CN111655349B - 用于生物分子的高灵敏度、高分离度lc-ms的二氟乙酸离子配对试剂 - Google Patents
用于生物分子的高灵敏度、高分离度lc-ms的二氟乙酸离子配对试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111655349B CN111655349B CN201980010713.7A CN201980010713A CN111655349B CN 111655349 B CN111655349 B CN 111655349B CN 201980010713 A CN201980010713 A CN 201980010713A CN 111655349 B CN111655349 B CN 111655349B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mobile phase
- stationary phase
- analyte
- sample
- dfa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/424—Elution mode
- B01D15/426—Specific type of solvent
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/16—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the fluid carrier
- B01D15/166—Fluid composition conditioning, e.g. gradient
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
- B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/282—Porous sorbents
- B01J20/283—Porous sorbents based on silica
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
- B01J20/287—Non-polar phases; Reversed phases
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
- G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
- G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/84—Preparation of the fraction to be distributed
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/30—Partition chromatography
- B01D15/305—Hydrophilic interaction chromatography [HILIC]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/84—Preparation of the fraction to be distributed
- G01N2030/8447—Nebulising, aerosol formation or ionisation
- G01N2030/8452—Generation of electrically charged aerosols or ions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本公开涉及使用色谱法确定样品中的分析物。本公开提供了从样品中分离分析物的方法。使流动相流过色谱柱。所述流动相包含约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的二氟乙酸和小于约100ppb的任何单独的金属杂质。将包含所述分析物的样品注射到所述流动相中。从所述样品中分离所述分析物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年1月29日提交的名称为“Difluoroacetic Acid Ion PairingReagent for High Sensitivity,High Resolution LC-MS of Proteins”的美国临时专利申请号62/623,059的优先权,该申请的整个内容据此以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及从样品中分离分析物的方法。更具体地,本公开涉及高纯度二氟乙酸作为高分离度液相色谱-质谱中的流动相以从样品中分离和检测分析物的用途。
背景技术
质谱(“MS”)是测量由样品形成的带电分子或分子片段的质荷比的分析技术。MS用于分析感兴趣的样品的质量、化学组成和/或化学结构。一般来讲,MS包括三个步骤:将样品离子化以形成带电分子或分子片段(即,离子);根据其质荷比率分离离子;以及检测所分离的离子以形成质荷信号(即,光谱)。离子的形成可通过常规MS电离技术来实现,常规MS电离技术诸如例如电喷雾电离(ESI)、快速原子轰击(FAB)、化学电离(CI)、电子轰击(EI)、大气固体分析电离(ASAI)、大气压力光致电离(APPI)、解吸电喷雾电离(DESI)、大气压力蒸气源(APVS)或基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。
存在许多不同类型的MS设备。例如,扇形质谱仪、飞行时间质谱仪、四极杆质谱仪、离子阱质谱仪、傅立叶变换离子回旋共振质谱仪和串联质谱仪(以上质谱仪中的两个或更多个串联或正交组合)都是被认为是MS设备的不同仪器。MS分析的某些特征包括例如质量准确性、分离度、灵敏度、动态范围、选择性和特异性等。
蛋白质反相液相色谱(“RPLC”)在很大程度上取决于其运行条件。迄今为止,只有通过使用与疏水性酸性流动相添加剂如三氟乙酸(“TFA”)的离子配对,才能实现最佳分离能力。然而,已知TFA抑制电喷雾电离质谱信号,并且由于其能够与带正电的分析物离子形成气相离子对而产生干扰,因而使MS谱复杂化。因此,一些人优选较弱的离子配对添加剂甲酸。然而,利用甲酸流动相,蛋白质RPLC方法不能接近其最佳分离能力。
多年来,已提出若干种另选的流动相添加剂。在2002年,Monroe和同事提出使用一氟乙酸进行肽LC-MS分析,表明其可提供比甲酸略好的色谱以及比TFA更好的离子产率。Monroe,M.E.,“Development of Instrumentation and Applications for MicrocolumnLiquid Chromatography Coupled to Time-of-Flight Mass Spectrometry”,TheUniversity of North Carolina at Chapel Hill,2002年。然而,考虑到一卤代酸的急性毒性和破坏柠檬酸循环的能力,对任何一卤代酸的使用引起了深切关注。在寻找另一种可行的另选酸改性剂时,Monroe和同事考虑使用DFA,但未能继续更多的工作。同上
Yamamoto等人探究了使用DFA进行小分子、碱性分析物诸如丙咪嗪和纳多洛尔的反相分离和MS检测的用途。Yamamoto,E.等人,“Application of partially fluorinatedcarboxylic acids as ion-pairing reagents in LC/ESI-MS”,Talanta,2014年,第127卷,第219-224页。分析表明,DFA在增加分析物的色谱保留值方面几乎与TFA一样有效,但是它可在不显著损害电离的情况下增加分析物的色谱保留值。同上
Wagner等人公布了TFA对DFA的一对一交换的影响及其在0.1%(v/v)的常规流动相改性剂浓度下用于蛋白质RPLC的所得用途。Wagner,B.M.等人,“Tools to ImproveProtein Separations”,LCGC North America,2017年,第33卷第11期,第856-865页。Wagner和同事证实,使用任一种方法条件可获得完整单克隆抗体的类似色谱结果。同上Wagner提出但未证实,DFA可为一种对MS更友好的方法。
发明内容
需要用于生物分子(例如,蛋白质、肽和/或聚糖,并且更具体地用于表征蛋白质治疗剂诸如单克隆抗体(mAb)和抗体药物缀合物(ADC))LC-MS的流动相添加剂,该流动性添加剂解决了与使用TFA相关联的问题,即,已知由于TFA能够与带正电的分析物离子形成气相离子对因而抑制电喷雾电离质谱信号并使质谱复杂化,但也保持色谱的最佳分离能力。流动相添加剂/改性剂不仅应实现高灵敏度检测,而且还应使色谱的分离度增加。该技术解决了生物分子LC-MS分析在实现高色谱分离度、高质谱灵敏度和质谱质量(即不含不期望的离子加合物)之间的平衡优化中存在的挑战。
为了解决与在生物分子(例如,蛋白质、肽和/或聚糖)LC-MS(例如,RPLC)中使用TFA相关的问题,该技术提供了基于低浓度的另选的酸,二氟乙酸(“DFA”),与或不与基于苯基的固定相一起使用的方法,该固定相能够产生对色谱性能和质谱性能两者的不可预见的优化。该技术也包括具有低含量金属杂质,例如小于约100ppb的任何单独的金属杂质的DFA的组合物。DFA的纯度导致能够实现足以使基于DFA的液相色谱-质谱(“LC-MS”)方法产生可解读数据的质谱(MS)质量。该技术也包括使用其他卤代酸,例如二氯乙酸或二溴乙酸。也可使用一卤代酸(例如一氟乙酸或一氯乙酸),但是由于一卤代酸能够作为柠檬酸循环的一部分被代谢,因而它是急性毒性的。
