포화된 (및 그의 혼합물) C12 내지 C22 지방 알코올, C12 내지 C22 지방 알코올, C12 내지 C22 지방산의 에스테르, C12 내지 C22 지방 알데하이드, C12 내지 C22 지방 아미드, 트라이글리세라이드, 및 그의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 유기 추출용매일 수 있으며, 이는 발효 배양액에 접촉되어 수성상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성한다. 추출용매는 또한 포화된, 단일-불포화된, 다중-불포화된 (및 그의 혼합물) C4 내지 C22 지방 알코올, C4 내지 C28 지방산, C4 내지 C28 지방산의 에스테르, C4 내지 C22 지방 알데하이드, C4 내지 C22 지방 아미드, 및 그의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 유기 추출용매일 수 있으며, 이는 발효 배양액에 접촉되어 수성상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성한다. 슬러리로부터의 유리 지방산은 ISPR 추출용매로서 제공될 수도 있다. ISPR 추출용매 (FFA)는 발효 배양액에 접촉되어 수성상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성한다. 발효 배양액에 존재하는 생성물 알코올은 우선적으로는 유기 상으로 분할되어 알코올-함유 유기 상을 형성한다.
부탄올 이성질체는 물과 함께 비등점이 낮은 공비 혼합물을 형성하기 때문에, 증류는 혼합물을 그의 공비 조성까지 분리하는데만 사용될 수 있다. 증류는 공비점 부근의 분리를 수득하기 위하여 다른 분리 방법과 조합될 수 있다. 부탄올의 분리 및 정제를 위하여 증류와 조합하여 사용할 수 있는 방법은 경사 분리, 액체-액체 추출, 흡착 및 막-기재의 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가적으로, 부탄올 이성질체는 분리용 매제(entrainer)를 사용하는 공비성 증류를 사용하여 분리될 수 있다 (예로서, [Doherty and Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw Hill, New York (2001)] 참조).
부탄올 분리 및 정제를 위하여 증류가 경사 분리와 조합되어 사용된 경우, 부탄올을 함유하는 발효 배양액은 공비 조성물에 가깝게 증류된다. 그 후, 공비 혼합물을 응축시키고, 경사 분리에 의해 발효 배지로부터 부탄올을 분리한다. 경사 분리된 수성상은 제1 증류 컬럼에 환류되어 돌아갈 수 있다. 부탄올이 풍부한 경사 분리된 유기상을 제2 증류 컬럼에서 증류에 의해 추가로 정제할 수 있다.
증류가 액체-액체 추출과 조합되어 사용되는 경우, 부탄올은 적합한 용매를 이용하여 액체-액체 추출을 이용하여 발효 배양액으로부터 추출된다. 그 후에 부탄올-함유 유기상을 증류하여 용매로부터 부탄올을 분리한다.
증류를 흡착과 조합하여 사용하는 경우,부탄올을 함유하는 발효 배양액을 공비 조성 부근까지 증류한 후, 잔류하는 물은 분자체와 같은 흡착제를 사용하여 제거한다 ([Aden et al., Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Report NREL/TP-510-32438, National renewable Energy Laboratory, June 2002]).
증류를 투과증발과 조합하여 사용하는 경우, 부탄올을 함유하는 발효 배양액을 공비 조성 부근까지 증류한 후, 잔류하는 물은 친수성 막을 통하여 투과증발에 의해 제거된다 ([Guo et al., J. Membr. Sci., 245:199-210 (2004)]).
임의의 상에서의 부탄올 적정농도는, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 기체 크로마토그래피를 통한 것과 같은, 본 기술분야에서 알려져 있는 방법에 의하여 결정될 수 있으며, 이는 예로서, 본 명세서에 참고문헌으로 통합된 미국 특허 출원 공개 번호 제 US20090305370호에 기재된 바와 같다.
고형분 제거 방법
발효가능한 탄소 기질의 발효 후, 발효 배지 중에 잔류하는 건조 고체 잔류물 (또는 고형분)은, 본 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 제거될 수 있다. 이들 고형분은 단백질, 섬유 및 오일로 구성되며, 이는 다음 세가지 유형일 수 있다: 건고형 주정박 (Distiller's Dried Grains: DDG), 건주정박즙 (Distiller's Dried Solubles: DDS), 및 주정박 (Distiller's Dried Grains with Solubles: DDGS). 이들 고형분 중, 오직 DDGS만이 동물 사료 산업에서 이용될 수 있다. DDGS는 높은 영양가를 가지며, 따라서 동물 사료로서 적합하다.
고형분은 원심분리, 여과, 경사 분리 등에 의해 발효 배지로부터 제거될 수 있다. 고형분의 제거 후, 부탄올은 증류, 공비 증류, 액체-액체 추출, 흡착, 가스 스트리핑, 막 증발, 또는 투과증발과 같은 방법을 이용하여 발효 배지로부터 분리될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 양태를 나타내는 한편, 단지 예시로 주어짐을 이해해야 한다. 상기 토의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있고, 그의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들어서 본 발명이 다양한 용도와 조건에 적합하도록 할 수 있다.
일반 방법
박테리아 배양물의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 주지되어 있다. 하기 실시예에서의 이용에 적합한 기술은 [Manual of Method for General Bactreiology (Phillipp et al., eds., American Society for Microbiology, Washington, DC., (1994))] 또는 [Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)]에 정리된 바와 같이 찾을 수 있다. 세균 세포의 성장 및 유지에 사용된 모든 시약, 제한 효소 및 재료는, 달리 특정되지 않는 한, Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, MO), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Invitrogen (Carlsbad, CA), HiMedia (Mumbai, India), SD Fine chemicals (India), 또는 Takara Bio Inc. (Shiga, Japan)으로부터 수득하였다.
배양 배지 중 아이소부탄올 농도의 결정 방법
배양 배지 내 아이소부탄올의 농도는 본 기술 분야에서 알려진 다수의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예로서, 특정 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 방법은 Shodex SH-G 가드(guard) 컬럼이 있는 Shodex SH-1011 컬럼을 이용하였으며, 이들 모두는 Waters Corporation (Milford, Mass.)으로부터 구매하였고, 굴절률 (RI) 검출을 이용하였다. 0.01M H2SO4를 이동상으로 사용하여, 50℃의 컬럼 온도 및 0.5 mL/분의 유속으로 크로마토그래피 분리를 달성하였다. 아이소부탄올은 사용된 조건 하에서 체류시간이 46.6 min이었다. 대안적으로, 기체 크로마토그래피(GC) 방법이 이용가능하다. 예로서, 특정 GC 방법은 HP-INNOWax 컬럼 (30 m × 0.53 mm 내경, 1 μm 필름 두께, Agilent Technologies (Wilmington, Del.))을 불꽃 이온화 검출기 (FID)와 함께 이용하였다. 운반 기체는 일정 헤드 압력 (head pressure)으로, 150℃에서 측정하여 4.5 mL/분의 유속의 헬륨이었으며; 주입기 스플릿 (injector split)은 200℃에서 1:25였고; 오븐 온도는 1 분 동안 45℃, 10℃/분으로 45 내지 220℃, 및 5분 동안 220℃였으며; FID 검출은 240℃에서 26 mL/분 헬륨 보충 기체를 이용하였다. 아이소부탄올의 체류시간은 4.5 분이었다.
약어의 의미는 다음과 같다: "sec"는 초(들)를 의미하고, "min"은 분(들)을 의미하고, "h"은 시간(들)을 의미하고, "nm"은 나노미터를 의미하고, "uL"은 마이크로리터(들)를 의미하고, "mL"은 밀리리터(들)를 의미하고, "mg/mL"은 밀리리터 당 밀리그램을 의미하고, "L"은 리터(들)를 의미하고, "nm"은 나노미터를 의미하고, "mM"은 밀리몰을 의미하고, "M"은 몰을 의미하고, "mmol"은 밀리몰(들)을 의미하고, "μmole"은 마이크로몰(들), "㎏"은 킬로그램을 의미하고, "g"는 그램(들)을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램(들)을 의미하고, "ng"은 나노그램(들)을 의미하고, "PCR"은 중합효소연쇄반응을 의미하고, "OD"는 광학 밀도를 의미하고, "OD600"은 파장 600 nm에서 측정된 광학 밀도를 의미하고, "kDa"는 킬로달튼을 의미하고, "g"는 중력 상수를 의미할 수도 있고, "bp"는 염기쌍(들)을 의미하고, "kbp"는 킬로염기쌍(들)을 의미하고, "kb"는 킬로베이스를 의미하고, "%"는 퍼센트를 의미하고, "% w/v"는 중량/부피 퍼센트를 의미하고, "% v/v"는 부피/부피 퍼센트를 의미하고, "HPLC"는 고속 액체 크로마토그래피를 의미하고, "g/L"는 리터 당 그램을 의미하고, "㎍/L"은 리터 당 마이크로그램을 의미하고, "ng/μL"은 마이크로리터 당 나노그램을 의미하고, "pmol/μL"은 마이크로리터 당 피코몰을 의미하고, "RPM"은 분 당 회전수를 의미하고, "μmol/min/mg"은 밀리그램 당 분 당 마이크로몰을 의미하고, "w/v"는 부피 당 중량을 의미하고, "v/v"는 부피 당 부피를 의미한다.
