KR20140104344A - Ｔ 세포 매개성 질병의 병증을 개선하기 위한 ｔｌ１ａ-ｄｒ３의 상호작용의 차단 및 그것의 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용을 차단하는 것을 포함하는, 피험자에게서 염증성 또는 자가면역성 질병을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 TL1A의 발현을 감소시킴으로써 차단될 수 있고, TL1A는 항-TL1A 항체의 투여에 의해 차단될 수 있다. 염증성 또는 자가면역성 질병을 치료하는 방법에 있어서, 상기 염증성 또는 자가면역성 질병은 T 세포 성분으로 인한 자가면역성 질병일 수 있다. 염증성 또는 자가면역성 질병을 치료하는 방법에 있어서, 상기 염증성 또는 자가면역성 질병은 천식, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 제1형 당뇨병, 이식편대 숙주질병 또는 염증성 장질병(IBD)일 수 있다.

Description

Ｔ 세포 매개성 질병의 병증을 개선하기 위한 ＴＬ１Ａ-ＤＲ３의 상호작용의 차단 및 그것의 항체{BLOCKADE OF TL1A-DR3 INTERACTIONS TO AMELIORATE T CELL MEDIATED DISEASE PATHOLOGY AND ANTIBODIES THEREOF}

이 출원은 그 전체가 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 2011년 5월 20일에 출원된 미국 가출원번호 61/488,671호의 이점을 청구하고 있다. 상기 언급된 출원의 심사 동안 발생 될 수 있는 어떠한 권리 포기도 이에 의하여 명확하게 철회되며, 모든 관련 기술들의 재고를 정중하게 요청한다.

여기에 첨부된 25 킬로바이트 크기의 서열 리스트 텍스트 파일은 2012년 3월 13일에 만들어졌으며, 그 전체가 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 파일명 "6137NIAMS2PCT_SEQ_20120313_ST25.txt"로서 제출되었다.

미국 정부는 본원에 개시되고 청구되어 있는 발명(들)을 소유한다.

본 발명은 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용을 차단하는 것을 포함하는, 피험자에게서 질병을 치료하기 위한 방법 및 조성물, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

DR3(TRAMP, LARD, WSL-1, TNFRSF25)는 TNFR1과 가장 유사한 T 세포 상에서 특이적으로 발현되는 종양 괴사 수용체 패밀리 멤버(tumor necrosis receptor family member)이다. DR3에 대한 리간드는 내피세포(endothelial cells)에 의해 발현되는 것으로 보고된 TNF 패밀리 멤버 단백질인 TL1A이다. TL1A는 시험관 내(in vitro)에서는 T 세포 활성화를 공자극(costimulate)할 수 있으나, TL1A의 생리학적 근원(physiological sources) 및 말초성 T 세포 생물학에서의 그것의 생체 내(in vivo) 역할은 알려져 있지 않다.

많은 TNF 패밀리 리간드 및 수용체 간의 상호작용은 T 세포 반응의 특이적 특징들을 형성하는데 중요한 역할을 한다. CD30, TNFR2, OX40, CD27, GITR, HVEM 및 4-1BB를 포함하는 TNF 수용체들의 서브 패밀리는 T 세포 상에서 발현되며, 특정 T 세포의 서브셋(subset)에서 독특한 양상의 공자극을 매개한다(Croft, 2003). 예를 들면, OX40은 활성화된 CD4⁺ T 세포의 활성화 후 생존(post-activation survival)을 증가시키고(Croft), TNFR2는 CD8⁺ T 세포 활성화를 공자극하며, GITR은 조절 T 세포(regulatory T cells)에서 고유의 역할을 한다(Expand, refs). DR3(TNFRSF25/TRAMP/LARD/WSL-1)는 그것과 가장 유사한 동족체인 TNFR1과 비슷하며, TRADD를 유도하고, NF-κB 및 MAP-키나아제를 활성화하는 능력을 가지거나 대안적으로는 세포 환경(cellular context)하에서 카스파제(caspase) 활성화 및 예정된 세포 사멸(programmed cell death)을 유발하는 TNF 패밀리 수용체를 포함하는 사멸 도메인(death domain)이다. TNFR1과는 달리, DR3는 T 세포에서 가장 높은 비율을 차지하는 림프구(lymphocytes)에서 특이적으로 발현되지만, T 세포 항상성에서의 이 수용체의 기능은 특히 이 수용체의 정확한 리간드인 TL1A가 최근에서야 확인되었기 때문에 잘 알려져 있지 않다. 최초 보고는 TL1A가 오직 내피세포 상에서만 발현된다고 하였고, 외인성(exogenous) TL1A의 첨가는 TCR을 통해 자극받은 인간 T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-G 생성을 공자극하는 것으로 보고하였다(Papadakis et al., 2004; Papadakis et al., 2005). 더욱 최근에는, TL1A는 염증성 장질환에서와 같은 염증 부위에서도 발견되었다(Bamias et al., 2003; Bamias et al., 2006).

본 발명의 목적에 따라서, 본원에 구현되고 대략적으로 기술된 바와 같이, 본 발명은 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용을 차단하는 것을 포함하는, 피험자에게서 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

개시된 방법 및 조성물의 부가적인 이점들은 명세서에 일부 제시될 것이며, 어느 정도는 명세서로부터 알 수 있거나 개시된 방법 및 조성물의 실시에 의해 알게 될 것이다. 개시된 방법 및 조성물의 이점들은 첨부된 청구항들에 특별히 언급하였다. 앞서 말한 일반 명세서 및 하기 상세한 설명 모두 예시적이며 설명하기 위한 것일 뿐 청구된 것과 같이 발명을 제한하고자 하는 것이 아님을 알게 될 것이다.

본 발명은 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용을 차단하는 것을 포함하는, 피험자에게서 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명의 방법 및 조성물에 따르면, T 세포 성분으로 인한 염증성 또는 자가 면역성 질병을 효과적으로 치료할 수 있다.

이 명세서의 일부분으로 포함되며 이를 구성하고 있는 첨부된 도면들은 개시된 방법 및 조성물의 원리를 설명하는 서술과 함께 개시된 방법 및 조성물의 몇몇의 구현들을 나타낸다.
도 1은 다양한 내재적 자극(innate stimuli) 후 TL1A mRNA 발현이 골수(bone-marrow) 유래의 수지상 세포(dendritic cells, DC)에서 강하게 유도되며, MyD88 의존적임을 나타낸 것이다. 도 1a는 골수 유래 수지상 세포 또는 D11c⁺ 수지상 세포를 배양하고, 100ng/ml의 LPS, SEA 또는 STAg를 사용하거나 사용하지 않고 표기된 시간 동안 자극한 것을 나타낸 것이다. 도 1b는 3시간 동안 100ng/ml의 LPS의 존재 또는 부재하에 다양한 녹-아웃(knock-out, KO) 마우스에서의 골수 유래 수지상 세포에서의 TL1A mRNA 발현을 나타낸 것이다. 각 샘플로부터 RNA을 제조하고, 이를 정량적 PCR에 사용하였다. 그 결과는 각 집단의 휴지 세포(resting cells)에 관하여 계산된 TL1A mRNA의 양을 나타낸다. 도 1c는 정제된 T 세포를 표기된 시간 동안 5μg/ml의 항 CD3/CD28을 사용하여 배양하고 자극한 것을 나타낸 것이다. 각 샘플로부터 RNA를 제조하고, 이를 정량적 PCR에 사용하였다. 그 결과는 새롭게 정제된 T 세포에 관하여 계산된 TL1A mRNA의 양을 나타낸다. 도 1d는 항-CD3/CD28을 사용한 T 세포 활성화 후 인간 말초 혈액단핵구(human Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC)에서의 TL1A mRNA 유도를 나타낸 것이다. 도 1e는 비-T(non-T), 비-B(non-B) 세포로부터 비롯된 TL1A 유도에서의 조기 최고값(early peak)을 나타낸 것이다. 표기된 세포 형태들은 PBMC로부터 정제되었으며, 기술된 바와 같이 자극하였다.
도 2는 DR3 KO 마우스로부터 정제된 T 세포들이 DC-T 공배양에서 증식(proliferation)이 감소되고, 활성화 마커(activation markers)가 발현되며, 변경된 사이토카인(altered cytokine production)을 생산한다는 것을 보여준다. 도 2a는 정제된 T 세포가 3일간 10ng/ml의 rTL1A의 존재 또는 부재하에 항-CD3 또는 항-CD3/CD28로 활성화된다는 것을 나타낸 것이다. ³H를 배양액에 첨가하고, 밤새 배양한 후 티미딘 혼입(tymidine incorporation)에 대해 분석하였다. 도 2b는 정제된 T 세포가 3일간 10ng/ml의 rTL1A 및 10μg/ml의 3C7의 존재 또는 부재하에 항-CD3 또는 항-CD3/CD28로 활성화된다는 것을 나타낸 것이다. ³H를 배양액에 첨가하고, 밤새 배양한 후 티미딘 혼입에 대해 분석하였다. 도 2c는 CFSE로 표지된 정제된 T 세포가 10ng/ml의 rTL1A의 존재 또는 부재하에 항-CD3 또는 항-CD3/CD28로 활성화된다는 것을 나타낸 것이다. 유세포 분석기(flow cytometry)로 세포들을 분석하였다. 도 2d는 항-CD3/CD28에 의해 활성화된 T 세포로부터의 상층액을 수집하고, 24시간 후 표기된 사이토카인들의 생성에 대하여 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 DC-T 공배양에서 DR3 KO의 T 세포는 증식이 감소되고, 활성화 마커가 발현되며, 변경된 사이토카인을 생산한다는 것을 보여준다. 도 3a는 3일간 표기된 Ova 펩티드 농도에서의 미접촉(naive) OTⅡ 또는 DR3 KO-OTⅡ T 세포와 함께 골수 유래 수지상 세포를 배양한 것을 나타낸 것이다. ³H를 배양액에 첨가하고, 밤새 배양한 후 티미딘 혼입에 대해 분석하였다. 도 3b는 표기된 Ova 펩티드 농도에서의 미접촉 OTⅡ 또는 DR3 KO-OTⅡ T 세포와 함께 골수 유래 수지상 세포를 배양한 것을 나타낸 것이다. 도면을 위해, 사용된 세포들을 24시간, 48시간 및 72시간 후에 수집하고, 활성화 마커를 위해 염색하고, 유세포 분석기로 분석하였다. 공배양액으로부터 상층액을 24시간, 48시간 및 72시간에 수집하고, IL-2 생성에 대하여 테스트하였다.
도 4는 TL1A가 T 세포 분화에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여준다. 도 4a는 항 CD3/CD28로 자극된 정제된 미접촉 T 세포를 6일간 TH1(항 IL-4 + IL-2) 또는 TH2(항 IFN-γ + IL-4) 조건하에 배양한 것을 나타낸 것이다. 그 후, 세포를 5-6시간 동안 항 CD3/CD28로 재자극하고, 세포 내 사이토카인을 염색하고, 유세포 분석기로 분석하였다. 분리된 CD11c⁺ 수지상 세포를 6일간 SEA, STAg 또는 IL-12 중 하나와 Ova 펩티드의 존재하에 OTⅡ 또는 DR3-OTⅡ T 세포를 함께 배양하였다. 그 후 세포를 6일간 PMA/이오노마이신(ionomycin)으로 재자극하고, 세포 내 사이토카인을 염색하고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 5는 DR3 KO 마우스는 Ova 매개성 천식 모델(Ova mediated asthma model)에서 감소된 폐 조직병리(histopathology)를 가짐을 보여준다. 마우스를 Alum + PBS(대조군) 또는 Alum + Ova로 감작(sensitize)시켰다. 그 후, 마우스를 PBS(대조군) 또는 Ova로 유발하였다. 도 5a는 PAS 염색을 이용하여 수행한 폐의 조직염색을 나타낸 것이다. 도 5b는 점수화된 폐의 조직병리를 나타낸 것이다. 도 5c는 RNA가 폐로부터 제조되었으며, 정량적 PCR에 사용되었음을 보여준다. 결과들은 PBS로 처리된 대조군 마우스의 폐(오른쪽 패널)에 대하여 계산된 사이토카인 mRNA의 양을 나타낸 것이다. Ova 매개성 천식 모델 마우스의 비장을 채취하고, 10μg/ml 또는 50μg/ml의 Ova 단백질 중 하나의 존재 또는 부재하에 비장세포(splenocyte)를 3일간 배양하였다. ³H를 배양액에 첨가하고, 밤새 배양한 후 티미딘 혼입에 대해 분석하였다. 50μg/ml로 배양된 비장세포의 상층액을 3일 후에 수집하고, 사이토카인을 분석하였다(왼쪽 패널). 도 5d는 Ova 매개성 천식 모델 마우스의 혈액을 수집하고, 그 혈청의 IgG1 및 Ova 특이적 IgG1 레벨을 ELISA로 테스트한 것을 나타낸 것이다.
도 6은 DR3 KO 마우스는 MOG-EAE 모델에서 감소된 EAE를 가짐을 보여준다. 도 6a는 임상 스코어(clinical score)를 나타낸 것이다. 도 6b는 비장, 비배수(non draining) 및 배수 림프절을 배양하고, MOG로 재자극한 것을 나타낸 것이다. ³H를 배양액에 첨가하고 밤새 배양한 후 티미딘 혼입에 대해 분석하거나, 세포를 PMA/이오노마이신으로 6시간 동안 재자극하고 IL-17 및 IFNγ에 대하여 염색하였다(도 6c). 도 6c 및 6d는 척수 유래 세포를 6시간 동안 PMA/이오노마이신으로 재자극하고, IL-17 및 IFNγ에 대하여 염색한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 인간 CD2 T 세포-특이적 조절 요소(CD2 T cell-specific regulatory element)의 제어하에 마우스의 TL1A가 넣어진 CD2-TL1A 형질전환 마우스에서의 증가된 T 세포 활성화 및 자연적 염증성 장질환(spontaneous inflammatory bowel disease)을 보여준다. 도 7a는 3개의 독립된 계통(founder line)의 CD2-TL1A 형질전환 마우스로부터 분리된 T 세포에서의 증가된 CD44 발현을 나타낸 것이다. 도 7b는 CD2-TL1A 형질전환 마우스 유래 및 한배로부터 유래된 대조군(WT)의 회장(ileum)의 대표적인 육안(Gross)(상부), 저배율(low power) H&E 절편(중앙), 및 고배율 H&E 절편(하부) 이미지를 나타낸 것이다. 장벽비후(bowel wall thickening), 융모의 파괴(destruction of villi) 및 점막 내로의 염증성 세포의 침윤(infiltration)을 볼 수 있다.
도 8은 TL1A가 DR3를 통하여 CD4⁺ T 세포에서 증식 및 사이토카인 생성을 공자극함을 보여준다. 도 8a는 C57BL/6 또는 DR3^-/- 마우스 유래의 정제된 CD4⁺ T 세포가 3일간 10ng/ml의 마우스 rTL1A의 존재 또는 부재하에 항-CD3 또는 항-CD3 및 항-CD28로 활성화됨을 나타낸 것이다. ³H를 배양액에 첨가하고, 밤새 배양한 후 티미딘 혼입에 대해 분석하였다. 에러 바(error bars)는 3개 샘플의 평균의 표준 오차(standard error of the mean)를 나타낸다. 도 8b는 C57BL/6 유래의 정제된 T 세포를 상기와 같지만, 3일간 10μg/ml의 항-IL-2Rα 항체 또는 아이소타입(isotype) 대조군의 존재하에 배양하였다(왼쪽 패널). IL-2^-/- 또는 IL-2^+/+ 유래의 정제된 T 세포를 3일간 10U/ml의 IL-2의 부재 또는 존재하에 상기와 같이 배양하였다(중앙 및 오른쪽 패널). 에러 바는 3개 샘플의 평균의 표준 오차를 나타낸다. 도 8c는 도 8a에서와 같이 활성화되고 배양된 CD4⁺ T 세포로부터의 상층액을 정해진 시점에서 수집하였고, 표기된 사이토카인은 사이토카인 비드 어레이(cytokine bead arrays)로 측정되었으며; n.d.=검출 한계 이하(4pg/ml)임을 나타낸 것이다.
도 9는 수지상 세포 및 T 세포에서의 TL1A 발현의 서로 다른 유도를 보여준다. 도 9a는 야생형 C57BL/6 마우스로부터의 골수 유래 수지상 세포 또는 CD11c⁺ 수지상 세포를 100ng/ml의 LPS, 20μg/ml의 SEA 또는 10μg/ml의 STAg의 존재 또는 부재하에 정해진 시간 동안 배양하고 자극한 것을 나타낸 것이다. RNA를 각 샘플로부터 제조하고, 역전사 효소 정량적 PCR(reverse-transcriptase quantitative PCR, RT-qPCR)에 사용하였다. 도 9b는 야생형 C57BL/6 또는 표기된 녹-아웃(KO) 마우스로부터의 골수 유래 수지상 세포를 배양하고, 3시간 동안 100ng/ml의 LPS의 존재 또는 부재하에 자극한 것을 나타낸 것이다. RNA를 각 샘플로부터 제조하고, 역전사 효소 정량적 PCR에 사용하였다. 도 9c는 야생형 C57BL/6로부터의 골수 유래 수지상 세포를 배양하고, 100ng/ml의 LPS, 또는 Ig 가교(cross linking)의 존재 또는 부재하에 정해진 시간 동안 자극하였고, RNA를 각 샘플로부터 제조하여 RT-qPCR에 사용한 것을 나타낸 것이다. 도 9d는 야생형 C57BL/6 또는 DR3^-/- 마우스로부터 정제된 T 세포를 배양하고, 표기된 시간 동안 5μg/ml의 항-CD3 및 항-CD28로 자극한 것을 나타낸 것이다. RNA를 각 샘플로부터 제조하고, RT-qPCR에 사용하였다. 결과들은 각 집단의 비처리 세포(도 9a-c)에 대하여 또는 각 유전자형(genotype)의 비자극 T 세포(도 9d)에 대하여 계산된 TL1A mRNA의 양을 나타낸다. T 세포에서의 TL1A의 기저 mRNA 레벨은 수지상 세포보다 대략 50배 낮았다. 에러 바는 3개 샘플의 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 10은 DR3^-/- T 세포가 수지상 세포의 존재하에 배양될 때 증식이 감소되며, 변경된 사이토카인을 생성함을 보여준다. 도 10a는 골수 유래 수지상 세포를 3일간 표기된 Ova 펩티드 농도의 존재하에, 그리고 CTLA4Ig의 부재(왼쪽 패널) 또는 존재(오른쪽 패널)하에 미접촉 OT-Ⅱ 또는 DR3^-/- OT-Ⅱ CD4⁺ T 세포와 함께 배양한 것을 나타낸 것이다. ³H를 배양액에 첨가하고, 밤새 배양한 후 티미딘 혼입에 대해 분석하였다. 도 10b는 상기 배양액으로부터의 상층액을 72시간 후에 수집하고, 사이토카인 생성에 대하여 테스트한 것을 나타낸 것이며, n.d. = 검출 한계 이하(4pg/ml)이다.
도 11은 DR3가 미접촉 T 세포의 Th1, Th2 또는 Th17 분화를 필요로 하지 않음을 보여준다. 도 11a는 T 세포가 제거된 APCs를 4일간 Th0, Th1, Th2 또는 Th17의 극성화 조건(polarization conditions)에서 수용성 항-CD3 및 항-CD28의 존재하에 C57BL/6 또는 DR3^-/- 정제된 미접촉 CD4⁺ T 세포와 함께 배양한 것을 나타낸 것이다. 그 후 세포를 5-6시간 동안 PMA와 이오노마이신으로 재자극하고, 세포 내 사이토카인에 대해 염색하고, 이를 유세포 분석기로 분석하였다. 도 11b는 분리된 CD11c⁺ 수지상 세포를 6일간 Th0, Th1 또는 Th2 극성화 조건에서 Ova 펩티드의 존재하에 또는 STAg의 존재하에 OT-Ⅱ 또는 DR3^-/- OT-Ⅱ 정제된 미접촉 CD4⁺ T 세포와 함께 배양한 것을 나타낸 것이다. 그 후 5-6시간 동안 항-CD3 및 항-CD28로 재자극하고, 세포 내 사이토카인에 대해 염색하고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 12는 DR3가 Th2-매개성 폐 염증에 필수적이라는 것을 보여준다. 마우스를 Alum + PBS(대조군) 또는 Alum + Ova로 감작시켰다. 그 후, 상기 마우스를 PBS(대조군) 또는 Ova로 유발하였다. 도 12a는 기도(airway, aw)와 침윤세포(화살표)를 나타낸 PAS-염색된 조직의 예를 나타낸 것이다. 도 12b는 점수화된 폐의 조직병리(왼쪽 패널)를 나타내고, BAL에서의 세포를 계산한 것(오른쪽 패널)을 나타낸 것이다. 도 12c는 세포를 폐로부터 추출하고, 유세포 분석기로 분석한 것을 나타낸 것이다(도 12d). RNA를 폐로부터 제조하고, RT-qPCT에 사용하였다. 결과들은 PBS로 처리된 대조군 마우스의 폐에 관하여 계산된 사이토카인 mRNA의 양을 나타낸다. P 값은 DR3^-/-와 Ova로 유도된 대조군 마우스 사이의 표기된 사이토카인의 mRNA 레벨에 대한 이표본 T 검정(unpaired t-test)을 위한 것이다. 도 12w는 비장세포를 3일간 50μg/ml의 Ova 단백질 또는 배지 대조군(media control)의 존재하에서 배양한 것을 나타낸 것이다. 사이토카인 생성에 대하여 혈구계산 비드 어레이(cytometric bead array)로 상층액을 분석하였다. 도 12f는 Ova-특이적 IgE 및 Ova-특이적 IgG1 레벨에 대하여 ELISA로 혈청을 테스트한 것을 나타낸 것이다. 이표본, 양방 T 검정(unpaired, two-tailed T test)를 이용한 그룹 비교에 의하여 얻어진 P 값은 유의미함을 나타내며, n.s. = 유의미하지 않음을 나타낸다.
도 13은 DR3^-/- 마우스가 결함이 있는 T 세포 반응 및 감소된 실험적 알러지성 뇌척수염(EAE)을 가짐을 보여준다. 도 13a는 DR3^-/- 마우스 및 C57BL/6 대조군 마우스에 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 EAE를 유도하고, 임상 스코어를 매일 측정한 것을 나타낸 것이다. 도 13b는 MOG 주사 부위로부터의 배액 림프절(draining lymph node)을 채취하고, 세포를 표기된 양의 MOG 펩티드로 재자극한 것을 나타낸 것이다. 도 13c는 척수로부터 채취된 세포를 4시간 동안 항-CD3 및 항-CD28로 재자극하고, T 세포 표면 마커를 위해 유세포 분석기로 분석하고, 개폐형(gated) CD45⁺ CD4⁺ 세포를 세포 내 사이토카인 생성에 대하여 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 13d는 표기된 마우스 군으로부터의 척수 또는 비장으로부터 유래된 mRNA를 IL-17 및 IFN-γ mRNA에 대하여 RT-qPCR로 분석하였다. 그 결과들을 β2m 또는 CD3-δ로 정규화하였다. 에러 바(error bars)는 3개 샘플의 평균의 표준 오차(standard error of the mean)를 나타낸다.
도 14는 톡소 플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)에 대한 정상적인 전신 반응 (systemic response)을 보여준다. 표기된 마우스에 평균 20 cyst/animal로 복강 내로 접종하였다. 7주 후, 비장 세포를 채취하고, 48시간 동안 항-CD3 및 항-CD28과 함께 또는 STAg와 함께 배양하고, 상층액을 표기된 사이토카인의 생성에 대하여 테스트하였다.
도 15는 인간 및 마우스에서의 T 세포 특이적 DR3 발현을 나타낸 것이다. SymAtlas(symatlas.gnf.org)로부터 얻은 DR3에 대한 마이크로어레이-유래 유전자 발현 데이터(TNFRSF25)는 마우스 조직(도 15a) 및 인간 조직(도 15b)으로부터의 다양한 세포 형태를 보여준다(Su et al., 2004). 데이터를 gcRMA 알고리즘으로 정규화하였다.
도 16은 DR3^-/- 및 WT T 세포의 활성화 후 표면 마커 발현의 역학(kinetic)을 나타낸 것이다. C57BL/6 또는 DR3^-/- 마우스로부터 정제된 CD4⁺ T 세포를 10ng/ml의 마우스 rTL1A의 존재 또는 부재하에 1μg/ml의 항-CD3로 활성화시켰다. 세포를 자극하기 24시간, 48시간 및 72시간 전에 표기된 활성화 마커에 대하여 염색하고, 유세포 분석기로 측정하였다.
도 17은 미접촉 T 세포에의 TL1A의 효과를 나타낸 것이다. 도 17a는 C57BL/6 또는 DR3^-/- 마우스로부터 유래된 정제된 미접촉 (CD62L^hiCD44^lo)CD4⁺ T 세포를 3일간 10ng/ml의 마우스 rTL1A의 존재 또는 부재하에 항-CD3로 활성화시킨 것을 나타낸 것이다. ³H-티민을 배양액에 첨가하고, 밤새 배양한 후 티미딘 혼입에 대해 분석하였다. 도 17b는 상기와 같이 배양된 미접촉 CD4⁺ 세포로부터의 상층액을 3일 후 채취하고, 사이토카인 생성에 대하여 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 17c는 C57BL/6 또는 DR3^-/- 마우스로부터 유래된 비장 및 림프절을 CD4⁺ T 세포에서 CD44 발현을 측정함으로써 기억 집단(memory population)에 대해 분석하였다.
도 18은 Ova 펩티드가 결합된 수지상 세포(Ova peptide-pulsed DC)를 사용하여 DR3^-/- 및 WT OT-Ⅱ T 세포의 활성화한 후의 표면 마커 발현을 나타낸 것이다. 골수 유래 수지상 세포를 표기된 농도의 Ova 펩티드의 존재하에 미접촉 OT-Ⅱ 또는 DR3^-/- OT-Ⅱ T 세포와 함께 배양하였다. 세포를 CD4로 염색하고, 24시간, 48시간 및 72시간 후 표면 발현 마커를 표시하고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 19는 Ova-유도성 폐 염증에서의 T 세포 및 대식세포(macrophage)의 변경된 위치를 나타낸 것이다. 실험 방법에 기술된 바와 같이 Ova로 촉발되고(primed) 유발된(challenged) 표기된 유전자형의 마우스로부터 얻은 폐의 조직학적 절편을 항-CD3(T 세포) 또는 항-F4/80(대식세포) 마커 항체 및 HRP-결합 2차 항체로 면역조직학적으로 표지하였다. 기도(aw) 및 혈관(bv)을 나타내었다.
도 20은 기능적 항-TL1A 차단 항체의 특성을 나타낸 것이다. 도 20a-d는 마우스 TL1A-GFP 융합 단백질로 형질감염된 세포의 유세포 분석적 염색을 나타낸 것이다. 도 20a는 음성 대조군인 mAb이다. 도 20b 및 20c는 두 개의 양성 항-TL1A 클론이다. 도 20d는 GFP 단독으로 형질감염된 세포에 반응한 양성 클론이다. 도 20e는 RPMI 8826 세포주에서 TL1A 유도성 아포토시스(apoptosis)의 차단을 나타낸 것이다. 100ng/ml의 TL1A + 시클로헥시미드(cycloheximide, CHX)를 RPMI-8826 B 림프종 세포에 첨가하고, 세포 생존율(cellular viability)을 MTT 검정 24시간 후에 측정하였다. 생존율을 배지 단독을 100%로 하여 정규화하였다. 항-TL1A 항혈청을 1:1000 희석액으로 사용하였다.
도 21은 TL1A 형질전환 마우스에서의 염증성 장질환을 나타낸 것이다. 도 21a는 야생형(WT), TL1A-CD2 line R6(R6) 및 TL1A CD11c line I4(I4) 형질전환 마우스의 회장(ileum) 절편의 육안(상부), 저배율(중간) 및 고배율을 나타낸 것이다. 도 21b 및 21c는 CD2-TL1A 및 CD11c-TL1A 형질전환 마우스의 표기된 부위의 조직병리학적 IBD 스코어를 요약한 것이다. 도 21d는 표기된 군의 마우스들의 젖을 떼게 한 후, 3주간의 체중 증가를 나타낸 것이다. 도 21e는 정량적 RT-PCR로 측정하고 야생형 마우스의 평균으로 정규화시킨, CD2-TL1A 형질전환 마우스의 회장에서의 표기된 사이토카인에 대한 RNA의 상대적 레벨을 나타낸 것이다.
도 22a 내지 22c는 녹색 형광 단백질(Green Flourescent Protein, GFP)과 융합된 TL1A로 형질감염된 293T 세포를 사용하여 항-TL1A 항체를 선별하는 전략을 나타낸 것이다. 예시는 마우스(murine) TL1A(mTL1A)에 대한 항체의 선별을 나타낸 것이다. 알매니안 햄스터(Armenian Hamsters)에 마우스 재조합 TL1A를 사용하여 면역화하였다. 마우스 TL1A로 형질감염된 293T 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 선별하였다. 예시는 A에서의 양성 클론에 대하여 나타낸 것이다. B에서는, 추가 분석을 위하여 선택된 표기된 양의 두 개의 클론에 의한 mTL1A의 예시적 염색을 나타내었다. mIgG2a 카파 아이소타입 항체인 항-인간 TL1A 클론 1A9 및 1C6을 선택하기 위하여 인간 재조합 TL1A를 사용하여 면역성을 갖게 한 마우스로부터 하이브리도마를 선별하기 위하여, 인간 TL1A를 발현하는 293T 세포를 이용한 동일한 전략을 사용하였다.
도 23은 야생형 또는 TL1A 형질전환 마우스의 T 세포를 24시간 동안 항-CD3/항-CD28로 활성화시킨 후, 범례에 표기한 바와 같이 표기된 세포 타입에서의 이 mAb에 의한 표면 TL1A의 인식을 입증하기 위하여 항-TL1A mAb 5G4.6으로 염색한 것을 나타낸 것이다. 회색으로 그림자진 그래프는 대조 염색제로서 햄스터 Ig를 사용한 형광발광의 백그라운드 레벨을 나타낸다.
도 24는 항-인간 TL1A mAb 1A9를 사용하는, 체액(body fluid) 및 배양 상층액에서의 인간 TL1A의 검출을 위한 비드-기반 검정의 민감도 곡선(sensitivity curve)을 나타낸 것이다.
도 25는 표기된 mAb의 존재하에 마우스(A) 또는 인간(B) TL1A + 시클로헥시미드(CHX)로 처리된 TF1 적백혈병 세포(erythroleukemia cell)를 나타낸 것이다. 프로메가 셀타이터-글로® ATP 시약(Promega CellTiter-Glo® ATP reagent)으로 세포 생존율을 측정하였다. 발광에의 변화는 이 세포들에서 TL1A + CHX에 대하여 알려진 반응인 세포의 사멸을 나타낸다. 발광에의 변화의 감소는 mAb에 의한 TL1A 작용의 차단을 나타낸다. 이들 mAb는 또한 인간 및 마우스 TL1A 사이에서 교차반응하지 않음을 보여주었다.
도 26은 항-마우스 TL1A mAb를 사용한 TNBS 대장염(TNBS colitis)의 예방을 나타낸 것이다. A) 0일째에 트리니트로-벤젠 술폰산(trinitro-benzene sulphonic acid, TNBS)의 직장 내 투여로 TNBS 대장염이 발병하도록 유도된 마우스 집단에서의 체중 감소. 10mg/kg 항-TL1A mAb 5G4.6 또는 대조군 햄스터 IgG를 1일 전 또는 0일째에 복강 내로 주사하였다. 각 지점은 집단의 평균 체중을 나타낸다. 실험이 끝나기 전에 죽은 마우스들은 화살표로 표기하였다. 데이터는 그룹당 최소 8마리의 마우스를 이용한 두 개의 독립적인 실험을 나타낸다. B) (A)에서와 같이 대조군 또는 항-TL1A mAb로 처리된 TNBS 대장염이 발생하도록 유도된 마우스로부터 얻은 결장의 전형적인 H&E 절편. 화살표는 대조군 Ab 처리된 마우스의 심각한 염증 부위를 나타낸다. 왼쪽 패널은 50×, 오른쪽 패널은 동일한 절편의 200× 확대이다. (A)에서 대장염 유도 후 6일째에 마우스의 평균 병증 스코어(pathology scores)를 나타내었다.
도 27은 항-마우스 TL1A mAb 5G4.6에 의한 콜라겐 유도성 관절염(Collagen-Induced Arthritis, CIA)의 예방을 나타낸 것이다. A. 표준 방법에 의해 DBA/1 마우스에 CIA를 유도하였다. 주 1회 20mg/kg의 항-TL1A mAb 5G4.6(치료군, n=5) 또는 햄스터 면역글로불린(대조군, n=7) 중 하나의 복강 내 주입은 콜라겐을 이용한 초기 예방접종 후 21일째에 시작하였다. 3개의 독립된 실험의 대표적인 예를 나타내었다. 매일 임상 스코어를 이표본 t-검정을 사용하여 비교하였으며, 유의성에 대한 p값은 상기 각 날짜 위의 별표(* = p < 0.05, ** = P < 0.005)로 나타낸 상기 각 시점을 나타낸다. 두 그래프의 경향을 비교하기 위하여 이원분산분석(2-way ANOVA)도 수행하고, 각 실험의 오른편에 p값을 나타내었다. B. 매일 항-TL1A 처리군 및 대조군 사이에서 관절염이 없는 마우스의 생존 분석의 비율을 비교하였다. 관절염을 두 개 또는 그 이상의 조합된 임상 스코어로 정의하였다. C. 패널 A에서 CIA가 발생하도록 유도된 각 군의 마우스로부터 얻은 혈청을 표기된 시점에서 수집하고, ELISA에 의해 항-닭(anti-chicken) 콜라겐 IgG 레벨을 측정하였다.
도 28은 항-마우스 TL1A mAb 5G4.6을 이용하여 TL1A를 차단하는 것은 CIA에서의 관절 스코어(joint score)와는 관계없이 뼈 침식(bony erosions)을 감소시킨다. A) 방법에 기재된 바와 같이 CIA가 발생하도록 유도된 마우스의 뒷발을 채취하고, 10% 포름알데히드로 고정하였다. 발을 마이크로-CT로 스캔하고, 영상을 방법에 기재된 바와 같이 재구성하였다. 예들은 최대 임상 스코어를 가지는 각 치료군으로 나타내었고, 침식 스코어(erosion score)는 치료군에 대하여 모르는 두 개의 독립된 관측자에 의하여 그 발에 대해 얻어진 것이다. B) 임상 스코어에 대해 모르는 두 명의 독립된 관측자들로부터 얻어진 침식 스코어를 각 샘플에 대하여 평균을 내었다. 본원에 나타낸 것은 웰치 보정(Welch's correction)을 이용한 이표본 t-검정으로부터의 P 값(*p=0.05)을 가지는 항-TL1A mAb 5G4.6 처리된 군(n=18)과 대조군-항체 처리된 군(n=20)으로부터 얻어진 스코어의 총합이다. 각 부위의 분석은 발목(ankle)/족근골(tarsus)에서 0.078, 중족지(Metatarsophalangeal, MTP) 관절에서 0.042, 그리고 발가락에서 0.015의 p값을 나타내었다. C) 최대 임상 스코어에 기초한 두 그룹으로부터 얻은 발의 CT 스코어의 비교. 항-TL1A mAb 처리는 임상 스코어와는 관계없이 침식(erosions)을 현저하게 감소시켰다. p < 0.0001는 이원분산분석을 이용하였다(***p < 0.0001).

개시된 방법 및 조성물들은 본원에 포함된 특정 구현 및 예시들, 그리고 도면들에 대한 하기 상세한 설명들 및 그것들의 이전 및 하기의 서술을 참조함으로써 더욱 쉽게 이해되어 질 것이다.

개시된 것들은 개시된 방법 및 조성물들의 산물을 위해 사용될 수 있거나, 산물과 함께 사용될 수 있거나, 산물의 제조에 사용될 수 있는 물질, 조성물 및 성분이거나 개시된 방법 및 조성물들의 산물이다. 이것들 및 다른 물질들도 본원에 개시되어 있으며, 이 물질들의 조합, 서브셋, 상호 작용, 그룹 등이 개시된 경우 이들 화합물의 각각의 다양한 개개 및 집단의 조합(combination) 및 치환(permutatoin)의 특정 참고 문헌들은 명백하게 개시되어 있지 않을 수 있지만, 각각은 특별하게 고려되며 본원에 기재되어 있다. 예를 들면, 펩티드가 개시되고 논의되고 있다면, 펩티드를 포함하는 다수의 분자들을 위해 만들어질 수 있는 다수의 변경들(modifications)이 논의되며, 펩티드의 모든 조합 및 치환과 가능한 변경들은 특별히 반박하는 것으로 나타내지 않는 한 특별하게 고려된다. 따라서, 분자 A, B 및 C 클래스뿐만 아니라 분자 D, E 및 F 클래스가 기재된다면, 조합 분자의 예인 A-D가 개시되면 각각이 개별적으로 인용되어 있지 않다 할지라도, 각각은 개별적이고 종합적으로 고려된다. 따라서, 이 예에서, 각각의 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F는 특별히 고려되며, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적 조합 A-D의 개시로부터 기재된 것으로 고려되어야만 한다. 비슷하게는, 이것들의 임의의 서브셋 또는 조합들 또한 특별히 고려되고 개시된다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F 및 C-E의 서브그룹은 특별히 고려되며, A, B 및 C; D, E 및 F 및 예시적 조합 A-D의 개시로부터 기재된 것으로 고려되어야만 한다. 이 컨셉은 개시된 조성물을 만들고 사용하는 방법에서의 단계를 포함하나 이로 제한되지는 않는 이 출원의 모든 양상에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가적인 단계가 있는 경우, 이들 추가적인 각각의 단계들은 개시된 방법의 임의의 특이적 구현 또는 구현의 조합을 이용하여 수행될 수 있고, 각각의 이러한 조합들은 특별히 고려되고 개시된 것으로 고려되어야만 한다.

사용된 약어의 의미는 다음과 같다: "BSA"는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 의미하고, "ELISA"는 효소결합 면역흡착 검정법(enzyme linked immunosorbent assay)을 의미하고, "CIH"는 콜라겐 유도성 관절염(collagen-induced arthritis)을 의미하고, "SF"는 윤활액(synovial fluid)을 의미하고, "microCT"는 마이크로 단층촬영(microtomography)을 의미하고, "APC"는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell)를 의미하고, "WT"는 야생형(wild type)을 의미하고, "KO"는 녹-아웃(knockout)을 의미하고, "DC"는 수지상 세포(dendritic cells)을 의미하고, "RIA"는 방사성 면역검정법(radioimmunoassay)을 의미하고, "RIPA"는 방사성면역 침강 검정법(radioimmune precipitation assay), "FRET"는 형광공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer)를 의미하고, "FRAP/FLAP"는 광퇴색 후 형광회복/내재화(fluorescence recovery/localization after photobleaching)을 의미하며, "FACS"는 형광세포 분리(fluorescence activated cell sorting)를 의미하고, "RT-PCR"은 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction)을 의미하고, "LPS"는 지질다당류(lipopolysaccharide)를 의미하고, "FADD"는 Fas 관련 사멸 도메인 단백질(fas-associated protein with Death Domain)을 의미하고, "BALF"는 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid)을 의미한다.

당업자들은 본원에 기재된 방법 및 조성물의 특정 구현을 위한 많은 동등물을 단지 통상적인 실험을 사용하여 알아내거나 확인할 수 있을 것이다. 이와 같은 동등물은 하기 청구항들에 포함된다.

개시된 방법 및 조성물들은 달라질 수 있으므로 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약들로 한정되지 않는다는 것은 말할 것도 없는 일이다. 본원에 사용된 용어들은 특정 구현들을 설명하기 위한 것일 뿐, 첨부된 청구항에 의해서만 한정되어 질 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니라는 것 또한 말할 것도 없는 일이다.

A. 치료 방법

DR3 및 TL1A 사이의 상호작용을 차단하는 것을 포함하는, 피험자에게서 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 내인성(endogenous) DR3의 레벨(levels), 활성(activity) 또는 이용성(availability)을 감소시킴으로써 차단될 수 있다. DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 또한 내인성 TL1A의 레벨, 활성 또는 이용성을 감소시킴으로써 차단될 수 있다. DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 두 분자 간의 상호작용을 직접적으로 간섭(interference)하는 약제를 사용하여 차단될 수 있다. 예를 들면, 직접적인 간섭은 TL1A에 대한 DR3의 결합 부위에서 DR3에 결합하는 약제 또는 DR3에 대한 TL1A의 결합 부위에서 TL1A에 결합하는 약제에 의해 영향을 받을 수 있다. 전형적으로, 이 결합은 그 부위에 결합하는 다른 분자들의 능력을 경쟁적으로 간섭할 것이다.

단백질의 레벨, 활성 또는 이용성은 조절(modulating), 예를 들어, 전사(transcription), 번역(translation), 전좌(translocation), 유비퀴틴화(ubiquitination), 인산화(phosphorylation), 글리코실화(glycosylation) 또는 펩티드의 프로펩티드 절단(propeptide cleavage)에 의해 영향을 받을 수 있다.

i. 기능성 핵산( Functional Nucleic Acids )

예를 들어, TL1A의 내인성 레벨은 안티센스(antisense), RNAi, siRNA, 리보자임(ribozymes) 또는 압타머와 같은 기능성 핵산을 사용하여 감소될 수 있다.

기능성 핵산은 표적 분자에 결합하거나 특정 반응을 촉매하는 것과 같은 특이적 기능을 가지는 핵산 분자이다. 기능성 핵산 분자는 하기의 카테고리로 나눠질 수 있지만, 이로 제한됨을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, 기능성 핵산은 안티센스 분자, 압타머, 리보자임, 삼중체 형성 분자(triplex forming molecules), RNAi 및 외부 가이드 서열(external guide sequence)을 포함한다. 기능성 핵산 분자는 표적 분자가 지니는 특이적 활성의 작용인자(effectors), 억제인자(inhibitors), 조절인자(modulators) 및 자극인자(stimulators)로서 작용할 수 있거나, 기능성 핵산 분자는 임의의 다른 분자들과는 관계없는 새로운(de novo) 활성을 가질 수 있다.

기능성 핵산 분자(functional nucleic acid molecules)는 DNA, RNA, 폴리펩티드 또는 탄수화물 사슬과 같은 임의의 거대분자(macromolecules)과 상호작용할 수 있다. 따라서, 기능성 핵산은 TL1A의 mRNA 또는 TL1A의 유전체(genomic) DNA와 상호작용할 수 있거나, 그것들은 폴리펩티드 TL1A와 상호작용할 수 있다. 대안적으로, 기능적 핵산은 DR3의 mRNA 또는 DR3의 유전체 DNA와 상호작용할 수 있거나, 그것들은 DR3 폴리펩티드와 상호작용할 수 있다. 종종 기능성 핵산은 표적 분자와 기능성 핵산 분자 사이의 서열 상동성(sequence homology)에 기초하여 다른 핵산과 상호작용하도록 설계된다. 다른 상황에서, 기능성 핵산 분자와 표적 분자 사이의 특이적 인식(recognition)은 기능성 핵산 분자와 표적 분자 사이의 서열 상동성에 기초하고 있는 것이 아니라, 특이적 인식이 일어나도록 하는 3차 구조의 형성에 기초하고 있다.

안티센스 분자(antisense molecules)는 표준적(canonical) 또는 비표준적(non-canonical) 염기쌍(base pairing) 중 하나를 통하여 표적 핵산 분자와 상호작용하도록 설계된다. 안티센스와 표적 분자의 상호작용은 예를 들어, RNAseH 매개성 RNA-DNA 하이브리드 분해(RNAseH mediated RNA-DNA hybrid degradation)를 통하여 표적 분자의 파괴를 촉매하도록 설계된다. 대안적으로, 안티센스 분자는 전사(transcription) 또는 복제(replication)와 같은 표적 분자에서 일반적으로 일어날 수 있는 프로세싱 기능을 간섭하도록 설계된다. 안티센스 분자는 표적 분자의 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 표적 분자의 가장 접근 가능한 부위를 발견함으로써 안티센스 효율을 최적화하기 위한 많은 방법들이 존재한다. 예시적 방법은 시험관 내(in vitro) 선별 실험 및 DMS와 DEPC를 사용하는 DNA 변경(modification) 연구일 수 있다. 안티센스 분자는 10^-6, 10^-8, 10^-10 또는 10^-12보다 작거나 같은 해리상수(dissociation constant, K_d)를 가지는 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 안티센스 분자의 설계 및 사용에 도움을 주는 방법 및 기술의 대표적인 예는 U.S. Patent Nos. 5,135,917, 5,294,533, 5,627,158, 5,641,754, 5,691,317, 5,780,607, 5,786,138, 5,849,903, 5,856,103, 5,919,772, 5,955,590, 5,990,088, 5,994,320, 5,998,602, 6,005,095, 6,007,995, 6,013,522, 6,017,898, 6,018,042, 6,025,198, 6,033,910, 6,040,296, 6,046,004, 6,046,319, 및 6,057,437에서 찾을 수 있다.

압타머(aptamers)는 바람직하게는 특이적 방식으로 표적 분자와 상호작용하는 분자이다. 전형적으로, 압타머는 스템-루프(stem-loops) 또는 G-쿼테트(G-quartets)와 같이 정의된 2차 및 3차 구조로 접히는 길이가 15-50 염기까지인 작은 핵산이다. 압타머는 ATP(U.S. Patent No. 5,631,146) 및 테오필린(theophylline)(U.S. Patent No. 5,580,737)과 같은 작은 분자들뿐만 아니라, 역전사 효소(reverse transcriptase)(U.S. Patent No. 5,786,462) 및 트롬빈(thrombin)(U.S. Patent No. 5,543,293)과 같은 큰 분자들과도 결합할 수 있다. 압타머는 10-12M보다 작은 표적 분자로부터의 해리상수(K_d)로 매우 단단하게 결합할 수 있다. 압타머는 10^-6, 10^-8, 10^-10 또는 10^-12보다 작은 해리상수로 표적분자와 결합하는 것이 바람직하다. 압타머는 매우 높은 수준의 특이도(specificity)로 표적 분자와 결합할 수 있다. 예를 들어, 압타머는 표적 분자와 단지 분자 상의 단 하나의 위치에만 차이가 있는 다른 분자 사이의 결합 친화력에 10,000배보다 큰 차이를 가지는 것이 분리되었다(U.S. Patent No. 5,543, 293). 압타머는 백그라운드 결합 분자에 대한 K_d보다 적어도 10, 100, 1000, 10,000 또는 100,000배 더 작은 표적 분자에 대한 K_d를 가지는 것이 바람직하다. 예를 들어 폴리펩티드에 대한 비교를 할 때, 백그라운드 분자는 서로 다른 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 다양한 서로 다른 표적 분자에 결합하기 위한 압타머를 어떻게 만들고 사용하는지에 대한 대표적인 예는 U.S. Patent Nos. 5,476,766, 5,503,978, 5,631,146, 5,731,424 , 5,780,228, 5,792,613, 5,795,721, 5,846,713, 5,858,660 , 5,861,254, 5,864,026, 5,869,641, 5,958,691, 6,001,988, 6,011,020, 6,013,443, 6,020,130, 6,028,186, 6,030,776, 및 6,051,698에서 찾을 수 있다. 용어 "합성 압타머(synthetic aptamer)"는 지금까지 자연적으로 발생하는 것으로 알려져 있지 않으며, 생물학적 인식 부위(biological recognition site) 또는 압타머 접합체(aptamer conjugate)로서 작용하는 압타머 또는 압타머 서열을 의미한다.

리보자임(lybozymes)은 분자 내(intramolecularly) 또는 분자간(intermolecularly) 화학반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 리보자임은 따라서 촉매성 핵산(catalytic nucleic acid)이다. 리보자임은 분자간 반응을 촉매하는 것이 바람직하다. 해머헤드 리보자임(hammerhead ribozymes)(U.S. Patent Nos. 5,334,711, 5,436,330, 5,616,466, 5,633,133, 5,646,020, 5,652,094, 5,712,384, 5,770,715, 5,856,463, 5,861,288, 5,891,683, 5,891,684, 5,985,621, 5,989,908, 5,998,193, 5,998,203; International Patent Application Nos. WO 9858058 by Ludwig and Sproat, WO 9858057 by Ludwig and Sproat, 및 WO 9718312 by Ludwig and Sproat), 헤어핀 리보자임(hairpin ribozymes)(예를 들어, U.S. Patent Nos. 5,631,115, 5,646,031, 5,683,902, 5,712,384, 5,856,188, 5,866,701, 5,869,339 및 6,022,962) 및 테트라히메나 리보자임(tetrahymena ribozymes)(예를 들어, U.S. Patent Nos. 5,595,873 and 5,652,107)과 같은 자연계에서 발견되는 리보자임에 기초한 뉴클레아제(nuclease) 또는 핵산 중합효소형 반응을 촉매하는 다수의 서로 다른 형태의 리보자임이 존재한다. 자연계에서는 발견할 수 없지만 새로운 특이적 반응을 촉매하도록 조작된 다수의 리보자임도 또한 존재한다(예를 들어, U.S. Patent Nos. 5,580,967, 5,688,670, 5,807,718, and 5,910,408). 바람직한 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단하며, 더욱 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 전형적으로 후속 절단(with subsequent cleavage)으로 표적 기질의 인식 및 결합을 통하여 핵산 기질을 절단한다. 이 인식은 종종 대부분 표준 또는 비표준 염기쌍 상호작용에 기초한다. 표적 기질의 인식이 표적 기질 서열에 기초하고 있기 때문에, 이러한 특성은 리보자임이 핵산의 표적 특이적 절단을 위한 특별히 우수한 후보물질이 되도록 한다. 다양한 서로 다른 반응을 촉매하기 위한 리보자임을 어떻게 만들고 사용하는지에 대한 대표적인 예는 U.S. Patent Nos. 5,646,042, 5,693,535, 5,731,295, 5,811,300, 5,837,855, 5,869,253, 5,877,021, 5,877,022, 5,972,699, 5,972,704, 5,989,906, 및 6,017,756에서 찾을 수 있다.

삼중체 형성 기능성 핵산 분자(triplex forming functional nucleic acid molecules)는 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산과 상호작용할 수 있는 분자이다. 삼중체 분자가 표적 영역과 상호작용할 때, 삼중체라 불리는 구조가 형성되며, 왓슨 크릭(Watson-Crick) 및 후그스틴형 염기쌍(hoogsteen base-pairing) 양쪽 모두에 의존하는 복합체를 형성하는 DNA의 세 개의 가닥이 있다. 삼중체 분자는 그것들이 높은 친화력과 특이도로 표적 영역과 결합할 수 있기 때문에 바람직하다. 삼중체 형성 분자는 10^-6, 10^-8, 10^-10 또는 10^-12보다 작은 K_d를 가지는 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 다양한 서로 다른 표적 분자와 결합하기 위한 삼중체 형성 분자를 어떻게 만들고 사용하는지에 대한 대표적인 예는 U.S. Patent Nos. 5,176,996; 5,645,985; 5,650,316; 5,683,874; 5,693,773; 5,834,185; 5,869,246; 5,874,566 및 5,962,426에서 찾을 수 있다.

외부 가이드 서열(external guide sequences, EGSs)은 복합체를 형성하는 표적 핵산 분자와 결합하는 분자이며, 이 복합체는 표적 분자를 절단하는 RNase P에 의해 인식된다. EGSs는 선택되는 RNA 분자를 특이적으로 표적화하도록 설계될 수 있다. RNAse P는 세포 내에서 운반 RNA(transfer RNA, tRNA)의 프로세싱을 돕는다. 세균성 RNAse P는 천연의 tRNA 기질을 모방하기 위하여 표적 RNA:EGS 복합체를 만들어내는 EGS를 사용하는 것에 의하여 실질적으로 임의의 RNA 서열을 절단하도록 유인될 수 있다(WO 92/03566 by Yale, and Forster and Altman, Science 238:407-409 (1990)).

유사하게는, 진핵 EGS/RNAse P-유도성 RNA 절단은 진행세포 내에서 원하는 표적을 절단하는데 사용될 수 있다(Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8006-8010 (1992); WO 93/22434 by Yale; WO 95/24489 by Yale; Yuan and Altman, EMBO J 14:159-168 (1995), and Carrara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:2627-2631 (1995)). 다양한 서로 다른 표적 분자의 절단을 용이하게 하기 위한 EGS 분자를 어떻게 만들고 사용하는지에 대한 대표적인 예는 U.S. Patent Nos. 5,168,053, 5,624,824, 5,683,873, 5,728,521, 5,869,248 및 5,877,162에서 찾을 수 있다.

유전자 발현(gene expression) 또한 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)을 통하여 매우 특이적인 방식으로 효과적으로 침묵화(silenced)될 수 있다. 이 침묵(silencing)은 원래 이중 가닥 RNA(double stranded RNA, dsRNA)의 첨가로 발견된다(Fire,A., et al. (1998) Nature, 391:806-11; Napoli, C., et al. (1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, G.J. (2002) Nature, 418:244-51). 일단 dsRNA가 세포로 들어가면, RNase Ⅲ-유사 효소(RNAse Ⅲ-like enzyme)인 다이서(Dicer)에 의해 3' 말단으로 2 뉴클레오티드가 연장된 돌출부(overhangs)를 포함하는 21-23 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥의 짧은 간섭 RNAs(small interfering RNAs, siRNA)로 절단된다(Elbashir, S.M., et al. (2001) Genes Dev., 15:188-200; Bernstein, E., et al. (2001) Nature, 409:363-6; Hammond, S.M., et al. (2000) Nature, 404:293-6). ATP 의존적 단계(ATP dependent step)에서, siRNAs는 흔히 RNAi 유도성 침묵 복합체(RNAi induced silencing complex, RISC)로 알려진 다중서브유닛 단백질 복합체(multisubunit protein complex)로 편입되고, 표적 RNA 서열로 siRNAs를 가이드한다(Nykanen, A., et al. (2001) Cell, 107:309-21). siRNA 듀플렉스가 풀리는 어느 지점에서, 안티센스 가닥은 여전히 RISC에 결합하고 있으며, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제의 조합에 의해 상보적 mRNA 서열을 직접적으로 분해하는 것으로 보인다(Martinez, J., et al. (2002) Cell, 110:563-74). 그러나, iRNA 또는 siRNA의 효과 또는 그것들의 용도는 어떤 형태의 메커니즘으로 제한되지 않는다.

짧은 간섭 RNA(short Interfering RNA, siRNA)는 서열-특이적 전사 후 유전자 침묵(sequence-specific post-transcriptional gene silencing)을 유도하여 유전자 발현을 감소시키거나 심지어 저해할 수 있는 이중 가닥의 RNA이다. 일 실시예에서, siRNA는 siRNA와 표적 RNA 양쪽 모두에 있는 서열 동일성의 영역 내에서 mRNA와 같은 상동 RNA의 특이적 분해를 촉발한다. 예를 들어, 본원에 이들 siRNAs를 만드는 방법을 위한 참고자료로 통합되어 있는 WO 02/44321은 염기쌍이 3'로 돌출된 말단을 가지는 경우 표적 mRNAs의 서열-특이적 분해가 가능한 siRNAs를 개시하고 있다. 서열 특이적 유전자 침묵은 효소 다이서에 의해 생성되는 siRNAs를 모방하는 합성의, 짧은 이중 가닥 RNAs를 사용하여 포유동물의 세포에서 달성될 수 있다(Elbashir, S.M., et al. (2001) Nature, 411:494 498, Ui-Tei, K., et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82). siRNA는 화학적으로 또는 시험관 내에서 합성될 수 있고, 또는 세포 안에서 siRNA로 처리되는 짧은 이중 가닥 헤어핀-유사 RNAs(short double-stranded hairpin-like RNAs, shRNAs)로 인하여 만들어질 수 있다. 합성 siRNAs는 일반적으로 알고리즘(algorithms) 및 기존의 DNA/RNA 합성기를 사용하여 설계된다. 공급자는 앰비온(Ambion)(Austin, Texas), 켐진스(ChemGenes)(Ashland, Massachusetts), 다마콘(Dharmacon)(Lafayette, Colorado), 글렌 리서치(Glen Research)(Sterling, Virginia), MWB 바이오테크(MWB Biotech)(Esbersberg, Germany), 프롤리고(Proligo)(Boulder, Colorado) 및 퀴아젠(Qiagen)(Vento, The Netherlands)을 포함한다. siRNA는 또한 앰비온의 SILENCER® siRNA 컨스트럭션 키트(construction kit)와 같은 키트를 사용하여 시험관 내에서 합성될 수 있다. 어떤 실시예에서, siRNAs는 TL1A 유전자 또는 DR3 유전자와 같은 어떤 표적 유전자에 대하여 유도된다.

벡터로부터 siRNA의 생산은 짧은 헤어핀 RNAs(shRNAs)의 전사를 통하여 더욱 일반적으로 행해진다. shRNA를 포함하는 벡터의 생산을 위한 키트는 예를 들어, 임제넥스(Imgenex)의 GENESUPPRESSOR^TM 컨스트럭션 키트 및 인비트로젠(Invitrogen)의 BLOCK-1T^TM 유도성 RNAi 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터(lentivirus vector)와 같이 입수가능하다. 본원에 개시된 것들은 본원에 개시된 염증성 매개물질에 대한 서열에 기초하여 상기에 기재된 것과 같이 설계된 임의의 shRNA이다.

플라스미드(plasmids)는 SEQ ID NOS:1 및 3으로 표시된 하나 또는 그 이상의 서열을 인식하는 안티센스 서열 또는 SEQ ID NOS:2 및 4에 열거된 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 바이러스성 감염에 관련이 있는 숙주 단백질을 암호화하는 cDNA 단편 또는 변이체를 PCR로 증폭하였다. 뉴클레오티드를 Pfu DNA 폴리머라아제(Stratagene)를 사용하여 증폭하고, pcDNA 벡터(InVitrogen, Carlsbad, CA)와 같은 벡터에서 안티센스 방향(antisense orientation)으로 클로닝하였다. 뉴클레오티드 서열 및 삽입 방향은 서열 분석 키트(Sequenase kit)(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 서열분석을 함으로써 확인될 수 있다.

ii . 우성 음성 펩티드( Dominant Negative Peptides )

DR3와 TL1A 사이의 상호작용은 또한 우성 음성 돌연변이체(dominant negative mutants)를 사용하여 차단될 수 있다.

예를 들어, 우성 음성 돌연변이체는 FADD를 유입하는 '사멸 도메인(death domain)'이 결여된 DR3의 절단된 세포질성 도메인(truncated cytoplasmic domain) 또는 FADD 결합을 제거하는 이 영역에서의 점 돌연변이(point mutations)로 이루어질 수 있다. 이와 같은 우성 음성 구조물(constructs)은 Fas와 같은 관련 수용체에 의한 신호전달(signaling)을 성공적으로 차단한다.

비슷하게는, TL1A의 우성 음성 돌연변이체는 야생형 TL1A 삼량체(trimer)의 서브유닛에 결합하지만, 이전에 기재된 바와 같이 리간드에는 결합하지 않도록 조작될 수 있다(Steed et al., 2003).

저해를 우세하게 하도록 하기 위한 다른 전략은 PLADs의 교시를 위하여 그 전체가 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 U.S. Patent 7,148,061에서 TNFR1 및 Fas에 대하여 기재되어 있는 바와 같이 프리-리간드 어셈블리 도메인(pre-ligand assembly domain, PLAD)을 사용할 수 있다.

DR3에 대한 PLAD는 성숙한 DR3 수용체 폴리펩티드의 N-말단의 겨우 38개의 아미노산만을 포함할 수 있다. 성숙한 수용체 폴리펩티드는 신호 서열(signal sequence)을 포함하지 않는다. 따라서, 서열 R¹-PLAD-R²를 가지는 폴리펩티드를 제공한다. DR3의 RLADs의 예는 하기의 것들을 포함한다:

R¹-DR3 PLAD-R²를 포함하는 폴리펩티드를 개시하였으며, 여기에서 R¹ 및 R²는 선택적이며, 만약 존재할 경우 H, 아실(acyl), NH₂, 아미노산 또는 펩티드일 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 43-58을 포함할 수 있다.

따라서, DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-80, 22-80, 23-80, 24-80, 25-80, 26-80, 27-80, 28-80, 29-80, 30-80, 31-80, 32-80, 33-80, 34-80, 35-80, 36-80, 37-80, 38-80, 39-80, 40-80, 41-80, 42-80, 43-80으로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-79, 22-79, 23-79, 24-79, 25-79, 26-79, 27-79, 28-79, 29-79, 30-79, 31-79, 32-79, 33-79, 34-79, 35-79, 36-79, 37-79, 38-79, 39-79, 40-79, 41-79, 42-79, 43-79로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-78, 22-78, 23-78, 24-78, 25-78, 26-78, 27-78, 28-78, 29-78, 30-78, 31-78, 32-78, 33-78, 34-78, 35-78, 36-78, 37-78, 38-78, 39-78, 40-78, 41-78, 42-78, 43-78로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-77, 22-77, 23-77, 24-77, 25-77, 26-77, 27-77, 28-77, 29-77, 30-77, 31-77, 32-77, 33-77, 34-77, 35-77, 36-77, 37-77, 38-77, 39-77, 40-77, 41-77, 42-77, 43-77로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-76, 22-76, 23-76, 24-76, 25-76, 26-76, 27-76, 28-76, 29-76, 30-76, 31-76, 32-76, 33-76, 34-76, 35-76, 36-76, 37-76, 38-76, 39-76, 40-76, 41-76, 42-76, 43-76으로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-75, 22-75, 23-75, 24-75, 25-75, 26-75, 27-75, 28-75, 29-75, 30-75, 31-75, 32-75, 33-75, 34-75, 35-75, 36-75, 37-75, 38-75, 39-75, 40-75, 41-75, 42-75, 43-75로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-74, 22-74, 23-74, 24-74, 25-74, 26-74, 27-74, 28-74, 29-74, 30-74, 31-74, 32-74, 33-74, 34-74, 35-74, 36-74, 37-74, 38-74, 39-74, 40-74, 41-74, 42-74, 43-74로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-73, 22-73, 23-73, 24-73, 25-73, 26-73, 27-73, 28-73, 29-73, 30-73, 31-73, 32-73, 33-73, 34-73, 35-73, 36-73, 37-73, 38-73, 39-73, 40-73, 41-73, 42-73, 43-73으로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-72, 22-72, 23-72, 24-72, 25-72, 26-72, 27-72, 28-72, 29-72, 30-72, 31-72, 32-72, 33-72, 34-72, 35-72, 36-72, 37-72, 38-72, 39-72, 40-72, 41-72, 42-72, 43-72로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-71, 22-71, 23-71, 24-71, 25-71, 26-71, 27-71, 28-71, 29-71, 30-71, 31-71, 32-71, 33-71, 34-71, 35-71, 36-71, 37-71, 38-71, 39-71, 40-71, 41-71, 42-71, 43-71로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-70, 22-70, 23-70, 24-70, 25-70, 26-70, 27-70, 28-70, 29-70, 30-70, 31-70, 32-70, 33-70, 34-70, 35-70, 36-70, 37-70, 38-70, 39-70, 40-70, 41-70, 42-70, 43-70으로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-69, 22-69, 23-69, 24-69, 25-69, 26-69, 27-69, 28-69, 29-69, 30-69, 31-69, 32-69, 33-69, 34-69, 35-69, 36-69, 37-69, 38-69, 39-69, 40-69, 41-69, 42-69, 43-69로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-68, 22-68, 23-68, 24-68, 25-68, 26-68, 27-68, 28-68, 29-68, 30-68, 31-68, 32-68, 33-68, 34-68, 35-68, 36-68, 37-68, 38-68, 39-68, 40-68, 41-68, 42-68, 43-68로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-67, 22-67, 23-67, 24-67, 25-67, 26-67, 27-67, 28-67, 29-67, 30-67, 31-67, 32-67, 33-67, 34-67, 35-67, 36-67, 37-67, 38-67, 39-67, 40-67, 41-67, 42-67, 43-67로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-66, 22-66, 23-66, 24-66, 25-66, 26-66, 27-66, 28-66, 29-66, 30-66, 31-66, 32-66, 33-66, 34-66, 35-66, 36-66, 37-66, 38-66, 39-66, 40-66, 41-66, 42-66, 43-66으로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-65, 22-65, 23-65, 24-65, 25-65, 26-65, 27-65, 28-65, 29-65, 30-65, 31-65, 32-65, 33-65, 34-65, 35-65, 36-65, 37-65, 38-65, 39-65, 40-65, 41-65, 42-65, 43-65로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-64, 22-64, 23-64, 24-64, 25-64, 26-64, 27-64, 28-64, 29-64, 30-64, 31-64, 32-64, 33-64, 34-64, 35-64, 36-64, 37-64, 38-64, 39-64, 40-64, 41-64, 42-64, 43-64로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-63, 22-63, 23-63, 24-63, 25-63, 26-63, 27-63, 28-63, 29-63, 30-63, 31-63, 32-63, 33-63, 34-63, 35-63, 36-63, 37-63, 38-63, 39-63, 40-63, 41-63, 42-63, 43-63으로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-62, 22-62, 23-62, 24-62, 25-62, 26-62, 27-62, 28-62, 29-62, 30-62, 31-62, 32-62, 33-62, 34-62, 35-62, 36-62, 37-62, 38-62, 39-62, 40-62, 41-62, 42-62, 43-62로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-61, 22-61, 23-61, 24-61, 25-61, 26-61, 27-61, 28-61, 29-61, 30-61, 31-61, 32-61, 33-61, 34-61, 35-61, 36-61, 37-61, 38-61, 39-61, 40-61, 41-61, 42-61, 43-61로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-60, 22-60, 23-60, 24-60, 25-60, 26-60, 27-60, 28-60, 29-60, 30-60, 31-60, 32-60, 33-60, 34-60, 35-60, 36-60, 37-60, 38-60, 39-60, 40-60, 41-60, 42-60, 43-60으로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-59, 22-59, 23-59, 24-59, 25-59, 26-59, 27-59, 28-59, 29-59, 30-59, 31-59, 32-59, 33-59, 34-59, 35-59, 36-59, 37-59, 38-59, 39-59, 40-59, 41-59, 42-59, 43-59로 이루어질 수 있다. DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산21-58, 22-58, 23-58, 24-58, 25-58, 26-58, 27-58, 28-58, 29-58, 30-58, 31-58, 32-58, 33-58, 34-58, 35-58, 36-58, 37-58, 38-58, 39-58, 40-58, 41-58, 42-58, 43-58로 이루어질 수 있다.

R¹ 및/또는 R²가 펩티드인 경우, 이 펩티드는 길이가 다양할 수 있다. 예를 들면, R¹ 및/또는 R²는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 이상의 길이의 아미노산일 수 있다.

폴리펩티드를 포함하는 PLAD는 35-125 아미노산 길이일 수 있다. 다른 양상에서, 분리된 TNF-유사 PLAD를 포함하는 완전한(entire) 폴리펩티드는 단지 125 아미노산 잔기일 수 있고, 따라서 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ,101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 또는 125 아미노산 길이일 수 있다. R¹ 및 R²는 자연적으로 발생하는 DR3 수용체에서 일반적으로 DR3 PLAD와 인접하지 않은 서열일 수 있다. R¹ 및 R²는 또한 자연적으로 발생하는 TNF 수용체-유사 수용체(TNF receptor-like receptor)에서 일반적으로 DR3 PLAD와 인접한 DR3 수용체의 서열일 수 있고, 여기에서 상기 TNF-유사 수용체 PLAD를 포함하는 폴리펩티드는 TNF 수용체-유사 수용체의 완전한 세포 외 도메인이 아니다.

iii . DR3 융합 단백질( DR3 Fusion Protein )

DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 또한 DR3 Fc 융합 단백질을 사용하여 차단될 수 있다. 따라서, DR3 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.

인간 IgG1의 비-Fc 수용체 결합 돌연변이(non-Fc receptor binding mutant)에 융합된 DR3 세포 외 도메인(약 140-150 아미노산)을 포함하거나 이로 이루어지는 융합 단백질을 제공한다(IgG Fc(DR3(human))-huIg 융합 단백질). 상기 융합 단백질은 진핵 세포에서 발현되고, 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 사용하기 위한 단백질 A(protein A)를 사용하여 정제될 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질을 암호화하는 cDNA는 마우스의 꼬리 정맥 안으로의 유체역학 주입(hydrodynamic injection)을 통하여 발현된다. 이 기술은 자가면역 질병 모델을 유도하는 동안 또는 유도한 후 DR3Fc 단백질을 고수준으로 발현할 수 있게 한다(Dagnaes-Hansen et al., 2002; Hodges and Scheule, 2003; Lecocq et al., 2003).

DR3 영역을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또한 이뮤노아드헤신(immunoadhesin)을 암호화하도록 다른 핵산에 기능적으로 연결될 수 있다. 본 명세서의 목적을 위하여, 상기 용어 "이뮤노아드헤신(immunoadhesin)"은 DR3 세포 외 도메인과 같은 비-면역글로불린 분자를 암호화하는 핵산의 적어도 한 부분이 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드(immunoglobulin heavy chain polypeptide), 예를 들어 IgG를 암호화하는 핵산의 적어도 한 부분에 결합되는 핵산에 의해 암호화된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 것으로 정의한다. IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgE의 Fc 영역은 또한 이뮤노아드헤신을 만드는데 사용될 수 있다. 상기 결합(coupling)은 각각 핵산 분절(nucleic acid segment) 및 그것으로부터의 메세지의 기능적 전사 및 번역을 가능하게 하는 방식으로 달성될 수 있다. 이들 IgG 이뮤노아드헤신은 다양한 포유동물 숙주 세포뿐만 아니라 바큘로바이러스에 감염된(baculovirus-infected) 세포에서 일시적(transient) 또는 안정한(stable) 형질감염에 의해 발현될 수 있다. 항체와 유사하게, IgG 이뮤노아드헤신은 단일 단계(single-step) 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피에 의해 그것들이 분비되어 있는 배양 배지로부터 정제될 수 있다.

iv . 항체( Antibodies )

DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 항-DR3 항체의 투여에 의해 차단될 수 있다. 상호작용을 차단하기 위하여, 항-DR3 항체는 길항적(antagonistic)이어야만 한다. 게다가, DR3 Fc 융합 단백질은 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용을 억제할 수 있다.

DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 TL1A 항체의 투여에 의해 차단될 수 있다. TL1A 및 DR3에 대한 차단 항체(blocking antibodies)는 이들 단백질의 완전히 글리코실화된 포유동물의 세포 외 도메인을 사용하여 면역력을 갖게 된 마우스에 의해 생성되고, 특별히 TL1A-DR3 결합 및 신호전달(signal transduction)에 대한 바이오검정법으로 차단 활성을 선별한다. 따라서, 특이적으로 표면 TL1A와 결합하고 지표 세포주(indicator cell line)의 TL1A 유도성 세포 사멸을 저해하는 항-TL1A 항체를 제공한다. 예를 들어, 도 20은 기능성 항-TL1A 차단 항체의 특성을 나타낸다. 이들 항체는 TL1A 유도성 아포토시스를 저해한다(도 20e).

v. 질병( Diseases )

개시된 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하는 방법에서, 염증성 또는 자가 면역성 질병은 T 세포 성분을 가지는 자가 면역성 질병일 수 있다.

개시된 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하는 방법에서, 염증성 또는 자가 면역성 질병은 천식(asthma)일 수 있다. 본 발명의 데이터는 DR3 녹-아웃 마우스가 TL1A/DR3 상호작용의 차단이 이 모델 및 인간 천식에 효과적일 수 있다는 것을 제시하는 천식에 저항성이 있는 동물 모델임을 보여준다.

개시된 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하는 방법에서, 염증성 또는 자가 면역성 질병은 다발성 경화증(multiple sclerosis)일 수 있다. 다발성 경화증에서 활성화된 T 세포의 역할을 지지하는 증거들이 풍부하다: 다발성 경화증 환자의 뇌, 척수(spinal cord) & CSF로의 활성화된 T 세포의 혈관 외 유출(extravasation), 다발성 경화증에서 T 세포에 의한 IL-17 및 인터페론 감마와 같은 염증성 사이토카인의 생성, 및 실험적 다발성 경화증 동물 모델 병변. DR3는 활성화된 T 세포 상에서 발현되며, DR3의 결손은 본원에 나타낸 바와 같이 활성화된 T 세포에 의한 염증성 사이토카인 생성을 감퇴시킨다. 따라서, DR3-TL1A 상호작용의 차단은 T 세포 사이토카인 생성을 감퇴시키고, 다발성 경화증을 개선시킬 것으로 기대된다.

개시된 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하는 방법에서, 염증성 또는 자가 면역성 질병은 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)일 수 있다. 활성화된 T 세포는 류마티스성 관절염을 가지는 환자의 활액막(synovium)에서 발견될 수 있으며, T 세포 기능을 차단하는 약제, 예를 들어 CTLA4에 의한 공자극성(costimulatory) T 세포 차단은 이 질병에 효과적이다. DR3는 활성화된 T 세포 상에 발현되며, DR3의 결손은 본원에 나타낸 바와 같이 활성화된 T 세포에 의한 염증성 사이토카인 생성을 감퇴시킨다. 따라서, DR3-TL1A 상호작용의 차단은 T 세포 사이토카인 생성을 감퇴시키고, 류마티스성 관절염을 개선시킬 것으로 기대된다.

개시된 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하는 방법에서, 염증성 또는 자가 면역성 질병은 제1형 당뇨병(type 1 diabetes)일 수 있다. 제1형 당뇨병은 췌장을 침투하는 활성화된 T 세포에 의해 야기되며, 랑게르한스 섬(islets of langerhans)을 파괴한다. DR3는 활성화된 T 세포 상에 발현되며, DR3의 결손은 본원에 나타낸 바와 같이 활성화된 T 세포에 의한 염증성 사이토카인 생성을 감퇴시킨다. 따라서, DR3-TL1A 상호작용의 차단은 T 세포 사이토카인 생성을 감퇴시키고, 제1형 당뇨병을 개선시킬 것으로 기대된다.

개시된 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하는 방법에서, 염증성 또는 자가 면역성 질병은 이식편대숙주병(graft versus host disease)일 수 있다. DR3를 발현하는 동종특이적(allospecific)으로 활성화된 T 세포는 사이토카인 및 이식편대숙주병에 중요한 작용 분자(effector molecules)를 분비한다. 세 개의 리간드 모두에 결합하는 수용성 유인(decoy) 수용체 DcR3/TR6의 투여를 통한 TNF 패밀리 멤버인 TL1A, Light 및 FasL의 차단은 마우스 모델에서의 이식편대숙주병을 하향조절(downmodulate)한다(Zhang et al., 2001). DR3의 결손은 활성화된 T 세포에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 감퇴시키기 때문에, 상기 기재된 방법에 의한 DR3/TL1A 상호작용의 차단은 이식편대숙주병을 치료하거나 예방할 것으로 기대된다.

개시된 염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하는 방법의 몇몇 양상에서, 염증성 또는 자가 면역성 질병은 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD)이다. 따라서, 몇몇의 양상에 있어서, 상기 방법의 염증성 또는 자가 면역성 질병은 크론병(Crohn's disease)이다.

TL1A 및 DR3는 염증성 장질환을 가지는 환자 및 IBD의 마우스 모델로부터의 조직 샘플에서 발현된다는 것이 발견되었다(Bamias et al., 2003; Bamias et al., 2006). 게다가, T 세포 또는 수지상 세포에서 본질적으로 TL1A를 발현하는 형질전환 마우스의 복수의 세포주는 융모(villi)의 파괴, 장벽비후(Bowel wall thickening), 염증성 세포의 침투에 의한 조직학적 특성을 가지는 십이지장(duodenum) 및 회장(ileum)을 중심으로 하는 자연적 염증성 장질환을 유발한다. 따라서, 상기 기재된 방법에 의한 DR3/TL1A 상호작용의 차단은 염증성 장질환을 치료하거나 예방할 것으로 기대된다.

다른 양상에서, 상기 방법의 염증성 또는 자가 면역성 질병은 염증성 장질환이 아니다. 따라서, 몇몇의 양상에서, 상기 방법의 염증성 또는 자가 면역성 질환은 크론병이 아니다.

2. 효능의 확인( Verification of Efficacy )

염증성 또는 자가 면역성 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법의 효능을 확인하기 위한 방법 또한 제공한다. 동물들은 염증성 장질환 및 대장염의 관련 특성을 나타내도록 유도될 수 있다. 대장염이 발생한 동물은 임의의 포유동물일 수 있으며, 마우스, 쥐, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 염소, 원숭이 및 침팬지를 포함할 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다. 대장염은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 동물에서 유발될 수 있다. 예를 들면, 대장염은 유효량의 합텐(hapten) 시약을 동물의 결장 내로 주입함으로써 유발될 수 있다. 예로써, 합텐 시약은 트리니트로벤젠 술폰산(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS) 또는 옥사졸론(oxazolone)(4-에톡시메틸렌-2-페닐-2-옥사졸린-5-온(4-ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one)일 수 있다.

Th1-매개성 대장염은 TNBS를 이용하여 마우스에 유도될 수 있다. 급성 TNBS-대장염은 1회량의 TNBS를 사용하여 SJL 또는 C57BL10 마우스에서 유도될 수 있다. 간단하게는, 50% 에탄올에 용해시킨 2.5mg의 TNBS(pH 1.5-2.0; Sigma Aldrich, St Louis, MO)를 가볍게 마취된 마우스에 150μl의 총 용량으로 직장 내 투여하였다. TNBS 대장염 Balb/c의 만성 모델을 확립하기 위하여 하기의 방식으로 직장(rectum) 당 주 1회 투여량으로 투여하였다. 마우스에 1-2주 동안 1.5mg의 TNBS(150μl의 총 용량으로 50% 에탄올 비히클로 운반됨), 3-4주 동안 2.0mg의 TNBS 및 5-6주 동안 2.5mg의 TNBS를 투여하였다.

Th2-매개성 대장염은 옥사졸론(oxazolone)을 이용하여 마우스에 유도될 수 있다. 간단하게는, 100% 에탄올에 용해시킨 0.2mL 3% 옥사졸론을 피부에 바름으로써 감작시키고; 감작 5일 후 마우스를 이소플루란(isoflurane)(Baxter, Deerfield, IL)을 이용한 일반적인 마취하에서 50% 에탄올에 용해시킨 150μl의 1% 옥사졸론을 사용하여 직장 내로 유발시켰다.

이 모델은 본원에 기재된 항-DR3 및 항-TL1A 항체 및 DR3-Fc 융합 단백질을 테스트하는데 사용될 수 있다.

3. 선별 검정( Screening Assay )

염증성 질병을 치료하는데 사용될 수 있는 약제를 확인하는 방법 또한 본원에 제공된다. 상기 방법은 결합을 위해 DR3 및 TL1A의 결합을 가능하게 하는 조건 하에 DR3 및 TL1A를 포함하는 샘플을 준비하고, 후보약제와 상기 샘플을 접촉시키고, DR3/TL1A 결합의 레벨을 측정하고, 대조군과 결합 레벨을 비교하는 것을 포함할 수 있으며, 염증성 질병을 치료하는데 사용될 수 있는 약제를 확인하는 대조군과 비교하여 DR3/TL1A 결합이 감소하였다.

TL1A에 대한 DR3의 결합은 단백질 결합을 파괴하지 않는 면역 측정법(immunodetection methods)과 같은 통상의 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 상기 방법은 세포-기반(cell-based) 또는 세포를 포함하지 않는(cell-free) 검정법일 수 있다. 여러 가지 유용한 면역 측정법의 단계들이 각각 그 전체가 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있으며, 특별히 면역 측정법에 관한 교시를 위한 과학 문헌들에 기술되어 있다(예를 들어, Maggio et al., Enzyme-Immunoassay, (1987) and Nakamura, et al., Enzyme Immunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1: Immunochemistry, 27.1-27.20 (1986)). 면역검정법은 그것들의 가장 단순하고 직접적인 감각으로 항체와 항원 간의 결합을 수반하는 결합 검정법이다. 많은 형태 및 포맷들의 면역검정법이 알려져 있으며, 모두 기술된 바이오마커들을 검출하는데 적합하다. 면역검정법의 예는 효소결합 면역흡착 검정법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISAs), 방사성 면역검정법(radioimmunoassay, RIA), 방사성면역 침강 검정법(radioimmune precipitation assays, RIPA), 면역비드 포획 검정법(immunobead capture assays), 웨스턴 블롯(Western blotting), 점 블롯(dot blotting), 겔 이동 검정법(gel-shift assay), 유세포 분석법(flow cytometry), 단백질 검정법(protein assays), 다중화된 비드 어레이(multiplexed bead arrays), 마그네틱 포획(magnetic capture), 생체 내 영상화(in vivo imaging), 형광공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 및 광퇴색 후 형광회복/내재화(fluorescence recovery/localization after photobleaching, FRAP/FLAP)이다.

TL1A에 대한 DR3의 결합은 형광이용 세포 분리기(fluorescence activated cell sorting, FACS)를 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 형광 단백질에 융합된 TL1A 및 DR3로 형질감염된 세포주가 개시되어 있다. 이 세포주들은 생물학적으로 발현되며, 그것들의 생리학적 형태로 TL1A 및 DR3에 결합하는 작은 분자를 위한 고속 대량 스크리닝(high-throughput screens)을 용이하게 할 수 있다.

일반적으로, 후보약제는 천연 생성물 또는 합성(또는 반합성) 추출물의 대형 라이브러리 또는 당업계에 공지되어 있는 방법에 따른 화학 물질 라이브러리로부터 확인될 수 있다. 약물 발견 및 개발 분야의 당업자들은 테스트 추출물 또는 화합물의 정확한 공급원이 본 발명의 선별 방법에 중요하지 않다는 것을 알 것이다. 따라서, 사실상 많은 화학 추출물 또는 화합물들이 본원에 기재된 예시적 방법을 사용하여 선별될 수 있다. 이와 같은 추출물 또는 화합물의 예는 식물(plant)-, 진균(fungal)-, 원핵(prokaryotic)- 또는 동물에 기반한 추출물, 발효액(fermentation broth) 및 합성 화합물뿐만 아니라 기존의 화합물의 변경 또한 포함하지만 이로 제한되는 것은 아니다. 단당-, 지질-, 펩티드-, 폴리펩티드- 및 핵산에 기반한 화합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 많은 화학 화합물들을 랜덤 또는 직접 합성(예를 들어, 반합성 또는 완전합성)하는데 많은 방법들이 또한 이용 가능하다. 합성 화합물 라이브러리는 예를 들어, 브랜든 어소시에이트(Brandon Associates)(Merrimack, NH) 및 알드리치 케미컬(Aldrich Chemical)(Milwaukee, WI)로부터 상업적으로 이용가능하다. 대안적으로, 세균, 진균, 식물 및 동물 추출물의 형태로 천연 화합물의 라이브러리도 바이오틱스(Biotics)(Sussex, UL), 제노바(Xenova)(Slough, UK), 하버 브랜치 오션그래픽스 인스티튜트(Harbor Branch Oceangraphics institute)(Ft. Pierce, Fla.) 및 파르마마르 U.S.A. (PharmaMar, U.S.A.)(Cambridge, Mass.)를 포함하는 다수의 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다. 게다가, 만약 원한다면, 천연 및 합성적으로 생성된 라이브러리는 당업계에 공지된 방법에 따라, 예를 들어 표준 추출 및 분획화 방법에 의해 만들어진다. 또한, 만약 원한다면, 임의의 라이브러리 또는 화합물은 표준 화학, 물리학 또는 생화학적 방법을 사용하여 쉽게 변경된다. 게다가, 약물 발견 및 개발 분야의 당업자들은 가능하면, 염증을 감소시키는 활성에 대한 그것들의 효과가 이미 알려져 있는 물질들의 복제(replicates) 또는 중복(repeats)을 데레플리케이션(dereplication)(예를 들어, 분류학적 데레플리케이션(taxonomic dereplication), 생물학적 데레플리케이션(biological dereplication) 및 화학적 데레플리케이션(chemical dereplication) 또는 임의의 그것들의 조합)하거나 제거하기 위한 방법을 수행하여야만 한다는 것을 쉽게 이해할 것이다.

조 추출물(crude extract)이 원하는 활성을 가지는 것으로 발견된 경우, 관찰된 효과의 원인이 되는 화학적 구성성분을 분리하기 위하여 양성반응을 보이는 추출물의 추가적인 분획(fractionation)이 필요하다. 따라서, 추출, 분획 및 정제 공정의 목표는 DR3 및 TL1A의 결합을 자극하거나 억제하는 활성을 가지는 조 추출물 내의 화학적 실체(chemical entity)의 세심한 정의(characterization) 및 확인(identification)이다. 화합물의 혼합물에서의 활성의 검출을 위하여 본원에 기재되어 있는 동일한 검정법들은 활성 성분을 정제하고, 그것들의 유도체를 테스트하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 불균일한(heterogenous) 추출물의 분획 및 정제는 당업계에 공지되어 있다. 만약 원한다면, 치료에 유용한 약제로 보이는 화합물은 당업계에 공지된 방법에 따라 화학적으로 변경된다. 치료학적 가치가 있을 것으로 확인된 화합물은 그 후 본원에 기재된 것과 같은 질병 또는 질환들을 위한 동물 모델을 사용하여 분석될 수 있다.

후보 약제들은 수많은 화학적 종류들을 포함하지만, 유기 분자들, 예를 들어, 100보다는 크고 2,500 달톤 보다는 작은 분자량을 가지는 작은 유기 화합물이 가장 많다. 후보 약제들은 단백질과의 구조적 상호작용에 필요한 작용기, 특히 수소 결합(hydrogen bonding)을 포함하며, 전형적으로 예를 들어, 적어도 두 개의 작용성 화학기(functional chemical group)에 적어도 아민기, 카르보닐기, 하이드록실 또는 카르복실기를 포함한다. 상기 후보 약제들은 종종 하나 또는 그 이상의 상기 작용기들로 치환된 고리형 탄소(cyclical carbon) 또는 헤테로고리형(heterocyclic) 구조 및/또는 방향족(aromatic) 또는 다방향족(polyaromatic) 구조를 포함한다. 후보 약제들은 또한 펩티드(peptides), 단당류(saccharides), 지방산(fatty acids), 스테로이드(steroids), 퓨린(purines), 피리미딘(pyrimidines), 그것들의 유도체, 구조적 유사체 또는 그것들의 조합을 포함하는 생체분자들 중에서 발견된다. 또 다른 구현에서, 후보 약제는 펩티드이다.

몇몇 구현에서, 상기 후보 물질은 단백질이다. 몇몇 양상에서, 상기 후보 물질은 자연적으로 생성된 단백질 또는 자연적으로 생성된 단백질의 단편(fragments)이다. 따라서, 예를 들어, 단백질을 포함하는 세포 추출물 또는 단백질계 세포 추출물(proteinaceous cellular extracts)의 랜덤 또는 직접적인 소화물(digest)이 사용될 수 있다. 이렇게 하여, 원핵생물성 및 진행생물성 단백질의 라이브러리는 본원의 방법을 사용하여 선별용으로 만들어질 수 있다. 상기 라이브러리는 세균성, 진균성, 바이러스성 및 척추동물 단백질 및 인간 단백질일 수 있다.

4. 투여( Administration )

투여는 피험자에게 투여하는 방법을 의미한다. 이와 같은 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 국소적(topically), 비경구적(parenterally), 경구적(orally), 정맥 내(intravenously), 근육 내(intramuscularly), 피하(subcutaneously) 투여 또는 분무(aerosol)에 의한 투여를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 투여는 연속적 또는 간헐적으로 영향을 미칠 수 있다.

생체 내 투여를 위한 약제학적 조성물은 비경구적으로, 즉 정맥 내, 복강 내, 피하 내, 척수강 내(intrathecally), 척수에로의 주사, 근육 내, 관절강 내(intraarticularly), 간문맥(portal vein) 주사 또는 종양 내(intratumorally)로 투여되는 것이 바람직하다.

본원에 사용된 것으로서, 상기 용어 "비경구적(parenteral)"은 정맥(intravenous), 근육 내(intramuscular), 복강 내(intraperitoneal), 흉골 내(intrasternal), 피하(subcutaneous) 및 관절강 내(intraarticular) 주사 및 투입(infusion)을 포함하는 투여 방식을 말한다. 비경구적 주사를 위한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 멸균 수용액(sterile aqueous solutions) 또는 비수성 용액(nonaqueous solutions), 분산액(dispersions), 현탁액(suspensions) 또는 에멀전(emulsions) 뿐만 아니라, 사용하기 바로 전 멸균된 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 파우더(sterile powders)를 포함한다. 적절한 수성 및 비수성 담체(carriers), 희석제(diluents), 용매(solvents) 또는 비히클(vehicles)의 예는 물(water), 에탄올(ethanol), (글리세롤(glycerol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등과 같은) 폴리올(polyols), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose) 및 그것들의 적절한 혼합물, (올리브 오일과 같은) 식물유(vegetable oils) 및 에틸 올리에이트(ethyl oleate)와 같은 주사가능한 유기 에스테르(organic esters)를 포함한다. 적절한 유동성(fluidity)은 예를 들어, 레시틴(lecithin)과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제(surfactant)의 사용에 의해 유지될 수 있다. 이들 조성물은 또한 방부제(preservatives), 습윤제(wetting agents), 유화제(emulsifying agents) 및 분산제(dispersing agents)를 포함할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 파라벤(paraben), 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀 소르브산(phenol sorbic acid) 등과 같은 다양한 항균 및 항진균제의 포함에 의해 보장될 수 있다. 당(sugars), 소디움 클로라이드(sodium chloride) 등과 같은 등장화제(isotonic agent)가 포함되도록 하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 및 젤라틴(gelatin)과 같은 약제의 포함에 의해 이루어질 수 있다. 주사가능한 데포 형태(depot forms)는 폴리락타이드-폴리글리콜라이드(polylactide-polyglycolide), 폴리(오르토에스테르)(poly(orthoesters)) 및 폴리(안하이드라이드)(poly(anhydrides))와 같은 생분해성 폴리머(biodegradable polymers)로 약물의 마이크로인캡슐(microencapsule) 매트릭스를 형성함으로써 만들어진다. 폴리머에 대한 약물의 비율 및 사용된 특정 폴리머의 특성에 따라, 약물 방출률은 조절될 수 있다. 주사가능한 데포 제형은 또한 신체 조직에 적합한 리포솜(liposomes) 또는 마이크로에멀전(microemulsions)에 약물을 함입(entrapping)시킴으로써 제조된다. 주사가능한 제형은 예를 들어, 세균 리테이닝 필터(bacterial-retaining filter)를 통한 여과에 의하거나, 멸균수 또는 다른 사용하기 전 바로 주사가능한 멸균 매질(media)에 용해시키거나 분산시킬 수 있는 멸균된 고체 조성물의 형태로 살균제(sterilizing agent)를 포함시킴으로써 멸균될 수 있다.

다른 방법에서, 약제학적 제조물은 조직에 대한 제조물의 직접 적용(direct application)에 의해 표적 조직과 접촉될 수 있다. 상기 적용은 국소적(topical), "개방적(open) 또는 "폐쇄적(closed)" 방식으로 이루어질 수 있다. "국소적"은 피부(skin), 비인두(nasopharynx), 외이도(external auditory canal), 눈(eye)과 같은 주변환경에 노출되어 있는 조직에 대한 약제학적 제조물의 직접 적용, 폐(lung), 생식기 점막(genital mucosa) 등에의 흡입(inhalation)을 의미한다. "개방적" 방식은 환자의 피부를 절개하고, 약제학적 제조물이 적용될 내부 조직(underlying tissue)을 직접 가시화하는 것을 포함하는 방식이다. 이것은 일반적으로 폐로 접근하기 위한 개흉술(thoracotomy), 복부내장에 접근하기 위한 개복술(laparotomy) 또는 표적 조직에 도달하기 위한 다른 직접적인 수술 어프로치와 같은 수술 방식(surgical procedure)에 의해 달성된다. "폐쇄적" 방식은 내부 표적 조직이 직접적으로 가시화되지 않지만, 피부의 작은 상처를 통하여 기구를 집어넣는 것을 통하여 접근하는 침습적(invasive) 방식이다. 예를 들면, 상기 제조물은 바늘 세척(needle lavage)에 의해 복막(peritoneum)으로 투여될 수 있다. 비슷하게는, 상기 약제학적 제조물은 요추 천자(lumbar puncture) 동안 주입(infusion)에 의해 뇌척수막(meninges) 또는 척수(spinal cord)로 투여될 수 있으며, 그 후 척추마취(spinal anesthesia) 또는 척수의 메트리자마이드(metrizamide) 영상화를 위해 일반적으로 수행되는 것으로서 환자의 위치를 적절하게 고정(positioning)시킬 수 있다. 대안적으로, 상기 제조물은 내시경(endoscopic devices)을 통하여 투여될 수 있다.

국소 투여는 피부, 점막 또는 폐와 눈의 표면에의 투여를 포함한다. 흡입을 위한 것들을 포함하는 국소 투여를 위한 조성물은 압축(pressurized)되거나 비압축(non-pressurized)될 수 있는 건조 파우더(dry powder)로서 제조될 수 있다. 비압축 파우더 조성물에서, 미세하게 분할된 형태로 활성 성분은 예를 들어, 지름 100 마이크로미터 이상의 크기를 가지는 입자를 포함하는 대형의 약제학적으로 허용가능한 비활성 담체를 포함하는 혼합물에 사용될 수 있다.

눈에의 국소 투여를 위한 본 발명의 화합물은 이 화합물이 예를 들어, 전안방(anterior chamber), 후안방(posterior chamber), 유리체(vitreous body), 수양액(aqueous humor), 각막(cornea), 홍채(iris)/모양체(ciliary), 수정체(lens), 맥락막(choroid), 망막(retina)/공막(sclera)과 같은 눈의 각막 또는 내부 영역으로 침투할 수 있도록 하는 충분한 시간 동안 안구 표면(ocular surface)과 접촉하여 유지되도록 하는 약제학적으로 허용가능한 안과적 비히클(ophthalmic vehicle)로 운반된다. 약제학적으로 허용가능한 안과적 비히클은 예를 들면, 연고(ointment), 식물성 오일(vegetable oil) 또는 캡슐화 물질(encapsulating material)일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 화합물은 유리체(vitreous) 및 수양액 안으로 직접 주사될 수 있다.

직장 또는 질 투여를 위한 조성물은 바람직하게는 적절한 무자극성(non-irritating) 첨가제 또는 코코아 버터(cocoa butter), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 또는 상온에서는 고체지만 체온에서는 액체 상태이므로 직장 또는 질 내에서 녹아 활성 화합물을 방출하는 좌약용 왁스(suppository wax)와 같은 담체와 함께 본 발명의 화합물을 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌약이다.

증상에 효과를 가지지만 부작용은 회피하기 위한 투약 범위는 연령, 성별, 질병의 중증도에 따라 달라질 것이다. 상기 또는 다른 치료에 사용될 경우, 본 발명의 화합물 중 하나의 치료학적 유효량(therapeutically effective amount)은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 사용하거나 사용하지 않고, 순수한 형태(pure form) 또는 그러한 형태가 존재한다면 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 임의의 특정 환자에 특이적인 치료학으로 유효한 투약 수준(dose level)은 치료될 질환 및 질환의 중증도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용되는 특정 조성물; 연령, 체중, 일반적 건강, 성별 및 환자의 식이; 투여 시간; 투여 경로; 사용되는 특정 화합물의 배출율(rate of excretion); 치료 기간; 사용되는 특정 화합물과 함께 또는 동시 사용되는 약물 및 의학 분야에서 널리 공지된 기타 인자들을 포함하는 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 원하는 치료학적 효과를 달성하는데 필요한 것보다 낮은 수준으로 화합물의 투약을 시작하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투약을 점진적으로 증가시키는 것은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 만약 원한다면, 효과적인 1일 용량(darily dose)은 투여 목적을 위하여 다회 용량(multiple doses)으로 나눌 수 있다. 따라서, 단일 용량 조성물은 1일 용량을 형성하기 위한 양 또는 이의 약수(submultiple)를 함유할 수 있다.

투약량은 만약 어떤 사용금지 사유가 있는 경우에는 주치의에 의해 조정될 수 있다. 투약량은 서로 다를 수 있고, 하루 또는 며칠 동안 1일 한번 또는 그 이상의 투여 용량으로 투여될 수 있다. 안내(guidance)는 특정 종류의 약제학적 제품을 위한 적절한 투약량에 대한 문헌에서 발견할 수 있다. 예를 들면, 항체에 대한 적절한 용량을 선택하기 위한 안내는 항체의 치료학적 용도에 관한 문헌에서 발견할 수 있다(예를 들어, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389를 참조). 다른 Fc 융합 단백질 및 다른 TNF 패밀리 멤버에 대한 차단 항체들에 대한 경험에 기초하여, Fc 융합 단백질의 전형적인 1일 투약량은 상기에 언급된 인자들에 따라, 매일 체중 1kg 당 약 0.5 내지 약 10mg/kg 이상으로 사용된다. 단일 항체는 IV 주입 또는 피하 중 어느 하나로 체중 1kg 당 약 1 내지 약 5mg/kg으로 피하로 주어진다.

예를 들면, 단독으로 사용되는 개시된 조성물의 전형적인 1일 투약량은 상기 언급한 인자들에 따라 매일 체중 1kg 당 약 1μg/kg 내지 100mg/kg 이상일 수 있다.

면역 병리(immunopathology)를 치료하고, 억제하거나 예방하기 위한 개시된 조성물의 투여 후의 치료학적 효능은 숙련된 의사들에게 잘 알려져 있는 다양한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들면, 당업자들은 본원에 개시된 조성물이 면역 병리가 더 증가하는 것을 감소하거나 예방하는 것을 관찰함으로써 피험자에게서 면역 병리를 치료하거나 억제하는데 효과적임을 알 수 있을 것이다. 면역 병리는 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.

본원에 개시된 DR3 및 TL1A 상호작용을 억제하는 조성물은 면역 병리에 대한 위험성이 있거나 면역 병리를 가지는 것으로 새로이 진단된 환자 또는 피험자에게 예방적으로(prophylactically) 투여될 수 있다.

개시된 조성물 및 방법들은 또한 예를 들어, 다양한 면역 병리관련 질병들에 대한 새로운 약물 후보물질들을 분리하고 테스트하기 위한 툴(tools)로서 사용될 수 있다.

i. 단백질의 투여( Administration of Proteins )

단백질은 국소, 경구, 비경구, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안구 내, 경피 등의 투여를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 치료학적 단백질 약제의 투약량은 당업계에 잘 알려져 있으며, 약제학적 요약서(pharmaceutical compendia)(PHYSICIANS DESK REFERENCE, Medical Economics Data Publishers; REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co.; GOODMAN & GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, McGraw Hill Publ., THE CHEMOTHERAPY SOURCE BOOK, Williams and Wilkens Publishers)에서 발견할 수 있고, 대안적으로 예를 들어 하기의 이 섹션의 마지막에 기재되어 있는 것들과 같이 당업자들에게 잘 알려져 있는 표준 기술을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다.

ii . 항체의 투여( Administration of antibodies )

항체의 투여는 본원에 개시된 것과 같이 이루어질 수 있다. 항체 운반을 위한 핵산 접근법(approach) 또한 존재한다. 대략적으로, 차단 DR3 또는 TL1A 항체 및 항체 단편은 또한 환자 또는 피험자 자신의 세포가 핵산을 보호하고 암호화된 항체 또는 항체 단편을 생산하고 분비하도록, 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 제조물(예를 들어, DNA 또는 RNA)로서 환자 또는 피험자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체로 피험자에게 투여된다. 적절한 담체 및 그것들의 제형은 레밍턴에 기재되어 있다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995). 전형적으로, 적절한 양의 약제학적으로 허용가능한 염은 제형의 등장성을 위해 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는 식염수(saline), 링거액(Ringer's solution) 및 덱스트로스 용액(dextrose solution)을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 상기 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가적인 담체는 성형품(shaped articles)의 형태로, 예를 들어, 필름, 리포솜 또는 마이크로입자로 항체를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스(semipermeable matrices)와 같은 지연 방출성(sustained release) 제조물을 포함한다. 어떤 담체는 더욱 바람직하게는 예를 들어, 투여 경로 및 투여될 항체의 농도에 의존할 수 있다는 것은 당업자들에게 명백할 것이다.

항체는 주사(예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 피하, 근육 내로)에 의해 또는 유효한 형태로 혈류 내로 그것을 운반할 수 있게 하는 주입(infusion)과 같은 다른 방법에 의해 피험자, 환자 또는 세포로 투여될 수 있다. 국부(local) 또는 정맥 주사가 바람직하다.

항체를 투여하기 위한 효과적인 투약량 및 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있고, 이와 같은 결정을 하는 것은 당업계의 기술 내에 있다. 당업자들은 투여되어야만 하는 항체의 투약량이 예를 들어, 항체를 받아들일 피험자, 투여 경로, 사용되는 항체의 특정 형태 및 투여될 다른 약물에 따라 달라질 것이라는 것을 잘 알 것이다. 항체에 대한 적절한 용량을 선택하는 것에 대한 안내는 항체의 치료학적 사용에 관한 문헌에서 발견할 수 있다(예를 들어, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389). 단독으로 사용되는 항체의 전형적인 1일 투약량은 상기에 언급한 인자들에 따라, 매일 체중 1kg 당 약 1μg/kg 내지 100mg/kg 이상일 수 있다.

iii . 핵산의 투여( Administration of Nucleic aicds )

피험자의 세포 내로의 외인성 핵산의 투여 및 흡수(uptake)(즉, 유전자 형질도입(gene transduction) 또는 형질감염(trnasfection))를 포함하는 상기 기재된 방법들에서, 개시된 핵산은 나형(naked) DNA 또는 RNA의 형태일 수 있고, 또는 상기 핵산은 당업자들이 잘 이해할 수 있는 것으로서 항체를 암호화하는 DNA 단편이 프로모터의 전사적 조절하에 있는 세포로 핵산을 운반하기 위한 백터 내에 있을 수 있다. 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터(adenovirus vector)(Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canada))와 같은 상업적으로 이용가능한 제조물일 수 있다. 세포로의 핵산 또는 벡터의 운반은 다양한 메커니즘을 통할 수 있다. 일례로서, 운반은 리포펙틴(LIPOFECTIN), 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)(GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), 수퍼펙트(SUPERFECT)(Qiagen, Inc. Hilden, Germany) 및 트랜스펙탐(TRANSFECTAM)(Promega Biotec, Inc., Madison, WI)과 같은 상업적으로 이용가능한 리포솜 제조물을 사용하는 리포솜뿐만 아니라, 당업계에서 표준 절차에 따라 개발된 다른 리포솜을 통할 수 있다. 게다가, 개시된 핵산 또는 벡터는 전기천공법(electroporation), 제네트로닉스사(Genetronics, Inc.)(San Diego, CA)로부터 이용가능한 기술뿐만 아니라 소노포레이션 기계(SONOPORATION machine)(ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)을 사용하여 생체 내로 운반될 수 있다.

일례로서, 벡터 운반은 재조합 레트로바이러스 게놈을 패키징할 수 있는 레트로바이러스 벡터 시스템(retroviral vector system)과 같은 바이러스 시스템(viral system)을 통할 수 있다(예를 들어, Pastan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4486, 1988; Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895, 1986를 참조). 재조합 레트로바이러스는 그 후 감염시켜 차단 항체(또는 그것의 활성 단편)를 암호화하는 핵산을 감염된 세포로 운반하는데 사용될 수 있다. 포유동물의 세포 내로 변경된 핵산을 도입하는 정확한 방법은 레트로바이러스 벡터의 사용이지만, 물론 이로 제한되는 것은 아니다. 아데노바이러스 벡터(adenoviral vectors)(Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5:941-948, 1994), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated viral, AAV) 벡터(Goodman et al., Blood 84:1492-1500, 1994), 렌티바이러스 벡터(lentiviral veltors)(Naidini et al., Science 272:263-267, 1996), 슈도형 레트로바이러스 벡터(pseudotyped retroviral vectors)(Agrawal et al., Exper. Hematol. 24:738-747, 1996)의 사용을 포함하는 이 방법들을 위해 다른 기술들 또한 널리 사용할 수 있다. 리포솜 운반 및 수용체-매개성 및 다른 엔도시토시스(endocytosis) 메커니즘과 같은 물리적 형질도입 기술 또한 사용될 수 있다(예를 들어, Schwartzenberger et al., Blood 87:472-478, 1996을 참조). 이 개시된 조성물 및 방법들은 임의의 이것들 또는 다른 통상적으로 사용되는 유전자 전달 방법과 함께 사용될 수 있다.

일례로서, 만약 항체를 암호화하는 핵산이 아데노바이러스 벡터로 피험자의 세포로 운반될 때, 인간에 대한 아데노바이러스 투여를 위한 투약량은 주사 당 약 107 내지 109 플라크 형성 단위(plaque forming unit, pfu)일 수 있지만, 주사 당 1012 pfu 만큼 높을 수 있다(Crystal, Hum. Gene Ther. 8:985-1001, 1997; Alvarez and Curiel, Hum. Gene Ther. 8:597-613, 1997). 피험자는 1회 주사(single injection)될 수 있거나, 만약 추가적인 주사가 필요하다면, 그것들은 불명확한 기간(indefinite period) 동안 및/또는 치료의 효능이 달성될 때까지 6개월 간격(또는 숙련된 의사에 의해 결정된 것과 같은 다른 적절한 시간 간격)으로 반복될 수 있다.

B. 조성물

1. 항체( Antibodies )

TL1A 또는 DR3 폴리펩티드에 결합하고, DR3에 대한 TL1A의 결합을 차단하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4를 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체 또는 DR3와 결합하는 그것의 단편을 제공한다.

또한, TL1A 폴리펩티드의 세포외 도메인과 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-252를 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체 또는 DR3와 결합하는 그것의 단편을 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-252, 77-252, 78-252, 76-252, 79-252, 80 252,81-252,82-252,83-252,84-252,85-252,86-252, 87-252, 88-252, 89-252, 90-252, 91-252,92-252,93-252,94-252,95-252,96-252, 97-252, 98-252, 99-252 또는 100-252를 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-251, 77-251, 78-251, 76-251, 79-251,80-251,81-251,82-251,83-251,84-251, 85-251, 86-251, 87-251, 88-251,89-251,90-251,91-251,92-251,93-251, 94-251, 95-251,96-251,97-251,98-251, 99-251 또는 100-251를 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-250, 77-250, 78-250, 76-250, 79-250, 80-250, 81-250, 82-250, 83-250, 84-250, 85-250, 86-250,87-250,88-250,89-250,90-250,91-250, 92-250, 93-250, 94-250, 95-250, 96-250, 97-250,98-250,99-250 또는 100-250을 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-249, 77-249, 78-249, 76-249, 79-249, 80-249, 81-249, 82-249, 83-249, 84- 249,85-249,86-249,87-249,88-249,89-249,90-249, 91-249, 92-249, 93-249, 94-249, 95-249,96-249,97-249,98-249,99-249 또는 100-249를 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-248, 77-248, 78-248, 76-248, 79-248,80-248,81-248,82-248, 83-248,84-248,85-248,86-248,87-248, 88-248, 89-248,90-248,91-248, 92-248,93-248,94-248,95-248,96-248,97-248, 98-248, 99-248 또는 100-248을 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-247, 77-247, 78-247, 76-247, 79-247,80-247,81-247,82-247,83-247,84-247, 85-247,86-247,87-247,88-247,89-247, 90-247,91-247,92-247,93-247,94-247,95-247, 96-247,97-247,98-247,99-247 또는 100- 247을 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-246, 77-246, 78-246, 76-246, 79-246, 80-246, 81-246, 82-246, 83-246, 84-246, 85-246, 86-246, 87-246, 88-246,89-246,90-246,91-246,92-246,93-246, 94-246, 95-246, 96-246, 97-246, 98-246, 99-246 또는 100-246을 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-245, 77-245, 78-245, 76-245, 79-245,80-245,81-245,82-245,83-245, 84-245,85-245, 86-245,87-245,88-245,89-245,90-245,91-245, 92-245,93-245,94-245,95-245,96-245, 97-245,98-245,99-245 또는 100-245를 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-240, 77-240, 78-240, 76-240, 79-240, 80-240, 81-240, 82-240, 83-240, 84-240,85-240,86-240,87-240,88-240,89-240,90-240, 91-240, 92-240, 93-240,94-240, 95-240,96-240,97-240,98-240,99-240 또는 100-240을 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-230, 77-230, 78-230, 76-230, 79-230, 80-230, 81- 230,82-230,83-230,84-230,85-230,86-230,87-230, 88-230, 89-230, 90-230, 91-230, 92-230,93-230,94-230,95-230,96-230,97-230, 98-230, 99-230 또는 100-230을 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-220, 77-220, 78-220, 76-220, 79-220,80-220,81-220,82-220,83-220, 84-220, 85-220, 86-220, 87-220, 88-220, 89-220, 90-220,91-220,92-220,93-220,94-220,95-220, 96-220, 97-220, 98-220, 99-220 또는 100-220을 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-210, 77-210, 78- 210, 76-210, 79-210, 80-210, 81-210, 82-210, 83-210, 84-210, 85-210, 86-210, 87-210, 88-210,89-210,90-210,91-210,92-210,93-210, 94-210, 95-210, 96-210, 97-210,98-210, 99-210 또는 100-210을 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다. 따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 76-200, 77-200, 78-200, 76-200, 79-200, 80-200, 81-200, 82-200,83-200, 84-200,85-200, 86-200,87-200,88-200,89-200,90-200,91-200, 92-200, 93-200, 94-200,95-200,96-200, 97-200,98-200,99-200 또는 100-200을 포함하는 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다.

따라서, 인간 TL1A 폴리펩티드와 결합하는 1A9 및 1C6으로 나타낸 하이브리도마 클론 및 마우스 TL1A 폴리펩티드에 결합하는 12B12.6 및 5G4.6으로 나타낸 하이브리도마 클론에 의해 생성된 항체의 결합 특성을 가지는 항체를 제공한다.

항체의 결합 특성은 그것의 결합 특이도(binding specificity)를 포함한다. 결합 특이도는 항원에 대한 특이도일 수 있거나, 그것은 항체에 의해 인식되는 에피토프(epitope)에 기초한 특이도일 수 있다. 전자 및 후자 모두 항체의 내재된 특성이기 때문에, 본 발명의 항체의 개시는 에피토프 및 항원 특이도 모두에 대한 정의를 제공한다. 기탁된 단일클론 항체의 결합 특이도에 대한 언급은 그 항체가 결합하는 DR3 상의 특정 에피토프에 대한 언급에 해당한다. 임의의 각각의 단일클론 항체의 결합 특이도는 개시되고 기탁된 항체로 정의된 아속(sub genus)의 임의의 다른 단일클론 항체의 내재적 특성이다. 주어진 항체의 결합 특이도를 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체 결합의 결합활성(avidity) 및 다른 특성들을 측정하는 다른 방법도 잘 알려져 있다.

i. 일반적인 항체

용어 "항체(antibodies)"는 넓은 의미로 본원에 사용되었으며, 다중클론(polyclonal) 및 모노클론(monoclonal) 항체 모두를 포함한다. 그것들이 DR3가 TL1A와 상호작용하여 억제되도록 하는 그러한 DR3 또는 TL1A와 상호작용하기 위한 그것들의 능력에 대해 선택되는 한, 완전 면역글로불린 분자(intact immunoglobulin molecules)를 비롯하여 상기 용어 "항체"에 포함되는 것들은 또한 이들 면역글로불린 분자의 단편 또는 폴리머, 및 인간 면역글로불린 분자 또는 인간화된 형태의 면역글로불린 분자 또는 그것들의 단편이다. DR3 및 TL1A 사이의 상호작용에 관련된 개시된 영역과 결합하는 항체 또한 개시된다. 항체는 본원에 기재된 시험관 내(in vitro) 검정법을 사용하거나 유사한 방법에 의하여 그것들의 원하는 활성에 대하여 테스트될 수 있으며, 그 후 그것들의 생체 내 치료학적 및/또는 예방학적 활성은 알려진 임상 테스트 방법에 따라 테스트 된다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 상동한(homogenous) 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 말하며, 즉 집단 내의 각각의 항체들은 항체 분자들 중 작은 부분으로 존재할 수 있는 자연적으로 생성되는 돌연변이의 가능성을 제외하고는 동일하다. 본원의 단일클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종 또는 특정 항체 종류 또는 아종에 속하는 것으로부터 유래된 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동하는데 반하여, 사슬의 나머지 부분은 다른 종 또는 다른 항체 종류 또는 아종에 속하는 것으로부터 유래된 항체뿐만 아니라 그것들이 원하는 길항적 활성을 나타내는 한 그러한 항체들의 단편들에 상응하는 서열과 동일하거나 상동하는 "키메라(chimeric)" 항체를 특별히 포함한다(U.S. Pat. No. 4,816,567 and Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)를 참조).

개시된 단일클론 항체는 단일클론 항체를 생산하는 임의의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 개시된 단일클론 항체는 콜러 및 밀스타인(Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975))에 의해 기재된 것들과 같은 하이브리도마 방법(hybridoma methods)을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역제(immunizing agent)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구(lymphocyte)를 유인하기 위하여 면역제로 면역처리된다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내에서 면역처리될 수 있다.

차단 항체를 생산할 최적의 기회를 제공하기 위하여, 상기 면역제는 바람직하게는 진핵 세포에 의해 생산된 완전하게 글리코실화된 비변성 단백질(native protein)로 이루어질 것이다. DR3에 대한 위한, Fc 융합 단백질로서 발현되며 특정 프로테아제에 의해 절단된 인간 및 마우스 수용체의 세포외 단편은 바람직하게는:

인간: Accession No. NP_683866.1 (SEQ ID NO:5) 서열의 아미노산 1-141

마우스: Accession No. NP_149031.2(SEQ ID NO:6) 서열의 아미노산 1-159

가 사용될 수 있다.

TL1A에 대하여, 에피토프-태깅된(epitope-tagged) 융합 단백질로서 발현되는 인간 및 마우스 TL1A의 세포외 단편은 바람직하게는:

마우스: Accession No. NP_005109.2 (SEQ ID NO:7)

인간: NP_796345 (SEQ ID NO:8) 서열로부터의 아미노산 72-251

이 사용될 수 있다.

만약 이들 접근법이 차단 항체를 생산하지 않는다면, 이들 단백질의 세포 표면 국소적(localized) 형태를 발현하는 세포는 마우스, 쥐 또는 다른 종에 면역력을 갖게 하는데 사용될 것이다. 전통적으로, 단일클론 항체의 생성은 면역원(immunogen)으로서 사용하기 위한 정제된 단백질 또는 펩티드의 이용가능성(availability)에 의존한다. 최근에 DNA에 기반한 면역화(immunization)는 강력한 면역 반응을 유도하고 단일클론 항체를 생성하기 위한 방법으로서 유망하다. 이 접근법에서, DNA-기반 면역화가 사용될 수 있으며, 여기에서 인간 IGg1을 가지는 융합 단백질 또는 에피토프 태그로서 발현되는 DR3 및 TL1A의 세포외 단편을 암호화하는 DNA는 당업계에 공지된 방법에 따라 실시예에 기재되어 있는 것과 같이 숙주 동물에 주사된다(예를 들어, 항체 생산 방법을 위하여 전부 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 Kilpatrick KE, et al. Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor. Hybridoma. 1998 Dec;17(6):569-76; Kilpatrick KE et al. High-affinity monoclonal antibodies to PED/PEA-15 generated using 5 microg of DNA. Hybridoma. 2000 Aug;19(4):297-302를 참조).

정제된 단백질 또는 DNA 중 어느 하나를 사용한 면역화를 위한 대안적 접근법은 바큘로바이러스에서 발현된 항원(antigen)을 사용하는 것이다. 이 시스템에 대한 이점은 생성의 용이성, 고수준의 발현 및 포유동물 시스템에서 볼 수 있는 것과 유사하게 높은 번역후 변형(post-translational modification)을 포함한다. 이 시스템의 사용은 신호 서열 단편을 가지는 융합 단백질로서 TL1A 또는 DR3의 세포외 도메인을 발현하는 것을 포함한다. 항원은 신호 서열과 TL1A 또는 DR3 뉴클레오티드 서열의 성숙한 단백질 도메인 사이에 인-프레임(in-frame)으로 유전자 단편을 삽입함으로써 생성된다. 이것은 비리온(virion)의 표면상의 외래 단백질을 나타나게 한다. 이 방법은 표적 항원의 정제의 필요성을 제거하는, 전 바이러스(whole virus)을 이용한 면역화를 가능하게 한다.

일반적으로, 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte, "PBLs")는 인간 기원의 세포가 바람직한 경우 단일클론 항체를 생산하는 방법에 사용되며, 또는 비인간 포유동물 공급원이 바람직한 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 그 후, 림프구는 하이브리도마 세포(hybridoma cell)를 형성하기 위하여 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제(fusing agent)을 사용하여 불멸화된 세포주(immortalized cell line)와 융합된다(Goding, "monoclonal Antibodies: Principles and Practice" Academic Press, (1986) pp. 59-103). 불멸화된 세포주는 주로 설치류(rodent), 소(bovine), 말(equine) 및 인간 기원의 골수종 세포(myeloma cell)주를 포함하는, 형질전환된 포유동물 세포이다. 주로, 쥐 또는 마우스의 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합되고 불멸화된 세포의 성장 및 생존을 억제하는 하나 또는 그 이상의 물질을 포함하는 적절한 배양 배지(culture medium)에 배양될 수 있다. 예를 들면, 모 세포(parental cells)가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트란스퍼라아제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있다면, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 물질들이 HGPRT-결손 세포의 성장을 방지하는 하이포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함할 것이다("HAT 배지(HAT medium)"). 바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하며, 선택된 항체를 생산하는 세포에 의해 항체의 안정한 고수준의 발현을 지원하는 것이며, HAT 배지와 같은 배지에 민감하다. 더욱 바람직한 불멸화된 세포주는 예를 들어, 소크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)(San Diego, Calif) 및 어메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection)(Rockville, Md)으로부터 얻을 수 있는 마우스 골수종 세포주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 단일클론 항체의 생산을 위하여 기재되어 있다(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., "monoclonal Antibody Production Techniques and Applications" Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63). 하이브리도마 세포가 배양된 배양 배지는 그 후 DR3 및/또는 TL1A에 대해 유도된 단일클론 항체의 존재에 대하여 검정될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이도는 면역침강(immunoprecipitation)에 의해, 또는 방사성 면역검정법(RIA) 또는 효소결합 면역흡착 검정법(ELISA)와 같은 시험관 내 결합 검정법에 의해 측정된다. 이와 같은 기술 및 검정법은 당업계에 공지되어 있으며, 하기의 실시예 또는 할로우 및 레인 등의 "항체, 실험 매뉴얼"(Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988))에 또한 기재되어 있다.

원하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 한계 희석법(limiting dilution) 또는 FACS 분리 방법(FACS sorting procedures)에 의해 서브클로닝될 수 있고, 표준 방법에 의해 자란다. 이러한 목적을 위한 적절한 배양 배지는 예를 들어, 둘베코의 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물 내의 복수(ascites)와 같은 생체 내(in vivo)에서 자랄 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로즈(Protein A-Sepharose), 단백질 G(protein G), 하이드록실아파타이트hydroxylapatite) 크로마토그래피, 겔 전기영동(gel electrophoresis), 투석(dialysis) 또는 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)와 같은 기존의 면역글로불린 정제 방법에 의해 배양 배지 또는 복수(ascites fluid)로부터 분리 또는 정제될 수 있다.

단일클론 항체는 또한 U.S. Pat. No. 4,816,567에 기재되어 있는 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다(Cabilly et al.). 개시된 단일클론 항체를 암호화하는 DNA는 쉽게 분리될 수 있으며, 기존의 방법들을 이용하여(예를 들어, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 서열화될 수 있다. 항체 또는 활성 항체 단편의 라이브러리도 또한 생성되고, 예를 파지 디스플레이 기술(phage display techniques)을 사용하여 선별될 수 있다(예를 들어, Burton et al.의 U.S. Patent No. 5,804,440 및 Barbas et al.의 U.S. Patent No. 6,096,441에 기재되어 있는 것을 참조).

시험관 내(in vitro) 방법 또한 1가 항체(monovalent antibodies)를 제조하는데 적절하다. 그것들의 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해(digestion)는 당업계에 공지된 통상의 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 분해는 파파인(papain)을 사용하여 수행될 수 있다. 파파인 분해의 예는 1994년 12월 22일에 공개된 WO 94/29348 및 U.S. Pat. No. 4,342,566에 기재되어 있다. 항체의 파파인 분해는 전형적으로 각각 단일 항원 결합 부위(single antigen binding site)를 가지는 Fab 단편이라 불리는 두 개의 동일한 항원 결합 단편(antigen binding fragments)과 나머지 Fc 단편을 생산한다. 펩신 처리는 두 개의 항원 결합 부위(antigen combining site)을 가지며, 여전히 항원과 교차결합(cross-linking)이 가능한 단편을 생산한다.

항체 또는 항체 단편의 활성이 비변형된 항체 또는 항체 단편과 비교하여 현저하게 변경되거나 손상되지 않는다면, 다른 서열에 결합되는지의 여부에 관계없이 상기 단편은 또한 삽입(insertion), 결실(deletion), 치환(substitutions) 또는 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 다른 선택된 변형을 포함할 수 있다. 이들 변형은 이황화결합(disulfide bonding)이 가능한 아미노산을 제거/첨가하고, 그것의 생체 수명(bio-longevity)를 증가시키고, 그것의 분비 특성 등을 변경하는 것과 같은 몇몇의 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 그것의 동족 항원(cognate antigen)에 대한 특이적 결합과 같은 생리활성 특성(bioactive property)을 가져야만 한다. 항체 또는 항체 단편의 작용 또는 활성 영역은 단백질의 특정 영역의 돌연변이유발(mutagenesis) 후 발현시키고, 발현된 폴리펩티드를 테스트함으로써 확인될 수 있다. 이러한 방법은 당업자들에게 있어서 명백할 것이며, 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이(site-specific mutagenesis)를 포함할 수 있다(Zoller, M.J. Curr . Opin . Biotechnol. 3:348-354, 1992).

본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체(antibody)" 또는 "항체들(antibodies)"은 또한 인간 항체 및/또는 인간화(humanized) 항체를 말할 수 있다. 많은 비인간 항체들(예를 들어, 마우스, 쥐 또는 토끼로부터 유래된 것들)이 인간에서 자연 발생적으로 항원성이 있으므로, 인간에게 투여될 때 원하지 않는 면역 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 상기 방법들에서 인간 또는 인간화 항체의 사용은 인간에게 투여된 항체가 원하지 않는 면역 반응을 일으킬 기회를 줄인다.

ii . 완전 면역글로불린( whole immunoglobulin )

본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체(antibody)"는 임의의 종류의 완전 면역글로불린(즉, 완전(intact) 항체)을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 비변성(native) 항체는 주로 두 개의 동일한 경쇄(Light chains) 및 두 개의 동일한 중쇄(Heavy chains)로 이루어진 이종사량체성 당단백질(heterotetrameric glycoprotein)이다. 전형적으로, 각각의 경쇄는 하나의 공유성 이황화 결합(covalent disulfide bond)에 의해 중쇄에 연결되나, 이황화 결합의 수는 서로 다른 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에 차이가 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 쇄내 이황화물 가교(regularly spaced intrachin disulfide bridge)를 가진다. 각각의 중쇄는 가변 도메인(variable domain, V(H))에 이어 얼마간의 불변 도메인(constant domain)을 하나의 말단에 가진다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(V(L)) 및 그것의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인과 일직선이 되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 일직선이 된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면(interface)을 형성하는 것으로 알려져 있다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 그것들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(kappa, k) 및 람다(lamdba, l)라 불리는 두 개의 명확하게 구별되는 형태 중 하나로 지정될 수 있다. 그것들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 서로 다른 종류로 지정될 수 있다. 인간 면역글로불린에는 다섯 가지 주요 종류가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 몇몇은 예를 들어, IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2와 같은 아종(아이소타입)으로 더 나누어질 수 있다. 당업자들은 마우스에 필적할 만한 종류를 알 수 있을 것이다. 서로 다른 종류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파(alpha), 델타(delta), 엡실론(epsilon), 감마(gamma) 및 뮤(mu)로 칭한다.

용어 "가변(variable)"은 항체 간에 서열이 다른 가변 도메인의 어떤 부분을 설명하기 위하여 본원에 사용되며, 그것의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이도에 사용된다. 그러나, 가변성(variability)은 대개 항체의 가변 도메인을 통하여 균등하게 분배되지 않는다. 그것은 전형적으로 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 양쪽에 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDRs) 또는 초가변 영역(hypervariable region)이라 불리는 세 개의 분절(segment)로 집중되어 있다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된(highly conserved) 부분은 뼈대(framework, FR)라 불린다. 비변성(native) 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 루프 연결(loop connecting)을 형성하고, 어떤 경우에 있어서는 베타-시트 구조(β-sheet structure)의 일부분을 형성하는 주로 3개의 CDRs로 연결된 베타-시트 배열(β-sheet configuration)를 취하는 4개의 FR 영역(FR regions)을 포함한다. 각 사슬에서 CDRs는 항체의 항원 결정 부위의 형성에 기여하는 다른 사슬의 CDRs와 FR 영역에 의해 서로 근접하게 결합하고 있다(Kabat E. A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)를 참조). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합시키는데 직접적으로 관여하고 있지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular toxicity)에의 항체의 관여와 같은 다양한 작용 기능(effector function)을 나타낸다.

iii . 항체 단편( Antibody Fragments )

본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체(antibody)"는 온전한(intact) 분자뿐만 아니라 예를 들어, 에피토프 결정부위(epitope determinant)와 결합할 수 있는 Fab 및 F(ab')₂와 같은 그것들의 단편을 포함하는 것으로 한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체 또는 그것의 단편(antibody or fragment thereof)"은 이중(dual) 또는 다중(multiple) 항원 또는 에피토프 특이성(specificities)을 가지는 키메라 항체 및 하이브리드 항체 및 하이브리드 단편을 포함하는 F(ab')2, Fab', Fab 등과 같은 단편을 포함한다. 따라서, 그것들의 특정 항원에 결합하는 능력을 유지하는 항체의 단편들이 제공된다. 예를 들면, DR3 또는 TL1A 결합 활성을 유지하는 항체의 단편은 상기 용어 "항체 또는 그것의 단편"의 의미 내에 포함된다. 이와 같은 항체 및 단편은 당업계에 공지된 기술에 의해 만들어질 수 있고, 실시예에 기재된 방법 및 항체를 생산하고 특이도 및 활성에 대해 항체를 선별하기 위한 일반적인 방법에 따라 특이도 및 활성에 대하여 선별될 수 있다(Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)).

예를 들어, 참고문헌으로서 그 내용이 본원에 통합되어 있는 U.S. Pat. No. 4,704,692에 기재되어 있는 것과 같은 항체 단편과 항원 결합 단백질(단일 사슬 항체)의 접합체(conjugate) 또한 "항체 또는 그것의 단편"의 의미 내에 포함된다.

항체의 분리된 면역학적으로 특이적인 파라토프(immunogenically specific paratope) 또는 단편 또한 제공된다. 항체의 특이적 면역원성 에피토프(immunogenic epitope)는 분자의 화학적 또는 기계적 파괴에 의해 완전 항체(whole antibody)로부터 분리될 수 있다. 따라서, 얻어진 정제된 단편은 본원에 교시된 방법들에 의해 그것들의 면역원성 및 특이도를 측정하기 위해 테스트된다. 항체의 면역반응성 파라토프(immunoreactive paratopes)는 선택적으로 직접 합성된다. 면역반응성 단편은 항체 아미노산 서열로부터 유래된 적어도 약 2개 내지 5개의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열로 정의된다.

대안적으로, 비보호된 펩티드 분절(unprotected peptide segments)은 화학적 접합(chemical ligation)의 결과로서 펩티드 분절 사이에 형성된 결합이 비정상적인(비-펩티드성) 결합인 곳에서 화학적으로 연결된다(Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). 이 기술은 단백질 도메인의 유사체(analogs)뿐만 아니라 완전한 생물학적 활성을 가지는 수많은 상대적으로 순수한 단백질을 합성하는데 사용되어 왔다(deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)).

생물활성(bioactivity)을 가지는 항체의 단편 또한 개시된다. 폴리펩티드 단편은 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 발현 시스템과 같은 그것의 폴리펩티드 단편을 생산할 수 있는 발현 시스템에서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 클로닝하여 얻어진 재조합 단백질일 수 있다. 예를 들어, 어떤 것은 TL1A 또는 DR3와 항체의 상호작용과 관련된 생물학적 효과를 야기할 수 있는 특정 하이브리도마로부터 항체의 활성 도메인을 측정할 수 있다. 예를 들어, 항체의 활성 또는 결합 특이도 또는 친화력 중 어느 하나에 기여하지 않는 것으로 밝혀진 아미노산은 각각의 활성에의 손상 없이 제거될 수 있다. 예를 들어, 다양한 구현에서, 아미노- 또는 카르복시-말단 아미노산은 비변형 또는 변형된 비면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자 중 어느 하나로부터 연속적으로 제거되고, 많은 이용가능한 검정법들 중 하나로 각각의 활성이 분석된다. 다른 실시예에서, 항체의 단편은 변형된 항체를 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 아미노산은 특정 위치에서 자연적으로 생성된 아미노산으로 치환되고, 아미노 말단 또는 카르복시 말단 아미노산 중 어느 하나의 일부분, 또는 심지어 항체의 내부 영역은 변형된 항체의 정제를 용이하게 할 수 있는 비오틴과 같은 폴리펩티드 단편 또는 다른 일부분(moiety)으로 대체된다. 예를 들어, 변형된 항체는 펩티드 화학(peptide chemistry) 또는 코딩 영역(coding region)의 발현이 하이브리드 폴리펩티드를 생성하도록 하기 위한 발현 벡터 내로 두 개의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 각각의 핵산을 클로닝하는 것을 통하여 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein)에 융합될 수 있다. 하이브리드 폴리펩티드는 아밀로오스 친화 컬럼(amylose affinity column)으로 그것을 통과시킴으로써 친화적으로 정제될 수 있고, 변형된 항체 수용체는 그 후 특이적 프로테아제 인자 Xa(protease factor Xa)로 하이브리드 폴리펩티드를 절단함으로써 말토오스 결합 영역으로부터 분리될 수 있다(예를 들어, New England Biolabs Product Catalog, 1996, pg. 164.를 참조). 진핵세포로부터의 하이브리드 단백질을 분리하는데에도 유사한 정제 방법을 이용할 수 있다.

단편의 활성이 비변형된 항체 또는 항체 단편과 비교하여 현저하게 변경되거나 손상되지 않는다면, 다른 서열에 결합되는지의 여부에 관계없이 상기 단편은 또한 삽입(insertion), 결실(deletion), 치환(substitutions) 또는 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 다른 선택된 변형을 포함한다. 이들 변형은 이황화결합(disulfide bonding)이 가능한 아미노산을 제거 또는 첨가하고, 그것의 생체 수명(bio-longevity)를 증가시키고, 그것의 분비 특성 등을 변경하는 것과 같은 몇몇의 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우에 있어서, 단편은 결합 활성, 결합 도메인에서의 결합의 조절과 같은 생리활성 특성(bioactive property)을 가져야만 한다. 항체의 작용 또는 활성 영역은 단백질의 특정 영역의 돌연변이유발(mutagenesis) 후 발현시키고, 발현된 폴리펩티드를 테스트함으로써 확인될 수 있다. 이러한 방법은 당업자들에게 있어서 명백할 것이며, 항원을 암호화하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이(site-specific mutagenesis)를 포함할 수 있다(Zoller MJ et al. Nucl. Acids Res. 10:6487-500 (1982).

기술들은 또한 본 발명의 항원성 단백질에 특이적인 단일-사슬 항체의 생산을 위하여 조정될 수 있다(예를 들어, U.S. Pat. No. 4,946,778을 참조). 게다가, 방법들은 단백질 또는 유도체, 단편, 그것들의 유사체 또는 상동체에 대한 원하는 특이도를 가지는 단일클론 F(ab) 단편의 빠르고 효과적인 확인을 가능하게 하는 F(ab) 발현 라이브러리의 제조를 위해 조정될 수 있다(예를 들어, Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281를 참조). 당업계에 공지된 기술에 의해 생산될 수 있는 단백질 항원에 대한 아이소타입을 포함하는 항체 단편은 (i) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성된 F((ab'))(2) 단편; (ii) F ((ab'))(2) 단편의 이황화물 가교를 감소시킴으로서 생성된 Fab 단편; (iii) 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리함으로써 생성된 F(ab) 단편 및 (iv) F(v) 단편을 포함하나 이로 제한되지 않는다.

단일-사슬 항체의 생산을 위한 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 당업자들은 이와 같은 방법을 위하여 (본원에 참고문헌으로서 통합되어 있는) U.S. Pat. No. 5,359,046에 대해 언급한다. 단일 사슬 항체는 짧은 펩티드 링커(short peptide linker)를 사용하여 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 함께 융합하고, 그것에 의하여 단일 분자 상에 항원 결합 부위가 재구성됨으로써 만들어진다.

하나의 가변 도메인의 C-말단이 15 내지 25개의 아미노산 펩티드 또는 링커를 통하여 다른 가변 도메인의 N-말단에 묶여진 단일-사슬 항체 가변 단편(Single-chain antibody variable fragments, scFvs)은 항원 결합 또는 결합의 특이도를 현저하게 파괴하지 않도록 개발되었다(Bedzyk et al., 1990; Chaudhary et al., 1990). 링커는 중쇄 및 경쇄가 그것들의 적절한 입체구조적 방향(conformational orientation)으로 함께 결합가능하도록 선택된다(예를 들어, 본원에 참고문헌으로서 통합되어 있는 Huston, J. S., et al., Methods in Enzym. 203:46-121 (1991)를 참조). 이들 Fvs는 비변형 항체의 중쇄 및 경쇄에 존재하는 불변 영역(Fc)이 결여되어 있다.

iv . 1가 항체( Monovalent antibodies )

1가 항체를 제조하는데 시험관 내(in vitro) 방법 또한 적절하다. 그것들의 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 공지된 통상의 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 분해는 파파인을 사용하여 수행될 수 있다. 파파인 분해의 예는 1994년 12월 22일에 공개된 WO 94/29348, U.S. Pat. No. 4,342,566 및 할로우 및 레인 등의 "항체, 실험 매뉴얼"(Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988))에 기재되어 있다. 항체의 파파인 분해는 전형적으로 각각 단일 항원 결합 부위(single antigen binding site)를 가지는 Fab 단편이라 불리는 두 개의 동일한 항원 결합 단편(antigen binding fragments)과 나머지 Fc 단편을 생산한다. 펩신 처리는 두 개의 항원 결합 부위(antigen combining site)를 가지며, 여전히 항원과 교차결합(cross-linking)이 가능한 F(ab')2 단편이라 불리는 단편을 생산한다.

항체 분해로 생성된 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역(hinge region)으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인(cysteines)을 포함하는 중쇄 도메인의 카르복시 말단에의 몇 개의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과는 다르다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에 이황화물 가교에 의해 연결된 두 개의 Fab' 단편을 포함하는 2가(bivalent)의 단편이다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올기(free thiol group)를 지니는 Fab'를 위한 칭호이다. 항체 단편은 본래 그것들 사이에 힌지 시스테인을 가지는 한 쌍의 Fab' 단편으로 생성된다. 항체 단편들의 다른 화학적 연결 또한 공지되어 있다.

v. 키메라 ( chimeraic )/하이브리드( Hybrid )

하이브리드 항체에서, 하나의 중쇄 및 경쇄 쌍은 하나의 항원 인식 특징, 예를 들어, 에피토프에 대해 형성된 항체에서 발견된 것들에 상응하는 반면, 나머지 하나의 중쇄 및 경쇄 쌍은 다른 에피토프에 대해 형성된 항체에서 발견된 쌍에 상응한다. 이는 다기능성 원자가의 특성(multi-functional valency), 즉 적어도 두 개의 서로 다른 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 능력을 야기한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "하이브리드 항체(hybrid antibody)"는 각각의 사슬은 따로따로 포유동물 항체 사슬에 대한 참조와는 상동하지만, 그 조합(combination)은 두 개의 서로 다른 항원이 항체에 의해 인식되도록 신규한 어셈블리(assembly)를 나타내는 항체를 말한다. 이와 같은 하이브리드는 각 성분 항체를 생산하는 하이브리도마의 융합에 의해 또는 재조합 기술에 의해 형성될 수 있다. 이와 같은 하이브리드는 물론 키메라 사슬(chimeric chains)을 사용하여 형성될 수도 있다.

vi . 항-유전자형( Anti - idiotypic )

암호화된 항체들은 예를 들어, U.S. Pat. No. 4,699,880에 기재되어 있는 것과 같은 항-유전자형 항체(anti-idiotypic antibodies)(다른 항체와 결합하는 항체)일 수 있다. 이와 같은 항유전자형 항체는 치료된 개인에서 내인성(endogenous) 또는 외래(foreign) 항체와 결합할 수 있고, 그렇게 함으로써 예를 들어, 자가면역성 질병의 맥락에서 면역 반응에 관련된 병리학적 상태를 개선하거나 예방할 수 있다.

vii . 항체 단편의 접합체 또는 융합

항체의 표적화 기능은 항체 또는 그것의 단편은 치료제와 결합하여 치료학적으로 사용될 수 있다. 이와 같은 치료제와 항체 또는 단편(예를 들어, 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 일부분)의 결합은 면역 접합체(immunoconjugate)를 만들거나 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함하는 융합 단백질을 만드는 것에 의하여 달성될 수 있다. 예를 들면, DR3 Fc 융합 단백질, 예를 들어 마우스 IgG Fc(DR3(인간)-muIg 융합 단백질)에 융합된 DR3 세포외 도메인(150aa)이 제공된다.

예를 들어, 그 내용이 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 U.S. Pat. No. 4,704,692에 기재된 것과 같은 항체 단편 및 항원 결합 단백질(단일 사슬 항체)의 접합체 또한 "항체 또는 그것의 단편"의 의미 내에 포함된다.

항체(또는 그것의 단편)는 사이토톡신(cytotoxin), 치료제 또는 방사성 금속 이온(radioactive metal ion)과 같은 치료학적 부분(moiety)에 접합될 수 있다. 사이토톡신 또는 세포독성 약제(cytotoxic agent)는 세포에 해로운 어떤 약제를 포함한다. 예로는 탁솔(taxol), 사이토카라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라센 디온(dihydroxy anthracene dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol) 및 퓨로마이신(puromycin) 및 그것들의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 약제학적 치료제는 항대사성 물질(antimetabolites)(예를 들어, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 디카르바진(5-fluorouracil decarbazine)), 알킬화제(alkylating agents)(예를 들어, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine)(BSNU) 및 로무스틴(lomustine)(CCNU), 시클로토스파미드(cyclothosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C(mitomycin C) 및 시스-디클로로디아민 플래티늄 (II) 시스플라틴(cis-dichlorodiamine platinum (II)(DDP) cisplatin)), 안트라사이클린(anthracyclines)(예를 들어, 다우노루비신(daunorubicin)(예전에는 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신(doxorubicin)), 항생제(antibiotics)(예를 들어, 닥티노마이신(dactinomycin)(예전에는 악티노마이신(actinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin) 및 안트라마이신(anthramycin)(AMC)) 및 유사분열 억제제(antimitotic agents)(예를 들어, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine))을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.

개시되어 있는 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변경하는데 사용될 수 있다. 약물 부분(drug moiety)은 원하는 생물학적 활성을 가지고 있는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이와 같은 단백질은 예를 들어, 아브린(abrin), 리신 A(ricin A), 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin) 또는 디프테리아 독소(diphtheria toxin)와 같은 독소(toxin); 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), [agr]-인터페론(interferon), [bgr]-인터페론, 신경 성장 인자(nerve growth factor), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor), 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator)와 같은 단백질; 또는 예를 들어, 림포카인(lymphokines), 인터루킨-1(interleukin-1, "IL-1"), 인터루킨-2(interleukin-2, "IL-2"), 인터루킨-6(interleukin-6, "IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, "GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor, "G-CSF") 또는 다른 성장 인자와 같은 생물학적 반응 조절인자(biological response modifiers)를 포함할 수 있다.

항체에 이와 같은 치료학적 부분(moiety)을 접합하기 위한 기술은 잘 알려져 있다(예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)를 참조). 대안적으로, 항체는 U.S. Pat. No. 4,676,980에 Segal에 의해 기재된 것과 같은 항체 이종접합체(heteroconjugate)를 형성하도록 제2 항체에 접합될 수 있다.

viii . 단백질 화학( Protein Chemistry )을 이용하여 항체를 만드는 방법

항체를 포함하는 단백질을 생산하는 하나의 방법은 단백질 화학 기술로 두 개 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 결합시키는 것이다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)) 또는 Boc(tert-부틸옥시카르보노일)(tert-butyloxycarbonoyl)) 화학 중 어느 하나를 사용하는 현재 이용가능한 실험실 기기를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). 당업자는 항체에 해당하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 표준 화학 반응에 의해 합성될 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있다. 예를 들면, 펩티드 또는 폴리펩티드는 그것의 합성 수지(synthesis resin)로부터 합성되고 분리되지 않을 수 있지만, 다른 항체의 단편은 수지로부터 합성된 후 분리되어 다른 단편에서 기능적으로 차단된 말단기(terminal group)를 노출시킨다. 펩티드 축합반응(peptide condensation reaction)에 의해, 이들 두 개의 단편은 항체 또는 그것의 단편을 형성하기 위하여 각각 그것들의 카르복시 및 아미노 말단에서 펩티드 결합을 통하여 공유결합적으로 연결될 수 있다(Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY). 대안적으로, 펩티드 또는 폴리펩티드는 상기에 기재된 것과 같이 생체 내(in vivo)에서 독립적으로 합성된다. 일단 분리되면, 이들 독립적인 펩티드 또는 폴리펩티드는 유사한 펩티드 축합 반응을 통하여 항체 또는 그것의 단편을 형성하기 위하여 연결될 수 있다.

예를 들면, 클론되거나 합성된 펩티드 분절의 효소적 접합(enzymatic ligation)은 상대적으로 짧은 펩티드 단편이 더 큰 펩티드 단편, 폴리펩티드 또는 완전(whole) 단백질 도메인을 생성하기 위하여 접합될 수 있도록 한다(Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). 대안적으로, 합성 펩티드의 비변성 화학적 접합(native chemical ligation)은 짧은 펩티드 단편으로부터 큰 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성적으로 구성하기 위하여 사용될 수 있다. 이 방법은 두 단계의 화학적 반응으로 이루어진다(Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). 첫 번째 단계는 초기 공유결합 생성물로서 티오에스테르-결합된 중간물질(thioester-linked intermediate)를 제공하기 위하여, 비보호된 합성 펩티드-알파-티오에스테르(unprotected synthetic peptide-alpha-thioestser)와 아미노-말단 Cys 잔기를 포함하는 다른 비보호된 펩티드 분절의 화학선택적 반응(chemoselective reaction)이다. 반응 조건에의 변화없이, 이 중간물질은 접합 부위에서 비변성 펩티드 결합을 형성하도록 자발적이고, 빠른 분자내 반응(intramolecular reaction)을 겪는다. 단백질 분자의 전체 합성을 위한 이 비변성 화학적 접합 방법의 적용은 인간의 인터루킨 8(IL-8)의 제조에 의해 설명된다(Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).

ix . 인간 및 인간화( Human and Humanized )

내인성 면역글로불린의 생성이 없을 때, 면역화(immunization)로 인간 항체의 모든 레퍼토리(repertoire)를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 키메라(chimeric) 및 생식라인 돌연변이(germ-line mutant) 마우스에서 항체 중쇄의 결합 영역(joining region, J(H))의 동형접합성 결실(homozygous deletion)이 내인성 항체의 생산이 완전하게 억제된다는 것이 기재되어 있다. 이와 같은 생식라인 돌연변이 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 배열(array)의 전위(transfer)는 항원 유발(antigen challenge)에 의해 인간 항체가 생성되도록 할 것이다(예를 들어, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)를 참조). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리(phage display libraries)를 사용하여 생산할 수도 있다(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Cote et al. 및 Boerner et al.의 기술 또한 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 이용가능하다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)).

선택적으로, 항체는 다른 종에서 생성되며, 인간에게 투여하기 위하여 "인간화(humanized)"된다. 비인간(예를 들어, 마우스) 항체의 인간화된 형태는 키메라 면역글로불린(chimeric immunoglobulins), 면역글로불린 사슬(immunoglobulin chains) 또는 (Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서브서열(antigen-binding subsequences)와 같은) 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 포함하는 그것의 단편이다. 인간화 항체는 수용 항체의 상보성 결정 영역(CDR)로부터의 잔기가 원하는 특이도(specificity), 친화력(affinity) 및 능력(capacity)를 가지는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여 항체(donor antibody))의 CDR로부터의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린(수용 항체(recipient antibody))를 포함한다. 몇몇의 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 뼈대 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 치환된다. 인간화 항체는 또한 수용 항체뿐만 아니라 유입된(imported) CDR 또는 뼈대 서열 모두에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 해당하는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 모든 CDR과 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 공통 서열(consensus sequence)의 것들인, 실질적으로 모든 적어도 하나의 그리고 전형적으로 두 개의 가변성 도메인을 포함할 것이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분을 포함할 것이다(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).

비인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 공급원(source)으로부터 내부에 도입된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 전형적으로 "유입(import)" 가변 도메인으로부터 받아들여진 "유입" 잔기로 불린다. 항체 인간화 기술은 일반적으로 항체 분자의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 DNA 서열을 조작하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용을 포함한다. 인간화는 필수적으로 Winter 및 그 동료들의 방법에 따라, 설치류 CDR 또는 인간 항체의 해당 서열에 대한 CDR 서열을 치환시킴으로써 수행될 수 있다(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)). 따라서, 비인간 항체(또는 그것의 단편)의 인간화된 형태는 키메라 항체 또는 단편(U.S. Pat. No. 4,816,567)이며, 여기에서 완전(intact) 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적게 비인간 종들로부터의 해당 서열로 치환되었다. 실제는, 인간화 항체는 전형적으로 몇몇의 CDR 잔기 및 때때로 몇몇 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위 유래의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체를 만드는데 사용될 중쇄 및 경쇄 양쪽의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성(antigenicity)을 줄이는데 매우 중요하다. "최적합(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 선별된다. 설치류의 그것과 가장 유사한 인간 서열은 그 후 인간화 항체를 위한 인간 뼈대(FR)로서 받아들여진다(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993) and Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 다른 방법은 모든 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 공통서열로부터 유래된 특정 뼈대를 사용한다. 몇몇의 서로 다른 인간화 항체를 위해 동일한 뼈대가 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

항체는 항원에 대한 높은 친화력을 유지하고 다른 바람직한 생물학적 특성을 가지도록 인간화되는 것 또한 중요하다. 이 목적을 달성하기 위하여, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모(parental) 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 인간화 산물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델인 상업적으로 이용 가능하며, 당업자들에게 잘 알려져 있다. 컴퓨터 프로그램은 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 구조를 보여주고 나타내는 것이 가능하다. 이 디스플레이의 검토는 후보 면역글로불린 서열의 작용에 있어서 잔기가 어떤 역할을 할 것인지를 분석, 즉 그것의 항원에 결합하기 위해 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 표적 항원에 대하여 친화력이 증가된 것과 같은 원하는 항체 특성을 달성하도록 공통(consensus) 및 유입(import) 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는데 관여하고 있다(1994년 3월 3일에 공개된 WO 94/04679를 참조).

TNF-패밀리 사이토카인 TL1A에 특이적으로 결합하는 항원-결합 폴리펩티드 분자가 개시된다. 상기 폴리펩티드는 인간화 중쇄 가변 영역 및 인간화 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 뼈대(FR) 영역을 포함함에도 불구하고, 실질적으로 모 단일클론 항체의 항원-결합 특이도를 유지한다. 인간화 중쇄 가변 영역 및/또는 인간화 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDRs)를 제외하고, 적어도 약 87% 인간화되고, 적어도 약 90% 인간화되고, 적어도 약 95% 인간화되고, 적어도 약 98% 인간화되거나 적어도 약 100% 인간화된다. 항원-결합 폴리펩티드 분자는 단일클론 항체 공여자(예를 들어, 마우스 단일클론 항체 공여자; 인간 단일클론 항체 공여자)로부터 유래될 수 있고, 단일클론 항체(예를 들어, 마우스 단일클론 CDRs; 인간 단일클론 CDRs)로부터의 CDR을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 사이토카인 TL1A에 대하여 길항적으로 작용할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "에피토프(epitope)"는 개시되어 있는 항-DR3 또는 항-TL1A 항체와 특이적으로 상호작용할 수 있는 임의의 결정부위(determinant)를 포함하는 것이다. 에피토프성 결정부위(epitopic determinant)는 주로 아미노산 또는 당 측쇄(sugar side chain)와 같은 분자들이 모여있는 화학적으로 활성을 가지는 표면으로 이루어지며, 주로 특이적 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징 또한 갖는다.

"에피토프 태그(epitope tag)"는 항-에피토프 태그 항체(anti-epitope tag antibodies) 또는 다른 시약들을 사용하는 정제 또는 분자들의 가교결합을 위하여 사용될 수 있는 항체 또는 분자의 기능과 관련없는 짧은 펩티드 서열을 나타낸다.

"특이적으로 결합하는(specifically binds)"은 항체가 그것의 동족 항원(cognate antigen)(예를 들어, DR3 수용체 폴리펩티드 또는 TL1A 폴리펩티드)를 인식하여 물리적으로 상호작용하고, 다른 항원은 현저하게 인식하지 않으며 상호작용하지 않는 것을 의미하며; 이와 같은 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있는 기술에 의해 생성된다.

항체는 기질에 결합되거나, 검출가능한 부분(detectable moiety)으로 표지되거나, 결합되고 표지될 수 있다. 상기 검출가능한 부분은 형광(fluorescent), 효소(enzymatic) 및 방사성(radioactive) 마커를 포함하는 본 발명의 조성물로 고려된다.

2. 핵산

i. 서열( Sequences )

본원에 개시되어 있는 신호 경로에 관여하는 단백질 분자, 예를 들어 DR3 및 TL1A에 관련된 많은 서열들이 있으며, 이들은 모두 핵산에 의해 암호화되거나 핵산이다. 이들 유전자의 인간 유사체뿐만 아니라 다른 유사체 및 이들 유전자의 대립 형질(allele) 및 스플라이싱 변이체(splice variant) 및 다른 형태의 변이체에 대한 서열은 Genbank를 포함하는 다양한 단백질 및 유전자 데이터베이스에서 입수가능하다. Genbank에서 이 출원 당시 입수 가능한 서열들은 그 전체뿐만 아니라 거기에 포함되는 각각의 서브서열 또한 참조로서 본원에 통합되어 있다. Genbank는 www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi.에서 이용할 수 있다.

당업자들은 서열 불일치(discrepancies) 및 차이를 어떻게 해결하며, 다른 관련 서열에 대하여 특정 서열에 관련된 조성물 및 방법을 어떻게 조정하는지 알 수 있다. 프라이머(primer) 및/또는 프로브(probe)는 본원에 개시되어 있고 당업계에 공지되어 있는 임의의 주어진 서열 및 주어진 정보에 대하여 설계될 수 있다.

DR3에 대한 핵산 서열은 GenBank Accession No. NM_001039664.1(인간) 또는 Accession No. Q93038(인간; SEQ ID NO:1) 및 NM_033042.3(마우스)을 통하여 이용할 수 있다. TL1A에 대한 핵산 서열은 GenBank Accession No. NM_177371(마우스) 및 Accession No. NM_005118.2(인간) 또는 Accession No. Q8NFE9(SEQ ID NO:3)을 통하여 이용할 수 있다. GenBank Accession No. NM_001039664.1(인간) 및 NM_033042.3(마우스)으로 DR3에 대해 제공되거나, GenBank Accession No. NM_177371(마우스) 및 NM_005118.2(인간)으로 TL1A에 대해 제공되는 임의의 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는 모든 정보는 그 전체가 참고로서 본원에 포함된다.

ii . 뉴클레오티드 및 관련 분자( Nucleotides and related molecules )

뉴클레오티드는 염기 부분(base moiety), 당 부분(sugar moiety) 및 인산염 부분(phosphate moiety)을 포함하는 분자이다. 뉴클레오티드는 인터뉴클레오시드 결합(internucleoside linkage)을 만드는 그것들의 인산염 부분과 당 부분을 통하여 함께 결합될 수 있다. 뉴클레오티드의 염기 부분은 아데닌-9-일(adenin-9-yl)(A), 시토신-1-일(cytosin-1-yl)(C), 구아닌-9-일(guanin-9-yl)(G), 우라실-1-일(uracil-1-yl)(U) 및 티민-1-일(thymin-1-yl)(T)일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 부분은 리보오스(ribose) 또는 디옥시리보오스(deoxyribose)이다. 뉴클레오티드의 비제한적 예는 3'-AMP(3'-아데노신 모노포스페이트(3'-adenosine monophosphate)) 또는 5'-GMP(5'-구아노신 모노포스페이트(5'-guanosine monophosphate))일 것이다. 당업계에서 이용가능하며 본원에서 이용가능한 다양한 이들 형태의 분자들이 있다. 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 포함하는 뉴클레오티드의 군을 포함하며, N-글리코실 연결(N-glycosyl link)에 의해 인산화된 당에 결합되는 헤테로시클릭(heterocyclic) 화합물을 포함하는 임의의 화합물 또는 상보적 염기쌍(complementary base pairing)을 형성할 수 있는 임의의 모노머(monomer) 또는 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 임의의 폴리머(polymer)를 말한다.

용어 "뉴클레오티드 유사체(nucleotide analog)"는 바람직하게는 효소적 핵산 합성 및 프로세싱(processing)뿐만 아니라 화학적 합성 및 프로세싱에서 자연적으로 생성된 염기 대신에 사용될 수 있는 분자, 특히 염기쌍 형성이 가능한 변경된 뉴클레오티드를 말한다. 뉴클레오티드 유사체는 염기, 당 또는 인산염 부분 중 하나에 어떤 형태의 변형을 포함하는 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드에 대한 변형은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 5 메틸시토신(5 methylcytosine, 5 me C), 5 하이드록시메틸 시토신(5 hydroxymethyl cytosine), 크산틴(xanthine), 하이포크산틴(hypoxanthine) 및 2 아미노아데닌(2 aminoadenine) 뿐만 아니라 당 또는 인산염 부분에의 변형도 포함할 것이다.

이 용어는 변경된 퓨린(purine) 및 피리미딘(pyrimidine), 소수 염기(minor base), 전환가능한 뉴클레오시드(convertible nucleoside), 퓨린 및 피리미딘의 구조적 유사체, 표지되고, 유도체화되고 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드, 접합된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드, 서열 조절인자(sequence modifier), 말단 조절인자(terminus modifier), 스페이서 조절인자(spacer modifier), 및

리보오스-변형 뉴클레오티드(ribose-modified nucleotides), 포스포라미데이트(phosphoramidates), 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 포스폰아미디트(phosphonamidites), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonates), 메틸 포스포라미디트(methyl phosphoramiditesd), 메틸 포스폰아미디트(methyl phosphonamidites), 5'-β-시아노에틸 포스포라미디트(5'-β-cyanoethyl phosphoramidites), 메틸렌포스포네이트(methylenephosphonates), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioates), 펩티드 핵산(peptide nucleic acids), 아키랄(achiral) 및 뉴트럴(neutral) 인터뉴클레오티드성 결합(internucleotidic linkages) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 방향성 폴리아미드(aromatic polyamides) 및 지질과 같은 비뉴클레오티드 가교(nonnucleotide bridges)를 포함하나 이로 제한되지 않는 주쇄 변형(backbone modification)을 가지는 뉴클레오티드를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 선택적으로, 뉴클레오티드 유사체는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실 또는 소수 염기를 포함하지 않는 합성 염기이다. 이것들 및 다른 뉴클레오티드와 뉴클레오시드 유도체들, 유사체들 및 주쇄 변형은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Piccirilli J. A. et al. (1990) Nature 343:33-37; Sanghvi et al (1993) In: Nucleosides and Nucleotides as Antitumor and Antiviral Agents, (Eds. C. K. Chu and D. C. Baker) Plenum, New York, pp. 311-323; Goodchild J. (1990) Bioconjugate Chemistry 1:165-187; Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49:1925-1963). 뉴클레오티드 치환체(substitute)는 뉴클레오티드와 유사한 기능적 특성을 가지지만, 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)과 같은 인산염 부분을 포함하지 않는 분자이다. 뉴클레오티드 치환체는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 방식으로 핵산을 인식할 수 있지만, 인산염 부분이 아닌 부분을 통하여 함께 결합되는 분자이다. 뉴클레오티드 치환체는 적절한 표적 핵산과 상호작용할 때 이중 헬릭스형 구조(double helix type structure)에 따를 수 있다. 당업계에서 이용가능하고 본원에서 이용가능한 다양한 이들 형태의 분자들이 있다.

예를 들어, 세포 내 흡수(cellular uptake)를 증가시키기 위하여 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 다른 형태의 분자들(접합체)을 결합시킬 수 있다. 접합체(conjugate)는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 화학적으로 결합될 수 있다. 이와 같은 접합체는 콜레스테롤 부분(cholesterol moiety)과 같은 지질 부분을 포함하나 이로 제한되지 않는다(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989,86, 6553-6556). 당업계에서 이용가능하고 본원에서 이용가능한 다양한 이들 형태의 분자들이 있다.

핵산에 기초한 본원에 기재된 다양한 분자들은 예를 들어, TL1A 및 DR3, 본원에 기재된 임의의 다른 단백질뿐만 아니라 다양한 기능성 핵산들을 암호화하는 핵산을 포함한다. 개시된 핵산은 예를 들어, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체로 구성된다. 이들 및 다른 분자들의 비제한적 예들이 본원에서 논의된다. 예를 들어, 벡터가 세포에서 발현될 때, 발현된 mRNA는 전형적으로 A, C, G 및 U로 구성될 것이라는 것을 알 수 있다. 비슷하게는, 만약 예를 들어, 안티센스(antisense) 분자가 예를 들어 외인적 전달(exogenous delivery)을 통하여 세포 또는 세포 환경 내로 도입된다면, 안티센스 분자는 세포 환경에서 안티센스 분자의 분해를 감소시키는 뉴클레오티드 유사체로 만들어진다.

"분리된 핵산(isolated nucleic acid)" 또는 "정제된 핵산(purified nucleic acid)"은 본 발명의 DNA가 유래된 생물체의 자연적으로 생성된 게놈에 있는 유전자와 인접한 유전자를 포함하지 않는 DNA를 의미한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어, 자체적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스와 같이 벡터 내로 통합되거나; 원핵 또는 진핵세포의 게놈 DNA(genomic DNA)(예를 들어, 전이유전자(transgene)) 내로 통합되거나; 별개의 분자(예를 들어, PCR, 제한효소 분해(restriction endonuclease digestion) 또는 화학적 또는 시험관 내 합성에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 단편 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 그것은 또한 추가적인 폴리펩티드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부분인 재조합 DNA도 포함한다. 상기 용어 "분리된 핵산"은 또한 RNA, 예를 들어, 분리된 DNA 분자에 의해 암호화되거나, 화학적으로 합성되거나, 적어도 몇몇의 세포 성분들, 예를 들어 RNA 분자 또는 폴리펩티드 분자의 다른 형태들로부터 분리되거나 이것들을 실질적으로 포함하지 않는 mRNA 분자를 말한다.

iii . 뉴클레오티드 상호작용( Nucleotide interactions )

왓슨-크릭 상호작용(Watson-Crick interaction)은 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체의 왓슨-크릭 면(Watson-Crick face)과의 적어도 하나의 상호작용이다. 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체의 왓슨-크릭 면은 퓨린 기반 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체의 C2, N1 및 C6 위치 및 피리미딘 기반 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체의 C2, N3 및 C4 위치를 포함한다.

후그스틴 상호작용(Hoogsteen interaction)은 듀플렉스(duplex) DNA의 주홈(major groove)에 노출되어 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 후그스틴 면 상에서 일어나는 상호작용이다. 후그스틴 상호작용은 퓨린 뉴클레오티드의 N7 위치, 및 C6 위치에서의 반응기(reactive group)(NH₂ 또는 O)를 포함한다.

iv . 올리고 및 폴리뉴클레오티드( Oligo and Polynucleotides )

용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 뉴클레오티드의 자연적으로 생성된 혹은 합성 폴리머, 바람직하게는 적어도 세 개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리머, 더욱 바람직하게는 혼성화가 가능한 폴리머를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 선택된 핵산 서열, 헤테로듀플렉스(heteroduplexes), 키메라 및 혼성화된 뉴클레오티드를 포함하는 단일-가닥(single-stranded), 이중-가닥(double-stranded), 부분적으로 단일-가닥 또는 부분적으로 이중-가닥 리보뉴클레산(리보핵산(ribonucleic acid) 또는 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)일 수 있고, 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 비올리고뉴클레오티드(nonoligonucleotide) 분자에 접합된다.

용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 대개 본원에서 인산디에스테르 결합(phosphodister bond)에 의해 서로 결합된 두 개 또는 그 이상의 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 서열을 의미하는 것으로 사용된다. 그러한 것으로서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 유전자 또는 그것의 일부분, cDNA, 합성 폴리디옥시리보핵산 서열 등일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있을 뿐만 아니라, DNA/RNA 하이브리드일 수 있는 RNA 및 DNA를 포함한다. 게다가, 본원에 사용된 것으로서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 세포로부터 분리될 수 있는 자연적으로 생성된 핵산 분자뿐만 아니라, 예를 들어 화학적 합성 방법에 의하거나 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 것과 같은 효소적 방법에 의해 제조될 수 있는 합성 분자도 포함한다. 다양한 구현에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 인산디에스테르 결합이 아닌 주쇄결합(backbone bond)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 2'-디옥시리보오스에 결합된 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 티민과 같은 자연적으로 생성된 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보오스에 결합된 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실과 같은 리보뉴클레오티드이다. 그러나, 폴리뉴클레오티드는 또한 비자연적으로 생성된 합성 뉴클레오티드 또는 변형된 자연적으로 생성된 뉴클레오티드를 포함하는, 뉴클레오티드 유사체도 포함할 수 있다. 이와 같은 뉴클레오티드 유사체는 이와 같은 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 같이 당업계에 잘 알려져 있으며 상업적으로 이용가능하다(Lin et al., Nucl. Acids Res. 22:5220-5234 (1994); Jellinek et al., Biochemistry 34:11363-11372 (1995); Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15:68-73 (1997)을 참조, 그것들 각각은 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있다).

폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 연결하는 공유결합은 일반적으로 인산디에스테르 결합이다. 그러나, 공유 결합 또한 티오디에스테르 결합(thiodiester bond), 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate bond), 펩티드-유사 결합(peptide-like bond)을 포함하는 수많은 다른 임의의 결합이거나, 합성 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위하여 뉴클레오티드를 결합하는데 유용한 것으로서 당업계에 잘 공지되어 있는 임의의 다른 결합일 수 있다(예를 들어, Tam et al., Nucl. Acids Res. 22:977-986 (1994); Ecker and Crooke, BioTechnology 13:351360 (1995)을 참조, 그것들 각각은 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있다). 비자연적으로 생성된 뉴클레오티드 유사체의 도입(incorporation) 또는 뉴클레오티드 또는 유사체를 연결하는 결합은 폴리뉴클레오티드는 변형된 폴리뉴클레오티드는 분해에 덜 민감할 수 있기 때문에, 예를 들어, 조직 배양 배지 또는 살아있는 피험자에의 투여를 포함하는 핵산분해성(nucleolytic) 활성을 가질 수 있는 환경에 노출되는 경우 특히 유용할 수 있다.

자연적으로 생성된 폴리뉴클레오티드의 기능적 유사체는 RNA 또는 DNA에 결합할 수 있고, 펩티드 핵산(PNA) 분자를 포함할 수 있다.

참조 핵산의 단편은 참조 핵산의 인접한 핵산만을 포함하며, 적어도 하나의 참조 서열보다 더 짧은 뉴클레오티드이다.

v. 프라이머 및 프로브( Primers and Probes )

본원에 개시되어 있는 것과 같은 DR3 또는 TL1A와 같은 개시된 핵산과 상호작용할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물이 개시된다. 어떤 구현에서, 프라이머는 DNA 증폭 반응을 지원하기 위하여 사용된다. 전형적으로, 프라이머는 순서 특이적 방식(sequence specific manner)으로 신장(extension)될 수 있을 것이다. 순서 특이적 방식에서 프라이머의 신장은 핵산 분자의 서열 및/또는 구성에 대하여 프라이머가 프라이머의 신장에 의해 생성된 생성물의 구성 또는 서열과 혼성화되거나 그렇지 않으면 그것들과 직접적으로 관련되거나 그것들에 영향을 주는 어떤 방법을 포함한다. 순서 특이적 방식에서 프라이머는 따라서 PCR, DNA 염기서열분석(DNA sequencing), DNA 확장(DNA extension), DNA 중합(DNA polymerization) 또는 역전사(reverse transcription)를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 순서 특이적 방식에서 프라이머를 증폭하는 기술 및 조건이 바람직하다. 어떤 구현에서, 프라이머는 PCR 또는 직접 염기서열분석(direct sequencing)과 같은 DNA 증폭 반응을 위해 사용된다. 어떤 구현에서, 상기 프라이머는 또한 예를 들어, 프라이머를 신장하기 위해 사용된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 순서 특이적 방식으로 프라이머를 신장하기 위하여 화학적으로 반응할 수 있도록 변형된 비효소적 기술을 사용하여 신장될 수 있음을 알 수 있다. 전형적으로, 개시된 프라이머는 개시된 핵산 또는 그 핵산의 부분과 혼성화되거나, 그것들은 핵산의 상보체(complement) 또는 그 핵산의 부분의 상보체와 혼성화된다.

어떤 구현에서 핵산과 상호작용하기 위한 프라이머 또는 프라이머의 크기는 DNA 증폭, 또는 프로브 또는 프라이머의 간단한 혼성화와 같은 프라이머의 원하는 효소적 조작을 지지하는 임의의 크기일 수 있다. 전형적인 프라이머 또는 프로브는 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 또는 4000 뉴클레오티드 길이일 것이다.

다른 구현에서, 프라이머 또는 프로브는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 또는 4000 뉴클레오티드 길이보다 작거나 같을 수 있다.

DR3 또는 TL1A 유전자에 대한 프라이머는 전형적으로 DR3 또는 TL1A 유전자의 부분 또는 완전한 유전자를 포함하는 증폭된 DNA 생성물을 생산하기 위해 사용될 것이다. 일반적으로, 상기 생성물의 크기는 전형적으로 정확히 3 또는 2 또는 1 뉴클레오티드 내로 측정될 수 있는 그러한 것일 것이다.

어떤 구현에서, 이 생성물은 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 또는 4000 뉴클레오티드 길이이다.

다른 구현에서, 상기 생성물은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 또는 4000 뉴클레오티드 길이보다 작거나 같다.

3. 펩티드( Peptides )

i. 단백질 변이체( protein variants )

본원에 논의된 것과 같이, 공지되어 있으며 본원에서 고려되고 있는 다양한 DR3 단백질 및 TL1A 단백질의 변이체들이 있다. 게다가, 공지된 기능적 균주 변이체들에 대한 개시된 방법 및 조성물에서 또한 기능하는 DR3 또는 TL1A 단백질의 유도체들도 있다. 단백질 변이체 및 유도체들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 그것들 내에 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열 번형은 전형적으로 세 가지 종류들 중 하나 또는 그 이상을 포함한다: 치환(substitutional) 변이체, 삽입(insertional) 변이체 또는 결실(deletional) 변이체. 삽입(insertion)은 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열 내 삽입(intrasequence insertion)을 포함한다. 삽입은 대개 예를 들어, 하나 내지 네 개 잔기의 단위로 아미노 말단 또는 카르복실 말단 융합의 그것보다는 더 작은 삽입일 것이다. 실시예에 기재된 것들과 같은 면역원성 융합 단백질 유도체(immunogenic fusion protein derivatives)는 시험관 내 가교결합에 의하거나, 융합 단백질을 암호화하는 DNA로 형질전환된 재조합 세포 배양물에 의해 표적 서열에 면역원성을 부여하기에 충분히 큰 폴리펩티드를 융합하여 만들어진다. 결실(deletion)은 단백질 서열로부터의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 전형적으로, 약 2 내지 6개 이하의 잔기만이 단백질 분자 내의 어떤 한 부위에서 결실된다. 이들 변이체는 대개 단백질을 암호화하는 DNA에서 뉴클레오티드의 부위 특이적 돌연변이(site specific mutagenesis)에 의해 제조되며, 그에 의해 변이체를 암호화하는 DNA가 생성되고, 그 후 재조합 세포 배양물에서 DNA를 발현한다. 공지된 서열을 가지는 DNA 내의 미리결정된 부위에서 치환 변이체를 만들기 위한 기술, 예를 들어 M13 프라이머 돌연변이 및 PCR 돌연변이는 잘 알려져 있다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기이지만, 동시에 다수의 서로 다른 위치에서 일어날 수 있고; 삽입은 약 1 내지 10 아미노산 잔기의 단위일 것이며; 결실은 약 1 내지 30 잔기 범위일 것이다. 결실 또는 삽입은 인접한 쌍(adjacent pairs), 즉 2 잔기의 결실 또는 2 잔기의 삽입으로 이루어지는 것이 바람직하다. 친환, 결실, 삽입 또는 임의의 그것들의 조합은 최종 구조물에 이르기 위하여 조합될 수 있다. 돌연변이(mutation)는 리딩 프레임(reading frame) 바깥의 서열에서 일어나서는 안되며, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적인 영역(complementary region)을 만들지 않을 것이다. 치환 변이체는 적어도 하나의 잔기가 제거되고, 그것의 위치에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 이와 같은 치환은 일반적으로 하기 표 2에 따라 일어나며, 보존적 치환(conservative substitution)이라 칭한다.

아미노산 약어

아미노산	약어
Alanine	Ala	A
allosoleucine	AIle
Arginine	Arg	R
asparagine	Asn	N
aspartic acid	Asp	D
Cysteine	Cys	C
glutamic acid	Glu	E
Glutamine	Gln	Q
Glycine	Gly	G
Histidine	His	H
Isolelucine	Ile	I
Leucine	Leu	L
Lysine	Lys	K
phenylalanine	Phe	F
proline	Pro	P
pyroglutamic acid	pGlu
Serine	Ser	S
Threonine	Thr	T
Tyrosine	Tyr	Y
Tryptophan	Trp	W
Valine	Val	V

아미노산 치환

원래 잔기	예시적 보존적 치환, 그 외는 당업계에 공지되어 있음
Ala	Ser
Arg	Lys; Gln
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn, Lys
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn;Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln
Met	Leu; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

기능 또는 면역학적 동일성(identity)에 있어서의 상당한 변경은 표 3에 있는 것들보다 덜 보존적인 치환을 선택, 즉 (a) 예를 들어 시트형(sheet) 또는 나선형(helical) 구조와 같은, 치환 부위에서의 폴리펩티드 주쇄의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하(charge) 또는 소수성(hydrophobicity) 또는 (c) 측쇄(side chain)의 벌크(bulk)를 유지하는데 있어서 그것의 효과가 더욱 현저하게 다른 잔기를 선택함으로써 만들어진다. 일반적으로 단백질 특성에 가장 큰 변화를 주는 것으로 기대되는 치환은 (a) 친수성 잔기(hydrophilic residue), 예를 들어 세릴(seryl) 또는 트레오닐(threonyl)이 소수성 잔기(hydrophobic residue), 예를 들어 루실(leucyl), 이소루실(isoleucyl), 페닐알라닐(phenylalanyl), 발릴(valyl) 또는 알라닐(alanyl)로(또는 그것에 의해) 치환된 것; (b) 시스테인(cysteine) 또는 프롤린(proline)이 임의의 다른 잔기로(또는 그것에 의해) 치환된 것; (c) 전기 양성적(electropositive) 측쇄, 예를 들어 라이실(lysyl), 아르기닐(arginyl) 또는 히스티딜(histidyl)을 가지는 잔기가 전기음성적(electronegative) 측쇄, 예를 들어 글루타밀(glutamyl) 또는 아스파틸(aspartyl)로(또는 그것에 의해) 치환된 것; 또는 (d) 벌키한 측쇄(bulky side chain)를 가지는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌(phenylalanine)이 측쇄를 가지지 않는 것, 예를 들어 글리신(glycine)으로(또는 그것에 의해) 치환된 것, 이 경우에 있어서 (e) 황산화(sulfation) 및/또는 글리코실화(glycosylation)를 위한 부위의 수를 증가시키는 것에 의한 것일 것이다.

예를 들면, 생물학적 및/또는 화학적으로 유사한 다른 것을 사용한 하나의 아미노산 잔기의 치환은 당업계에 보존적 치환으로서 공지되어 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 한 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기로 또는 한 극성(polar) 잔기를 다른 극성 잔기로 치환하는 것일 수 있다. 치환은 예를 들어, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr과 같은 조합을 포함한다. 이와 같은 각각의 명백하게 개시된 서열의 보존적으로 치환된 변이체들은 본원에서 제공되는 모자이크 폴리펩티드(mosaic polypeptide) 내에 포함된다.

치환 또는 결실 돌연변이는 N-글리코실화(Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화(Ser 또는 Thr)를 위한 삽입 부위에 사용될 수 있다. 시스테인 또는 다른 불안정한(labile) 잔기의 결실은 또한 바람직할 수 있다. 잠재적 단백질 분해(proteolysis) 부위, 예를 들어 Arg의 결실 또는 치환은 예를 들어, 염기성 잔기(basic residues) 중 하나를 결실하거나 하나를 글루타미닐(glutaminyl) 또는 히스티딜(histidyl) 잔기로 치환함으로써 달성된다.

어떤 번역후 유도체화(post-translational derivatizations)는 발현된 폴리펩티드 상에서의 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐(glutaminyl) 및 아스파라기닐(asparaginyl) 잔기는 빈번하게 해당 글루타밀 및 아스파릴 잔기에 대하여 번역후 탈아미드화(post-translationally deamidated)된다. 대안적으로, 이들 잔기는 온화한 산성 조건하에서 탈아미드화된다. 다른 번역후 변형(post-translational modifications)은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화(hydroxylation), 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화(phosphorylation), 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노기의 메틸화(methylation)(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]), N-말단 아민의 아세틸화(acetylation) 및 몇몇의 경우에 있어서 C-말단 카르복실의 아미드화를 포함한다.

본원에 개시된 단백질의 변이체 및 유도체를 정의하기 위한 하나의 방법은 특정 공지 서열에 대한 상동성(homology)/동일성(identity)에 관하여 변이체 및 유도체를 정의하는 것임을 알 수 있다. 예를 들면, SEQ ID NO:2는 DR3 단백질의 특정 서열을 말하며, SEQ ID NO:4는 TL1A 단백질의 특정 서열을 말한다. 특별히, 이것들의 변이체 및 언급된 서열에 대하여 적어도 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95%의 상동성을 가지는 본원에 개시된 다른 단백질이 개시된다. 당업자들은 두 개의 단백질의 상동성을 어떻게 측정하는지에 대하여 쉽게 알 수 있다. 예를 들어, 상동성은 상동성이 가장 높은 수준에 있도록 두 개의 서열을 정렬한 후에 계산될 수 있다.

상동성을 계산하는 또 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬(optimal alignment)은 스미스 및 워터만(Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981))의 국부 상동성 알고리즘(local homology algorithm)에 의해, 니들만 및 분쉬(Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘(homology alignment algorithm)에 의해, 피어슨 및 립만(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988))의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 컴퓨터화된 실행에 의해, 또는 검토(inspection)에 의해 수행될 수 있다.

동일한 형태의 상동성은 예를 들어, 적어도 핵산 정렬에 관련된 물질에 대한 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 Zuker(M. Science 244:48-52, 1989), Jaeger(Jaeger et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:7706-7710, 1989; Jaeger et al. Methods Enzymol . 183:281-306, 1989)에 개시되어 있는 알고리즘에 의해 핵산에 대해 얻어질 수 있다.

보존적 돌연변이 및 상동성에 대한 기술은 특정 서열에 대한 적어도 70% 상동성을 가지는 구현과 같이 임의의 조합으로 함께 조합될 수 있으며, 여기에서 변이체는 보존적 돌연변이인 것으로 여겨진다.

이 명세서에서 다양한 단백질 및 단백질 서열을 논의하는 바와 같이, 이들 단백질 서열을 암호화할 수 있는 핵산들 또한 개시되는 것으로 여겨진다. 이것은 특정 단백질 서열에 관련된 모든 퇴화 서열(Degenerate sequence), 즉 하나의 특정 단백질 서열을 암호화하는 서열을 가지는 모든 핵산뿐만 아니라, 퇴화 핵산을 포함하는 개시된 변이체 및 단백질 서열의 유도체를 암호화하는 모든 핵산을 포함할 것이다. 따라서, 각각의 특정 핵산 서열이 본원에 자세히 기재되지 않을 수 있지만, 각각의 그리고 모든 서열은 사실 개시된 단백질 서열을 통하여 본원에 개시되고 기술되는 것으로 여겨진다. 또한, 어떤 아미노산 서열도 어떤 특정 DNA 서열이 생물체 내의 그 단백질을 암호화하는지를 나타내지 않는다 할지라도, 개시된 단백질의 특정 변이체가 본원에 개시된 경우, 그 단백질을 암호화하는 공지의 핵산 서열 또한 공지된 것이며, 본원에 개시되고 서술된 것으로 여겨진다.

개시된 조성물 내로 포함될 수 있는 다양한 아미노산 및 펩티드 유사체들이 있는 것으로 여겨진다. 예를 들면, 서로 다른 기능적 치환기를 가지는 다양한 D 아미노산 또는 아미노산이 있으며, 이들 아미노산을 표 2 및 표 3에 나타내었다. 자연적으로 생성된 펩티드의 반대의 입체 이성질체(opposite stereoisomer)뿐만 아니라 펩티드 유사체의 입체 이성질체도 개시된다. 이들 아미노산은 선택된 아미노산으로 tRNA 분자를 충전하고, 부위 특이적 방식으로 펩티드 사슬 내로 아미노산 유사체를 삽입하기 위하여 앰버 코돈(amber codon)을 사용하는 유전자 구조물(genetic construct)을 조작함으로써 폴리펩티드 내로 쉽게 통합되어 질 수 있다(Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Enginerring Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994), 이들 모두 적어도 아미노산 유사체에 관련된 물질에 대한 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있다).

분자들은 펩티드와 닮도록 생산될 수 있지만, 천연의 펩티드 결합을 통하여 연결되지는 않는다. 예를 들면, 아미노산 또는 아미노산 유사체에 대한 결합은 CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂--CH₂ --, --CH=CH-- (시스 및 트랜스), --COCH₂ --, --CH(OH)CH₂--, 및 --CHH₂SO--를 포함할 수 있다(Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH₂NH--, CH₂CH₂--); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H₂--S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH--CH--, cis and trans); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH₂--); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH₂--); Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CH₂--); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH₂--); and Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH₂--S--), 이들 각각은 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있다). 특히 바람직한 비펩티드 결합은 --CH₂NH--이다. 펩티드 유사체는 b-알라닌(b-alanine), g-아미노부티르산(g-aminobutyric acid) 등과 같이 결합 원자 사이에 많은 원자들을 가질 수 있는 것으로 여겨진다.

아미노산 유사체 및 펩티드 유사체는 종종 더욱 경제적인 생산, 더 큰 화학적 안정성, 증가된 약제학적 특성(반감기(half-life), 흡수(absorption), 역가(potency), 효능(efficacy) 등), 변경된 특이도(specificity)(예를 들어, 광범위 스펙트럼(broad-spectrum)의 생물학적 활성), 감소된 항원성(antigenecity) 등과 같이 강화되거나 바람직한 특성을 가진다.

D-아미노산은 펩티다아제(peptidase) 등에 의해 인식되지 않기 때문에, D-아미노산은 더욱 안정한 펩티드를 만드는데 사용될 수 있다. 동일한 형태의 D-아미노산(예를 들어, L-라이신 대신 D-라이신)을 가지는 공통서열(consensus sequence)의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 전체적 치환(systemic substitution)은 더욱 안정한 펩티드를 만드는데 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 두 개 또는 그 이상의 펩티드를 함께 환형화(cyclize)시키거나 부착시키는데 사용될 수 있다. 이것은 펩티드를 특정 형태로 만드는데 유익할 수 있다. (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), 이는 본원에 참고문헌으로서 통합되어 있음).

4. 서열 유사성( sequence similarities )

본원에 논의된 것과 같이, 용어 상동성 및 동일성의 사용은 유사성(similarity)과 같이 동일한 것을 의미하는 것으로 여겨진다. 따라서, 예를 들어, 상동성이라는 단어가 두 개의 비천연 서열들 간에 사용된다면, 이것은 반드시 두 서열 사이의 진화적 관계(evolutionary relationship)를 나타낼 필요는 없으며, 그보다는 그것들의 핵산 서열들 간의 유사성 또는 관련성을 보는 것으로 여겨진다. 그것들이 진화적으로 관련이 있는지 아닌지의 여부와는 관계없이 서열 유사성을 측정하기 위한 목적으로 임의의 두 개 또는 그 이상의 핵산 또는 단백질에 대하여 두 개의 진화적으로 관련된 분자들 사이의 상동성을 측정하기 위한 많은 방법들이 통상적으로 사용되고 있다.

일반적으로, 본원에 개시된 유전자 및 단백질의 어떤 공지의 변이체 및 유도체 또는 발생할 수 있는 것들을 정의하기 위한 하나의 방법은 특정 공지 서열에 대한 상동성에 관하여 변이체 및 유도체를 정의하는 것을 통한 것임을 알 것이다. 이러한 본원에 개시된 특정 서열의 동일성은 또한 본원의 다른 곳에서도 논의된다. 일반적으로, 본원에 개시된 유전자 및 단백질의 변이체는 전형적으로 언급된 서열 또는 천연 서열에 대하여 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 상동성을 가진다. 당업자들은 두 개의 단백질 또는 유전자와 같은 핵산의 상동성을 어떻게 측정하는지에 대하여 쉽게 알 수 있다. 예를 들어, 상동성은 상동성이 가장 높은 수준에 있도록 두 개의 서열을 정렬한 후에 계산될 수 있다.

상동성을 계산하는 또 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬(optimal alignment)은 스미스 및 워터만(Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981))의 국부 상동성 알고리즘(local homology algorithm)에 의해, 니들만 및 분쉬(Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘(homology alignment algorithm)에 의해, 피어슨 및 립만(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988))의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 컴퓨터화된 실행에 의해, 또는 검토(inspection)에 의해 수행될 수 있다.

동일한 형태의 상동성은 예를 들어, 적어도 핵산 정렬에 관련된 물질에 대한 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 Zuker 등(Zuker, M. Science 244:48-52, 1989), 재거(Jaeger et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:7706-7710, 1989; Jaeger et al. Methods Enzymol . 183:281-306, 1989)에 개시되어 있는 알고리즘에 의해 핵산에 대해 얻어질 수 있다.

상기 방법들 중 어떤 것이라도 전형적으로 사용될 수 있으며, 어떤 경우에는 이들 다양한 방법들의 결과가 다를 수 있으나, 만약 동일성이 이들 방법들 중 적어도 하나에서 발견된다면, 당업자들은 서열들이 언급되어 있는 동일성을 가지며 본원에 기재된 것이라 말할 수 있을 것이라는 것을 알 것이다.

예를 들어, 본원에 사용된 것으로서, 다른 서열에 대하여 특정 퍼센트의 상동성을 가지는 것으로 언급된 서열은 임의의 하나 또는 그 이상의 상기에 기재된 계산 방법에 의해 계산된 것으로 언급된 상동성을 가지는 서열을 말한다. 예를 들어, 첫 번째 서열이 임의의 다른 계산 방법에 의해 계산된 것으로서 두 번째 서열에 대하여 80% 상동성을 가지지 않는다 할지라도 주커 계산 방법을 사용하여 두 번째 서열에 대하여 80% 상동성을 가지는 것으로 계산된다면, 첫 번째 서열은 두 번째 서열에 대하여 본원에 정의된 것과 같이 80% 상동성을 가진다. 다른 예로서, 첫 번째 서열이 스미스 및 워터만 계산 방법, 니들만 및 분쉬 계산 방법, 재거 계산 방법 또는 임의의 다른 계산 방법에 의해 계산된 것으로서 두 번째 서열에 대하여 80% 상동성을 가지지 않는다 할지라도 주커 계산 방법 및 피어슨 및 립만 계산 방법 모두를 사용하여 두 번째 서열에 대하여 80% 상동성을 가지는 것으로 계산된다면, 첫 번째 서열은 두 번째 서열에 대하여 본원에 정의된 것과 같이 80% 상동성을 가진다. 또 다른 예로서, (비록, 실제로 서로 다른 계산 방법은 종종 서로 다르게 계산된 상동성 퍼센트를 나타낼 것이지만) 첫 번째 서열이 각각의 계산 방법을 사용하여 두 번째 서열에 대하여 80% 상동성을 가지는 것으로 계산된다면, 첫 번째 서열은 두 번째 서열에 대하여 본원에 정의된 것과 같이 80% 상동성을 가진다.

5. 혼성화 ( hybridization )/선택적 혼성화( selective hybridization )

용어 혼성화는 전형적으로 프라이머 또는 프로브 및 유전자와 같은 적어도 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유도성 상호작용(sequence driven interaction)을 의미한다. 서열 유도성 상호작용은 뉴클레오티드 특이적 방식으로 두 개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 유도체들 사이에서 발생하는 상호작용을 의미한다. 예를 들면, C와 상호작용하는 G 또는 T와 상호작용하는 A는 서열 중심의 상호작용이다. 전형적으로, 서열 유도성 상호작용은 뉴클레오티드의 왓슨-크릭 면 또는 후그스틴 면에서 발생한다. 두 개의 핵산의 혼성화는 당업자들에게 공지되어 있는 다수의 조건 및 매개변수(parameter)들에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 염 농도, pH 및 반응 온도 모두 두 개의 핵산 분자가 혼성화될 것인지에 영향을 미친다.

두 개의 핵산 분자 사이의 선택적 혼성화를 위한 매개변수는 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 몇몇의 구현에서, 선택적 혼성화 조건은 엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization condition)으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격함은 혼성화 및 세척 단계 중 하나 또는 그것들 모두의 온도 및 염 농도 모두에 의해 조절된다. 예를 들어, 선택적 혼성화를 달성하기 위한 혼성화 조건은 Tm(분자들의 절반이 그것들의 혼성화 파트너로부터 분리되는 용융 온도(melting temperature) 아래인 약 12-25℃의 온도에서 고이온강도(high ionic strength) 용액(6X SSC 또는 6X SSPE)에서의 혼성화 후, 세척 온도가 Tm 아래인 약 5℃ 내지 20℃가 되도록 선택된 온도와 염 농도의 조합에서 세척하는 것을 포함할 것이다. 상기 온도 및 염 농도는 필터에 고정화된 참조 DNA 샘플이 표지된 관심 핵산과 혼성화된 후 서로 다른 엄격한 조건 하에서 세척되는 예비적 실험에서 경험적으로 쉽게 결정된다. 혼성화 온도는 전형적으로 DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화에 대한 온도보다 높다. 엄격함을 달성하기 위하여 상기에 기재된 것 또는 당업계에 공지된 것과 같은 조건이 사용될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Kunkel et al. Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987 which is herein incorporated by reference for material at least related to hybridization of nucleic acids). DNA:DNA 혼성화를 위한 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 6X SSC 또는 6X SSPE에서(수용액에서) 약 68℃에서 혼성화한 후 68℃에서 세척하는 것일 수 있다. 만약 원한다면, 혼성화 및 세척의 엄격성은 원하는 상보성(complementarity)의 정도가 감소됨에 따라 감소될 수 있으며, 또한 찾아야 할 가변성이 있는 G-C 또는 A-T가 풍부한 어떤 영역에 의존할 수 있다. 마찬가지로, 당업계에 모두 공지되어 있는 것과 같이, 혼성화 및 세척의 엄격성은 원한다면 원하는 상동성이 증가함에 따라 증가될 수 있으며, 또한 높은 상동성이 요구되는 G-C 또는 A-T가 풍부한 어떤 영역에 의존할 수 있다.

선택적 혼성화를 정의하기 위한 다른 방법은 다른 핵산에 결합된 핵산 중 하나의 양(퍼센트)을 보는 것이다. 예를 들면, 몇몇 구현에서, 선택적 혼성화 조건은 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 제한(limiting) 핵산이 비제한(non-limiting) 핵산에 결합되는 경우일 것이다. 전형적으로, 비제한 프라이머는 예를 들어, 10 또는 100 또는 1000배 초과된다. 이러한 형태의 검정법은 제한 및 비제한 프라이머 모두가 예를 들어, 그것들의 K_d 이하 10배 또는 100배 또는 1000배이거나, 핵산 분자 중 하나만이 10배 또는 100배 또는 1000배이거나, 하나 또는 모든 핵산 분자가 그것들의 K_d 이상인 조건 하에서 수행될 수 있다.

선택적 혼성화를 정의하기 위한 다른 방법은 원하는 효소적 조작을 촉진하는데 혼성화가 요구되는 조건하에서 효소적으로 조작된 프라이머의 백분율을 보는 것에 의한 것이다. 예를 들면, 몇몇 구현에서, 선택적 혼성화 조건은 예를 들여, 만약 효소적 조작이 DNA 확장이라면, 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 프라이머가 효소적 조작을 촉진하는 조건하에서 효소적으로 조작되는 경우일 것이며, 그 후 선택적 혼성화 조건은 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 프라이머 분자가 확장되는 경우일 것이다. 바람직한 조건은 또한 제조자에 의해 제안된 것들 또는 조작을 수행하는 효소에 적합한 것으로 당업계에 나타나 있는 것들을 포함한다.

상동성의 경우와 마찬가지로, 두 개의 핵산 분자 사이의 혼성화 수준을 결정하기 위한 다양한 방법들이 본원에 개시되어 있다는 것을 알 것이다. 이들 방법 및 조건은 두 개의 핵산 분자 사이에 서로 다른 혼성화 백분율을 제공할 수 있지만, 달리 표시되어 있지 않는 한, 방법들 중 어느 것의 매개변수를 충족시키기 충분할 것이다. 예를 들어, 80% 혼성화가 요구되며, 이 방법들 중 어느 하나에서 요구되는 매개변수 내에서 혼성화가 일어나기만 한다면, 그것은 본원에 기재된 것으로 고려된다.

만약 조성물 또는 방법이 종합적으로 또는 단일적으로 혼성화를 결정하는 이들 기준 중 어느 하나라도 충족한다면, 그 조성물 또는 방법은 본원에 기재된 것이라는 것으로 여겨진다는 것을 당업자들은 잘 알 것이다.

6. 세포 운반 시스템( Cell Delivery System )

시험관 내(in vitro) 또는 세포 내(in vivo) 중 어느 하나에서, 세포로 핵산을 운반하는데 사용될 수 있는 다양한 조성물 및 방법들이 있다. 이들 방법 및 조성물은 크게 두 가지 종류로 나눠질 수 있다: 바이러스-기반 운반 시스템(viral based delivery system) 및 비바이러스-기반 운반 시스템(non-viral based delivery system). 예를 들면, 핵산은 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 칼슘인산침전법(calcium phosphate precipitation), 플라스미드(plasmid), 바이러스 벡터(viral vector), 바이러스 핵산(viral nucleic acids), 파지 핵산(phage nucleic acids), 파지(phages), 코스미드(cosmids)와 같은 수많은 직접 운반 시스템을 통하거나, 세포 내로의 유전 물질의 전이를 통하거나, 양이온성 리포솜(cationic liposome)과 같은 담체를 통하여 운반될 수 있다. 바이러스 벡터, 화학적 형질감염체(chemical transfectant) 또는 전기천공법 및 DNA의 직접 확산(direct diffusion)과 같은 물리기계적(physicomechanical) 방법을 포함하는 형질감염을 위한 적절한 수단이 예를 들어 Wolff 등에 기재되어 있다(Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); and Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991). 이와 같은 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위하여 쉽게 변형가능하다. 어떤 경우에 있어서, 상기 방법들은 큰 DNA 분자와 특이적으로 기능하도록 변형될 것이다. 게다가, 이들 방법은 담체의 표적화 특성을 사용함으로써 어떤 질병 및 세균 집단을 표적화하는데 사용될 수 있다.

i. 핵산 기반 운반 시스템( Nucleic acid based delivery systems )

전이 벡터(transfer vector)는 세포 내로 유전자를 운반하는데 사용되는 임의의 뉴클레오티드 구조물(예를 들어, 플라스미드) 또는 유전자를 운반하기 위한 일반적인 전략의 일부분, 예를 들어, 재조합 레트로바이러스 또는 아데노바이러스의 일부분일 수 있다(Ram et al. Cancer Res. 53:83-88, (1993)).

본원에 사용된 것으로서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 분해되는 일 없이 세포 내로 DR3 또는 TL1A와 같은 개시된 핵산을 운송하며, 그것이 운반된 세포 내에서 유전자를 발현시키는 프로모터(promoter)를 포함하는 약제이다. 몇몇 구현에서, 벡터는 바이러스 또는 레트로바이러스 중 어느 하나로부터 유래된다. 바이러스 벡터는 예를 들어, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스(Herpes virus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus), 폴리오 바이러스(Polio virus), AIDS 바이러스, 신경영양성 바이러스(neuronal trophic virus), 신드비스 바이러스(sindbis virus) 및 다른 RNA 바이러스이며, HIV 주쇄(backbone)을 가지는 이들 바이러스를 포함한다. 또한, 벡터로서 사용하기 적합하도록 만드는 이들 바이러스의 특성을 공유하는 임의의 바이러스 패밀리들 또한 바람직하다. 레트로바이러스는 마우스 몰로니 백혈병 바이러스(murine moloney leukemia virus, MMLV) 및 벡터로서 MMLV의 바람직한 특성을 발현하는 레트로바이러스를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 벡터들보다 더 큰 유전적 페이로드(genetic payload), 즉 전이유전자(transgene) 또는 마커 유전자(marker gene)를 운반할 수 있으며, 이러한 이유로 상용되는 벡터이다. 그러나, 그것들은 비증식(non-proliferating) 세포에서는 그렇게 유용하지 않다. 아데노바이러스 벡터는 상대적으로 안정하고 작업하기 쉬우며, 높은 역가(titer)를 가지고, 에어로졸 제형으로 운반될 수 있으며, 비분열(non-dividing) 세포를 형질감염시킬 수 있다. 폭스 바이러스 벡터(pox virus vector)는 크고 유전자를 삽입하기 위한 몇 개의 부위를 가지고 있으며; 그것들은 열에 안정하고(thermostable) 상온에서 보관할 수 있다. 바람직한 구현은 바이러스 항원에 의해 유발된 숙주 생물체의 면역 반응을 억제하도록 조작되어진 바이러스 벡터이다. 이러한 형태의 바람직한 벡터는 인터루이킨 8 또는 10을 위한 코딩 영역(coding region)을 운반할 것이다.

바이러스 벡터는 세포 내로 유전자를 도입하기 위한 화학적 또는 물리적 방법보다 높은 트랜잭션 능력(transaction abilities)(유전자를 도입하는 능력)을 가질 수 있다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비구조적 초기 유전자(nonstructural early genes), 구조적 후기 유전자(structural late genes), RNA 폴리머라아제 Ⅲ 전사체(RNA polymerase Ⅲ transcript), 복제(replicaton) 및 캡시드화(encapsidation)에 필요한 역위 말단 반복부위(inverted terminal repeat) 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 조절하는 프로모터를 포함한다. 벡터로서 조작될 경우, 바이러스는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 초기 유전자가 제거되며, 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트(cassette)가 제거된 바이러스 DNA 대신 바이러스 게놈 안으로 삽입된다. 이런 형태의 구조물은 약 8kb의 외래 유전 물질을 운반할 수 있다. 제거된 초기 유전자의 필요한 기능은 전형적으로 인 트랜스(in trans)로 초기 유전자의 유전자 산물을 발현하도록 조작되어진 세포주에 의해 제공된다.

a. 레트로바이러스 벡터( Retroviral Vectors )

레트로바이러스는 임의의 형태, 서브 패밀리, 속 또는 친화성(tropism)을 포함하는 레트로바이러스과(retroviridae)의 바이러스 패밀리에 속하는 동물 바이러스이다. 일반적으로, 레트로바이러스는 버마 등에 기재되어 있다(Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985), 본원에 참고문헌으로서 통합되어 있음). 유전자 치료용 레트로바이러스 벡터를 사용하기 위한 방법의 예는 그 교시가 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 미국 특허출원번호 제4,868,116호 및 제4,980,286호; PCT 출원번호 WO 90/02806 및 WO 89/07136; 및 멀리건(Science 260:926-932 (1993)) 등에 기재되어 있다.

레트로바이러스는 본질적으로 핵산 화물(nucleic acid cargo)이 가득 채워진 패키지(package)이다. 핵산 화물은 복제된 딸 분자(daughter molecules)가 패키지 피막(package coat) 안으로 효과적으로 패키징될 수 있도록 해주는 패키징 시그널(packaging signal)을 지니고 있다. 거기에는 패키지 시그널뿐만 아니라, 복제를 위하여 인 시스(in cis)에 필요하고 복제된 바이러스의 패키징에 필요한 많은 분자들이 있다. 전형적으로, 레트로바이러스 게놈은 단백질 피막(protein coat)의 형성에 관여하는 gag, pol 및 env 유전자를 포함한다. gag, pol 및 env 유전자는 전형적으로 표적 세포로 이동되는 외래 DNA로 치환된다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 패키지 피막 안으로 혼입(incorporation)시키기 위한 패키징 시그널, gag 전사 유닛(gag transcription unit)의 시작 신호를 보내는 서열, 역전사용 tRNA 프라이머에 결합하는 프라이머 결합 부위를 포함하는 역전사(reverse transcription)에 필요한 요소(elements), DNA 합성 동안 RNA 가닥의 전환(switch)을 가이드하는 말단 반복 서열(terminal repeat sequence), DNA 합성용 두 번째 가닥의 합성을 위한 전구체형성 부위(priming site)의 역할을 하는 퓨린이 풍부한 서열 5' 내지 3' LTR, 및 숙주 게놈 안으로 삽입하기 위한 DNA 상태의 레트로바이러스의 삽입을 가능하게 하는 LTR의 말단에 인접한 특정 서열을 포함한다. gag, pol 및 env 유전자의 제거는 약 8kb의 외래 서열이 바이러스 게놈 안으로 삽입되어, 역번역(reverse transcribed)되고, 새로운 바이러스 입자로 패키지되도록 복제될 수 있게 한다. 이와 같은 양의 핵산은 각각의 전사체의 크기에 따라 하나 또는 수많은 유전자를 운반하기에 충분하다. 인서트(insert) 내에 다른 유전자와 함께 양성 또는 음성 선택적 마커 중 하나를 포함하는 것이 바람직하다.

대부분의 레트로바이러스 벡터에서 복제 기구 및 패키징 단백질(gag, pol 및 env)이 제거되기 때문에, 벡터는 전형적으로 패키징 세포주 내에 그것들을 넣어둠으로써 생성된다. 패키징 세포주는 복제 및 패키징 기구를 포함하지만 임의의 패키징 시그널은 결여되어 있는 레트로바이러스로 형질감염 또는 형질전환된 세포주이다. 선택된 DNA를 운반하는 벡터가 이들 세포주로 형질감염된 경우, 관심 유전자를 포함하는 벡터는 보조 세포(helper cell)에 의해 인 시스(in cis)로 제공된 기구에 의해 새로운 바이러스 입자 내로 복제되고 패키징된다. 상기 기구를 위한 게놈은 필요한 시그널이 결여되어 있기 때문에 패키징되지 않는다.

b. 아데노바이러스 벡터( Adenoviral Vectors )

복제 결합(replication-defective) 아데노바이러스 구조물들이 기재되어 있다(Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993)). 벡터로서 이들 바이러스의 사용의 이점은 그것들이 초기 감염된 세포 내에서 복제될 수 있지만 새로운 감염성 바이러스 입자를 만들 수는 없기 때문에, 그것들이 다른 세포 형태로 전파될 수 있다는 정도로 한정된다. 재조합 아데노바이러스는 기도 상피세포(airway epithelium), 간세포(hepatocyte), 혈관 내피세포(vascular endothelium), CNS 유조직(CNS parenchyma) 및 다수의 다른 조직 부위로의 직접적인 생체 내(in vivo) 운반 후 고효율의 유전자 전이를 달성하는 것으로 나타났다(Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); and Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). 재조합 아데노바이러스는 바이러스가 야생형 또는 복제결함 아데노바이러스와 동일한 방식으로 수용체 매개성 엔도시토시스(receptor-mediated endocytosis)에 의해 내재화된 후, 특정 세포 표면 수용체에 결합되는 것에 의해 유전자 형질도입(gene transduction)을 달성한다(Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).

바이러스 벡터는 E1 유전자가 제거된 아데노바이러스에 기초한 것일 수 있고, 이들 바이러스는 인간 293 세포주(human 293 cell line)와 같은 세포주에서 생성된다. 다른 바람직한 구현에서, E1 및 E3 유전자 모두 아데노바이러스 게놈으로부터 제거된다.

c. 아데노 -관련 바이러스 벡터( Adeno - Associated Viral Vectors )

다른 형태의 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV)에 기초한다. 이 결손 파보바이러스(defective parvovirus)는 많은 세포 형태를 감염시킬 수 있으며 인간에게 병을 유발시킬 수 없기 때문에 바람직한 벡터이다. AAV 형태 벡터는 약 4 내지 5kb를 운반할 수 있고, 야생형 AAV는 19번 염색체(chromosome 19) 내로 안정하게 삽입하기 위한 것으로 알려져 있다. 이 부위 특이적 삽입 특성(site specific integration property)을 포함하는 벡터가 바람직하다. 이러한 형태의 벡터의 특히 바람직한 구현은 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 유전자(herpes simplex virus thymidine kinase gene), HSV-tk, 및/또는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)을 암호화하는 유전자와 같은 마커 유전자를 포함할 수 있는, 에비젠(Avigen, San Francisco, CA)에 의해 생산되는 P4.1 C 벡터이다.

다른 형태의 AVV 바이러스에서, AAV는 이종 유전자(heterologous gene)에 작동가능하게 연결되어 세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터를 포함하는 적어도 하나의 카세트에 인접한 한 쌍의 역위 말단 반복부위(inverted terminal repeates, ITRs)를 포함한다. 이 문맥에서 이종(heterologous)은 AAV 또는 B19 파보바이러스로부터 유래되지 않은 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 말한다.

전형적으로, AAV 및 B19 코딩 영역은 제거되어, 안전하고 세포독성이 없는 벡터가 된다. AAV ITRs 또는 그것의 변형은 감염성(infectivity)과 부위 특이적 삽입(site-specific integraion)을 부여하지만, 세포독성을 나타내지 않으며, 프로모터는 세포 특이적 발현을 유도한다. 미국특허 제6,261,834는 본원에 AAV 벡터에 관련된 물질에 대한 참조로서 본원에 통합되어 있다.

따라서, 개시된 벡터들은 실질적으로 독성이 없는 포유동물 염색체 내로의 삽입이 가능한 DNA 분자를 제공한다.

바이러스 및 레트로바이러스에 삽입된 유전자는 주로 프로모터(promoter) 및/또는 원하는 유전자 산물의 발현을 조절하도록 돕기 위한 인핸서(enhancers)를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 전사 시작 부위와 관련하여 비교적 고정된 위치에서 작용하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 폴리머라아제 및 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 중요한 요소를 포함하며, 상부 요소(upstream elements) 및 반응 요소(response elements)를 포함할 수 있다.

d. 큰 페이로드 바이러스 벡터( Large Payload Viral Vectors )

큰 인간 헤르페스바이러스를 이용한 분자 유전학 실험은 큰 이종 DNA 단편이 헤르페스바이러스를 이용한 감염이 가능한 세포에서 클로닝되고, 전파되고 확립되는 수단을 제공하였다(Sun et al., Nature genetics 8: 33-41, 1994; Cotter and Robertson, Curr Opin Mol Ther 5: 633-644, 1999). 이들 큰 DNA 바이러스(단순 헤르페스 바이러스(HSV) 및 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV))는 150kb를 초과하는 인간 이종 DNA의 단편을 특정 세포로 운반할 수 있는 가능성을 가지고 있다. EBV 재조합체는 에피솜 DNA(episomal DNA)로서 감염된 B-세포에서 DNA의 큰 조각을 유지할 수 있다. 각각의 클론들은 유전적으로 안정한 것으로 보이는 330kb 까지의 인간 게놈의 인서트(insert)를 운반한다. 이들 에피솜의 유지는 EBV로 감염된 동안 본질적으로 발현되는 특정 EBV 핵 단백질(nuclear protein), EBNA1을 필요로 한다. 게다가, 이들 벡터는 형질감염을 위해 사용될 수 있으며, 여기에서 많은 양의 단백질이 시험관 내(in vitro)에서 일시적으로 생성될 수 있다. 헤르페스 바이러스 앰플리콘 시스템(amplicon system) 또한 220kb를 초과하는 DNA의 패키지 조각에 에피솜으로서 DNA를 안정하게 유지할 수 있는 세포를 감염시키는데 사용되어진다.

다른 유용한 시스템은 예를 들어, 복제(replicating) 및 숙주-제한 비복제(host-restricted non-replicating) 백시니아 바이러스 벡터를 포함한다.

숙주 세포 게놈으로 통합되어 질 세포로 운반된 핵산은 전형적으로 통합 서열(integration sequence)을 포함한다. 이들 서열은 종종 특히 바이러스-기반 시스템이 사용될 경우, 바이러스 관련 서열이다. 이들 바이러스 통합 시스템은 또한 운반 시스템에 포함된 핵산이 숙주 게놈 안으로 통합될 수 있도록 리포솜(liposome)과 같은 운반용 비핵산-기반 시스템을 사용하여 운반될 핵산 내로 통합될 수 있다.

숙주 게놈 내로의 통합을 위한 다른 일반적인 기술은 예를 들어, 숙주 게놈과의 상동 재조합(homologous recombination)을 촉진하도록 설계된 시스템을 포함한다. 이들 시스템은 전형적으로 벡터 핵산과 표적 핵산 사이에서 재조합이 일어나 운반된 핵산이 숙주 게놈 내로 통합되는 숙주 세포 게놈 내에서 표적 서열과 충분한 상동성을 가지는, 발현될 핵산을 플랭킹(flanking)하는 서열에 의존한다. 상동 재조합을 촉진하는데 필요한 이들 시스템 및 방법은 당업자들에게 공지되어 있다.

ii . 비핵산 -기반 시스템( Non - Nucleic Acid Based Systems )

개시된 조성물은 다양한 방식으로 표적 세포에 운반될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 전기천공법을 통하거나, 리포펙션을 통하거나, 칼슘인산침전법을 통하여 운반될 수 있다. 선택된 운반 메커니즘은 부분적으로 표적화된 세포의 형태 및 운반이 예를 들어, 생체 내(in vivo)에서 일어나는지 또는 시험관 내에(in vitro)서 일어나는지에 달려 있다.

따라서, 상기 조성물은 개시된 핵산, 펩티드 또는 벡터 외에, 예를 들어 양이온성 리포솜(예를 들어, DOTMA, DOPE, DC-콜레스테롤) 또는 음이온성 리포솜과 같은 리포솜과 같은 지질을 포함할 수 있다. 리포솜은 만일 원한다면, 특정 세포를 표적화하는 것을 용이하게 하기 위한 단백질을 더 포함할 수 있다. 화합물 및 양이온성 리포솜을 포함하는 조성물의 투여는 표적 기관으로 향하거나 기도(respiratory tract)에서 기도의 표적 세포로 들어가는 혈액으로 투여될 수 있다. 리포솜에 대해서는 예를 들어, Brigham 및 Felgner 등을 참조하라(Brigham et al. Am . J. Resp . Cell . Mol . Biol . 1:95-100 (1989); Felgner et al. Proc . Natl . Acad. Sci USA 84:7413-7417 (1987); U.S. Pat. No.4,897,355). 게다가, 상기 화합물은 대식세포(macrophage)와 같은 특정 세포 형태를 표적화할 수 있거나, 마이크로캡슐로부터의 화합물의 확산 또는 화합물의 운반이 특정 속도 또는 투여량을 위해 설계된 마이크로캡슐 성분으로 투여될 수 있다.

피험자의 세포 내로의 외부 DNA의 투여 및 흡수(즉, 유전자 형질도입 또는 형질감염)를 포함하는 상기 기재된 방법에서, 세포로의 조성물의 운반은 다양한 메커니즘을 통할 수 있다. 하나의 예로서, 운반은 LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany) 및 TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI)과 같은 상업적으로 이용가능한 리포솜 제조물을 사용하는 리포솜뿐만 아니라, 당업계의 표준 절차에 따라 개발된 다른 리포솜을 통할 수 있다. 게다가, 개시된 핵산 또는 벡터는 전기천공법, 제네트로직스사(Genetronics, Inc., San Diego, CA)로부터 이용가능한 기술에 의해서뿐만 아니라 SONOPORATION 기계(ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)를 사용함으로써 생체 내로 운반될 수 있다.

물질은 (예를 들어, 물질이 마이크로입자, 리포솜 또는 세포 내로 혼입된) 용액, 현탁액일 수 있다. 이것들은 항체, 수용체 또는 수용체 리간드를 통하여 특정 세포 형태를 표적으로 할 수 있다. 종양 조직의 특정 단백질을 표적으로 하기 위한 이러한 기술의 사용의 예, 다른 세포의 표적화에 사용될 수 있는 원리에 관한 참고문헌들이 있다(Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); 및 Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). 이 기술들은 다양한 다른 특정 세포 형태에 대해서도 사용될 수 있다. "스텔스(stealth)"와 같은 비히클 및 (결장 악성종양(colonic carcinoma)을 표적으로 하는 리피드 매개성 약물(lipid mediated durg)을 포함하는) 다른 항체가 접합된 리포솜, 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개성 표적화, 대식세포 유도성 조양 표적화 및 세포 내 마우스 신경교종 세포(glioma cells)의 고특이적 치료학적 레트로바이러스성 표적화가 있다. 종양 조직에 대한 특정 단백질을 표적으로 하기 위한 이러한 기술의 사용의 예에 관한 참고문헌들이 있다(Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); and Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). 일반적으로, 수용체는 구성성(constitutive) 또는 리간드 유도성(ligand induced) 엔도사이토시스(endocytosis) 경로에 관여한다. 클라트린피복 소공(clathrin-coated pits)에 있는 이들 수용체 클러스터(cluster)는 클라트린 피복 소포(clathrin-coated vesicles)를 통해 세포로 들어가고, 수용체가 분리되는 산성화된 엔도좀(acidified endosome)을 통과한 후 세포 표면으로 되돌아가거나, 세포 내에 저장되거나, 리소좀에서 분해된다. 내재화 경로(internalization pathway)는 영양 섭취, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 제거, 바이러스 및 독소의 기회적 유입(opportunistic entry), 리간드의 해리 및 분해, 및 수용체-레벨 조절과 같은 다양한 기능을 제공한다. 많은 수용체들이 세포 형태, 수용체 농도, 리간드의 형태, 리간드 이온가(valency) 및 리간드 농도에 따라 많은 세포 내 경로를 따른다. 수용체 매개성 엔도시토시스의 분자적 및 세포적 메커니즘은 검토되어있다(Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).

숙주 세포 게놈으로 통합되어 질 세포로 운반된 핵산은 전형적으로 통합 서열(integration sequence)을 포함한다. 이들 서열은 종종 특히 바이러스-기반 시스템이 사용될 경우, 바이러스 관련 서열이다. 이들 바이러스 통합 시스템은 또한 운반 시스템에 포함된 핵산이 숙주 게놈 안으로 통합될 수 있도록 리포솜(liposome)과 같은 운반용 비핵산-기반 시스템을 사용하여 운반될 핵산 내로 통합될 수 있다.

숙주 게놈 내로의 통합을 위한 다른 일반적인 기술은 예를 들어, 숙주 게놈과의 상동 재조합(homologous recombination)을 촉진하도록 설계된 시스템을 포함한다. 이들 시스템은 전형적으로 벡터 핵산과 표적 핵산 사이에서 재조합이 일어나 운반된 핵산이 숙주 게놈 내로 통합되는 숙주 세포 게놈 내에서 표적 서열과 충분한 상동성을 가지는, 발현될 핵산을 플랭킹(flanking)하는 서열에 의존한다. 상동 재조합을 촉진하는데 필요한 이들 시스템 및 방법은 당업자들에게 공지되어 있다.

7. 발현 시스템( Expression Systems )

세포로 운반된 핵산은 전형적으로 발현 조절 시스템(expression controlling system)을 포함한다. 예를 들면, 바이러스 및 레트로바이러스 시스템에 삽입된 유전자는 주로 원하는 유전자 산물의 발현 조절을 돕는 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 전사 시작 부위에 대하여 비교적 고정된 위치에서 작용하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 폴리머라아제 및 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 중요한 요소를 포함하며, 상부 요소(upstream elements) 및 반응 요소(response elements)를 포함할 수 있다.

i. 바이러스 프로모터 및 인핸서( Viral Promoters and Enhancers )

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 전사를 조절하는 바람직한 프로모터는 다양한 공급원, 예를 들어 폴리오마(polyoma), 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40, SV40), 아데노바이러스(adenoviruses), 레트로바이러스(retroviruses), B형 간염 바이러스(hepatitis-B virus) 및 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)와 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻어질 수 있거나, 이종의 포유동물 프로모터, 예를 들어 베타 액틴 프로모터(beta actin promoter)로부터 얻어질 수 있다. SV40 바이러스의 초기(early) 및 후기(late) 프로모터는 편리하게 SV40 바이러스 복제 원점(origin of replication)을 또한 포함하는 SV40 제한 단편(restriction fragment)으로 얻어진다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 유전자(immediate early promoter)는 편리하게 HindⅢ E 제한 단편으로 얻어진다(Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)). 물론, 숙주 세포 또는 관련 종으로부터의 프로모터 또한 본원에 유용하다.

인핸서는 일반적으로 전사 시작 부위로부터 일정하지 않은 거리에서 작용하며, 전사 유닛에 대하여 5'(Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)) 및 3'(Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)) 중 어느 하나일 수 있는 DNA의 서열을 말한다. 게다가, 인핸서는 인트론 내(Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)) 뿐만 아니라 코딩 서열 그 자체 내(Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984))에 있을 수도 있다. 그것들은 주로 10 및 300 bp 길이 사이이며, 그것들은 인 시스(in cis)로 작용한다. 인핸서는 인근 프로모터로부터의 전사를 증가시키는 작용을 한다. 인핸서는 또한 종종 전사 조절을 매개하는 반응 요소(response elements)를 포함한다. 프로모터 또한 전사 조절을 매개하는 반응 요소를 포함할 수 있다. 인핸서는 종종 유전자 발현의 조절을 결정한다. 현재 많은 인핸서 서열들이 포유동물의 유전자들(글로빈(globin), 엘라스타아제(elastase), 알부민(albumin), 알파-페토프로테인(α-fetoprotein) 및 인슐린(insulin)으로부터 알려져 있고, 전형적으로 어떤 것은 일반적인 발현을 위해 진행 세포 바이러스로부터 유래된 인핸서를 사용할 것이다. 바람직한 예는 복제 원점의 후기 쪽(late side)(bp 100-270)에 있는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후기 쪽에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서이다.

프로모터 및/또는 인핸서는 그것들의 기능을 유발시키는 빛(light) 또는 특정 화학적 사건(chemical events) 중 어느 하나에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린(tetracycline) 및 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다. 감마선 조사(gamma irradiation)와 같은 방사선 또는 알킬 화학요법 약물(alkylating chemotherapy agent)에의 노출에 의해 바이러스 벡터 유전자 발현을 증가시키기 위한 방법들도 있다.

어떤 구현에서, 프로모터 및/또는 인핸서 부위는 번역될 전사 유닛의 부위의 발현을 최대화하기 위하여 구성적 프로모터 및/또는 인핸서로서 작용할 수 있다. 어떤 구조물에서, 프로모터 및/또는 인핸서 부위는 특정 시점에서 특정 형태의 세포에서만 발현됨에도 불구하고 모든 진핵 세포 형태에서 활성화된다. 이런 형태의 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터(650 염기)이다. 다른 바람직한 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(전장 프로모터) 및 레트로바이러스 벡터 LTR이다.

모든 특정 조절 요소(regulatory elements)가 흑색종 세포(melanoma cell)와 같은 특정 세포 형태에서 선택적으로 발현되는 발현 벡터를 구성하기 위해 클로닝되고 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 신경교 섬유성 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP) 프로모터는 신경교 기원(glial origin)의 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키는데 사용되어왔다.

진핵 숙주 세포(효모, 곰팡이, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 유핵세포(nucleated cell))에 사용되는 발현 벡터는 또한 mRNA 발현에 영향을 줄 수 있는 전사의 종결에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 이들 부위는 조직 인자 단백질(tissue factor protein)을 암호화하는 mRNA의 비번역된 부위에서 폴리아데닐화된 분절(polyadenylated segment)로 번역된다. 3' 비번역 부위 또한 전사 종결 부위(transcription termination sites)를 포함한다. 전사 유닛 또한 폴리아데닐화된 부위를 mvh함하는 것이 바람직하다. 이 부위의 하나의 이점은 번역된 유닛이 처리되고, mRNA처럼 이송될 가능성을 증가시킨다는 것이다. 발현 구조물에서의 폴리아데닐화 시그널(polyadenylation signals)의 확인 및 사용은 잘 구축되어 있다. 동종의 폴리아데닐화 시그널은 전이유전자 구조물(transgene constructs)에 사용되는 것이 바람직하다. 어떤 전사 유닛에서, 폴리아데닐화 부위는 SV40 초기 폴리아데닐화 시그널로부터 유래되며, 약 400 염기로 이루어진다. 번역된 유닛은 다른 표준 서열 단독 또는 구조물로부터의 발현 또는 구조물의 안정성을 향상시키는 상기 서열과 결합된 다른 표준 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

ii . 마커( Markers )

바이러스 벡터는 마커 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 생성물은 유전자가 세포로 운반되었는지와 일단 운반되면 발현하는지를 측정하기 위해 사용된다. 바람직한 마커 유전자는 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 암호화하는 E. coli lacZ 유전자 및 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)이다.

몇몇 구현에서, 마커는 선택적 마커(selectable marker)이다. 포유동물 세포에 대한 적절한 선택적 마커의 예는 디하이드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase, DHFR), 티미딘 키나아제(thymidine kinase), 네오마이신(neomycin), 네오바이신 유사체 G418, 하이드로마이신(hydromycin) 및 퓨로마이신(puromycin)이다. 이와 같은 선택적 마커가 포유동물 숙주 세포 안으로 성공적으로 전이된 경우, 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선택압(selective pressure) 하에 놓인다 할지라도 살아남을 수 있다. 여기에는 두 개의 널리 사용되는 서로 구분되는 카테고리의 선택적 상황이 있다. 첫 번째 카테고리는 세포의 대사(metabolism) 및 보강 배지(supplemented media)와는 관계없이 자랄 수 있는 능력이 결여된 돌연변이 세포주의 사용에 기초한다. 두 개의 예로 GHO DHFR-세포 및 마우스 LTK-세포가 있다. 이들 세포는 티미딘 또는 하이포크산틴과 같은 이러한 영양분의 첨가 없이 자랄 수 있는 능력이 결여되어 있다. 이들 세포는 완전한 뉴클레오티드 합성 경로에 필요한 어떤 유전자가 결여되어 있기 때문에, 그것들은 결여된 뉴클레오티드가 보강 배지에 제공되지 않는 한 살아남을 수 없다. 배지에의 보강에 대한 대안은 각 유전자가 결여된 세포 내로 온전한(intact) DHFR 또는 TK 유전자를 도입하여 그것들의 성장 요구성을 변경하는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 각각의 세포들은 비보강 배지에서 살아남을 수 없을 것이다.

두 번째 카테고리는 임의의 세포 형태에 사용되며, 돌연변이 세포주의 사용을 필요로 하지 않는 선택 기법을 칭하는 우성 선별(dominant selection)이다. 이들 기법은 전형적으로 숙주 세포의 성장을 억제하기 위한 약물을 사용한다. 신규한 유전자를 가지는 세포들은 약물 저항성을 전달하는 단백질을 발현하고, 선별에서 살아남을 것이다. 이와 같은 우성 선별의 예는 약물 네오마이신(neomycin)(Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), 마이코페놀산(mycophenolic acid)(Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) 또는 하이그로마이신(hygromycin)(Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985))을 사용한다. 상기 세 가지 예는 각각 적절한 약물 G418 또는 네오마이신(게네티신(geneticin)), xgpt(마이코페놀산) 또는 하이그로마이신에 대한 저항성을 전달하기 위하여 진핵생물 조절 하에 세균 유전자를 이용한다. 다른 것들은 네오마이신 유사체 G418 및 퓨라마이신(puramycin)을 포함한다.

8. 내재화 서열( Internalization Sequences )

제공되는 폴리펩티드는 융합 단백질을 더 구성하거나, 그렇지 않으면 추가적인 N-말단, C-말단 또는 매개성 아미노산 서열(intermediate amino acid sequence), 예를 들어 링커(linker) 또는 태그(tags)를 가질 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "링커(linker)"는 두 개의 서로 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 연결 또는 분리하는데 사용될 수 있는 아미노산 서열 또는 삽입물(insertion)이며, 여기에서 링커는 그 외에 조성물의 필수 기능에는 기여하지 않는다. 본원에 제공되는 폴리펩티드는 예를 들어, 아미노산 GLS, ALS 또는 LLA를 포함하는 아미노산 링커를 가질 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "태그(tag)"는 제공된 폴리펩티드를 검출 또는 정제하는데 사용될 수 있는 별개의 아미노산 서열을 말하며, 여기에서 태그는 그 외에 조성물의 필수 기능에는 기여하지 않는다. 제공되는 폴리펩티드는 폴리펩티드의 본질적인 활성에 기여하지 않는 N-말단, C-말단 또는 매개성 아미노산이 더 결실될 수 있다.

개시된 조성물은 세포에 효과적으로 들어가기 위하여 내재화 서열(internalization sequences) 또는 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain)에 연결될 수 있다. 최근의 연구들은 HIV 바이러스의 TAT 전사촉진 도메인(transactivation domain), 안테나페디아(antennapedia) 및 분자 및 작은 펩티드들을 원형질막(plasma membrane)을 가로질러 쉽게 수송시킬 수 있는 트랜스포탄(transportan)을 포함하는, 여러 개의 세포 투과성 펩티드(cell penetrating peptides)를 확인하였다(Schwarze et al., 1999; Derossi et al., 1996; Yuan et al., 2002). 가장 최근, 폴리아르기닌(polyarginine)은 펩티드 매개성 수송(peptide mediated transport)을 위한 매력적인 도구가 되도록 하는, 원형질막을 가로질러 펩티드 및 단백질을 수송하는 더 큰 효능을 나타내었다(Fuchs and Raines, 2004). 논아르기닌(nonarginine)(R₉, SEQ ID NO:18)은 TAT 또는 안테나페디아보다 더욱 현저하게 큰 최대 섭취량(maximal uptake)을 가지는, 단백질 형질도입 도메인에 기초한 가장 효과적인 폴리아르기닌 중 하나로서 기재되어 있다. 펩티드 매개성 세포독성(peptide mediated cytotoxicity) 또한 폴리아르기닌-기반 내재화 서열에서 더 적은 것으로 나타났다. R₉ 매개성 막 수송(R₉ mediated membrane transport)은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 결합(heparan sulfate proteoglycan binding) 및 식균성 패키징(endocytic packaging)을 통하여 촉진된다. 일단 내재화되면, 헤파란은 헤파라나아제(heparanases)에 의해 분해되고, 세포질(cytoplasm) 내로 새어들어 가는 R₉를 방출한다(Deshayes et al., 2005). 연구는 최근 폴리아르기닌의 유도체가 구강암 세포로 전장 p53 단백질을 운반하고, 그것들의 성장과 전이를 억제하여, 단백질 세포 투과성 펩티드로서 폴리아르기닌을 정의하였음을 보여준다(Takenobu et al., 2002).

따라서, 제공되는 폴리펩티드는 세포 내재화(cellular internalization) 수송물질(transporter) 또는 서열을 포함할 수 있다. 세포 내재화 서열은 당업계에 공지되어 있거나 새로이 발견된 임의의 내재화 서열 또는 그것들의 보존적 변이체(conservative variants)일 수 있다. 세포 내재화 수송물질 및 서열의 비제한적 예는 폴리아르기닌(예를 들어, R₉), 안테나페디아 서열, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴(Penetratin), Antp-3A(Antp 돌연변이), 부포린 Ⅱ(Buforin Ⅱ), 트랜스포탄, MAP(모델 양친매성 펩티드(model amphipathic peptide)), K-FGF, Ku70, 프리온(Prion), pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC(비스-구아니디늄-스페르미딘-콜레스테롤(Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol)) 및 BGTC(비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤(Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol)을 포함한다(표 4를 참조).

세포 내재화 수송물질

명칭	서열	SEQ ID NO
Polyarginine	RRRRRRRRR	SEQ ID NO:16
Antp	RQPKIWFPNRRKPWKK	SEQ ID NO:17
HIV-Tat	GRKKRRQRPPQ	SEQ ID NO:18
Penetratin	RQIKIWFQNRRMKWKK	SEQ ID NO:19
Antp-3A	RQIAIWFQNRRMKWAA	SEQ ID NO:20
Tat	RKKRRQRRR	SEQ ID NO:21
Buforin II	TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK	SEQ ID NO:22
Transportan	GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL	SEQ ID NO:23
model amphipathic peptide (MAP)	KLALKLALKALKAALKLA	SEQ ID NO:24
K-FGF	AAVALLPAVLLALLAP	SEQ ID NO:25
Ku70	VPMLK- PMLKE	SEQ ID NO:26
Prion	MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP	SEQ ID NO:27
pVEC	LLIILRRRIRKQAHAHSK	SEQ ID NO:28
Pep-1	KETWWETWWTEWSQPKKKRKV	SEQ ID NO:29
SynB1	RGGRLSYSRRRFSTSTGR	SEQ ID NO:30
Pep-7	SDLWEMMMVSLACQY	SEQ ID NO:31
HN-1	TSPLNIHNGQKL	SEQ ID NO:32
BGSC (Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol)
BGTC (Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol)

현재 공지되어 있거나 후에 확인된 임의의 다른 내자화 서열들도 본 발명의 펩티드와 결합될 수 있다.

9. 작용인자( Effectors )

본원에서 제공된 조성물은 작용 분자(Effector molecule)를 더 포함할 수 있다. "작용 분자(effector molecule)"는 원하는 효과가 일어나도록 표적 세포 또는 조직상에서 작용하는 물질을 의미한다. 그 효과는 예를 들어, 표적 세포 또는 조직의 표지(labeling), 활성화(activating), 억제(repressing) 또는 사멸(killing)일 수 있다. 따라서, 작용 분자는 예를 들어, 소분자(small molecule), 약제학적 약물(pharmaceutical drug), 독소(toxin), 지방산(fatty acid), 검출가능한 마커(detectable marker), 접합 태그(conjugating tag), 나노입자(nanoparticle) 또는 효소(enzyme)일 수 있다.

표적으로 하는 펩티드에 접합될 수 있는 소분자 및 약제학적 약물의 예는 당업계에 공지되어 있다. 작용인자는 표적 세포를 죽이는 세포독성 소분자 또는 약물일 수 있다. 상기 소분자 또는 약물은 임의의 중요한 세포 작용 또는 경로에 작용하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 소분자 또는 약물은 세포 주기(cell cycle)를 억제하고, 단백질 분해를 활성화하고, 아폽토시스를 유도하고, 키나아제 활성을 조절하거나 세포골격성 단백질(cytoskeletal protein)을 변경할 수 있다. 임의의 공지되거나 새로이 발견된 세포독성 소분자 또는 약물은 표적화 펩티드와의 사용이 고려된다.

작용인자는 표적화된 세포를 죽이는 독소일 수 있다. 독소의 비제한적 예는 아브린(abrin), 모데신(modeccin), 리신(ricin) 및 디프테리아 독소(diphtheria toxin)를 포함한다. 다른 공지되거나 새로이 발견된 독소들도 제공된 조성물과의 사용이 고려된다.

제공된 조성물에 접합될 수 있는 지방산(즉, 지질)은 리포솜 내로 펩티드를 효과적으로 통합시킬 수 있는 것들을 포함한다. 일반적으로, 지방산은 극성 지질(polar lipid)이다. 따라서, 지방산은 인지질(phospholipid)일 수 있다. 제공되는 조성물은 천연 또는 합성 인지질 중 하나를 포함할 수 있다. 인지질은 포화(saturated) 또는 비포화(unsaturated) 단일치환(monosubstituted) 또는 이치환(disubstituted)된 지방산을 함유하는 인지질 또는 그것들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 이들 인지질은 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine), 디올레오일포스파티딜세린(dioleoylphosphatidylserine), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol), 디올레오일포스파티딘산(dioleoylphosphatidic acid), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine), 팔미토일올레오일포스파티딜세린(palmitoyloleoylphosphatidylserine), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(palmitoyloleoylphophatidylglycerol), 팔미토일올레오일포스파티딘산(palmitoyloleoylphosphatidic acid), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜콜린(palmitelaidoyloleoylphosphatidylcholine), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜세린(palmitelaidoyloleoylphosphatidylserine), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜에탄올아민(palmitelaidoyloleoylphosphatidylethanolamine), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜글리세롤(palmitelaidoyloleoylphosphatidylglycerol), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딘산(palmitelaidoyloleoylphosphatidic acid), 미리스톨레오일올레오일포스파티딜콜린(myristoleoyloleoylphosphatidylcholine), 미리스톨레오일올레오일포스파티딜세린(myristoleoyloleoylphosphatidylserine), 미리스톨레오일올레오일포스파티딜에탄올아민(myristoleoyloleoylphosphatidylethanolamine), 미리스톨레오일올레오일포스파티딜글리세롤(myristoleoyloleoylphosphatidylglycerol), 미리스톨레오일올레오일포스파티딘산(myristoleoyloleoylphosphatidic acid), 디리놀레오일포스파티딜콜린(dilinoleoylphosphatidylcholine), 디리놀레오일포스파티딜세린(dilinoleoylphosphatidylserine), 디리놀레오일포스파티딜에탄올아민(dilinoleoylphosphatidylethanolamine), 디리놀레오일포스파티딜글리세롤(dilinoleoylphosphatidylglycerol), 디리놀레오일포스파티딘산(dilinoleoylphosphatidic acid), 팔미틱리놀레오일포스파티딜콜린(palmiticlinoleoylphosphatidylcholine), 팔미틱리놀레오일포스파티딜세린 palmiticlinoleoylphosphatidylserine), 팔미틱리놀레오일포스파티딜에탄올아민(palmiticlinoleoylphosphatidylethanolamine), 팔미틱리놀레오일포스파티딜글리세롤(palmiticlinoleoylphosphatidylglycerol), 팔미틱리놀레오일포스파티딘산(palmiticlinoleoylphosphatidic acid)일 수 있다. 이들 인지질은 또한 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)(리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine)), 포스파티딜세린(phosphatidylserine)(리소포스파티딜세린(lysophosphatidylserine)), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)(리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine)), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol)(리소포스파티딜글리세롤(lysophosphatidylglycerol)) 및 포스파티딘산(phosphatidic acid)(리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid))의 모노아실화된(monoacylated) 유도체일 수 있다. 이들 리소포스파티딜 유도체에서 모노아실 사슬은 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 팔미톨레오일(palmitoleoyl), 리놀레오일 미리스토일(linoleoyl myristoyl) 또는 미리스톨레오일(myristoleoyl)일 수 있다. 인지질은 또한 합성된 것일 수 있다. 합성 인지질은 아반티 폴라 리피드(AVANTI Polar Lipids, Albaster, Ala); 시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.)와 같은 다양한 공급원으로부터 상업적으로 쉽게 입수가능하다. 이들 합성 화합물은 다양할 수 있으며, 그것들의 지방산 측쇄에 자연적으로 생성된 인지질에서 발견되지 않는 변형(variation)을 가질 수 있다. 지방산은 PS 또는 PC 중 어느 하나 또는 그것들 모두에서 C14, C16, C18 또는 C20 사슬 길이를 가지는 비포화된 지방산 측쇄를 가질 수 있다. 합성 인지질은 구성성분으로서 디올레오일(18:1)-PS, 팔미토일(16:0)-올레오일(18:1)-PS, 디미리스토일(14:0)-PS, 디팔미톨레오일(16:1)-PC, 디팔미토일(16:0)-PC, 디올레오일(18:1)-PC, 팔미토일(16:0)-올레오일(18:1)-PC 및 미리스토일(14:0)-올레오일(18:1)-PC를 가질 수 있다. 따라서, 예로서, 제공되는 조성물은 팔미토일 16:0을 포함할 수 있다.

검출가능한 마커는 표적 조직 또는 세포를 표지하거나 염색하는데 사용될 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 검출가능한 마커의 비제한적 예는 방사성 동위원소(radioactive isotope), 효소(enzymes), 형광색소(fluorochromes) 및 양자점(quantum dot)(Qdot®)을 포함한다. 다른 공지되거나 새로이 발견된 검출가능한 마커도 제공되는 조성물과의 사용이 고려된다.

작용분자는 열 발생 나노쉘(heat generating nanoshell)과 같은 나노입자일 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "나노쉘(nanoshell)"은 하나 또는 그 이상의 전도성 외피층(conducting shell layers)으로 둘러싸인 별개의 유전체(dielectric) 또는 반도체(semi conducting) 코어 부위(core sectoin)를 가지는 나노입자이다. 본원에 그 전체가 참고문헌으로서 통합되어 있는 U.S. Patent No. 6,530,944는 금속 나노쉘을 만들고 사용하는 방법을 교시하고 있다. 나노쉘은 근적외선(near infrared light)(대략 800 내지 1300nm)과 같은 방사선을 사용하여 여기될 수 있는 고전도성 금속과 같은 물질로 코팅된, 실리콘과 같은 유전체 또는 비활성 물질의 코어로 이루어질 수 있다. 여기 상태에서, 나노쉘은 열을 방출한다. 그 결과로 일어난 이상 고열(hyperthermia)은 주변 세포 또는 조직을 죽일 수 있다. 나노쉘의 외피와 코어의 합쳐진 지름은 수십에서 수백만 나노미터에 이른다. 근적외선은 조직을 침투하는 그것의 능력에 이점이 있다. 나노입자 코팅 및 표적 세포의 선별에 따라, 다른 형태의 방사선 또한 사용될 수 있다. 예는 x-레이, 자기장(magnetic field), 전기장(electric field) 및 초음파(ultrasound)를 포함한다. 본원에 기재된 것과 같이 사용된 방사선의 레벨은 에너지가 유전체 상의 금속 표면에 의해 더욱 효과적으로 집중되는 나노입자의 표면을 제외하고는 이상 고열을 유도할 만큼 충분하지 않기 때문에, 특히 암 치료에 사용하기 위한 가열된 프로브(heated probe), 전자레인지(microwave), 초음파(ultrasound), 레이저(lasers), 관류(perfusion), 고주파 에너지(radiofrequency energy) 및 복사 가열(radiant heating)의 사용과 같은 이상고열에 대한 기존의 방법이 가지는 문제점은 방지된다. 상기 입자는 또한 특히 적외선 확산 광자 영상 방법(infrared diffuse photon imaging method)을 사용하여 영상을 강화시키는데 사용될 수 있다. 표적 분자는 항체 또는 그것들의 단편, 특정 수용체에 대한 리간드, 또는 표적이 되는 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 다른 단백질일 수 있다.

작용분자는 개시된 펩티드에 공유결합적으로 결합될 수 있다. 작용 분자는 개시된 펩티드의 아미노 말단에 결합될 수 있다. 작용 분자는 개시된 펩티드의 카르복시 말단에 결합될 수 있다. 작용 분자는 개시된 펩티드 내의 아미노산에 결합될 수 있다. 본원에서 제공되는 조성물은 작용 분자와 개시된 펩티드를 연결하는 링커(linker)를 더 포함할 수 있다. 개시된 펩티드는 또한 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)(Tkachenko et al., (2003) J Am Chem Soc, 125, 4700-4701)과 같은, 펩티드와 함께 나노쉘을 코팅하는데 사용될 수 있는 코팅 분자에 접합될 수 있다.

개시된 펩티드에 작용 분자를 가교(crosslink)시키는데 사용될 수 있는 단백질 가교제(crosslinker)는 당업계에 공지되어 있고, 그것의 유용성과 구조에 기초하여 정의되어 있으며, DSS (디숙신이미딜 수베레이트(Disuccinimidylsuberate)), DSP (디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(Dithiobis(succinimidylpropionate))), DTSSP (3,3'-디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트)(3,3'-Dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate))), SULFO BSOCOES (비스[2-(술포숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸]술폰)(Bis[2-(sulfosuccinimidooxycarbonyloxy) ethyl]sulfone)), BSOCOES (비스-[2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸]술폰)(Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone)), SULFO DST (디술포숙신이미딜타트레이트(Disulfosuccinimidyltartrate)), DST (디숙신이미딜타트레이트(Disuccinimidyltartrate)), SULFO EGS (에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate))), EGS (에틸렌 글리콜비스(술포숙신이미딜숙시네이트)(Ethylene glycolbis(sulfosuccinimidylsuccinate))), DPDPB (1,2-디[3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도]부탄)(1,2-Di[3'-(2'-pyridyldithio) propionamido]butane)), BSSS (비스(술포숙신이미딜)수베레이트(Bis(sulfosuccinimdyl) suberate)), SMPB (숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl) butyrate)), SULFO SMPB (술포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl) butyrate)), MBS (3-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(3-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)), SULFO MBS (3-말레이키도벤조일-N-하이드록시술포숙신이미드 에스테르(3-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)), SIAB (N-숙신이미딜(4-이오도아세틸)아미노벤조에이트(N-Succinimidyl(4-iodoacetyl) aminobenzoate)), SULFO SIAB (N-술포숙신이미딜(4-이오도아세틸)아미노벤조에이트(N-Sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate)), SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)), SULFO SMCC (술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)), NHS LC SPDP (숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트(Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio) propionamido) hexanoate)), SULFO NHS LC SPDP (술포숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio) propionamido) hexanoate)), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-Succinimdyl-3-(2-pyridyldithio) propionate)), NHS BROMOACETATE (N-하이드록시숙신이미딜프로모아세테이트(N-Hydroxysuccinimidylbromoacetate)), NHS IODOACETATE (N-하이드록시숙신이미딜이오도아세테이트(N-Hydroxysuccinimidyliodoacetate)), MPBH (4-(N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드 하이드로클로라이드(4-(N-Maleimidophenyl) butyric acid hydrazide hydrochloride)), MCCH (4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 하이드라지드 하이드로클로라이드(4-(N-Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid hydrazide hydrochloride)), MBH (m-말레이미도벤조산 하이드라지드하이드로클로라이드(m-Maleimidobenzoic acid hydrazidehydrochloride)), SULFO EMCS (N-(엡실론-말레이미도카프로일옥시)술포숙신이미드(N-(epsilon-Maleimidocaproyloxy) sulfosuccinimide)), EMCS (N-(엡실론-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드(N-(epsilon-Maleimidocaproyloxy) succinimide)), PMPI (N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트(N-(p-Maleimidophenyl) isocyanate)), KMUH (N-(카파-말레이미도운데카논산)하이드라지드(N-(kappa-Maleimidoundecanoic acid) hydrazide)), LC SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시(6-아미도카프로에이트)(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxy(6-amidocaproate))), SULFO GMBS (N-(감마-말레이미도부틸옥시)술포숙신이미드 에스테르(N-(gamma-Maleimidobutryloxy) sulfosuccinimide ester)), SMPH (숙신이미딜-6-(베타-말레이미도프로피온아미도헥사노에이트)(Succinimidyl-6-(beta-maleimidopropionamidohexanoate))), SULFO KMUS (N-카파-말레이미도운데카노일옥시)술포숙신이미드 에스테르(N-(kappa-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide ester)), GMBS (N-(감마-말레이미도부틸옥시)숙신이미드(N-(gamma-Maleimidobutyrloxy) succinimide)), DMP (디메틸피멜이미데이트 하이드로클로라이드(Dimethylpimelimidate hydrochloride)), DMS (디메틸수베르이미데이트 하이드로클로라이드(Dimethylsuberimidate hydrochloride)), MHBH(우드 시약(Wood's Reagent))(메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 하이드로클로라이드(Methyl-p-hydroxybenzimidate hydrochloride), 98%), DMA (디메틸아디프이미데이트 하이드로클로라이드(Dimethyladipimidate hydrochloride))를 포함한다.

10. 컴퓨터 판독가능한 매체( Computer readable mediums )

개시된 핵산 및 단백질은 아미노산의 뉴클레오티드로 이루어진 서열로서 나타내어질 수 있다는 것은 말할 것도 없는 일이다. 이러한 서열들을 나타내기 위한 다양한 방법들이 있으며, 예를 들어 뉴클레오티드 구아노신(guanosine)은 G 또는 g로 나타내어질 수 있다. 비슷하게는, 아미노산 발린(valine)은 Val 또는 V로 나타내어질 수 있다. 당업자들은 그것들 각각이 본원에 기재된 것으로 고려되는 임의의 핵산 또는 단백질 서열을 존재하는 다양한 임의의 방식으로 어떻게 나타내고 표시할 것인가를 알 것이다. 본원에서 특별히 고려되는 것은 상업적으로 이용가능한 플로피 디스크(floppy disks), 테이프(tapes), 칩(chips), 하드 드라이브(hard drives), 컴팩트 디스크(compact disks) 및 비디오 디스크(video disks)와 같은 컴퓨터 판독가능한 매체 또는 다른 컴퓨터 판독가능한 매체 상에의 이러한 서열들의 디스플레이이다. 또한, 개시된 서열들의 2진수 코드(Binary code) 표시가 개시된다. 당업자들은 컴퓨터 판독가능한 매체가 무엇인지 알 것이다. 따라서, 컴퓨터 판독가능한 매체에 핵산 또는 단백질 서열은 기록되고, 저장 또는 보관된다.

본원에 기재된 서열들에 관한 서열 및 정보를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체가 개시된다.

11. 개시된 조성물/조합 화학을 이용한 선별에 의해 확인된 조성물

개시된 조성물들은 원하는 방식으로 개시된 조성물과 상호작용하는 분자 또는 고분자 분자(macromolecular molecule)를 확인하기 위한 임의의 조합 기술(combinatorial technique)을 위한 표적으로서 사용될 수 있다. DR3 및/또는 TL1A 핵산, 펩티드 및 본원에 개시된 관련 분자들은 조합적 접근법을 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 또한, 개시되어 있는 것들은 SEQ ID NOS: 1, 2, 3 또는 4 또는 그것들의 일부분으로 개시된 조성물이 조합 또는 선별 프로토콜에서 표적으로서 사용된 조합 기술 또는 선별 기술을 통하여 확인된 조성물이다.

조합 기술 또는 선별 방법에 개시된 조성물을 사용할 때, 고분자 분자와 같은 분자는 억제 또는 자극 또는 표적 분자의 기능과 같은 특정한 원하는 특성을 가지는 것으로 확인될 것이라는 것을 알 것이다. SEQ ID NOS: 1, 2, 3 또는 4 또는 그것들의 일부분과 같은 개시된 조성물을 사용하여 확인되고 단리된 분자들 또한 개시된다. 따라서, SEQ ID NOS: 1, 2, 3 또는 4 또는 그것들의 일부분과 같이 개시된 조성물에 관련된 조합적 또는 선별 접근법을 사용하여 생성된 생성물 또한 본원에 개시된 것으로 고려된다.

예를 들어, DR3 및 TL1A 사이의 상호작용을 억제하는 분자를 확인하기 위한 개시된 방법은 고효율(high throughput) 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 추정상의 억제인자(putative inhibitor)는 상호작용을 빠르게 확인하기 위하여 형광공명 에너지 전이(FRET)를 사용하여 확인될 수 있다. 기술의 근간이 되는 이론은 두 개의 분자가 서로 근접할 때, 즉 백그라운드를 넘어선 수준으로 상호작용할 때, 시그널이 생성되거나 시그널이 퀀칭될 수 있다는 것이다. 그 후, 예를 들어 추정상의 억제인자를 첨가하는 것을 포함하는 다양한 실험들이 수행될 수 있다. 만약 억제인자가 두 개의 신호전달 분자들 사이의 상호작용과 경쟁한다면, 시그널은 그 공간에서 서로 상쇄될 것이며, 이것은 사용된 시그널의 형태에 따라 시그널을 감소시키거나 증가시키게 될 것이다. 이 시그널이 감소되거나 증가되는 것은 추정상의 억제인자의 존재 여부에 관련이 있을 것이다. 임의의 신호전달 수단이 사용될 수 있다. 예를 들면, 추정상의 억제인자의 존재하에 첫 번째 분자와 두 번째 분자를 함께 접촉시키는 것, 여기에서 상기 첫 번째 분자 또는 두 번째 분자는 형광 공여체(fluorescence donor)를 포함하며, 여기에서 상기 첫 번째 또는 두 번째 분자, 전형적으로 공여체를 포함하지 않는 분자는 형광 수용체(fluorescence acceptor)를 포함하고; 추정상의 억제인자의 존재하에 그리고 추정상의 억제인자의 부재하에 형광공명 에너지 전이(FRET)를 측정하는 것, 여기에서 추정상의 억제인자의 부재하의 FRET 측정값과 비교하여 추정상의 억제인자의 존재하의 FRET의 감소는 추정상의 억제인자가 두 개의 분자 사이의 결합을 억제한다는 것을 나타내는 것을 포함하는, 임의의 두 개의 개시된 분자 사이의 상호작용의 억제를 확인하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 형태의 방법은 세포 시스템에서도 수행될 수 있다.

조합 화학(combinatorial chemistry)은 전형적으로 반복 처리(iterative process)로 소분자 또는 다른 거대분자 중 어느 하나와 결합할 수 있는 소분자 또는 거대분자를 분리하기 위한 모든 방법을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 단백질, 올리고뉴클레오티드 및 당은 거대분자의 예이다. 예를 들면, 주어진 기능, 촉매적 또는 리간드-결합을 가지는 올리고뉴클레오티드 분자는 "시험관 내 유전학(in vitro genetics)"으로 불리는 랜덤 올리고뉴클레오티드의 복합 혼합물로부터 분리될 수 있다(Szostak, TIBS 19:89, 1992). 어떤 것은 랜덤의 정의된 서열들을 포함하는 분자들의 커다란 풀(pool)을 합성하고, 몇몇의 선별 및 농축 공정을 위해 10μg의 100 뉴클레오티드 RNA에 예를 들어, 대략 10¹⁵ 각각의 서열이 있는 그 복합 혼합물을 둔다. 컬럼 상의 리간드에 결합된 분자들의 친화 크로마토그래피 및 PCR 증폭의 주기 반복을 통하여, 엘링턴 및 쇼스택(Ellington and Szostak (1990))은 10¹⁰ RNA 분자들 중 하나가 소분자 염료와 결합하도록 하는 방식으로 접혀지는 것으로 추정하였다. 이러한 리간드-결합 거동(ligand-binding behavior)을 가지는 DNA 분자 또한 분리되었다(Ellington and Szostak, 1992; Bock et al, 1992). 당업자들에게 공지되어 있는 소유기분자(small organic molecules), 단백질, 항체 및 다른 거대분자에 대하여 비슷한 목적을 가지는 기술들이 존재한다. 소유기 라이브러리, 올리고뉴클레오티드 또는 항체에 기초한 것이든 아니든, 원하는 활성을 위한 분자의 스크리닝 세트(screening set)는 대체로 조합 화학으로 칭한다. 조합 기술은 특히 분자 간의 결합 상호작용을 정의하고, 거대분자가 핵산일 경우 종종 압타머로 불리는 특정 결합 활성을 가지는 분자를 분리하는데 적합하다.

12. 담체( Carriers )

개시된 조성물은 억제 인자의 투여, 운반 또는 그것의 다른 양상 및 그것들의 사용을 돕기 위하여, 담체 및 다른 조성물과 조합되고, 접합되거나 결합될 수 있다. 편의상, 이러한 조성물을 본원에서는 담체로 칭할 것이다. 담체는 예를 들어, 소분자, 약제학적 약물, 지방산, 검출가능한 마커, 접합 태그, 나노입자 또는 효소일 수 있다.

개시된 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 치료학적으로 사용될 수 있다. "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 생물학적이거나 그렇지 않으면 바람직하지 않은 것이 아닌 물질, 즉 어떤 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 그것이 포함되어 있는 약제학적 조성물의 어떤 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는, 상기 조성물과 함께 피험자에게 투여될 수 있는 물질을 의미한다. 담체는 물론 당업자들에게 잘 알려져 있는 것처럼, 활성 성분의 어떤 분해를 최소화하고, 피험자에 어떤 해로운 부작용을 최소화하도록 선택되어 질 것이다.

적절한 담체 및 그것들의 문헌들에 기재되어 있다(Remington : The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995). 전형적으로, 제형에 등장성(isotonic)을 부여하기 위해 적절한 양의 약제학적으로 허용가능한 염이 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는 식염수(saline), 링거 용액(Ringer's solutoin) 및 덱스트로스 용액(dextrose solution)을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 담체는 그것의 매트릭스가 성형체(shaped articles), 예를 들어, 필름, 리포솜 또는 마이크로입자의 형태인, 항체를 포함하는 고형의 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스(semipermeable matrices)와 같은 서방성(sustained release) 제조물을 포함한다. 어떤 담체는 예를 들어, 투여될 조성물의 투여 경로 및 농도에 의존하는 것이 더 바람직할 것이라는 것은 당업자들에게 명백할 것이다.

약제학적 담체는 당업자들에게 공지되어 있다. 이것들 대부분은 전형적으로 생리학적 pH로 멸균수, 식염수 및 버퍼 용액과 같은 용액을 포함하는, 인간에게 약물을 투여하기 위한 표준 담체일 것이다. 조성물은 근육 내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 다른 화합물은 당업자들에 의해 사용되는 표준 방법에 따라 투여될 수 있다.

약제학적 조성물은 선택된 분자뿐만 아니라, 담체(carriers), 증점제(thickeners), 희석제(diluents), 버퍼(buffers), 방부제(preservatives), 계면활성제(surface active agents) 등을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 항균제(antimicrobial agents), 항염증제(antiinflammatory agents), 마취제(anesthetics) 등과 같은 하나 또는 그 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.

비경구 투여(parenteral administration)를 위한 제조물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀전을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올리에이트(ethyl oleate)와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체는 식염수 및 완충 매질(buffered media)를 포함하는, 물, 알코올/수성 용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구적 비히클(vehicles)은 염화나트륨 용액(sodium chloride solution), 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거액(lactated Ringer's) 또는 고정유(fixed oils)를 포함한다. 정맥주사용 비히클은 유체(fluid) 및 영양 보충액(replenishers), (링거 덱스트로스에 기초한 것들과 같은) 전해질 보충액(electrolyte replenishers) 등을 포함한다. 예를 들어, 항균제(antimicrobials), 항산화제(anti-oxidants), 킬레이트제(chelating agents) 및 비활성 기체(inert gases) 등과 같은 방부제 및 다른 첨가물 또한 존재할 수 있다.

국소 투여를 위한 제형은 연고(ointments), 로션(lotions), 크림(creams), 겔(gels), 드롭제(drops), 좌약(suppositories), 스프레이(sprays), 용액(liquids) 및 파우더(powders)를 포함할 수 있다. 전통적인 약제학적 담체, 수용액, 파우더 또는 오일 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.

경구 투여를 위한 조성물은 파우더 또는 과립(granules), 물 또는 비수성 매질에 용해된 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사셋(sachet) 또는 정제를 포함한다. 증점제(thickeners), 향미료(flavorings), 희석제(diluents), 유화제(emulsifiers), 분산제(dispersing adis) 또는 결합제(binders)가 바람직할 수 있다.

몇몇의 조성물은 어쩌면 염산(hydrochloric acid), 하이드로브롬산(hydrobromic acid), 과염소산(perchloric acid), 질산(nitric acid), 티오시안산(thiocyanic acid), 황산(sulfuric acid) 및 인산(phosphoric acid)과 같은 무기산; 및 포름산(formic acid), 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid), 글리콜산(glycolic acid), 젖산(lactic acid), 피루브산(pyruvic acid), 옥살산(oxalic acid), 말론산(malonic acid), 숙신산(succinic acid), 말레산(maleic acid) 및 푸마르산(fumaric acid)과 같은 유기산과의 반응, 또는 소디움 하이드록사이드(sodium hydroxide), 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide), 포타슘 하이드록사이드(potassium hydroxide)와 같은 무기 염기, 및 모노(mono)-, 디(di)-, 트리알킬(trialkyl) 및 아릴 아민(aryl amines) 및 치환된 에탄올아민(substituted ethanolamines)과 같은 유기 염기와의 반응에 의해 형성된 약제학적으로 허용가능한 산- 또는 염기- 부가염(addition salt)으로 투여될 수 있다.

상기 물질은 용액, 현탁액에 (예를 들어, 마이크로입자, 리포솜 또는 세포 내로 통합되어) 있을 수 있다. 이것들은 항체, 수용체 또는 수용체 리간드를 통하여 특정 세포 형태를 표적화할 수 있다. 하기의 참고문헌들은 종양 조직에 대한 특정 단백질을 표적화하기 위한 이 기술의 사용의 예이다(Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); and Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). "스텔스(stealth)"와 같은 비히클 및 (결장 악성종양(colonic carcinoma)을 표적으로 하는 리피드 매개성 약물(lipid mediated durg)을 포함하는) 다른 항체가 접합된 리포솜, 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개성 표적화, 대식세포 유도성 조양 표적화 및 세포 내 마우스 신경교종 세포(glioma cells)의 고특이적 치료학적 레트로바이러스성 표적화가 있다. 종양 조직에 대한 특정 단백질을 표적으로 하기 위한 이러한 기술의 사용의 예에 관한 참고문헌들이 있다(Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); and Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). 일반적으로, 수용체는 구성성(constitutive) 또는 리간드 유도성(ligand induced) 엔도사이토시스(endocytosis) 경로에 관여한다. 클라트린피복 소공(clathrin-coated pits)에 있는 이들 수용체 클러스터(cluster)는 클라트린 피복 소포(clathrin-coated vesicles)를 통해 세포로 들어가고, 수용체가 분리되는 산성화된 엔도좀(acidified endosome)을 통과한 후 세포 표면으로 되돌아가거나, 세포 내에 저장되거나, 리소좀에서 분해된다. 내재화 경로(internalization pathway)는 영양 섭취, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 제거, 바이러스 및 독소의 기회적 유입(opportunistic entry), 리간드의 해리 및 분해, 및 수용체-레벨 조절과 같은 다양한 기능을 제공한다. 많은 수용체들이 세포 형태, 수용체 농도, 리간드의 형태, 리간드 이온가(valency) 및 리간드 농도에 따라 많은 세포 내 경로를 따른다. 수용체 매개성 엔도시토시스의 분자적 및 세포적 메커니즘은 검토되어있다(Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).

담체 분자는 개시된 억제인자에 공유적으로 결합될 수 있다. 담체 분자는 개시된 펩티드의 아미노 말단에 결합될 수 있다. 담체 분자는 개시된 펩티드의 카르복시 말단에 결합될 수 있다. 담체 분자는 개시된 펩티드 내의 아미노산에 결합될 수 있다. 본원에서 제공된 조성물은 담체 분자와 개시된 억제인자를 연결하는 링커(linker)를 더 포함할 수 있다. 개시된 억제인자는 또한 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)(Tkachenko et al., (2003) J Am Chem Soc, 125, 4700-4701)과 같은, 펩티드와 함께 나노쉘을 코팅하는데 사용될 수 있는 코팅 분자에 접합될 수 있다.

개시된 펩티드에 작용 분자를 가교(crosslink)시키는데 사용될 수 있는 단백질 가교제(crosslinker)는 당업계에 공지되어 있고, 그것의 유용성과 구조에 기초하여 정의되어 있으며, DSS (디숙신이미딜 수베레이트(Disuccinimidylsuberate)), DSP (디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(Dithiobis(succinimidylpropionate))), DTSSP (3,3'-디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트)(3,3'-Dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate))), SULFO BSOCOES (비스[2-(술포숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸]술폰)(Bis[2-(sulfosuccinimidooxycarbonyloxy) ethyl]sulfone)), BSOCOES (비스-[2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸]술폰)(Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone)), SULFO DST (디술포숙신이미딜타트레이트(Disulfosuccinimidyltartrate)), DST (디숙신이미딜타트레이트(Disuccinimidyltartrate)), SULFO EGS (에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate))), EGS (에틸렌 글리콜비스(술포숙신이미딜숙시네이트)(Ethylene glycolbis(sulfosuccinimidylsuccinate))), DPDPB (1,2-디[3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도]부탄)(1,2-Di[3'-(2'-pyridyldithio) propionamido]butane)), BSSS (비스(술포숙신이미딜)수베레이트(Bis(sulfosuccinimdyl) suberate)), SMPB (숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl) butyrate)), SULFO SMPB (술포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl) butyrate)), MBS (3-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(3-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)), SULFO MBS (3-말레이키도벤조일-N-하이드록시술포숙신이미드 에스테르(3-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)), SIAB (N-숙신이미딜(4-이오도아세틸)아미노벤조에이트(N-Succinimidyl(4-iodoacetyl) aminobenzoate)), SULFO SIAB (N-술포숙신이미딜(4-이오도아세틸)아미노벤조에이트(N-Sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate)), SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)), SULFO SMCC (술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)), NHS LC SPDP (숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트(Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio) propionamido) hexanoate)), SULFO NHS LC SPDP (술포숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio) propionamido) hexanoate)), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-Succinimdyl-3-(2-pyridyldithio) propionate)), NHS BROMOACETATE (N-하이드록시숙신이미딜프로모아세테이트(N-Hydroxysuccinimidylbromoacetate)), NHS IODOACETATE (N-하이드록시숙신이미딜이오도아세테이트(N-Hydroxysuccinimidyliodoacetate)), MPBH (4-(N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드 하이드로클로라이드(4-(N-Maleimidophenyl) butyric acid hydrazide hydrochloride)), MCCH (4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 하이드라지드 하이드로클로라이드(4-(N-Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid hydrazide hydrochloride)), MBH (m-말레이미도벤조산 하이드라지드하이드로클로라이드(m-Maleimidobenzoic acid hydrazidehydrochloride)), SULFO EMCS (N-(엡실론-말레이미도카프로일옥시)술포숙신이미드(N-(epsilon-Maleimidocaproyloxy) sulfosuccinimide)), EMCS (N-(엡실론-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드(N-(epsilon-Maleimidocaproyloxy) succinimide)), PMPI (N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트(N-(p-Maleimidophenyl) isocyanate)), KMUH (N-(카파-말레이미도운데카논산)하이드라지드(N-(kappa-Maleimidoundecanoic acid) hydrazide)), LC SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시(6-아미도카프로에이트)(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxy(6-amidocaproate))), SULFO GMBS (N-(감마-말레이미도부틸옥시)술포숙신이미드 에스테르(N-(gamma-Maleimidobutryloxy) sulfosuccinimide ester)), SMPH (숙신이미딜-6-(베타-말레이미도프로피온아미도헥사노에이트)(Succinimidyl-6-(beta-maleimidopropionamidohexanoate))), SULFO KMUS (N-카파-말레이미도운데카노일옥시)술포숙신이미드 에스테르(N-(kappa-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide ester)), GMBS (N-(감마-말레이미도부틸옥시)숙신이미드(N-(gamma-Maleimidobutyrloxy) succinimide)), DMP (디메틸피멜이미데이트 하이드로클로라이드(Dimethylpimelimidate hydrochloride)), DMS (디메틸수베르이미데이트 하이드로클로라이드(Dimethylsuberimidate hydrochloride)), MHBH(우드 시약(Wood's Reagent))(메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 하이드로클로라이드(Methyl-p-hydroxybenzimidate hydrochloride), 98%), DMA (디메틸아디프이미데이트 하이드로클로라이드(Dimethyladipimidate hydrochloride))를 포함한다.

i. 나노입자, 마이크로입자 및 마이크로버블( Nanoparticles , Microparticles, and Microbubbles )

용어 "나노입자(nanoparticle)"는 나노미터로 측정되는 크기를 가지는 나노스케일의 입자, 예를 들어 적어도 하나의 약 100nm보다 적은 크기를 가지는 나노크기의 입자(nanoscopic particles)을 말한다. 나노입자의 예는 상자성 나노입자(paramagnetic nanoparticles), 초상자성 나노입자(superparamagnetic nanoparticles), 금속 나노입자(metal nanoparticles), 풀러렌-유사 물질(fullerene-like materials), 무기 나노튜브(inorganic nanotubes), (공유적으로 부착된 금속 킬레이트 화합물을 가지는 것과 같은) 덴드리머(dendrimers), 나노섬유(nanofibers), 나노홈(nanohoms), 나노-오니언(nano-onions), 나노로드(nanoloads), 나노로프(nanoropes) 및 양자점(quantom dot)을 포함한다. 나노입자는 예를 들어, (고주파(radio frequency)와 가시성 광자(visible photon)를 포함하는) 광자(photon) 및 플라스몬 공명(plasmon resonance)의 흡수 및/또는 방출을 통하여 검출가능한 시그널을 생성할 수 있다.

마이크로스피어(microspheres)(또는 마이크로버블) 또한 본원에 개시된 방법들과 함께 사용될 수 있다. 발색단(chromophore)을 포함하는 마이크로스피어는 광결정(photonic crystal), 생물학적 표지(biological labeling) 및 미세유체 채널(microfluidic channel)에서의 흐름 가시화(flow visualization)을 포함하는 광범위하게 다양한 적용에 사용되어 왔다(예를 들어, 각각 그 전체가 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 Y. Lin, et al., Appl. Phys Lett. 2002, 81, 3134; D. Wang, et al., Chem. Mater. 2003, 15, 2724; X. Gao, et al., J. Biomed. Opt. 2002, 7, 532; M. Han, et al., Nature Biotechnology. 2001, 19, 631; V. M. Pai, et al., Mag. & Magnetic Mater. 1999, 194, 262를 참조). 발색단의 광안정성(photostability) 및 마이크로스피어의 단분산성(monodispersity) 모두 중요할 수 있다.

예를 들어, 실리카 나노입자(silica nanoparticles), 금속 나노입자(metal nanoparticles), 금속 산화물 나노입자(metal oxide nanoparticles) 또는 반도체성 나노결정(semiconductor nanocrystals)과 같은 나노입자는 마이크로스피어 내로 혼입될 수 있다. 나노입자의 광학적(optical), 자성적(magnetic) 및 전기적(electronic) 특성은 그것들이 마이크로스피어와 결합하는 동안 관찰될 수 있게 하며, 마이크로스피어가 확인되며 공간적으로 관찰될 수 있게 한다. 예를 들어, 콜로이드적으로 합성된 반도체성 나노결정의 높은 광안정성, 우수한 형광 효율(fluorescence efficiency) 및 넓은 방출 조정가능성(wide emission tunability)은 우수한 발색단의 선택을 가능하게 한다. 유기 염료와는 달리, 서로 다른 색(즉, 서로 다른 파장)을 방출하는 나노결정은 단일 광원(single light source)을 사용하여 동시에 여기될 수 있다. (예를 들어, 코어-쉘(core-shell) CdSe/ZnS 및 CdS/ZnS 나노결정과 같은) 콜로이드적으로 합성된 반도체성 나노결정은 마이크로스피어 내로 혼입될 수 있다. 마이크로스피어는 단일분산 실리카 마이크로스피어(monodisperse silica microspheres)일 수 있다.

나노입자는 금속 나노입자, 금속 산화물 나노입자 또는 반도체성 나노결정일 수 있다. 금속 나노입자 또는 금속 산화물 나노입자의 금속은 티타늄(titanium), 지르코늄(zirconium), 하프늄(hafnium), 바나듐(vanadium), 니오븀(niobium), 탄탈(tantalum), 크로뮴(chromium), 몰리브덴(molybdenum), 텅스텐(tungsten), 망간(manganese), 테크네튬(technetium), 레늄(rhenium), 철(iron), 루테늄(ruthenium), 오스뮴(osmium), 코발트(cobalt), 로듐(rhodium), 이리듐(iridium), 니켈(nickel), 팔라듐(palladium), 백금(platinum), 구리(copper), 은(silver), 금(gold), 아연(zinc), 카드뮴(cadmium), 스칸듐(scandium), 이트륨(yttrium), 란탄(lanthanum), 란탄계열(lanthanide series) 또는 악티늄 계열( actinide series) 요소(예를 들어, 세륨(cerium), 프라세오디뮴(praseodymium), 네오디뮴(neodymium), 프로메티움(promethium), 사마륨(samarium), 유로퓸(europium), 가돌리늄(gadolinium), 테르븀(terbium), 디스프로슘(dysprosium), 홀뮴(holmium), 에르븀(erbium), 툴륨(thulium), 이테르븀(ytterbium), 루테튬(lutetium), 토륨(thorium), 프로탁티늄(protactinium), 및 우라늄(uranium)), 붕소(boron), 알루미늄(aluminum), 갈륨(gallium), 인듐(indium), 탈륨(thallium), 실리콘(silicon), 게르마늄(germanium), 주석(tin), 납(lead), 안티몬(antimony), 비스무스(bismuth), 폴로늄(polonium), 마그네슘(magnesium), 칼슘(calcium), 스트론튬(strontium), 및 바륨(barium)을 포함할 수 있다. 어떤 구현에서, 상기 금속은 철, 루테늄, 코발트, 로듐, 니켈, 팔라듐, 백금, 은, 금, 세륨 또는 사마륨일 수 있다. 금속 산화물은 임의의 이들 물질 또는 물질들의 조합의 산화물일 수 있다. 예를 들어, 상기 금속은 금일 수 있고, 상기 금속 산화물은 산화철(iron oxide), 산화 코발트(cobalt oxide), 산화 아연(zinc oxide), 산화 세륨(cerium oxide) 또는 산화 티타늄(titanium oxide)일 수 있다. 금속 및 금속 산화물 나노입자의 제조는 예를 들어, 각각 그 전체가 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있는 U.S. Pat. Nos. 5,897,945 및 6,759,199에 기재되어 있다.

예를 들면, 개시된 조성물은 실리카 나노입자(silica nanoparticles, SNPs) 상에 고정될 수 있다. SNPs는 그것들의 적절한 부피에 대한 표면적의 비율, 간단한 제조 및 형광 표지, 자성 나노입자(Yang, H.H. et al. 2005) 및 반도체성 나노결정(Lin, Y.W., et al. 2006)의 부착 가능성 때문에, 바이오센싱(biosensing) 및 촉매적 적용을 위해 널리 사용되어 왔다.

나노입자는 또한 예를 들어, 열 발생 나노쉘일 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "나노쉘(nanoshell)"은 하나 또는 그 이상의 전도성 외피층(shell layer)으로 둘러싸인 별개의 유전체성 또는 반도체성 코어 섹션(core section)을 가지는 나노입자이다. U.S. Pat. No. 6,530,944는 금속 나노쉘을 만들고 이용하는 방법의 교시를 위하여 그 전체가 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있다.

표적 분자는 개시된 조성물 및/또는 담체에 결합될 수 있다. 예를 들면, 표적 분자는 항체 또는 그것의 단편, 특정 수용체에 대한 리간드, 또는 표적화되는 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 다른 단백질일 수 있다.

ii . 리포솜( Liposomes )

본원에 사용된 용어로서 "리포솜(liposome)"은 내부 수성 공간을 둘러싼 외부 지질 이중층(bi-layer) 또는 다중층(multi-layer) 막을 포함하는 구조를 말한다. 리포솜은 세포로 운반하기 위한 임의의 생물학적 활성제를 패키징하는데 사용될 수 있다.

리포솜을 만들기 위한 물질 및 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 적절한 매질에의 분산시키면, 매우 다양한 인지질이 팽창(swell)하고, 수화되고 지질 이중층을 격리하는 수성 매질의 층을 가지는 다층의 동심성 이중층 소포체(multilamellar concentric bilayer vesicle)를 형성한다. 이들 시스템은 다층 리포솜(multilamellar liposomes) 또는 다층 지질 소포체(multilamellar lipid vesicles, "MLVs")로 불리며, 10nm 내지 100μm 범위 내의 지름을 가진다. 이들 MLV는 뱅햄 등에 의해 처음으로 개시되었다(Bangham, et al., J Mol. Biol. 13:238-252 (1965)). 일반적으로, 지질 또는 친유성 물질은 유기 용매에 용해된다. 회전 증발(rotary evaporation)에 의한 진공하에서와 같이 용매가 제거되면, 지질 잔류물은 용기의 벽에 필름을 형성한다. 그 후, 전형적으로 전해질성 또는 친수성 생물학적 활성 물질을 포함하는 수성 용액을 필름에 첨가한다. 큰 MLV는 교반(agitation)으로 생성된다. 더 작은 MLV가 바람직한 경우, 큰 소포체를 초음파 처리하고, 감소된 공극 크기를 가지는 필터를 통해서 연속적으로 여과되거나, 다른 형태의 기계적 전단(mechanical shearing)에 의해 감소된다. MLV의 층의 크기와 수가 모두 감소될 수 있는 기술, 예를 들어 가압 압출(pressurized extrusion)이 있다(Barenholz, et al., FEBS Lett. 99:210-214 (1979)).

리포솜은 또한 MLV의 더욱 광범위한 음파 처리(sonication)에 의해 제조되며, 수성 용액을 둘러싼 단층의 구체 지질 이중층으로 이루어지는 단층 소포체(unilammellar vesicles)를 형성할 수 있게 한다. 단층 소포체("ULVs")는 작고, 20 내지 200nm 범위 내의 지름을 가질 수 있는 반면, 더 큰 ULV는 200nm 내지 2μm 범위 내의 지름을 가질 수 있다. 단층 소포체를 만들기 위한 여러 가지 기술들이 잘 알려져 있다. Papahadjopoulos 등에 있어서, 인지질의 수성 분산액의 음파 처리(sonication)는 수성 용액을 둘러싸는 지질 이중층을 가지는 작은 ULV를 만들어낸다(Papahadjopoulos, et al., Biochim et Biophys Acta 135:624-238 (1968)). Schneider의 U.S. Pat. No. 4,089,801은 초음파 처리(ultrasonication)에 의해 리포솜 전구체를 형성한 후, 양친매성 화합물을 포함하는 수성 매질을 첨가하여 생체분자 지질층 시스템(biomolecular lipid layer system)을 형성한 것을 개시하고 있다.

작은 ULV는 또한 Batzri 등에 의해 기재된 에탄올 주입 기술(ethanol injection technique)(Batzri, et al., Biochim et Biophys Acta 298:1015-1019 (1973)) 및 Deamer 등에 의한 에테르 주입 기술(ether injection technique)(Deamer, et al., Biochim et Biophys Acta 443:629-634 (1976))에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 버퍼 용액 내로의 유기성 지질 용액의 빠른 주입을 포함하며, 그 결과 단층 리포솜이 빠르게 형성된다. ULV를 만들기 위한 다른 기술은 Weder 등에 교시되어 있다Weder, et al. in "Liposome Technology", ed. G. Gregoriadis, CRC Press Inc., Boca Raton, Fla., Vol. I, Chapter 7, pg. 79-107 (1984). 이러한 세제 제거 방법(detergent removal method)은 원하는 소포체를 얻기 위하여 세제와 함께 지질과 첨가물을 교반 또는 음파 처리에 의해 가용화시키는 것을 포함한다.

Papahadjopoulos 등 및 U.S. Pat. No. 4,235,871은 유기 용매에 용해시킨 지질과 버퍼 수용액에 봉입될 약물의 유중수형 에멀전(water-in-oil emulsion)의 형성을 포함하는 역상 증발법(reverse phase evaporation technique)에 의한 큰 ULV의 제조를 기재하고 있다. 수성 매질에 교반시키거나 분산시킨 큰 ULV로 전환되는 혼합물을 얻기 위하여 유기 용매는 압력하에 제거된다. Suzuki 등의 U.S. Pat. No. 4,016,100은 약제와 지질의 수성 인지질 분산액을 동결(freezing)/해동(thawing)시킴으로써 단일막 소포체에 약제를 봉입시키는 다른 방법을 기재하고 있다.

MLV 및 ULV뿐만 아니라, 리포솜 또한 다소포체(multivesicular)일 수 있다. Kim 등에는 이들 다소포체 리포솜이 구형이며, 내부 과립 구조(internal granular structure)를 포함한다는 것을 개시하고 있다(Kim, et al., Biochim et Biophys Acta 728:339-348 (1983)). 외피막(outer membrane)은 지질 이중층이며, 내부 영역은 이중층 격벽(bilayer septum)에 의해 분리된 작은 구획을 포함한다. 여전히 다른 형태의 리포솜은 여러 개의 주변 지질층에 의해 둘러싸인 큰 중심 구획을 가지는 올리고층 소포체(oligolamellar vesicles, "OLVs")이다(Callo, et al., Cryobiology 22(3):251-267 (1985)).

Mezei 등의 U.S. Pat. Nos. 4,485,054 및 4,761288 또한 지질 소포체를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 가장 최근, U.S. Pat. No. 5,653,996은 에어로졸화(aerosolization)를 사용하여 리포솜을 제조하는 방법을 개시하였고, Yiournas 등의 U.S. Pat. No. 5,013,497은 고속 전단 혼합 챔버(high velocity-shear mixing chamber)를 사용하는 리포솜의 제조 방법을 개시하였다. ULV(Wallach, et al., U.S. Pat. No. 4,853,228) 또는 OLV(Wallach, U.S. Pat. Nos. 5,474,848 and 5,628,936)를 생산하기 위하여 특정 시작 물질을 사용하는 방법 또한 개시되어 있다.

앞서 언급한 지질 소포체와 그것들의 제조를 위한 방법 모두에 대한 포괄적 리뷰가 "리포솜 기술"에 기재되어 있다("Liposome Technology", ed. G. Gregoriadis, CRC Press Inc., Boca Raton, Fla., Vol. I, II & III (1984)). 본 발명에 사용하기에 적합한 다양한 지질 소포체를 기재하고 있는 이것과 앞서 언급한 참고문헌들은 본원에 참고문헌으로서 통합되어 있다.

제공되는 조성물에 접합될 수 있는 지방산(즉, 지질)은 리포솜 내로의 전단백질 컨버타아제(proprotein convertase) 억제인자의 효율적인 혼입을 가능하게 하는 것들을 포함한다. 일반적으로, 지방산은 극성 지질(polar lipid)이다. 따라서, 지방산은 인지질(phospholipid)일 수 있다. 제공되는 조성물은 천연 또는 합성 인지질 중 하나를 포함할 수 있다. 인지질은 포화(saturated) 또는 비포화(unsaturated) 단일치환(monosubstituted) 또는 이치환(disubstituted)된 지방산을 함유하는 인지질 또는 그것들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 이들 인지질은 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine), 디올레오일포스파티딜세린(dioleoylphosphatidylserine), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol), 디올레오일포스파티딘산(dioleoylphosphatidic acid), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine), 팔미토일올레오일포스파티딜세린(palmitoyloleoylphosphatidylserine), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(palmitoyloleoylphophatidylglycerol), 팔미토일올레오일포스파티딘산(palmitoyloleoylphosphatidic acid), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜콜린(palmitelaidoyloleoylphosphatidylcholine), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜세린(palmitelaidoyloleoylphosphatidylserine), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜에탄올아민(palmitelaidoyloleoylphosphatidylethanolamine), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜글리세롤(palmitelaidoyloleoylphosphatidylglycerol), 팔미텔라이도일올레오일포스파티딘산(palmitelaidoyloleoylphosphatidic acid), 미리스톨레오일올레오일포스파티딜콜린(myristoleoyloleoylphosphatidylcholine), 미리스톨레오일올레오일포스파티딜세린(myristoleoyloleoylphosphatidylserine), 미리스톨레오일올레오일포스파티딜에탄올아민(myristoleoyloleoylphosphatidylethanolamine), 미리스톨레오일올레오일포스파티딜글리세롤(myristoleoyloleoylphosphatidylglycerol), 미리스톨레오일올레오일포스파티딘산(myristoleoyloleoylphosphatidic acid), 디리놀레오일포스파티딜콜린(dilinoleoylphosphatidylcholine), 디리놀레오일포스파티딜세린(dilinoleoylphosphatidylserine), 디리놀레오일포스파티딜에탄올아민(dilinoleoylphosphatidylethanolamine), 디리놀레오일포스파티딜글리세롤(dilinoleoylphosphatidylglycerol), 디리놀레오일포스파티딘산(dilinoleoylphosphatidic acid), 팔미틱리놀레오일포스파티딜콜린(palmiticlinoleoylphosphatidylcholine), 팔미틱리놀레오일포스파티딜세린 palmiticlinoleoylphosphatidylserine), 팔미틱리놀레오일포스파티딜에탄올아민(palmiticlinoleoylphosphatidylethanolamine), 팔미틱리놀레오일포스파티딜글리세롤(palmiticlinoleoylphosphatidylglycerol), 팔미틱리놀레오일포스파티딘산(palmiticlinoleoylphosphatidic acid)일 수 있다. 이들 인지질은 또한 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)(리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine)), 포스파티딜세린(phosphatidylserine)(리소포스파티딜세린(lysophosphatidylserine)), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)(리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine)), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol)(리소포스파티딜글리세롤(lysophosphatidylglycerol)) 및 포스파티딘산(phosphatidic acid)(리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid))의 모노아실화된(monoacylated) 유도체일 수 있다. 이들 리소포스파티딜 유도체에서 모노아실 사슬은 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 팔미톨레오일(palmitoleoyl), 리놀레오일 미리스토일(linoleoyl myristoyl) 또는 미리스톨레오일(myristoleoyl)일 수 있다. 인지질은 또한 합성된 것일 수 있다. 합성 인지질은 아반티 폴라 리피드(AVANTI Polar Lipids, Albaster, Ala); 시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.)와 같은 다양한 공급원으로부터 상업적으로 쉽게 입수가능하다. 이들 합성 화합물은 다양할 수 있으며, 그것들의 지방산 측쇄에 자연적으로 생성된 인지질에서 발견되지 않는 변형(variation)을 가질 수 있다. 지방산은 PS 또는 PC 중 어느 하나 또는 그것들 모두에서 C14, C16, C18 또는 C20 사슬 길이를 가지는 비포화된 지방산 측쇄를 가질 수 있다. 합성 인지질은 구성성분으로서 디올레오일(18:1)-PS, 팔미토일(16:0)-올레오일(18:1)-PS, 디미리스토일(14:0)-PS, 디팔미톨레오일(16:1)-PC, 디팔미토일(16:0)-PC, 디올레오일(18:1)-PC, 팔미토일(16:0)-올레오일(18:1)-PC 및 미리스토일(14:0)-올레오일(18:1)-PC를 가질 수 있다. 따라서, 예로서, 제공되는 조성물은 팔미토일 16:0을 포함할 수 있다.

iii . 생체 내( In vivo )/생체 외( Ex vivo )

상기 기재한 바와 같이, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체로 투여될 수 있고, 당업계에 잘 알려져 있는 다양한 메커니즘(예를 들어, 나형 DNA(naked DNA)의 흡수, 리포솜 융합(liposome fusion), 유전자 총(gene gun)을 통한 DNA의 근육 내 주사, 엔도시토시스(endocytosis) 등)에 의해 생체 내(in vivo) 및/또는 생체 외(ex vivo)로 피험자의 세포로 운반될 수 있다.

만약 생체 외 방법이 사용된다면, 세포 또는 조직은 당업계에 잘 알려져 있는 표준 프로토콜에 따라 제거되어 신체 외부에서 유지될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 인산칼슘 매개성 유전자 운반(calcium phosphate mediated gene delivery), 전기천공법(electroporation), 미세주입법(microinjection), 프로테오 리포솜(proteoliposome)과 같은 임의의 유전자 수송 메커니즘을 통하여 세포 안으로 도입될 수 있다. 형질도입된 세포는 그 후 세포 또는 조직 형태에 대한 표준 방법에 따라 피험자에게 (예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 담체로) 주입되거나 동위적으로 이식될 수 있다. 피험자 내로의 다양한 세포의 이식 또는 주입에 대한 표준 방법들은 공지되어 있다.

C. 조성물을 만드는 방법

본원에 개시되어 있는 조성물 및 개시되어 있는 방법을 수행하는데 필요한 조성물은 특별히 언급하지 않는 한 특정 시약 또는 화합물에 대하여 당업자들에게 공지되어 있는 임의의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다.

1. 핵산 합성( Nucleic Acid Synthesis )

자연적으로 생성된 뉴클레오티드 및 포스포디에스테르 결합을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수 있거나, 주형으로서 적절한 폴리뉴클레오티드를 사용하는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 이에 비해, 뉴클레오티드 유사체 또는 포스포디에스테르 결합이 아닌 공유 결합을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 비록 T7 폴리머라아제와 같은 효소가 어떤 형태의 뉴클레오티드 유사체를 폴리뉴클레오티드 내로 혼입시킬 수 있다 할지라도 일반적으로 화학적으로 합성될 것이며, 적절한 주형으로부터 재조합적으로 이와 같은 폴리뉴클레오티드를 생산하는데 사용될 수 있다(Jellinek et al., Biochemistry 34:11363-11372 (1995)).

예를 들어, 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산은 표준 화학 합성 방법을 사용하여 만들어질 수 있거나, 효소적 방법 또는 임의의 다른 공지의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 이와 같은 방법은 오직 예를 들어, Milligen 또는 Beckman 시스템 1Plus DNA 합성장치(synthesizer)(예를 들어, 밀리건-바이오리서치(Milligen-Biosearch)의 Model 8700 자동화 합성장치(Model 8700 automated synthesizer)(Burlington), MA 또는 ABI Model 380B)를 사용하는 시아노에틸 포스포라미디트(cyanoethyl phosphoramidite) 방법에 의한 합성 방법에 대하여 표준 효소적 분해(enzymatic digestion)에서 뒤이어 뉴클레오티드 단편 분리에까지 걸쳐있을 수 있다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chapters 5, 6을 참조). 올리고뉴클레오티드를 만드는데 유용한 합성 방법은 또한 Ikuta 등에 의해 기재되어 있다(Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), (phosphotriester and phosphite-triester methods), and Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (phosphotriester method). 단백질 핵산 분자는 Nielsen 등에 기재되어 있는 것들과 같은 공지의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다(Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994).

2. 펩티드 합성( Peptide Synthesis )

SEQ ID NO:23과 같은 개시되어 있는 단백질을 생산하는 하나의 방법은 단백질 화학 기술에 의해 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 함께 연결시키는 것이다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 현재 이용가능한 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)) 또는 Boc(tert-부틸옥시카르보닐(tert-부틸옥시카르보닐(tert-butyloxycarbonyl)) 화학 중 어느 하나를 사용하는 실험실 기기를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). 당업자들은 개시되어 있는 단백질에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 예를 들어, 표준 화학 반응에 의해 합성될 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 그것의 합성 수지(synthesis resin)로부터 합성되고 분리되지 않을 수 있지만, 펩티드 또는 단백질의 다른 단편은 수지로부터 합성된 후 분리될 수 있고, 그렇게 함으로써 다른 단편 상에서 기능적으로 차단된 말단기(terminal group)가 노출된다. 펩티드 축합 반응(peptide condensation reaction)에 의하여, 이들 두 개의 단편은 항체 또는 그것들의 단편을 형성하기 위하여 각각 그것들의 카르복실 및 아미노 말단에서 펩티드 결합을 통하여 공유적으로 결합될 수 있다(Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY, 적어도 펩티드 합성에 관련된 물질에 대한 참고문헌으로서 본원에 통합되어 있음). 대안적으로, 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에 기재되어 있는 것과 같이 생체 내(in vivo)에서 독립적으로 합성된다. 일단 분리되면, 이들 독립된 펩티드 또는 폴리펩티드는 유사한 펩티드 축합 반응을 통하여 펩티드 또는 그것들의 단편을 형성하기 위하여 결합될 수 있다.

예를 들면, 클론된 또는 합성 펩티드 분절의 효소적 접합(ligation)은 상대적으로 짧은 펩티드 단편이 더 큰 펩티드 단편, 폴리펩티드 또는 완전 단백질 도메인을 생성하도록 연결되게 할 수 있다(Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). 대안적으로, 합성 펩티드의 천연 화학적 접합(native chemical ligation)이 더 짧은 펩티드 단편으로부터 더 큰 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성적으로 구성하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 두 단계의 화학적 방법으로 이루어진다(Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). 첫 번째 단계는 초기 공유결합 생성물로서 티오에스테르-결합 중간생성물을 얻기 위한, 아미노-말단 Cys 잔기를 포함하는 다른 비보호된 펩티드 분절과 비보호된 합성 펩티드-티오에스테르의 화학선택적 반응(chemoselective reaction)이다. 반응 조건에의 변경없이, 이 중간생성물은 접합 부위에서 천연 펩티드 결합을 형성하기 위하여 자발적이며(spontaneous), 빠른 분자 내 반응을 겪는다(Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).

대안적으로, 비보호된 펩티드 분절은 화학적으로 결합되며, 화학적 접합의 결과로서 펩티드 분절 사이에 형성된 결합은 비자연적(비-펩티드성) 결합이다(Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). 이 기술은 단백질 도메인의 유사체뿐만 아니라 완전한 생물학적 활성을 가지는 수많은 상대적으로 순수한 단백질을 합성하는데에도 사용되어 왔다(deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)).

D. 키트( Kits )

상기 기재된 물질들뿐만 아니라 다른 물질들 또한 개시되어 있는 방법을 수행하거나 수행하는데 도움을 주는데 유용한 키트로서 임의의 적절한 조합으로 함께 패키징될 수 있다. 주어진 키트에 있는 키트 성분들이 개시되어 있는 방법과 함께 사용하도록 설계되고 개조된다면 유용할 것이다. 예를 들어, DR3 또는 TL1A와 결합하는 펩티드 또는 항체를 포함하는 키트가 개시되어 있다.

E. 용도( Uses )

상기 개시되어 있는 조성물은 검색 도구(research tool)로서 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들면, SEQ ID NO:2 또는 4를 포함하는 분리된 폴리펩티드와 같은 상기 개시되어 있는 조성물은 예를 들어, 결합의 억제인자로서 작용함으로써, DR3 또는 TL1A 사이의 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있다. 다른 용도들 또한 개시되어 있으며, 개시에 의해 분명히 드러나 있고/있거나 당업자들에게 이해될 것이다.

F. 정의( Definitions )

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 개시되어 있는 방법과 조성물이 속하는 기술 분야에서 당업자들에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 방법 및 조성물을 실행하거나 시험하는데 사용될 수 있으나, 특히 유용한 방법, 기구 및 물질은 기술된 바와 같다. 본원에 인용된 간행물 및 그것들이 인용된 자료들은 본원에 특별히 참고문헌으로서 인용되어 있다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 개시를 소급시킬 권한이 부여되지 않음을 인정하는 것으로 해석되지 않는다. 어떠한 참고문헌들도 선행기술인 것으로 인정하지 않는다. 참고문헌의 토의(discussion)는 저자가 주장하고 있는 것이 무엇인가를 명시하고 있으며, 출원인은 언급된 문헌의 정확성과 적절성에 이의를 제기할 권리를 가지고 있다.

첨부된 청구항과 본 명세서에 사용된 것으로서, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 그 내용을 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 참고문헌을 포함한다는 것에 유의하여야 한다. 따라서, 예를 들어 "약제학적 담체"에 대한 언급은 수많은 이러한 약제학적 담체를 포함하며, "약제학적 담체"에 대한 언급은 하나 또는 그 이상의 약제학적 담체 및 당업자들에게 공지되어 있는 그것들의 동등물 등에 대한 언급이다.

"선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 바로 뒤에 기재된 사건, 상황 또는 물질이 발생하거나 발생하지 않거나 존재할 수 있다는 것을 의미하며, 기재(description)는 상기 사건, 상황 또는 물질이 발생하거나 존재하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않거나 존재하지 않는 경우의 예를 포함한다는 것을 의미한다.

본원에서 범위는 "약(about)"의 한 특정 값 및/또는 내지 "약"의 다른 특정 값으로서 표현할 수 있다. 그러한 범위를 표현하는 경우, 다른 구체예는 한 특정 값 및/또는 내지 다른 특정 값을 포함한다. 유사하게는, 선행사 "약"의 사용에 의해 값이 근사치로 표현되는 경우, 특정 값은 또 다른 구체예를 이룬다는 것이 이해될 것이다. 상기 범위 각각의 종결점은 다른 종결점과 관련되거나, 다른 종결점과 독립적으로, 또는 상기 둘 모두의 측면에서 유의미하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 본원에는 수많은 값들이 개시되어 있으며, 각각의 값은 또한 본원에서 값 그 자체뿐만 아니라 "약"의 그 특정 값으로 개시된다는 것 또한 이해될 것이다. 예를 들어, 만약 값 "10"이 개시된다면, "약 10" 또한 개시된다. 값이 개시되는 경우, 당업자들에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이, "그 값보다 작거나 같은 것(less than or equal to the value)", "그 값보다 크거나 같은 것(greater than or equal to the value)" 및 값들 사이의 가능한 범위 또한 개시된다는 것이 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 만약 값 "10"이 개시된다면, "10보다 작거나 같은 것"뿐만 아니라 "10보다 크거나 같은 것" 또한 개시된 것이다. 출원서 전체에 걸쳐서 데이터는 다수의 서로 다른 포맷으로 제공되며, 이 데이터는 종결점과 시작점, 및 그 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 범위를 나타낸다는 것이 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 만약 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 "15"가 개시된다면, 그것은 10 및 15보다 큰, 그보다 크거나 같은, 그보다 작은, 그보다 작거나 같은 및 그것과 같은 것뿐만 아니라, 10 및 15의 사이 또한 개시된 것으로 고려된다. 두 개의 특정 유닛 사이의 각 단위 또한 개시된다는 것도 이해될 것이다. 예를 들어, 만약 10 및 15가 개시된다면, 11, 12, 13 및 14 또한 개시된 것이다.

기재 및 이 명세서의 청구항에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)" 및 그것의 변형들("comprises" 및 "comprising")은 예를 들어, 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 "포함하지만 이로 제한되지 않으며", "그것을 배제하고자 하는 의도가 아님"을 의미한다.

"프로브(probe)"는 전형적으로 서열 특이적 방식, 예를 들어 혼성화(hybridization)를 통하여 표적 핵산과 상호작용할 수 있는 분자이다. 핵산의 혼성화는 당업계에 잘 알려져 있으며 본원에도 논의되어 있다. 전형적으로, 프로브는 당업계에서 이용할 수 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 또는 유사체의 임의의 조합으로 만들어질 수 있다.

"프라이머(primer)"는 몇몇 형태의 효소적 조작을 도울 수 있고, 효소적 조작이 발생할 수 있도록 표적 핵산과 혼성화될 수 있는 프로브의 서브셋이다. 프라이머는 효소적 조작을 방해하지 않는 당업계에서 이용할 수 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 또는 유사체의 임의의 조합으로 만들어질 수 있다. 전형적으로, 프라이머는 폴리뉴클레오티드 서열의 신장(extension)을 돕는다.

"피험자(subject)"는 동물, 식물, 세균, 바이러스, 기생충 및 임의의 다른 생물 또는 핵산을 가지는 독립체(entity)를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 상기 피험자는 척추동물(vertebrate), 더욱 특별하게는 포유동물(예를 들어, 인간, 말, 돼지, 토끼, 개, 양, 염소, 비인간 영장류, 젖소, 고양이, 기니아피그 또는 설치류), 생선, 새 또는 파충류 또는 양서류일 수 있다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 수컷 또는 암컷의 여부에 관계없이, 성숙한 그리고 갓 태어난 피험자뿐만 아니라 태아 또한 포함되는 것으로 의도된다. 환자(patient)는 질병 또는 질환으로 고통받는 피험자를 말한다. 상기 용어 "환자(patient)"는 인간 및 가축 피험자를 포함한다.

본원에 정의된 것으로서, "샘플(sample)"은 생물로부터 얻어진 임의의 샘플을 말한다. 생물학적 샘플의 예는 체액(body fluid) 및 조직 견본(tissue specimens)을 포함한다. 샘플의 공급원(source)은 혈액(blood), 혈청(serum), 혈장(plasma), 모유(breast milk), 고름(pus), 조직 스크래핑(tissue scraping), 세척액(washing), 소변(urine), 배설물(feces), 눈물(tears), 림프(lymph), 담즙(bile), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 세포 간질액(interstitial fluid), 수양액(aqueous humor) 또는 유리액(vitreous humor), 초유(colostrum), 가래(sputum), 양수(amniotic fluid), 침(saliva), 항문(anal) 및 질(vaginal) 분비물(secretions), 땀(perspiration), 정액(semen), 누출액(transudate), 삼출액(exudate) 및 윤활액(synovial fluid), 및 림프절(lymph nodes), 비장(spleen) 등과 같은 조직을 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, "차단된(blocked)"은 상호작용, 예를 들어 리간드와 그것의 수용체 간의 상호작용(예를 들어, 결합)의 완전한 또는 부분적 억제를 의미할 수 있다. 억제된 결합은 정상적인 결합의 정상적인 후속 효과(downstream effects)의 측정을 통하여 검출될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, "치료(treatment or treating)"는 질환을 가지는 피험자에게 조성물을 투여하는 것을 의미하며, 여기에서 상기 질환은 임의의 병리학적 질병, 암 또는 염증성 질환일 수 있다. 피험자에의 투여의 효과는 상기 질환의 증상의 감소, 상기 질환의 심각도(severity)의 감소 또는 상기 질환의 완치(complete cessation)일 수 있으나 이로 제한되지 않는다.

"예방(prevent)"은 TL1A과 DR3의 상호작용과 관련된 질병 또는 질환(예를 들어, T 세포 성분에 대한 자가면역성 질병)이 발병하기 쉬운 소인을 가지는 피험자가 질병 또는 질환에 걸릴 가능성을 최소화시키는 것을 의미한다.

이 명세서에 전반에 다양한 간행물들이 언급되어 있다. 이들 간행물의 개시 그 전체가 그것이 속하는 기술 분야의 기술적 수준을 더욱 완벽하게 설명하기 위하여 이 명세서에 참고문헌으로 통합되어 있다. 개시되어 있는 참고문헌은 또한 참고가 필요한 문장에서 논의되는 것들이 포함된 물질에 대하여 본원에 참고문헌으로 개별적이고 특별하게 통합된다.

G. 실시예( Examples )

하기 실시예들은 본원에 청구된 화합물, 조성물, 물건, 기구 및/또는 방법들이 어떻게 만들어지고 평가되는지에 대한 완벽한 서술과 기재를 당업자에게 제공하도록 하기 위한 것이며, 단지 설명을 위하여 제공되는 것일 뿐, 서술을 한정하고자 하는 것은 아니다. 수치(예를 들어, 양, 온도 등)에 관한 정확도를 보장하기 위하여 노력하였으나, 약간의 오류 및 편차는 설명되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부분(parts)은 중량부(parts by weight)이고, 온도는 ℃이거나 주위 온도(ambient temperature)이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.

1. 실시예 1:

내피세포 외에도, TL1A는 myd88-의존성 방식으로 TLR4 또는 TRL11을 통한 자극 후 수지상 세포(dendritic cells)로부터 빠르게 상향조절되고 분비되며, 또한 부분적으로는 CD40L-CD40 상호작용을 통하여 활성화된 T 세포에 의해 유도될 수 있다. T 세포 그 자체는 지연된 동역학(delayed kinetics)으로 활성화된 후 TL1A를 상향조절한다. 외인성 및 내인성 TL1A는 미접촉 T 세포 증식과 DR3를 통한 사이토카인 생성을 공자극(costimulate)할 수 있다. 분화된 작용 세포(effector cells)에 의한 사이토카인 생성은 DR3-결손 T 세포에서는 비효율적이지만, 수지상 세포의 강한 자극 또는 그것의 존재에 의해 대체로 극복될 수 있다. 생체 내에서, DR3-결손 마우스는 EAE 및 천식 모델에서 T-세포 의존성 면역 병리에 결손을 나타내지만, 전신성 T 세포 극성화(systemic T cell polarization) 및 작용 인자 기능은 보존된다. 따라서, DR3는 사이토카인 생성 및 염증이 생긴 조직에서의 면역 병리에 특이적인 강화 인자(potentiator)로서 작용하며, 그리고 그러한 것은 T-세포 매개성 자가면역성 질병의 치료를 위한 표적을 제시한다.

골수성 수지상 세포(myeloid DC)는 빠르게 수용성 TL1A를 생성한 후, TLR 및 Myd88 의존성 방식 모두로 선천성 면역 자극(innate immune stimuli)을 일으키지만, T 세포는 더 적은 양의 TL1A를 더욱 느리게 생성하며, T-세포 유래 TL1A는 상층액으로 스며들지 않는다. 외부적으로 첨가되거나 수지상 세포에 의해 생성되지만 T 세포 단독은 아닌 TL1A는 미접촉 T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 공자극할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 차선적인 조건하에서 사이토카인 생성의 효율은 영향을 받긴하지만, Th1 및 Th2 작용 세포(effector cell)로의 분화는 DR3에 의존하지 않는다. 생체 내에서, DR3-결손 T 세포는 비장과 림프절에서 사이토카인을 생성할 수 있는 작용 세포로 분화된다. 그러나, DR3-결손 마우스는 염증 부위에서 작용 사이토카인(effector cytokines)의 생성이 감소된, 두 가지 별개의 T-세포 의존성 자가면역(autoimmunity) 모델에 저항성이 있다. TL1A-DR3 상호작용은 따라서 T-세포 매개성 면역병리의 원인이 되는 표적 조직에서의 작용 T 세포 기능을 증가시킨다.

a. T 세포와 수지상 세포에서의 TL1A 의 차별적 유도

인간 말초 혈액 단핵구(human peripheral blood mononuclear cells, PBMC)가 T 세포 수용체에 대한 항체로 활성화될 때, TL1A mRNA의 빠르고 극적인 상향조절이 일어나며, ~1000배의 유도에서는 6 시간에 최대값을 나타내었다(도 1d). 그러나, T 및 B 세포가 말초 혈액으로부터 정제되고 단독으로 활성화되는 경우, TL1A 상향조절은 더욱 느려지며, 100배의 유도 미만에서는 48시간에 최대값을 나타내었다. 이것은 비림프구성 항원 제시 세포(non-lymphocyte antigen presenting cell)가 초기 활성화 동안 T 세포에 대한 TL1A의 주요 공급원일 수 있음을 나타낸다. 정제된 마우스 비장 유래 및 골수 유래 CD11c⁺ 수지상 세포, TL1A mRNA는 LPS에 의해 빠르게 상향조절되고, 3시간에 최대값을 나타내며, 12시간 만에 기준치(baseline)로 돌아왔다(도 1a). 좀 더 상세하게는 TL1A를 유도하는 자극에 노출시키기 위하여, 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii, STAg)로부터 유래된 기생충 유래 면역촉진 분자(immunostimulatory molecules)인 타키조이트(tachyzoite) 항원 및 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni)로부터 유래된 주혈흡충란 항원(schistosoma egg antigen, SEA)을 사용하여, 각각 Th1 및 Th2 반응을 위한 T 세포를 준비하는 차별적인 수지상 세포 활성화 프로그램을 만들었다. 수지상 세포는 STAg로 자극되지만 SEA로는 자극되지 않으며, LPS와 유사한 역학으로 TL1A mRNA를 강력하게 상향조절한다(도 1a 중간 패널). 24시간 후에도, SEA는 TL1A를 유도하지 않았다(오른쪽 패널). 다양한 녹아웃 마우스로부터 유래된 수지상 세포를 이용한 실험들은 TL1A 유도가 Myd88 및 TIRAP에 의존적이며, TL1A의 LPS-유도는 TLR-4-의존적이라는 것을 보여주었다(도 1b). 고도 정제된 마우스 T 세포가 TCR을 통해 활성화될 때, 유사한 TL1A 상향조절은 인간 T 세포에서 볼 수 있는 지연된 역학(delayed kinetics)을 보였다(도 1c). 이들 데이터는 다른 TNF-패밀리 멤버들과 같이, TL1A도 TLR 및 Myd88/TIRAP 의존성 신호전달 경로를 통하여 수지상 세포에서 급격하게 상향조절된다는 것을 나타낸다. DC-유래 TL1A는 T 세포 활성화의 초기 단계(initial phase)를 조절할 수 있을 것이지만, T 세포는 T 세포 확대(expansion) 및 분화(differentiation)의 마지막 단계에 영향을 줄 수 있는 TL1A를 더욱 느리게 상향조절한다.

b. TL1A 는 DR3 를 통하여 CD4 + T 세포에서의 증식 및 사이토카인 생성을 공자극한다 .

외인성 TL1A는 이미 T 세포를 공자극한다는 것을 보여주었으나, 이것이 DR3에 의존하든 의존하지 않든 간에 내인적으로 생성된 TL1A가 성숙한 T 세포 활성화에 어떠한 역할을 하는지는 아직 연구되어 있지 않다. 이를 연구하기 위하여, 야생형(wild-type, WT) C567B1/6 또는 동유전자형(isogenic) DR3 녹아웃(knockout, KO) 마우스의 비장 및 림프절로부터 CD4+ T 세포를 정제하고, 재조합 마우스 TL1A의 존재 또는 부재하에 활성화시켰다. 다른 TNF 패밀리 멤버에 의한 공자극은 CD28 매개성 공자극이 차단될 때 최대가 되는 것으로 보였다(Croft, 2003). 외인적으로 첨가된 TL1A는 T 세포 증식을 지속적으로 증가시켰으며, 이 효과는 CD28 매개성 공자극의 부재하에 더욱 명백해졌다(도 1a). 이중의(dual) CD3/CD28 가교(crosslinking)로, TL1A는 단지 적은 양의 항-CD3에서만 증식을 공자극하였다. 중요하게는, DR3 KO 세포는 TL1A에 대하여 완전하게 반응이 없었으며, 이는 DR3가 TL1A에 의한 공자극을 매개하는 주요 수용체라는 것을 나타낸다. 또한, ConA에 대한 그것들의 이전에 보고된 정상적인 증식과 비슷하게(Wang et al., 2001), WT와 DR3 KO 마우스로부터 정제된 T 세포는 공자극을 하거나 하지않거나 항-CD3에 대한 반응과 유사하게 증식되었다(도 2a). TL1A에 의해 유발된 티미딘 혼입의 증가가 증가된 세포 주기 때문인지 세포 생존 때문인지를 확인하기 위하여, CFSE 희석(CFSE diluton) 실험을 유사한 조건하에서 수행하였다. 티미딘 혼입 데이터에 따르면, 외인성 TL1A는 특히 CD28 신호전달의 부재하에, 증가된 세포 주기를 반영하는 CFSE 희석이 현저하게 증가되었다(도 2b). 이 실험에서 TL1A에 대한 세포의 생존 능력에는 어떠한 변화도 검출되지 않았다.

TL1A에 의해 공자극될 수 있는 사이토카인의 스펙트럼을 연구하기 위하여, 재조합 TL1A의 존재 또는 부재하에 활성화된 WT 또는 DR3 KO T 세포에서 DR3, IL-2, 인터페론-γ 및 IL-4의 생성으로 사이토카인 생성의 의존성을 측정하였다. TL1A는 WT에서 IL-2 생성, 인터페론-γ 생성 및 IL-4 생성을 증가시켰지만, CD28으로 활성화되거나 활성화되지 않은 DR3 KO 세포에서는 그렇지 않았다. TL-4는 TL1A에 의해 대략 10배 정도 증가한 가장 현저하게 유도된 사이토카인인 반면, IL-2 및 인터페론-γ는 2배보다 적게 증가되었다. 따라서, 증식성 반응(proliferative response)에서와 마찬가지로, DR3는 TL1A 신호전달의 주요 매개체(mediator)이며, 내인적으로 생성된 T-세포 유래 TL1A는 이들 조건하에서 활성화된 T 세포에 의한 사이토카인의 생성에 필요하지 않다. TL1A에 의해 유도된 증식이 증가된 IL-2 생성 때문인지를 알아내기 위하여, TL1A의 존재 또는 부재하에 T 세포 활성화 동안 항-CD25 차단 항체를 첨가하였다. CD25의 차단은 TL1A에 의해 유도되는 증가된 증식의 대부분을 차단하였지만, 몇몇의 IL-2 의존성 증식은 여전히 볼 수 있었고, 이는 TL1A에 의해 유도된 공자극이 적어도 IL-2 생성의 증가에 부분적으로 의존한다는 것을 나타낸다(도 2b).

정제된 DR3 결손 T 세포가 증식 반응 또는 사이토카인 생성에 큰 결점을 가지지 않기 때문에, T 세포에 의해 생성된 TL1A는 이들 작용에 있어서 필수적인 것으로 보이지는 않는다. 따라서, 동족의(cognate) DC-T 세포 상호작용 동안 수지상 세포에 의해 생성된 TL1A는 T 세포 공자극을 위한 TL1A의 더욱 적절한 공급원일 것이다. 이를 시험하기 위하여, 오브알부민(Ovalbumin, Ova)-특이적 TCR 형질전환 계통 OT-Ⅱ으로 교배된 DR3 WT 또는 KO 마우스를 이용하여 실험을 수행하였다. 정제된 DR3 결손 세포를 C57B1/6 골수 유래 수지상 세포 및 동족의 Ova 펩티드와 공배양하였다. 이들 조건하에서, DR3 KO 세포의 증식은 특히 CTLA4-Ig 차단과는 상관없이 낮은 농도의 Ova 펩티드의 존재하에서 줄어들었다(도 3a). OT-Ⅱ T 세포에 의한 사이토카인 생성은 많은 양은 IFN-γ 생성에 유리하며, 낮은 양은 IL-4 생성에 유리함에 따라 항원의 양에 의존하는 것을 특징으로 한다. DR3 KO OT-Ⅱ 세포는 적은 양의 Ova에서는 대략 50% 적은 IL-2를 생성하고, 테스트된 전체 양의 Ova에서는 적은 양의 IL-4를 생성하였다. 따라서, 수지상 세포에 의해 생성된 내인성 TL1A는 이 공자극성 TNF 패밀리 멤버의 생리학적으로 중요한 공급원일 가능성이 있다.

c. DR3 KO T 세포는 시험관 내에서 극성화될 때 TH2 분화가 감소된다 .

T 세포 분화의 마지막 단계에 대한 TL1A-DR3 상호작용의 중요성을 연구하기 위하여, 두 가지 형태의 T 세포 분극화 검정법으로 작용 사이토카인 생성에 대하여 DR3-결손 T-세포를 테스트하였다. WT 또는 DR3 KO 마우스로부터 정제된 T 세포를 TH2 극성화를 위한 IL-4 및 항-IFNγ 또는 TH1 극성화를 위한 IL-2 및 IL-4 중 어느 하나로 활성화시켰다. 정제된 T 세포가 활성화 및 극성화 5-6일 후 재자극된 경우, T 세포가 TCR을 통하여 재자극된 경우 IFNγ 및 IL-4를 생성하는 세포의 비율은 현저하게 부족하였다. 그러나, PMA/이오노마이신의 조합은 이들 사이토카인이 정상적으로 생성되게 할 수 있었다(도 4a). 흥미롭게도, TGF 베타, IL-1, IL-6, TNF, 및 IL-4와 IL-2의 차단의 조합에 의한 이 작용인자 형태에 대하여 극성화된 T 세포에 의한 IL-17 생성은 최초 활성화 72시간 후 및 CD3/28을 이용한 재자극 후 상층액에서 측정되지 않았다. PMA/이오노마이신 자극은 사이토카인 분비 결함을 우회하는 것으로 보이므로, DR3 KO 세포에서의 결함은 T 세포 분화 그 자체라기보다는 TCR 유도성 사이토카인 분비에 있을 수 있다. T 세포 분화가 DR3의 부재하에서 온전할 수 있는지를 확인하기 위하여, 각각 Th1 및 Th2 세포 분화를 프로그래밍하는 표준 전사인자(canonical transcription factors)인 T-bet 및 GATA-3의 레벨을 측정하였다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, Th1 세포로 분화되도록 극성화된 DR3 KO T 세포에서의 T-bet의 유도는 정상적이었으며, Th2 조건 하에서의 GATA-3 유도에는 단지 약간의 장애가 있었다. 따라서, DR3는 특정 T 세포 서브셋으로 분화하기 위한 T 세포 프로그래밍에서보다는 사이토카인의 생성에 더 중요한 것으로 나타났다. TL1A가 수자상 세포에 의해 제공되는 경우도 이 경우에 해당하는지를 확인하기 위하여, DR3 KO x OTⅡ 마우스 유래 T 세포 또는 OTⅡ 대조군을 외인성 사이토카인 또는 기생충 유래 항원 SEA 또는 STAg의 영향하에 생성된 내인성 인자에 의해 극성화가 유발되는 조건 하에서 항체 및 수지상 세포와 함께 배양하였다. DR3 KO 세포가 STAg 또는 외인성 IL-12 및 항-IL4로 극성화되었을 때, IFNγ에 어떠한 결함도 발견되지 않았다(도 4d). 그러나, SEA의 존재하에서 활성화된 T 세포에서는 IL-4 생성에 현저한 결함이 나타났다. 이것은 외인성 IL-4의 첨가에 의해 해결된다. T 세포 유래 IFNγ를 필요로 하지 않는 STAg 유도성 Th1 극성화와는 달리, SEA에 의한 Th2 극성화는 T 세포 유래 IL-4에 의존하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 관측된 DR3 KO T 세포에 의한 IL-4 생성에서의 결함(도 3b)은 외인성 IL-4의 부재하에서의 Th2 극성화 결함을 설명할 수 있다.

d. DR3 KO 마우스는 Ova 유도성 천식 모델에서 폐 염증이 감소되었다 .

시험관 내 Th2 극성화 결함이 Th2 매개성 질병의 동물 모델에서 중요한가를 확인하기 위하여, DR3 KO 마우스가 Ova 의존성 천식 모델에서 어떻게 반응하는지를 조사하였다. 마우스를 백반(Alum)과 Ova 단백질로 감작시키거나 대조군으로서 백반과 PBS로 감작시킨 후, Ova 단백질 또는 PBS 중 어느 하나를 기관 내(intratracheally) 또는 비강 내(intranasally)로 투여하였다. 마지막 투여 이틀 후 마우스를 희생시켰다. 조직학은 DR3 KO 마우스의 폐가 WT 마우스보다 뮤신(mucin)을 적게 생성하며, 또한 더 적은 기관지주위세포침윤(peribronchial cuffing)을 나타낸다는 것을 보여주었다(도 5a). DR3 KO의 폐에 대한 조직병리 스코어(histopathology score) 또한 야생형의 폐와 비교하여 감소되었다(도 5b). 게다가, DR3 KO의 폐에서의 염증은 야생형의 폐에서의 전형적인 호산구성 침윤(eosinophilic infiltrates)과는 대조적으로 대부분 림프구성(lymphocytic)이었다. 다음으로, 폐에서의 서로 다른 사이토카인의 mRNA 레벨을 측정하였다. DR3 KO의 폐에서는 점액 생성을 반영하는 IL-13의 감소가 나타났고, 야생형의 폐와 비교하여 폐에서 IL-5가 감소하였다(도 5c). 게다가, 비장의 Ova 특이적 재자극이 영향을 미치는지의 여부를 알아내었다. 흥미롭게도, 폐에서 관찰된 사이토카인 mRNA 레벨과는 대조적으로, 여기에는 사이토카인의 생성에 어떠한 차이도 없었으며, 이것은 더욱 국부적인 영향(local effect)이라는 것을 암시한다. 게다가, WT 및 DR3 KO 마우스의 T 세포 증식 사이에는 어떠한 차이도 없었다. 혈청 내에 존재하는 IgG1의 레벨 또한 측정하였다. WT 및 DR3 KO 마우스 사이의 IgG1, IgG2 혈청 레벨, 특히 Ova 특이적 IgG1 레벨(도 5d)에는 어떠한 차이도 없었으며, 이는 병적 측면에서 더욱 국부적인 영향이라는 것을 암시한다. IgG1 생성은 PBS 처리된 마우스와 비교하여 DR3 KO 마우스에서 Ova 유발 후에 증가된다는 사실은 (시험관 내 극성화로부터 얻은 데이터) 그보다 정도가 덜할지라도 T 세포가 반응하여 분화할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 국부 염증의 감소는 면역 반응의 마지막 단계에의 결함 때문일 수 있다.

e. DR3 KO 마우스는 EAE 에 덜 걸린다.

DR3 KO 마우스의 천식 모델에서는 TH2-T 세포 매개성 병증(pathology)이 감소되며, 이는 시험관 내 TH2 분화의 감소와 관련이 있으므로, DR3 KO 마우스가 TH1/TH17 매개성 질병에 어떻게 반응하는지를 조사하였다. 이를 위하여, 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)-유도성 EAE 마우스 모델을 사용하였다. DR3 KO 마우스는 MOG 주사 약 1주 후 임상적인 병증이 발생하는 WT 마우스와 비교하여 지연되고 감소된 EAE 병증을 나타내었다(도 6a). 이것은 DR3 KO 마우스가 전적으로 다른 사이토카인에 의존하는 질병 모델에서 감소된 병증을 보임을 나타내는 것이다. 게다가, Ova-천식 모델과 유사하게, 비장 및 림프절 유래 T 세포의 MOG-재자극은 손상되지 않았다(도 6b). 이것은 또한 DR3/TL1A 결손의 전반적인 효과가 전신적이라기보다는 더욱 국부적일 수 있음을 나타낸다. 몇몇의 최근 보고들은 IL-17 생산 세포와 같은 작용 T 세포의 추가적인 서브셋이 면역 반응 동안 생성된다는 것을 보여준다. 이 IL-17 생산 세포의 집단은 TH1 사이토카인을 생산하는 작용 세포라기보다는 TH1 매개성 질병에 있어서 병원성의 원인이 되는 것으로 생각된다. 따라서, IL-17 생산 세포가 뇌, 비장 및 림프절, 척수로부터 채취한 조혈 세포(hematopoietic cells)에 어느 정도까지 존재하는가를 확인하기 위하여, IL-17과 IFNγ로 세포 내 염색을 하기 전 PMA/이오노마이신으로 6시간 동안 자극하였다. WT 마우스와 비교하여 DR3 KO 마우스의 CNS에 존재하는 IL-17 생산 세포가 감소되었다. 게다가, DR3 KO 마우스는 WT 마우스보다 CNS에 2배 더 많은 T 세포를 가진다. 그러나, 비장 또는 림프절에는 어떠한 차이도 없었다.

2. 실시예 2:

i. 결과

a. TL1A 는 CD4 + T 세포에서 DR3 를 통하여 증식과 사이토카인 생성을 공자극한다

외인성 TL1A는 인간과 마우스의 T 세포를 공자극할 수 있지만, DR3가 TL1A에 대한 유일한 공자극성 수용체(costimulatory receptor)인지의 여부와 내생적으로 생성된 TL1A가 성숙한 T 세포 활성화에 어떤 역할을 하는지는 알려져 있지 않다. 이를 조사하기 위하여, 야생형 또는 C57BL/6 백그라운드를 가지는 연령과 성별이 같은 DR3 녹아웃(DR3^-/-) 마우스의 비장 및 림프절로부터 CD4⁺ T 세포를 정제하고, 그것들을 재조합 마우스 TL1A의 존재 또는 부재하에 TCR을 통하여 활성화시켰다(Wang et al., 2001) . 다른 TNF 패밀리 멤버에 의한 공자극은 CD-28 매개성 공자극이 차단되었을 때 최대가 되는 것으로 나타났다(Croft, 2003). TL1A 또한 CD28-매개성 공자극의 부재하에 가장 극적으로 T 세포 증식을 증가시켰다(도 8a). CD28-매개성 공자극이 존재하는 경우, TL1A는 단지 적은 양의 항-CD3에서만 증식을 공자극하였다(도 8a). 증가된 티미딘 혼입은 증가된 세포 분열(cell division) 때문이며, CFSE 희석이 증가하였으므로 생존을 증가시키지는 않았고, TL1A에 의해 유도된 세포 생존율(cellular viability)에 어떠한 현저한 변화도 관찰되지 않았다. 중요하게는, DR3^-/- 세포는 TL1A에 반응이 없었으며, 이는 DR3가 TL1A에 의한 공자극을 매개α하는 주요 수용체임을 나타내는 것이다(도 8a). 그러나, 정제된 DR3^-/- T 세포의 배양에서 증식에 결손은 없었으므로, 내인성 T 세포 유래 TL1A를 통한 DR3의 자극은 T 세포 증식에 불필요한 것으로 보인다(도 8a). TL1A 공자극은 TL1A 유도성 증식이 길항적 항-IL-2Rα 항체의 첨가 후 IL-2 결손 T 세포를 크게 감소시키기 때문에 증가된 IL-2 생성에 크게 의존한다(도 8b).

TL1A에 의해 공자극될 수 있는 사이토카인의 스펙트럼을 조사하기 위하여, DR3, IL-2, IFNγ 및 IL-4 생성에서 사이토카인 생성의 의존성을 재조합 TL1A의 존재 또는 부재하에 활성화된 WT 또는 DR3^-/-의 T 세포에서 측정하였다. TL1A는 WT에서는 IL-2, IFNγ 및 IL-4의 생성을 증가시켰지만, DR3^-/- T 세포에서는 증가시키지 않았으며, CD28 공자극의 존재하에 TL1A에 의해 가장 두드러지게 유도된 것은 IL-4였다(도 8c). DR3 결손 T 세포는 TL1A에는 반응하지 않지만, 야생형 T 세포와 비교하여 사이토카인 생성에 결손은 없었다. 따라서, 증식 반응과 함께, DR3는 TL1A 유도성 공자극에 필요하지만, 내생적으로 생성된 T 세포 유래 TL1A는 이들 조건하에서 활성화된 T 세포에 의한 사이토카인의 생성에는 필요하지 않다. 활성화 마커 CD25(IL-2Rα) 및 CD69의 상향조절은 특히 활성화 24시간 후에 TL1A에 의하여 강화되지만, 야생형 대조군과 비교하여 DR3 결손 T 세포에서는 활성화 마커 발현에 어떠한 결손도 관찰되지 않았다(도 16). TL1A는 기억(memory)을 공자극하지만 비접촉 T 세포는 아니라는 것이 보고되어 있다(Bamias et al., 2006). 이 조직을 다루기 위하여, CD62hi/CD44lo 비접촉 CD4⁺ T 세포를 WT 및 DR3 결손 마우스로부터 정제하고, 외인성 TL1A를 사용하거나 사용하지 않고 그것들을 활성화시켰다. TL1A는 CD28 공자극의 여부에 관계없이 증식을 약간 증가시켰으며, 또한 DR3-의존적 방식으로 IL-2 및 IFNγ 생성을 강하게 증가시켰고(도 17a, 17b), 이는 DR3가 비접촉 T 세포로 기능할 수 있다는 것을 나타낸다. 기억 표현형(memory phenotype) CD44hi CD4⁺ T 세포의 비율 또한 성별이 동일한 DR3-/- 및 대조군 마우스에서와 동일하였고(도 17c), 이는 분리되지 않은 T 세포의 TL1A 공자극이 기억 및 비접촉 세포의 비율에 차이가 있기 때문인 것 같지는 않다.

b. 수지상 세포는 TLR 과 Fc γR 자극에 반응하여 TL1A 를 생성하고, DR3 를 통하여 T 세포를 공자극할 수 있다

정제된 DR3 결손 T 세포에서의 증식의 결여 또는 사이토카인 생성의 결손은 다른 세포 형태가 TL1A의 생리학적 공급원일 수 있음을 암시한다. TL1A는 다양한 자극 후 인간 수지상 세포 및 단핵구에 의해 생성되며, 수지상 세포는 적절한 시기에 T 세포 공자극을 위한 곳에서 생성된 TL1A의 공급원일 것이라는 것이 보고되어 있다. 이를 테스트하기 위하여, 다양한 약제로 자극된 정제된 비장의 CD11c⁺ 수지상 세포와 골수 유래 수지상 세포에서 TL1A 유전자 발현의 상향조절을 역전사 효소 정량적 PCR(reverse-transcriptase quantitative PCR, RT-qPCR)로 측정하였다. 톨 유사 수용체(Toll-Like receptors, TLR's)를 통하여 작용하며 다른 TNF 패밀리 멤버의 발현을 유도할 수 있는 자극제인, LPS 및 톡소플라스마 곤디 유래의 수용성 타키조이트 항원(STAg)은 TL1A의 빠른 상향조절을 유도하며, 발현은 3시간째에 상기 기준치의 100배까지 최대값을 나타내고 그 후 빠르게 감소하였다(도 9a). 흥미롭게도, Th2 분화를 위한 T 세포를 프로그래밍하기 위하여 수지상 세포의 대안적인 활성화를 촉발시키는 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni)로부터 유래된 주혈흡충란 항원(schistosoma egg antigen, SEA)은 TL1A mRNA를 눈에 띄게 유도하지 못하였다(도 9a, 왼쪽 패널). TLR 신호전달 성분이 결여된 수지상 세포의 자극은 TL1A의 LPS 유도가 MyD88 및 TIRAP에 의존하는 방식으로 TLR4에 의해 매개된다는 것을 보여준다(도 9b). 낮은 친화력의 Fc 수용체를 통하여 작용하는 면역 복합체(immune complex)는 최근 TL1A 생성을 위한 강력한 자극제인 것으로 나타났다(Cassatella et al., 2007; Prehn et al., 2007). 플레이트에 고정된(plate-bound) 가교결합 마우스 Ig(IC) 를 이용한 마우스 수지상 세포의 자극 또한 LPS에 비해 손색이 없을 만큼 TL1A 유전자 발현을 자극하였다(도 9c). 따라서, 다른 TNF 패밀리 멤버들과 같이, TL1A는 수지상 세포에서 TLR과 면역 복합체를 통하여 빠르게 유도될 수 있다. T 세포가 TL1A의 자가분비성 공급원(autocrine source)의 역할을 할 수 있는지를 테스트하기 위하여, 정제된 T 세포를 TCR을 통하여 자극하고, TL1A mRNA 레벨을 RT-qPCR로 측정하였다. TL1A mRNA는 TCR 자극 후 상향조절되었으나, 수지상 세포와 비교하여 지연된 역학을 보였다. 흥미롭게도, DR3 결손 T 세포는 TL1A 유도를 극적으로 감소시켰으나, 활성화 후 IL-2 mRNA는 정상적으로 상향조절한다는 것을 나타냈으므로, TL1A 상향조절은 특히 DR3 발현에 의존적이었다(도 9d). 모두 종합해 보면, 이들 데이터는 T 세포가 그 자신의 발현을 지속시키기 위하여 자가분비성 방식으로 작용하는 TL1A를 생산할 수는 있지만, T 세포 유래의 TL1A는 분리된 T 세포에 의한 증식 또는 사이토카인 생성에 필요하지는 않음을 나타낸다.

T 세포 활성화의 보다 생리학적인 모델에서의 TL1A-DR3 상호작용의 역할을 연구하기 위하여, DR3 결손 마우스를 오브알부민(Ova)-특이적 TCR 형질전환 계통 OT-Ⅱ로 역교배(backcrossed)시키고, DR3^-/- OT-Ⅱ 및 OT-Ⅱ 대조군 마우스 유래의 비접촉 T 세포를 Ova 펩티드 및 야생형 골수 유래 수지상 세포와 함께 배양하였다. 이들 조건하에서, DR3-/- OT-Ⅱ 세포의 증식은 특히 낮은 농도의 Ova에서 줄어들었다(도 10a). Ova 펩티드와 수지상 세포로 자극된 T 세포의 사이토카인 프로파일은 특징적으로 IFNγ 생성에 유리한 고농도(high dose)과 IL-4 생성에 유리한 저농도(low dose)을 포함하는, 항원의 농도에 의존한다(Tao et al., 1997). DR3^-/- OT-Ⅱ 세포는 저농도의 Ova에서 IL-2를 더 적게 생산하며, 테스트된 모든 농도의 Ova에서 더 적은 양의 IL-4를 생산하였다. 그에 반하여, IFNγ의 생성은 테스트된 모든 농도에서 대조군보다 더 높았다(도 10b). T 세포 활성화 마커 발현의 분석은 CD25 및 CD71의 최적 상향조절 또한 낮은 농도의 Ova 펩티드에서 DR3 의존적이었다(도 18). 이들 데이터는 T 세포와 수지상 세포 제시 표준 항원 사이의 상호작용 동안, TL1A-DR3 상호작용이 T 세포 증식 및 IFNγ은 제외한 IL-2, IL-4의 생성을 공자극하도록 작용한다는 것을 나타낸다. DR3 부재하에서의 사이토카인 생성 및 증식에서 이들 변경은 T 세포 극성화에 영향을 줄 수 있다. 이를 테스트 하기 위하여, DR3^-/- 또는 대조군 마우스 유래의 비접촉 CD4⁺ T 세포를 Th1, Th2 또는 Th17 작용 T 세포의 분화에 최적화된 조건 또는 중성 조건하에서 수지상 세포의 존재하에 활성화시키고, 재자극 후 사이토카인 생성을 측정하였다(도 11). 외인성 극성화 자극제의 부재하에서, DR3^-/- T 세포는 C57BL/6 백그라운드에서 예상되는 Th1-IFN-γ 분비 프로파일로의 가벼운 편향화(mild skewing)를 나타내었다. 게다가, 적절한 사이토카인은 극성화된 DR3^-/- 세포를 정상적으로 IL-4, IFN-γ 또는 IL-17 생성 세포로 유도한다. 그 후, 수지상 세포 및 Ova로 자극된 DR3^-/- OP-Ⅱ 및 대조군 OT-II T 세포의 배양을 시작하고, 사이토카인 또는 수용성 타키조이트 항원(STAg)으로 극성화시키고, IL-12를 첨가하여 TL1A 생성을 유도하였다. 이들 조건은 또한 항원 특이적 DR3^-/- T 세포에 의해 정상적인 Th1 편향화(skewing)를 야기하였다(도 11b). 적절한 분화 자극제에 의한 전사 인자 T-bet, GATA-3 또는 RORγ의 유도 또한 DR3^-/- 유래의 정제된 T 세포에 영향을 받지 않는다. 따라서, DR3는 비접촉 T 세포의 Th1, Th2 또는 Th17 작용 세포 서브타입으로의 분화에 불필요한 것으로 나타났다.

c. DR3 는 1차 전신성 T 세포 반응에는 불필요하지만, T 세포 매개성 질병의 동물 모델에서의 면역병리에는 필수적이다.

T 세포 분화에서의 DR3의 역할 및 무손상 면역계(intact immune system)의 작용기능을 알아내기 위하여, 별개의 T 세포 서브셋에 의존하는 질병 모델을 DR3^-/- 마우스로 연구하였다. Ova와 Alum으로 전신성으로 촉발된 Th2 의존성 폐 염증 모델을 먼저 조사한 후, Ova로 국부적으로 유발하였다(Gavett et al., 1994). 3개의 독립적인 실험에서, 조직학적 분석은 DR3^-/- 마우스 폐의 기도(airway)가 뮤신 생성 및 기관지주위세포(peribronchial) 염증을 포함하는 염증을 가짐을 보여주었다(도 12a). 표준 조직병리학 스코어 및 폐기관지세척(BAL)에서의 세포계수(cell counts)는 OVA를 사용하여 유사하게 감작되고 유발된 DR3 WT 마우스와 비교하여 OVA로 감작되고 유발된 DR3^-/- 마우스에서 감소되었다(도 12b). 대조군과 비교하여 Ova로 감작되고 유발된 DR3^-/- 마우스 유래의 폐 세포 제조물에서 CD3⁺와 CD4⁺ T 세포, 글리코스핑고지질(glycosphingolipid)/CD1d 사량체(tetramer)를 인식하는 불변성 Vα14 양성 T 세포(invariant Vα14 positive T cell) 및 호산성 백혈구(eosinophil)의 비율은 모두 현저하게 감소하였다(도 12c). 면역조직화학염색에 의한 Ova-감작된 DR3 결손 마우스로부터의 폐 조직에서 CD3⁺ 세포의 내재화(localization)는 대조군과 비교하여 더 적은 간질성(interstitial) 및 기관지주위성 T 세포를 보였으며, 혈관주위 내재화(perivascular localization)가 증가되었고, 이는 폐에서의 T 세포의 이동 또는 생존 결함(survival defect)을 암시한다. 대식세포(macrophage)에 대하여 혈관주위 침윤에의 유사한 증가가 관찰되었다(도 19). Th-2 매개성 폐 병증에 매우 중요한 IL-5 및 IL-13에 대한 mRNA의 레벨은 DR3^-/- Ova 감작된 폐에서는 현저하게 감소된 반면, IL-10 및 IFN-γ는 동등하게 생성되었다(도 12d). 그와 대조적으로, 이들 마우스로부터 유래된 DR3^-/- 비장 세포가 Ova로 재자극되면, IL-5 및 IL-13은 정상적으로 생성되며, 이는 Ova-특이적 Th2 T 세포의 전신성 촉발(systemic priming)이 DR3와는 관계가 없다는 것을 나타낸다(도 12e). 게다가, DR3^-/- 비장세포(splenocyte)는 Ova에 정상적으로 반응하여 증식된다. Ova 촉발 후 Ova-특이적 IgG1 및 Ova-특이적 IgE의 생성에 의해 평가된 것과 같은 전신성 Th2 기능 또한 DR3^-/- 마우스에서 정상적이었다(도 12f). 따라서, th2-매개성 폐 염증의 이 모델에서, DR3는 Th2 작용 세포를 염증 부위에 축적하는데는 필요하지만 Th2 T 세포의 전신성 분화(systemic differentiation)에는 필요하지 않다. 폐에서의 세포의 감소는 DR3^-/- 폐에서 관찰된 것과 같은 염증 부위로의 호산구성 백혈구 및 iNKT 세포의 결함적 동원(defective recruitment)을 야기할 수 있다.

DR3가 다른 T 세포 서브셋에 의해 매개되는 질병에 필요한지를 알아보기 위하여, Th17- 및 Th1 의존적 자가면역성 질병인 실험적 자가면역성 뇌척수염(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)을 DR3^-/- 마우스로 연구하였다. 4개의 독립된 실험에서, DR3^-/- 마우스는 임상 스코어로 측정된 것과 같이 지연되고 극적으로 감소된 마비(paralysis)를 보였다(도 13a). EAE에 대한 저항에도 불구하고, MOG로 촉발된 DR3^-/- 마우스의 배수 림프절(draining lymph node)로부터의 T 세포는 MOG에 반응하여 정상적으로 증식하였다(도 13b). 척수 균질액(spinal cord homogenate)에서 CD4⁺ T 세포의 비율은 DR3^-/- 마우스에서 현저하게 감소하였다(도 13c). T 세포 관문(gate) 내에서, IFN-γ 생성 세포의 비율은 DR3^-/- 마우스의 척수 유래 T 세포의 2배까지 감소되었다(도 13c). 이 관문 내에서 IL-17 생성 세포의 비율은 DR3-/- 마우스에서는 정상이었지만, 전체적으로는 척수에서의 CD4+ T 세포의 감소된 비율 때문에 여전히 감소되었다. 염증이 생긴 척수에서의 이들 사이토카인의 절대 레벨(absolute level)을 조사하기 위하여, IL-17 및 IFN-γ에 대한 mRNA를 척수 균질액에서 RT-qPCR로 측정하였다. 두 사이토카인 모두 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin)으로 정상화(normalized)될 때 MOG로 촉발된 DR3^-/- 마우스 유래의 척수 균질액에서 감소되었으며, IFN-γ가 가장 영향을 미쳤다. 그러나, T 세포 특이적 유전자 CD3-δ의 발현으로 정상화될 때, DR3^-/- 척수에서 IL-17 및 IFN-γ mRNA 발현은 감소되지 않는다(도 13d). 따라서, DR3는 또한 Ova 유도성 폐 염증 모델보다는 서로 다른 세트의 사이토카인과 관련이 있는 자가면역성 탈수초성 질병(demyelinating disease) 및 DR3-/- 마우스에서 표적 기관에서의 작용 T 세포수의 감소와 관련이 있는 질병에 저항성이 있는 이 모델에 중요하다.

자가면역성 질병에서의 그것들의 역할뿐 아니라, 작용 T 세포도 감염을 조절하는데 중요하다. 마우스가 급성 감염에서 살아남기 위하여 IFN-γ 분비 Th1 세포(IFN-γ secreting Th1 cell)가 필요한 감염인 톡소플라스마증(toxoplasmosis)에서의 DR3 신호전달(signaling)의 역할을 더 조사하기로 결정하였다. 톡소플라스마 곤디로 감염시킨 후, DR3^-/- 뿐만 아니라 대조군 마우스 모두 7주 동안 100% 생존율을 나타내었다. 감염 7주 후 DR3^-/- 감염 마우스로부터 비장 세포를 분리하고, STAg로 자극하였으며, 대조군과 비교하여 상당한 양의 TNFα, IFN-γ 및 IL-10을 생산하였다(도 14). 이들 데이터는 톡소플라스마 곤디에 반응하는 작용 Th1 세포의 촉발 및 유지가 DR3에 의존적이지 않음을 나타낸다.

ii . 실험 절차( Experimental Procedures )

a. 시약 및 마우스

E. coli 유래의 LPS를 시그마(Sigma)로부터 입수하였다. 음파처리한 톡소플라스마 곤디 타키조이트(Toxoplasma gondii tachyzoites)로부터 수용성 타키조이트 Ag(STAg)를 제조하였고, 앞서 기술한 바와 같이 만손주혈흡충란(Schistosoma mansoni)으로부터 주혈흡충란 항원(SEA)을 제조하였다(Grunvald et al., 1996). C57BL/6 마우스를 잭슨 연구소(Jackson Laboratories)로부터 입수하였다. 앞서 기술한 바와 같이 만들어진 DR3^-/- 마우스는 C57BL/6 백그라운드에 대하여 적어도 8 세대로 역교배 되었다(Wang et al., 2001). DR3^-/- 마우스를 OT-Ⅱ TCR 형질전환 마우스로 교잡함으로써 DR3^-/- OT-Ⅱ 마우스를 만들었다. IL-2^-/- 마우스는 미국 국립알레르기감염연구소(NIAID), 푸슈파 판디안(Pushpa Pandiyan)으로부터 기부된 것이다. 모든 항체들은 달리 나타내지 않는 한 BD 파밍겐(BD pharmingen)으로부터 구입하였다. Vα14iNKT T 세포를 인식하는 CD1d/PBS57 사량체는 NIH 사량체 핵심 시설에 의해 제조되었다.

b. 세포 제조 및 정제

CD11c⁺의 고발현을 위해 MoFlo 초고속 유세포 분리장치(MoFlo FACS sorter)(Dako Carpenteria, CA)에서 리베라아제로 분해된(liberase-digested) 비장으로부터 비장의 수지상 세포를 분리하였다. CD11c⁺ 수지상 세포의 순도는 적어도 97%였다. 이들 항체에 대한 FITC 접합된 mAb(FITC conjugated mAb)(BD pharmingen) 및 항-FITC 마이크로비드(Miltenyi)를 사용하여, CD11b, PanNK, B220, NK1.1, CD24, CD16/32, GR-1, I-Ab의 자성에 의한 제거(magnetic depletion)에 의해 T 세포를 비장 및 림프절 세포 현탁액으로부터 정제하였다. CD4⁺ T 세포를 정제하기 위하여, 항-CD8-FITC를 상기 항체에 첨가하였다. 비접촉 T 세포를 위한, CD4⁺ 정제된 세포의 CD62L^- CD44^- 집단을 PE-Cy5 항-CD44 및 PE 항-CD62L로 염색한 후 분리하였다. 10ng/ml의 마우스 GM-CSF(PeroTech, Rocky Hill, NJ)와 함께 RPMI/10% FCS로 배양하여 골수 유래 수지상 세포를 얻었다. 얼음 상에서 10분간 항-Thy1.1과 함께 비장 세포 현탁액을 배양한 후, 37℃에서 30분간 low-tox-M 토끼 보체(low-tox M rabbit complement)(Cedarlane laboratories)와 함께 배양하여 T-결핍 APC(T-depleted APC)를 얻었다. 세포를 세척하고, 37℃에서 30분간 25μg의 미토마이신 C(mitomycin C, Sigma)와 함께 배양하였다.

c. T 세포 활성화 및 극성화

공자극 연구를 위하여, CD4⁺ 또는 비접촉 CD4⁺ 세포를 플레이트에 고정된(platebound) 항-CD28 mAb(5μg/ml)(37.51; BD Pharmingen) 의 존재 또는 부재하에 플레이트에 고정된(platebound) 항-CD3 mAb(5μg/ml 또는 정해진 농도, 145-2C11; BD Pharmingen)로 자극하였다. 재조합 마우스 TL1A(R&D systems)를 10ng/ml로 첨가하였다. IL2^-/- 마우스에 대해 연구하기 위하여, 정제된 T 세포를 상기와 같지만 10U/ml의 IL-2의 존재 또는 부재하에 배양하였다. DC-T 세포 공배양 연구를 위하여, 10⁴의 골수 유래 수지상 세포를 10μg/ml의 마우스 CTLA4/Fc(Chimerigen)와 함께 또는 이를 포함하지 않고, 웰 당 10⁵ OT-Ⅱ 또는 DR3^-/- OT-Ⅱ 비접촉 CD4+ T 세포 및 정해진 농도의 OVA323-339 펩티드와 함께 배양하였다. 3일째에, 사이토카인 측정을 위해 배양 상층액을 수집하고, 세포에 1μCi의 3H-티미딘을 부가하였다. 추가적으로 16-20시간 후, 3H-티미딘의 혼입을 섬광계수기(scintillation counter)를 이용하여 측정하였다. 극성화 연구를 위하여, 8×10⁵의 T-결핍 APC를 C57BL/6 또는 DR3^-/- 마우스로부터 유래된 2×10⁵의 비접촉 CD4⁺ T 세포와 함께 배양하였다. Th1 극성화는 rIL-12(20ng/ml)(PeproTech, Rocky Hill, NJ) 및 항-IL-4(10μg/ml)로 유도하고, Th2 극성화는 rIL-4(20ng/ml)(PeproTech, Rocky Hill, NJ), 항-IL-12(10μg/ml) 및 항 IFN-γ(10μg/ml)로 유도하였고, Th17 극성화는 rhTGFα(5ng/ml)(eBioscience), IL-6(20ng/ml)(Ebioscience), 항-IL-12(10μg/ml), 항 IFN-γ(10μg/ml) 및 항-IL-4(10μg/ml)로 유도하고, Th0 극성화는 항-IL-12(10μg/ml), 항 IFN-γ(10μg/ml) 및 항-IL-4(10μg/ml)로 유도하였다. 배양 4일 후, 하기에 기술하는 바와 같이 세포 내 사이토카인 염색을 수행하였다. STAg를 이용한 극성화 연구를 위하여, 5×10⁴의 비장 수지상 세포를 1μM의 OVA323-339 펩티드와 함께, 웰 당 10⁵의 OT-Ⅱ 또는 DR3^-/- OT-Ⅱ 비접촉 CD4⁺ T 세포와 함께 배양하였다. Th1 극성화는 rIL-12(10ng/ml)로 유도하고, Th2 극성화는 rIL-4(10ng/ml)로 유도하고, STAg 극성화는 5μg/ml의 STAg로 유도하였다. 72시간의 배양 후, 상층액을 10 U/ml의 rIL-2를 포함하는 신선한 배양액으로 바꾸고, 추가적으로 2-3일 후에 하기에 기술하는 바와 같이 세포 내 사이토카인 염색을 수행하였다.

d. 실험적 알레르기성 뇌척수염( Experimental Allergic Encephalomyelitis )의 유도

EAE를 유도하기 위하여, 0 및 2일째에 복강 내로 백일해 독소(pertussis toxin)를 투여하고, 완전 프로인트 항원 보강제(Complete Freund's Adjuvant, CFA)에 용해시킨 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG) 33-55 펩티드를 마우스에 피하로 예방접종하였다. 그룹당 5 내지 8마리의 마우스를 포함시키고, 점수를 매겼다. EAE의 임상 평가(clinical assessment)를 하기 기준에 따라 매일 수행하였다: (0) 병에 걸리지 않음(no disease); (1) 꼬리 마비(tail paralysis); (2) 후지 무기력(hind leg weakness); (3) 모든 후지마비(full hind leg paralysis); (4) 완전 후각마비(complete hind limb paralysis)와 더불어 전각 부전마비(fromt limb paraparesis); (5) 사망(death). 제조사의 추천 프로토콜에 따라 밀테니 바이오텍 사(Miltenyi Biotec)의 신경조직 분리 키트(Neural Tissue Dissociation Kit)를 사용하여 CNS로부터 세포를 분리하였다. 상기 세포를 APC로서 방사선 조사된 T-결핍 비장세포의 존재하에서 96웰 플레이트에서 정해진 농도의 MOG 펩티드로 재자극하였다. 3일째에, 상기 세포를 6시간 동안 ³H-티미딘을 부가한 후 수집하고, 섬광계수기로 계수하였다.

e. Ova -유도성 폐 염증( Ova - Induced Lung Inflammation )

0 및 7일째에, 백반(alum)(Pierce Laboratories, Rockford, IL)과 함께 동량의 혼합물에 유화시킨 100μg의 닭 Ova(Sigma) 또는 PBS 중 어느 하나를 포함하는 200μl의 복강 내(i.p.) 주사를 통하여 마우스를 전신적으로 감작시켰다. 폐 염증(pulmonary inflammation)의 평가를 위하여, 100μg의 Ova 또는 PBS/30μl 접종물(inoculum)을 14일째에 기관 내(i.t.)로, 15일째에 비강 내로(i.n.) 유발하였다. 폐에서의 세포 침윤(cell infiltration), 세포 내 염증 및 혈청과 기관지폐포세척액(BALF)에서의 사이토카인 레벨을 평가하기 위하여 마지막 유발 48-72시간 후 마우스를 안락사시켰다. 20-게이지의 정맥 내 카테터(intravenous catheter)를 이용한 폐로의 직접적 배관삽입(cannulation) 및 (사이토카인 분석을 위한) PBS에 용해시킨 500μl의 1% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)과 (세포 침윤을 분석하기 위한) PBS에 용해시킨 750μl의 1% FBS를 이용한 세척에 의해 폐포 세척액(BAL fluid)을 얻었다. 사이토카인 분석을 위한 샘플을 -80℃에 보관하였다. 세포 분석을 위한 샘플을 Kwik-diff(Thermo-Shandon)로 염색한 후 차별적 세포 분석(differential cellular analysis)을 위한 사이토스핀(cytospin)(Thermo-Shandon, Pittsburgh, PA)으로 제조하였고, 일부를 전균수(total cell counts)를 측정하는데 사용하였다. 앞서 기술한 바와 같은 실험 조건을 이용한 판독기로 폐의 면역조직의 점수를 매겼다(McConchie et al., 2006).

f. 톡소플라스마 감염( Toxoplasma Infection )

감염된 C57BL/6 마우스의 뇌로부터 ME-49 균주 유래 톡소플라스마 곤디의 낭포(cysts)를 제조하였다. 실험적 감염을 위하여, 평균 20낭포/1마리로 마우스 복강 내로 접종하였다. 감염 7주 후, 각각의 감염된 동물의 뇌에 있는 낭포의 수를 측정하였다. 비장 세포를 수집하고 배양한 후, 항-CD3 및 항 CD28 또는 5μg/ml의 STAg 중 어느 하나로 자극하였다. 72시간 후 상층액을 수집하고, 사이토카인 생성을 분석하였다.

g. 사이토카인 및 면역글로불린의 측정

IFN-γ, IL-4 및 IL-17 생성 세포의 검출은 항-IFN-γ-APC, 항 IL-4-PE, 항-IL-17-PE(BD Biosciences)를 사용하는 세포 내 사이토카인 염색에 의해 측정하였다. 간단하게는, 세포를 항-CD3 및 항-CD28 또는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate) 및 이오노마이신(ionomycin)으로 5시간 동안 자극하고, 2시간 후 모넨신(monensin)을 첨가하였다. 세포를 3% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고, 0.1% 사포닌으로 투과성을 높이고(permeabilized), FACS 칼리버 유세포 분석기(FACS Calibur flow cytometer)(Becton Dickinson)로 분석하였다. 혈구계산 비드 어레이(Cytometric Bead Array)(BD biosciences)에 의해 세포 배양 상층액에서의 사이토카인 생성을 분석하였다. 제조사(Bethyl Labs)의 지시에 따라 혈청 면역글로불린을 ELISA로 측정하고, OVA-특이적 IgG1 및 IgE를 50μl의 OVA(100μg/ml)로 코팅된 플레이트를 사용하는 IgG1 또는 IgE-특이적 ELISA로 측정하였다.

h. 수지상 세포 및 T 세포에서의 TL1A 유도

골수 유래 수지상 세포 또는 C57BL/6 마우스 및 정해진 녹아웃 마우스 유래의 CD11c⁺ 수지상 세포를 배양하고, 100ng/ml의 LPS, 20μg/ml의 SEA 또는 10μg/ml의 STAg과 함께 또는 이를 포함하지 않고 정해진 시간 동안 자극하였다. Ig 가교(cross-linking)를 이용한 자극을 코팅 플레이트에서 37℃에서 1시간 동안 0.5μg/ml의 마우스 IgG(Jackson Immunoresearch)를 이용한 후, 37℃에서 1시간 동안 50μg/ml의 양 항-마우스 IgG(Jackson Immunoresearch)를 이용하여 수행하였다. 정제된 T 세포를 정해진 시간 동안 5μg/ml의 항-CD3 및 항-CD28로 자극하였다.

i. 정량적 RT - PCR 에 의한 RNA 의 측정

TriZOL과 pure link^TM Micro-to midi kit(Invitrogen)을 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. SuperScript One-Step RT-PCT 시스템(Invitrogen)을 이용하는 ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템을 사용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 전장 TL1A(forward: CCCCGGAAAAGACTGTATGC; reverse: GGTGAGTAAACTTGCTGTGGTGAA; probe: TCGGGCCATAACAGAAGAGAGATCTGAGC)를 인식하도록 설계된 프라이머로 검출되는 TL1A를 제외하고는, 미리 설계된 프라이머/프로브 세트는 사용된 생물계로부터 유래된 것이다. β2-마이크로글로불린 또는 CD3-δ에 특이적인 프로브를 내부 대조군(internal controls)으로 사용하였다.

3. 실시예 3: TL1A -유도성 염증성 장 질환( TL1A - induced inflammatory bowel disease )

TL1A의 기능을 평가하기 위하여, TL1A가 수지상 세포 및 T 세포에서 본질적으로 발현되는 형질전환 마우스를 만들었다. T 세포를 위하여 향상된 형태의 인간 CD2 인핸서 구조물(human CD2 enhancer construct)을 사용하였고(Zhumabekov T, et al. 1995), 수지상 세포-특이적 발현을 위하여 CD11c 프로모터 구조물(CD11c promoter construct)를 사용하였다(Brocker T, et al. 1997). 전이유전자(transgene) 유래의 TL1A mRNA 및 단백질의 확인을 위하여, 인플루엔자 혈구응집소(influenza hemagglutinin, HA) 에피토프 태그를 TL1A cDNA의 N-말단에 첨가하였다. 각각 기원 계통(founder line)의 형질전환 마우스에서 전이유전자의 발현을 평가하였다. CD2-TL1A 구조물에 대하여, 4개의 계통(R1, R6, U8 및 Z9)이 다른 면역 세포 서브셋에서 검출되며 후속 분석에서 사용되는 HA 염색을 사용하지 않고, CD3로 게이트 온 된(gated on) T 세포에서의 HA 태그에 대한 세포 내 유세포 분석기에 의해 분석된 비장 및 림프절 T 세포에서 유사한 검출가능한 레벨의 TL1A 발현을 나타내었다. CD11c-TL1A 형질전환 마우스에 대하여, 광범위한 발현이 있다. 내인성 TL1A에 관한 형질전환 발현은 2 내지 500배가 넘는 범위에 걸쳐져 있고, 계통은 8배의 과발현의 컷오프(cutoff)에 기초하여 고발현 및 저발현으로 나뉘어진다. 증가된 수의 CD69+ T 세포는 CD2 및 CD11c TL1A 형질전환 계통 양쪽 모두로부터 유래된 비장 및 림프절에 존재한다. 자발적 T 세포 활성화는 CD8 T 세포 서브셋보다는 CD4에서 더 현저하다. 이 결과들은 T 세포 또는 수지상 세포 중 어느 하나에서의 TL1A의 탈 조절(deregulation)은 자발적 T 세포 활성화와 T 세포 항상성(homeostasis)의 파괴를 야기한다.

CD11c-TL1A 및 CD2-TL1A 계통 양쪽 모두로부터 유래된 형질전환 마우스를 더 검토한 결과, 빈번한 장 부종(bowel edema)과 작은 창자에 걸친 장벽비후(bowel wall thickening)의 증거가 관찰되었다. 이들 특징의 발생률은 연구중 4개 계통의 CD2-TL1A 형질전환 마우스에서 사실상 100%였고, 이는 CD11c-TL1A 계통에서의 전이 유전자 발현의 레벨과 관련이 있다. 장벽비후(bowel wall thickening), 염증성 침윤(inflammatory infiltrate), 배상세포의 과증식(goblet cell hyperplasia), 융모의 거대화(enlargement of villi) 및 정상 구조물(architecture)의 변형(distortion)을 볼 수 있다(도 21). 이들 변화는

염증성 세포 침윤(inflammatory cell infiltrates), 융모의 신장(elongation) 및 파괴(destruction), 음와농양(crypt abscess) 및 근육층(muscularis layer)의 비후(thickening)를 포함하는 TNBS 대장염(colitis)을 위해 개발된 점수 체계(scoring scheme)에 따른 마우스의 상태를 모르는 숙련된 관측자에 의해 수치화되었다(Neurath M, et al. 2000)(도 21). 비교적 넓은 결장을 가지는 말단 회장(terminal ileum)은 CD11c 및 CD2-TL1A 형질전환 마우스 양쪽 모두에서 시진(gross inspection) 및 조직병리 모두에 가장 현저하게 관여하고 있었다(도 21b, c). 장내 염증(intestinal inflammation)은 이들 마우스에서의 체중 감소와 관련이 있었으며, 또한 전이 유전자 발현의 레벨에 의존적이었다(도 21c).

이들 관찰은 경벽성 염증(transmural inflammation) 및 말단 회장에 대한 호발성(predilection)을 포함하는 인간의 크론병과 눈에 띄게 유사한 몇몇 특징들을 가지는 신규한 염증성 장질환 모델로서 TL1A 형질전환 마우스를 수립하였다. 흥미롭게도, 다수의 최근 보고들이 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 또는 크론병(Crohn's disease)에 걸린 환자들의 생검 시료의 점막 고유층(lamina propria)에서 TL1A 및 DR3의 증가된 발현을 기술하고 있다. 증가된 TL1A 및 DR3 발현은 또한 두 개의 다른 IBD의 동물 모델인 SAMP1/YitFc 및 TNF^{Δ ARE} 종에서도 잘 알려져 있다(Bamias G, et al. 2003; Bamias G, et al. 2006). 탈조절된 TL1A 발현이 형질전환된 마우스에서 자발적 IBD를 유발한다는 발견들을 종합하여 보면, TL1A-DR3 상호작용은 IBD의 발병에 중요할 것이고, IBD에 유망한 치료학적 표적이 될 것이며, 류마티스성 관절염을 포함하는 T 세포 성분으로 인한 염증성 질병과 관련될 것이다.

i. 병원성 세포 형태의 특성화 및 TL1A 유도성 IBD 에서의 장내 세균총( gut flora)의 역할

선택된 CD2-TL1A 및 CD11c-TL1A 형질전환 마우스로부터 얻은 조직 절편에서 면역조직화학염색(immunohistochemical) 및 면역형광염색(immunofluorescence) 연구를 수행하였다. 초기 연구는 TL1A 형질전환 마우스로부터 얻은 창자의 동결건조 절편을 면역염색함으로써 항-CD3로 T 세포를, F4-80으로 대식세포를 내재화시켰다. TL1A 형질전환 마우스의 창자 관련 부위로부터 얻은 상피내(intraepithelial) 및 점막 고유층(lamina propria)의 림프구 제조물에서 FACS 분석을 수행하였다. αβ,γδ, 및 NKT 세포를 NK 세포, B 세포와 함께 계수하였고, 활성화 상태를 CD25, CD69 및 CD71 표면 마커로 조사하였다. T 세포에 의해 유도된 면역병증의 다른 모델에서 볼 수 있는 것과 같은 Tregs(Regulatory T cells)를 통한 면역 길항반응(counter-regulation)이 일어나는지의 여부를 알아보기 위하여, 이들 샘플에서 FoxP3⁺CD25⁺ Tregs 또한 계수하였다(Tang Q, et al. 2006). 비록 T 세포가 TL1A 수용체 DR3를 발현하는 주요 세포 형태라 할지라도, TL1A 발현은 NKT 세포, NK 세포 및 B 세포에서도 발견된다. 따라서, 강화된 TL1A는 이들 마우스에서 IBD를 매개할 수 있는 다른 면역 세포 서브셋으로 확장될 수 있다. 림프구 서브셋이 TL1A에 의해 유도된 대장염에 필요한지를 알아보기 위하여, TL1A 형질전환 마우스를 서로 다른 림프구 소집단(subpopulations)이 결여된 다양한 계통의 녹아웃 마우스와 교잡하였다. T, B 및 NKT 세포에 대한 의존성을 알아보기 위하여, TL1A 형질전환 마우스를 먼저 RAG 결핍 마우스와 교잡하였다. 만약 이들 마우스가 염증성 장질환이 없다면, TL1A 유도성 IBD의 의존성은 후천성 면역 시스템(adaptive immune system)이다. 그 후, αβ T 세포(TCR 알파 녹아웃), NKT 세포(CD1d 녹아웃), NK 세포(IL15 녹아웃) 및 B 세포(IgH 녹아웃) 마우스의 필요요건을 알아보기 위하여 다른 교잡을 수행하였다. 만약 αβ T 세포가 TL1A 형질전환 마우스에서의 IBD에 필요한 것으로 밝혀진다면, 서로 다른 T 세포 서브셋의 조건은 각각 CD8 및 CD4 T 세포가 결여되어 있는 클래스 I 또는 클래스 Ⅱ MHC 결핍 마우스에 CD2-TL1A 형질전환 마우스를 교잡하는 것을 통하여 조사될 수 있다. 만약 T 세포가 연루되어 있다면, IBD는 TL1A에 의한 비 항원-특이적 공자극이 원인이며, 또는 그렇지 않으면 특이적 T 세포 재가동(즉, 내장 유래 항원(gut-derived antigens)에 대한)이 질병 유도에 필요할 수 있다. 이를 테스트하기 위하여, TL1A 마우스를 OT-Ⅱ 알부민-특이적 TCR 형질전환 마우스와 같은 관련없는 특이성을 가지는 TCR 형질전환 마우스와 교잡하였다. 만약 자가반응성(autoreactive) 또는 장내세균총 반응성(gut flora reactive) T 세포가 TL1A 유도성 IBD에 필요하다면, 이들 TCR 형질전환 마우스는 질병이 개선될 것이다.

ii . TL1A 유도성 IBD 에서 병원성 사이토카인의 특성화

염증성 장질환 모델은 광범위한 서로 다른 사이토카인에 의존하는 것으로 밝혀졌다(Strober W, et al. 2007). 처음에는, 관심이 인터페론 γ 및 IL-12에 맞춰져 있었으며, 사실 IL-12의 p40 서브유닛에 대한 항체는 인간 염증성 장질환 및 마우스 IBD 모델에서 효과가 있었다. 가장 최근, p40은 염증성 장질환에 중요한 것으로 보이는 IL-12 패밀리 사이토카인인 IL-23의 성분이라는 것이 발견되었다. IL-23은 호중구(neutrophil) 및 단핵구(monocytes)를 강력하게 유인하고 활성화시키는 사이토카인인 IL-17을 생산하는 T 세포의 분화 및/또는 생존을 증가시키는 것을 통하여 적어도 부분적으로 작용한다(Fuss IJ, et al. 2006; Hue S, et al. 2006; McKenzie BS, et al. 2006). 작용 세포 집단이 이 질병에 중요한지를 알아보고 만성 TL1A 자극의 효과를 더욱 잘 이해하기 위하여, TL1A 유도성 IBD에서 발현되는 우점적인 사이토카인을 알아보기 위한 실험을 수행하였다. TL1A 형질전환 마우스의 회장 및 창자의 다른 부분으로부터 추출된 RNA로부터의 사이토카인의 양은 IL-17 및 TL-13의 지속적인 증가를 보였다(도 21e). 흥미롭게도, T 세포의 Th17 서브셋에 의해 생성된 다른 사이토카인인 IL-22는 검출되지 않았고, Th1 세포의 특징적 산물인 IFN-γ 또한 대조군에 비하여 증가되지 않았다. 장간막(mesenteric)의 림프절에서의 T 세포의 조사는 IL-17을 생성하는 T 세포가 IFN-γ 및 IL-4와 비교하여 대조군에 비해 가장 증가하였음을 보여주었다. 항-사이토카인 항체 또는 녹아웃 마우스에서 특정 T 세포 서브셋(예를 들어, IL17, STAT4, STAT6, ROR-γ) 발달에 매우 중요한 것으로 알려진 유전자를 차단하는 것은 어떤 사이토카인과 Th 세포 서브셋이 TL1A-유도성 IBD의 발병에 필요한지를 알아내는데 사용될 수 있다.

iii . TL1A 가 조절 T 세포 기능을 차단하거나 T 세포가 Tregs 에 저항성을 가지도록 하는지에 대한 확인

TL1A가 천연 Tregs의 생성 또는 기능에 영향을 미치는가의 여부는 알려져 있지 않다. 류마티스성 관절염에서, 관련된 사이토카인인 TNF는 그것들의 수와는 관계없이 FOXP3+ 조절 T 세포의 기능을 손상시키는 것으로 나타났다(Nadkarni S, et al. 2007; Valencia X, et al. 2006). Foxp-3 양성 Tregs는 DR3 녹아웃 마우스에 정상적인 수로 존재하며, 흥미롭게는 TL1A 형질전환 마우스의 장간막 림프절에서는 증가된 수로 존재한다. 증가된 수의 활성화된 CD25+ T 세포를 가지는 TL1A 형질전환 마우스로부터의 Tregs의 분리를 위하여, 단지 FOXP3 양성 Tregs만을 이 실시예에서 연구할 수 있도록 선별된 계통의 TL1A 형질전환 마우스를 FOXP3-GFP 리포터 마우스(reporter mice)와 교잡하였다. TL1A 형질전환 마우스로부터 분리된 Tregs를 그것들의 기능에 대하여 시험하였고, 또한 CD2-TL1A 형질전환 반응 세포(responder cell)(Tresp)의 사용 및 Treg/Tresp 배양액에의 TL1A의 첨가를 통하여 TL1A가 정상적인 Tregs의 억제 기능(suppressive function)을 차단할 수 있는지에 대하여 시험하였다. Tregs가 비접촉 CD45RB hi 세포를 면역결핍 숙주(immunodeficient hosts)로 형질전환시키는 Treg 기능의 생체 내 검정 또한 수행하였다(Powrie F, et al. 1993). IBD를 야기하기 위한 비접촉 T 세포의 Treg 기능 또는 능력이 TL1A에 의해 영향을 받는지를 알아보기 위하여, CD2-TL1A 형질전환 마우스로부터 유래된 Treg 또는 비접촉 T 세포 중 어느 하나를 사용하여 상호간 실험을 수행하였다.

iv . IBD 의 발병에 있어서의 TL1A - DR3 상호작용의 요건

DR3가 전이유전자 유래의 TL1A의 부재하에 대장염의 발병에 필요한지도 알아보았다. 헵텐 TNBS의 직장 내 투여에 의해 유도된 대장염은 폭넓게 특성화되어 있다. 대장염은 T 세포를 필요로 하며, 또한 TNF 및 IL-12p40에 의존적이라는 것이 알려져 있다(Neurath M, et al. 2000; Neurath MF, et al. 1997). 최근의 증거는 또한 IL-23이 이 실험적 질병의 발병에 표적 사이토카인 IL-17을 연루시키고 있음을 보여주었다(Zhang Z, et al. 2006). EAE 및 Ova 유도성 천식에 대한 저항성은 DR3 결핍 마우스가 한배 새끼(littermate) 대조군과 비교하여 TNBS 대장염에 저항성이 있을 수 있음을 나타낸다. 이 실험을 하기 위하여, DR3 KO 마우스를 감수성(susceptible)이 있는 C57B1/10 종류와 여교잡하였다. 대안적으로, 여교잡(backcrossing)을 진행하는 동안, 감수성이 있는 마우스를 TNBS 대장염을 유도하기 전 또는 후에 TL1A 차단 항체로 처리하였다. T 세포 상의 DR3가 이 대장염 모델에 필요한지를 알아보기 위하여, 대장염 전달 모델에서 DR3 결핍 T 세포를 또한 면역결핍 숙주로 형질전환하였다.

실시예 3

TL1A를 류마티스 윤활막(rheumatoid synovium)에서 검출하였다. 발명자들은 TL1A를 유도하는 인자 및 다른 류마티스성 질병에 비해 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA)에 대하여 윤활액(synovial fluid, SF) 또는 혈액에서 상승된 TL1A 레벨의 특이도를 알아보기 위하여, 인간 TL1A에 대한 신규한 단일클론 항체를 사용하였다. 마우스 콜라겐 유도성 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 모델에서, 발명자들은 TL1A에 대한 중화 항체(neutralizing antibody)를 사용하여 TL1A-DR3 상호작용을 차단하였고, 항-콜라겐 항체에 대한 TL1A 차단의 효과, 임상적 관절염(joint inflammation) 및 마이크로 CT에 의해 침식(erosion)을 측정하였다. TL1A는 Fc 수용체 가교(crosslinking)에 의해 유도되었고, 보다 적게는 인간 단핵구에서의 원형질막(plasma membrane) TLR에 의해 유도되었다. 다른 류마티스성 질병과 비교하여 현저하게 높은 혈액 및 SF 레벨의 TL1A가 류마티스성 관절염 환자에게서 나타났다. 혈장 TL1A는 SF TL1A 레벨을 예측할 수 있다. 그러나, SF TL1A는 류마티스성 관절염 환자에서의 TNF 및 질병 활성도(disease activity)와는 관계없이 증가하였다. TL1A 차단은 콜라겐 유도성 관절염(CIA)에서의 임상학적 관절 스코어를 감소시키고, 발의 부기(swelling)에의 효과와는 관계없이 골 침식(bone erosion)을 극적으로 감소시키는데 효과적이었다. TL1A는 인간 및 마우스 양쪽 모두의 자가면역성 관절염, 특히 침식의 발병에 있어서 중요하다. 발명자들은 TNF와는 관계없이 작용하는 류마티스성 관절염에 대한 강력한 질병 완화 치료(disease modifying treatment)로서 TL1A 차단을 개시한다.

단핵구 세포 배양 및 자극

미국국립보건원(National Institutes of Health, NIH) 수혈 의학 부서(transfusion medicine department)로부터 NIH RIB 승인 임상 프로토콜에 따라 정상 공여자로부터 현탁분리된(elutriated) 단핵구를 얻었다. 단핵구를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 10% FCS와 함께 RPMI 배지에서 1×10⁶ 세포/ml로 배양하였다. 특정 시점에서, TL1A의 측정을 위하여 배양 상층액을 수집하고, TL1A mRNA의 측정을 위한 qRT-PCR 용 세포를 채취하였다. LPS(Ultrapure Salmonella Minnesota R595, List Biological Laboratories inc., Campbell, CA)를 정해진 농도로 첨가하였다. 앞서 기술한 바와 같이, 면역 복합체를 사용하여 자극을 수행하였다. qScript One-Step qRT-PCR 키트인 Low ROX(Quanta BioSciences, Inc.)를 사용하는 ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템의 사용과 함께 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 미리 설계된 프라이머/프로브를 사용된 생물계로부터 얻었으며, 그 서열은 정장 TL1A를 검출하도록 설계되었다(forward: 5'- CCCCGGAAAAGACTGTATGC-3'; reverse: 5'GGTGAGTAAACTTGCTGTGGTGAA3'; probe: 5'-TCGGGCCATAACAGAAGAGAGATCTGAGC-3'). 각각의 측정은 β2-마이크로글로불린(델타Ct)의 발현에 대하여 정규화되었다. 2^델타Ct는 그 후 유전자 발현의 레벨로서 사용된다. 유전자 발현 레벨은 비자극된 세포에 존재하는 레벨로 정규화되었다.

인간 샘플

윤활액과 혈장 샘플을 로스앤젤레스 카운티(LAC) + 서던캘리포니아 대학교 의료 센터(IRB protocol HS-05-00270)로부터 동시에 얻었다. 병력(medical history), 검진(physical examination) 및 윤활액 분석에 의해 관절 삼출(joint effusion)의 기저 원인을 밝혀내었다. 치료 데이터는 이용 가능하지 않다. 브링엄 여성병원 류마티스 진료소(Brigham and Women's Hospital Rheumatology clinic)에서 얻은 폐기되어진 개인 정보가 삭제된(de-identified) 익명의 임상학적 샘플로부터 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 통풍(gout) 및 가성통풍(pseudogout) 환자 유래의 윤활액을 얻었다. 치료 데이터는 이용 가능하지 않다. 다른 연구를 위하여 정형외과치료전문병원(HSS)에서 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE) 환자로부터 혈청을 미리 수집하였다. 인구 통계학적 데이터 및 SLE 질병 활성도 데이터(SELENA-SLEDAI)를 그들의 임상 방문 시기에 기록하였다. 모든 데이터는 개인 정보가 삭제되어 있으며, 모든 환자들은 혈액 채취 전 IRB-승인 사전동의에 서명하였다. IRB 승인 프로토콜 넘버 99-D-0070 및 84-D-0056에 따라 NIH의 닥터 가버 일레이(Dr. Gabor Illei)로부터 쇼그렌병(Sjogren's disease) 환자의 혈액 샘플을 얻었다. IRB 승인 프로토콜 넘버 00-AR-0222에 따라 NIH의 닥터 라파엘라 골드바흐-멘스키(Dr. Raphaela Goldbach-Mansky)로부터 류마티스성 관절염 환자로부터의 혈청 샘플을 제공받았다. IRB 승인 프로토콜 넘버 03-AR-0131에 따라 NIH의 닥터 마이클 워드(Dr. Michael Ward)로부터 강직성 척추염(ankylosing spondylitis, AS) 환자의 혈청 샘플을 제공받았다.

ELISA 에 의한 TL1A 의 측정

세포 배양 상층액에서 TL1A를 측정하기 위하여, 상업적으로 이용가능한 인간 TL1A ELISA 키트(PeproTech, cat no. 900-K290) 를 사용하였다. 혈장과 윤활액의 대응 샘플에서 인간 TL1A를 측정하기 위하여, 하기와 같이 ELISA를 수행하였다: 96웰 평판바닥 플레이트(96 well flat-bottom plate)를 PBS에 녹인 1μg/ml의 마우스 항-인간 TL1A(클론 1A9)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 1시간 동안 차단 버퍼(5% BSA, 0.1% Tween 20 in PBS)로 차단하였다. 225μL의 샘플 희석액(1% BSA, 0.1% Tween 20 in PBS)으로 10배 희석된 25μL의 샘플을 각 웰에 로딩하고, 상기 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 다클론 비오티닐화된 토끼 항-인간 TL1A Ab(polyclonal biotinylated rabbit anti-human TL1A Ab)로 TL1A를 검출한 후, 37℃에서 1시간 동안 스트렙타비딘-서양고추냉이 과산화효소(Streptavidin-Horseradish Peroxidase, SA-HRP) 0.5μg/ml을 결합시켰다. TMB(3,3'5,5'tetramethylbenzidine)를 기질로 사용하였다. 100μL의 1N 황산을 사용하여 반응을 정지시키고, OD 450nm에서 측정하였다. 표준 희석액(10% 혼합 정상 인간 혈청(pooled normal human sera)이 첨가된 샘플 희석액)에 희석된 재조합 인간 TL1A(Pepro Tech)를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 바이오-플렉스 COOH 비드(Bio-Plex COOH beads)(Bio-Rad) 상에 접합된 항-인간 TL1A 항체(클론 1A9)를 사용하여 독립된 비드-기반의 검정 시스템을 개발하였다. 3000 항-TL1A 접합 비드를 96웰 필터 플레이트(96-well filter plate)(MultiScreen HTSTM by Millipore, Cat No. MSBVN1250)의 각 웰에 첨가한 후, 50μL의 혈청 또는 윤활액을 첨가하였다. 바이오-플렉스 인간 혈청 희석액(Bio-Plex Human Serum Diluent)(Bio-Rad, Cat no. 171-305000)를 사용하여 윤활액을 2배로 희석하였다. 샘플과 표준물질을 30분간 배양한 후, 25μL의 1μg/ml의 비오티닐화된 다클론 항-인간 TL1A(PeproTech, Cat no. 500-P240Bt)과 50μL의 1:100으로 희석된 SA-PE(Bio-Plex Cytokine Reagent Kit, Bio-Rad, 171-304001)와 함께 30분간 배양하였다. 각 웰을 125μL의 검정 버퍼(assay buffer)로 재현탁하고, 바이오-플렉스 200 시스템(Bio-Plex 200 system)(Bio-Rad)을 사용하여 사이토카인 레벨을 측정하였다. 프리즘(Prism)(GraphPad Software, Inc.) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. TNF 검정을 위하여, 제조사의 설명서에 따라 바이오-플렉스 프로 인간 사이토카인 TNF-α 세트(Bio-Plex Pro Human Cytokine TNF-α set)(Bio-Rad, Cat no. 171- B5026M)를 사용하였다.

콜라겐 유도성 관절염( CIA )의 유도 및 차단제( blocking reagent )의 투여

0일째에 잭슨 연구소(Jackson Laboratory)(Bar Harbor, ME)로부터 얻은 수컷 DBA/1J 마우스(8-10 주령)의 꼬리 기저부위(tail base)에 완전 프로인트 항원 보강제(complete Freund's adjuvant)에 녹인 100μg의 닭 콜라겐 타입 Ⅱ(chicken collagen type Ⅱ, CⅡ)(1:1, w/v)를 피하주사하고, 21일째에 완전 프로인트 항원 보강제에 녹인 100μg의 CⅡ(1:1, w/v)를 피하주사하여 상승시켰다(boosted). 그 후, 21일째에 대조군 또는 치료군 중 어느 하나로 마우스를 랜덤화하였다. 치료군에서의 마우스에는 21일에 시작하여 매 7일마다 20mg/kg의 햄스터 항-마우스 TL1A 항체(클론 5G4.6)를 복강 내로 주사하였다. 대조군의 마우스에는 20mg/kg의 햄스터 면역글로불린을 주사하였다. 49일째에 마우스를 안락사시켰다. 후각(hind leg)을 무릎 위에서 절단하였고, 10% 포름알데히드로 고정하였다. NIAMS ACUC에 의해 승인된 프로토콜에 따라 동물을 사용하였다.

콜라겐 유도성 관절염에서 관절염의 임상적 심각도의 평가

관절염의 발병을 앞서 기술한 0-4 스케일에 대한 각 발의 거시적 점수화(macroscopic scoring)로 평가하였다. 점수화는 랜덤화(randomization) 및 사용된 마우스의 각 스코어에 대하여 모르는 두 명의 개별 연구원에 의해 이루어졌다.

항-닭 콜라겐 IgG 를 측정하기 위한 ELISA

96웰 평면바닥 플레이트를 0.05M TRIS-0.2M NaCl에 녹인 50μg/ml의 닭 콜라겐 100μL로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 상온에서 30분간 200μL의 차단 버퍼(1% BSA in PBS)로 차단하였다. 샘플 희석액(1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS)을 사용하여 1:100 내지 1:12500으로 5배 단계적으로 희석된 혈청의 50μL 샘플을 2개의 웰에 로딩하고, 플레이트를 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 상온에서 1시간 동안 5ng/ml의 염소 항-마우스 HRP(Pierce, cat. no. 1858413) 를 이용하여 항체를 검출하고, 기질 검출 키트(substrate detection kit)(R&D, cat. no. DY999)로 검출하고, 50μL의 2M H2_SO₄로 정지시킨 후, OD450에서 측정하였다.

미세전산화 단층촬영술( microcomputed tomography , micro - CT ) 및 침식( erosion )의 평가

CIA 실시예로부터의 다리를 스캔할 때까지 10% 포름알데히드에 저장하였다.

44kV/22 마이크로앰프(microamps)로 편향된 x-레이 광원(촛점 크기(focal spot size) 4 마이크로미터, 에너지 범위 20-100kV)과 빔 경화(beam hardening)를 감소시키기 위한 0.5mm 알루미늄 필터(aluminum filter)가 장착된 SkyScan 1172 마이크로 X레이 CT 스캐너(SkyScan 1172 Micro Xray CT scanner)(MicroPhotonics, Inc. Allentown PA, USA, SkyScan, Kontich, Belgium)를 사용하여 마우스 해부를 위한 마이크로-CT를 수행하였다. 220mm의 광원에서 카메라까지의 거리와 116mm의 광원에서 물체까지의 거리를 사용하여, 12.17 마이크로미터의 복셀 크기(voxel size)를 가지는 영상을 획득하였다. 180도 회전을 통해 0.4도의 각도 분해능(angular resolution)을 사용한 450개의 투사상(projection)을 획득하였다. 프레임당 295ms의 노출 시간을 사용하여 각 투시 방사선 사진(projection radiograph)을 평균하여 8개의 프레임을 획득하였다. 스캐닝 주기(scan duration)는 대략 40분이었다. 펠드캄프 콘-빔 알고리즘(feldkamp cone beam algorithm)에 기초한 업체가 공급한 소프트웨어를 사용하여 단층 영상(tomographic image)을 재구성하였다. 재구성된 영상을 그 후 CTAn(v.1.10)을 사용하여 3차원 영상으로 만든 후, CTVol(v.2.1)(SkyScan)을 사용하여 가시화하였다. 3차원 영상을 기술된 점수화 시스템에 기초하여 두 명의 개별 연구원에 의해 개인정보가 삭제된 3-D 재구성에 대해 점수를 매겼다.

Fc-수용체(FcR) 가교(cross-linking) 및 TLR 리간드는 인간 단핵구에서 TL1A 발현을 유도한다. 류마티스성 관절염에서, 면역 복합체 및 내이성 리간드에 의한 TLR의 자극에 의한 FcR 가교는 관절에서 단핵구와 다른 선천적인 면역 세포를 자극함으로써 염증을 지속시킬 수 있다. 따라서, 발명자들은 인간 단핵구에 의한 TL1A의 발현을 유도하는 것에 대한 면역 복합체 및 TLR 리간드의 능력을 테스트하였다. FcR 가교 및 LPS 모두 TL1A mRNA의 3' 비번역 부위에 존재하는 AU가 풍부한 성분에 의해 지배를 받는 TL1A RNA의 분해와 일치하는, 18시간에 최고 레벨에 이른 후 빠르게 떨어지는 레벨을 가지는 mRNA 레벨로 TL1A를 유도하였다. TL1A 유도의 최대값(peak)은 최적 농도의 LPS에 따른 것보다 FcR 가교에 따른 것이 6배 더 높았다. 단백질 레벨에서, FcR 가교는 18시간 만에 검출가능한 고레벨의 TL1A를 유도한 반면, LPS 유도성 TL1A는 단지 48시간에서만 검출가능하였으며, TL1A 생성은 FcR 가교를 사용하였을 때보다 최적 농도의 LPS를 사용하였을 때 대략 10배 더 낮았다. TLR은 그것들이 아답터 단백질(adapter protein) MyD88, TRIF 또는 두 가지 모두에 관련된 신호전달 경로를 활성화시키는가의 여부에 따라 서브클래스로 나뉠 수 있다. 이들 신호전달 경로가 TL1A 발현의 유도에 중요한지를 알아보기 위하여, 발명자들은 각 수용체에 특이적인 TLR 리간드의 패널로 인간 단핵구를 자극하였다. TLR1, 2, 4 및 6을 통한 자극은 TL1A를 유도하는데 가장 효과적이었으며; TLR 5 및 9는 중간 정도였으며; TRL 3, 7 및 8을 통한 자극은 TL1A 생성에 어떠한 영향도 미치지 않았다. TLR 3, 7 및 8이 MyD88을 저조하게 활성화시켰기 때문에, 이들 결과는 TL1A 유도에 중요할 MyD88-의존성 빠른 NF-kB 상향조절과 일치하였다. 이들 결과는 또한 LPS에 반응한 TL1A 생성이 주로 Myd88에 의존하는 마우스의 수지상 세포를 사용하여 얻어진 결과와 일치하였다.

TL1A 는 윤활액과 혈액에서 류마티스성 관절염의 바이오마커이다

시험관 내(in vitro)에서 TL1A 생성을 촉진하는데 대한 면역 복합체의 강력한 능력을 고려해 볼 때, 발명자들은 이 사이토카인이 류마티스성 인자(rheumatoid factor, RF)와 다른 면역 복합체가 선천적 면역 세포를 자극하는 류마티스성 관절염에서 우선적으로 증가될 수 있다고 추론하였다. 그러한 목적을 가지고, 발명자들은 류마티스성 관절염 환자 집단(31명의 환자로부터 얻은 39개의 샘플), 또는

건선성 관절염(psoriatic arthritis), 결정 유발성 관절염(crystal induced arthritis), 반응성 관절염(reactive arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 비특이적 염증성 관절염(nonspecific inflammatory arthritis), 소아 염증성 관절염(juvenile inflammatory arthritis) 또는 감염성 관절염(infectious arthritis)을 포함하는 다른 형태의 관절염 환자 집단(31명의 환자로부터 얻은 37개의 샘플)으로부터 얻어진 혈장 및 윤활액의 대응 샘플(matched sample)에서 TL1A 레벨을 측정하였다. 류마티스성 환자로부터 유래된 SF 샘플의 대다수(39개 중 27)가 0.1ng/mL보다 높고, 평균 0.58ng/mL이며, 3.25ng/mL까지의 TL1A 레벨을 가지는 것으로 검출되었다. 그와 대조적으로, 비 류마티스성 관절염 샘플(각각 반응성 관절염과 건성성 관절염 환자로부터 유래된 것들)의 37개 중 2개만이 0.1ng/mL보다 많은 TL1A를 포함하고 있었다. 혈장에서는, 더 적지만 여전히 현저한 비율의 류마티스성 환자가 높은 TL1A 레벨을 나타낸 반면, 다른 관절염 환자 유래의 어떠한 샘플에서도 TL1A 레벨을 검출할 수 없었다. 다섯 명의 류마티스성 관절염 환자 및 다섯 명의 비류마티스성 관절염 환자가 이 집단에 대한 많은 샘플에 기여하고 있었다. 윤활액에서, TL1A 레벨은 윤활액 수집일에 따라 변하였다. 그러나, 혈장에서는, 반복 측정한 환자의 TL1A 레벨은 여전히 꽤 변함이 없었으며, 매우 높거나(> 2ng/ml) 또는 0.1ng/ml 이하이거나 둘 중 하나였다. 이것은 환자들 중 관련된 관절 간 염증에의 가변성(variability)이 반복된 활액 흡인(synovial aspiration)에 영향을 받았음을 반영하는 것으로 예상된다. 증가된 TL1A는 샘플 수집 시점에서의 질병 활성도 보다는 더욱 심각한 질병과 침식을 예측하는 항-CCP와 같은 마커와 더 관련이 있다. 항-CCP 항체에 대하여 테스트된 류마티스성 환자들 중, 양성 항-CCP를 가지는 환자들(n=15)은 윤활액에서 현저하게 높은 TL1A 레벨을 나타냈으며(p=0.039), 그렇지 않은 환자들에서보다(n=4) 혈장에서 TL1A가 높아지는 경향을 보였다(p=0.129). 류마티스성 인자(RF)를 가지든 가지지 않든, 류마티스성 관절염 환자들 간의 윤활액과 혈장에서의 TL1A 레벨을 비교하는 것은 이 집단의 대부분의 환자들이 양성 혈청을 가졌기 때문에(sero-positive) 가능하지 않았다. 여전히, 음성 혈청(sero-netagive) 환자들(n=2)은 일반적으로 윤활액과 혈장 양쪽 모두에서 TL1A를 검출할 수 없었으며, 이는 TL1A가 류마티스성 인자를 가지는 환자에게서 주로 증가될 수 있다는 것을 암시한다. 그러나, 류마티스성 인자 또는 항-CCP의 정량적 레벨은 혈장 또는 윤활액에서의 TL1A 레벨과는 관련이 없었다. 게다가, 윤활액 또는 혈장에서의 TL1A 레벨은 DAS-28 스코어, ESR, CRP 또는 동통이 있는(tender)/부종이 있는(swollen) 관절 수(joint count)를 포함하는 임상적 심각도의 측정과는 관련이 없었을 뿐만 아니라, SF WBC 수와 관련 있는 SF TL1A 레벨에도 관련이 없었다. 윤활액(평균 비침식성에서 0.55ng/mL, 침식성에서 0.68ng/mL)과 혈장(평균 비침식성에서 0.25ng/mL, 침식성에서 1.09ng/mL) 양쪽 모두에서 TL1A가 높아지는 경향을 보였다. 그 중에서도 특히, 39개의 대응 류마티스성 관절염 혈장 및 윤활액 샘플에서의 혈장 및 윤활액의 TL1A 레벨 사이에는 선형적인 상관관계(linear correlation)가 있었으며(R2= 0.52, p<0.0001), 이는 혈청 TL1A가 관절에서 TL1A를 대리할 수 있음을 나타낸다. 이들 발견의 일반화 가능성을 알아보기 위하여, 발명자들은 서로 독립된 집단의 류마티스성 관절염 또는 다른 관절염 환자들로부터 유래된 윤활액 샘플에서 비드-기반의 형광 TL1A 검정법(bead-based fluorescent TL1A assay)을 사용하여 TL1A를 측정하였다. 이 검정법과 사용된 다른 검정법 사이의 시험 내 분석(inter-assay) 가변성은 약 100pg/ml을 넘는 값을 가지는 샘플에 대하여 10%보다 작았으며, 이 비드-기반 검정법은 10pg/ml 만큼 낮은 TL1A 레벨을 추가적으로 검출할 수 있는 능력을 가진다. 이 두 번째 집단에서, 비록 다른 염증성 관절염에서의 윤활액의 TL1A 레벨 또한 퇴행성 관절염에서보다 현저하게 높았지만, 윤활액의 TL1A 레벨은 퇴행성 관절염(OA), 통풍 또는 가성통풍, 또는 건선성 관절염(PsA) 환자에서보다 류마티스성 관절염 환자에서 현저하게 높았다. 비록 류마티스성 관절염에서의 주요 병원성 사이토카인인 TNF가 내피 세포(endothelial cells), 연골세포(chondrocyte) 및 활막 섬유아세포(synovial fibroblast)에서 TL1A의 발현을 유도할 수 있다 할지라도, TNF 및 TL1A의 윤활액 레벨은 테스트된 17개의 류마티스성 관절염 샘플과는 관련이 없었다. 따라서, TNF는 윤활액에서 TL1A 발현과는 독립적인 성분인 것으로 나타났다. 류마티스성 관절염이 혈류중 면역 복합체(circulating immune complex)와 관련된 유일한 류마티스성 질병은 아니다. 염색질(chromatin)의 성분과 복합체를 형성하는 항 핵 항체(anti-nuclear antibodies, ANA)는 SLE 및 쇼그렌 증후군과 관련이 있다. 혈청 TL1A 레벨이 또한 이들 질병에서 증가되는지를 알아보기 위하여, 발명자들은 광범위한 질병 활성도에 걸친 쇼그렌 증후군과 SLE 환자들로부터 얻은 혈청을 테스트하고, 이것을 건강한 지원자들로부터 얻은 혈청과 류마티스성 관절염 환자의 독립적인 집단으로부터 얻은 혈청을 비교하였다. 정상 대조군과 비교하여 류마티스성 환자에서는 혈청 TL1A 레벨이 현저하게 높아졌으며, 어떠한 환자에서도 혈청 TL1A는 검출할 수 없었다. 이 류마티스성 관절염 환자 집단에서, 항-TNF 치료 상태는 TL1A 값과는 상관이 없었다. 혈청 TL1A 레벨은 쇼그렌 증후군 환자에서는 높아졌으나, 류마티스성 관절염 환자에서는 그렇지 않았다(류마티스성 관절염 대 쇼그렌 증후군, p=0.0006). 게다가, TL1A는 모든 환자들의 혈청에서 검출가능하지 않았으나, 세 명의 SLE 환자에서는 검출가능하였다. 각각의 이들 3명의 SLE 환자들은 높은 SLEDAI 레벨(8-12)을 나타냈으며, 그들 중 두 명은 샘플 수집 시점에 관절염의 악화(arthritic flare)를 겪었다. 추가적인 대조군으로서, 발명자들은 혈류중 면역 복합체와는 관련이 없는 강직성 척추염(ankylosing spondylitis, AS) 환자의 혈청에서 TL1A의 레벨을 측정하였다. 단지 소수의 강직성 척추염 환자의 혈청만이 100pg/ml보다 높은 레벨로 TL1A를 포함하고 있었다. TL1A는 류마티스성 관절염 환자에서보다 현저하게 낮게 증가되었다(RA 대 AS의 t 검정, p=0,0003). 그러나, 쇼그렌 증후군에서와 같이, TL1A는 건강한 대조군과 비교하여 강직성 척추염 환자의 혈청에서 여전히 현저하게 높아졌다. 강직성 척추염에서 영향을 받은 말초관절(peripheral joint)의 수, 척추 강직(spine ankylosis)의 정도, 항-TNF 치료 또는 전반적인 질병 활성도와 TL1A 레벨에는 관계가 없었다. 종합하여 보면, 이들 결과는 류마티스성 관절염에서는 다른 류마티스성 관절염에서보다 증가된 TL1A 레벨과 더욱 강력하게 관련이 있었고, 높아진 혈청 TL1A는 염증성 관절염의 셋팅에서 혈청양성(seropositive) 류마티스성 관절염에 대한 바이오마커로 고려될 수 있다.

TL1A-DR3 상호작용을 차단하는 것은 콜라겐 유도성 관절염(CIA)에서의 임상학적 결과 및 골 침식(bony erosions)을 개선한다. 앞선 연구들은 마우스의 콜라겐 유도성 관절염에서의 TL1A의 유익한 효과는 발견하였으나, 골 침식에의 TL1A 차단의 효과는 정량화하지 못하였었다. 이것을 위하여, 발명자들은 콜라겐 유도성 관절염에서 항원으로 부스팅(boosting)하는 시점에서 DBA/1 마우스에 길항적 항-TL1A 단일클론 항체를 투여하였다. 28일 후, 특히 더 이른 시점에서 총 관절 스코어에서의 현저한 감소가 관찰되었다. 관절염의 측정 가능한 임상 증상(measurable clinical sign)의 개시(onset)는 항-TL1A mAb에 의해 현저하게 지연되었다. 흥미롭게도, 항-TL1A로 치료된 마우스에서의 임상적 심각도의 감소는 항-콜라겐 항체의 역가(titer)의 감소와는 관련이 없었다. 종합하여 보면, 이들 데이터는 TL1A-DR3 상호작용을 차단하는 것은 콜라겐 면역원에 대한 전신성 면역 반응에 영향을 주지 않고 콜라겐 유도성 관절염의 임상학적 염증 증상을 강력하게 감소시킴을 나타낸다. TL1A-DR3 상호작용을 차단하는 것은 콜라겐 유도성 관절염의 임상학적 심각도를 명확하게 개선시키기 때문에, 발명자들은 이 치료가 골 침식 또한 예방할 수 있는지를 평가하였다. 발명자들은 침식의 정량적이고 국제적인 평가를 제공하기 위하여 미세전산화 단층촬영술(micro-CT)를 사용하였다. 항-TL1A 치료는 콜라겐 유도성 관절염이 발병하도록 유도된 마우스의 뒷발에의 침식을 극적으로 감소시켰다. 뒷발의 각 관절에서의 관절주위 침식(peri-articular erosions) 및 기형(deformities)의 점수를 매기는 점수 체계(scoring system)에 따른 뒷발에서의 침식의 정량화는 TL1A로 치료된 마우스에서의 평균 및 최대 침식 스코어보다 현저한 감소를 나타내었다. 상기 감소는 MTP 관절(*p=0.042)과 발가락(*p=0.015)에서 특히 확연하였다. 또한, 일반적인 기형은 단지 대조군(치료군에서의 0%에 대하여, 20%)에서만 발생하였다. 두드러지게는, 항-TL1A로 치료된 마우스에서의 침식은 발에서 현저하게 감소되어 유사한 최대 임상학적 스코어를 가진다(2-way ANOVA, 최대 임상학적 스코어와는 관계없이 치료 효과에 대하여 p<0.0001, 치료에 대하여 p<0.0001 그리고 최대 임상학적 스코어에 대하여 p<0.0001). 이는 항-TL1A 항체 치료가 임상학적 관절염을 저해함으로써 침식을 감소시킬 뿐만 아니라, 임상학적 관절 스코어에 의해 측정된 것과 같이 염증과는 관계없이 침식에 대한 예방도 제공함을 나타낸다.

H. 참고문헌

Adams DJ, Biggs PJ, Cox T, et al. Mutagenic insertion and chromosome engineering resource (MICER). Nat Genet 2004;36(8):867-71.

Adler B, Ashkar S, Cantor H, Weber GF. Costimulation by extracellular matrix proteins determines the response to TCR ligation. Cell Immunol 2001;210(1):30-40.

Adriani M, Aoki J, Horai R, et al. Impaired in vitro regulatory T cell function associated with Wiskott-Aldrich syndrome. Clin Immunol 2007;124(1):41-8.

Arestides, R.S., He, H., Westlake, R.M., Chen, A.I., Sharpe, A.H., Perkins, D.L., and Finn, P.W. (2002). Costimulatory molecule OX40L is critical for both Th1 and Th2 responses in allergic inflammation. Eur J Immunol 32, 2874-2880.

Badour K, Zhang J, Shi F, Leng Y, Collins M, Siminovitch KA. Fyn and PTP-PEST-mediated regulation of Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASp) tyrosine phosphorylation is required for coupling T cell antigen receptor engagement to WASp effector function and T cell activation. J Exp Med 2004;199(1):99-112.

Bamias, G., Martin, C., 3rd, Marini, M., Hoang, S., Mishina, M., Ross, W.G., Sachedina, M.A., Friel, C.M., Mize, J., Bickston, S.J., et al. (2003). Expression, localization, and functional activity of TL1A, a novel Th1-polarizing cytokine in inflammatory bowel disease. J Immunol 171, 4868-4874.

Bamias, G., Mishina, M., Nyce, M., Ross, W.G., Kollias, G., Rivera-Nieves, J., Pizarro, T.T., and Cominelli, F. (2006). Role of TL1A and its receptor DR3 in two models of chronic murine ileitis. Proc Natl Acad Sci U S A.

Baum W, Kirkin V, Fernandez SB, et al. Binding of the intracellular Fas ligand (FasL) domain to the adaptor protein PSTPIP results in a cytoplasmic localization of FasL. J Biol Chem 2005;280(48):40012-24.

Blott EJ, Bossi G, Clark R, Zvelebil M, Griffiths GM. Fas ligand is targeted to secretory lysosomes via a proline-rich domain in its cytoplasmic tail. J Cell Sci 2001;114(Pt 13):2405-16.

Brocker T, Riedinger M, Karjalainen K. Targeted expression of major histocompatibility complex (MHC) class II molecules demonstrates that dendritic cells can induce negative but not positive selection of thymocytes in vivo. J Exp Med 1997;185(3):541-50.

Bruijn LI, Becher MW, Lee MK, et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron 1997;18(2):327-38.

Cassatella, M.A., da Silva, G.P., Tinazzi, I., Facchetti, F., Scapini, P., Calzetti, F., Tamassia, N., Wei, P., Nardelli, B., Roschke, V., et al. (2007). Soluble TNF-like cytokine (TL1A) production by immune complexes stimulated monocytes in rheumatoid arthritis. J Immunol 178, 7325-7333.

Chakrabandhu K, Herincs Z, Huault S, et al. Palmitoylation is required for efficient Fas cell death signaling. Embo J 2007;26(1):209-20.

Chinnaiyan, A.M., O'Rourke, K., Yu, G.L., Lyons, R.H., Garg, M., Duan, D.R., Xing, L., Gentz, R., Ni, J., and Dixit, V.M. (1996). Signal transduction by DR3, a death domaincontaining receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274, 990-992.

Croft, M. (2003). Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity. Nat Rev Immunol 3, 609-620.

Dagnaes-Hansen, F., Holst, H.U., Sondergaard, M., Vorup-Jensen, T., Flyvbjerg, A., Jensen, U.B., and Jensen, T.G. (2002). Physiological effects of human growth hormone produced after hydrodynamic gene transfer of a plasmid vector containing the human ubiquitin promotor. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany) 80, 665-670.

Derry JM, Ochs HD, Francke U. Isolation of a novel gene mutated in Wiskott-Aldrich syndrome. Cell 1994;79(5):following 922.

Deshpande P, King IL, Segal BM. IL-12 driven upregulation of P-selectin ligand on myelin-specific T cells is a critical step in an animal model of autoimmune demyelination. Journal of neuroimmunology 2006;173(1-2):35-44.

Deshpande SS, Angkeow P, Huang J, Ozaki M, Irani K. Rac1 inhibits TNF-alpha-induced endothelial cell apoptosis: dual regulation by reactive oxygen species. Faseb J 2000;14(12):1705-14.

Devadas S, Das J, Liu C, et al. Granzyme B is critical for T cell receptor-induced cell death of type 2 helper T cells. Immunity 2006;25(2):237-47.

Di Prospero NA, Baker A, Jeffries N, Fischbeck KH. Neurological effects of high-dose idebenone in patients with Friedreich's ataxia: a randomised, placebo-controlled trial. Lancet neurology 2007;6(10):878-86.

Dupuis-Girod S, Medioni J, Haddad E, et al. Autoimmunity in Wiskott-Aldrich syndrome: risk factors, clinical features, and outcome in a single-center cohort of 55 patients. Pediatrics 2003;111(5 Pt 1):e622-7.

Faure S, Salazar-Fontana LI, Semichon M, et al. ERM proteins regulate cytoskeleton relaxation promoting T cell-APC conjugation. Nat Immunol 2004;5(3):272-9.

Feig C, Tchikov V, Schutze S, Peter ME. Palmitoylation of CD95 facilitates formation of SDS-stable receptor aggregates that initiate apoptosis signaling. Embo J 2007;26(1):221-31.

Fritsch RD, Shen X, Illei GG, et al. Abnormal differentiation of memory T cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 2006;54(7):2184-97.

Fritzsching B, Oberle N, Eberhardt N, et al. In contrast to effector T cells, CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells are highly susceptible to CD95 ligand- but not to TCR-mediated cell death. J Immunol 2005;175(1):32-6.

Fuss IJ, Becker C, Yang Z, et al. Both IL-12p70 and IL-23 are synthesized during active Crohn's disease and are down-regulated by treatment with anti-IL-12 p40 monoclonal antibody. Inflammatory bowel diseases 2006;12(1):9-15.

Gaudet S, Janes KA, Albeck JG, Pace EA, Lauffenburger DA, Sorger PK. A compendium of signals and responses triggered by prodeath and prosurvival cytokines. Mol Cell Proteomics 2005;4(10):1569-90.

Gavett, S.H., Chen, X., Finkelman, F., and Wills-Karp, M. (1994). Depletion of murine CD4+ T lymphocytes prevents antigen-induced airway hyperreactivity and pulmonary eosinophilia. American journal of respiratory cell and molecular biology 10, 587-593.

Gout S, Morin C, Houle F, Huot J. Death receptor-3, a new E-Selectin counter-receptor that confers migration and survival advantages to colon carcinoma cells by triggering p38 and ERK MAPK activation. Cancer Res 2006;66(18):9117-24.

Grunvald, E., Chiaramonte, M., Hieny, S., Wysocka, M., Trinchieri, G., Vogel, S.N., Gazzinelli, R.T., and Sher, A. (1996). Biochemical characterization and protein kinase C dependency of monokine-inducing activities of Toxoplasma gondii. Infect Immun 64, 2010-2018.

Hao, Z., Hampel, B., Yagita, H., and Rajewsky, K. (2004). T cell-specific ablation of Fas leads to Fas ligand-mediated lymphocyte depletion and inflammatory pulmonary fibrosis. J Exp Med 199, 1355-1365.

He L, Wu X, Meylan F, et al. Monitoring caspase activity in living cells using fluorescent proteins and flow cytometry. Am J Pathol 2004;164(6):1901-13.

Hodges, B.L., and Scheule, R.K. (2003). Hydrodynamic delivery of DNA. Expert opinion on biological therapy 3, 911-918.

Hue S, Ahern P, Buonocore S, et al. Interleukin-23 drives innate and T cell-mediated intestinal inflammation. J Exp Med 2006;203(11):2473-83.

Humblet-Baron S, Sather B, Anover S, et al. Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for regulatory T cell homeostasis. J Clin Invest 2007;117(2):407-18.

Jones RG, Elford AR, Parsons MJ, et al. CD28-dependent activation of protein kinase B/Akt blocks Fas-mediated apoptosis by preventing death-inducing signaling complex assembly. J Exp Med 2002;196(3):335-48.

Kamata H, Honda S, Maeda S, Chang L, Hirata H, Karin M. Reactive oxygen species promote TNFalpha-induced death and sustained JNK activation by inhibiting MAP kinase phosphatases. Cell 2005;120(5):649-61.

Kim YS, Morgan MJ, Choksi S, Liu ZG. TNF-induced activation of the Nox1 NADPH oxidase and its role in the induction of necrotic cell death. Mol Cell 2007;26(5):675-87.

Kim, S., and Zhang, L. (2005). Identification of naturally secreted soluble form of TL1A, a TNF-like cytokine. J Immunol Methods 298, 1-8.

Kimberley FC, Lobito AA, Siegel RM, Screaton GR. Falling into TRAPS - receptor misfolding in the TNF receptor 1-associated periodic fever syndrome. Arthritis research & therapy 2007;9(4):217.

Lambeth JD. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat Rev Immunol 2004;4(3):181-9.

Lecocq, M., Andrianaivo, F., Warnier, M.T., Wattiaux-De Coninck, S., Wattiaux, R., and Jadot, M. (2003). Uptake by mouse liver and intracellular fate of plasmid DNA after a rapid tail vein injection of a small or a large volume. The journal of gene medicine 5, 142-156.

Li QJ, Chau J, Ebert PJ, et al. miR-181a is an intrinsic modulator of T cell sensitivity and selection. Cell 2007;129(1):147-61.

Lobito AA, Kimberley FC, Muppidi JR, et al. Abnormal disulfide-linked oligomerization results in ER retention and altered signaling by TNFR1 mutants in TNFR1-associated periodic fever syndrome (TRAPS). Blood 2006;108(4):1320-7.

Maillard MH, Cotta-de-Almeida V, Takeshima F, et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med 2007;204(2):381-91.

Man S, Ubogu EE, Ransohoff RM. Inflammatory cell migration into the central nervous system: a few new twists on an old tale. Brain Pathol 2007;17(2):243-50.

Marsters SA, Sheridan JP, Donahue CJ, et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Curr Biol 1996;6(12):1669-76.

Martinez-Lorenzo MJ, Anel A, Gamen S, et al. Activated human T cells release bioactive Fas ligand and APO2 ligand in microvesicles. J Immunol 1999;163(3):1274-81.

McConchie, B.W., Norris, H.H., Bundoc, V.G., Trivedi, S., Boesen, A., Urban, J.F., Jr., and Keane-Myers, A.M. (2006). Ascaris suum-derived products suppress mucosal allergic inflammation in an interleukin-10-independent manner via interference with dendritic cell function. Infect Immun 74, 6632-6641.

McDermott MF, Aksentijevich I, Galon J, et al. Germline mutations in the extracellular domains of the 55 kDa TNF receptor, TNFR1, define a family of dominantly inherited autoinflammatory syndromes. Cell 1999;97(1):133-44.

McKenzie BS, Kastelein RA, Cua DJ. Understanding the IL-23-IL-17 immune pathway. Trends Immunol 2006;27(1):17-23.

Micheau O, Tschopp J. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes. Cell 2003;114(2):181-90.

Migone, T.S., Zhang, J., Luo, X., Zhuang, L., Chen, C., Hu, B., Hong, J.S., Perry, J.W., Chen, S.F., Zhou, J.X., et al. (2002). TL1A is a TNF-like ligand for DR3 and TR6/DcR3 and functions as a T cell costimulator. Immunity 16, 479-492.

Misulovin Z, Yang XW, Yu W, Heintz N, Meffre E. A rapid method for targeted modification and screening of recombinant bacterial artificial chromosome. Journal of immunological methods 2001;257(1-2):99-105.

Morales-Tirado V, Johannson S, Hanson E, et al. Cutting edge: selective requirement for the Wiskott-Aldrich syndrome protein in cytokine, but not chemokine, secretion by CD4+ T cells. J Immunol 2004;173(2):726-30.

Muppidi JR, Lobito AA, Ramaswamy M, et al. Homotypic FADD interactions through a conserved RXDLL motif are required for death receptor-induced apoptosis. Cell Death Differ 2006;13(10):1641-50.

Muppidi JR, Siegel RM. Ligand-independent redistribution of Fas (CD95) into lipid rafts mediates clonotypic T cell death. Nat Immunol 2004;5(2):182-9.

Nadkarni S, Mauri C, Ehrenstein MR. Anti-TNF-{alpha} therapy induces a distinct regulatory T cell population in patients with rheumatoid arthritis via TGF-{beta}. J Exp Med 2007.

Nakajima, A., Oshima, H., Nohara, C., Morimoto, S., Yoshino, S., Kobata, T., Yagita, H., and Okumura, K. (2000). Involvement of CD70-CD27 interactions in the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of neuroimmunology 109, 188-196.

Neurath M, Fuss I, Strober W. TNBS-colitis. International reviews of immunology 2000;19(1):51-62.

Neurath MF, Fuss I, Pasparakis M, et al. Predominant pathogenic role of tumor necrosis factor in experimental colitis in mice. Eur J Immunol 1997;27(7):1743-50.

Nohara, C., Akiba, H., Nakajima, A., Inoue, A., Koh, C.S., Ohshima, H., Yagita, H., Mizuno, Y., and Okumura, K. (2001). Amelioration of experimental autoimmune encephalomyelitis with anti-OX40 ligand monoclonal antibody: a critical role for OX40 ligand in migration, but not development, of pathogenic T cells. J Immunol 166, 2108-2115.

Osawa, K., Takami, N., Shiozawa, K., Hashiramoto, A., and Shiozawa, S. (2004). Death receptor 3 (DR3) gene duplication in a chromosome region 1p36.3: gene duplication is more prevalent in rheumatoid arthritis. Genes and immunity 5, 439-443.

Papadakis, K.A., Prehn, J.L., Landers, C., Han, Q., Luo, X., Cha, S.C., Wei, P., and Targan, S.R. (2004). TL1A synergizes with IL-12 and IL-18 to enhance IFN-gamma production in human T cells and NK cells. J Immunol 172, 7002-7007.

Papadakis, K.A., Zhu, D., Prehn, J.L., Landers, C., Avanesyan, A., Lafkas, G., and Targan, S.R. (2005). Dominant role for TL1A/DR3 pathway in IL-12 plus IL-18-induced IFN-gamma production by peripheral blood and mucosal CCR9+ T lymphocytes. J Immunol 174, 4985-4990.

Parlato S, Giammarioli AM, Logozzi M, et al. CD95 (APO-1/Fas) linkage to the actin cytoskeleton through ezrin in human T lymphocytes: a novel regulatory mechanism of the CD95 apoptotic pathway. Embo J 2000;19(19):5123-34.

Pivniouk VI, Snapper SB, Kettner A, et al. Impaired signaling via the high-affinity IgE receptor in Wiskott-Aldrich syndrome protein-deficient mast cells. Int Immunol 2003;15(12):1431-40.

Powrie F, Leach MW, Mauze S, Caddle LB, Coffman RL. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol 1993;5(11):1461-71.

Prehn, J.L., Thomas, L.S., Landers, C.J., Yu, Q.T., Michelsen, K.S., and Targan, S.R. (2007). The T cell costimulator TL1A is induced by FcgammaR signaling in human monocytes and dendritic cells. J Immunol 178, 4033-4038.

Ramaswamy M, Dumont C, Cruz AC, et al. Cutting Edge: Rac GTPases Sensitize Activated T Cells to Die via Fas. J Immunol 2007;179(10):6384-8.

Reinhardt RL, Khoruts A, Merica R, Zell T, Jenkins MK. Visualizing the generation of memory CD4 T cells in the whole body. Nature 2001;410(6824):101-5.

Riou C, Yassine-Diab B, Van grevenynghe J, et al. Convergence of TCR and cytokine signaling leads to FOXO3a phosphorylation and drives the survival of CD4+ central memory T cells. J Exp Med 2007;204(1):79-91.

Salek-Ardakani, S., Song, J., Halteman, B.S., Jember, A.G., Akiba, H., Yagita, H., and Croft, M. (2003). OX40 (CD134) controls memory T helper 2 cells that drive lung inflammation. J Exp Med 198, 315-324.

Schwartz M. Rho signalling at a glance. J Cell Sci 2004;117(Pt 23):5457-8.

Screaton, G.R., Xu, X.N., Olsen, A.L., Cowper, A.E., Tan, R., McMichael, A.J., and Bell, J.I. (1997). LARD: a new lymphoid-specific death domain containing receptor regulated by alternative pre-mRNA splicing. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 4615-4619.

Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol 2004;22(12):1567-72.

Shell S, Park SM, Radjabi AR, et al. Let-7 expression defines two differentiation stages of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104(27):11400-5.

Siegel RM, Chan FK, Chun HJ, Lenardo MJ. The multifaceted role of Fas signaling in immune cell homeostasis and autoimmunity. Nat Immunol 2000;1(6):469-74.

Siegel RM, Frederiksen JK, Zacharias DA, et al. Fas preassociation required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutations. Science 2000;288(5475):2354-7.

Siegel RM, Muppidi JR, Sarker M, et al. SPOTS: signaling protein oligomeric transduction structures are early mediators of death receptor-induced apoptosis at the plasma membrane. J Cell Biol 2004;167(4):735-44.

Soroosh, P., Ine, S., Sugamura, K., and Ishii, N. (2006). OX40-OX40 ligand interaction through T cell-T cell contact contributes to CD4 T cell longevity. J Immunol 176, 5975-5987.

Steed, P.M., Tansey, M.G., Zalevsky, J., Zhukovsky, E.A., Desjarlais, J.R., Szymkowski, D.E., Abbott, C., Carmichael, D., Chan, C., Cherry, L., et al. (2003). Inactivation of TNF signaling by rationally designed dominant-negative TNF variants. Science 301, 1895-1898.

Storey H, Stewart A, Vandenabeele P, Luzio JP. The p55 tumour necrosis factor receptor TNFR1 contains a trans-Golgi network localization signal in the C-terminal region of its cytoplasmic tail. The Biochemical journal 2002;366(Pt 1):15-22.

Stranges PB, Watson J, Cooper CJ, et al. Elimination of antigen-presenting cells and autoreactive T cells by fas contributes to prevention of autoimmunity. Immunity 2007;26(5):629-41.

Strober W, Fuss I, Mannon P. The fundamental basis of inflammatory bowel disease. J Clin Invest 2007;117(3):514-21.

Su, A.I., Wiltshire, T., Batalov, S., Lapp, H., Ching, K.A., Block, D., Zhang, J., Soden, R., Hayakawa, M., Kreiman, G., et al. (2004). A gene atlas of the mouse and human protein-encoding transcriptomes. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 6062-6067.

Sukits SF, Lin LL, Hsu S, Malakian K, Powers R, Xu GY. Solution structure of the tumor necrosis factor receptor-1 death domain. Journal of molecular biology 2001;310(4):895-906.

Sullivan KE, Mullen CA, Blaese RM, Winkelstein JA. A multiinstitutional survey of the Wiskott-Aldrich syndrome. J Pediatr 1994;125(6 Pt 1):876-85.

Suzuki A, Yamaguchi MT, Ohteki T, et al. T cell-specific loss of Pten leads to defects in central and peripheral tolerance. Immunity 2001;14(5):523-34.

Tang Q, Adams JY, Tooley AJ, et al. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat Immunol 2006;7(1):83-92.

Tao, X., Constant, S., Jorritsma, P., and Bottomly, K. (1997). Strength of TCR signal determines the costimulatory requirements for Th1 and Th2 CD4+ T cell differentiation. J Immunol 159, 5956-5963.

Touitou I, Lesage S, McDermott M, et al. Infevers: an evolving mutation database for auto-inflammatory syndromes. Human mutation 2004;24(3):194-8.

Valencia X, Stephens G, Goldbach-Mansky R, Wilson M, Shevach EM, Lipsky PE. TNF downmodulates the function of human CD4+CD25hi T-regulatory cells. Blood 2006;108(1):253-61.

von Andrian UH, Mackay CR. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N Engl J Med 2000;343(14):1020-34.

Wang, E.C., Thern, A., Denzel, A., Kitson, J., Farrow, S.N., and Owen, M.J. (2001). DR3 regulates negative selection during thymocyte development. Mol Cell Biol 21, 3451-3461.

Watts, T.H. (2005). TNF/TNFR family members in costimulation of T cell responses. Annu Rev Immunol 23, 23-68.

Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., and Wei, P. (2003). TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. J Biol Chem 278, 39251-39258.

Wise CA, Gillum JD, Seidman CE, et al. Mutations in CD2BP1 disrupt binding to PTP PEST and are responsible for PAPA syndrome, an autoinflammatory disorder. Human molecular genetics 2002;11(8):961-9.

Xiao, Q., Hsu, C.Y., Chen, H., Ma, X., Xu, J., and Lee, J.M. (2005). Characterization of cis-regulatory elements of the vascular endothelial growth inhibitor gene promoter. Biochem J 388, 913-920.

Yamazaki, K., McGovern, D., Ragoussis, J., Paolucci, M., Butler, H., Jewell, D., Cardon, L., Takazoe, M., Tanaka, T., Ichimori, T., et al. (2005). Single nucleotide polymorphisms in TNFSF15 confer susceptibility to Crohn's disease. Human molecular genetics 14, 3499-3506.

Zhang Z, Zheng M, Bindas J, Schwarzenberger P, Kolls JK. Critical role of IL-17 receptor signaling in acute TNBS-induced colitis. Inflammatory bowel diseases 2006;12(5):382-8.

Zhang, J., Salcedo, T.W., Wan, X., Ullrich, S., Hu, B., Gregorio, T., Feng, P., Qi, S., Chen, H., Cho, Y.H., et al. (2001). Modulation of T-cell responses to alloantigens by TR6/DcR3. J Clin Invest 107, 1459-1468.

Zhumabekov T, Corbella P, Tolaini M, Kioussis D. Improved version of a human CD2 minigene based vector for T cell- specific expression in transgenic mice. Journal of immunological methods 1995;185(1):133-40.

SEQUENCE LISTING <110> GOVERNMENT OF THE UNITED STATES, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES SIEGEL, Richard M MEYLAN, Francoise SONG, Yun-Jeong <120> BLOCKADE OF TL1A-DR3 INTERACTIONS TO AMELIORATE T CELL MEDIATED DISEASE PATHOLOGY AND ANTIBODIES THEREOF <130> 6137NIAMS-2-PCT <150> 61/488,671 <151> 2011-05-20 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1743 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctgaaggcgg aaccacgacg ggcagagagc acggagccgg gaagcccctg ggcgcccgtc 60 ggagggctat ggagcagcgg ccgcggggct gcgcggcggt ggcggcggcg ctcctcctgg 120 tgctgctggg ggcccgggcc cagggcggca ctcgtagccc caggtgtgac tgtgccggtg 180 acttccacaa gaagattggt ctgttttgtt gcagaggctg cccagcgggg cactacctga 240 aggccccttg cacggagccc tgcggcaact ccacctgcct tgtgtgtccc caagacacct 300 tcttggcctg ggagaaccac cataattctg aatgtgcccg ctgccaggcc tgtgatgagc 360 aggcctccca ggtggcgctg gagaactgtt cagcagtggc cgacacccgc tgtggctgta 420 agccaggctg gtttgtggag tgccaggtca gccaatgtgt cagcagttca cccttctact 480 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Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser 305 310 315 320 Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr 325 330 335 Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg 340 345 350 Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val Glu Val Glu Ile 355 360 365 Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys Arg Trp Arg Gln 370 375 380 Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala Leu Glu Arg Met 385 390 395 400 Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gln Arg Gly 405 410 415 Pro <210> 3 <211> 2016 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gagagggaaa agggaaggag gagactgagt gattaagtca cccactgtga agagctggtc 60 ttctatttaa tgggggctct ctctgcccag gagtcagagg tgcctccagg agcagcagga 120 gcatggccga ggatctggga ctgagctttg gggaaacagc cagtgtggaa atgctgccag 180 agcacggcag ctgcaggccc aaggccagga gcagcagcgc acgctgggct ctcacctgct 240 gcctggtgtt gctccccttc cttgcaggac tcaccacata cctgcttgtc agccagctcc 300 gggcccaggg agaggcctgt gtgcagttcc aggctctaaa aggacaggag 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205 Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp 210 215 220 Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys 225 230 235 240 Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu 245 250 <210> 5 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 65 70 75 80 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp 85 90 95 Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp 100 105 110 Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser 115 120 125 Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys 130 135 140 <210> 6 <211> 159 <212> PRT <213> Murine <400> 6 Met Glu Glu Leu Pro Arg Arg Glu Arg Ser Pro Pro Gly Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Gly Ser Thr Ala Arg Val Leu Gln Pro Leu Phe Leu Pro Leu Leu 20 25 30 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Met Ser 35 40 45 Gly Arg Cys Asp Cys Ala Ser Glu Ser Gln Lys Arg Tyr Gly Pro Phe 50 55 60 Cys Cys Arg Gly Cys Pro Lys Gly His Tyr Met Lys Ala Pro Cys Ala 65 70 75 80 Glu Pro Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Pro Cys Pro Ser Asp Thr Phe 85 90 95 Leu Thr Arg Asp Asn His Phe Lys Thr Asp Cys Thr Arg Cys Gln Val 100 105 110 Cys Asp Glu Glu Ala Leu Gln Val Thr Leu Glu Asn Cys Ser Ala Lys 115 120 125 Ser Asp Thr His Cys Gly Cys Gln Ser Gly Trp Cys Val Asp Cys Ser 130 135 140 Thr Glu Pro Cys Gly Lys Ser Ser Pro Phe Ser Cys Val Pro Cys 145 150 155 <210> 7 <211> 170 <212> PRT <213> Murine <400> 7 Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg Ala 1 5 10 15 His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn Gln 20 25 30 Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys 35 40 45 Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly 50 55 60 Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu 65 70 75 80 Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile 85 90 95 Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr Gln 100 105 110 Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp Phe 115 120 125 Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys 130 135 140 Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu 145 150 155 160 Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu 165 170 <210> 8 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Leu Arg Ala Ile Thr Glu Glu Arg Ser Glu Pro Ser Pro Gln Gln 1 5 10 15 Val Tyr Ser Pro Pro Arg Gly Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Ile Lys 20 25 30 Lys Gln Thr Pro Ala Pro His Leu Lys Asn Gln Leu Ser Ala Leu His 35 40 45 Trp Glu His Asp Leu Gly Met Ala Phe Thr Lys Asn Gly Met Lys Tyr 50 55 60 Ile Asn Lys Ser Leu Val Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Thr Phe Arg Gly Thr Thr Ser Val Cys Gly Asp Ile Ser 85 90 95 Arg Gly Arg Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Ile Thr Lys 100 105 110 Val Ala Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Ala Arg Leu Leu Thr Gly Ser Lys 115 120 125 Ser Val Cys Glu Ile Ser Asn Asn Trp Phe Gln Ser Leu Tyr Leu Gly 130 135 140 Ala Thr Phe Ser Leu Glu Glu Gly Asp Arg Leu Met Val Asn Val Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly 165 170 175 Ala Phe Leu Leu 180 <210> 9 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD of DR3 <400> 9 Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg Cys Asp Cys Ala 1 5 10 15 Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys Arg Gly Cys Pro 20 25 30 Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro Cys Gly Asn Ser 35 40 45 Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 50 55 60 <210> 10 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD of DR3 <400> 10 Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg Cys Asp Cys Ala 1 5 10 15 Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys Arg Gly Cys Pro 20 25 30 Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro Cys Gly Asn Ser 35 40 45 Thr Cys 50 <210> 11 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD of DR3 <400> 11 Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg Cys Asp Cys Ala 1 5 10 15 Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys Arg Gly Cys Pro 20 25 30 Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro 35 40 <210> 12 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD of DR3 <400> 12 Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg Cys Asp Cys Ala 1 5 10 15 Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys Arg Gly Cys Pro 20 25 30 Ala Gly His Tyr Leu Lys 35 <210> 13 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD of DR3 <400> 13 Pro Arg Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe 1 5 10 15 Cys Cys Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr 20 25 30 Glu Pro Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe 35 40 45 Leu Ala 50 <210> 14 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD of DR3 <400> 14 Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr 1 5 10 15 Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val 20 25 30 Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 35 40 <210> 15 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD of DR3 <400> 15 Ile Gly Leu Phe Cys Cys Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Pro Cys Thr Glu Pro Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro 20 25 30 Gln Asp Thr Phe Leu Ala 35 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyarginine <400> 16 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antp <400> 17 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-Tat <400> 18 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Penetratin <400> 19 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antp-3A <400> 20 Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala 1 5 10 15 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat <400> 21 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 22 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Buforin II <400> 22 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 1 5 10 15 Arg Leu Leu Arg Lys 20 <210> 23 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transportan <400> 23 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Model Amphipathic Peptide (MAP) <400> 24 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-FGF <400> 25 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ku70 <400> 26 Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu 1 5 10 <210> 27 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Prion <400> 27 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pVEC <400> 28 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-1 <400> 29 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SynB1 <400> 30 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-7 <400> 31 Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HN-1 <400> 32 Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu 1 5 10

Claims (25)

1. DR3 및 TL1A 사이의 상호작용을 차단하는 것을 포함하는 피험자에서 염증성 또는 자가면역성 질병을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 DR3의 내인성(endogenous) 레벨을 감소시킴으로써 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 TL1A의 내인성(endogenous) 레벨을 감소시킴으로써 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 DR3 Fc 융합 단백질(fusion protein)의 투여에 의해 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 항-DR3 항체의 투여에 의해 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 항-TL1A 항체의 투여에 의해 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 DR3 및 TL1A 사이의 상호작용은 DR3 프리-리간드 어셈블리 도메인(pre-ligand assembly domain, PLAD)을 포함하는 펩티드의 투여에 의해 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 펩티드는 서열 R¹-DR3 PLAD-R²를 가지며, 여기에서 DR3 PLAD는 SEQ ID NO:2의 아미노산 43-58을 포함하며, 여기에서 R¹ 및 R²는 선택적으로 H, 아실(acyl), NH₂, 아미노산 또는 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 염증성 또는 자가면역성 질병은 천식(asthma)인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 또는 자가면역성 질병은 다발성 경화증(multiple sclerosis)인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 또는 자가면역성 질병은 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 또는 자가면역성 질병은 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 또는 자가면역성 질병은 제1형 당뇨병(type I diabetes)인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 또는 자가면역성 질병은 이식편대 숙주질병(graft versus host disease)인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 또는 자가면역성 질병은 T 세포 성분으로 인한 자가면역성 질병인 것을 특징으로 하는 방법.
16. (a) DR3 및 TL1A를 포함하는 샘플을 준비하는 단계,
    (b) 후보약제와 샘플을 접촉시키는 단계,
    (c) DR3/TL1A 결합 레벨을 측정하는 단계, 및
    (d) 대조군과 결합 레벨을 비교하는 단계
    를 포함하며, 항염증제를 확인하는 대조군과 비교하여 DR3/TL1A 결합을 감소시키는 항염증제(anti-inflammatory agent)를 확인하는 방법.
17. TL1A에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
18. 제17항에 있어서,
    인간 TL1A 및 마우스 TL1A로 이루어지는 군에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 단일클론 항체는 인간화(humanized)된 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 단일클론 항체는 인간화되었으며, 여기에서 상기 항체는 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 중쇄 가변영역(heavy chain variable region) 및 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 경쇄 가변영역(light chain variable region)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
21. 제17항에 있어서,
    상기 항체는 항-인간 TL1A 클론 1A9인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
22. 제17항에 있어서,
    상기 항체는 항-인간 TL1A 클론 1C6인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
23. 제17항에 있어서,
    상기 항체는 항-인간 TL1A 클론 12B12.6인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
24. 제17항에 있어서,
    상기 항체는 항-인간 TL1A 클론 5G4.6인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
25. 제6항에 있어서,
    상기 항-TL1A 항체는 클론 1A9 및 클론 1C6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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