DFA的使用尚未成为生物分子LC-MS中的常规方案。已发现当前DFA源包含高浓度的钠和钾。这些盐加合物不会不利地影响分离,但它们确实破坏质谱的可解读性。因此,开发了LC-MS技术,该技术使用色谱分离度和MS灵敏度具有前所未有的平衡的纯化DFA。如本文所示,纯化的DFA提供比TFA高的MS灵敏度,并且它提供更好的色谱分离度。这些分析能力增加相当于适用于基于mAb的治疗剂(甚至包括高度疏水性半胱氨酸连接的ADC)的亚基水平表征的新LC-MS平台。与先前方法不同,这种基于纯化DFA的RPLC-MS方法几乎不显示柱上样品降解、分析物完全回收、值得注意的蛋白质变体分离度和高3倍的MS灵敏度,总而言之,这使得能够以更高的保真度检测和监测产物相关杂质的痕量水平。
本公开涉及一种从样品中分离分析物的方法。该方法包括使流动相流过色谱柱。流动相包含约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的二氟乙酸和小于约100ppb的任何单独的金属杂质。将包含分析物的样品注射到流动相中。从样品中分离分析物。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
本公开还涉及一种从样品中分离分析物的方法。该方法包括使流动相流过色谱柱。流动相包含约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的二氟乙酸。将包含分析物的样品注射到流动相中。从样品中分离分析物。用质谱仪检测分析物。质谱仪产生具有对应于金属或盐加合物的小于约5%相对离子强度的质谱。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
色谱柱可为液相色谱柱或反相色谱柱。色谱柱可为亲水作用色谱(“HILIC”)柱。色谱柱可包括具有基于苯基的表面化学物质的固定相。固定相可为与苯基部分键合的表面多孔型二氧化硅固定相。固定相可为与苯基部分键合的完全多孔型二氧化硅固定相。在一些实施方案中,固定相为与苯基部分键合的有机二氧化硅固定相。色谱柱可包括具有聚合物聚苯乙烯二乙烯基苯表面化学物质的固定相。
流动相可具有小于约50ppb的任何单独的金属杂质。流动相可具有小于约20ppb的任何单独的金属杂质。流动相可具有小于约90ppb、80ppb、70ppb、60ppb、50ppb、40ppb、30ppb、20ppb或10ppb的任何单独的金属杂质。单独的金属杂质可为例如钠、钾、钙、铁或它们的组合。
流动相可具有约0.01%(v/v)至约0.05%(v/v)的二氟乙酸。流动相可具有约0.02%(v/v)至约0.05%(v/v)的二氟乙酸。流动相可具有约0.01%(v/v)至约0.02%(v/v)的二氟乙酸。流动相还可包括水、乙腈、甲醇、丙醇、丁醇、戊醇或它们的组合。
分析物可以是生物分子。分析物可以是蛋白质、肽、聚糖或它们的组合。分析物可包括多种蛋白质、多种肽、多种聚糖或它们的组合。
该方法还可包括确定分析物例如生物分子的分子量。例如,该方法可包括确定蛋白质、肽、聚糖或它们的组合的分子量。
该方法还可包括用质谱仪检测分析物。分析物离子可由质谱仪产生。分析物离子可通过电喷雾电离或解吸电喷雾电离产生。可采集分析物离子的质谱。
本公开还涉及套件。套件包括色谱柱,该色谱柱具有包含在柱内部的固定相材料。套件还包括具有一定体积的流动相添加剂的安瓿。流动相添加剂包括二氟乙酸和小于约100ppb的任何单独的金属杂质。套件还包括说明书。说明书指示用户获得样品基质中包含至少一种生物分子(例如,蛋白质、肽、聚糖或任何组合)的样品,用溶剂稀释流动相添加剂以获得约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的二氟乙酸,用稀释的流动相使样品流过色谱柱以基本上分离和保留该至少一种生物分子(例如,蛋白质、肽、聚糖或任何组合),并且使用检测器检测该至少一种生物分子。套件可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
固定相材料可为与苯基部分键合的表面多孔型二氧化硅固定相。固定相可为与苯基部分键合的完全多孔型二氧化硅固定相。在一些实施方案中,固定相为与苯基部分键合的有机二氧化硅固定相。固定相材料可为聚合物聚苯乙烯二乙烯基苯表面化学物质。
本公开涉及一种套件,该套件包括色谱柱和容器,该色谱柱具有包含在柱内部的固定相材料,该容器具有一定体积的流动相。流动相具有约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的二氟乙酸和小于约100ppb的任何单独的金属杂质。套件也包括说明书,该说明书用于获得样品基质中包含至少一种生物分子(例如,蛋白质、肽、聚糖或任何组合)的样品,用流动相使样品流过柱以基本上分离和保留该至少一种生物分子(例如,蛋白质、肽、聚糖或任何组合),并且使用检测器检测该至少一种生物分子。套件可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
固定相材料可为与苯基部分键合的表面多孔型二氧化硅固定相。固定相可为与苯基部分键合的完全多孔型二氧化硅固定相。在一些实施方案中,固定相为与苯基部分键合的有机二氧化硅固定相。固定相材料可为聚合物聚苯乙烯二乙烯基苯表面化学物质。
本公开还涉及一种纯化包含大于100ppb杂质的二氟乙酸的方法。杂质可为钠、钾、钙、铁或它们的组合。该方法包括蒸馏二氟乙酸以获得包含小于100ppb杂质的高纯度二氟乙酸。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
高纯度二氟乙酸可包含小于50ppb的杂质。高纯度二氟乙酸可包含小于20ppb的杂质。在一些实施方案中,高纯度二氟乙酸可包含小于40ppb、小于30ppb或小于10ppb的杂质。
本公开提供了优于当前***和方法的许多优点。例如,纯化的DFA为生物分子(例如,蛋白质、肽、聚糖或任何组合)LC-MS提供相比于TFA对MS更友好的替代方案。此外,与TFA相比,纯化的DFA使色谱的分离度增加。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述,将更充分地理解本技术,在附图中:
图1A是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm BioResolve RP mAb Polyphenyl2.7μm色谱柱和0.1%TFA流动相改性剂观察到的。
图1B是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm BioResolve RP mAb Polyphenyl2.2μm色谱柱和0.1%FA流动相改性剂观察到的。
图1C是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm AMT Halo Protein C43.4μm色谱柱和0.1%TFA流动相改性剂观察到的。
图1D是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm AMT Halo Protein C43.4μm色谱柱和0.1%FA流动相改性剂观察到的。
图1E是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Agilent AdvanceBio RP-mAb Diphenyl3.5μm色谱柱和0.1%TFA流动相改性剂观察到的。
图1F是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Agilent AdvanceBio RP-mAb Diphenyl3.5μm色谱柱和0.1%FA流动相改性剂观察到的。
图1G是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Acquity UPLC Protein BEH C41.7μm色谱柱和0.1%TFA流动相改性剂观察到的。
图1H是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Acquity UPLC Protein BEH C41.7μm色谱柱和0.1%FA流动相改性剂观察到的。
图1I是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm BioResolve RP mAb Polyphenyl2.7μm色谱柱和0.01%DFA流动相改性剂观察到的。
图1J是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm BioResolve RP mAb Polyphenyl2.7μm色谱柱和0.02%DFA流动相改性剂观察到的。
图1K是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm BioResolve RP mAb Polyphenyl2.7μm色谱柱和0.1%DFA流动相改性剂观察到的。
图1L是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm AMT Halo Protein C43.4μm色谱柱和0.01%DFA流动相改性剂观察到的。
图1M是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm AMT Halo Protein C43.4μm色谱柱和0.02%DFA流动相改性剂观察到的。
图1N是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm AMT Halo Protein C43.4μm色谱柱和0.1%DFA流动相改性剂观察到的。