미생물 균주는, 달리 나타내지 않는 한, 미국 균주보존협회 (ATCC) (Manassas, Va. 소재)로부터 수득하였다.
하기 실시예들에 사용된 특정 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 표 1에 제공하였다. 모든 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 Sigma-Genosys (Woodlands, Tex. 소재) 또는 Integrated DNA Technologies (IDT) (Coralville, Iowa 소재)에 의하여 합성된 것이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예에서 사용된 균주의 구축
PNY2068의 구축
사카로마이세스 세레비시에 균주 PNY0827는 추가의 유전적 조작을 위해 숙주 세포로서 사용된다. PNY0827은 사카로마이세스 세레비시에로부터 유래된 균주를 지칭하며, 이는 부타페스트 조약 하에 2011년 9월 22일, 미국 균주보존협회의 특허 기탁소 (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 기탁되었으며, 특허 기탁 번호는 PTA-12105이다.
URA3의 결실 및 반수체로의 포자형성
내생의 URA3 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 생체 내 상동성 재조합 및 이후 KANMX4 마커의 제거를 가능하게 하는 loxP 자리에 플랭킹되는 PTEF1-kanMX4-TEF1t 카세트를 함유하는, pLA54 (서열번호 9)로부터 결실 카세트를 PCR-증폭시켰다. PCR은, Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA) 및 프라이머 BK505 (서열번호 10) 및 BK506 (서열번호 11)을 이용하여 수행하였다. 각 프라이머의 URA3 부분을 URA3 ATG의 5' 영역 180bp 업스트림 및 코딩 영역의 3' 영역 78bp 다운스트림으로부터 유도하여, kanMX4 카세트의 통합이 URA3 코딩 영역을 대체하도록 하는 결과를 생성하도록 하였다. PCR 생성물을, 표준 유전학적 기술을 이용하여 (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202) PNY0827로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서 2% 글루코스 및 100 ㎍/ml 제네티신 (Geneticin)으로 보충한 YEP 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를 프라이머 LA468 (서열번호 12) 및 LA492 (서열번호 13)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 스크리닝하여 통합 카세트의 존재를 확인하였다. 이형접합성 이배체 NYLA98가 수득되었으며, 이의 유전형은 MATa/α URA3/ura3::loxP-kanMX4-loxP이었다. 반수체를 수득하기 위하여, NYLA98를 표준 방법(
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeast. Appl Environ Microbiol. 1995 PMID: 7574601)을 이용하여 포자생성시켰다. 4분체 (tetrad)를 미세조작기를 이용하여 분할하고, 2% 글루코스로 보충된 풍부 YPE 배지 상에서 성장시켰다. 4개의 생육성 포자를 함유하는 4분체를 2% 글루코스로 보충된 우라실 결여된 합성 완전 배지 상에 패치하고(patched), AK109-1 (서열번호 14), AK109-2 (서열번호 15), 및 AK109-3 (서열번호 16) 프라이머를 이용하여 다중형 콜로니 PCR에 의하여 접합형을 확인하였다. 생성된 동정된 반수체 균주는 유전형이 MATα ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP인 NYLA103, 및 유전형이 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP인 NYLA106으로 명명되었다.
His3의 결실
내생의 HIS3 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 스카리스 (scarless) 결실 카세트를 이용하였다. 스카리스 HIS3 결실을 위하여 PCR 카세트용 4개의 단편을, Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA 소재)를 사용하여, 그리고 Gentra Puregene Yeast/Bact 키트 (Qiagen; Valencia, CA 소재)로 제조된 주형으로서의 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. HIS3 단편 A를, 프라이머 oBP452 (서열번호 17) 및 HIS3 단편 B의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일 (tail)을 함유하는 프라이머 oBP453 (서열번호 18)을 이용하여 증폭시켰다. HIS3 단편 B를, HIS3 단편 A의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP454 (서열번호 19) 및 HIS3 단편 U의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP455 (서열번호 20)를 이용하여 증폭시켰다. HIS3 단편 U를, HIS3 단편 B의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP456 (서열번호 21) 및 HIS3 단편 C의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP457 (서열번호 22)을 이용하여 증폭시켰다. HIS3 단편 C를, HIS3 단편 U의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP458 (서열번호 23), 및 프라이머 oBP459 (서열번호 24)를 이용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트 (Qiagene)를 사용하여 정제하였다. HIS3 단편 AB를, HIS3 단편 A 및 HIS3 단편 B를 혼합하고, 프라이머 oBP452 (서열번호 17) 및 oBP455 (서열번호 20)를 이용하여 증폭시켜 오버래핑(overlapping) PCR에 의하여 생성하였다. HIS3 단편 UC를, HIS3 단편 U 및 HIS3 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP456 (서열번호 21) 및 oBP459 (서열번호 24)를 이용하여 증폭시켜 오버래핑 PCR에 의하여 생성하였다. 생성된 PCR 생성물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트 (Gel Extraction kit) (Qiagene) 상에서 정제하였다. HIS3 ABUC 카세트를, HIS3 단편 AB 및 HIS3 단편 UC를 혼합하고, 프라이머 oBP452 (서열번호 17) 및 oBP459 (서열번호 24)를 이용하여 증폭시켜 오버래핑 PCR에 의하여 생성하였다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트 (Qiagene)로 정제하였다. NYLA106의 수용 세포(competent cell)를 HIS3 ABUC PCR 카세트를 이용하여 형질전환하였으며, 30℃에서 우라실이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 30℃에서 히스티딘이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에서 복제 도말함에 의하여 스크리닝하였다. 게놈 DNA 준비물 (preps)을 제조하여, 5' 말단에 대하여 프라이머 oBP460 (서열번호 25) 및 LA135 (서열번호 26)을 이용하고, 3' 말단에 대하여 프라이머 oBP461 (서열번호 27) 및 LA92 (서열번호 28)를 이용하는 PCR에 의하여 통합을 입증하였다. URA3 마커는, 표준 프로토콜에 따라 30℃에서 2% 글루코스 및 5-FOA로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말함으로써 재활용하였다. 5-FOA 플레이트로부터의 콜로니를 SD -URA 배지에 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. PNY2003로 명명된, 생성된 동정된 균주의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ이었다.
PDC1의 결실
내생의 PDC1 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 포함하는 pLA59 (서열번호 29)로부터 결실 카세트를 PCR-증폭시켰다. PCR은, Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA 소재) 및 프라이머 LA678 (서열번호 30) 및 LA679 (서열번호 31)를 이용하여 수행하였다. 각 프라이머의 PDC1 부분은 PDC1 개시 코돈의 5' 영역 50bp 다운스트림 및 종결 코돈의 3' 영역 50bp 업스트림으로부터 유도되었으며, URA3 카세트의 통합이 PDC1 코딩 영역을 대체하는 결과를 생성하지만, 코딩 영역의 첫번째 50bp 및 코딩 영역의 최종 50bp는 남도록 하였다. PCR 생성물을 표준 유전학적 기술을 사용하여 PNY2003으로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서, 우라실이 결여되고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5' 코딩 영역에 대하여 외부의, 프라이머 LA337 (서열번호 32) 및 URA3에 대한 내부 프라이머인 LA135 (서열번호 26)를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체는 그 후 LA692 (서열번호 33) 및 PDC1 코딩 영역에 대해 내부의 LA693 (서열번호 34) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝되었다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고, 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말하였다. 형질전환체를 0.5% 갈락토스로 보충된 강화 배지(rich medium) 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 2% 글루코스로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. PNY2008로 명명된, 생성된 동정된 균주의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66이었다.
PDC5의 결실
내생의 PDC5 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 결실 카세트를 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA59 (서열번호 29)로부터 PCR-증폭시켰다. PCR은, Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA) 및 프라이머 LA722 (서열번호 36) 및 LA733 (서열번호 37)을 이용하여 수행되었다. 각 프라이머의 PDC5 부분을 PDC5 개시 코돈의 5' 영역 50bp 업스트림 및 종결 코돈의 3' 영역 50bp 다운스트림으로부터 유도하여, URA3 카세트의 통합이 전체 PDC5 코딩 영역을 대체하는 결과를 생성시켰다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2008로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5' 코딩 영역에 대하여 외부의 LA453 (서열번호 38), 및 URA3에 대하여 내부의 프라이머인 LA135 (서열번호 26) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체를 그 후 프라이머 LA694 (서열번호 39) 및 PDC5 코딩 영역에 대하여 내부의 LA695 (서열번호 40)를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용되었고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고, 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말되었다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 풍부 YEP 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. PNY2009로 명명된, 생성된 동정된 균주의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66이었다.
