MX2011003313A - Actividad enzimatica de fe-s heterologa aumentada en levadura. - Google Patents

Actividad enzimatica de fe-s heterologa aumentada en levadura.

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Abstract

Se modificaron genéticamente cepas de levadura que tienen actividad aumentada de proteínas heterólogas que requieren la unión de un agrupamiento de Fe-S para su actividad. Las cepas de levadura tienen actividad reducida de una proteína de Fe-S endógena. Se aumentaron las actividades de las dihidroxi-ácido deshidratasas fúngicas o vegetales heterólogas y de la propanodiol deshidratasa reactivasa para una producción aumentada de productos elaborados mediante el uso de rutas biosintéticas que incluyen estas enzimas, tales como valina, isoleucina, leucina, ácido pantoténico (vitamina B5), isobutanol, 2-butanona y 2-butanol.

Description

ACTIVIDAD ENZI ATICA DE Fe-S HETEROLOGA AUMENTADA EN LEVADURA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el campo de la microbiología industrial y con la expresión de proteínas que requieren un agrupamiento de hierro-azufre para la actividad. Más específicamente, la expresión de la actividad de la proteína de Fe-S heteróloga en células de levadura se mejora a través de la desactivación del gen hospedero específico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La ingeniería de levadura para la producción fermentativa de productos comerciales es un campo activo y en crecimiento. Las rutas enzimáticas desarrolladas para la biosíntesis de algunos productos incluyen enzimas que requieren la unión de un agrupamiento de hierro-azufre (Fe-S) para la actividad. Un ejemplo es la dihidroxi-ácido deshidratasa (DHAD) . La DHAD es parte de las rutas biosintéticas de origen natural que producen valina, isoleucina, leucina y ácido pantoténico (vitamina B5) . La expresión aumentada de la actividad de la DHAD se prefiere para la producción microbial aumentada de aminoácidos de cadena ramificada o de ácido pantoténico. Además, la conversión catalizada por DHAD de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato es una etapa común en las múltiples rutas Ref.: 217942 biosintéticas de isobutanol que se describen en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente núm. 20070092957 Al. En la misma publicación se describe la ingeniería de microorganismos recombinantes para producir isobutanol, el cual es útil como aditivo de combustible y cuya disponibilidad podría reducir la demanda de combustibles petroquímicos .
La diol deshidratasa proporciona una actividad enzimática en una ruta biosintética para la producción de 2-butanona y 2-butanol que se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente núm. 2007-0292927A1. En la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20090155870 se describe una butanodiol deshidratasa que es útil para la expresión en esta ruta debido a su independencia de la coenzima B-12. Una diol deshidratasa reactivasa, que es una proteína de agrupamiento de Fe-S requerida para la actividad de la butanodiol deshidratasa independiente de B-12, también se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20090155870. La 2-butanona, también denominada metiletilcetona, (MEK, por sus siglas en inglés) es un solvente, extractor y activador de reacciones oxidativas usado ampliamente, así como un sustrato para la síntesis química de 2-butanol. El 2-butanol es útil como un aditivo de combustible, cuya disponibilidad podría reducir la demanda de combustibles petroquímicos .
Para la producción mejorada de compuestos sintetizados en rutas que incluyen una enzima que contiene un agrupamiento de Fe-S, es deseable proporcionar una célula hospedera capaz de expresar altos niveles de esta actividad enzimática en el hospedero de producción de interés. Si bien varias bacterias y levaduras relevantes corriereialmente pueden expresar actividad de proteínas que contienen agrupamientos de Fe-S, esta actividad se encuentra a niveles muy por debajo de los que resulta útil comercialmente para aumentar las rutas biosintéticas introducidas. En consecuencia, existe una necesidad de descubrir células hospederas capaces de expresar actividad de proteínas que contienen agrupamientos de Fe-S a niveles lo suficientemente altos para aumentar las rutas introducidas que tienen requerimientos de Fe-S. La obtención de una expresión funcional alta de enzimas que contienen agrupamientos de Fe-S heterólogas es problemática debido al requerimiento del agrupamiento de Fe-S, el cual involucra disponibilidad y carga adecuada del agrupamiento en la apoproteína .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente invención se proporcionan células hospederas de levadura recombinante que comprenden al menos una proteína de agrupamiento de Fe-S heteróloga, en donde el hospedero de levadura ha reducido la expresión de al menos una proteína endógena de agrupamiento de Fe-S. La célula de levadura recombinante podría cultivarse bajo condiciones adecuadas para la producción de productos que incluyen isobutanol, 2-butanol y 2-butanona.
En un aspecto, la célula de levadura recombinante comprende una interrupción en el gen que codifica la al menos una proteína endógena de agrupamiento de Fe-S.
En otro aspecto, la proteína endógena de agrupamiento de Fe-S se selecciona del grupo que consiste de dihidroxi-ácído deshidratasa, isopropilmalato deshidratasa, sulfito reductasa, glutamato deshidrogenasa, biotina sintasa, aconitasa, homoaconitasa, lipoato sintasa, maduración de ferredoxina, NADH ubiquinona oxidorreductasa, succinato deshidrogenasa, ubiquinol-citocromo C reductasa, proteína de la familia abe Rlil, NTPasa Nbp35 y proteína similar a la hidrogenasa.
En otro aspecto, la levadura se selecciona del grupo que consiste de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia y Pichia.
En otro aspecto, la proteína de Fe-S endógena se expresa en la mitocondria y, en otra modalidad, la proteína de agrupamiento de Fe-S endógena tienen una actividad seleccionada del grupo que consiste de: actividad dihidroxi-ácido deshidratasa e isopropilmalato deshidratasa.
En otro aspecto, la célula hospedera es Saccharomyces que expresa un gen que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de iden . : 114.
En algunas modalidades la proteína de agrupamiento de Fe-S heteróloga se selecciona del grupo que consiste de dihidroxi -ácido deshidratasas de 2Fe-2S fúngicas y dihidroxi-ácido deshidratasas de 2Fe-2S vegetales. En una modalidad la dihidroxi-ácido deshidratasa heteróloga de agrupamiento de 2Fe-2S fúngica o vegetal se expresa en el citosol. En una modalidad la dihidroxi-ácido deshidratasa heteróloga de agrupamiento de 2Fe-2S fúngica o vegetal es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el Perfil de H M de la tabla 9 con un valor E de < 10"5, en donde el polipéptido comprende, adicionalmente , las tres cisteínas conservadas que corresponden a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de S reptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident.: 179. En una modalidad la dihidroxi-ácido deshidratasa heteróloga de agrupamiento de 2Fe-2S fúngica o vegetal es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las sec. con núm. de ident.: 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150 y 152. En una modalidad la dihidroxi-ácido deshidratasa heteróloga de agrupamiento de 2Fe-2S fúngica o vegetal es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la sec . con núm . de ident . : 114 mediante el uso del método de alineamiento Clustal W, con los parámetros de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=0.1 y series de Gonnet 250 de matriz de peso para proteínas sobre la longitud total de la secuencia de la proteína.
En otro aspecto se proporciona un método para la conversión de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato ; el método comprende: a) proporcionar (1) una célula hospedera de levadura recombinante que comprende al menos un gen heterólogo que codifica una dihidroxi- ácido deshidratasa de 2Fe-2S, en donde la célula hospedera de levadura recombinante tiene actividad reducida de al menos una proteína endógena de agrupamiento de Fe-S; y (2) una fuente de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato; y b) cultivar el célula hospedera recombinante de (a) con la fuente de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato bajo condiciones en donde la célula hospedera convierte el 2 , 3 -dihidroxiisovalerato en a- cetoisovalerato .
En otro aspecto se proporciona un método para la conversión de 2 , 3 -butanodiol en 2-butanona; el método comprende : a) proporcionar (1) una célula hospedera de levadura recombinante que comprende al menos un gen heterólogo que codifica una propanodiol deshidratasa reactivasa de Fe-S, en donde la célula hospedera de levadura recombinante tiene actividad reducida de al menos una proteína endógena de agrupamiento de Fe-S; y (2) una fuente de 2 , 3 -butanodiol ; y b) cultivar la célula hospedera recombinante de (a) con la fuente de 2 , 3 -butanodiol bajo condiciones en donde la célula hospedera convierte 2 , 3 -butanodiol en 2-butanona.
También se proporciona un método para la producción de isobutanol; el método comprende cultivar una célula de levadura recombinante descrita en la presente invención bajo condiciones en donde se produce isobutanol.
En otras modalidades, la al menos una proteína heteróloga de agrupamiento de Fe-S tiene actividad propanodiol deshidratasa reactivasa de Fe-S. En algunas modalidades la al menos una proteína heteróloga de agrupamiento de Fe-S que tiene actividad propanodiol deshidratasa reactivasa de Fe-S es una propanodiol deshidratasa reactivasa con una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec . con núm . de ident . : 44, mediante el uso del método de alineamiento Clustal W, con los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=0.1 y series de Gonnet 250 de matriz de peso para proteínas sobre la longitud total de la secuencia de la proteína.
En algunas modalidades, la célula produce 2-butanol y en algunas modalidades, la célula produce 2-butanona. En algunas modalidades, la célula comprende una ruta biosintética de 2-butanol y en algunas modalidades, la célula comprende una ruta biosintética de 2-butanona.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se comprenderá con mayor facilidad a partir de la siguiente descripción detallada, las figuras y descripciones de secuencias acompañantes, las cuales forman parte de esta solicitud.
La Figura 1 muestras las rutas biosintéticas para la producción de isobutanol.
La Figura 2 muestra una ruta biosintética para la producción de 2-butanona y 2 butanol .
BREVE DESCRIPCION DE LAS TABLAS La Tabla 9 es una tabla del Perfil de HMM para dihidroxi-ácido deshidratasas basadas en enzimas con función probada preparada como se describe en el Ejemplo 1. La Tabla 9 se presenta en la presente invención de forma electrónica y se incorpora en la presente invención como referencia.
BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS Las siguientes secuencias cumplen con el Título 37 del C.F.R., 1.821-1.825 ("Requisitos para solicitudes de patentes que contienen descripciones de secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos - reglas de las secuencias") según la norma ST. 25 (1998) de la Organización Mundial de Propiedad Intelectual (WIPO, por sus siglas en inglés) y los requisitos para listados de secuencias de la EPO y el PCT (Reglas 5.2 y 49.5 (a-bis), y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones Administrativas) . Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen con las reglas que se describen en el Título 37 del C.F.R., §1.822.
Tabla 1. Proteína de Fe-S objetivo de desactivación, que codifica genes Organismo y gen Sec . con núm. Sec . con de ident . : núm . de Ácido ident . : nucleico Péptido Saccharomyces cerevisiae LEUl 1 2 Schizosaccharomyces pombe LEUl 3 4 Candida galbrata CBS 138 LEUl 5 6 Candida albicans SC 5314 LEUl 7 8 Kluyveromyces lactis LEUl 9 10 Yarrowia lipolytica LEUl 11 12 Pichia stipitis LEUl 13 14 Saccharomyces cerevisiae YJ 789 ILV3 111 112 Schizosaccharomyces pombe ILV3 93 94 Candida galbrata CBS 138 ILV3 107 108 Candida albicans SC5314 ILV3 101 102 Kluyveromyces lactis ILV3 113 114 Yarrowia lipolytica ILV3 105 106 Pichia stipitis CBS 6054 ILV3 103 104 Saccharomyces cerevisiae ACOl 153 154 Schizosaccharomyces pombe 155 156 (cromosoma II) ACOl Schizosaccharomyces pombe 157 158 (cromosoma I) ACOl Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140 ACOl 159 160 Candida albicans SC5314 ACOl 161 162 Yarrowia lipolytica CLIB122 ACOl 163 164 Pichia stipitis CBS 6054 ACOl 165 166 Tabla 2. DHAD de 2Fe-2S fúngica y vegetal en adición a las de la Tabla 1 Sec . con núm . Sec . con de ident . : núm. de Ácido ident . : Descripción nucleico Péptido Chlamydomonas reinhardtii 45 46 Ostreococcus lucimarinus CCE9901 47 48 Vitis vinifera (Producto de proteína 49 50 sin nombre: CA071581.1) Vitis vinifera (CA 67446.1) 51 52 Arabidopsis thaliana 53 54 Oryza sativa (grupo cultivar indica) 55 56 Physcomitrella patens subesp. patens 57 58 Chaetomium globosum CBS 148.51 59 60 Neurospora crassa OR74A 61 62 Magnaporthe grísea 70-15 63 64 Gibberella zeae PH-1 65 66 Aspergíllus niger 67 68 Sec. con núm. Sec . con de ident . : núm. de Ácido ident . : Descripción nucleico Péptido Aspergillus clavatus NRRL 1 127 128 Neosartorya fischeri NRRL 181 129 130 (Putativo) Aspergillus oryzae 131 132 Aspergillus niger (Anl8g04160) 133 134 Aspergillus terreus NIH2624 135 136 Coccidioides immitis RS (CIMG 04591) 137 138 Paracoccidioides brasiliensis 139 140 Phaeosphaeria nodorum SN15 141 142 Gibberella zeae PH-1 143 144 Neurospora crassa OR74A 145 146 Coprinopsis cinérea okayama 7#130 147 148 Lacearía bicolor S238N-H82 149 150 Ustilago mayáis 521 151 152 Tabla 3. Genes de expresión Sec . con núm . Sec . con de ident . : núm. de Ácido ident . : Descripción nucleico Péptido Roseburia inulinivorans (RdhtA) 15 43 Roseburia inulinivorans (RdhtB) 16 44 Bacillus subtilis (alsS) 27 28 Vijbrio cholerae (KARI) 35 36 Pseudomonas aeruginosa PA01 (KARI) 37 38 Pseudomonas fluorescens PF5 (KARI) 39 40 Sec . con núm . Sec . con de ident . : núm . de Ácido ident . : Descripción nucleico Péptido Achromobacter xylosoxidans (sadB) 41 42 Glicerol deshidratasa independiente 190 191 de B12 de Clostridium butyricum Butanodiol deshidratasa reactivasa 192 193 independiente de B-12 de Clostridium butyricum La sec. con núm. de ident. : 17 es una secuencia de rdhtAB sintética.
Las sec. con núm. de ident.: 18-21 y 30-33 son cebadores para análisis de secuenciación, PCR o clonación usados como se describen en los ejemplos de la presente invención.
La sec. con núm. de ident.: 22 es una secuencia terminadora dual .
La sec. con núm. de ident.: 23 es el terminador ADH de Saccharomyces cerevisiae .
La sec. con núm. de ident. : 24 es el terminador CYC1 de Saccharomyces cerevisiae .