图1O是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Agilent AdvanceBio RP-mAb Diphenyl3.5μm色谱柱和0.01%DFA流动相改性剂观察到的。
图1P是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Agilent AdvanceBio RP-mAb Diphenyl3.5μm色谱柱和0.02%DFA流动相改性剂观察到的。
图1Q是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Agilent AdvanceBio RP-mAb Diphenyl3.5μm色谱柱和0.1%DFA流动相改性剂观察到的。
图1R是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Acquity UPLC Protein BEH C41.7μm色谱柱和0.01%DFA流动相改性剂观察到的。
图1S是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Acquity UPLC Protein BEH C41.7μm色谱柱和0.02%DFA流动相改性剂观察到的。
图1T是根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的色谱图,如使用2.1mm×50mm Acquity UPLC Protein BEH C41.7μm色谱柱和0.1%DFA流动相改性剂观察到的。
图2A是示出根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的有效峰容量值的曲线图,如使用不同2.1mmm×50mm色谱柱和0.1%TFA流动相改性剂观察到的。
图2B是示出根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的有效峰容量值的曲线图,如使用不同2.1mm×50mm色谱柱和0.01%DFA流动相改性剂观察到的。
图2C是示出根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的有效峰容量值的曲线图,如使用不同2.1mm×50mm色谱柱和0.02%DFA流动相改性剂观察到的。
图2D是示出根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的有效峰容量值的曲线图,如使用不同2.1mmm×50mm色谱柱和0.1%DFA流动相改性剂观察到的。
图2E是示出根据本技术的例示性实施方案的还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的有效峰容量值的曲线图,如使用不同2.1mm×50mm色谱柱和0.1%FA流动相改性剂观察到的。
图3A是示出用于检测还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的轻链亚基的LC-MS灵敏度的曲线图,如使用可以商品名“BioResolveTM RP mAb Polyphenyl 2.1mm×50mm色谱柱”从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))商购获得的LC色谱柱和可以商品名“单四极杆质量检测器”从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))商购获得的检测器观察到的。图3A示出了根据本技术的例示性实施方案的由于使用不同流动相改性剂得到的总离子色谱(TIC)峰高度。
图3B是示出用于检测还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的轻链亚基的LC-MS灵敏度的曲线图,如使用可以商品名“BioResolveTM RP mAb Polyphenyl 2.1mm×50mm色谱柱”从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))商购获得的LC色谱柱和可以商品名“单四极杆质量检测器”从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))商购获得的检测器观察到的。图3B示出了根据本技术的例示性实施方案的由于使用不同流动相改性剂得到的TIC信噪比。
图4A是用于NIST标准物质8671的轻链亚基的解卷积ESI质谱,如使用0.1%(v/v)TFA和可以商品名G2-Si从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(WatersCorporation(Milford,MA))商购获得的质谱仪观察到的。根据本技术的例示性实施方案,报告不期望的离子加合物(包括Na和K)的相对强度。
图4B是用于NIST标准物质8671的轻链亚基的解卷积ESI质谱,如使用0.1%(v/v)DFA和可以商品名G2-Si从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(WatersCorporation(Milford,MA))商购获得的质谱仪观察到的。根据本技术的例示性实施方案,报告不期望的离子加合物(包括Na和K)的相对强度。
图5为示出在DFA(奥克伍德公司(Oakwood),部件号001231,批号D06N)的样品中通过电感耦合等离子体(ICP)-MS量化的金属杂质的图表。根据本技术的例示性实施方案,浓度以十亿分之一(“ppb”)报告。
图6A示出了根据本技术的例示性实施方案的钠和钾含量对通过ICP-MS定量的原样DFA对蒸馏DFA的透光光谱质量的影响。用BioResolve RP mAb Polyphenyl2.7μm2.1mm×50mm色谱柱,使用0.2mL/min的流速,80℃的柱温和0.25μg质量载荷进行分离。
图6B是根据本技术的例示性实施方案的使用原样DFA获得的NIST mAb LC亚基的解卷积质谱。用BioResolve RP mAb Polyphenyl2.7μm 2.1mm×50mm色谱柱,使用0.2mL/min的流速,80℃的柱温和0.25μg质量载荷进行分离。
图6C是根据本技术的例示性实施方案的使用蒸馏DFA获得的NIST mAb LC亚基的解卷积质谱。用BioResolve RP mAb Polyphenyl2.7μm 2.1mm×50mm色谱柱,使用0.2mL/min的流速,80℃的柱温和0.25μg质量载荷进行分离。
图7A示出了如用C4键合的有机二氧化硅完全多孔型固定相、0.6mL/min流速、80℃温度、0.1%TFA改性的流动相和90:10CAN/IPA洗脱液分离的来自半胱氨酸连接的奥里斯他汀(auristatin)缀合抗体的TIC(计数)。
图7B示出了如用C4键合的有机二氧化硅完全多孔型固定相、0.6mL/min流速、80℃温度、0.1%TFA改性的流动相和90:10CAN/IPA洗脱液分离的来自半胱氨酸连接的奥里斯他汀缀合抗体的总吸附(AU)。
图7C示出了根据本技术的例示性实施方案的如用由苯基键合的2.7μm表面多孔型固定相、0.6mL/min流速、70℃温度和0.15%DFA改性的流动相组成的新平台方法分离的来自半胱氨酸连接的奥里斯他汀缀合的抗体的TIC(计数)。
图7D示出了根据本技术的例示性实施方案的如用由苯基键合的2.7μm表面多孔型固定相、0.6mL/min流速、70℃温度和0.15%DFA改性的流动相组成的新平台方法分离的来自半胱氨酸连接的奥里斯他汀缀合的抗体的总吸附(AU)。
图8A是根据本技术的例示性实施方案的使用0.1%MS级FA改性的流动相获得的来自半胱氨酸连接的奥里斯他汀ADC的未修饰LC片段的解卷积MS谱。用BioResolve RP mAbPolyphenyl2.7μm 2.1mm×150mm色谱柱,使用0.6mL/min的流速,80℃的柱温和1μg质量载荷进行分离。
图8B是根据本技术的例示性实施方案的使用0.1%蒸馏DFA改性的流动相获得的来自半胱氨酸连接的奥里斯他汀ADC的未修饰LC片段的解卷积MS谱。用BioResolve RP mAbPolyphenyl2.7μm 2.1mm× 150mm色谱柱,使用0.6mL/min的流速,80℃的柱温和1μg质量载荷进行分离。
具体实施方式
本公开涉及基于低浓度的另选的酸,二氟乙酸(“DFA”),与或不与基于苯基的固定相一起使用的方法,该固定相能够产生对色谱性能和质谱性能两者的不可预见的优化。该技术也包括具有低含量金属杂质,例如小于约100ppb的任何单独的金属杂质的DFA的组合物。DFA的纯度导致能够实现足以使基于DFA的液相色谱-质谱(“LC-MS”)方法产生可解读数据的质谱(MS)质量。
虽然本公开讨论了与二氟乙酸相关的技术,但也可使用二氯乙酸或二溴乙酸,并且预期二氯乙酸或二溴乙酸在对色谱性能和质谱性能两者的不可预见的优化方面显示类似的结果。此外,虽然本公开讨论了主要涉及蛋白质的技术,但该方法也可应用于其他生物分子,该其他生物分子包括例如肽和聚糖。另外,本技术的试剂和方法也适用于肽的分析和蛋白质治疗剂的肽谱。
如本文所用,术语“分离度”是指两个峰分离得有多好的量度。可通过Rs(tr,2-tr,1)/(0.5×(w1+w2))来确定分离度,其中tr是峰1或峰2的保留时间,并且w1是峰1或峰2的半高峰宽。以类似的方式,使用分离能力和峰容量指代在给定分离空间内可拟合多少峰的量度。峰容量可确定为Pc=1+(t/wavg),其中t为对应于给定分离空间的时间,并且wavg为在给定分离中观察到的峰的半高处的平均峰宽。
如本文所用,术语“蛋白质”是指被称为多肽的氨基酸的聚合链。蛋白质还可包括多种修饰,该多种修饰包括磷酸化、脂化、异戊二烯化、硫酸盐化、羟基化、乙酰化、添加碳水化合物(糖基化和糖化)、添加辅基或辅因子、形成二硫键、蛋白质水解、组装成大分子复合物等。