FRA2의 결실
FRA2 결실을 설계하여, 코딩 서열의 3' 말단으로부터 250개 뉴클레오타이드를 결실시키고, 온전한 FRA2 코딩 서열의 처음 113개 뉴클레오타이드를 남겼다. 인-프레임 종결 코돈은 결실의 7개 뉴클레오타이드 다운스트림에 나타났다. 스카리스 FRA2 결실을 위한 PCR 카세트에 대한 4개의 단편을 Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs사, Ipswich, MA 소재)를 사용하여, 그리고 Gentra Puregene Yeast/Bact 키트 (Qiagen사, Valencia, CA 소재)로 제조된 주형으로서의 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. FRA2 단편 A를, 프라이머 oBP594 (서열번호 41) 및 FRA2 단편 B의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP595 (서열번호 42)를 이용하여 증폭시켰다. FRA2 단편 B를, FRA2 단편 A의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5" 테일을 함유하는 프라이머 oBP596 (서열번호 43), 및 FRA2 단편 U의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP597 (서열번호 44)를 이용하여 증폭시켰다. FRA2 단편 U를, FRA2 단편 B의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 말단을 함유하는 프라이머 oBP598 (서열번호 45), 및 FRA2 단편 C의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP599 (서열번호 46)로 증폭시켰다. FRA2 단편 C를, FRA2 단편 U의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP600 (서열번호 47) 및 프라이머 oBP601 (서열번호 48)을 이용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. FRA2 단편 AB를, FRA2 단편 A 및 FRA2 단편 B를 혼합하고, 프라이머 oBP594 (서열번호 41) 및 oBP597 (서열번호 44)을 이용하여 증폭시켜 오버래핑 PCR에 의해 생성하였다. FRA2 단편 UC를 FRA2 단편 U 및 FRA2 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP598 (서열번호 45) 및 oBP601 (서열번호 48)을 이용하여 증폭시켜 오버래핑 PCR에 의해 생성하였다. 생성된 PCR 생성물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트 (Gel Extraction kit) (Qiagen)에서 정제하였다. FRA2 ABUC 카세트를, FRA2 단편 AB 및 FRA2 단편 UC를 혼합하고, 프라이머 oBP594 (서열번호 41) 및 oBP601 (서열번호 48)을 이용하여 증폭시켜, 오버래핑 PCR에 의하여 생성하였다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트 (Qiagen)로 정제하였다.
내생의 FRA2 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 상기 수득된 스카리스 결실 카세트를, 표준 기술을 이용하여 PNY2009로 형질전환시키고 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말하였다. 게놈 DNA 준비물을 제조하여, 5' 말단에 대하여 프라이머 oBP602 (서열번호 49) 및 LA135 (서열번호 26), 및 전체 유전자좌를 증폭시키기 위하여 프라이머 oBP602 (서열번호 49) 및 oBP603 (서열번호 50) 을 이용하여 PCR에 의하여 통합을 입증하였다. URA3 마커는, 30℃에서 표준 프로토콜에 따라, 1% 에탄올 및 5-FOA (5-플루오로오로트산)으로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말함으로써 재활용시켰다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 5-FOA 플레이트로부터의 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. 생성된 동정된 균주, PNY2037의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ이었다.
2 미크론 플라스미드의 추가
loxP71-URA3-loxP66 마커를 Phusion DNA 중합효소 (New England BioLabs; Ipswich, MA)를 사용하여 pLA59 (서열번호 29)로부터 PCR-증폭시키고, LA811x817 (서열번호 51, 52) 및 LA812x818 (서열번호 53, 54) 2-미크론 플라스미드 단편과 함께 30℃에서 SE -URA 플레이트 상에서 균주 PNY2037로 형질전환시켰다. 생성된 균주 PNY2037 2μ::loxP71-URA3-loxP66는 pLA34 (pRS423::cre) (pLA34로도 명명됨) (서열번호 35)를 이용하여 형질전환되었으며, 30℃에서 SE -HIS -URA 플레이트 상에서 선발되었다. 형질전환체를 YP-1% 갈락토스 플레이트 상에 패치하고, 30℃에서 48시간 동안 성장시켜 Cre 재조합효소 발현을 유도하도록 하였다. 각각의 콜로니를 그 후 SE -URA, SE -HIS, 및 YPE 플레이트에 패치시켜 URA3 마커의 제거를 확인하였다. 결과로서 동정된 균주, PNY2050의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP, his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-미크론이었다.
GPD2의 결실
내생의 GPD2 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 결실 카세트를 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA59 (서열번호 29)로부터 PCR-증폭시켰다. PCR은, Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA) 및 LA512 (서열번호 55) 및 LA513 (서열번호 56) 프라이머를 이용하여 수행하였다. 각 프라이머의 GPD2 부분을, GPD2 출발 코돈의 5' 영역 50bp 업스트림 및 종결 코돈의 3' 영역 50bp 다운스트림으로부터 유도하여, URA3 카세트의 통합이 전체 GPD2 코딩 영역을 대체하도록 하는 결과를 생성하도록 하였다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2050로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서, 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5'코딩 영역에 대하여 외부의 프라이머 LA516 (서열번호 57), 및 URA3에 대하여 내부의 LA135 (서열번호 26)을 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체는 그 후 LA514 (서열번호 58) 및 GPD2 코딩 영역에 대하여 내부의 LA515 (서열번호 59) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말하였다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 강화 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. 생성된 동정된 균주, PNY2056의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-micron gpd2Δ이었다.
YMR226의 결실 및 AlsS의 통합
내생의 YMR226C 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 통합 카세트를, FBA1 프로모터 및 CYC1 종결자를 갖는 바실러스 서브틸리스 종으로부터의 아세토락테이트 신타제 유전자, 및 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA71 (서열번호 60)로부터 PCR-증폭시켰다. Kapa Biosystems (Woburn, MA 소재)로부터의 KAPA HiFi 및 LA829 (서열번호 61) 및 LA834 (서열번호 62) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 YMR226C 부분은 코딩 서열의 처음 60bp 및 종결 코돈의 409bp 업스트림인 65bp로부터 유도되었다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2056으로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5' 코딩 영역에 대하여 외부의 N1257 (서열번호 63) 및 FBA1 프로모터에 대하여 내부의 LA740 (서열번호 69) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체는 그 후 N1257 (서열번호 63) 및 YMR226C 코딩 영역에 대하여 내부의 LA830 (서열번호 64) 프라이머, 및 3' 코딩 영역에 대하여 외부의 LA830 (서열번호 64) 및 URA3 마커에 대하여 내부의 LA92 (서열번호 28) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝되었다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말되었다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 강화 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. 생성된 동정된 균주 PNY2061의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-micron gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 이었다.
ALD6의 결실 및 KivD의 통합
내생의 ALD6 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 통합 카세트를, 혼성 FBA1 프로모터 및 TDH3 종결자를 갖는 리스테리아 그라이이 종으로부터의 kivD 유전자, 및 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA78 (서열번호 65)로부터 PCR-증폭시켰다. Kapa Biosystems (Woburn, MA 소재)로부터의 KAPA HiFi 및 LA850 (서열번호 66) 및 LA851 (서열번호 67) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 ALD6 부분은 코딩 서열의 처음 65bp 및 코딩 영역의 마지막 63bp로부터 유도되었다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2061로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5' 코딩 영역에 대하여 외부의 N1262 (서열번호 68), 및 FBA1 프로모터에 대하여 내부의 LA740 (서열번호 69) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체는 그 후 3' 코딩 영역에 대하여 외부의 N1263 (서열번호 70), 및 URA3 마커에 대하여 내부의 LA92 (서열번호 28) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝되었다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말하였다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 강화 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. 생성된 동정된 균주, PNY2065의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-미크론 gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 ald6Δ::(UAS)PGK1-PFBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71이었다.
ADH1의 결실 및 ADH의 통합
ADH1은 사카로마이세스 세레비시에에 존재하는 내생의 알코올 탈수소효소이다. 하기 기재된 바와 같이, 내생의 ADH1을 베이제린키이 인디카로부터의 알코올 탈수소효소 (ADH)로 대체시켰다.
내생의 ADH1 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 통합 카세트를, ILV5 프로모터 및 ADH1 종결자를 갖는 베이제린키이 인디카 종으로부터의 알코올 탈수소효소 및 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA65 (서열번호 71)로부터 PCR-증폭시켰다. Kapa Biosystems (Woburn, MA 소재)로부터의 KAPA HiFi 및 LA855 (서열번호 72) 및 LA856 (서열번호 73) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 ADH1 부분은 ADH1의 개시 코돈의 5' 영역 50bp 업스트림 및 코딩 영역의 마지막 50bp로부터 유도되었다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2065로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5' 코딩 영역에 대하여 외부의 LA414 (서열번호 74), 및 ILV5 프로모터에 대하여 내부의 LA749 (서열번호 75) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체는 그 후 3' 코딩 영역에 대하여 외부의 프라이머 LA413 (서열번호 76), 및 URA3 마커에 대하여 내부의 LA92 (서열번호 28)를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝되었다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말되었다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 강화 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. PNY2066로 명명된, 생성된 동정된 균주의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-미크론 gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 ald6Δ::(UAS)PGK1-PFBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71/66 adh1Δ::PILV5-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66이었다.
