KR20140084124A - 소수성 치환 크로마토그래피용 음이온 디스플레이서 분자 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법에 관한 것으로, 소수성 정지 상을 제공하고; 소수성 정지 상에, 분리될 유기 화합물을 포함하는 혼합물을 가하며; 여기에 비-표면 활성의 소수성 음이온 디스플레이서 분자 및 약 10 중량% 이하의 유기 용매를 포함하는 수성 조성물을 가하여 소수성 정지 상으로부터 유기 화합물을 치환(displacing)하며; 분리된 유기 화합물을 함유하는 소수성 정지 상으로부터 용리된 복수의 분획을 수거하는 단계를 포함하고, 여기서 비-표면 활성의 소수성 음이온 디스플레이서 분자는, 상세한 설명에서 정의된 바와 같이, 화학식 A 또는 B를 갖는, 소수성 음이온과 반대 이온(counterion, CI)을 포함한다.
[CM][CI]_d (A) [CM-R^*-CM'][CI]_d (B)

Description

소수성 치환 크로마토그래피용 음이온 디스플레이서 분자{ANIONIC DISPLACER MOLECULES FOR HYDROPHOBIC DISPLACEMENT CHROMATOGRAPHY}

치환 크로마토그래피(displacement chromatograpy; DC)는 컬럼 크로마토그래피의 3가지 잘 정의된 형태들 - 용리(elution), 치환(displacement), 프론탈(frontal) 중의 하나이다. DC는 주로 제조적 방법이지만, 또한 팩킹된 "협소한-구멍(narrow-bore)" 또는 모세관 컬럼을 사용한 "미세제조적(micropreparative)" DC를 사용하는 분석적 적용들이 존재한다.

치환 크로마토그래피는, 적합한 고순도 디스플레이서 분자들이 이용 가능한 경우 4가지 일반적인 크로마토그래피적 방법 중의 어느 하나를 사용하여 수행할 수 있다. DC는 (a) 이온-교환 크로마토그래피(양이온-교환, 음이온-교환), (b) 소수성 크로마토그래피[역-상(reversed-phase), 소수성-상호작용, 소수성 전하-유도, 호황성(thiophilic)], (c) 친수성-상호작용 크로마토그래피(HILIC)를 포함하는 정상-상(normal-phase) 크로마토그래피 및 (d) 부동화된 금속-이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)에서 사용된다.

최적화된 DC를 사용하여, 당업자는 고순도(고 분해능), 고 회복성(고수율) 및 고 컬럼 로딩(high column loading)(고 용량)을 동시에 수득할 수 있다 - 후자는 오버로딩된(overloaded) 제조적 용리 크로마토그래피보다 훨씬 더 크다. 대부분의 경우들에서, 이들 이점들은 DC의 단점들을 보다 더 보상한다(더 느린 유속들, 더 긴 실행 시간, 고순도 디스플레이서들에 대한 필요성).

치환 크로마토그래피는, (a) 적용 가능한 크로마토그래피적 방법, (b) 적절한 치수들을 갖는 적합한 크로마토그래피 컬럼,(c) 적절한 이동 상 조건들, (d) 적합한 디스플레이서 분자 및 (e)적절하게 구성된 LC 장치를 갖는 적합한 작동 프로토콜들을 선택하여 수행한다. 초기에, 적합한 "약하게 치환하는(displacing) 이동 상"(캐리어; carrier)을 선택하고, 컬럼은 적합한 유속로 평형시킨다. 캐리어는 유용한 pH 값으로 조절된 pH 완충 화합물을 포함할 수 있다. 최적 치환 유속들은 낮은 경향이 있으며, 전형적으로 35-105 cm/hr의 범위이지만 때때로 이보다 더 높다. 적합한 양의 샘플 용액을 샘플-로딩 유속로 컬럼 상으로 로딩한다. 샘플 용액은, 샘플 또는 디스플레이서 분자들이 하전되는 경우 적절한 수준의 이온 쌍 형성제(ion-pairing agent) 또는 이온 쌍 형성 염과 함께 캐리어 속에서 정제되는 물질을 포함한다. 전형적인 샘플 로딩들은 작동적 관류 용량(operative breakthrough capacity)의 50 내지 80%이다. 다음에, 캐리어 용액 중의 적절한 농도에서 적합한 디스플레이서 화합물로부터 제조된 디스플레이서 이동 상(디스플레이서 완충제)는, 디스플레이서 관류가 관찰될 때까지 치환 유동속도로 컬럼 상으로 펌핑(pumping)된다. 정제된 샘플은, 디스플레이서 관류 프런트(displacer breakthrough front) 앞의 컬럼을 제거한다. 컬럼으로부터의 분획들을 수집하고 함량 및 순도에 대해 별도로 분석한다. 최종적으로, 디스플레이서는 "디스플레이서 제거 용액"을 이용하여 컬럼으로부터 제거한 다음, 컬럼은 저장하기 위해 또는 후속적인 용도를 위해 이의 원래 상태로 세척하고 재생한다.

일부 국면들에서, 용리 크로마토그래피와 상이하지만, 치환 크로마토그래피는 이해하기 용이하고 수행하기 용이하다. DC에서, 샘플은 이동 상에 의해 컬럼으로부터 "용리"되기보다 디스플레이서에 의해 컬럼으로부터 "치환(displacing)"된다. 컬럼의 배출(output)이 온라인으로(예를 들면, UV 흡수, pH, 또는 전도성) 모니터링되는 경우, "용리 크로마토그램"보다는 "치환 트레인(displacement train)"이 수득된다. 치환 트레인은 크로마토그램에서 용매-분리된 "용리 피크"보다 나란한 "치환 밴드(displacement bands)"로 구성된다. 치환 밴드가 정지 상(stationary phase)을 포화시킬 정도로 큰 경우, 사다리꼴 "포화 밴드(saturating band)"가 형성된다. 치환 밴드가 정지 상을 포화시킬 정도로 크지 않은 경우, 작은 삼각형 "비-포화 밴드"가 형성된다. 포화 밴드의 높이는 작동 점에서 결합-등온선(binding-isotherm)으로 측정하고; 사다리꼴-밴드 또는 삼각형-밴드의 면적은 성분의 양에 비례한다.

소수성 크로마토그래피는, 고도로 구성되고 자체결합되고 수소-결합된 액체로부터 수득되는 물의 독특한 용매화 특성들에 거의 전적으로 의존한다. 통상적인 역-상 크로마토그래피 정지 상들(하전되지 않은 C₁₈ 컬럼)에 있어서, 결합은 보통 엔트로피(+T△S)에 의해 구동되는 데, 이는 종종 바람직하지 않은 엔탈피(+△H)를 극복해야만 한다. 따라서, 크로마토그래피 작업자들에 의해 종종 사용되는 온도 범위들(10-70℃) 이상에서, 분석물-결합 및 디스플레이서-결합은 종종 온도 증가에 따라 더 강해진다. 소수성 크로마토그래피의 또 다른 유용한 특징은, 수계 용매의 자체-수소-결합의 구조 및 강도 둘 다를 수정하는 첨가제들의 용도이다. 이들 첨가제들은 크로마토그래피 완충제들 중의 염들(NaCl, K₂HPO, (NH₄)₂SO₄), 유기 용매들(MeCN, MeOH, EtOH) 및 극성 유기 분자들(우레아, 올리고-에틸렌글리콜)을 포함한다.

소수성 치환 크로마토그래피는 키랄 분석물들(chiral analytes), 키랄 디스플레이서들 및 키랄 크로마토그래피 매트릭스들을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 조건들 하에서, 아키랄 디스플레이서(achiral displacer)를 사용할 수 있지만, 키랄 디스플레이서의 라세믹 혼합물(racemic mixture)은 사용할 수 없다. 라세믹 키랄 분석물들은 또한 아키랄 크로마토그래피 컬럼 및 아키랄 디스플레이서를 이용하여 정제할 수 있다. 이 경우, 부분입체이성체들을 포함하는 불순물들은 목적하는 라세믹 화합물로부터 제거되지만, 거울상이성체들의 키랄 분해능은 없다. 음이온 디스플레이서는 하나 이상의 중심(center)들을 포함할 수 있다. 키랄 크로마토그래피 매트릭스, 이동 상 및 아키랄 디스플레이서를 적절하게 선택하면, 거울상이성체들은 통상적으로 제조적으로 분해(분리)된다. 특정한 상황들에 좌우되어, 양호하고 거울상이성체적으로 순수한 키랄 디스플레이서가, 키랄 정지 상 위에서 거울상이성체들의 치환 분리를 수행하는 경우 양호한 아키랄 디스플레이서에 비해 성능 이점들을 가질 수 있다.

양호한 소수성 디스플레이서 분자들은 독특한 조합의 화학적 및 물리적 특성들을 지녀서 이들이 효율적으로 작용하도록 해야한다. 일부 가용성 소수성 분자들은 디스플레이서들로서 작용할 수 있지만, 단지 제한된 일부만이 잘 작용한다. 본원에 기술된 다수의 분자들은 잘-작용하는 디스플레이서들에 대한 필요한 요건들을 충족한다.

유용한 역-상, 제조적 치환 유용한 제조적 소수성 치환 크로마토그래피의 개발은 적합한 고순도 디스플레이서 분자들의 비이용 가능성에 의해 방해받아 왔다. 예를 들면, 미국 특허 제 6,239,262호는 디스플레이서들로서 저분자량 표면-활성 화합물을 이용하는 각종의 역 상 액체 크로마토그래피 시스템들을 기술한다. 미국 특허 제 6,239,262호는, 디스플레이서들로서 사용된 기재된 표면 활성 화합물을 형성하기 위해 소수성 잔기들과 커플링(coupling)될 수 있는 매우 광범위한 가능한 하전된 잔기들을 기술하고 있지만, 기술된 디스플레이서들의 표면 활성 특성들을 완화시키기 위해 다량의 유기 용매를 포함할 필요가 있다는 것을 기술하고 있다. 이러한 다량의 유기 용매들이 존재하면, 공정을 상당히 변경시켜서 역 상의 소수성 치환 크로마토그래피의 이점들이 폄하된다. 또한, 미국 특허 제 6,239,262호에 기술된 표면 활성 디스플레이서 화합물들은 잘 작용하지 않아서, 상당한 수준의 불순물들이 "정제된" 생성물들 중에 존재할 수 있는 비교적 불량한 품질의 치환 트레인들을 생성시킨다.

본 발명자들은 본 특허출원에서 소수성 치환 크로마토그래피의 각종 형태들에서 유용성을 갖는 디스플레이서 분자들 및 이들을 사용하는 방법들을 기술한다.

본 발명자들은, 소수성 치환 크로마토그래피에서 양호한 디스플레이서 거동을 위해 필요한 화학적 및 물리적 특성들의 조합을 독특하게 지니는 음으로 하전된 소수성 유기 화합물들, 염들 또는 쯔비터이온(zwitterion)들의 부류들을 발견하고 개발하였다.

따라서, 본 발명은, 일 실시예에서,

소수성 정지 상을 제공하고;

소수성 정지 상에, 분리될 유기 화합물을 포함하는 혼합물을 적용하고;

여기에 비-표면 활성의 소수성 음이온 디스플레이서 분자를 포함하는 수성 조성물을 가하여 소수성 정지 상으로부터 유기 화합물을 치환(displacing)하며;

분리된 유기 화합물을 함유하는 소수성 정지 상으로부터 용리된 복수의 분획들을 수집함을 포함하여, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법으로서, 여기서 비-표면 활성의 소수성 음이온 디스플레이서 분자는 다음 화학식 A 또는 B를 갖는, 소수성 음이온 및 반대 이온(counterion), CI를 포함하는 방법에 관한 것이다:

[CM][CI]_d (A) [CM-R^*-CM'][CI]_d (B)

상기 화학식 A 및 B에서,

각각의 CM 또는 CM'는 카르복시레이트(XVI), N-아실-α-아미노산(XVII), 설포네이트(XVIII), 설페이트 모노에스테르(XIX), 포스페이트 모노에스테르(XX), 포스페이트 디에스테르(XXI), 포스포네이트 모노에스테르(XXII), 포스포네이트(XXIII), 테트라아릴 보레이트(XXIV), 보로네이트(XXV), 보로네이트 에스테르(XXVI)로부터 선택된 음 형식 전하(negative formal charge)를 갖는 독립적인 소수성 화학 잔기이고; 여기서 화학 잔기 (XVI) 내지 (XXVI)은 다음의 화학 구조식들을 가지며:

상기 화학식 B에서,

CM 및 CM'는 동일한 또는 반대의 형식적 전하를 갖는 독립적으로 하전된 화학 잔기들이고 이중 연결된 화학 잔기 R^*에 의해 서로 화학적으로 부착되며, 당해 잔기는 CM 상의 하나의 R¹, R²　(존재하는 경우), R³　(존재하는 경우) 또는 R⁴　(존재하는 경우) 화학 잔기를 치환하고 CM'(여기서, CM' 상의 R 그룹은 프라임(')으로 나타내며, 예를 들면, R^1'는 CM' 상의 R¹ 그룹이다) 상의 하나의 R^1', R^2'　(존재하는 경우), R^3'　(존재하는 경우) 또는 R^4'　(존재하는 경우) 화학 잔기를 치환하고;

R¹, R^1', R², R^2', R³, R^3', R⁴ 및 R^4'의 각각은 화학식 -C_xX_{2x -2r}-AR¹-C_uX_{2u -2s}-AR²로 독립적으로 정의된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이고,

R^*는 직접 화학 결합이거나 또는 화학식 -C_xX_{2x -2r}-AR¹-C_uX_{2u -2s}-로 정의된 이중 연결된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이며,

R⁵ 및 R^5'은 화학식 -C_xX_{2x -2r}-AR²로 정의된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이며;

상기 화학식에서,

각각의 AR¹은 독립적으로 이중 연결된 메틸렌 잔기(-CX¹X²-, 메탄으로부터), 이중 연결된 페닐렌 잔기(-C₆G₄-, 벤젠으로부터), 이중 연결된 나프틸렌 잔기(-C₁₀G₆-, 나프탈렌으로부터) 또는 이중 연결된 비페닐렌 잔기(-C₁₂G₈-, 비페닐로부터)이고;

여기서 AR²는 독립적으로 수소(-H), 플루오르(-F), 페닐 그룹(-C₆G₅), 나프틸 그룹(-C₁₀G₇) 또는 비페닐 그룹(-C₁₂G₉)이고;

여기서 각각의 X, X¹　및 X²는 개별적 및 독립적으로, -H, -F,-Cl 또는 - OH이고;

여기서 어떠한 -C_xX_{2x -2r}- 내의 또는 어떠한 -C_uX_{2u -2s}- 내의 또는 어떠한 -(CX¹X²)_P- 내의 어떠한 메틸렌 잔기(-CX¹X²-)는 독립적인 에테르-산소 원자, -O-, 독립적인 티오에테르-황 원자, -S-, 또는 독립적인 케톤-카보닐 그룹, -C(O)-에 의해, 각각의 에테르-산소 원자, 각각의 티오에테르-황 원자 또는 각각의 케톤-카보닐 그룹이 지방족 탄소 원자 또는 방향족 탄소 원자에 각각의 측면에 결합되는 방식으로, 개별적 및 독립적으로, 치환될 수 있으며;

여기서 2개 이하의 에테르-산소 원자들, 2개 이하의 티오에테르-황 원자들 및 2개 이하의 케톤-카보닐 그룹들은 어떠한 -C_xX_{2x -2r}- 또는 어떠한 -C_uX_{2u -2s}- 내로 치환될 수 있고;

여기서 m_x는, 에테르-산소 원자들, 티오에테르-황 원자들 및 케톤-카보닐 그룹들로 치환되는 각각의 -C_uX_{2x -2r}- 내의 메틸렌 그룹들의 총 수이고, m_u는 에테르-산소 원자들, 티오에테르-황 원자들 및 케톤-카보닐 그룹들로 치환되는 각각의 -C_uX_{2u -2s}- 내의 메틸렌 그룹들의 총 수이고;

여기서 G는 개별적 및 독립적으로, -H, -F, -Cl, -CH₃, -OH, -OCH₃, -N(CH₃)₂, -CF₃, -CO₂Me, -CO₂NH₂; -CO₂NHMe, -CO₂NMe₂의 임의의 조합이고;

G^*는 개별적 및 독립적으로, -F, -Cl, -R², -OH, -OR², -NR²R³, -CF₃, -CO₂Me, -CO₂NH₂; -CO₂NHMe, -CO₂NMe₂의 임의의 조합이고;

여기서 R², R^2', R³, R^3', R⁴ 및 R^4'의 쌍은, R²/R³, R²/R⁴, R³/R⁴, R^2'/R^3', R^2'/R^4'　또는 R^3'/R^4'가 개별적 및 독립적으로, -(CX¹X²)p-(여기서, p = 3, 4, 5 또는 6이다)이도록 단일 화학 잔기를 포함할 수 있고;

여기서 x, r, u, s, m_x, m_u의 각각의 정수 값은 각각의 R¹, R^1', R², R^2', R³, R^3', R⁴ 및 R^4', R⁵　R^5'　및 R^*에 대하여 독립적으로 선택되고, 정수 값들 r 및 s는, 포함되고, 분리된 시스/트랜스 올레핀계(알켄) 그룹들의 총 수 + 포함된 단일의 모노사이클릭 구조들의 총 수이며 범위들 0 ≤ r ≤ 2 및 0 ≤ s ≤ 2에 속하고, 수치량(numeric quantity) x+u-m_x-m_u는 범위 0 ≤ x+u-m_x-m_u ≤ 11에 속하고;

여기서 적어도 하나의 방향족 화학 잔기, 헤테로사이클릭 방향족 화학 잔기, 이미다졸린 화학 잔기, 아미딘 화학 잔기 또는 구아니딘 화학 잔기는 A 또는 B의 CM 또는 CM' 내에 포함되고;

여기서 각각의 R-화학 잔기에 대한 그룹-소수성-지수(n)는 지방족 탄소 원자의 수 + 올레핀계 탄소 원자의 수 + 티오에테르-황 원자의 수 + 염소 원자의 수 + 플루오르 원자의 수의 1/5 + 에테르-산소 원자의 수의 1/2 + 케톤-탄소 원자의 수의 1/2 + 수 6을 넘는 방향족 탄소 원자의 수의 1/2의 합 - 수 1을 넘는 하이드록실-산소 원자의 수와 동일하고;

여기서 각각의 [CM] 또는 [CM-R^*-CM']에 대한 전체-소수성 지수(N)는 지방족 탄소 원자의 수 + 올레핀계 탄소 원자의 수 + 티오에테르-황 원자의 수 + 염소 원자의 수 + 플루오르 원자의 수의 1/5 + 에테르-산소 원자의 수의 1/2 + 케톤-탄소 원자의 수의 1/2 + 수 6을 넘는 방향족 탄소 원자의 수의 1/2의 합 - 수 1을 넘는 하이드록실-산소 원자의 수와 동일하고;

여기서 R¹　및 R^1'에 대한 그룹-소수성 지수들(¹n 및　^1'n)은 범위 4.0 <　¹n,^1'n < 12.0에 속하고, R², R^2', R³, R^3', R⁵, R^5', R^*에 대한 그룹-소수성 지수들(²n,　^2'n, ³n,　^3'n,　⁵n,　^5'n 및 ^*n)은, 존재하는 경우, 범위 0.0 ≤　²n, ^2'n,　³n, ^3'n,　⁵n, ^5'n, ^*n < 12.0에 속하며, R⁴　및 R^4'에 대한 그룹-소수성 지수들(⁴n 및　^4'n)은, 존재하는 경우, 범위 0.0 ≤　⁴n, ^4'n ≤ 5.0에 속하고;

여기서 g의 값으로 나눈 전체-소수성-지수(N)은 범위 10.0 ≤ N/g < 24.0에 속하며;

여기서 A에서, 하전된 잔기, CM이 형식 음성 전하를 갖는 경우, g=1이고, B에서, CM 및 CM' 둘 다가 형식 음성 전하들을 갖는 경우, g=2이며, B에서 CM 및 CM'가 [CM-R^*-CM']의 전체 전하를 갖는 반대의 형식 전하들을 갖는 경우, g=1이고;

사이클릭 화학 잔기에 대해 계산된 그룹-소수성-지수의 수치 값은 2개의 각각의 R-화학 잔기 사이에 동일하게 나누어지고;

여기서 R¹ 또는 R¹은, 단지 하나의 R-화학 잔기가 CM 또는 CM'에 부착되는 경우 이러한 R-화학 잔기로 정의되고; 여기서 R¹ 또는 R^1'은, CM 또는 CM'에 부착된 하나 이상의 R-화학 잔기들이 존재하는 경우 그룹-소수성-지수의 최대 값을 갖는 이러한 R-화학 잔기로 정의되며; 여기서 R⁴ 또는 R^4'은, CM 또는 CM'에 부착된 3개 이상의 R-화학 잔기들이 존재하는 경우 그룹-소수성-지수의 최소값을 갖는 이러한 R-화학 잔기로 정의되고;

여기서 CI는 비-간섭하는, 반대로 하전된 반대 이온 또는 이러한 반대 이온들의 혼합물이고, d의 값은, 전체 소수성 화합물의 전기중성(electroneutrality)이 유지되도록 하는 0, 양의 정수 또는 양의 분수이다.