如本文所用,术语“约”意指该数值是近似的,并且较小的变化不会显著影响所公开的实施方案的实践。在使用数值限制的情况下,除非上下文另外指明,否则“约”意指该数值可改变±10%并且仍然在所公开的实施方案的范围内。
在概念上,DFA是对于蛋白质LC-MS来讲相比于TFA对MS更友好的替代形式。DFA的酸性为TFA的十分之一,因此它对MS检测的危害可能更小。作为较弱的酸,它有可能与分析物阳离子形成较弱的离子对相互作用。继而,DFA在质谱中可显示相比于TFA,生成加合物的倾向性更低。另外,由于相对于TFA由三个氟原子构成,DFA仅由两个氟原子构成,因此DFA不太可能吸附到材料上并且不太可能在整个LC流动路径和MS离子路径中成问题地保留,这对于一些LC-MS科学家尝试使用TFA而言是令人讨厌的。
然而,仅通过推测不能完全地认识到DFA的吸引力。如在本技术的范围中所示,蛋白质LC-MS的质量不仅仅指电离效率,还包括更多。利用本技术,指定了DFA的组合物,以确保产生高质量蛋白质质谱。该DFA的组合物可与色谱柱和使用说明一起提供于套件中。此外,对于蛋白质LC-MS定义了新型方法,该新型方法需要在与或不与基于苯基的固定相一起使用的情况下使用非常低浓度的DFA。此外,本技术提供了一种纯化可商购获得的二氟乙酸以获得包含小于100ppb金属杂质的高纯度二氟乙酸的方法。
生物分子(例如,蛋白质、肽和/或聚糖)LC-MS不仅仅是关于实现高灵敏度检测。该方法的能力受到色谱分离度的极大影响。有趣的是,与TFA相比,DFA流动相实际上可使分离度增加。考虑到相对于TFA,甲酸(一种较弱、疏水性较差的酸)导致惊人更低的峰容量,这是令人惊讶的结果。因此,假设酸性更强、疏水性更好的流动相添加剂始终产生更佳的色谱分离能力。不受理论的限制,据信DFA在产生高分离度色谱方面比TFA更有效,因为它表现出更小的位阻效应。因此,DFA可能更有效且更广泛地与蛋白质分析物和RPLC固定相的键合相相互作用。DFA的疏水性(比TFA的疏水性弱)也可能有利于更优的蛋白质吸附、分配和解吸。
图1A至图1T示出了还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的有效峰容量值,如使用不同2.1mm×50mm色谱柱所观察到的,这些色谱柱包括(1)Waters BioResolveTM RP mAbPolyphenyl,2.7μm;(2)AMTProtein C4,3.4μm;(3)AgilentRP-mAb Diphenyl,3.5μm;和(4)WatersProtein BEH C4,1.7μm。图2A至图2E示出了还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的有效峰容量值,如使用图1A至图1T的不同色谱柱中的每一者观察到的。分析的细节可见于本文的实施例1中。
如对这些不同色谱柱技术的评估中所示,相对于0.1%(v/v)TFA,0.1%(v/v)DFA可产生显著更高的峰容量。具体地,对于还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的分离,已经看出,可存在对应于有效峰容量增加高达约40%的增加。例如,当使用0.1%(v/v)TFA作为流动相时,使用IdeS酶解的NIST标准物质8671与AgilentRP-mAb Diphenyl3.5μm的有效峰容量为72.0,但是当使用0.1%(v/v)DFA时,有效峰容量增加至102.9,从而导致有效峰容量增加超过40%。此外,与较高浓度的0.1%(v/v)TFA相比,当使用0.02%(v/v)DFA时Agilent色谱柱显示有效峰容量增加约20%。另外,与0.1%(v/v)TFA相比,当0.01%(v/v)DFA与Agilent色谱柱一起使用时,有效峰容量仅略微降低小于5%。
如图1A至图1T和图2A至图2E所示,与0.1%TFA相比,当使用0.1%DFA时,所有色谱柱均显示有效峰容量增加。与0.1%(v/v)TFA相比,当使用0.1%(v/v)DFA时,其他三根色谱柱各自显示有效峰容量增加约10%。
当分析由其他酶(包括IdeZ、Lys-C和木瓜蛋白酶)以及可以商品名和从瑞典隆德的Genovis AB公司(Genovis AB(Lund,Sweden))商购获得的酶产生的样品时,也可看到这些增加。甚至更值得注意的是,已发现在多步硅烷化方法中与苯基部分键合的表面多孔型二氧化硅固定相提供DFA流动相的示例性性能能力。利用该固定相,即使使用低浓度的DFA添加剂,性能也令人惊讶地良好。图1A至图1T和图2A至图2E示出,实际上当0.01%和0.02%DFA流动相与此类固定相材料一起使用时,产生示例性分离能力。然而,不仅当在多步硅烷化方法中表面多孔型固定相与苯基部分键合时产生的有效峰容量的增加提供示例性性能,而且固定相的表面上的苯基覆盖百分比也提供示例性性能。例如,可以商品名BioResolveTMRP mAb Polyphenyl从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))商购获得的色谱柱具有约10%的苯基覆盖率,使得其在更低程度上依赖于离子配对。可有利地与这些独特条件一起使用的固定相已描述于转让给沃特世科技公司(WatersTechnologies Corporation)的名称为“Chromatographic Compositions”的美国公布号2018/0264438中,该专利全文以引用方式并入本文。
值得注意的是,已发现即使使用仅0.01%和0.02%(v/v)DFA,示例性水平的色谱性能也是可能的,因为已证明这有益于MS检测的灵敏度。图3A和图3B示出了用于检测还原的IdeS酶解NIST标准物质8671的轻链亚基的LC-MS灵敏度,如使用可以商品名“BioResolveTMRP mAb Polyphenyl 2.1mm×50mm色谱柱”从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))商购获得的LC色谱柱和可以商品名“单四极杆质量检测器”从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(WatersCorporation(Milford,MA))商购获得的MS检测器观察到的。图3A示出了由于使用不同流动相改性剂得到的总离子色谱(“TIC”)峰高度。图3B示出了由于使用不同流动相改性剂得到的TIC信噪比。分析的细节可见于本文的实施例2中。
TIC峰高度和TIC峰信噪比是经常用于限定LC-MS分析的灵敏度的两个值。当采用不同的流动相体系用可以商品名举四极杆质量检测器从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))商购获得的MS检测器来检测还原的IdeS酶解NIST标准物质8671时,观察到MS灵敏度的显著不同的值。当使用0.1%(v/v)DFA代替0.1%(v/v)TFA时,实现了MS灵敏度的大约4倍增加。此外,当使用0.02%(v/v)DFA代替0.1%(v/v)TFA时,实现了MS灵敏度的大约8倍增加。蛋白质RPLC方法能够在此类条件下产生接近最优的分离度意味着已经建立用于蛋白质的高分离度、高灵敏度LC-MS的新标准。
因此,提供了一种用于从样品中分离分析物的方法。分析物可为生物分子,例如蛋白质、肽、聚糖或它们的组合。该方法包括使流动相流过色谱柱。流动相可以是卤代酸,例如DFA、二氯乙酸或二溴乙酸。流动相可包含约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的卤代酸。此外,流动相可具有小于约100ppb的任何单独的金属杂质。换句话讲,流动相卤代酸中的所有金属杂质均各自小于100ppb,但合并起来可大于100ppb。将包含分析物的样品注射到流动相中,然后从样品中分离分析物。
可通过色谱从样品中分离分析物。本领域的普通技术人员应理解,许多不同类型的色谱可与该方法一起使用。例如,该方法可应用于液相色谱、RPLC、UHPLC、HPLC和亲水作用色谱(“HILIC”)。因此,该方法中可使用液相色谱柱、反相色谱柱、超高效色谱柱、高效色谱柱和亲水作用色谱柱。
在该技术的一个实施方案中,使用DFA改性的流动相与具有基于苯基的表面化学物质的色谱柱固定相的组合来实现高灵敏度、高分离度蛋白质RPLC方法。色谱柱可包括具有基于苯基的表面化学物质的固定相。固定相可为与苯基部分键合的完全多孔型二氧化硅固定相或表面多孔型二氧化硅固定相。固定相可包括但不限于存在于可以商品名RP mAb DiphenylRRHD Diphenyl从加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司(Agilent Technologies(Santa Clara,CA))商购获得的和以商品名BioResolveTM RP mAb Polyphenyl色谱柱从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(WatersCorporation(Milford,MA))商购获得的反相色谱柱中的那些,以及转让给沃特世科技公司(Waters Technologies Corporation)的名称为“Chromatographic Compositions”的美国公布号2018/0264438中所述的材料,该专利全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中,固定相可具有聚合物聚苯乙烯二乙烯基苯表面化学物质。在另一个实施方案中,固定相可基于与苯基部分键合的有机二氧化硅。这些固定相可分别存在于例如可以商品名从加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司(AgilentTechnologies(Santa Clara,CA))商购获得的和以商品名BEHPhenyl从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))商购获得的色谱柱中。