ADH의 pdc1Δ 유전자 좌 내로의 통합
pdc1Δ 영역에서 ADH의 추가 복제물을 통합하기 위하여, 통합 카세트를 ADH1 종결자를 갖는 베이제린키이 인디카 종으로부터의 알코올 탈수소효소, 및 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA65 (서열번호 71)로부터 PCR-증폭시켰다. Kapa Biosystems (Woburn, MA 소재)로부터의 KAPA HiFi 및 LA860 (서열번호 77) 및 LA679 (서열번호 31) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 PDC1 부분은 PDC1 출발 코돈의 5' 영역 60bp 업스트림 및 종결 코돈의 103bp 업스트림인 50bp로부터 유도되었다. 내생의 PDC1 프로모터를 사용하였다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2066으로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5' 코딩 영역에 대하여 외부의 LA337 (서열번호 32), 및 BiADH 유전자에 대하여 내부의 N1093 (서열번호 78) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체를 그 후 3' 코딩 영역에 대하여 외부의 LA681 (서열번호 79), 및 URA3 마커에 대하여 내부의 LA92 (서열번호 28) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말되었다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 강화 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. PNY2068로 명명된, 생성된 동정된 균주의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-미크론 gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 ald6Δ::(UAS)PGK1-PFBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71/66 adh1Δ::PILV5-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66 pdc1Δ::PPDC1-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66이었다.
아이소부타놀로겐 균주 PNY2270의 구축
2 개의 플라스미드, pHR81-ILV5p-K9SB2 (서열번호 80) 및 pYZ067DkivDDhADH (서열번호 81)을 이용한 세포의 형질전환에 의하여 균주 PNY2068 (상기 기재됨)로부터 균주 PNY2270을 생성하였다. 플라스미드를 리튬 아세테이트 형질전환 방법에 의하여 도입시키고 ([Methods in Yeast Genetics, 2005, p. 113]), 형질전환체를 히스티딘과 우라실을 빼고 1% 에탄올을 탄소 공급원으로서 갖는 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를 그 후, 히스티딘과 우라실을 빼고 2% 글루코스를 탄소 공급원으로서 갖고, 에탄올 (0.05%) 또는 아세테이트 (2 mM)를 C2 보충물로서 갖는 합성 완전 배지를 함유하는 플레이트로 이동시켰다.
pHR81-ILV5p-K9SB2 (서열번호 80)는 pHR81 플라스미드 골격 내에서 ILV5 프로모터 및 ILV5 종결자에 의하여 유도된 A. 칵캐 K9SB2 KARI 유전자를 함유한다. pYZ067DkivDDhADH (서열번호 81)는 pRS423 플라스미드 골격 내에서 FBA1 프로모터 및 FBA1 종결자에 의하여 유도된 S. 뮤탄스 ilvD 유전자를 함유한다.
아이소부타놀로겐 균주 PNY2092의 구축
유전형 MATa ura3Δ::loxP-kanMX4-loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-미크론 gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66을 갖는 기본 균주 PNY2061 (상기 기재됨)을, 플라스미드: pHR81-ILV5p-R8B2y2 (서열번호 82) 및 pLA84 (서열번호 83)를 이용하여 플라스미드 형질전환시킴으로써 균주 PNY2092를 구축하였다.
pHR81-ILV5p-R8B2y2 (서열번호 82)는 pHR81 플라스미드 골격 내에서 ILV5 프로모터 및 ILV5 종결자에 의하여 유도된 P. 플루오레센스 R8B2 KARI (효모에 대하여 코돈-최적화됨)를 함유한다. pLA84 (서열번호 83)는 FBA1 프로모터 및 FBA1 종결자에 의하여 유도된 S. 뮤탄스로부터의 IlvD, GPM1 프로모터 및 ADH1 종결자에 의하여 유도된 B. 인디카로부터의 ADH 및 pRS423 플라스미드 골격 내에서 TDH3 프로모터 및 TDH3 종결자에 의해 유도된 L. 그라이이로부터의 KivD를 함유한다.
아이소부타놀로겐 균주 PNY2118, PNY2120 및 PNY2318의 구축
PNY2050으로부터의 PNY2115의 구축
PNY2050으로부터의 PNY2115 [MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP66/71 fra2Δ 2-미크론 플라스미드 (CEN.PK2) pdc1Δ::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 fra2Δ::P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 gpd2Δ::loxP71/66]의 구축은 하기와 같았다.
Pdc1Δ::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66
alsS를 내생의 PDC1 프로모터를 이용하여 PNY2050의 pdc1Δ::loxP66/71 유전자좌 내로 통합시키기 위하여, 통합 카세트를, FBA1 프로모터 및 CYC1 종결자를 갖는 바실러스 서브틸리스 종으로부터의 아세토락테이트 신타제 유전자, 및 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의하여 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA71 (서열번호 60)로부터 PCR-증폭시켰다. KAPA HiFi 및 프라이머 895 (서열번호 84) 및 679 (서열번호 31)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 PDC1 부분은 코딩 서열의 업스트림의 60bp 및 종결 코돈의 53bp 업스트림인 50bp로부터 유도되었다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2050으로 형질전환하였으며, 형질전환체를 30℃에서 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 3' 코딩 영역에 대하여 외부의 681 (서열번호 79), 및 URA3 유전자에 대하여 내부의 LA92 (서열번호 28) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체를 그 후 게놈 DNA에 대하여 준비하고, 프라이머 N245 (서열번호 85) 및 N246 (서열번호 86)을 이용하여 PCR에 의하여 스크리닝하였다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말되었다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0/5% 갈락토스로 보충된 풍부 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 확인하여 마커 제거를 확인하였다. PNY2090으로 명명된, 생성된 동정된 균주의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP, his3Δ, pdc1Δ::loxP71/66, pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-미크론 pdc1Δ::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66이었다.
Pdc6Δ::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66
내생의 PDC6 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 통합 카세트를 혼성 FBA1 프로모터 및 TDH3 종결자를 갖는 리스테리아 그라이이 종으로부터의 kivD 유전자, 및 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의하여 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA78 (서열번호 65)로부터 PCR-증폭시켰다. KAPA HiFi 및 프라이머 896 (서열번호 87) 및 897 (서열번호 88)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 PDC6 부분을 코딩 서열의 60p 업스트림 및 코딩 영역의 59bp 다운스트림으로부터 유도하였다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2090으로 형질전환하였으며, 형질전환체를 30℃에서 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해, PDC6 유전자에 대해 내부의 프라이머인, 365 (서열번호 89) 및 366 (서열번호 90) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 생성물이 없는 형질전환체를 그 후 유전자의 5' 말단에 대하여 외부의 N638 (서열번호 91), 및 FBA1 프로모터에 대하여 내부의 740 (서열번호 69)을 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체를 그 후 게놈 DNA에 대하여 준비하고, PDC6 코딩 서열에 대하여 2 개의 외부의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 스크리닝하였다. PDC6 야생형 형질전환체는 2130bp 생성물을 산출할 수 있으나, 양성의 통합체는 4720bp 생성물을 산출할 수 있을 것이다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에서 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말되었다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 풍부 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. 생성된 동정된 균주는 PNY2093로 명명되며, 그의 유전형 MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-미크론 pdc1Δ::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66을 갖는다.
Adh1Δ::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66
내생의 ADH1 코딩 영역을 결실시키고, 내생의 ADH1 프로모터를 이용하여 BiADH를 통합시키기 위하여, 통합 카세트를 ILV5 프로모터 및 ADH1 종결자를 갖는 베이제린키이 종으로부터의 알코올 탈수소효소 및 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA65 (서열번호 71)로부터 PCR-증폭시켰다. KAPA HiFi 및 856 (서열번호 73) 및 857 (서열번호 110) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 ADH1 부분은 ADH1 출발 코돈의 5' 영역 50 bp 업스트림 및 코딩 영역의 마지막 50 bp로부터 유도되었다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2093으로 형질전환하였으며, 형질전환체를 30℃에서 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5' 코딩 영역의 외부의 프라이머 BK415 (서열번호 92), 및 BiADH 유전자에 대하여 내부의 N1092 (서열번호 93)를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체는 그 후 3' 코딩 영역에 대하여 외부의 413 (서열번호 76), 및 URA3 마커에 대하여 내부의 92 (서열번호 28) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝되었다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말되었다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 풍부 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. PNY2101로 명명된, 생성된 동정된 균주의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2-미크론 pdc1Δ::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66이었다.
Fra2Δ::P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66
BiADH를 PNY2101의 fra2Δ 유전자좌 내로 통합시키기 위하여,통합 카세트를, ILV5 프로모터 및 ADH1 종결자를 갖는 베이제린키이 인디카 종으로부터의 알코올 탈수소효소 및 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA65 (서열번호 71)로부터 PCR-증폭시켰다. KAPA HiFi 및 906 (서열번호 94) 및 907 (서열번호 95) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 FRA2 부분은 ATG에서 출발하는 코딩 서열의 처음 60bp 및 종결 코돈의 56bp 다운스트림으로부터 유도되었다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생산물을 PNY2101로 형질전환하였으며, 형질전환체를 30℃에서 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5' 코딩 영역에 대하여 외부의 667 (서열번호 96), 및 ILV5 프로모터에 대하여 내부의 749 (서열번호 75) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말되었다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 풍부 배지 상에 도말하여 재조합효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 확인하여 마커 제거를 확인하였다. PNY2110로 명명된, 생성된 동정된 균주의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP66/71 2-미크론 pdc1Δ::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 fra2Δ::P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66이었다.
