KR20140092227A - 분리 방법용 조성물 - Google Patents

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KR20140092227A
KR20140092227A KR1020137017938A KR20137017938A KR20140092227A KR 20140092227 A KR20140092227 A KR 20140092227A KR 1020137017938 A KR1020137017938 A KR 1020137017938A KR 20137017938 A KR20137017938 A KR 20137017938A KR 20140092227 A KR20140092227 A KR 20140092227A
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트레이시 톰슨
베른드 헬무트 아담 렘
앤드류 브라이언 헐버트
에드워드 조지 새라볼락
Original Assignee
트레이시 톰슨
에드워드 조지 새라볼락
앤드류 브라이언 헐버트
베른드 헬무트 아담 렘
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Abstract

본 발명은 대체로 분리 및 변환 기술 분야, 특히 접선-유동 여과 기술에 관한 것이다. 접선-유동 물질은 역삼투, 미세 여과, 한외 여과, 또는 나노여과, 반투과성 여과막에 의존하는 것들을 포함하는, 넓은 범위의 분리 및 변환 공정에서 유용하며, 접선-유동 여과 상에서 사용하기 위한 바이오 폴리머를 포함하는, 다양한 기질의 분리 또는 생성 방법을 제공한다.

Description

분리 방법용 조성물{COMPOSITIONS FOR SEPARATION METHODS}
본 발명은 대체로 분리 및 변환 기술 분야, 특히 접선 유동 여과 기술(tangential-flow filtration technique)에서 사용하기 위한 물질에 관한 것이다. 접선 유동 여과 기술은, 역삼투(reverse osmosis), 미세여과(microfiltration), 한외여과(ultrafiltration), 또는 나노여과(nanofiltration) 반투과성 여과막(semipermeable filtration membrane)에 의존하는 것들을 포함하는, 넓은 범위의 분리 및 변환 공정에서 유용하며, 다양한 목표 물질(target substance)을 정제 또는 생성하기 위한 효율적 방법을 제공하다.
원치 않는 물질, 예컨대 복합 조성물로부터 원하는 목표 물질을 분리하는 것은, 식품, 화학물질, 약물, 및 생물 제제 예컨대 세포, 바이러스, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 대사물을 포함하는 많은 중요 상품의 생산에서 기본 단계이다. 마찬가지로, 하나 이상의 전구 물질을 원하는 물질로, 예컨대 효소 전환 및 임의로 예컨대 전구 물질로부터 목표 물질을 강화 또는 분리함으로써 변환시키는 것은, 많은 제조 방법에서 기본 단계이다.
그 결과로서, 원하는 목표 물질의 효율적 분리 및 생성을 가능하게 하기 위한 방법 및 기술의 개발에 많은 비용이 들었다. 제 2 성분, 예컨대 다른 액체, 또는 하나 이상의 용해 또는 현탁된 고체로부터, 하나 이상의 원하는 기질, 전형적으로 하나 이상의 액체를 분리하기 위해, 예를 들어, 역삼투(RO), 미세 여과(MF), 한외 여과(UF), 및 나노 여과(NF) 기술이 오랫동안 개발되어 왔다.
가장 흔히 사용되는 것은, 충전층 크로마토그래피(packed bed chromatography)로서, 수지(resin) 입자를 층(bed) 내에 패킹하고, 목표 분자를 함유하는 용액을 컬럼 내로 통과시켜, 목표 분자가 수지에 결합하게 한다. 상기 방법의 특별한 문제점은, 불규칙한 유동 채널(flow channel)을 형성한다는 것이다. 이러한 불규칙 유동 채널은, 목표 분자의 효율적인 정제를 방해할 뿐만 아니라, 수지에 대한 효율적인 세척도 방해하여, 잠재적인 오염 가능성이 생긴다.
예를 들어, 단일 클론 항체(monoclonal antibody)의 생성시, 층(bed)을 10배 과잉의 수지로 패킹함으로서 불규칙 유동 경로를 해결할 수 있다는 것이 제안되었다. 명백하게, 상기 제안을 채택할 때에는, 비용이 많이 들지만 효율적인 결과가 있었다. 모든 이용가능한 매체에 대해 접근할 수 있는 시스템에서, 요구되는 수지의 양을 감소시켜, 생산 비용을 감소시킬 수 있다.
불규칙 유동 경로의 위험성을 감소시키는 하나의 해결책은, 컬럼의 가동 압력을 감소시키는 것이다. 이것은 채널링(channelling) 위험성의 감소라는 원하는 효과를 갖는 반면, 가동 시간의 증가라는 부정적 결과도 갖는다.
접선-유동(또는 크로스-플로우(cross-flow)라고도 함) 여과 공정은, 유동층이 반투과성 막 표면을 가로지르며, 농축된 스트림이 통상적으로 공급 유동층 경로의 하류(downstream)로 빠져나가는데, 이는 상기의 일부 문제를 해결할 잠재 가능성을 갖는다. 이들 공정 및 다른 여과 공정에서 사용하기 위해, 다양한 반투과성 막이 개발되어 왔다.
기존의 접선-유동 기술은, 특이적인 분리에는 만족스러운 반면, 특정 목표 물질, 예컨대 폴리펩티드를 복합 공급 원료로부터 제조 또는 분리하는 응용에는 잘 맞지 않는다. 높은 수준의 미립자를 갖는 원료액, 또는 입자를 사용하는 여과 기술은, 일반적으로 접선-유동 여과의 응용에는 잘 맞지 않으며, 이는 전형적으로 이들이 겔층을 형성하거나 그렇지 않으면 필터 막을 막거나, 또는 막에 달라붙어 효율성을 감소시키기 때문이다. 이러한 문제를 해결하기 위한 시도는, 크고 견고한 입자(100 내지 300 마이크론의 수준)의 사용에 집중되었다. 큰 크기와 견고함은 파울링(fouling)의 위험성 또는 그 정도를 감소시키는 반면, 감소된 표면적 대 부피 비율로 인해 결합 부위가 거의 없어져서, 수지를 더욱 많이 사용할 것이 요구된다.
본 발명의 목적은, 상기의 일부 단점들을 극복하거나 적어도 경감시켜서, 특히 접선-유동 여과에 의해 목표 물질을 분리 및 정제하기 위한 개선된 조성물 및 그 방법을 제공하거나, 또는 적어도 대중에게 유용한 선택 사항을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해지며, 이는 하기의 실시예에 의해서만 주어진다.
본 발명은 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 원료 물질로부터 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 무정형 폴리머 입자의 집단이 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 이의 하나 또는 그 이상의 전구 물질, 또는 하나 또는 그 이상의 오염물과 결합하기에 충분한 시간 동안, 원료 물질을 상기 무정형 폴리머 입자의 집단과 접촉시키는 단계, 접선-유동 여과에 의해 하나 또는 그 이상의 오염물을 입자-결합 목표 물질 또는 이의 전구 물질, 또는 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 이의 전구 물질을 입자-결합 오염물로부터 분리하는 단계, 및 목표 물질을 회수하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 무정형 폴리머 입자의 집단은 동종 집단이다. 다른 구현예에서, 무정형 폴리머 입자의 집단은 이종 집단이다.
하나의 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 무정형 폴리머 입자는, 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는, 하나 또는 그 이상의 바이오폴리머를 포함한다.
하나의 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 무정형 폴리머 입자는, 입자-형성 단백질에 의해 합성되거나, 또는 합성 가능하다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 모든 폴리머 입자의 집단은 입자-형성 단백질에 의해 합성되거나, 또는 합성 가능하다.
하나의 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 무정형 폴리머 입자는, 폴리머 입자-형성 단백질, 예컨대 폴리머 합성효소(polymer synthase) 또는 폴리머 합성효소 융합체(polymer synthase fusion))를 포함한다.
하나의 구현예에서, 목표 물질의 회수는 폴리머 입자로부터의 용출(elution)에 의한다. 하나의 구현예에서, 목표 물질의 회수는 접선-유동 여과 투과물(permeate)의 수집(collection)에 의한다. 하나의 구현예에서, 목표 시스템의 회수는 접선-유동 여과 잔류물(retentate)의 수집에 의한다.
따라서 하나의 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 원료 물질로부터 분리 또는 회수하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하나 또는 그 이상의 목표 물질과 결합하기에 충분한 시간 동안, 원료 물질을 상기 폴리머 입자의 집단과 접촉시키는 단계, 하나 또는 그 이상의 오염물을 접선-유동 여과에 의해 입자-결합 목표 물질로부터 분리하는 단계, 및 목표 물질을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 것들을 포함한다:
ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성효소 또는 폴리머 합성효소 융합체; 또는
ⅲ) 상기의 둘 다
따라서, 다른 측면에서 본 발명은 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 원료 물질로부터 분리 또는 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하나 또는 그 이상의 오염물에 결합하기에 충분한 시간 동안 원료 물질을 상기 폴리머 입자의 집단을 접촉시키는 단계, 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 접선-유동 여과에 의해 입자-결합 오염물로부터 분리하는 단계, 및 목표 물질을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 것들을 포함한다:
ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성효소 또는 폴리머 합성효소 융합체; 또는
ⅲ) 상기의 둘 다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 반응 산물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하나 또는 그 이상의 반응 기질의 원하는 분획과 결합하기에 충분한 시간 동안, 접선-유동 여과에 의해 하나 또는 그 이상의 반응 기질을 포함하는 원료 물질을 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자와 접촉시키는 단계, 임의로 하나 또는 그 이상의 오염물을 접선-유동 여과에 의해 폴리머 입자로부터 분리하는 단계, 및 반응 산물을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 반응 촉매를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 것들을 포함한다:
ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성효소 또는 폴리머 합성효소 융합체; 또는
ⅲ) 상기의 둘 다.
본 발명은 추가로 목표 물질을 원료 물질로부터 분리하는 정제 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 원료 물질을 제공하는 단계, (b) 상기 원료 물질을 적어도 하나의 반투과성 필터로 접선-유동 여과하며, 상기 원료 물질 또는 반투과성 필터가 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 포함하는 단계, 및 (c) 목표 물질을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 원료 물질, 상기 반투과성 필터, 또는 상기 접선 유동 여과시 사용되는 하나 또는 그 이상의 용액은 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 목표 물질과 결합할 수 있는 리간드를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 것들을 포함한다:
ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
ⅴ) 친화성 리간드;
ⅵ) 효소;
ⅶ) 상기의 i) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
ⅷ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
따라서, 하나의 예시적 구현예에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 항체의 정제를 위한 정제 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 항체를 포함하는 원료 물질을 제공하는 단계, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 포함하는 적어도 하나의 반투과성 필터로 상기 원료 물질을 접선-유동 여과하는 단계로서, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 항체와 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 단계, 및 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
따라서, 다른 예시적 구현예에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 정제하기 위한 정제 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자을 포함하는 원료 물질을 제공하는 단계, 원료 물질을 적어도 하나의 반투과성 막으로 접선-유동 여과하는 단계를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 것을 포함한다:
ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
ⅲ) 상기의 둘 다.
추가적 관점에서, 본 발명은 하기의 것들을 포함하는 폴리머 입자를 제공하며:
ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
ⅲ) 상기의 둘 다; 및
상기 하나 또는 그 이상의 융합 폴리펩티드는, Streptococcus spp.로부터의 단백질 G의 GB1 도메인이거나, 또는 이를 포함한다.
융합 폴리펩티드는, 폴리머 입자-형성 폴리펩티드 및 Streptococcus spp.로부터의 단백질 G의 하나 또는 그 이상의 GB1 도메인을 포함한다.
하나의 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열 번호 4의 12개 또는 그 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 GB1 도메인이거나, 또는 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 서열 번호 4의 12개 또는 그 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드이거나, 또는 이를 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 폴리머 입자는 30mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자보다 큰 이뮤노글로블린 결합 능력(binding capacity)을 갖는다.
하나의 구현예에서, 결합 능력은 적어도 약 35mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 약 40mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 약 45mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 약 50mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 55mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 또는 약 60mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자이다.
하나의 구현예에서, 이뮤노글로블린은 IgG이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 접선-유동 여과 용도의 반투과성 필터의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 투과성 또는 반투과성 지지체를 제공하는 단계, 상기 반투과성 필터를 제공하기 위해, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 상기 지지체와 연결하는 단계를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 것들을 포함한다:
ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
ⅲ) 상기의 둘 다.
추가적 측면에서, 본 발명은 폴리머 입자의 제조 방법을 제공하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 것들을 포함하며;
ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
ⅲ) 상기의 둘 다;
상기 방법은 접선-유동 여과에 의해, 하나 또는 그 이상의 오염물을 폴리머 입자로부터 분리하는 단계, 및 폴리머 입자를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 원료 물질로부터 분리 또는 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 접선-유동 여과에 의해 하나 또는 그 이상의 오염물을 폴리머 입자로부터 분리하는 단계, 및 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 회수하는 단계를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 입자는 하기의 것들을 포함한다:
ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
ⅲ) 상기의 둘 다.
본 발명은 추가로 본 명세서에서 설명한 바와 같은 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 포함하는, 조성물, 막, 필터, 및 필터 장치(예컨대, 필터 카트리지)를 제공한다. 이러한 조성물, 막, 필터, 및 필터 장치는 특히 접선-유동 여과에 사용하기에 적합하다.
하기의 구현예는 상기의 어떠한 관점과도 관련된다.
다양한 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 하나 또는 그 이상의 것들을 포함한다:
ⅰ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
ⅱ) 폴리펩티드 융합 파트너;
ⅲ) 친화성 리간드;
ⅳ) 효소;
ⅴ) 상기의 i) 내지 ⅳ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
ⅵ) 상기의 i) 내지 ⅴ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
다양한 구현예에서, 실질적으로 모든 폴리머 입자는 하기의 것들을 포함한다:
ⅰ) 바이오폴리머, 예컨대 폴리-베타-히드록시산, 바이오폴리락테이트, 바이오폴리티오에스테르, 및 바이오폴리에스테르로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
ⅲ) 상기의 둘 다.
하나의 구현예에서, 폴리머 입자-형성 폴리펩티드는 입자 표면에 공유 결합한다.
하나의 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 이의 표면에 나타나는 하나 또는 그 이상의 리간드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 폴리머 입자는 반투과성 지지체, 예컨대 반투과성 막, 수지, 접선-유동 필터, 접선-유동 필터 카트리지 등에 결합되거나, 이와 연결되거나, 또는 이를 포함한다.
하나의 구현예에서, 원료 물질은 세포 용해물(cell lysate)이거나, 또는 이로부터 유래된다. 하나의 구현예에서, 원료 물질은 시험관내(in vitro) 단백질 발현 시스템을 포함하는 단백질 발현 시스템이거나, 또는 이로부터 유래된다.
하나의 구현예에서, 원료 물질은 식품, 예컨대 유제품 또는 유가공 스트림, 와인 또는 맥주 발효물 등을 포함하는 발효물 등이거나, 또는 이로부터 유래한다.
하나의 구현예에서, 원료 물질은 반응 용액, 화학적 합성 용액, 화학적 합성 중간체 등을 포함하는 용액이다.
하나의 구현예에서, 목표 물질은 폴리펩티드, 예컨대 재조합 폴리펩티드, 항체, 효소, 호르몬 등이다.
하나의 구현예에서, 목표 물질은 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 올리고뉴클레오티드, rRNA, mRNA, miRNA, siRNA, 또는 tRNA와 같은 RNA 분자, 또는 cDNA와 같은 DNA 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
하나의 구현예에서, 목표 물질은 분비된 대사물질을 포함하는 세포 대사물질이다.
다양한 구현예에서, 폴리머 입자는 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트(PHA)로부터 선택되는 바이오폴리머를 포함한다. 가장 바람직하게는, 폴리머는 폴리히드록시알카노에이트, 더욱 바람직하게는 폴리(3-히드록시부티레이트)(PHB)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 입자를 구성하는 폴리머는 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트(PHA)로부터 선택된 바이오폴리머로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로서만 이루어진다. 가장 바람직하게는, 폴리머가 폴리히드록시알카노에이트, 바람직하게는 폴리(3-히드록시부티레이트)(PHB)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리머 입자는 인지질 단일층으로 둘러싸인(encapsulate) 폴리머 입자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리머 합성 효소는 폴리머 입자 또는 인지질 단일층에 결합하거나, 또는 상기의 둘 다에 결합한다.
다양한 구현예에서, 폴리머 입자는 둘 또는 그 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리머 입자는 폴리머 입자 표면 상에, 둘 또는 그 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리머 입자는 셋 또는 그 이상의 상이한 융합 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 입자 표면 상의 셋 또는 그 이상의 상이한 융합 폴리머를 포함한다.
다양한 구현예에서, 폴리머 입자는 추가로 폴리머 입자에 결합되거나 또는 포함된 적어도 하나의 물질, 또는 이들의 조합을 포함한다.
다양한 구현예에서, 물질은 가교(cross-linking)에 의해 폴리머 입자에 결합된다.
다양한 구현예에서, 폴리머 합성 효소는 폴리머 입자 또는 인지질 단일층에 결합되거나, 또는 상기의 둘 다에 결합된다.
다양한 구현예에서, 폴리머 합성 효소는 자신이 형성하는 폴리머 입자에 공유-결합 또는 비공유 결합된다.
다양한 구현예에서, 폴리머 합성 효소는 1류 Acinetobacter , Vibrio , Aeromonas, Chromobacterium , Pseudomonas , Zoogloea , Alcaligenes , Delftia , Burkholderia, Ralstonia , Rhodococcus , Gordonia , Rhodobacter , Paracoccus , Rickettsia, Caulobacter , M ethylobacterium , Azorhizobium , Agrobacterium , Rhizobium, Sinorhizobium , Rickettsia , Crenarchaeota , Synechocystis , Ectothiorhodospira, Thiocapsa , Thyocystis 및 Allochromatium 속(genera), 2류 Burkholderia 및 Pseudomonas 속, 또는 4류 Bacillus 속으로부터, 더욱 바람직하게는 1류 Acinetobacter 종 RA3849, Vibrio cholerae , Vibrio parahaemolyticus , Aeromonas punctata FA440, Aeromonas hydrophila , Chromobacterium violaceum , Pseudomonas 종 61-3, Zoogloea ramigera , Alcaligenes latus , Alcaligenes 종 SH-69, Delftia acidovorans , Burkholderia 종 DSMZ9242, Ralstonia eutrophia H16, Burkholderia cepacia , Rhodococcus rubber PP2, Gordonia rubripertinctus , Rickettsia prowazekii , Synechocystis 종 PCC6803, Ectothiorhodospira shaposhnikovii N1, Thiocapsa pfennigii 9111, Allochromatium vinosum D, Thyocystis violacea 2311, Rhodobacter sphaeroides , Paracoccus denitrificans , Rhodobacter capsulatus , Caulobacter crescentus , M ethylobacterium extorquens , Azorhizobium caulinodans , Agrobacterium tumefaciens , Sinorhizobium meliloti 41, Rhodospirillum rubrum HA, 및 Rhodospirillum rubrum ATCC25903, 2류 Burkholderia caryophylli , Pseudomonas chloraphis , Pseudomonas 종 61-3, Pseudomonas putida U, Pseudomonas oleovorans , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas R esinovorans , Pseudomonas stutzeri , Pseudomonas mendocina , Pseudomonas pseudolcaligenes , Pseudomonas putida BM01, Pseudomonas nitroreducins, Pseudomonas chloraphis, 및 4류 Bacillus megaterium 및 Bacillus 종 INT005를 포함하는 군에서 선택되는 PHA 합성 효소이다.
다른 구현예에서, 폴리머 합성 효소는 그람(gram)-음성 및 그람-양성 진정세균, 또는 고세균으로부터의 PHA 폴리머 합성 효소이다.
다양한 실시예에서, 폴리머 합성 효소는 각각 C. necator , P. aeruginosa , A. vinosum , B. megaterium , H. marismortui , P. aureofaciens, 또는 P. putida(각각, 기탁 번호(Accession No.)가 AY836680, AE004091, AB205104, AF109909, YP137339, AB049413 및 AF150670임)로부터의 PHA 폴리머 합성 효소이다.
본 발명에서 사용하기에 용이한 다른 폴리머 합성 효소는, 하기의 생물(각각의 기탁 번호로 식별)로부터 폴리머 합성 효소를 포함한다: R. eutropha (A34341), T. pfennigii (X93599), A. punctata (O32472), Pseudomonas 종 61-3 (AB014757 및 AB014758), R. sphaeroides (AAA72004), C. violaceum (AAC69615), A. borkumensis SK2 (CAL17662), A. borkumensis SK2 (CAL16866), R. sphaeroides KD131 (ACM01571 및 YP002526072), R. opacus B4 (BAH51880 및 YP002780825), B. multivorans ATCC 17616 (YP001946215 및 BAG43679), A. borkumensis SK2(YP693934 및 YP693138), R. rubrum (AAD53179), gamma proteobacterium HTCC5015 (ZP05061661 및 EDY86606), Azoarcus 종 BH72 (YP932525), C. violaceum ATCC 12472 (NP902459), Limnobacter 종 MED105 (ZP01915838 및 EDM82867), M. algicola DG893 (ZP01895922 및 EDM46004), R. sphaeroides (CAA65833), C. violaceum ATCC 12472 (AAQ60457), A. latus (AAD10274, AAD01209 및 AAC83658), S. maltophilia K279a (CAQ46418 및 YP001972712), R. solanacearum IPO1609 (CAQ59975 및 YP002258080), B. multivorans ATCC 17616 (YP001941448 및 BAG47458), Pseudomonas 종 gl13 (ACJ02400), Pseudomonas 종 gl06 (ACJ02399), Pseudomonas 종 gl01 (ACJ02398), R. 종 gl32 (ACJ02397), R. leguminosarum bv. viciae 3841 (CAK10329 및 YP770390), Azoarcus 종 BH72 (CAL93638), Pseudomonas 종 LDC-5 (AAV36510), L. nitroferrum 2002 (ZP03698179), Thauera 종 MZ1T (YP002890098 및 ACR01721), M. radiotolerans JCM 2831 (YP001755078 및 ACB24395), Methylobacterium 종 4-46 (YP001767769 및 ACA15335), L. nitroferrum 2002 (EEG08921), P. denitrificans (BAA77257), M. gryphiswaldense (ABG23018), Pseudomonas 종 USM4-55 (ABX64435 및 ABX64434), A. hydrophila (AAT77261 및 AAT77258), Bacillus 종 INT005 (BAC45232 및 BAC45230), P. putida (AAM63409 및 AAM63407), G. rubripertinctus (AAB94058), B. megaterium (AAD05260), D. acidovorans (BAA33155), P. seriniphilus (ACM68662), Pseudomonas 종 14-3 (CAK18904), Pseudomonas 종 LDC-5 (AAX18690), Pseudomonas 종 PC17 (ABV25706), Pseudomonas 종 3Y2 (AAV35431, AAV35429 및 AAV35426), P. mendocina (AAM10546 및 AAM10544), P. nitroreducens (AAK19608), P. pseudoalcaligenes (AAK19605), P. resinovorans (AAD26367 및 AAD26365), Pseudomonas 종 USM7-7 (ACM90523 및 ACM90522), P. fluorescens (AAP58480) 및 다른 비배양 박테리아 (BAE02881, BAE02880, BAE02879, BAE02878, BAE02877, BAE02876, BAE02875, BAE02874, BAE02873, BAE02872, BAE02871, BAE02870, BAE02869, BAE02868, BAE02867, BAE02866, BAE02865, BAE02864, BAE02863, BAE02862, BAE02861, BAE02860, BAE02859, BAE02858, BAE02857, BAE07146, BAE07145, BAE07144, BAE07143, BAE07142, BAE07141, BAE07140, BAE07139, BAE07138, BAE07137, BAE07136, BAE07135, BAE07134, BAE07133, BAE07132, BAE07131, BAE07130, BAE07129, BAE07128, BAE07127, BAE07126, BAE07125, BAE07124, BAE07123, BAE07122, BAE07121, BAE07120, BAE07119, BAE07118, BAE07117, BAE07116, BAE07115, BAE07114, BAE07113, BAE07112, BAE07111, BAE07110, BAE07109, BAE07108, BAE07107, BAE07106, BAE07105, BAE07104, BAE07103, BAE07102, BAE07101, BAE07100, BAE07099, BAE07098, BAE07097, BAE07096, BAE07095, BAE07094, BAE07093, BAE07092, BAE07091, BAE07090, BAE07089, BAE07088, BAE07053, BAE07052, BAE07051, BAE07050, BAE07049, BAE07048, BAE07047, BAE07046, BAE07045, BAE07044, BAE07043, BAE07042, BAE07041, BAE07040, BAE07039, BAE07038, BAE07037, BAE07036, BAE07035, BAE07034, BAE07033, BAE07032, BAE07031, BAE07030, BAE07029, BAE07028, BAE07027, BAE07026, BAE07025, BAE07024, BAE07023, BAE07022, BAE07021, BAE07020, BAE07019, BAE07018, BAE07017, BAE07016, BAE07015, BAE07014, BAE07013, BAE07012, BAE07011, BAE07010, BAE07009, BAE07008, BAE07007, BAE07006, BAE07005, BAE07004, BAE07003, BAE07002, BAE07001, BAE07000, BAE06999, BAE06998, BAE06997, BAE06996, BAE06995, BAE06994, BAE06993, BAE06992, BAE06991, BAE06990, BAE06989, BAE06988, BAE06987, BAE06986, BAE06985, BAE06984, BAE06983, BAE06982, BAE06981, BAE06980, BAE06979, BAE06978, BAE06977, BAE06976, BAE06975, BAE06974, BAE06973, BAE06972, BAE06971, BAE06970, BAE06969, BAE06968, BAE06967, BAE06966, BAE06965, BAE06964, BAE06963, BAE06962, BAE06961, BAE06960, BAE06959, BAE06958, BAE06957, BAE06956, BAE06955, BAE06954, BAE06953, BAE06952, BAE06951, BAE06950, BAE06949, BAE06948, BAE06947, BAE06946, BAE06945, BAE06944, BAE06943, BAE06942, BAE06941, BAE06940, BAE06939, BAE06938, BAE06937, BAE06936, BAE06935, BAE06934, BAE06933, BAE06932, BAE06931, BAE06930, BAE06929, BAE06928, BAE06927, BAE06926, BAE06925, BAE06924, BAE06923, BAE06922, BAE06921, BAE06920, BAE06919, BAE06918, BAE06917, BAE06916, BAE06915, BAE06914, BAE06913, BAE06912, BAE06911, BAE06910, BAE06909, BAE06908, BAE06907, BAE06906, BAE06905, BAE06904, BAE06903, BAE06902, BAE06901, BAE06900, BAE06899, BAE06898, BAE06897, BAE06896, BAE06895, BAE06894, BAE06893, BAE06892, BAE06891, BAE06890, BAE06889, BAE06888, BAE06887, BAE06886, BAE06885, BAE06884, BAE06883, BAE06882, BAE06881, BAE06880, BAE06879, BAE06878, BAE06877, BAE06876, BAE06875, BAE06874, BAE06873, BAE06872, BAE06871, BAE06870, BAE06869, BAE06868, BAE06867, BAE06866, BAE06865, BAE06864, BAE06863, BAE06862, BAE06861, BAE06860, BAE06859, BAE06858, BAE06857, BAE06856, BAE06855, BAE06854, BAE06853 및 BAE06852).
다양한 구현예에서, 폴리머 합성 효소는 기질 (R)-히드록시아실-CoA 또는 다른 CoA 티오에스테르 또는 이의 유도체를 중합시키거나, 또는 이를 용이하게 함으로서, 폴리머 입자의 시험관내 생성을 위해 사용될 수 있다.
다양한 구현예에서, 기질 또는 기질 혼합물은, 적어도 하나의 임의 치환된 아미노산, 락테이트, 에스테르 또는 포화 또는 불포화 지방산, 바람직하게는 아세틸-CoA를 포함한다.
다양한 구현예에서, 촉매는 효소이다. 대표적 실시예에서, 촉매는 효소이고, 전구 물질은 효소의 기질이며, 목표 물질은 효소에 의해 촉매화되는 반응의 산물이다. 추가적 구현예에서, 폴리머 입자의 집단은 하나 또는 그 이상의 효소를 포함한다. 특히 상기 폴리머 입자의 집단이 둘 또는 그 이상의 효소를 포함하는 구현예가 고려되며, 여기에서 반응 산물은 예를 들어, 합성 또는 촉매 경로의 일부 또는 전부를 포함하는 둘 또는 그 이상의 효소와 같은, 또 다른 효소에 의해 촉매화되는 된다.
하나의 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 투과성 또는 반투과성 지지체에 영구적으로 연관된다. 다른 구현예에서는, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 투과성 또는 반투과성 지지체에 가역적으로 연관된다.
다양한 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 반투과성 필터에 공유 결합 또는 비공유 결합한다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 반투과성 지지체 또는 막에 흡착된다. 다른 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 반투과성 지지체 또는 막에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다.
다양한 구현예에서, 반투과성 지지체는 하기의 것들 중 하나 또는 그 이상을 포함한다: 폴리에테르설폰, PVDF, PP, PEES HDPE (고밀도 폴리에틸렌), PP (폴리프로필렌), PEEK (폴리에테르에테르케톤), PET 및 FEP (불화 에틸렌 프로필렌). 다른 구현예에서, 반투과성 지지체는 예를 들어, 셀룰로스, 유도 셀룰로스, 또는 안정화 셀룰로스를 포함하는 폴리사카라이드(polysaccharide)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 반투과성 지지체는 하나 또는 그 이상의 세라믹을 포함한다.
다양한 구현예에서, 반투과성 필터는 하기의 구성을 포함한다: 나선 회전형, 플레이트 & 프레임(plate & frame), 평판 시트, 중공 섬유, 스핀-디스크(spin-disc), 또는 튜브형. 이의 예는 카세트 또는 카트리지로서 용이하게 제공된다.
다양한 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 하기의 하나 또는 그 이상의 존재 하에서, 접선-유동 여과에 의해 제조, 분리 또는 정제된다 : 계면활성제, pH 조절제, 하나 또는 그 이상의 용매, 하나 또는 그 이상의 카오트로프(chaotrope), 하나 또는 그 이상의 효소, 및 하나 또는 그 이상의 티올. 예를 들어, 접선-유동 여과는 화학적 처리, 예컨대 산 또는 염기 처리를 포함한다. 다양한 구현예에서, 이 방법은 본 명세서에서 예시된 하나 또는 그 이상의 화학적 처리, 예컨대 실시예 12에서 예시된 하나 또는 그 이상의 처리를 포함한다.
다양한 구현예에서, 접선-유동 여과를 사용하는 하나 또는 그 이상의 물질, 또는 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 제조, 분리 또는 정제하는 방법은, 균질화, 미세유동, 초음파 처리, 원심 분리 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이들에 선행되거나, 또는 이들에 뒤이어 실시된다.
다양한 구현예에서, 항체와 결합할 수 있는 리간드는, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G , 단백질 L, 이들의 재조합 변형체(variant), 이들의 재조합 기능성 절편을 포함하는 이의 기능성 절편, 예컨대 단백질 A의 Z 도메인, 및 이들의 조합, 예컨대 단백질 A의 Z 도메인의 연속된 반복 서열을 포함한 ZZ 도메인을 포함하는 군에서 선택된다.
본 명세서에서 기재된 다양한 수의 범위(예를 들어, 1 내지 10)에 대한 언급은, 또한 그 범위 내의 모든 유리수(예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10)에 대한 언급을 포함하며, 따라서 본 명세서에서 명확히 기재된 모든 범위의 모든 하위-범위도 이에 의하여 명백히 설명된다. 이들은 단지 구체적으로 의도된 것들에 대해서만 실시예가 있으며, 열거된 최저값과 최대값 사이의 절대값에 대한 모든 가능한 조합은, 본 발명에서 비슷한 방식으로 명확히 기재된 것으로 고려된다.
본 명세서에서는, 특허 명세서, 다른 외부 문헌, 또는 다른 정보원에 대한 참고예가 있으며, 이는 일반적으로 본 발명의 특징을 논의하기 위한 내용을 제공하기 위한 목적이다. 달리 구체적인 기재가 없으면, 이러한 외부 문헌에 대한 참고예가, 어떠한 범주(jurisdiction)에서든 상기 문헌, 또는 상기 정보원이 선행기술이거나, 또는 당업계의 일반적 상식을 형성한다고 승인하는 것으로 이해되지는 않는다.
본 발명의 추가적 측면 및 장점은, 하기의 상세한 설명에서 실시예에 의해서만 명백해질 것이다.
도 1은 시스템 내의 투과물을 공급 수조로부터 접선-유동 여과 막 카트리지를 통과하여 재순환시키는, 접선-유동 여과의 전체 개략도(도 1a), 및 단순 접선-유동 여과 시스템의 예시(도 1b)를 나타낸다.
도 2 내지 4는 본 발명의 방법을 사용하여, 원료액으로부터 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 정제 또는 분리하는데 사용되는 일반적 개요를 나타낸다.
도 5는 본 명세서의 실시예에서 설명한 바와 같이, IgG 이뮤노글로블린의 접선-유동 여과 정제에 사용된 ZZPhaC-폴리머 입자의, 폴리머 입자 단백질 프로파일의 SDS-PAGE 분석(쿠마시 블루 및 실버 염색)의 사진을 나타낸다. 레인 1, MW 마커; 레인 2, 여과하지 않은 과립; 레인 3, 100kDa 여과로부터의 잔류물; 레인 4, 0.1㎛ 여과로부터의 잔류물; 레인 5, 0.2㎛ 여과로부터의 잔류물.
도 6은 본 명세서의 실시예에서 설명한 바와 같이, IgG 이뮤노글로블린의 접선-유동 여과 정제에 사용된 ZZPhaC-폴리머 입자의, 폴리머 입자 단백질 프로파일의 GC/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 본 명세서의 실시예에서 설명한 바와 같이, 공급 원료를 투석여과 하기 전(도 7a), 및 한 후(도 7b)의 ZZ-폴리머 입자의 투과 현미경 사진이다.
도 8은 BSA 및 IgG의 혼합물의 TFF 투석 여과로부터의, 투과물 분획 용출 프로파일을 나타내는 그래프이다. BSA는 Z-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자에 결합하지 않아서, 시스템으로부터 용이하게 제거된다. IgG를 농축하고, 잔류물 비드를 50 mM 시트레이트 150 mM 식염수 pH 3.0 (at 분획 13)로 처리하면, IgG가 비드로부터 유출되어, 잔류물에서 용이하게 투석 여과된다.
도 9는 본 명세서의 실시예 2에서 설명한 바와 같이, BSA로부터 인간 IgG를 TFF 분리하여 얻은, 투과물 분획의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 도 9a는 제 1의 TFF 280 nm 피크 (1 x PBS pH 7.4 세척 분획) 상의, BSA 함유 분획의 용출을 나타낸다. 도 9b는 Z-도메인 비드를 포함하는 본 발명의 폴리머 입자를, 시트레이트(pH 3.0)로 여과한 후, IgG 함유 분획의 용출을 나타낸다.
도 10은 실시예 3에서 설명한 바와 같이, 단백질 G의 GB1-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자 및 TFF를 사용하여, 염소 혈청으로부터 염소 IgG를 정제한 용출 프로파일이다. (PBS 중에) 1:10 희석된 염소 혈청 50 mL 현탁액을, GB1-도메인 입자를 포함하는 본 발명의 5 g 습윤 중량 폴리머 입자과 함께 배양한 후, 투석 여과(50㎠ 카트리지, 0.1 ㎛)하여, 혈청 단백질을 제거하였다. IgG를 20 mL로 농축한 후 용출하고, 분획 15에서 150 mM NaCl 중의 50 mM 소듐 시트레이트 (pH 3.0)에 대해 투석 여과하였다.
도 11는 염소 혈청으로부터 IgG 정제의 TFF 투과물 분획에 대한, SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 도 11a는 TFF로부터 용출된, 실버 염색한 혈청 단백질을 나타낸다. 도 11b는 시트레이트-식염수(pH 3.0)로 투석 여과 후, 용출된 분획 중에 우세한 단백질로서 명확히 보이는 IgG 중쇄 및 IgG 경쇄를 갖는, TFF로부터 용출된 단백질을 나타낸다.
도 12는 실시예 4에서 설명한 바와 같이, 금-결합-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자 및 TFF를 사용하여, 용액으로부터 콜로이드성 금의 제거를 측정한 그래프를 나타낸다. 0.005% 콜로이드성 금의 30 ml 현탁액을, 20㎠, 0.2㎛의 중공 섬유 미세여과 카트리지를 구비한 TFF 시스템에서, 9 ml/분의 투과물 유속으로 재순환시킨다. 8, 13 및 29 분에, (*) 30 mg, 300 mg 및 300 mg의, 각각 금-결합-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자를, 잔류물에 첨가하였다. 투과물 중의 콜로이드성 금의 흡광도를, 520 nm에서 측정하였다.
도 13는 실시예 5에서 설명한 바와 같이, TFF를 사용하여, 아밀라제-결합 입자 매개의 전분의 생물 변환으로부터, 말토오스의 회수 그래프를 나타낸다. 용해성 전분의 현탁액(300 ml 1%. 4% 및 8% w/v)은, 2g의 PolyEnz-Amy 비드를 사용하여 말토오스로 변환된다. 현탁액은 TFF에 의해 여과되어, 투과물 중의 말토오스를 회수하고, 잔류물 분획 중에 비드를 포함한다.
도 14는 실시예 7에서 설명한 바와 같이, TFF 동안 오르가노포스페이트 히드로라제-결합 입자에 의한 메틸 파라티온의 파라-니트로페놀로의 변환을 나타낸다. 메틸 파라티온(200 uM)의 30 ml 용액을 20㎠, 0.2㎛의 중공 섬유 카트리지를 구비하는 TFF 시스템에서 재순환시킨다. 동일한 조건 하에서, 2 사이클의 생물 변환을 기록한다.
도 15는 실시예 7에 나타난 바와 같이, TFF 투석여과를 사용한, 오르가노포스페이트 히드로라제(organophosphate hydrolase)-결합 입자의 현탁액으로부터, 파라-니트로페놀의 제거를 나타낸다.
도 16는 실시예 8에 나타난 바와 같이, 세포 균질화물로부터 PHB 폴리머 입자의 직접적인 정제를 위한, 소규모 크로스플로우 여과 공정 개요의 일례를 나타낸다. 전략으로서는 집중적인 미세유동을 사용함으로서, 고도로 분산된 균질화물의 현탁액이 가능하도록 고안되었다. 균질화 후, DNAase 및 MgCl2를 첨가하여, 여과에 앞서 DNA 절편의 크기를 감소시킨다. MgCl2을 과량으로 EDTA에 첨가하여, DNAase가 활성화되도록 한다. TFF 동안, 균질화물의 현탁액을 8 배의 투석 여과 버퍼로 투석여과하여, 숙주 단백질 및 핵산을 제거한다.
도 17a는 실시예 9에서 설명한 바와 같이, 250 ml 조 세포 균질화물의 투과물의 용출 프로파일을 나타낸다. TFF 정제는 20% EtOH 중의 8 배의 투석여과 PBS-EDTA를 사용하여, 110 ㎠ 0.1 ㎛ 중공 섬유 카트리지 상에서 세포 균질화물에 대하여 실시하였다.
도 17b는 세포 균질화물의 TFF 정제로부터 나온 투과물 분획의, 브래드포드 단백질 에세이(Bradford Protein Assay)의 그래프이다. 도 17c는 투과물 분획의 SDS-PAGE이다. 투과물 분획 1-8의 20 ㎕ 분취량(aliquot)(레인 3-10)을 15% 겔 상에서 전개시켰다(레인 1, 분자량 표준; 레인 2, 20㎕ 최종 비드 현탁액). 샘플은 부피 기준으로 로딩했고, 단백질 함량에 대해 조절하지는 않았다.
도 18은 실시예 10에서 설명한 바와 같이, 0.2% 데옥시콜레이트에 의한 TFF로 정제한, PHB 입자의 투과물 분석을 나타내었다. 나타난 바와 같이, 기호들은 12 배 투석여과 부피에 대해 모은 투과물 분획의 A260 (△) 및 A280nm (■) 흡광도의 양을 나타내며, 측정된 pH (○)도 또한 나타내었다. 입자는 8 배의 10 mM Tris 10 mM EDTA 0.2% 데옥시콜레이트(pH 11)에 이어, 4 배의 PBS(pH 7.4)에 대해 투석 여과하였다.
도 19은 실시예 10에서 설명한 바와 같이, TFF 정제 후 Z-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자의, IgG 결합 능력의 에세이를 보여준다. 다양한 범위의 0.2 % 데옥시콜레이트 함유 용액(표 2 참고)에서 투석 여과 후, 50 mg 분취량의 비드를 PBS(pH 7.4) 중에서 5 mg의 인간 IgG와 함께 30 분 동안 실온에서 배양하였다. 배양 후, 폴리머 입자를 원심 분리하여 비결합 분획을 제거한 후, 글리신 버퍼(pH 2.7)로 용출하여, Z-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자로부터 IgG를 용출하였다. 폴리머 입자를 다시 원심분리하고, 브래드포드 단백질 에세이를 사용하여, 용출액 상등액 중에서 회수된 IgG의 양을 결정하였다.
도 20은 실시예 11에서 설명한 바와 같이, 개방 채널(open channel) TFF 시스템을 사용하는, GB1-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자의 투과물 분석을 나타낸다. 루브롤(lubrol)-추출 PHB 폴리머 입자를, Millipore Prostak-4 stak 시스템 상에 로딩한다. 비드를 현탁하여, 1.3 리터의 잔류물을 만들고, 1 리터의 투과물 분획을 모아서 분석하였다.
도 21는 실시예 11에서 설명한 바와 같이, TFF 정제 후, GB1-도메인를 포함하는 본 발명의 폴리머 입자의, IgG 결합 능력의 에세이 결과를 나타낸다. 글리세롤 구배 또는 TFF-루브롤 기본 공정 중 어느 하나로서 정제한 후, 50 mg 분취량의 폴리머 입자를 PBS(pH 7.4) 중에서, 30 분 동안 실온에서 5 mg의 인간 IgG와 함께 배양하였다. 배양 후, 폴리머 입자를 원심분리하여 비결합 분획을 제거한 후, 글리신 버퍼(pH 2.7)로 용출하여, 폴리머 입자로부터 IgG를 용출하였다. 폴리머 입자를 다시 원심분리하고, 브래드포드 단백질 에세이를 사용하여, 용출액 상등액 중의 회수된 IgG의 양을 결정하였다.
도 22는 세포 추출물 중에서 Z-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자로부터의 숙주 단백질/핵산의 제거, 및 잔여 결합 활성에 대한, 다양한 추출 제제의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 22a는 (필요한 경우) 20% PBS 중에 희석된 배치 (batch) 세척 상등액의 A260nm 및 A280nm 흡광도 결과를 나타낸다. 도 22b는 IgG 결합 활성을 나타내며, 여기에서 조 폴리머 입자 펠렛(pellet)은 1 x PBS로 세척하고, 15,000 x g에서 20 분 동안 원심분리하여, 상등액을 따라낸(drained) 펠렛의 무게를 달고, 중량-정규화(weight-normalized)하여 IgG 결합 활성을 결정하였다.
도 23는 박테리아 바이오메스(biomass)로부터 PHB 폴리머 입자를 정제하기 위한 유동적 규모의 개요를 나타낸다.
도 24는 실시예 14에서 설명한 바와 같이, SDS 계면활성제 추출에 의한, PHB 폴리머 입자로부터 숙주 바이오메스의 제거를 나타낸다. 바이오메스(1.1 ~ 1.2 kg)의 2개의 개별 복제 서브-배치를, 0.08% SDS, 25 mM Tris 10 mM EDTA(pH 11)의 2.7리터에 현탁하고, 미세유동하였다. 용해 버퍼, 10 mM 티오글리세롤 및 0.1 M NaOH 중에서, 각각 2.7 L, 1 L 및 1 L 부피로, 순차적인 화학적 세척을 실시하였다. 조 폴리머 입자의 습윤 중량을 각 공정 단계에서 결정하였다.
도 25는 도 14에서 설명한 바와 같이, SDS 기반 TFF 정제 공정으로 정제된, Z-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자에 대한, 투과물 분석을 나타낸다. SDS 추출 PHB 비드를 Millipore Prostak 시스템에 3으로 로딩하였다. 시스템 (0.41㎡)의 2개의 스택 모듈(stak modules). 비드를 현탁하여, 2 리터 잔류물 및 2 리터의 투과물 분획을 형성한 후, 모아서 260, 280, 600 nm 흡광도 및 pH를 분석하였다.
도 26은 실시예 14에서 설명한 바와 같이, SDS-기반 TFF 공정으로 정제된 PHB 비드에 대한 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 5 ㎕ 샘플 버퍼 및 20 ㎕의 각 샘플에 의한 (25 ㎕) 분취량을 8-15% 구배 겔 상에 로딩하였다. 샘플들은 이하와 같다: 1. MW 마커, 2. 조 세포 용해물, 3. 폴리머 입자의 추후 용해물(post lysis), 4. 폴리머 입자의 추후 용해 버퍼 (SDS) 세척물, 5. 폴리머 입자의 추후 트리글리세롤(triglycerol) 세척물, 6. 폴리머 입자의 추후 NaOH 세척물 (예비 TFF), 7. 폴리머 입자의 추후 TFF 정제물.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 접선-유동 여과 기술에서 사용하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 접선 유동 여과는 공급 원료가 막에 접선으로 전개되는 분리 기술로서, (이는 전량 여과(dead-end filtration) 시 막에 실질적으로 수직인 경우와는 반대이다). 이러한 접선-유동은 막을 가로질러서 차등 압력을 형성한다. 그 결과로, 일부 입자는 막을 통과한 반면, 다른 입자는 계속 막을 가로질러 유동하며(도 1A 참고), 이는 특정한 경우 막을 청소하는 역할을 한다. 전량 여과와 비교하여, 접선-유동은 일반적으로 입자가 필터 케이크(filter cake)로 쌓이는(build-up) 것을 늦출 것이다. 접선-유동 여과 시스템에 의해 실현되는 다른 이점은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려졌으며, 이는 높은 액체 부피 용량, 높은 목표 물질-결합 능력, 폴리머 입자, 크로마토그래피 수지, 막 재생의 용이성 등을 포함한다.
정의
본 명세서에서 사용될 때, "무정형 폴리머(amorphous polymer)"라 함은, 분자 사슬의 불규칙 배열에도 불구하고 실온에서 고체인 폴리머들로 이해된다. 이들 폴리머는 본질적으로 비결정성이며, 이의 결정성의 정도는 통상적으로 20% 미만, 바람직하게는 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 바람직하게는 2% 미만, 또는 0%이다. 이러한 무정형 폴리머는 유리전이온도(glass transition temperature, TG)가 0℃ 내지 60℃, 바람직하게는 0℃ 내지 50℃, 바람직하게는 0℃ 내지 40℃, 바람직하게는 0℃ 내지 35℃, 및 특히 0℃ 내지 30℃의 범위일 때 특히 적합하다.
본 명세서에서 사용될 때, "바이오폴리머(biopolymer)"라 함은, 생물학적 시스템 또는 개체에 의해 합성될 수 있는 폴리머로서, 생물, 세포, 또는 단백질에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 따라서, "바이오폴리에스테르(biopolyester)" 및 "바이오폴리티오에스테르(biopolythioester)"라 함은, 각각 생물학적 시스템 또는 개체에 의해 합성가능한 폴리에스테르 및 폴리티오에스테르와 같은 것으로 이해된다. 실시예들은 다양한 박테리아 및 고세균에 의해 생성된 폴리에스테르 및 폴리히드록시카르복실레이트를 포함하며, 이는 전형적으로 탄소 또는 에너지의 저장수단으로서, 상기 폴리티오에스테르 및 폴리히드록시알카노에이트에 제한되지 않는다.
"암호화 부위(encoding region)" 또는 "오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)"이라 함은, 적절한 조절 서열의 조절 하에서, 전사 산물 및/또는 폴리펩티드를 생성할 수 있는 게놈 DNA 서열 또는 cDNA 서열의 센스 가닥(sense strand)을 말한다. 코딩 서열은 5' 번역 개시 코돈 및 3' 번역 정지 코돈의 존재로서 식별된다. 유전적 구조체로 삽입될 때, "암호화 서열(coding sequence)"은, 프로모터 및 종결자 서열에 사용가능하게(operably) 연결될 때 발현될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "포함하는(comprising)"이라 함은, "적어도 부분적으로 이루어지는(consist at least in part)"의 의미이다. 본 명세서에서 "포함하는"이라는 용어를 포함하는 각 문장을 번역할 때, 상기와 다른 특징들 또는 상기 용어로 시작하는(preface) 것들도 또한 존재한다. "comprise"및 "comprises"와 같은 관련 용어는, 동일한 방식으로 번역된다.
"오염물(contaminant)"이라 함은, 원료 물질 중에서 목표 물질과는 다른 하나의 기질 또는 복수의 기질을 말하며, 이는 바람직하게는 최종 목표 물질 제조시 배제된다. 생물학적 원료 물질의 전형적인 오염물은, 핵산, 단백질, 펩티드, 엔도톡신(endotoxin), 바이러스 등을 포함한다. 본 발명의 방법을 실시함으로서 제거될 수 있는 오염물은, 원하는 산물에서와 다른, 하나 또는 그 이상의 특성, 예를 들어 분자량, 전하, 다양한 리간드에 대한 특이적 친화도 등을 갖는다.
"접선-유동 필터(tangential-flow filter)" 및 이의 문법적 동등물들은, 본 명세서에서 다공성, 투과성 또는 반투과성 필터 요소를 포함하는 필터 모듈 또는 필터 카세트의 타입을 말하며, 이는 예컨대 원료 배지의 오염물 또는 선택된 성분을 필터 요소를 통하여 투과하기 위해, 여과될 원료 배지가 접선 유동 방식으로 그 표면을 가로질러 유동한다.
"커플링 제제(coupling reagent)"라 함은 본 명세서에서 사용될 때, 적어도 하나의 물질과 결합하거나, 또는 한 쪽에서는 커플링제와 결합하고 다른 한 쪽에서는 적어도 하나의 물질과 결합하는 추가의 커플링제와 결합하는데 적합한 무기 또는 유기 화합물을 말한다. 적절한 커플링제의 예, 및 본 발명의 입자 또는 융합 단백질의 화학적 변형(modification)에 적합한 방법을 포함하는 그들의 용도가, PCT/DE2003/002799(Bernd Rehm)에 제시되었으며, 이는 WO 2004/020623로서 공개되었으며, 본 명세서에 전체로서 참고된다.
"발현 구조체(expression construct)"라 함은, 삽입된 폴리뉴클레오티드 분자의 전사, 및 임의로 상기 전사체를 폴리펩티드로 번역 가능하게 하는 요소를 포함하는 유전적 구조체를 말한다. 발현 구조체는 통상적으로 5' 에서 3' 방향으로 포함된다:
(1) 구조체가 도입될 숙주 내에서 기능을 발휘하는 프로모터,
(2) 발현될 폴리뉴클레오티드, 및
(3) 구조체가 도입될 숙주 내에서 기능을 발휘하는 종결자(terminator).
본 발명의 발현 구조체는 클로닝 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터로 삽입되거나, 또는 숙주 게놈으로 끼어든다(incorporate).
본 발명에서 사용되기에 적합한 발현 구조체의 예로서는, WO 2004/020623로서 공개된 PCT/DE2003/002799(Bernd Rehm), 및 WO 2007/037706로서 공개된 PCT/NZ2006/000251(Bernd Rehm)에서 제공하며, 이들은 본 명세서에서 전체로서 참고된다.
"폴리머 입자를 형성하는 것(form a polymer particle)" 또는 "폴리머 입자의 형성(formation of polymer formation)"라 함은, 입자-형성 단백질과 관련하여 본 명세서에서 사용될 때, 논의된 바와 같이 입자-형성 단백질의 활성을 말한다.
폴리펩티드 "절편(fragment)"은 효소 또는 결합 활성에 요구되는 기능을 수행하고, 및/또는 폴리펩티드의 3차원 구조를 제공하는 폴리펩티드의 하위서열(subsequence)이다.
"융합 폴리펩티드(fusion polypeptide)"라 함은 본 명세서에서 사용될 때, 2개 또는 그 이상의 아미노산 서열, 예를 들어 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드 도메인을 포함하며, 펩티드 결합에 의해 각각의 아미노 및 카르복실 잔기를 통해 융합되어 단일의 연속 폴리펩티드를 형성하는 폴리펩티드를 말한다. 둘 또는 그 이상의 아미노산 서열은, 그들의 각각의 아미노 및 카르복실 말단에 직접 융합되거나, 또는 링커 또는 스페이서, 또는 추가 폴리펩티드를 통하여 간접적으로 융합되는 것으로 이해해야 한다.
하나의 구현예에서, 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 중 하나는, 입자-형성 단백질을 포함한다. 하나의 구현예에서, 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 중 하나는, 폴리머 합성 효소를 포함한다.
하나의 구현예에서, 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 중 하나는, 융합 파트너를 포함한다.
"융합 파트너(fusion partner)"라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 폴리펩티드, 예컨대 단백질, 단백질 절편, 결합 도메인, 목표-결합 도메인, 결합 단백질, 결합 단백질 절편, 항체, 항체 절편, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 단일 사슬 항체, 단일-도메인 항체(예를 들어, VHH), Fab 항체 절편, Fc 항체 절편, Fv 항체 절편, F(ab')2 항체 절편, Fab'항체 절편, 단일-사슬 Fv (scFv) 항체 절편, 항체 결합 도메인(예를 들어, ZZ 도메인), 항원, 항원 결정기, 에피토프(epitope), 헵텐(hapten), 면역원(immunogen), 면역원 절편, 비오틴(biotin), 비오틴 유도체, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 기질, 효소, 항체효소(abzyme), 보조 인자(co-factor), 수용체, 수용체 절편, 수용체 서브유닛, 수용체 서브유닛 절편, 리간드, 저해제, 호르몬, 렉틴(lectin), 폴리히스티딘(polyhistidine), 커플링 도메인, DNA 결합 도메인, FLAG 에피토프, 시스테인 잔기, 라이브러리 펩티드, 리포터 펩티드, 친화성 정제 펩티드, 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 조합을 말한다.
상기 나열된 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드가 융합 파트너를 형성할 수 있다는 것은 자명한 일이다.
하나의 구현예에서, 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 링커 또는 스페이서를 통해서, 폴리머 합성 효소-링커- 융합 파트너, 또는 융합 파트너-링커-폴리머 합성 효소의 순서로 배열된 상기 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열과 간접적으로 융합된다. 다른 구현예에서, 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 폴리머 합성 효소-추가적 폴리펩티드-융합 파트너, 또는 폴리머 합성 효소-링커-융합 파트너-추가적 폴리펩티드의 순서로 배열된 추가적 폴리펩티드를 통해서 간접적으로 융합되거나, 또는 이를 포함한다. 또한, 폴리머 합성 효소의 N-말단 확장도 본 명세서에서 명확하게 고려된다.
하나의 예시적 구현예에서, 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 링커 또는 스페이서를 통하여, 예를 들어 폴리머 합성 효소-링커-항체 결합 폴리펩티드 또는 항체 결합 폴리펩티드-링커-폴리머 합성 효소, 또는 폴리머 합성 효소-링커-효소 또는 효소-링커-폴리머 합성 효소의 순서로 정렬된, 상기 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열과 간접적으로 융합된다. 다른 예시적 구현예에서, 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 폴리머 합성 효소-추가적 폴리펩티드-항체 결합 폴리펩티드 또는 폴리머 합성 효소-추가적 폴리펩티드-효소, 또는 폴리머 합성 효소-링커-항체 결합 폴리펩티드-추가적 폴리펩티드 또는 폴리머 합성 효소-링커-효소-추가적 폴리펩티드의 순서로 정렬된 추가 폴리펩티드와 간접적으로 융합하거나, 또는 이를 포함한다. 또한, 폴리머 합성 효소의 N-말단 확장도 본 명세서에서 명확히 고려된다.
본 발명에 의한 융합 폴리펩티드는, 또한 다른 폴리펩티드의 서열 내부에 삽입된, 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 서열을 또한 포함한다. 예를 들어, 프로테아제(protease) 인식 서열과 같은 폴리펩티드 서열이, 입자 결합 도메인을 포함하는 단백질의 가변적(variable) 부위에 삽입된다.
용이하게도, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 단일 핵산 서열에 의해 암호화되며, 상기 핵산 서열은 적어도 두 개의 하위서열을 포함하며, 그의 각각은 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인을 암호화한다. 특정 구현예에서, 적어도 두 개의 하위서열이 "프레임 내에 존재하여(in frame)", 단일의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하므로, 본 명세서에서 고려된 바와 같이 융합 폴리펩티드를 암호화할 것이다. 다른 구현예에서는, 적어도 두 개의 하위서열은 프레임 밖에 있고(out of frame), 리보솜 프레임 이동 부위(ribosomal frame-shifting site), 또는 리딩 프레임 내에서 이동을 촉진시키는 다른 서열에 의해 분리되어, 번역 시 융합 폴리펩티드가 생성된다. 특정 실시예에서, 적어도 두 개의 하위서열은 인접된다. 다른 구현예에서, 상기에서 논의한 바와 같이 적어도 두 개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인은, 추가적 폴리펩티드를 통해 간접적으로 융합되며, 적어도 두 개의 하위서열은 인접하지 않는다.
"결합 도메인(binding domain)" 또는 "결합 가능한 도메인(domain capable of binding)"은, 상보적 결합 쌍의 절반을 의미하도록 의도되며, 상기 목록으로부터의 결합 쌍을 포함한다. 예를 들어, 항체-항원, 항체-항체 결합 도메인, 비오틴-스트렙타비딘, 수용체-리간드, 효소-저해제 쌍. 목표-결합 도메인은 샘플 중의 목표 분자에 결합할 것이고, 이는 예를 들어 항체 또는 항체 절편이다.　 폴리펩티드-결합 도메인은 폴리펩티드에 결합하며, 이는 예를 들어 항체 또는 항체 절편, 또는 수용체의 결합 도메인 또는 신호 단백질이다.
결합 도메인에 의해 결합된 물질의 예로서는, 단백질, 단백질 절편, 펩티드, 폴리펩티드, 폴리펩티드 절편, 항체, 항체 절편, 항체 결합 도메인, 항원, 항원 절편, 항원 결정기, 에피토프, 헵텐, 면역원, 면역원 절편, 약학적 활성 제제, 생물학적 활성 제제, 어쥬번트(adjuvant), 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 조합을 포함한다. 상기 물질은 샘플 중의 "목표 성분"으로서, 본 발명의 방법에 의하여 분석되었다.
따라서, "목표 물질과 결합할 수 있는 도메인" 및 이의 문법적 동등체는, 상보적 결합쌍의 한 요소를 말하는 것으로 이해될 것이고, 여기에서 다른 요소는 목표 물질이다.
"유전적 구조체(genetic construct)"라 함은, 보통 이중-가닥 DNA로서 그 중에 다른 폴리뉴클레오티드 분자(삽입된 폴리뉴클레오티드 분자), 예컨대 제한되지는 않지만 cDNA 분자가 삽입된 폴리뉴클레오티드 분자를 말한다. 유전적 구조체는 삽입된 폴리뉴클레오티드 분자의 전사, 및 임의로 상기 전사체를 폴리펩티드로 번역할 수 있도록 하는 필수 요소를 포함한다. 다양한 구현예에서, 삽입된 폴리뉴클레오티드 분자는 숙주로부터 유래되거나, 또는 상이한 세포 또는 생물로부터 유래하고, 및/또는 재조합 폴리뉴클레오티드이다. 하나의 구현예에서, 유전적 구조체는 일단 숙주 내로 들어가면, 숙주 게놈, 예컨대 숙주 염색체 DNA로 끼어든다. 하나의 실시예에서, 유전적 구조체는 벡터에 연결된다.
"숙주 세포(host cell)"라 함은, 1) 천연 PHA 입자 생성 숙주 세포, 또는 2) 적어도 티올라제(thiolase) 및 리덕타제(reductase) 및 임의로 파신(phasin)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조체를 갖는 숙주 세포 중 어느 하나인, 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 동물 세포, 예컨대 포유동물 숙주 세포를 말한다. 숙주가 폴리머 입자 형성을 위해 부족한 것을 증가시키는데 필요한 유전자는, 숙주의 유전적 구조 및 배양 배지에 공급된 기질에 따라 달라질 것이다.
"링커(linker)" 또는 "스페이서(spacer)"라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드 또는 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 둘 또는 그 이상의 핵산 서열과, 간접적으로 융합하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100개 길이의 아미노산 또는 뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 약 1000 개 길이의 아미노산 또는 뉴클레오티드이다. 또 다른 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 약 1 내지 약 1000 개 길이의 아미노산 또는 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 1000, 약 50 내지 약 1000, 약 100 내지 약 1000, 약 200 내지 약 1000, 약 300 내지 약 1000, 약 400 내지 약 1000, 약 500 내지 약 1000, 약 600 내지 약 1000, 약 700 내지 약 1000, 약 800 내지 약 1000, 또는 약 900 내지 약 1000 개 길이의 아미노산 또는 뉴클레오티드이다.
하나의 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 제한 효소 인식 부위를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 프로테아제 절단(cleavage) 인식 서열 예컨대 엔테로키나아제(enterokinase), 트롬빈(thrombin) 또는 인자 Xa 인식 서열, 또는 인테인(intein)과 같은 자가-스플라이싱 요소(self-splicing element)를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 촉진한다.
"혼합 집단(mixed population)"이라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 개체들의 둘 또는 그 이상의 집단을 말하며, 혼합 집단 내의 개체들의 각 집단은 혼합 집단 내 개체들의 다른 집단과 일부 측면에서는 다르다. 예를 들어, 발현 구조체의 혼합 집단이라는 말이 사용될 때, 이는 발현 구조체의 각 집단이 그 집단의 멤버에 의해 암호화된 융합 폴리펩티드, 또는 구조체의 일부 다른 측면, 예를 들어 구조체에 존재하는 프로모터의 동일성에서 상이한, 발현 구조체의 둘 또는 그 이상의 집단을 말한다. 대안적으로, 융합 폴리펩티드의 혼합 집단이란 말이 사용될 때, 이는 융합 폴리펩티드의 각 집단이 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소, 융합 파트너, 예컨대 항체 결합 도메인 또는 효소, 그 집단이 포함하는 멤버의 면에서 상이한, 둘 또는 그 이상의 융합 폴리펩티드의 집단을 말한다. 예를 들어, 정제된 항체의 제조의 맥락에서, 융합 폴리펩티드의 혼합 집단은, 융합 폴리펩티드의 각 집단이 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소, 항체 결합 도메인, 집단이 포함하는 멤버의 측면에서 상이한, 융합 폴리펩티드의 둘 또는 그 이상의 집단을 말한다. 마찬가지로, 목표 물질 제조시의 용도에 대한 맥락에서, 융합 폴리펩티드의 혼합 집단은, 융합 폴리펩티드의 각 집단이 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소, 효소, 전구 물질 결합 도메인, 또는 효소-기질 결합 도메인, 집단이 포함하는 멤버의 측면에서 다른, 융합 폴리펩티드의 둘 또는 그 이상의 집단을 말한다. 나아가, 폴리머 입자의 혼합 집단이란 말이 사용될 때, 이는 폴리머 입자의 각 집단이 융합 폴리펩티드 또는 집단의 각 멤버가 포함하는 융합 폴리펩티드의 측면에서 상이한, 폴리머 입자의 둘 또는 그 이상의 집단을 말한다. 둘 또는 그 이상의 폴리머 입자의 소집단을 포함하는 폴리머 입자의 혼합 집단은, 각 소집단이 본 명세서에서 설명한 하나 또는 그 이상의 융합 폴리펩티드(예컨대, 상기의 것들)을 포함하는데, 이들도 구체적으로 고려된다.
"핵산(nucleic acid)"이라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 데옥시리보뉴클레오티드의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머, 리보뉴클레오티드 염기 또는 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체, 또는 이들의 혼합물을 말한다. 이 용어는 달리 특정되지 않으면, 특정 서열 뿐만 아니라 그의 상보 서열에 대한 언급도 포함한다. "핵산"및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"라 함은, 본 명세서에서 호환하여 사용된다.
"사용가능하게 연결된(operably-liked)"이라 함은, 발현될 서열이 프로모터, 조직 특이적 조절 요소, 일시적 조절 요소, 인헨서, 억제자 및 종결자를 포함하는 조절 요소의 조절 하에 놓이는 것을 의미한다.
"과다 발현(over-expression)"이라 함은, 일반적으로 정상 또는 비-형질전환 숙주에서의 생성 정도를 넘어서는, 숙주 세포 내 유전자 산물의 생성을 말한다. "과다발현"이란 용어가, 메신저 RNA의 수준에 관하여 사용될 때, 바람직하게는 대조군 또는 비-형질전환 세포 상의 숙주에서 통상적으로 관찰되는 것보다, 적어도 약 3 배 많이 발현되는 것을 가리킨다. 더욱 바람직하게는, 발현 수준은 대조군 숙주 또는 비-형질전환 세포에서 통상 관찰되는 것보다, 적어도 약 5 배 초과, 약 10 배 초과, 약 15 배 초과, 약 20 배 초과, 약 25 배 초과, 약 30 배 초과, 약 35 배 초과, 약 40 배 초과, 약 45 배 초과, 약 50 배 초과, 약 55 배 초과, 약 60 배 초과, 약 65 배 초과, 약 70 배 초과, 약 75 배 초과, 약 80 배 초과, 약 85 배 초과, 약 90 배 초과, 약 95 배 초과, 또는 약 100 배 초과 또는 그 이상이다.
mRNA의 수준은, 노던 블롯(Northern blot) 분석 및 RT-PCR, 예컨대 정량적 RT-PCR를 포함하는, 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 어떠한 기술을 사용해서도 측정되며, 상기에 제한되지 않는다.
"입자-결합 단백질(particle-binding protein)"이라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 입자에 결합할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인을 말한다. 상기 결합은 폴리머와의 상호작용, 또는 폴리머에 붙은 잔기와의 상호작용을 통해서, 예컨대 폴리머에 공유 결합된 폴리머 합성 효소을 통하여 직접 매개된다. 본 명세서에서 사용하기에 적합한 입자-결합 단백질은, 폴리머 입자 핵에 결합가능한 단백질, 예컨대 PHA 합성 효소 단백질의 C-말단 절편, 또는 폴리머 디폴리머라제(depolymerase)의 입자 결합 도메인의 하나 또는 그 이상의 입자 결합 도메인이다.
"입자-형성 단백질(particle-forming protein)"이라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 입자 형성에 관여하는 단백질을 말한다. 이는 예를 들어, 폴리머 디폴리머라제, 폴리머 조절자(regulator), 폴리머 합성 효소 및 입자 크기-결정 단백질을 포함하는 단백질의 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 입자-형성 단백질은 티올라제, 리덕타제, 폴리머 합성 효소 및 파신을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 합성 효소와 같은 입자-형성 단백질은, 기질 또는 기질 유도체를 중합함으로서 폴리머 입자의 형성을 촉매화하여 폴리머 입자를 형성할 수 있다. 대안적으로, 입자-형성 단백질, 예컨대 티올라제, 리덕타제 또는 파신은, 중합화를 촉진함으로서 폴리머 입자의 형성을 촉진한다. 예를 들어, 티올라제제 또는 리덕타제는 폴리머라제에 대한 적절한 기질의 생성을 촉매화한다. 파신은 형성된 폴리머 입자의 크기를 조절한다. 바람직하게는 입자-형성 단백질은, 입자 결합 도메인 및 입자 형성 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, "입자-형성 반응 혼합물(particle-forming reaction mixture)"이라 함은, 숙주 세포 또는 발현 구조체가 합성 효소의 촉매화 도메인 또는 폴리머 합성 효소를 포함하는 경우 적어도 하나의 폴리머 합성 효소 기질을 말하며, 숙주 세포 또는 발현 구조체가 폴리머 합성 효소의 촉매화 도메인이 아닌, 또 다른 입자-형성 단백질 또는 입자 결합 도메인인 경우 이의 기질을 말한다.
"입자 크기-결정 단백질(particle size determining protein)"이라 함은, 폴리머 입자의 크기를 조절하는 단백질을 말한다. 이는 예를 들어 파신-유사 단백질의 과(family), 바람직하게는 Ralstonia , Alcaligenes 및 Pseudomonas 속, 더욱 바람직하게는, Ralstonia eutropha로부터의 파신 유전자 phaP 및 Pseudomonas oleovorans.로부터의 파신 유전자 phaF에서 유래될 수 있다. 파신은 분자량 14 내지 28 kDa의 양친매성 단백질로서, 폴리머 입자의 소수성 표면에 단단히 결합한다. 이는 또한 입자에 결합하고 입자 크기에 영향을 미치는, 다른 숙주 단백질을 포함할 수도 있다.
폴리머 합성 효소는 적어도 폴리머의 중합화 및 합성 효소 단백질의 입자 핵에 대한 부착을 매개하는 합성 효소 단백질의 C-말단에, 합성 효소의 촉매화 도메인을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 폴리머 합성 효소는, Rehm, 2003에서 상세히 기재되며, 이는 본 명세서에 전체로서 참고된다. 예를 들어, 폴리머 합성 효소는 1류 Acinetobacter, Vibrio , Aeromonas , Chromobacterium , Pseudomonas , Zoogloea , Alcaligenes, Delftia , Burkholderia , Ralstonia , Rhodococcus , Gordonia , Rhodobacter , Paracoccus , Rickettsia , Caulobacter , Methylobacterium , Azorhizobium, Agrobacterium , Rhizobium , Sinorhizobium , Rickettsia , Crenarchaeota, Synechocystis , Ectothiorhodospira , Thiocapsa , Thyocystis 및 Allochromatium 속, 2류 Burkholderia 및 Pseudomonas 속, 또는 4류 Bacillus 속, 더욱 바람직하게는, 1류 Acinetobacter 종 RA3849, Vibrio cholerae , Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas punctata FA440 , Aeromonas hydrophila , Chromobacterium violaceum , Pseudomonas 종 61-3, Zoogloea ramigera , Alcaligenes latus , Alcaligenes 종 SH-69, Delftia acidovorans , Burkholderia 종 DSMZ9242, Ralstonia eutrophia H16, Burkholderia cepacia, Rhodococcus rubber PP2, Gordonia rubripertinctus , Rickettsia prowazekii, Synechocystis 종 PCC6803, Ectothiorhodospira shaposhnikovii N1, Thiocapsa pfennigii 9111, Allochromatium vinosum D, Thyocystis violacea 2311, Rhodobacter sphaeroides , Paracoccus denitrificans , Rhodobacter capsulatus , Caulobacter crescentus , methyllobacteria extorquens , Azorhizobium caulinodans, Agrobacterium tumefaciens , Sinorhizobium meliloti 41, Rhodospirillum rubrum HA, 및 Rhodospirillum rubrum ATCC25903, 2류 Burkholderia caryophylli , Pseudomonas chloraphis, Pseudomonas 종 61-3, Pseudomonas putida U, Pseudomonas oleovorans , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas resinovorans , Pseudomonas stutzeri , Pseudomonas mendocina , Pseudomonas pseudolcaligenes , Pseudomonas putida BM01, Pseudomonas nitroreducins, Pseudomonas chloraphis , 및 4류 Bacillus megaterium 및 Bacillus 종 INT005을 포함하는 군에서 선택된 PHA 합성 효소이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 다른 폴리머 합성 효소는, 하기의 생물(각각이 기탁 번호로 식별됨)로부터의 폴리머 합성 효소를 포함한다: C. necator (AY836680), P. aeruginosa (AE004091), A. vinosum (AB205104), B. megaterium (AF109909), H. marismortui (YP137339), P. aureofaciens (AB049413), P. putida (AF150670), R. eutropha (A34341), T. pfennigii (X93599), A. punctata (O32472), Pseudomonas 종 61-3 (AB014757 및 AB014758), R. sphaeroides (AAA72004, C. violaceum (AAC69615), A. borkumensis SK2 (CAL17662), A. borkumensis SK2 (CAL16866), R. sphaeroides KD131 (ACM01571 및 YP002526072), R. opacus B4 (BAH51880 및 YP002780825), B. multivorans ATCC 17616 (YP001946215 및 BAG43679), A. borkumensis SK2(YP693934 및 YP693138), R. rubrum (AAD53179), gamma proteobacteria HTCC5015 (ZP05061661 및 EDY86606), Azoarcus 종 BH72 (YP932525), C. violaceum ATCC 12472 (NP902459), Limnobacter 종 MED105 (ZP01915838 및 EDM82867), M. algicola DG893 (ZP01895922 및 EDM46004), R. sphaeroides (CAA65833), C. violaceum ATCC 12472 (AAQ60457), A. latus (AAD10274, AAD01209 및 AAC83658), S. maltophilia K279a (CAQ46418 및 YP001972712), R. solanacearum IPO1609 (CAQ59975 and YP002258080), B. multivorans ATCC 17616 (YP001941448 및 BAG47458), Pseudomonas 종 gl13 (ACJ02400), Pseudomonas 종 gl06 (ACJ02399), Pseudomonas 종 gl01 (ACJ02398), R. 종 gl32 (ACJ02397), R. leguminosarum bv . viciae 3841 (CAK10329 및 YP770390), Azoarcus 종 BH72 (CAL93638), Pseudomonas 종 LDC-5 (AAV36510), L. nitroferrum 2002 (ZP03698179), Thauera 종 MZ1T (YP002890098 및 ACR01721), M. radiotolerans JCM 2831 (YP001755078 및 ACB24395), Methylobacterium 종 4-46 (YP001767769 and ACA15335), L. nitroferrum 2002 (EEG08921), P. denitrificans (BAA77257), M. gryphiswaldense (ABG23018), Pseudomonas 종 USM4-55 (ABX64435 및 ABX64434), A. hydrophila (AAT77261 및 AAT77258), Bacillus 종 INT005 (BAC45232 및 BAC45230), P. putida (AAM63409 및 AAM63407), G. rubripertinctus (AAB94058), B. megaterium (AAD05260), D. acidovorans (BAA33155), P. seriniphilus (ACM68662), Pseudomonas 종 14-3 (CAK18904), Pseudomonas 종 LDC-5 (AAX18690), Pseudomonas 종 PC17 (ABV25706), Pseudomonas 종 3Y2 (AAV35431, AAV35429 및 AAV35426), P. mendocina (AAM10546 및 AAM10544), P. nitroreducens (AAK19608), P. pseudoalcaligenes (AAK19605), P. 수지 ovorans (AAD26367 및 AAD26365), Pseudomonas 종 USM7-7 (ACM90523 및 ACM90522), P. fluorescens (AAP58480) 및 다른 비배양 박테리아 (BAE02881, BAE02880, BAE02879, BAE02878, BAE02877, BAE02876, BAE02875, BAE02874, BAE02873, BAE02872, BAE02871, BAE02870, BAE02869, BAE02868, BAE02867, BAE02866, BAE02865, BAE02864, BAE02863, BAE02862, BAE02861, BAE02860, BAE02859, BAE02858, BAE02857, BAE07146, BAE07145, BAE07144, BAE07143, BAE07142, BAE07141, BAE07140, BAE07139, BAE07138, BAE07137, BAE07136, BAE07135, BAE07134, BAE07133, BAE07132, BAE07131, BAE07130, BAE07129, BAE07128, BAE07127, BAE07126, BAE07125, BAE07124, BAE07123, BAE07122, BAE07121, BAE07120, BAE07119, BAE07118, BAE07117, BAE07116, BAE07115, BAE07114, BAE07113, BAE07112, BAE07111, BAE07110, BAE07109, BAE07108, BAE07107, BAE07106, BAE07105, BAE07104, BAE07103, BAE07102, BAE07101, BAE07100, BAE07099, BAE07098, BAE07097, BAE07096, BAE07095, BAE07094, BAE07093, BAE07092, BAE07091, BAE07090, BAE07089, BAE07088, BAE07053, BAE07052, BAE07051, BAE07050, BAE07049, BAE07048, BAE07047, BAE07046, BAE07045, BAE07044, BAE07043, BAE07042, BAE07041, BAE07040, BAE07039, BAE07038, BAE07037, BAE07036, BAE07035, BAE07034, BAE07033, BAE07032, BAE07031, BAE07030, BAE07029, BAE07028, BAE07027, BAE07026, BAE07025, BAE07024, BAE07023, BAE07022, BAE07021, BAE07020, BAE07019, BAE07018, BAE07017, BAE07016, BAE07015, BAE07014, BAE07013, BAE07012, BAE07011, BAE07010, BAE07009, BAE07008, BAE07007, BAE07006, BAE07005, BAE07004, BAE07003, BAE07002, BAE07001, BAE07000, BAE06999, BAE06998, BAE06997, BAE06996, BAE06995, BAE06994, BAE06993, BAE06992, BAE06991, BAE06990, BAE06989, BAE06988, BAE06987, BAE06986, BAE06985, BAE06984, BAE06983, BAE06982, BAE06981, BAE06980, BAE06979, BAE06978, BAE06977, BAE06976, BAE06975, BAE06974, BAE06973, BAE06972, BAE06971, BAE06970, BAE06969, BAE06968, BAE06967, BAE06966, BAE06965, BAE06964, BAE06963, BAE06962, BAE06961, BAE06960, BAE06959, BAE06958, BAE06957, BAE06956, BAE06955, BAE06954, BAE06953, BAE06952, BAE06951, BAE06950, BAE06949, BAE06948, BAE06947, BAE06946, BAE06945, BAE06944, BAE06943, BAE06942, BAE06941, BAE06940, BAE06939, BAE06938, BAE06937, BAE06936, BAE06935, BAE06934, BAE06933, BAE06932, BAE06931, BAE06930, BAE06929, BAE06928, BAE06927, BAE06926, BAE06925, BAE06924, BAE06923, BAE06922, BAE06921, BAE06920, BAE06919, BAE06918, BAE06917, BAE06916, BAE06915, BAE06914, BAE06913, BAE06912, BAE06911, BAE06910, BAE06909, BAE06908, BAE06907, BAE06906, BAE06905, BAE06904, BAE06903, BAE06902, BAE06901, BAE06900, BAE06899, BAE06898, BAE06897, BAE06896, BAE06895, BAE06894, BAE06893, BAE06892, BAE06891, BAE06890, BAE06889, BAE06888, BAE06887, BAE06886, BAE06885, BAE06884, BAE06883, BAE06882, BAE06881, BAE06880, BAE06879, BAE06878, BAE06877, BAE06876, BAE06875, BAE06874, BAE06873, BAE06872, BAE06871, BAE06870, BAE06869, BAE06868, BAE06867, BAE06866, BAE06865, BAE06864, BAE06863, BAE06862, BAE06861, BAE06860, BAE06859, BAE06858, BAE06857, BAE06856, BAE06855, BAE06854, BAE06853 및 BAE06852).
PHA 합성 효소 단백질의 N-말단 절편(약 1 내지 200, 또는 1 내지 150, 또는 1 내지 100 아미노산)은, 매우 가변적이며, 일부 실시예에서는 폴리머 입자 결합 도메인(예컨대, C-말단 절편)을 통한, 폴리머 핵에 대한 합성 효소의 공유적 부착을 방해하지 않고도, 삭제되거나 또는 효소, 항체 결합 도메인, 또는 또 다른 융합 파트너에 의해 대체된다. 합성 효소의 폴리머 입자 결합 도메인은 적어도, 폴리머 핵의 중합화 및 폴리머 입자의 형성을 매개하는, 합성 효소 단백질의 촉매화 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, PHA 합성 효소 단백질의 C-말단 절편이, 합성 효소를 불활성화하거나 또는 폴리머 입자에 대한 합성 효소의 공유적 부착을 방해하지 않고도, 변경, 일부 삭제, 또는 효소, 항체 결합 도메인, 또는 또 다른 융합 파트너에 의해 부분적으로 대체된다.
특정한 경우, 효소, 항체 결합 도메인, 또는 또 다른 융합 파트너는, 합성 효소를 불활성화하거나, 또는 폴리머 입자에 대한 합성 효소의 공유적 부착을 방해하지 않고도, PHA 합성 효소 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합된다. 마찬가지로, 다른 경우에는 효소, 항체 결합 도메인, 또는 또 다른 융합 파트너가, PHA 합성 효소 단백질, 또는 사실은 입자-형성 단백질의 내부에 삽입된다. PhaC 융합체의 예가 당업계에 공지되었으며, 본 명세서에서 제시된다.
하나의 특이적 실시예에서, PHA 합성 효소 단백질의 N-말단 절편(약 1 내지 200, 또는 1 내지 150, 또는 1 내지 100의 아미노산)은, 합성 효소를 불활성화하거나, 또는 폴리머 입자에 대한 합성 효소의 공유적 부착을 방해하지 않고도, 삭제되거나, 항체 결합 도메인, 예컨대 단백질 A의 Z 도메인 또는 이의 텐덤 반복서열(tandem repeat)에 의해 대체된다.
"폴리머 디폴리머라제(polymer depolymerase)"라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 존재하는 폴리머, 예컨대 폴리머 입자에서 발견되는 것들을, 수용성 모노머 또는 올리고머로 가수분해시킬 수 있는 단백질을 말한다. 폴리머 디폴리머라제의 예들이 넓은 범위의 PHA-분해성 박테리아 및 진균에서 발생하며, Paucimonas lemoignei로부터의 PhaZ1-PhaZ7 세포외 디폴리머라제, Acidovorax 종, A. faecalis (균주 AE122 및 T1), Delftia (Comamonas) acidovorans 균주 YM1069, Comamonas testosteroni, Comamonas 종, Leptothrix 종 균주 HS, Pseudomonas 종 균주 GM101 (기탁 번호 AF293347), P. fluorescens 균주 GK13, P. stutzeri, R. pickettii (균주 A1 및 K1, 기탁 번호 JO4223, D25315), S. exfoliatus K10 및 Streptomyces hygroscopicus (Jendrossek D., 및 Handrick, R., 폴리히드록시알카노에이트의 미생물성 분해, Annual Review of Microbiology, 2002, 56:403-32 참고)로부터의 PhaZ 디폴리머라제를 포함한다.
"폴리펩티드(polypeptide)"라 함은 본 명세서에서 사용될 때, 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하나, 바람직하게는 전장(full-length) 단백질을 포함하는 적어도 5개의 아미노산을 포함하며, 이들의 아미노산 잔기는 펩티드 공유 결합에 의해 연결된다. 본 발명의 폴리펩티드는 정제된 천연 산물이거나, 또는 재조합 또는 합성 기술을 부분적으로, 또는 전적으로 사용하여 생산된다. 이 용어는 폴리펩티드, 폴리펩티드의 응집체(aggregate), 예컨대 이량체 또는 다른 다량체, 융합 폴리펩티드, 폴리펩티드 변형체, 또는 이의 유도체를 말한다.
"프로모터(promoter)"라 함은, 유전자 전사를 조절하는 암호화 부위의 상류에 위치하는, 비전사 시스(cis)-조절 요소를 말한다. 프로모터는 전사 개시 부위를 특정하는 시스-개시 요소, 및 보존 부위(conserved box), 예컨대 TATA 박스, 및 전사 인자에 결합된 모티프를 포함한다.
"종결자(terminator)"라 함은, 전사를 종결하는 서열을 말하며, 이들은 번역되는 서열의 하류, 유전자의 3' 비번역 말단에서 발견된다. 종결자는 mRNA 안정성에 대한 중요 결정 인자로서, 일부 경우 공간적 조절 기능을 갖는 것으로 발견되었다.
"물질(substance)"이라 함은, 폴리머 입자에 결합하거나, 이에 흡수되거나, 또는 그 내부로 혼입되는 것과 관련하여 언급될 때, 융합 파트너에 의해 결합되는 물질, 또는 폴리머 입자에 흡수 또는 그 내부로 혼입될 수 있는 물질을 의미하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용될 때, "변형체(variant)"라 함은, 구체적으로 식별된 서열과는 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 말하며, 여기에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 삭제, 치환, 또는 첨가된다. 변형체는 자연 발생적인 대립 형질 변형체(allelic variants), 또는 비-자연 발생적인 변형체이다. 변형체는 동일한 종 또는 다른 종에서 유래되며, 동일체(homologues), 또는 상동체(paralogues) 및 상사체(orthologues)를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 변형체는, 야생형 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 동일 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대하여 사용될 때 "변형체(variant)"는, 본 명세서에서 정의한 모든 형태의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 임의의 길이, 바람직하게는 적어도 15개 뉴클레오티드의 단일 또는 이중-가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드의 폴리머를 의미하며, 비제한적 예로서는 유전자의 암호화 및 비암호화 서열, 센스 및 안티센스 서열 상보체, 엑손, 인트론, 게놈 DNA, cDNA, pre-mRNA, mRNA, rRNA, siRNA, miRNA, tRNA, 리보자임, 재조합 폴리펩티드, 분리 및 정제된 자연 발생적 DNA 또는 RNA 서열, 합성 RNA 및 DNA 서열, 핵산 프로브, 프라이머 및 절편을 포함한다. 다수의 핵산 유사체가 당업계에 잘 알려졌으며, 이들 또한 고려된다.
본 명세서에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열의 "절편(fragment)"은, 바람직하게는 적어도 15개 길이의 뉴클레오티드인, 연속된 뉴클레오티드의 하위서열이다. 본 발명의 절편은, 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 적어도 20 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 30 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 40 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 50 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 적어도 60개의 연속된 뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절편은, 안티센스, 유전자 스플라이싱, 삼중 나선 또는 리보자임 기술, 또는 마이크로어레이에 포함되는 프라이머, 프로브로서 사용되거나, 또는 폴리뉴클레오티드 기반의 선별 방법에 사용된다.
프로모터 폴리뉴클레오티드 서열에 관련된 "절편(fragment)"은, 시스-요소(cis-element)를 포함하는 서열, 및 그 절편이 사용가능하게 연결된, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절할 수 있는 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열 영역을 포함하도록 의도된다.
바람직하게는, 본 발명의 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열의 절편은, 적어도 20, 더욱 바람직하게는 적어도 30, 더욱 바람직하게는 적어도 40, 더욱 바람직하게는 적어도 50, 더욱 바람직하게는 적어도 100, 더욱 바람직하게는 적어도 200, 더욱 바람직하게는 적어도 300, 더욱 바람직하게는 적어도 400, 더욱 바람직하게는 적어도 500, 더욱 바람직하게는 적어도 600, 더욱 바람직하게는 적어도 700, 더욱 바람직하게는 적어도 800, 더욱 바람직하게는 적어도 900 및 가장 바람직하게는 적어도 1000개의 본 발명의 프로모터 폴리뉴클레오티드의 연속된 서열을 포함한다.
"프라이머(primer)"라 함은, 짧은 폴리뉴클레오티드로서, 통상 자유 3' OH 기를 가지며, 템플레이트(template)와 혼성화하여, 상기 템플레이트에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 중합화를 개시(priming)하는데 사용되는 것을 말한다. 상기 프라이머는 바람직하게는 적어도 5, 더욱 바람직하게는 적어도 6, 더욱 바람직하게는 적어도 7, 더욱 바람직하게는 적어도 9, 더욱 바람직하게는 적어도 10, 더욱 바람직하게는 적어도 11, 더욱 바람직하게는 적어도 12, 더욱 바람직하게는 적어도 13, 더욱 바람직하게는 적어도 14, 더욱 바람직하게는 적어도 15, 더욱 바람직하게는 적어도 16, 더욱 바람직하게는 적어도 17, 더욱 바람직하게는 적어도 18, 더욱 바람직하게는 적어도 19, 더욱 바람직하게는 적어도 20개 길이의 뉴클레오티드이다.
"프로브(probe)"라 함은, 혼성화 기반 에세이에서, 프로브에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 탐지하는데 사용되는 짧은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 프로브는 상기에서 정의한 바와 같이 폴리뉴클레오티드의 "절편"으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 상기 프로브는 적어도 5, 더욱 바람직하게는 적어도 10, 더욱 바람직하게는 적어도 20, 더욱 바람직하게는 적어도 30, 더욱 바람직하게는 적어도 40, 더욱 바람직하게는 적어도 50, 더욱 바람직하게는 적어도 100, 더욱 바람직하게는 적어도 200, 더욱 바람직하게는 적어도 300, 더욱 바람직하게는 적어도 400 및 가장 바람직하게는 적어도 500개 길이의 뉴클레오티드이다.
"변형체(variant)"라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 구체적으로 식별된 서열과는 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 말하며, 여기에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 삭제, 치환, 또는 첨가된다. 변형체는 자연발생적인 대립 형질 변형체, 또는 비-자연발생적인 변형체이다. 변형체는 동일 또는 다른 종으로부터 유래했으며, 동일체, 상동체, 및 상사체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 변형체는, 야생형 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 동일 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 관한 "변형체"는, 본 명세서에서 정의한 모든 형태의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 변형체
변형 폴리뉴클레오티드 서열은, 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 보인다. 동일성은 적어도 20개 뉴클레오티드 위치, 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드 위치, 적어도 100개 뉴클레오티드 위치의 비교 창에 걸쳐, 또는 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 전 길이에 걸쳐 발견된다.
폴리뉴클레오티드 서열 동일성은, 하기의 방식으로 결정할 수 있다. 해당 폴리뉴클레오티드 서열은 bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "blast 2 서열 - 단백질 및 뉴클레오티드 서열 비교용 신규 툴" FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)에서 BLASTN(BLAST 프로그램, 버전 2.2.10 [Oct 2004])을 사용하여, 후보 폴리뉴클레오티드 서열과 비교되며, 이 프로그램은 NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)로부터 공공적으로 사용가능하다. 저 복합성 부분의 필터링을 해제해야 하는 것을 제외하고, bl2seq의 디폴트 변수를 사용하였다.
폴리뉴클레오티드 서열의 동일성은, 하기의 유닉스 명령 라인 변수를 사용하여 조사할 수 있다:
bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2- F F-p blastn
변수-F F는 저 복합성 섹션의 필터링을 해제하였다. 변수-P는 서열 쌍에 적절한 알고리즘을 선택한다. bl2seq 프로그램은 "Identities ="의 라인에서의 동일한 뉴클레오티드의 수 및 퍼센트로서, 서열 동일성을 보고한다.
폴리뉴클레오티드 서열의 동일성은, 또한 세계 공용적(global) 서열 정렬 프로그램 (예를 들어, Needleman, S. B. 및 Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453)을 사용하여, 후보 및 해당 폴리뉴클레오티드 서열이 겹치는 부분의 전체 길이에 걸쳐서 계산되었다. 니들만-분취 세계 공용 정렬 알고리즘 (Needleman-Wunsch global alignment algorithm)의 완전한 실행은, http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/에서 입수할 수 있는 EMBOSS 패키지 (Rice,P. Longden,I. 및 Bleasby,A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp.276-277)의 니들만 프로그램에서 발견하였다. 유러피안 바이오임포머틱스 연구소 서버 (European Bioinformatics Institute server)도 또한, http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/에서 라인 상의 두 서열 간에 EMBOSS-needle global alignment을 실행하는 설비(facility)를 제공한다.
대안적으로, GAP 프로그램은 말단 갭을 패널라이징 하지 않고, 두 서열의 최대의 세계 공용적인 정렬을 수행하는데 사용될 수 있다. GAP은 하기의 논문에 기재되었다: Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 변형체는 또한, 하나 또는 그 이상의 구체적으로 식별된 서열로서, 이들 서열의 기능적 동일성을 보존하며 이의 임의 발생을 합리적으로 기대할 수 없는 서열에 대한 유사성을 보여주는 것을 포함한다. 폴리펩티드에 대한 이러한 서열 유사성은, NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)로부터의 BLAST 프로그램(버전 2.2.10 [Oct 2004])에서 나온, 공공이 사용가능한 bl2seq 프로그램을 사용하여 결정하였다.
폴리뉴클레오티드 서열의 유사성은, 하기의 유닉스 명령 라인 변수를 사용하여 조사하였다:
bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-F F -p tblastx
변수-F F는 저 복합성 섹션의 필터링을 해제하였다. 변수-P는 서열 쌍에 적절한 알고리즘을 선택한다. 이 프로그램은 서열 간의 유사 영역을 찾고, 각 영역에 대하여 "E 값"을 보고하며, 이는 랜덤 서열을 포함하는 고정된 참고 크기의 데이터베이스 상에서, 우연히 일치하는 부분을 찾도록 기대할 수 있는 기대 횟수이다. 이러한 데이터베이스의 크기는, bl2seq 프로그램 상의 디폴트로 세팅되었다. 1보다 훨씬 작은 E 값에 대하여, 상기 E 값은 대략 상기의 임의의 매치(match)에 대한 가능성(probability)이다.
변형 폴리뉴클레오티드 서열은, 구체적으로 식별된 서열 중 어느 하나와 비교할 때, 바람직하게는 1 x 10-10 이하, 더욱 바람직하게는 1 x 10-20 이하, 1 x 10-30 이하, 1 x 10-40 이하, 1 x 10-50 이하, 1 x 10-60 이하, 1 x 10-70 이하, 1 x 10-80 이하, 1 x 10-90 이하, 1 x 10-100 이하, 1 x　10-110 이하, 1 x 10-120 이하, 또는 1 x 10-123 이하의 E 값을 보인다.
대안적으로, 본 발명의 변형 폴리뉴클레오티드는, 엄격한(stringent) 조건 하에서, 특이적 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보체에 혼성화한다.
"엄격한 조건 하의 혼성화" 및 이의 문법적 동등물은, 온도 및 염 농도가 한정된 조건 하에서, 목표 폴리뉴클레오티드 분자(예컨대, 서던 블롯 또는 노던 블롯과 같은 DNA 또는 RNA 블롯에 고정된 목표 폴리뉴클레오티드)에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 분자의 능력을 말한다. 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 능력은, 처음에는 덜 엄격한 조건에서 혼성화하였으나, 원하는 엄격한 조건까지 그 정도를 증가시킴으로서 결정된다.
약 100개 염기 길이보다 큰 폴리뉴클레오티드 분자에 대해서는, 통상적으로 엄격한 혼성화 조건은 원래 이중 가닥의 녹는점(Tm) 미만인, 25 내지 30℃ 이하(예를 들어, 10℃)이다(일반적으로, Sambrook 등, Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel 등, 1987, 최신 프로토콜 in Molecular Biology, Greene Publishing 참고). 약 100개 염기 초과의 폴리뉴클레오티드 분자의 Tm은, 일반식 Tm = 81.5 + 0.41% (G + C-log(Na+)에 의해 계산할 수 있다(Sambrook 등, Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390). 약 100개 염기 초과의 폴리뉴클레오티드에 대한 통상적인 가혹화 조건은, 하기와 같다: 6X SSC, 0.2% SDS의 용액에서 예비 세척; 65℃, 6X SSC, 0.2% SDS에서 밤새 혼성화; 이어서 1X SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 30분 동안 2번 세척, 및 30 분 각각 0.2X SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 두 번의 세척.
약 100개 염기 길이 이하인 폴리뉴클레오티드 분자에 대하여, 대표적 엄격한 혼성화 조건은 Tm의 5 내지 10℃ 미만이다. 평균적으로, 약 100개 염기 길이 이하의 폴리뉴클레오티드 분자의 Tm은, 대략 (500/올리고뉴클레오티드 길이)℃로 감소한다.
펩티드 핵산(PNAs)이라고 알려진 DNA 모방체(mimics)(Nielsen 등, Science. 1991 Dec 6;254(5037):1497-500)에 관해서는, Tm 값은 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화물에서 보다 높고, Giesen 등, Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1;26(21):5004-6에서 기재된 일반식을 사용하여 계산할 수 있다. 100개 염기 이하의 길이를 갖는 DNA-PNA 혼성화물에 대한 예시적 엄격한 혼성화 조건은, Tm보다 5 내지 10℃ 미만이다.
본 발명의 변형 폴리뉴클레오티드는, 또한 본 발명의 서열과 다르나, 유전적 코드의 축퇴(degeneracy)의 결과로서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 서열 변이는, 침묵 변이(silent variation)이다. ATG(메티오닌) 및 TGG(트립토판)을 제외하고는, 일부 실시예에서 동일한 아미노산에 대한 다른 코돈이, 최신의 인정받은 기술에 의해 변경되어, 예를 들면 특히 숙주 생물에서의 코돈 발현을 극대화한다.
암호화 폴리펩티드 서열에서 하나 또는 여러 개 아미노산의 보존적 치환(conservative substitution)이 생성되는 폴리뉴클레오티드 서열의 변이는, 또한 이의 생물학적 활성을 유의하게 변경시키지 않고도, 본 발명에 포함된다. 당업계의 통상의 기술자는 표현형으로 나타나지 않는(phenotypically silent) 아미노산 치환의 생성 방법을 알고 있을 것이다(예를 들어, Bowie 등, 1990, Science 247, 1306 참고).
암호화 폴리펩티드 서열 상의 침묵 변이 및 보존적 치환에 기인한 변형 폴리뉴클레오티드는 NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)의 BLAST 프로그램(버전 2.2.10 [Oct 2004])에서, 상기에서 설명한 tblastx 알고리즘을 통하여 공공적으로 이용가능한 bl2seq을 사용하여 결정할 수 있다.
폴리펩티드 변형체
폴리펩티드에 관한 "변형체"는, 자연 발생적, 재조합 및 합성에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함한다. 변형 폴리펩티드 서열은, 본 발명의 서열에 대하여, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 보인다. 동일성은 본 발명의 폴리펩티드의 적어도 20 아미노산 위치, 바람직하게는 적어도 50 아미노산 위치, 적어도 100 아미노산 위치의 비교창, 또는 이의 전체 길이에 걸쳐서 나타난다.
폴리펩티드 서열 동일성은 하기의 방식으로 결정할 수 있다. 해당 폴리펩티드 서열은 NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)에서 공공적으로 이용가능한, bl2seq의 BLASTP (BLAST 프로그램, 버전 2.2.10 [Oct 2004])을 사용하여 후보 폴리펩티드 서열과 비교된다. 저 복합성 부위의 필터링을 해제해야 하는 것을 제외하고, bl2seq의 디폴트 변수를 사용하였다.
폴리펩티드 서열 동일성도 또한, 세계 공용의 서열 정렬 프로그램을 사용하여, 후보 및 해당 폴리뉴클레오티드 서열 간의 겹치는 부위의 전체 길이에 걸쳐서 계산되었다. 상기에서 논의한 바와 같이, EMBOSS-needle (http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/에서 이용가능) 및 GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235)도 또한, 폴리펩티드 서열 동일성을 계산하기 위한, 적절한 세계적 서열 정렬 프로그램이다.
본 발명의 폴리펩티드 변형체는 또한, 이 서열들의 기능적 동등물을 보존하며, 임의 발생을 합리적으로 기대할 수 없는, 하나 또는 그 이상의 구체적으로 식별된 서열에 대한 유사성을 보여준다. 폴리펩티드에 대한 상기 서열의 유사성은, NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)로부터 BLAST 프로그램 (version 2.2.10 [Oct 2004])에서 공공적으로 사용가능한 bl2seq 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 폴리펩티드 서열의 유사성은 하기의 유닉스 명령 라인 변수를 사용하여 조사할 수 있다:
bl2seq - i peptideseq 1 - peptideseq2 -F F-p blastp
변형 폴리펩티드 서열은, 구체적으로 식별된 임의의 서열 중 어느 하나와 비교할 때, 바람직하게는 1 x 10-10 이하, 더욱 바람직하게는 1 x 10-20 이하, 1 x 10-30 이하, 1 x 10-40 이하, 1 x 10-50 이하, 1 x 10-60 이하, 1 x 10-70 이하, 1 x 10-80 이하, 1 x 10-90 이하, 1 x10-100 이하, 1 x 10-110 이하, 1 x 10-120 이하 또는 1 x 10-123 이하의 E 값을 보인다.
변수-F F는 저 복합성 섹션의 필터링을 해제한다. 변수-P는 서열 쌍에 적절한 알고리즘을 선택한다. 이 프로그램은 서열들 간의 유사 영역을 찾고 각 영역에 대하여 "E 값"을 보고하며, 이는 랜덤 서열을 포함하는 고정된 참고 크기의 데이터베이스 상에서 우연히 이러한 매치를 볼 수 있을 것으로 기대되는 기대 횟수이다. 1보다 훨씬 작은 E 값에 대해서, 이는 대략적으로 상기 임의 매치의 가능성이다.
이의 생물학적 활성을 유의하게 변경시키지 않고도, 기재된 폴리펩티드 서열의 하나 또는 여러 개의 아미노산을 보존적으로 치환시키는 것, 또한 본 발명에 포함된다. 당업계의 통상의 기술자들은, 표현형으로 나타나지 않는 아미노산 치환의 생성 방법에 대해 알고 있을 것이다(예를 들어, Bowie 등, 1990, Science 247, 1306 참고).
본 발명의 폴리펩티드 변형체는 또한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에서 생성되나, 야생형 폴리펩티드와는 다르며, 즉 이는 변경된 아미노산 서열을 갖도록 차이 나게 가공된 것이다. 예를 들어, 변형체는 야생형 폴리펩티드를 생성하는 1차 RNA 전사체가 얼터너티브 스플라이싱(alternative splicing) 패턴을 거쳐서 생성된다.
"벡터(vector)"라 함은, 폴리뉴클레오티드 분자, 보통 유전적 구조체를 숙주 세포로 전달하는데 사용되는 2중 나선 DNA를 말한다. 특정 실시예에서, 벡터는 적어도 하나의 추가적 숙주 시스템, 예컨대 E. coli에서 복제가능하다.
접선 유동 여과
일반적으로, 본 발명은 접선-유동 여과 기술 상에서의 응용을 찾는다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 원료액으로부터 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 접선-유동 여과 시스템에 첨가될 때 또는 그 이전에, 원료액을 바이오폴리머 입자의 집단과 접촉시키는 단계로서, 이는 하나 또는 그 이상의 하기의 단계를 실시한다:
- 폴리머 입자의 집단을 농축하는 단계,
- 하나 또는 그 이상의 오염물을, 예컨대 투석 여과에 의해, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자-결합 목표 물질 또는 이의 폴리머 입자-결합 전구 물질로부터 분리하는 단계,
- 목표 물질을 폴리머 입자로부터 용출하는 단계; 및
- 목표 물질을 회수하는 단계.
목표 물질의 입자-결합 전구 물질에 관련된 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 전구 물질의 목표 물질로의 변환, 또는 추가적 전구 물질의 목표 물질로의 변환을 촉매화할 수 있는 하나 또는 그 이상의 효소를 포함한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 목표 물질의 전구 물질은, 기질의 목표 물질로의 변환을 촉매화할 수 있는 효소의 기질이며, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 효소를 포함한다. 다른 실시예에서, 목표 물질의 전구 물질은, 기질의 추가적 전구 물질 및 이후 목표 물질로의 변환을 촉매화할 수 있는 효소의 기질이고, 이는 그 자체로 추가의 전구 물질의 목표 물질로의 변환을 촉매화할 수 있는 제 2 효소의 기질이며, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 제 1 효소, 제 2 효소, 또는 제 1 및 제 2 효소 모두를 포함한다. 적절히 선택된 효소를 포함하는 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 제공함으로서, 전구 물질의 목표 물질로의 변환시 일련의 촉매화 단계를 사용할 수 있다는 것은 자명한 일이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 원료액으로부터 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기의 공정을 포함한다: 접선-유동 여과 시스템에 첨가될 때 또는 그 이전에, 원료액을 바이오폴리머 입자의 집단과 접촉시키는 단계로서, 이는 하나 또는 그 이상의 하기의 단계를 실시한다:
- 폴리머 입자의 집단을 농축하는 단계,
- 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 이의 전구 물질을, 예컨대 투석여과에 의해, 하나 또는 이상의 폴리머 입자-결합 오염물로부터 분리하는 단계; 및
- 목표 물질을 회수하는 단계.
하나의 구현예에서, 원료액을 바이오폴리머 입자의 집단과 접촉시키는 단계는, 바이오폴리머 입자 및 원료액을 접선-유동 여과 시스템에서 순환시킴으로서 실시한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 원료액으로부터 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 바이오폴리머 입자의 집단 및 임의로 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 이의 전구 물질 및/또는 하나 또는 그 이상의 오염물을 포함하는 원료액을 접선-유동 여과 시스템에 첨가하는 단계, 폴리머 입자의 집단을 농축시키는 단계, 및/또는 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 이의 전구 물질 및/또는 하나 또는 그 이상의 오염물을 폴리머 입자로부터 분리시키는 단계, 및 폴리머 입자, 목표 물질, 또는 오염물을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 조성물, 방법 및 폴리머 입자는, 기존의 접선-유동 시스템 및 기술과 함께 응용할 수 있다. 매우 다양한 이러한 시스템이 존재한다. 접선-유동 여과 시스템에서, 액체 배지의 유동에 의해 필터 요소에 걸리는 전단력은, 필터 요소의 표면 상의 고체의 축적에 반하는 경향이 있다.
접선 유동 필터는, 미세여과, 한외여과, 나노여과 및 역삼투압 필터 시스템을 포함한다. 하나의 예시적 구현예에서, 접선-유동필터는 사용가능하게 포개진 정렬의 다수의 필터 시트를 포함하며, 여기에서 예를 들어 상기 필터 시트는 투과물 및 잔류물 시트와 교체되며(alternate with), 여과가 될 액체가 필터 시트를 가로질러 유동되므로, 비투과물 종류, 예컨대 고체 또는 필터 시트의 구멍 크기보다 큰 직경을 갖는 고분자량의 종들이 잔류하여, 잔류물 흐름으로 들어가며, 액체는 모든 투과물과 함께 필터 시트를 통하여 확산되어 투과물 흐름으로 들어간다.
자명하게 알 수 있듯이, 많은 접선-유동 기술 (또한, 크로스 플로우 기술이라고도 함)이 현재 이용가능하며, 본 발명과 함께 사용하기에 적절하다. 접선-유동 막 필터를 포함하는 시판 접선-유동 기술은, 예를 들어, (Vivaflow 200, 100,000 MWCO, PES, VivaScience 등을 포함하는) Vivaflow 필터(Vivascience 사제), Hydrosart® 및 폴리에테르설폰 미세여과 및 한외여과 막(Sartorius 사)를 포함하며, 적절한 접선-유동필터 모듈 및 이러한 타입의 카세트는, 미국 특허 제 4,867,876 호; 미국 특허 제 4,882,050 호; 미국 특허 제 5,034,124 호; 미국 특허 제 5,034,124 호; 미국 특허 제 5,049,268 호; 미국 특허 제 5,232,589 호; 미국 특허 제 5,342,517 호; 미국 특허 제 5,593,580 호; 미국 특허 제 5,868,930 호; 및 WO/2010/107677로 공개된 PCT 국제출원 PCT/US2010/027266에서 다양하게 기재된다(상기의 모든 문헌은 본 명세서에서 전체로서 참고됨).
본 발명에 활용가능한 예시적인 접선-유동의 일반적 개요를, 도 1 내지 도 4에 나타내었다. 접선 유동 여과 (TFF) 또는 크로스플로우 여과 (본 명세서에서 호환하여 사용됨)는, 여과 매질의 표면에 평행한 용액 또는 현탁액의 유동 경로를 가동함으로서, 여과가 이루어지는 공정이다(도 1A). 일례의, 간단한 시스템은 공급 수조로부터 TFF 막 카트리지를 통과하여, 시스템 내에서 투과물의 재순환이 가능하도록 공급 펌프를 사용한다(도 1B). 작은 화합물 및 용액이, 투과물로서 필터를 통과한다. 이러한 방식으로, 잔류물 중의 큰 화합물이 농축된다. 추가적인 용액 저장소를 추가함으로서, 잔류물을 여과에 의해 투석(투석 여과) 할 수 있다. 따라서 특정 구현예에서, 투석여과는 큰 화합물(현탁액 중의 분자, 세포, 고체)을 더 작은 화합물로부터 분리하는 공정으로서 사용된다. 일반적으로, 서브마이크론 범위, 예컨대 0.1-0.6㎛의 TF 필터를 사용하는 것이, 미세여과라고 알려져 있다. 도 2에서 나타난 일반적 개요에 관하여, 원료액은 임의로 예비 가공되며, 예를 들어 (예를 들어 원심 분리, 또는 당업계에 잘 알려진 여과 기술에 의하여) 미립자 또는 고체 물질을 제거하고, 이후의 정제 시 필요하다면 농축, 또는 희석된다. 그 후 원료액을, 입자:목표물 혼합체의 형성이 가능한 충분한 시간 동안, 바이오폴리머 입자의 집단과 접촉시킨다.
일반적으로, 원료액은 바람직한 비율의 목표물이 바이오폴리머 입자와 결합하는데 충분한 시간 동안 바이오폴리머 입자와 접촉된다. 예를 들어, 교반 또는 접선-유동 여과 시스템을 통한 공정에 의하여 원료액과 바이오폴리머 입자의 혼합하는 것은, 통상적으로 목표물에 대한 최적의 접촉 및 결합을 보장하는데 유리하다.
입자:목표물 복합체는 접선-유동 여과 시스템 및 이에 의한 접선-유동필터를 통하여 순환하고, 여기에서 (a) 복합체가 농축되며, (b) 상기 복합체를 (통상적으로 입자:목적물 복합체로부터 비특이적으로 결합된 오염물을 분리하도록 선택된) 투석여과액에 대해 투석여과되며, (c) (통상적으로 제 2 투석여과액에 의해 투석여과하여 입자:목표 물질 복합체를 분리시킴으로서) 목표 물질이 입자로부터 용출되며, (d) 그 후 목표 물질이 바이오폴리머 입자로부터 분리되며(예를 들어, 목표 물질이 투석여과되며), 이로 인하여 정제된 목표 물질을 회수한다. 목표 물질은 (e) 임의로, 예컨대 농축에 의하여, 추가로 가공된다.
도 3에서 나타낸 추가적 구현예에서, 원료액은 목표 물질, 예를 들어, 하나 이상의 효소의 기질의 전구물질을 포함하며, 상기 효소의 산물은 원하는 목표 물질이다. 이러한 구현예에서, 전구 물질 물질을 포함하는 원료액은, 전구 물질의 목표 물질로의 변환을 촉매화할 수 있는 하나 또는 그 이상의 효소를 포함하는 하나 또는 그 이상의 바이오폴리머 입자와 접촉된다. 상기에서 설명한 바와 같이, 원료액 및 바이오폴리머 입자는, 복합체(이 경우에는 입자:효소-기질 복합체)를 형성하기에 충분한 시간 동안 접촉된다. 원료액 및 바이오폴리머 입자 혼합물은, 바람직한 비율의 전구 물질이 바이오폴리머 입자에 결합하고 전구 물질 분자가 목표 물질로 변환하기에 충분한 시간 동안 유지된다.
도 4는 본 발명의 방법을 사용하여 목표 물질을 정제하기 위한 일반적 개요를 나타내며, 여기에서 바이오폴리머 입자는 하나 또는 그 이상의 오염물을 제거함으로서 목표 물질을 강화하는데 사용된다. 이러한 경우에, 원료액은 상기 원료액에 존재하는 하나 또는 그 이상의 오염물과 결합할 수 있는, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자의 집단과 접촉된다. 여기에서, 입자:오염물 복합체의 형성으로(예를 들어, 본 명세서에서 설명한 바와 같이 본 발명의 하나 또는 그 이상의 접선-유동 방법을 통하여) 추후 처리되는 목표 물질을 투석여과할 수 있게 된다. (통상적으로 제 2 투석여과액에 의해) 투석여과를 함으로서, 입자:오염물 복합체와 분리되게 할 수 있고, 여기에서 바이오폴리머 입자는 추후의 사용을 위해 재순환될 수 있다.
따라서, 당업계의 통상의 기술자는 (상기에서 개략된 대표적 실시예를 포함하는) 본 발명의 다양한 구현예에서, 잔류물 또는 투과물 중 어느 하나에서, 원하는 목표 물질을 접선-유동 여과 시스템으로부터 용출하는 것이 고려되었으며, 이는 사용된 폴리머 입자의 특정 구성 또는 특정 집단에 따라 달라진다는 것을 인정할 것이다.
원료 물질
본 발명은 원료 물질로부터 목표 물질을 제조하는 것에 관한 것이다. "원료 물질(source material)"이라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 물질, 통상적으로 적어도 하나 및 종종 그 이상의 물질, 보통 생물학적 물질, 또는 원료 물질에 존재하는 다른 물질로부터 추출 또는 정제하고자 하는 가치있는 산물을 포함하는 액체를 말한다. 일반적으로, 원료 물질은 수성 용액, 유기 용매 시스템, 또는 수성/유기 용매 혼합물 또는 용액일 수 있다. 원료 물질은 종종 복합 혼합물 또는 많은 생물학적 분자, 예컨대 단백질, 항체, 호르몬 및 바이러스, 뿐만 아니라 작은 분자, 예컨대 염, 당, 지질 등을 포함하는 용액이다. 생물학적 시작(origin)의 통상적인 원료 물질이 수성 용액 또는 현탁액으로 시작하는 반면, 이는 이전의 분리 단계, 예컨대 용매 침착, 추출 등에서 사용된 유기 용매도 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 정제 방법에 사용할 수 있는, 가치있는 생물학적 물질을 포함하는 원료액의 예로서는, 바이오리액터(bioreactor)의 배양 상등액, 균질화된 세포 현탁액, 혈장 (plasma), 혈장 분획, 및 유가공 스트림 예컨대 우유, 초유(colostrum) 및 유청(whey), 예컨대 치즈 유청을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 구현예에서, 원료 물질은 혈청(serum), 혈장, 혈장 분획, 전체 혈액, 우유, 초유, 유청, 세포액, 조직 배양액, 식물 세포액, 식물 세포 균질화물, 및 조직 균질화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 액체를 포함한다. 예를 들어, 원료 물질은 식물 추출물, 예컨대 과일즙 또는 채소즙이다. 발효물은 배양액 또는 배양 상등액이므로, 하나 또는 그 이상의 재조합 단백질, 예컨대 하나 또는 그 이상의 단일 클론 항체를 발현하는 배양액의 발효물이 특히 고려된다.
다른 구현예에서, 원료 물질은 본 발명의 폴리머 입자를 포함하는, 예를 들어 바이오리액터로부터의 배양 상등액을 포함한다. 당업계의 통상의 기술자는, 이러한 원료 물질이 특정 환경에서는 오염물로 간주되는, 유의량의 다른 생물학적 물질을 포함하는 것을 인정할 것이다. 예를 들어, 하나의 예시적 구현예에서, 원료 물질은 본 발명의 폴리머 입자를 생성하는데 사용되는 박테리아를 포함하는, 배양 상등액 또는 세포 시료이다. 명확히 고려된 또 다른 구현예에서, 원료 물질은 본 발명의 폴리머 입자, 및 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 이의 전구 물질을 생성하는 세포로부터의 배양 상등액, 또는 세포 시료이다. 특정 실시예에서, 원료 물질은 본 발명의 폴리머 입자, 및 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 이의 전구 물질 모두를 생성하는 세포 집단을 포함하는 배양 상등액, 또는 세포 시료이다.
목표 물질
상기한 바와 같이, 본 발명은 원료 물질, 예컨대 목표 물질의 전구 물질을 포함하는 원료 물질로부터 목표 물질을 제조하는 것에 관한 것이다. "목표 물질(target material)"이라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 원료액으로부터 제조되거나 또는 정제되는, 하나 또는 그 이상의 원하는 산물 또는 산물들을 말한다. 목표 물질은 통상적으로 가치있는 생물학적 산물, 예를 들어 이뮤노글로블린, 응고인자(clotting factor), 백신, 항원, 항체, 분비 단백질 또는 당단백질, 펩티드, 효소, 대사물질 등이다.
다양한 구현예에서, 목표 물질은 백신, 응고 인자, 이뮤노글로블린, 항원, 항체, 단백질, 당단백질, 펩티드, 당, 탄수화물, 및 효소로 이루어진 군에서 선택된다.
다양한 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 친화성 리간드는, 단백질, 핵산, 바이러스, 당, 탄수화물, 이뮤노글로블린, 응고 인자, 당단백질, 펩티드, 항체, 항원, 호르몬, 또는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 목표 종류 중 적어도 하나에 결합한다.
그러나, 본 발명은 통상 "생물학적"이라고 고려되는 것들 이외의, 매우 다양한 목표 물질의 제조에 대한 응용을 찾아내었으며, 이는 본 명세서에서 기재된 폴리머 입자에 연결될 수 있는 다수의 관능성 잔기를 인식할 때 자명하다. 예를 들어, 본 발명의 폴리머 입자는 예를 들어 폴리머 합성 효소:금속-결합 폴리펩티드 융합 폴리펩티드의 발현에 의하여, 금속 또는 금속-이온 결합 잔기, 예컨대 금속 또는 금속-이온 조정(co-ordinating) 폴리펩티드와 함께 용이하게 기능화된다. 사실, 하나 또는 그 이상의 단백질 관능기가 폴리머 입자를 포함하는 폴리머-형성 단백질 또는 폴리머-결합 단백질과 융합할 수 있는 능력은, 극히 다양한 범위의 목표 물질의 제조시의 응용도 가능하게 한다.
본 발명의 바이오폴리머 입자를 포함하는 융합 폴리펩티드는, 하나 또는 그 이상의 발현 구조체의 사용을 포함한, 당업계에 잘 공지된 생명공학 기술을 사용하여 용이하게 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 바이오폴리머 입자를 포함하는 융합 폴리펩티드 및 바이오폴리머 입자가, 본 명세서에서 고려된 바와 같이, 그 자체로 목표 물질인 것은 자명한 사실이다.
발현 구조체
미생물, 식물 세포 또는 동물 세포 (세포 발현 시스템) 또는 무세포 발현 시스템(cell-free expression system), 및 본 발명에서 사용하기 위한 폴리머 입자의 형성에 유용한 발현 구조체를 포함하는 숙주에서, 융합 폴리펩티드 발현을 위한 발현 구조체를 생산 및 사용하기 위한 공정은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Sambrook 등, 1987; Ausubel 등, 1987).
본 발명의 방법에 사용하기 위한 발현 구조체는, 하나의 구현예에서는 클로닝 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터로 삽입되고, 또는 다른 구현예에서는 숙주 게놈 내로 끼어든다. 다양한 벡터는 공공적으로 사용가능하다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지의 형태이다. 적절한 핵산 서열은, 다양한 공정을 거쳐 벡터 내로 삽입된다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 적절한 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) 부위로 삽입된다. 벡터 요소는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 신호 서열, 복제 개시점(origin), 하나 또는 그 이상의 선택적 마커 유전자, 인헨서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 하나 또는 그 이상의 요소를 포함하는 적절한 벡터의 제작은, 당업계에 공지된 표준 라이게이션(ligation) 기술을 사용한다.
발현 및 클로닝 벡터의 모두가, 하나 또는 그 이상의 선택된 숙주 내에서 벡터를 복제가능하게 하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에서 공지되어 있다.
하나의 구현예에서, 발현 구조체는 다수 카피 수의(high copy number) 벡터에 존재한다.
하나의 구현예에서, 다수의 카피수의 벡터는 숙주 세포 당 20　내지 3000　카피 수로 존재하는 것들로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 다수 카피수의 벡터는 다수 카피수의 복제 개시점(ori), 예컨대 ColE1 또는 ColE1-유래의 복제 개시점을 포함한다.　　 예를 들어, ColE-1 유래의 복제 개시점은, pUC19 복제 개시점을 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터에 사용하기에 적합한, 수많은 다수 카피 수의 복제 개시점이, 당업계의 통상의 기술자에 공지되어 있다. 이들은 pBR322 및 이의 유도체으로부터의 ColE1-유래의 복제 개시점, 뿐만 아니라 다른 다수 카피수의 복제 개시점, 예컨대 M13 FR 개시점 또는 p15A 개시점을 포함한다. 2μ의 플라스미드 개시점이 효모에 적합하며, 다양한 바이러스(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)의 개시점이 포유 동물 세포의 클로닝 벡터에 유용하다.
바람직하게는, 다수 카피 수의 복제 개시점은, ColE1-유래 pUC19 복제 개시점을 포함한다.
제한 부위는 복제 개시점 내에 위치하여, 제한 부위로 삽입체를 클로닝 할 때 개시점이 불활성화되고, 그로 인하여 벡터의 복제 진행이 불가능해진다. 대안적으로, 적어도 하나의 제한 부위는 복제 개시점 내에 위치하여, 제한 부위 내로 삽입체를 클로닝함으로서 작은 카피수 또는 단일 카피수의 벡터의 복제를 지지할 수 있을 것이다.　
발현 및 클로닝 벡터는, 통상적으로 형질전환 숙주 세포 내에서 벡터의 존재를 탐지하기 위한 선택 유전자(선택적 마커라고도 함)를 포함한다. 통상적인 선택 유전자는, (a) 항생제 또는 다른 톡신, 예컨대, 암피실린(ampicillin), 네오마이신(neomycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 또는 테트라사이클린(tetracyclin)에 저항성을 부여하고, (b) 영양요구성 결핍(auxotrophic deficiency)을 보완하며, 또는 (c) 복합 배지에서 사용할 수 없는 필수 영양소를 공급하는 단백질을 암호화하며, 예를 들어 Bacilli의 D-알라닌 라세마제(racemase)를 암호화하는 유전자를 들 수 있다.
식물의 형질전환에 흔히 사용되는 선택 마커는, 카나마이신(kanamycin) 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(phosphotrasnferase) II 유전자(NPT II), 스펙티노마이신(spectinomycin) 및 스트렙토마이신(streptomycin) 저항성을 부여하는 aadA 유전자, Ignite (AgrEvo 사) 및 Basta (Hoechst 사) 저항성을 위한 포스피노마이신 아실 트랜스퍼라제(phosphinomycin acyl transferase) (bar 유전자), 및 하이그로마이신(hygromycin) 저항성을 위한 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(hpt)를 포함한다.
포유 동물 세포를 위한 적절한 선택 마커의 예로서는, 발현 구조체를 받아들인(take up) 세포를 식별할 수 있게 하는 것들, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나아제가 있다. 야생형 DHFR이 이용될 때 적절한 숙주 세포는, Urlaub 등,1980에서 기재된 바와 같이 준비 및 배양된, DHFR 활성 결핍의 CHO 세포주이다. 효모에 사용시 적합한 선택 유전자는, 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자(Stinchcomb 등, 1979; Kingsman 등, 1979; Tschemper 등, 1980)이다. trp1 유전자는 트립토판에서의 생장 능력이 결핍된 효모의 돌연변이 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]를 위한 선택 마커를 제공한다.
폴리머 입자를 형성하는데 유용한 발현 구조체는, 바람직하게는 폴리머 합성 효소, 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산의 발현을 조절하는 프로모터를 포함한다.
다양한 잠재 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터들이 잘 알려져 있다. 원핵 숙주와 함께 사용하는데 적합한 프로모터는, β-락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템 (Chang 등, 1978; Goeddel 등, 1979), 알칼라인 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776), 및 혼성화 프로모터, 예컨대 tac 프로모터 (deBoer 등, 1983)를 포함한다. 박테리아 시스템을 위한 프로모터는, 또한 폴리머 합성 효소, 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에, 사용가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgano) (S.D.) 서열을 포함할 것이다.
효모 숙주에서 사용하기 위한 적절한 프로모터 서열의 예는, 3-포스포글리세레이트 키나아제 (Hitzeman 등, 1980) 또는 다른 당분해 효소 (Hess 등, 1968; Holland, 1978), 예컨대 에놀라제(enolase), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(glyceraldehyde-3-dehydrogenase), 헥소키나아제(hexokinase), 피루베이트 디카르복실라제(pyruvate decarboxylase), 포스포프룩토키나아제(phosphofuctokinase), 글루코스-6-포스페이트 이소머라제(glucose-6-phosphate isomerase), 3-포스포글리세레이트 뮤타아제(3-phosphoglycerate mutase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 트리오스포스페이트 이소머라제(triosephosphate isomerase), 포스포글루코스 이소머라제(phosphoglucose isomerase), 및 글루코키나아제(glucokinase)를 위한 프로모터를 포함한다..
다른 효모 프로모터로서, 생장 조건에 의해서 조절되는 전사의 추가적 장점을 갖는 유도성 프로모터는, 알콜 디히드로게나제 2(alcohol dehydrogenase 2), 이소시토크롬 C(isocytochrome C), 산 포스파타제(acid phosphatase), 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인(metallothionein), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 및 말토오스 및 갈락토오스 사용시의 효소의 프로모터 영역이다.
외떡잎 또는 쌍떡잎 식물의 조직 또는 기관을 포함하는, 식물 숙주 세포에 사용시 적절한 프로모터의 예로서는, 세포-, 조직- 및 기관-특이적 프로모터, 세포 사이클 특이적 프로모터, 일시적 프로모터, 유도성 프로모터, 대부분의 식물 조직에서 활성을 보이는 구조 프로모터, 및 재조합 프로모터를 포함한다. 프로모터의 선택은, 원하는 대로 클로닝된 폴리뉴클레오티드의 일시적 및 공간적 발현에 달려있다. 프로모터는 숙주 세포에서 유래된 것이거나, 또는 다른 식물, 바이러스, 및 식물 감염 박테리아 및 진균의 유전자에서 유래된다. 당업계의 통상의 기술자는, 과도한 실험이 없어도, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적 구조체를 사용하여, 발현 구조체를 변형(modify) 및 조절(modulate)하는데 사용하기에 적합한 프로모터를 선택할 수 있다 . 식물의 구조 프로모터의 예로서는, CaMV 35S 프로모터, 노팔라인(nopaline) 합성 효소 프로모터 및 옥토파인(octopine) 합성 효소 프로모터, 및 옥수수로부터의 Ubi 1 프로모터를 포함한다. 특이적 조직에서 활성이며, 내부의 발생 신호 또는 외부의 비생물적 또는 생물학적 스트레스에 반응하는 식물 프로모터가, 과학 문헌에 기재되어 있다. 예시적인 프로모터가 예를 들어 WO 02/00894에 기재되어 있고, 이는 본 명세서에서 전체로서 참고된다.
포유동물 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모터의 예로서는, 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두(powlfox) 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 살코마(avian sarcoma) 바이러스, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈 유래의 것, 이질적 포유동물 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로블린 프로모터 유래의 것, 및 열-충격(heat-shock) 프로모터 유래의 것들을 포함하며, 상기 프로모터는 숙주 세포 시스템과 양립 가능하다.
고등 진핵 생물에 의한 발현 구조체의 전사는, 일부 실시예에서 인헨서 서열을 벡터 내로 삽입함으로서 증가한다. 인헨서는 포로모터에 작용하여 이의 전사를 증가시키는, 보통 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용 요소이다. 많은 인헨서 서열이 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인(fetoprotein), 및 인슐린)에서 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵 세포 바이러스에서 유래한 인헨서가 사용될 것이다. 예로서는, 복제 개시점의 하류(bp 100-270)에 위치하는 SV40 인헨서, 시토메갈로바이러스 상류 프로모터 인헨서, 복제 개시점의 하류에 위치하는 폴리오마 인헨서, 및 아데노바이러스 인헨서가 있다. 통상적으로, 인헨서는 폴리머 합성 효소, 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드 암호화 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱되나, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 생물로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는, 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함한다. 이러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 가끔씩 3' 비번역 부위에서 일반적으로 얻을 수 있다. 이들 영역은 폴리머 합성 효소, 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA의 비번역 부위의, 폴리아데닐화 절편으로 전사되는 뉴클레오티드 절편을 포함한다.
하나의 구현예에서, 발현 구조체는 상류의 유도성 프로모터, 예컨대 아라비노스(arabinose)에 의해 유도되는 BAD 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 발현 구조체는 구조 또는 조절 프로모터 시스템을 포함한다.
하나의 구현예에서, 조절 프로모터 시스템은 유도성 또는 억제성 프로모터 시스템이다.
재조합 단백질 생성시에는 강한 프로모터를 사용하는 것이 바람직한 반면, 이질 단백질의 구조적인 과다 생성이 생장 속도, 플라스미드 안정성 및 배양액 안정성의 감소를 초래하므로 이들 프로모터의 조절이 필수적이다.
다수의 프로모터는 억제자 단백질과 작동자(operator)(프로모터로부터 하류 영역)와의 상호 작용에 의해 조절된다. 가장 잘 알려진 작동자는, 젖산 오페론 및 박테리오파지 A에서 유래한 것이다. E. coli에서 조절된 프로모터의 개요(overview)가 Friehs & Reardon, 1991의 표 1에 제공된다.
표준 박테리아 배양과 재조합 E. coli 관련 배양과의 주요한 차이점은, 생장기 및 생산기 또는 유도기가 분리된다는 것이다. 재조합 단백질 생성은, 종종 조절된 프로모터를 사용하여 성장기(프로모터가 "꺼져 있고(switch off)" 숙주에 대한 대사적 부담이 덜할 때)에서 고밀도의 세포, 및 그 후 (프로모터가 "켜지도록(switch on)" 하는 유도에 이어서) 유도기에서 이질 단백질의 높은 생성 속도를 얻을 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 프로모터 시스템은 LacI, Trp, 파지 γ 및 파지 RNA 폴리머라제로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 프로모터 시스템은 lac 또는 Ptac 프로모터 및 lacI 억제자, 또는 trp 프로모터 및 TrpR 억제자로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, LacI 억제자는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가함으로서 불활성화되며, 이는 활성 억제자에 결합하여, 이를 작동자로부터 분리시키므로, 발현이 가능해진다.
하나의 구현예에서, trp 프로모터 시스템은 정해진 트립토판 농도를 갖는 합성 배지를 사용하며, 농도가 한계 수준(threshold level) 미만으로 떨어질 때 상기 시스템은 자가-유도성이 된다. 하나의 구현예에서, 3-β-인돌-아크릴산이 첨가되어, TrpR 억제자를 불활성화 한다.
하나의 구현예에서, 프로모터 시스템은 박테리오파지 γ 억제자 cI를 사용할 수 있다. 이러한 억제자는 γ 프로파지를 사용하며, OL 및 OR이라고 하는 2개의 작동자와 상호작용을 함으로서 모든 용해성 유전자(lytic gene)의 발현을 방지한다. 이들 작동자는 각각 2개의 강한 프로모터 PL 및 PR과 겹친다. cI 억제자의 존재 하에서, RNA 폴리머라제의 결합이 억제된다. cI 억제자는 UV-조사 또는 세포에 미토마이신 C(mitomycin C)를 처리함으로서 불활성화할 수 있다. 재조합 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 좀더 편리한 방법은, cI 억제자 cI857의 온도-민감성 변환을 응용하는 것이다. γ-계 발현 시스템을 갖는 숙주 세포는, 저온에서 중간-기하급수기(mid-exponential phase)로 성장할 수 있으며, 이후 고온으로 바뀔 때 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도한다.
널리 사용되는 발현 시스템은 T7 DNA 상에서 발견되는 프로모터만 인식하고, 숙주 세포 염색체 상에 존재하는 프로모터는 인식하지 않는 파지 T7 RNA 폴리머라제를 사용한다. 따라서, 발현 구조체는 재조합 유전자가 융합될 T7 프로모터 (보통 유전자 10의 바로 앞에 존재하는 프로모터) 중 하나를 이용한다. T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 유전자는, 발현 구조체 또는 제 2의 양립가능한 발현 구조체 중 어느 하나에 존재하거나, 또는 숙주 염색체에 끼어든다. 세 가지 모두의 경우에, 유전자는 유도성 프로모터에 융합되어, 발현기 동안 이의 전사 및 번역이 가능해진다.
E. coli 균주 BL21 (DE3) 및 BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen 사, CA)는, T7 RNA 폴리머라제 유전자를 포함하는 숙주의 예이다(T7 RNA 폴리머라제 유전자, 예컨대 KRX 및 XJ (자가 용해성)을 포함하는, 매우 적절하고 시판 중인 E. coli 균주들이 몇 개 더 있음) T7 RNA 폴리머라제 유전자를 포함하는 다른 세포 균주가 당업계에 공지되었으며, 예컨대 게놈 내로 끼어드는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 포함하는 Pseudomonas aeruginosa ADD1976(Brunschwig & Darzins, 1992) 및 phaP 프로모터 조절 하에서 게놈 내로 끼어드는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 포함하는 Cupriavidus necator(이전에 Ralstonia eutropha)(Barnard 등, 2004)가 있다.
T7 RNA 폴리머라제는 숙주 세포 효소에 대한 3가지 장점을 제안한다: 첫째, 이는 단지 하나의 서브 유닛으로 이루어지며, 둘째 높은 가공성을 보이며, 셋째 리팜피신(rifampicin)에 대한 민감성이 없다. 가장 후자의 특성은, T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 유전자의 유도 후 약 10분 후에 상기 항생제를 첨가함으로서, 특히 융합 폴리펩티드의 양을 증가시키는데 사용될 수 있다. 그 시간 동안, 충분한 폴리머라제가 합성되어 융합 폴리펩티드의 높은 발현이 가능해지며, 숙주 세포 효소의 저해는 추가로 플라스미드 및 염색체 모두에 존재하는 다른 모든 유전자의 발현도 막는다. 박테리아 RNA 폴리머라제를 저해하나 T7 RNA 폴리머라제를 저해하지 않는 다른 항생제가 당업계에 알려져 있으며, 예로서 스트렙토리디진(streptolydigin) 및 스트렙토바리신(streptovaricin)이 있다.
모든 프로모터 시스템dl 취약(leaky)하므로, T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 유전자의 낮은 정도의 발현으로도, 재조합 폴리펩티드가 독성 단백질을 암호화하는 경우에 세포에 해가 된다. 생장기 동안 존재하는 이들 폴리머라제 분자는, 리소자임을 위한 T7-암호화 유전자를 발현함으로서 저해될 수 있다. 이 효소는 숙주 세포벽에 대한 결합을 절단하고, 자신이 이에 결합함으로서 T7 RNA 폴리머라제를 선택적으로 저해하는 이중 기능의 단백질이며, T7 감염 동안의 폭발적인 전사를 조절하도록 보장하는 피드백 메커니즘을 갖는다. E. coli 균주 BL21 (DE3) pLysS는, T7 리소자임을 구조적으로 발현하는 플라스미드 pLysS를 포함하는 숙주 세포의 예이다.
하나의 구현예에서, 프로모터 시스템은 프로모터, 예컨대 API 또는 PR를 사용하며, 이는 예컨대 온도 변화, 예컨대 약 30-37℃에서 42℃로 온도를 올림으로서 유도되거나, 또는 "켜져서" 유도 사이클을 개시한다.
강한 프로모터는 생체 내(in-vivo) 생성 동안 입자 표면에서 융합 폴리펩티드 밀도를 강화할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서 사용하기 위한 바람직한 융합 폴리펩티드는, (i) 폴리머 합성 효소 및 (ⅱ) 적어도 하나의 항체 결합 도메인을 포함하는 융합 파트너를 포함한다.
본 명세서에서 사용하기 위한 (i) 및 (ⅱ) 모두를 암호화하는 핵산 서열은, 폴리머 합성 효소를 암호화하는 핵산 및 적어도 하나의 항체 결합 도메인을 포함하는 융합 파트너를 암호화하는 핵산을 포함한다. 융합 폴리펩티드는 일단 발현되면, 폴리머 입자를 형성할 수 있거나, 또는 이의 형성을 촉진할 수 있다. 　
하나의 구현예에서, 적어도 폴리머 합성 효소를 암호화하는 핵산 서열은, 원하는 길이의 폴리뉴클레오티드 링커 또는 스페이서 서열를 통해, 입자-형성 단백질를 암호화하는 핵산 서열 또는 융합 파트너를 암호화하는 핵산과 간접적으로 융합한다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 융합 파트너를 암호화하는 융합 단백질의 아미노산 서열은, 폴리머 합성 효소를 포함하는 아미노산 서열의 C-말단과 인접한다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 융합 파트너를 암호화하는 융합 단백질의 아미노산 서열은, 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 용이하게 하는, 원하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통하여, 폴리머 합성 효소 절편를 포함하는 아미노산 서열의 N-말단과, 간접적으로 융합된다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 융합 파트너를 암호화하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단, 또는 C 말단 합성 효소 절편과 인접한다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 융합 파트너를 암호화하는 융합 단백질의 아미노산 서열은, 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 C-말단, 또는 N-말단 폴리머 합성 효소 절편에, 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 용이하게 하는 원하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통하여 간접 융합된다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 융합 파트너를 암호화하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 디폴리머라제(depolymerase)를 암호화하는 아미노산 서열의 N-말단, 또는 C-말단 디폴리머라제 절편과 인접한다.
본 발명에 의한 융합 폴리펩티드의 하나의 장점은, 폴리머 입자의 표면에 대한 단백질 결합의 변화(modification)가, 폴리머 입자의 형성에 관여하는 단백질의 기능성에 영향을 미치지 않는다는 점이다. 예를 들어, 폴리머 합성 효소의 기능성은, 재조합 폴리펩티드가 이의 N-말단과 융합하여, 입자 표면 상에 재조합 폴리펩티드의 생성을 야기할 때에도 유지된다. 그럼에도 불구하고, 단백질의 기능이 융합에 의해 손상되는 경우에도, 이러한 단점은 동일한 기능을 수행하며 활성 상태로 존재하는 추가적 입자-형성 단백질의 존재에 의해 상쇄된다.
이러한 방식으로, 입자-형성 단백질을 통하여 폴리머 입자에 결합된 재조합 폴리펩티드의 안정된 결합을 보장할 수 있다.
융합 폴리펩티드의 단백질의 배열이, 플라스미드에 포함된 핵산의 유전자 서열의 순서에 의존한다는 것은 자명한 일이다.
예를 들어, 융합 파트너가 폴리머 합성 효소에 간접적으로 융합되는 융합 폴리펩티드를 생성하는 것이 바람직하다. "간접적으로 융합된(indirectly fused)˝이라 함은, 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 합성 효소, 및 적어도 하나의 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩티드를 말하며, 이는 융합 폴리펩티드에서 발현되기를 원하는 임의의 단백질 일 수 있는 추가적 단백질에 의해 분리된다.
하나의 구현예에서, 추가적 단백질은 상기에서 설명한 바와 같이, 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드, 또는 융합 폴리펩티드의 독립적 폴딩을 촉진하는 링커 또는 스페이서로부터 선택된다. 이러한 구현예에서, 융합 폴리펩티드에서의 원하는 정렬을 반영하기 위해, 플라스미드 상의 유전자 서열을 정렬(order)하는 것이 필수적이다.
하나의 구현예에서, 융합 파트너는 폴리머 합성 효소에 직접 융합된다. "직접 융합된(directly fused)"이라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 둘 또는 그 이상의 펩티드가 펩티드 결합을 통해 연결된 것을 가리킨다.
또한 폴리머 입자에 결합된 적어도 두 개의 구별되는 융합 폴리펩티드를 포함하는 입자를 형성할 수도 있다. 예를 들어, 폴리머 합성 효소에 융합된 적어도 하나의 효소 산물과 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 제 1 융합 폴리펩티드가 폴리머 입자에 결합할 수 있고, 효소를 포함하는 제 2 융합 폴리펩티드가 폴리머 입자에 결합할 수 있다.
하나의 구현예에서, 발현 구조체는 생체내에서 발현된다. 바람직하게는 발현 구조체는 미생물, 바람직하게는 Escherichia coli에서 발현되는 플라스미드이다.
하나의 구현예에서, 발현 구조체는 시험관내에서 발현된다. 바람직하게는 발현 구조체는 무세포 발현 시스템을 사용하여 시험관내에서 발현된다.
하나의 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 유전자는 단일 발현 구조체로 삽입될 수 있거나, 또는 하나 또는 그 이상의 유전자가 숙주 세포의 게놈으로 끼어들 수도 있다. 모든 경우에, 발현은 상기에서 설명한 바와 같이, 프로모터를 통하여 조절될 수 있다.
하나의 구현예에서, 발현 구조체는 추가로 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원, 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원과 결합가능한 결합 도메인 및 입자-형성 단백질, 바람직하게는 상기에서 설명한 폴리머 합성 효소를 포함하는 적어도 하나의 추가적 융합 폴리펩티드를 암호화한다.
본 명세서에서 유용한 플라스미드는 실시예에서 나타나 있으며, WO 2004/020623로 공개된 PCT/DE2003/002799(Bernd Rehm)에서 상세히 기재되었고, 상기의 각각은 본 명세서에서 전체로서 참고된다.
입자 생성을 위한 숙주
본 발명의 입자는 본 명세서에서 설명한 바와 같은 하나 또는 그 이상의 발현 구조체를 사용하여, 숙주 세포 내에서 용이하게 생성된다. 본 발명의 폴리머 입자는, 숙주 세포가 발현 구조체를 발현할 수 있게 함으로서 생성될 수 있다. 이는 먼저 발현 구조체를 숙주 세포 또는 숙주의 전구 세포(progenitor)로 도입, 예를 들어 숙주 또는 숙주의 전구 세포를 발현 구조체로 형질 전환 또는 형질 감염함으로서 성취할 수 있거나, 그렇지 않으면 발현 구조체가 숙주 세포 내에 존재하는 것을 확인함으로서 성취할 수 있다.
형질전환에 이어서, 형질전환된 숙주 세포는 발현 구조체에서 융합 폴리펩티드의 발현 및 폴리머 입자가 형성되기에 적합한 조건 하에서 유지될 수 있다. 이러한 조건은 당업계에 알려진 바와 같이, 선택된 발현 구조체, 예컨대 적절한 생물 내의 플라스미드의 발현에 적절한 것을 포함한다. 예를 들어, 특히 높은 수율 또는 과다발현을 원하는 경우, 배양 배지 내의 적절한 기질의 비율에 의해, 융합 폴리펩티드의 입자-형성 단백질 성분이 폴리머 입자를 형성할 수 있게 된다.
바람직하게는 숙주 세포는 예를 들어, 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포, 바람직하게는 분리 또는 비분리된 인간 숙주 세포이다. 재조합 폴리머 입자의 생성을 위하여 당업계에 잘 공지된 방법에 유용한 숙주 세포(예를 들어, Sambrook 등, 1987; Ausubel 등, 1987)는, 본 명세서에서 논의한 고려 사항을 감안한다면, 종종 본 발명의 방법을 사용하는데에도 적절하다.
적절한 원핵 숙주 세포는 예를 들어, 진정세균, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 미생물, 예를 들어, E. coli와 같은 Enterobacteriacea를 포함한다. 다양한 E. coli 균주는 공공적으로 사용가능하며,예컨대 E. coli K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)를 포함한다. 다른 적절한 원핵 숙주 세포는, 다른 Enterobacteriacea, 예컨대 Escherichia spp., Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, 예컨대 Salmonella typhimurium, Serratia, 예컨대 Serratia marcescans, 및 Shigella, 뿐만 아니라 Bacilli , 예컨대 B. subtilis 및 B. licheniformis, Pseudomonas , 예컨대 P. aeruginosa, 및 Actinomycetes, 예컨대 Streptomyces, Rhodococcus, Corynebaceria 및 Mycobaterium를 포함한다.
일부 실시예에서, 예를 들어, E. coli 균주 W3110는 그 자신이 재조합 DNA 산물 발효를 위한 일반적인 숙주 균주이므로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110는 변형되어, 숙주에 내생하는 단백질을 암호화하는 유전자 상의 유전적 돌연변이에 영향을 미치며, 상기 숙주 세포의 예로서는, 완전한 유전형 tonA를 갖는 E. coli W3110 균주 1A2; 완전한 유전형 tonA ptr3를 갖는 E. coli W3110 균주 9E4; 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr를 갖는 E. coli W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr을 갖는 E. coli W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 저항성 degP 삭제 돌연변이를 갖는 균주인 E. coli W3110 균주 40B4를 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 예를 들어, 리포폴리사카라이드 엔도톡신을 생성하지 않는 Lactococcus lactis 균주가 사용될 수 있다. Lactococcus lactis 균주의 예로서는, MG1363 및 Lactococcus lactis 아종 cremoris NZ9000를 포함한다.
원핵 미생물에 더하여, 사상 진균(filamentous fungi) 또는 효모와 같은 진핵 미생물은, 예를 들어 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 예는 하급 진핵 숙주 미생물에 흔히 사용되는 Saccharomyces cerevisiae를 포함한다. 다른 예는 Schizosaccharomyces pombe (Beach 및 Nurse, 1981; EP 139,383), Kluyveromyces 숙주 (미국 특허 제 4,943,529 호; Fleer 등, 1991), 예컨대 K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt 등, 1983), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al, 1990), K. thermotolerans, 및 K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna 등, 1988); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case 등, 1979); Schwanniomyces such as Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 published 31 October 1990); 및 사상 진균 예컨대, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 published 10 January 1991), 및 Aspergillus 숙주, 예컨대 A. nidulans (Ballance 등, 1983; Tilburn 등, 1983; Yelton 등, 1984) 및 A. niger (Kelly 및 Hynes, 1985)을 포함한다. 메틸자화 효모(methylotrophic yeast)가 본 명세서에서 적절하며, 이는 Hanenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, 및 otorula.로 이루어진 속(genera)에서 선택된, 메탄올에서 생장가능한 효모를 포함한다. 이러한 부류의 효모의 예가 되는 특정 종의 목록이 Anthony(1982)에서 발견된다.
무척추 동물 숙주 세포의 예로서는, Drosophila S2 및 Spodoptera Sf9와 같은 곤충 세포, 뿐만 아니라 식물 세포, 예컨대 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 및 담배의 세포 배양액을 포함한다. 다양한 배큘로바이러스 균주 및 그 변종 및 예컨대 Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (모기), Aedes albopictus (모기), Drosophila melanogaster (초파리), 및 Bombyx mori로부터의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 식별되었다. 형질감염(transfection)을 위한 다양한 바이러스 균주는 공개적으로 사용가능한 것으로, 예를 들어 Autographa californica NPV의 L-1 변종 및 Bombyx mori NPV의 Bm-5 균주이며, 상기 바이러스는 본 발명에 의한 바이러스, 특히 Spodoptera frugiperd 세포의 형질 감염을 위한 바이러스로서 사용될 수 있다 .
유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로서는, SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 태아 신장 세포주(현탁 배양액 내에서의 생장을 위해 서브클론된 293 또는 293 세포), Graham 등, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포주(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포주/-DHFR (CHO, Urlaub 등, 1980); 마우스 세르톨리 세포주 (TM4, Mather, 1980); 원숭이 신장 세포주 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 푸른 원숭이 신장 세포주 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포주 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포주 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 lung 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간의 간 세포주 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방암 세포주(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포주 (Mather 등, 1982); MRC 5 세포; FS4 세포주; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)이다.
진핵 세포주, 예를 들어 포유동물 세포주는, 예를 들어, 효소 또는 항체 결합 도메인과 같은 융합 파트너가 하나 또는 그 이상의 번역후 변형(post-translational modifications) 과정, 예컨데 당화 반응(glycation)을 필요로 할 때 바람직할 것이다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 효소는 번역후 변형 과정이 최적 활성화될 것이 요구되며, 따라서 상기 번역후 변형 과정이 가능한 발현 숙주에서 유용하게 발현될 수 있다.
하나의 구현예에서, 숙주 세포는 산화성 세포질을 갖는 세포, 예를 들어 E. coli Origami 균주(Novagen 사)이다.
다른 구현예에서, 숙주는 환원성 세포질을 갖는 세포, 바람직하게는 E. coli이다.
숙주 세포는 예를 들어, Ralstonia, Acaligenes, Pseudomonas 및Halobiforma.를 포함하는 속(genera)으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 사용된 미생물은 예를 들어, Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Escherichia coli, Pseudomonas fragi, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, 및 Halobiforma haloterrestris를 포함하는 군에서 선택된다. 이러한 군은 자연적으로 생체적합성, 생분해성 입자를 생성할 수 있는 미생물, 및 그들의 유전자 구성(genetic makeup) 때문에 이를 할 수 없는 미생물, 예컨대 E. coli 모두를 포함한다. 후자의 미생물이 입자를 생성할 수 있게 하기 위해 필요한 유전자는, 상기에서 설명한 바와 같이 도입된다.
극호염성 고세균은 단백질의 비특이적 결합 수준이 낮은 폴리머 입자를 생성하며, 이로 인하여 세포로부터의 입자의 분리 및 정제가 좀더 용이해 질 수 있다.
원칙적으로, 모든 배양가능한 숙주 세포는, 상기 숙주 세포가 상이한 대사 때문에 폴리머 입자의 형성에 요구되는 기질을 생성할 수 없는 경우에도, 상기에서 설명한 공정에 의해 폴리머 입자의 생성에 사용된다. 이러한 경우에, 필요한 기질이 배양 배지에 첨가되고, 그 후 세포에 도입된 유전자에 의해 발현된 단백질에 의해 폴리머 입자로 변환된다.
후자의 숙주 세포가 폴리머 입자를 생성할 수 있도록 사용되는 유전자는, 예를 들어, 티올라제제, 리덕타제 또는 폴리머 합성 효소, 예컨대 Ralstonia eutropha로부터의 phaA 티올라제, phaB 케토아실 리덕타제 또는 phaC 합성 효소를 포함한다. 폴리머 입자 형성이 잘 안되는 숙주 세포를 증폭시키기 위해 사용되는 유전자는, 숙주의 유전적 구조 및 배양 배지에 제공되는 기질에 따라 달라진다.
폴리히드록시알카노에이트 (PHA) 입자의 형성에 관여하는 유전자 및 단백질, 및 입자 형성의 일반적 고려 사항은, Madison, et al, 1999; PCT 국제 공개 WO 2004/020623 (Bernd Rehm); 및 Rehm, 2003; Brockelbank JA. 등, 2006; Peters 및 Rehm, 2006; Bakstrom et al, (2006) 및 Rehm, (2006)에 보고되어 있으며, 상기의 모두 본 명세서에 전체로서 참고된다.
폴리머 합성 효소는 단독으로, (R)-히드록시아실-CoA 또는 다른 CoA 티오에스테르 또는 이의 유도체를 갖는 모든 숙주 세포에 기질로서 사용될 수 있다.
폴리머 입자는 또한 생체 내에서 형성될 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 무세포 발현 시스템이 사용된다. 이러한 시스템에서, 폴리머 합성 효소가 제공된다. 정제된 폴리머 합성 효소, 예컨대 재조합 생성, 또는 단백질 번역이 가능한 무세포 시스템에서 얻을 수 있는 것들로서 폴리머 합성 효소를 암호화하는 발현 구조체의 도입에 의해 무세포 시스템 자체에서 얻을 수 있는 것들이, 바람직할 것이다. 시험관내에서 입자 형성이 가능하게 되는 환경을 만들기 위하여, 폴리머 입자 형성에 필요한 기질을 배지에 첨가하여야 한다.
폴리머 합성 효소는 예를 들어, 기질로서 (R)-히드록시아실-CoA 또는 다른 CoA 티오에스테르를 사용하여, 관능화 폴리머 입자의 시험관내 생성에 사용될 수 있다.
융합 폴리펩티드는 시험관내 폴리머 입자 생성시 사용하기에 앞서, 세포 분류기(sorter), 원심 분리, 여과 또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여, 용해된 세포로부터 정제할 수 있다.
시험관내 폴리머 입자 형성으로, 융합 폴리펩티드 범위(coverage), 인지질 조성 등의 수준을 포함한, 표면 조성을 최적으로 조절할 수 있게 된다.
폴리머 입자가 생성되는 조건을 조절함으로서, 폴리머 입자의 특성이 영향을 받거나 또는 조절된다는 것은 자명한 일이다. 이는 예를 들어, 숙주 세포의 유전적 구조, 예컨대 Peters 및 Rehm, 2005에서 논의한 바와 같이, 큰 과립을 생성하는 세포 분열 돌연변이를 포함할 수 있다. 숙주 세포가 유지되는 조건은, 예를 들어 온도, 기질의 존재, 하나 또는 그 이상의 입자-형성 단백질 예컨대 입자 크기-결정 단백질의 존재, 폴리머 조절자의 존재 등이다.
하나의 구현예에서, 폴리머 입자의 바람직한 특성은, 이들이 지속된다는 것이다. "지속성(persistent)"이라 것은, 선택 환경에서의 분해에 저항하는 폴리머 입자의 능력을 말한다. 폴리머 입자의 추가적인 바람직한 특성은, 이들이 폴리머 합성 효소 또는 입자-형성 단백질로부터 형성되며, 입자 조립 과정에서 폴리머 합성 효소 또는 입자-형성 단백질의 C- 또는 N-말단에 결합한다는 것이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 숙주 세포 내에서 발현 구조체의 과다발현을 얻을 수 있는 것이 바람직하다. 특정 발현 구조체의 과다발현 메커니즘이 당업계에 잘 알려져 있으며, 이는 구조체 자신, 다른 인자(이들이 발현될 숙주, 및 원하거나 또는 필요한 과다발현의 수준을 포함)에 의존한다. 예를 들어, 과다발현은 i) 강한 프로모터 시스템, 예를 들어 원핵 숙주의 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 시스템의 사용; ⅱ) 다수 카피수의 플라스미드, 예를 들어 colE1 복제 개시점을 포함하는 플라스미드의 사용 또는 ⅲ) 예를 들어 융합 서열의 사용을 통한 메신저 RNA의 안정화, 또는 ⅳ) 예를 들어, 리보좀 결합 부위, 또는 종결 부위 등의 코돈 사용의 최적화를 통한 번역의 최적화에 의해 얻을 수 있다. 과다발현의 이점은, 원한다면 입자를 더 작은 크기로 생성할 수 있으며, 폴리머 입자를 더 많이 생성할 수 있게 된다는 점이다.
폴리머 입자를 형성하는 폴리머의 조성은, 폴리머 입자의 기계적 또는 생리화학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 폴리머 조성이 상이한 폴리머 입자는, 반감기가 다를 수 있거나, 또는 생물학적 활성 물질, 특히 약리학적 활성 성분을 상이한 속도로 유출할 수 있다. 예를 들어, C6-C14 3-히드록시 지방산으로 구성된 폴리머 입자는, 폴리머의 낮은 결정성 때문에, 폴리머 분해 속도가 더욱 높다. 폴리머 뼈대 상에 비교적 큰 측쇄를 갖는 폴리머 구조체의 몰비율을 높임으로서, 보통 결정성이 감소하여, 더욱 확연한 신축성 특성이 나타난다. 폴리머 조성을 본 명세서에 기재된 방법 및 당업계에 공지된 방법에 따라서 조절함으로서, 폴리머 입자의 생분해성에 적절하게 영향을 미칠 수 있고, 따라서 (존재하는 하나 또는 그 이상의 융합 파트너가 예를 들어, 접선-유동 여과 시스템에서 유지될 때) 폴리머 입자의 지속성에 영향을 주거나, 또는 폴리머 입자에 대한, 폴리머 입자 상의, 또는 그로부터 유래한 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 이의 전구 물질의 결합, 촉매화 또는 그의 유출에 적절하게 영향을 미칠 수 있다.
기능성 측쇄를 갖는 적어도 하나의 지방산은, 바람직하게는 폴리머 입자의 형성을 위한 기질로서, 적어도 하나의 히드록시 지방산 및/또는 적어도 하나의 머캅토 지방산, 및/또는 특히 바람직하게는 적어도 하나의 β-아미노 지방산과 함께 배양 배지로 도입된다. "기능성 측쇄를 갖는 지방산"은, 포화 또는 불포화 지방산을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 이들은 또한 메틸기, 알킬기, 히드록시기, 페닐기, 설프히드릴기, 1차, 2차 및 3차 아미노기, 알데히드기, 케토기, 에테르기, 카르복실기, O-에스테르기, 티오에스테르기, 카르복실산 아미드기, 헤미아세탈기, 아세탈기, 포스페이트 모노에스테르기 및 포스페이트 디에스테르기를 포함하는 군으로부터 선택된 기능성 측쇄를 포함하는 지방산을 포함한다. 기질의 사용은 폴리머 입자의 원하는 조성 및 원하는 특성에 의해 결정된다.
기질 또는 기질 혼합물은, 적어도 하나의 임의로 치환된 아미노산, 락테이트, 에스테르 또는 포화 또는 불포화 지방산, 바람직하게는 아세틸-CoA을 포함한다.
하나의 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 물질이 기질 혼합물 중에 제공되거며, 폴리머 입자 형성 동안 폴리머 입자 내로 혼입되거나, 또는 폴리머 입자 내로 확산되게 된다.
폴리머 입자는 예를 들어 폴리-베타-히드록시산, 폴리락테이트, 폴리티오에스테르 및 폴리에스테르로부터 선택된 폴리머를 포함한다. 가장 바람직하게는, 폴리머는 폴리히드록시알카노에이트(PHA), 바람직하게는 폴리(3-히드록시부티레이트) (PHB)를 포함한다.
폴리머 합성 효소 또는 폴리머 입자는, 바람직하게는 폴리머 입자를 감싸는 인지질 단일층을 포함한다. 바람직하게는, 상기 입자-형성 단백질은 상기 지질 단일층을 가로지른다(span).
폴리머 합성 효소 또는 입자-형성 단백질은, 바람직하게는 폴리머 입자 또는 인지질 단일층에 결합되거나, 또는 상기의 둘 다에 모두 결합된다.
입자-형성 단백질은 바람직하게는 이들이 형성하는 폴리머 입자에 공유 결합 또는 비공유 결합된다.
바람직하게는, 폴리머 입자 표면적의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%를 융합 폴리펩티드가 차지한다.
특정 환경에서 본 발명의 방법으로 생성된 입자의 크기를 조절하는 것이 바람직하며, 예를 들어 본 발명에 특히 적합한 입자를 생성하는 것이다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 융합 파트너를 포함하는 폴리머 입자를 비교적 큰 크기로 생성하여, 예를 들어 견고한 내구성을 유지하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 항체의 제조에 사용하기 위한 입자의 맥락에서, 하나 또는 그 이상의 항체 결합 도메인을 포함하는 폴리머 입자를 비교적 큰 크기로 생성하여, 접선-유동 여과 시스템에서의 내구성 및 기능성을 보장하는 것이 바람직하다. 다른 실시예에서, 예컨대 효소 기질을 목표 물질로 촉매화할 때, 하나 또는 그 이상의 효소를 포함하는 폴리머 입자를 비교적 비교적 작은 크기로 생성하여, 예를 들어 접선-유동 여과 시스템에서 비교적 고농도의 효소가 가능하게 하는 것이 바람직하다. 폴리머 입자의 크기를 조절하는 방법은, WO 2004/020623으로 공개된 PCT/DE2003/002799 및 WO 2007/037706로 공개된 PCT/NZ2006/000251에 기재되었다.
일부 실시예에서, 입자 크기는 예를 들어, 입자-형성 단백질의 발현 조절, 또는 존재한다면 입자 크기-결정 단백질의 발현을 조절함으로서 조절된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 예를 들어, 입자 크기 조절은 기질의 사용 가능성, 예를 들어 배양 배지에서의 기질의 사용 가능성을 조절함으로서 성취될 수 있다. 특정 실시예에서, 기질은 폴리머 입자 크기의 조절을 보장하기에 충분한 양이 되도록, 배양 배지 중에 첨가된다.
상기 방법들의 조합을 사용하여, 입자 크기에 대해 더욱더 효율적인 조절 가능성을 얻을 수 있다는 것은 자명한 사실이다.
다양한 구현예에서, 예를 들어, 입자 크기는 약 10 nm 내지 3 nm, 바람직하게는 약 10 nm 내지 약 900 nm, 약 10 nm 내지 약 800 nm, 약 10 nm 내지 약 700 nm, 약 10 nm 내지 약 600 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 400 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 및 특히 바람직하게는 약 10 nm 내지 약 100 nm의 직경을 갖는 입자를 생성하도록 조절될 수 있다.
다른 구현예에서, 예를 들어, 입자 크기는 약 10 nm 내지 약 90 nm, 약 10 nm 내지 약 80 nm, 약 10 nm 내지 약 70 nm, 약 10 nm 내지 약 60 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 10 nm 내지 약 40 nm, 약 10 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 20 nm의 직경을 갖는 입자를 생성하도록 조절된다.
평균 폴리머 크기에 대한 다른 범위는, 예를 들어 상기 인용 범위 내의 범위를 포함하여, 구체적으로 고려되어, 예를 들어 약 50 내지 약 500 nm, 약 150 내지 약 250 nm, 또는 약 100 내지 약 500 nm 등의 직경을 갖는 폴리머 입자이다.
다양한 구현예에서, 예를 들어, 생성된 입자의 90%가 약 200 nm 이하의 직경을 갖고, 80 %가 약 150 nm 이하의 직경을 가지며, 60 %가 약 100 nm 이하의 직경을 가지며, 45 %가 약 80 nm 이하의 직경을 가지며, 40 %가 약 60 nm 이하의 직경을 가지며, 25 %가 약 50 nm 이하의 직경을 가지며, 5 %가 약 35 nm 이하의 직경을 갖는다.
다양한 구현예에서, 예를 들어, 방법은 약 200 nm 이하, 약 150 nm 이하, 또는 약 110nm 이하의 평균 직경을 갖는 폴리머 입자를 생성한다.
본 발명은 상기의 것들로 이루어지며, 하기에서 실시예로만 주어지는 것들의 구성도 또한 고려할 것이다.
실시예
실시예 1: 접선-유동 여과에 의한 IgG 의 정제
본 실시예는 항체-결합 폴리펩티드 도메인을 제시하는 폴리머 입자 및 다양한 시판용 접선-유동 막을 함께 사용하여, IgG 이뮤노글로블린을 정제하는 것에 대해 설명한다.
재료 및 방법
모든 여과는 Sartorius Crossflow Slice 200 시스템으로 실시하였다. 하기의 막을 사용하였다: 0.1 ㎛ 폴리에테르설폰, 0.2 ㎛ Hydrosart, 및 100 kDa Hydrosart(상기의 각각은 Sartorius 사 제조).
압력 모니터닝
P1, P2 및 P3를, 각 지점으로부터 중앙 조절기로 신호를 보내고 이를 기록하는 압력 변환기(pressure transducer)에 연결하였다. P1, P2 및 P3는 처음에는 튜브의 클램핑으로 조절하다가, 가동(Water flux 및 투석여과) 시간 내내 방치한다. 나아가, 트랜스-막 압력 (TMP)은 펌프 공급 속도의 자동 변경에 의해 유지된다.
입자 제조
ZZPhaC 폴리머 입자는 pET14b-ZZ(-)phaC 플라스미드를 포함하는 E. coli BL21 박테리아를 배양함으로서 바이오리액터 내에서 제조된다. 모든 바이오메스를 BugBuster 프로토콜에 따라 용해하고, 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에서 세번 세척하였다.
2.69g의 폴리머 입자를 50ml의 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에 재현탁하여, 53.8g/L 폴리머 입자 현탁액을 생성하였다.
15ml의 53.8g/L 폴리머 입자 현탁액을 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.5)와 함께 100ml로 만들어, 8.07g/L의 폴리머 입자 현탁액을 생성하였다.
이러한 100mL의 8.07g/L 폴리머 입자 현탁액을 접선 유동 여과 동안 사용하였다.
정수 투과 ( Clear Water Flux )
필터막 품질을 모니터하기 위하여, 폴리머 입자 현탁액의 투석 여과 전후에 정수 투과를 실시하였다.
0.1 ㎛ 필터:-
투석여과 전, TMP= 1 bar, 투과물 유속 = 272 mL/분.
투석여과 후, 막을 1M NaOH (40℃)로 15분 및 다시 30 분 동안 살균한 후, MQ 수로 헹궈냈다. 저장을 위하여 0.1M NaOH를 막에 순환시켰다.
TMP = 1bar, 투과물 유속 = 248 mL/분.
0.2 ㎛ 필터:-
투석여과 전, TMP = 1.1 bar, 투과물 유속 = 284 mL/분.
투석여과 후, 막을 1M NaOH (40℃)로 30분 및 다시 50 분, 다시 30 분 동안 살균한 후, MQ 수로 헹궈냈다. 저장을 위하여 0.1M NaOH를 막에 순환시켰다.
TMP = 1.1 bar, 투과물 유속 = 228 mL/분.
100 kDa 필터:-
투석여과 전, TMP = 1.3 bar, 투과물 유속 = 136 mL/분.
투석여과 후, 막을 1M NaOH (40℃)로 15분 동안 살균한 후, MQ 수로 헹궈냈다. 저장을 위하여 0.1M NaOH를 막에 순환시켰다.
TMP = 1.3 bar, 투과물 유속 = 120 mL/분.
투석 여과
100mL의 8.7 g/L 폴리머 입자 현탁액을, 2L의 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.5)으로 투석여과하였다. 2L의 최종 부피가 소진될 때까지 여과를 실시하였다(대략 18-20 분). TMP는 다양한 펌프 공급 유속에서도 일정하게 유지시켰다.
결과
잔류물 분석
폴리머 입자 단백질 프로파일의 SDS-PAGE(쿠마시 블루 염색, 도 5 참고), IgG 정제, GC/MS (도 6 참고), 및 TEM (도 7 참고) 분석을, 원래 공급 원료(각각 도 6A 및 7A) 및 접선-유동 여과의 잔류물(각각 도 6B 및 7B)에서 실시하였다.
나타난 바와 같이, 본 발명의 폴리머 입자를 사용하면, 탁월한 유동 속도, 투과물 수집 속도, 및 IgG 이뮤노글로블린에 대한 극히 높은 정제성을 얻을 수 있었다. GC/MS 분석은 지방산 오염물이 제거된 것을 보여주었다.
또한 이러한 데이터는, 본 발명의 폴리머 입자가, 접선-유동 여과에 통상적으로 사용되는 조건 하에서, 분해(도 7B 참고) 또는 손상(도 6B 및 도 7B)을 받지 않는다는 것을 나타내었다. GC/MS 분석은 폴리머 분해 산물에 대한 증거를 나타내지 않았다. 이러한 테이터는, 본 발명의 폴리머 입자를 사용하는 접선-유동 기술(막, 필터 및 필터 장치를 포함)이, 손상 및 파울링에 저항성이 있어서, 목표 물질을 오염시키지 않고, 용이하게 재사용을 위해 재생될 수 있다는 것을 나타낸다.
논의
본 실시예는 본 명세서에서 기재한 바와 같이, 접선-유동 여과 기술에 폴리머 입자를 사용하는 본 발명의 방법이, 복합 혼합물로부터 가치있는 목표 분자의 분리 및 제조에 잘 맞는다는 것을 명백히 입증한다.
실시예 2. 혼합 용액으로부터 인간 IgG 의 정제
도입
본 실시예는 혼합 용액으로부터 인간 IgG를 정제할 때, Z-도메인 포함 폴리머 입자 및 TFF의 사용에 대해 기재한다.
재료 및 방법
(상기 실시예 1에서 설명한 바와 같은) Z-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자 5 g을, BSA 및 IgG의 용액(PBS(pH 7.4) 중의 50 ml 현탁액)에 첨가하였다. IgG는 설정 시간(30분) 동안 폴리머 입자에 결합하도록 허용되었다. 예비 배양 후에, 폴리머 입자-IgG-BSA 현탁액을 수 배의 투석여과 부피로서 TFF (0.1 ㎛ 막) 상에 투석여과하였다. 모은 투과물 분획 중에 존재하는 단백질에 대해, 280nm (A280, 50 ml 분획)에서 흡광도를 측정하고, (BSA의 제거를 관찰하기 위하여) 용출 프로파일을 플로팅하였다. IgG는 A280이 0에 도달했을 때 시트레이트(pH 3.0)를 첨가함으로서 용출되며, IgG 용출액에 대해서도 투과물의 A280 및 SDS-PAGE(실버 염색)에 의한 투과물 분획의 분석을 실시하였다.
결과
도 8에 나타난 바와 같이, BSA는 초기의 A280 흡광도를 나타낸다. 분획 13에서, 투과물 분획의 흡광도가 0인 경우, 시트레이트를 첨가하여 IgG 용출 도중에 투석여과 버퍼로서 사용하였다. IgG 및 BSA의 상대량을 각각의 몰흡광 계수(molar extinction coefficients)를 사용하여 계산하였다. 이러한 계산값에서 볼 때, 투과물 분획 중에서 IgG 및 BSA의 양이 원래 용액에서 제조된 비율로 회수되었음을 알 수 있었다.
제 1 피크 및 제 2 피크가 각각 BSA 및 IgG라는 것을 확인하기 위하여, SDS-PAGE를 전개하여 각각의 투과물 분획 중의 단백질을 조사하였다. 도 9A의 겔은, 원래 용액 및 TFF 분석으로부터의 투과물 분획 1-13 각각을 보여준다. 겔에서, (존재하는 미량의 비결합 IgG와 함께) 예비 유출된 투과물 분획 중의 원래의 BSA의 존재를 확인하였다. 도 9B에서 나타난 제 2 겔을 전개하여, 투과물 분획 14-26 중의 단백질을 관찰하였다. 이러한 분획을 시트레이트(pH 3.0) 첨가 및 뒤이은 IgG의 유출 직후에 모았다.
이들 결과는 IgG가 1차적으로 폴리머 입자로부터 투과물로 용출되는 것을 보여준다.
논의
이러한 결과는, TFF 상에 Z-도메인을 포함하는 폴리머 입자를 사용하는 본 발명의 방법이, 오염 단백질(BSA)을 포함하는 용액으로부터 IgG를 정제하는데 효율적이라는 것을 명백히 입증한다. 마찬가지로, 본 발명의 방법은 IgG가 제거된 용액의 제조에 효율적이며, 이는 예를 들어, 이뮤노글로블린-미포함 혈청의 제조시 본 발명의 방법의 유용성을 입증한다.
실시예 3. 염소 혈청으로부터 염소 IgG 를 정제하기 위한, GB1 -도메인 폴리머 입자 및 TFF 의 사용
도입
본 실시예는 단백질 G의 GB1 도메인을 포함하는 폴리머 입자의 제조 및 TFF에서 사용하여, 복합 혼합물로부터 염소 IgG를 정제하는 것에 대해 설명한다.
재료 및 방법
발현 플라스미드 구조체의 제작
플라스미드 pET-14b Pha C-(GB 1)3을 하기와 같이 제작하였다. DNA 서열들(첨부된 서열 목록의 서열번호 1)은 N-말단 링거 (LEVLAVIDKRGGGGGSGGGSGGGSGGGG, 서열번호 2) 및 단백질 G(Streptococcus sp.)로부터의 3 개의 GB1 결합 도메인을 암호화하며, 이들 각각은 링커 영역(SGGGSGGGSGGGGS, 서열번호 3)에 의해 분리되었고, Genscript 사에서 합성하였다. 도입된 XhoⅠ/BamHⅠ부위는, pET-14b Pha C-MalE(Jahns 및 Rehn, 2009)에서 DNA를 암호화하는 MalE를 대체하는데 사용되었다. 이는 첨부된 DNA 서열 목록의 서열 번호 4에서 기재된 바와 같은 DNA를 갖는 pET-14b Pha C-(GB 1)3를 생성한다.
E.coli 균주에 플라스미드 pMCS69를 포함하는 pET-14b Pha C-(GB 1)3을 도입함으로서, (GB 1)3을 나타내는 PHB 폴리머 입자의 생성이 가능해진다.
IgG 의 정제
TFF 기본 IgG 결합 및 정제 프로토콜을 사용하여, 염소 혈청으로부터의 IgG와 결합하고 이를 정제한다. 염소 혈청의 5 mL 샘플을 GB1-도메인 현탁액을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자 35.5 ml(5 g)에 첨가하였다. 폴리머 입자를 총 IgG 결합이 가능하도록 계산된 수준(예를 들어, 5g 습윤 중량 폴리머 입자 현탁액 > 220 mg IgG 결합 능력)으로 첨가하고, 최종 부피를 50 ml로 맞춰서, PBS 중 1:10의 최종 혈청 희석액을 생성하였다. 혈청 단백질이 A280 nm (도 10) 및 SDS-PAGE (도 11)에 의해 측정하여 완전히 제거될 때까지, 혼합물을 PBS에 대하여 투석 여과한다.
투석여과는 0.1 nm 구멍 크기를 갖는 50㎠ 중공 섬유 카트리지로서 실시된다. 일단 혈청 단백질이 제거되면, 잔류물을 20 ml로 농축한 후, 염소 IgG은 Na 시트레이트-식염수(pH 3.0)을 사용하여, 50 ml 잔류물로 용출된다.
결과
도 10 및 11에 나타난 데이터는, IgG가 염소 혈청에서 성공적으로 제거되어, IgG 미포함 혈청 단백질이 생성되며, 그 후 정제된 IgG가 잔류물 중의 폴리머 입자로부터 유출되어, 낮은 pH 버퍼에서 투석여과할 때 투과물을 통하여 흘러나온다.
논의
이러한 결과는 TFF 중의 GB1-도메인을 포함하는 폴리머 입자를 사용하는 본 발명의 방법이, 복합 혼합물로부터 먼저 IgG-미포함 혈청 단백질 제제, 및 그 후 IgG를 정제하는데 효과적이라는 것을 입증한다. 따라서, 적절한 투석여과 조건을 선택함으로서, 본 발명의 방법에 의해 복합 혼합물로부터 원하는 성분 분획을 순차적으로 제공할 수 있다.
실시예 4. 물로부터 무기 콜로이드성 금을 정제하기 위한, 금-결합 펩티드 폴리머 입자 및 TFF 의 사용
도입
본 실시예는 용액으로부터 무기 물질(콜로이드성 금)를 제거할 때, 금-결합 도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자 및 TFF의 사용에 대해 설명한다.
방법
금-결합 펩티드를 포함하는 폴리머 입자(Jajn, A. C 등, Bioconjugate Chem 2008, 19, 2072-2080 참고)를 설명한 바와 같이 제조하였다. 10 nm 콜로이드성 금 입자의 0.005% 용액을 30 ml의 탈이온수에서 제조하고, 20 ㎠, 0.2 ㎛ 중공 섬유 미세여과 카트리지 상에서 균등화(equilibrated)하였다. 투과물을 다시 잔류물 관 내로 공급하면서, 시스템을 완전히 재순환시키면서 가동한다. 금 입자의 양을 520 nm에서의 흡광도로 측정하였다. 투과물 분획 중의 콜로이드성 금 용액의 흡광도를 측정한 후, 30 mg(최종 1 mg/ml)의 폴리머 입자를 잔류물 저장소에 첨가하였다. 투과물의 분획을 4분 간격으로 공급 스트림으로부터 샘플 채취한다. 8 분 및 29 분에, 추가적인 300 mg의 폴리머 입자를 잔류물에 첨가하여, 추가로 용액 중에 잔존하는 금과 결합시킨다.
결과
도 12에서 투과물 스트림 중의 콜로이드성 금 수준의 감소를 쉽게 볼 수 있으며, 이는 용액으로부터 금 입자를 봉쇄할(sequestering) 때의, 금 결합 도메인을 포함하는 폴리머 입자 및 TFF의 효율을 명백히 입증한다.
논의
본 실시예는 용액으로부터 무기 화합물의 회수 및 이의 제거시 본 발명의 방법의 효율을 명백하게 입증한다. 이러한 방법은 무기 화합물이 가치있고 그 회수가 바람직한 환경, 및 무기 화합물이 오염 화합물이고 용액 또는 상기 용액 중에 존재하는 다른 성분으로부터 이를 제거하는 것이 바람직한 환경 모두에서 유용하였다.
실시예 5. 용해성 전분으로부터 말토오스를 생성 및 회수하기 위한, 아밀라제-연결 폴리머 입자 및 TFF 의 사용
도입
본 실시예는 생물 분자의 생물공정(bioprocessing)에서, 효소를 포함하는 폴리머 입자 및 TFF의 사용에 대해 설명한다. 여기에서는, 아밀라제를 포함하는 폴리머 입자가 용해성 전분 현탁액을 말토오스로 변환시키는데 사용된다.
방법
아밀라제를 포함하는 폴리머 입자는 설명한 바와 같이 제조되었다(Rasiah, I., Rehm, B.H.A., (2009) 재조합 Escherichia coli 중의 고정된 α-아밀라제의 단일 단계 생산 Appl Environ. Microbiol. 75:2012-2016 참고). 용해성 전분의 1% w/v, 4% w/v 및 8% w/v PBS 현탁액(300 ml)을 2 g의 폴리머 입자와 함께 50℃에서 진탕 배양하였다(배치 공정). 2 시간의 배양 후, 1% 전분-폴리머 입자 현탁액을 110 ㎠, 0.1 ㎛ 미세여과 카트리지가 부착된 TFF 시스템으로 투석여과하였다. 투과물 분획을 모은 후(50 ml), 말토오스 농도를 측정하였다. 추가적으로, 말토오스를 200 ml PBS 버퍼를 통하여 투석여과함으로서 폴리머 입자로부터 세척하였다.
1% 용액을 완전히 모은(harvest) 후에, 4 % 전분-폴리머 입자 현탁액을 동일한 잔류물에 첨가하고, 시스템을 통하여 투석여과하고, 동일한 방식으로 8% 현탁액으로부터도 말토오스를 회수한다. 일단 TFF이 완료되면, 투과물 중에서 회수된 말토오스의 양이 결정된다(도 13).
결과
도 13에 명백히 나타난 바와 같이, 폴리머 입자에 결합한 아밀라제 효소는 TFF 시스템 내에서 말토오스 생성을 촉매화할 수 있고, 이는 입자-연결 촉매가 고온에서도 적용될 수 있으며, 그 산물(말토오스)을 반응 현탁액으로부터 용이하게 회수할 수 있다는 것을 입증한다.
논의
본 실시예에서, 폴리머 입자 및 고 분자량 전분이 잔류물 분획 중에 남아있으며, 이로 인하여 저 분자량 산물 말토오스가 계속적으로 투과물 분획으로 분리될 수 있는 동안에도 가수분해가 일어나게 된다.
본 실시예는 폴리머 입자-결합 효소 활성에 의해 매개하여 개시물질에서 원하는 물질로 변환할 때 및 용액으로부터 그 산물의 회수시, 본 발명의 효율성을 명백히 입증한다.
실시예 6. 물의 오염 제거 및 해독을 위하여, TFF 상에서 사용하기 위한 촉 매화 폴리머 입자의 생성
도입
본 실시예는 A. radiobacter로부터의 오르가노포스포히드록실라제(OpdA)를 포함하는 폴리머 입자 생성용 벡터의 제조, 및 Escherichia coli에서의 그 입자의 발현에 대해 설명한다. OpdA는 N-말단에서, 고안된 링커 영역을 통하여, Ralstonia eutropha의 폴리머 입자-형성 효소 PhaC의 C-말단과 융합된다(Blatchford 등, press Biotech. Bioeng. 참고).
재료 및 방법
박테리아 균주 및 생장 조건
본 연구에 사용된 박테리아 균주는 표 1에 나열되었다. 모든 E. coli 균주는 달리 언급되지 않으면, 37℃에서 생장한다. 필요하다면, 항생제를 하기의 농도로 첨가한다: 암피실린 (75 ㎍/ml), 클로람페니콜(chloramphenicol) (50 ㎍/ml), 및 테트라사이클린 (12.5 ㎍/ml). 폴리머 입자 생성을 위하여, 세포를 37℃에서 OD600가 0.45가 될 때까지 키운 후, 1 mM IPTG을 첨가하여 유도하였다. 유도 후, 배양액을 44 시간 동안 진탕 플라스크에서 30℃로 배양하였다.
박테리아 균주, 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드
균주, 플라스미드 또는 올리고뉴클레오티드
유전형, 설명 또는 서열
참고 또는 입수처
균주


E. coli XL1-Blue 		recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (r-k, m+k), supE44, relA1, lac [F', proAB, lacIq, lacZ Δ M15, Tn10 (Tcr)]

Stratagene 사
E. coli BL21 λ (DE3) F-; ompT; hsdSB(rB- mB-); gal; dcm λ DE3) Novagen 사
플라스미드
pET14b Apr; T7 프로모터 Novagen 사

pETC 		T7 프로모터 조절 하에서 phaC 야생형을 암호화하는 pET14b 유도체 Peters, V., 및 B. H. Rehm. (2008). J. Biotechnol. 134:266-74.


pMCS69 		lac 프로모터와 나란한 R. eutropha로부터의 유전자 phaA 및 phaB를 포함하는 pBBR1MCS 유도체; Cmr
Amara, A., Rehm, B. H.A (2003). Biochem. J. 374:413-421.

pETMCSI 		pET3계의 T7 발현 벡터. Apr Jackson, C. J., 등, (2006). Biochem. J. 397:501-508.

pET14b PhaC-링커-MalE 		링커 서열을 통하여 phaC의 3' 말단에 융합된, malE를 포함하는 pET14b 유도체 Jahns A.C., Rehm B.H.A. (2009). Appl Environ Microbiol. 75:5461-6.

pET14b PhaC-링커-OpdA		 링커 서열을 통하여 phaC의 3' 말단에 융합된, opdA을 포함하는 pET14b 유도체
본 실시예

pGEM-T Easy		 Apr; Plac
Invitrogen 사
올리고뉴클레오티드

5'- XhoI 		5'-GGA CTC TCG AGA GCA TGG CCC GAC CAA TCG GTA CAG-3'
[서열 번호 5]
Sigma Aldrich 사

3'- BamHI 		5'-GTA CAG GAT CCT CAC GAC GCC CGC ACG GTC GGT GAC AAG-3'
[서열 번호 6]
Sigma Aldrich 사
Tcr- 테트라사이클린 저항성, Apr-암피실린 저항성, Cmr-클로람페니콜 저항성
플라스미드 및 올리고뉴클레오티드
본 연구에 사용된 플라스미드를, 상기 표 1에 나열하였다. 일반적인 클로닝 방법 및 DNA 분리는, 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 실시하였다. DNA 프라이머, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, T4 DNA 리가아제 및 Taq 폴리머라제는 Integrated DNA 테크놀로지사(CA, USA)로부터 구입하였다. 화학적 시약은 Sigma Aldrich 사(St. Louis, MO)로부터 구입하였다.
기능성 OpdA 폴리에스테르 과립 생성을 위한 플라스미드의 제작
오르가노포스페이트(organophosphate) 분해 단백질을 암호화하는 opdA DNA 서열은, 플라스미드 pETMCSI 내의 삽입체로서, CSIRO사(오스트레일리아, 캔버라) 로부터 입수하였다. 프라이머는 조작된 5'및 3' 제한 부위를 갖도록 고안되었다. 5'프라이머 (5' XhoI, [서열 번호 5])는 XhoI 제한 부위를 포함하며(horbor), 3'프라이머 (3' BamHI, [서열 번호 6])는 BamHI 제한 부위를 포함한다. Sigma 사 제조의 프라이머로서 Pfx PCR을 실시하여, OpdA 암호화 부위를 증폭시켰다. 절편은 폴리 A-말단(tail) 처리되어, 플라스미드 pGEM-T Easy에 이어진다. 형질전환체는 진단 플레이트 상의 청색/백색 선별법을 사용하여 스크리닝하였다. 재조합 흰색 콜로니를 시퀀싱하여, opdA 삽입체를 스크리닝하였다. opdA 서열을 XhoI 및 BamHI 제한 효소로 가수 분해하여, 플라스미드 pGEM-T Easy로부터 절단한다. 플라스미드 pET14b PhaC-링커-MalE가 적절한 벡터로 사용되며, 이는 링커 영역의 포함이 opdA 단백질 N-말단의 소수성 분석 이후 진짜로 필요해지기 때문이다. 플라스미드 pET14b PhaC-링커-MalE를, XhoI 및 BamHI으로 가수분해하여, 플라스미드의 MalE 영역을 절단한다. opdA 서열은 플라스미드 백본 pET14b PhaC-링커의 XhoI 및 BamHI 부위 내로 클로닝되어, 플라스미드 pET14b PhaC-링커-OpdA를 형성한다. 이는 플라스미드 pMCS69를 포함하는 E. coli BL21 λ(DE3) 컴피턴트 세포(competent cell)를 형질전환하는데 사용되며, 폴리머 입자 형성에 필요한 전구 물질 R-3-히드록시부티릴-조효소 A (CoA)의 합성을 매개한다. 새로운 플라스미드 구조체의 DNA 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인한다. OpdA 활성을 보이지 않는 조절 폴리머 입자를 생성하기 위하여, R. eutropha의 야생형 PhaC 만을 암호화하는 플라스미드 pETC가, 플라스미드 pMCS69의 존재 하에서 E. coli BL21 λ(DE3)에서 사용된다.
단백질 분석
폴리에스테르 단백질 프로파일을, Laemmli, U. K. 1970에서 기재된 바와 같이, 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 분석하였다. 박테리오파지 T4의 머리 조립 도중 구조 단백질의 절단. Nature 227:680-5. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 G250(Coomassie briliant blue G250)로 염색하였다. 단백질 농도는 브래드포드 단백질 정량법을 사용하여 결정하였다.
MALDI - TOF 메스 스펙트로메트리(mass spectrometry)를 사용하는, 트립신 펩티드 지문 분석
PhaC-OpdA 융합 단백질을 식별하기 위하여, 원하는 단백질 밴드를 겔에서 잘라내어, 트립신 소화한 후, 이미 설명한 바와 같이(15) 생성된 트립신 펩티드의 MALDI-TOF 메스 스펙트로메트리를 실시하였다.
폴리에스테르 분석
폴리에스테르 합성 효소의 생체내 활성을 나타내는, 폴리에스테르, 폴리히드록시부티레이트의 생성은, (Brandl, H., R. A. Gross, R. W. Lenz, 및 R. C. Fuller. 1988. 폴리(베타-히드록시알카노에이트)의 원료로서 생분해성 폴리에스테르로서의 잠재적 응용을 위한 폴리(베타-히드록시알카노에이트)의 원료로서 Pseudomonas oleovorans as . Appl. Env. Microbiol. 54:1977-1982)에서 설명한 바와 같이, 가스 크로마토그래피/메스 스펙트로메트리 (GC/MS)에 의해 정성적으로 및 정량적으로 결정되었다.
폴리머 입자
폴리머 입자는, 기계적 세포 파쇄 및 Jahns, A. C., R. G. Haverkamp, 및 B. H. Rehm. 2008에서 설명한 바와 같이, 글리세롤 구배 상의 초원심 분리를 사용하여 재조합 E. coli 세포로부터 분리된다. 다기능성 무기-결합 폴리머 입자는, 조작된 박테리아 내부에서 자가-조립된다(Bioconj. Chem. 19:2072-80). 조절 폴리머 입자는, pMCS69 및 pETC를 포함하는 E. coli BL21 λ (DE3) 세포로부터 생성된다.
현미경 관찰
박테리아 세포 내에 생성된 폴리에스테르 과립은, Peters, V., 및 B. H. Rehm. 2005에서 설명한 바와 같이, Nile red 염색 이후 형광현미경으로 가시화되었다. GFP-표지 PHA 합성 효소를 사용하는 PHA 과립 형성의 생체내 모니터링. (FEMS Microbiol. Lett. 248:93-100).
효소 에세이
폴리머 입자 결합 PhaC-OpdA 및 폴리에스테르 결합 PhaC의 포스포트리에스테라제 활성은, (Dumas 및 coworkers (Dumas, D. P., S. R. Caldwell, J. R. Wild, 및 F. M. Raushel. 1989. Pseudomonas diminuta부터의 포스포트리에스테라제의 정제 및 R J. Biol. Chem. 264:19659-19665) 및 Harcourt 등 (Harcourt, R. L., I. Horne, T. D. Sutherland, B. D. Hammock, R. J. Russell, and J. G. Oakeshott. 2002 쿠마포스-가수분해성 박테리아 분리를 위한 간단하고 민감한 형광측정 방법의 개발(Lett. Appl. Microbiol. 34:263-268))에 의해 설명된 방법을 사용하여 결정하였고, 기질로서 메틸 파라티온 (O,O-디에틸 O-(4-니트로페닐) 포스포로티오에이트; Sigma)을 사용하였다.
메틸 파라티온의 가수분해 속도는, Spectromax 190 스펙트로포토미터(Molecular Devices 사)를 사용하여 405 nm에서의 흡광도 증가로서 모니터링하였고, 이는 파라-니트로페놀의 유리(liberation)에 의해 발생하였다. 효소 활성의 단위는, 1분당 메틸 파라티온 턴오버(μmol)로 정의된다.
결과
폴리에스테르 합성 효소 Pha C-말단에 번역가능하게 융합된, 전장(full-lenght) OpdA를 암호화하는 플라스미드 pET14b PhaC-링커-OpdA는, 재조합 E. coli Bl21 λ(DE3)에서 폴리히드록시부티레이트 (PHB) 폴리머 입자의 형성을 매개하여, 바이오메스에 대한 총 폴리에스테르 함량이 약 48%가 되며, 이는 단지 야생형 폴리에스테르 합성 효소만을 발현하는 재조합 E. coli Bl21 λ (DE3)에 의해 생성된 59%의 함량에 비해 약간 적다.
세포 내에 구형 입자의 형성은, Nile red 염색 세포 (데이터 미도시)의 형광 현미경 관찰에 의해 추가적으로 확인되었다. 분리된 폴리머 입자에 부착된 단백질의 분석은, Pha C-OpdA 융합 단백질의 과다 생성을 명확히 보여주며, 이는 트립신 펩티드 지문 분석에 의해 확인된 것과 동일하다(데이터 미제시).
PhaC 및 PhaC-OpdA 융합을 보이는 폴리머 입자에 대해, 기질로서 메틸 파라티온을 사용하여, 포스포트리에스테라제(phosphotriesterase) 활성을 조사하였다. PhaC 폴리머 입자에서는 포스포트리에스테라제 활성을 감지하지 못한 반면, PhaC-OpdA 융합 단백질 발현 폴리머 입자는 습윤 폴리머 입자 질량 1 그램 당 대략 1,840 U의 활성을 갖는다.
논의
본 실시예는 본 발명의 촉매화 폴리머 입자가 생성 가능하며, 여기에서 효소(이 경우, OpdA)는 폴리에스테르 합성 효소, PhaC의 C 말단에 융합함으로서, 고밀도로서 기능성을 갖고 효율적으로 고정된다는 것을 보여준다. 이들 폴리머 입자는 표준 박테리아 발효 기술을 사용하여 산업적 규모로 생산될 수 있으며, 이는 TFF에 사용하기에 적합하다.
실시예 7. TFF -계 변환 및 해독을 위한 촉매화 폴리머 입자의 사용
본 실시예에서, 유기 저 분자량 화합물은 TFF를 사용하여 효소 잔기를 포함하는 폴리머 입자를 사용함으로서, 촉매화되고 용액으로부터 분리된다. 추가적으로 본 공정에서 효소 활성이 재활용될 수 있다는 것이 입증된다.
방법
CHES 버퍼 중의 200 μM 메틸 파라티온 50 ml 용액은, 잔류물 용액을 형성한다. 0.2 ㎛, 20 ㎠ PES 미세여과 카트리지를 사용하는 TFF 시스템을 사용하고, 50 ml TFF 잔류물을 매 5 분마다 모은 0.5 ml 분획(~ 30 ml 또는 1 DV)과 함께 완전히 재순환시켜 전개하고, 흡광도를 측정하여, 잔류물로 돌려보낸다. 10 분 동안 가동한 후, 500 mg의 폴리머 입자를 현탁액에 첨가하고, MP에서 PNP로의 전환을 405 nm에서 관찰하였다(도 14). 반응이 완료된 후, 잔류물을 투석여과하여, 상기의 모여진 50 ml 분획에서 모든 PNP를 제거하였다(도 15). 모든 PNP가 제거된 후, 남아있는 폴리머 입자를 45 ml에 재현탁하고, 5 ml MP 농축물을 첨가하여 200 μM 메틸 파라티온 농도를 형성하며, 배치 변환 공정을 완전한 재순환 하에서 반복하고, 반응 전개를 520nm에서 5분 간격으로 측정하였다(도 14).
결과
도 14 및 15에서 명백히 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법은 다수 사이클의 촉매화 공정을 통하여, 오염된 저분자량의 유기 화합물을 제거하는데 사용될 수 있다. 도 14는 TFF 도중 폴리머 입자와 접할 때, 메틸 파라티온이 파라-니트로페놀로 신속히 변환됨을 명확히 보여준다. 도 14에 이어서, 메틸 파라티온에서 파라니트로페놀로의 촉매화 변환이 완료된 후, 폴리머 입자의 30 ml 현탁액을 CHES 버퍼로 투석 여과하였다. 파라니트로페놀의 제거는, 투과물 분획에 대해 405 nm에서의 흡광도를 측정함으로서 모니터링한다. 일단 파라니트로페놀을 제거하면, 폴리머 입자는 추가적 해독(detoxification) 단계를 위해 재활용이 가능해진다.
실시예 8. 폴리머 입자 정제시의 접선 유동 여과의 사용
본 실시예는 다양한 범위의 스케일 및 응용에서의, PHB 폴리머 입자의 정제를 위한 일반적 TFF를 설명한다. 하나의 예시적 구현예에서, TFF는 세포 균질화물로부터 숙주 오염물을 제거하는데 사용된다. 박테리아 바이오메스를 리소자임 및 EDTA과 같은 가공 부형제(process excipient)를 포함하는 버퍼 용액에 현탁하여 (박테리아 세포 벽을 불안정화시키고), 당업계에 잘 알려진 다양한 방법, 예컨대 초음파 처리, 프렌치 압력(french pressure) 세포 또는 미세유동으로 용해하였다. 일단 용해되면, 작은 하위 세포 요소는 원하는 구멍 크기(예컨대, 0.1 ㎛ - 0.45 ㎛)의 미세여과를 사용하여, 폴리머 입자로부터 분리된다. 대표 공정 개요가 도 16에 나타나 있다.
실시예 9. 중공 섬유 크로스 플로우 필터- 투과물 분석을 사용하는, TFF 에 의한 숙주 세포 오염물의 제거
실시예 9의 대표 공정 개요는 대표적인 실시예로 사용되며, 이는 TFF를 사용하는 폴리머 입자의 제조를 설명한다.
방법
PHB 폴리머 입자를 포함하는 대략 20 g의 E. coli 바이오메스는, 250 ml의 포스페이트 버퍼 식염수 (PBS) 및 1 mM EDTA 중에 미세유동화된다. 250 ml 균질화물을 0.1 ㎛ 구멍을 갖는 110 ㎠ TFF 카트리지를 구비한 중공 섬유 TFF 시스템에 직접 첨가하고, 20 % 에탄올 중의 PBS를 사용하여 8번 투석여과하였다(8 x 250 ml)(도 17).
결과
도 17에서 나타난 바와 같이, 숙주 세포 오염물의 제거는 쉽게 이루어지며, 이는 260, 280 및 600 nm에서의 흡광도에 의해 투과물 분획의 함량(도 17A), 투과물 분획의 단백질 농도(도 17B), 및 SDS PAGE 상의 투과물 분획의 분석(도 17C)을 관찰함으로서 증명된다. 따라서 정제는 폴리머 입자로부터의 투과물로의, 용해성 단백질 (A280) 및 핵산 (A260)의 제거에 의해 증명된다.
실시예 10. 중공 섬유 접선 유동 여과를 사용한 PHB 폴리머 입자의 정제 시, 계면활성제( 데옥시콜산 )의 사용.
본 실시예는 숙주 세포 단백질 및 막의 해리가 계면활성제(본 실시예에서는 데옥시콜산(DOC))의 사용에 의해 추가로 강화된다는 것을 보여준다.
방법
숙주를 균질화시키는데 다양한 버퍼가 사용되어 (PHB 폴리머 입자를 유출시키며), 상기 버퍼는 각각 0.2% DOC를 함유한다. 사용된 균질화 버퍼의 조성은, 하기 표 2에 나타나있다. 이들 동일한 버퍼가 또한 중공 섬유 TFF 공정시의 투석여과에 사용되어 폴리머 입자 현탁액을 정제한다(도 18). E. coli 바이오메스 (~20 g)는 250 ml의 다양한 버퍼 중에서 미세유동화된다. 균질화물은 추후 110㎠ 중공 섬유 접선-유동 카트리지 (GE Exampler CFP-1-E-3MA) 상에서 8 배의(8 x 250 ml) 동일한 버퍼 중에서 투석 여과된다. 폴리머 입자는, 20% 에탄올 중의 PBS에 대한 추가적 TFF 투석여과 후, IgG 결합 활성에 대해 조사하였다.
결과
도 19에 나타난 바와 같이, 점점 엄격한(harsh) 조건 범위 하에서, TFF 투석여과 처리 후에도 IgG-결합 활성은 보존된다.
IgG 정제를 위한 균질화 및 TFF 버퍼 조건
버퍼 타입 미세유동/TFF 정제 조건
1 50 mM Tris-EDTA pH 11
2 50 mM Tris-EDTA-0.2 % 데옥시콜레이트, pH 11
3 50 mM Tris-EDTA-0.2% 데옥시콜레이트, 300 mM NaCl, pH 11
4 50 mM Tris-EDTA + 0.1 % 데옥시콜레이트, pH 10, 및 그 후 50 mM Na 시트레이트, 식염수(pH 3.0) 내지 PBS(pH 7.4)에서의 TFF
실시예 11. 개방 채널 접선 유동 여과를 사용하는 PHB 폴리머 입자의 정제시, 계면활성제 ( 루브롤 )의 사용
또한 PHB 폴리머 입자에 대한 계면활성제 강화 TFF 정제의 사용은, 산업적 규모의 정제를 위해 고안된 개방-채널 크로스플로우 시스템을 사용하여 더 큰 규모로 개발되었다. 계면활성제 예컨대 데옥시콜레이트, 루브롤 및 SDS는, 이들 폴리머 입자의 정제를 향상시키는데 효과적인 것으로 나타났다.
방법
Z-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자를 포함하는 325 g의 E. coli 바이오메스를, 0.5% 루브롤 50 mM Tris-10 mM EDTA 버퍼(pH10)에서 미세 유동에 의하여 균질화하였다. 세포 균질화물을 30 분 동안 원심분리(16,000 x g)함으로서 조 폴리머 입자를 회수하고, 숙주 세포 DNA, 단백질 및 지질이 포함된 상등액을 제거한다.
조 폴리머 입자 균질화물을, 0.34㎡의 총 개방 채널 표면적을 갖는 Millipore Prostak - 4 stak 막 카트리지에 적용하였다. 조 폴리머 입자 현탁액은, 8 배의 0.1% 루브롤, 20 mM Tris- 10 mM 소듐 EDTA( pH 10), 8 배의 25 mM 소듐 시트레이트-식염수(pH 3.0) 및 20 % 에탄올 중의 8 배의 PBS(pH 7.4)에 대하여 투석 여과하도록 처리하였다. pH 3.0의 시트레이트 버퍼의 처리는 폴리머 입자 용출 조건을 모방하였고, 산성 조건 하에서 용출될 수 있는 모든 잔여 숙주 세포 단백질을 제거하도록 고안되었다. PBS-20% 에탄올을 사용하여, 미생물 생장을 지지하지 않는 환경에서 최종 산물의 pH 및 염도(salinity)를 조절하였다.
결과
도 20에 나타난 투과물 분석은 단백질 및 핵산이 실질적으로 감소한 것을 보여주며, 이는 TFF에 앞서 조 폴리머 입자를 원심분리하여 이러한 오염물을 제거하는데 크게 기인한다.
잔류물로부터 회수한, GB1-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자를 IgG 결합 활성에 대해 분석하고, 이를 원래 숙주 세포 바이오메스에 대한 글리세롤 구배의 정제 샘플과 비교하였다(도 21 참고). 결합 데이터는, 이들 폴리머 입자에서의 IgG 수율이, 비계측(non-scalable) 글리세롤 구배 공정 및 계측가능한(scalable) TFF-계면활성제 추출 공정 모두에서 서로 유사하다는 것을 보여준다. 따라서, PHB 폴리머 입자의 기능이 보존될 뿐만 아니라, 입자 제조에 사용되는 TFF-계 방법은 대규모 생산에도 적합하다.
실시예 12. 폴리머 입자의 TFF 정제를 향상시키기 위한 화학적 방법
본 실시예는 화학적 추출제의 사용을 통하여 폴리머 입자 정제가 향상된다는 것을 증명한다. 이 과정에서, 박테리아 균질화물이 화학적 조건 범위 중 어느 하나로 처리되어, 세포 잔여물의 분산 및 오염물 제거에 의한 정제를 향상시켰다. 화학적 조건의 범위는 화학적 추출 메트릭스별로 정리할 수 있다. 추가로, 폴리머 입자의 활성에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 화학적 처리를 조사하였다.
방법
본 발명의 방법에서 PHB-폴리머 입자로부터 오염물의 추출을 강화하는데 사용되는 화학적 조건의 범위는, 이하 표 3에 개략적으로 나타나있다.
화학적 추출 메트릭스
카오트로프 산/염기 킬레이터 계면활성제 염 기타
우레아 NaOH EDTA ASB NaCl 리파아제
구아니딘 HCl Tris pH 8-10 사르코신 이미다졸 트리글리세롤
시트네이트 pH3-4 트윈
트리에틸아민 데옥시콜레이트
Chaps
SDS
쯔비터화제
(zwittergent)
루브롤
배치 세척 연구
Z-도메인을 포함하는 본 발명의 폴리머 입자(IgG 결합 PHB 폴리머 입자)를 함유하는 조 바이오메스 균질화물을, 산 및 염기 처리, 고염, 킬레이터, 계면활성제 및 카오트로프를 포함한 일련의 화학적 처리를 함으로서 추출하였다. 오염물 제거의 정도는, 폴리머 입자/균질화물이 원심분리(15,000 x g, 20 분)된 후, 상등액에서 흡광도를 측정함으로서 정량화된다. 조 폴리머 입자 펠렛을 PBS(pH 7.4)에 재현탁하여, (PBS 대조군에 비교한) 잔여 IgG 결합의 정도를 평가하였다.
결과
도 22A에서 나타난 바와 같이, A260 및 A280에서 정량화했을 때 오염물 제거의 정도는, 사용된 화학적 처리에 따라서 실질적으로 달라진다. 나아가, 도 22B에서 나타난 바와 같이, 잔여 IgG 결합의 정도는 제조 방법에서 사용된 화학적 처리에 따라서 실질적으로 달라진다.
실시예 13. PHB 폴리머 입자의 정제를 위한 유동적 규모의 공정
화학적 추출 및 TFF 모두를 포함하는, 폴리머 입자 정제를 위한 계측가능한 공정이 도 23에 나타나있다. 이 공정은 20 g의 바이오메스 양에서 수 킬로그램 규모까지 가동될 수 있다. 추가로, 화학적 추출 조건은 본 명세서에서 구체적으로 예시되는 것들에 제한되지 않는다 - 계면활성제 타입, 농도 및 화학적 처리 모두는, 폴리머 입자 제조 공정에 특히 필요한 것들에 맞게 변경될 수 있다.
화학적 추출 후, 정제된 폴리머 입자 메스는 필요에 따라서 0.17㎡ 내지 수 ㎡의 측정가능한 막 표면을 구비한 Prostak 시스템에 적용하였다.
투석여과에 이어서, 정제된 폴리머 입자는 Prostak 시스템으로부터 회수될 때 PBS-에탄올 중에 저장되거나, 또는 소규모 중공 섬유 시스템 상에서 특이적 "슬러리" 농도로 농축된다. 다양한 분석 측정이 실시되어 최종 폴리머 입자 제조를 특징화하며, 또는 필요하다면 전 공정 과정에 거쳐 실시된다.
실시예 14. E. coli 바이오메스로부터의 PHB 폴리머 입자의 공업적 규모의 추출
본 실시예에서, PHB 폴리머 입자를 포함하는 E. coli 바이오메스의 공업적 규모의 정량(1100-1200 g)은, 상기 실시예 13에서 설명한 유동적 규모의 공정을 사용하여 실시하였다.
방법
폴리머 입자를 SDS-Tris-EDTA 알칼라인 용액 중에 미세유동화하여, 세포를 균질화하고, 조 폴리머 입자를 회수한다. 제 2 상에서, 용해 공정에서 집중적으로 덩어리를 제거한(de-bulked) 조 폴리머 입자 메스를, 용해성 계면활성제, 트리글리세롤 및 0.1 N NaOH 순으로 세척하였다. 각 단계 사이에, 폴리머 입자를 16,000 x g로 30분 동안 모았다(harvest).
추출 후 조 폴리머 입자를 중화하여, 0.41 m2 막 면적의 측정가능한 막 표면을 구비한 Prostak 시스템에 로딩하고, 현탁액의 pH가 pH 7.4에 이를 때까지 20 배의 0.04% SDS-TRIS EDTA, 7 배의 시트레이트 식염수 버퍼(pH 3.0), 및 많게는 10 배의 10 mM 소듐 포스페이트, 20 % 에탄올 중의 150 mM NaCl(pH 7.4)에서 투석 여과한다(도 25).
결과
본 실시예에 사용된 정제 공정의 효율성은, SDS-PAGE 분석(도 26 참고), 및 하기 표 3에 나타낸 폴리머 입자 현탁액 중의 엔도톡신(엔도톡신) 감소 평가 모두에서 명백하게 나타난다.
TFF 정제의 전후의 엔도톡신 수준
샘플 엔도톡신 단위
DS 104-1 전구-TFF 폴리머 입자 <1000EU/mg
>125 EU/mg
최종 폴리머 입자 (End TFF 3) <250 EU/mg
>125 EU/mg
논의
본 실시예는 본 명세서에 의한 방법을 사용함으로서, TFF를 통하여 폴리머 입자를 공업적 규모로(pilot scale) 용이하게 제조할 수 있다는 것을 입증한다. 엔도톡신 수준의 실질적 감소와 함께, 조 바이오메스로부터 오염 단백질을 실질적TFF 분리에 의해 이루어진다. 따라서, 본 발명의 방법은 TFF 방법을 사용하여 정제된 폴리머 입자의 측정가능한 생성에 잘 맞다.
산업적 응용
본 발명의 폴리머 입자 및 방법은, 복합 조성물로부터 목표 물질의 분리, 및 하나 또는 그 이상의 반응 기질을 포함하는 조성물로부터 반응 산물을 제조하는 것을 포함하는, 광범위한 정제 및 제조 기술에서 응용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> THOMPSON, Tracy REHM, Bernd HA <120> COMPOSITIONS FOR SEPARATION METHODS <130> 650817 <150> 61/421669 <151> 2010-12-10 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic - sequence synthesised in laboratory <400> 1 ggatcctcat tccggttttt ccgtgacggt aaacgttttg gttgcatcgt cataggtcca 60 ttcaccatca acgccgttgt cattggcgta ctgtttgaac actttttcgg ccgtggcggc 120 atccacggct tcggtcgtgg tttcaccttt cagcgttttg ccgttcagaa tcagtttgta 180 cgtgtcggtc ttgctgccac cgccaccact gccaccgcca gaaccgccac cgctctcagg 240 cttctccgtc acggtaaacg ttttggtcgc atcatcgtac gtccattcac cgtcaacgcc 300 gttgtcattt gcgtactgtt taaacacttt ttccgcggtc gctgcatcca ctgcttccgt 360 ggtcgtttcg cctttcaggg ttttaccatt cagaatcagt ttgtaggtat ccgttttaga 420 gccaccgcca ccactgccac cgccagaacc gccaccgctt tccggttttt cggtaaccgt 480 gaaggttttc gtggcatcat cgtaggtcca ttcgccatcc acaccattat cgttcgcgta 540 ctgtttgaaa actttttctg cggttgctgc atccactgct tcggtcgtgg tttcgccttt 600 cagcgtttta 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ccattattat 7020 catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaa 7075 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic PCR primer <400> 5 ggactctcga gagcatggcc cgaccaatcg gtacag 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic PCR primer <400> 6 gtacaggatc ctcacgacgc ccgcacggtc ggtgac 36

Claims (52)

  1. 목표 물질을 원료 물질로부터 정제하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 (a) 원료 물질을 제공하는 단계,
    (b) 상기 원료 물질을 적어도 하나의 반투과성 필터로 접선 유동 여과하는 단계, 및
    (c) 상기 목표 물질을 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 하나 또는 그 이상의 원료 물질, 상기 반투과성 필터, 또는 상기 접선 유동 여과 단계에 사용된 하나 또는 그 이상의 용액은 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 것들을 포함하는 방법:
    ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅴ) 친화성 리간드;
    ⅵ) 효소;
    ⅶ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅷ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머, 및 하기의 것들을 포함하는 방법:
    ⅰ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅲ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅳ) 친화성 리간드;
    ⅴ) 효소;
    ⅵ) 상기의 i) 내지 ⅴ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅶ) 상기의 i) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 목표 물질과 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 목표 물질이 하나 또는 그 이상의 항체인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 목표 물질이 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자인 방법.
  6. 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 원료 물질로부터 제조하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 무정형 폴리머 입자가 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 상기 목표 물질의 하나 또는 그 이상의 전구 물질, 또는 하나 또는 그 이상의 오염물과 결합하기에 충분한 시간 동안, 원료 물질을 무정형 폴리머 입자의 집단과 접촉시키는 단계;
    접선 유동 여과에 의해 하나 또는 그 이상의 오염물을 입자-결합 목표 물질 또는 이의 전구 물질로부터 분리하거나, 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 이의 전구 물질을 입자-결합 오염물로부터 분리하는 단계; 및
    목표 물질을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 무정형 폴리머 입자의 집단이 동종 집단인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 무정형 폴리머 입자의 집단이 이종 집단인 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 무정형 폴리머 입자는, 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 바이오폴리머를 포함하는 방법.
  10. 제 6 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 무정형 폴리머 입자는, 입자-형성 단백질에 의해 합성되거나, 또는 합성가능한 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 실질적으로 모든 폴리머 입자의 집단은, 입자-형성 단백질에 의해 합성되거나, 또는 합성가능한 방법.
  12. 제 6 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 무정형 폴리머 입자는, 폴리머 입자-형성 단백질, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체를 포함하는 방법
  13. 제 6 항에 있어서,
    상기 목표 물질의 회수는, 폴리머 입자로부터의 용출에 의하는 방법.
  14. 제 6 항에 있어서,
    상기 목표 물질의 회수는, 접선 유동 여과 투과물의 수집에 의하는 방법.
  15. 제 6 항에 있어서,
    목표 시스템의 회수는, 접선 유동 여과 잔류물의 수집에 의하는 방법.
  16. 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 원료 물질로부터 분리 또는 정제하는 방법에 있어서,
    상기 방법이 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하나 또는 그 이상의 목표 물질과 결합하기에 충분한 시간 동안 원료 물질과 폴리머 입자의 집단과 접촉시키는 단계;
    접선 유동 여과에 의해 하나 또는 그 이상의 오염물을 입자-결합 목표 물질로부터 분리시키는 단계; 및
    목표 물질을 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하기의 것들을 포함하는 방법:
    ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅴ) 친화성 리간드;
    ⅵ) 효소;
    ⅶ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅷ) 상기의 (i) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
  17. 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 원료 물질로부터 분리 또는 정제하는 방법에 있어서,
    상기 방법이 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하나 또는 그 이상의 오염물과 결합하기에 충분한 시간 동안, 원료 물질과 폴리머 입자의 집단을 접촉시키는 단계;
    접선 유동 여과에 의해 하나 또는 그 이상의 목표 물질을 입자-결합 오염물로부터 분리시키는 단계; 및
    목표 물질을 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하기의 것들을 포함하는 방법:
    ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅴ) 친화성 리간드;
    ⅵ) 효소;
    ⅶ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅶ) 상기의 (i) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
  18. 하나 또는 그 이상의 반응 산물의 제조 방법에 있어서,
    상기 방법은 접선 유동 여과에 의해 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하나 또는 그 이상의 반응 기질의 원하는 분획과 결합시키기에 충분한 시간 동안, 하나 또는 그 이상의 반응 기질을 포함하는 원료 물질을, 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자와 접촉시키는 단계;
    임의로 접선 유동 여과에 의해 하나 또는 그 이상의 오염물을 폴리머 입자로부터 분리하는 단계; 및
    반응 산물을 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 반응 촉매를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하기의 것들을 포함하는 방법:
    ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅴ) 친화성 리간드;
    ⅵ) 효소;
    ⅶ) 상기의 (ⅰ) 내지 (ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅷ) 상기의 (i) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
  19. 폴리머 입자의 제조 방법에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 하기의 것들을 포함하며;
    ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅴ) 친화성 리간드;
    ⅵ) 효소;
    ⅶ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅷ) 상기의 (i) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합;
    상기 방법은 접선 유동 여과에 의하여 하나 또는 그 이상의 오염물을 폴리머 입자로부터 분리하는 단계, 및 폴리머 입자를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 원료 물질로부터 분리 또는 정제하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 접선 유동 여과에 의해 하나 또는 그 이상의 오염물을 폴리머 입자로부터 분리하는 단계; 및
    하나 또는 그 이상의 폴리머 입자을 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 하나 또는 그 이상의 입자가 하기의 것들을 포함하는 방법:
    ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅴ) 친화성 리간드;
    ⅵ) 효소;
    ⅶ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅷ) 상기의 (i) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
  21. 하나 또는 그 이상의 항체의 정제 방법에 있어서,
    상기 방법은 하나 또는 그 이상의 항체를 포함하는 원료 물질을 제공하는 단계;
    상기 원료 물질을 적어도 하나의 반투과성 필터로 접선-유동 여과하는 단계로서, 상기 하나 또는 그 이상의 원료 물질, 상기 반투과성 필터, 또는 상기 접선 유동 여과에 사용되는 하나 또는 그 이상의 용액이 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 포함하고, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자가 항체에 결합가능한 리간드를 포함하는 단계; 및
    항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 접선 유동 여과에 사용하기 위한 반투과성 필터의 제조 방법에 있어서,
    상기 방법은 투과성 또는 반투과성 지지체를 제공하는 단계; 및
    상기 반투과성 필터를 제공하기 위해 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 상기 지지체와 연관하는 단계를 포함하며,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는 하기의 것들을 포함하는 방법:
    ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅴ) 친화성 리간드;
    ⅵ) 효소;
    ⅶ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅷ) 상기의 (i) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
  23. 접선 유동 여과에 사용되는 조성물, 막, 필터, 또는 필터 장치에 있어서,
    하기의 것들을 포함하는 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자를 포함하는 조성물, 막, 필터, 또는 필터 장치:
    ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅴ) 친화성 리간드;
    ⅵ) 효소;
    ⅶ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅷ) 상기의 (i) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
  24. 하기의 것들을 포함하는 폴리머 입자에 있어서,
    ⅰ) 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택되는 바이오폴리머; 또는
    ⅱ) 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 예컨대 폴리머 합성 효소 또는 폴리머 합성 효소 융합체; 또는
    ⅲ) 폴리머 입자-결합 폴리펩티드;
    ⅳ) 폴리펩티드 융합 파트너;
    ⅴ) 친화성 리간드;
    ⅵ) 효소;
    ⅶ) 상기의 ⅰ) 내지 ⅵ) 중 둘 또는 그 이상의 것들을 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
    ⅷ) 상기의 (i) 내지 ⅶ) 중 둘 또는 그 이상의 것들의 조합.
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드가 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp.)로부터의 단백질 G의 GB1 도메인이거나, 또는 이를 포함하는 입자.
  25. 폴리머 입자-형성 폴리펩티드, 및 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp .)으로부터의 단백질 G의 하나 또는 그 이상의 GB1 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 서열 번호 4의 12개 또는 그 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 GB1 도메인이거나, 또는 이를 포함하는 입자 또는 폴리펩티드.
  27. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 서열 번호 4의 12개 또는 그 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드이거나, 또는 이를 포함하는 입자 또는 폴리펩티드.
  28. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 30mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자보다 큰, 이뮤노글로블린 결합 능력을 갖는 입자.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 결합 능력이 적어도 약 35mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 약 40mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 약 45mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 약 50mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 약 55mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자, 또는 약 60mg 이뮤노글로블린/g 습윤 폴리머 입자인 입자.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    상기 이뮤노글로블린이 IgG인 입자.
  31. 제 1 항 내지 제 18 항, 제 20 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 원료 물질이 세포 용해물로부터 유래하거나, 또는 단백질 발현 시스템이거나 또는 이로부터 유래하는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 18 항, 제 20 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 원료 물질이 유제품 또는 유가공 스트림, 와인 또는 맥주 발효물을 포함하는 발효물을 포함하는 식품이거나, 또는 이로부터 유래하는 것인 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 18 항, 제 20 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 원료 물질이 반응 용액, 화학 합성 용액, 화학 합성 중간체를 포함하는 용액인 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 18 항, 제 20 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목표 물질이 예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 항체, 효소, 호르몬을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 18 항, 제 20 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목표 물질이 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 올리고뉴클레오티드, rRNA, mRNA, miRNA, siRNA, 또는 tRNA와 같은 RNA 분자, 또는 cDNA와 같은 DNA 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드인 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 18 항, 제 20 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목표 물질이 분비된 대사물질을 포함하는 세포 대사물질인 방법.
  37. 제 1 항 내지 제 24 항, 또는 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트(PHA)로부터 선택되는 바이오폴리머를 포함하는 방법, 조성물, 막, 필터, 필터 장치 또는 입자.
  38. 제 1 항 내지 제 24 항, 또는 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머는 폴리히드록시알카노에이트, 바람직하게는 폴리(3-히드록시부티레이트)(PHB)를 포함하는 방법, 조성물, 막, 필터, 필터 장치 또는 입자.
  39. 제 1 항 내지 제 24 항, 또는 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자를 구성하는 폴리머는 폴리에스테르, 폴리티오에스테르 또는 폴리히드록시알카노에이트(PHA)로부터 선택되는 바이오폴리머로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로서만 구성되는 방법, 조성물, 막, 필터, 필터 장치 또는 입자.
  40. 제 1 항 내지 제 24 항, 또는 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자가 인지질 단일층으로 둘러싸인 폴리머 입자를 포함하는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    존재하는 경우 폴리머 합성 효소는 폴리머 입자 또는 인지질 단일층에 결합되거나, 둘 다에 결합하는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리머 입자가 둘 또는 그 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함하는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  43. 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    존재하는 경우 상기 폴리머 합성 효소는, 자신이 형성하는 폴리머 입자에 공유 결합되거나 또는 비공유 결합되는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    존재하는 경우 상기 폴리머 합성 효소는, 그람-음성 및 그람-양성 진정세균, 또는 고세균으로부터의 PHA 폴리머 합성 효소인 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    존재하는 경우 상기 폴리머 합성 효소는, C. necator, P. aeruginosa, A. vinosum, B. megaterium, H. marismortui, P. aureofaciens, 또는 P. putida(각각, 기탁 번호 AY836680, AE004091, AB205104, AF109909, YP137339, AB049413 및 AF150670 임)으로부터의 PHA 폴리머 합성 효소를 포함하는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  46. 제 1 항 내지 제 24항, 또는 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 투과성 또는 반투과성 지지체에 영구적으로 연관되는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  47. 제 1 항 내지 제 24 항, 또는 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 투과성 또는 반투과성 지지체에 가역적으로 연관되는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  48. 제 1 항 내지 제 24 항, 또는 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 투과성 또는 반투과성 필터에 공유 결합 또는 비공유 결합되는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  49. 제 1 항 내지 제 24 항, 또는 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 투과성 또는 반투과성 지지체 또는 막에 흡착되는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  50. 제 1 항 내지 제 24 항, 또는 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 폴리머 입자는, 투과성 또는 반투과성 지지체 또는 막에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 방법, 조성물, 막, 필터 또는 필터 장치 또는 입자.
  51. 하나 또는 그 이상의 목표 물질 또는 폴리머 입자를 원료 물질로부터 분리 또는 정제하는 방법에 있어서,
    본질적으로 본 명세서의 실시예 및 도면에서 설명한 바에 따르는 방법.
  52. 조성물, 막, 필터, 필터 장치, 또는 폴리머 입자에 있어서,
    본질적으로 본 명세서의 실시예 및 도면에서 설명한 바에 의한 조성물, 막, 필터, 필터 장치, 또는 폴리머 입자.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021201405A1 (ko) * 2020-03-30 2021-10-07 한국세라믹기술원 반응성 및 안정성 그리고 항체회수가 향상된 z-도메인 및 칼시퀘스트린 융합단백질 및 이를 이용한 항체의 분리 및 정제 방법

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
CA2868485C (en) * 2012-03-28 2020-09-15 Michael R. Ladisch Methods and systems useful for foodborne pathogen detection
WO2013190453A2 (en) * 2012-06-18 2013-12-27 Tracy Thompson Compositions for separation methods
EP2970955B1 (en) * 2013-03-14 2018-11-14 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
ES2923018T3 (es) 2013-03-15 2022-09-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Métodos de purificación de ARN
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
JP6503355B2 (ja) * 2013-12-04 2019-04-17 ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドＰｏｃａｒｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｔｄ． スライダバルブを備えるフィルタ構造と、それを利用するための方法
KR20160133489A (ko) * 2014-03-07 2016-11-22 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 생물학적 생성물들의 제조를 위한 장치 및 방법들
SG11201608725YA (en) * 2014-04-25 2016-11-29 Shire Human Genetic Therapies Methods for purification of messenger rna
EP3294885B1 (en) 2015-05-08 2020-07-01 CureVac Real Estate GmbH Method for producing rna
EP3744843A1 (en) 2015-05-29 2020-12-02 CureVac Real Estate GmbH A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration
US9758755B2 (en) * 2015-10-23 2017-09-12 Life Technologies Corporation Filter-based method for efficient capture of lysis of suspended cells
CN108602048B (zh) 2015-12-18 2022-02-18 坎特伯雷大学 分离介质
JP2018053175A (ja) * 2016-09-30 2018-04-05 日立化成株式会社 溶解処理装置及び溶解処理方法
EP3601321A1 (en) * 2017-03-29 2020-02-05 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Purification of an agent of interest
AU2019325702A1 (en) 2018-08-24 2021-02-25 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
WO2023049747A1 (en) * 2021-09-22 2023-03-30 Elanco Us Inc. Streptococcus suis lytic enzyme compositions and methods of use thereof
WO2023085374A1 (ja) * 2021-11-11 2023-05-19 株式会社カネカ ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
WO2024008256A1 (en) * 2022-07-05 2024-01-11 Lihme Protein Solutions Improved apparatus for compound separation

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5256557A (en) * 1991-12-27 1993-10-26 Solvay Enzymes, Inc. Purified alkaline protease concentrate and method of preparation
WO1996024682A1 (en) * 1995-02-09 1996-08-15 Monsanto Company Latex of polyhydroxyalkanoate
JP2003535589A (ja) * 2000-06-02 2003-12-02 パル・コーポレーション プラスミド含有液のプロセシング
AU2005305347A1 (en) * 2004-11-03 2006-05-18 Introgen Therapeutics Inc. Method of producing and purifying of adenoviral vectors
US20060141570A1 (en) * 2004-11-16 2006-06-29 Wood David W Intein-mediated protein purification using in vivo expression of an aggregator protein
CA2623705A1 (en) * 2005-09-27 2007-04-05 Bernd Helmut Adam Rehm Polymer particles and uses thereof
HUE047316T2 (hu) * 2008-08-14 2020-04-28 Genentech Inc Eljárások szennyezés eltávolítására indigén fehérjekiszorításos ioncserés membrán kromatográfia alkalmazásával

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021201405A1 (ko) * 2020-03-30 2021-10-07 한국세라믹기술원 반응성 및 안정성 그리고 항체회수가 향상된 z-도메인 및 칼시퀘스트린 융합단백질 및 이를 이용한 항체의 분리 및 정제 방법

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