本技术的色谱柱可与浓度为约0.005%至约0.20%(v/v)的DFA流动相一起使用。该范围内的任何浓度的流动相可与本发明所公开的方法、套件和组合物一起使用。例如,0.01%至0.05%(v/v)DFA流动相可与色谱柱例如RPLC柱一起使用。在另一个示例中,0.02%(v/v)至0.05%(v/v)DFA流动相可与色谱柱例如RPLC柱一起使用。
除了色谱分离度之外,还通过它们提供的质谱的质量来判断蛋白质LC-MS方法。关于由DFA流动相产生的质谱的质量尚未执行工作,如由可商购获得的DFA源产生低质量质谱的事实所证实的。图4示出了用于NIST标准物质8671的轻链亚基的解卷积ESI质谱,如使用(a)0.1%(v/v)TFA和(b)0.1%(v/v)DFA和可以商品名G2-Si从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))商购获得的质谱仪观察到的。报告不期望的离子加合物(包括Na和K)的相对强度。分析的细节可见于本文的实施例3中。
如图4A和图4B所示,使用0.1%(v/v)DFA(奥克伍德公司(Oakwood),部件号001231,批号D06N)获得的轻链单克隆抗体(mAb)亚基的质谱对于钠(+Na)和钾(+K)离子产生非常高的离子强度。这是损害质谱判读的离子强度水平(大约6%-7%)。相比之下,从使用0.1%(v/v)TFA流动相的LC-MS收集的质谱显示显著更高质量的质谱,因为钠离子和钾离子导致小于或等于2%的相对强度。虽然不限于理论,但可能的是特定酸不仅对分析物离子的形成具有影响,而且对加合物的形成具有不同的影响。无论如何,据推理,可商购获得的DFA试剂不适合LC-MS,因为尚未认识到为了实现期望的质谱质量,必须制造基本上更高纯度的DFA,最具体地低金属含量DFA。即,某些杂质与蛋白质质谱的期望特征之间存在相关性。
图5示出了在DFA(奥克伍德公司(Oakwood),部件号001231,批号D06N)的样品中通过电感耦合等离子体(ICP)-MS量化的金属杂质。浓度以十亿分之一(“ppb”)报告。使DFA(奥克伍德公司(Oakwood),部件号001231,批号D06N)的样品经受ICP-MS以定量其金属杂质(图5),由此发现DFA实际上确实包含相对高含量的金属,包括浓度为1500ppb的钠。毫无疑问,该金属含量水平过高,以至于无法获得高质量的蛋白质质谱。
来源于DFA的解卷积光谱显示来自钾和钠加合物的显著干扰,如图6A所示。在该结果的证实中,所采用DFA的ICP-MS定量显示它包含400ppm钠和2ppm钾(图6B)。有趣的是,已确认两种其他商业来源的DFA也具有这些相同成问题的高浓度(数据未示出)。为了解决该缺点,使用由耐化学品性全氟烷氧基烷烃(PFA)聚合物构造的设备将商业来源的DFA蒸馏至更高纯度。ICP-MS结果表明,通过该蒸馏,DFA的钠和钾含量可降低至小于20ppb的浓度。当用于LC-MS时,该蒸馏的DFA提供加合物含量降低至仅2%的相对强度的光谱(图6C)。
本技术的方法包括使用包含小于约100ppb的任何单独的金属杂质的流动相添加剂。换句话讲,包含在流动相添加剂中的每种金属杂质不以大于约100ppb的量存在。在一些实施方案中,流动相包含小于约90ppb、80ppb、70ppb、60ppb、50ppb、40ppb、30ppb、20ppb或10ppb的任何单独的金属杂质。在一些实施方案中,流动相添加剂包含小于约95ppb、85ppb、75ppb、65ppb、55ppb、45ppb、35ppb、25ppb或15ppb的任何单独的金属杂质。金属杂质为影响质谱的期望特征(例如,质谱的质量)的任何金属。金属杂质可为例如钠、钾、钙和/或铁。本技术的这些方面扩展到随后用上述流动相添加剂制备的任何稀释液和任何流动相。
该方法可包括用质谱仪检测分析物。这可通过生成分析物离子来实现。分析物离子可通过电喷雾电离或解吸电喷雾电离产生。
质谱仪可产生具有对应于金属或盐加合物的小于约5%相对离子强度的质谱。当流动相添加剂包含小于约100ppb的任何单独的金属杂质时,质谱仪可产生具有对应于金属或盐加合物的小于约5%相对离子强度的质谱。在一些实施方案中,质谱仪可产生具有对应于金属或盐加合物的小于约2%或小于约1%的相对离子强度的质谱。
本文所述的方法也可包括测定分析物的分子量,例如测定蛋白质、肽、聚糖或它们的组合的分子量。同样,本文所述的方法可用于有利于确定某些翻译后修饰的位置,如可通过RPLC-MS/MS实验进行的。
本技术也包括纯化可商购获得的卤代酸的方法。例如,可获得可商购获得的卤代酸(例如,DFA、二氯乙酸或二溴乙酸)。卤代酸包含大于100ppb的金属杂质。金属杂质为钠、钾、钙、铁或它们的组合。该方法包括蒸馏卤代酸以获得包含小于100ppb杂质的高纯度二氟乙酸。在一些实施方案中,卤代酸包含小于50ppb或小于20ppb的杂质。
可商购获得的卤代酸可通过其他方法纯化,例如通过过滤、离心、蒸发、萃取、离子交换或任何组合。
本技术包括针对蛋白质的LC-MS分析的一定体积(在10μL至10mL的范围内)的二氟乙酸的组合物,该组合物包含小于100ppb的单独的金属杂质,该金属杂质包括但不限于钠、钾、钙和/或铁,其中使用此类试剂有利于产生具有对应于金属和/或盐加合物(包括但不限于钠、钾、钙和/或铁)的小于5%的相对离子强度的蛋白质质谱。本技术使用高纯度组合物可有利于产生具有对应于金属和/或盐加合物(包括但不限于钠、钾、钙和/或铁)的小于2%(并且甚至可能小于1%)的相对离子强度的蛋白质质谱。在一些实施方案中,本技术使用高纯度组合物可有利于产生具有对应于金属和/或盐加合物(包括但不限于钠、钾、钙和/或铁)的小于1%的相对离子强度的蛋白质质谱。
卤代酸的组合物可以即用型安瓿以及套件的组件的形式(诸如由包含本技术的组合物的安瓿连同LC柱或装置构成的组合产品)商购获得。例如,套件可包括色谱柱、具有一定体积的流动相添加剂的安瓿和使用说明。色谱柱具有包含在柱内部的固定相材料。固定相材料可为本文所述的任何固定相材料,例如,与苯基部分键合的表面多孔型二氧化硅固定相、与苯基部分键合的完全多孔型二氧化硅固定相、与苯基部分键合的有机二氧化硅固定相、或聚合物聚苯乙烯二乙烯基苯表面化学物质。流动相添加剂为卤代酸,例如DFA。流动相添加剂具有小于约100ppb的任何单独的金属杂质。说明书指示使用者获得样品基质中包含至少一种生物分子(例如,蛋白质)的样品,以及用溶剂稀释流动相添加剂以获得约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的卤代酸(例如,DFA)。类似于DFA流动相添加剂,溶剂具有小于约100ppb的任何单独的金属杂质,或小于约95ppb、85ppb、75ppb、65ppb、55ppb、45ppb、35ppb、25ppb或15ppb的任何单独的金属杂质。然后指示使用者使具有稀释的流动相的样品流过色谱柱,以基本上分离和保留该至少一种生物分子(例如,蛋白质)。此外,说明书指示使用者使用检测器来检测该至少一种生物分子(例如,蛋白质)。
类似地,卤代酸的组合物扩展到即用型流动相。可包括即用型流动相的容器作为套件的一部分。套件也包括色谱柱和使用说明。色谱柱具有包含在柱内部的固定相材料。固定相材料可为本文所述的任何固定相材料,例如,与苯基部分键合的完全多孔型二氧化硅固定相或表面多孔型二氧化硅固定相、与苯基部分键合的有机二氧化硅固定相、或聚合物聚苯乙烯二乙烯基苯表面化学物质。流动相为约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的卤代酸(例如DFA)和小于约100ppb的任何单独的金属杂质。说明书指示使用者获得样品基质中包含至少一种生物分子(例如,蛋白质)的样品。然后指示使用者使具有流动相的样品流过色谱柱,以基本上分离和保留该至少一种生物分子(例如,蛋白质)。此外,说明书指示使用者使用检测器来检测该至少一种生物分子(例如,蛋白质)。
在惯例中,通过将小体积(10μL至10mL)的液体添加剂(通常为甲酸或三氟乙酸)添加到期望溶剂(诸如水或乙腈)中来制备LC流动相。为此,预期本技术涵盖用针对蛋白质的LC-MS分析的0.005%至0.2%(v/v)卤代酸(例如DFA)改性的基于水、乙腈、甲醇、丙醇、丁醇和戊醇(以及它们的组合)的即用型流动相(其具有小于约100ppb含量,或小于50ppb含量,或小于20ppb含量的单独的金属杂质,该金属杂质包括但不限于钠、钾、钙和/或铁),其中使用此类试剂有利于产生具有对应于金属和/或盐加合物(包括但不限于钠、钾、钙和/或铁)的小于5%、小于2%或小于1%的相对强度的蛋白质质谱。
实施例
实施例1:mAb亚基的反相色谱法
该实施例比较了三种酸TFA、DFA和甲酸在RPLC***中的四根不同柱上的影响。每根柱均分离相同的标准物质。运行用基于0.1%TFA、0.1%DFA、0.02%DFA、0.01%DFA和0.1%甲酸的流动相改性剂进行。下文汇总了所有运行中使用的基本程序。结果汇总于图1A至图1T和图2A至图2E中。
还原的IdeS酶解NIST标准物质8671是从鼠细胞系表达的人源化IgG1κ,以WatersmAb亚基标准品(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters,Milford,MA))的形式获得。将一个小瓶的内容物在0.1%(v/v)甲酸水溶液中重构。使用由马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))以商品名H-Class Bio出售的LC***和下文概述的分离方法进行该样品的分析。图1A至图1T和图2A至图2E呈现用与不同RPLC柱结合使用的几种不同流动相体系获得的色谱数据。LC条件示于表1中,并且梯度条件示于表2中。