GPD2 결실
내생의 GPD2 코딩 영역을 결실시키기 위하여, 결실 카세트를, 생체 내 상동성 재조합 및 이후 URA3 마커의 제거를 가능하게 하는 축퇴 loxP 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 마커를 함유하는 pLA59 (서열번호 29)로부터 PCR-증폭시켰다. KAPA HiFi 및 LA512 (서열번호 55) 및 LA513 (서열번호 56) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머의 GPD2 부분을 GPD2 출발 코돈의 5' 영역 50bp 업스트림 및 출발 코돈의 3' 영역 50bp 다운스트림으로부터 유도하여, URA3 카세트의 통합이 전체 코딩 영역을 대체하도록 하는 결과를 생성하도록 하였다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2110으로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서, 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 정확한 통합을 입증하기 위해 5' 코딩 영역에 대하여 외부의 LA516 (서열번호 57) 및 URA3에 대하여 내부의 LA135 (서열번호 26) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 양성 형질전환체는 그 후 LA514 (서열번호 58) 및 GPD2 코딩 영역에 대하여 내부의 LA515 (서열번호 59) 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. URA3 마커는 GAL1 프로모터 하에 CRE 재조합효소를 함유하는 pLA34 (서열번호 35)를 이용하여 형질전환함으로써 재활용시키고, 30℃에서 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말되었다. 형질전환체를 1% 에탄올 및 0.5% 갈락토스로 보충된 강화 배지 상에 도말하여 재조합 효소를 유도하였다. 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 콜로니를 패치하여 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. PNY2115로 명명된, 생성된 동정된 균주의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP66/71 fra2Δ 2-미크론 pdc1Δ::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 fra2Δ::P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 gpd2Δ::loxP71/66이었다.
PNY2115로부터의 PNY2145의 구축
pdc5Δ 유전자 좌에서 포스포케톨라제 유전자 카세트의 추가적인 통합에 의해, 그리고 천연의 AMN1 유전자를 CEN.PK로부터의 오솔로그(ortholog)의 코돈 최적화된 형태로 치환함에 의해 PNY2115로부터 PNY2145를 구축하였다. 통합 구축물을 하기에 추가로 기재하였다.
pdc5Δ::FBA(L8)-xpk1-CYC1t-loxP71/66
pRS423::TEF(M4)-xpk1+ENO1-eutD (서열번호 111)로부터의 TEF(M4)-xpk1-CYC1t 유전자를, N1341 및 N1338 (서열번호 112 및 113) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켜 3.1 kb 생성물을 생성하였다. pLA59 (서열번호 29)로부터의 loxP-플랭킹되는 URA3 유전자 카세트를 N1033c 및 N1342 (서열번호 114 및 115) 프라이머를 이용하여 증폭하여, 1.6 kb 생성물을 생성하였다. xpk1 및 URA3 PCR 생성물을, Phusion DNA 중합효소를 이용하여 PCR의 추가의 10 사이클에 프라이머 없이 조합하여 융합하였다. 생성된 반응 혼합물을 그 후 KAPA Hi Fi 및 N1342 및 N1364 (서열번호 115 및 116) 프라이머를 이용한 PCR 반응에 대한 주형으로서 사용하였다. 4.2 kb PCR 생성물을 전기영동 아가로스 겔 (Zymo 키트)로부터의 정제에 의하여 회수하였다. FBA 프로모터 변이체 L8 (서열번호 117)을, N1366 및 N1368 (서열번호 118 및 119) 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. xpk1::URA3 PCR 생성물을 PCR의 추가 구동에 의하여 FBA 프로모터와 조합시켰다. 생성된 생성물을 폴리뉴클레오타이드 키나제로 인산화하고, EcoRV로 분해시키고 송아지 장 포스파타제로 처리된 pBR322 내로 결찰시켰다. 결찰 반응은 대장균 세포로 형질전환되었다 (Invitrogen로부터의 Stbl3 수용 세포). 통합 카세트는 서열분석에 의하여 확인하였다. 통합을 위한 DNA를 제조하기 위하여, 플라스미드는 Kapa HiFi 및 N1371 및 N1372 (서열번호 120 및 121) 프라이머를 이용하는 PCR 반응에서 주형으로서 이용되었다. PCR 생성물을 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전 (표준 방법, 예로서, Maniatas 등의 방법 이용)에 의하여 분리하였다. 5 마이크로그램의 DNA를 균주 PNY2115를 형질전환시키는데 이용하였다. 형질전환체를 우라실 결여 배지 (탄소 공급원으로서 1% 에탄올을 갖는, 우라실을 뺀 합성 완전 배지) 상에서 선발하였다. 콜로니를 프라이머 BK93 및 N1114 (서열번호 122 및 123)를 이용하는 PCR (JumpStart)을 이용하여 통합 경우에 대해 스크리닝하였다. 2 개의 클론을 선발하여 앞서 실시하였다. URA3 마커를 GAL1 프로모터 하에서 CRE 재조합효소를 함유하는 pJT254 (서열번호 97)를 이용하여 형질전환시키고, 30℃에서 히스티딘 결여 및 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에 도말하여 재활용하였다. 형질전환체를 1% 에탄올로 보충된 강화 배지 상에서 배양하여 재조합효소를 억제하였다. 단일 콜로니 분리물을 우라실 결여 및 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 패치시켜 성장의 부재를 입증하기 하여 마커 제거를 확인하였다. 콜로니를 히스티딘을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지에 패치시켜, 재조합효소 플라스미드 pJT254의 손실을 확인하였다. 적절한 마커 제거는 PCR (프라이머 N160SeqF5 (서열번호 124) 및 BK380 (서열번호 125)에 의하여 확인하였다. 생성된 하나의 클론을 PNY2293로 명명하였다.
amn1Δ::AMN1(y)-loxP71/66
AMN1의 내생의 복제물을, CEN.PK2로부터의 AMN1 유전자의 코돈-최적화된 형태로 대체하기 위하여, CEN.PK AMN1 프로모터, AMN1(y) 유전자 (핵산 서열번호 98; 아미노산 서열번호 99 번역), 및 CEN.PK AMN1 종결자를 함유하는 통합 카세트를 SOE PCR에 의하여 조립하고 셔틀 벡터 pLA59로 서브클로닝하였다. AMN1(y) 유전자를 S. 세레비시에에 대한 코돈-최적화를 갖는 DNA 2.0으로부터 정렬하였다. 완성된 pLA67 플라스미드 (서열번호 100)는: 1) E. 콜라이 복제 기원 및 암피실린 내성 유전자를 함유하는 pUC19 벡터 골격 서열; 2) loxP71 및 loxP66 자리에 의해 플랭킹되는 URA3 선발 마커; 및 3) PAMN1(CEN.PK)-AMN1(y)-termAMN1(CEN.PK) 발현 카세트를 포함하였다.
AMN1(y)-loxP71-URA3-loxP66 카세트의 PCR 증폭은 Kapa Biosystems (Woburn, MA 소재)로부터의 KAPA HiFi 및 프라이머 LA712 (서열번호 101) 및 LA746 (서열번호 102)를 이용하여 수행되었다. 표준 유전학적 기술을 이용하여 PCR 생성물을 PNY2293으로 형질전환하고, 형질전환체를 30℃에서, 우라실을 결여하고 1% 에탄올로 보충된 합성 완전 배지 상에서 선발하였다. 형질전환체를, 대조구 (PNY2293)에 비하여 뭉친 (clumping) 표현형의 부재에 대하여, 확대 하에 관찰하였다 URA3 마커를, 상기 기재된 바와 같이 pJT254 Cre 재조합효소 플라스미드를 이용하여 재활용하였다. 마커 재활용 후, 클론을 확대 하에 다시 관찰하여 뭉친 표현형의 부재를 확인하였다. 생성된 동정된 균주, PNY2145의 유전형은 MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::P[FBA(L8)]-XPK|xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71 fra2Δ 2-미크론 플라스미드 (CEN.PK2) pdc1Δ::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 fra2Δ::P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 gpd2Δ::loxP71/66 amn1Δ::AMN1(y)을 가졌다
PNY2118 및 PNY2120은 모두 효모-E. 콜라이 셔틀 벡터를 균주 PNY2115로 형질전환시킴으로써 구축되었다. 플라스미드 형질전환체는 우라실 또는 히스티딘 없이, 단독 탄소 공급원으로서 1% 에탄올 (v/v)을 포함하는 합성 완전 배지 상에서 세포를 도말하여 선발되었다. PNY2118은 PCT 공개 번호 제 WO2012/129555호에 기재된, 플라스미드 pYZ067ΔkivDΔhADH (서열번호 103) 및 pHR81-ILV5p-K9JB4P (서열번호 104)를 수용한 클론이다. PNY2120는 플라스미드 pHR81-ILV5p-K9SB2-SH (서열번호 105) 및 pYZ067ΔkivDΔhADH를 수용한 클론이다. pHR81-ILV5p-K9JB4P 및 pHR81-ILV5p-K9SB2-SH 플라스미드는 pHR81 (ATCC로부터 입수가능, #87541 (Manassas, VA 소재))에 기초하고, KARI (각각, 변이체 K9JB4P, 서열번호 106 nt 및 서열번호 107 단백질; 및 K9SB2-SH, 서열번호 126)의 발현을 위한 유전자를 함유한다. 플라스미드 pYZ067ΔkivDΔhADH는 pRS423 (ATCC로부터 입수가능, # 77104)으로부터 유래되었으며, DHAD의 발현을 위한 유전자를 함유한다.