일 실시예에서, 비-표면 활성의 소수성 음이온 디스페이서 분자를 포함하는 수성 조성물은 pH 완충제 이외의 첨가된 염이 존재하지 않는다.

일 실시예에서, CM은 일반식 XXIV 또는 XXV를 갖는다:

상기 화학식 XXIV에서, R¹은 페닐, 4-EtC₆H₄-, 4-ⁿPrC₆H₄-, 4-ⁿBuC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-FC₆H₄-, 4-MeC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-EtC₆H₄-, 4-ClC₆H₄-, 또는 C₆F₅-이며; 각각의 R², R³ 및 R⁴는 독립적으로 페닐, 4-FC₆H₄-, 4- MeC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-EtC₆H₄-, 4-ClC₆H₄- 또는 C₆F₅-이며; 상기 화학식 XXV에서, R¹은 4-(4-ⁿBuC₆H₄)C₆H₄- 또는 4-(4-ⁿBuC₆H₄)-3-ClC₆H₃-이다.

일 실시예에서, CM은 4-R¹C₆H₄SO₃H, 5-R⁶-2-HO-C₆H₃SO₃H, 4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-4'-SO₃H 및 4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-3'-SO₃H로부터 선택된 화학식을 가지며, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n이고, 여기서 n = 4-10이며 X는 H 또는 OH이다.

일 실시예에서, CM은 다음 화학식 XVIII 또는 XXIII을 갖는다:

상기 화학식 XVIII 및 화학식 XXIII에서, R¹은 C₆H₅(CH₂)_n-이고, 여기서 n = 5-11이다.

일 실시예에서, CM은 5-R¹-2-HO-C₆H₃CO₂H 및 R¹C(O)NHCH(C₆H₅)CO₂H로부터 선택된 화학식을 가지며, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n- 이고, 여기서 n = 4-10이다.

일 실시예에서, CM은 화학식 4-R¹C₆H₄PO₃H₂이고, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n-이고, 여기서 n = 4-10이다.

일 실시예에서, CI는 그룹들: 알칼리 금속 이온들(Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺, Cs⁺), 알칼리 토금속 이온들(Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Sr^{2 +}, Ba^{2 +}), 2가 전이금속 이온들(Mn^{2 +}, Zn²⁺) 및 NH₄ ⁺로부터 선택된 비-간섭 무기 양이온 또는 이러한 비-간섭 양이온들의 혼합물이고; 여기서 CI는, C₁-C₆　알킬 그룹들 및/또는 C₂-C₄　하이드록시알킬 그룹들을 포함할 수 있는 양자화된 1차 아민들(1+), 양자화된 2차 아민들(1+), 양자화된 3차 아민들(1+), 양자화된 디아민들(2+), 4차 암모늄 이온들(1+), 설포늄 이온들(1+), 설폭소늄 이온들(1+), 포스포늄 이온들(1+), 비스-4차 암모늄 이온들(2+)로부터 선택된 비-간섭 유기 양이온 또는 이러한 비-간섭 양이온들의 혼합물이다.

도 1a는, 본 발명의 예시적인 실시예들에 따라 치환 크로마토그래피 공정을 위한 상대적인 흡수 단위들(y-축)에 대한 시간(x-축)을 플로팅하는 미정제 합성 펩티드의 정제를 위한 치환 흔적이다.
도 1b는, 본 발명의 예시적인 실시예에 따르는 치환 크로마토그래피 공정을 위한 각각의 분획 속의 각각의 성분의 농도(㎍/㎖)에 대한 분획 수(x-축)를 플로팅하는 도 1a에 나타낸 치환 데이터의 분획 분석이다.
도 2a는, 본 발명의 예시적인 실시예에 따르는 치환 크로마토그래피 공정을 위한 상대 흡수 단위들(y-축)에 대한 시간(x-축)을 플로팅하는 미정제 합성 올리고뉴클레오타이드의 정제용 치환 흔적이다.

본원에서 사용된 바와 같은, "비-표면 활성"이라는 용어는, 본 발명에 따라 사용된 중성 비-표면 활성의 음이온 디스플레이서 화합물과 관련하여, 이와 같이 기술된 화합물이 본 발명에 따라 치환 크로마토그래피 공정에서 사용된 화합물의 농도보다 더 큰 중요한 미셀 농도("CMC")를 가짐을 의미한다. 일 실시예에서, 비-표면 활성 디스플레이서 화합물의 농도는, CMC에 영향을 미치게 되는 유기 용매, 염 또는 기타 제제의 부재하의 물 속의 화합물에 대하여 CMC의 약 80% 미만이다. 일 실시예에서, 비-표면 활성 디스플레이서 화합물의 농도는, CMC에 영향을 미치게 되는 유기 용매, 염 또는 기타 제제의 부재하의 물 속의 화합물에 대하여 CMC의 약 60% 미만이다. 일 실시예에서, 비-표면 활성 디스플레이서 화합물의 농도는, CMC에 영향을 미치게 되는 유기 용매, 염 또는 기타 제제의 부재하의 물 속의 화합물에 대하여 CMC의 약 50% 미만이다.

일 실시예에서, 본 발명에 따라 사용된 비-표면 활성의 소수성 양이온성 디스플레이서 분자를 포함하는 수성 조성물은 (1) 음이온 비-표면 활성 디스플레이서 화합물이 이의 CMC보다 낮은 농도에서 존재하는 것; (2) g의 값으로 나눈 각각의 [CM] 또는 [CM-R^*-CM']에 대하여 전체-소수성-지수(N)가 범위 10 ≤ N/g < 24에 속하는 것; (3) 각각의 R¹ 또는 R^1' 에 대한 그룹-소수성-지수(¹n)가 범위 4 <　¹n < 12 내에 속하고, 각각의 R², R^2', R³, R^3', R⁵, R^5'　및 R^*에 대한 그룹-소수성-지수(²n,　³n,　⁵n 및 ^*n)가, 존재하는 경우, 범위 0 ≤　²n,　³n,　⁵n, ^*n < 12 내에 속하며, 각각의 R⁴에 대한 그룹-소수성-지수(⁴n)가, 존재하는 경우, 범위 0 ≤　⁴n ≤ 5 내에 속하는 것; (4) 조성물이 약 5 부피% 이상의 유기 용매를 포함하는 것 중의 하나 또는 이들의 2개 이상의 조합으로 인하여 부정적인 표면 활성 특성들을 나타내지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, "저 유기 용매 함량"은, 예를 들면, 약 25 부피% 미만의, 본 발명에 따르는 비-표면 활성의 음이온 디스플레이서 화합물을 포함하는 수성 "캐리어" 조성물 중의 유기 용매 함량을 일반적으로 나타낸다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물의 유기 용매 함량은 약 20부피% 미만의 어떠한 유기 용매를 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물의 유기 용매 함량은 약 15부피% 미만의 어떠한 유기 용매를 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물의 유기 용매 함량은 약 10부피% 미만의 어떠한 유기 용매를 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물의 유기 용매 함량은 약 5부피% 미만의 어떠한 유기 용매를 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물은 유기 용매를 포함하지 않는다.

일 실시예에서, 유기 용매는 메탄올(CH₃OH 또는 MeOH), 에탄올(C₂H₅OH 또는 EtOH) 또는 아세토니트릴(CH₃CN 또는 MeCN) 중의 하나 또는 이들 2개 이상의 혼합물이다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물은 적합한 유기 용매들의 혼합물을 포함한다. 일 실시예에서, 수성 "캐리어" 조성물은 유기 용매를 포함하지 않는다.

소수성 치환 크로마토그래피는 키랄 분석물들, 키랄 디스플레이서들 및 키랄 크로마토그래피 매트릭스들을 사용하여 수행할 수 있다. 이들 조건들하에서, 아키랄 디스플레이서를 사용할 수 있지만, 키랄 디스플레이서의 라세믹 혼합물은 사용할 수 없다. 라세믹 키랄 분석물들은 또한 아키랄 크로마토그래피 컬럼 및 아키랄 디스플레이서를 사용하여 정제할 수 있다. 이 경우, 부분입체이성체들을 포함하는 불순물들은 목적하는 라세믹 화합물로부터 제거하지만, 거울상이성체들의 키랄 분해는 존재하지 않는다.

음이온 디스플레이서는 하나 이상의 키랄 중심들을 함유할 수있다: 예를 들면, 키랄 디스플레이서 화합물들(689) 및(698)을 참조한다(참조: 하기 표 XIII). 디스플레이서들(613) 및(639)는 아키랄인 디스플레이서들 화합물을 나타낸다. 키랄 크로마토그래피 매트릭스의 적절한 선택으로, 이동 상 및 아키랄 디스플레이서, 거울상이성체들이 제조 규모로서 통상적으로 분해(분리)된다. 특수 상황들에 따라서, 우수하고, 거울상이성체적으로 순수한, 키랄 디스플레이서는 키랄 정지 상에서 거울상이성체들의 치환 분리를 수행하는 경우 우수한 아키랄 디스플레이서를 능가하는 수행 이점들을 가질 수 있다.

유용한 pH 범위 - 화학식 A 또는 B를 갖는 음이온 소수성 디스플레이서들의 각종 부류들은 하전된 잔기들의 화학적 특성에 좌우되어 상이한 유용한 pH 범위들을 갖는다. 양자화 가능한 음이온 그룹들을 포함하는 음이온 소수성 디스플레이서들은 실제 pKa 값들 이상의 pH 1-2 단위들 이상에서 작동해야 한다.

· 설포네이트 - 일반적으로, 지방족 설포네이트들(pKa~ -1.9) 및 방향족 설포네이트들(pKa~ -2.7)은, 이들의 매우 낮은 pka 값들로 인하여, 광범위하게 유용한 pH 범위, 1 내지 11을 갖는다.

· 카르복시레이트 - 일반적으로, 단순한 지방족 카르복시레이트들(pKa~4.7), N-아실-α-페닐글리시네이트들, pKa~3.0), 방향족 카르복시레이트들(벤조에이트들, pKa~4.2) 및 살리실레이트들(오르토-OH 벤조에이트들, pKa~3.0)은 각각 6.7 내지 10, 5.0 내지 10, 6.2 내지 10 및 5.0 내지 10의 유용한 pH를 갖는다. 이들의 완전하게 탈양자화된 형태들에서 조차, 일부 카르복시레이트 디스플레이서들은 용해도 제한들을 갖는다.

· 포스포네이트 - 포스포네이트들은 유용한 음이온 디스플레이서들이지만, 이들의 용도는 제 2의 산 해리(pK_a2)에 의해 복잡해질 수 있다. pH를 조절하여 디스플레이서가 대부분(>90%) 이의 제 1형 또는 대부분(>90%) 이의 제 2형이 되도록 함으로써, DC에서 우수한 크로마토그래피 분리를 수득하도록 해야한다. 일반적으로, 단순한 지방족 포스포네이트들(pKa~2.2, 7.7)은 4.2 내지 6.7(1-) 및 8.7 내지 10(2-)의 유용한 pH 범위들을 갖는 반면, 단순한 방향족 포스포네이트들(pKa~2.0, 7.2)은 4.0 내지 6.2(1-) 및 8.2 내지 10(2-)의 유용한 pH 범위들을 갖는다. 적절하게 위치한 치환체들은 편리하게는 방향족 포스폰산들의 pKa 값들을 이동시키고 이들의 유용한 pH 범위들을 이동시킨다. 예를 들면, 방향족 인산들내 -PO₃H₂에 대해 오르토인 OCH₃ 그룹은 pK_a2 값(2.3, 7.9)을 증가시키는 반면, 메타 -NO₂ 그룹(pKa~1.5, 6.4) 또는 오르토 -OH 그룹(pKa~2.0, 6.4)은 pK_a2　값을 감소시킨다.

· 테트라아릴보레이트 - 일반적으로, 이들 분자들은, 하기 범위를 벗어나는 가수분해 불안정성을 갖는 문제들로 인하여, 중성 pH 범위(6 내지 8)로 제한된다. 일부 테트라아릴보레이트들은 용해도 제한들을 가지며 단지 협소한 범위의 양이온성 이온 쌍 형성제와 함께 사용될 수 있다.

· 아릴보레이트 - 대부분의 디스플레이서 적용들의 경우, 통상의 아릴보론산들의 pKa 값들(pKa~8.9)은 너무 높아서 중성의 pH 범위에서 유용하다. 메타-NO₂(pKa~7.4) 또는 메타-Cl(pKa~8.1)과 같은 전자-구인성 그룹들을 지닌 경우에도, pKa 값은 여전히 높다. 그러나, 특정의 폴리올들의 첨가에 의한 보로네이트 에스테르들의 형성은, 특정 경우들에서 pKa 값들이 2.0 내지 2.5pKa 단위들까지 낮은 조성물을 초래한다. 폴리올 분자의 화학적 특성은 또한 생성되는 보로네이트 에스테르 디스플레이서의 소수성 및 가용성에 영향을 미친다. 유용한 폴리올들은 프럭토즈, 리보즈, 소르비톨, 만니톨, 시스-1,2-디하이드록시사이클로펜탄 및 시스-3,4-디하이드록시테트라하이드로푸란이며, 이들은 pH 범위 7.1 내지 10.0에서 유용한 디스플레이서들이다. 대표적인 폴리올 농도(mM)는 디스플레이서의 농도의 약 2배이거나 디스플레이서의 농도보다 25mM 더 높고, 어느 경우에든 더 높다.

디스플레이서 결합 강도 - 디스플레이서는 컬럼에 샘플의 성분들 모두보다 더 강하게 또는 목적하는 주 성분들 모두보다 적어도 더 강하게 결합해야 한다. 양호한 경험칙은, 1 내지 4% 이하의 샘플 질량이 디스플레이서보다 더 강하게 결합해야 한다는 것이다.

최적의 디스플레이서는 정지 상에 너무 강하거나 너무 약하게 결합하지 않아야 한다. 적절한 결합 강도는 목적하는 분석물 및 연합된 결합-등온선들에 좌우된다. 대개, 특정한 범위의 결합 강도들을 갖는 디스플레이서들의 범위는 정제되는 각종의 상이한 컬럼들 및 분석물들에 대하여 필요하다. 디스플레이서가 너무 강하게 결합하면, 저 분해능, 저 분석물 결합 용량, 디스플레이서 제거 시 곤란성 및 긴-사이클 시간들과 같은 불량한 성능이 수득된다. 디스플레이서가 너무 약하게 결합하면, 불량한 치환 트레인이 디스플레이서 하부의 치환된 분석물들의 너무 많은 "테일링(tailing)"과 함께 수득될 수 있거나, 단지 부분 치환만이 있거나 치환이 전혀 없을 수 있다.

적절한 결합 강도를 갖는 디스플레이서들을 선택하는 데 도움을 주는 편리한 경험칙은, 치환 실험에서 사용될 유사한 컬럼들 및 이동 상들을 이용하여 잠재적인 디스플레이서들 및 분석물들의 간단한 구배 용리 크로마토그래피를 수행하는 것이다. 제 1 스크린으로서, 디스플레이서는 60분 구배에서의 목적하는 분석물보다 5 내지 15분 더 늦게 용리하여야 한다. 이상적으로, 당업자는 단일 분석물들 및 분석물들의 혼합물의 등온선들을 측정하게 되었지만 이는 시간 소모적이며 종종 비실용적이다. 이는 결합-등온선에서 조기에 작동하기 때문에, 이러한 경험칙은 완벽하지 않지만, 추가의 DC 최적화를 위한 편리한 출발점을 제공한다.

이용 가능한 결합 등온선 - 적절한 결합 강도와는 별도로, 유용한 소수성 디스플레이서들은 특정한 다른 유용한 특성들과 함께 결합 등온선들을 가질 필요가 있다.

(1) 디스플레이서 및 분석물 분자들을 위한 단정의(monomodal) 볼록 상향 등온선들(랑뮈르-형 등온선 거동; Langmuir-type isotherm behavior)은 이소택틱 치환 트레인들을 정돈되게 형성하는 것을 촉진시키며 방법 최적화 공정을 단순화시킨다. 이는 방향족 알콜들(예: 치환된 페놀들, 나프톨들, 하이드록시비페닐들)과 같은 많은 다른 하전되지 않은 소수성 디스플레이서 분자들(비-쯔비터이온들)의 결합-등온선들과 대조적으로 많은 양이온성 디스플레이서 분자들의 유용한 특성이고, 지방 알콜들(예: 1-도데칸올, 1,2-도데칸디올) 및 하전되지 않은 지방 카복실산들(예: 미리스트산)은 저농도들에서 정상적으로 거동한 다음 바이모달(bimodal)이 되며 다시 고농도들에서 일어난다(BET-형 등온선 거동). 이러한 결합 거동은 종종 소수성 디스플레이서의 다중 층들의 부착으로부터 발생하며, 여기서 각각의 층은 상이한 결합 특성들을 갖는다. 이러한 결합 거동은 치환 공정 및 이의 유용한 이행을 상당히 복잡하게 만든다.

(2) DC에서의 크로마토그래피적 결과들은 또한, 디스플레이서 분자들이 용액중에서 자체-연합을 수행하는 경우 복잡해진다. 농도들이 증가함에 따라, 디스플레이서 자체-연합과 관련된 문제점들은 악화된다. 다시, 양이온성 소수성 디스플레이서들 내의 하전된 그룹들은 수용액에서 자체-연합의 문제점들을 억제한다.