表1:LC条件
表2:梯度表
时间(min) | 流速(mL/min) | %A | %B | 曲线 |
初始 | 0.2000 | 85.0 | 15.0 | 初始 |
20.00 | 0.2000 | 45.0 | 55.0 | 6 |
20.30 | 0.2000 | 20.0 | 80.0 | 6 |
21.30 | 0.2000 | 20.0 | 80.0 | 6 |
21.60 | 0.2000 | 85.0 | 15.0 | 6 |
25.00 | 0.2000 | 85.0 | 15.0 | 6 |
实施例2:配有单四极杆质量检测器的质谱法
进行本实施例以基于用于限定LC-MS分析的灵敏度的TIC峰高度和TIC峰信噪比来比较使用DFA和TFA对MS灵敏度的影响。使用各种流动相体系来检测相同的标准物质。运行用0.1%TFA、0.1%DFA、0.02%DFA、0.01%DFA和0.1%甲酸流动相进行。下文汇总了所有运行中使用的基本程序。结果汇总于图3A和图3B中。
还原的IdeS酶解NIST标准物质8671以Waters mAb亚基标准品(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters,Milford,MA))的形式获得。将一个小瓶的内容物在水中重构。使用由马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))以商品名WatersH-Class Bio***销售的LC***进行该样品的分析,该***配有由马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))销售的UV和MS检测器,包括可调谐紫外(TUV)检测器和质量检测器。方法条件如下列出。图3A和图3B示出了使用不同流动相改性剂洗脱的轻链峰的计算的TIC峰高度和信噪比的比较。LC条件示于表3中,梯度条件示于表4中,并且MS条件示于表5中。
表3:LC条件
表4:梯度表
时间(min) | 流速(mL/min) | %A | %B | 曲线 |
初始 | 0.300 | 95.0 | 05.0 | 初始 |
10.00 | 0.300 | 45.0 | 55.0 | 6 |
10.50 | 0.300 | 20.0 | 80.0 | 6 |
11.50 | 0.300 | 20.0 | 80.0 | 6 |
11.51 | 0.300 | 95.0 | 05.0 | 6 |
15.00 | 0.300 | 95.0 | 05.0 | 6 |
表5:MS条件
模式: | ESI阳离子 |
质量范围: | 350-1250m/z |
采集模式: | Centroid |
锥电压: | 15V |
探针温度: | 600℃ |
毛细管电压: | 1.5kV |
样品速率: | 2pts/s |
实施例3:高分离度质谱法
进行该实施例以比较由可商购获得的DFA和TFA流动相产生的质谱的质量。运行用0.1%TFA和0.1%DFA流动相进行。下文汇总了所有运行中使用的基本程序。结果汇总于图4中。
还原的IdeS酶解NIST标准物质8671以Waters mAb亚基标准品(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters,Milford,MA))的形式获得。将一个小瓶的内容物在水中重构。使用由马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))以商品名H-Class Bio***销售的LC***进行该样品的分析,该***配有由马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation(Milford,MA))销售的UV和MS检测器,包括用于检测的可调谐紫外(TUV)检测器和G2-Si QTof MS***。图4A和图4B示出了使用相同浓度的LC-MS级TFA和试剂级DFA的解卷积质谱中的不同金属加合物含量。LC条件示于表6中,用TFA分离的梯度条件示于表7中,用DFA分离的梯度条件示于表8中,并且MS条件示于表9中。
表6:LC条件
表7:用TFA分离的梯度表
时间(min) | 流速(mL/min) | %A | %B | 曲线 |
初始 | 0.300 | 75.0 | 25.0 | 初始 |
10.00 | 0.300 | 55.0 | 45.0 | 6 |
10.50 | 0.300 | 20.0 | 80.0 | 6 |
11.50 | 0.300 | 20.0 | 80.0 | 6 |
11.51 | 0.300 | 75.0 | 25.0 | 6 |
15.00 | 0.300 | 75.0 | 25.0 | 6 |
表8:用DFA分离的梯度表
时间(min) | 流速(mL/min) | %A | %B | 曲线 |
初始 | 0.300 | 85.0 | 15.0 | 初始 |
10.00 | 0.300 | 65.0 | 35.0 | 6 |
10.50 | 0.300 | 20.0 | 80.0 | 6 |
11.50 | 0.300 | 20.0 | 80.0 | 6 |
11.51 | 0.300 | 85.0 | 15.0 | 6 |
15.00 | 0.300 | 85.0 | 15.0 | 6 |
表9:MS条件
实施例4:可商购获得的DFA的分析
进行该实施例以通过电感耦合等离子体质谱法定量金属杂质的量显示,可商购获得的DFA实际上确实具有高含量的金属杂质。
通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)定量10mL二氟乙酸(奥克伍德公司(Oakwood),部件号001231,批号D06N)样品中包含的金属。该分析的结果提供于图5中,以十亿分之一或ng/g为单位报告。各种金属浓度以±50%的不确定性报告。
实施例5:制备高纯度DFA
通过用由明尼苏达州伊登普雷利的Savillex公司(Savillex Corporation(EdenPrairie,MN))以商品名DST-1000酸纯化***出售的PFA(四氟乙烯和全氟烷基乙烯基醚的共聚物)酸纯化体系蒸馏,由可商购获得的DFA制备低金属含量的高纯度DFA。首先使500mL可商购获得的DFA通过蒸馏设备以使其随时可用。此后进行一次和两次蒸馏以获得越来越纯的DFA形式。(参见图6A-6C。)
实施例6:用于ADC表征的低丰度变体
本技术适用于进行mAb和ADC(抗体-药物缀合物)亚基分析的新方法。亚基通常通过采用亚2μm C4键合的有机二氧化硅完全多孔型固定相、80℃的分离温度、0.1%TFA流动相以及由90%乙腈和10%异丙醇构成的洗脱液分离来表征,需要该洗脱液以有利于疏水性蛋白质的回收。该方法的典型结果提供于图7A和图7B中。
开发了一种新技术,该技术简化了图7A和图7B的方法、加速转换和/或改善灵敏度。通过使用苯基键合的表面多孔型固定相,获得了更高的分离度和改善的选择性,以及背压的降低和使用更快色谱速度的能力。由于该变化,可能从流动相中排除IPA而不显著影响峰容量或蛋白质回收。由于采用DFA,还可能降低分离温度。这种新方法由图7C和图7D举例说明。需要说明的是,虽然亚2μm色谱柱需要超高压仪器,但是基于2.7μm的方法可由于具有较低操作背压而转移到其他不太专业化的仪器。此外,使用后一种平台,可能优化色谱分离的几乎所有方面,并且有利于深度表征的一些更困难的示例。低丰度变体的两个示例可在与未修饰Fc/2亚基相邻的肩峰内发现(参见图7A至图7D)。与这些物质相对应的质谱在图8A-8C中示出。
DFA方法(图8B)产生更高的信噪比谱,这可用于更确信地确认+16Da(前峰)和+674Da(后峰)质量偏移以及Fc结构域氧化和非糖基化同种型的相应鉴定。
结论
生物制药形态的复杂性不断增加,需要在分析方法中作出改进。反相液相色谱法是一项用于在所有分子水平上分离蛋白质和/或肽的强大技术,并且当耦接到质谱时变得格外地更加强大。然而,取决于使用的常规酸改性剂诸如三氟乙酸(TFA)和甲酸(FA),蛋白质和/或肽RPLC通常在损害MS灵敏度的情况下表现出优异的色谱分离度,或者反过来,在损害分离质量的情况下表现出优异的MS灵敏度。本文所述的技术展示了用于LC-MS分析的新选择,该LC-MS分析基于在与或不与高覆盖率苯基键合的表面多孔型固定相一起使用的情况下使用高度纯化的二氟乙酸(DFA)。苯基键合的表面多孔型固定相的使用建立在具有有助于降低温度和离子配对依赖性的独特苯基键合的表面多孔型颗粒的优点的基础上。这很好地适用于使用DFA来进行蛋白质和/或肽分离,其中现已示出,该另选的离子配对改性剂可达到通过TFA和FA原本无法达到的色谱和质谱之间的优化。
已证明经纯化的DFA是发现蛋白质和/或肽LC-MS能力突变的关键。如与前述高覆盖率苯基固定相一起使用,基于DFA的方法大大改善了疏水性非常强的半胱氨酸连接的奥里斯他汀缀合的ADC的亚基水平分析(参见例如实施例6)。另外,除了向色谱分离度和MS灵敏度提供有益效果之外,还发现该稳健的平台极大地增加了蛋白质回收,而无需使用醇共溶剂进行洗脱,即使在柱温降低的情况下也是如此。理论上这是由于经纯化的DFA具有足够强酸性以便最大程度降低离子次级相互作用(与FA不同)但不如TFA那样疏水以迫使吸附过强所产生的效应。
虽然本公开已经参考其示例性实施方案具体示出和描述,但是本领域技术人员将理解,在不脱离所附权利要求所涵盖的本技术的范围的情况下,可以在形式和细节上进行各种改变。
Claims (34)
1.一种从样品中分离分析物的方法,所述方法包括:
使流动相流过色谱柱,其中所述流动相包含约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)二氟乙酸和小于约100ppb的任何单独的金属杂质;