PNY2318은 PNY2145를 플라스미드 pLH689-L2V4 (서열번호 108) 및 pRS413::BiADH-kivD (서열번호 109)를 이용하여 형질전환함으로써 구축하였다. 형질전환체는 PNY2118 및 PNY2120에 대하여 상기 기재된 것과 같이 수득하였다. 플라스미드 pLH689-L2V4는 pHR81에 기초하며, KARI (K9JB4P 변이체, 아미노산 서열번호 107; ILV5 프로모터의 통제 하) 및 DHAD (C-말단 Lumioㄾ tag를 포함하는 L2V4 변이체, 아미노산 서열번호 127; TEF(M7) 프로모터의 통제 하)의 발현을 위한 유전자를 함유한다. 플라스미드 pRS413::BiADH-kivD는 pRS413 (ATCC#)에 기초하며, BiADH (아미노산 서열번호 128; PDC1 프로모터의 통제 하) 및 L. grayi kivD (아미노산 서열번호 129, PGK(UAS)-FBA1 혼성 프로모터의 통제 하)의 발현을 위한 유전자를 함유한다.
실시예 1
PNY2270에 의한 아이소부탄올 생산
본 실시예의 목적은 에탄올 또는 아세테이트 중 어느 하나를 C2 보충물로서 함유하는 성장 배지 내에서 균주 PNY2270에 의한 성장 및 아이소부탄올 생산을 예증하고자 하는 것이다.
PNY2270은, 0.3% 글루코스 및 2mM 아세테이트 또는 0.3% (vol/vol) 에탄올 중 어느 하나를 합성 완전 배지 중, 30℃에서 플랫폼 진탕기 (platform shaker)에서 (220 rpm), 호기적으로 배양되었다 (환기된 125 ml 플라스크 중 10 ml 배지). 아세테이트-보충된 배지 중 대수적 성장 속도는 에탄올을 이용한 것보다 40% 더 높았다. 어느 한 배지 중 배양물을 약 2의 광학 밀도로 성장시켰다 (에펜도르프 생물광도계 (Eppendorf BioPhotometer) (Eppendorf AG사, Hamburg, Germany 소재)를 사용하여 측정). 배양 배지를 그 후 2% 글루코스, BME 비타민 및 2mM 아세테이트 또는 0.05% (vol/vol) 에탄올을 갖는 합성 완전 배지를 혈청 바이알 중에 (15 ml 바이알 중 10 ml 배지) 0.22의 출발 OD로 접종하는데 사용하였다. 바이알을 마개로 막고(stoppered), 크림프시켜(crimped), 플랫폼 진탕기 (220 rpm) 내 30℃에서 인큐베이션하였다. 48시간 후, 크림프 및 마개를 제거하고, 광학 밀도를 측정하고, 배양 여과물을 아이소부탄올 생산에 대해 HPLC로 분석하였다.
아세테이트를 함유하는 배양 배지 중에서 성장한 균주는, 아세테이트 없는 배지 중에서 성장한 균주보다 더욱 높은 농도로 아이소부탄올을 생산하는 것으로 발견되었다 (하기 표 2에 나타낸 결과).
Figure pct00006
실시예 2
PNY2092에 의한 아이소부탄올 생산
본 실시예의 목적은 에탄올 또는 아세테이트 중 어느 하나를 C2 보충물로서 함유하는 성장 배지 내에서 균주 PNY2092에 의한 성장 및 아이소부탄올 생산을 예증하고자 하는 것이다.
PNY2092는 0.3% 글루코스 및 2mM 아세테이트 또는 0.3% (vol/vol) 에탄올 중 어느 하나를 갖는 합성 완전 배지 중, 30℃에서 플랫폼 진탕기에서 (220 rpm), 호기적으로 배양되었다 (환기된 125 ml 플라스크 중 10 ml 배지). 아세테이트-보충된 배지 중 대수적 성장 속도는 에탄올을 이용한 것보다 더 높았다. 어느 한 배지 중 배양물을 약 2의 광학 밀도로 성장시켰다 (에펜도르프 생물광도계 (Eppendorf AG사, Hamburg, Germany 소재)). 배양 배지를 그 후 2% 글루코스, BME 비타민 및 2mM 아세테이트 또는 0.05% (vol/vol) 에탄올을 갖는 합성 완전 배지를 혈청 바이알 중 (15 ml 바이알 중 10 ml 배지)에 0.2의 출발 OD로 접종하는데 사용하였다. 바이알을 마개로 막고, 크림프시켜, 플랫폼 진탕기 (220 rpm) 내 30℃에서 인큐베이션하였다. 48시간 후, 크림프 및 마개를 제거하고, 광학 밀도를 측정하고, 배양 여과물을 HPLC로 분석하였다.
아세테이트를 함유하는 배양 배지 중에서 성장한 균주는, 아세테이트 없는 배양 배지 중에서 성장한 균주보다 더욱 높은 농도로 아이소부탄올을 생산하는 것으로 발견되었다 (하기 표 3에 나타낸 결과).
Figure pct00007
실시예 4
균주 PNY2118 및 PNY2120에 의한 아이소부탄올 생산
본 실시예의 목적은 에탄올 또는 아세테이트 중 어느 하나를 C2 보충물로서 함유하는 배지 내에서 균주 PNY2118 및 PNY2120에 의한 아이소부탄올 생산을 예증하고자 하는 것이다.
샘플을 47.3시간에 분석을 위해 수집한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2에서 기재된 것과 같이 균주를 배양한 후 혈청 바이알 내에서 아이소부탄올 생산에 대하여 평가하였다.
Figure pct00008
실시예 5
PNY2318에 의한 아이소부탄올 생산
본 실시예의 목적은 에탄올 또는 아세테이트 중 어느 하나를 C2 보충물로서 함유하는 배지 내에서 균주 PNY2318에 의한 아이소부탄올 생산을 예증하고자 하는 것이다.
상기 기재된 실험들과 유사하게, 균주를 배양한 후 혈청 바이알 내에서 아이소부탄올 생산에 대하여 평가하였다 (실시예 2 및 3). 이 경우에서, PNY2318은 성장을 위해 C2-보충물을 필요로 하지 않는다. 따라서 균주는 C2와 함께 또는 C2 없이 배양되고, 그 후 혈청 바이알 내로 다시 C2와 함께 또는 C2 없이 접종되었다. 샘플을 분석을 위해 36 시간에 수집하였다.
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> Butamax(TM) Advanced Biofuels LLC <120> ACCETATE SUPPLEMENTATION OF MEDIUM FOR BUTANOLOGENS <130> CL5681USNP <140> US 61/615,174 <141> 2012-03-23 <160> 134 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Escherichia coli ketol-acid reductoisomerase <400> 1 Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Gln Gln Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Gly Lys Cys Arg Phe Met Gly Arg Asp Glu Phe Ala Asp Gly Ala 20 25 30 Ser Tyr Leu Gln Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln 35 40 45 Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ser 50 55 60 Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ile Ala Glu Lys Arg Ala Ser Trp Arg 65 70 75 80 Lys Ala Thr Glu Asn Gly Phe Lys Val Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Ile 85 90 95 Pro Gln Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Ser 100 105 110 Asp Val Val Arg Thr Val Gln Pro Leu Met Lys Asp Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Val Gly Glu Gln Ile Arg 130 135 140 Lys Asp Ile 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720 ggtaagtctg ctttcaatga agagaatgaa cattaccttg gtatctacga tggcaaaatc 780 gcaaaggaaa atgtgagaga gtacgtcgac aatgctgatg tcatattgaa cataggtgcc 840 aaactgactg attctgctac agctggattt tcctacaagt tcgatacaaa caacataatc 900 tacattaacc ataatgactt caaagctgaa gatgtgattt ctgataatgt ttcactgatt 960 gatcttgtga atggcctgaa ttctattgac tatagaaatg aaacacacta cccatcttat 1020 caaagatctg atatgaaata cgaattgaat gacgcaccac ttacacaatc taactatttc 1080 aaaatgatga acgcttttct agaaaaagat gacatcctac tagctgaaca aggtacatcc 1140 tttttcggcg catatgactt atccctatac aagggaaatc agtttatcgg tcagccttta 1200 tgggggtcaa tagggtatac ttttccatct ttactaggaa gtcaactagc agacatgcat 1260 aggagaaaca ttttgcttat aggcgatggt agtttacaac ttactgttca agccctaagt 1320 acaatgatta gaaaggatat caaaccaatc attttcgtta tcaataacga cggttacacc 1380 gtcgaaagac ttatccacgg catggaagag ccatacaatg atatccaaat gtggaactac 1440 aagcaattgc cagaagtatt tggtggaaaa gatactgtaa aagttcatga tgctaaaacc 1500 tccaacgaac tgaaaactgt aatggattct gttaaagcag acaaagatca catgcatttc 1560 attgaagtgc atatggcagt agaggacgcc ccaaagaagt tgattgatat agctaaagcc 1620 tttagtgatg ctaacaagta a 1641 <210> 6 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Listeria grayi, 2-ketoisovalerate decarboxylase <400> 6 atgtacaccg tcggccaata cttagtagac cgcttagaag agatcggcat cgataaggtt 60 tttggtgtcc cgggtgacta caacctgacc tttttggact acatccagaa ccacgaaggt 120 ctgagctggc aaggtaatac gaatgaactg aatgccgcgt acgcagctga tggctatgct 180 cgtgaacgcg gtgttagcgc tttggtcacg accttcggcg ttggtgagct gtccgcaatc 240 aatggcaccg caggtagctt cgcggagcaa gttccggtga ttcatatcgt gggcagcccg 300 accatgaatg ttcagagcaa caagaaactg gttcatcaca gcctgggtat gggcaacttt 360 cacaacttca gcgagatggc gaaagaagtc accgccgcaa ccacgatgct gacggaagag 420 aatgcggcgt cggagattga tcgtgttctg gaaaccgccc tgctggagaa acgcccagtg 480 tacatcaatc tgccgatcga cattgctcac aaggcgatcg tcaagccggc gaaagccctg 540 caaaccgaga agagctctgg cgagcgtgag gcacaactgg cggagatcat tctgagccat 600 ctggagaagg ctgcacagcc gattgtgatt gcgggtcacg agatcgcgcg cttccagatc 660 cgtgagcgtt tcgagaattg gattaatcaa acgaaactgc cggtgaccaa tctggcctac 720 ggcaagggta gcttcaacga agaaaacgag catttcattg gtacctatta tcctgcattt 780 agcgataaga acgtgctgga ctacgtggat aactccgact ttgtcctgca ctttggtggt 840 aaaatcattg ataacagcac ctccagcttc tcccaaggct tcaaaaccga gaacaccctg 900 actgcggcga acgatatcat tatgctgccg gacggtagca cgtattctgg tattagcctg 960 aatggcctgc tggccgagct ggaaaaactg aatttcacgt ttgccgacac cgcagcaaag 1020 caggcggagt tggcggtgtt tgagccgcag gctgaaaccc cgttgaaaca ggaccgtttt 1080 caccaggcgg tgatgaattt tctgcaagct gacgatgtcc tggttacgga acagggcacc 1140 tcttcttttg gcttgatgct ggcgcctctg aaaaagggta tgaacttgat ctcgcaaacg 1200 ctgtggggta gcattggtta cacgttgccg gcgatgattg gtagccaaat tgcggcaccg 1260 gagcgtcgtc atatcctgag cattggtgat ggtagctttc agctgactgc gcaggaaatg 1320 agcaccattt tccgtgagaa actgacccca gtcatcttca tcattaacaa tgatggctat 1380 accgttgagc gtgcgatcca tggcgaagat gaaagctata acgacattcc gacgtggaac 1440 ttgcaactgg tggcggaaac cttcggtggt gacgccgaaa ccgtcgacac tcacaatgtg 1500 ttcacggaga ctgatttcgc 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dehydrogenase <400> 8 Met Lys Ala Leu Val Tyr His Gly Asp His Lys Ile Ser Leu Glu Asp 1 5 10 15 Lys Pro Lys Pro Thr Leu Gln Lys Pro Thr Asp Val Val Val Arg Val 20 25 30 Leu Lys Thr Thr Ile Cys Gly Thr Asp Leu Gly Ile Tyr Lys Gly Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Val Ala Asp Gly Arg Ile Leu Gly His Glu Gly Val Gly 50 55 60 Val Ile Glu Glu Val Gly Glu Ser Val Thr Gln Phe Lys Lys Gly Asp 65 70 75 80 Lys Val Leu Ile Ser Cys Val Thr Ser Cys Gly Ser Cys Asp Tyr Cys 85 90 95 Lys Lys Gln Leu Tyr Ser His Cys Arg Asp Gly Gly Trp Ile Leu Gly 100 105 110 Tyr Met Ile Asp Gly Val Gln Ala Glu Tyr Val Arg Ile Pro His Ala 115 120 125 Asp Asn Ser Leu Tyr Lys Ile Pro Gln Thr Ile Asp Asp Glu Ile Ala 130 135 140 Val Leu Leu Ser Asp Ile Leu Pro Thr Gly His Glu Ile Gly Val Gln 145 150 155 160 Tyr Gly Asn Val Gln Pro Gly Asp Ala Val Ala Ile Val Gly Ala Gly 165 170 175 Pro Val Gly Met Ser Val Leu Leu Thr Ala Gln Phe Tyr Ser Pro Ser 180 185 190 Thr Ile Ile Val Ile Asp Met Asp Glu Asn Arg Leu Gln Leu Ala Lys 195 200 205 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Gly Val Leu Glu Thr Thr Phe Arg Thr Glu 180 185 190 Thr Glu Thr Asp Leu Phe Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Val 195 200 205 Cys Ala Leu Met Gln Ala Gly Phe Glu Thr Leu Val Glu Ala Gly Tyr 210 215 220 Asp Pro Arg Asn Ala Tyr Phe Glu Cys Ile His Glu Met Lys Leu Ile 225 230 235 240 Val Asp Leu Ile Tyr Gln Ser Gly Phe Ser Gly Met Arg Tyr Ser Ile 245 250 255 Ser Asn Thr Ala Glu Tyr Gly Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Lys Ile Ile 260 265 270 Thr Glu Asp Thr Lys Lys Ala Met Lys Lys Ile Leu Ser Asp Ile Gln 275 280 285 Asp Gly Thr Phe Ala Lys Asp Phe Leu Val Asp Met Ser Asp Ala Gly 290 295 300 Ser Gln Val His Phe Lys Ala Met Arg Lys Leu Ala Ser Glu His Pro 305 310 315 320 Ala Glu Val Val Gly Glu Glu Ile Arg Ser Leu Tyr Ser Trp Ser Asp 325 330 335 Glu Asp Lys Leu Ile Asn Asn 340 <210> 134 <211> 571 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> DHAD variant L2V4 <400> 134 Met Thr Asp Lys Lys Thr Leu Lys Asp Leu Arg Asn Arg Ser Ser Val 1 5 10 15 Tyr Asp Ser Met Val Lys Ser Pro Asn Arg Ala Met Leu Arg Ala Thr 20 25 30 Gly Met Gln Asp Glu Asp Phe Glu Lys Pro Ile Val Gly Val Ile Ser 35 40 45 Thr Trp Ala Glu Asn Thr Pro Cys Asn Ile His Leu His Asp Phe Gly 50 55 60 Lys Leu Ala Lys Val Gly Val Lys Glu Ala Gly Ala Trp Pro Val Gln 65 70 75 80 Phe Gly Thr Ile Thr Val Ser Asp Gly Ile Ala Met Gly Thr Gln Gly 85 90 95 Met Arg Phe Ser Leu Thr Ser Arg Asp Ile Ile Ala Asp Ser Ile Glu 100 105 110 Ala Ala Met Gly Gly His Asn Ala Asp Ala Phe Val Ala Ile Gly Gly 115 120 125 Cys Asp Lys Asn Met Pro Gly Ser Val Ile Ala Met Ala Asn Met Asp 130 135 140 Ile Pro Ala Ile Phe Ala Tyr Gly Gly Thr Ile Ala Pro Gly Asn Leu 145 150 155 160 Asp Gly Lys Asp Ile Asp Leu Val Ser Val Phe Glu Gly Val Gly His 165 170 175 Trp Asn His Gly Asp Met Thr Lys Glu Glu Val Lys Ala Leu Glu Cys 180 185 190 Asn Ala Cys Pro Gly Pro Gly Gly Cys Gly Gly Met Tyr Thr Ala Asn 195 200 205 Thr Met Ala Thr Ala Ile Glu Val Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Ser 210 215 220 Ser Ser His Pro Ala Glu Ser Ala Glu Lys Lys Ala Asp Ile Glu Glu 225 230 235 240 Ala Gly Arg Ala Val Val Lys Met Leu Glu Met Gly Leu Lys Pro Ser 245 250 255 Asp Ile Leu Thr Arg Glu Ala Phe Glu Asp Ala Ile Thr Val Thr Met 260 265 270 Ala Leu Gly Gly Ser Thr Asn Ser Thr Leu His Leu Leu Ala Ile Ala 275 280 285 His Ala Ala Asn Val Glu Leu Thr Leu Asp Asp Phe Asn Thr Phe Gln 290 295 300 Glu Lys Val Pro His Leu Ala Asp Leu Lys Pro Ser Gly Gln Tyr Val 305 310 315 320 Phe Gln Asp Leu Tyr Lys Val Gly Gly Val Pro Ala Val Met Lys Tyr 325 330 335 Leu Leu Lys Asn Gly Phe Leu His Gly Asp Arg Ile Thr Cys Thr Gly 340 345 350 Lys Thr Val Ala Glu Asn Leu Lys Ala Phe Asp Asp Leu Thr Pro Gly 355 360 365 Gln Lys Val Ile Met Pro Leu Glu Asn Pro Lys Arg Glu Asp Gly Pro 370 375 380 Val Ile Ile Leu His Gly Asn Leu Ala Pro Asp Gly Ala Val Ala Lys 385 390 395 400 Val Ser Gly Val Lys Val Arg Arg His Val Gly Pro Ala Lys Val Phe 405 410 415 Asn Ser Glu Glu Glu Ala Ile Glu Ala Val Leu Asn Asp Asp Ile Val 420 425 430 Asp Gly Asp Val Val Val Val Arg Phe Val Gly Pro Lys Gly Gly Pro 435 440 445 Gly Met Pro Glu Met Leu Ser Leu Ser Ser Met Ile Val Gly Lys Gly 450 455 460 Gln Gly Glu Lys Val Ala Leu Leu Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly 465 470 475 480 Thr Tyr Gly Leu Val Val Gly His Ile Ala Pro Glu Ala Gln Asp Gly 485 490 495 Gly Pro Ile Ala Tyr Leu Gln Thr Gly Asp Ile Val Thr Ile Asp Gln 500 505 510 Asp Thr Lys Glu Leu His Phe Asp Ile Ser Asp Glu Glu Leu Lys His 515 520 525 Arg Gln Glu Thr Ile Glu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Arg Gly Ile Leu 530 535 540 Gly Lys Tyr Ala His Ile Val Ser Ser Ala Ser Arg Gly Ala Val Thr 545 550 555 560 Asp Phe Trp Lys Pro Glu Glu Thr Gly Lys Lys 565 570

Claims (32)

  1. 부탄올의 제조 방법으로서:
    a)
    i) 조작된 (engineered) 부탄올 생합성 경로
    를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
    b) a)의 숙주 세포를:
    i) 발효가능한 탄소 기질; 및
    ii) 숙주 세포의 개선된 성장 또는 개선된 부탄올 생산 중 하나 이상에 대해 충분한 양의 아세테이트
    를 포함하는 발효 배지와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    여기에서 아세테이트는 발효 배지에 첨가된 것이고,
    상기 재조합 숙주 세포는 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성을 감소 또는 제거하도록 조작되었으며;
    이에 의하여 부탄올은 조작된 부탄올 생합성 경로를 통하여 발효가능한 탄소 기질로부터 직접 생산되는 것인 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 피루베이트 탈카르복실화 효소를 암호화하는 하나 이상의 내생의 유전자가 비활성화된 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 내생의 유전자는 PDC1, PDC5, PDC6 또는 이의 조합인 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 그의 성장을 위해, 외생의 2탄소 기질 보충물에 대해 감소 또는 제거된 필요를 포함하도록 조작되거나 또는 발달된 (evolved) 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 포스포케톨라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 및 포스포트랜스아세틸라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 숙주 세포는 알데하이드 탈수소효소 활성을 감소 또는 제거하도록 조작된 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 알데하이드 탈수소효소를 암호화하는 내생의 유전자는 비활성화된 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 내생의 유전자는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6 또는 이의 조합인 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 부탄올 생산이 개선된 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 부티르산 생산이 감소된 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 부탄올 수율 또는 유효 적정농도 (effective titer)가 증가된 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 부탄올은 아이소부탄올 또는 1-부탄올, 또는 이의 조합인 방법.
  13. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 부탄올 생합성 경로는 하기 기질에서 생성물로의 전환을 포함하는 방법으로서:
    a) 피루베이트에서 아세토락테이트 (경로 단계 a);
    b) a)로부터의 아세토락테이트에서 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트 (경로 단계 b);
    c) b)로부터의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트에서 α-케토아이소발레레이트 (경로 단계 c);
    d) c)로부터의 α-케토아이소발레레이트에서 아이소부티르알데하이드 (경로 단계 d); 및
    e) d)로부터의 아이소부티르알데하이드에서 아이소부탄올 (경로 단계 e);
    여기에서
    i) 단계 a)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세토락테이트 신타제 (synthase) 효소에 의하여 수행되고;
    ii) 단계 b)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세토하이드록시산 이성질화환원 효소 (isomeroreductase enzyme)에 의하여 수행되고;
    iii) 단계 c)의 기질에서 생성물로의 전환은 다이하드록시산 탈수효소에 의하여 수행되고;
    iv) 단계 d)의 기질에서 생성물로의 전환은 α-케토산 탈카르복실화효소에 의하여 수행되고;
    v) 단계 e)의 기질에서 생성물로의 전환은 알코올 탈수소효소에 의하여 수행되고;
    이에 의하여 아이소부탄올이 조작된 부탄올 생합성 경로를 통해 피루베이트로부터 직접 생산되는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 부탄올 생합성 경로는 하기 기질에서 생성물로의 전환을 포함하는 방법으로서:
    a) 피루베이트에서 아세토락테이트 (경로 단계 a);
    b) a)로부터의 아세토락테이트에서 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트 (경로 단계 b);
    c) b)로부터의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트에서 α-케토아이소발레레이트 (경로 단계 c);
    d) c)로부터의 α-케토아이소발레레이트에서 아이소부티릴-CoA (경로 단계 f);
    e) d)로부터의 아이소부티릴-CoA에서 아이소부티르알데하이드 (경로 단계 g); 및
    f) e)로부터의 아이소부티르알데하이드에서 아이소부탄올 (경로 단계 e);
    여기에서
    i) 단계 a)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세토락테이트 신타제 효소에 의하여 수행되고;
    ii) 단계 b)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세토하이드록시산 이성질화환원 효소에 의하여 수행되고;
    iii) 단계 c)의 기질에서 생성물로의 전환은 다이하드록시산 탈수효소에 의하여 수행되고;
    iv) 단계 d)의 기질에서 생성물로의 전환은 분지쇄 케토산 탈수소효소에 의하여 수행되고;
    v) 단계 e)의 기질에서 생성물로의 전환은 아세틸화 알데하이드 탈수소효소에 의하여 수행되고;
    vi) 단계 f)의 기질에서 생성물로의 전환은 알코올 탈수소효소에 의하여 수행되고;
    이에 의하여 아이소부탄올이 조작된 생합성 경로를 통해 피루베이트로부터 직접 생산되는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 숙주 세포는 세균 또는 효모인 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 재조합 숙주 세포는 효모이고, 여기에서 조작된 부탄올 생합성 경로 중 기질에서 생성물로의 전환을 수행하는 둘 이상의 효소가 미토콘드리아에 국지화되지 않은 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배지는 부탄올을 더 포함하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 숙주 세포와 발효 배지의 접촉의 적어도 일부는 혐기성 또는 미세호기성 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 숙주 세포와 발효 배지의 접촉은 배치 (batch) 또는 연속 발효로서 수행되는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, c) 부탄올을 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 회수는 증류, 액체-액체 추출, 흡착, 경사 분리, 투과증발 또는 이의 조합에 의한 것인 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 방법으로부터 생산된 부탄올.
  23. a)
    i) 조작된 부탄올 생합성 경로
    를 포함하는 재조합 숙주 세포; 및
    b)
    i) 발효가능한 탄소 기질; 및
    ii) a)의 숙주 세포의 개선된 성장 또는 개선된 부탄올 생산에 대해 충분한 양의 아세테이트
    를 포함하는 발효 배지를 포함하는 조성물로,
    여기에서 아세테이트는 발효 배지에 첨가된 것이고,
    상기 재조합 숙주 세포는 피루베이트 탈카르복실화효소 (PDC) 활성, 및 선택적으로 알데하이드 탈수소효소 활성이 감소 또는 제거되도록 조작된 조성물.
  24. 제 23항에 있어서, 피루베이트 탈카르복실화효소를 암호화하는 하나 이상의 내생의 유전자가 비활성화된 조성물.
  25. 제 23항에 있어서, 알데하이드 탈수소효소를 암호화하는 내생의 유전자가 비활성화된 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 내생의 유전자는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6 또는 이의 조합인 조성물.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 내생의 유전자는 PDC1, PDC5, PDC6 또는 이의 조합인 조성물.
  28. 제 23항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 숙주 세포는 세균 또는 효모인 조성물.
  29. 제 23항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배지는 부탄올을 더 포함하는 조성물.
  30. 제 29항에 있어서, 부탄올은 아이소부탄올 또는 1-부탄올, 또는 이의 조합인 조성물.
  31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 발효 배지는 부탄올을 약 0.01mM 내지 약 500mM의 범위로 포함하는 조성물.
  32. 제 23항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배지는 아세테이트를 약 0.1mM 내지 약 50mM의 범위로 포함하는 조성물.
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