(3) 추가의 복잡한 문제점들은 또한, 생성물 및/또는 불순물 등온선들이 높은 비-선형 결합 영역에서 디스플레이서 등온선을 교차할 때 발생할 수 있다. 이러한 거동은 치환 순서의 역전, 치환 밴드들 사이의 중첩 영역들의 확장 및 공동-치환을 갖는 문제점들을 야기한다. 이러한 경우, 디스플레이서 농도에서의 작은 변화들은 치환 트레인에서의 큰 변화들을 야기해서 방법 최적화를 매우 어렵게 만들 수 있다.

본 발명자들은, 적절한 반대-이온들 및 필요한 경우, 소량의 유용한 유기 용매들로 보충된 적절하게 고안된 양이온성 디스플레이서 분자들이 랑뮈르-형 결합 거동 및 유용한 범위들의 결합 강도들의 군을 제공함을 밝혀내었다.

음이온 디스플레이서용 이온 쌍 형성 양이온 - 이들의 많은 이점으로 인하여, 음이온 소수성 디스플레이서 분자들은 한 가지 여분의 요건: 적절한 이온 쌍 형성 양이온, CI를 갖는다. 양이온은 디스플레이서의 결합-등온선 및 디스플레이서의 작용 및 유용성에 상당한 영향을 미친다. 양이온의 농도는, 적절한 양의 이온 쌍 형성 양이온의 CI^-/ HCO₂ ^-　염을 가함으로써 독립적으로 조절한다. 하전된 소수성 디스플레이서에 대한 이온 쌍 형성 양이온의 특성은 이의 치환 특성에 강하게 영향을 미친다. 몇몇 양이온은 용액에서 이온 쌍 형성에 관여되고, 모든 양이온은 소수성 크로마토그래피 매트릭스 상의 흡수 상태에서 이온 쌍 형성에 관여된다. 또한, 양이온은 분석물(예를 들면, pH=7에서 음이온 올리고뉴클레오타이드)과의 이온 쌍 형성에 포함될 수 있다. 디스플레이서 및 분석물에 대한 동일한 이온 쌍 형성 양이온이 양호한 크로마토그래피적 분해를 위해 사용되어야 한다. 유용한 이온 쌍 형성 양이온들은 일반적으로 단일 하전된다. 이들의 고 용매화 에너지들로 인하여, 2가 이온들(Ca^{2 +}) 및 3가 이온들(La^{3 +})이 일반적으로 덜 유용하지만 일부 전문화된 경우들에서 사용될 수 있다. 이러한 일반적인 법칙에 대한 예외들은 Me₃N⁺(CH₂)₄N⁺Me₃와 같은 단일 유기 이온에서 분리된 다수의 단일 하전된 잔기들이다.

더 큰 소수성 특성을 갖는 이온 쌍 형성 양이온들은 결합강도를 증가시키고 또한 용해도를 감소시키는 경향이 있다. 더욱이, 소수성 디스플레이서들을 사용하는 경우, DC의 분해능은, 양이온 자체가 너무 소수성이거나 너무 친수성인 경우 감소할 수 있다. 전형적으로, 양이온의 중간 소수성/친수성 특성은 최고의 결과들을 제공하지만, 이는 정제되는 분자에 따라 변한다. 각각의 정제를 위한 최적의 이온 쌍 형성 양이온은 실험적으로 측정하여야 한다. 휘발성 이온 쌍 형성제들은 감압하에서 편리하게 제거되지만, 비휘발성의 것들은 디아필트레이션(diafiltration), 침전 또는 결정화와 같은 다른 수단으로 용이하게 제거한다. 표 I은 유용한 1가 이온 쌍 형성 양이온들의 부분 목록을 제공한다. 양자화된 아민(pKa~9.8-11.0), 양자화된 아미딘(pKa~12.5) 또는 양자화된 구아니딘(pKa~13.5)을 사용하는 경우, 작동 pH는 각각의 아민의 pKa 이하의 2개 이상의 pH 단위들이어야 한다.

[표 I]

적절한 차수의 증가하는 이온 쌍 형성 강도에 있어서 1가 양이온

RP 매트릭스에 대한 음이온 분석물의 추정되는 암모늄-이온-쌍- 보조된 결합

· 소수성 및 향상된 결합은 지방족 탄소 원자의 수와 함께 증가한다.

· 동일한 수의 지방족 탄소 원자의 경우, 주요 암모늄 그룹들은 4차 암모늄 그룹들보다 더 우수하게 분석물 결합을 향상시킨다.

(ⁿ부틸-NH₃ ⁺ > Et₂NH₂ ⁺ > EtMe₂NH^- > Me₄N⁺)

· 동일한 수의 지방족 탄소 원자의 경우, 선형 그룹들은 측쇄 그룹들보다 더 우수하게 분석물 결합을 향상시킨다("ⁿ부틸 > ⁱ부틸).

· 동일한 수의 지방족 탄소 원자의 경우, 선형 그룹들은 사이클릭 그룹들보다 더 우수하게 분석물 결합을 향상시켰다("ⁿ펜틸 > 사이클로펜틸).

· 특정의 화학 잔기들의 경우, 암모늄 이온들과 일부 분석물들 사이의 수소 결합은 분석물 결합; 예를 들면, 주요 암모늄 대 포스페이트 디에스테르들(올리고뉴클레오타이드들) 및 구아니디늄 대 카르복시레이트들(Asp- 및 Glu-함유 펩티드들)을 향상시킨다.

혼합된 이온 쌍 형성 양이온들은 흔히 크로마토그래피적 분배능의 손실을 초래하므로 일반적으로 피한다. 그러나, 혼합된 양이온들이 사용되는 경우; 즉,(a) 목적한 양이온이 존재하는 다른 반대-이온들보다 유의적으로 더 강한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 경우 및(b) 목적한 양이온이 샘플 로딩 혼합물 속에서 및 디스플레이서 완충제 속에서 화학량론적 과량으로 존재하는 경우 둘 다에서 조건들 중 하나의 세트가 존재한다.

이온 쌍 형성 반대-이온들의 잠재적으로 시간 소모적인 스크리닝을 단순화시키기 위해, 다음의 추천들을 이온 쌍 형성 양이온들을 위한 초기 출발점으로 제공한다:

· 펩티드들 및 작은 펩티드들(pH=6.0-9.0): Me₄N⁺, Me₃NH⁺, Me₃NE⁺, Me₂EtNH⁺

· 올리고뉴클레오타이드(pH=6.5-8.0):　ⁿ부틸-NH₃ ⁺,　ⁿ펜틸-NH₃ ⁺,ⁿ헥실-NH₃ ⁺

· DMT-온 올리고뉴클레오타이드(pH=7.0-8.0): EtNH₃ ⁺, Et₃NH⁺

많은 유용한 아민들 또는 아민 염들이 HPLC-등급의 순도에서 이용할 수 없기 때문에, 유용한 형태는 화학적으로 더 안정하고 반복된 재결정화에 의해 용이하게 정제되는 이들의 양자화된 암모늄 염들이다. 적합한 아민들의 하이드로포스페이트(2-), 모노메틸포스페이트(2-), 포스포네이트(2-, aka 포스파이트), 메틸포스포네이트(2-) 및 에틸포스포네이트(2-) 염들을 음이온 디스플레이서들과 함께 사용할 수 있다:

[MeNH₃ ⁺]₂[HOPO₃ ^{2 -}], [Me₃NH⁺]₂[HOP0₃ ^{2 -}], [ⁿBuNH₃ ⁺]₂[HOPO₃ ^{2 -}], [ⁿC₆H₁₃NH₃ ⁺]₂[HOPO₃ ^2-], [MeNH₃ ⁺]₂[EtPO₃ ^{2 -}], [Me₃NH⁺]₂[EtP0₃ ^{2 -}], [ⁿBuNH₃ ⁺]₂[EtP0₃ ^{2 -}], [ⁿC₆H₁₃NH₃ ⁺]₂[EtP0₃ ^{2 -}].

용해도 - "소수성 크로마토그래피" 또는 보다 적합하게는, "소용매 크로마토그래피(solvophobic chromatography)"에서, 주요한 용매 성분이 물인 경우, 잠재적 소수성 디스플레이서 분자들은 종종 제한된 용해도를 갖는다. 소수성 분자들은, 소수성 분자, 예를 들면, 하전된 이온-그룹들, 친수성 반대-이온들, 극성 그룹들 또는 수소-결합 공여체들 또는, 수용체들로서 작용하는 그룹들에 부착된 "친수성 그룹들"이 존재하지 않는 한 어떠한 인지할만한 정도로 대개 물 속에서 용해되지 않는다. 방향족 분자들은, pi-전자들이 약한 수소-결합 수용체들로서 작용하는 독특한 방식으로 인하여 독특한 방식으로 물과 상호작용한다. 더욱이, 방향족 분자들은 수용액에서 면-대-면 pi-적층에 관여할 수 있다. 이들 작지만 중요한 효과들은, 사이클로헥산(~10 μM) 및 트랜스-데칼린(<1 μM)과 비교하여 벤젠(9 mM) 및 나트탈렌(200 μM) 의 물 속에서 높은 용해도에서 반영되며, 하이드록실화되지 않은 아렌들과 비교하여 페놀(960 mM) 및 β-나프톨(7 mM)의 높은 용해도에서 반영된다. 유용한 디스플레이서 분자의 분자 구조는 물 속에서 또는 저 유기물 함량을 갖는 물 속에서 합리적인 용해도(10-50 mM)를 가능하게 하여야 하지만 동시에 충분히 소수성이어서 정지 상에 강하게 결합해야 한다. 일반적으로, 하전된 디스플레이서 분자들은 충전된 종들(species), 특히 반대-이온들의 증가된 용매화 에너지들로 인하여 중성의 것들보다 더 양호한 용해도 특성들을 갖는다. 이는 음이온 분자들에 대한 물리적 및 화학적 특성들의 독특한 균형을 필요로 하여 양호한 디스플레이서들로서 거동한다.

일반적으로 말해서, 불량한 디스플레이서 용해도를 보상하기 위하여 유기 용매의 수준들을 증가시키는 것은 좀처럼 유용한 결과들을 생성하지 않는다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 0 내지 25% 유기 용매 또는 보다 바람직하게는 2 내지 15% 유기 용매를 사용하여 최적의 크로마토그래피적 결과들을 수득한다. 이동 상의 높은 유기물 함량(25-75%)을 일부 경우들에 사용할 수 있지만 대개 용량 및 분해능은 종종 더 나빠진다.

감소된 생성물-디스플레이서 연합 - 소수성 치환 크로마토그래피와 관련된 한 가지 문제점은 용액 중에서의 소수성 디스플레이서와 소수성 분석물의 가능한 연합이다. 이는 분해능 및 오염의 상당한 손실을 야기할 수 있다. 정지 상에서의 흡수된 상태의 디스플레이서-분석물 연합이 또한 일어날 수 있지만 존재하는 적합한 양들의 이온 쌍 형성제들을 사용하는 경우 덜 문제가 된다. 이러한 문제를 취급하는 양호한 방법은 충전된 분석물들 및 충전된 소수성 디스플레이서들을 동일한 전하로 사용하는 것이다. 이러한 문제점들은, 중성 소수성 디스플레이서들 및 중성 소수성 분석물들이 상호작용하는 경우 더 빈번하게 종종 발생한다.

디스플레이서 자체-연합 및 미셀 형성 - 화학 구조 및 물리적 특성들이 전도성인 일부 경우들에서, 음이온 소수성 분자들은 자체-연합성이어서, 용액 중에서 미셀들 및 미세-형 자체-연합된 구조들을 형성할 수 있다. 이러한 상황은 디스플레이서 용액들의 원하지 않는 발포 뿐만 아니라 DC에서의 용해도의 손실도 일으킬 수 있다. 용액 중의 디스플레이서는 각종 화학 평형들에 의해 상호관련되는 각종 형태들로 자체로 발견된다. 더욱이, 미셀들은 소수성 분석물 분자들에 대한 캐리어들로서 작용하여 이들이 각종 형태들로 용액중에 존재하도록 할 수 있다. 이러한 원하지 않는 현상은 농도 의존성이며 메탄올, 에탄올 또는 아세토니트릴과 같은 소량의 적합한 유기 용매를 첨가하여 효과적으로 억제한다. 적합하게 설계된, 음이온 디스플레이서 분자들은 미셀 형성을 증진시키지 않고 더 양호한 치환 결과들을 제공한다. 따라서, R-그룹들, R¹-R³에 대하여 그룹-소수성 지수들을 12.0 이하로 유지시키면, 원하지 않는 세정성의 문제점을 감소시킨다.

고순도 - 디스플레이서 중의 불순물 - 디스플레이서는 적합한 순도를 가져야 한다. 제조적 크로마토그래피의 목적은 목적하는 성분으로부터 불순물을 제거하는 것이다. 디스플레이서 자체에 의한 바람직한 화합물의 오염은 거의 문제가 되지 않지만, 디스플레이서 용액 중의 "조기 치환(early displacing)" 불순물들에 의한 오염은 일부 경우들에서 불순물들의 양들 및 이들의 결합 특성들에 따라 문제가 될 수 있다. 따라서, 양호한 디스플레이서는 조기 치환 불순물을 거의 함유하지 않거나 전혀 함유하지 않야야 한다.

적합한 UV 흡광도 - DC 실험 전반에 걸쳐 디스플레이서의 위치와 양들을 추적하기 위하여, 디스플레이서 관통 곡선들을 관찰하기 위하여 및 컬럼 재생 과정들 동안에 디스플레이서 제거를 따르기 위하여, 적절한 자외선 흡수를 갖는 디스플레이서를 갖는 것이 유용하다. 고 흡수성은 디스플레이서 및 분석물의 고 농도들로 인하여 필요하지 않거나 바람직하지 않다. 일반적으로, 저 흡수성의 전략적으로 위치된 윈도우(window)들을 갖는 UV 스펙트럼을 가져서 분석물들이 일부 주기들에서 따를 수 있고 디스플레이서가 다른 주기들에서 모니터링되는 무색 디스플레이서들이 바람직하다.

제조의 용이성 및 비용 - 화학 합성, 생산 및 제조의 편리하고 비용-효과적인 방법들은 유용한 디스플레이서들 및 합리적인 비용들을 생성하기 위해 중요하다. 더욱이, 정제, 특히 비-크로마토그래피적 정제의 실제적인 방법들은 비용-효과적인 방법으로 순도 요건들을 성취하기 위해 필요하다.

화학적 안정성, 저독성 및 긴 저장 수명 - 이의 모든 다른 목적하는 화학적 및 물리적 특성들 중에서, 유용한 디스플레이서 분자는 화학적으로 안정해야 한다. 이는 분석물 분자들에 대하여 불활성이어야 하고 물, 일반 유기 용매들, 약 염기들, 약산들 및 산소(공기)에 대하여 화학적으로 안정(비반응성)해야 한다. 이는 전형적인 사용 및 저장 조건들 하에서 광-안정성 및 열 안정성이어야 하며 이상적인 저장 수명을 지녀야 한다. 디스플레이서 분자들은 육안으로 무색이지만 필수적인 수준들의 UV 흡광도를 갖는 것이 매우 바람직하다. 염료들은 일반적으로 DC에서 유용한 디스플레이서들을 제조하지 않는다. 유용한 디스플레이서 분자들은 또한 저 독성을 가질 필요가 있고, 디스플레이서와 접촉하게 될 수 있는 생물학적 및 약물 샘플들도 보호할 필요가 있을 뿐만 아니라 작업자들도 보호할 필요가 있다.

적합한 크로마토그래피적 컬럼: 가장 일반적인 유형의 역-상 컬럼은 옥타데실 피복된 실리카이지만, 많은 소수성 정지 상들은 DC에서의 유용성을 발견한다. 적합한 정지 상들의 예들은 표 II에 나타낸다. 궁극적으로, 정지 상의 최고의 선택은 연구중에 있는 각각의 시스템에 대해 실험적으로 측정한다.

[표 II]

소수성 정지 상을 위한 물질

● 피복된 다공성 실리카(공유 결합된 실란)

· 옥타데실(C18) · 도세실(C12)

· 옥틸(C₈)　 · 헥실(C₆)

· 부틸(C₄)　 · 펜타플루오로페닐프로필(C₆F₅-C₃)

· 페닐프로필(Ph-C₃)　 · 페닐헥실(Ph-C₆)

· p-비페닐(Ph-Ph)　 · β-나프틸에틸(Nap-C₂)

● 피복되지 않은 다공성 폴리스티렌/디비닐벤젠

● 다공성 플루오로카본 중합체

● 다공성 폴리옥타데실메타크릴레이트 중합체

● 탄소-유사 상:

· 다공성 흑연화 탄소

· 세정된 목탄

· 다공성 지르코니아 위의 탄소

· 다공성 지르코니아 위의 탄소에 결합된 C₁₈

● 무기 산화물 위의 유기 중합체 코팅

● 혼합된-방식의 소수성 상

· 음성 표면 전하를 갖는 C₁₈

· 양성 표면 전하를 갖는 C₁₈

· 묻힌 음성 전하를 갖는 C₁₈

· 묻힌 양성 전하를 갖는 C₁₈

치환 크로마토그래피에서 우수한 결과들이 보다 우수한 회수 및 수율을 제공한 보다 길고, 잘-팩킹된 컬럼을 사용하여 수득되다. 표 III은 컬럼 면적 및 초기 유속들의 초기 선택들을 위한 안내를 제공한다.

[표 III]

크로마토그래피 컬럼 치수

a) 500 mm 또는 2 x 250 mm b) 초기 유속 = 75 cm/hr(12.5 mm/min); 최적화될 필요가 있음.

적절한 컬럼 길이는 양호한 결과들을 위해 중요하다. 치환 트레인을 완전히 날카롭게 하고 양호한 분해능을 제공하기 위해서는 충분히 길어야 한다. 그러나, 너무 긴 컬럼들은 분리 시간을 불필요하게 증가시키고 종종 불량하게 팩킹된 베드(bed)들 및 감소된 분해능을 생성한다. 많은 경우들에서, 2개의 잘 팩킹된 컬럼들은 양호한 크로마토그래피적 결과들로 말단-대-말단 부착될 수 있다. 작은 분자들(MW <3KDa)을 사용한 상당한 실험은, 최적 컬럼 길이가 5 ㎛ 입자들에 대해 15-45 cm의 범위 있고 10 ㎛ 입자들에 대해 20-60 cm에 있음을 나타낸다. 공극 크기들이 80-100 Å인 다공성 입자들은 전통적인 약물들 및 작은 펩티드들을 위해 적합하고, 중간 및 대형 올리고펩티드들 및 올리고뉴클레오타이들에 대해서는 120-150 Å이 적합하며, 대부분의 단백질들 및 DNA에 대해서는 300-500 Å이 적합하다. 비-다공성 입자들이 사용될 수 있지만, 로딩 용량은 상당히 감소할 것이다.

원통형 컬럼에서, 평면 유동-프런트(planar flow-front)가 설정되어 이것이 유동 축에 수직이되는 것이 중요하다. 다량의 샘플을 정제하기 위해 규모를 키우는 것은, 일단 최적화된 프로토콜이 작은 컬럼에서 개발되면 치환 크로마토그래피에서 간단하고 용이해진다. 가장 짧은 허용되는 컬럼 길이가 발견된 후에, 규모를 키우는 것은 일정한 선형 유속를 유지시키면서 컬럼 직경을 증가시켜서 간단히 성취한다. 적합한 수정들을 가하여, 치환 크로마토그래피는 방사상-유동 컬럼들 및 축방향-유동 모놀리쓰 컬럼들(axial-flow monolith columns)로 사용할 수 있다. 치환 크로마토그래피의 원리들은 또한 분석적 및 제조적 박층 크로마토그래피에서 적용할 수 있다.

성공적인 치환 크로마토그래피 장치들의 수행

유기 화합물, 전통적인 약물들 및 펩티드들의 치환 크로마토그래피는 오래 동안 동안에 수행되어 왔지만, 보통(medicre) 내지 불량한 결과들이 종종 수득된다. 양호한 디스플레이서들, 양호한 컬럼들 및 양호한 작동 프로토콜들은 우수한 재현가능성 및 현저히 양호한 크로마토그래피적 성능을 생성하다.

디스플레이서 및 농도 - 초기 평가는 적절한 결합 강도를 갖는 양호한 일반적인 목적의 양이온성 디스플레이서를 사용하여 수행한다. 작동 pH에서, 음이온 분석물 분자들은 음이온 디스플레이서를 필요로 한다. 작동 pH에서, 음이온 디스플레이서들을 사용하여 음이온 및 중성 분석물을 정제할 수 있다. 디스플레이서는 정제되는 물질보다 더 강하게 컬럼에 결합해야 하지만, 디스플레이서는 너무 강하게 결합하지 않아야 한다. 전형적인 디스플레이서 농도들은 10-50 mM의 범위에 있다. 초기에, 디스플레이서 농도는 10-15 mM에서 설정된다. 필요에 따라, pH 완충제 및 이온 쌍 형성제가 디스플레이서 용액에 가해진다. 디스플레이서 용액 및 캐리어 용액은, 디스플레이서의 존재 및 이온 쌍 형성염의 농도를 제외하고, 동일한 조성(pH 포함)을 가져야 한다. 디스플레이서들(579, 609 및 634)(하기 표 V-XIII 참조)은 양호한 일반적인 목적의 음이온 디스플레이서이다. 방법 최적화 동안에, 디스플레이서 농도를 20-30 mM 이상으로 증가시키는 것이 도움이 될 수 있다.

이온 쌍 형성제 선택 - 표 I은, 소수성 크로마토그래피에 유용한, 유용한 1가 이온 쌍 형성 양이온(CI)의 목록을 포함한다. 이들은, 디스플레이서 또는 분석물이 하전되는 경우 필요하다. 음이온 분석물과 디스플레이서에 있어서, 결합-등온선은 반대-이온 및 이의 농도의 화학적 특성들에 강하게 좌우된다. 중간 내지 중간 정도로 강한 결합 특성들을 갖는 이들 이온 쌍 형성 양이온들은 대개 사용하기에 가장 좋다. 초기 실험들 동안에 트리메틸암모늄 포르메이트 또는 포스페이트를 사용하여 시작한다. 분석물이 이온 쌍 형성제를 필요로 하는 경우, 이는 대개 DC 실험 동안에 이온 쌍 형성제의 선택을 나타낸다. 분석물 및 디스플레이서에 대한 이온 쌍 형성제는 동일해야 한다.

이온 쌍 형성제의 농도 - 앞에서 언급한 바와 같이, 불충분한 수준들의 양호한 이온 쌍 형성제를 사용하는 것은 치환 크로마토그래피 실험들에서 불량한 크로마토그래피적 성능의 주요한 원인들 중의 하나이다. 샘플 용액 중의 이온 쌍 형성제의 적합한 농도(C_IPS, mM))를 계산하는 식은 다음 식으로 제공된다:

C_IPS = E_S x C_S(mM) x G_S

상기 식에서, E_S는 샘플에 대한 초과 인자이고, C_s는 샘플의 농도(mM)이며, G_s는 작동적 pH에서 샘플의 순 전하의 절대값이다. E_S의 최적 값은 실험적으로 측정하는 데 필요한 파라미터이다. 디스플레이서 용액 중의 이온 쌍 형성제의 적합한 농도(C_IPD, mM)를 계산하기 위한 식은 다음 식으로 제공된다:

C_IPD = E_d　x C_d(mM) x G_d

상기 식에서, E_d는 디스플레이서의 초과 인자이고, C_d는 디스플레이서의 농도(mM)이며, G_d는 작동적 pH에서 디스플레이서의 순 전하의 절대값이다. E_d의 최적 값은 실험적으로 측정할 필요가 있는 파라미터이다. 적어도 화학양론적 양의 이온 쌍 형성제가 용액들 중에 존재하는 것이 필수적이다(E_S　≥ 1.0 및 E_d ≥ 1.0). 실시시, 본 발명자들의 경험상, E_S는 범위 1.1-10.0, 보다 바람직하게는 범위 1.2-6.0, 여전히 보다 바람직하게는 1.5-4.5 내에 있어야 한다. 더욱이, 본 발명자들의 경험상, E_d는 범위 1.1-10.0, 보다 바람직하게는 범위 1.2-4.0 내에 있어야 한다. 크로마토그래피적 성능에서 심각한 열화(deterioration)는, 이온 쌍 형성 농도가 최적화되지 않거나 너무 낮은 경우, 즉 E_S　< 1.0 및/또는 E_d　< 1.0인 경우에 수득된다.

RP 컬럼의 선택 - 초기의 역-상 작업을 위해, 실리카 위의 수개의 양호한 품질의 옥타데실 또는 실리카 컬럼들 위의 페닐헥실을 평가해야 한다(치수들이 4.6 x 250 mm인 5㎛ 구형 입자들). 더 큰 제조적 컬럼들로 규모를 키우는 것은 이후에 수행할 수 있으며 비교적 간단하다. 중요한 주제는 적합한 기공 크기를 선택하는 것이다. 너무 크거나 너무 작은 기공들을 갖는 매트릭스들은 종종 감소된 용량을 유발하며 때때로 감소된 분해능을 유발한다. 상기한 표들 II 및 III을 참조한다.

유속 - 치환 크로마토그래피는 "쿼시-평형 기술(quasi-equilibrium technique)"이기 때문에, 비교적 느린 유속들이 종종 필요하다. 최적 유속는 분해능을 잃지 않고 가능한 가장 빠른 유속이다. 샘플 로딩 유속 및 치환 유속는, 둘 다 35-105 cm/hr의 범위로 대략 동일해야 한다. 통상적인 약물들, 올리고펩티드들 및 올리고뉴클레오타이드들에 있어서 75 cm/hr에서 시작하고 단백질들 및 DNA에 있어서는 40 cm/hr에서 시작한다. 재생 유속들은 치환 유속의 2 내지 8배이어야 한다. 약물들, 펩티드들 및 올리고뉴클레오타이드들을 역-상 컬럼들 상에서 승온들에서 정제하는 경우, 더 빠른 유속들이 사용될 수 있다.

온도 - 역-상 크로마토그래피 및 기타 형태들의 소수성 크로마토그래피는 △H를 갖는 +T△S에 의해 주로 구동되기 때문에, 고온은 종종 더 강한 결합, 더 빠른 결합 역학 및 분명히 상이한 분해능을 생성한다. 결과적으로, 컬럼의 온도 및, 어느 정도는, 치환 완충제들은 주의깊게 조절(+/- 0.5 ℃)하여 밴드 확장을 방지하여야 한다. 초기 작업은 종종 25℃에서 수행한 다음, 승온들(45, 65℃)은, 샘플이 이를 견딜 경우 시도하며, 유기 용매의 비점은 적합하다.

유기 용매의 선택 - 대부분의 수-혼화성 유기 용매들이 작용할 것이지만, 아세토니트릴, 메탄올 및 에탄올이 가장 일반적으로 사용된다. 일부 DC 정제들은 약간의 유기 용매를 사용하거나 유기 용매를 전혀 사용하지 않고 수행한다. 이는 변성되지 않은 단백질들의 실질적인 RPC 및 HIC 정제를 저 염 및 저 유기 용매로 허용한다. 유기 용매를 사용하지 않은 작동은 또한, 휘발성, 난연성 용매들과 연관된 안정성 문제들이 존재하는 경우 도움이 될 수도 있다. 실험하는 경우, 먼저 펩티드들에 대한 아세토니트릴, 대형 단백질들 올리고뉴클레오타이드들 및 DNA에 대한 저분자량 유기 약물들 및 작은 단백질들 또는 메탄올을 시도한다. 물 속의 이러한 샘플의 용해도가 허용가능한 경우, 캐리어 완충제, 디스플레이서 완충제 및 샘플 로딩 용액 중의 3% v/v MeCN, 4% v/v EtOH 또는 5% v/v MeOH로 시작하고; 이들 3개 용액들의 유기물 함량은 동일해야 한다. 유기 용매 함량은 각각의 샘플, 컬럼 및 디스플레이서에 대해 최적화될 필요가 있는 중요한 파라메터이다. 일반적인 작동 목적으로, 유기 용매는 약 15 부피% 미만, 보다 바람직하게는 약 10 부피% 미만, 여전히 보다 바람직하게는 약 5 부피% 미만이어야 한다. 옥타데실 컬럼들이 사용되는 경우, 2-3% 아세토니트릴, 3-4% 에탄올 또는 4-5% 메탄올이 대개 매트릭스의 최적 작용화를 위해 필요하다. 페닐헥실 및 옥틸 컬럼들이 대개 유기 용매의 부재를 견딜 수 있다.

pH 및 pH 완충제의 선택 - pH 완충제는, 샘플, 디스플레이서, 이온 쌍 형성제 속에 또는 정지 상 위에 이온화가능한 양자들이 존재하는 경우 요구된다. 일부 분석물들은 특정의 pH 범위들내에서만 안정하다. 일부 분석물들이 경우, 크로마토그래피적 분리는 강력하게 pH-의존성이다. 음이온 단백질들(pH>pl)을 포함하는 음이온 샘플들은 음이온 디스플레이서들 및 음이온 pH 완충제들을 사용하여 정제한다. 음이온 pH 완충제들과 관련된 양이온들은, 이온 쌍 형성 양이온과 동일할 수 있지만, 일부 경우들에서, 유의적으로 보다 약한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 양이온일 수 있다. 또한, 일부 흔한 경우들에서, 양이온성 pH-완충제들이 사용될 수 있지만 단지 이들이 기본적인 이온 쌍 형성 양이온보다 더 약한 이온 쌍 형성 특성들을 지닌 경우에만 사용될 수 있다. 따라서, N-메틸모르폴린(7.4, NMM), 트리에탄올아민(7.8, TEOA) 및 TRIS(8.1)는, 트리메틸암모늄, 트리에틸암모늄 또는 n-부틸암모늄이 이온 쌍 형성 양이온인 경우에 pH 완충제들로서 때때로 사용될 수 있다. 중간-범위의 pK_a　값들을 갖는 음이온 화합물들이 pH-완충제들로서 유용할 수 있다: 탄산염(9.9), 붕산염(9.0), TABS(8.9), TAPS(8.4), TAPSO(7.6), 메틸포스폰산(7.6, MPA), MOPS(7.2), MOPSO(6.9), 인산(6.8), 모노메틸포스포르산(6.3), 인산(6.3), MES(6.2), 3,3-디메톡시글루타르산(5.9, DMG), 석신산(5.2, SUC), 아세트산(4.6, HOAc).

[표 IV]

10 mM 의 [ Me ₃ NH ⁺ ][ D1 ] 디스플레이서용 완충 시스템

a) 산-아민 완충제는 작동 용매인, 물과 유기 용매의 혼합물 속에서 완전히 용해될 수 있다.

b) 보다 염기성인 아민은 보다 높은 pH(>7.8)를 필요로 한다; 디스플레이서(D^-)는 동일한 반대-양이온을 가져야 한다.

동시-치환 - 수백개의 성분들 및 불순물을 포함하는 샘플들을 사용하여 작업하는 경우, 동시-치환은, 결합 등온선들의 어느 곳에서 DC 실험들이 발생하는 지에 무관하게 목적하는 주 성분을 사용하여 동시-치환하는 수개의 주요 성분들이 존재하기 쉽기 때문에, 거의 피할 수 없는 현상이다. 운좋게도, 치환 크로마토그래피에서의 동시-치환은 제조적 용리 크로마토그래피에서의 동시-용리보다 훨씬 덜 심각한 문제이다. 동시-치환은 다음과 같은 2가지 조건들에서 발생한다: (1) 결합-등온선들이 너무 유사해서 불량한 분해능이 존재하는 경우 및 (2) 결합-등온선의 작동 영역 근처에서 결합-등온선들의 교차가 존재하는 경우. 운 좋게도, 이러한 주제를 다루는 간단한 방법들이 존재한다:

a. 디스플레이서의 농도를 변화시킴,

b. 상이한 결합 특성들을 갖는 상이한 디스플레이서로 변화시킴에 의해, 결합-등온선들 위의 상이한 점을 작동시킴으로써 상이한 조건들 하에 제 2의 DC 실험을 수행함.

대안적으로, 등온선들 자체는,

c. 크로마토그래피 매트릭스를 변화시킴(정지 상),

d. 유기 용매의 농도를 변화시킴,

e. 상이한 유기 용매를 변화시킴,

f. 상이한 이온 쌍 형성제로 변화시킴,

g. 온도를 변화시킴에 의해 변화시킬 수 있다.

제 2의 "직교형" IP-RP DC 단계는 전형적으로 우수한 순도(~99.5%)를 우수한 수율(90-95%)로 제공한다.

컬럼 로딩 - DC 실험들은 비교적 고 로딩률, 전형적으로 최대 로딩 용량의 60-80%의 범위로 수행한다. 작동적 컬럼 로딩 용량은 고정된 수가 아니며, 이보다는 결합-등온선의 어느 곳에서 DC 실험이 작동하는 지에 좌우된다.

컬럼 용량의 전부가 사용을 위해 이용 가능한 것은 아니다 (하기한 "예외" 참조). 실제, 컬럼 부피의 단지 90-98%만이 사용가능하다. 일단 샘플이 컬럼 상으로 로딩되면, 디스플레이서 완충제는 이후에 컬럼 상으로 펌핑된다. 컬럼 하부로 상이한 속도들에서 각각 운행하는 3개의 프런트(front)들이 존재한다: (1) 액체 프런트(T₁, 디스플레이서 완충제 - 디스플레이서), (2) 샘플 프런트(T₂) 및 (3) 디스플레이서 포화 프런트 자체(T₃). 첫 번째 프런트는 제 2 및 제 3 프런트들보다 더 빠르게 운행하며 이용 가능한 컬럼 용량을 제한하는 데, 그 이유는 첫 번째 프런트가, 치환 트레인(T₂)이 빠져나가기 시작하기 전에 컬럼을 빠져나가야 하기 때문이다. 프런트들의 실제 속도들은 치환 유동속도에 직접적으로 좌우된다. 프런트 속도들의 비, α, Vel₁-/Vel₂는 다음 식으로 주어진다:

α = K_m　/ (R x C_d)

상기 식에서, K_m은 C_d의 디스플레이서 농도에서 매트릭스의 디스플레이서 결합 용량(디스플레이서 mg / 팩킹된 매트릭스 ㎖)이고, 여기서 C_d는 디스플레이서 완충제 중의 디스플레이서 농도(디스플레이서 mg / 디스플레이서 완충제 ㎖)이고, R은 컬럼의 총 부피에 대한 컬럼 중의 액체의 부피의 비(액체 ㎖ liquid / 베드 부피 ㎖_m). 최대 % 이용 가능한 컬럼 부피는 다음 식으로 주어진다:

(100 x (α-1 )) / α

아래 예 2에서, 각각의 α-값은 21.98이며, 각각의 최대 부피 용량들은 95.4%이다. C_d가 증가함에 따라, K_m은 또한 감소할 것이지만, 등온선의 비선형 부분에서 높게 작동하는 것만큼 높지는 않다. 따라서, α는 증가할 것이고 최대 % 이용 가능한 컬럼 용량은 감소할 것이다.

상기한 것에 대한 예외가 존재한다 - 상당한 수준들의 원하지 않는 조기-치환 불순물들이 샘플 내에 존재하는 경우, 당업자는, 컬럼을 오버로딩하고 디스플레이서 유동이 시작되기 전에 샘플 로딩 동안에 이들 불순물을 쏟아버림으로써 100% 이상까지도, 컬럼의 이용 가능한 용량을 증가시킬 수 있다. 따라서, 컬럼 로딩은 전체 샘플을 기준으로 최대의 105%일 수 있지만, 컬럼 로딩은 주 생성물 + 나중-치환 불순물들의 양을 기준으로 단지 80%가 될 수 있다.

샘플 로딩 방법 - 샘플은 2가지 방법 중의 하나를 사용하여 샘플 주사 밸브를 통해 컬럼 상으로 로딩시킨다. 이 샘플은, DC 실험이 수행되는 결합-등온선의 동일한 지점에서 프론탈(frontal) 크로마토그래피 조건들 하에 로딩하여야 한다. 캐리어는, 샘플이 로딩된 후에 컬럼을 통과하지 않는다. 방법 1: 샘플 로딩 펌프를 사용한다; 방법 2: 주입 루프를 사용한다. 대개, 부분 루프 주입만을 사용한다. 루프 내의 샘플은 먼저 캐리어 및 이후에 디스플레이서 용액을 사용하여 루프로부터 컬럼 위로 사라지게 하여야 한다. 루프 부피의 85-95%를 컬럼 위로 로딩하여 캐리어에 의해 희석된 샘플이 로딩되지 않도록 해야 한다.

샘플 용액의 농도 및 부피 - 로딩 샘플의 농도는 중요한 작동 파라메터이다. 최적의 샘플 로딩 농도(mg/㎖)는 치환 실험으로부터의 정제된 생성물의 배출 농도(output concentration) - 치환 트레인의 평탄부 영역(plateau region)과 동일하다. 결합-등온선들, 컬럼 결합 용량들 및 배출 농도들은 초기에는 알려져 있지 않다. 다음에 나타낸 바와 같은 초기 추정치들을 사용하여 컬럼 상으로 로딩된 샘플 용액을 사용한 제 1 치환 실험을 간단하게 수행한다:

(1) 당업자가 작업하기 원하는 초기 컬럼 로딩 비율, 즉 75%를 취한다.

샘플 로딩 시간 = 디스플레이서 관통 시간(T₃-T₁) x 0.75

= (736 min - 312 min) x 0.75 = 318 min (예 1에서)

(2) 2가지 방법 중의 하나로 샘플에 대한 초기 농도를 취함:

(a) 초기 샘플 농도(mg/㎖) = 0.12 x 디스플레이서 농도(mM) x 제형 중량(mg/㎛ole) = 0.12 x 10 mM x 2.30 mg/㎛ole = 2.76 mg/㎖ (예 1에서)

(b) 샘플에 대한 추정된 컬럼 결합 용량, 즉 50 mg 샘플/㎖ 매트릭스를 취한다. 치환 유속 및 샘플 로딩 유속가 동일하다고 추정한다:

초기 샘플 농도(mg/㎖) = (컬럼 결합 용량(mg/㎖_m) x 컬럼 부피(㎖_m)/((T₂-T₁) x 샘플 유속(㎖/min))

= (50 mg/㎖_m　x 4.155 ㎖_m) / ((736 min-312 min) x 0.208 ㎖/min) = 2.36 mg/㎖ (예 1에서)

로딩된 샘플을 사용한 제 1 DC 실험이 오버로딩된 조건들(>100% 로딩)을 생성하는 경우, 실험을 샘플 농도의 절반에서 재수행한다. 하나의 샘플을 사용하는 동안의 첫 번째의 성공적인 DC 실험의 결과들로부터, 실제 로딩 농도 및 실제 컬럼 로딩 용량을 용이하게 계산하고, 이들 값들을 이후에 조정 샘플 농도에서 사용하고, 제 2 DC 실험을 위해 로딩한다.

샘플 제조 - 로딩 샘플 용액을 상기한 바와 같은 농도 및 양에서 제조한다. 충분히 과량의 용액이 루프를 과대충전하거나 샘플 로딩 펌프 및 운반 라인들의 죽은 부피(dead volume)를 충전하기 위해 필요하다. pH, pH 완충제의 양 및 유기 용매의 양은 캐리어 및 디스플레이서 완충제와 동일한다. 샘플을 캐리어 속에 용해시키면 이의 pH를 변화시켜서 샘플 용액의 pH가 용해 후에 재조절되어야 할 것이다. 그러나, 이온 쌍 형성제의 양은 상이할 수 있다. 샘플 용액 속에 사용된 이온 쌍 형성제는 디스플레이서 완충제 속에 사용된 것과 반드시 동일해야 한다. 이러한 관점에서, 이온 쌍 형성제가 샘플 용액 및 디스플레이서 용액 중에 사용되는, 샘플의 이온 쌍 형성 요건들이 언급된다. 주 분석물의 작동 pH 및 농도에서 형식적인 화학 전하를 기준으로 하여, 이러한 농도의 농도는 이온 쌍 형성제이거나 이온 쌍 형성 염이 계산된다. 상기한 "이온 쌍 형성제의 농도"를 참조한다.

샘플의 조성 및 이력은 공지되어야 한다. 샘플이 양이온을 함유하는 경우, 이의 화학적 특성 및 양(농도)도 공지되어야 한다. (a) 분명하게, 음이온이 존재하지 않는 경우, 어떠한 조절도 샘플 제조 시에 이루어지지 않는다. (b) 샘플 중의 양이온이 DC에서 사용된 이온 쌍 형성제와 동일한 경우, 샘플 용액이 첨가된 이온 쌍 형성제의 양은 이에 따라 감소된다. (c) 샘플 중의 양이온이 DC에서 사용된 이온 쌍 형성 양이온보다 상당히 더 약한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 경우, 이의 존재는 무시된다. (d) 샘플 내의 양이온이 DC에서 사용된 이온 쌍 형성 양이온보다 더 강한 이온 쌍 형성 특성들을 갖는 경우, 양이온은 가공하기 전에 교환하거나 제거해야 한다.

분획의 회수 - 치환 크로마토그래피는, 특히 양호한 C₁₈-역-상 컬럼을 사용하는 최적화된 프로토콜들을 사용하여, 우수한 크로마토그래피적 분해능을 제공하다. 그러나, 분해능은, 모든 밴드들이 치환 트레인에서 백-투-백 밴드들과 함께 컬럼을 빠져나오기 때문에 관찰하기 힘들다. 많은 작은 불순물 삼각형-밴드들은 30초 너비(<100 ㎕)이다. 따라서, 250 분 및 80% 샘플 로딩의 디스플레이서 관통 시간을 사용한 실험에서, 치환 트레인은 약 200 분 너비이며, 400개 이상의 분획들이 취해져서 크로마토그래피적 분해능이 분획-회수 공정 동안에 손실되지 않도록 할 수 있다. 400개 분획들을 분석하는 것은 진실로 이해시키고 관심을 갖도록 하는 것이지만 또한 두렵게 하는 일이다. 이는, 온라인 실시간 분획 분석이 유용할 수 있는 경우이다. 실제, 본 발명자들은 분해된 것을 버리고 100 내지 130개의 큰 분획들만 수집한다. 이러한 수의 분획들도 많은 작업을 나타낸다.

제조적 DC 실험들이 수행되고 단지 정제된 주성분만이 관심이 있는 상황에서, 분획 회수 공정은 매우 간단해진다. 각종 주파수들(UV)에서 관찰된 치환 트레인의 형태를 기준으로 하여, 목적하는 주 밴드의 시작 및 끝을 판단한 다음 약 10개의 분획들을 두 가지 영역들에서 분석하여, 어떠한 분획들을 모을 것인지를 결정한다. 100 내지 130개의 분획들 대신에 20개의 분획들을 분석하는 것은 용이한 작업이다.

아래 예 3에서, 분석은 훨씬 더 용이하다. 상기한 방법을 기준으로 하여, 목적하는 주 밴드의 초기 및 말기를 판단하고, 어떠한 분석없이 연속적인 혼주(pooling)를 수행하고 최종 혼주에서 단지 하나의 분석을 수행한다.

디스플레이서 제거 및 컬럼 재생 - 디스플레이서는 어떠한 pH 완충제 또는 이온 쌍 형성제도 없이 5-10 컬럼 부피들의 95/5(v/v) 에탄올-물 또는 80/10/10(v/v/v) 아세토니트릴-ⁿ프로판올-물을 사용하여 제거한다. 이러한 목적은 가장 짧은 시간에서 컬럼으로부터 >99.9% 이상의 디스플레이서를 효과적으로 제거하기 위한 것이다. 유속를 증가(100-400 cm/hr)시켜서, 매트릭스가 증가된 배-압(back-pressure)을 견딜 경우 컬럼 재생 공정으로 가속시킨다. 디스플레이서의 최대 흡수율(디스플레이서 지시사항들 참조) 근처의 디스플레이서 제거율을 관찰하여 재생 공정이 UV 검출에 의해 조심스럽게 모니터링되고 최적화되도록 한다.

첨가된 염의 효과 - 수성 용매들 중의 염들은 용해된 소수성 분석물들 및 소수성 디스플레이서들에 대하여 덜 수용가능한 용매들을 생성시켜서 소수성 크로마토그래피적 매트릭스들에 대하여 더 강한 결합을 일으킨다. 이는 소수성-상호작용 크로마토그래피(HIC) 뒤에 있는 원리이다. 분석물의 용해도가 염 용액 중에서 충분한 한, 염의 첨가는 분석물 결합 및, 소수성 매트릭스에 대한 선택성를 조절하기 위한 양호한 방법이다.

일부 경우에서, 소수성 매트릭스에 결합하는 분석물은 너무 약해서 충분한 분석물 결합을 수득하기 위해서는 염이 가해질 필요가 있다. 일반적으로 사용된 염 용액들은 0.5-2.5M (NH₄)₂SO₄, K₂SO₄, Na₂SO₄, NaCl 및 KCl이다. 많은 상이한 염들을 각종 농도들에서 사용하는 경우, 치환 모드의 HIC는 단백질의 유용한 크로마토그래피적 분리들을 위한 많은 선택사항들을 제공한다.

기구 프로토콜 - 예 2에 대한 예 프로토콜을 참조한다(이중 펌프 작동). 선행 실험들로부터의 잔류하는 디스플레이서는 잠재적인 문제점이기 때문에, 프로토콜은 라인 퍼징 작동들(line purging operations), 신속한 컬럼 재생 및 평형 작동들을 가져서, HPLC 시스템 및 컬럼이 샘플 로딩 직전에 완전히 세정되고 적절하게 평형되도록 한다. 이러한 단계들은 단순히 예방적이며 항상 필요하지는 않다. 프로토콜은 (a) 예비-평형화 순서, (b) 평형 순서, (c) 샘플 로딩 순서, (d) 치환 순서 및 (e) 재생 순서를 단일 프로토콜로 포함한다. 시스템 중의 죽은 부피과 관련된 문제점들을 극복하기 위하여, 모든 로딩 완충제들, 디스플레이서 완충제들 및 샘플 용액들을 시스템을 통해 퍼징하여 컬럼 상으로 펌핑하기 직전에 폐기한다. 이러한 방식으로, 컬럼은 밸브 스위칭(valve switching) 시 즉시 희석되지 않은 용액들의 날카로운 프런트를 보이게 된다. 샘플 용액들은 탈기시켜서 기체 버블들이 이들 속에 형성되지 않도록 한다. 주사 루프들이 사용되는 경우, 이들은 약 10%로 과충전될 필요가 있다. 이러한 과충전은 추가의 용도로 수집할 수 있다. 완전 루프 주입물을 사용하지 않아야 하며, 부분 루프 주사물들만을 사용하여야 한다. 경험은, 루프 부피의 단지 85-95%만이 루프 도관의 내부 직경에 따라 사용될 수 있음을 나타내는 데, 그 이유는 샘플 용액이 드라이버 용액과 혼합되고 이를 희석시키기 때문이다. 루프 내의 샘플은 로딩 완충제를 사용하여 컬럼 상으로 구동시키지만, 샘플 로딩 공정의 끝을 향해서는 구동시키지 않고, 구동 용액은 디스플레이서 완충제로 변한다. 이는, 디스플레이서 완충제가 컬럼 상으로 직접 펌핑되는 디스플레이서 완충제 자체 직전에 시스템을 통해 퍼징되도록 한다. 재생 공정의 초기 부분 동안에, 더 느린 유속들이 사용된다. 따라서, 높은 배압과 관련된 문제점들은 거의 발생하지 않는다. 일단 대부분의 디스플레이서가 제거되면, 더 빠른 유속들을 사용할 수 있다.

방법 최적화 - 모든 형태들의 제조적 크로마토그래피를 사용하는 경우, 크로마토그래피적 방법 및 과정들의 최적화가 중요하지만 약간의 실험이 필요하다. 치환 크로마토그래피의 이점들은 가격-시간에 따라 발생한다. 시간-소모적인 인자들은 방법 최적화 동안에 최소화될 수 있다.

· 분리 시간에 무관하게 치환 정제를 위한 거의 최적 조건들을 측정한다.

· 분해가 감소할 때까지 샘플 로딩 용액의 농도와 디스플레이서 농도를 증가시킨다.

· 분해가 감소할 때까지 치환 유속 및 샘플 로딩 유속를 증가시킨다.

· 예비-평형화 순서 및 디스플레이서 제거/컬럼 재생 순서들을 단축시킨다.

기존의 프로토콜은 방법 최적화를 위한 유용한 출발점을 제공하지만, 이들은 연구하에 있는 특정한 샘플을 위한 수정을 필요로 할 것이다. 시간에 무관하게 순도에 대해 최적화시킨 샘플 프로토콜(예 2)은 하기에 나타낸다. 목적하는 샘플의 특정한 물리적 특성들 및 크로마토그래피적 특성들에 대해 맞춰진 방법 최적화를 수행하는 것이 중요하다. 최적화 시, 더 긴 공정시간들(600-800 min)은 종종 200 내지 300 분 및 일부 경우들에서 100 내지 150 분으로 감소될 수 있다.

치환 모드에 사용된 소수성 크로마토그래피는 (a) 높은 매트릭스 생산성(매트릭스의 수명에 걸친 매트릭스 리터 당 생성물 그람), (b) 높은 부피 생산성(컬럼 부피의 리터 당 생성물 그람), (c) 높은 용매 생산성(사용된 용매의 리터당 생성물 그람)을 갖지만 (d) 보통 시간 생산성(단위 시간 리터당 생성물 그람)을 가질 수 있다. 적절한 방법 최적화는 시간 인자를 이동시킨다.

적절하게 구성된 기구화 ( Properly Configured Instrumentation ): 작은 제조적 HPLC 시스템을 위한 전형적인 기구 구성은 하기에 나타낸다.

· 주 펌프: 스테인레스 강, 티타늄, 세라믹, PEEK; 0.01 -10 ㎖/min 유속; 3000-4500 psi 압력으로 정밀하게 함.

· 임의의 컬럼 바이패스 밸브: 2개 위치, 6구 스위칭 밸브(스테인레스 강, PEEK); 컬럼 인라인 또는 바이패스 컬럼. 이는 편리한 선택사항이다.

· 필요한 샘플 주입 밸브: 주입 루프 또는 샘플 주입 펌프를 위한 2개 위치, 6구 주입 밸브(스테인레스 강, PEEK).

· 주입 루프: 20-40 ㎖ 주입 루프(스테인레스 강, PEEK). 루프는 오버로딩(~10%) 되어야 한다. 부분 루프 주입만이 사용되며, 전형적으로 85-95% 이하의 루프 부피가 사용된다. 주입 루프나 샘플 펌프 중의 하나를 사용한다.

· 샘플 펌프: 이는 샘플 주입을 위한 주 펌프와 유사하다. 샘플은 펌프 헤드의 유동 경로와 호환성이 있어야 한다. 주입 루프 또는 샘플 펌프 중의 하나를 사용한다. 2-펌프 작동을 사용하여, 2개 펌프들의 유속들을 조정하여 이들의 유동들을 조화시킬 수 있어야 한다.

· 구배 혼합기 없음: 치환 크로마토그래피에서 구배 혼합기를 바이패싱하거나 제거한다.

· UV 검출기: 짧은 경로, 저 부피 석영 유동-셀(0.2-2.0 mm 유동 경로, <10 ㎕ 유동 부피)을 갖는, 200-400 nm 주파수 범위의 다중 파장 또는 광-다이오드-배열 검출기.

· 임의의 전도성 검출기: UV 검출기 후의 유동 셀, 0.1 -200 mS, <100 ㎕ 유동-부피를 갖는 전도성 검출기; 500 ㎕/min의 치환 유속에서 분석하기 위한 분획들을 수집하는 경우의 바이패스 전도성 유동-셀.

· 분획 수집기: 시간 또는 방울들의 수에 따른 분획 당 10 ㎕ 내지 10 ㎖.

· 컬럼 냉각기/가열기: 0-100 ℃ +/-0.5 ℃. 컬럼이 주변 온도와 실질적으로 상이한 온도에서 작동하는 경우, 완충제 용액들을 가열하거나 냉각하기 위한 배열들이 필요하다.

예 1: 디스플레이서 579(4- ⁿ 헥실벤젠 설포네이트 )-중성 pH 근처의 음이온 디스플레이서를 사용한 미정제 등록된 펩티드 (20-mer)의 치환 크로마토그 래피 정제(참조: 도 1a- 치환 흔적, 도 1b 분석)

작동 조건:

출발 펩티드: 미정제 20-mer 펩티드, 65.8% 순도, FW ~ 2.300 mg/μmole, 전하 = -4

컬럼: Waters Xbridge BEH130, 5㎛, 135A, 4.6 x 250mm SS, 실리카 상의 -C₁₈

유속: 로딩 = 208 ㎕/min; 치환 = 208㎕/min

이온 쌍 형성제: 트리메틸암모늄(Me₃NH⁺);

온도 = 23℃; pH = 7.1;

디스플레이서 완충제: w/5%(v/v) MeOH를 함유하는 탈이온수 중의 10.0mM 디스플레이서 579 + 15mM H₃P0₄　(HPLC 등급), pH=7.1, w/37% Me₃N(HPLC 등급), 최종 Me₃NH⁺　농도 ~25mM.

로딩 완충제: 5%(v/v) MeOH를 함유하는 물 속의 15mM H₃P0₄　(HPLC 등급), pH=7.1 w/ 37% Me₃N(HPLC 등급), Me₃NH⁺　농도 ~25mM.

샘플 용액: 5%(v/v) MeOH를 함유하는 물 속의 3.02 mg/㎖ 펩티드, 15mM H₃P0₄; pH=7.1 w/ 37% Me₃N, Me₃NH⁺　농도 ~25mM.

로딩 양: 로딩 펌프(펌프 2)로부터 157.2 mg; 로딩 시간 = 250.0 min.

분획 크기: 520㎕; 5 ㎖의 포름산을 각각의 분획에 첨가하였고, pH는 3.5로 감소시켰으며; 샘플들은 분석 또는 혼주할 때까지 즉시 동결시켰다(-20℃).

결과:

분획 분석: 215nm에서 분석적 용리 HPLC로 분석된 희석되지 않은 분획들(17㎕의 주입 부피); 면적%를 기준으로 한 계산.

총 수행 시간: 12.3 hr

배출 농도: 2.77 mg/㎖

컬럼 로딩: 최대 용량의 88.2%

컬럼 용량:

전체 샘플을 기준으로 ~42.9 mg 펩티드/㎖ 매트릭스 @ 2.79 mg 펩티드/㎖ 용액

순수한 생성물을 기준으로 ~58.6 mg 펩티드/㎖ 매트릭스 @ 2.79 mg 펩티드/㎖ 용액

~212 μmole 디스플레이서/㎖ 매트릭스 @ 10.0 μmole 디스플레이서/㎖ 용액

순도%: 99.3% 99.3% 99.3% 99.3%

수율%: 80% 85% 90% 95%

코멘트: 샘플 농도/배출 농도 = 1.1

샘플 중 Me₃NH⁺의 양 = 화학량론적 양의 4.7배.

우수한 결과들이 충분한 로딩(42.9 g/L), 탁월한 순도 및 탁월한 수율(99.3% 순도 @ 90% 수율)로 소 "분석-유형" 컬럼을 1 단계로 사용하여 미정제 펩티드로부터 수득된다. 해당 예는 중성 pH(7.1)에서 양이온성 이온 쌍 형성제를 사용하는 음이온 디스플레이서를 사용한 미정제 합성 음이온 펩티드의 정제를 나타내기 위해 설계된다. 1급 또는 2차 아민을 사용하기보다, 양자화된 3차 아민을 IP 제제로 선택하여 트랜스-아미드화 반응들의 모든 가능성을 방지하였다. 광범위한 3차 아민들의 스크리닝은 해당 예에서 우수한 분리, 순도 및 수율를 나타내었다. 동일한 컬럼을 사용하는 제조 조건들하에서, 기본 불순물들은 pH=7.1(99.3% 순도 @ 90% 회수; 5% MeOH와 트리메틸암모늄 포스페이트)에서 pH=2.0(98.6% 순도 @ 90% 수율; 3% MeCN과 틀리플루오로아세트산; 데이터는 나타내지 않음)보다 더 우수하게 제거된다. 당해 디스플레이서 밴드 및 펩티드 밴드들은 매우 급격하여 거의 직교의 치환 밴드들 및 거의 균일한 공치환(codisplacement)(5개의 약간의 분순물들로 구성된 총 0.7%)을 일으킨다. 그 결과, 회수된 순도는 80 내지 95%이 수율들 범위 전체에서 99.3%로 거의 변하지 않는다. 단지 하나의 불순물이 pH 조건들(2.0, 7.1) 둘다 하에서 동시 나타나며, 이는 2개의 상이한 pH 값들에서 동일한 컬럼 상에서의 당해 펩티드의 2-단계 정제가 85 내지 90%의 전체적인, 2-단계 수율에서 99.8 내지 99.9%의 최종 순도를 가져올 수 있음을 제안한다.

예 2: 미정제 합성 올리고뉴클레오타이드의 정제를 위한 치환 프로토콜

장치 구성: 4개의 완충제 라인들을 갖는 주요 펌프(1), 1개의 용매 라인을 갖는 샘플 로딩 펌프(2), 펌프 선택기 밸브, 컬럼 바이패스(Bypass) 밸브

펌프 선택기 밸브: 단일-채널 토글 로직(single-channel toggle logic)으로 조절된 6개-포트(6구) 밸브(S3=0, 컬럼에 대한 펌프 l-폐기하기 위한 펌프 2, S3=1개의 폐기하기 위한 펌프 l-컬럼에 대한 펌프 2)

컬럼 밸브: 단일-채널 토글 로직으로 조절된 6구 밸브(S6=0, 컬럼을 통한 액체 유동, S6=1, 액체 유동 바이패스 컬럼)

컬럼(유동 셀: 0.5mM 통로길이, 9㎕의 부피) 후 UV 광다이오드 배열 검출기에 이은 전도성 검출기(유동 셀: 170㎕의 부피); 전도성

유동 셀은, 분획들이 분석을 위해 수집되는 경우 제거된다.

로딩 완충제 = 펌프 l 상의 A-라인[S1=1-유동개시(flow on), S1=0-유동 중단(flow off)]; 디스플레이서 완충제 = 펌프 1에서 B-라인(S2=1-flow on, S2=0-flow off); 디스플레이서 제거 완충제 = 펌프 l에서 C-라인(S4=1-flow on, S4=0-flow off); 컬럼 저장 완충제 = 펌프 l에서 D-라인(S5=1-flow on, S5=0-low off); 샘플 용액 = 펌프 2에서 A-라인(S7=1, 샘플 flow on, S7=0 샘플 flow off). 샘플 용액을 여과하고(0.2μ) 탈기한다.

순서를 시작하기 전에, 세정된 컬럼에 A-완충제를 간단이 퍼징하여 컬럼 저장 완충제를 제거한다. 다른 세부사항들의 설명에 대해 예 3을 참조한다.

디스플레이서 제거 완충제(C-완충제) = 10%(v/v) 1-프로판올, 아세토니트릴중 10%(v/v) 탈이온수.

컬럼 저장 완충제(D-완충제) = 70/30(v/v) 메탄올/물과 포름산(15mM) 및 암모늄포르메이트(15mM).

예 3: 거의 중성 pH 에서 디스플레이서 607b(5- ⁿ 헥실 -2- 하이드록시벤젠 설포네이트 ) - 음이온 디스플레이서를 사용한 미정제 올리고뉴클레오타이드 (20-mer)의 치환 크로마토그래피 정제 (참조: 도표 2a)

작동 조건:

출발 펩티드: 미정제 합성 올리고뉴클레오타이드(20-mer, A₂G₆T₈C₄, 암모늄 염, 모노티오포스페이트 골격), 82.2% 순도, FW=6.7397 mg/μmole, 전하 = -19.

컬럼: Waters Xbridge BEH130, 5㎛, 135Å, 4.6 x 250mM SS, 실리카 상의 -C₁₈

유속: 로딩 = 208㎕/min; 치환 = 208㎕/min

이온 쌍 형성제:　ⁿ부틸암모늄(ⁿBuNH₃ ⁺)

온도 = 23℃

pH = 7.0

디스플레이서 완충제: 탈이온수 w/ 5%(v/v) MeOH에서, 15.0mM 디스플레이서 607b + 20mM H₃P0₄　(HPLC 등급) + 50mM 정제된　ⁿBuNH₂, pH = 7.0 w/ 50% HC0₂H (HPLC 등급).

로딩 완충제: 물 w/ 5%(v/v) MeOH에서, 20mM H₃P0₄　(HPLC 등급) + 50mM 정제된　ⁿBuNH₂, pH = 7.0 w/ 50% HC0₂H(HPLC 등급).

샘플 용액: 5%(v/v) MeOH를 함유한 물에서 3.78 mg/㎖(561μM) 올리고, 20mM H₃P0₄　+ 100mM 정제된　ⁿBuNH₂; pH = 7.0 w/ 50% HC0₂H(HPLC 등급).

로딩 양: 로딩 펌프(펌프 2)로부터 124.2 mg; 로딩 시간 = 158.0 min.(2.63 hr)

분획 크기: 624 ㎕

샘플 제조: 암모니아 수(25.1 mg/㎖) 중 미정제 합성 20-mer 올리고뉴클레오타이드를 회전 증발기(30℃) 상에서 진공하에 대부분의 모든 NH₃　및 물이 제거되어 무색의 점성 잔사를 형성할 때까지 둔다. 희석 완충제-1 및 로딩 완충제를 사용하여, 샘플을 동일한 원래 부피(회전 증발기 상에서 용매 제거 전)로 역 희석시켜서 샘플이 100mM의　ⁿBuNH₃ ⁺를 함유하도록 한다. 단지 약간의 pH 조절이 요구된다. 농축액의 일부를 25.1 mg/㎖로부터 3.78 mg/㎖로 희석 완충제-2를 사용하여 희석시킨다. 희석된 샘플 용액을 여과하고, 탈기시키고 사용할 때까지 4℃에 저장한다. 희석 완충제-1은 120mM　ⁿBuNH₃ ⁺를 제외하고는 로딩 완충제와 동일하다. 희석 완충제-2는 100mM　ⁿBuNH₃ ⁺를 제외하고는 로딩 완충제와 동일하다.

결과:

분획 분석: 분획 분석은 수행하지 않는다. 정제된 분획들은 치환 흔적의 유형을 기준으로 보존적으로 혼주된다.

혼주된 생성물의 분석은 분석 용리 IP-RP 크로마토그래피 및 음이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 수행한다.

분획들을 260 nm에서 모니터링한다; 계산들을 면적%를 기준으로 한다.

총 이동 시간: 7.5 hr

배출 농도: 2.40 mg/㎖

컬럼 로딩: 전체 샘플을 기준으로 최대 용량의 100.3%;

주요 밴드를 기준으로 최대 용량의 85.2%

컬럼 용량: 전체 샘플 기준으로 ~30.0mg 올리고/㎖ 매트릭스 @ 2.40mg 올리고/㎖

주요 밴드를 기준으로 ~35.3 mg 올리고/㎖ 매트릭스 @ 2.40 mg 올리고/㎖

~221μmole 디스플레이서/㎖ 매트릭스 @ 15.0μmole 디스플레이서/㎖ 용액

순도%: 99.0%

수율%: 75%; 분획 분석 없이 보존된 분획-혼주물을 기준으로 한 데이터;

실제 이용 가능한 수율은 보다 더 높을 수 있다 (80 내지 85%).

코멘트: 샘플 농도/배출 농도 = 1.57

샘플에서 ⁿBuNH₃ ⁺의 양 = 화학량론적 양의 9.4배.

로딩 농도가 약간 높고(3.78 대 2.40 mg/㎖) 로딩 양이 약간 높다(100% 대 80%)고 해도, 우수한 결과들이 충분한 로딩(30.0 g/L)으로 및 우수한 순도(99.0% 순도 @ 75% 수율)로 작은 "분석-유형" 컬럼을 1 단계로 사용함으로써 미정제 올리고뉴클레오타이드로부터 수득된다. 해당 예는 양이온성 이온 쌍 형성제를 사용한 음이온 디스플레이서를 사용하여 미정제 합성 올리고뉴클레오타이드의 치환 정제를 나타내기 위해 설계된다. 당해 실험은 또한, 성공적인 샘플 혼주(pooling)가 분획들의 집중적인 분석없이 수행될 수 있음을 나타낸다. 1급, 2급 및 3차 아민들, 및 또한 4차 암모늄 염들의 스크리닝은, 충분한 결합 강도 및 분리를 제공하는 3개의 이온 쌍 형성제들을 나타낸다: ⁿC₄H₉NH₃ ⁺,　ⁿC₅H₁₁NH₃ ⁺, 및　ⁿC₆H₃NH₃ ⁺. 제조적 IP-RP 치환 크로마토그래피는 올리고뉴클레오타이드들의 제조적 음이온-교환 치환 크로마토그래피에 대한 보충 및 치환 둘다이다. 더욱이, 당해 방법은 중성 근처의 pH(pH=7-8)에서 작동하며 올리고-RNA들의 정제와 혼용성이다.

예 4: HPLC 분석- 방법 4a, 4b - 음이온( 설포네이트 , 카르복시레이트 )에 대한 역-상

샘플 주입: A 완충제에서 25㎕의 ~1mM 샘플 용액

UV 검출: 분석될 화합물에 따라 208 내지 220 nm

유속: 1.0 ㎖/min.

A 완충제: HPLC-등급의 증류수 중 5% CH₃OH(v/v)와 15mM 인산(HPLC-등급) 및 25mM 트리메틸아민(HPLC-등급); 메탄올 첨가 전 완충제의 pH는 7.10 +/- 0.05이다.

B 완충제: HPLC-등급의 CH₃OH 중 5% H₂0(v/v)와 15mM 인산(HPLC 등급) 및 25mM 트리메틸아민(HPLC-등급).

조사 구배 방법: 100% A 0-2 min

100% A 내지 100% B 2-62 min

100% B 62-70 min

분석 구배 방법: 15% B 0-2 min

15% B 내지 50% B 2-62 min

50% B 내지 100% B 62-67 min

100% B 67-70 min

방법 4c - 음이온(포스페이트, 포스포네이트)에 대한 역-상:

샘플 주입: A 완충제 중 25㎕의 ~1mM 샘플 용액

UV 검출: 분석될 화합물을 기준으로 208-220 nm

유속: 1.0 ㎖/min.

A 완충제: HPLC-등급의 증류수 중 5% CH₃OH(v/v)와 15mM 인산(HPLC-등급) 및 25mM 트리메틸아민(HPLC-등급); 완충제의 pH는 메탄올 첨가 전에 포름산으로 6.10 +/-0.05로 조절한다.

B 완충제: HPLC-등급의 CH₃OH 중 5% H₂0(v/v)와 15mM 인산(HPLC 등급), 25mM 트리메틸아민(HPLC-등급) 및 포름산(A 완충제와 동일한 양).

분석 구배 방법: 100% A 0-2 min

100% A 내지 100% B 2-62 min

100% B 62-70 min

방법 4d - 음이온(보로네이트)에 대해 역-상:

샘플 주입: A 완충제 중 25㎕의 ~1mM 샘플 용액

UV 검출: 분석될 화합물을 기준으로 208-220 nm

유속: 1.0 ㎖/min.

A 완충제: HPLC-등급의 증류수 중 5% CH₃OH(v/v)와 15mM 메틸포스폰산(HPLC-등급), 25mM 트리메틸아민(HPLC-등급) 및 35mM 시스-3,4-디하이드록시테트라하이드로푸란; 메탄올 첨가 전 완충제의 pH는 7.90 +/- 0.05이다.

B 완충제: HPLC-등급 CH₃OH 중 5% H₂0(v/v)와 15mM 메틸포스폰산(HPLC-등급), 25mM 트리메틸아민(HPLC-등급) 및 35mM 35mM 시스-3,4-디하이드록시테트라하이드로푸란.

분석 구배 방법: 100% A 0-2 min

100% A 내지 100% B 2-62 min

100% B 62-70 min

방법 4e - 장쇄 알킬 할라이드에 대해 역-상:

샘플 주입: A 완충제 중 25㎕의 ~1mM 샘플 용액

UV 검출: 검출된 화합물에 따라 200-220 nm

유속: 1.0 ㎖/min.

A 완충제: HPLC-등급의 증류수 중 5% CH₃CN(v/v)과 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산.

B 완충제: HPLC-등급의 CH₃CN 중 5% H₂0(v/v)와 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산.

구배 방법: 50% A/50% B 0-2 min

50% A/50% B 내지 100% B 2-62 min

100% B 62-70 min

예 5: 4- ⁿ 헥실벤젠설폰산(디스플레이서 579; 유리산, fw =242.34)의 제조

97.37g의 새로이 증류된 n-헥실벤젠(0.60 mole, fw=162.276, ~113 ㎖)을 300㎖의 교반하는, 무수 1,2-디클로로에탄에 환류 응축기, 자기 교반기, 500㎖의 첨가 깔대기 및 Teflon^®-피복된 열전쌍이 장착된 1L들이의, 3-구 환저 플라스크 속에서 가한다. 유리제품 및 다른 장치들을 오븐 속에서 건조시켜 표면 습윤을 제거한다. 환류 응축기는 안전성 예방주의로서 외에는 실제로 요구되지 않는다. 반응을 무수 질소 대기 하에서 느린 N₂　퍼지로 수행한다. 주위 온도에서, 300 ㎖ 무수 1,2-디클로로에탄 중 69.92g의 클로로설폰산(0.60 mole, fw=116.525, ~40 ㎖)을 적가 방식으로 교반하는 반응 혼합물에 전체 첨가가 약 60분내에 완료되는 속도(~5-6 ㎖/min)로 가한다. 온화한 발열 반응이 관찰된다(~10℃). 모든 클로로설폰산이 첨가된 후, 혼합물을 주위 온도에서 약 20시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 HPLC로 주기적으로 모니터링한다. 20 내지 24 시간 후에, 잔류하는 n-헥실벤젠의 양이 원래의 양의 5 내지 10%가 되면, 반응은 완료된 것으로 고려한다. 그렇지 않으며, 디클로로에탄 중 추가의 클로로설폰산을, 혼합물을 추가로 12시간 교반시키면서 가한다. 반응의 종료시, 소량의 잔류하는, 반응하지 않은 헥실벤젠이 관찰되며 디-설폰화를 나타내지 않는다. 일부 모노설폰화 이성체들이 관찰되며(0.5%의 3-이성체, 3.5%의 2-이성체) 이들은 후속적인 정제로 제거한다. 당해 시점에서, 반응 용액은 투명한 황색 용액이 된다. 그러나, 반응 용액이 혼탁하거나 흐리면, 이는, 소량의 물이 시스템에 도입되었음을 나타낸다. 혼합물을 습윤된 공기에 노출시키지 않고, 용매 및 HCl 부산물을 진공하에 제거하여 연갈색의 오일성 생성물을 수득한다. 기체상 HCl을 저온 트랩을 사용하기 전에 KOH 펠릿을 함유하는 트랩을 사용하여 제거함으로써 용매 및 다른 휘발물질들을 보유시킨다. 최종적으로, 생성물을 고 진공(0.01 torr)하에 24 시간 동안 주위 온도에 두어서 휘발물질들의 제거를 완료한다. 4-ⁿ헥실벤젠설폰산(유리산)의 이러한 제조를 또한 후속적인 제조(생성물 a)에 사용한다. 달리는, 생성물을 소량의 무수 n-펜탄(~1.5 L)에 용해시킨 후 펜탄 용액(생성물 b)으로서 사용한다; 펜탄 중 설폰산의 농도는 HPLC로 추정한다. 다시, 혼합물을 습윤된 공기에 노출시키지 않고, n-펜탄을 진공하에 제거하여 정제된, 연갈생의 오일성 생성물(생성물 c)를 수득한다. 펜탄 용액을 제조하는 경우, 대부분의 설폰산 생성물(90 내지 95%)이 용해되고; 펜탄 불?성 분획이 다른 용도들을 위해 비축됨에 주목한다. 그러나, 설폰산 생성물이 약간의 주위 습도에 노출되는 경우, 펜탄 속에 불용성인 옥소늄 염이 형성되고, 보다 적은 양의 설폰산이 펜탄 추출 동안 수득된다. ⁿ헥실벤젠설폰산(유리산)은 실질적으로 모든 용매들 속에서 인지할만하게 가용성인 유일한 분자이다: n-펜탄, 사이클로펜탄, 염화메틸렌, 1,2-디클로로에탄, 디에틸 에테르, ^t부틸 메틸 에테르, 아세토니트릴, 톨루엔, 디옥산, 이소프로판올, 무수 에탄올, 메탄올 및 물.

예 6: 4- ⁿ 헥실벤젠설폰산 일수화물(OH ₃ ⁺ 　염, fw=242.34)의 제조

방법 A. 정확하게 1 당량의 정제수(약 10.8g)를 예 5로부터의 전체 ⁿ헥실벤젠설폰산(유리산) 생성물(생성물 a)에 교반하면서 적가 방식으로 조심스럽게 가한다. 물과의 반응은 현저하게 발열성이다. 냉각된 반응 혼합물을 200㎖의 n-펜탄으로 2회 추출하여 ⁿ헥실벤젠 및 다른 유기 물질들을 제거한다. 합한 펜탄 분획을 버리는 동안 잔류 펜탄을 설폰산 일수화물로부터 진공하에 제거한다. 반응은 점성인 담갈색 액체를 거의 정량적으로 수득한다.

방법 B. 정확하게 1 당량의 정제수(6 내지 10g)를 예 5로부터의 n-펜탄 중 전체 ⁿ헥실벤젠설폰산(유리산) 생성물에 격렬하게 교반하면서 적가 방식으로 조심스럽게 가한다. 물과의 반응은 현저하게 발열성이다. 냉 반응 혼합물을 약 0℃로 냉각시키고, 상부 펜탄 층을 제거하고 하부 생성물 층을 200 ㎖의 n-펜탄으로 1회 추출한다. 합한 펜탄 분획들을 버리는 동안 잔류 펩탄을 설폰산 일수화물로부터 제거한다. 반응은 점성의 황색 액체를 거의 정량적으로 수득한다.

방법 C. 선행 방법은 단순하고 간단하지만, 생산된 알킬선폰산은 보통 순도를 가지며 정제하기 어렵다. 다른 방법은 최종적으로 유리 산으로 다시 역전되는 나트륨 염의 분리 및 정제를 포함한다. 26.4g의 정제되고 재결정화된, 나트륨 4-ⁿ헥실벤젠설포네이트(100mmole, fw=264.32)를 300㎖의 HPLC-등급 2-프로판올에 현탁시킨다. 교반 혼합물을 70℃로 약 10분 동안 가열한 후 0 내지 5℃로 냉각시킨다. 냉 혼합물을 칭량한다. 기체상 HCl을 서서히 및 조심스럽게 냉, 교반하는 혼합물내로 버블링(bubbling)하는 동안 온도를 10℃ 이하로 유지시킨다(용액의 강력한 발열성 열 주의). HCl 첨가는 18 내지 20g의 HCl을 가한 후 종결한다. 교반 혼합물을 약 50℃로 조심스럽게 가온시키고 당해 온도에서 약 6시간 동안 유지시킨다. 용매 및 과량의 HCl을 진공(회전 증발기) 하에 제거한다. 300㎖의 2-프로판올을 혼합물에 가하고 다시 용매를 진공하에 제거한다. 잔사를 150㎖의 디에틸 에테르에 넣고, 용액을 여과하고 용매 및 다른 휘발물질들을 회전 증발기를 사용하여 진공하에 제거한다. 최종적으로, 생성물을 고 진공(0.01 torr)하에 24 시간 동안 주위 온도에 두어 모은 휘발물질들의 제거를 완료한다. 당해 과정으로 22 내지 23g의 순수하고, 무색이며, 점성인 오일이 수득되며, 이는 건조기 속에 P₂O₅ 위에서 5℃로 암실 속에 저장한다. 출발하는 나트륨 염이 순수하므로, 수득되는 설폰산 일수화물의 순도는 >99.7%(HPLC)이다. 잔류 클로라이드 함량은 <0.5 mole%이다. 카를-피셔(Karl-Fisher) 적정들은, 설폰산이 일수화물(설폰산당 0.9-1.1 당량 H₂0)로서 존재함을 나타낸다.

방법 D. 1,2-디클로로에탄 또는 HCl을 제거하기 전에 예 5로부터의 최종 반응 용액에, 10.8g의 정제수를 교반하면서 조심스럽게 적가한다. 알킬벤젠 설폰산들의 일수화물들의 용액은 실온에서 디클로로에탄 속에서 가용성이다. 그러나, 저온(-20℃)에서, 보다 높은 알킬설폰산들(ⁿ옥틸, ⁿ노닐, ⁿ데실, ⁿ운데실)의 일수화물들은 용액으로부터 무색의, 왁스성 결정들로 우수하게 결정화된다. 보다 높은 알킬설폰산들의 옥소늄 염들을 소결된 유리를 통해 저-온 여과를 사용하여 습윤-유리된 대기(무수 N₂) 속에서 분리한다. 결정들을 냉, 무수 용매: 디클로로에탄/펜탄(50/50)로 세척한 후 n-펜탄으로 세척한다. 잔류하는 펜탄을 진공하에 제거한다. 실온으로 가온시키는 경우, 고체 일수화물들이 용해된 후 -20℃로 냉각 시 다시 재고화된다. 대조적으로, 중간체 알킬설폰산들(ⁿ펜틸,　ⁿ헥실, ⁿ헵틸)의 일수화물들은 디클로로에탄으로부터 -20℃에서 결정화되지 않는다.

예 7: 4- ⁿ 헥실벤젠설폰산 , 나트륨 염( fw =264.32)의 제조

주위 온도에서, 전체 생성물, 상기 제조(예 5, 생성물 a)로부터의 4-ⁿ헥실벤젠설폰산을 적가 방식으로 약 30분에 걸쳐 2L 들이 비이커 속에 함유된 800 ㎖의 격렬하게 교반된 수중 NaBr 용액(3.0M, 여과됨)에 가한다. 첨가 동안, 회백색 고체가 형성되며, 첨가가 완료된 후, 혼합물을 주위 온도에서 약 60분 동안 격렬하게 교반한다. 충분한 NaOH(50% 수성)를 교반하는 용액에 pH가 거의 중성(pH 페이퍼에 의한 pH=6-8)이 될 때까지 적가한다. 당해 고체를 소결된 유리를 통해 여과하여 제거하고 무수 에탄올로 2회 세척하고 아세토니트릴을 사용하여 다시 2회 세척한다. 고체 생성물은 이를 통과하는 무수 공기를 밤새 흡인함으로써 건조시킨다.

재결정화는 생성물을 이의 중량의 4X의 더운 에탄올-물(50/50 w/w) 속에 용해하고 소결된 유리를 통해 투명한 플라스크 내로 신속하게 여과함으로써 달성한다. 필요할 경우, 소량의 무수 에탄올을 여과된 용액에 가하고 진공 여과 동안에 손실되는 것들을 보상하도록 한다. 여과된 용액을 약 65 내지 70℃로 가열한 후, 등량(4X)의 가온된(65 내지 70℃) 무수 에탄올을 교반하면서 신속하게 가한다. 가온된 혼합물을 실온에서 약 4 시간 동안 정치시키면 이 동안 목적한 생성물의 결정들(백색 판상체들(platelets))이 형성되기 시작한다. 이후에 결정화 혼합물을 -20℃에서 약 4시간 동안 정치시켜 결정화를 완료한다. 냉 혼합물을 냉 용융된 유리 여과기를 사용하여 신속하게 진공-여과시킨 후, 혼합물을 주위 온도로 가온되도록 한다. 실온에서, 생성물을 소량의 아세토니트릴을 사용하여 1회 세척한 후 여과기를 통해 무수 공기를 통과시켜 건조시킨다. 당해 과정으로 HPLC 순도가 >99.8%(HPLC)인 약 82g(반응한　ⁿ헥실벤젠의 양을 기준으로 57% 수율)의 백색 결정성 생성물이 생산된다. 에탄올-물 혼합물 속의 용매의 양 및 물의 양을 조절함으로써, 알킬벤젠설폰산들의 다른 다른 고-순도 나트륨 염들을 유사하게 제조한다: ⁿ펜틸, ⁿ헵틸,　ⁿ옥틸,　ⁿ노닐, ⁿ데실 및 ⁿ운데실.

예 8: 4- ⁿ 헥실벤젠설폰산 , 트리메틸암모늄 염( fw =301.45)의 제조

방법 A. 주위 온도에서, 상기 제조(예 5, 생성물 a)로부터의 전체 생성물, 4-ⁿ헥실벤젠설폰산(유리산)을 1000㎖의 퍼옥사이드가 없는 디에틸 에테르 속에 2L들이 플라스크 속에서 용해한다. 기체상 트리메틸아민을 교반하는 에테르 용액에 더 이상의 반응이 관찰되지 않을 때까지 서서히 버블링한다. 흡습성의 담황색 결정성 고체를 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 여과기 케이크를 통해 무수 질소를 통과시켜 건조한다. 생성물을 900㎖의 따뜻한(40℃) 2-프로판올 속에 용해한 후 실온으로 냉각시킨다. 혼합물을 여과하여 불용물질들을 제거하고, 900㎖ 이상의 2-프로판올을 가한 후 디에틸 에테르(~5L)를 서서히 가하여 생성물의 초기 결정화를 유도한다. 혼합물을 -20℃로 냉각시키고 밤새 당해 온도에서 정치시킨다. 냉 혼합물을 소결된 유리 생성물을 사용하여 여과하여 회백색 결정들을 수득하고 이를 후속적으로 디에틸 에테르로 세척하고 건조시킨다. 당해 생성물을 2-프로판올/디에틸 에테르로부터 다시 재결정화하여 113g(반응된 ⁿ헥실 벤젠을 기준으로 69% 수율)의 백색 흡습성 결정들을 >99.5%(HPLC)의 순도로 수득한다. 당해 생성물을 진공 오븐(50℃, 25 torr) 속에서 약 6시간 동안 건조시키고 건조기 속에서 P₂O₅ 위에서 저장한다. 알킬벤젠설폰산들의 많은 다른 알킬암모늄 염들을 유사하게 제조할 수 있다. 모두는 물 및 단순한 알콜들 속에서 가용성이다. 일부는 디에틸 에테르 및 n-펜탄(예를 들면, 트리메틸암모늄 및 테트라메틸암모늄 염들) 속에서 불용성이지만 다른 것들은 디에틸 에테르 속에서 가용성이고 n-펜탄(예를 들면, ⁿ부틸암모늄 및 ⁿ헥실암모늄 염들) 속에서 여전히 불용성이다.

방법 B. 4-ⁿ헥실벤젠설폰산(㎖ 당 0.33mmole 유리산, 예 5, 생성물 b)의 1000㎖의 냉각된(10℃), 교반하는 n-펜탄 용액을 상층 용액이 염기성(damp pH 페이퍼)이 될 때까지 온도가 20℃ 이하로 유지되는 속도로 기체상 트리메틸아민에 서서히 버블링시킨다. 용액을 주위 온도에서 약 15분 동안 교반하여 생성물의 결정화를 완료한다. 백색 결정들을 프릿화된 유리(fritted glass)를 사용하여 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 무수 질소를 여과기 케이크를 통해 통과시켜 건조시킨다. 백색 고체를 2-프로판올에 주위 온도에서 용해하고, 여과한 후 2-프로판올/디에틸 에테르로부터 상기 예 20, 방법 A에 따라 재결정화한다. 당해 과정으로 약 84g(84% 수율)의 백색, 결정성 생성물이 >99%의 HPLC 순도로 수득된다.

방법 C. 26.4g의 정제되고 재결정화된, 나트륨 염(100mmole, fw=264.32)을 300㎖의 HPLC-등급의 2-프로판올 속에 현탁시킨다. 11.0g의 트리메틸암모늄 클로라이드 결정들(115mmole, fw=95.57)을 가하고, 수개의 소적들의 새로이 제조된 HCl(HPLC-등급의 2-프로판올 중 ~8%의 기체상 HCl)을, pH가 명확하게 산성(damp pH 페이퍼)가 될 때까지 가한 후 혼합물을 교반하고 75℃로 10분 동안 잠시 가열한다. 교반하는 혼합물을 주위 온도로 6시간에 걸쳐 서서히 냉각되도록 한다. 혼합물을 약 40℃로 온화하게 가열한 후 소결된 유리를 통해 여과하여 염화나트륨을 제거한다. 용매를 여액으로부터 진공(회전 증발기)하에 제거하고, 300㎖의 추가의 2-프로판올을 가한 후 또한 진공하에 제거한다. 추가의 2-프로판올을 가하여, 혼합물의 총 부피가 약 270㎖가 되도록 한 후, 730㎖의 과산화물이 없고, 억제제가 없는 디에틸 에테르를 가하여 혼합한다. 당해 혼합물을 -20℃에서 밤새 냉각시켜 생성물의 결정화를 완료한다. 냉 혼합물을 소결된 유리을 통해 신속하게 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고, 무수 질소를 여과기-케이크를 통해 통과시켜 건조시키고, 진공 오븐(50℃, 25 torr) 속에서 약 6시간 동안 추가로 건조시키고 건조기 속에 P₂O₅ 위에 저장한다. 당해 과정으로 약 26g(86% 수율) 수율의 순수한, 백색의 결정성 생성물이 수득된다. 당해 물질은 디스플레이서로서 사용하기에 적합하다. 아렌 설포네이트 음이온의 HPLC 순도는 출발 물질의 것(>99.8%)과 필수적으로 동일하다. 잔류하는 클로라이드 함량은 <0.2 mole%이고 잔류하는 나트륨은 <0.05 mole%이다.

예 9: 4- ⁿ 프로필비페닐 -4'- 설폰산(유리산, fw=276.36)의 제조

117.8g의 새로이 증류시킨 4-ⁿ프로필페닐(0.60 mole, fw=1 96.29, ~120 ㎖)을 300 ㎖의 교반하는, 무수 1,2-디클로로에탄에 환류 응축기, 자기 교반기, 500㎖의 첨가 깔때기 및 Teflon^® 피복된 열전쌍이 장착된 1L, 3-구 환저 플라스크 속에서 가한다. 유리제품 및 다른 장치들을 오븐 속에서 건조시켜 표면 습윤을 제거한다. 환류 응축기는 안전성 예방주의로서 외에는 실제로 요구되지 않는다. 반응을 무수 질소 대기 하에서 느린 N₂　퍼지로 수행한다. 주위 온도에서, 300 ㎖ 무수 1,2-디클로로에탄 중 69.92g의 클로로설폰산(0.60 mole, fw=116.53, ~40 ㎖)을 적가 방식으로 교반하는 반응 혼합물에 전체 첨가가 약 60분내에 완료되는 속도(~5-6 ㎖/min)로 가한다. 온화한 발열 반응이 관찰된다. 모든 클로로설폰산이 첨가된 후, 혼합물을 주위 온도에서 약 20시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 HPLC로 주기적으로 모니터링한다. 20 시간 후에, 잔류하는 ⁿ프로필비페닐의 양이 원래의 양의 5 내지 10%가 되면, 반응은 완료된 것으로 고려한다. 그렇지 않으며, 디클로로에탄 중 추가의 클로로설폰산을, 혼합물을 추가로 12시간 교반시키면서 가한다. 반응의 종료시 주요 생성물 외에, 일부의 반응하지 않은 부틸비페닐(~5%)이 모노설폰화 이성체(~0.2%) 및 일부 디설폰화(~2%)와 함께 관찰되며, 이들은 모두 추출 또는 재결정화에 의해 후속적으로 제거된다. 당해 시점에서, 반응 용액은 투명한 황색 용액이다. 혼합물을 습윤된 공기에 노출시키지 않고, 용매 및 HCl 부산물을 진공하에 제거하여 연갈색의 오일성 생성물을 수득한다. 기체상 HCl을 저온 트랩을 사용하기 전에 KOH 펠릿들을 함유하는 트랩을 사용하여 제거함으로써 용매 및 다른 휘발물질들을 보유시킨다. 최종적으로, 생성물을 고 진공(0.01 torr)하에 24 시간 동안 주위 온도에 두어서 휘발물질들의 제거를 완료한다. 4-ⁿ프로필비페닐-4'-설폰산(유리산)의 이러한 제조를 후속적인 디스플레이서 제조들에 사용한다.

예 10: 4- ⁿ 프로필비페닐 -4'- 설폰산 일수화물 (디스플레이서 632; OH ₃ ⁺ 　염, fw=294.37)의 제조

1,2-디클로로에탄 또는 HCl을 제거하기 전 예 9로부터의 최종 반응 용액에 10.8g의 정제수를 30분의 기간에 걸쳐 교반하면서 적가 방식으로 조심스럽게 가한다. 물 첨가 동안, 일수화물의 백색 결정들이 용액으로부터 침착된다. 혼합물을 60분 동안 실온에서 교반한 후 약 0℃로 냉각시키고 당해 온도에서 2시간 동안 정치되도록 한다. 냉 혼합물을 소결된 유리를 사용하여 무수 N₂　대기 속에서 여과하고, 디클로로에탄, 사이클로펜탄 및 최종적으로 n-펜탄으로 세척한다. 생성물을 여과기 케이크를 통해 무수 N₂를 통과시켜 건조시키고 최종적으로 진공 오븐(45℃, 25 torr) 속에서 약 6시간 동안 건조시킨다. 백색 고체를 건조기 속에서 P₂0₅ 위에 유지시킨 밀봉된 용기 속에 저장한다. 당해 과정으로 약 128g(반응된 프로필페닐의 양을 기준으로 79% 수율)의 흡습성, 백색 결정성 고체가 수득되며, 이는 HPLC에 의해 98 내지 99% 순수하다. 일반적으로, 알킬비페닐 설폰산들의 일수화물들은 실온에서 디클로로에탄으로부터 백색 고체들로서 우수하게 결정화된다.

예 11: 4- ⁿ 프로필페닐 -4'- 설폰산 , 트리메틸암모늄 염(디스플레이서 634; fw=355.47)의 제조

58.8g의 4-ⁿ프로필페닐-4'-설폰산 일수화물(예 10, 200mmole, fw=294.37)을 175㎖의 무수 에탄올 속에 용해한다. 입상체들이 존재하는 경우, 용액을 소결된 유리를 통해 여과한다. 주위 온도에서 당해 교반 용액을 통해, 기체상 트리메틸아민을, 이것이 염기성(pH 페이퍼)이 될 때까지 용액내로 조심스럽게 버블링한다. 당해 용액은, 산이 아민에 의해 중화되면서 현저하게 가온되며, 온도는 50 내지 55℃로 상승된다. 실온에서 약 1시간 동안 냉각 및 정치시키면, 백색 결정들의 덩어리가 용액으로부터 분리된다. 약 450㎖의 디에틸 에테르를 가하고 혼합물을 다시 주위 온도에서 약 1시간 동안 교반한다. 혼합물을 소결된 유리를 사용하여 무수 N₂　대기하에 여과하고, 디에틸 에테르로 2회 세척하고 무수 N₂를 여과기 케이크를 통해 통과시켜 건조시킨다. 생성물을 가온된 무수 에탄올로부터 2회 재결정화하고 앞서와 같이 세척/건조한다. 최종적으로, 생성물을 진공 오븐(45℃, 25 torr) 속에서 약 6시간 동안 건조시킨다. 백색 고체를 건조기 속에서 P₂O₅ 위에 유지시킨 밀봉된 용기 속에 저장한다. 당해 과정으로 약 65g(92% 수율)의 백색 결정성 고체가 수득되며, 이는 HPLC에 의한 순도가 >99.5%이다. Na⁺, NH₄ ⁺　및 다른 알킬암모늄 염들을 유사하게 제조한다.

예 12: 7- 페닐헵탄 -1- 설폰산 , 나트륨 염(디스플레이서 660; fw =278.35)의 제조

25.5g의 새로이 증류된 1-브로모-7-페닐헵탄(100mmole, fw=255.20) 및 190㎖의 아세토니트릴을 가열 맨틀, 기계적 교반기, 환류 응축기 및 Teflon^® 피복된 열전쌍이 장착된 1-리터들이, 3-구 환저 플라스크 속에 둔다. 반응을 질소 대기 하에 느린 N₂　퍼지로 수행한다. 50.4g의 아황산나트륨(400mmole, fw=126.04)을 150 ㎖의 가온된 정제수에 가하고 당해 용액을 여과하여 입상체들을 제거한다. 수성 아황산염 용액을 모두 한번에 반응 플라스크에 가하고, 반응 혼합물을 76℃에서 약 20시간 동안 격렬한 기계적 교반과 함께 가열한다. 반응 혼합물을 밤새 15 내지 20℃에서 정치시켜 혼합물이 2개 층으로 완전 분리되도록 한다. 층들을 분리하고, 상부 층(생성물과 아세토니트릴)을 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 이후에, 용매를 진공하에 제거하고, 백색 결정성 생성물을 형성시킨다. 혼합물을 소결된 유리 여과기를 사용하여 여과하고, 과산화물이 없는 디에틸 에테르로 수회 세척하고 여과기 상에서 무수 N₂를 여과기 케이크를 통해 건조시킨다. 생성물을 진공 오븐(50℃, 15 torr) 속에서 밤새 추가로 건조시킨다. 당해 과정으로 약 23.9g(86% 수율)의 백색 결정성 고체를 수득하며 이는 HPLC에 의한 순도가 >99%이다.

예 13: L-N- 옥타노일 -2- 페닐글리신 , 유리산( fw =277.36)의 제조.

28.42g의 L-2-페닐글리신(188mmole, >98% ee, fw=151 .1 7, S-거울상이성체)을 200㎖의 정제수에 온도계, 자기 교반기 및 외부 냉각기가 장착된 개방된 750㎖의 얼렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask) 속에서 현탁시킨다. 13.60g의 50% NaOH(170mmole, fw=40.00) 용액을 15분의 기간에 걸쳐 적가한다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후 10 내지 15℃로 냉각시킨다. 13.83g의 새로이 증류된 옥타노일 클로라이드(85mmole, fw=162.66)를 적가 방식으로 15분의 기간에 걸쳐 가한 후, 혼합물을 10 내지 15℃에서 추가로 60분 동안 교반한다. NaOH 용액에 이어 옥타노일 클로라이드들을 교반하면서 2회 이상의 첨가를 수행한다: 8.96g의 50% NaOH, 9.16g의 옥타노닐 클로라이드, 1시간 동안 10 내지 15℃에서 교반, 7.52g의 50% NaOH, 7.59g의 옥타노일 클로라이드, 3시간 동안 실온에서 교반. 혼합물을 소결된 유리를 통해 여과하고, 여액을 10 내지 15℃로 냉각하고, 진한 수성 HCl(시약, 37%)을 pH가 약 1(pH 페이퍼)이 될 때까지 적가한다. 산 첨가 동안에, 미정제 생성물로서 투명한 오일 층 또는 점성 고체 형태가 용액으로부터 배출된다. 250㎖의 과산화물이 없는 디에틸 에테르를 교반하면서 가하여 에테르 중 생성물을 취한다. 층들을 분리하고, 상부 에테르 층을 무수 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 황산마그네슘은 여과로 후속적으로 제거하며, 에테르는 진공하에 제거하여 무색 오일 또는 점성의 결정성 덩어리를 남긴다. 당해 물질을 최소량의 약간 가온된(30℃) 디에틸 에테르에 넣은 후, -20℃에서 밤새 결정화되도록 한다. 냉 혼합물을 소결된 유리를 사용하여 신속하게 여과한 후, n-펜탄으로 세척하고 진공(0.01 torr)하에 주위 온도에서 최종적으로 건조시켜 순수한 백색 결정성 고체(~42 g, 81 % 수율)를 수득한다.

예 14: L-N- 옥타노일 -2- 페닐글리신 , 트리메틸암모늄 염( fw =336.48)의 제조

L-N-옥타노일-2-페닐글리신, 유리산(g당 5 ㎖의 에테르)의 무수의, 건조되고 여과된 디에틸 에테르 용액을 적합한 얼렌마이어 플라스크에 두고 주위 온도에서 자기적으로 교반한다. 기체상 트리메틸아민(>99%)을, 온도를 30℃ 이하로 유지시키는 동안 교반하는 에테르 용액에 서서히 버블링시킨다. 즉시, 트리메틸암모늄 염의 백색 결정들이 용액으로부터 결정화된다. 상층 액체가 충분히 염기성(pH > 8, damp pH 페이퍼)인 경우, 아민의 첨가를 종결하고, 혼합물을 5℃에서 2시간 동안 정치시킨다. 냉 혼합물을 소결된 유리를 통해 신속하게 여과하고, 에테르로 세척한 후 진공하에 건조시켜 거의 정량적 수율(>95%)의 트리메틸암모늄 염을 수득한다. 생성물을 무수 에탄올/디에틸 에테르로부터 1회 재결정화하여 >99.5%의 HPLC 순도를 수득한다. 옥탄산 또는 이의 염은 검출되지 않는다. 백색 고체를 실온에서 건조기 속에 P₂O₅ 위에서 유지시킨 밀봉된 용기 속에 저장한다.

예 15: 디( ⁿ 부틸암모늄 ) 메탄포스포네이트 (fw=244.30)의 제조

오염을 방지하기 위하여, 조심스럽게 세정된 보로실리케이트 유리제품, 비이커들, 플라스크들, 프릿화된 유리 여과기 및 피펫들을 사용하고; 유기 추출가능한 플라스틱 랩웨어(labware)는 피한다. 32.62g의 새로이 증류된 n-부틸아민(440mmole, fw=74.138)을 적가 방식으로 약 15분에 걸쳐 110㎖의 HPLC-등급의 변성된 에탄올(90/5/5 w/w 에탄올/메탄올/2-프로판올) 속에 용해된 19.21g의 새로이 재결정화된 메탄포스폰산(200mMole, fw=96.023)에 가한다. 아민 첨가 과정 동안, 현저한 발열이 있다. 따뜻한 용액을 70℃로 잠시 가온한 후 실온으로 약 6시간 동안 냉각되도록 하여 결정화를 개시한다. 이후에, 110㎖의 과산화물이 없고, 억제제가 없는 디에틸 에테르를 가하고, 혼합물을 교반한 후 밤새 -20℃에서 정치되도록 한다. 디-암모늄 염을 소결된 유리를 사용하여 여과하고, 디에틸 에테르로 2회 세척하고, HPLC-등급 n-펜탄으로 1회 세척하고 여과기 케이크를 통해 무수 질소를 흡인시켜 건조시킨다. 재결정화 공정을 백색 결정성 생성물을 적절한 더운 변성된 에탄올 속에 용해시켜 2회 반복한다. 최종의 재결정화 후, 생성물을 진공 오븐(45℃, 25 torr) 속에서 약 6시간 동안 추가로 건조시킨 후 건조기 속에서 P₂O₅ 위에서 저장한다. 당해 과정으로 약 43g(88% 수율)의 안정하고, 용매가 없는, 약하게 흡습성인, 백색 결정성 염이 수득되며, 이는, HPLC 완충제들에 10 내지 100mM의 범위에서 가하기에 충분히 순수하다.

일반적으로, HPLC 완충제들로서 사용하기 위한 HPLC-등급 아민들 및 산들은 트리에틸아민 및 포스폰산과 같이 일반적으로 사용되는 매우 제한된 범위의 시약들의 경우를 제외하고는 수득하기 어렵다. 이러한 이유로, HPLC 용도들을 위한 완충 음이온들의 안정하고, 고-순도인 암모늄 염들을 수득하는 것이 유용하다. 암모늄 염들은 상응하는 유리 아민들보다 화학적으로 보다 더 안정하며, 이들은 순수한 아민들 자체들보다 취급하기가 더 용이하다. 약간의 변형들이 있는 이러한 일반적인 과정을 사용하여 메탄포스폰산, 인산 및 아인산의 정제된 디-암모늄 염들을 제조한다. 우수한 품질의 HPLC-등급의 인산, 우수한 품질, 새로이 재결정화된, 고체 아인산 또는 메탄포스폰산이 사용된다. 액체 아민들을 사용 전에 증발시켜 많은 불순물을 제거한다. 고 순도(>99%) 기체상 아민들, Me₃N, Me₂NH, MeNH₂, EtNH₂는 가압된 실린더들로부터 기체 형태로 전달된다. 일반적으로, 이들 아민들의 시판되는 수용액들은 사용하기에 충분히 순수하지 않다. 수중(~35% w/w) 고 순도, 4차 수산화암모늄 용액을 또한 사용한다. 2개 용매들, HPLC-등급 메탄올 또는 HPLC-등급 변성된 에탄올 중 어느 하나를 염의 그램당 2 내지 20 ㎖의 용매의 사용 비율로 결정화를 위해 사용한다. 광범위한 결정성 디-암모늄 염들이 당해 방법을 사용하여 제조된다.

[표 V]

[표 VI]

[표 VII]

[표 VIII]

[표 IX]

[표 X]

[표 XI]

[표 XII]

[표 XIII]

Claims (9)

1. 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법으로서,
   소수성 정지 상(hydrophobic stationary phase)을 제공하는 단계와,
   상기 소수성 정지 상에, 분리될 유기 화합물을 포함하는 혼합물을 가하는 단계와,
   비-표면 활성의 소수성 음이온 디스플레이서 분자를 포함하는 수성 조성물을 가하여 상기 소수성 정지 상으로부터 상기 유기 화합물을 치환하는 단계와,
   분리된 유기 화합물을 함유하는 상기 소수성 정지 상으로부터 용리된 복수의 분획을 수거하는 단계를
   포함하는, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법에 있어서,
   상기 비-표면 활성의 소수성 음이온 디스플레이서 분자는 다음 화학식 A 또는 B를 갖는, 소수성 음이온 및 반대 이온(counterion, CI)을 포함하고,
   [CM][CI]_d (A) [CM-R^*-CM'][CI]_d (B)
   상기 화학식 A 및 B에서,
   각각의 CM 또는 CM'는, 카르복시레이트(XVI), N-아실-α-아미노산(XVII), 설포네이트(XVIII), 설페이트 모노에스테르(XIX), 포스페이트 모노에스테르(XX), 포스페이트 디에스테르(XXI), 포스포네이트 모노에스테르(XXII), 포스포네이트(XXIII), 테트라아릴 보레이트(XXIV), 보로네이트(XXV), 보로네이트 에스테르(XXVI)로부터 선택된 음 형식 전하(negative formal charge)를 갖는 독립적인 소수성 화학 잔기이고, 상기 화학 잔기 (I) 내지 (XXVI)는 다음의 화학 구조를 가지며,
   

   

   
   상기 화학식 B에서,
   CM 및 CM'는, 서로 동일하거나 반대의 형식 전하를 갖는 독립적인 하전 화학 잔기이고, 이중 연결 화학 잔기 R^*에 의해 서로 화학적으로 부착되며, 상기 이중 연결 화학 잔기는 CM 상에서 하나의 R¹, R²　(존재하는 경우), R³　(존재하는 경우) 또는 R⁴　(존재하는 경우) 화학 잔기를 치환하고, CM' 상에서 하나의 R^1', R^2'　(존재하는 경우), R^3'　(존재하는 경우) 또는 R^4'　(존재하는 경우) 화학 잔기를 치환하며,
   R¹, R^1', R², R^2', R³, R^3', R⁴ 및 R^4' 각각은 화학식 -C_xX_{2x -2r}-AR¹-C_uX_{2u -2s}-AR²로 독립적으로 정의된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이고,
   R^*는 직접 화학 결합이거나 또는 화학식 -C_xX_{2x -2r}-AR¹-C_uX_{2u -2s}-로 정의된 이중 연결된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이며,
   R⁵는 화학식 -C_xX_{2x -2r}-AR²로 정의된 직쇄 또는 측쇄 화학 잔기이고,
   상기 화학식에서,
   각각의 AR¹은, 독립적으로, 이중 연결된 메틸렌 잔기(-CX¹X²-, 메탄으로부터), 이중 연결된 페닐렌 잔기(-C₆G₄-, 벤젠으로부터), 이중 연결된 나프틸렌 잔기(-C₁₀G₆-, 나프탈렌으로부터) 또는 이중 연결된 비페닐렌 잔기(-C₁₂G₈-, 비페닐로부터)이고,
   AR²는, 독립적으로, 수소(-H), 플루오르(-F), 페닐 그룹(-C₆G₅), 나프틸 그룹(-C₁₀G₇) 또는 비페닐 그룹(-C₁₂G₉)이며,
   각각의 X, X¹　및 X²는, 개별적 및 독립적으로, -H, -F, -Cl 또는 -OH이고,
   임의의 -C_xX_{2x -2r}- 또는 임의의 -C_uX_{2u -2s}- 또는 임의의 -(CX¹X²)_P- 내의 임의의 메틸렌 잔기(-CX¹X²-)는, 개별적 및 독립적으로, 독립적인 에테르-산소 원자, -O-, 독립적인 티오에테르-황 원자, -S-, 또는 독립적인 케톤-카보닐 그룹, -C(O)-로, 각각의 에테르-산소 원자, 각각의 티오에테르-황 원자 또는 각각의 케톤-카보닐 그룹이 지방족 탄소 원자 또는 방향족 탄소 원자에 각각의 측면에 결합되는 방식으로 치환될 수 있으며,
   2개 이하의 에테르-산소 원자, 2개 이하의 티오에테르-황 원자, 및 2개 이하의 케톤-카보닐 그룹은 임의의 -C_xX_{2x -2r}- 또는 임의의 -C_uX_{2u -2s}-로 치환될 수 있고,
   m_x는, 에테르-산소 원자, 티오에테르-황 원자, 및 케톤-카보닐 그룹으로 치환된 각각의 -C_uX_{2x -2r}- 내의 메틸렌 그룹의 총 수이고, m_u는 에테르-산소 원자, 티오에테르-황 원자, 및 케톤-카보닐 그룹으로 치환된 각각의 -C_uX_{2u -2s}- 내의 메틸렌 그룹의 총 수이며,
   G는, 개별적 및 독립적으로, -H, -F, -Cl, -CH₃, -OH, -OCH₃, -N(CH₃)₂, -CF₃, -CO₂Me, -CO₂NH₂; -CO₂NHMe, -CO₂NMe₂의 임의의 조합이고,
   G^*는, 개별적 및 독립적으로, -F, -Cl, -R², -OH, -OR², -NR²R³, -CF₃, -CO₂Me, -CO₂NH₂; -CO₂NHMe, -CO₂NMe₂의 임의의 조합이며,
   R², R^2', R³, R^3', R⁴ 및 R^4'의 쌍은, R²/R³, R²/R⁴, R³/R⁴, R^2'/R^3', R^2'/R^4'　또는 R^3'/R^4'가 개별적 및 독립적으로 -(CX¹X²)p-(p = 3, 4, 5 또는 6)이도록 단일 화학 잔기를 포함할 수 있고,
   x, r, u, s, m_x, m_u의 각각의 정수 값은, 각각의 R¹, R^1', R², R^2', R³, R^3', R⁴, R^4', R⁵　및 R^*에 대하여 독립적으로 선택되고, 정수 값 r과 s는, 포함되고, 분리된 시스/트랜스 올레핀계(알켄) 그룹의 총 수 + 포함된 단순 모노사이클릭 구조의 총 수이며, 범위 0≤r≤2와 0≤s≤2에 속하고, 수치량(numeric quantity) x+u-m_x-m_u는 범위 0≤x+u-m_x-m_u≤11에 속하며,
   적어도 하나의 방향족 화학 잔기, 헤테로사이클릭 방향족 화학 잔기, 이미다졸린 화학 잔기, 아미딘 화학 잔기 또는 구아니딘 화학 잔기는, A 또는 B의 CM 또는 CM' 내에 포함되고,
   각각의 R-화학 잔기에 대한 그룹-소수성-지수(n)는, 지방족 탄소 원자의 수 + 올레핀계 탄소 원자의 수 + 티오에테르-황 원자의 수 + 염소 원자의 수 + 플루오르 원자의 수의 1/5 + 에테르-산소 원자의 수의 1/2 + 케톤-탄소 원자의 수의 1/2 + 수 6을 넘는 방향족 탄소 원자의 수의 1/2의 합 - 수 1을 넘는 하이드록실-산소 원자의 수와 동일하며,
   각각의 [CM] 또는 [CM-R^*-CM']에 대한 전체-소수성 지수(N)는, 지방족 탄소 원자의 수 + 올레핀계 탄소 원자의 수 + 티오에테르-황 원자의 수 + 염소 원자의 수 + 플루오르 원자의 수의 1/5 + 에테르-산소 원자의 수의 1/2 + 케톤-탄소 원자의 수의 1/2 + 수 6을 넘는 방향족 탄소 원자의 수의 1/2의 합 - 수 1을 넘는 하이드록실-산소 원자의 수와 동일하고,
   R¹　및 R^1'에 대한 그룹-소수성 지수(¹n 및　^1'n)는, 범위 4.0 <　¹n, ^1'n < 12.0에 속하고, R², R^2', R³, R^3', R⁵, R^5', R^*에 대한 그룹-소수성 지수(²n,　^2'n, ³n,　^3'n,　⁵n,　^5'n, 및 ^*n)는, 존재하는 경우, 범위 0.0 ≤　²n, ^2'n,　³n, ^3'n,　⁵n, ^5'n, ^*n < 12.0에 속하며, R⁴　및 R^4'에 대한 그룹-소수성 지수(⁴n 및　^4'n)는, 존재하는 경우, 범위 0.0 ≤　⁴n, ^4'n ≤ 5.0에 속하고,
   g의 값으로 나눈 전체-소수성-지수(N)는, 범위 10.0 ≤ N/g < 24.0에 속하며,
   A에서, 하전된 잔기 CM이 형식 음성 전하를 갖는 경우, g=1이고, B에서, CM 및 CM' 둘 다가 형식 음성 전하를 갖는 경우, g=2이며, B에서 CM 및 CM'가 [CM-R^*-CM']의 전체 전하를 갖는 반대의 형식 전하를 갖는 경우, g=1이고,
   사이클릭 화학 잔기에 대해 계산된 그룹-소수성-지수의 수치 값은, 2개의 각각의 R-화학 잔기 사이에 동일하게 나누어지며,
   R¹ 또는 R^1'은, 단지 하나의 R-화학 잔기가 CM 또는 CM'에 부착되는 경우 이러한 R-화학 잔기로 정의되고, 여기서 R¹ 또는 R^1'은, CM 또는 CM'에 부착된 하나 이상의 R-화학 잔기가 존재하는 경우 그룹-소수성-지수의 최대 값을 갖는 이러한 R-화학 잔기로 정의되며, 여기서 R⁴ 또는 R^4'은, CM 또는 CM'에 부착된 3개 이상의 R-화학 잔기가 존재하는 경우 그룹-소수성-지수의 최소값을 갖는 이러한 R-화학 잔기로 정의되고,
   CI는, 비-간섭하는, 반대로 하전된 반대 이온 또는 이러한 반대 이온의 혼합물이고, d의 값은, 전체 소수성 화합물의 전기중성(electroneutrality)이 유지되도록 하는 0, 양의 정수 또는 양의 분수인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 비-표면 활성의 소수성 음이온 디스플레이서 분자를 포함하는 상기 수성 조성물은, pH 완충제 이외의 추가된 염을 함유하지 않는, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   CM은 다음 화학식 XXIV 또는 XXV를 갖고,
   

   

   
   상기 화학식 XXIV에서, R¹은 페닐, 4-EtC₆H₄-, 4-ⁿPrC₆H₄-, 4-ⁿBuC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-FC₆H₄-, 4-MeC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-EtC₆H₄-, 4-ClC₆H₄-, 또는 C₆F₅-이고, 각각의 R², R³ 및 R⁴는, 독립적으로, 페닐, 4-FC₆H₄-, 4- MeC₆H₄-, 4-MeOC₆H₄-, 4-EtC₆H₄-, 4-ClC₆H₄- 또는 C₆F₅-이며, 상기 화학식 XXV에서, R¹은, 4-(4-ⁿBuC₆H₄)C₆H₄- 또는 4-(4-ⁿBuC₆H₄)-3-ClC₆H₃-인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은, 4-R¹C₆H₄SO₃H, 5-R¹-2-HO-C₆H₃SO₃H, 4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-4'-SO₃H, 및 4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-3'-SO₃H로부터 선택된 화학식을 갖고, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n이고, 여기서 n은 4 내지 10이며, X는 H 또는 OH인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   CM은 다음 화학식 XVIII 및 화학식 XXIII을 갖고,
   

   

   
   상기 화학식 XVIII 및 화학식 XXIII에서, R¹은 C₆H₅(CH₂)_n-이고, 여기서 n은 5 내지 11인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은, 5-R¹-2-HO-C₆H₃CO₂H와 R¹C(O)NHCH(C₆H₅)CO₂H로부터 선택된 화학식을 갖고, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n-이고, 여기서 n은 4 내지 10인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, CM은 화학식 4-R¹C₆H₄PO₃H₂이고, 여기서 R¹은 CH₃(CH₂)_n-이고, 여기서 n은 4 내지 10인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
   CI는, 그룹들: 알칼리 금속 이온(Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺, Cs⁺), 알칼리 토금속 이온(Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Sr^{2 +}, Ba^{2 +}), 2가 전이 금속 이온(Mn^{2 +}, Zn^{2 +}), 및 NH₄ ⁺로부터 선택된 비-간섭 무기 양이온 또는 이러한 비-간섭 양이온의 혼합물이고, 여기서 CI는, C₁-C₆　알킬 그룹 및/또는 C₂-C₄　하이드록시알킬 그룹을 포함할 수 있는 양자화된 1차 아민(1+), 양자화된 2차 아민(1+), 양자화된 3차 아민(1+), 양자화된 디아민(2+), 4차 암모늄 이온(1+), 설포늄 이온(1+), 설폭소늄 이온(1+), 포스포늄 이온(1+), 비스-4차 암모늄 이온(2+)으로부터 선택된 비-간섭 유기 양이온 또는 이러한 비-간섭 양이온의 혼합물인, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 비-표면 활성의 소수성 음이온 디스플레이서 분자를 포함하는 상기 수성 조성물은, 약 25 부피% 이하의 유기 용매를 포함하는, 역-상 치환 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 유기 화합물을 분리하는 방법.

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