将包含所述分析物的样品注射到所述流动相中;以及
从所述样品中分离所述分析物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述色谱柱是液相色谱柱。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述色谱柱是反相色谱柱。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述色谱柱还包括具有基于苯基的表面化学物质的固定相。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述固定相为与苯基部分键合的表面多孔型二氧化硅固定相。
6.根据权利要求4所述的方法,其中所述固定相为与苯基部分键合的完全多孔型二氧化硅固定相。
7.根据权利要求4所述的方法,其中所述固定相为与苯基部分键合的有机二氧化硅固定相。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述色谱柱还包括具有聚合物聚苯乙烯二乙烯基苯表面化学物质的固定相。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述流动相包含小于约50ppb的任何单独的金属杂质。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述流动相包含小于约20ppb的任何单独的金属杂质。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述流动相包含约0.01%(v/v)至约0.05%(v/v)的二氟乙酸。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述流动相包含约0.02%(v/v)至约0.05%(v/v)的二氟乙酸。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述流动相包含约0.01%(v/v)至约0.02%(v/v)的二氟乙酸。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述分析物为蛋白质、肽或它们的组合。
15.根据权利要求1所述的方法,还包括确定所述分析物的分子量。
16.根据权利要求1所述的方法,还包括用质谱仪检测所述分析物。
17.根据权利要求16所述的方法,还包括生成分析物离子。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述分析物离子通过电喷雾电离产生。
19.根据权利要求16所述的方法,还包括采集所述分析物离子的质谱。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述流动相还包含水、乙腈、甲醇、丙醇、丁醇、戊醇或它们的组合。
21.一种从样品中分离分析物的方法,所述方法包括:
使流动相流过色谱柱,其中所述流动相包含约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的二氟乙酸;
将包含所述分析物的样品注射到所述流动相中;
从所述样品中分离所述分析物;以及
用质谱仪检测所述分析物,其中所述质谱仪产生具有对应于金属或盐加合物的小于约5%相对离子强度的质谱。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述流动相包含约0.01%(v/v)至约0.05%(v/v)的二氟乙酸。
23.根据权利要求21所述的方法,其中所述流动相包含约0.02%(v/v)至约0.05%(v/v)的二氟乙酸。
24.根据权利要求21所述的方法,其中所述流动相包含约0.01%(v/v)至约0.02%(v/v)的二氟乙酸。
25.一种套件,包括
(i)色谱柱,所述色谱柱具有包含在所述柱内部的固定相材料;
(ii)安瓿,所述安瓿具有一定体积的流动相添加剂,所述流动相添加剂包含二氟乙酸和小于约100ppb的任何单独的金属杂质;以及
(iii)说明书,所述说明书用于
(a)获得样品基质中包含至少一种蛋白质的样品;
(b)用溶剂稀释所述流动相添加剂以获得约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的二氟乙酸;
(c)使所述样品与所述稀释的流动相添加剂流过所述柱,其中所述至少一种蛋白质基本上被分离和保留;以及
(d)使用检测器来检测所述至少一种蛋白质。
26.根据权利要求25所述的套件,其中所述固定相材料包括与苯基部分键合的表面多孔型二氧化硅固定相。
27.根据权利要求25所述的套件,其中所述固定相材料包括与苯基部分键合的完全多孔型二氧化硅固定相。
28.根据权利要求25所述的套件,其中所述固定相为与苯基部分键合的有机二氧化硅固定相。
29.根据权利要求25所述的套件,其中所述固定相材料包括聚合物聚苯乙烯二乙烯基苯表面化学物质。
30.一种套件,包括
(i)色谱柱,所述色谱柱具有包含在所述柱内部的固定相材料;
(ii)容器,所述容器具有一定体积的流动相,所述流动相包含约0.005%(v/v)至约0.20%(v/v)的二氟乙酸和小于约100ppb的任何单独的金属杂质;以及
(iii)说明书,所述说明书用于
(a)获得样品基质中包含至少一种蛋白质的样品;
(c)使所述样品与所述流动相流过所述柱,其中所述至少一种蛋白质基本上被分离和保留;以及
(d)使用检测器来检测所述至少一种蛋白质。
31.根据权利要求30所述的套件,其中所述固定相材料包括与苯基部分键合的表面多孔型二氧化硅固定相。
32.根据权利要求30所述的套件,其中所述固定相材料包括与苯基部分键合的完全多孔型二氧化硅固定相。
33.根据权利要求30所述的套件,其中所述固定相为与苯基部分键合的有机二氧化硅固定相。
34.根据权利要求30所述的套件,其中所述固定相材料包括聚合物聚苯乙烯二乙烯基苯表面化学物质。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862623059P | 2018-01-29 | 2018-01-29 | |
US62/623059 | 2018-01-29 | ||
PCT/IB2019/050675 WO2019145920A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-01-28 | Difluoroacetic acid ion pairing reagent for high sensitivity, high resolution lc-ms of biomolecules |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111655349A CN111655349A (zh) | 2020-09-11 |
CN111655349B true CN111655349B (zh) | 2022-04-19 |
Family
ID=65685842
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201980010713.7A Active CN111655349B (zh) | 2018-01-29 | 2019-01-28 | 用于生物分子的高灵敏度、高分离度lc-ms的二氟乙酸离子配对试剂 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11433320B2 (zh) |
EP (1) | EP3746203A1 (zh) |
CN (1) | CN111655349B (zh) |
WO (1) | WO2019145920A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11761932B2 (en) * | 2019-06-07 | 2023-09-19 | Waters Technologies Corporation | RPLC-based peptide mapping chromatographic performance using metal chelators as mobile phase additives |
US20210255196A1 (en) * | 2020-01-17 | 2021-08-19 | Waters Technologies Corporation | Low binding surfaces for peptide mapping |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101356003A (zh) * | 2005-12-16 | 2009-01-28 | 阿克佐诺贝尔公司 | 二氧化硅基材料 |
CN103958016A (zh) * | 2011-10-03 | 2014-07-30 | 塞克姆公司 | 用于疏水性置换色谱法的中性两性离子置换剂分子 |
CN105987964A (zh) * | 2015-02-06 | 2016-10-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 液相色谱-质谱联用对分析物进行高效分离鉴定的方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11092574B2 (en) * | 2013-12-24 | 2021-08-17 | Waters Technologies Corporation | Materials for hydrophilic interaction chromatography and processes for preparation and use thereof for analysis of glycoproteins and glycopeptides |
