JP5307716B2 - ドックリンポリペプチドおよびそれを利用した組換え融合タンパク質の精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、組換え融合タンパク質の短時間での精製等に利用可能な新規ポリペプチドおよびそれを用いた組換え融合タンパク質の精製方法等に関する。

ゲノム解析が終了し、全ての発現遺伝子が分かろうとしている今日、タンパク質の機能解析の重要性が増している。また、分子生物学の発達によって、生体組織からタンパク質を精製する代わりに、組換え遺伝子を動植物、酵母、細菌などの細胞中に導入し、組換えタンパク質として大量に発現させることが可能になった。

しかしながら、一般的に組換えタンパク質を得るためには、組換えタンパク質を発現させた後、細胞を磨砕し、大量に存在する細胞由来のタンパク質や核酸、多糖類などの夾雑物から目的とする組換えタンパク質を分離、精製する必要がある。従って、細胞を宿主とした組換えタンパク質の生産においては、目的とする組換えタンパク質の分離、精製を効率よく行うことが、タンパク質の機能解析や利用のために重要な課題となっている。

組換えタンパク質の分離・精製によく用いられる有効な方法の一つがアフィニティークロマトグラフィーである。この方法では、まず、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列と、あるリガンドに対して高い親和性をもつタンパク質フラグメント（以下、アフィニティーペプチドという）をコードする遺伝子配列を利用して、アフィニティーペプチドと目的とするタンパク質とを組み合わせた組換え融合タンパク質を発現させる。次に、この組換え融合タンパク質を、付加したアフィニティーペプチドと結合するリガンドを固定化させた担体を使用することにより、他の夾雑物等から分離し、その後アフィニティーペプチドを解離させることにより、目的ペプチドを簡便に精製することができる。実際に、アフィニティークロマトグラフィーとして知られているものとして、ポリヒスチジンを用いた手法（特許文献１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いた手法(特許文献２）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を利用する手法などがある。

しかしながら、これまでに開発されたアフィニティークロマトグラフィーの多くには、いくつかの問題があった。例えば、ポリヒスチジンと、目的とするタンパク質とを組み合わせた組換え融合タンパク質のなかには、宿主によって不溶化することがあったり、本来の活性を有さないことがしばしばあった。特に、ＧＳＴやＭＢＰのような、その分子量が約３０〜５０ｋＤａと大きなアフィニティーペプチドを融合させた場合には、正常なホールディングを妨げ、本来の活性を有さない組換え融合タンパク質として発現することがあった。また、多くのアフィニティークロマトグラフィーは、担体として、ＩｇＧ抗体など非常に高価なリガンドを用いるため、経済的な問題があった。そのほかに、アフィニティーペプチドによっては、組換え融合タンパク質を担体から溶出する際の条件が、目的タンパク質を失活させてしまうようなｐＨであったり、グアニジンやエチレングリコールなど目的タンパク質を変性させたり活性を阻害したりする物質の添加を必要とする場合も多かった。すなわち、アフィニティークロマトグラフィーは、付加したアフィニティーペプチドとそれに相応するリガンドを利用することにより特異性が高い精製が行えるものの、穏和な条件下で解離がし難く、実用上問題のある場合があった。

このような現状を鑑み、本発明者らは、オオミヤら（非特許文献１）によって報告されているクロストリジウム・ジョスイ（Clostridium josui）由来のセルロソームと呼ばれるタンパク質の複合体の一部で、カルシウム結合モチーフドメインをもつタンパク質であるドックリンと、それにカルシウムイオンを介して特異的に結合するコヘシンドメインというタンパク質を利用することにより、組換え融合タンパク質を比較的穏和な条件下で精製分離できることを報告している（特許文献３)。

しかしながら、この精製方法において、組換え融合タンパク質の変性を抑えるために４℃程度の低温下で溶出する場合には、ドックリンとコヘシンドメインの結合が強いため、溶出に６時間〜１６時間という長い時間を要するという問題があった。一方、常温下で溶出する場合には短時間で溶出することができるが、この場合はタンパク質の活性などに影響を与えることが危惧されていた。

特許第２６８６０９０号 特開平７−１８４６６３号公報 ＷＯ０３／０３３６９５号国際公開パンフレット 三重大学生物資源紀要、第１９号、ｐｐ７１−９６（１９９７）

従って、従来のドックリンとコヘシンを用いた精製法の問題点である低温条件下での溶出時間を短縮し、効率的かつ経済的に組換え融合タンパク質の生産・精製を行える新規な精製系の開発が求められており、本発明はこのような精製系の提供をその課題とするものである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究したところ、ドックリンのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸を、特定の他のアミノ酸に置換することにより得られるドックリンポリペプチドは、これを従来のドックリンとコヘシンを用いた精製方法に適用した場合に、低温下においても目的タンパク質の溶出時間が著しく短縮されることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はクロストリジウム・ジョスイ（Clostridium josui）由来のドックリンのサブドメイン２の１４番目のアミノ酸であるイソロイシンまたはロイシンを、スレオニン、グリシン、セリン、チロシンおよびアスパラギンからなる群から選ばれる特定の他のアミノ酸に置換したことを特徴とするドックリンポリペプチドである。

また、本発明は目的タンパク質と、上記ドックリンポリペプチドとを含む組換え融合タンパク質を、カルシウムイオンを介してコヘシンドメインを含むポリペプチドに結合させて複合体を形成させ、その後、金属キレーターで複合体からカルシウムイオンを除去し、組換え融合タンパク質を溶出させることを特徴とする組換え融合タンパク質の精製方法である。

更に、本発明は上記ドックリンペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこれを組み込んだ発現ベクターである。

また更に、本発明は上記発現ベクターと、コヘシンドメインを含むポリペプチドを固定化した担体とを含むことを特徴とする組換え融合タンパク質の精製キットである。

本発明のドックリンポリペプチドは、野生型ドックリンと同等のコヘシンドメインに対する結合親和力を有する。そして、これを従来の野生型ドックリンとコヘシンを用いた組換え融合タンパク質の精製方法に適用した場合には、組換え融合タンパク質の活性に与える影響が少ない低温下での溶出時間を著しく短縮することができる。

従って、本発明のドックリンポリペプチドを利用した組換え融合タンパク質の精製方法は効率的かつ経済的に組換え融合タンパク質を精製することができるものである。

本明細書において、クロストリジウム・ジョスイ（Clostridium josui）由来のドックリンとは、ＣｅｌＢ、Ａｇａ２７Ａ、Ｃｅｌ４８Ａ等のクロストリジウム・ジョスイが産生するセルロソームに含まれるものである。例えば、ＣｅｌＢに含まれるドックリンは、ＣｅｌＢのアミノ酸配列（BAA04078またはP37701）の４０２〜４６０番目（配列番号１）であり、Ａｇａ２７Ａに含まれるドックリンはＡｇａ２７Ａのアミノ酸配列（BAB83765）の４０２〜４７８番目（配列番号２）であり、Ｃｅｌ４８Ａに含まれるドックリンはＣｅｌ４８Ａのアミノ酸配列（BAA32430）の６６０〜７１９番目（配列番号３）である。

上記ドックリンのアミノ酸配列は共通して二つのサブドメイン、ドックリンサブドメイン１およびサブドメイン２を含む。例えば、ＣｅｌＢに含まれるドックリンのサブドメイン１は配列番号１の３〜２７番目までの範囲であり、サブドメイン２は３６〜６０番目までの範囲である。また、Ａｇａ２７Ａに含まれるドックリンのサブドメイン１は配列番号２の２〜２６番目までの範囲であり、サブドメイン２は３８〜６２番目の範囲である。更に、Ｃｅｌ４８Ａに含まれるドックリンのサブドメイン１は配列番号３の２〜２６番目の範囲であり、サブドメイン２は３４〜５３番目の範囲である。これらサブドメイン１および２には、それぞれ最初のアミノ酸から、４、６、８、１２および１５番目にカルシウム結合に関与するアミノ酸（カルシウム結合アミノ酸）が存在し、カルシウムバインディングサイトを形成している。

本発明のドックリンポリペプチドは、上記クロストリジウム・ジョスイ由来のドックリンのサブドメイン２の１４番目のアミノ酸（サブドメイン２の最下流側のカルシウム結合アミノ酸の直前のアミノ酸）であるイソロイシンまたはロイシンを、スレオニン、グリシン、セリン、チロシンおよびアスパラギンからなる群から選ばれる特定の他のアミノ酸に置換することにより得られるものである。これらの特定の他のアミノ酸に置換することにより、カルシウムイオン存在下でのコヘシンとの結合親和力を変化させず、キレート剤を作用させた場合のみコヘシンからの解離速度が速まり、コヘシン固定化担体からの精製タンパク質の低温下での溶出時間を顕著に短縮（３０分以内に９０％以上が溶出）することができる。一方、上記特定の他のアミノ酸以外のアミノ酸、例えば、バリンに置換した場合には、キレート剤を作用させた場合にコヘシンからの解離速度に変化はなく、低温下での溶出時間の短縮も顕著ではない。

上記特定の他のアミノ酸の中でもスレオニンまたはグリシンが好ましく、特にグリシンが好ましい。これらのアミノ酸に置換することにより特に、キレート剤を作用させた場合のみに起こるコヘシンからの解離速度の上昇が顕著であり、低温下での溶出時間が短縮され、カラム精製法において溶出ピークがシャープであり、高濃度の精製蛋白質を短時間で得ることが可能になる。

また、本発明においては、上記サブドメイン２の１４番目のアミノ酸であるイソロイシンまたはロイシンを、特定の他のアミノ酸に置換することに加えて、更に、サブドメイン１の１４番目のアミノ酸であるロイシンまたはイソロイシンを、スレオニンおよびグリシンからなる群から選ばれる特定の他のアミノ酸に置換することが好ましい。

上記ドックリンポリペプチドの好ましいものとしては、ＣｅｌＢに含まれるドックリンのアミノ酸配列（配列番号１）の、最初のメチオニンから４９番目の野生型のアミノ酸であるイソロイシンを、スレオニンに置換したもの（配列番号４）、グリシンに置換したもの（配列番号５）、セリンに置換したもの（配列番号６）、アスパラギンに置換したもの（配列番号７）、チロシンに置換したもの(配列番号９)、最初のメチオニンから１６番目の野生型のアミノ酸であるロイシン（Ｌ）と４９番目の野生型のアミノ酸であるイソロイシンとをそれぞれスレオニンに置換したもの（配列番号８）、最初のメチオニンから１６番目の野生型のアミノ酸であるロイシン（Ｌ）と４９番目の野生型のアミノ酸であるイソロイシンとをそれぞれグリシンに置換したもの（配列番号１０）が挙げられる。これらのドックリンポリペプチドの中でも特に最初のメチオニンから４９番目の野生型のアミノ酸であるイソロイシンを、グリシンに置換したもの（配列番号５）が好ましい。

本発明のドックリンポリペプチドの作製は、公知のペプチドを形成するアミノ酸を別のアミノ酸に変換する方法を用い、行うことができる。例えば、クロストリジウム・ジョスイ由来のドックリンの遺伝子配列を基に、重複配列を含む２つのＰＣＲ産物をハイブリダイズさせ、伸長反応の産物を２次ＰＣＲの鋳型に用いるオーバーラップ伸長法(Mikaelian, et al., Nucl. Acids Res., 20, 376 (1992))等のヌクレオチドに変異を導入することのできる方法を用いることにより、野生型ドックリンのサブドメインに含まれるカルシウムバインディングサイトを形成する最後のアミノ酸の直前のアミノ酸を所望のアミノ酸に置換したドックリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そして、このポリヌクレオチドを発現ベクターに組込み、更にその発現ベクターを任意の宿主に導入し、宿主を培養することにより本発明のドックリンポリペプチドを得ることができる。

上記のようにして得られた本発明のドックリンポリペプチドは、コヘシンドメインを含むポリペプチド（以下、「コヘシンポリペプチド」という）を利用した目的タンパク質の精製方法（以下、「本発明の精製方法」という）に利用することができる。すなわち、本発明ドックリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む塩基配列を適当な発現ベクターに組込み、これを適当な宿主中で培養する。そして得られた組換え融合タンパク質を、カルシウムイオンを介してコヘシンポリペプチドに結合させて複合体を形成させ、その後、金属キレーターで複合体からカルシウムイオンを除去し、組換え融合タンパク質を溶出させることにより組換え融合タンパク質を精製することができる。なお、この精製方法はＷＯ０３／０３３６９５号国際公開パンフレットに準ずる方法で実施可能である。

本発明の精製方法に用いられる組換え融合タンパク質を作製するには、上記本発明のドックリンポリペプチドの発現ベクターの作製において、本発明のドックリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを目的タンパク質遺伝子の５'領域の上流もしくは、３'領域の下流に組込み、それを任意の発現ベクターのプロモーターの下流に組み込めばよい。また、本発明のドックリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと目的タンパク質遺伝子との間にはトロンビン切断配列やエントロキナーゼ切断配列等の切断遺伝子を導入してもよい。また、目的タンパク質遺伝子としては、種々の公知のタンパク質をコードする遺伝子が使用できる。

上記組換え融合タンパク質の作製に用いられる発現ベクターとしては、特に制限なく、使用する宿主に応じて適宜選択することができる。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合は、ｐＥＴ（ノバジェン製）等が使用され、宿主が昆虫培養細胞または虫体の場合は、バキュロウイルス由来の発現ベクターが好ましく、例えば、ＡＢｖ（片倉工業製）等が使用でき、特に宿主として虫体を用いる場合はＡＢｖを使用することが好ましい。

本発明の精製方法において使用されるコヘシンポリペプチドとしては、前記ドックリンポリペプチドと特異的に結合するものであれば特に限定されない。このようなコヘシンポリペプチドとしては、クロストリジウム・ジョスイ由来のＣｉｐＡ（BAA32429）等のコヘシンポリペプチドが挙げられる。また、コヘシンポリペプチドの調製は、組換え融合タンパク質の調製に準じて行うことができる。例えば、クロストリジウム・ジョスイ由来のＣｉｐＡ全長あるいはＣｉｐＡのコヘシンドメインを含む領域をクローニングし、これを任意の発現ベクターに組み込んでコヘシンポリペプチドを発現するベクターを構築し、その発現ベクターを宿主に導入し、コヘシンポリペプチドを産生させ、得られたコヘシンポリペプチドをクロマトグラフィー操作により精製、単離することにより得られる。

コヘシンポリペプチドの精製には、タンパク質の精製を行うための常法が用いられる。このようなタンパク質精製のための方法としては、例えば、硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。また、これらの方法は組み合わせることができ、それにより純度の高いコヘシンポリペプチド含有画分を得ることができる。具体的には、疎水性クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせることで、高純度のコヘシンポリペプチドを精製できる。

また、このコヘシンポリペプチドは、常法に従い担体に結合させることにより固定化することができる。例えば、このコヘシンポリペプチドは共有結合を利用することにより直接担体に結合させることができる。具体的にコヘシンポリペプチドは架橋剤等により活性化担体に結合させることができる。活性化担体としては、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＥＡＨ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＥＣＨ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）等が挙げられる。また、このコヘシンポリペプチドは水素結合を利用して担体に結合させることもできる。この場合には、コヘシンポリペプチドとして、コヘシンポリペプチドとセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を含むＣｉｐＡ等を用い、これに含まれるＣＢＤとセルロースの吸着を利用してセルロース担体に結合させることができる。セルロース担体としては、ＣＢｉｎＤ １００ Ｒｅｓｉｎ（ノバジェン製）等が挙げられる。

上記のようにしてコヘシンポリペプチドを固定化した担体に、組換え融合タンパク質を結合させる方法としては特に限定されず、例えば、バッチ法、カラム法等が挙げられる。いずれの方法でも、組換え融合タンパク質を含む試料にカルシウムイオンを添加した後、それをコヘシンドメインポリペプチドを固定化した担体に接触させ、必要であれば一定時間放置することにより、組換え融合タンパク質のみをコヘシンドメインを含むポリペプチドを固定化した担体に結合させて、複合体とすることができる。この操作において複合体を形成しなかった不要物は、適当な緩衝液で洗浄することにより除去することが可能である。

上記複合体から組換え融合タンパク質を溶出するには、金属キレーターを含む適当な緩衝液を添加すればよい。この溶出は室温下で行うことも可能であるが、組換え融合タンパク質の失活を防ぐためには、４℃といった低温下で行うことが特に好ましい。本発明のドックリンポリペプチドを用いることにより、従来は、低温下でバッチ法により６時間以上かかっていた溶出時間が３０分〜１時間に短縮される。また、カラム法では、溶出ピークがシャープになり、０.５ｍｌ／分の流速で１０分以内に溶出タンパク質のほぼ全てが回収される。

上記溶出に使用される緩衝液としては、従来のドックリンとコヘシンを用いた精製法と同じく、グッド緩衝液やリン酸緩衝液等が挙げられる。また、金属キレーターとしては、ＥＤＴＡやＥＧＴＡ等が挙げられる。これらの金属キレーターは緩衝液中にＥＤＴＡでは５０ｍＭ程度、ＥＧＴＡでは５ｍＭ程度で含有させればよい。

上記した本発明の精製方法を容易に実施するためには、上記ドックリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターと、コヘシンドメインを含むポリペプチドを固定化した担体とを含む組換え融合タンパク質の精製キットを利用してもよい。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものでないことは言うまでもない。

実 施 例 １
ドックリンポリペプチドをコードする遺伝子の作製：
以下に記載のクロストリジウム・ジョスイ（Clostridium josui）のＣｅｌＢ由来の野性型ドックリンのアミノ酸配列（配列番号１）において、最初のアミノ酸であるメチオニンから１６番目（ドックリンのサブドメイン１の１４番目）のロイシン（Ｌ）および／または４９番目（ドックリンのサブドメイン２の１４番目）のイソロイシン（Ｉ）のアミノ酸を以下の表１に示したアミノ酸に置換したドックリンポリペプチドをコードする遺伝子を以下のようにして作製した。

上記アミノ酸の置換はオーバーラップ伸長法(Mikaelian, et al., Nucl. Acids Res., 20, 376 (1992))を利用して行った。オーバーラップ伸長法に用いたＰＣＲプライマー等を下記に示す。なお、以下の実施例においてＰＣＲサンプルの調製、ＰＣＲ反応条件は、特に断りのない限り下記と同様にして行った。また、以下のＰＣＲプライマーにおいてＮ末端付加用とは、トランスファーベクターへの挿入のためにドックリンの５'端に制限酵素ＮｃｏＩ認識配列および３'端に制限酵素ＮｈｅＩ認識配列を付加させるものをいい、Ｃ末端付加用とはトランスファーベクターへの挿入のためにドックリンの５'端に制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉ認識配列および３'端に制限酵素ＳｎａＢＩ認識配列を付加させるものをいう。

＜ＰＣＲプライマー＞
Ｎ末端付加用プライマー
ｎＤｏｃｋ１プライマー：（制限酵素ＮｃｏＩ配列付加）
５'−ｇａｔｃｃＡＴｇｇｇＴＴＴＡＡＡＡｇｇＣｇＡＴｇＴＣＡＡＴＡＡＴｇ−３'
ｎＤｏｃｋ２プライマー：（制限酵素ＮｈｅＩ配列付加）
５'−ｃｔｔＣＣＧｃｔａｇｃＡＴＴｃＡＧｃＡＧＴＴＴＡＡｃＴＴＴＴＡＧｃＴＧ
−３'
Ｃ末端付加用プライマー
ｃＤｏｃｋ１プライマー：（制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉ配列付加）
５'−ＣＴｇｇＣＣＴＣＡｇｇＡＴｇｇｇＴＴＴＡＡＡＡｇｇ−３'
ｃＤｏｃｋ２プライマー：（制限酵素ＳｎａＢＩ配列付加）
５'−ＧＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡ
ＴＣ−３'
Ｌ１６Ｔ置換用プライマーセット
Ｌ１６Ｔセンスプライマー：
５'−ｇｇＴｇＣＴＡＴＡｇＡＴｇＣＣａｃＴｇＡＴＡＴＴｇＣＴｇＣｇ−３'
Ｌ１６Ｔアンチセンスプライマー：
５'−ｃＧｃＡＧｃＡＡＴＡＴｃＡｇｔＧＧｃＡＴｃＴＡＴＡＧｃＡｃｃ−３'
Ｉ４９Ｔ置換用プライマーセット
Ｉ４９Ｔセンスプライマー：
５'−ｃｇｇＡＡＡＴＡＴＴｇＡＴｇＣＣＡｃＴｇＡＴＴＴＴｇＣＴＣＡｇ−３'
Ｉ４９Ｔアンチセンスプライマー：
５'−ｃＴＧＡＧｃＡＡＡＡＴｃＡｇＴＧＧｃＡＴｃＡＡＴＡＴＴＴｃｃｇ−３'
Ｉ４９Ｇ置換用プライマーセット
Ｉ４９Ｇセンスプライマー：
５'−ｇｇＡＡＡＴＡＴＴｇＡＴｇｃＣｇｇｃｇＡＴＴＴＴｇＣＴＣＡｇ−３'
Ｉ４９Ｇアンチセンスプライマー：
５'−ｃＴＧＡＧｃＡＡＡＡＴｃｇｃｃＧｇｃＡＴｃＡＡＴＡＴＴＴｃｃ−３'
Ｉ４９Ｓ置換用プライマーセット
Ｉ４９Ｓセンスプライマー：
５'−ｇｇＡＡＡＴＡＴＴｇＡＴｇｃＣｔｃｃｇＡＴＴＴＴｇＣＴＣＡｇ−３'
Ｉ４９Ｓアンチセンスプライマー：
５'−ｃＴＧＡＧｃＡＡＡＡＴｃｇｇａＧｇｃＡＴｃＡＡＴＡＴＴＴｃｃ−３'
Ｉ４９Ｎ置換用プライマーセット
Ｉ４９Ｎセンスプライマー：
５'−ｇｇＡＡＡＴＡＴＴｇＡＴｇｃＣａａＴｇＡＴＴＴＴｇＣＴＣＡｇ−３'
Ｉ４９Ｎアンチセンスプライマー：
５'−ｃＴＧＡＧｃＡＡＡＡＴｃＡｔｔＧｇｃＡＴｃＡＡＴＡＴＴＴｃｃ−３'
Ｌ１６Ｇ置換用プライマーセット
Ｌ１６Ｇセンスプライマー：
５'−ｇｇＴｇＣＴＡＴＡｇＡＴｇＣＣｇｇＴｇＡＴＡＴＴｇＣＴｇＣｇ−３'
Ｌ１６Ｇアンチセンスプライマー：
５'−ｃＧｃＡＧｃＡＡＴＡＴｃＡｃｃＧＧｃＡＴｃＴＡＴＡＧｃＡｃｃ−３'
Ｉ４９Ｙ置換用プライマーセット
Ｉ４９Ｙセンスプライマー：
５'−ｃｇｇＡＡＡＴＡＴＴｇＡＴｇＣＣｔＡｃｇＡＴＴＴＴｇＣＴＣＡｇ−３'
Ｉ４９Ｙアンチセンスプライマー：
５'−ｃＴＧＡＧｃＡＡＡＡＴｃｇＴＡＧＧｃＡＴｃＡＡＴＡＴＴＴｃｃｇ−３'
Ｉ４９Ｖ置換用プライマーセット
Ｉ４９Ｖセンスプライマー：
５'−ｇｇＡＡＡＴＡＴＴｇＡＴｇｃＣｇＴＴｇＡＴＴＴＴｇＣＴＣＡｇ−３'
Ｉ４９Ｖアンチセンスプライマー：
５'−ｃＴＧＡＧｃＡＡＡＡＴｃＡＡｃＧｇｃＡＴｃＡＡＴＡＴＴＴｃｃ−３'

＜ＰＣＲ反応条件＞
手順１：９４.０℃、２分
手順２：９４.０℃、１５秒
手順３：５２.０℃、３０秒
手順４：６８.０℃、１ｋｂｐにつき１分
手順５：手順２〜手順４を３０回繰り返す

（１）Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
組換えバキュロウイルス作製用トランスファーベクターｐＭ０００００１（片倉工業製）に、クロストリジウム・ジョスイのＣｅｌＢ由来の野性型ドックリンの遺伝子配列（BAA04078）をマルチクローニングサイトの上流に組み込んだベクターｐＭ０ＮＤＴ１０を作製した。このｐＭ０ＮＤＴ１０を鋳型とし、上記ｎＤｏｃｋ１プライマーとＩ４９Ｔアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行いドックリンの前半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。また、ｎＤｏｃｋ２プライマーとＩ４９Ｔセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ドックリンの後半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。このドックリンポリペプチドの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を用いて以下の遺伝子結合用ＰＣＲサンプルを調製し、ドックリンの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を以下の遺伝子結合用ＰＣＲ反応条件でアニールした。このアニール後のサンプルにｎＤｏｃｋ１プライマーとｎＤｏｃｋ２プライマーを加え、アニールした遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、野生型ドックリンの４９番目のアミノ酸ＩをＴに置換したＮ末端付加用ドックリンポリペプチドをコードする遺伝子（以下、これを「Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子」という）を合成した。

＜遺伝子結合用ＰＣＲ反応条件＞
手順１：９４℃、１５秒
手順２：５２℃、３０秒
手順３：７４℃、３０秒
手順４：手順１〜３を２回繰り返す

（２）Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｇ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
Ｉ４９Ｔ置換用プライマーセットに代えてＩ４９Ｇ置換用プライマーセットを用いる以外は、上記（１）と同様にして野生型ドックリンの４９番目のアミノ酸ＩをＧに置換したＮ末端付加用Ｉ４９Ｇ置換ドックリンポリペプチド遺伝子（以下、これを「Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｇ置換遺伝子」という）を合成した。

（３）Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｓ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
Ｉ４９Ｔ置換用プライマーセットに代えてＩ４９Ｓ置換用プライマーセットを用いる以外は、上記（１）と同様にして野生型ドックリンの４９番目のアミノ酸ＩをＳに置換したＮ末端付加用Ｉ４９Ｓ置換ドックリンポリペプチド遺伝子（以下、これを「Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｓ置換遺伝子」という）を合成した。

（４）Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｎ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
Ｉ４９Ｔ置換プライマーセットに代えてＩ４９Ｎ置換プライマーセットを用いる以外は、上記（１）と同様にして野生型ドックリンの４９番目のアミノ酸ＩをＮに置換したＮ末端付加用Ｉ４９Ｎ置換ドックリンポリペプチド遺伝子（以下、これを「Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｎ置換遺伝子」という）を合成した。

（５）Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｙ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
Ｉ４９Ｔ置換プライマーセットに代えてＩ４９Ｙ置換プライマーセットを用いる以外は、上記（１）と同様にして野生型ドックリンの４９番目のアミノ酸ＩをＹに置換したＮ末端付加用Ｉ４９Ｙ置換ドックリンポリペプチド遺伝子（以下、これを「Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｙ置換遺伝子」という）を合成した。

（６）Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｖ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
Ｉ４９Ｔ置換プライマーセットに代えてＩ４９Ｖ置換プライマーセットを用いる以外は、上記（１）と同様にして野生型ドックリンの４９番目のアミノ酸ＩをＶに置換したＮ末端付加用Ｉ４９Ｖ置換ドックリンポリペプチド遺伝子（以下、これを「Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｖ置換遺伝子」という）を合成した。

（７）Ｎ末端付加用Ｌ１６Ｇ／Ｉ４９Ｇ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
上記（２）で合成したＮ末端付加用Ｉ４９Ｇ置換遺伝子を鋳型とし、上記ｎＤｏｃｋ１プライマーとＬ１６Ｇアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行いドックリンの前半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。また、ｎＤｏｃｋ２プライマーとＬ１６Ｇセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ドックリンの後半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。このドックリンの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を用いて上記した遺伝子結合用ＰＣＲサンプルを調製し、ドックリンの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を上記遺伝子結合用ＰＣＲ反応条件でアニールした。このアニール後のサンプルにｎＤｏｃｋ１プライマーとｎＤｏｃｋ２プライマーを加え、アニールした遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、野生型ドックリンの１６番目のアミノ酸ＬをＧ、４９番目のアミノ酸ＩをＧに置換したＮ末端付加用ドックリンポリペプチドをコードする遺伝子（以下、これを「Ｎ末端付加用Ｌ１６Ｇ／Ｉ４９Ｇ置換遺伝子」という）を合成した。

（８）Ｎ末端付加用Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
上記（１）で合成したＮ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子を鋳型とし、上記ｎＤｏｃｋ１プライマーとＬ１６Ｔアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行いドックリンの前半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。また、ｎＤｏｃｋ２プライマーとＬ１６Ｔセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ドックリンの後半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。このドックリンの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を用いて上記した遺伝子結合用ＰＣＲサンプルを調製し、ドックリンの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を上記遺伝子結合用ＰＣＲ反応条件でアニールした。このアニール後のサンプルにｎＤｏｃｋ１プライマーとｎＤｏｃｋ２プライマーを加え、アニールした遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、野生型ドックリンの１６番目のアミノ酸ＬをＴ、４９番目のアミノ酸ＩをＴに置換したＮ末端付加用ドックリンポリペプチドをコードする遺伝子（以下、これを「Ｎ末端付加用Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換遺伝子」という）を合成した。

（９）Ｃ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
組換えバキュロウイルス作製用トランスファーベクターｐＭ０００００１（片倉工業製）に、クロストリジウム・ジョスイのＣｅｌＢ由来の野性型ドックリンの遺伝子配列（BAA04078）を常法によりマルチクローニングサイトの下流に組み込んだベクターｐＭ０ＣＤＴ１７を作製した。このｐＭ０ＣＤＴ１７を鋳型とし、上記ｃＤｏｃｋ１プライマーとＩ４９Ｔアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行いドックリンの前半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。また、ｃＤｏｃｋ２プライマーとＩ４９Ｔセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ドックリンの後半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。このドックリンの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を用いて上記の遺伝子結合用ＰＣＲサンプルを調製し、ドックリンの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を上記遺伝子結合用ＰＣＲ反応条件でアニールした。このアニール後のサンプルにｃＤｏｃｋ１プライマーとｃＤｏｃｋ２プライマーを加え、アニールした遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、野生型ドックリンの４９番目のアミノ酸ＩをＴに置換したＣ末端付加用ドックリンポリペプチドをコードする遺伝子（以下、これを「Ｃ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子」という）を合成した。

（１０）Ｃ末端付加用Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチド遺伝子の合成
上記（９）で合成したＣ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子を鋳型とし、上記ｃＤｏｃｋ１プライマーとＬ１６Ｔアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行いドックリンの前半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。また、ｃＤｏｃｋ２プライマーとＬ１６Ｔセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ドックリンの後半の部分配列をコードする遺伝子を合成した。このドックリンの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を用いて上記遺伝子結合用ＰＣＲサンプルを調製し、ドックリンの前半部分をコードする遺伝子と後半部分をコードする遺伝子産物を上記遺伝子結合用ＰＣＲ反応条件でアニールした。このアニール後のサンプルにｃＤｏｃｋ１プライマーとｃＤｏｃｋ２プライマーを加え、アニールした遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、野生型ドックリンの１６番目のアミノ酸ＬをＴ、４９番目のアミノ酸ＩをＴに置換したＣ末端付加用ドックリンポリペプチドをコードする遺伝子（以下、これを「Ｃ末端付加用Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換遺伝子」という）を合成した。

実 施 例 ２
トランスファーベクターの構築（１）：
（１）Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子の精製
実施例１（１）で合成したＮ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子のＰＣＲ産物５μｌに制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩ（共に宝酒造製）を８〜２４Ｕ加え、制限消化することにより末端配列を露出させた。次に、これをキアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）に通し、制限酵素処理Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子を精製した。

（２）Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子のトランスファーベクターへの挿入
実施例１（１）で調製したｐＭ０ＮＤＴ１０の制限酵素認識サイトＮｃｏＩ・ＮｈｅＩを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩ（共に宝酒造製）で開いてトランスファーベクターを線状化した後、これの制限酵素切断末端をアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により脱リン化した。このトランスファーベクター０.１μｇ（２μｌ）と、上記（１）で精製した制限酵素処理Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子断片０.１μｇ（３μｌ）を混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて１６℃で１時間反応した後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＤＨ５α（インビトロジェン製）を形質転換した。この形質転換体から常法に従いアンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。次にいくつかのクローンの塩基配列確認を以下のｙｎｇ.ｆｏｒプライマーを用い、ＡＢＩシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させた後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ製）を用いて、Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子が導入されているかどうかを解析した。Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子が導入され、その他の部分に変異のないクローンをｐＭ０ＮＤＴ１０−ＤＶ（Ｉ４９Ｔ）ベクターとした。

また、実施例１の（２）〜（８）で合成した遺伝子を用い、上記と同様の方法によりＮ末端付加用Ｉ４９Ｇ置換遺伝子を挿入したベクターをｐＭ０ＮＤＴ１０−ＤＶ（Ｉ４９Ｇ）、Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｓ置換遺伝子を挿入したベクターをｐＭ０ＮＤＴ１０−ＤＶ（Ｉ４９Ｓ）、Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｎ置換遺伝子を挿入したベクターをｐＭ０ＮＤＴ１０−ＤＶ（Ｉ４９Ｎ）、Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｙ置換遺伝子を挿入したベクターをｐＭ０ＮＤＴ１０−ＤＶ（Ｉ４９Ｙ）、Ｎ末端付加用Ｉ４９Ｖ置換遺伝子を挿入したベクターをｐＭ０ＮＤＴ１０−ＤＶ（Ｉ４９Ｖ）、Ｎ末端付加用Ｌ１６Ｇ／Ｉ４９Ｇ置換遺伝子を挿入したベクターをｐＭ０ＮＤＴ１０−ＤＶ（Ｌ１６Ｇ／Ｉ４９Ｇ）、およびＮ末端付加用Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換遺伝子を挿入したベクターをｐＭ０ＮＤＴ１０−ＤＶ（Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ）とした（図１）。

クローンの塩基配列確認用プライマー
ｙｎｇ.ｆｏｒプライマー：
５'−ａａｃｃａｔｃｔｃｇｃａａａｔａａａｔａ−３'

実 施 例 ３
トランスファーベクターの構築（２）：
（１）Ｃ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子の調製
実施例１（９）で合成したＣ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子のＰＣＲ産物の５μｌに制限酵素Ｅｃｏ８１ＩおよびＳｎａＢＩ（共に宝酒造製）を８〜２４Ｕ加え、制限消化することにより末端配列を露出させた。次に、これをキアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）に通し、制限酵素処理Ｃ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子を精製した。

（２）Ｃ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子のトランスファーベクターへの挿入
実施例１（９）で調製したｐＭ０ＣＤＴ１７の制限酵素認識サイトＥｃｏ８１Ｉ・ＳｎａＢＩを、制限酵素Ｅｃｏ８１ＩおよびＳｎａＢＩ（共に宝酒造製）で開いてトランスファーベクターを線状化した後、これの制限酵素切断末端をアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により脱リン化した。このトランスファーベクター０.１μｇ（２μｌ）と、上記（１）で精製した制限酵素処理Ｃ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子０.１μｇ（３μｌ）を混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて１６℃で１時間反応した後に、反応溶液すべてを用いて大腸菌ＤＨ５α（インビトロジェン製）を形質転換した。この形質転換体から常法に従いアンピシリン耐性形質転換体を選抜し、プラスミドの精製を行った。次にいくつかのクローンの塩基配列確認を上記ｙｎｇ.ｆｏｒプライマーを用い、ＡＢＩシーケンスキット（ＡＢＩ製）を用いて反応させた後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ製）を用いてＣ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子が導入されているかどうかを解析した。Ｃ末端付加用Ｉ４９Ｔ置換遺伝子が導入され、その他の部分に変異のないクローンをｐＭ０ＣＤＴ１７−ＤＶ（Ｉ４９Ｔ）ベクターとした。

また、実施例１の（１０）で合成した遺伝子を用い、上記と同様の方法によりＣ末端付加用Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換遺伝子を挿入したベクターをｐＭ０ＣＤＴ１７−ＤＶ（Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ）とした（図２）。

実 施 例 ４
組換え融合タンパク質の調製：
（１）ＪＮＫ３遺伝子の取得
プロテインキナーゼＪＮＫ３（mitogen-activated protein kinase 10 isoform 3）の 遺伝子が導入されたベクターであるＦＬＪ４２８０１（社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム（ＪＢｉＣ））を鋳型とし、ＪＮＫ３遺伝子調製用のＪＮＫ３−５'プライマーとＪＮＫ３−３'ＴＧＡプライマーを用いてＰＣＲを行った。このＪＮＫ３遺伝子の５'端に制限酵素ＸｈｏＩ認識配列および３'端に制限酵素ＥｃｏＲＶ認識配列が付加されたＰＣＲ産物５μｌに、制限酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶ（共に宝酒造製）を加え、制限消化することにより末端配列を露出させた。次に、これをキアゲンスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ：キアゲン製）により制限酵素処理ＪＮＫ３遺伝子を精製した。

ＪＮＫ３遺伝子調製用プライマー
ＪＮＫ３−５'プライマー（制限酵素ＸｈｏＩ配列付加）：
５'−ｇａｔｃｔｃｇａｇａｔｇａｇｃａａａａｇｃａａａｇｔｔｇ−３'
ＪＮＫ３−３'ＴＧＡプライマー（制限酵素ＥｃｏＲＶ配列付加）：
５'−ｇｃｇａｔａｔｃｔｃａｃｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｔｇａａｇ−３'

（２）ＪＮＫ３遺伝子のトランスファーベクターへの挿入
実施例２および３で作製した各種トランスファーベクターを、それぞれＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶ（共に宝酒造製）で消化し、これにＪＮＫ３遺伝子をライゲーションキット（宝酒造製）を用いて挿入し、組換え融合タンパク質発現用トランスファーベクターを調製した。更に、このトランスファーベクターで大腸菌ＤＨ５α（インビトロジェン製）を形質転換し、アンピシリン耐性クローンについてプラスミド精製を行い、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ製）でＪＮＫ３遺伝子の挿入および読み枠が合っていること、また、ＪＮＫ３遺伝子に変異のないことを確認した。

（３）組換え融合タンパク質発現用ウイルスの作製
上記（２）で調製した組換え融合タンパク質発現用トランスファーベクターとＥｃｏ８１Ｉ（宝酒造製）で直鎖化したＡＢｖＮＰＶのＤＮＡ（片倉工業製）をＴＣ−１００培地（無血清）中で２.５：１の割合（質量比）で混合し、これをカチオン性脂質試薬（リポフェクチン（登録商標）試薬：インビトロジェン製）とともにＢｍ−Ｎ細胞（ＴＣ−１００培地で培養）にコ・トランスフェクションした。２５℃で７日間静置培養後、その培養上清を組換え融合タンパク質発現用ウイルス原液とした。

（４）組換え融合タンパク質の発現
上記（３）で調製した組換え融合タンパク質発現用ウイルス原液を、テルモシリンジでカイコ（錦秋鐘和）蛹２頭に接種した後、７日目のものを回収、凍結保存し、これを組換え融合タンパク質発現用ウイルス感染カイコとした。このカイコ２頭を５０ｍｌチューブに入れ、グリセロールを１０質量％（以下、「％」という）含むＰＢＳを１０ｍｌ、ステンレスビーズを１個、ジルコニアビーズを５ｇ、５００ｍＭの２−メルカプトエタノールを１００μｌ、１Ｍのベンズアミンを１００μｌおよび１００ｍＭのＰＭＳＦを１００μｌ加え、ホモジナイザーを用いて、４℃で３分間磨砕した。この磨濁液を３,０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心後、ガーゼで濾過し、上清を得た。この上清をさらに超遠心分離機（BECKMAN COULTER Avanti(商標登録) Centrifuge HP-30I）を用い、１００,０００ｇで６０分間超遠心分離し、組換え融合タンパク質を含む超遠心上清を得た。

実 施 例 ５
組換えコヘシンタンパク質の調製およびコヘシンカラムの作製：
（１）組換えコヘシンタンパク質の調製
クロストリジウム・ジョスイのＣｉｐＡ遺伝子（BAA32429）を組み込んだバキュロウイルスを、上記実施例４と同様の方法で作製し、そのウイルス溶液をテルモシリンジでカイコ蛹（錦秋鐘和）２頭に接種した。ウイルス接種後、７日目のものを回収、凍結保存し、これを組換えコヘシンタンパク質発現用ウイルス感染カイコとした。このカイコ２頭を５０ｍｌチューブに入れ、グリセロールを１０％含むＰＢＳ１０ｍｌ、ステンレスビーズを１個、ジルコニアビーズを５ｇ、５００ｍＭの２−メルカプトエタノールを１００μｌ、１Ｍのベンズアミンを１００μｌおよび１００ｍＭのＰＭＳＦを１００μｌ加え、ホモジナイザーを用いて、４℃で３分間磨砕した。この磨濁液を３,０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心後、ガーゼで濾過し、上清を得た。超遠心分離機（BECKMAN COULTER Avanti(商標登録) Centrifuge HP-30I）を用い、１００，０００ｇで６０分間超遠心分離し、組換えコヘシンタンパク質を含む超遠心上清を得た。

（２）組換えコヘシンタンパク質の精製
上記で得られた超遠心上清は、４倍容積の緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸水素カリウム−塩酸および１Ｍの硫酸アンモニウムを含む、ｐＨ６.８）で希釈し、０.４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、緩衝液Ａで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラム（Phenyl Sepharose HP：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）に供した。この操作により組換えコヘシンタンパク質は担体に吸着した。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）を、緩衝液Ａを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１〜０Ｍまで直線的に変化させて組換えコヘシンタンパク質を溶出させ、硫酸アンモニウム濃度が約０.３〜０.２Ｍの溶出画分を回収した。

疎水性クロマトグラフィーで得られた組換えコヘシンタンパク質を含む画分をそれぞれ集めて、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのリン酸水素カリウム−塩酸を含む、ｐＨ６.０）に対して透析し、０.４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、緩衝液Ｂで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Q-Sepharose HP：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）に供して担体に吸着させた。非吸着タンパク質を緩衝液Ａで洗い流した後、塩化カリウム濃度を０〜１Ｍまで直線的に変化させて吸着した組換えコヘシンタンパク質の溶出を行い、塩化カリウム濃度が約０.１Ｍの画分で組換えコヘシンタンパク質を回収した。

上記陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた組換えコヘシンタンパク質を含む画分をそれぞれ集めて、遠心濾過膜（セントリコンプラス−２０バイオマックス−５メンブレン：ミリポア製）に供し、蛋白質溶液の濃縮と、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.０）への交換を行い、組換えコヘシンタンパク質の粗精製品を得た。

（３）コヘシン融合ＮＨＳ−セファロースの作製
上記で得た組換えコヘシンタンパク質の粗精製品は、小バッチ精製のために、共有結合でＮＨＳ−セファロース（NHS-Activated Sepharose 4FF：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。この組換えコヘシンタンパク質融合ＮＨＳ−セファロース（以下、「コヘシン担体」とする）は、緩衝液（２５ｍＭのトリス−塩酸、２５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２.５ｍＭの塩化カルシウムを含む、ｐＨ７.４）中、４℃で保存した。また、上記で得た組換えコヘシンタンパク質の粗精製品は、クロマトグラフィーシステム（AKTAprime：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製を行うために、カラム（HiTrap NHS-activated HP：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。

実 施 例 ６
組換え融合タンパク質の精製比較試験：
実施例４で調製した組換え融合タンパク質を含む各超遠心上清の２００μｌに、実施例５で調製したコヘシン担体を２００μｌおよび結合用緩衝液（２５ｍＭのトリス−塩酸、２５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２.５ｍＭの塩化カルシウムを含む）を６００μｌ加え、回転震とう器を用い、１時間混合した。その後、３,０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いた。次に、コヘシン担体に洗浄緩衝液（２５ｍＭのトリス−塩酸および２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む）を１ｍｌ添加し、コヘシン担体を洗浄した。洗浄後、コヘシン担体に溶出用緩衝液（２５ｍＭのトリス−塩酸、２５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび５ｍＭのＥＧＴＡを含む）を２００μｌ添加することにより、組換え融合タンパク質を溶出させた。溶出液は、５分、３０分、１時間、６時間ごとに、１５μｌずつサンプリングした。なお、上記操作の何れもが４℃で行われた。

上記サンプルは、電気泳動ゲル（Perfect NT Gel A 10-20%：ＤＲＣ社製）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＪＮＫ３のＮ末端に、Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルおよびＪＮＫ３のＮ末端に野生型ドックリンを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示した。また、ＪＮＫ３のＣ末端に、Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルおよびＪＮＫ３のＣ末端に野生型ドックリンを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示した。

ＪＮＫ３のＮ末端に野生型ドックリンを付加した組換え融合タンパク質は、図３（Ａ）のレーン６〜９から明らかなように時間経過ごとに溶出量が増加し、レーン９の６時間後にピークをむかえていた。一方、ＪＮＫ３のＮ末端に、Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質は、レーン７の３０分後には溶出量のピークをむかえていることが明らかになった。また、野生型ドックリンのアミノ酸を置換したことによる精製純度への影響はなかった。

また、ＪＮＫ３のＣ末端に野生型ドックリンを付加した組換え融合タンパク質は、図４（Ａ）のレーン６〜９から明らかなように時間経過ごとに溶出量が増加し、レーン９の６時間後にピークをむかえていた。一方、ＪＮＫ３のＣ末端に、Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質は、レーン７の３０分後には溶出量のピークをむかえていることが明らかになった。また、野生型ドックリンのアミノ酸を置換したことによる精製純度への影響はなかった。

更に、その他の野生型ドックリンのアミノ酸を置換したドックリンポリペプチド（Ｉ４９Ｔ、Ｉ４９Ｇ、Ｉ４９Ｎ、Ｉ４９Ｓ、Ｉ４９Ｖ）をＪＮＫ３のＮ端側に導入した場合についても、同様の精製比較試験を行い、６時間後の溶出量（最大溶出量）を１００として、各時間における溶出割合をデンシトメトリー解析（CS Analyzer：ＡＴＴＯ製）により求めた（表２）。その結果、Ｉ４９Ｖを除きどのドックリンポリペプチドを融合させた場合においても、溶出を始めて３０分後には、ほぼ全てが溶出していることが分かった。また、ＪＮＫ３のＣ末端にドックリンポリペプチドを導入した場合であっても同じ結果を示した（表３）。

また、カラム精製におけるドックリンの変異の効果を確かめるため、次の実験を行った。実施例５で調製したカラム（HiTrap NHS-activated HP）をクロマトグラフィーシステム（AKTAprime）に装着し、実施例４で調製したＪＮＫ３のＮ末端にＩ４９Ｇ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質を含む各超遠心上清の０.１ｍｌを結合用緩衝液（２５ｍＭのトリス−塩酸、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化カルシウムおよび１０％のグリセロールを含む）で５倍に希釈し、１分間に１ｍｌの速さで流した。次に、洗浄緩衝液（２５ｍＭのトリス−塩酸、２５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび１０％グリセロールを含む）で非吸着画分を取り除き、溶出用緩衝液（２５ｍＭのトリス−塩酸、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＧＴＡおよび１０％グリセロールを含む）を１分間に０.１ｍｌの速さで流し、組換え融合タンパク質を溶出させた。その結果を図５に示した。また、溶出液は１ｍｌごとにサンプリングを行った。

ＪＮＫ３のＮ末端に野生型ドックリンを付加した組換え融合タンパク質は、溶出を始めて２フラクション目から連続的に溶出し、２０フラクションを超えても溶出していた（図５（Ａ））。一方、ＪＮＫ３のＮ末端にＩ４９Ｇ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質は、溶出を始めて２フラクション目から溶出が始まり、３フラクション目（溶出が開始から１０分）には終わっていた（図５（Ｂ））。また、上記と同様に、溶出用緩衝液を１分間に０.５ｍｌの速さで流した場合も、ＪＮＫ３のＮ末端にＩ４９Ｇ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質は、溶出開始から１０分以内に溶出が完了した。

実 施 例 ７
相互作用解析による組換え融合タンパク質と組換えコヘシンタンパク質との
親和性解析：
ビアコアＴ−１００（ビアコア製）を用いた表面プラズモン共鳴法（以下、「ＳＰＲ法」と略す）により、ＪＮＫ３のＮ末端に野生型ドックリンを結合させた組換え融合タンパク質に対する、組換えコヘシンタンパク質の結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を測定した。測定には、ビアコアＴ−１００の推奨品であるＨＢＳ−Ｐ（０.０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、０.１５Ｍの塩化ナトリウムおよび０.００５％の界面活性剤（Ｐ２０））と同様の組成のランニング緩衝液を使用した。

センサーチップＣＭ５（ビアコア製）にｒＰｒｏｔｅｉｎＡ（２９４３５−１４：ナカライテスク製）をアミンカップリング法により共有結合させた。このとき、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡの固定化量は約１２,０００ＲＵであった。このｒＰｒｏｔｅｉｎＡを共有結合させたセンサーチップＣＭ５（以下、「ＰｒｏｔｅｉｎＡチップ」と略す）に抗ＪＮＫ３抗体（55A8：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製）を約１,３００ＲＵになるように固定化し、さらに、ＪＮＫ３のＮ末端に野生型ドックリンを融合させた組換えタンパク質を約１００ＲＵになるようにキャプチャーさせた。これに、組換えコヘシンタンパク質（５ｎＭ、１０ｎＭまたは２０ｎＭ）と終濃度１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加し、組換えコヘシンタンパク質とＮ末端に野生型ドックリンを融合したＪＮＫ３との相互作用解析を行い、結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）、解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定した。それらの結果を表４に示した。同様に、ＪＮＫ３のＮ末端に各種変異導入ドックリンポリペプチド（Ｉ４９Ｔ、Ｉ４９Ｇ、Ｉ４９Ｎ、Ｉ４９Ｓ、Ｉ４９Ｖ、Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ）を融合させた組換えタンパク質について、組換えコヘシンタンパク質との相互作用解析を行った。これらの結果も表４に併せて示した。

さらに、キレート剤の添加によるコヘシンと各種変異導入ドックリンとの解離速度の変化を調査するため、ランニング緩衝液に５ｍＭのＥＧＴＡを添加し、同様の方法で組換えコヘシンタンパク質とＪＮＫ３のＮ末端に各種変異導入ドックリンを融合した蛋白質の相互作用解析を行った。これらの結果を図６〜８および表４に示した。

上記測定結果から算出された解離定数（Ｋ_Ｄ）は、野生型ドックリンでは、カルシウムイオン存在下で６.５Ｅ−０９（Ｋ_Ｄ）であったのに対し、キレート剤添加時で３.９Ｅ−０９（Ｋ_Ｄ）であり、キレート剤作用による解離速度の上昇はほとんど認められなかった。これに対し、変異型ドックリンでは、Ｉ４９Ｔがカルシウムイオン存在下で３.８Ｅ−０９（Ｋ_Ｄ）、キレート剤添加時で１.９Ｅ−０８（Ｋ_Ｄ）、Ｉ４９Ｇがカルシウムイオン存在下で２.２Ｅ−０９（Ｋ_Ｄ）、キレート剤添加時で１.７Ｅ−０７（Ｋ_Ｄ）、Ｉ４９Ｎがカルシウムイオン存在下で３.７Ｅ−０９（Ｋ_Ｄ）、キレート剤添加時で５.６Ｅ−０８（Ｋ_Ｄ）、Ｉ４９Ｓがカルシウムイオン存在下で４.５Ｅ−０９（Ｋ_Ｄ）、キレート剤添加時で６.７Ｅ−０８（Ｋ_Ｄ）、Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔがカルシウムイオン存在下で３.２Ｅ−０９（Ｋ_Ｄ）、キレート剤添加時で１.２Ｅ−０８（Ｋ_Ｄ）であり、いずれもキレート剤を作用させた場合に解離速度が１０倍程度（最高１００倍）高まった。一方、カルシウムイオン存在下での解離定数については、野生型と各種変異導入ドックリンでは大差なく、カルシウムイオン存在下でのコヘシンとの結合特性は、これらの変異導入により特に変化が認められず、キレート剤を作用させた場合のみ結合特性が変化することが判明した。

一方、Ｉ４９Ｖの変異型ドックリンでは、カルシウムイオン存在下での解離定数が７.６Ｅ−０９（Ｋ_Ｄ）、キレート剤添加時の解離定数が８.１Ｅ−０９（Ｋ_Ｄ）であり、キレート剤を作用させても顕著な解離速度の上昇は認められなかった（図８）。

以上の相互作用解析の結果から、キレート剤を含む緩衝液で溶出させた際に、低温下においても各種変異導入ドックリン融合タンパク質がコヘシン担体から溶出する時間が著しく短縮する効果は、特定のアミノ酸への置換によってドックリンポリペプチドとコヘシンの相互作用特性がキレート剤存在下において変化（解離速度が上昇）するためであることが示唆された。すなわち、特定のアミノ酸を置換した変異型ドックリンは、カルシウムイオン存在下では、何らコヘシンとの結合特性に変化は認められず、精製工程でのカラム担体への吸着効率を低下させたり洗浄時の脱落を増加させたりすることはない。一方、キレート剤を添加する溶出時のみコヘシンとの結合親和性が低下し、カラム担体からの精製タンパク質の溶出効率が低温下においても劇的に改善することがわかった。

なお、上記実施例では、ドックリンポリペプチドと、目的タンパク質としてプロテインキナーゼ（ＪＮＫ３）を融合させた組換え融合タンパク質の解析例を示したが、目的タンパク質として他のプロテインキナーゼやサイトカインを用いたものについても同様の試験を行い、同じ結果を得た。

また、クロストリジウム・ジョスイのＣｅｌＢ由来の野性型ドックリンのアミノ酸配列（配列番号１）において、最初のアミノ酸であるメチオニンから４８番目（ドックリンのサブドメイン２の１３番目）のアミノ酸であるアラニン（Ａ）をセリン（Ｓ）に置換したドックリンポリペプチドをプロテインキナーゼ（ＪＮＫ３）のＮ末端に付加した組換え融合タンパク質を実施例１〜４と同様に作製した。そして、この組換え融合タンパク質と、実施例５と同様に作製した組換えコヘシンタンパク質との相互作用解析を実施例７と同様に行った。その結果、キレート剤を作用させた場合のコヘシンとの解離定数（Ｋ_Ｄ）は５.２Ｅ−０９であり、野生型の解離定数と同等であった。

本発明のドックリンポリペプチドは、野生型ドックリンと同等のコヘシンドメインに対する結合親和力を有する。そして、これを従来の野生型ドックリンとコヘシンを用いた組換え融合タンパク質の精製方法に適用した場合には、組換え融合タンパク質の活性に与える影響が少ない低温下での溶出時間を著しく短縮する。この効果は、カラム精製時においても溶出ピークをシャープにし、高濃度の精製蛋白質を短時間で得られることから実用性が高い。

従って、本発明のドックリンポリペプチドを利用した組換え融合タンパク質の精製方法は効率的かつ経済的に組換え融合タンパク質を精製することができる。

ドックリンポリペプチドＮ末端付加用ベクターの構成を示す図面である（下線：カルシウム結合に関与するアミノ酸、囲み：置換されたアミノ酸）。 ドックリンポリペプチドＣ末端付加用ベクターの構成を示す図面である（下線：カルシウム結合に関与するアミノ酸、囲み：置換されたアミノ酸）。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図面である（（Ａ）ＪＮＫ３のＮ末端に野生型ドックリンを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルの結果、（Ｂ）ＪＮＫ３のＮ末端に、Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルの結果、レーンＭ：分子量マーカー（Magic Mark）、レーン１：組換え融合タンパク質を発現させた蛹磨砕液の超遠心上清、レーン２：レーン１の組換え融合タンパク質をコヘシン担体に結合させた後の画分、レーン３：コヘシン担体洗浄画分１、レーン４：コヘシン担体洗浄画分２、レーン５：コヘシン担体洗浄画分３、レーン６：ＥＧＴＡを含む緩衝液で組換え融合タンパク質を溶出した画分（５分）、レーン７：ＥＧＴＡを含む緩衝液で組換え融合タンパク質を溶出した画分（３０分）、レーン８：ＥＧＴＡを含む緩衝液で組換え融合タンパク質を溶出した画分（１時間）、レーン９：ＥＧＴＡを含む緩衝液で組換え融合タンパク質を溶出した画分（６時間））。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図面である（（Ａ）ＪＮＫ３のＣ末端に野生型ドックリンを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルの結果、（Ｂ）ＪＮＫ３のＣ末端に、Ｌ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルの結果、レーンＭ：分子量マーカー（Magic Mark）、レーン１：組換え融合タンパク質を発現させた蛹磨砕液の超遠心上清、レーン２：レーン１の組換え融合タンパク質をコヘシン担体に結合させた後の画分、レーン３：コヘシン担体洗浄画分１、レーン４：コヘシン担体洗浄画分２、レーン５：コヘシン担体洗浄画分３、レーン６：ＥＧＴＡを含む緩衝液で組換え融合タンパク質を溶出した画分（５分）、レーン７：ＥＧＴＡを含む緩衝液で組換え融合タンパク質を溶出した画分（３０分）、レーン８：ＥＧＴＡを含む緩衝液で組換え融合タンパク質を溶出した画分（１時間）、レーン９：ＥＧＴＡを含む緩衝液で組換え融合タンパク質を溶出した画分（６時間））。 クロマトグラフィーシステムを用いた組換え融合タンパク質の精製の結果を示す図面である（（Ａ）ＪＮＫ３のＮ末端に野生型ドックリンを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルの結果、(Ｂ)ＪＮＫ３のＮ末端にＩ４９Ｇ置換ドックリンポリペプチドを付加した組換え融合タンパク質を含むサンプルの結果）。 表面プラズモン共鳴法によるコヘシンタンパク質と各種変異導入ドックリンとの相互作用解析の結果を示す図面である。カルシウムイオン添加時とキレート剤添加時での結果を並列して示す（（Ａ）組換えコヘシンタンパク質と、ＪＮＫ３のＮ末端に野生型ドックリンを融合させた組換えタンパク質との相互作用解析の結果、（Ｂ）組換えコヘシンタンパク質と、ＪＮＫ３のＮ末端にＩ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチドを融合させた組換えタンパク質との相互作用解析の結果、（Ｃ）組換えコヘシンタンパク質と、ＪＮＫ３のＮ末端にＩ４９Ｇ置換ドックリンポリペプチドを融合させた組換えタンパク質との相互作用解析の結果）。 表面プラズモン共鳴法によるコヘシンタンパク質と各種変異導入ドックリンとの相互作用解析の結果を示す図面である。カルシウムイオン添加時とキレート剤添加時での結果を並列して示す（（Ａ）組換えコヘシンタンパク質と、ＪＮＫ３のＮ末端にＩ４９Ｎ置換ドックリンポリペプチドを融合させた組換えタンパク質との相互作用解析の結果、（Ｂ）組換えコヘシンタンパク質と、ＪＮＫ３のＮ末端にＩ４９Ｓ置換ドックリンポリペプチドを融合させた組換えタンパク質との相互作用解析の結果、（Ｃ）組換えコヘシンタンパク質と、ＪＮＫ３のＮ末端にＬ１６Ｔ／Ｉ４９Ｔ置換ドックリンポリペプチドを融合させた組換えタンパク質との相互作用解析の結果）。 表面プラズモン共鳴法によるコヘシンタンパク質と各種変異導入ドックリンとの相互作用解析の結果を示す図面である。カルシウムイオン添加時とキレート剤添加時での結果を並列して示す（組換えコヘシンタンパク質と、ＪＮＫ３のＮ末端にＩ４９Ｖ置換ドックリンポリペプチドを融合させた組換えタンパク質との相互作用解析結果）。

Claims (8)

1. 配列番号４〜１０に記載のアミノ酸配列の何れかからなる、クロストリジウム・ジョスイ（Clostridium josui）由来のドックリンポリペプチド。
2. 目的タンパク質と、請求項１記載のドックリンポリペプチドとを含む組換え融合タンパク質を、カルシウムイオンを介してコヘシンドメインを含むポリペプチドに結合させて複合体を形成させ、その後、金属キレーターで複合体からカルシウムイオンを除去し、組換え融合タンパク質を溶出させることを特徴とする組換え融合タンパク質の精製方法。
3. コヘシンドメインを含むポリペプチドが、担体に固定化されたものである請求項２記載の組換え融合タンパク質の精製方法。
4. 請求項１記載のドックリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
5. 請求項４記載のドックリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクター。
6. 更に、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み込んだものである請求項５記載の発現ベクター。
7. バキュロウイルス由来のものである請求項５または６記載の発現ベクター。
8. 請求項５ないし７の何れかに記載の発現ベクターと、コヘシンドメインを含むポリペプチドを固定化した担体とを含むことを特徴とする組換え融合タンパク質の精製キット。

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