La sec. con núm. de ident.: 25 es el promotor de FBA de Saccharomyces cerevisiae .
La sec. con núm. de ident. : 26 es el promotor de GPM de Saccharomyces cerevisiae .
La sec. con núm. de ident.: 29 es el vector pNY13.
La sec. con nútti. de ident.: 34 es el promotor de CUP1 de Saccharomyces cerevisiae .
La sec. con núm. de ident.: 173 es la región codificante optimizada por codones para ILV3 DHAD de Kluyveromyces lactis.
Tabla 4. DHAD verificadas funcionalmente usadas para Perfil de HM DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente invención se describe el descubrimiento de que las proteínas que contienen Fe-S introducidas en células hospederas de levadura tienen altos niveles de actividad cuando se inhibe o interrumpe la expresión de proteínas endógenas que contienen Fe-S. La presente invención se relaciona con células de levadura recombinante desarrolladas para proporcionar la expresión de al menos una proteína heteróloga que es una proteína de agrupamiento de Fe-S y desarrolladas para la expresión reducida de al menos una proteína endógena de agrupamiento de Fe-S. En estas células se mejora la actividad de la proteína heteróloga de agrupamiento de Fe-S, de manera que hay una producción mejorada de un producto elaborado en una ruta biosintética que incluye la actividad enzimática. Los ejemplos de los productos útiles comercialmente de una ruta que incluye una proteína de Fe-S incluyen valina, isoleucina, ácido pantoténico, isobutanol, 2-butanona y 2-butanol.
Se usarán las siguientes abreviaturas y definiciones para la interpretación de la especificación y de las reivindicaciones.
Como se usa en la presente descripción, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene", o cualquier otra variante de estos, pretenden abarcar una inclusión no excluyente. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, método, artículo o aparato que comprende una lista de elementos no se limita necesariamente sólo a esos elementos, sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a tal composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente lo contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios: A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual) , A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual) , y tanto A como B son verdaderos (o actuales) .
Además, los artículos indefinidos "un(a)" y "unos (as)" que preceden un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias (es decir, incidencias) del elemento o componente. Por consiguiente, "un(a)" o "unos (as) " deben interpretarse para' incluir uno o por lo menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente también incluye el plural, a menos que el número obviamente indique que es singular.
El término "invención" o "presente invención" , tal como se usa en la presente descripción, es un término no limitante y no está previsto para referirse a cualquier modalidad individual de la invención en particular, sino que abarca todas las modalidades posibles según se describe en la descripción y las reivindicaciones.
Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" usado para modificar la cantidad empleada de un ingrediente o reactivo de la invención se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede suceder, por ejemplo, en los procedimientos de manejo de líquidos y medición usados para elaborar concentrados o usar soluciones en el mundo real; por errores involuntarios en los procedimientos; por diferencias en la fabricación, fuente o pureza de los ingredientes empleados para elaborar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" abarca, además, cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial específica. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente" , las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades. En una modalidad el término "aproximadamente" significa una cantidad dentro del 10 % del valor numérico reportado, preferentemente, dentro del 5 % del valor numérico reportado El término "proteína de agrupamiento de Fe-S" se refiere a una proteína que se une a un agrupamiento de hierro-azufre y que requiere la unión del agrupamiento para su actividad.
El término "DHAD de 2Fe-2S" se refiere a enzimas DHAD que requieren un agrupamiento de [2Fe-2S]2+ unido para su actividad .
El término "propanodiol deshidratasa reactivasa de Fe-S" se refiere a las propanodiol deshidratasa reactivasas que requieren un agrupamiento de Fe-S unido para la actividad.
El término "ruta biosintética del isobutanol" se refiere a una ruta enzimática para producir isobutanol a partir de piruvato .
El término "ruta biosintética del 2-butanol" se refiere a la ruta enzimática para producir 2-butanol a partir de piruvato.
El término "ruta biosintética del 2-butanona" se refiere a la ruta enzimática para producir 2-butanona a partir de piruvato .
El término "dihidroxi-ácido deshidratasa" , también abreviado DHAD, se referirá a una enzima que convierte 2,3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato .
El término "butanodiol deshidratasa" , también conocido como "diol deshidratasa" o "propanodiol deshidratasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de 2,3-butanodiol en 2-butanona. Las butanodiol deshidratasas que no usan el cofactor adenosil cobalamin (también conocido como coenzima B12 o vitamina B12; aunque vitamina B12 también podría referirse a otras formas de cobalamin que no son la coenzima B12) son diol deshidratasas independientes de la coenzima B12 que requieren la asociación con una diol deshidratasa reactivasa que es una proteína de agrupamiento de Fe-S. Los ejemplos de diol deshidratasas independientes de B12 incluyen aquellos de Clostridium glycolicum (Hartmanis et al. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 245:144-152), Clostridium butyricum (proteína: sec. con núm. de ident . : 191; región codificante: sec. con núm. de ident.: 190; O'Brien et al. (2004) Biochemistry 43:4635-4645) y Roseburia inulinivorans (codificación: sec. con núm. de ident.: 15; proteína: sec. con núm. de ident.: 43; descritas en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente núm. 20090155870.
El término "propanodiol deshidratasa reactivasa" , también conocido como "diol dehidratasa reactivasa" o "butanodiol deshidratasa reactivasa" se refiere a un factor reactivante para diol deshidratasa, una enzima la cual sufre desactivación suicida durante la catálisis. Las diol deshidratasa reactivasas asociadas con las diol deshidratasas independientes de la coenzima B12 podrían ser proteínas de agrupamiento de Fe-S. Los ejemplos incluyen aquellas de Clostridiu glycolicu (Hartmanis et al. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 245:144-152), Clostridium butyricum (proteína: sec. con núm. de ident.: 193; región codificante: sec. con núm. de ident.: 192; O'Brien et al. (2004) Biochemistry 43:4635-4645) y Roseburia inulinivorans (codificación: sec. con núm. de ident.: 16; proteína: sec. con núm. de ident.: 44; descrita en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 20090155870) .
El término "expresión reducida" , tal como se aplica a la expresión de una proteína en un hospedero de célula, incluirá aquellas situaciones en donde la actividad de la proteína se reduce en comparación con una forma silvestre (como con tecnología no codificante, por ejemplo) o prácticamente se elimina, por ejemplo, como con interrupción, deleción o desactivación génica.
El término "sustrato de carbono" o "sustrato fermentable de carbono" se refiere a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por organismos hospederos de la presente invención y, específicamente, a fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste de monosacáridos, oligosacáridos , polisacáridos y sustratos de un solo carbono, o mezclas de estos.
El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de expresarse como una proteína específica que incluye, opcionalmente , las secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificantes) y que siguen (secuencias 3' no codificantes) a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no sea nativo, que comprenda secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentren juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de distintos orígenes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan del mismo origen, pero se disponen de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un "gen extraño" o "gen heterólogo" se refiere a un gen que, normalmente, no se encuentra en el organismo hospedero, pero que se introduce en el organismo hospedero mediante transferencia génica. El término "gen heterólogo" incluye una región codificante nativa, o parte de ella, que se vuelve a introducir en el organismo fuente en una forma distinta a la del gen nativo correspondiente. Por ejemplo, un gen heterólogo podría incluir una región codificante nativa que es una porción de un gen quimérico que incluye regiones reguladoras no nativas, que se vuelve a introducir en el hospedero nativo. Además, un gen extraño puede comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma por medio de un procedimiento de transformación.
Como se usa en la presente descripción, el término "región codificante" se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias reguladoras adecuadas" se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas corriente arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro, o corriente abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante, y la cual influye en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento del ARN, sitio de unión a efectores y estructura de tallo-lazo.
El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. En general, una secuencia de codificación se localiza en dirección 3 ' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores distintos que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos sintéticos de ADN. Los experimentados en la materia comprenderán que los distintos promotores pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos de células diferentes, o en distintas etapas del desarrollo, o en respuesta a condiciones ambientales o fisiológicas diferentes. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayor parte de los tipos de células la mayor parte de las veces se denominan, comúnmente, "promotores constitutivos" . También se reconoce que dado que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido totalmente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener actividad promotora idéntica.
El término "operativamente unido" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de manera que la función de una se vea afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias codificantes pueden estar operativamente unidas a secuencias reguladoras en orientación codificante o no codificante.
Como se usa en la presente descripción, el término "expresión" se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN codificante (AR m) o AR no codificante derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. El término también puede referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido.
Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un organismo hospedero, lo que produce una herencia genéticamente estable. Los organismos hospederos que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos "transgénicos" , "recombinantes" o "transformados" .
Los términos "plásmido" y "vector", como se usan en la presente descripción, se refieren a un elemento extracromosómico que con frecuencia presenta genes los cuales no son parte del metabolismo central de la célula y se encuentran, usualmente, en forma de moléculas de ADN circular de doble hebra. Tales elementos podrían ser secuencias que se replican de manera autónoma, secuencias integradoras de genoma, fagos o secuencias de nucleótidos, lineales o circulares, de un ADN o ARN de hebra sencilla o doble, derivados de cualquier fuente, en la cual se han unido varias secuencias de nucleótidos o se han recombinado en una construcción única la cual es capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de ADN para un producto de gen seleccionado junto con la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula.
Como se usa en la presente descripción, el término "degeneración de codones" se refiere a la naturaleza del código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El técnico experimentado conoce perfectamente la "preferencia codónica" exhibida por una célula hospedera específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por ello, cuando se sintetiza un gen para expresión mejorada en una célula hospedera, es conveniente diseñar el gen de manera que su frecuencia de uso de codones se aproxime a la frecuencia preferida de uso de codones de la célula hospedera.
El término "optimizado por codones" , con referencia a genes o regiones codificantes de moléculas de ácido nucleico para transformación de diversos hospederoses, se refiere a la alteración de codones en el gen o regiones codificantes de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso típico de codones del organismo hospederos sin alterar el polipéptido codificado por el ADN.
Como se usa en la presente descripción, las frases "fragmento aislado de ácido nucleico" o "molécula aislada de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN mono o bicatenario que contiene, opcionalmente, bases nucleotídicas sintéticas no naturales o alteradas . Un fragmento aislado de ácido nucleico en la forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.
Un fragmento de ácido nucleico es "hibridable" con otro fragmento de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico o molécula de ARN, cuando una forma monocatenaria del fragmento de ácido nucleico puede aparearse con el otro fragmento de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y potencia iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y de lavado son muy conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J . , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Clonación molecular: A Laboratory Manual, 2°. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989) , particularmente el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 en el mismo (incorporado en la presente, en su totalidad, como referencia) . Las condiciones de temperatura y potencia iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para identificar fragmentos moderadamente similares (tales como secuencias homologas de organismos poco relacionados) con fragmentos muy similares (tales como los genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados) . Los lavados posteriores a la hibridación determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto de condiciones preferidos usa una serie de lavados que comienzan con 6X SSC, 0.5 % SDS a temperatura ambiente durante 15 min, para luego repetirse con 2X SSC, 0.5 % SDS a 45°C durante 30 min, y después repetirse dos veces con 0.2X SSC, 0.5 % SDS a 50 °C durante 30 min. Un conjunto de condiciones de rigurosidad de mayor preferencia usa temperaturas más altas en las que los lavados son idénticos a los mencionados anteriormente, excepto que la temperatura de los dos lavados finales de 30 minutos en 0.2X SSC, 0.5 % SDS se incrementó a 60 °C. Otro conjunto de condiciones altamente rigurosas preferido usa dos lavados finales en 0. IX SSC, 0.1 % SDS a 65°C. Otro conjunto de condiciones rigurosas incluye la hibridación a 0. IX SSC, 0.1 % SDS, 65°C y lavados con 2X SSC, 0.1 % SDS seguidos de 0. IX SSC, 0.1 % SDS, por ej emplo .
La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles las faltas de coincidencias entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables muy conocidas en la materia. A mayor grado de similaridad u homología entre las dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a valores más altos de Tm) de hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, AD : ARN, AD : ADN . Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular Tin (véase Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucléotidos , la posición de las faltas de coincidencias se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8) . En una modalidad la longitud de un ácido nucleico hibridable es de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos. Preferentemente, una longitud mínima de un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 15 nucleótidos; con mayor preferencia, al menos aproximadamente 20 nucleótidos; y con la máxima preferencia la longitud es de al menos aproximadamente 30 nucleótidos . Además, el técnico experimentado reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado podrán regularse según sea necesario de conformidad con factores tales como la longitud de la sonda.
Una "porción sustancial" de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos es aquella porción que comprende una cantidad suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o gen, ya sea por evaluación manual de la secuencia por parte de una persona con experiencia en la materia o por comparación e identificación de secuencias automatizada por computadora mediante el uso de algoritmos, tales como BLAST (Altschul, S. F . , et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)). Generalmente, se necesita una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos para identificar putativamente una secuencia de polipéptidos o de ácidos nucleicos como homologa de una proteina o un gen conocidos. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas de oligonucleótidos específicas para genes que comprenden de 20 a 30 nucleótidos contiguos pueden usarse en métodos dependientes de secuencias para identificación (por ejemplo, hibridación Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in si tu de colonias bacterianas o placas bacteriófagas) de genes. Además, los oligonucleótidos cortos de 12-15 bases pueden usarse como cebadores para la amplificación por PCR con el fin de obtener un fragmento específico de ácido nucleico que comprende los cebadores. Por consiguiente, una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende una cantidad suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La especificación de la presente instruye sobre la secuencia completa de aminoácidos y de nucleótidos que codifican proteínas particulares. El técnico con experiencia, con el beneficio de las secuencias como se reportan en la presente descripción, puede usar ahora todas o una porción sustancial de las secuencias descritas para propósitos conocidos para los experimentados en la materia. Por lo tanto, la invención de la presente comprende las secuencias completas como se reportan en el listado de secuencias anexo, así como las porciones sustanciales de aquellas secuencias, tal como se describió anteriormente.
El término "complementario" se usa para describir la relación entre bases nucleotídicas que son capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria de la timina, y la citosina es complementaria de la guanina.
El término "porcentaje de identidad", tal como se conoce en la materia, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos , según lo determinado al comparar las secuencias. En la materia, "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre las secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, según el caso, según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de estas secuencias. La "identidad" y "similitud" pueden calcularse fácilmente por métodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M . , Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M . , y Griffin, H. G . , Eds . ) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).
Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la mejor coincidencia entre las secuencias sometidas a prueba. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Los cálculos de alineamientos de secuencia y de porcentajes de identidad pueden realizarse con el programa MegAlign™ del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) . El alineamiento múltiple de las secuencias se realiza con el "Método de alineamiento Clustal" , que abarca distintas variedades del algoritmo que incluyen el "Método de alineamiento Clustal V" que corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins , D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) e incluido en el programa MegAlign™ del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para alineaciones múltiples, los valores predeterminados corresponden a PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN10 y PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10. Los parámetros predeterminados para las alineaciones en pares y para el cálculo del porcentaje de identidad de secuencias de proteínas con el método Clustal son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. Para ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después de la alineación de las secuencias con el programa Clustal V es posible obtener un "porcentaje de identidad" al observar la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa. Además, está disponible el "Método de alineamiento Clustal W" que corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)) e incluido en el programa egAlign™ v6.1 del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.). Parámetros predeterminados para alineamiento múltiple (PENALIDAD POR INTERRUPCIÓN--10 , PENALIDAD POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=0.2 , Retardo de las secuencias divergentes (%) =30, Peso de transición del ADN=0.5, Matriz de pesos para proteínas=Series de Gonnet, Matriz de pesos para el ADN=IUB) . Después del alineamiento de las secuencias mediante el uso del programa Clustal , es posible obtener un "porcentaje de identidad" al ver la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa.
Una persona con experiencia en la materia comprenderá muy bien que para identificar polipéptidos a partir de otras especies, en donde los polipéptidos tienen una función o actividad igual o similar, son útiles varios niveles de identidad de secuencia. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidades incluyen, pero no se limitan a: 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %, o cualquier porcentaje entero desde 55 % a. 100 % podría ser útil para describir la presente invención, tal como 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 % , 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 , 83 %, 84 %, 85 %, 86 , 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Los fragmentos de ácido nucleico adecuados no solo tienen las homologías mencionadas anteriormente si no que, típicamente, codifican un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, preferentemente, al menos 100 aminoácidos, con mayor preferencia, al menos 150 aminoácidos, todavía con mayor preferencia, al menos 200 aminoácidos y, con la máxima preferencia, al menos 250 aminoácidos.
El término "software de análisis de secuencias" se refiere a cualquier algoritmo computacional o programa de software que sea útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El "software de análisis de secuencias" puede estar comercialmente disponible o desarrollarse de manera independiente. El software de análisis de secuencias típico incluye, pero no se limita a: 1.) el conjunto de programas de GCG (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI) ; 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J". Mol. Biol . , 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput . Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Fecha de reunión: 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, Sandor. Plenum: Nueva York, NY) . Dentro del contexto de esta aplicación se entenderá que cuando el análisis se realiza con el programa de análisis de secuencias, los resultados del análisis estarán basados en los "valores predeterminados" del programa de la referencia, a menos que se especifique de cualquier otra forma. Como se usa en la presente descripción, "valores predeterminados" se refiere a cualquier conjunto de valores o parámetros que se carga originalmente con el programa la primera vez que se inicia .
Las técnicas estándar de clonación molecular y de ADN recombinante usadas en la presente son muy conocidas en la materia y se describen en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (en adelante, "Maniatis"); y en Silhavy, T. J., Bennan, M. L. y Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusione, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocole in Molecular Biology, publicada por Greene Publishing Assoc. y Wiley- Interscience (1987). Los métodos adicionales usados aquí se encuentran en Methods in Enzymology, Volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA) .
Descubrimiento de actividad mejorada de la proteína de agrupamiento de Fe-S en levadura Las proteínas que contienen un agrupamiento de hierro-azufre (Fe-S) unido que se requiere para su actividad podrían tener una actividad baja cuando se usan en sistemas de expresión heterólogos . La formación de agrupamientos de Fe-S y su transferencia a apoproteínas es un proceso de etapas múltiples que involucra, al menos, varias proteínas que incluyen la cisteína desulfurasa, una proteína de supercóntigo y una chaperona. Así, una proteína de Fe-S heterologa podría no estar compuesta eficazmente por el sistema hospedero endógeno. Los solicitantes han descubierto una forma para aumentar la actividad de una proteína de Fe-S expresada como una proteína heterologa en una célula hospedera de levadura. Los solicitantes han descubierto que mediante la reducción de la producción de una proteína de Fe-? endógena en la célula hospedera de levadura puede lograrse una mejora en la actividad de una proteína de agrupamiento de Fe-S heterologa expresada. La expresión en levadura de la dihidroxi-ácido deshidratasa (DHAD) de 2Fe-2S o propanodiol deshidratasa reactivasa (RdhtB) de Fe-S vegetal o fúngica heterologa se mejoró cuando se desactivó un gen endógeno que codifica isopropilmalato deshidratasa (LEU1) o un gen endógeno que codifica dihidroxi-ácido deshidratasa (ILV3) en las células hospederas de levadura.
En las células hospederas de levadura con desactivación de un gen que codifica una proteína de Fe-S endógena, la actividad de la proteína de Fe-S heterologa expresada podría aumentarse hasta al menos aproximadamente 1.4 veces respecto a la actividad en una célula hospedera de levadura sin desactivación del gen que codifica la proteína de Fe-S. Por ejemplo, la DHAD de Kluyveromyces lactis tuvo una actividad de 1.4 veces en un hospedero de deleción de LEUl, comparada con un hospedero sin deleción; la RdhtB de Roseburia inulinivorans tuvo una actividad de 1.7 veces en un hospedero de deleción de LEU, tal como se midió por la actividad de la proteína de RdhtA activada (descrita más abajo) ; la DHAD de Saccharo yces cerevisiae expresada en el citosol tuvo una actividad comparativa de 1.5 veces en un hospedero de deleción de ILV3 mitocondrial y la DHAD de Kluyveromyces lactis expresada en el citosol tuvo una actividad comparativa de 7.4 veces en un hospedero de deleción de ILV3 mitocondrial.
Células hospederas de levadura con expresión reducida de la proteina de Fe-S endógena La expresión reducida de la proteína de Fe-S endógena podría desarrollarse en cualquier célula de levadura que sea susceptible de manipularse genéticamente. Los ejemplos incluyen levaduras de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia y Pichia. Las cepas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces thermotolerans, Candida glabrata, Candida albicans, Pichia stipitis y Yarrowia lipolytica. La Saccharomyces cerevisiae es particularmente adecuada.
En cualquiera de estas levaduras, cualquier proteína de Fe-S endógena podría ser un objetivo para la expresión reducida. Las proteínas de Fe-S en levadura que podrían ser objetivo de expresión reducida incluyen, por ejemplo, las siguientes proteínas (con gen codificante) : aconitasa (AC01) , homoaconitasa (LYS4) , DHAD (ILV3) , lipoato sintasa (LIP5) , biotina sintasa (BI02) , maduración de ferredoxina (YAH1) , NADH ubiquinona oxidoreductasa (NDll) , succinato deshidrogenasa (SDH2) , ubiquinol-citocromo C reductasa (RIP1) , isopropilmalato isomerasa (LEU1) , sulfito reductasa (ECM17) , glutamato deshidrogenasa (GLT1) , proteína de la familia abe. Rlil (RLI1) , NTPasa Nbp35 (NBP35) y proteína parecida a la hidrogenasa (NARI1) . Las células de levadura con expresión reducida de proteínas de Fe-S individuales podrían requerir condiciones especiales para el crecimiento, tales como complementación del medio de crecimiento con un nutriente particular, como conoce bien una persona con experiencia en la materia. Por ejemplo, una cepa con interrupción de LEU1 se complementa con leucina, una cepa con interrupción de DHAD se complementa con leucina, isoleucina y valina, y una cepa con interrupción de LYS4 se complementa con lisina. Algunas cepas con una interrupción no requieren complementación para el crecimiento. Las proteínas de Fe-S particularmente adecuadas que podrían ser objetivo de la expresión reducida incluyen Isopropilmalato isomerasa (LEU1) , dihidroxi-ácido deshidratasa (ILV3) , sulfito reductasa (ECM17) , glutamato deshidrogenasa (GLT1) y biotina sintasa (BI02) . La expresión reducida se desarrolla para, al menos, una proteína de Fe-S endógena y podrían reducirse dos o más proteínas de Fe-S endógenas.
LEU1 codifica isopropilmalato deshidratasa, una enzima que pertenece a EC 4.2.1.33 que está involucrada en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada, especialmente, la síntesis de leucina. Cualquier gen que codifique una isopropilmalato deshidratasa, la cual es un enzima que requiere un agrupamiento de 4Fe-4S para la actividad, podría desactivarse en una célula hospedera de levadura de esta descripción. Los ejemplos de genes de levadura objetivo de desactivación LEU1 y sus proteínas codificadas son aquellos de Saccharomyces cerevisiae (codificación: sec . con núm. de ident.: 1; proteína: sec . con núm. de ident.: 2), Schizosaccharomyces pombe (codificación: sec. con núm. de ident.: 3; proteína: sec. con núm. de ident.: 4), Candida galbrata cepa CBS 138 (codificación: sec. con núm. de ident. : 5; proteína: sec. con núm. de ident. : 6) , Candida albicans SC5314 (codificación: sec. con núm. de ident. : 7; proteína: sec. con núm. de ident. : 8) , Kluyveromyces lactis (codificación: sec. con núm. de ident.: proteína: sec. con núm. de ident . : 10), Yarrowia lipolytica (codificación: sec. con núm. de ident.: 11; proteína: sec. con núm. de ident.: 12) y Pichia stipitis (codificación: sec. con núm. de ident.: 13; proteína: sec. con núm. de ident.: 14) .
De manera similar, en cualquiera de los hospederos de levadura descritos en la presente descripción, podría desactivarse un gen ILV3 endógeno para reducir la expresión de la proteína de Fe-S endógena. El ILV3 codifica la DHAD mitocondrial que está involucrada en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada. La DHAD mitocondrial se encuentra codificada por un gen nuclear y tiene una secuencia señal de objetivo mitocondrial de manera que se transporta a y se localiza en la mitocondria. Cualquier gen ILV3 podría desactivarse en una célula hospedera de levadura de esta descripción. Los ejemplos de genes de levadura objetivo de desactivación ILV3 y sus proteínas codificadas son aquellos de Saccharomyces cerevisiae YJM78 (codificación: sec. con núm. de ident.: 111; proteína: sec. con núm. de ident.: 112), Schizosaccharomyces pombe (codificación: sec. con núm. de ident.: 93; proteína: sec. con núm. de ident.: 94), Candida galbrata cepa CBS 138 (codificación: sec. con núm. de ident.: 107; proteína: sec. con núm. de ident.: 108), Candida albicans SC5314 (codificación: sec. con núm. de ident.: 101; proteína: sec. con núm. de ident.: 102), Kluyvero yces lactis (codifiación: sec. con núm. de ident.: 113; proteína: sec. con núm. de ident.: 114), Yarrowia lipolytica (codificación: sec. con núm. de ident.: 105; proteína: sec. con núm. de ident.: 106) y Pichia stipitis CBS 6054 (codificación: sec. con núm. de ident.: 103; proteína: sec. con núm. de ident.: 104) .
Dado que los genes que codifican isopropilmalato deshidratasas y los genes de enzimas DHAD son muy conocidos, y debido a la prevalencia de la secuenciación genómica, una persona con experiencia en la materia puede identificar fácilmente especies adecuadas adicionales de estas enzimas sobre la base de la similitud de secuencia, mediante el uso de enfoques bioinformáticos . Típicamente, se usa la búsqueda BLAST (descrita anteriormente) de las bases de datos disponibles públicamente con secuencias de aminoácidos de isopropilamalato deshidratasa, tales como las que se describen en la presente descripción, para identificar estas enzimas y sus secuencias de codificación que podrían ser objetivo de desactivación en las presentes cepas. Por ejemplo, las proteínas de levadura endógenas isopropilmalato deshidratasa y DHAD que tienen identidades de secuencias de aminoácidos de al menos aproximadamente 70-75 %, 75 %-80 %, 80-85 %, 85 %- 90 %, 90 %- 95 % o 98 % de identidad de secuencia con las proteínas isopropilmalato deshidratasa de sec. con núm. de ident.: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 y las proteínas DHAD de sec. con núm. de ident.: 94, 102, 104, 106, 108, 112 y 114 podrían tener expresión reducida en las presentes cepas . Las identidades se basan en el método de alineamiento Clustal W, mediante el uso de los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN0.1 y series de Gonnet 250 de matriz de peso para proteínas.
Además, las secuencias de regiones codificantes LEU1 e ILV3 proporcionadas en la presente descripción podrían usarse para identificar otros homólogos en la naturaleza. Por ejemplo, cada una de las regiones codificantes descritas en la presente invención podrían usarse para aislar genes que codifican proteínas homologas. En la materia se conoce el aislamiento de genes homólogos por medio de protocolos que dependen de la secuencia. Los ejemplos de protocolos dependientes de secuencias incluyen, pero no se limitan a, 1.) métodos de hibridación de ácidos nucleicos; 2.) métodos de amplificación de ADN y ARN, tal como se ilustra por diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos [por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), Mullís et al., patente de los Estados Unidos núm. 4,683,202; la reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés) , Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci . Estados Unidos 82:1074 (1985); o amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA, por sus siglas en inglés), Walker, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. Estados Unidos., 89:392 (1992)]; y 3.) métodos de construcción de genotecas y análisis por complementacion.
Por ejemplo, los genes que codifican polipéptidos o proteínas similares a los genes que codifican isopropilmalato deshidratasa y DHAD proporcionados en la presente invención podrían aislarse directamente mediante el uso de la totalidad o una parte de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención como sondas de hibridación de ADN para analizar genotecas de cualquier organismo deseado, mediante el uso de metodologías bien conocidas por aquellas personas con experiencia en la materia. Pueden diseñarse y sintetizarse sondas de oligonucleótidos específicos sobre la base de las secuencias de ácido nucleico descritas, mediante métodos conocidos en la materia (Maniatis, arriba) . Además, las secuencias completas se pueden usar directamente para sintetizar sondas de ADN mediante métodos conocidos por las personas con experiencia en la materia (por ejemplo, técnicas de marcado de ADN cebadores al azar, traslación de mellas o marcado de extremos) o sondas de ARN con sistemas de transcripción in vitro. Además, se pueden diseñar y usar sondas específicas para amplificar una parte (o la longitud completa de) todas las secuencias de la presente. Los productos resultantes de la amplificación se pueden marcar directamente durante las reacciones de amplificación o después de las reacciones de amplificación, y se pueden usar como sondas para aislar fragmentos de ADN de longitud completa por hibridación bajo las condiciones de rigor apropiadas .
Típicamente, en las técnicas de amplificación del tipo de PCR, los cebadores tienen distintas secuencias y no son complementarios entre sí. Dependiendo de las condiciones de prueba deseadas, las secuencias de los cebadores deben diseñarse para proporcionar una réplica eficiente y fiel del ácido nucleico objetivo. Los métodos de diseño de cebadores de PCR son comunes y muy conocidos en la materia (Thein y Wallace, "The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders" , en Human Genetic Diseases : A Practical Approach, K. E. Davis Ed., (1986) págs. 33-50, IRL: Herndon, VA; y Rychlik, W., en Methods in Molecular Biology, White, B. A. Ed. , (1993) Vol. 15, págs. 31-39, PCR Protocols : Current Methods and Applications. Humania: Totowa, NJ) .
Generalmente, dos segmentos cortos de las secuencias descritas podrían usarse en los protocolos de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifican genes homólogos de ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa también se podría realizar en una genoteca de fragmentos de ácido nucleico clonados, en donde la secuencia de un cebador se deriva de los fragmentos de ácido nucleico descritos y la secuencia del otro cebador aprovecha la presencia de las cadenas de ácido poliadenílico al extremo 3 ' del precursor de ARNm que codifica los genes microbiales.
Alternativamente, la secuencia del segundo cebador puede estar basada en secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, la persona con experiencia en la materia puede seguir el protocolo RACE (Frohman et al., PNAS USA 85:8998 (1988)) para generar ADNc mediante el uso de PCR para amplificar copias de la región entre un solo punto del transcrito y el extremo 3 ' o 51. Los cebadores orientados en las direcciones de los extremos 31 y 5 ' se pueden diseñar a partir de las secuencias de la presente invención. Mediante el uso de sistemas RACE 3' o RACE 5' (por ejemplo, BRL, Gaithersburg, MD) pueden aislarse fragmentos de ADNc 3' o 5' específicos (Ohara et al., PNAS USA 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989)).
Alternativamente, las secuencias de codificación de isopropilmalato deshidratasa y DAD proporcionadas pueden usarse como reactivos de hibridación para la identificación de homólogos. Los componentes básicos de una prueba de hibridación de ácidos nucleicos incluyen una sonda, una muestra que se sospecha contiene el gen o fragmento de gen de interés y un método de hibridación específico. Las sondas son, típicamente, secuencias de ácido nucleico monocatenarias que son complementarias de las secuencias de ácido nucleico que se detectarán. Las sondas son "hibridables" para la secuencia de ácidos nucleicos que se detectará. La longitud de la sonda puede variar desde 5 bases hasta decenas de miles de bases y dependerá de la prueba especifica que se practicará. Típicamente, es adecuada una longitud de sonda de aproximadamente 16 bases a aproximadamente 30 bases. Sólo una parte de la molécula de la sonda necesita ser complementaria de la secuencia de ácido nucleico que se detectará. Además, no es necesario que la complementariedad entre la sonda y- la secuencia objetivo sea perfecta. La hibridación se producirá entre las moléculas de complementariedad imperfecta con el resultado de que una cierta fracción de las bases en la región hibridada no se apareará con la base complementaria apropiada.
Los métodos de hibridación están bien definidos. Típicamente, la sonda y la muestra deben mezclarse en condiciones que permitan la hibridación de los ácidos nucleicos. Esto implica poner en contacto la sonda y la muestra en presencia de una sal orgánica o inorgánica en la concentración y condiciones de temperatura adecuadas. La sonda y los ácidos nucleicos de la muestra deben estar en contacto durante un tiempo suficientemente largo para que pueda producirse cualquier hibridación posible entre la sonda y los ácidos nucleicos de la muestra. La concentración de la sonda o del objetivo en la mezcla determinará el tiempo necesario para que se produzca la hibridación. Cuanto más alta sea la concentración de la sonda o del objetivo, más corto será el tiempo que se necesitará para la incubación de la hibridación. Opcionalmente, puede agregarse un agente caotrópico. El agente caotrópico estabiliza los ácidos nucleicos al inhibir la actividad nucleasa. Además, el agente caotrópico permite la hibridación sensible y rigurosa de las sondas de oligonucleótidos cortos a temperatura ambiente (Van Ness and Chen, Nucí. Acids Res. 19:5143-5151 (1991)). Los agentes caotrópicos adecuados incluyen cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, tiocianato de sodio, tetracloroacetato de litio, perclorato de sodio, tetracloroacetato de rubidio, yoduro ' de potasio y trifluoroacetato de cesio, entre otros. Típicamente, el agente caotrópico estará presente en una concentración final de aproximadamente 3M. Si se deseara, puede agregarse formamida a la mezcla de hibridación, típicamente, de 30 a 50 % (v/v) .
Puede emplearse diversas soluciones de hibridación.
Típicamente, estas comprenden de aproximadamente 20 a 60 % en volumen, preferentemente, 30 %, de un solvente polar orgánico. Una solución de hibridación común emplea de aproximadamente 30 a 50 % v/v de formamida, aproximadamente, 0.15 a 1 M de cloruro de sodio, aproximadamente, 0.05 a 0.1 M de amortiguadores (por ejemplo, citrato de sodio, tri-HCl, PIPES o HEPES (el pH varía de aproximadamente 6 a 9) ) , aproximadamente 0.05 a 0.2 % de detergente (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio), o entre 0.5-20 mm de EDTA, FICOLL (Pharmacia Inc.) (aproximadamente 300 a 500 kdal) , polivinilpirrolidona (aproximadamente 250 a 500 kdal) y albúmina sérica. También se incluyen en la solución de hibridación típica los ácidos nucleicos portadores sin marcar de aproximadamente 0.1 a 5 mg/ml, ADN nucleico fragmentado, por ejemplo, ADN de timo de becerro o esperma de salmón, o ARN de levaduras) y, opcionalmente , de aproximadamente 0.5 a 2 % en peso/vol. de glicina. También pueden incluirse otros aditivos, tales como agentes de exclusión de volumen que incluyen una variedad de agentes polares dilatables o solubles en agua (por ejemplo, polietilenglicol) , polímeros aniónicos (por ejemplo, poliacrilato o polimetilacrilato) y polímeros sacarídicos aniónicos (por ejemplo, sulfato de dextrano) .
La hibridación de ácido nucleico puede adaptarse a una variedad de formatos de ensayo. Uno de los más adecuados es el formato de ensayo intercalado. Específicamente, el ensayo intercalado puede adaptarse a la hibridación en condiciones no desnaturalizantes . Un componente primario de un ensayo de tipo intercalado es un soporte sólido. El soporte sólido tiene adsorbida o acoplada covalentemente a él una sonda inmovilizada de ácidos nucleicos que está no marcada y es complementaria de una porción de la secuencia.
Las secuencias de codificación de proteínas y ácidos nucleicos para cualquiera de las otras proteínas de Fe-S que podrían ser objetivo de actividad reducida en una célula de levadura de la invención podrían identificarse mediante el uso de la bioinformática y de) otros métodos muy conocidos por una persona con experiencia en la materia. Por ejemplo, las secuencias de aconitasa se identifican mediante búsquedas por palabra clave en bases de datos bioinformáticas . Varias secuencias identificadas mediante este método son las de Saccharomyces cerevisiae (codificación: sec . con núm. de ident.: 153; proteína: sec. con núm. de ident . : 154), Schizosaccharomyces pombe en cromosoma II (codificación: sec. con núm. de ident.: 155; proteína: sec. con núm. de ident.: 156) , Schizosaccharomyces pombe en cromosoma I (codificación: sec. con núm. de ident.: 157; proteína: sec. con núm. de ident.: 158), Kluyveromyces lactis (codificación: sec. con núm. de ident.: 15; proteína: sec. con núm. de ident.: 160), Candida albicans SC5314 (codificación: sec. con núm. de ident.: 161; proteína: sec. con núm. de ident.: 162), Yarrowia lipolytica (codificación: sec. con núm. de ident.: 163; proteína: sec. con núm. de ident.: 164), Pichia stipitis CBS 6054 (codificación: sec. con núm. de ident.: 165; proteína: sec. con núm. de ident.: 166), Candida galbrata CBS 138 cromosoma F (codificación: sec. con núm. de ident.: 167; proteína: sec. con núm. de ident.: 168), Candida galbrata CBS 138 cromosoma D (codificación: sec. con núm. de ident.: 169; proteína: sec. con núm. de ident.: 170) y Candida galbrata CBS 138 cromosoma K (codificación: sec. con núm. de ident.: 171; proteína: sec. con núm. de ident.: 172) .
Los genes que codifican proteínas de Fe-S, por ejemplo, LEU1, ILV3 o ACOl podrían interrumpirse en cualquier célula de levadura mediante el uso de modificación genética. Muchos métodos para la modificación genética de genes objetivo son conocidos por una persona con experiencia en la materia y podrían usarse para crear las presentes cepas de levadura. Las modificaciones que podrían usarse para reducir o eliminar la expresión de una proteína objetivo son interrupciones que incluyen, pero no se limitan a, la deleción del gen completo o de una porción del gen, la inserción de un fragmento de ADN en el gen (tanto en el promotor o la región codificante) de manera que la proteína no se exprese o se exprese a niveles más bajos, la introducción de una mutación en la región codificante, la cual adiciona un co'dón de terminación o un desplazamiento del marco de lectura de manera que no se exprese una proteína funcional, y la introducción de una o más mutaciones en la región codificante para alterar aminoácidos de manera que se exprese una proteína no funcional o menos enzimáticamente activa. Adicionalmente , la expresión de un gen podría bloquearse por la expresión de un ARN no codificante o un ARN de interferencia, y podrían introducirse constructos que dan como resultado una cosupresión. Adicionalmente, la síntesis o estabilidad del transcrito podría reducirse por mutación. De forma similar, la eficacia con la cual una proteína se traduce a partir de ARNm podría modularse por mutación. Una persona con experiencia en la materia podría poner en práctica estos métodos fácilmente mediante el uso de las secuencias codificantes conocidas o identificadas, tales como LEU1 o ILV3.
Las secuencias de ADN que rodean una secuencia codificante LEU1, ILV3 o ACOl también son útiles en algunos procedimientos de modificación y se encuentran disponibles para levaduras, tales como para Saccharomycse cerevisiae en la secuencia genómica completa coordinada por el Proyecto genómico ID9518 de los Proyectos genómicos coordinados por el NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) con GOPID de identificación 13838. Los ejemplos adicionales de secuencias genómicas de levadura incluyen aquellas de Yarrowia lipolytica, GOPIC 13837, y de Candida albicans, la cual se incluye en GPID 10771,10701 y 16373. Se secuenciaron y anotaron genomas adicionales que se encuentran disponibles públicamente para las siguientes cepas de levadura Candida glabrata CBS 138, Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140, Pichia stipitis CBS 6054 y Schizosaccharo yces pombe 972h- .
Particularmente, las secuencias de ADN que rodean una secuencia codificante objetivo, tales como LEU1 o ILV3 , son útiles para los métodos de modificación que usan recombinación homologa. Por ejemplo, en este método, las secuencias flanqueadoras se ubican delimitando un gen marcador seleccionable para mediar la recombinación homologa a través de la cual el gen marcador reemplaza al gen objetivo. Además, podrían usarse secuencias de genes objetivo y secuencias flanqueadoras parciales delimitando un gen marcador seleccionable para mediar la recombinación homologa a través de la cual el gen marcador reemplaza una porción del gen objetivo. Adicionalmente , el marcador seleccionable podría estar delimitado por sitios de recombinación específica del sitio, de manera que después de la expresión de la recombinasa específica del sitio correspondiente, el gen de resistencia se elimine del gen objetivo sin reactivar a este último. La recombinación específica del sitio deja atrás un sitio de recombinación, el cual interrumpe la expresión de la proteína codificada por el gen objetivo. El vector de recombinación homologa podría construirse para que también deje una deleción en el gen objetivo después de la eliminación del marcador seleccionable, como conoce bien una persona con experiencia en la materia.
Las deleciones podrían hacerse mediante el uso de recombinación mitótica, como se describe en Wach et al. ((1994) Yeast 10:1793-1808). El método incluye preparar un fragmento de ADN que contiene un marcador seleccionable entre regiones genómicas que podrían ser tan cortas como 20 bp, y las cuales delimitan una secuencia de ADN objetivo. Este fragmento de ADN puede prepararse por amplificación por PCR del gen marcador seleccionable con el uso de oligonucleótidos como cebadores que se hibridan a los extremos del gen marcador y que incluyen regiones genómicas que pueden recombinarse con el genoma de levadura. El fragmento de ADN lineal puede transformarse eficazmente en levadura y recombinarse en el genoma, lo que resulta en el reemplazo de genes con deleción de la secuencia de ADN objetivo (como se describe en Methods in Enzymology, vl94, págs . 281-301 (1991) ) .
Además, los métodos de reemplazo de promotores podrían usarse para intercambiar los elementos de control transcripcional endógenos, lo que permite otros medios para modular la expresión, como se describe en Mnaimneh et al. ((2004) Cell 118 (1) : 31-44) y en el Ejemplo 12 de la presente invención.
Adicionalmente , un gen objetivo en cualquier célula de levadura podría interrumpirse mediante el uso de mutagénesis aleatoria, a la cual le sigue el análisis para identificar cepas con actividad reducida codificada por un gen objetivo.
Con el uso de este tipo de método, no necesita conocerse la secuencia de ADN de, por ejemplo, LEU1 , ILV3 o cualquier otra región del genoma que afecta la expresión de una proteína de Fe-S objetivo.
Los métodos para crear mutaciones genéticas son comunes y muy conocidos en la materia, y podrían aplicarse al ejercicio de creación de mutantes. Los métodos de ingeniería genética aleatoria usados comúnmente (revisados en Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) incluyen mutagénesis espontánea, mutagénesis causada por genes mutadores, mutagénesis química, irradiación con rayos X o UV, o mutagénesis de transposón.
La mutagénesis química de levadura, comúnmente, involucra el tratamiento de las células de levadura con uno de los siguientes mutagenes de ADN: metansulfonato de etilo (EMS, por sus siglas en inglés) , ácido nitroso, sulfato de dietilo o N-metil- ' -nitro-N-nitroso-guanidina (MNNG, por sus siglas en inglés) . Estos métodos de mutagénesis se han revisado en Spencer et al (Mutagénesis in Yeast, 1996, Yeast Protocols : Methods in Cell and Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ) . La mutagénesis química con EMS podría llevarse a cabo como se describe en Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. La irradiación con luz ultravioleta (UV) o rayos X también puede usarse para producir mutagénesis aleatoria en células de levadura. El efecto primario de la mutagénesis por irradiación de UV es la formación de dímeros de pirimidina, la cual interrumpe la fidelidad de la replicación de ADN. Los protocolos para la mutagénesis de levadura por UV pueden encontrarse en Spencer et al (Mutagénesis in Yeast, 1996, Yeast Protocole : Methods in Cell and Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ) . La introducción de un fenotipo mutador también puede usarse para generar mutaciones cromosómicas aleatorias en levadura. Los fenotipos mutadores comunes pueden obtenerse a través de la interrupción de uno o más de los siguientes genes: PMS1, MAG1, RAD18 o RAD51. La restauración del fenotipo no mutador puede obtenerse fácilmente por la inserción del alelo silvestre. Las colecciones de células modificadas producidas a partir de cualquiera de estos u otros procesos de mutagénesis aleatoria conocidos podrían analizarse en busca de actividad reducida de proteínas de Fe-S.
Proteínas de Fe-S heterólogas Cualquier dihidroxi-ácido deshidratasa (DHAD) de agrupamiento de 2Fe-2S fúngica o vegetal y cualquier propanodiol deshidratasa reactivasa de Fe-S podría expresarse como una proteína heteróloga en una célula hospedera de levadura desarrollada como se describe en la presente invención para la expresión reducida de proteínas endógenas de agrupamiento de Fe-S, y podría obtenerse un aumento en la actividad. Una proteína heteróloga incluye una que se expresa de una forma diferente a la expresión de una proteína endógena correspondiente. Por ejemplo, en levadura, la DHAD endógena está codificada por ILV3 en el núcleo y la proteína DHAD expresada tiene una secuencia señal de objetivo mitocondrial de manera que la proteína se localice en la mitocondria. Se adiciona un agrupamiento de Fe-S a la proteína DHAD en la mitocondria para su actividad en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada. Se prefiere expresar la actividad de la DHAD en el citosol para que participe en las rutas biosintéticas localizadas en el citosol. La expresión citosólica de la DHAD en levadura es una expresión heteróloga ya que la proteína nativa se localiza en la mitocondria. Por ejemplo, la expresión heteróloga de DHAD de Saccharomyces cerevisiae en S. cerevisiae se obtiene por la expresión de la región codificante de DHAD de S. Cerevisiae con la señal de objetivo mitocondrial eliminada, de manera que la proteína se mantenga en el citosol. Las DHAD de 2Fe-2S que podrían usarse en la presente descripción incluyen aquellas de hongos y plantas. Las DHAD de 2Fe-2S vegetales o fúngicas se enumeran en las Tablas 1 y 2. Las DHAD de 2Fe-2S fúngicas o vegetales con identidades de secuencias de aminoácidos de 95 % o mayores se eliminaron del análisis que proporciona esta lista, por cuestiones de simplificación. Sin embargo, cualquier secuencia con 95 % de identidad de aminoácidos o más con cualquiera de estas secuencias resultan útiles en la presente invención. El análisis usado para obtener DHAD de 2Fe-2S se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 61/100792, la cual se incorpora en la presente descripción como referencia. El análisis es de la siguiente manera: En él, se preparó un Perfil de modelo oculto de Markov (H , por sus siglas en inglés) sobre la base de secuencias de aminoácidos de ocho DHAD verificadas funcionalmente . Estas DHAD son de Nitrosomonas europaea (ADN: sec. con núm. de ident . : 174; Proteína: sec. con núm. de ident.: 175), Synechocystis esp. PCC6803 (ADN: sec. con núm. de ident.: 176; Proteína: sec. con núm. de ident.: 177), Streptococcus mutans (ADN: sec. con núm. de ident.: 178; Proteína: sec. con núm. de ident.: 179), Streptococcus thermophilus (ADN: sec. con núm. de ident.: 180; proteína: sec. con núm. de ident.: 181), Ralstonia metallidurans (ADN: sec. con núm. de ident.: 182; proteína: sec. con núm. de ident.: 183), Ralstonia eutropha (ADN: sec. con núm. de ident.: 184; proteína: sec. con núm. de ident.: 185) y Lactococcus lactis (ADN: sec. con núm. de ident.: 186; proteína: sec. con núm. de ident. : 187) . Adicionalmente , se descubrió que la DHAD de Flavobacterium johnsoniae (ADN: sec. con núm. de ident.: 188; proteína: sec. con núm. de ident.: 189) tiene actividad dihidroxi-ácido deshidratasa cuando se expresa en E. coli, y se usó en la elaboración del Perfil. El Perfil de HMM se prepara mediante el uso del paquete de software HMMER (la teoría detrás de los perfiles de HMM se describe en R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh y G. Mitchison, Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998; Krogh et al., 1994; J. Mol. Biol. 235:1501-1531) al seguir la guía del usuario que está disponible de HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA) . La salida del programa de software HMMER es un Perfil de modelo oculto de Markov (HMM) que caracteriza las secuencias de entrada, que figura en la Tabla 9.
Cualquier proteína que coincida con el Perfil de HMM con un valor E de < 10"5 es una proteína relacionada con DHAD, la cual incluye DHAD de 4Fe-4S, DHAD de 2Fe-2S, arabonato deshidratasas y fosfogluconato deshidratasas . Las secuencias que coinciden con el Perfil de HMM, después, se analizan para determinar la presencia de tres cisteínas conservadas, que corresponden a las posiciones 56, 129 y 201 en la DHAD de Streptococcus mutans . La presencia de las tres cisteínas conservadas es característica de que las proteínas tienen un agrupamiento de [2Fe-2S]2+. Las proteínas que tienen las tres cisteínas conservadas incluyen arabonato deshidratasas y DHAD de 2Fe-2S. Las DHAD de 2Fe-2S podrían distinguirse de las arabonato deshidratasas mediante el análisis de los aminoácidos distintivos conservados que se descubrió que estaban presentes en las DHAD de 2Fe-2S o en las arabonato deshidratasas en posiciones que corresponden a las posiciones siguientes en la secuencia de aminoácidos de DHAD de Streptococcus mutans . Estos aminoácidos distintivos se encuentran en DHAD de 2Fe-2S o en arabonato deshidratasas, respectivamente, en las posiciones siguientes (con una incidencia mayor que 90 %) : 88 asparagina en comparación con ácido glutámico,- 113 no conservado en comparación con ácido glutámico; 142 arginina o asparagina en comparación con no conservado; 165: no conservado en comparación con glicina; 208 asparagina en comparación con no conservado; 454 leucina en comparación con no conservado; 477 fenilalanina o tirosina en comparación con no conservado; y 487 glicina en comparación con no conservado.
Las proteínas identificadas por este proceso que tienen origen fúngico o vegetal, tales como las sec . con núm. de ident.: 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150 y 152 podrían usarse en la presente invención, así como cualquier proteína con identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con cualquiera de estas secuencias. Es particularmente adecuada la DHAD de Kluyvero yces lactis (sec. con núm. de ident . : 114) y las DHAD con al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la sec. con núm. de ident.: 114, mediante el uso del método de alineamiento Clustal W con los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN0.1 y series de Gonnet 250 de matriz de peso para proteínas sobre la longitud total de la secuencia de proteínas.
Adicionalmente , las DHAD de 2Fe-2S fúngicas o vegetales que podrían usarse en la presente invención podrían identificarse por su posición en una rama de DHAD de 2Fe-2S fúngica o vegetal de un árbol filogenético de proteínas relacionadas con DHAD. Adicionalmente, las DHAD de 2Fe-2S que podrían usarse podrían identificarse mediante el uso de comparaciones de secuencias con cualquiera de las DHAD de 2Fe-2S fúngicas o vegetales, cuyas secuencias se proporcionan en la presente descripción, en donde la identidad de secuencia podría ser de al menos aproximadamente 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 % o 95 %-99 %.
Adicionalmente, las secuencias de DHAD de 2Fe-2S fúngicas o vegetales proporcionadas en la presente descripción podrían usarse para identificar otros homólogos en la naturaleza. Por ejemplo, cada una de las DHAD que codifican fragmentos de ácido nucleico que figuran en la presente descripción como sec. con núm. de ident.: 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 11, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 13, 141, 143, 145, 147, 149 y 151 podrían usarse para aislar genes que codifican proteínas homologas, como se describió anteriormente para la región codificante de LEU1.
La propanodiol deshidratasa reactivasa independiente de la coenzima B12 de Roseburia inulin.ivora.ns es una proteína que requiere un agrupamiento de Fe-S para la actividad. Esta proteína, RdhtB, se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente núm. US20090155870 , la cual se incorpora en la presente descripción como referencia. La RdhtB reactiva una propanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12 de Roseburia inulinivorans, la cual se denomina RdhtA y también se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. US20090155870. La actividad de la RdhtB podría evaluarse mediante el ensayo de la actividad de la RdhtA, dado que la actividad de la RdhtA requiere la RdhtB. La actividad de la RdhtB y, por lo tanto, de la RdhtA, se mejora mediante la expresión en un hospedero de levadura con expresión reducida de la proteína de Fe-S endógena descrito en la presente descripción. La expresión heteróloga de cualquier propanodiol deshidratasa reactivasa independiente de la coenzima B12 que requiere un agrupamiento de Fe-S para su actividad podría mejorarse en una cepa de levadura que tiene expresión reducida de la proteína de Fe-S endógena. Una persona con experiencia e la materia podría identificar fácilmente una propanodiol deshidratasa reactivasa independiente de la coenzima B12 mediante la evaluación de la actividad propanodiol deshidratasa de la enzima propanodiol deshidratasa asociada, en presencia o ausencia de la coenzima B12. Un ejemplo es una diol deshidratasa reactivasa de Clostridium butyricu (región codificante: sec. con núm. de ident . : 192; proteína sec. con núm. de ident . : 193).
Una persona con experiencia en la materia podría identificar otras propanodiol deshidratasa reactivasas independientes de la coenzima B12 que podrían usarse a través del análisis bioinformático de secuencias, en comparación con el de RdhtB sec. con núm. de ident.: 44. Podrían usarse proteínas con actividad propanodiol deshidratasa reactivasa independiente de la coenzima B12 e identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 44 de al menos aproximadamente 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 % o 95 %-99 %. Son particularmente adecuadas aquellas que son al menos aproximadamente 90 % idénticas a la secuencia de aminoácidos como se expone en la sec. con núm. de ident.: 44 mediante el método de alineamiento Clustal W, con los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN0.1 y series de Gonnet 250 de matriz de peso para proteínas sobre la longitud total de la secuencia de proteínas.
Adicionalmente , otros homólogos de propanodiol deshidratasa reactivasa independiente de la coenzima B12 que podrían usarse podrían identificarse por medio de la región codificante de RdhtB (sec. con núm. de ident.: 16), mediante el uso de métodos como se describen anteriormente para la región codificante de LEU1.
Expresión de proteínas de Fe-S heterologas La expresión se logra mediante la transformación con una secuencia que codifica una proteína de Fe-S. La región codificante a expresarse podría estar optimizada por codones para la célula hospedera objetivo, como conoce muy bien una persona con experiencia en la materia. Los métodos para expresión de genes en levadura son conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, Volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA) . La expresión de genes en levadura requiere, típicamente, un promotor unido operacionalmente a una región codificante de interés, y un terminador transcripcional . Puede usarse una cantidad de promotores de levadura en la construcción de casetes de expresión para genes en levadura que incluyen, pero no se limitan a, los promotores derivados a partir de los siguientes genes: CYC1, HIS3, GAL1, GALIO, ADH1 , PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3 , LEU2, ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD, GPM, y A0X1. Los terminadores transcripcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, FBAt , GPDt, GPMt , ERGIOt , GALlt , CYC1 y ADH1.
Las regiones codificantes, los terminadores transcripcionales y los promotores adecuados podrían clonarse en vectores versátiles de levadura de E. coli y transformarse en células de levadura. Estos vectores permiten la propagación de la cepa en E. coli y cepas de levadura. Típicamente, el vector usado contiene un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica en el hospedero deseado. Típicamente, los plásmidos usados en levadura son los vectores versátiles pRS423, pRS424, pRS425 y pRS426 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) , los cuales contienen un origen de replicación de E. coli (por ejemplo, pMBl) , un origen de replicación 2 µ de levadura y un marcador para selección nutricional. Los marcadores de selección para estos cuatro vectores son His3 (vector pRS423), Trpl (vector pRS424) , Leu2 (vector pRS425) y Ura3 (vector pRS426) . La construcción de vectores de expresión con un gen quimérico que codifica las regiones codificantes de las proteínas de Fe-S descritas podría llevarse a cabo mediante técnicas de clonación molecular estándar en E. coli o mediante el método de recombinación de reparación de interrupciones en levadura.
El enfoque de clonación de reparación de interrupciones aprovecha la recombinación homologa altamente eficaz en levadura. Típicamente, un ADN vector de levadura se digiere (por ejemplo, en su sitio de clonación múltiple) para crear una "interrupción" en su secuencia. Se genera una cantidad de ADN insertos de interés que contienen una secuencia de = 21 bp en los extremos 5' y 3' que se superponen secuencialmente entre sí, y con los extremos 5' y 3' del ADN vector. Por ejemplo, para construir un vector de expresión de levadura para el "Gen X" , se seleccionan un promotor de levadura y un terminador de levadura para el cásete de expresión. El promotor y el terminador se amplifican a partir del ADN genómico de levadura y el Gen X se amplifica por PCR a partir de su organismo fuente o se obtiene a partir de un vector de clonación que comprende la secuencia del Gen X. Hay al menos una secuencia superpuesta de 21 bp entre el extremo 5' del vector linearizado y la secuencia promotora, entre el promotor y el Gen X, entre el Gen X y la secuencia terminadora y entre el terminador y el extremo 3' del vector linearizado. El vector "interrumpido" y los ADN insertos se cotransforman, después, en un cepa de levadura y se colocan en placas en el medio que contiene las mezclas de compuestos adecuadas que permiten la complementación de los marcadores de selección nutricional en los plásmidos . La presencia de combinaciones de insertos correctas puede confirmarse por mapeo por PCR mediante el uso de ADN plásmido preparado a partir de las células seleccionadas. El ADN plásmido aislado de levadura (usualmente en concentración baja) , después, puede transformarse en una cepa de E. coli, por ejemplo, TOP10, seguido por mini preparados y mapeo de restricción para verificar aun más el constructo plásmido. Finalmente, el constructo puede verificarse por análisis de secuencias.
Como la técnica de reparación de interrupciones, la integración en el genoma de levadura también aprovecha el sistema de recombinación homologa en levadura. Típicamente, un cásete que contiene una región codificante más elementos de control (promotor y terminador) y marcador auxotrófico se amplia por PCR con una ADN polimerasa de alta fidelidad, mediante el uso de cebadores que se hibridan con el cásete y contienen 40-70 pares de bases de homología de secuencia con las regiones 5' y 3' del área genómica donde se desea la inserción. El producto de PCR se transforma, después, en levadura y se coloca en placas en un medio que contiene las mezclas de compuestos adecuadas que permiten la selección para el marcador auxotrófico integrado. Por ejemplo, para integrar el "Gen X" en una ubicación cromosómica "Y" , el constructo promotor-región codificante X-terminador se amplifica por PCR a partir de un constructo de ADN plásmido y se une a un marcador autotrófico (tal como URA3) por SOE PCR o por digestos de restricción comunes y clonación. El cásete completo, que contiene la región promotor-región codificante X- terminador- URA3 se amplifica por PCR con secuencias cebadoras que contienen 40-70 bp de homología con las regiones 5' y 3' de la ubicación "Y" en el cromosoma de levadura. El producto de PCR se transforma, después, en levadura y se selecciona en medios de crecimiento sin uracilo. Los transformantes pueden verificarse por PCR de colonia o por secuenciación directa del ADN cromosómico.
Cualquier región codificante expresada en las células de levadura presentes podrían estar optimizadas por codones para la expresión en la célula hospedera de levadura específica que se está desarrollando, como conoce muy bien una persona con experiencia en la materia. Por ejemplo, para la expresión de las regiones codificantes ILV3 de K. lactís y P. stipitis ILV3 en S. cerevísíae, cada una estaba optimizada por codones para la expresión de S. cerevisiae en el Ejemplo 1 de la presente descripción.
Biosíntesis de producto con actividad mejorada de proteína de Fe-S heteróloga La producción de cualquier producto que tenga una proteína de Fe-S contribuyendo a su ruta biosintética podría beneficiarse a partir de la actividad mejorada descrita en la presente descripción de una proteína de Fe-S expresada heteróloga en un hospedero de levadura con expresión reducida de proteína de Fe-S endógena. Por ejemplo, la DHAD proporciona una etapa en las rutas para la biosíntesis de isobutanol y la RdhtB contribuye a una ruta biosintética para producir 2-butanona o 2-butanol.
Las rutas biosintéticas que incluyen una etapa llevada a cabo por la DHAD para la síntesis de isobutanol se describen en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. US 20070092957 Al, la cual se incorpora en la presente descripción como referencia. En la Figura 1 se proporciona un diagrama de las rutas biosintéticas de isobutanol descritas. La producción de isobutanol en una cepa descrita en la presente descripción se beneficia a partir de la actividad de DHAD aumentada. Como se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US20070092957 Al, las etapas en una ruta biosintética de isobutanol ilustrativa incluyen la conversión de: piruvato en acetolactato (Fig. 1 etapa de ruta a) como la cataliza, por ejemplo, la acetolactato sintasa; acetolactato en 2 , 3 -dihidroxiisovalerato (Fig. 1 etapa de ruta b) como la cataliza, por ejemplo, la acetohidroxiácido isomerorreductasa ; 2 , 3 -dihidroxiisovalerato en OÍ- cetoisovalerato (Fig. 1 etapa de ruta c) como la cataliza, por ejemplo, la acetohidroxiácido deshidratasa, también denominada DHAD; a-cetoisovalerato en isobutiraldehído (Fig. 1 etapa de ruta d) como la cataliza, por ejemplo, la -ceto ácido decarboxilasa de cadena ramificada; y isobutiraldehído en isobutanol (Fig. 1 etapa de ruta e) como la cataliza, por ejemplo, la alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada.
Las conversiones de sustrato en producto y las enzimas involucradas en estas reacciones para las etapas f, g, h, 1, j y k de rutas alternativas se describen en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US 20070092957 Al.
Los genes que podrían usarse para la expresión de las enzimas para rutas de isobutanol se describen en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US 20070092957 Al, y una persona con experiencia en la materia puede identificar los genes adicionales que podrían usarse experimentalmente o mediante bioinformática, como se describió anteriormente. Los usos preferidos en las tres rutas de las enzimas cetol-ácido reductoisomerasa (KARI, por sus siglas en inglés) con actividades particularmente altas se describen en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm.
US20080261230. Los ejemplos de KARI con actividad alta descritos allí son aquellos de Vibrio cholerae (ADN: sec . con núm. de ident . : 35; proteína: sec. con núm. de ident.: 36), Pseudo onas aeruginosa PA01, (ADN: sec. con núm. de ident.: 37; proteína: sec. con núm. de ident.: 38) y Pseudomonas fluorescens PF5 (ADN: sec. con núm. de ident.: 39; proteína: sec. con núm. de ident. : 40) .
Adicionalmente , en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US 20070092957 Al se describen genes quiméricos y la ingeniería genética de levadura, ejemplificada por Saccharomyces cerevisiae, para la producción de isobutanol mediante el uso de las rutas biosintéticas descritas.
Una ruta biosintética que incluye propanodiol deshidratasa para la síntesis de 2-butanona y 2-butanol se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. US20070292927A1 , la cual se incorpora en la presente como referencia. En la Figura 2 se proporciona un diagrama de la ruta biosintética de 2-butanona y 2-butanol descrita. S-butanona es el producto elaborado cuando se omite la última etapa descrita de conversión de 2-butanona en 2-butanol. La producción de 2-butanona o 2-butanol en una cepa descrita en la presente descripción se beneficia de la actividad aumentada de la propanodiol deshidratasa reactivasa independiente de la coenzima B12. Como se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US20070292927A1 , las etapas en la ruta biosintética descrita incluyen la conversión de: piruvato en acetolactato (Fig. 2 etapa a) como la cataliza, por ejemplo, la acetolactato sintasa; acetolactato en acetoína (Fig. 2 etapa b) como la cataliza, por ejemplo, la acetolactato decarbosilasa ; acetoína en 2 , 3 -butanodiol (Fig. 2 etapa i) como la cataliza, por ejemplo, la butanodiol deshidrogenasa; 2 , 3 -butanodiol en 2-butanona (Fig. 2 etapa j) como la cataliza, por ejemplo, la diol deshidratasa, glicerol deshidratasa o propanodiol deshidratasa; y 2-butanona en 2-butanol (Fig. 2 etapa f) como la cataliza, por ejemplo, la butanol deshidrogenasa .
Los genes que podrían usarse para la expresión de estas enzimas se describen en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US20070292927A1. El uso en esta ruta en levadura de la butanodiol deshidratasa de Roseburia inulinivorans, RdhtA, (proteína: sec . con núm. de ident . : 43, región codificante: sec. con núm. de ident.: 15) se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. US20090155870. Esta enzima se usa en combinación con la butanodiol deshidratasa reactivasa de Roseburia inulinivorans, RdhtB, (proteína: sec . con núm. de ident . : 44, región codificante: sec . con núm. de ident.: 16). Esta butanodiol deshidratasa se prefiere en muchos hospederos porque no requiere la coenzima En la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US20090155870 se describe, adicionalmente , la construcción de genes quiméricos y la ingeniería genética de levadura para la producción de 2-butanol mediante el uso de la ruta biosintética descrita en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US 20070292927A1.
Medios de fermentación Las levaduras descritas en la presente descripción podrían cultivarse en medios de fermentación para la producción de un producto que tenga una proteína de Fe-S como parte de la ruta biosintética. Los medios de fermentación deben contener los sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos , tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos , tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos , tales como almidón o celulosa, o mezclas de estos, y mezclas no purificadas de materias primas renovables, tales como perraeato de suero de queso, líquido de maceración de maíz, molasa de betabel azucarero, y malta de cebada. Además, el sustrato de carbono también puede ser un sustrato de un solo carbono, tal como dióxido de carbono o metanol, para los que se ha demostrado la conversión metabólica en intermedios bioquímicos clave. Además de los sustratos de uno y de dos carbonos, los organismos metilotróficos también se sabe que usan diversos compuestos adicionales que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y diversos aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, la levadura metilotrófica es conocida por usar el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd. , [Int. Symp.], 7.° (1993), 415-32. Editor(es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Editor: Intercept, Andover, Reino Unido). Análogamente, diversas especies de Candida metabolizarán alanina u ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990)). Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono empleada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y sólo estará limitada por la elección del organismo.
Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de estos son adecuados en la presente invención, los sustratos de carbono preferidos son glucosa, fructosa y sacarosa.
Además de una fuente de carbono apropiada, el medio de fermentación debe contener minerales adecuados, sales, cofactores, amortiguadores y otros componentes conocidos por aquellas personas con experiencia en la materia, adecuados para el crecimiento de los cultivos y para promover la ruta enzimática necesaria para la producción del producto deseado. Condiciones de cultivo Típicamente, las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 37 °C en un medio apropiado. Los medios de crecimiento adecuados en la presente invención son medios comunes comercialmente preparados, tales como el caldo que incluye una base nitrogenada de levadura, sulfato de amonio y dextrosa, como la fuente de carbono/energía) o medio YPD, una combinación de peptona, extracto de levadura y dextrosa en proporciones óptimas para cultivar el mayor número de cepas de Saccharomyces cerevisiae . También pueden usarse otros medios de crecimiento definidos o sintéticos y el medio adecuado para crecimiento del microorganismo específico será conocido para una persona con experiencia en la materia de la ciencia de microbiología o fermentación.
Los intervalos adecuados de pH para la fermentación están entre pH 3.0 y pH 7.5 , en donde se prefiere el pH de 4.5 a pH 6.5 como la condición inicial.
Las fermentaciones pueden realizarse en condiciones aerobias o anaerobias, en donde se prefieren las condiciones anaerobias o microaerobias .
La cantidad de butanol producida en un medio de fermentación puede determinarse mediante el uso de una cantidad de métodos conocidos en la materia, por ejemplo, cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) o cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés) .
Fermentaciones industriales continuas y por lotes El presente proceso usa un método de fermentación por lotes. Una fermentación por lotes clásica es un sistema cerrado en donde la composición del medio se define al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por ello, al comienzo de la fermentación, el medio se inocula con uno o más organismos deseados y se deja que la fermentación se produzca sin ningún agregado al sistema. Sin embargo, típicamente, una fermentación "por lotes" es por lotes con respecto a la adición de la fuente de carbono y a menudo se hacen intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En sistemas por lotes, las composiciones de biomasa y metabolito del sistema cambian constantemente hasta el momento que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos por lotes las células se moderan a través de una fase de retardo estático hasta una fase logarítmica de crecimiento alto para terminar con una fase estacionaria, en donde la velocidad de crecimiento disminuye o se interrumpe. Si no están tratadas, las células de la fase estacionaria, finalmente, morirán. Las células de la fase logarítmica son responsables, generalmente, de la producción en masa del producto final o intermedio.
Una variación del sistema por lotes estándar es el sistema de alimentación por lotes. Los procesos de fermentación con alimentación por lotes también son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema por lotes típico, con la excepción de que el sustrato se agrega en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas de alimentación por lotes son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células, y en donde es conveniente contar con cantidades limitadas de sustrato en los medios. Es difícil determinar la concentración real del sustrato en los sistemas de alimentación por lotes y, por consiguiente, se calcula sobre la base de los cambios de factores medibles, tales como el pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases de residuos, tales como C02. Las fermentaciones por lotes y de alimentación por lotes son comunes y muy conocidas en la materia, y se pueden encontrar ejemplos en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Mícrobiology, Segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. o Deshpande, ukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992), incorporados en la presente como referencia.
Aunque la presente invención se lleva a cabo en el modo de lotes, se contempla que el método puede ser adaptado para métodos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto, en donde un medio de fermentación definido se agrega continuamente a un bioreactor y se extrae, simultáneamente, una cantidad igual de medio acondicionado para procesamiento. La fermentación continua mantiene, generalmente, los cultivos a una densidad elevada constante en las que las células están principalmente en la fase de crecimiento logarítmica.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno, a una concentración fija y permitirá que se moderen todos los demás parámetros. En otros sistemas se pueden alterar de manera continua diversos factores que afecten el crecimiento mientras se mantiene constante la concentración celular, medida por turbidez del medio. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento estables y, por ello, la pérdida celular debida al medio que se extrae debe equilibrarse contra la velocidad de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua, así como las técnicas para maximizar la velocidad de la formación del producto, son muy conocidos en la materia de la microbiología industrial y se detalla una variedad de métodos en Brock, supra.
La presente invención podría practicarse mediante el uso de procesos continuos, de lote o de alimentación por lote y son adecuados los modos de fermentación conocidos. Además, se contempla que las células pueden inmovilizarse sobre un sustrato como catalizadores de células enteras y someterse a condiciones de fermentación para la producción de 1-butanol. Métodos para aislar el butanol del medio de fermentación El butanol bioproducido podría aislarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, los sólidos pueden extraerse del medio de fermentación por centrifugación, filtración, decantación, o similares. Después, el butanol podría aislarse a partir del medio de fermentación, el cual se ha tratado para eliminar los sólidos como se describió anteriormente, mediante el uso de métodos tales como destilación, extracción líquido- líquido o separación basada en membranas. Dado que el butanol forma una mezcla azeotrópica con agua y de bajo punto de ebullición, la destilación solo puede usarse para separar la mezcla hasta su composición azeotrópica. La destilación puede usarse en combinación con otro método de separación para obtener la separación alrededor del azeótropo. Los métodos que pueden usarse en combinación con la destilación para aislar y purificar el butanol incluyen, pero no se limitan a, decantación, extracción líquido- líquido, adsorción y técnicas basadas en membranas. Además, el butanol puede aislarse mediante el uso de destilación azeotrópica al usar un cosolvente (véase, por ejemplo, Doherty y Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw. Hill, New York, 2001) .
La mezcla de butanol-agua forma un azeótropo heterogéneo para que la destilación pueda usarse en combinación con decantación para aislar y purificar el butanol. En este método, el butanol que contiene el caldo de fermentación se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica. Luego, se condensa la mezcla azeotrópica, y el butanol se separa del medio de fermentación por decantación. La fase acuosa decantada puede retornarse a la primera columna de destilación como reflujo. La fase orgánica decantada rica en butanol puede purificarse aún más por destilación en una segunda columna de destilación.
Además, el butanol puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de extracción líquido- líquido en combinación con destilación. En este método, el butanol se extrae del caldo de fermentación por medio de una extracción líquido- líquido con un solvente adecuado. Después, la fase orgánica que contiene, butanol se destila para separar el butanol del solvente.
También puede usarse la destilación en combinación con adsorción para aislar el butanol del medio de fermentación. En este método, el caldo de fermentación que contiene el butanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica y luego se extrae el resto del agua mediante el uso de un adsorbente, tal como los tamices moleculares (Aden et al. Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizíng Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Informe NREL/TP-510-32438, National Renewable Energy Laboratory, junio de 2002) .
Adicionalmente , puede usarse la destilación en combinación con pervaporación para aislar y purificar el butanol del medio de fermentación. En este método, el caldo de fermentación que contiene el butanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica, y luego se extrae el resto del agua por pervaporación a través de una membrana hidrófila (Guo et al., J. Membr. Sci . 245, 199-210 (2004)) .
EJEMPLOS La presente invención se define más detalladamente a través de los siguientes ejemplos. Debe entenderse que si bien estos ejemplos señalan las modalidades preferidas de la invención, se aportan a manera de ejemplo únicamente. De la descripción precedente y de estos ejemplos, aquellos con experiencia en la materia pueden determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrán introducir diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones.
Métodos generales Las técnicas estándar de clonación molecular y de ADN recombinante usadas en los ejemplos son muy conocidas en la materia y se describen en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Clonación molecular: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) (Maniatis) y T. J. Silhavy, M. L. Bennan, y L. W. Enquist, Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) , y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. y Wiley- Interscience (1987), y Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son muy conocidos en la materia. Las técnicas adecuadas para usarse en los siguientes ejemplos pueden encontrarse en el Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. ilvC de E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene . Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, editores), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994) ) o en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989) . Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de células microbianas se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) , BD Diagnostic Systems (Sparks, D) , Life Technologies (Rockville, MD) , o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que se especifique de cualquier otra forma. Las cepas microbianas se obtuvieron de la colección de The American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA, a menos que se especifique de cualquier otra forma. Todos los cebadores oligonucleótidos fueron sintetizados por Sigma-Genosys (Woodlands, TX) o Integrated DNA Technologies (Coralsville , IA) .
El medio sintético completo se describe en Amberg, Burke y Strathern, 2005, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
HPLC El análisis para la composición de subproducto de fermentación es muy conocido en la materia. Por ejemplo, un método de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) usa una columna Shodex SH-1011 con una columna de guarda Shodex SH-G (disponibles de aters Corporation, Milford, MA) , con detección de índice de refracción (RI, por sus siglas en inglés) . La separación cromatográfica se logra mediante el uso de 0.01 M de H2S04 como la fase móvil con un régimen de flujo de 0.5 ml/min y una temperatura de columna de 50 °C. El tiempo de retención del isobutanol es de 47.6 minutos.
El significado de las abreviaturas es el siguiente: "s" significa segundo (s), "min" significa minuto (s), "h" significa hora(s), "psi" significa libras por pulgada cuadrada, "nm" significa nanómetros, "d" significa dla(s), "µ?' significa microlitro (s) , "mi" significa mililitro ( s ) , "1" significa litro(s), "mm" significa milímetro (s) , "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "µ?t???" significa micromol (es) , "g" significa gramo(s), " g" significa microgramo (s) y "ng" significa nanogramo ( s) , "PCR" significa reacción en cadena de la polimerasa, "OD" significa densidad óptica, "OD6oo" significa la densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm, "kDa" significa kilodaltons , ng" significa constante de gravitación, "bp" significa par (es) de bases, "kbp" significa par (es) de kilobases, "% w/v" significa por ciento en peso/volumen, "% v/v" significa por ciento en volumen/volumen, "HPLC" significa cromatografía de líquidos de alta resolución, y "GC" significa cromatografía de gases. El término "selectividad molar" es la cantidad de moles de producto producida por mol de sustrato de azúcar que se consume y se informa como porcentaje.
Ejemplo 1 Expresión de DHAD de K. lactis en la cepa de deleción de LETJ1 de S. cerevisiae El gen LEU1 de levadura codifica isopropilmalato deshidratasa, una enzima que requiere un agrupamiento de Fe-S para su funcionamiento. El impacto de la deleción de LEU1 en la actividad de DHAD expresada a partir de la región codificante de DHAD de Kluyveromyces lactis se analizó en el ejemplo. Para la expresión génica en levadura, se usó el vector versátil pNY13 (sec. con núm. de ident . : 29) derivado de pRS423. Este vector versátil contenía un origen de replicación Fl (1423 a 1879) para mantenimiento en E. coli y un origen de 2 mieras (nt 7537 a 8881) para replicación en levaduras. El vector tiene un promotor de FBA (nt 2111 a 3110) y un terminador de FBA (nt 4316 a 5315) . Además, incluye el marcador HIS3 (nt 504 a 1163) para selección en levaduras, y el marcador de resistencia a la ampicilina (nt 6547 a 7404) para selección en E. coli. pNY9 es el mismo vector con un marcador URA3 que reemplaza al marcador HIS3.
La región codificante ILV3 para DHAD de Kluyveromyces lactis se sintetizó con optimización por codones para la expresión en S. cerevisiae mediante ADN 2.0 ( enlo Park, CA) . La secuencia sintetizada clonada se amplificó por PCR. Durante la amplificación, se suprimió una porción del péptido señal mitocondrial para la DHAD en el N- erminal mediante el uso de ilv3 (K) (O)-F(delet) como el cebador directo con ilv3 (K) (o) -R como el cebador inverso, lo que resultó en una región codificante para expresión citoplasmática (sec. con núm. de ident . : 173). Adicionalmente , se incorporó un sitio Sphl en el cebador directo, mientras que se incluyó un sitio Nofcl en el cebador inverso. El producto de PCR se clonó en los vectores versátiles pNY9 y pNY13 de manera que la región codificante ILV3 estaba bajo el control del promotor de FBA. El producto de PCR y cada vector (pNY9, pNY13) se digirieron con Sphl y Noti . Después de la digestión, los componentes se ligaron y la mezcla de ligadura se transformó en células competentes TOP10 (Invitrogen) . Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB complementadas con 100 g/ml de ampicilina. Los clones positivos se analizaron por PCR con los cebadores directo e inverso descritos anteriormente. Los plásmidos resultantes se designaron como pRS423 : : FBAp- ILV3 (KL) y pRS426 : : FBAp- ILV3 (KL) , derivados de los plásmidos pNY13 y pNY9 , respectivamente.
Para estudiar la expresión de la DHAD de K. lactis en S. cerevisiae, el vector de expresión pRS 23 :: FBAp- ILV3 (KL) junto con un vector pRS426 vacío se transformaron en las cepas BY4743 y BY4743 leul::kanMX4 (ATCC 4034377). La preparación y transformación de células competentes se basaron en el kit de transformación de levadura congelada de Zymo Research. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar con medio sintético de levadura sin histidina ni uracilo (Teknova) . Para ensayos enzimáticos, las cepas que llevaban el constructo de expresión y el vector vacío pRS426 primero se cultivaron durante la noche en 5 mi de medio sintético completo de levadura sin histidina ni uracilo. Los cultivos de 5 mi que se cultivaron durante la noche se transfirieron a 100 mi de medio en un matraz de 250 mi. Los cultivos se cosecharon cuando alcanzaron 1 a 2 O.D. a 600 nm. Las muestras se lavaron con 10 mi de Tris 20 mM (pH 7.5) y, después, se volvieron a suspender en 1 mi del mismo amortiguador Tris. Las muestras se transfirieron a tubos de 2.0 mi que contenían 0.1 mm de sílice (Lysing Matrix B, MP biomedicals) . Después, las células se rompieron en una centrífuga para disrupción celular (BIO101) . Se obtuvo el sobrenadante por centrifugación en una microcentrífuga a 13,000 rpm a 4 °C durante 30 minutos. Típicamente, se usó 0.06 a 0.1 mg de proteína de extracto crudo en un ensayo de DHAD. La proteína en los extractos crudos se determinó por ensayo Bradford con tintura Coomassie.
Ensayo de enzima dihidroxi-ácido deshidratasa El ensayo de enzima DHAD in vitro es una variación del ensayo descrito en Flint et al. (J. Biol . Chem. (1993) 268:14732-14742.). El ensayo se llevó a cabo en un volumen total de 1.6 µ? y consistió de: 800 mi de amortiguador 2X (100 mM de Tris pH 8.0, 20 mM de MgCl2) , 160 mi de sustrato 10X (15.6 mg/ml de dihidroxiisovalerato) , extracto crudo (típicamente 50-200 mg de proteínas) y agua. La reacción se incubó a 37 °C. A intervalos de tiempo de 0, 30, 60 y 90 minutos, se quitaron alícuotas de 350 µ? de la reacción y se incubaron con 350 µ? de dinitrofenildrazina al 0.05 % en 1N HC1 durante 30 minutos a 25 °C. Para apagar la reacción se adicionaron 350 µ? de hidróxido de sodio 4N a la mezcla de reacción y la reacción se centrifugó a 15,000 x g durante 2 minutos. Se transfirió el sobrenadante a una cubeta desechable de plástico y se midió la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro . La cantidad de -cetoisovalerato (KIV) producido se determinó al ingresar la absorbancia en la ecuación de regresión lineal obtenida a partir de la curva estándar de a-cetoisovalerato . Se gráfico la cantidad de KIV producido en cada punto de tiempo para determinar la velocidad de producción. La pendiente de la regresión lineal se usó, después, para calcular la actividad específica mediante el uso de la fórmula: Cálculo de actividad específica = (pendiente de producción de KIV/1000) / mg de proteína por 1.6 mi de reacción = mmol/min * mg La deshidratasa de K. lactis tuvo una actividad específica en el intervalo de 0.2 a 0.35 µt??? min"1 mg"1 cuando se expresó en la cepa de levadura BY4743 (Aleul) . Por el contrario, esta enzima tuvo una actividad específica en el intervalo de solo 0.14 µp??? min"1 mg"1 cuando se expresó en la cepa de levadura original BY4743. Las cepas BY4743 (Aleul) y BY4743 silvestre que contienen los vectores vacíos pRS423 o pRS426 tenían un fondo de actividad de 0.03 a 0.1 µt??? min"1 mg"1.
Ejemplo 2 Expresión de diol deshidratasa en la cepa de deleción de LEUl de S. cerevisiae En la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. US20090155870 se describe una propanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12. Las secuencias que codifican esta propanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12 (dependiente de S-adenosilmetionina (SAM) ) (sec. con núm. de ident . : 15) y su reactivasa putativa asociada (sec. con núm. de ident.: 16} en la bacteria Roseburia inulinivorans [Scott et al. (2006) J. Bacteriol. 188:4340-9], en adelante denominadas rdhtA y rdhtB, respectivamente, se sintetizaron como un fragmento de ADN (sec. con núm. de ident.: 17) mediante métodos estándar y se clonaron en un vector de E. coli (por DNA2.0, Inc., Menlo Park, CA) . Este clon se usó como una plantilla de PCR para preparar fragmentos de regiones codificantes RdhtA y RdhtB independientes. La región codificante RdhtA para la diol deshidratasa se amplificó por PCR mediante el uso de los cebadores N695 y N696 (sec. con núm. de ident . : 18 y 19) . La región codificante RdhtB para la diol deshidratasa activasa se amplificó por PCR mediante el uso de los cebadores N697 y N698 (sec. con núm. de ident.: 20 y 21) . Los dos fragmentos de ADN se combinaron con un fragmento de ADN terminador dual (sec. con núm. de ident.: 22) que tiene un terminador ADH (sec. con núm. de ident.: 23) y un terminador CYC1 (sec. con núm. de ident.: 24) adyacentes entre sí en orientación opuesta, mediante el uso de SOE PCR (Horton et al. (1989) Gene 77:61-68) . El fragmento terminador dual se aisló como un fragmento de 0.6 kb después de la digestión Pací de pRS426 : : FBA- ILV5+GPM-kivD (descrito en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 20070092957 Al, Ejemplo 17) . El fragmento de ADN de 4 kb resultante tenía las regiones codificantes RdhtA y RdhtB en orientación opuesta a cada lado del terminador dual, con el extremo 3' de cada región codificante adyacente a la secuencia terminadora dual. Este fragmento de ADN se clonó, después, mediante tecnología de reparación de interrupciones (Ma et al. (1987) Genetics 58:201-216) en el vector versátil de S. cerevisiae pRS426 : : FBA- ILV5+GPM-kivD que se preparó por digestión con BbvCl para eliminar las regiones codificantes ILV5 y kivD y la secuencia terminadora dual entre sus extremos 3' . El plásmido resultante, pRS426 : : RdhtAB (abajo), contenía el gen RdhtA bajo el control del promotor de FBA de S. cerevisiae (sec. con núm. de ident . : 25) y el gen RdhtB bajo el control del promotor de GPM de S. cerevisiae (sec. con núm. de ident.: 26).
Los plásmidos pRS426 y pRS426 : : RdhtAB se introdujeron en las cepas de S. cerevisiae BY4743 (ATCC 201390) y BY4743 leul::kanMX4 (ATCC 4034377) mediante técnicas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202). Las células se colocaron en placas en medio sintético completo sin uracilo para seleccionar para transformantes. Los transformantes se analizaron en busca de la actividad diol deshidratasa mediante el uso de un ensayo in vivo, como se describe a continuación. Las células cultivadas en placas sobre medio sólido se usaron para inocular medios líquidos (20 mi) en cajas petri . Los medios usados eran completos sintéticos menos uracilo con y sin adición de 5 g/1 de 1,2-propanodiol 9Aldrich cat . núm. 398039) . Las cajas petri se transfirieron a un recipiente Anaeropack™ System (Mitsubishi Gas Chemical Co. Cat. núm. 50-70). Se generó un ambiente anerobio (<0.1 % de oxígeno) mediante el uso de sachets Pack-Anaero (Mitsubishi Gas Chemical Co . Cat. núm. 10-01). Después de 48 horas, se tomaron muestras de los sobrenadantes del cultivo, y estas se filtraron y se analizaron por HPLC, como se describe en Métodos generales. Se observó propanol, el cual tiene un tiempo de retención de 38.8 minutos, en los sobrenadantes del cultivo de cepas que llevaban pRS426 : : RdhtAB cuando se proporcionó 1 , 2-propanodiol al medio. Los resultados que figuran en la Tabla 5 muestran que se produjo más propanol en los sobrenadantes de la cepa que también tenía deleción de LEU1 que en la cepa sin deleción de LEU1. El análisis estadístico arrojó un puntaje P menor que 0.0005.
Tabla 5. Producción de propanol con expresión de propanodiol deshidratasa/reactivasa en levadura con y sin desactivación de LEU1.
Ejemplo 3.
Mejoramiento de la actividad de dihidroxi-ácido deshidratasa (DHAD) citosólica en S. cerevisiae a través de una interrupción de ILV3 mitocondrial Construcción de hospedero/vector En S. cerevisíae , ILV3 codifica la dihidroxi-ácido deshidratasa mitocondrial que está involucrada en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada. Para reducir el fondo de la expresión del ILV3 endógeno para ensayos enzimáticos in vitro en S. cerevisiae , se construyó un cásete de interrupción ilv3: :URA3 mediante amplificación por PCR del marcador URA3 de pRS426 (núm. de la ATCC 77107) con cebadores "ILV3: :URA3 F" y "ILV3: :URA3 R" , dados como sec . con núm. de ident . : 30 y 31. Estos cebadores produjeron un producto de PCR URA3 de 1.4 kb que contenía extensiones 5' y 3' de 70 bp idénticas a las secuencias corriente arriba y corriente abajo del locus cromosómico ILV3 para recombinación homologa. El producto de PCR se transformó en células de BY4741 (ATCC 201388) mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes resultantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y complementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR mediante el uso de cebadores "ILV3 F Check" y "URA3 REV Check" , dados como sec. con núm. de ident. : 32 y 33, para verificar la integración en el sitio correcto y la interrupción del locus de ILV3 endógeno. Los transformantes correctos tenían el genotipo: BY4741 il v3 : : URA3.
La construcción de los plásmidos pRS423 : : FBAp-ILV3{KL) y pRS426 : : FBAp - ILV3 ( KL) se describió en el Ejemplo 1. La construcción de pRS423 : : CUP1 - alsS+FBA- ILV3 se ha descrito en la publicación de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. US20070092957 Al, Ejemplo 17, la cual se incorpora en la presente como referencia. pRS423 : : CUP1 - alsS+FBA-ILV3 es el mismo plásmido que pRS423 : : CUPlp- alsS- FBAp-ILV3. Esta construcción contiene un gen quimérico que contiene el promotor de CUP1 de S. cerevisíae (sec. con núm. de ident . : 34) , la región codificante alsS de Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident. : 27) y el terminador CYC1 (sec. con núm. de ident.: 24) ; y, además, un gen quimérico que contiene el promotor de FBA de S. cerevisíae (sec. con núm. de ident. : 25), la región codificante ILV3 de S. cerevisíae sin la secuencia codificante señal de objetivo mitocondrial (sec. con núm. de ident. : 111) y el terminador ADH1 (sec. con núm. de ident . : 23 ) .
Preparación de muestras Los vectores plasmídicos pRS423 : : CUPlp- alsS- FBAp-ILV3 y pRS423 : : FBAp- ILV3 ( KL ) se transformaron en la cepa BY4741 ilv3::URA3 mediante técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y se mantuvieron en medios sintéticos completos sin histidina. Los vectores plasmídicos pRS423 : : CUPlp- alsS-FBAp- ILV3 y pRS426 : : FBAp- ILV3 (KL) también se transformaron en la cepa BY4741. Los cultivos aerobios se cultivaron en matraces de 1000 mi que contenían 200 mi de medios sintéticos completos sin histidina complementados con 2 % de glucosa en una incubadora Innova4000 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 30 °C y 225 rpm . Los cultivos se cosecharon a mediciones de OD600 de 1.0-2.0 y se sedimentaron por centrifugación a 6000 x g durante 10 minutos. Las bolillas celulares se lavaron con 10 m de Tris-HCl, pH 8.0 y las bolillas se almacenaron a -80 °C hasta que se realizaron los ensayos para determinar la actividad. Se prepararon extractos libres de células por el método estándar de lisis mecánica mediante el uso de 1 mi de esferas de 0.5 mm y 1.5 mi de suspensión de células de levadura. La concentración de proteínas en los extractos se determinó por ensayo Bradford con tintura Coomassie. Se llevaron a cabo ensayos de enzima DHAD y cálculos de actividad específica como se describió en el Ejemplo 1. Los resultados que figuran en la Tabla 6 muestran que hubo una actividad mayor de DHAD en las células con deleción de ILV3 que en las células sin deleción de ILV3.
Tabla 6. Actividad de DHAD en levadura con y sin deleción de ILV3.
Verificación de la formación de alfa-cetoisovalerato por HPLC La formación de alfa-cetoisovalerato a partir de los ensayos de enzima DHAD in vitro se alcanzó mediante el uso de HPLC y derivación de semicarbizida . Los ensayos de enzima DHAD se llevaron a cabo en un volumen total de 1.6 mi y consistieron de: 800 µ? de amortiguador 2X (100 mM de Tris pH 8.0, 20 mM de MgCl2), 160 µ? de sustrato 10X (15.6 mg/ml de dihidroxiisovalerato) , extracto crudo (típicamente, 50-200 g de proteínas) y agua. Las reacciones se incubaron a 37 °C. En los intervalos de tiempo de cero y 90 minutos se eliminaron alícuotas de 350 µ? de las reacciones, se transfirieron a hielo y se centrifugaron a 13,000 x g durante 2 minutos a 4 °C para eliminar la proteína precipitada. Los sobrenadantes se transfirieron a columnas Microcon YM-10 (Sigma) enfriadas con hielo y se centrifugaron a 13,000 x g durante 20 minutos a 4 °C para quitar las enzimas y las proteínas solubles. Los flujos continuos se mezclaron con 100 µ? de reactivo derivatizante (1 % de clorhidrato de semicarbizida y 1.5 % de trihidrato de acetato sódico) y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las reacciones se centrifugaron a través de filtros de centrifugación CoStar (CoStar, filtro de 0.22 µp?) a 13,000 x g durante 5 minutos a 4 °C para quitar cualquier precipitado. Los flujos continuos se transfirieron a frascos de HPLC para el análisis.
El análisis de alfa-cetoisovalerato derivatizado se condujo mediante el uso de cromatografía de fase inversa en una columna Supelco LC-18 con columna de guarda Superguard LC-18-DB (Supelco; 25 cm x 4.6 mm, 5 µt?) . Los volúmenes de inyección fueron 10 µ? . Las fases móviles fueron metanol (A) y 50 mM de NaOAc pH 7.2. El programa de gradiente usado figura en la Tabla 7, con detección a 250 nm.
Tabla 7. Gradiente usado para ensayo de HPLC de alfa-cetoisovalerato derivatizado Tiempo (min) Flujo (ml/min) % de NaOAc (50 mM) % de MEOH Curva Inicial 1. 0 95 5 5 1. 0 95 5 6 20 1. 0 70 30 6 21 1. 0 0 100 6 25 1. 0 0 100 6 26 1. 0 95 5 6 35 1. 0 95 5 6 El tiempo de retención de alfa-cetoisovalerato derivado de semicarbizida fue de 11.5 minutos.
Los resultados que figuran en la Tabla 8 confirmaron que el KIV se produjo en las células, como se detectó en el ensayo indirecto para actividad especifica mencionado anteriormente. La cantidad de KIV enumerada en la columna Ensayo de DHAD es la cantidad determinada indirectamente en la muestra de 90 minutos para el ensayo de actividad descrito anteriormente en la determinación de la actividad especifica. Esta cantidad de KIV se correlaciona bien con la cantidad detectada en el ensayo de HPLC.
Tabla 8. Comparación de KIV detectado en ensayo de actividad de DHAD y por HPLC.
Cepa producción de ceto- isovalerato (µ?) Ensayo de DHAD HPLC BY4741 Ílv3 : : URA3 pRS423 : : FBAp-JLV3 (KL) 256 256 BY4741 Hv3::URA3 pRS423 : : FBAp-ILV3 (KL) 162 163 Tabla 9 HM E 2.0 [2.2 g] Nombre y versión del programa ÑAME dhad_for_hrara Nombre del archivo de alineamiento de secuencias de entrada LENG 564 Longitud del alineamiento: incluye indel ALPH Amino Tipo de residuos MAP yes (sí) Mapa de los estados de coincidencia con las columnas del alineamiento COM/app/public/hmmer/current/bin/hmmbuild -F d ad-exp_hmm Comandos usados para generar el archivo: este significa que se aplicó hmmbuild (construir) dhad_for hmm. aln (parámetros por defecto) al archivo de alineamiento COM/ app/public/hmmer/current/bin/hmmcalibrate dhad-exp_hmm Comandos usados para generar el archivo: este significa que se aplicó hmmcalibrate (calibrar) NSEQ 8 (parámetros por defecto) al archivo hmm Fecha martes 3 jun 10:48:24 2008 Número de secuencias en el archivo de alineamiento XT -8455 -4 -1000 -1000-8455 -4 -8455 -4 Cuándo se generó el archivo NULT -4 -8455 La distribución de probabilidad de transición para el modelo nulo (estado G sencillo) .
NULE 595 -1558 85 338 -294 453 -1158 197 249 902 -1085 -142 La distribución de probabilidad de emisión de símbolo para el modelo nulo (estado G) ,- consiste -21 -313 45 531 201 384 -199 de K (por ejemplo, 4 o 20) enteros. La probabilidad nula usada para volver a convertir estas en EVD -499.650970 0.086142 probabilidades de modelo es 1/ .
Los parámetros de distribución de valor extremo, µ y lambda respectivamente; ambos valores de punto flotante. Lambda es positivo y no cero. Estos valores se fijan cuando el modelo se calibra 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 - * * * * 5 * 10 - - * * - - * * 15 - - * * 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 - - * * - - * * 5 - * * 10 - * * - - * * 15 - * * 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 * * - * 5 10 - * * - * * 15 - * * 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 - - * * - - * 5 10 - * * - - * 15 - - * * 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 -16 -7108 -8150 -894 -1115 -701 -1378 * 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 - - * * * 5 10 - * * - - * * 15 - - * 5 10 15 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una célula hospedera de levadura recombinante que comprende al menos una proteína de agrupamiento de Fe-S heteróloga, caracterizada porque el hospedero de levadura tiene expresión reducida de al menos una proteína endógena de agrupamiento de Fe-S.
2. La célula de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una interrupción en el gen que codifica al menos una proteína de agrupamiento de Fe-S endógena.
3. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además la proteína endógena de agrupamiento de Fe-S se selecciona del grupo que consiste de dihidroxi- cido deshidratasa, isopropílmalato deshidratasa, sulfito reductasa, glutamato deshidrogenasa, biotina sintasa, aconitasa, homoaconitasa, lipoato sintasa, maduración de ferredoxina, NADH ubiquinona oxidorreductasa, succinato deshidrogenasa, ubiquinol-citocromo C reductasa, proteína de la familia ABC Rlil, NTPasa Nbp35 y proteína similar a la hidrogenasa.
4. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además la levadura se selecciona del grupo que consiste de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia y Pichia.
5. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además la proteína de Fe-S endógena se expresa en la mitocondria .
6. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además la proteína de agrupamiento de Fe-S endógena tiene una actividad seleccionada del grupo que consiste de: actividad dihidroxi-ácido deshidratasa e isopropilmalato deshidratasa .
7. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque además la célula hospedera es Saccharomyces que expresa un gen que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos como se expone en la sec . con núm. de ident . : 114.
8. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además la al menos una proteína de agrupamiento de Fe-S heteróloga se selecciona del grupo que consiste de dihidroxi-ácido deshidratasas de 2Fe-2S fúngicas y dihidroxi-ácido deshidratasas de 2Fe-2S vegetales.
9. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque además la dihidroxi-ácido deshidratasa de agrupamiento de 2Fe-2S fúngica o vegetal se expresa en el citosol.
10. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque además la dihidroxi -ácido deshidratasa de agrupamiento de 2Fe-2S fúngica o vegetal es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el Perfil de HMM de la Tabla 9 con un valor E de < 10"5, en donde el polipéptido comprende, adicionalmente, las tres cisteínas conservadas, que corresponden a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident . : 179.
11. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque además la dihidroxi -ácido deshidratasa de agrupamiento de 2Fe-2S fúngica o vegetal es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las sec. con núm. de ident. : 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150 y 152.
12. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque además la dihidroxi-ácido deshidratasa de agrupamiento de 2Fe-2S heteróloga fúngica o vegetal es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 90 % idéntica a la sec. con núm. de ident . : 114, mediante el uso del método de alineamiento Clustal W con los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN0.1 y series de Gonnet de matriz de peso para proteínas sobre la longitud total de la secuencia de proteínas.
13. La célula hospedera recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, caracterizada porque además la célula comprende una ruta biosintética de isobutanol .
14. La célula hospedera recombinante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque además la célula produce isobutanol.
15. Un método para producir isobutanol; caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 14 bajo condiciones en las que se produce isobutanol.
16. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además la al menos una proteína de agrupamiento de Fe-S heteróloga tiene actividad propanodiol deshidratasa reactivasa .
17. La célula hospedera recombinante de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque además la al menos una proteína heteróloga de agrupamiento de Fe-S que tiene actividad propanodiol deshidratasa reactivasa de Fe-S es una propanodiol deshidratasa reactivasa con una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident . : 44, mediante el uso del método de alineamiento Clustal W, con los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN0.1 y series de Gonnet 250 de matriz de peso para proteínas sobre la longitud total de la secuencia de la proteína.
18. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque además la célula produce 2-butanol.
19. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque además la célula produce 2-butanona.
20. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque además la célula comprende una ruta biosintética de 2-butanol.
21. La célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque además la célula comprende una ruta biosintética de 2-butanona .
22. Un método para convertir 2,3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato; caracterizado porque comprende : a) proporcionar (1) una célula hospedera de levadura recombinante que comprende al menos un gen heterólogo que codifica una dihidroxi-ácido deshidratasa de 2Fe-2S, caracterizado además porque la célula hospedera de levadura recombinante tiene actividad reducida de al menos una proteína de agrupamiento de Fe-S endógena y (2) una fuente de 2,3- dihidroxiisovalerato ; y b) cultivar la célula hospedera recombinante de (a) con la fuente de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato bajo condiciones en donde la célula hospedera convierte el 2 , 3 -dihidroxiisovalerato en a- cetoisovalerato .
23. Un método para producir 2-butanona; caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 21 bajo condiciones en las que se produce 2-butanona.
24. Un método para convertir 2 , 3 -butanodiol en 2-butanona; caracterizado porque comprende: a) proporcionar (1) una célula hospedera de levadura recombinante que comprende al menos un gen heterólogo que codifica una propanodiol deshidratasa reactivasa de Fe-S, en donde la célula hospedera de levadura recombinante tiene actividad reducida de al menos una proteína de agrupamiento de Fe-S endógena y (2) una fuente de 2 , 3 -butanodiol ; y b) cultivar la célula hospedera recombinante de (a) con la fuente de 2 , 3 -butanodiol bajo condiciones en las que la célula hospedera convierte 2,3- butanodiol en 2-butanona.
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