CN110418795B (zh) | 2017-03-16 | 2023-05-23 | 沃特世科技公司 | 色谱组合物 |
-
2019
- 2019-01-28 WO PCT/IB2019/050675 patent/WO2019145920A1/en unknown
- 2019-01-28 CN CN201980010713.7A patent/CN111655349B/zh active Active
- 2019-01-28 EP EP19709103.6A patent/EP3746203A1/en active Pending
- 2019-01-28 US US16/259,705 patent/US11433320B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101356003A (zh) * | 2005-12-16 | 2009-01-28 | 阿克佐诺贝尔公司 | 二氧化硅基材料 |
CN103958016A (zh) * | 2011-10-03 | 2014-07-30 | 塞克姆公司 | 用于疏水性置换色谱法的中性两性离子置换剂分子 |
CN105987964A (zh) * | 2015-02-06 | 2016-10-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 液相色谱-质谱联用对分析物进行高效分离鉴定的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Chromatographic efficiency and selectivity in top-down proteomics ofhistones;Yiyang Zhou等;《Journal of Chromatography B》;20170215;第1044-1045卷;第47-53页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190232197A1 (en) | 2019-08-01 |
WO2019145920A1 (en) | 2019-08-01 |
CN111655349A (zh) | 2020-09-11 |
US11433320B2 (en) | 2022-09-06 |
EP3746203A1 (en) | 2020-12-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Roy-Lachapelle et al. | Analysis of multiclass cyanotoxins (microcystins, anabaenopeptins, cylindrospermopsin and anatoxins) in lake waters using on-line SPE liquid chromatography high-resolution Orbitrap mass spectrometry | |
US11133170B2 (en) | Atmospheric-pressure ionization and fragmentation of molecules for structural elucidation | |
US10520510B2 (en) | Methods for detecting and quantifying non-polar analytes with high sensitivity | |
Isaac et al. | Lipid separation using UPLC with charged surface hybrid technology | |
Arvaniti et al. | Simultaneous determination of eighteen perfluorinated compounds in dissolved and particulate phases of wastewater, and in sewage sludge by liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
CN111655349B (zh) | 用于生物分子的高灵敏度、高分离度lc-ms的二氟乙酸离子配对试剂 | |
Nomura et al. | Simple and rapid analysis of amatoxins using UPLC–MS–MS | |
WO2014121031A1 (en) | Characterization of antibody mixtures by mass spectrometry | |
WO2020185546A1 (en) | Methods, compositions and kits useful for ion exchange chromatography and mass spectrometry analysis | |
US20190064126A1 (en) | Methods of liquid chromatography for anionic compounds | |
Ayala-Cabrera et al. | Negative-ion atmospheric pressure ionisation of semi-volatile fluorinated compounds for ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis | |
WO2017050825A1 (en) | A method for quantifying bevacizumab | |
Kim et al. | Reversed‐phase liquid chromatographic method for the analysis of aminoglycoside antibiotics using pre‐column derivatization with phenylisocyanate | |
US10809259B2 (en) | Protocol for preconcentration and quantification of microcystins using LC-MS | |
Fekete et al. | Size exclusion chromatography of protein biopharmaceuticals: Past, present and future | |
Sakamaki et al. | Evaluation of column carryover of phosphorylated peptides and fumonisins by duplicated solvent gradient method in liquid chromatography/tandem mass spectrometry | |
US11478727B2 (en) | Difluoroacetic acid ion pairing reagent for high sensitivity, high resolution LC-MS of biomolecules and small molecules | |
US10436794B1 (en) | Protocol for preconcentration and quantification of microcystins using LC-MS | |
Li et al. | Sensitive determination of two major mercapturic acid metabolites of 1, 3-butadiene in human urine based on the isotope dilution ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
WO2017077389A1 (en) | Quantification of drugs in biological samples | |
EP4019957A1 (en) | Mass spectrometry method using chromatography-mass spectrometry device | |
Guo et al. | Alternative reagents for chemical noise reduction in liquid chromatography-mass spectrometry using selective ion-molecule reactions | |
Nguyen et al. | A new LC-MS approach for enhancing subunitlevel profiling of mABs and ADCs | |
US20230213490A1 (en) | Methods and Systems for Hydrophilic-Phase Extraction | |
Shah et al. | Emerging mass spectrometry-based technologies for analyses of chromatin changes: analysis of histones and histone modifications |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |