KR20140038369A

KR20140038369A - 항-ｉｌ-12/ｉｌ-23 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140038369A
Application number: KR1020137020934A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 더블유. 보르하니; 람크리쉬나 사드후크한; 수잔 이. 레이시; 홀리 에이치. 사우터
Original assignee: 애브비 인코포레이티드
Priority date: 2011-01-07
Filing date: 2012-01-06
Publication date: 2014-03-28
Also published as: RU2013136908A; MX2013007904A; TW201242976A; JP2014506132A; AU2012204237A1; BR112013017417A2; CN103596978A; EP2661448A2; WO2012094623A3; US20120288494A1; WO2012094623A2; EP2661448A4; NZ611840A; CA2821926A1; SG191874A1

Abstract

본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 잔기 1 내지 197 유래의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는, 항체 및 이의 항원 결합부를 제공한다. 본 발명은 추가로 항체를 암호화하는 핵산, 항체를 포함하는 조성물, 벡터 및 숙주 세포, 및 이를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-ＩＬ-12/ＩＬ-23 항체 및 이의 용도{ANTI-IL-12/IL-23 ANTIBODIES AND USES THEREOF}

관련 출원

본 출원은 2011년 1월 7일에 출원된 미국 가특허출원 제61/460,780호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.

사람 인터류킨 12(IL-12)는 고유한 구조 및 다면발현성 효과를 갖는 사이토카인으로서 특징분석되었다(Kobayashi, et al. (1989) J. Exp Med . 170:827-845; Seder, et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . 90:10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp Med . 154:116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch . Biochem . Biophys. 294:230-237). IL-12는 면역 및 염증 반응에 관여하는 몇몇 질환과 관련된 병리학에서 중요한 역할을 행한다. IL-12의 리뷰, 이의 생물학적 활성 및 질환에서의 이의 역할은 문헌[Gately et al. (1998) Ann . Rev . Immunol . 16: 495-521]에서 찾을 수 있다.

구조적으로, IL-12는, 둘 다 디설파이드 브릿지에 의해 함께 연결된 35kDa 서브유닛(p35) 및 40kDa 서브유닛(p40)을 포함하는 이종이량체 단백질("p70 서브유닛"으로서 나타냄)이다. 이종이량체 단백질은 주로 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포 등의 항원-제시 세포에 의해 생산된다. 또한, 이들 세포 유형은 p70 서브유닛에 비해 과량의 p40 서브유닛을 분비한다. p40 및 p35 서브유닛은 유전학적으로 관련이 없고, p40 동종이량체가 IL-12 길항제로서 기능할 수 있지만, 둘 중 어느 것도 생물학적 활성을 소유하는 것으로 보고되어 있지 않다.

기능적으로, IL-12는, 항원 특이적 T 보조 유형 1(Th1) 림프구와 유형 2(Th2) 림프구 사이의 밸런스를 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. Th1 및 Th2 세포는 자가면역 장애의 개시 및 진행을 지배하고, IL-2는 Th1-림프구 분화 및 성숙의 조절에 있어서 중요하다. Th1 세포에 의해 방출된 사이토카인은 염증성이고, 인터페론 감마(IFNγ), IL-2 및 림프독소(LT)를 포함한다. Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 분비하여 체액성 면역, 알레르기 반응, 및 면역저해를 촉진시킨다. 자가면역 질환 및 IFNγ의 염증촉진성 활성에서의 Th1 반응의 우세함과 일관되게, IL-12는, 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 및 크론 질환 등의 다수의 자가면역 및 염증성 질환과 관련된 병리학에서 주요한 역할을 할 수 있다.

MS를 지닌 사람 환자는, 급성 MS 플라크에서의 p40 mRNA 수준에 의해 입증된 바와 같이 IL-12 발현의 증가를 입증하였다(Windhagen et al., (1995) J. Exp . Med. 182: 1985-1996). 또한, MS 환자 유래의 CD40L-발현 T 세포를 이용한 항원-제시 세포의 생체외 자극은, CD40/CD40L 상호작용이 IL-12의 강한 유도 인자라고 하는 관찰과 일관되게, 대조군 T 세포와 비교하여 증가된 IL-12 생산을 초래하였다.

건강한 대조군과 비교하여 RA 환자의 활액에서, 상승된 수준의 IL-12 p70이 검출되었다(Morita et al (1998) Arthritis and Rheumatism . 41: 306-314). RA 활액에서의 사이토카인 전령 리보핵산(mRNA) 발현 프로파일은 우세한 Th1 사이토카인을 확인하였다(Bucht et al., (1996) Clin . Exp . Immunol . 103: 347-367). 또한, IL-12는 크론 질환(CD)과 관련된 병리학에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다. 이러한 질환을 지닌 환자의 장 점막에서, 증가된 IFNγ 및 IL-12의 발현이 관찰되었다(Fais et al. (1994) J. Interferon Res . 14:235-238; Parronchi et al., (1997) Am . J. Path . 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology . 112:1169-1178, 및 Berrebi et al., (1998) Am . J. Path 152:667-672). CD 환자의 고유판(lamina propria) 유래의 T 세포의 사이토카인 분비 프로파일은 크게 상승된 IFNγ 수준을 포함한 우세한 Th1 반응의 특징이다(Fuss, et al., (1996) J. Immunol. 157:1261-1270). 또한, CD 환자 유래의 결장 조직 절편은 풍부한 IL-12 발현 대식세포 및 IFNγ 발현 T 세포를 나타낸다(Parronchi et al (1997) Am . J. Path. 150:823-832).

각종 사람 장애에서의 사람 IL-12의 역할로 인하여, IL-12 활성을 억제하거나 이에 대응하기 위한 치료학적 전략이 고안되었다. 특히, IL-12에 결합하여 이를 중화시키는 항체는 IL-12 활성을 억제하는 수단으로서 요구되었다. 고도로 특이적인 항원(Ag) 인식은, 항체(Ab)가 외래 침입인자(foreign invader)에 대한 체액성 면역 반응을 시작하고 자기(self) 및 비-자기(non-self)를 스크리닝하도록 한다. 모노클로날 항체(mAb)는 자가면역 질환을 포함한 각종 병태의 치료에서 단백질 치료제로서 사용하기 위해 개발되었다(Brekke, O. H. and I. Sandlie (2003). "Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century." Nat Rev Drug Discov 2(1):52-62). 항체는, 질환-관련 표적 분자를 중화시킴으로써 또는 파괴하기 위한 특정 세포를 표적으로 함으로써 치료제로서 작용할 수 있다.

인터류킨 23(IL-23)은 p19(IL-23 알파 서브유닛)과 p40(IL-12의 베타 서브유닛, 즉, IL-12B)의 2개의 서브유닛들로 이루어진 사람 이종이량체 사이토카인 단백질이다. IL-23은 다수의 상이한 세포(대식세포 및 수지상 세포 포함)에 의해 분비된다. IL-12와 마찬가지로, IL-23은 자가면역 질환의 발달에 있어 중요한 것으로 밝혀진다; 예를 들면, IL-23은 다발성 경화증의 뮤린 모델에서 주요 역할을 한다(Cua, D. J., J. Sherlock, et al. (2003). "Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain." Nature 421(6924):744-8).

최초의 항체들 중 일부는 IL-12를 이용하여 면역화된 마우스의 림프구로부터 제조된 하이브리도마에 의해 분비된 뮤린 모노클로날 항체(mAb)였다[참조예: 스트로버(Strober) 등에 의한 국제 특허 출원 공보 제WO 97/15327호; Neurath et al. (1995) J. Exp . Med . 182: 1281-1290; Duchmann et al. (1996) J. Immunol . 26:934-938]. 이들 뮤린 IL-12 항체는 사람에게 마우스 항체를 투여하는 것과 관련된 문제(예를 들면, 짧은 혈청 반감기, 소정 사람 이펙터 기능의 유발에 대한 무능함 및 사람에서의 마우스 항체("사람 항-마우스 항체", HAMA: human anti-mouse antibody)에 대한 원치 않는 면역 반응(HAMA 반응)의 유발)로 인하여 뮤린 IL-12 항체의 생체내 용도가 한정된다.

일반적으로, 사람에게 완전-뮤린 항체를 사용하는 것과 관련된 문제를 극복하기 위한 시도는 항체를 보다 "사람-유사"하게 유전학적으로 조작하는 것과 관련되었다. 예를 들면, 항체 쇄의 가변 영역이 뮤린-유도된 것이고 항체 쇄의 불변 영역이 사람-유도된 것인 키메라 항체가 제조되었다(Junghans, et al. (1990) Cancer Res . 50:1495-1502; Brown et al. (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . 88:2663-2667; Kettleborough et al. (1991) Protein Engineering . 4:773-783). 그러나, 이들 키메라 및 사람화된 항체는 몇몇 뮤린 서열을 여전히 보유하기 때문에, 항체는 특히 연장된 기간 동안 투여되는 경우에 원치 않는 면역 반응, 사람 항-키메라 항체(HACA: human anti-shimeric antibody) 반응을 유발할 수 있다. 뮤린 항체에 대한 바람직한 IL-12 억제제 또는 이의 유도체(예를 들면, 키메라 또는 사람화된 항체)는, 이러한 억제제가 연장된 기간 동안 사용되는 경우라도 HAMA 반응을 유발하지 않아야 하기 때문에 전체 사람 항-IL-12 항체일 것이다.

17개의 mAb가 치료학적 용도로 승인되어 있다. 그 예로는 뮤린 mAb(예를 들면, 급성 동종이식편 거부에 대한 ORTHOCLONE OKT®3(항-CD3)(Ortho Multicenter Transplant Study Group (1985). "A randomized clinical trial of OKT3 monoclonal antibody for acute rejection of cadaveric renal transplants. Ortho Multicenter Transplant Study Group." N Engl J Med 313(6): 337-42), 뮤린 가변 도메인이 사람 불변 도메인 상에 절편이식된 뮤린-사람 키메라 mAb(예를 들면, 류마티스 관절염 및 크론 질환에 대한 Remicade®(항-TNFα)(Bondeson, J. and R. N. Maini (2001). "Tumour necrosis factor as a therapeutic target in rheumatoid arthritis and other chronic inflammatory diseases: the clinical experience with infliximab (REMICADE)." Int J Clin Pract 55(3): 211-6), 및 비-호지킨 림프종에 대한 Rituxan®(항-CD20)(White, C. A., R. L. Weaver, et al. (2001). "Antibody-targeted immunotherapy for treatment of malignancy." Annu Rev Med 52: 125-45), 뮤린 상보성-결정 영역(CDR)이 그 이외의 사람 면역글로불린에 도입된 사람화된 mAb(예를 들면, 유방암에 대한 Herceptin®(항-Her2)(Shak, S. (1999). "Overview of the trastuzumab (Herceptin) anti-HER2 monoclonal antibody clinical program in HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Herceptin Multinational Investigator Study Group." Semin Oncol 26(4 Suppl 12): 71-7), 및 가장 최근에는 재조합 사람 mAb(예를 들면, 류마티스 관절염에 대한 Humira®(항-TNFα)(Weinblatt, M. E., E. C. Keystone, et al. (2003). "Adalimumab, a fully human anti-tumor necrosis factor alpha monoclonal antibody, for the treatment of rheumatoid arthritis in patients taking concomitant methotrexate: the ARMADA trial." Arthritis Rheum 48(1): 35-45))가 포함되고, 여기서, 고가변성 잔기 및 골격 잔기 둘 다는 천연-발생 사람 면역글로불린 서열로부터 유도된다.

치료학적 항체의 3차원 구조는 과학자 및 임상의 둘 다에게 상당히 흥미로운 것이다. mAb 결합 친화성 및 특이성, 및 Ag 결합 및 방출의 동력학은 임상에서의 성공 또는 실패에 결정적인 모든 기능적 특성이다. mAb 및 mAb-Ag 복합체의 구조에 대한 지식으로부터 이들 특성이 보다 완전하게 이해된다. 또한, 이들 특성에 대한 구조적 근거에 대한 이해는 그러한 이해에 대해 치료학적 유용성을 위한 항원-결합 분자의 합리적 최적화의 능력을 가져다준다. 따라서, 치료제, 예를 들면, 항원, 예를 들면, IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하기 위해 최적화된 항체 및 이로부터 유도된 항원-결합 단백질이 계속해서 요구되고 있다. 이들 항체는 비정상적 IL-12 및/또는 IL-23 활성의 효과를 개선하는데 효과적일 것이다.

본 발명의 요약

본 발명은, 단독의, 그리고 인터류킨-12(IL-12) p70(이하, IL-12 p70, 또는 간략하게 IL-12)에 복합체화된, IL-12/IL-23 항체 J695의 항-p40 서브유닛의 항원 결합 단편(Fab)을 포함하는 폴리펩타이드의 x-선 결정학적 연구에 적어도 부분적으로 기반한다. 이러한 연구로부터 얻어진 원자 배위는 IL-12 및 IL-23과 같은 p40-함유 사이토카인에 결합하는 개선된 항체 및 기타 항체-유사 결합 분자(예를 들면, 항체 단편, 또는 도메인 항체)를 식별하고 고안하는데 있어 유용하다. 이들 개선된 항체는, 예를 들면, 면역 시스템의 부적절하거나 목적하지 않은 자극에 의존하는 병태(다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 크론 질환, 홍반성 낭창, 만성 염증성 질환, 및 이식 수술에 따른 이식편 거부) 또는 암을 포함한 p40-함유 사이토카인의 생물학적 활성에 의하거나 이에 의존하여 조절되는 병태를 갖는 환자를 치료하는 방법에 있어 유용하다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 1 내지 197로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들면, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 ,141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 또는 197 잔기)를 포함하는 p40 서브 유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프(conformational epitope)에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 1 내지 107로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는 p40 서브유닛의 루프 1 내지 7의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하고, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 107, 124 내지 129, 157 내지 164, 및 194 내지 197로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는 p40 서브유닛의 루프 1 내지 7의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하고, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 Asp14, Trp15, Tyr16, Pro17, Asp18, Ala19, Pro20, Gly21, Glu22, Met23, Lys58, Glu59, Phe60, Lys84, Lys85, Glu86, Asp87, Gly88, Ile89, Trp90, Ser91, Thr92, Asp93, Ile94, Leu95, Lys96, Asp97, Gln98, Lys99, Glu1OO, Pro1O1, Lys102, Asn103, Lys104, Thr105, Phe106, Leu107, Thr124, Thr125, Ile126, Ser127, Thr128, Asp129, Arg157, Val158, Arg159, Gly160, Asp161, Asn162, Lys163, Glu164, His194, Lys195, Leu196 및 Lys197로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 23으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 15 내지 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 85 내지 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 86 내지 89 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 86, 87, 89 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 루프 3의 아미노산 잔기 87을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 102 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 124 내지 129로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 5의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 157 내지 164로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 6의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 194 내지 197로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 7의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 23, 58 내지 60 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 18, 85 내지 93 및 102 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 17, 86 내지 89, 93 및 103 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 15 내지 17, 86 내지 87, 89, 93 및 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 23 및 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 15, 17 내지 21, 23 및 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 23 및 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 및 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 23 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 및 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 84 내지 94 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3 및 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합부 중 어느 하나와 결합하기 위해 경쟁하는 분리된 항체를 제공한다.

또 다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 항체 Y61 또는 J695가 아니다.

다른 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 중 어느 하나는 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.

다른 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 중 하나 이상은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32 및 102 중 하나 이상은 방향족 잔기로 독립적으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 내지 92 중 하나 이상은 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 92 및 97 중 하나 이상은 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 101 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 51 중 하나 이상은 Tyr, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91은 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95는 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97은 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상은 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되고, 여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다.

한 실시형태에서, 분리된 항체는 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는다: (a) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상이 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다); (b) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나; (c) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환되거나; (d) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53 중 하나 이상은 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

다른 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 1 및 33 중 하나 이상은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asn, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Lys으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ile 또는 Trp으로 치환된다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ser 또는 Thr으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Tyr 또는 Trp으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Gln 및 Lysd으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 한 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 항체 J695 또는 Y61이 아니다.

다른 양상에서, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합부 중 어느 하나와 결합하기 위해 경쟁하는 분리된 항체를 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 변경시키는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 중 하나 이상을 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환하여 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 것을 포함하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 변경시키는 방법을 제공한다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 및 92 중 하나 이상은 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는다: (a) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상이 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다); (b) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나; (c) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환되거나; (d) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53은 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

한 실시형태에서, 본 발명의 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 US 2009/0202549(이의 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 기재되어 있는 에피토프 중 하나 이상에 추가로 결합한다.

다른 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33 중 하나 이상을 상이한 아미노산 잔기로 치환하여 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 것을 포함하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법을 제공한다.

한 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Gln 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 한 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.

다른 추가의 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는, 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프에 대해 10Å 이내에 결합하고, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 16, 87 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 아미노산 잔기 16에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에, 10^-3M^-1 이하의 K_off 또는 10^-10M 이하의 K_d로 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 생물학적 활성을 중화시킨다.

다른 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 생물학적 활성제를 추가로 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는, 분리된 핵산을 제공한다.

다른 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 전사 조절 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 핵산을 포함하는, 분리된 핵산 벡터를 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 핵산 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다. 한 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포 또는 원핵 숙주 세포이다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 피검체에서의 하나 이상의 IL-12 및/또는 IL-23 관련 병태를 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 피검체 유래의 생물학적 샘플을 본 발명의 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부와 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 중에 존재하는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 양을 측정함(여기서, 정상 또는 대조군에 대해 비교한 상기 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 상승되거나 감소된 수준의 검출은 IL-12 및/또는 IL-23 관련 병태의 존재 또는 부재의 지표이다)에 의해 피검체에서의 하나 이상의 IL-12 및/또는 IL-23 관련 병태를 진단함을 포함한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 검출가능한 표지를 함유하거나, 또는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 검출가능한 표지를 갖는 제2 분자에 의해 검출된다.

다른 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성 중 하나 이상을 조절하는 제제를 식별하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 샘플을 본 발명의 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부와 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성을 검출함(여기서, 비처리된 샘플에 대해 비교한 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성 중 하나 이상의 증가 또는 감소는 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성 중 하나 이상을 조절할 수 있는 제제의 지표이다)에 의해 상기 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성 중 하나 이상을 조절하는 제제를 식별함을 포함한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 검출가능한 표지를 함유하거나, 또는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 검출가능한 표지를 갖는 제2 분자에 의해 검출가능하다.

한 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합부로서, 상기 항체는, 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 1 내지 197로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들면, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 ,141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 또는 197 잔기)를 포함하는 p40 서브 유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공한다. 한 실시형태에서, 항체, 또는 이의 항원-결합부는 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 1 내지 197을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는, 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 1 내지 107로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 1 내지 107을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는, 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 107, 124 내지 129, 157 내지 164 및 194 내지 197로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, p40 서브유닛의 루프 1 내지 7의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 도는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 107, 124 내지 129, 157 내지 164 및 194 내지 197을 적어도 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 107, 124 내지 129, 157 내지 164 및 194 내지 197을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는, 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1의 잔기 14 내지 23을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체는, 잔기 14 내지 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1의 잔기 14 내지 18을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체는, 잔기 14 내지 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는, 루프 1의 잔기 14 내지 17을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

또 다른 실시형태에서, 분리된 항체는, 잔기 15 내지 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기, 2개 이상, 또는 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1의 잔기 15 내지 17을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체는, 잔기 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 2의 하나 이상의 아미노산 잔기, 2개 이상의 아미노산 잔기, 또는 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 2의 잔기 58 내지 60을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 3의 잔기 84 내지 94를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 85 내지 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 3의 잔기 85 내지 93을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 잔기 86 내지 89로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 3의 잔기 86 내지 89 및 93을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체는, 잔기 86, 87, 89 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기, 2개, 3개 또는 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프3 의 잔기 86, 87, 89 및 93을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

또 다른 실시형태에서, 분리된 항체는 루프 3의 아미노산 잔기 87을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 4의 잔기 95 내지 107을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 102 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 1개, 2개 또는 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 4의 잔기 102 내지 104를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 124 내지 129로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 5의 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 5의 잔기 124 내지 129를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 157 내지 164로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 6의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 6의 잔기 157 내지 164를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 194 내지 197로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 7의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 또는 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 7의 잔기 194 내지 197을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 94 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1 내지 4의 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 94 및 95 내지 107을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서,

잔기 14 내지 18, 85 내지 93 및 102 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브 유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1 내지 4의 잔기 14 내지 18, 85 내지 93 및 102 내지 104를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 14 내지 17, 86 내지 89, 93 및 103 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1 내지 4의 잔기 14 내지 17, 86 내지 89, 93 및 103 내지 104를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 15 내지 17, 86 내지 87, 89, 93 및 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1 내지 4의 잔기 15 내지 17, 86 내지 87, 89, 93 및 104를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 14 내지 23 및 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 2의 하나 이상의 아미노산 잔기, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1 내지 2의 잔기 14 내지 23 및 58 내지 60을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 15, 17 내지 21, 23 및 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 2의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1 내지 2의 잔기 15, 17 내지 21, 23 및 58 내지 60을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산 잔기, 및 잔기 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 2의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2 또는 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1의 잔기 14 내지 23 및 루프 2의 잔기 58 내지 60을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 14 내지 23 및 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 및 3의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1 및 3의 잔기 14 내지 23 및 84 내지 94를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산 잔기, 및 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1의 잔기 14 내지 23 및 루프 3의 잔기 84 내지 94를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 14 내지 23 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 및 4의 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 1 및 4의 잔기 14 내지 23 및 95 내지 107을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산 잔기, 및 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 2의 잔기 14 내지 23 및 루프 4의 잔기 95 내지 107을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 84 내지 94 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3 및 4의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 3 및 4의 잔기 84 내지 94 및 95 내지 107을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개 이상의 아미노산 잔기, 및 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 루프 3의 잔기 84 내지 94 및 루프 4의 잔기 95 내지 107을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 결합한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시되는 임의의 항체 또는 이의 항원 결합부와 결합하기 위해 경쟁하는, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공한다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합부는 항체 Y61 또는 J695가 아니다.

한 실시형태에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는, 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102, 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 및 101 이외의 가변 영역 잔기들 중 어느 하나는 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102, 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 및 101 이외의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 가변 영역 잔기는 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는, 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102, 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35, 51 및 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 및 101 중 하나 이상은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102, 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35, 51 및 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 및 101 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개 이상은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102, 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35, 51 및 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 및 101은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32 및 102 중 1개, 2개 또는 3개는 방향족 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32 및 102는 방향족 잔기로 독립적으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 및 92 중 1개, 2개 또는 3개는 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 및 92는 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 92 및 97 중 1개 또는 2개는 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 92 및 97은 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 101 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 51 중 1개 또는 2개는 Tyr, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 101 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 51은 Tyr, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91은 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95는 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97은 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다.

다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 이상은 적어도 하나 이상의 아미노산으로 독립적으로 치환되고, 여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다.

다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는다: (a) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개가 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다); (b) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나; (c) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환되거나; (d) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101의 전부가 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되고, 여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다.

다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53 중 1개 또는 2개는 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53은 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99, 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33 중 1, 2, 3, 4 또는 5개는 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99, 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 33은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asn, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Gln 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다.

다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Lys으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ile 또는 Trp으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ser 또는 Thr으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Tyr 또는 Trp으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다.

한 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합부는 항체 J695 또는 Y61이 아니다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시되어 있는 상기 항체 또는 이의 항원 결합부 중 어느 하나와 결합하기 위해 경쟁하는 분리된 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공한다.

한 실시형태에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개 이상을 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환하여 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 것을 포함하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101은 상이한 아미노산 잔기로 치환되어 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시킨다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 및 102 중 1개, 2개 또는 3개는 방향족 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32 및 102는 방향족 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 및 92 중 1개 또는 2개는 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 및 92는 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 92 및 97 중 1개 또는 2개는 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 92 및 97은 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 101 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 51 중 1개 또는 2개는 Tyr, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 101 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 51은 Tyr, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91은 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95는 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97은 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개는 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되고, 여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101은 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되고, 여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다.

한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는다: (a) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 이상이 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다); (b) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나; (c) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환되거나; (d) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101은 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되고, 여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다.

다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53 중 1개 또는 2개 이상은 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53은 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 33 중 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상을 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환하여 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 것을 포함하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 상이한 아미노산 잔기로 치환되어 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시킨다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asn, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선태되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 서열 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Gln 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다.

한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Lys으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ile 또는 Trp으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ser 또는 Thr으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Tyr 또는 trp으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 제조된, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 16, 87 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 2개 또는 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 아미노산 잔기 16에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 3의 아미노산 잔기 16, 87 및 93에 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에, 10^-3M^-1 이하의 K_off 또는 10^-10M 이하의 K_d로 결합한다.

다른 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 생물학적 활성을 중화시킨다.

한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 본원에서 논의된 에피토프에 결합하기 위한, 본 발명의 이전에 당해 분야에 공지되어 있었던 임의의 항체를 포함하지 않는다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합부는 미국 특허 공개 공보 제2009/0202549호(이의 전문이 본원에 명확히 인용됨)에 기재되어 있는 항체가 아니다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합부는 미국 특허 제6,902,734호 또는 미국 특허 제7,166,285호(이들의 전문이 본원에 명확히 인용됨)에 기재되어 있는 항체가 아니다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합부는 미국 특허 제6,902,764 또는 미국 특허 제7,166,285호(이들의 전문이 본원에 명확히 인용됨)에 기재되어 있는 항체 C340이 아니다.

다른 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12 및/또는 IL-23의 활성을 억제시키는 방법으로서, 상기 방법은, 상기 피검체에게 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 투여하여 상기 피검체에서 IL-12 및/또는 IL-23의 활성을 억제시키는 것을 포함하는, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12 및/또는 IL-23의 활성을 억제시키는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 항체의 유효량이 피검체에게 투여된다.

관련 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은, 상기 피검체에게 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 투여하여 상기 피검체를 치료하는 것을 포함하는, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 항체의 유효량이 피검체에게 투여된다.

다른 양상에서, 본 발명은, 치료요법에서의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 용도를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 용도를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 의약의 제조시 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 용도를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12 및/또는 IL-23의 활성을 억제하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 용도를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12 및/또는 IL-23의 활성을 억제하기 위한 의약의 제조시 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 용도를 제공한다.

한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는, 건선, 류마티스 관절염, 크론 질환, 다발성 경화증 및 건선성 관절염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 장애이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 건선이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 류마티스 관절염이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 크론 질환이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 다발성 경화증이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 건선성 관절염이다.

한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는, 유육종증, 수장-족저 농포성 건선, 및 수장-족저 농포증, 중증 수장 족저 건선, 활성 강직성 척추염 및 원발성 담즙성 간경변증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 장애이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 유육종증이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 수장-족저 농포성 건선이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 수장-족저 농포증이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 중증 수장 족저 건선이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 척추염이다. 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 원발성 담즙성 간경변증이다.

한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는 자가면역 질환이다. 한 실시형태에서, 자가면역 질환은 염증과 관련이 있고, 류마티스 척추염, 알레르기, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애는, 류마티스 과절염, 골 관절염, 소아 만성 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신성 홍반성 낭창, 크론 질환, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 피부염 강피증, 아토피성 피부염, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 죽상 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키 질환, 그레이브스 질환, 신 증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충성 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변증, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전, 심근 경색, 애디슨 질환, 산발성 다선성 결핍증 I형 및 다선성 결핍증 II형, 슈미트 증후군, 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모, 원형 탈모, 혈청반응음성 관절병증, 관절증, 라이터 질환, 건선성 관절병증, 궤양성 결장염성 관절병증, 장병증성 활막염, 클라미디아, 여시니아 및 살모넬라 관련 관절병증, 척추관절병증, 아테롬성 질환/죽상 동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 유천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 소아 악성 빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리 질환, 만성 피부점막 캔디다증, 거대 세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍증 관련 질환, 간염 C, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근병증, 여성 불임, 난소 부전, 조기 난소 부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유성 폐포염, 염증-후 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 혼합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신성 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염성 범발성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤성 폐 질환, 감염 후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(전형적인 자가면역 간염 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증을 갖는 B형 인슐린 내성, 부갑상선 기능 저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골 관절증, 원발성 경화성 담관염, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임 질환, 원판상 홍반성 낭창, 남성 불임 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압, 굿 패스튜어 증후군, 결절성 다발성 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스 발열, 류마티스성 척추염, 스틸스 질환, 전신 경화증, 다카야스 질환/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 갑상선종 자가면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 질환), 위축성 자가면역 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염 및 백반증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 장애이다.

본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 나타내어지는 하나 이상의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 이러한 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 요금의 지불에 따라 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 사람 IL-12p40, J695에 결합하는 사람 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 나타낸다. 캐뱃 넘버링을 이용하여 아미노산 위치를 확인한다.
도 2는 J695 및 선택된 전구체 항체의 CDR 서열 및 기능적 특성을 나타낸다.
도 3은 결합 부위의 중심에의 포스페이트 이온 배위를 가능하게 하는 J695 CDR L3의 고유의 헤어핀 입체형태를 나타낸다. cis His-L95A-ProOL95B 펩타이드 결합을 포함하고 다른 잔기를 선택하는, J695의 CDR L3(Fab 결정 형태 I)이 밀착-결합된 물 분자(적색 스피어) 및 포스페이트 이온(오렌지색/적색)과 함께 나타내어진다. 수소 결합은 회색 선으로 나타내어진다.
도 4는 비정규 입체형태를 채택하는 J695 CDR L3을 나타낸다. 정규 클래스 1의 대표적 구조로부터의 것과 J695 CDR L3(Gab 결정 형태 I)의 중첩(Al-Lazikani, Lesk et al. 1997)(4-4-20 Fab, pdb entry 1flr(Whitlow, Howard et al. 1995)). CDR L3은 J695에서 보다 연장되고, Pro-L95B에서 벌지 센터(bulge centered)를 갖고, 이는 둘 다 보존된 프롤린 잔기의 위치를 변경한다.
도 5는 J695 항원-결합 부위(Fab 결정 형태 II)의 표면도를 나타내고, 이는 J695 및 IL-12 p40이 상보성 하전된 표면, 특히, J695 결합 부위의 고도의 양전기적 결합 클레프트를 갖는다는 것을 나타낸다. 용매 접근가능한 표면은 정전기적 표면 전위에 따라 컬러로 나타낸다(청색, 백색, 적색: +15, 0, -15kT/e). 좌측면도는 항원-결합 부위 측에서 본 것이고, 우측면도는 위에서 직접 본 것이다. 삽도: Fab 결정 형태 I.
도 6은 IL-12 p70의 표면도를 나타내고, 이는 고도의 음전기적 표면 패치를 나타낸다. 정전기적 규모 및 컬러표시는 각각 청색, 백색, 적색: +15, 0, -15kT/e이고; p35 서브유닛은 밝은-녹색으로 나타낸다. IL-12 p40의 N-말단은 좌측에 나타내고, C-말단은 우측에 나타낸다. 명세서에서 논의되는 항체 결합 부위는 강조되어 있다.
도 7은 IL-12 p70의 p40 서브유닛의 J695 결합을 나타낸다. 이 도면에서, J695 Fab/IL-12 p70 복합 결정 구조에 기반하여, J695 Fab 경쇄는 밝은 청색으로 컬러표시되고, 중쇄는 어두운 청색으로 컬러표시된다. 각각의 CDR은 분명한 색이다. IL-12 p40 서브유닛은 황갈색이고, p35 서브유닛은 밝은 녹색이다. 도메인 D1에서 대부분 J695와 상호작용하는 p40 상의 1차 루프는 각각 분명한 색이다.
도 8은 다중 부위에서 J695 결합 IL-12 p40을 나타낸다. 이 도면에서, J695 Fab는 밝은 청색(경쇄) 및 어두운 청색(중쇄)을 나타내고; 각각의 CDR은 분명한 색이다. IL-12 p40 서브유닛은 황갈색이다. J695 및 IL-12 p40 상의 각종 주요 접촉 잔기는 표지되고; IL-12 p40 루프 1, 3, 및 4로 나타낸다.
도 9는 J695 결합 부위의 표면도를 나타낸다. 이 도면에서, J695 Fab/IL-12 p70 복합 결정 구조에 기반하여, 각각의 CDR은 분명하게 컬러표시된다. 이 도면은 결합된 IL-12 p40의 위치로부터의 것이다. IL-12 p40 잔기 Asp87(스피어로서 나타낸 측쇄 원자)은 CDR L1, L2, L3 및 H3에 의해 형성된 포켓에 깊이 삽입된다.
도 10은 결합 부위에서 J695와 IL-12 p40 사이에 큰 갭이 존재한다는 것을 나타내는 결정 구조이다. (상부) 측면으로부터 본 J695 표면(도 9로부터 -90° 회전시킴). 깊은 클레프트에 주의한다. (하부) p40의 결합은 충전되지 않은 갭을 남긴다. (화살표) CDR H2와 L3 사이 및 p40 루프 3과 4 사이.
도 11은 키메라 맵핑에 의해 IL-12 p40에 대해 정의된 6개의 항체 결합 부위를 나타낸다. 2차 구조적 요소 및 용매 접근성(after (Yoon, C., S. C. Johnston, et al. 2000 "Charged residues dominate a unique interlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12." The EMBO Journal 19(14):3530-3521); white, cyan and blue bar: not-, partly, and fully-accessible)은 p40 서브유닛의 이러한 부분적 서열 정렬로 나타내어진다. 동일한 잔기는 녹색으로 박스표시되고; 상동 및 비-보존된 잔기는 갈색 및 적색이다. 사이노몰거스 IL-12 p40(도시하지 않음)은 25-잔기 C-말단 연장이 추가된 레서스 p40과 동일하다.
도 12는 키메라 맵핑에 의해 IL-12 p40에 대해 정의된 6개의 항체 결합 부위의 위치를 나타낸다. 이 도면은 IL-12 p40 부위 7 내지 12의 3차원 위치를 나타내는 J695 Fab/IL-12 p70 복합 결정 구조에 기반한다. p40 및 p35 서브유닛은 황갈색 및 밝은 청색이고; p40 N-말단은 우측에 나타내고, C-말단은 좌측에 나타낸다. J695 Fv는 청색의 쉐이드로 나타낸다.
도 13은 키메라 맵핑에 의해 IL-12 p40에 대해 정의된 6개의 항체 결합 부위의 위치를 나타내는 결정 구조이다. 표면도는 IL-12 p40 부위 7 내지 12의 3차원 위치(도 11)를 나타내는 J695 Fab/IL-12 p70 복합 결정 구조에 기반한다. p40 및 p35 서브유닛은 황갈색 및 밝은 청색이고; p40 N-말단은 우측에 나타내고, C-말단은 좌측에 나타낸다. J695 Fv(도면)은 청색의 쉐이드로 나타낸다. 삽도: 후면도; 부위 7a, 7b, 8, 9 및 11이 나타내어진다.
도 14는 키메라 맵핑에 의해 정의된 6개의 추가의 IL-12 p40 에피토프의 위치를 나타내는 결정 구조이다. 표면도는 도 13에서와 같은 J695 Fab/IL-12 p70 복합 결정 구조에 기반하여, 에피토프 2 내지 5의 근사한 위치를 나타낸다. 좌측: 에피토프 3.1, 3.2, 및 5. 우측: 에피토프 2, 4a, 4b 및 4c.
도 15는 키메라 맵핑에 의해 IL-12 p40에 대해 정의된 것과 인접한 추가의 항체 결합 부위의 위치를 나타내는 결정 구조이다. 표면도는 J695 Fab/IL-12 p70 복합 결정 구조에 기반한다. 도 13에서와 같이, 부위 7 내지 12와 함께, IL-12 p40 부위 13 내지 18의 3차원 위치를 나타낸다. 삽도: 후면도; 부위 13, 14, 15, 16 및 17을 나타낸다.

본 발명은, 단독으로 및 IL-12 p70에 복합체화된, IL-12/IL-23 항체 J695의 항-p40 서브유닛의 항원 결합 단편(Fab)을 포함하는 폴리펩타이드의 x-선 결정학적 연구에 적어도 부분적으로 기반한다. 이러한 연구로부터 얻어진 원자 배위는 IL-12 및 IL-23과 같은 p40-함유 사이토카인에 결합하는 개선된 항체 및 기타 항체-유사 결합 분자(예를 들면, 항체 단편, 도메인 항체, 어드넥틴, 나노바디, 유니바디, 압타머 또는 어피바디)를 식별하고 고안하는데 있어 유용하다. 상술한 바와 같이, IL-23은 디설파이드-연결된 p40(IL-12에서 발견되는 것과 동일한 p40) 및 p19 서브유닛으로 이루어진 이종이량체 사이토카인이다.

본원에 제공된 개선된 항체는, 예를 들면, 부적절하거나 목적하지 않은 면역 시스템의 자극에 의존하는 병태(다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 크론 질환, 홍반성 낭창, 만성 감염 질환, 및 이식 수술에 따른 이식편 거부) 또는 암을 포함한 p40-함유 사이토카인의 생물학적 활성에 의하거나 이에 의존하여 조절되는 병태를 갖는 환자를 치료하는 방법에 있어 유용하다.

본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 소정 용어가 우선 정의된다.

I. 정의

하기 약어 및 두문자어는 본 특허 출원에 사용된다. "Ab"는 항체를 나타낸다. "mAb"는 모노클로날 항체를 나타내고, "Ig"는 면역글로불린을 나타낸다. "Fab"는 항체의 항원 결합 단편을 나타낸다. "야생-형" 또는 "야생형"은 단백질의 변경되지 않은 천연 아미노산 서열을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "인터류킨 12" 또는 "사람 인터류킨 12"(본원에 IL-12 또는 hIL-12로서 약기함)는 대식세포 및 수지상 세포에 의해 처음으로 분비되는 사람 사이토카인을 포함한다. 당해 용어는 둘 다 디설파이드 브릿지에 의해 함께 연결된 35kD 서브유닛(p35) 및 40kD 서브유닛(p40)을 포함하는 이종이량체 단백질을 포함한다. 이종이량체 단백질은 "p70 서브유닛"으로서 나타낸다. 사람 IL-12의 구조는 예를 들면, 문헌[Kobayashi, et al. (1989) J. Exp. Med. 170:827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp. Med. 154: 116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237]에 기재되어 있다. 용어 사람 IL-12 재조합 사람 IL-12(rhIL-12)을 포함하는 것으로 의도되고, 이는 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조될 수 있다.

인터류킨-12(IL-12)는 세포내 병원체에 대한 세포-배개된 면역성을 자극하는 Ag-제시 세포에 의해 분비된 초기 염증-촉진성 사이토카인이다(Wolf, S. F., P. A. Temple, et al. (1991). "Cloning of cDNA for natural killer cell stimulatory factor, a heterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and natural killer cells." J Immunol 146(9): 3074-81; D'Andrea, A., M. Rengaraju, et al. (1992). "Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peripheral blood monoclear cells." J. Exp. Med. 176: 1387-1398; Trinchieri, G. (1998) "Interleukin-12: a cytokine at the interface of inflammation and immunity." Advanced Immunology 70: 83-243). 류마티스 관절염, 크론 질환, 및 다발성 경화증 등의 각종 자가면역 질환에 있어서의 사이토카인의 관여는 잘 확립되어 있다(Flavell, R. A. (2002). "The relationship of inflammation and initiation of autoimmune disease: role of TNF super family members." Curr Top Microbiol Immunol 266: 1-9; O'Shea, J. J., A. Ma, et al. (2002). "Cytokines and autoimmunity." Nat Rev Immunol 2(1): 37-45). 특히, 비조절된 IL-12 분비는 예를 들면, 크론 질환에서 부적절한 자가면역 반응을 초래한다(Tsukada, Y., T. Nakamura, et al. (2002). "Cytokine profile in colonic mucosa of ulcerative colitis correlates with disease activity and response granulocytapheresis." The American Journal of Gastroenterology 97(11): 2820-2828).

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인터류킨 23" 또는 "사람 인터류킨 23"(본원에서 IL-23 또는 hIL-23으로서 약기됨)은 p19(IL-23 알파 서브유닛) 및 IL-12의 베타 서브유닛(즉, IL-12B)인 p40의 2개의 서브유닛으로 이루어진 사람 이종이량체 사이토카인 단백질을 포함한다. IL-23은 대식세포 및 수지상 세포를 포함한 다수의 상이한 세포에 의해 분비된다. IL-12와 마찬가지로, IL-23은 자가면역 질환의 발달에 있어 중요한 것으로 밝혀진다; 예를 들면, IL-23은 다발성 경화증의 뮤린 모델에서 주요 역할을 한다(Cua, D. J., J. Sherlock, et al. (2003). "Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain." Nature 421(6924):744-8). IL23의 수용체는 IL12의 베타 1서브유닛(IL12RB1) 및 IL23 특이적 서브유닛, IL23R에 의해 형성된다. IL23 및 IL12는 둘 다 전사 활성인자 STAT4를 활성화할 수 있고, 인터페론-감마(IFNG)의 생산을 자극할 수 있다. 나이브 CD4(+) T 세포에 주로 작용하는 IL12와는 대조적으로, IL23은 기억 CD4(+) T 세포에 우선적으로 작용한다. IL-23은 감염에 대한 염증 반응의 중요한 부분이다. 이는 매트릭스 메탈로프로테아제 MMP9의 상향조절을 촉진하고, 혈관신생을 증가시키고, CD8+ T-세포 침윤을 감소시킨다. 최근, IL-23은 암성 종양의 발전에 연루되어 왔다. IL-6 및 TGF-β1과 함께, IL-23은 나이브 CD4+ T 세포를 자극하여 Th17 세포라고 칭하는 세포의 신규 서브세트로 분화시키고, 이는 전형적인 Th1 및 Th2 세포와는 구별된다. p40 또는 p19 중 어느 하나가 결핍되거나 IL-23 수용체의 서브유닛(IL-23R 및 IL12R-β1) 중 어느 하나가 결핍된 녹아웃 마우스는 다발성 경화증의 보다 덜 심각한 증상을 발전시키고, 염증성 장 질환은 염증 경로에서 IL-23의 중요성을 강조한다.

"에피토프"는 항체와 이의 항원(들) 사이의 상호작용의 부위 또는 부위들을 나타내는 당해 분야의 용어이다. 문헌(Janeway, C, Jr., P. Travers, et al. (2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3-8. New York, Garland Publishing, Inc)에 의해 기술되는 바와 같이: 항체는 일반적으로 단백질과 같은 거대 분자의 표면 상의 작은 영역만을 인식하고...[소정 에피토프]는 단백질 폴딩에 의해 함께 합쳐진 [항원] 폴리펩타이드 쇄의 상이한 부분으로부터의 아미노산으로 이루어지는 경향이 있다. 이러한 종류의 항원 결정인자는, 인식된 구조가 항원의 아미노산 서열에서 비연속적이지만 3차원 구조로 합쳐지는 단백질의 분절로 이루어지므로 입체형태적 또는 비연속적 에피토프로서 알려져 있다. 대조적으로, 폴리펩타이드 쇄의 단일 분절로 이루어진 에피토프는 용어 연속적 또는 선형 에피토프이다(Janeway, C., Jr., P. Travers, et al. (2001). Immunology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3-8. New York, Garland Publishing, Inc).

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "입체형태적 에피토프" 또는 "비-선형 에피토프" 또는 "비연속적 에피토프"는, 단일 단백질 쇄에서 연속적인 아미노산들이 아닌 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 에피토프를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, 입체형태적 에피토프는, 개재 아미노산들의 스트레치(stretch)에 의해 분리되지만 본 발명의 항체에 의해 단일 에피토프로서 인식되기에는 충분하도록 가까운 2개 이상의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 추가의 예로서, 단일 단백질 쇄 상에 아미노산들을 개재시킴으로써 분리되는 아미노산들, 또는 별도의 단백질 쇄들 상에 존재하는 아미노산들은, 단백질 구조 또는 단백질 복합체의 입체형태적 형상으로 인해 근접하게 되어 본 발명의 항체에 의해 결합될 수 있는 입체형태적 에피토프가 될 수 있다. 특정한 비연속적인 그리고 입체형태적인 에피토프가 본원에 기술된다.

일반적으로, 본 발명의 항체에 의해 결합되는 선형 에피토프는 항원, 예를 들면, IL-12 또는 IL-23의 2차, 3차 또는 4차 구조에 의존할 수 있거나, 의존하지 않을 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들면, 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 아미노산 그룹들이 천연 3차원 단백질 구조로 폴딩되는지의 여부에 관계없이 아미노산의 그룹에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 에피토프를 구성하는 개별 아미노산 잔기를 인식하지 않을 수 있고, 본 발명의 항체는 에피토프를 인식하여 결합하기 위해, 특정 입체형태(벤드, 트위스트, 턴 또는 폴드)를 요구할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "루프"는, 단백질의 2차 구조에서 2개의 Ca 원자가 서로 가깝게 접근하고(약 7Å 이하 이내에) 알파 헬릭스 또는 베타 시트와 같은 일반적인 2차 구조 요소와 관련되어 있지 않은 턴을 나타내기 위해 사용된다. 루프는 연장되고/되거나, 잘-형성되거나 고정된 내부 수소 결합 없이 무질서화될 수 있다. 루프는, 2개의 Ca 원자가 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 잔기에 의해 분리되는 턴을 포함할 수 있다.

용어 "원자 배위"(또는 "구조적 배위" 또는 "원자 모델")은 결정성 물질의 원자에 의한 x-선의 회절(x-선 산란 중심)에 대해 수득된 패턴에 관한 수학적 방정식으로부터 유도된 물질에서의 원자의 수학적 3차원 배위를 나타내는 당해 분야의 용어이다. 회절 데이터를 이용하여 결정의 단위 셀의 전자 밀도 맵을 계산한다. 이들 전자 밀도 맵을 이용하여 결정의 단위 셀 내의 개별 원자의 위치를 확립한다. 원자 배위는, 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 원자의 상대적 위치에 영향을 미치지 않으면서 상이한 배위 시스템으로 변형될 수 있다. 이러한 변형된 원자 배위는 본래 배위와 동등한 것으로서 고려되어야 한다.

달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체" 및/또는 "항체들"은, 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합부") 또는 이의 단일 쇄, 및 항체 변이체(이특이적, 이종특이적, 및 이종접합체 형태를 포함)를 포함한 항체를 나타내기 위해 집합적으로 사용된다. 본 발명의 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 사람화된 또는 사람 항체일 수 있다. 또한, 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합부, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 골격 영역, 또는 이의 임의의 일부의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드도 포함된다. 또한, 용어 "항체"는 본원에서 항체-유사 결합 분자 또는 "항체 모사체", 예를 들면, 항체 또는 이의 단편 또는 일부의 구조 및/또는 기능을 모사하지만 천연 항체 구조에 한정되지 않는 분자를 나타내는 것으로도 사용된다. 이러한 항체-유사 분자로는 예를 들면, 도메인 항체, 어드넥틴, 나노바디, 베르사바디, 유니바디, 어피바디, 아비머, 안티칼린, DARPin, 펩타이드성 분자 및 압타머가 포함된다.

한 실시형태에서, "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합부를 나타낸다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에 V_H로서 약기됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, C_H1, C_H2 및 C_H3으로 이루어지고, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에 V_L로서 약기됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, C_L로 이루어진다. V_H 및 V_L 영역은, 골격 영역(FR)이라고 칭하는 보다 보존된 영역 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 칭하는 고가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은, 면역 시스템의 각종 세포(예를 들면, 이펙터 세포) 및 전형적인 보상 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 항체의 "항원-결합부"(또는 간단하게 "항체부")는 항원(예를 들면, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합부"에 포함된 결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편, V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가의 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편; (iii) 근본적으로 힌지 영역의 부분을 갖는 Fab인 Fab' 단편(참조: FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3rd ed. 1993); (iv) V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (vi) V_H 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 나노바디, 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, V_L 및 V_H은 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가의 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일쇄 Fv(scFv)로서 공지되어 있음; 예를 들면, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)로서 제조되는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 또한, 이러한 단일쇄 항체는 용어 항체의 "항원-결합부"에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지되어 있는 통상의 기술을 이용하여 수득되고, 당해 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 선별된다.

본원에 기술되거나 포함된 항체를 구성하는 아미노산은 약기되는 경우가 있다. 아미노산 명명은 아미노산을 이의 1 글자 암호, 이의 3 글자 암호, 또는 당해 분야에 잘 이해되어 있는 바와 같은 명칭에 의해 명명함으로써 나타낼 수 있다(Alberts, B., A. Johnson, et al. (2002). Molecular Biology of The Cell. New York, Garland Publishing, Inc.):

또한, 본원에 기재된 아미노산 서열은, 핵산 변경이 화학적으로 유사한 아미노산의 치환을 초래하는 암호화 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 수의 아미노산을 변경하거나, 추가하거나 결실시키는 핵산의 치환, 결실 또는 첨가를 포함하는 "보존적 돌연변이"를 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 제1 아미노산의 화학적 및/또는 물리적 특성과 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성(예를 들면, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 갖는 제2 아미노산에 의한 제1 아미노산의 대체를 나타낸다. 보존적 치환은, 한 아미노산을 하기 그룹 내의 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다: 라이신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H); 아스파테이트(D) 및 글루타메이트(E); 아스파라긴(N) 및 글루타민(Q); N, Q, 세린(S), 트레오닌(T), 및 티로신(Y); K, R, H, D, 및 E; D, E, N, 및 Q; 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C), 및 글리신(G); F, W, 및 Y; H, F, W, 및 Y; C, S 및 T; C 및 A; S 및 T; S, T, 및 Y; V, I, 및 L; V, I, 및 T. 또한, 다른 보존적 아미노산 치환은 문제의 아미노산의 내용에 따라 유효한 것으로 인식된다. 예를 들면, 일부 경우에, 메티오닌(M)은 라이신(K)을 치환할 수 있다. 또한, 보존적 변이가 상이한 서열은 일반적으로 상동성이다.

본원에서 사용된 바와 같은 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 포함하지 않는 항체를 나타내는 것으로 의도된다(예를 들면, IL-12/IL-23의 p40 서브유닛에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 IL-12/23의 p40 서브유닛 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 포함하지 않는다). 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 나타낸다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람 항체"는, 골격 및 CDR 영역 둘 다는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유도되는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하면, 불변 영역도 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 본 발명의 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람 항체"는, 다른 포유동물 종(예를 들면, 마우스)의 배선으로부터 유도된 CDR 서열이 사람 골격 서열 상에 절편이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.

용어 "사람 모노클로날 항체"는, 골격 및 CDR 영역이 둘 다 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 나타낸다. 한 실시형태에서, 사람 모노클로날 항체는 유전자전이 비사람 동물, 예를 들면, 불멸화된 세포에 융합된 사람 중쇄 전이유전자 및 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자전이 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 사람 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 분리되는 모든 사람 항체, 예를 들면, (a) 사람 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 유전자전이되거나 또는 염색체전이된 동물(예를 들면, 마우스)로부터 분리된 항체(하기에 추가로 기재됨), (b) 사람 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들면, 트랜스펙토마로부터 분리된 항체, (c) 재조합의 조합성 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 사람 면역글로불린 유전자 서열을 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 또는 분리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 사람 항체는, 골격 및 CDR 영역이 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 소정 실시형태에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이(또는 사람 Ig 서열에 대해 유전자전이된 동물을 사용하는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이)를 실시하고, 따라서 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은, 사람 배선 V_H 및 V_L 서열로부터 유도되고 이와 관련되는 한편, 생체내 사람 항체 배선 레퍼토리 내에 천연적으로 존재할 수 없는 서열이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류(예를 들면, IgM 또는 IgG1)를 나타낸다.

어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

용어 "사람 항체 유도체"는 임의의 변형된 형태의 사람 항체, 예를 들면, 항체 및 다른 제제 또는 항체의 접합체를 나타낸다.

용어 "사람화된 항체"는, 다른 포유동물 종(예를 들면, 마우스)의 배선으로부터 유도된 CDR 서열이 사람 골격 서열 상에 절편이식된 항체를 나타내는 것으로 의도된다. 추가의 골격 영역 변형은 사람 골격 서열 내에서 이루어질 수 있다. 서열이 특정 종으로부터 "유도되는" 경우에 상기 서열은 가변 영역 아미노산을 뮤린 항체로부터 취하는 경우와 같이 단백질 서열일 수 있고, 또는 상기 서열은 핵산을 암호화하는 가변 영역을 뮤린 DNA로부터 취하는 경우와 같이 DNA 서열일 수 있다는 것은 당업자에게 이해될 것이다. 또한, 사람화된 항체는 공지되어 있는 사람 및 비-사람(예를 들면, 뮤린 또는 토끼) 항체의 서열에 기반하여 고안될 수 있다. 사람 및 비-사람 잔기 둘 다를 잠재적으로 도입하는 상기 고안된 항체는 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 서열은 DNA 수준에서 합성될 수 있고, 시험관내 또는 생체내 발현되어 사람화된 항체가 생성될 수 있다.

용어 "키메라 항체"는, 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유도되고 불변 영역 서열이 다른 종으로부터 유도된 항체, 예를 들면, 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유도되고 불변 영역 서열이 사람 항체로부터 유도된 항체를 나타내는 것으로 의도된다.

용어 "항체 모사체" 또는 "항체 미믹(mimic)"은 항체의 항원 결합 능력을 모사할 수 있지만 천연 항체 구조에 한정되지 않는 분자를 나타내는 것으로 의도된다. 이러한 항체 모사체의 예로는 도메인 항체, 어드넥틴(즉, 피브로넥틴 기반 결합 분자), 어피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머, 나노바디, 유니바디, 베르사바디, 압타머 및 펩타이드 분자가 포함되지만 이들에 한정되지 않고, 이들은 모두, 통상의 항체 결합을 모사하면서, 별도의 메커니즘으로부터 생성되고 이러한 메커니즘을 통해 기능하는 결합 구조를 사용한다. 본 발명의 실시형태는, 이들이 항체 또는 이의 항원 결합부에 대해 지시되므로 상기 기재된 항체 모사체에도 적용된다.

아미노산 치환("점") 돌연변이는 야생형 아미노산 잔기 유형, 잔기 수, 및 돌연변이된 아미노산 잔기 유형으로 나타낸다. 예를 들면, 아스파라긴에 대한 글리신 96의 점 돌연변이는 아미노산에 대한 3 또는 1 글자 약어를 이용하여 "Gly-96-Asn" 또는 "G96N"으로 나타낸다.

용어 "캐뱃 넘버링", "캐뱃 정의" 및 "캐뱃 표지"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당해 분야에 인식되어 있는 이들 용어는, 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더욱 가변성(즉, 고가변성)인 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 나타낸다(Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 및 Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 예를 들면, 본원에서 참조된 IL-12/IL-23 항체 J695의 사람 항-p40 서브유닛에 대해, 고가변성 영역은 하기와 같다. 중쇄 가변 영역에 대해, 고가변성 영역은 CDR1에 대해 아미노산 위치 27 내지 35, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 65, 및 CDR3에 대해 아미노산 위치 95 내지 102의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 대해, 고가변성 영역은 CDR1에 대해 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 56, 및 CDR3에 대해 아미노산 위치 89 내지 97의 범위이다(도 1에 나타낸 J695에 대한 캐뱃 넘버링 참조).

용어 "활성"은 항원에 대한 항체(예를 들면, IL-12 항원에 결합하는 항-hIL-12 항체)의 결합 특이성/친화성 및/또는 항체(예를 들면, hIL-12에 대한 이의 결합이 hIL-12의 생물학적 활성을 억제(예를 들면, PHA 배아 증식의 억제 또는 사람 IL-12 수용체 결합 분석에서 수용체 결합의 억제)하는 항-hIL-12 항체)의 중화 효능과 같은 활성을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "변형"은 항체 또는 이의 항원-결합부에서 하나 이상의 아미노산을 변화시키는 것을 나타내는 것으로 의도된다. 이러한 변화는 하나 이상의 위치에서의 아미노산을 첨가하거나, 치환하거나 또는 결실시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 변화는 공지되어 있는 기술, 예를 들면, PCR 돌연변이유발을 이용하여 생성될 수 있다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한 하한의 제10 단위에 대해 상기 범위 및 임의의 다른 언급된 범위 또는 상기 언급된 범위에서 사이 값의 상한과 하한 사이의 각각의 사이 값은 본 발명에 포함된다는 것이 이해된다. 보다 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 이들 보다 작은 범위의 상한 및 하한도 본 발명에 포함되고, 임의의 특정하게 제외된 한계를 상기 언급된 범위 내가 되게 한다. 상기 언급된 범위가 한계들 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 둘 다를 제외하는 범위도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 각종 양상은 하기 세부항목에서 상세하게 추가로 기재된다.

II . J695 Fab 의 결정 구조

여기에서 실시예는 사람 mAb K695의 Fab를 포함하는 폴리펩타이드의 제조 및 결정화를 기재한다. J695는 치료학적 및 진단학적 유용성을 갖는 사람 IL-12 및 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 대한 재조합 사람 mAb이다. J695는 IgG1 중쇄 및 λ 경쇄 분변 영역 이소타입을 포함한다. 이는 사람 IL-12에 단단히 결합하고(K_d 102±25pM) 이의 IL-12 수용체와의 상호작용을 방지한다(Salfeld et al. 1992 Science 255(5047):959-965). 마찬가지로, J695는 hp40 단독 및 hIL-23 둘 다에 단단히 결합한다. 캐뱃 넘버링 시스템을 참조하여, 완전 J695 CDR 서열은(도 1 및 도 2 참조): H1: ²⁷FTFSSYGMH³⁵(서열번호 1의 aa 27 내지 35); H2: ⁵⁰FIRYDGSNKYYADSVKG⁶⁵(서열번호 1의 aa 50 내지 66); H3: ⁹⁵HGSHDN¹⁰²(서열번호 1의 aa 99 내지 104); L1: ²⁴SGSRSNIGSNTVK³⁴(서열번호 2의 aa 23 내지 35); L2: ⁵⁰YNDQRPS⁵⁶(서열번호 2의 aa 51 내지 57); L3: ⁸⁹QSYDRYTHPALL⁹⁷(서열번호 2의 aa 90 내지 101)이다.

J695 Fab 단편은 파파인 분해에 의해 CHO-세포 제조된 J695 면역글로불린으로부터 제조되었다. J695에 대해, Fab는 서열번호 2의 약 잔기 1 내지 약 잔기 217의 경쇄 아미노산 잔기(서열번호 2에서 나타낸 바와 같음)와 결합된 서열번호 1의 약 잔기 1 내지 약 잔기 220의 중쇄 아미노산 잔기(서열번호 1에서 나타낸 바와 같음)으로 이루어진다. Fab 중쇄 및 경쇄는 종종 디설파이드 결합에 의해 공유 결합된다. 결합된 IL-12 p70과 상호작용을 이루는 특정 J695 Fab 아미노산 잔기(p40 쇄)는 하기에 보다 상세하게 논의된다.

J695 Fab는 각종 조건 하에서 결정화되었다. 특히, Fab는 사방정계 공간 그룹 P2₁2₁2₁, a = 53.92Å, b = 67.36Å, c = 115.79Å으로 결정화되었다. 이러한 결정 형태는 본원에서 "형태 I"로서 나타낸다(도 4 참조). 또한, 특히, J695 Fab는 단사정계 공간 그룹 P2₁, a = 85.62Å, b = 173.41Å, c = 139.85Å, β = 105.5°로 결정화되었다. 이러한 결정 형태는 본원에서 "형태 II"로서 나타낸다(도 5 참조). 용어 "공간 그룹"은 결정의 단위 셀의 대칭 요소의 무리를 나타내는 당해 분야의 용어이다. 용어 "단위 셀"은 결정의 빌딩 블록과 유사한 기본 반복 단위를 나타내는 당해 분야의 용어이다. 이들 결정 형태들 중 어느 것도 이전에 보고되지 않았다.

7개의 파라미터는 결정의 대칭 및 기하학적 특성을 고유하게 기술한다. 이들 파라미터는 공간 그룹(대칭), 3개의 단위 셀 축 길이 "a", "b", 및 "c", 및 3개의 단위 셀 축간 각 "α", "β", 및 "γ"(기하학)이다. "단위 셀 축 길이" 및 "단위 셀 축간 각"은 단위 셀의 3차원 기하학적 특성, 본질적으로 이의 길이, 폭 및 높이, 및 빌딩 블록이 수직이거나 경사진 평행육면체인지의 여부를 나타내는 당해 분야의 용어이다. 단위 셀 축 길이 및 축간 각은 단위 셀 내의 분자의 배열을 실질적으로 변경하지 않으면서 ±10% 만큼 변할 수 있다. 따라서, 각각의 단위 셀 축 길이 및 축간 각이 본원에서 "약" 특정 값인 것으로 나타내어지는 경우, 이들 단위 셀 축 길이 및 축간 각의 임의의 조합이 언급된 값으로부터 ±10% 만큼 변할 수 있다는 것을 의미함을 이해해야 한다. 유사하게, 특정 경우에 있어서, 결정의 공간 그룹(및 종종 단위 셀 파라미터와 함께)은 우선, 변경된 대칭(및 기하학적) 특성을 갖는 상이한 결정인 것이 제공되도록 변경될 수 있다. 그러나, 실제로 이러한 독특한 새로운 결정은 동일한 결정 형태를 실질적으로 기술하는 다른 방법일 뿐이다. 하기 및 실시예에 상세하게 나타내는 바와 같이, J695 Fab는 단사정계 공간 그룹 P2₁에서 결정화되었다. 동일한 결정을 실질적으로 제공하거나 또는 제공하지 않는 결정 파라미터 변동의 상기 논의 전부에 관해서, 본원에 제시된 J695 fab 결정 형태는 고유하고, 대안이 없으며, 동일한 결정 분자 배열을 실질적으로 기술하기 위해 동등하게 유효한 방법이다.

본원에서 보고된 P2₁2₁2₁ 사방정계 단위 셀은 결정학적 비대칭 단위 내에 1개의 J695 Fab 분자를 함유한다. 용어 "비대칭 단위"는, 처음으로 온전한 단위 셀을 제조하기 위해서, 특이적 공간 그룹에 대해 특정하고 당업자에게 친숙한 수학적 대칭 조작을 이용하고, 이어서 수학적 이동 대칭 조작을 적용함으로써 확장 수 있는 결정, 전체 거시적 결정의 분자 내용물의 고유의 비를 나타내는 당해 분야의 용어이다. 본원에서 보고된 P2₁ 단사정계 단위 셀은 결정학적 비대칭 단위 내에 8개의 J695 Fab 분자를 함유한다. 형태 II 결정 내의 8개의 고유한 Fab는 비-결정학적 가대칭에 의해 서로 관련되어 있다. 특히, 대략 <011> 결정학적 방향에 따라 역평행 방식으로 정렬된 2개의 fab는 [100]에 대해 평행한 의사(pseudo)-2-배 회전축("dyad")에 의해 서로 관련되어 있다. 제2 Fab 쌍은 대략 동일한 dyad로 배열되지만, ~½a만큼 이동된다. 이러한 사량체 Fab 조립체는 번역 벡터[~½a, ~½b, ~½c]에 의해 복제되어 다른 4개의 Fab에 결정학적 비대칭 단위를 제공한다. 본원에 보고된 새로운 J695 Fab 결정 형태는 둘 다 이러한 항체의 항원-결합 부위의 상세한 원자 배열을 제공하는 이점을 갖는다.

결정학적 구조 측정에 의해 나타낸 바와 같이, 공간 그룹 P2₁2₁2₁ 내의 J695 Fab 결정은 실제로 결정학적 비대칭 단위 내의 1개의 J695 Fab 분자뿐만 아니라 다수의 정렬된 물 분자도 함유한다. 또한, 결정학적 구조 측정에 의해 나타낸 바와 같이, 공간 그룹 P2₁ 내의 새로운 J695 Fab 결정은 결정학적 비대칭 단위 내의 8개의 J695 Fab 분자뿐만 아니라 다수의 정렬된 물 분자도 함유한다.

또한, 당업자에게 명백한 바와 같이, 단백질 또는 결정화 조건(사용된 단백질의 정확한 형태 등)의 약간의 변형에 의해 상기 기재된 2개의 결정 형태와 실질적으로 상이하지 않은 추가의 결정 형태가 수득될 수 있다. 상이한 공간 그룹에 존재하므로 처음으로 구별될 수도 있는 이들 다른 결정 형태는 여기에서 보고되는 결정 형태와 동등한 것으로 간주되어야 한다.

실시예에 기재되는 바와 같이, 이들 결정 중 몇몇은 x-선 결정학에 의해 조사되어, 폴리펩타이드의 원자 배위가 수득되었다. J695 Fab의 결정 구조는 분자 대체를 이용하여 측정하였고, 각각 형태 I 및 형태 II 결정에 대해 1.34-Å 및 2.10-Å 해상도에서 19.7% 및 26.1%의 유리 R-팩터로 개선되었다. "유리 R 팩터"(또는 "R_free")는 결정으로부터 실험적으로-측정된 x-선 회절 데이터와 실험적 데이터를 설명하기 위해 구성된 원자 모델(또는 원자 배위)로부터 계산된 이론적 회절 데이터 사이의 비편향 일치 정도를 나타내는 당해 분야의 용어이다. R_free 값은 항상 0%(이는 완벽한 일치를 나타냄) 초과이고; 10 내지 30% 범위 내의 값은 원자 모델과 실험적 데이터 사이의 실질적으로 정확한 일치를 나타낸다. R_free 값은 전형적으로 실험적으로-측정된 x-선 회절 데이터의 해상도에 의존한다. 보다 낮은 해상도 데이터(예를 들면, 4 내지 2-Å 해상도)는 일반적으로 보다 높은 Rfree 값과 관련이 있고, 반면 보다 높은 해상도 데이터(1 내지 2-Å 해상도)는 일반적으로 보다 낮은 R_free 값과 관련이 있다.

1. J695 의 CDR L3 은 비일반적인 시스 -대-트랜스 펩타이드 결합 이성질체화를 나탄낸다.

J695 결정 형태 I에서, CDR L3(잔기 L89 내지 L97)은 His-L95A^L3과 Pro-L95B^L3 사이에 시스-펩타이드 결합을 함유한다(도 2). 이러한 시스-프롤린은 보존된 구조적 특징의 CDR L3 정규 클래스 1 및 2이다. 문헌[Chothia, C. and A. M. Lesk (1987). "Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins." J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia, C, A. M. Lesk, et al. (1989). "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions." Nature 342: 877-883.. Al-Lazikani, B., A. M. Lesk, et al. (1997). "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins." J. Mol. Biol. 273: 927-948; Barre, S., A. S. Greenberg, et al. (1994). "Structural conservation of hypervariable regions in immunoglobulins evolution." Structural Biology 1(12): 915-920]을 참조한다. 대조적으로, CDR L3은 His-L95AL3―Pro-L95BL3 펩타이드 결합이 트랜스 입체형태를 채택하는 형태 II에서 독특한 입체구조를 갖는다. 이러한 입체형태적 전환에 의해 야기되는 L3의 재배열은 항-인플루엔자 바이러스 헤마그글루티닌 Fab 17/9에 대해 처음 기술된 H3의 유도-적합 재배열과 유사하다(Rini, J. M., U. Schulze-Gahmen, et al. (1992). "Structural evidence for induced fit as a mechanism for antibody- antigen recognition." Science 255(5047): 959-65) and the autoantibody BV04-01. Herron, J. N., X. M. He, et al. (1991). "An autoantibody to single- stranded DNA: comparison of the three-dimensional structures of the unliganded Fab and a deoxynucleotide-Fab complex." Proteins 11(3): 159-75). 이러한 전환 때문에, 2개의 결정 형태의 L3 CDR은 r.m.s. 편차 2.3Å로 열악하게 중첩되고, 반면에 다른 5개의 CDR은 r.m.s. 편차 0.2 내지 0.4Å로 잘 중첩된다.

단백질 데이터 은행(Protein Data Bank)의 체계적인 알고리듬 연구(2003년 3월 28일 현재 이용가능한 453 Ab 구조 엔트리)(Berman, H. M., T. Battistuz, et al. (200). "The Protein Data Bank." Acta Cryst. D58: 899-907)를 행하여 전체로서의 항체 내에서, 그러나 특히 CDR 내에서 둘 다 시스-대-트랜스 펩타이드 결합 이성질체화의 예를 확인한다. 다수의 비논리적 시스/트랜스 쌍을 제거한, 본원에서 사용된 알고리듬은 J695를 이용하여 관찰된 이러한 현상의 단 하나의 이전 예, 즉 항-단일 가닥 DNA mAb DNA-1을 확인하였다(Tanner, J. J., A. A. Komissarov, et al. (2001). "Cyrstal Structure of an Antigen-binding Fragment Bound to Single-stranded DNA." J. Mol. Biol. 314: 807-822). 따라서, J695는 단지 시스 및 트랜스 입체형태적 둘 다를 채택하는 CDR 중 어느 하나에서 펩타이드 결합을 명백하게 나타내는 제2 Ab이고, 이는 CDR L3에서 시스-대-트랜스 이성질체화를 나타내는 제1 Ab인 것으로 생각된다.

2. CDR L3 은 2개의 신규 연장된 헤어핀 입체구조를 채택한다.

결정 형태 둘 다에서, J695의 CDR L3은 이전에 관찰되지 않았던 독특한 연장된 헤어핀 입체구조를 채택한다(도 3). L3은 12개의 잔기로 드물게 길고, 구조적으로-특징분석된 Ab에 대해 나타낸 가장 긴 것이다. L3의 드문 길이는 이것이 드문 입체형태를 채택하도록 하는 것으로 생각된다.

CDR L3은, 정규 클래스 1 및 2에 이전에 기술된 위치 95B에서의 보존된 시스-프롤린의 존재에도 불구하고, 3개-잔기 연장 및 보존된 잔기 Gln-L90의 결여 때문에 결정 형태 I의 고유한 입체형태를 채택한다(Chothia and Lesk 1987 Nature 342:877-883; Chothia and Lesk 1989 Nature 342:877-883; Barre and Greenberg 1994 Structural Biology 1(12):915-920; Al-Lasikani and Lesk 1997 J. Mol. Biol. 273:927-948). 또한, L3 입체형태는 마틴 및 토른톤(Martin and Thornton)에 의해 기술된 신규한 정규 클러스터 중 어느 하나에 상응하지 않고(Martin and Thornton 1996 J. Mol. Biol. 263:800-815), 이들이 문서에 기재한 신규 비-클러스터 루프 구조 중 어느 하나와 유사하지도 않다. 추가의 잔기는 L3이 골격으로부터 연장되게 하여 Pro-L95B^L3 주위에 벌지를 형성함으로써 항원-결합 부위의 한 말단을 한정한다. 이러한 입체구조에서, 시스-프롤린은 정규 클래스 1에서 관찰된 입체구조에 대해 플립핑되어 C_β 원자가 이로부터 다소 떨어진 항원-결합 부위를 향하여 지정하게 한다(도 4).

3개의 강하게-결합된 물 분자는 연장된 L3 입체구조를 안정화시킨다. 일반적으로-보존된 Gln-L90의 구조적 역할과 유사한 구조적 역할을 행하는 L3 헤어핀의 중심에서 1개의 물 분자가 Thr-L95^L3(3.0Å)의 측쇄, Asp-L92^L3(3.1Å) 및 Ala-L95C^L3(2.7Å)의 주쇄 카르보닐 산소 원자, 및 Asp-L92^L3의 마이드 질소(2.0Å)에 수소 결합을 형성한다(도 3). 헤어핀의 끝에 위치한 제2 물 분자는 Arg-L93^L3(3.1Å)의 카르보닐 산소 및 His-L95A^L3(2.7Å)의 아미드 질소에 수소 결합을 형성하고, 제3 물 분자는 Tyr-L94^L3의 카르보닐 산소에 수소 결합(2.8Å)을 형성한다. 또한, 시스-펩타이드 결합은 이러한 신규 구조를 형성하는 것을 돕는다. 결합된 포스페이트(또는 설페이트)는 Lyw-L34^L1의 N^ζ 원자, Pro-L95B^L3, Tyr-L91^L3 O^η, His-H35^H1 N^ε1, 및 His-H95^H3 N^δ1의 카르보닐 산소와 직접적 상호작용 및 물-매개된 상호작용을 통해, L1, L3, H2 및 H3 CDR을 연결한다(도 3).

또한, CDR L3은, 부분적으로 트랜스 입체형태에 대한 His-L95A^L3―Pro-L95B^L3 펩타이드 결합의 이성질체화로 인해 결정 형태 II 내에 독특한 비-정규 입체구조를 채택한다. L3 입체구조는 몇몇의 강하게 결합된 물 분자와의 수소 결합 상호작용에 의해, 형태 I과 유사하지만 Thr-L95^L3의 측쇄에 대한 수소 결합을 손실을 갖는 방식으로 강화된다. 형태 I에서 나타낸 것과 구별되는 물-매개된 상호작용은 수소 결합을 GlnL31^L1의 측쇄 및 Thr-L95^L3 및 His-L95A^L3의 몇몇 주쇄 원자에 수소 결합을 가교시키는 것을 포함한다.

3. 제2 Fab 의 결합 부위에의 CDR L3 의 삽입은 항원 결합을 모방한다.

WP2 분자의 항원-결합 부위에, 결정 격자 내의 한 분자 유래의 L3을 삽입하는 것은 결정 형태 II에서 L3 입체구조를 강화시킨다. 형태 I에서 발견되지 않는 이러한 분자간 접촉은 결정학적 대칭-관련된 Fab 유래의 L3'과 H3' 사이에 L3을 고정시킨다. 이러한 상호 L3 교환은 결정 형태 I에서 관찰되는 결합된 포스페이트 음이온을 대체하고; 얻어진 공동은 CDR, 2개의 잘-정렬된 물 분자, 및 Tyr-L'94^L3의 측쇄의 일반적 내향 "밀착"에 의해 채워진다.

시스-트랜스 이성질체화, 및 후속적인 광범위한 결정 팩킹 접촉의 형성에 의해 야기된 형태 II의 CDR L3의 끝의 재구성은, Arg-L93^L3으로부터 His-L95A^L3으로의 항원-결합 클레프트 방향으로의 잔기의 153°회전으로서 기재될 수 있다. Arg-L93^L3 C^α 및 Pro-L95B^L3의 피롤리딘 환에 의해 거의 정의된 축에 대한 이러한 회전은 Thr-L95L3을 항원-결합 부위를 향하여 9Å 초과로 이동시킨다. Tyr-L94^L3의 C^α 원자는 7.4Å 이동하고, 이의 측쇄는 결합 부위로 회전하여(O^η은 15Å 이동함) 대칭-관련된 Tyr-L'91^L3의 O^η에 수소 결합을 형성한다. His-L95A^L3은 2개의 결정 형태 사이의 배향을 플립핑한다. 몇몇의 추가 접촉이 L3과 대칭-관련된 H2 및 H3 CDR 사이에서 관찰된다. 대조적으로, 결정 형태 I의 CDR L3은 단일 분자간 접촉만을 형성한다.

따라서, J695의 CDR L3은, Ab가 항원에 대해 다소 상이한 2개의 항원 결합 부위를 나타내도록 하는 입체형태적 이성질체화를 나타낸다. 결정 형태 II에서 관찰되는 분자간 Ab/Ag 상호작용은 Ab/Ag 상호작용을 모방할 수 있다.

4. J695 는 항원 결합의 가변 도메인 인터페이스 특성에서 구조적 변경을 나타낸다.

2개의 결정 형태의 가변 도메인 사이의 인터페이스는 실질적으로 리간드화되지 않은 Ab와 유사한 형태 I 및 리간드화된 Ab와 유사한 형태 II와 상이하다. 우선, 매우 짧은 (6개의 잔기) CDR H3은 "벌지형 토르소(bulged torso)" 입체구조를 채택하는 형태 II에서만 정렬된다(Morea et al. 1998 J. Mol. Biol 275 :269-294). 상기 논의된 바와 같이, 4개의 H3 잔기 H96 내지 H101의 정렬은 IL-12와의 상호 작용을 치환할 수 있는 결정 접촉의 형성과 조합된다. 항원 결합에 따른 H3의 정렬 또는 입체형태적 변화는 흔히 관찰된다(Stanfield and Wilson 1994 Trends Biotechnol 2(7):275-9).

둘째, V_L-V_H 인터페이스에 숨겨진 용매-접근가능한 표면 영역은 형태 I로부터 형태 II로 38% 증가한다(1,114 대 1,540 ± 28Å²). 이러한 증가는 비결합 상태로부터 항원-결합 상태로의 형질전환의 특성이다(Stanfield et al. 1993 Structure 15 :83-93). 이러한 증가의 약 2/3는 H3의 정렬에 의한 것이다. 표면 면적 차이와 일치하게, 형태 I에서의 V_L-V_H 인터페이스는, Gln-L38 및 Gln-H39의 측쇄 사이의 일반적으로 숨겨진 상호 교환, 1개의 수소-결합 상호작용만을 함유하고, 반면 형태 II에서의 인터페이스는 8개이다. V_L-V_H 인터페이스에서의 이들 변화는 C_L-C_H1 인터페이스의 불변과는 대조적이다: C_L과 C_H1 사이에 숨겨진 표면 면적은 2개의 결정 형태(형태 I: 1,702Å²; 형태 II: 1,757 ± 159Å², 범위 1,512 내지 2,003Å²)에서와 유사하다. 가변성 도메인에 의해 나타내어지는 불변성(1.8%)에 대해 비교된 형태 II C_L-C_H1 인터페이스에서의 상대적으로 큰 가변성(9%)은 몇몇의 형태 II 불변 도메인에서 고도의 장애(보다 높은 온도 인자에 의해 반영됨)로 인한 것으로 생각된다.

셋째, 결정 형태 II의 Fab는, V_L을 V_H에 관련시키는 의사(pseudo)-2-배 회전축에서 형태 I에 비해 변화를 나타낸다. 형태 II의 8개의 V_L 도메인이 형태 I V_L 상에 정렬되는 경우, 이어서 형태 II V_H 도메인에 추가의 회전이 적용되어 이들이 형태 I의 V_H와 정렬되도록 해야 한다. 이들 회전은 평균 2.1 ± 0.9°(범위 0.8 내지 4.0°)이다. 이러한 V_L-V_H 회전 비정렬은 리간드화된 Fab와 리간드화되지 않은 Fab 사이의 차이의 특성이다(Stanfield et al. 1993 Structure 15:83-93). 8개의 형태 II Fab 중 6개가 형태 I과 동일한 엘보우(elbow) 각도를 가지므로 이들 회전 차이는 엘보우 각도 변화에 연계되지 않는다(136 ± 5 대 135°).

5. J695 항원 결합 부위는 음으로-하전된 펩타이드에 결합하기 위한 태세를 갖춘 현저한, 양으로-하전된 클레프트 갖는다.

결정 형태 둘 다에서, J695 CDR은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 깊은 클레프트를 형성하고, 항체의 보다 전형적인 결합 부위는 소분자 합텐에 대해 지시되었다(도 5). 대조적으로, 대부분의 단백질-지시된 항체는 상대적으로 평평한 표면을 갖는 항원-결합 부위를 함유한다(MacCallum, R. M., A. C. Martin, et al. (1996). "Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography." J. Mol. Biol. 262(5): 732-745). 클레프트는 결정 형태 I에서 양쪽 말단에서 열려 있고, 반면 결정 형태 II에서는 양쪽 말단에서 닫혀 있다. 형태 II에서의 CDR L3의 재배열은 클레프트의 한 말단을 닫고, H3의 정렬은 클레프트의 바닥을 완성하여 다른 말단을 닫는다. 닫힌 클레프트는 약 9Å 너비(V_H 내지 V_L)이고, 약 11Å 깊이(바닥 내지 CDR 끝)이고, -13Å 길이(H3 내지 L3)이다. 클레프트의 바닥은 고도로 양전기성이다. 따라서, J695는 IL-12의 표면으로부터 연장하는 음으로-하전된 펩타이드 루프에 결합하기 위해 필요한 기하학적 특성 및 전하 특성을 갖는다.

J695 항원-결합 부위의 양 전하를 감소시켜 음으로-하전된 IL-12에 대한 상보성을 방해하는 돌연변이(도 6)는 결합 효능의 손실을 야기한다(PCT 공보 제WO 0056772 A1 참조). 양으로-하전된 클레프트에 기여하는 잔기로는: Asn-L31^L1(서열번호 2의 aa 32); Lys-L34^L1(서열번호 2의 aa 35); Gln-L89^L3(서열번호 2의 aa 90); His-H35^H1(서열번호 1의 aa 35); Lys-H93(서열번호 1의 aa 97); His-H95^H3(서열번호 1의 aa 99); His-H98^H3(서열번호 1의 aa 102); Asn-H102^H3(서열번호 1의 aa 104); 및 Trp-H103(서열번호 1의 aa 105)이 포함된다.

J695 전구체 Joe 9의 CDR H3에는 이들 잔기들 중 3개가 결여되어 있다. His-H95^H3, 및 His-H98^H3의 단독 도입은 mAb 70-1의 결합에서 약 5배의 개선을 초래하였다(도 2). 110-11을 제공하기 위한 78-34의 재배치된 L3 아르기닌 잔기와의 조합은 50배 초과의 개선을 초래하였다. 103-14에서 특이하게-위치된 골격 잔기 Lys-H93의 첨가(Morea, V., A. Tramontano, et al. (1998). "Conformations of the third hypervariable region of the VH domain of immunoglobulins." J. Mol. Biol. 275: 269-294)는 효능에 있어서 Joe 9에 비해 1000배 증가를 제공하였다. 심지어 이들 양으로-하전된 잔기의 고도로-최적화된 Y61 돌연변이에서도, IL-23 결합시 측정가능한 영향을 가졌다. 예를 들면, 음으로-하전된 글루타메이트에 대한 Y61 His-H95^H3의 돌연변이는 k_off 속도 상수에서의 8배 증가(또한 참조로 친화성에서의 감소)를 야기하였고, 아스파르테이트에 대한 AsnL31^L1의 돌연변이는 2.5배 증가를 초래하였다. 따라서, 친화성 성숙 데이터, 전하 상소벙, 및 간단한 기하학적 고려는 모두 J695가 IL-12 상의 유망한 음으로-하전된 루프에 결합한다는 것을 나타낸다.

III. IL-12 p70(p40/p35)에 결합된 J695 Fab의 결정 구조

사람 mAb J695의 Fab를 포함하는 폴리펩타이드와 사람 IL-12 p70을 포함하는 폴리펩타이드 사이의 복합체를 제조하였다. 상기 나타낸 바와 같이, 사람 IL-12 p70은 2개의 서브유닛, p40 폴리펩타이드 쇄 및 p35 폴리페타이드 쇄로 이루어진다. 전구체(또는 폴리펩타이드) p40 쇄 아미노산 잔기는 서열번호 5로서 나타낸다. 전구체(또는 폴리펩타이드) p35 쇄 아미노산 잔기는 서열번호 6으로서 나타낸다. 성숙 p40 쇄 아미노산 잔기, 즉 서열번호 5의 잔기 약 23 내지 잔기 약 328은 성숙 p35 쇄 아미노산 잔기, 즉 서열번호 6의 잔기 약 23 내지 잔기 약 213과 결합되어 IL-12 p70 이종이량체성 사이토카인을 형성한다. p40 및 p35 쇄는 디설파이드 결합에 의해 공유 결합된다. 이후로, 이러한 특허 출원을 통해, IL-12 p40 및 IL-12 p35 폴리펩타이드의 성숙 넘버링이 사용되고 있다. J695 Fab와 상호작용하게 하는 특이적 IL-12 p40 아미노산 잔기는 하기에 보다 상세하게 논의된다.

천연 사람 IL-12 40의 아미노산 서열(서열번호 5)은 SWISS-PROT(http://www.expasy.ch;Entry Name: IL12B_HUMAN; Primary Accession Number: P29460)에 정의된 바와 같은 것을 선택한다. 이러한 SWISS-PROT 엔트리에서의 아미노산 잔기 23 내지 328은 성숙 IL-12 p40 폴리펩타이드에 상응하고, 이는 본원에서 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 잔기 1 내지 306으로서 나타낸다. 천연 사람 IL-12 p35의 아미노산 서열(서열번호 6)은 SWISS-PROT(http://www.expasy.ch;Entry Name: IL12A_HUMAN; Primary Accession Number: P29459)에 정의된 바와 같은 것을 선택한다. 이러한 SWISS-PROT 엔트리에서의 아미노산 잔기 23 내지 219는 성숙 IL-12 p35 폴리펩타이드에 상응하고, 이는 본원에서 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 잔기 1 내지 197로서 나타낸다.

실시예에 기재되는 바와 같이, 복합체는 각종 조건 하에서 결정화되었다. 특히, J695 Fab/IL-12 p70 복합체는 사방정계 공간 그룹 C222₁, a = 136.3151Å, b = 209.5560Å, c = 217.1127Å으로 결정화되었다. 이러한 결정 형태는 이전에 보고되지 않았다.

하기 및 실시예에 상세하게 기재되는 바와 같이, 본원에 보고된 C222₁ 사방정계 단위 셀은 결정학적 비대칭 단위 내의 J695 Fab의 2개의 분자 및 IL-12 p70의 2개의 분자를 함유한다. 결정학적 구조 측정에 의해 나타내는 바와 같이, 공간 그룹 C222₁ 내의 새로운 J695 Fab/IL-12 p70 복합체 결정은, 실제로 결정학적 비대칭 단위 내의 J695 Fab의 2개의 분자 및 IL-12 p70의 2개의 분자뿐만 아니라 다수의 정렬된 물 분자도 함유한다.

또한, 당업자에게 명백한 바와 같이, 단백질 또는 결정화 조건(사용된 단백질의 정확한 형태 등)의 약간의 변형에 의해 상기 기재된 사방정계 형태와 실질적으로 상이하지 않은 추가의 결정 형태가 수득될 수 있다. 상이한 공간 그룹에 존재하므로 처음으로 구별될 수도 있는 이들 다른 결정 형태는 여기에서 보고되는 결정 형태와 동등한 것으로 간주되어야 한다.

실시예에 기재되는 바와 같이, 이들 결정 중 몇몇은 x-선 결정학에 의해 조사되어, 폴리펩타이드에 대한 원자 배위가 수득되었다. 특히, x-선 결정학에 의해 조사된, 본원에서 보고되는 C222₁ 결정 형태는 결합 부위에서 분자 J695와 IL-12 p70 둘 다의 3차원 입체구조를 포함하는 J695와 IL-12 p70 사이의 정확한 분자 상호작용을 나타내는 이점을 가질뿐만 아니라 이는 IL-12 아미노산 잔기가 결합 부위 또는 에피토프를 포함한다. J695 Fab와 IL-12 p70 사이의 1-대-1 복합체의 결정 구조를 측정하였고, 3.25-Å 해상도에서 유리 R 팩터 28.7%로 개선되었다.

IV. IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체

본 발명의 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 본원에 기재된 p40 서브유닛의 특정 도메인 또는 일부 또는 입체형태적 에피토프, 예를 들면, 성숙 사람 p40 단백질의 아미노산 서열(서열번호 3)의 잔기 1 내지 197로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에 결합한다. 바람직한 실시형태에서, IL-12 및/또는 Il-23의 p40 서브유닛에 대한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 결합은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성 및/또는 p40-함유 사이토카인의 활성을 조절한다, 예를 들면, 억제하거나 감소시킨다. 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부는, p40-함유 사이토카인, 예를 들면, IL-12 또는 IL-23의 이의 수용체, 예를 들면, 각각 IL-12 또는 IL-23 수용체에 대한 결합을 차단할 수 있다.

본 발명의 항체는 p40 서브유닛의 특이적 도메인 또는 일부, 예를 들면, 성숙 사람 p40 단백질의 아미노산 서열(서열번호 3)의 잔기 1 내지 197로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 부분에 결합시키기 위해 선택되거나 고안된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 성숙 사람 p40 단백질의 아미노산 서열(서열번호 3)의 잔기 1 내지 197로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에 결합시키기 위해 선택되거나 고안된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 p40 서브유닛의 루프 1 내지 7의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에 결합시키기 위해 선택되거나 고안되고, 예를 들면, 여기서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 성숙 사람 p40 단백질의 아미노산 서열(서열번호 3)의 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 107, 124 내지 129, 157 내지 164 및 194 내지 197로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 IL-12 및/도는 IL-23의 p40 서브유닛의 도메인에 대한 상동성을 공유하는 단백질에 결합시키기 위해 선택되거나 고안된다. 예를 들면, 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 도메인과 50% 이상 동일하거나, 60% 이상 동일하거나, 70% 이상 동일하거나, 80% 이상 동일하거나, 90% 이상 동일하거나, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 도메인에 결합시키기 위해 선택되거나 고안될 수 있다. 이러한 항체 또는 이의 항원 결합부는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 도메인과 기능적으로 유사한 단백질 도메인에 결합할 수 있다.

한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 아미노산의 인접한 스트링을 나타내는 단백질 모티프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는, 단백질의 3차원 구조를 나타내는 단백질 모티프 또는 컨센서스 서열에 결합한다. 이러한 모티프 또는 컨센서스 서열은 아미노산의 인접한 스트링을 나타내지 않지만, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 3차원 폴딩으로부터 얻어지는 비-인접한 아미노산 배열(즉, "구조적 모티프" 또는 "비-선형 에피토프")을 나타낼 수 있다. 이러한 모티프의 예는 섹션 IV의 표 4에 기재된 바와 같은, 예를 들면, 사람 p40의 Tyr16, Asp87 및 Asp93을 포함하는 에피토프 1일 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 예를 들면, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 루프 1 내지 7 유래의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 비-선형 에피토프에 결합한다. 본 발명의 항체는 하기 하위섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.

A. J695 Fab/IL-12 p70 복합체의 결정 구조에 기반한 항체

1. IL-12 p40에 대한 접촉

J695 Fab/IL-12 p70 복합 결정 구조는, J695가 p40 서브유닛을 통해 IL-12에 결합하는 것을 나타내고; J695와 p35 서브유닛 사이에 접촉이 존재하지 않는다(도 7). IL-12 p40 서브유닛의 아미노산 잔기에 대한 모든 참조는 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 성숙 p40 폴리펩타이드에 대한 참조로 이루어진다.

J695 Fab와 p40 사이의 상호작용의 벌크는 p40, 약 아미노산 잔기 1 내지 197, 보다 바람직하게는 성숙 p40 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 107 사이의 N-말단 도메인 D1에서(미성숙 서열의 잔기 약 23 내지 130; 서열번호 3에 제시된 성숙 p40 폴리펩타이드 서열 참조) 발생한다(도 8). 따라서, 예시 실시형태에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 1 내지 197로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 1 내지 107로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

또한, IL-12 p40의 다른 도메인에 대해 몇몇 상호작용이 이루어진다. 특히, J695는 IL-12 p40에 결합하고, 하기 IL-12 p40 아미노산 잔기: Asp14, Trp14, Tyr16, Pro17, Asp18, Ala19, Pro20, Gly21, Glu22, Met23, Lys58, Glu59, Phe60, Lys84, Lys85, Glu86, Asp87, Gly88, Ile89, Trp90, Ser91, Thr92, Asp93, Ile94, Leu95, Lys96, Asp97, Gln98, Lys99, Glu1OO, Pro101, Lys102, Asn103, Lys104, Thr105, Phe106, Leu107, Thr124, Thr125, Ile126, Ser127, Thr128, Asp129, Arg157, Val158, Arg159, Gly160, Asp161, Asn162, Lys163, Glu164, His194, Lys195, Leu196, 및 Lys197과 접촉된다(도 8). 이들 잔기는 p40 서브 유닛의 루프 1 내지 7 중 하나 이상의 루프에 각각 위치한다. 따라서, 또한, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체는 본 발명에 포함되고, 여기서, 항체는 루프 1 내지 7의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에 결합한다. 예시 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 루프 1 내지 7의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내, 예를 들면, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

특히, J695는 IL-12 p40에 결합하고, IL-12 p40 루프 1을 포함하는 하기 IL-12 p40 아미노산 잔기, 즉 잔기: Asp14, Trp15, Tyr16, Pro17, Asp18, Ala19, Pro20, Gly21, Glu22, 및 Met23과 접촉된다(도 8). 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 실시형태에서, 항체는 14 내지 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 14 내지 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 항체는 15 내지 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

또한, 결정 구조 분석은, J695가 IL-12 p40에 결합하고, IL-12 p40 루프 2를 포함하는 하기 IL-12 p40 아미노산 잔기, 즉 잔기: Lys58, Glu59, 및 Phe60과 접촉된다는 것을 나타낸다. 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 잔기 58 내지 60으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 루프 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

또한, 결정 구조 분석은, J695가 IL-12 p40에 결합하고, IL-12 p40 루프 3을 포함하는 하기 IL-12 p40 아미노산 잔기, 즉 잔기: Lys 84, Lys85, Glu86, Asp87, Gly88, Ile89, Trp90, Ser91, Thr92, Asp93, 및 Ile94와 접촉된다는 것을 나타낸다(도 8). 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 잔기 84 내지 94로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 다른 실시형태에서, 항체는 85 내지 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 항체는 86 내지 89 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 86, 87, 89 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

IL-12 p40 아미노산 잔기 Asp87은 J695에 대한 결합에 있어서 특히 우세하다. 이의 측쇄 카르복실레이트는, 결합된 포스페이트 이온이 J695 Fab의 형태 I 결정 구조에서 관찰된 것과 동일한 위치에서 결합 부위에 깊게 결합한다(도 9). 따라서, 추가의 바람직한 실시형태에서, 항체는 루프 3의 아미노산 잔기 87을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

또한, 결정 구조 분석은, J695가 IL-12 p40에 결합하고, IL-12 p40 루프 4를 포함하는 하기 IL-12 p40 아미노산 잔기, 즉 잔기: Leu95, Lys96, Asp97, Gln98, Lys99, Glu1OO, Pro1O1, Lys102, Asn103, Lys104, Thr105, Phe106, 및 Leu107과 접촉된다는 것을 나타낸다. 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 잔기 95 내지 107로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 다른 실시형태에서, 항체는 102 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 103 및 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체는 루프 4의 아미노산 잔기 104를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 항체는 루프 4의 아미노산 잔기 103을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

또한, 결정 구조 분석은, J695가 IL-12 p40에 결합하고, IL-12 p40 루프 5를 포함하는 하기 IL-12 p40 아미노산 잔기, 즉 잔기: Thr124, Thr125, Ile126, Ser127, Thr128, 및 Asp129와 접촉된다는 것을 나타낸다(도 8). 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 잔기 124 내지 129로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 루프 5의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

또한, 결정 구조 분석은, J695가 IL-12 p40에 결합하고, IL-12 p40 루프 6을 포함하는 하기 IL-12 p40 아미노산 잔기, 즉 잔기: Arg157, Val158, Arg159, Gly160, Asp161, Asn162, Lys163, 및 Glu164와 접촉된다는 것을 나타낸다. 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 항체는 잔기 157 내지 164로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 루프 6의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

또한, 결정 구조 분석은, J695가 IL-12 p40에 결합하고, IL-12 p40 루프 7을 포함하는 하기 IL-12 p40 아미노산 잔기, 즉 잔기: His194, Lys195, Leu196, 및 Lys197과 접촉된다는 것을 나타낸다. 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 항체는 잔기 194 내지 197로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 루프 7의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

결정 구조 분석은, J695와 IL-12 사이의 특이적 상호작용의 대부분이, 하기 IL-12 p40 루프: 루프 1, 루프 3, 및 루프 4와의 상호작용임을 추가로 나타낸다. 예를 들면, J695와 에피토프 내의 IL-12 p70 사이의 특이적 접촉의 대부분은, 1차 서열에서 인접하지 않은 4개의 IL-12 p40 표면 루프(잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 94, 및 95 내지 107; 각각 루프 1, 2, 3, 및 4, 상기에 나타냄)로 주로 이루어진 에피토프, 소위 "입체형태" 에피토프에 존재한다(Janeway, C, Jr., P. Travers, et al. (2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. New York, Garland Publishing, Inc). 이와 같이, 다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 항체는 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 94, 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은, 잔기 14 내지 18, 85 내지 93, 및 102 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는 항체를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은, 잔기 14 내지 17, 86 내지 89, 93 및 103 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는 항체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 잔기 15 내지 17, 86 내지 87, 89, 93 및 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는 항체를 포함한다.

다른 추가의 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 잔기 14 내지 23 및 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 잔기 15, 17 내지 21, 23 및 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는 항체를 포함한다.

다른 추가의 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 다른 실시형태에서, 항체는 잔기 14 내지 23 및 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 및 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 항체는 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

추가의 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 잔기 14 내지 23 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 및 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 실시형태에서, 항체는 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

추가의 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23, 예를 들면, 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 잔기 84 내지 94 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3 및 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 실시형태에서, 항체는 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에 및/또는 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합한다.

J695와 IL-12 p70 사이의 실험적으로-측정된 결합 부위는, p40 잔기가 J695의 결합을 조절하는 것에 관한 공지된 데이터, 특히, 각종 소스, 예를 들면, 사람, 레서스 원숭이, 개, 래트, 또는 마우스 IL-12 유래의 IL-12 p40 또는 IL-12 p70과 J695 사이에 공지된 교차-반응성 또는 이의 결여와 일치한다(도 11). 예를 들면, 결합 부위에서의 2개의 주요 아미노산 잔기는 사람 IL-12와 래트 또는 마우스 IL-12, 즉 IL-12 p40 아미노산 잔기 Tyr16(루프 1)과 Asp87(루프 3) 사이에 보존된다. 이들 2개의 잔기, 즉 Tyr16Arg(래트) 또는 Tyr16Thr(마우스), 및 Asp87Asn(래트 또는 마우스)의 변경은 래트 또는 마우스 IL-12에서, 또는 사람/래트 키메라 단백질(하기 참조)에서 발견되는 바와 같이 J695에 대한 결합을 필수적으로 폐지한다.

또한, IL-12 p40 아미노산 잔기 Gln98, Lys99, 및 Glu100의 결실은, 래트 또는 마우스 IL-12 p40에서 발견되는 바와 같이, 루프 3 및 루프 4의 형태를 변경하고, 따라서, J695에 대해 상기 언급된 주요 잔기를 적절히 제시한다. 관찰된 결합 부위는 또한 IL-12 p70, IL-12 p40, 또는 IL-23 p40/p19 이종이량체 중 어느 하나에 대한 J695의 공지된 결합과 일치하고, 모두 필수적으로 동등한 친화성을 갖는다(도 7). 최종적으로, 관찰된 결정학적 결합 부위는 J695의 친화성 성숙으로부터의 공지된 돌연변이유발 데이터와도 일치한다, 즉, J695 전구체 항체로 이루어진 돌연변이가 IL-12 결합 효능에 영향을 미친다(전문이 본원에 참조로 도입되는 PCT 공보 제WO 0056772 A1호에 기재된 바와 같음).

본 발명의 한 실시형태에서, IL-12 및/또는 IL-23의 p4 서브유닛에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부는 비연속적 또는 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 루프 1 내지 7의 아미노산 잔기, 즉, 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 107, 124 내지 129, 157 내지 164 및 194 내지 197로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 1의 아미노산 잔기, 즉 아미노산 잔기 14 내지 23으로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 2의 아미노산 잔기, 즉 아미노산 잔기 58 내지 60으로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 3의 아미노산 잔기, 즉 아미노산 잔기 84 내지 94로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 4의 아미노산 잔기, 아미노산 잔기 95 내지 107로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 5의 아미노산 잔기, 즉, 아미노산 잔기 124 내지 129로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 6의 아미노산 잔기, 즉, 아미노산 잔기 157 내지 164로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 7의 아미노산 잔기, 즉, 아미노산 잔기 194 내지 197로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다.

다른 실시형태에서, 항체는 루프 1 내지 7의 아미노산 잔기로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합하고, 여기서, 2개 이상의 아미노산 잔기들 중 2개 이상은 상이한 루프에 존재한다. 상이한 루프 내에 존재하는 2개 이상의 아미노산이 루프의 임의의 조합, 예를 들면, 루프 1 및 2, 루프 1 및 3, 루프 1 및 4, 루프 1 및 5, 루프 1 및 6, 루프 1 및 7, 루프 2 및 3, 루프 2 및 4, 루프 2 및 5, 루프 2 및 6, 루프 2 및 7, 루프 3 및 4, 루프 3 및 5, 루프 3 및 6, 루프 3 및 7, 루프 4 및 5, 루프 4 및 6, 루프 4 및 7, 루프 5 및 6, 루프 5 및 7, 또는 루프 6 및 7 유래일 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

예를 들면, 한 실시형태에서, 항체는 루프 1이 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기 및 루프 2의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 1의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기 및 루프 3의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 1의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기 및 루프 4의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 2의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기 및 루프 3의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 2의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기 및 루프 4의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 루프 3의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기 및 루프 4의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프에 결합한다. p40 서브유닛의 입체형태적 에피토프가, 상이한 루프 내에 존재하는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 여기서, 상이한 루프는 루프 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 임의의 조합일 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

2. J695에 대한 접촉

J695 상보성 결정 영역(CDR)은 모두 IL-12 p40에 접촉한다. 특히, IL-12의 결합은 전체 J695 결합 부위의 6개의 영역을 통해 처음으로 발생하고, 이는 하기 및 도 8에 기재되는 바와 같이 "부위"로서 확인된다.

부위 1은 3개의 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp, 또는 His)을 포함하고, 이들 중 2개는 CDR H1 내에 위치하고(Phe-H27 및 Tyr-H32), 이들 중 하나는 CDR H3 내에 위치하여(His-H98), 이들 3개의 잔기의 Cβ 원자가 약 8Å(2개의 H1 잔기 사이에), 11Å 및 11Å(각각 H1 잔기 및 H3 잔기 사이에)의 치수를 갖는 삼각형을 형성하도록 한다. 부위 1의 아미노산 잔기는 IL-12 p40 잔기 Tyr16 및 Pro17이 삽입된 포켓을 형성하고, 여기서 이들은 J695와 다수의 반 데르 발스 상호작용을 한다. 하나 이상의 방향족 잔기가, J695의 결합 특성을 보유하거나 심지어 향상시키면서, Phe-H27, Tyr-H32, 또는 His-H98(예를 들면, 각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 27, 32, 및 102에 상응함)에 대해 치환될 수 있다는 것은 본원에서 측정된 J695/IL-12 p70 결정 구조로부터 명백하다.

부위 2는 Lys, Arg, Tyr, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 3개의 잔기와 CDR L1(Lys-L34), L3(Tyr-L91) 및 H3(H3을 진행하는 3개의 골격 잔기를 포함; Lys-H93)에서 각각 하나의 잔기를 포함하여, 이들 3개의 잔기의 Cβ 원자가 약 10Å(L1과 L3 잔기 사이에), 12Å(L1 및 H3 잔기 사이에) 및 15Å(L3 및 H3 잔기 사이에)의 치수를 갖는 삼각형을 형성하도록 한다. J695 부위 2의 아미노산 잔기는 IL-12 p40 잔기 Asp87이 삽입된 포켓을 형성하고; 3개의 J695 아미노산은 특정 상보성 전하 및 Asp87 측쇄 카르복실레이트와의 수소 결합 상호작용을 형성한다(도 9). Lys, Arg, Tyr, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기가, J695의 결합 특성을 보유하거나 심지어 향상시키면서, Lys-L34(예를 들면, 서열번호 2의 아미노산 잔기 35에 상응함), Tyr-L91(예를 들면, 서열번호 2의 아미노산 잔기 92) 또는 Lys-H93(예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 잔기 97)에 대해 치환될 수 있다는 것은 본원에서 측정된 J695/IL-12 p70 결정 구조로부터 명백하다.

부위 3은 둘 다 CDR L3 내에 위치한 2개의 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp, 또는 His)(Tyr-L91 및 His-L95A)을 포함하여 이들 2개의 잔기의 Cβ 원자가 약 5Å로 분리되도록 한다. 부위 3의 아미노산 잔기는 IL-12 p40 잔기 Ile89가 삽입된 포켓을 형성하고, 여기서 이는 J695와의 다수의 반 데르 발스 상호작용을 하게 한다. 하나 이상의 방향족 잔기가, J695의 결합 특성을 보유하거나 심지어 향상시키면서, Tyr-L91 또는 His-L95A(예를 들면, 각각 서열번호 2의 아미노산 잔기 92 및 97에 상응함)에 대해 치환될 수 있다는 것은 본원에서 측정된 J695/IL-12 p70 결정 구조로부터 명백하다.

부위 4는 CDR L2(Tyr-L50) 및 H3(ser-H97) 내의 각각의 하나의 잔기와 Tyr, Ser, Thr, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개의 잔기를 포함하여 이들 2개의 잔기의 Cβ 원자가 약 7Å로 분리되도록 한다. J695 부위 4의 아미노산 잔기는 IL-12 p40 잔기 Asp14가 삽입된 포켓을 형성하고; 2개의 J695 아미노산은 특정 상보성 전하 및 Asp14 측쇄 카르복실레이트와의 수소 결합 상호작용을 형성한다. Tyr, Ser, Thr, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기가, J695의 결합 특성을 보유하거나 심지어 향상시키면서, Tyr-L50(예를 들면, 서열번호 2의 아미노산 잔기 51에 상응함) 또는 Ser-H97(예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 잔기 101)에 대해 치환될 수 있다는 것은 본원에서 측정된 J695/IL-12 p70 결정 구조로부터 명백하다.

부위 5는 J695의 CDR L3 전체(서열번호 2의 아미노산 잔기 90 내지 101에 상응함)를 포함하고, 이는 하기 특성을 갖는다: (i) CDR L3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다(이는 J695에서 12개의 아미노산 길이이다); (ii) CDR L3 위치 90에서의 아미노산 잔기는 Gln이 아니다(이는 J695의 Ser이다); (iii) CDR L3 위치 94에서의 아미노산 잔기는 방향족이다(이는 J695의 Tyr이다); (iv) CDR L3 위치 95A에서의 아미노산 잔기는 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다(이는 J695의 His이다); CDR L3 위치 95B에서의 아미노산 잔기는 Pro이다.

부위 5의 아미노산 잔기는, J695 결합 부위의 중심으로부터 연장하여 IL-12 p40 잔기 Lys102, Asn103, 및 Lys104에 접촉하는 β-헤어핀 루프를 형성한다. 상기 각각의 특성은 CDR L3의 생산적인 결합 입체형태적 또는 IL-12와의 결합 특이적 상호작용에 기여한다. J695의 결합 특성을 보유하거나 심지어 향상시키면서, 하기 변화, 즉 (i) 12개 아미노산 잔기보다 긴 CDR L3 길이, (ii) Tyr-L94에 대한 상이한 방향족 잔기의 치환, 또는 (iii) His-L95A에 대한 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 잔기의 치환들 중 하나 이상이 이루어질 수 있는 CDR L3 변이체는 여기서 측정되는 J695/IL-12 p70 결정 구조로부터 명백하다.

부위 6은 CDR H2(Arg-H52 및 Tyr-H52A) 내의 잔기 둘 다와 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개의 잔기를 포함하여 이들 2개의 잔기의 Cβ 원자가 약 6Å로 분리되도록 한다. J695 부위 6의 아미노산 잔기는 이에 대해 IL-12 p40 잔기 Asp93이 위치된 벽(wall)을 형성하고; 2개의 J695 아미노산은 특정 상보성 전하 및 Asp93 측쇄 카르복실레이트와의 수소 결합 상호작용을 형성한다. Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기가, J695의 결합 특성을 보유하거나 심지어 향상시키면서, Arg-H52 또는 Tyr-H52A(예를 들면, 각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 52 또는 53에 상응함)에 대해 치환될 수 있다는 것은 본원에서 측정된 J695/IL-12 p70 결정 구조로부터 명백하다.

또한, 상기 기재된 6개의 부위 모두가 IL-12 p40 또는 다른 p40-함유 사이토카인에 결합할 필요는 없다는 것이 본원에서 측정된 J695/IL-12 p70 결정 구조로부터 명백하다. 특히, 상기 기재된 부위 1, 부위 2, 부위 3, 부위 4, 부위 5, 및 부위 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 결합 부위를 갖는, 상기 기재된 바와 같이 부위의 변이를 갖는 항체는, J695에 비교하여 보유되거나 심지어 향상된 결합 특성을 나타낼 수 있다. 유사하게, 상기 기재된 부위 1 내지 6의 그룹으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 또는 5개의 결합 부위를 갖는, 상기 기재된 바와 같은 부위의 변위를 갖는 항체는, J695에 비교하여 보유되거나 또는 심지어 향상된 결합 특성을 나타낼 수 있다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102, 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 이외의 가변 영역 잔기들 중 어느 하나는 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

다른 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102, 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 중 하나 이상은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 이러한 양상의 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32 및 102 중 하나 이상은 방향족 잔기로 독립적으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 및 92 중 하나 이상은 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 92 및 97 중 하나 이상은 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 101 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 51 중 하나 이상은 Tyr, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91은 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95는 상이한 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97은 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상은 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되고, 여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다.

추가의 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다: (a) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상이 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다); (b) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나; (c) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환되거나; (d) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53 중 하나 이상이 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

관련 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체의 활성을 변경시키는 방법으로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체의 활성을 변경시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양상의 한 실시형태에서, 상기 방법은 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 중 하나 이상을 상이한 아미노산 잔기로 치환하여 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체의 활성을 변경시키는 것을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32 및 102 중 하나 이상은 방향족 잔기로 독립적으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 성려번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 및 92 중 하나 이상은 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 92 및 97 중 하나 이상은 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 101 및 서열번호 2의 가변영역 아미노산 잔기 51 중 하나 이상은 Tyr, Ser, Thr, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91은 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95는 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97은 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상은 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되고, 여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체의 활성을 변경시키는 방법으로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 항체는 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체의 활성을 변경시키는 방법을 제공한다: (a) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상이 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다); (b) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나; (c) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환되거나; (d) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53 중 하나 이상이 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환된다.

B. J695 Fab / IL -12 p70 복합체 구조에 기반한 J695 에 대한 추가의 유용한 변경

J695는 상기에 상세하게 기재된 IL-12와 다수의 특이적 상호작용을 하지만, J695 결합 부위에 대한 추가의 변화는 J695에 비교하여 보유되거나 심지어 향상된 결합 특성을 나타낼 수 있는 변이 항체를 제공할 수 있다. 결합 부위에서 J695와 IL-12 p40 사이에 큰 갭이 존재한다. p40의 결합은 결합 부위의 깊은 클레프트를 단지 부분적으로 채워, 특히 J695 CDR H2 및 L3과 p40 루프 3 및 4 사이에 채워지지 않은 갭을 남긴다(도 9, 화살표). 따라서, 이러한 갭, 또는 기타 결함을 해결하기 위한 변이체가 이로울 것이다. 이들 항체 변이체는 하기 4개의 메커니즘에 의해 향상된 특성을 나타낼 것으로 예측될 수 있다: (i) IL-12 p40과의 추가의 특이적 상호작용을 하는 메커니즘; (ii) J695와 IL-12 p40 사이에 존재하는 갭을 채우기 위한 메커니즘; (iii) 일단 변이체 항체 결합 부위에 결합되면 IL-12 p40의 움직임을 제한하기 위한 메커니즘; 또는 (iv) 변이체 항체를 생산적 결합 입체형태로 사전-조직화하기 위한 메커니즘. 또한, 이들 4개의 메커니즘의 몇몇 조합은 보다 치료학적으로 유효한 항체를 초래할 수 있다. 특히, J695 아미노산 서열 단독 또는 조합에 대한 5개의 그룹의 변이가 하기에 기술되는 바와 같이 수행될 수 있다.

첫째, 상기 기재된 바와 같은 부위 1, 부위 2, 부위 3, 부위 4, 부위 5, 및 부위 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 부위 중 2개 이상을 갖는 항체, 및 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asn, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CDR H1 위치 33에 아미노산 잔기(서열번호 1의 아미노산 잔기 33에 상응함)를 추가로 갖는 항체는, J695에 비교하여 보유되거나 심지어 향상된 결합 특성을 나타낼 수 있다. 특히, 이러한 위치에서의 돌연변이 Gly-H33-Lys은 J695와 IL-12 p40 아미노산 잔기 Glu88 사이의 갭을 채울 것으로 예측될 수 있고, LysH33 및 Glu88은 추가의 염-브릿지 상호작용을 제조할 것으로 예측될 수 있다.

둘째, 상기 기재된 바와 같은 부위 1, 부위 2, 부위 3, 부위 4, 부위 5, 및 부위 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 부위 중 2개 이상을 갖는 항체, 및 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CDR H2 위치 50에 아미노산 잔기(서열번호 1의 아미노산 잔기 50에 상응함)를 추가로 갖는 항체는, J695에 비교하여 보유되거나 심지어 향상된 결합 특성을 나타낼 수 있다. 특히, 이러한 위치에서의 돌연변이 Phe-H50-Tyr 및 Phe-H50-Trp은 J695와 IL-12 p40 아미노산 잔기 Thr92 및 Lys104 사이의 갭을 채울 것으로 예측될 수 있다.

셋째, 상기 기재된 바와 같은 부위 1, 부위 2, 부위 3, 부위 4, 부위 5, 및 부위 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 부위 중 2개 이상을 갖는 항체, 및 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CDR H2 위치 56에 아미노산 잔기(서열번호 1의 아미노산 잔기 57에 상응함)를 추가로 갖는 항체는, J695에 비교하여 보유되거나 심지어 향상된 결합 특성을 나타낼 수 있다. 특히, 이러한 위치에서의 돌연변이 Asn-H56-Ile 및 Asn-H56-Trp은 J695와 IL-12 p40 아미노산 잔기 Asp97 및 Lys104 사이의 갭을 채우고, 일단 항체에 결합되면 IL-12 p40의 움직임을 제한하는 것으로 예측될 수 있다. 또한, 이러한 위치에서의 돌연변이 Asn-H56-Ser 및 Asn-H56-Thr은 Ser Oγ(Thr의 Oγ1)과 Arg Nε 사이의 수소 결합 형성에 의해 ArgH52를 생산적 결합 입체형태로 추가로 사전-조직화하는 것으로 예측될 것이다.

넷째, 상기 기재된 바와 같은 부위 1, 부위 2, 부위 3, 부위 4, 부위 5, 및 부위 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 부위 중 2개 이상을 갖는 항체, 및 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CDR H3 위치 95에 아미노산 잔기(서열번호 1의 아미노산 잔기 99에 상응함)를 추가로 갖는 항체는, J695에 비교하여 보유되거나 심지어 향상된 결합 특성을 나타낼 수 있다. 특히, 이러한 위치에서의 돌연변이 His-H95-Tyr 및 His-H95-Trp은 J695와 IL-12 p40 아미노산 잔기 Glu86 사이의 갭을 채우고, 일단 항체에 결합되면 IL-12 p40의 움직임을 제한하는 것으로 예측될 수 있다. 또한, 이러한 위치에서의 돌연변이 His-H95-Tyr은 추가로 Tyr Oη과 Glu86의 카르보닐 산소 원자 사이의 수소 결합을 형성하는 것으로 예측될 것이다.

다섯째, 상기 기재된 바와 같은 부위 1, 부위 2, 부위 3, 부위 4, 부위 5, 및 부위 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 부위 중 2개 이상을 갖는 항체, 및 Phe, Tyr, Trp, His, Gln 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CDR L1 위치 32에 아미노산 잔기(서열번호 2의 아미노산 잔기 33에 상응함)를 추가로 갖는 항체는, J695에 비교하여 보유되거나 심지어 향상된 결합 특성을 나타낼 수 있다. 특히, 이러한 위치에서의 돌연변이 Thr-L32-Tyr 및 Thr-L32-Trp은 J695와 IL-12 p40 아미노산 잔기 Gly88 사이의 갭을 채울 것으로 예측될 수 있다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은 또한 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99, 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33 중 하나 이상은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asn, Gln, Arg 및 Lys로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Lys으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다.

다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Phe, Try, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ile 또는 Trp으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ser 또는 Thr으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Tyr 또는 Trp으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Gln 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다.

다른 양상에서, 본 발명은 경쟁적 결합, 즉 본원에 기재된 항체 중 어느 하나의 경쟁적 억제를 경험할 수 있는 항체를 제공한다. 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 종 중 어느 하나와 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하기 위해 경쟁하는 항체를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체의 활성을 변경시키기 위한 방법으로서, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99, 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33 중 하나 이상을 상이한 아미노산 잔기로 치환하여 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체의 활성을 변경시키는 것을 포함하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체의 활성을 변경시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asn, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Lys으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ile 또는 Trp으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57은 Ser 또는 Thr으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99는 Tyr 또는 Trp으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역아미노산 잔기 33은 Phe, Tyr, Trp, His, Gln 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 Tyr 또는 Trp으로 치환된다.

추가의 양상에서, 본 발명은, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 항체를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 항체를 제공하고 포함한다. 예를 들면, 본원에 기재된 항체 실시형태 중 어느 하나에서, 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에, 10^-3M^-1 이하의 K_off 또는 10^-10M 이하의 K_d로 결합한다. 또한, 본 발명에 의해 포함되는 항체 실시형태 중 어느 하나에서, 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 생물학적 활성을 중화시킨다. 본 발명에 의해 포함되는 항체의 기능적 특성은 하기 섹션 V(C)에서 추가로 논의된다.

다른 추가의 양상에서, 본 발명의 항체는, 당해 분야에 존재하고 본원의 명세서에서 식별된 에피토프에 본래 결합하는 항체 중 하나가 아니다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 미국 특허 6,914,128호에 기재된 항체가 아니고, 예를 들면, 항체 Y61 또는 J695가 아니다(전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 6,914,129에 기재된 바와 같음).

C. 다른 항- IL -12 항체의 에피토프의 측정에 기반한 항체

다른 항-IL-12 항체의 에피토프는 래트/사람 IL-12 p40 키메라 단백질(또는 "키메라들") 접근법을 이용하여 측정하였다. 특정 위치에 도입된 소정 래트 IL-12 p40 아미노산 잔기(들)을 갖는 우세한 사람 IL-12 p40 분자가 발현 및 정제되었다. 항체(예를 들면, J695, C8.6.5 또는 C11.5.14, 하기에 추가로 기술됨)의 패널에 대한 이들 키메라 뿐만 아니라 IL-12 대조군 단백질(예를 들면, 사람 및 래트 IL-12 p40 및/또는 p70)의 결합은 표면 플라스몬 공명 결합 분석을 이용하여 측정하였다. 또한, 특정 위치에 도입된 소정 사람 IL-12 p40 아미노산 잔기(들)을 갖는 우세한 래트 IL-12 p40 키메라는 유사하게 발현, 정제, 및 분석되었다.

1. 사람/래트 및 래트/사람 IL-12 p40 키메라의 제조

IL-12 p40 키메라에서 돌연변이된 특정 아미노산 잔기는 IL-12 p40 내에 위치한 몇몇 상이한 부위에서 발견된다. 시험된 사람/래트 IL-12 p40 키메라는 표 1에 열거되고, 래트/사람 IL-12 p40 키메라는 표 2에 열거된다.

[표 1]

[표 2]

키메라를 제조하기 위한 발현 플라스미드의 클로닝 및 작제는 하기와 같이 수행하였다. 사람 IL-12 p40 서브유닛을 암호화하는 cDNA(InvivoGen, CA로부터 구입함, 카탈로그 번호 porf-hil12)는, 프라이머 5'- CAC CAT GGG TCA CCA GCA GTT GGT C -3'(서열번호 7) 및 5'- ACC CTG GAA GTA CAG GTT TTC ACT GCA GGG CAC AGA TGC CCA TTC GC -3'(서열번호 8)을 이용하여 증폭 폴리머라제 키트(Expand Polymerase Kit; Roche)에 의해 PCR 증폭되었다. 얻어진 1009bp 생성물을 게이트웨이 BP 반응(Gatway BP reaction; Invtirogen)을 이용하여 pENTR/D-TOPO에 클로닝하였다. 주형으로서의 플라스미드 pENTR/D-hIL-12p40 및 표 2.1에 열거된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 제조업자의 지침에 따라 퀵-체인지 XL 부위-지시된 돌연변이유발 키트를 이용하여 부위-지시된 돌연변이유발을 행하였다. 목적하는 돌연변이의 존재는 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 돌연변이유발에 따라, 야생형 hIL-12p40 및 돌연변이체를 게이트웨이 LR 반응(Gateway LR reaction)을 이용하여 포유동물 발현 벡터 pcDNA DEST40으로 서브클로닝시켜 pcDNA DEST40-hIL-12p40 및 이의 변이체를 제조하였다.

IL-12p40 키메라 단백질은 HEK293.F 세포에서의 일시적 형질감염에 의해 발현되었다. HEK293.F 세포는 프리스타일(Freestyle) 293 발현 배지(Invitrogen)의 250mL의 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크(Corning, NY)에서 8% CO₂ 및 37℃에서 배양되었다. 각각의 작제물에 대해, 30 x 10⁶ 세포를 30mL 규모로 100mL 에를렌마이어 플라스크에서 293fectin을 이용하여 30㎍의 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 세포를 습윤 8% CO2 대기의 37℃에서 진탕하면서 항온배양하였다. 72시간 후, 세포를 수거하고, 상청을 웨스턴 블롯에 의해 분비된 IL-12p40에 대해 분석하였다. hIL-12p40 함유 상청을 하기에 기술되는 후속적 결합 분석에 직접 사용하였다.

[표 2.1]

2. 사람/ 래트 및 래트 /사람 키메라는 IL -12 p40 에 대한 7개의 추가의 부위를 정의한다.

IL-12 p40 키메라에 의해 정의되고 기술된 7개의 추가의 "부위"는 도 11에서는 몇몇 IL-12 p40 아미노산 서열의 정렬과 관련하여, 그리고 도 6, 12 및 13에서는 IL-12 p70(및 결합된 J695)의 3차원 구조에 비교하여 나타낸다. 이들 부위는 하기에 보다 상세하게 기재되고, 하기 표 3에 요약된다.

부위 7은 사람 IL-12 p40 아미노산 잔기 Tyr16, Asp87, 및 Asp93을 포함한다. 이들 잔기는 IL-12 p40의 도메인 1 상의 2개의 상이한 표면 루프 상에 위치한다(Yoon, C., S. C. Johnston, et al. (2000). "Charged residues dominate a unique interlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12." The EMBO Journal 19(14):3530-3521). 단독으로 채택하면, 부위 7의 잔기는 J695/IL-12 p70 복합 결정 구조에 의해 나타나는 바와 같이 비연속적(또는 입체형태) 에피토프를 정의한다. 부위 7은 3개의 하위-부위, 즉 하위-부위 7a(Tyr16), 하위-부위 7b(Asp87), 및 하위-부위 7c(Asp93)으로 이루어진 것으로 간주될 수 있다.

부위 8은 사람 IL-12 p40 아미노산 잔기 Leu40, Asp41, Gln 42, Ser43, Ser44, Glu45, Val46, 및 Leu47을 포함한다. 이들 잔기는 IL-12 p40의 도메인 1 상의 표면 루프를 형성한다(Yoon, C., S. C. Johnston, et al. (2000). "Charged residues dominate a unique interlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12." The EMBO Journal 19(14):3530-3521). 단독으로 채택하면, 부위 8의 잔기는 연속적(또는 선형) 에피토프를 정의한다.

부위 9는 사람 IL-12 p40 아미노산 잔기 Gly35를 포함한다. 이러한 잔기는 IL-12 p40의 도메인 1 상의 표면 루프 상에 위치한다(Yoon, C., S. C. Johnston, et al. (2000). "Charged residues dominate a unique interlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12." The EMBO Journal 19(14):3530-3521). 단독으로 채택하면, 부위 9의 잔기는 연속적(또는 선형) 에피토프를 정의한다.

부위 10은 사람 IL-12 p40 아미노산 잔기 Gly61을 포함한다. 이러한 잔기는 부위 8 루프의 한 쪽(부위 9의 반대쪽; 상기 참조)에 위치된, IL-12 p40의 도메인 1 상의 표면 루프 상에 위치한다(Yoon, C., S. C. Johnston, et al. (2000). "Charged residues dominate a unique interlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12." The EMBO Journal 19(14):3530-3521). 단독으로 채택하면, 부위 10의 잔기는 연속적(또는 선형) 에피토프를 정의한다.

부위 11은 사람 IL-12 p40 아미노산 잔기 Asp97, Gln98, Lys99, Glu100 및 Pro101을 포함한다. 이들 잔기는 IL-12 p40의 도메인 1 상의 표면 루프를 형성한다(Yoon, C., S. C. Johnston, et al. (2000). "Charged residues dominate a unique interlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12." The EMBO Journal 19(14):3530-3521). 단독으로 채택하면, 부위 11의 잔기는 연속적(또는 선형) 에피토프를 정의한다.

부위 12는 사람 IL-12 p40 아미노산 잔기 Arg157, Val158, Arg159, Gly160, Asp161, Gly160, Asp161, Asn162, Lys 163, 및 Glu164를 포함한다. 이들 잔기는 IL-12 p40의 도메인 2 상의 (비정렬된) 표면 루프를 형성하고(Yoon, C., S. C. Johnston, et al. (2000). "Charged residues dominate a unique interlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12." The EMBO Journal 19(14):3530-3521); 이러한 루프는 본원에 기재된 J695 Fab/IL-12 p70 복합 구조에서 정렬된다. 단독으로 채택하면, 부위 12의 잔기는 연속적(또는 선형) 에피토프를 정의한다.

[표 3]

각종 항체에 의한 래트/사람 IL-12 p40 키메라의 결합은 표면 플라스몬 공명에 의해 분석하였다. 구체적으로, 항체는, 100mM N-하이드록시숙신이미드(NHS) 및 400mM N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 이용하여 매트릭스 상의 카르복실 그룹을 처음으로 활성화시킴으로써, 유리 아민 그룹을 통해 바이아코어(Biacore) 칩 덱스트란 매트릭스에 공유 결합되었다. 이것은 4개의 상이한 유동 세포에 걸쳐서 완료되었다. 나트륨 아세테이트에 희석된 대략 50㎕의 각각의 항체(25㎍/mL)(pH 4.5)를 활성화된 바이오센서에 주사하였고, 단백질 상의 유리 아민은 활성화된 카르복실 그룹에 직접 결합되었다. 전형적으로, 5000 공명 단위가 고정되었다. 미반응 매트릭스 EDC-에스테르를 1M 에탄올아민의 주사에 의해 불활성화시켰다.

IL-12p40 상청 샘플에 대한 몇몇 상이한 모노클로날 항체의 에피토프 패턴을 확인하기 위해서, 직접 결합 분석을 행하였다. 재조합 사람 IL-12p40의 분획(100nM)을 바이아코어 덱스트란 칩 바이오센서 표면 상에 공유적으로 고정된 항체에 25mL/분의 유속으로 주사하였다. 항원의 주사 전에 및 직후에, HBS-EP 완충액을 단독으로 각 유동 세포를 통해 유동시켰다. 기준선과 리간드 주사의 종료 후 대략 30초에 상응하는 지점 사이의 신호의 실제 차이는 최종 결합가(대략 500 내지 2500 RU)를 나타내는 것으로 채택하였다. 반응은 공명 단위(RU)로 측정하였다. 쌍을 이루는 결합 센서그램은, 표적 분자에 대한 제1 프로브의 결합이 신속하고 강한 경우에만 양성으로 표명되었다. 공유적으로 고정화된 항체-커플링된 표면은 10mM HCl(접촉 시간 5분)을 이용하여 완전하게 재생성되었고, 이들의 완전 결합 능력이 20사이클에 걸쳐 유지되었다.

사람/래트 및 래트/사람 IL-12 p40 키메라에 대한 표면 플라스몬 공명에 의해 수득된 결합 데이터의 요약은 표 3.1에 하기 요약된다.

[표 3.1]

3. 사람/ 래트 IL -12 p40 키메라의 결합 분석에 의해 측정시 7개의 추가의 IL-12 p40 에피토프의 도시 및 정의

키메라 및 상기 기재된 표면 플라스몬 공명 방법을 이용하여, 결정학적으로-측정된 J695 에피토프(예를 들면, 상기 섹션 II 내지 V에 기재됨) 이외에 IL-12 p40의 7개의 추가의 에피토프를 도시하고 정의하였다. 키메라 및 표면 플라스몬 공명 방법을 이용하여 식별된 에피토프 1은 결정학적으로-측정된 J695 에피토프의 범위 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 이로써 결정학적으로-측정된 J695 에피토프를 확인한다. 항체/키메라 결합 데이터는 표 3.1에 상기 요약되어 있다. 이들 에피토프는, IL-12 p40의 표면 상에 상기 기재된 하나 이상의 항원성 "부위"를 포함한다. 이들 부위는 도 11에서는 몇몇 IL-12 p40 아미노산 서열의 정렬과 관련하여, 그리고 도 6, 12 및 13에서는 IL-12 p70(및 결합된 J695)의 3차원 구조에 비교하여 나타낸다. 추가의 6개의 에피토프, 즉 에피토프 2, 3.1, 또는 3.2, 4a, 4b, 4c, 및 5는 도 14에 도식적으로 나타낸다. 모든 8개의 에피토프, 즉 에피토프 1 내지 5(즉, 에피토프 1, 2, 3.1 또는 3.2, 4a, 4b, 4c 및 5)는 표 4에 요약되어 있고, 하기에 상세하게 기재된다.

[표 4]

에피토프 1. 에피토프 1에서 IL-12 p40에 결합하는 항체로는: J695(PCT 공보 제WO 0056772 A1에 기재된 바와 같음)가 포함된다. 부위 7a(Tyr16) 및 7b(Asp87)에서의 돌연변이는 결합을 제거하고; 부위 7c(Asp93)에서의 돌연변이는 경미한 효과를 갖는다. 이러한 생화학적으로-정의된 에피토프는 결정학적으로 관찰된 것과 일치한다.

에피토프 2. 에피토프 2에서 IL-12 p40에 결합하는 항체로는: 사람화된 모노클로날 항체 8E1.1이 포함된다. 항체 8E11.1의 설명은 적어도 미국 특허 7,700,739에서 찾을 수 있고, 이의 전문, 및 특히 항체 8E11.1의 설명은 본원에 참조로 인용된다. 부위 7a(Tyr16), 7b(Asp87) 및 11(Asp97, Gln98, Lys99, Glu100, 및 Pro101)에서의 돌연변이는 결합에 대해 강한 효과를 갖고; 부위 7c(Asp93)에서의 돌연변이는 경미한 효과를 갖는다. 에피토프 2는 에피토프 1에 명백하게 관련되어 있지만, 8E1.1의 결합에 따른 부위 11에서의 돌연변이의 효과는 강하지만 J695의 결합에 따른 효과는 약해 이들 2개의 에피토프를 구별한다.

에피토프 3. 에피토프 3에서 IL-12 p40에 결합하는 항체로는: 사람화된 모노클로날 항체 1A6.1이 포함된다. 항체 1A6.1의 설명은 적어도 미국 특허 7,700,739에서 찾을 수 있고, 이의 전문, 및 특히 항체 1A6.1의 설명은 본원에 참조로 인용된다. 부위 9(Gly35) 및 10(Gly61)(함께)에서의 돌연변이는 결합시 강한 효과를 갖는다. 이들 2개의 잔기는 단지 함께 돌연변이된다. 단독으로, 에피토프 3이 1개의 글리신 또는 기타 또는 둘 다에 의해 정의되는지의 여부를 측정하는 것은 불가능할 수 있다. 그러나, IL-12 p40의 3차원 구조에 대한 지식과 조합하여, 부위 8(Leu40, Asp41, Gln42, Ser43, Ser44, Glu45, Val46, 및 Leu47)에서의 돌연변이의 효과의 완전한 결여는, 에피토프 3이 부위 9 및 주어진 최소 크기의 항체 결합 부위(Davies, D. R., E. A. Padlan, et al. 1990 "Antibody-antigen complexes." Annu Rev Biochem 59: 439-73; Davies, D. R. and G. H. Cohen 1996 "Interactions of protein antigens with antibodies." Proc Natl Acad Sci U S A 93(1): 7-12), 부위 8과 거리가 먼 부위 9 주위의 다른 잔기(Gly35), 즉 에피토프 3.1, 또는 부위 10(Gly61) 및 부위 9과 거리가 먼 부위 10 주위의 다른 잔기, 즉 에피토프 3.2 중 어느 하나에 결합하지만 둘 다에 결합하지는 않음으로써 정의된다는 것을 나타낸다.

에피토프 4. 에피토프 4에서 IL-12 p40에 결합하는 항체로는 뮤린 항체 C8.6.2(D'Andrea, A., M. Rengaraju, et al. (1992). "Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells." J. Exp. Med. 176: 1387-1398), 및 3개의 사람화된 모노클로날 항체, 즉 3G7.2, 1D4.1, 및 1D4.7이 포함된다. 항체 3G7.2, 1D4.1 및 1D4.7의 설명은 적어도 미국 특허 7,700,739에서 찾을 수 있고, 이의 전문, 및 특히 항체 3G7.2, 1D4.1, 및 1D4.7의 설명은 본원에 참조로 인용된다. 부위 8(Leu40, Asp41, Gln42, Ser43, Ser44, Glu45, Val46, 및 Leu47)에서의 돌연변이는 결합에 강한 영향을 미치고, 부위 9(Gly35) 또는 부위 10(Gly61) 중 어느 하나에서의 돌연변이는 약하거나 강한 효과를 가졌다. 재차, IL-12 p40의 3차원 구조에 대한 지식을 도출하여, 부위 8이 부위 9 및 10에 의해 플랭킹되므로, 이들 항체 중 어느 하나의 결합은 부위 8 및 9, 부위 8 및 10, 또는 부위 8, 9, 및 10에 대한 것일 수 있었다. 따라서, 에피토프 4는 실제로 관련된, 부분적으로 중첩된 에피토프, 즉: 에피토프 4a(부위 8 및 9); 에피토프 4b(부위 8 및 10); 및 에피토프 4c(부위 8, 9, 및 10) 계열을 정의한다. 항체 C8.6.2, 3G7.2, 1D4.1 및 1D4.7은 각각 에피토프 4a, 4b, 및 4c의 목록으로부터 선택되는 임의의 에피토프에 결합할 수 있고; 이들은 동일한 에피토프에 결합하는 것에 제한되지 않는다.

에피토프 5. 에피토프 5에서 IL-12 p40에 결합하는 항체로는 표준 뮤린 항체 C11.5.14(D'Andrea, A., M. Rengaraju, et al. (1992). "Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells." J. Exp. Med. 176: 1387-1398)가 포함된다. 부위 12(Arg157, Val158, Arg159, Gly160, Asp161, Asn162, Lys163, 및 Glu164)에서의 돌연변이는 C11.5.14의 결합을 제거하였고, 부위 11(Asp97, Gln98, Lys99, Glu100 및 Pro101)에서의 돌연변이는 약한 효과를 가졌다. 에피토프 5를 정의하는 이들 키메라-유도된 결합 결과는 티오레독신/플라겔린 융합 단백질에 대한 "FLITRX" 펩타이드 표시에 의해 측정된 사전-측정 C11.5.14와 일치한다(Lu, Z., K. S. Murray, et al. (1995). "Expression of thioredoxin random peptide libraries on the Escherichia coli cell surface as functional fusions to flagellin: a system designed for exploring protein-protein interactions." Biotechnology (N Y) 13(4): 366-72).

따라서, 추가의 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 입체형태적 에피토프에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시형태에서, 입체형태적 에피토프는 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 16, 87 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이사의 아미노산 잔기를 포함한다(예를 들면, 에피토프 1, 부위 7a 내지 7c 포함). 다른 실시형태에서, 항체는 아미노산 잔기 16(즉, 부위 7a)에 결합한다. 소정 실시형태에서, 에피토프, 예를 들면, 입체형태적 에피토프에 결합하는 본 발명의 항체에 대해 참조가 이루어지는 경우, 항체는 에피토프를 구성하는 이들 특정 잔기에만 결합하고, 항원의 선형 아미노산 서열 내의 다른 잔기, 예를 들면, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에는 결합하지 않는 것이 의도된다는 것을 이해해야 한다.

다른 양상에서, 본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 16, 87 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 1, 부위 7a 내지 7c 포함) 및 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 2009/0202549에 기재된 임의의 에피토프에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

추가의 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 97, 98, 99, 100 및 101로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 2, 부위 7a, 7b 및 11 포함)에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 16, 87, 93, 97, 98, 99, 100 및 101로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 2, 부위 7a, 7b 및 11 및 7c 포함)에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

추가의 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 35 및 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 3, 부위 9 및 10 포함)에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시형태에서, 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하고, 여기서, 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 35 또는 아미노산 잔기 36을 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 3, 부위 9 또는 10 포함)에 결합한다. 관련된 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 93을 포함하고 서열번호 3의 아미노산 잔기 35 또는 아미노산 잔기 36을 추가로 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 3, 부위 9 또는 10, 및 7c 포함)에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

추가의 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 40 내지 47 및 35로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 4a, 부위 8 및 9 포함)에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 관련된 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 40 내지 47 및 61로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 4b, 부위 8 및 10 포함)에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 관련된 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 40 내지 47, 35 및 62로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 4c, 부위 8, 9 및 10 포함)에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

추가의 양상에서, 본 발명은, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 157 내지 164로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 5, 부위 12 포함)에 결합하는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체를 제공한다.

한 실시형태에서, 항체는: (a) 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 16, 87 및 97 내지 101로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 2, 부위 7a, 7b 및 11 포함); (b) 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 35 및 61로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 3, 부위 9 또는 10 포함); (c) 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 40 내지 47, 35 및 61로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(예를 들면, 에피토프 4a 내지 4c, 부위 8, 9 및/또는 10 포함); 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 157 내지 164로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 연속적 에피토프(예를 들면, 에피토프 5, 부위 12 포함) 중 하나 이상에 결합하지 않는다.

4. J695 Fab / IL -12 p70 결정 구조에 대한 지식과 조합된, 사람/ 래트 IL -12 p40 키메라의 결합 분석에 의해 측정된 바와 같은 추가의 IL -12 p40 결합 부위의 설명

추가의 결합 부위는, J695 Fab/IL-12 p70 결정 구조에 의해 제공되는 바와 같은 이들 부위의 3차원 배치에 대한 지식과 조합하여, 상기 기술된 사람/래트 IL-12 p40 키메라를 이용하여 수득된 표면 플라스몬 공명 결합 데이터로부터 측정될 수 있다. 이들 추가의 항체 결합 부위는 도 15에 나타낸다.

예를 들면, 에피토프 3.1 및 3.2와 관련하여 상기에 논의된 바와 같이, 사람화된 모노클로날 항체 1A6.1은 부위 9(Gly35) 또는 부위 10(Gly61) 중 어느 하나에 결합하지만, 둘 다 동시에 결합하지 않고, 이는 항체 결합 부위의 크기 및 형태가 주어진 결합시 동시 결합은 부위 8(Leu40, Asp41, Gln42, Ser43, Ser44, Glu45, Val46, 및 Leu47)에서의 돌연변이의 효과의 완전한 결여와 불일치할 수 있기 때문이다(Davies, D. R., E. A. Padlan, et al. (1990). "Antibody-antigen complexes." Annu Rev Biochem 59: 439-73; Davies, D. R. and G. H. Cohen (1996). "Interactions of protein antigens with antibodies. " Proc Natl Acad Sci U S A 93(1): 7-12).

따라서, 항체 1A6.1은 부위 9 및 추가로 부위 8과 거리가 먼 부위 9 주위의 다른 잔기(Gly35), 즉 에피토프 3.1에 결합하거나; 또는 항체 1A6.1은 부위 10 및 추가로 부위 8과 거리가 먼 부위 10 주위의 다른 잔기(Gly61), 즉 에피토프 3.2에 결합한다. 대부분 IL-12 p40의 표면-노출된 루프 상에 위치하는, 이들 "다른 잔기"는 하기에 정의된다:

부위 9 근처에 위치하지만 부위 8과 거리가 먼 부위 13은 IL-12 p40 아미노산 잔기 Pro 31, Glu32, Glu33, Asp34, Ile36, Thr37, Trp38, 및 Thr39를 포함한다.

부위 9 근처에 위치하지만 부위 8과 거리가 먼 부위 14는 IL-12 p40 아미노산 잔기 Gly48, Ser49, Gly50, Lys51, Thr52, Leu53, 및 Thr54를 포함한다.

부위 9 근처에 위치하지만 부위 8과 거리가 먼 부위 15는 IL-12 p40 아미노산 잔기 Gly64, Gln65, Thr67, Lys68, His69, Lys70, Gly71, Gly72, Glu73, Val74, Leu75, Ser76, 및 His77을 포함한다.

부위 10 근처에 위치하지만 부위 8과 거리가 먼 부위 16은 IL-12 p40 아미노산 잔기 Ile55, Gln56, Val57, Ly58, Glu59, Phe60, Asp62, Ala63, 및 Tyr66을 포함한다.

부위 10 근처에 위치하지만 부위 8과 거리가 먼 부위 17은 IL-12 p40 아미노산 잔기 Thr124, Thr125, Ile126, Ser127, Thr128, Asp129, Leu130, 및 Thr131을 포함한다.

부위 10 근처에 위치하지만 부위 8과 거리가 먼 부위 18은 IL-12 p40 아미노산 잔기 His194, Lys195, Leu196, 및 Lys197을 포함한다.

따라서, 본 발명은 또한 부위 9에 결합하지만 부위 8에 결합하지 않는 항체의 부류를 제공하고, 이는 추가로 부위 13, 부위 14, 및 부위 15로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부위에 결합한다. 또한, 본 발명은 부위 10에 결합하지만 부위 8에 결합하지 않는 항체의 부류를 제공하고, 이는 추가로 부위 16, 부위 17, 및 부위 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부위에 결합한다. 또한, 이들 부위 9, 10 및 13 내지 17의 3차원 배치로 인하여, 본 발명은 또한 부위 9에 결합하지만 부위 8에 결합하지 않고, 추가로 부위 13, 부위 14, 부위 15, 부위 16, 부위 17, 및 부위 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부위에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 부위 10에 결합하지만 부위 8에 결합하지 않고, 추가로 부위 13, 부위 14, 부위 15, 부위 16, 부위 17, 및 부위 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부위에 결합하는 항체를 추가로 제공한다.

D. 조작 및 변형된 항체

본 발명의 방법에 따라 제조된 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열은 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있고, 이 변형된 항체는 출발 물질로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 본래 가변 영역 중 하나 또는 둘 다(즉, V_H 및/또는 V_L), 예를 들면, 하나 이상의 CDR 영역 내의 및/또는 하나 이상의 골격 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안으로, 항체는 예를 들면, 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해서 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.

수행될 수 있는 한 유형의 가변 영역 조작은 CDR 절편이식이다. 항체는, 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 대부분 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 각각의 항체들 사이에서 CDR 외부의 서열보다 더욱 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용에 관여하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체 유래의 골격 서열 상에 절편이식된 특정 천연 발생 항체 유래의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제함으로써 특정 천연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다(예를 들면, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321 :522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 10029-10033; 윈터(Winter)에 의한 미국 특허 제5,225,539호, 및 퀸(Queen) 등에 의한 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).

항체에 대한 골격 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공의 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 사람 배선 서열 데이터베이스(인터넷 mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능함) 및 문헌(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836, 이들 문헌의 내용은 각각 본원에서 참조로 명확하게 인용됨)에서 찾을 수 있다. 다른 예로서, 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 Genbank 데이터베이스에서 찾을 수 있다.

한 실시형태에서, IL-12/IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 본 발명의 항체는 V_H3 계열의 배선 서열의 구성원으로부터 유도된 중쇄 가변 영역, 및 Vλ1 계열의 배선 서열의 구성원으로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또한, 당업자는 V_H3 계열의 중쇄 서열의 임의의 구성원이 Vλ1 계열의 경쇄 서열의 임의의 구성원과 조합될 수 있음을 이해할 것이다.

항체 단백질 서열은, 당업자에게 잘 알려져 있는 Gapped BLAST(Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402)라고 칭하는 서열 유사성 탐색 방법 중 하나를 이용하여 컴파일드(compiled) 단백질 서열 데이터베이스에 대해 비교된다. BLAST는 항체 서열과 데이터베이스 서열 사이의 통계학적으로 유의한 정렬이 고-득점 분절 쌍(HSP)의 정렬된 단어를 함유할 것인 경험적 알고리듬이다. 연장 또는 트리밍에 의해 스코어가 개선될 수 없는 분절 쌍은 히트(hit)라고 칭한다. 간략하게, VBASE 기원(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.php)의 뉴클레오타이드 서열이 번역되고, FR1 내지 FR3 골격 영역 사이의 영역 및 FR1 내지 FR3 골격 영역을 포함하는 영역은 유지된다. 데이터베이스 서열은 98 잔기의 평균 길이를 갖는다. 단백질의 전체 길이에 걸쳐 정확하게 일치하는 중복 서열은 제거된다. 단백질에 대한 BLAST 탐색은 복잡도가 낮은 필터(해제되어 있음), 및 BLOSUM62의 치환 매트릭스, 서열 일치를 수득하는 상위 5개의 히트에 대한 필터를 제외하고 디폴트 표준 파라미터를 갖는 프로그램 blastp를 이용한다. 6개의 프레임 모두에서 뉴클레오타이드 서열을 번역하고, 데이터베이스 서열의 일치하는 분절에서 정지 코돈이 없는 프레임은 잠재적인 히트로서 간주된다. 이는 최종적으로, 6개의 프레임 모두에서 항체 서열을 번역하고 이들 번역물을 6개의 프레임 모두에서 동적으로 번역된 VBASE 뉴클레오타이드 서열에 대해 비교하는, BLAST 프로그램 tblastx를 이용하여 확인한다. IMGT(http://imgt.cines.fr)로부터 이용가능한 것과 같은 다른 사람 배선 서열 데이터베이스는 상기 기재된 바와 같은 VBASE와 유사하게 탐색될 수 있다.

정체성은 항체 서열과 서열의 전체 길이에 걸친 단백질 데이터베이스 사이의 정확한 아미노산 일치이다. 포지티브(정체성 + 치환 일치)는 동일하지 않지만, 아미노산 치환은 BLOSUM62 치환 매트릭스에 의해 유도된다.

항체 서열이 동일한 정체성을 갖는 데이터베이스 서열 중 2개와 일치하는 경우, 최대 포지티브를 갖는 히트는 일치하는 서열 히트인 것으로 결정될 수 있다.

식별된 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은, 이로부터 골격 서열이 유도되는 배선 면역글로불린 유전자에서 발견된 것과 동일한 서열을 갖는 골격 영역 상에 절편이식될 수 있거나, CDR 서열은 배선 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 골격 영역 상에 절편이식될 수 있다. 예를 들면, 소정예에서 골격 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지하거나 향상시키는 것이 이롭다는 것이 발견되었다(예를 들면, Queen 등에 의한 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).

다른 유형의 가변 영역 변형은 V_H 및/또는 V_L CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 목적하는 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들면, 친화성)을 개선시키는 것이다. 부위-지시된 돌연변이유발 또는 PCR-매개된 돌연변이유발을 행하여 돌연변이(들) 및 항체 결합에 대한 효과를 도입할 수 있거나, 목적하는 다른 기능적 특성은 당해 분야에 공지되어 있는 시험관내 또는 생체내 분석으로 평가할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 돌연변이되어 라이브러리가 생성될 수 있고, 이어서, 라이브러리는 IL-12/IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 것에 대해 선별될 수 있다. 바람직하게는 보존적 변형(상기 논의된 바와 같음)이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.

다른 유형의 골격 변형은 골격 영역 내, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 또한, 이러한 접근법은 "탈면역화"로서도 나타내고, Carr 등에 의한 미국 특허 공개 제20030153043호에 추가로 상세하게 기재된다.

골격 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 대해 추가로 또는 대안으로, 본 발명의 항체를 조작하여 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록, 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들면, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존적 세포의 세포독성을 변경하도록 할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예를 들면, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있다), 글리코실화를 변경하고, 또한 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 이들 각각의 실시형태는 하기에 더 상세하게 기재된다. Fc 영역의 잔기의 넘버링은 캐뱃의 EU 인덱스의 넘버링이다.

한 실시형태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들면, 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 보드머(Bodmer) 등에 의한 미국 특허 제5,677,425호에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 변경되어, 예를 들면, 경쇄 및 중쇄의 조립을 가능하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시킨다.

다른 실시형태에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이시켜 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌CH지 단편의 2-CH3 도메인 인터페이스 영역에 도입하여, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 스태필로코커스 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록 한다. 이러한 접근법은 워드(Ward) 등에 의한 미국 특허 제 6,165,745호에 보다 상세하게 기재되어 있다.

다른 실시형태에서, 항체가 변형되어 항체의 생물학적 반감기가 증가된다. 각종 접근법이 가능하다. 예를 들면, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: 워드(Ward) 등에 의한 미국 특허 제6,277,375호에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체가 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경되어 프레스타(Presta) 등에 의한 미국 특허 제5,869,046호 ㅁ및 제6,121,022호에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 채택된 재생(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유할 수 있다. 이들 전략은 IL-12/IL-23의 p40 서브유닛의 항체에 대한 결합이 손상되지 않는 한 유효할 것이다.

또 다른 실시형태에서, Fc 영역은, 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경되어 항체의 이펙터 기능(들)이 변경된다. 예를 들면, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체되어 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화성을 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 할 수 있다. 친화성이 변경된 이펙터 리간드는 예를 들면, Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성성분일 수 있다. 이러한 접근법은 둘 다 윈터(Winter) 등에 의한 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 더욱 상세하게 기재되어 있다.

다른 예에서, 항체는 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 제거된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 이두소지에(Idusogie) 등에 의한 미국 특허 제6,194,551호에 보다 상세하게 기재되어 있다.

다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시키는 항체의 능력이 변경된다. 이러한 접근법은 보드머(Bodmer) 등에 의한 PCT 공보 WO 94/29351호에 추가로 기재되어 있다.

또 다른 예에서, Fc 영역이 변형되어 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 중재하는 항체의 능력이 증가되고/되거나 하기 위치: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439에서 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fcγ에 대한 항체의 친화성이 증가된다. 이러한 접근법은 프레스타(Presta)에 의한 PCT 공보 WO 00/42072호에 추가로 기재되어 있다. 또한, 맵핑된 사람 FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 사람 IgG1 상의 결합 부위, 및 결합이 개선된 변이체가 기재되었다(참조: Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특정 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선하는 것으로 나타났다. 추가로, 하기 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A and S298A/E333A/K334A을 개선하는 것으로 나타났다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체의 C-말단은 국제 PCT 출원 제 PCT/US08/73569(PCT 공보 제WO 2009/026274호)(이는 본원이 그 전문이 참조에 의해 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이 시스테인 잔기의 도입에 의해 변형된다. 이러한 변형으로는 전장 중쇄 서열의 C-말단에 또는 그 근처에 존재하는 아미노산의 대체 및 전장 중쇄 서열의 C-말단에의 시스테인-함유 연장의 도입이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시형태에서, 시스테인-함유 연장은 서열 알라닌-알라닌-시스테인(N-말단으로부터 C-말단까지)을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 이러한 C-말단 시스테인 변형의 존재는 파트너 분자, 예를 들면, 치료제 또는 마커 분자의 접합을 위한 위치를 제공한다. 특히, C-말단 시스테인 변형으로 인한 반응성 티올 그룹의 존재는 하기에 상세하게 기재되는 디설파이드 링커를 사용하여 파트너 분자를 접합시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 파트너 분자에 항체를 접합시키는 것은 부착의 특정 부위에 걸친 제어를 증가시킨다. 또한, C-말단에 또는 그 근처에 부착 부위를 도입함으로써, 항체의 기능적 특성과의 간섭을 감소시키거나 제거하고, 접합체 제제의 간략화된 분석 및 품질 제어를 가능하게 하도록 접합을 최적화할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 항체의 글리코실화는 변형된다. 예를 들면, 글리코실화된 항체(즉, 항체에는 글리코실화가 결여되어 있다)가 제조될 수 있다. 글리코실화를 변경시켜, 예를 들면, 항원에 대한 항체의 친화성이 증가될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들면, 항체 서열 내의 글리코실화의 하나 이상의 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 부위를 제거하여 당해 부위에서의 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 코(Co) 등에 의한 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 보다 상세하게 기재되어 있다. 글리코실화를 변경하기 위한 추가의 접근법은 하나이(Hanai) 등에 의한 미국 특허 7,214,775호, 프레스타(Presta)에 의한 미국 특허 제6,737,056호, 프레스타에 의한 미국 특허 공개 제20070020260호, 딕키(Dickey) 등에 의한 PCT 공보 제WO/2007/084926호, 쥬(Zhu) 등에 의한 PCT 공보 제WO/2006/089294호, 및 라벳치(Ravetch) 등에 의한 PCT 공보 제WO/2007/055916호에 보다 상세하게 기재되어 있고, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.

추가로 또는 대안으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예를 들면, 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화된 항체 또는 증가된 이등분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들면, 변경된 글리코실화 기구를 이용하여 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당해 분야에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체에 이들의 탄수화물에 대한 푸코스가 결여되도록 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709에는 푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8(알파 (1,6) 푸코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8^-/- 세포주는, 2개의 대체 벡터를 이용한 CHO/DG44 세포에서의 FUT8 유전자의 표적화된 파괴에 의해 생성된다(야만(Yaman) 등에 의한 미국 특허 공개 제20040110704호 및 Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22 참조). 다른 예로서, 하나이(Hanai) 등에 의한 EP 1,176,195는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하고, 이는 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하여, 알파 1,6 결합-관련된 효소를 감소시키거나 제거함으로써 이러한 세포주에서 발현되는 항체가 저푸코실화를 나타내도록 한다. 또한, 하나이(Hanai) 등은 항체의 Fc 영역에 결합하거나 효소 활성을 갖지 않는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 첨가하기 위한 낮은 효소 활성을 갖는 세포주, 예를 들면, 래트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)을 기재한다. 프레스타(Presta)에 의한 PCT 공보 WO 03/035835는 변이체 CHO 세포주, Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착하는 능력이 감소된 Lec13 세포를 기재하고, 이는 또한 상기 숙주 세포에서 발현되는 항체의 저푸코실화를 초래한다(또한, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). 우마나(Umana) 등에 의한 PCT 공보 WO 99/54342는, 조작된 세포주에서 발현된 항체가 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래하는 증가된 이분성 GlcNac 구조를 나타내도록 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들면, 베타(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현시키기 위해 조작된 세포주를 기재한다(또한, Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180 참조). 대안으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 이용하여 절단될 수 있다. 예를 들면, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다(Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

추가로 또는 대안으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체가 제조될 수 있고, 여기서, 상기 변경은 항체의 시알릴화의 수준에 관한 것이다. 이러한 변경은 딕키(Dickey) 등에 의한 PCT 공보 제WO/2007/084926호 및 라벳치(Ravetch) 등에 의한 PCT 공보 제WO/2007/055916호에 기재되어 있고, 이들 문헌은 둘 다 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 예를 들면, 시알리다제, 예를 들면, 아트로박터 우레아파센스 시알리다제를 이용한 효소 반응을 사용할 수 있다. 이러한 반응의 조건은 일반적으로 미국 특허 제5,831,077호에 기재되어 있고, 이 문헌은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 적합한 효소의 다른 비-제한적 예로는 각각 문헌(Schloemer et al. J. Virology, 15(4), 882-893 (1975)) 및 문헌(Leibiger et al., Biochem J., 338, 529-538 (1999))에 기재된 바와 같은 뉴라미니다제 및 N-글리코시다제 F가 있다. 탈시알릴화된 항체는 친화성 크로마토그래피를 이용함으로써 추가로 정제될 수 있다. 대안으로, 예를 들면, 시알릴트랜스퍼라제 효소를 사용함으로써 시알릴화의 수준을 증가시키는 방법을 사용할 수 있다. 이러한 반응의 조건은 일반적으로 문헌(Basset et al., Scandinavian Journal of Immunology, 51(3), 307-311 (2000))에 기재되어 있다.

본 발명에 의해 고려되는 본원의 항체의 다른 변형은 페길화이다. 항체는 예를 들면, 항체의 생물학적(예를 들면, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체 또는 이의 단편은, 전형적으로 하나 이상의 PEG 그룹이 항체 또는 항체 단편에 부착되게 하는 조건 하에 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들면, 반응성 에스테르 또는 PEG의 알데하이드 유도체와 반응된다. 바람직하게, 페길화는, 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 폴리머)를 이용한 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 행한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 임의의 형태, 예를 들면, 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 것으로 의도된다. 소정 실시형태에서, 페길화될 항체는 글리코실화된 항체이다. 단백질의 페길화 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들면, 니시무라(Nishimura) 등에 의한 EP 0 154 316 및 이시카와(Ishikawa) 등에 의한 EP 0 401 384를 참조한다. 이와 같이, 본원에 기재된 페길화 방법은 또한 하기에 기재되는 본 발명의 펩타이드성 분자에도 적용한다.

E. 항체 단편 및 항체 모사체

본 발명은 종상적인 항체에 한정되는 것은 아니고, 항체 단편 및 항체 모사체의 사용을 통해 실시될 수 있다. 하기에 설명되는 바와 같이, 현재 광범위한 항체 단편 및 항체 모사체 기술이 개발되어 왔고, 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 다수의 이들 기술, 예를 들면, 도메인 항체, 나노바디, 및 유니바디는 통상의 항체 구조의 단편의 사용, 또는 통상의 항체 구조에 대한 다른 변형을 제조하고, 또한, 통상의 항체 결합을 모방하면서 독특한 메커니즘으로부터 생성되고 독특한 메커니즘을 통해 기능하는 결합 구조를 사용하는, 대안의 기술, 예를 들면, 어드넥틴, 어피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머, 베르사바디, 압타머 및 SMIPS가 존재한다. 이들 대안의 구조 중 몇몇은 문헌(Gill and Damle (2006) 17: 653-658)에서 리뷰된다.

도메인 항체(dAb)는 사람 항체의 중쇄(V_H) 또는 경쇄(V_L) 중 어느 하나의 가변 영역에 상응하는 항체의 최소 기능성 결합 단위이다. 도메인 항체는 대략 13kDa의 분자량을 갖는다. 도맨티스(Domantis)는 완전 사람 VH 및 VL dAb의 거대 및 고도로 기능성인 일련의 라이브러리(각각의 라이브러리에서 100억 초과의 상이한 서열)를 개발하였고, 이들 라이브러리를 사용하여 치료학적 표적에 대해 특이적인 dAb를 선택한다. 다수의 통상의 항체와는 대조적으로, 도메인 항체는 세균, 효모, 및 포유동물 세포 시스템에서 잘 발현된다. 도메인 항체의 추가의 세부사항 및 이의 제조 방법은 미국 특허 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; 미국 특허 일련번호 제2004/0110941호; 유럽 특허 출원 제1433846호 및 유럽 특허 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 and WO03/002609를 참조하여 수득될 수 있고, 이들 문헌의 각각은 이들의 전문이 참조에 의해 본원에 인용된다.

나노바디는 천연-발생 중쇄 항체의 고유한 구조 및 기능적 특성을 함유하는 항체-유도된 치료학적 단백질이다. 이들 중쇄 항체는 단일 가변 도메인(VHH) 및 2개의 불변 도메인(CH2 및 CH3)을 함유한다. 중요하게도, 클로닝되고 분리된 VHH 도메인은 본래 중쇄 항체의 완전 항원-결합 능력을 숨기는 완벽히 안정한 폴리펩타이드이다. 나노바디는 사람 항체의 VH 도메인과 높은 상동성을 갖고, 활성을 전혀 손실시키지 않으면서 추가로 사람화될 수 이다. 중요하게도, 나노바디는 저면역원성 잠재성을 갖고, 이는 나노바디 유도 화합물을 이용한 영장류 연구에서 확인되었다.

나노바디는 통상의 항체의 이점과 소분자 약물의 중요한 특성을 조합한다. 통상의 항체와 유사하게, 나노바디는 높은 표적 특이성, 이들의 표적에 대한 높은 친화성 및 낮은 내재적 독성을 나타낸다.

그러나, 소분자 약물과 유사하게 이들은 효소를 억제하여 쉽게 수용체 클레프트에 접근할 수 있다. 또한, 나노바디는 매우 안정하고, 주사 이외의 수단에 의해 투여될 수 있고(예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용되는 WO 04/041867 참조), 제조하기에 용이하다. 나노바디의 다른 이점으로는 이들의 작은 크기의 결과로서 일반적이지 않거나 숨겨진 에피토프를 인식하는 것, 이들의 고유한 3차원 구조로 인해 단백질 표적의 공동 또는 활성 부위에 높은 친화성 및 선택성으로 결합하는 것, 및 약물 포맷 유연성, 반감기의 테일러링 및 약물 발견의 용이함 및 속도가 포함된다.

나노바디는 단일 유전자에 의해 암호화되고, 대부분의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예를 들면, 이. 콜라이(예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 6,765,087 참조), 곰팡이(예를 들면, 아스퍼질러스 또는 트리코더마) 및 효모(예를 들면, 사카로마시에스, 클루이베로마이세스, 한세눌라, 또는 피키아)에서 유효하게 생산된다(예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 6,838,254 참조). 생산 프로세스는 확장가능하고, 수-킬로그램 양의 나노바디가 생산된다. 나노바디는 통상의 항체와 비교하여 우수한 안정성을 나타내기 때문에, 이들은 긴 저장-수명, 즉시 사용형 용액으로서 제형화될 수 있다.

나노클론 방법(예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용되는 WO 06/079372 참조)은, B-세포의 자동화된 고-출력 선택에 기반한 목적하는 표적에 대한 나노바디를 생성하기 위한 특허 방법이고, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.

유니바디는 또 다른 항체 단편 기술이지만, 이러한 기술은 IgG4 항체의 힌지 영역의 제거에 기반한다. 힌지 영역의 결실은 근본적으로 일반적인 IgG4 항체 크기의 절반이고 IgG4 항체의 2가의 결합 영역에 비해 1가의 결합 영역을 갖는 분자를 수득한다. 또한, IgG4 항체는 비활성이고 따라서 면역 시스템과 상호작용하지 않는다는 것이 공지되어 있으며, 이는 면역 반응이 바람직하지 않은 질환의 치료에 이로울 수 있고, 이러한 이점은 유니바디에 전달된다. 예를 들면, 유니바디는 이들이 결합하는 세포를 억제하거나 침묵시키지만 사멸시키지는 않는 기능을 할 수 있다. 추가로, 암 세포에 결합하는 유니바디는 증식시키기 위해 암 세포를 자극하지 않는다. 또한, 유니바디는 일반적인 IgG4 항체의 크기의 대략 절반이므로, 이들은 잠재적으로 이로운 효능을 지닌 보다 큰 고형 종양에 걸쳐 보다 우수한 분포를 나타낼 수 있다. 유니바디는 전체 IgG4 항체와 유사한 속도로 신체로부터 제거되고, 전체 항체와 유사한 이들의 항원 친화성으로 결합할 수 있다. 유니바디의 추가의 상세설명은 전문이 본원에 참조로 인용되는 특허 출원 WO2007/059782를 참조하여 수득될 수 있다.

어드넥틴 분자는 피브로넥틴 단백질의 하나 이상의 도메인으로부터 유도된 조작된 결합 단백질이다. 피브로넥틴은 사람 신체에 자연적으로 존재한다. 이는 불용성 당단백질 이량체로서 세포외 매트릭스에 존재하고, 또한 링커 단백질로서 작용한다. 또한, 디설파이드 결합된 이량체로서 혈장 내에 가용성 형태로 존재한다. 혈장 형태의 피브로넥틴은 간 세포(헤파토사이트)에 의해 합성되고, ECM 형태는 연골세포, 대식세포, 내피 세포, 섬유아세포, 및 상피의 몇몇 세포에 의해 제조된다(Ward M., and Marcey, D., callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/fibro/fibro.htm 참조). 이전에 언급된 바와 같이, 피브로넥틴은 세포 부착 분자로서 자연적으로 기능할 수 있거나, 세포외 매트릭스에서 접촉을 생성함으로써 세포의 상호작용을 매개할 수 있다. 전형적으로, 피브로넥틴은 3개의 상이한 단백질 모듈, 유형 I, 유형 II 및 유형 III 모듈로 이루어진다. 피브로넥틴의 기능의 구조의 리뷰를 위해, 문헌[Pankov and Yamada (2002) J Cell Sci.; 115(Pt 20):3861-3, Hohenester and Engel (2002) 21 : 115-128, 및 Lucena et al. (2007) Invest Clin.48:249-262]을 참조한다.

바람직한 실시형태에서, 어드넥틴 분자는, 2개의 베타 시트 사이에 분포된 다중 베타 가닥으로 이루어진 본래 단백질을 변경시킴으로써 피브로넥틴 유형 III 도메인으로부터 유도된다. 본래 조직에 의존하여, 피브로넥틴은 예를 들면, ¹Fn3, ²Fn3, ³Fn3 등으로 나타내어질 수 있는 다중 유형 III 도메인을 함유할 수 있다. ¹⁰Fn3 도메인은 인테그린 결합 모티프를 함유하고, 베타 가닥을 연결하는 3개의 루프를 추가로 함유한다. 이들 루프는 IgG 중쇄의 항원 결합 루프에 상응하는 것으로 생각될 수 있고, 이들은 하기에 논의되는 방법에 의해 변경되어 목적하는 표적, 예를 들면, IL-12/IL-23의 p40 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 목적에 유용한 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질 데이터 은행(PDB, rcsb.org/pdb/home/home.do)으로부터 접근 코드: 1ttg로 접근할 수 있는 피브로넥틴 유형 III 분자의 구조를 암호화하는 서열과 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열이다. 어드넥틴 분자는 또한 단순 단량체성 ¹⁰Fn3 구조보다는 ¹⁰Fn3 관련된 분자의 폴리머로부터 유도될 수 있다.

천연 ¹⁰Fn3 도메인은 전형적으로 인테그린에 결합하지만, 어드넥틴 분자가 되도록 적응된 ¹⁰Fn3 단백질은 목적하는 항원, 예를 들면, IL-12/IL-23의 p40 서브유닛에 결합하도록 변경된다. 한 실시형태에서, ¹⁰Fn3 분자에 대한 변경은 베타 가닥에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, ¹⁰Fn3 분자의 베타 가닥을 연결하는 루프 영역은 IL-12/IL-23의 p40 서브유닛에 결합하도록 변경된다.

¹⁰Fn3에서의 변경은 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있고, 이러한 방법으로는 본원에서 참조된, 오류 발생이 쉬운 PCR, 부위-지시된 돌연변이유발, DNA 셔플링, 또는 기타 유형의 재조합적 돌연변이유발이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한 예에서, ¹⁰Fn3 서열을 암호화하는 DNA의 변이체는 시험관내에서 직접 합성되고, 후에 전사되어 시험관내 또는 생체내에서 번역될 수 있다. 대안으로, 천연 ¹⁰Fn3 서열은 표준 방법을 이용하여 게놈으로부터 분리되거나 클로닝될 수 있고(미국 특허 출원 제20070082365호에서 수행된 바와 같음), 이어서 당해 분야에 공지되어 있는 돌연변이유발 방법을 이용하여 돌연변이될 수 있다.

한 실시형태에서, 표적 단백질, 예를 들면, IL-12/IL-23의 p40 서브유닛은 고체 지지체, 예를 들면, 컬럼 수지 또는 미세적정 플레이트의 웰에 고정화될 수 있다. 이어서, 표적은 잠재적 결합 단백질의 라이브러리와 접촉된다. 라이브러리는 ¹⁰Fn3 클론, 또는 ¹⁰Fn3 서열의 돌연변이유발/무작위화에 의해 또는 ¹⁰Fn3 루프 영역(베타 가닥이 아님)의 돌연변이유발/무작위화에 의해 야생형 ¹⁰Fn3으로부터 유도된 어드넥틴 분자를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 라이브러리는 문헌[Szostak et al., 미국 특허 번호 제09/007,005호 및 제09/247,190호; Szostak et al., WO989/31700; 및 Roberts & Szostak (1997) 94: 12297-12302]에 기재된 기술에 의해 생성된 RNA-단백질 융합 라이브러리일 수 있다. 또한, 라이브러리는 DNA-단백질 라이브러리일 수 있다[예를 들면, Lohse, 미국 특허 번호 제60/110,549, 미국 특허 번호 제09/459,190호, 및 WO 00/32823에 기재된 바와 같음]. 이어서, 융합 라이브러리를 고정화된 표적(예를 들면, IL-12/IL-23의 p40 서브유닛)과 항온배양하고, 고체 지지체를 세척하여 비-특이적 결합 모이어티를 제거한다. 이어서, 밀착 바인더를 엄중한 조건 하에서 용출시키고, PCR을 이용하여 유전적 정보를 증폭시키거나 결합 분자의 새로운 라이브러리를 생성하여 프로세스를 반복한다(추가의 돌연변이유발을 포함하거나 포함하지 않음). 선택/돌연변이유발 프로세스는 표적에 대해 충분한 친화성을 갖는 바인더가 수득될 때까지 반복될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 어드넥틴 분자는 Adnexus, Briston-Myers Squibb company에 의해 사용되는 PROfusion^TM 기술을 이용하여 조작될 수 있다. PROfusion 기술은 상기 참조된 기술(예를 들면, Roberts & Szostak (1997) 94: 12297-12302)에 기반하여 생성되었다. 본 발명에서 사용될 수 있는, 변경된 ¹⁰Fn3 도메인의 라이브러리를 생성하고 적절한 바인더를 선택하는 방법은 하기 미국 특허 및 특허 출원 문헌에 완전하게 기재되어 있고, 이들은 본원에 참조로 인용된다: 미국 특허 제7,115,396호; 제6,818,418호; 제6,537,749호; 제6,660,473호; 제7,195,880호; 제6,416,950호; 제6,214,553호; 제6623926호; 제6,312,927호; 제6,602,685호; 제6,518,018호; 제6,207,446호; 제6,258,558호; 제6,436,665호; 제6,281,344호; 제7,270,950호; 제6,951,725호; 제6,846,655호; 제7,078,197호; 제6,429,300호; 제7,125,669호; 제6,537,749호; 제6,660,473호; 및 미국 특허 출원 제20070082365호; 제20050255548호; 제20050038229호; 제20030143616호; 제20020182597호; 제20020177158호; 제20040086980호; 제20040253612호; 제20030022236호; 제20030013160호; 제20030027194호; 제20030013110호; 제20040259155호; 제20020182687호; 제20060270604호; 제20060246059호; 제20030100004호; 제20030143616호; 및 제20020182597호. 선별 단계에 이어서, 피브로넥틴 유형 III 도메인, 예를 들면, ¹⁰Fn3의 다양성을 생성하는 것이 당해 분야에 공지되어 있는 다른 방법, 예를 들면, 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 또는 효모 표면 디스플레이를 이용하여 달성될 수 있다(참조예: Lipovsek et al. (2007) Journal of Molecular Biology 368: 1024-1041; Sergeeva et al. (2006) Adv Drug Deliv Rev. 58: 1622-1654; Petty et al. (2007) Trends Biotechnol. 25: 7-15; Rothe et al. (2006) Expert Opin Biol Ther. 6: 177-187; 및 Hoogenboom (2005) Nat Biotechnol. 23: 1105-1116).

상기 언급된 참조문헌의 방법을 이용하여 바람직한 ¹⁰Fn3 도메인 이외의 단백질로부터 항체 모사체를 유도할 수 있다는 것이 당업자에게 이해되어야 한다. 상기 참조된 방법을 통해 항체 모사체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 추가의 분자로는 제한 없이, 사람 피브로넥틴 모듈 ¹Fn3-⁹Fn3 및 ¹¹Fn3-¹⁷Fn3 및 비-사람 동물 및 원핵생물 유래의 관련된 Fn3 모듈이 포함된다. 또한, ¹⁰Fn3과 서열 상동성을 지닌 다른 단백질 유래의 Fn3 분자, 예를 들면, 테나신 및 운둘린도 사용할 수 있다. 면역글로불린-유사 폴드를 갖는(그러나, V_H 도메인과 관련되지 않은 서열을 가짐) 다른 예시 단백질로는 N-카데린, ICAM-2, 티틴, GCSF 수용체, 사이토카인 수용체, 글리코시다제 억제제, E-카데린, 및 항생제성 색소 단백질이 포함된다. 관련된 구조를 갖는 추가의 도메인은 미엘린 막 부착 분자 P0, CD8, CD4, Cd2, MHC 클래스 1, T-세포 항원 수용체, CD1, CD2 및 VCAM-1의 I-세트 도메인, 미오신-결합 단백질 C의 I-세트 면역글로불린 폴드, 미오신-결합 단백질 H의 I-세트 면역글로불린 폴드, 텔로킨의 I-세트 면역글로불린 폴드, 텔리킨, NCAM, 트위트친, 뉴로글리안, 성장 호르몬 수용체, 에리트로포이에틴 수용체, 프롤락틴 수용체, GC-SF 수용체, 인터페론-감마 수용체, 베타-갈락토시다제/글루쿠로니다제, 베타-글루쿠로니다제, 및 트랜스글루타미나제로부터 유도될 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 면역글로불린-유사 폴드를 포함하는 임의의 다른 단백질을 이용하여 어드넥틴 유사 결합 모이어티를 생성할 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들면, SCOP 프로그램을 이용하여 식별될 수 있다(Murzin et al., J. Mol. Biol. 247:536 (1995); Lo Conte et al , Nucleic Acids Res. 25:257 (2000).

압타머는 본 발명에 의해 포함되는 다른 유형의 항체-모사체이다. 압타머는 전형적으로 특정 분자 표적에 결합하는 작은 뉴클레오타이드 폴리머이다. 압타머는 단일 또는 이중 가닥 핵산 분자(DNA 또는 RNA)일 수 있지만, DNA 기반 압타머는 가장 일반적으로 이중 가닥이다. 압타머 핵산에 대한 길이는 정의되어 있지 않지만, 압타머 분자는 가장 일반적으로 15 내지 40 뉴클레오타이드 길이이다.

압타머는 보통 표적 분자에 대한 압타머의 친화성을 결정하는 복합 3차원 구조를 형성한다. 압타머는, 주로 이들이 거의 전체적으로 시험관내에서 조작 및 증폭될 수 있으므로, 단순 항체에 비해 다수의 이점을 제공할 수 있다. 또한, 압타머는 보통 면역 반응을 거의 또는 전혀 유도하지 않는다.

압타머는 각종 기술을 이용하여 생성될 수 있지만, 본래 시험관내 선택(Ellington and Szostak. (1990) Nature. 346(6287):818-22) 및 SELEX 방법(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)(Schneider et al. 1992. J Mol Biol. 228(3): 862-9)을 이용하여 발전되었고, 이들 문헌의 전문은 본원에 참조에 의해 인용된다. 문헌[Klussmann. The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications. ISBN: 978-3-527-31059-3; Ulrich et al. 2006. Comb Chem High Throughput Screen 9(8):619-32; Cerchia and de Franciscis. 2007. Methods Mol Biol. 361 : 187-200; Ireson and Kelland. 2006. Mol Cancer Ther. 2006 5(12):2957-62; 미국 특허 제5582981호; 제5840867호; 제5756291호; 제6261783호; 제6458559호; 제5792613호; 제6111095호; 및 미국 특허 출원 제11/482,671호; 제11/102,428호; 제11/291,610호; 및 제10/627,543호, 이들 문헌은 모두 본원에 참조로 인용됨]을 포함한, 압타머의 제조 및 사용을 위한 다른 방법이 공개되어 있다.

SELEX 방법이 명확하게 가장 일반적이고, 3개의 기본 단계로 수행된다. 첫째, 특정 분자 표적에의 결합을 위한 후보 핵산 분자의 라이브러리를 선택한다. 둘째, 표적에 대한 충분한 친화성을 지닌 핵산을 비-바인더로부터 분리한다. 셋째, 결합된 핵산을 증폭시키고, 제2 라이브러리를 형성하고, 프로세스를 반복한다. 각각의 반복시에, 표적 분자에 대해 더욱 더 높은 친화성을 갖는 압타머가 선택된다. SELEX 방법은 본원에 참조로 인용되는 하기 출판물에서 보다 완전하게 설명된다: Bugaut et al. 2006. 4(22):4082-8; Stoltenburg et al. 2007 Biomol Eng. 2007 24(4):381-403 ; 및 Gopinath. 2007. Anal Bioanal Chem. 2007. 387(l): 171-82.

또한, 본 발명의 "압타머"는 뉴클레오타이드 대신 펩타이드로 이루어진 압타머 분자를 포함한다. 펩타이드 압타머는 뉴클레오타이드 압타머와 다수의 특성(예를 들면, 작은 크기 및 표적 분자에 높은 친화성으로 결합하는 능력)을 공유하고, 이들은 뉴클레오타이드 압타머를 생성하기 위해 사용된 것과 유사한 원칙을 갖는 선택 방법(예를 들면, Baines and Colas. 2006. Drug Discov Today. 11(7-8):334-41; 및 Bickle et al. 2006. Nat Protoc. 1(3): 1066-91, 이들 문헌은 본원에 참조로 인용된다)에 의해 생성될 수 있다.

어피바디 분자는 스태필로코커스 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나로부터 유도된 58-아미노산 잔기 단백질 도메인에 기반한 새로운 부류의 친화성 단백질을 나타낸다. 이러한 3개의 나선 다발 도메인은, 조합적 파지미드 라이브러리의 작제를 위한 스캐폴드로서 사용되었고, 조합적 파지미드 라이브러리로부터, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 목적하는 분자를 표적으로 하는 어피바디 변이체가 선택될 수 있다(Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997; 15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55).

어피바디 분자의 저분자량(6kDa)과 함께, 어피바디의 간단하고 강한 구조는 이들을 광범위한 적용, 예를 들면, 검출 시약으로서의 적용(Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261 : 199-211) 및 수용체 상호작용을 억제하기 위한 적용(Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003; 16:691-7)에 적합하게 한다. 어피바디 및 이의 제조 방법의 추가 상세설명은 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제5,831,012호를 참조하여 수득될 수 있다.

DARPin(Desinged Ankyrin Repeat Protein: 고안된 안키린 반복 단백질)은 비-항체 폴리펩타이드의 결합 능력을 발휘하기 위해 개발된 항체 모사체 DRP(고안된 반복 단백질) 기술의 한 예이다. 안키린 또는 류신-풍부 반복 단백질과 같은 반복 단백질은, 항체와는 달리 세포내 및 세포외에서 발생하는 유비쿼터스 결합 단백질이다. 이들의 고유한 모듈 구조는 함께 적층하여 가변 및 모듈 표적-결합 표면을 표시하는 긴 반복 도메인을 형성하는 반복 구조 단위(반복체)를 특징으로 한다. 이러한 모듈성에 기반하여, 매우 다양화된 결합 특이성을 갖는 폴리펩타이드의 조합적 라이브러리를 생성할 수 있다. 이러한 전략은 가변 표면 잔기 및 이들의 무작휘 조립체를 반복 도메인에 표시하는 자기-적합성 반복체의 컨센서스 디자인을 포함한다.

DARPin은 세균 발현 시스템에서 매우 높은 수율로 생성될 수 있고, 이들은 공지되어 있는 가장 안정한 단백질에 속한다. 사람 수용체, 사이토카인, 키나제, 사람 프로테아제, 바이러스 및 막 단백질을 포함하는 광범위한 표적 단백질에 대해 고도로 특이적인 고-친화성 DARPin을 선택하였다. 한자릿수의 나노몰 내지 피코몰 범위의 친화성을 갖는 DARpin을 수득할 수 있다.

DARPin은 ELISA, 샌드위치 ELISA, 유동 세포측정 분석(FACS), 면역조직화학(IHC), 칩 적용, 친화성 정제, 또는 웨스턴 블로팅을 포함한 광범위한 적용에 사용되어 왔다. 또한, DARPin은 세포내 구획에서 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP)에 융합된 세포내 마커 단백질로서 고도로 활성인 것으로 증명되었다. 또한, DARPin은 pM 범위의 IC50을 이용한 바이러스 침입을 억제하기 위해 사용되었다. DARPin은 단백질-단백질 상호작용을 차단하는데 이상적일 뿐만 아니라 효소를 억제하는데에도 이상적이다. 프로테아제, 키나제 및 수송체는 알로스테릭 억제 방식으로 가장 흔하게 성공적으로 억제시켰다. 종양 및 혈액비에 매우 바람직한 종양에 대한 매우 빠르고 특이적인 농축은 DARPin을 생체내 진단 또는 치료학적 접근에 적합하게 한다.

DARPin 및 기타 DRP 기술에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공개 제2004/0132028호 및 국제 특허 출원 공보 제WO 02/20565호에서 찾을 수 있고, 이들 문헌은 둘 다 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.

안티칼린은 추가의 항체 모사체 기술이지만, 이러한 경우 결합 특이성은 피로칼린, 사람 조직 및 체액에서 천연적으로 풍부하게 발현되는 저분자량 단백질 계열로부터 유도된다. 리포칼린은 생리학적 수송 및 화학적으로 민감하거나 불용성인 화합물의 저장과 관련된 생체내 기능의 범위를 수행하도록 전개되었다. 리포칼린은, 단백질의 한 말단에서 4개의 루프를 지지하는, 고도로 보존된 β-배럴을 포함하는 강한 내인성 구조를 갖는다. 이들 루프는 결합 포켓으로의 입구를 형성하고, 분자의 이러한 부분에서의 입체형태적 차이는 각각의 리포칼린 사이의 결합 특이성의 변이를 설명한다.

보존된 β-시트 골격에 의해 지지된 고가변성 루프의 전체 구조가 면역글로불린을 연상시키지만, 리포칼린은 단일 면역글로불린 도메인보다 약간 큰 160 내지 180 아미노산의 단일 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 항체와 크기의 관점에서 현저히 다르다.

리포칼린을 클로닝시켜, 이들의 루프를 조작하여 안티칼린을 생성한다. 구조적으로 다양한 안티칼린의 라이브러리가 생성되었고, 안티칼린 디스플레이는 결합 기능의 선택 및 선별, 이어서 원핵생물 또는 진핵생물 시스템에서의 추가의 분석을 위한 가용성 단백질의 발현 및 제조를 가능하게 한다. 연구는, 사실상 분리될 수 있는 임의의 사람 표적 단백질에 대해 특이적인 안티칼린이 개발될 수 있고, 분리될 수 있으며, 나노몰 또는 힌지 영역에서 결합 친화성이 수득될 수 있다는 것을 성공적으로 입증하였다.

또한, 안티칼린은 이중 표적화 단백질, 소위 듀오칼린으로 포맷될 수 있다. 듀오칼린은 표준 제조 프로세스를 이용하여 쉽게 제조되지만 2개의 결합 도메인의 구조적 배향에 관계없이 표적 특이성 및 친화성을 보유하는 단량체성 단백질에서 2개의 별도의 치료학적 표적에 결합한다.

단일 분자를 통한 다중 표적의 모듈화는 특히 하나 이상의 원인성 인자를 포함하는 것으로 공지되어 있는 질환에 유리하다. 또한, 이가 또는 다가 결합 포맷, 예를 들면, 듀오칼린은 질환에서의 세포 표면 분자의 표적화, 신호 도입 경로에 대한 효능제 효과의 매개, 또는 결합을 통해 향상된 내재화 효과의 유도 및 세포 표면 수용체의 클러스터링에 현저한 잠재성을 갖는다. 또한, 듀오칼린의 높은 내재적 안정성은 듀오칼린에 비해 유연한 제형 및 잠재적인 전달을 제공하는 단량체성 안티칼린과 비교할 수 있다.

안티칼린에 관한 추가의 정보는 미국 특허 제7,250,297호 및 국제 특허 출원 공보 제WO99/16873호에서 찾을 수 있고, 이들 문헌 둘 다는 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.

본 발명과 관련하여 유용한 다른 항체 모사체 기술은 아비머이다. 아비머는, 결합 및 억제 특성을 갖는 다중도메인 단백질을 생성하는, 시험관내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이에 의해 거대 계열의 사람 세포외 수용체 도메인으로부터 전개된다. 다중 독립적 결합 도메인의 결합은 산가를 생성하는 것으로 나타났고, 통상의 단일-에피토프 결합 단백질에 비하여 개선된 친화성 및 특이성을 초래한다. 다른 잠재적 이점으로는 에스케리키아 콜라이에서의 다중표적-특이적 분자의 간단하고 효율적인 생산, 개선된 열안정성 및 프로테아제에 대한 내성이 포함된다. 각종 표적에 대해 서브-나노몰 친화성을 갖는 아비머를 수득하였다.

아비머에 관한 추가 정보는 미국 특허 출원 공보 제2006/0286603호, 제2006/0234299호, 제2006/0223114호, 제2006/0177831호, 제2006/0008844호, 제2005/0221384호, 제2005/0164301호, 제2005/0089932호, 제2005/0053973호, 제2005/0048512호, 제2004/0175756호에서 찾을 수 있고, 이들 문헌은 모두 이들의 전문이 본원에서 참조로 인용된다.

베르사바디는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 다른 항체 모사체 기술이다. 베르사바디는 15% 초과의 시스테인을 갖는, 3 내지 5kDa의 작은 단백질이고, 이는 높은 디설파이드 밀도의 스캐폴드를 형성하고, 전형적인 단백질이 zkw는 소수성 코어를 대체한다. 소수성 코어를 포함하는 다수의 소수성 아미노산을 소수의 디설파이드로 대체하는 것은 보다 작고, 보다 친수성이고(보다 적은 응집 및 비-특이적 결합), 프로테아제 및 열에 대해 보다 내성이고, 보다 낮은 밀도의 T-세포 에피토프를 갖는 단백질을 수득하고, 이것은 대부분 MHC 표시에 기여하는 잔기가 소수성이기 때문이다. 이들 4개의 특성은 모두 면역원성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있고, 이들은 함께 면역원성에 큰 감소를 일으키는 것으로 예상된다.

베르사바디에 대한 인스퍼레이션은 예상치 않게 낮은 면역원성을 나타내는 것으로 알려져 있는 거머리, 뱀, 거미, 전갈, 달팽이 및 아네모네에 의해 생성된 천연 주사가능한 생물약제로부터 비롯된다. 선택된 천연 단백질 계열에서 시작하여, 디자인에 의해 그리고 크기를 선별함으로써, 소수성, 단백질용해성 항원 프로세싱 및 에피토프 밀도는 천연 주사가능한 단백질에 대한 평균 보다 훨씬 미만의 수준으로 최소화된다.

베르사바디의 구조를 감안하면, 이들 항체 모사체는 다가, 다-특이성, 반감기 기구의 다양성, 조직 표적화 모듈 및 항체의 Fc 영역의 부재를 포함한 다목적 포맷을 제공한다. 또한, 베르사바디의 친수성 및 작은 크기로 인하여 베르사바디는 이.콜라이에서 고수율로 생산되고, 베르사바디는 고도로 가용성이며, 고농도로 제형화될 수 있다. 베르사바디는 열적으로 매우 안정하고(이들은 비등될 수 있음), 연장된 수명을 제공한다.

베르사바디와 관련된 추가의 정보는 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 출원 공개 제2007/0191272호에서 찾을 수 있다.

SMIP^TM(소형 모듈 면역약제-트루비온(Trubion) 제약)를 표적 결합, 이펙터 기능, 생체내 반감기, 및 발현 수준이 유지 및 최적화되도록 조작한다. SMIPS는 3개의 독특한 모듈 도메인으로 구성된다. 첫째, 이들은 특이성을 부여하는 임의의 단백질(예를 들면, 세포 표면 수용체, 단일쇄 항체, 가용성 단백질 등)로 이루어질 수 있는 결합 도메인을 함유한다. 둘째, 이들은 결합 도메인과 이펙터 도메인 사이의 유연한 링커로서 작용하는 힌지 도메인을 함유하고, 또한 SMIP 약물의 다량체화 제어를 보조한다. 마지막으로, SMIPS는 Fc 도메인 또는 다른 특별히 설계된 단백질을 포함하는 다양한 분자로부터 유도될 수 있는 이펙터 도메인을 함유한다. 상이한 결합, 힌지, 및 이펙터 도메인이 다양한 SMIPs 간단한 작제를 가능하게 하는 디자인의 모듈성은 신속하고 사용자정의 가능한 약물 설계를 제공한다.

SMIPs을 설계하는 방법의 예를 포함한 SMIP에 대한 보다 많은 정보는 문헌[Zhao et al. (2007) Blood 110:2569-77 및 하기 미국 특허 출원 제20050238646호; 제20050202534호; 제20050202028호; 제20050202023호; 제20050202012호; 제20050186216호; 제20050180970호; 및 제20050175614호]에서 찾을 수 있다.

상기 제공된 항체 단편 및 항체 모사체 기술의 상세한 설명은 본 명세서와 관련하여 사용될 수 있는 모든 기술의 포괄적인 목록인 것으로 의도되는 것은 아니다. 예를 들면, 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용되는 문헌[Qui et al , Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)]에 개요된 바와 같은 상보성 결정 영역의 융합과 같은 대안의 폴리펩타이드-기반 기술, 및 전문이 본원에 참조로 인용되는 문헌[미국 특허 제5,789,157호, 제5,864,026호, 제5,712,375호, 제5,763,566호, 제6,013,443호, 제6,376,474호, 제6,613,526호, 제6,114,120호, 제6,261,774호, 및 제6,387,620호]에 기재된 RNA 압타머 기술과 같은 핵산-기반 기술을 포함한 각종 추가의 기술이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.

F. 항체 물리적 특성

IL-12/IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 본 발명의 항체들은 다양한 물리적 특성들에 의해 추가로 특징분석되었다. 다양한 검정법은 이들 물리적 특성들을 토대로 상이한 부류들의 항체들을 검출하고/하거나 구별하는데 사용될 수 있다.

일부 양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 부위들을 함유할 수 있다. 상기 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 부위들의 존재는 변경된 항원 결합으로 인해 항체의 면역원성을 증가시키거나 항체의 pK를 변경시킬 수 있다(참조: Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 일어나는 것으로 알려졌다. 가변 영역 글리코실화는, 항체를 절단하여 Fab를 생성한 후, 산화(periodate oxidation) 및 쉬프 염기 형성을 측정하는 검정법을 사용하여 글리코실화에 대해 시험하는 글리코블롯(Glycoblot) 검정법을 사용하여 시험될 수 있다. 대안적으로, 가변 영역 글리코실화는 Fab로부터의 사카라이드를 모노사카라이드로 절단하고 개별 사카라이드 함량을 분석하는 디오넥스(Dionex) 라이트 크로마토그래피(디오넥스-LC)를 사용하여 시험될 수 있다. 일부 예에서, 가변 영역 글리코실화를 함유하지 않는 항체를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이는 가변 영역에 글리코실화 모티프를 함유하지 않는 항체를 선택함으로써 또는 당해 분야에 익히 공지된 표준 기술을 사용하여 글리코실화 모티프 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.

각각의 항체는 특유의 등전점(pI)을 가질 것이지만, 일반적으로 항체는 6 내지 9.5의 pH 범위 내에 속할 것이다. IgGl 항체에 대한 pI는 통상적으로 7-9.5의 pH 범위 내에 속하며, IgG4 항체에 대한 pI는 통상적으로 6-8의 pH 범위 내에 속한다. 항체는 이러한 범위를 벗어나는 pI를 가질 수 있다. 효과가 일반적으로 알려져 있지 않더라도, 표준 범위를 벗어난 pI를 갖는 항체가 생체내 조건하에서 일부 언폴딩(unfolding) 및 불안정을 가질 수 있음이 예측된다. 등전점은 pH 구배를 생성하는 모세관 등전 집중 검정법(capillary isoelectric focusing assay)을 사용하여 시험될 수 있고, 정확도를 증가시키기 위해 레이저 집중법(laser focusing)을 이용할 수 있다(참조: Janini et al (2002) Electrophoresis 23: 1605-11 ; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). 일부 예에서, 표준 범위에 속하는 pI 값을 함유하는 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 표준 범위의 pI를 갖는 항체를 선택함으로써 또는 당해 분야에 익히 공지된 표준 기술을 사용하여 하전된 표면 잔기를 돌연변이시켜 달성될 수 있다.

각각의 항체는 열 안정성을 지시하는 용융 온도를 가질 것이다(참조: Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 높은 열 안정성은 생체내에서 더 큰 전반적 항체 안정성을 지시한다. 항체의 융점은 시차 주사 열량측정법과 같은 기술을 사용하여 측정할 수 있다(참조: Chen et al (2003) Pharm Res 20: 1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). T_M1은 항체의 초기 언폴딩의 온도를 지시한다. T_M2는 항체의 완전한 언폴딩의 온도를 지시한다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 T_M1이 60℃ 초과, 바람직하게는 65℃ 초과, 더욱 더 바람직하게는 70℃ 초과인 것이 바람직하다. 대안적으로, 항체의 열 안정성은 원편광 2색법을 사용하여 측정할 수 있다(참조: Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

바람직한 양태에서, 신속하게 분해되지 않는 항체가 바람직할 수 있다. 항체의 단편화는, 당해 분야에 익히 알려진 바와 같은 모세관 전기이동(CE) 및 MALDI-MS를 사용하여 측정될 수 있다(참조: Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

또 다른 바람직한 양태에서, 최소 응집 효과를 갖는 항체가 선택된다. 응집은 원치 않는 면역 반응 및/또는 변경되거나 바람직하지 않은 약동학적 특성을 유발할 수 있다. 일반적으로, 항체는 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 더욱 더 바람직하게는 15% 이하, 더욱 더 바람직하게는 10% 이하, 더욱 더 바람직하게는 5% 이하의 응집이 허용된다. 응집은 크기-배제 컬럼(SEC) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 및 단량체, 이량체, 삼량체 및 다량체를 스크리닝하기 위한 광 산란을 포함하는, 당해 분야에 익히 공지된 몇몇 기술에 의해 측정될 수 있다.

V. 본 발명의 항체의 생성

A. 본 발명의 다클론 항체의 생성

본 발명의 다클론 항체는 당해 분야에 익히 공지된 다양한 기술들에 의해 생성될 수 있다. 다클론 항체는 상이한 B-세포주로부터 유도되며, 이에 따라 동일한 항원에 대해 다수의 에피토프를 인지할 수 있다. 다클론 항체는 통상적으로 적합한 포유동물과 관심있는 항원, 예를 들면, IL-12/IL-23의 p40 서브유닛과의 면역화에 의해 생성된다. 다클론 항체의 제조에 종종 사용되는 동물은 닭, 염소, 기니아 피그, 햄스터, 말, 마우스, 래트, 양, 및 가장 일반적으로 토끼이다. 다클론 항체를 생성하는 표준 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있으며 본 발명의 방법과 조합될 수 있다(예를 들면, research.cm.utexas.edu/bkitto/Kittolabpage/Protocols/Immunology/PAb.html; 미국 특허 제4,719,290호, 제6,335,163호, 제5,789,208호, 제2,520,076호, 제2,543,215호, 및 제3,597,409호, 이들의 전문은 본원에 참조로 인용되어 있다).

B. 본 발명의 단클론 항체의 생성

본 발명의 단클론 항체(mAbs)는 통상적인 단클론 항체 방법, 예를 들면, 콜러 및 밀슈타인(참조: Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495)의 표준 체세포 하이브리드화 기술을 포함하는, 다양한 기술들에 의해 생성될 수 있다. 체세포 하이브리드화 절차가 바람직하더라도, 원칙적으로, 단클론 항체를 생성하기 위한 다른 기술, 예를 들면, B 림프구의 바이러스 또는 종양발생 전환이 사용될 수 있다. 항체(단클론 또는 다클론) 또는 이의 항원 결합 부분이, 본원에 기재된 입체형태, 불연속 또는 선형 에피토프를 포함하는, IL-12/IL-23의 p40 서브유닛 상의 임의의 에피토프에 대해 일어날 수 있음을 주지해야 한다.

당해 분야에 공지된 몇몇 방법은 관심있는 불연속 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 특이적으로 선택하는데 유용하다. 예를 들면, 미국 공보 제2005/0169925호(이의 전문은 본원에 참조로 인용된다)에 개시된 기술은 단백질 서열 내의 2개의 상이한 펩타이드에 결합하는 항체의 선택을 가능하게 한다. 이러한 방법은 본원에 개시된 입체형태적 및 불연속 에피토프를 특이적으로 표적화하기 위해 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 입체형태적 에피토프가 단백질 2차 구조인 경우, 이러한 구조는 종종 더 작은 펩타이드(예를 들면, <50 아미노산)에서 용이하게 형성한다. 따라서, 더 작은 펩타이드를 갖는 동물의 면역화는 일부 입체형태적 에피토프를 포착할 수 있다. 대안적으로, 입체형태적 에피토프를 포함하는 작은 펩타이드(예를 들면, 표 5에서 스크리닝된 펩타이드)는 가변 링커(예를 들면, 폴리글리콜, 또는 극성, 비하전 아미노산의 스트레치(stretch))를 통해 연결될 수 있다. 링커는 펩타이드가 다양한 상호작용 배향을 탐색하도록 할 것이다. 이러한 작제물(construct)과 면역화한 후 적절하게 선별하여 입체형태적 에피트포로 향하는 항체의 스크리닝을 가능하게 할 수 있다. 바람직한 양태에서, 입체형태적 또는 선형 에피토프(예를 들면, 상기 표 3에 기재된 부위들 및 표 4에 기재된 에피토프들을 포함하는, 섹션 11(A) 및 11(C)에 기재된 에피토프)에 특이적인 펩타이드는 동물을 IL-12/IL-23의 p40 서브유닛의 특정 도메인과 면역화시킨 후 관심있는 에피토프와 결합하는 항체에 대한 선별에 의해 생성될 수 있다. 하나의 양태에서, 저온전자 현미경관찰법(참조: Jiang et al. (2008) Nature 451, 1130-1134; Joachim (2006) Oxford University Press_ISBN:0195182189)은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 결합되는 에피토프를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, IL-12/IL-23의 p40 서브유닛 또는 이의 도메인은 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결정화될 수 있고, X-선 결정학에 의해 분석하여 결합되어 있는 정확한 에피토프를 결정할 수 있다. 또한, 에피토프는 IL-12/IL-23 서열의 p40 서브유닛 부분을 마우스 또는 또 다른 종으로부터의 상응하는 서열로 대체하여 맵핑될 수 있다. 관심있는 에피토프로 향하는 항체는 사람 서열 영역과 선택적으로 결합할 것이며, 이에 따라, 표적 에피토프를 연속하여 맵핑할 수 있다. 이러한 키메라 기반 에피토프 맵핑 기술은 다양한 환경에서 에피토프를 스크리닝하는데 성공적으로 사용되었다(참조: Henriksson and Pettersson (1997) Journal of Autoimmunity. 10(6):559-568; Netzer et al. (1999) J Biol Chem. 1999 Apr 16;274(16): 11267-74; Hsia et al. (1996) Mol. Microbiol. 19, 53-63, the entire contents of which are incorporated herein by reference).

관심있는 IL-12/IL-23 도메인의 p40 서브유닛이 글리코실화되는 경우, 항체 또는 이의 항원 결합 부위(및 본 발명의 다른 항체 모방체)는 이들이 관련 아미노산 및/또는 당 잔기에 결합하도록 일어날 수 있다. 사람 IL-12/23의 p40 서브유닛은 10개의 시스테인 잔기 및 4개의 가능한 N-결합된 글리코실화 부위를 함유한다. IL-12/23의 p40 서브유닛의 글리코실화 패턴은 적어도 문헌[참조: Yoon et al. 2000 EMBO 19(14):3530-3541; Gubler et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4143-4147; and Brunda et al. 1994 J. Leukocyte Biol. 55:280-288]에 추가로 기재되어 있으며, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다. 따라서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분(및 본 발명의 다른 모이어티)은 이들이 본원에서 스크리닝된 임의의 에피토프에 부착될 수 있는 당 잔기에 결합하도록 일어날 수 있음이 의도된다. 이러한 목적을 위해, 관심있는 항원성 펩타이드는 적절하게 글리코실화되도록 동물 세포에서 생성될 수 있고, 이후 글리코실화된 항원성 펩타이드는 동물을 면역화시키는데 사용될 수 있다. 글리코실화된 펩타이드를 생성하는데 적합한 세포 및 기술은 당해 분야에 공지되어 있고 하기에 추가로 기재되어 있다(예를 들면, GlycoFi, Inc., Lebanon, NH 및 BioWa; Princeton, NJ로부터 이용가능한 기술들 참조). 펩타이드의 적절한 글리코실화는 등전점 전기영동(IEF), (모노사카라이드 조성을 결정하기 위한) 산 가수분해, 화학적 또는 효소적 절단, 및 글리칸을 확인하기 위한 질량분석법(MS)과 같은 임의의 표준 방법을 사용하여 시험될 수 있다. 글리칸 분석을 가속화시키기 위해 렉틴-기반 배열을 사용하는 프로코그니아(Procognia; procognia.com)에 의해 제공된 기술도 또한 사용될 수 있다. O-글리코실화는 구체적으로 환원적 알킬리성 절단 또는 "베타 제거", 펩타이트 맵핑, 액체 크로마토그래피, 및 질량분석법 또는 이들 기술들의 임의의 조합과 같은 기술들을 사용하여 검출될 수 있다.

하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 익히-정립된 과정이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 분리를 위한 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너(예를 들면, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 과정도 또한 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 사람화된 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클론 항체의 서열을 토대로 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는 관심있는 뮤린 하이브리도마로부터 얻을 수 있고, 비-뮤린(예를 들면, 사람) 면역글로불린 서열을 함유하기 위해 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 조작될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 생성하기 위해, 뮤린 가변 영역은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 사람 불변 부위와 연결될 수 있다(참조예: Cabilly et al.의 미국 특허 제4,816,567호). 사람화된 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 사람 골격 내로 삽입될 수 있다(참조예: Winter의 미국 특허 제5,225,539호, 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; Queen et al.의 제5,693,762호 및 제6,180,370호). 대안적으로, 사람화된 항체는 사람 및 비-사람 서열의 지식을 주어졌을 때 DNA 또는 단백질 수준으로 고안될 수 있다. 이러한 항체는 화학적으로 직접 합성될 수 있거나, 또는 DNA가 합성되고 시험관내 또는 생체내에서 발현시켜 사람화된 항체를 생성할 수 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는 사람 단클론 항체이다. 본원에 기재된 바와 같이 IL-12/IL-23의 p40 서브유닛의 도메인 또는 에프토프로 향하는 이러한 사람 단클론 항체는 마우스 시스템보다는 사람 면역 시스템의 유전자전이 또는 트랜스염색체(transchromosomic) 마우스 보유 부분을 사용하여 생성될 수 있다. 이들 유전자전이 및 트랜스염색체 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스™로 지칭된 마우스를 포함하며, "사람 Ig 마우스"라고 본원에서 총체적으로 지칭된다.

HuMAb 마우스®(Medarex, Inc.)는 재배열되지 않은 사람 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 암호화하는 사람 면역글로불린 유전자 미니유전자좌(miniloci)를, 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께 함유한다(참조예: Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 사람 중쇄 및 경쇄 전이유전자는 분류 전환(class switching) 및 체세포 돌연변이를 겪어 고 친화성 사람 IgGκ 단클론을 생성한다(참조: Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). HuMab 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스를 수반한 게놈 변형은 문헌(참조: Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591 ; and Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851)에 추가로 기재되어 있으며, 이의 모든 내용은 이의 전문이 본원에 참조로 구체적으로 인용되어 있다. 추가로, 모두 Lonberg and Kay의 미국 특허 제5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429호; Surani et al.의 미국 특허 제5,545,807호; 모두 Lonberg and Kay의 PCT 공보 제WO 92/03918호, 제WO 93/12227호, 제WO 94/25585호, 제WO 97/13852호, 제WO 98/24884호 및 제WO 99/45962호; 및 Korman et al.의 PCT 공보 제WO 01/14424호를 참조한다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 사람 항체는 전이유전자 및 트랜스염색체 상에 사람 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들면, 사람 중쇄 전이유전자 및 사람 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 마우스를 사용하여 일어날 수 있다. 본원에서 "KM 마우스™"로 지칭되는 이러한 마우스는 Ishida et al.의 PCT 공보 제WO 02/43478호에 상세히 기재되어 있다.

더 추가로, 사람 면역글로불린 유전자를 발현시키는 대안적인 유전자전이 동물 시스템이 당해 분야에서 이용가능하며 본 발명의 항체를 발생시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 제노마우스(Xenomouse; Abgenix, Inc.)라고 지칭되는 대안적인 유전자전이 시스템이 사용될 수 있고; 이러한 마우스는, 예를 들면, Kucherlapati et al.의 미국 특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6, 150,584호 및 제6,162,963호에 기재되어 있다.

더욱이, 사람 면역글로불린 유전자를 발현시키는 대안적인 트랜스염색체 동물 시스템이 당해 분야에서 이용가능하며 본 발명의 항체를 발생시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, "TC 마우스"라고 지칭되는, 사람 중쇄 트랜스염색체 및 사람 경쇄 트랜스염색체 둘다를 보유하는 마우스가 사용될 수 있고, 이러한 마우스는 문헌(참조: Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727)에 기재되어 있다. 추가로, 사람 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 암소가 당해 분야에 기재되어 있고(참조: Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) 본 발명의 항체를 발생시키는데 사용될 수 있다.

본 발명의 사람 단클론 항체는 또한 사람 면역글로불린 유전자의 선별 라이브러리를 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 사람 항체를 분리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당해 분야에 확립되어 있다. 예를 들면, Ladner et al.의 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호; Dower et al.의 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호; McCafferty et al.의 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호; 및 Griffiths et al.의 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호를 참조한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 사람 단클론 항체는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,914,128호에 기재된 파지 디스플레이 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 사람 단클론 항체는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,914,128호에 기재된 바와 같이 사람 항체 라이브러리로부터 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 사람 모노클로날 항체는, 사람 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 이용하여 면역화시에 사람 항체 반응이 생성될 수 있도록 제조될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들면, 문헌[윌슨(Wilson) 등에 의한 미국 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767]에 기재되어 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 널리 공지되어 있는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 문헌[Marks, J.D., et al. ((1991). J. Mol. Biol. 222, 581), Nissim, A., et al. ((1994). EMBO J. 13, 692) 및 미국 특허 제6,794,132호; 제6562341호; 제6057098호; 제5821047호; 및 제6512097호]에 기재된 바와 같이 발생시킬 수 있다.

추가의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 예를 들면, 문헌[미국 특허 제6,423,538호; 제6,300,065호; 제6,696,251호; 제6,699,658호]에 기재된 바와 같은 효모 세포 표면 디스플레이 기술을 이용하여 발견될 수 있다.

본 발명의 사람 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

본 발명의 사람 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해서, 면역화된 마우스 유래의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 분리하고 적절한 불멸화된 세포주, 예를 들면, 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 수득된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 선별할 수 있다. 예를 들면, 면역화된 마우스 유래의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG를 이용하여 P3X63-Ag8.653을 분비하지 않는 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)의 수의 1/6에 융합될 수 있다. 대안으로, 면역화된 마우스 유래의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 전기융합 방법에 기반한 전계를 이용하여, CytoPulse 거대 챔버 세포 융합 전기영동기(CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland)를 이용하여 융합될 수 있다. 세포를 편저 미세적정 플레이트에 대략 2 x 10⁵으로 플레이팅하고, 이어서, 20% 소 클론 혈청, 18% "653" 조건 배지, 5% 오리젠(IGEN), 4mM L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨, 5mM HEPES, 0.055mM 2-머캅토에탄올, 50단위/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신, 50mg/ml 젠타마이신 및 IX HAT(Sigma; HAT는 융합 24시간 후에 첨가된다)를 함유하는 선택 배지에서 2주 항온배양한다. 대략 2주 후에, 세포를, HAT가 HT로 대체된 배지에서 배양할 수 있다. 이어서, 각각의 웰을 사람 모노클로날 IgM 및 IGG 항체에 대해 ELISA에 의해 선별할 수 있다. 광범위한 하이브리도마 성장이 발생하면, 배지는 일반적으로 10 내지 14일 후에 관찰될 수 있다. 항체 분비 하이브리도마는 재플레이팅하고, 재차 선별하고, 사람 IgG에 대해 여전히 양성인 경우 희석을 제한함으로써 모노클로날 항체를 적어도 2배로 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론이 시험관내에서 배양되어 특징분석을 위한 조직 배양 배지에 소량의 항체를 생성할 수 있다.

사람 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마는 모노클로날 항체 정제를 위한 2리터 스피너-플라스크에서 성장될 수 있다. 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 이용한 친화성 크로마토그래피 이전에 상청을 여과 및 농축할 수 있다. 용출된 IgG는 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인하여 순도를 확보할 수 있다. 완충액은 PBS로 교환될 수 있고, 농도는 흡광 계수 1.43을 이용한 OD₂₈₀에 의해 측정될 수 있다. 모노클로날 항체는 분획되어 -80℃에서 저장될 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성

또한, 본 발명의 항체는 예를 들면, 당해 분야(예를 들면, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202)에 잘 공지되어 있는 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마(하이브리도마의 한 유형)에서 생산될 수 있다.

예를 들면, 항체 또는 이의 항체 단편을 발현시키기 위해서, 일부 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 분리된 핵산 분자, 예를 들면, DNA를 표준 분자 생물학 기술(예를 들면, PCR 증폭 또는 목적하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 이용한 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, DNA를 발현 벡터에 삽입하여 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동적으로 연결되도록 할 수 있다.

어구 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.

항체 또는 항체 일부(예를 들면, "분리된 항체"를 포함하는 hIL-12에 결합하는 VH, VL, CDR3)를 암호화하는 핵산과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 어구 "분리된 핵산 분자"는, 항체 또는 항체 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hIL-12 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 일부를 암호화하는 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 상기 다른 서열은 사람 게놈 DNA의 핵산을 천연적으로 플랭킹할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 항-IL-12 항체의 VH 영역을 암호화하는 본 발명의 분리된 핵산은 IL-12 이외의 항원에 결합하는 다른 VH 영역을 암호화하는 다른 서열을 포함하지 않는다. 어구 "분리된 핵산 분자"는 또한 VH 및 VL 영역이 디아바디의 서열 이외의 다른 서열을 포함하지 않는 디아바디와 같은 이가의 이특이적 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "벡터"는 다른 핵산을 이것이 연결되는 곳에 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 한 유형의 벡터는 "플라스미드"이고, 이는, 추가의 DNA 분절이 라이게이션될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 소정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포(예를 들면, 세균성 복제 기원을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)에서 자가 복제할 수 있다. 다른 벡터(예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에의 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 세포를 따라 복제된다. 또한, 소정 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로서 나타낸다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 이용하는 발현 벡터는 대개 플라스미드 형태로 존재한다. 본 명세서에 있어서, 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 형태의 벡터이므로, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면 세균 벡터(예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하도록 의도되고, 이들은 동등한 기능은 한다.

이러한 문맥에서, 용어 "작동적으로 연결된"은, 항체 유전자가 벡터에 라이게이션되어 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 목적의 기능을 행한다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 적합한 것으로 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있고, 또는 보다 전형적으로 유전자 둘 다가 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들면, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 블런트 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 삽입된다. 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 이용하여, 이들을 목적하는 이소타입의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 암호화하는 발현 벡터에 미리 삽입함으로써 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 생성하여, V_H 분절이 벡터 내의 C_H 분절(들)에 작동적으로 연결되고, V_K 분절이 벡터 내의 C_L 분절(들)에 작동적으로 연결되게 한다. 추가로 또는 대안으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄의 분비를 촉진하는 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩타이드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 프레임내에서 연결되도록 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질 유래의 신호 펩타이드)일 수 있다.

항체 쇄 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 갖는다. 어구 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 이러한 용어는 특정 피검체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 후손도 나타내는 것으로 의도된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 소정 변형이 성공적으로 생성될 수 있으므로, 이러한 후손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다. 소정 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다.

용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 항체 연쇄 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 기타 발현 대조 요소(예: 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것을 의도한다. 이러한 조절 서열은 예를 들면, 문헌에 기재된다[참조: Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]. 당해 기술분야의 숙련가에 의해, 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 변형되는 숙주 세포의 선택으로서 이러한 인자(원하는 단백질 발현의 수준 등)에 좌우될 수 있다는 것이 명백하다. 포유동물 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 단백질 발현의 높은 수준을 지시하는 바이러스 성분을 포함한다(예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원바이러스(Simian Virus) 40(SV40), 아데노바이러스(예: 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유도되는 프로모터 및/또는 인핸서). 대안적으로, 비바이러스 조절 서열이 사용될 수 있고, 예를 들면, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터이다. 또한 추가로, 조절 요소는 SV40 조기 프로모터로부터의 서열을 포함하는 SRoc 프로모터 시스템과 같은 상이한 소스로부터의 서열 및 사람 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 장쇄 말단 반복으로 구성된다[참조: Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472].

항체 연쇄 유전자 및 조절 서열에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들면, 숙주 세포(예를 들면, 복제의 원점) 및 선택 표지 유전자에서 벡터의 복제를 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 선택 표지 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포의 선택을 수행한다(참조: 미국 특허 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017, 모두 Axel 등에 의함). 예를 들면, 통상적으로, 선택 표지 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포에서 약물, 예를 들면, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내약성을 부여한다. 바람직한 선택 표지 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(dhfr-숙주 세포에서 메토트렉세이트 선택/증폭으로 사용하기 위한) 및 neo 유전자(G418 선택에 대해)를 포함한다.

경쇄 및 중쇄의 발현에 대해, 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)은 표준 기술로 숙주 세포로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA의 원핵 또는 진핵 숙주 세포로의 도입을 위해 통상 사용되는 광범위한 기술, 예를 들면, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 이론적으로, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 중 어느 하나에서 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있지만, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 항체의 발현이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵 세포는 특히 포유동물 세포에서, 원핵 세포 보다 어셈블리되는 경향이 있고, 적합하게 폴딩되고 면역학적 활성인 항체를 분비한다. 항체 유전자의 원핵 발현은 활성 항체의 고 수율 생산에 비효율적인 것으로 보고되었다[참조: Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13].

상기의 관점에서, 본 발명의 또 다른 양상은 항체 및 항체 단편의 재조합 발현에 사용될 수 있는 핵산, 벡터 및 숙주 세포 조성물에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 J695의 CDRs를 암호화하는 분리된 핵산, 및/또는 J695의 전체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 특징으로 한다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 기재된 J695 중쇄 CDR3을 암호화하는 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 하나의 양태에서, 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 기재된 J695 중쇄 CDR2를 추가로 암호화한다. 또 다른 양태에서, 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 추가로 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 기재된 J695 중쇄 CDR1를 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역(J695의 전체 VH 영역)을 암호화한다. 다양한 양태에서, 핵산은 예를 들면, 상기 섹션 11(A)(2) 및 11(B)에 기재된 바와 같이 상기한 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 암호화한다.

다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 기재된 J695 경쇄 CDR3을 암호화하는 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 하나의 양태에서, 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 추가로 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 기재된 J695 경쇄 CDR2를 암호화한다. 하나의 양태에서, 핵산은 추가로 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 기재된 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 J695 경쇄 CDR1을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 암호화한다(J695의 전체 VL 영역). 다양한 양태에서, 핵산은 추가로 예를 들면, 상기 섹션 11(A)(2) 및 11(B)에 기재된 바와 같이 상기한 하나 이상의 치환을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 암호화한다.

본 발명은 또한 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, 하나의 양태에서, 본 발명은 다음을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 제공한다: a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 중쇄; 및 b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 경쇄, 및 추가로, 예를 들면, 상기 섹션 11(A)(2) 및 11(B)에 기재된 상기한 하나 이상의 치환을 포함하는 것.

본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 재조합 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포를 제공한다. 또한 추가로 본 발명은 본 발명의 재조합 사람 항체가 합성될 때까지 본 발명의 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하여 본 발명의 재조합 사람 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 추가로 배양 배지로부터 재조합 사람 항체를 분리하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 항체를 발현하는 바람직한 포유동물 숙주 세포는 문헌[참조: R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 59:601-621]에 기재된 DHFR 선택 마커로서 사용되는 dhfr-CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)[참조: Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216- 4220], NSO 골수세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수세포를 사용하는 용도에서, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 기술된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 포유동물 숙주 세포로 도입되고, 항체는 숙주 세포를 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하는 충분한 시간 동안 배양하여, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 항체를 분비하여 제조한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

C. IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체의 특성

본 발명은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 특이적으로 결합하는 IL-12 및/또는 항-IL-23 항체의 항-p40 서브유닛(또한 본원에 각각 IL-12p40 항체 및 IL-23p40 항체로서 언급됨)을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 "특이적으로 결합하는" 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 K_d 1 x 10^-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-9 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10^-9 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-10 M 이하, 및 보다 바람직하게는 1 x 10^-10 M 이하, 및 보다 바람직하게는 1 x 10^-11 이하로 결합하는 항체를 언급하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 용어 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않음"은 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 높은 친화도를 갖고 결합하지 않음을 의미하고, 즉, 단백질 또는 세포에 1 x 10^-6 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10^-5 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10^-4 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10^-3 M 이상, 훨씬 보다 바람직하게는 1 x 10^-2 M 이상의 K_d로 결합한다.

본 발명에 제공된 IL-12 및/또는 항-IL-23 항체의 항-p40 서브유닛은 임의로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 높은 친화도를 특징으로 할 수 있다. 항체의 항원에 대한 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 측정할 수 있다[참조: Berzofsky, et al, "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); 및 본원에 기재된 방법]. 특정한 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 상태(예를 들면, 염 농도, pH)하에 측정되는 경우, 가변적일 수 있다. 따라서, 친화도의 측정치 및 다른 항원-결합 파라미터(예를 들면, K_a)는 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액, 예를 들면, 본원에 기재된 완충액으로 수행된다. IL-12/IL-23의 p40 서브유닛에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들면, ELISAs, 웨스턴 블롯 및 RIAs을 포함함). 항체의 결합 운동학(예를 들면, 결합 친화도)은 또한 예를 들면, ELISA, 스캐차드(Scatchard) 및 비아코어(Biacore) 분석에 의한 당해 기술분야에 공지된 표준 검정으로 평가될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "K_d"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 언급하는 것을 의도하고, 몰 농도(M)로서 표현된다. 항체에 대한 K_d 값은 당해 기술분야에서 잘 확립된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 항체의 K_d를 측정하는 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 사용하는 것이고, 바람직하게는 Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.

항체의 해리 속도 상수(k_off)는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로, 표면 플라스몬 공명 분석은 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.)을 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 리간드(예를 들면, 바이오센서 매트릭스 상에 고정된 재조합 사람 IL-12) 및 분석물(용액 중 항체) 간에 실시간 결합 상호작용을 측정한다. 표면 플라스몬 분석은 또한 분석물(바이오센서 매트릭스 상 항체)를 고정시키고, 리간드(예를 들면, 용액 중 재조합 IL-12)를 제공하여 수행할 수 있다.

구절 "표면 플라스몬 공명"은 바이오센스 매트릭스 내에 단백질 농도의 변화를 검출하여, 예를 들면, BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)을 사용하여 실시간 생체특이적 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상을 포함한다. 추가의 설명을 위해 문헌을 참조한다[참조: Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51 : 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11 :620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277].

특정한 양태에서, 본 발명에 제공된 항체는 IL-12(예를 들면, 사람 IL-12) 및/또는 IL-23(예를 들면, 사람 IL-23)의 p40 서브유닛에 광범위한 친화도(K_d)로 결합할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 높은 친화도로 사람 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합한다. 예를 들면, 항체는 약 10^-7 M 이하의 K_d로 사람 IL-12 및/또는 사람 IL-23의 p40 서브유닛에 결합할 수 있다(예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 0.1-9.9 (또는 임의의 범위 또는 그안의 값) x 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13 또는 임의의 범위 또는 그안의 값). 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 x 10^-6 M 이하의 K_d로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 x 10^-7 M 이하의 K_d로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 x 10^-8 M 이하의 K_d로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 x 10^-9 M 이하의 K_d로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 x 10^-10 M 이하의 K_d로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 x 10^-11 M 이하의 K_d로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 x 10^-12 M 이하의 K_d로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 x 10^-13 M 이하의 K_d로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합한다. 다양한 양태에서, 본 발명의 항체는 사이토킨 함유 p40 서브유닛에, 예를 들면, IL-12 및/또는 IL-23에 5 x 10^-8 M 이하의 K_d, 1 x 10^-8 M 이하의 K_d, 5 x 10^-9 M 이하의 K_d, l x 10^-9 M 이하의 K_d, 5 x 10^-10 M 이하의 K_d, 또는 1 x 10^-10 M 이하의 K_d로 결합한다.

특정한 다른 양태에서, 본 발명에 제공된 항체는, 표면 플라스몬 공명으로 측정되는 바와 같이, IL-12(예를 들면, 사람 IL-12) 및/또는 IL-23(예를 들면, 사람 IL-23)의 p40 서브유닛에 0.1 s^-1 이하의 k_off 속도 상수로 결합될 수 있다. 하나의 양태에서, 분리된 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23 항체의 p40 서브유닛, 또는 이의 항원-결합 단편은, IL-12, IL-23 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛으로부터 1 x 10^-2 s^-1 이하의 k_off 속도 상수로 해리된다. 보다 바람직한 양태에서, 분리된 IL-12 , IL-23 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23 항체의 p40 서브유닛, 또는 이의 항원-결합 단편은, IL-12, 및/또는 사람 IL-23, 및/또는 이의 p40 서브유닛으로부터 1 x 10^-3 s^-1 이하의 k_off 속도 상수로 해리된다. 보다 바람직한 양태에서, 분리된 IL-12, IL-23 및/또는 IL-12 및/또는 11-23 항체의 p40 서브유닛, 또는 이의 항원-결합 단편은, IL-12, 및/또는 IL-23, 및/또는 이의 p40 서브유닛으로부터 1 x 10^-4 s^-1 이하의 k_off 속도 상수로 해리된다. 보다 바람직한 양태에서, 분리된 IL-12, IL-23 및/또는 IL-12 및/또는 11-23 항체의 p40 서브유닛, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-12, 및/또는 IL-23, 및/또는 이들의 p40 서브유닛으로부터 1 x 10^-5 s^-1 이하의 k_off 속도 상수로 해리된다.

다양한 양태에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 중화될 수 있다. 본 발명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중화 활성은 본원에 기술된 하나 이상의 수개의 적합한 시험관내 검정을 사용하여 평가할 수 있다. "중화 항체"(또는 "IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성을 중화시키는 항체" 또는 "IL-12 및/또는 IL-23의 활성을 중화시키는 항체")는, 항체의 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛으로의 결합이 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 생물학적 활성(예를 들면, IL-12 및/또는 IL-23의 생물학적 활성)의 억제를 야기하는 항체를 포함한다. 이러한 생물학적 활성의 억제는 IL-12/23 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛 생물학적 활성의 하나 이상의 지시자, 예를 들면, 식물성혈구응집소 배아 증식 검정(PHA 검정)에서 사람 식물성혈구응집소 배아 증식의 억제, 사람 배아 세포에 의한 IL-12-유도된 인터페론 감마 생성의 억제(IFN 감마 검정), 또는 IL-12(또는 IL-23) 수용체 결합 검정(RBA 검정)에서 수용체 결합의 억제에 의해 측정되어 평가될 수 있고, 이러한 방법은 US 6,914,128에 상세하게 기술되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다. IL-12/23 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 생물학적 활성의 이들 지시자는 당해 기술분야에 공지된 하나 이상의 수개의 표준 시험관내 또는 생체내 검정에 의해 평가될 수 있다.

IL-12/IL-23 항체의 항-p40 서브유닛은 PHA 배아 증식(여기서, 증식은 IL-12에 의해 자극된다)을 억제하는 이들의 능력을 평가할 수 있다. 표준 검정에서, IL-12/IL-23 항체의 항-p40 서브유닛의 일련의 희석액은 1시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 230 pg/ml hIL-12를 사용하여 100 ml RPMI 경쟁 배지에서 미세역가 플레이트(U-버텀, 96-웰, Costar, Cambridge, MA)에서 예비항온배양한다. PHA 배아 세포를 분리하고, 1회 세척하고, RPMI 경쟁 배지에 3 x 10⁵ 세포/ml의 세포 밀도로 재현탁시킨다. PHA 배아(100 ml, 3 x 10⁴ 세포)를 항체/hIL-12 혼합물에 첨가하고, 3일 동안 37℃, 5% CO₂에서 항온배양하고, 4-6시간 동안 0.5 mCi/웰 (³H)-티미딘(Thymidine)(Amersham, Arlington Heights, IL)을 사용하여 표지화한다. 배양 내용물은 세포 수확기(Tomtec, Orange, CT)를 통해 유리 섬유 필터로 수확되고, 세포 DNA로의 (³H)-티미딘 도입은 액체 신틸레이션 계수에 의해 측정된다.

따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 시험관내 식물성혈구응집소 배아 증식 검정(PHA 검정)에서 식물성혈구응집소 배아 증식을 1 x 10^-6 M 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 시험관내 식물성혈구응집소 배아 증식 검정(PHA 검정)에서 식물성혈구응집소 배아 증식을 1 x 10^-7 M 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 시험관내 PHA 검정에서 식물성혈구응집소 배아 증식을 1 x 10^-8 M 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 시험관내 PHA 검정에서 식물성혈구응집소 배아 증식을 1 x 10^-9 M 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 시험관내 PHA 검정에서 식물성혈구응집소 배아 증식을 1 x 10^-10 M 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 시험관내 PHA 검정에서 식물성혈구응집소 배아 증식을 1 x 10^-11 M 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 시험관내 PHA 검정에서 식물성혈구응집소 배아 증식을 1 x 10^-12 M 이하의 IC₅₀으로 억제한다.

PHA 배아에 의한 IFNγ의 생성(여기서, 생성은 IL-12에 의해 자극된다)을 억제하는 IL-12/IL-23 항체의 항-p40 서브유닛의 능력은 다음과 같이 분석될 수 있다. 다양한 농도의 IL-12/IL-23 항체의 항-p40 서브유닛을 1시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 200-400 pg/ml hIL-12를 사용하여 100 ml RPMI 경쟁 배지에서 미세역가 플레이트(U-버텀, 96-웰, Costar)에서 예비항온배양한다. PHA 배아 세포를 분리하고, 1회 세척하고, RPMI 경쟁 배지에 1 x 1O⁷ 세포/ml의 세포 밀도로 재현탁시킨다. PHA 배아(100㎕의 1 x 10⁶세포)를 항체/hIL-12 혼합물에 첨가하고, 18시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 항온배양한다. 항온배양후, 150㎕의 세포 비함유 상청액을 각 웰로부터 빼내고, 생성된 사람 IFNγ의 수준을 ELISA(Endogen Interferon gamma ELISA, Endogen, Cambridge, MA)에 의해 측정한다.

따라서, 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 사람 배아 세포에 의한 IL-12-유도된 인터페론 감마 생성을 대략적으로 1.0 x 10^-8M의 IC₅₀ 값으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 사람 배아 세포에 의한 IL-12-유도된 인터페론 감마 생성을 대략적으로 1.0 x 10^-9M의 IC₅₀ 값으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 사람 배아 세포에 의한 IL-12-유도된 인터페론 감마 생성을 대략적으로 1.0 x 10^-10M의 IC₅₀ 값으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 사람 배아 세포에 의한 IL-12-유도된 인터페론 감마 생성을 대략적으로 1.0 x 10^-11nM의 IC₅₀ 값으로 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 결합하고, 사람 배아 세포에 의한 IL-12-유도된 인터페론 감마 생성을 대략적으로 1.0 x 10^-12M의 IC₅₀ 값으로 억제한다.

IL-23의 활성을 억제하는 IL-12/IL-23 항체의 항-p40 서브유닛의 능력은, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 방법 및 검정을 사용하여[참조: www.copewithcytokines.de, IL-23하에, IL-23 단백질, IL-23 검정 및 IL-12 검정에 대한 기술 및 참조를 위해, 이의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다] 및 본원에 기술된 바와 같이 분석할 수 있다. 예를 들면, 사람 IL-23은 IFN-감마의 생성을 PHA 배아 T-세포 및 기억 T-세포에 의해 자극하여 나타나고, 또한 둘 다의 세포 타입의 증식을 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, PHA 배아에 의해 IFNγ의 생성(여기서, 생성은 IL-23에 의해 자극된다)을 억제하는 IL-12/IL-23 항체의 항-p40 서브유닛의 능력은 IL-12의 문맥에서 상기된 바와 같이 분석될 수 있다. 추가로, IL-12/IL-23 항체의 항-p40 서브유닛은 PHA 배아 증식(여기서, 증식은 IL-23에 의해 자극된다)을 억제하는 이들의 능력을 IL-12의 문맥에서 상기된 바와 같이 평가할 수 있다. IL-23 및 IL-12 둘 다는 동일한 신호전달 분자를 활성화시키고, 여기에는 JAK2, TYK2, 및 STAT1, STAT3, STAT4, 및 STAT5이 포함된다. STAT4 활성화는 실질적으로 보다 약하고, 상이한 DNA-결합 STAT 복합체는 IL-12와 비교하여 IL-23에 반응하여 형성한다. IL-23은 베타-1 서브유닛에 결합하지만, IL-12 수용체의 베타-2 서브유닛에는 결합하지 않고, STAT 단백질 중 하나인, STAT4를 PHA 배아 T-세포에서 활성화시킨다. 따라서, PHA 배아 T-세포에서 STAT4의 활성을 억제하는 IL-12/IL-23 항체의 항-p40 서브유닛의 능력은 문헌에 기술된 검정으로 분석될 수 있다[참조: Parham et al. Journal of Immunology 168(11): 5699-5708 2002, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다]. 시모자토 등(Shimozato et al)[참조: Immunology 117(1): 22-28 (2006)]은 IL-23 기능 및, 특히 비장세포에서 IL-23 유도된 사이토킨(예를 들면, IFN-감마) 생성이 IL-12-p40의 p40 서브유닛에 의해 억제되고, 이는 IL-23 수용체에 결합하기 위해 경쟁하는 것으로 보고된다. 따라서, 비장세포에서 사이토킨, 예를 들면, IFN-감마의 활성을 억제하는 IL-12/IL-23 항체의 항-p40 서브유닛의 능력은, 예를 들면, 시모자토 등(Shimozato et al)에 의해 기술된 바와 같이 분석될 수 있고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 낮은 독성을 갖는다. 특히, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편(여기서, 가변 영역, 불변 영역 및 프레임워크와 같은 개별적인 부분(component)은 개별적으로 및/또는 총괄적으로 낮은 낮은 면역원성을 갖는다)은 본 발명에서 유용하다. 본 발명에 사용되는 항체는 임의로 연장된 기간 동안 환자를 치료하여 측정가능하게 증상이 완화되는 이들의 능력 및 낮은 및/또는 허용되는 독성으로 특성확인된다. 낮은 또는 허용되는 면역원성 및/또는 높은 친화도, 뿐만 아니라, 기타 적합한 특성은 성취되는 치료학적 결과에 영향을 미친다. "낮은 면역원성"은 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50% 미만으로 치료받은 환자에서 유의한 HAHA, HACA 또는 HAMA 반응을 상승시키는 것 및/또는 치료되는 환자에서 낮은 역가를 상승시키는 것(이중 항원 효소 면역검정으로 측정하여 약 300 미만, 바람직하게는 약 100 미만)으로 본원에서 정의된다[참조: Elliott et al., Lancet 344: 1125-1127 (1994), 전문이 본원에 참조로서 인용된다]. "낮은 면역원성"은 또한 동일하게 치료된 환자에서, 치료 기간 동안 요법의 추천된 코스에 대해 권장된 용량을 사용하여 치료된 환자의 25% 미만, 바람직하게는, 치료된 환자의 25% 미만으로 발생하는, 본 발명의 항-IL-12에 대한 항체 및/또는 항-IL-23 항체의 적정할 수 있는 수준의 정도(incidence)로서 정의될 수 있다.

본 발명의 항체는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛(예를 들면, 본원의 섹션 IV(A), IV(C) 및/또는 표 3 및 표 4에 기재된 바와 같은 단편, 도메인, 부위 또는 에피토프)로의 결합에 대해, 예를 들면, 표준 ELISA로 시험할 수 있다. 간략히, 미세역가 플레이트를 정제된 p40 서브유닛(또는 바람직한 p40 도메인)을 사용하여 PBS 중 0.25μg/ml에서 코팅하고, 이어서, PBS 중 5% 소혈청 알부민으로 블록킹한다. 항체의 희석액(예를 들면, 면역화된 마우스, 예를 들면, p40 서브유닛 도메인으로 면역화된 마우스로부터의 혈청의 희석액)을 각 웰에 첨가하고, 1-2시간 동안 37℃에서 항온배양한다. 플레이트를 PBS/Tween로 세척하고, 이어서, 알칼리성 포스파타제로 콘쥬게이트된 제2 시약(예를 들면, 사람 항체에 대해, 염소-항-사람 IgG Fc-특이 폴리클로날 시약)으로 1시간 동안 37℃에서 항온배양한다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질(1 mg/ml)로 전개시키고, 405-650의 OD에서 분석한다. 바람직하게는, 최고 역가를 전개시킨 마우스를 융합을 위해 사용할 것이다.

상기한 ELISA 검정을 또한 면역원을 사용하여 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 위한 스크리닝을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛(예를 들면, 본원의 섹션 IV(A), IV(C) 및/또는 표 3 및 표 4에 기재된 바와 같은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 단편, 도메인, 부위 또는 에피토프)에 대해 높은 결합활성으로 결합하는 하이브리도마는 서브클로닝되고, 추가로, 특성확인된다. (ELISA에 의해) 모 세포의 반응성을 유지하는 각 하이브리도마로부터의 하나의 클론은 -140℃에서 보관되는 5-10 바이알 세포 뱅크를 만들기 위해 및 항체 정제를 위해 선택될 수 있다.

항-IL-12 및/또는 IL-23 항체의 p40 서브유닛를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위해 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고, 단백질 A-세파로스로 친화도 크로마토그래피 전에 농축시킬 수 있다(Pharmacia, Piscataway, NJ). 용리된 IgG를 순도를 보장하기 위해 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 확인할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환할 수 있고, 농도를 1.43 흡광 계수를 사용하는 OD₂₈₀으로 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취화하고, -80℃에 보관할 수 있다.

선택된 모노클로날 항체가 고유 에피토프(unique epitopes)에 결합하는지를 측정하기 위해, 각 항체는 시판되는 시약(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 바이오티닐화될 수 있다. 비표지 모노클로날 항체 및 바이오티닐화 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛(예를 들면, 본원의 섹션 IV(A), IV(C) 및/또는 표 3 및 표 4에 기재된 바와 같은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 단편, 도메인, 부위 또는 에피토프)으로 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 상기한 바와 같이 수행될 수 있다. 바이오티닐화 mAb 결합은 스트렙-아비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출될 수 있다.

정제된 항체의 이소타입을 측정하기 위해, 이소타입 ELISA를 특정 이소타입의 항체에 대해 특정된 시약을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 사람 모노클로날 항체의 이소타입을 측정하기 위해, 미세역가 플레이트의 웰을 1μg/ml의 항-사람 면역글로불린으로 밤새 4℃에서 코팅할 수 있다. 1% BSA로 블록킹한 후, 플레이트를 1μg /ml 이하의 시험 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조군을 사용하여 주위온도에서 1 내지 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 사람 IgGl 또는 사람 IgM-특이 알칼리성 포스파타제-콘쥬게이트된 프로브 중의 어느 하나와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 전개시키고, 상기한 바와 같이 분석한다.

IL-12 및/또는 IL-23의 항-p40 서브유닛 사람 IgGs를 추가로 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛, 또는 이의 도메인으로 본원에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯팅에 의해 반응성을 시험할 수 있다. 간략히, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛(예를 들면, 본원의 섹션 IV(A), IV(C) 및/또는 표 3 및 표 4에 기재된 바와 같은 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 단편, 도메인, 부위 또는 에피토프)은 제조될 수 있고, 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스막으로 옮기고, 10% 소태아 혈청으로 블록킹하고, 시험될 모노클로날 항체로 프로빙한다. 사람 IgG 결합은 항-사람 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출될 수 있고, BCIP/NBT 기질 정제(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)로 전개시킬 수 있다.

에피토프 맵핑(Epitope mapping)은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 부위를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 수개의 방법이 이용가능하며, 이는 입체형태적 에피토프(conformational epitopes)의 맵핑을 추가로 허용한다. 예를 들면, 문헌에 기재된 방법[참조: Timmerman et al., Mol Divers. 2004;8(2):61-77]이 사용될 수 있다. 티머맨 등(Timmerman et al.)은 2개의 신규한 기술, 도메인 스캔(Domain Scan) 및 매트릭스 스캔(Matrix Scan)을 사용하여 불연속/입체형태적 에피토프(discontinuous/conformational epitopes)를 성공적으로 맵핑할 수 있었다. 문헌에 기술된 기술[참조: Ansong et al., J Thromb Haemost. 2006. 4(4):842-7]을 또한 사용할 수 있다. 앤송 등(Ansong et al.)은 항체 R8B12에 의해 인식된 불연속 에피토프를 맵핑하기 위해 친화도 지향된 질량 분석법을 사용하였다. 또한, 영상화 기술, 예를 들면, 프로테인 토모그래피(Protein Tomography)는 표적 RTKs에 결합하는 항체 또는 펩티드를 그리기 위해 사용할 수 있다. 프로테인 토모그래피는 분자 상호작용을 통찰하기 위해 이전에 사용되었고, 억제 항체가 EGFR의 도메인 III 결합, 이에 따른, EGFR의 경직되고 불활성 형태로의 잠금에 의해 작용하는 것을 나타내기 위해 사용되었다[참조: Lammerts et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008.105(16):6109-14]. 보다 전형적인 방법, 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이생성을 또한 불연속 에피토프를 맵핑하는데 적용할 수 있다. 불연속 에피토프에 참여하는 것으로 여겨지는 아미노산 영역을 선택적으로 돌연변이화하고, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에의 결합에 대해 검정할 수 있다. 영역의 어느 하나가 돌연변이화되는 경우 항체의 결합 불능은 결합이 아미노산 단편 둘 다에 의존한다는 것을 나타낼 수 있다. 상기한 바와 같이, 몇몇 선형 에피토프는 특정한 3차원 구조로 특성확인되고, 이는 본 발명의 모이어티를 결합하기 위해 존재하여야 한다. 이러한 에피토프는, IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛이 이의 본래 또는 폴딩된 상태인 경우 및 다시 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛이 변성되는 경우, 항체의 결합을 검정하여 발견될 수 있다. 결합이 폴딩된 상태에서만 발생하는 관찰은, 에피토프가 특정한 폴딩된 구조를 특징으로 하는 선형 에피토프 또는 폴딩된 단백질에 단지 존재하는 불연속 에피토프 중의 하나임을 나타낼 것이다.

VI . 본 발명의 항체를 포함한 약제학적 조성물 및 약제학적 투여

본 발명의 항체 및 항체-부분은 피검체의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용가능한 담체"로는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상, 및 이들의 조합이 포함된다. 다수의 경우, 등장제, 예를 들면, 당, 다가알콜(예를 들면, 만니톨, 소르비톨), 또는 염화 나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 소량의 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 항체 또는 항체 일부의 저장 수명 또는 유효성을 향상시킨다.

본 발명의 항체 및 항체-부분은 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 도입될 수 있다. 바람직하게, 항체 또는 항체-부분은 0.1 내지 250mg/ml 항체를 함유하는 주사가능한 용액으로서 제조될 것이다. 주사가능한 용액은 플린트 또는 앰버 바이알, 앰플, 또는 사전-충전된 시린지의 액체 또는 동결건조된 용량 형태 중 허느 하나로 이루어질 수 있다. 완충제(1 내지 50mM)는 L-히스티딘일 수 있고, pH 5.0 내지 7.0(최적 pH 6.0)에서 최적으로 5 내지 10mM이다. 다른 적합한 완충제로는 숙신산 나트륨, 시트르산 나트륨, 인산 나트륨 또는 인산 칼륨이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 염화 나트륨을 이용하여 용액의 독성을 0 내지 300mM(최적으로는 액체 용량 형태에 대해 150mM)의 농도로 변형시킬 수 있다. 동결보호제는 동결건조된 용량 형태에 대해 주로 0 내지 10%(최적으로 0.5 내지 1.0%) 슈크로스가 포함될 수 있다. 다른 적합한 동결보호제로는 트레할로스 및 락토스가 포함된다. 증량제(bulking agent)는 동결건조된 용량 형태에 대해 주로 1 내지 10%(최적으로 24%)의 만니톨이 포함될 수 있다. 안정화제는 액체 및 동결건조된 용량 형태 둘 다로 사용될 수 있고, 주로 1 내지 50mM(최적으로는 5 내지 10mM)의 L-메티오닌이 사용될 수 있다. 다른 적합한 증량제로는 글리신, 아르기닌이 포함되고, 0 내지 0.05%(최적으로 0.005 내지 0.01%)의 폴리소르베이트-80로서 포함될 수 있다. 추가의 계면활성제로는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물로는 항체가 약 0.01mg/kg 내지 10mg/kg의 용량으로 포함된다. 항체의 보다 바람직한 용량으로는 격주로 투여되는 1mg/kg, 또는 매주 투여되는 0.3mg/kg이 포함된다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 상기 형태로는 예를 들면, 액체, 반-고체 및 고체 용량 형태, 예를 들면 액체 용액(예를 들면, 주사가능한 용액 및 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포솜 및 좌제가 포함된다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료학적 적용에 의존한다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사가능하거나 주입가능한 용액의 형태로 존재하고, 예를 들면, 다른 항체를 이용한 사람의 수동적 면역화에 사용되는 것과 유사한 조성물이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.

치료학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균성이고 안정해야한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은, 적절한 용매 중에 요구된 양으로 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 일부)을 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 도입하고, 이어서 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 성분 중 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 동결건조된 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 스프레이-건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 주사가능한 용액의 지연된 흡수를 야기할 수 있다.

본 발명의 항체 및 항체-부분은 당해 분야에 공지되어 있는 각종 방법에 의해 투여될 수 있지만, 다수의 치료학적 적용에 대해 바람직한 투여의 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자에게 이해될 것인 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 다를 것이다. 소정 실시형태에서, 활성 화합물은, 상기 화합물을 신속한 방출에 대해 보호할 담체, 예를 들면, 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 제어된 방출 제형과 함께 제조될 것이다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생체분해성, 생체적합성 다량체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 다수의 방법은 특허출원되어 있거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.]을 참조한다.

소정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항체 일부는, 예를 들면, 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 또한, 이러한 화합물(및 필요한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나, 정제로 압착되거나, 또는 피검체 식이에 직접 포함될 수도 있다. 경구 치료 투여용인 경우, 상기 화합물은 부형제와 함께 도입되어 섭취성 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 이외의 방식으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서는 화합물을 불활성화 방지용 물질로 피복하거나 또는 상기 방지용 물질과 함께 공동 투여할 필요가 있을 수 있다.

또한, 보충적 활성 화합물도 상기 조성물에 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는 IL-12 및/또는 IL-23 활성이 유해한 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 공동제형화되고/되거나 공동투여된다. 예를 들면, 항-IL-12, 항-IL-23 및/또는 본 발명의 항-p40 항체 또는 항체 일부는 다른 표적(예를 들면, 다른 사이토카인에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)에 결합하는 하나 이상의 추가의 항체와 공동제형화 및/또는 공동투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 상술한 치료제 중 2종 이상과 병용하여 사용될 수 있다. 이러한 병용 치료요법은 투여되는 치료제를 보다 낮은 용량으로 유리하게 사용할 수 있게 하므로 각종 단독치료요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있으므로 바람직하다. 본 발명의 항체가 병용 치료요법의 일부로 사용되는 경우, 항체가 단독으로 피검체에 투여되는 경우보다 더욱 낮은 용량의 항체가 바람직할 수 있다는 것은 당업자에게 이해될 것이다(예를 들면, 상승적 치료 효과는 결과적으로 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 보다 낮은 용량의 항체를 사용하도록 하는 병용 치료요법의 사용을 통해 달성될 수 있다).

인터류킨 12 및/또는 23은 면역 및 염증 요소를 포함하는 각종 질환과 관련된 병리학에서 주요한 역할을 한다. 이들 질환으로는 류마티스 관절염, 골 관절염, 소아 만성 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신성 홍반성 낭창, 크론 질환, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 피부염 강피증, 아토피성 피부염, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 죽상 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키 질환, 그레이브스 질환, 신 증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충성 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변증, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전, 심근 경색, 애디슨 질환, 산발성 다선성 결핍증 I형 및 다선성 결핍증 II형, 슈미트 증후군, 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모, 원형 탈모, 혈청반응음성 관절병증, 관절증, 라이터 질환, 건선성 관절병증, 궤양성 결장염성 관절병증, 장병증성 활막염, 클라미디아, 여시니아 및 살모넬라 관련 관절병증, 척추관절병증, 아테롬성 질환/죽상 동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 유천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 소아 악성 빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리 질환, 만성 피부점막 캔디다증, 거대 세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍증 관련 질환, 간염 C, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근병증, 여성 불임, 난소 부전, 조기 난소 부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유성 폐포염, 염증-후 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 혼합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신성 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염성 범발성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤성 폐 질환, 감염 후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(전형적인 자가면역 간염 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증을 갖는 B형 인슐린 내성, 부갑상선 기능 저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골 관절증, 원발성 경화성 담관염, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임 질환, 원판상 홍반성 낭창, 남성 불임 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압, 굿 패스튜어 증후군, 결절성 다발성 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스 발열, 류마티스성 척추염, 스틸스 질환, 전신 경화증, 다카야스 질환/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 갑상선종 자가면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 질환), 위축성 자가면역 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염 및 백반증이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 사람 항체 및 항체 일부는 자가면역 질환, 특히 류마티스 척추염, 알레르기, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 소정 양상에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 항체 중 어느 하나 또는 이의 조합의 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항체 또는 항체의 조합은 질환 또는 장애를 개선하는데 유효한, 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형체와 함께 투여된다.

바람직하게, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부를 사용하여 하기에 보다 상세하게 기재되는 바와 같이 류마티스 관절염, 크론 질환, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 진성 당뇨병 및 건선을 치료한다.

또한, 본 발명의 사람 항체, 또는 항체 일부는 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 이러한 질환을 치료하기 위해 단독으로 또는 병용하여 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 단독으로 또는 추가의 제제, 예를 들면, 치료제와 병용하여 사용될 수 있고, 상기 추가의 제제는 의도되는 목적에 따라 당업자에 의해 선택된다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들면, 추가의 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 치료하는데 유용한 것으로 당해 분야에 인식되는 치료제일 수 있다. 또한, 추가의 제제는 치료학적 조성물에 유리한 속성을 부여하는 제제, 예를 들면, 조성물의 점성에 영향을 미치는 제제일 수 있다.

본 발명의 범위에 포함되어야 하는 배합물은 의도된 목적에 유용한 이들 배합물임이 추가로 이해되어야만 한다. 하기에 제시되는 제제는 예시 목적이고, 한정되도록 의도되는 것은 아니다. 본 발명의 일부인 배합물은 본 발명의 항체, 및 하기 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 제제일 수 있다. 또한, 형성된 조성물이 의도된 기능을 수행할 수 있도록 하는 조합인 경우, 하나 이상의 추가의 제제, 예를 들면, 2개 또는 3개의 추가의 제제를 포함할 수 있다.

따라서, 추가의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 항-감염성 약물, 심혈관(CV)계 약물, 중추 신경계(CNS) 약물, 자율 신경계(ANS) 약물, 호흡관 약물, 위장관(GI) 약물, 호르몬 약물, 유체 또는 전해질 균형을 위한 약물, 혈액학적 약물, 항신생물제, 면역조절 약물, 이비인후과 약물, 국소 약물, 영양학적 약물 등 중 하나 이상으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 단백질의 유효량을 임의로 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약물은 본원에 제시된 각각에 대해 제형, 지침, 용량 및 투여를 포함하여 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들면, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21.sup.st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J.; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, Conn. 참조, 이들 문헌은 각각 전문이 본원에 참조로 인용된다).

바람직한 배합물은 이부프로펜과 같은 약물을 포함하는 NSAID로서도 나타내는 비스테로이드성 소염 약물(들)이다. 다른 바람직한 배합물은 프레드니솔론을 비롯한 코르티코스테로이드류이고; 본 발명의 항-IL-12 항체와 병용하여 환자를 치료하는 경우, 필요한 스테로이드 용량을 점점 감소시켜 스테로이드 사용의 공지된 부작용이 감소되거나 심지어 제거될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 일부과 병용될 수 있는 류마티스 관절염용 치료제의 비제한적 예로는 하기가 포함된다: 사이토카인 저해성 소염 약물(CSAID)(들); 다른 사람 사이토카인 또는 성장인자(예를 들면, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF)에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90, 또는 CD154(gp39 또는 CD40L)을 포함하는 이들의 리간드와 같은 세포 표면 분자에 대한 항체와 조합될 수 있다.

치료제의 바람직한 배합물은 자가면역 및 후속적 염증 캐스캐이드의 여러 지점에서 방해할 수 있고; 바람직한 예로는 TNF 길항제, 예를 들면, 키메라, 사람화된 또는 사람 TNF 항체, D2E7(1996년 2월 9일에 출원된 미국 특허 출원 제 08/599,226호), cA2(Remicade.TM.), CDP 571, 항-TNF 항체 단편(예를 들면, CDP870), 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이들의 유도체, (p75TNFRIgG (Enbrel.TM.) 또는 p55TNFRIgG(Lenercept), 가용성 IL-13 수용체(sIL-13), 및 또한 TNF.알파. 전환 효소(TACE) 억제제가 있고; 유사하게 IL-1 억제제(예를 들면, 인터류킨-1-전환 효소 억제제, Vx740, 또는 IL-1RA 등)는 동일한 이유로 유효하다. 다른 바람직한 배합물로는 인터류킨 11, 항-P7s 및 p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL)가 포함된다. 또 다른 바람직한 배합물은 IL-12 기능과 병행하거나, IL-12 기능에 의존적이거나 IL-12 기능과 협동적인 작용을 할 수 있는 자가면역 반응의 다른 주요 작용인자이고; 특히 IL-18 항체 또는 가용성 IL-18 수용체를 포함하는 IL-18 길항제 또는 IL-18 결합 단백질이 바람직하다. IL-12와 IL-18이 중복되지만 독특한 기능을 보유하여, 이 둘에 대한 길항제의 배합물이 가장 효과적일 수 있음이 밝혀졌다. 또 다른 바람직한 배합물은 비고갈성 항-CD4 억제제이다. 또 다른 바람직한 배합물로는 공동자극 경로의 길항제 CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2), 예를 들면, 항체, 가용성 수용체 또는 길항제성 리간드 등이 포함된다.

또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린 설파살라진, 메살라진, 올살라진 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 오로티오말레이트(근육내 및 경구), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사), 베타-2 아드레날린수용체 효능제(살부타몰, 터부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, 전염증성 사이토카인, 예를 들면 TNF 알파 또는 IL-1에 의한 신호 전달을 방해하는 제제(예를 들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1 베타 전환 효소 억제제(예를 들면, Vx740), 항-P7s, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNFα 전환 효소(TACE) 억제제, T-세포 신호 전달 억제제(예: 키나제 억제제), 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체 및 이의 유도체(예, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFRIgG(Enbrel™ 및 p55TNFRIgG(Lenercept)), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)), 소염성 사이토카인(예, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGF 베타) 등의 제제와도 배합될 수 있다. 바람직한 배합물로는 메토트렉세이트 또는 레플루노미드가 포함되며, 보통 또는 중증 류마티스 관절염 증례에는 사이클로스포린이 포함된다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부가 배합될 수 있는 염증성 장 질환에 유용한 치료제의 비제한적 예로는 하기가 포함된다: 부데노사이드; 표피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린, 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-머캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리폭시게나제 억제제; 메살라민; 올살라진; 발살라지드; 항산화제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 길항제; 항-IL-1α 모노클로날 항체; 항-IL-6 모노클로날 항체; 성장 인자; 엘라스타제 억제제; 피리디닐-이미다졸 화합물; 다른 사람 사이토카인 또는 성장 인자, 예를 들면, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF 등에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 세포 표면 분자, 예를 들면, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이들의 리간드에 대한 항체와 조합될 수도 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 제제, 예를 들면, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNF 알파 또는 IL-1과 같은 전염증성 사이토카인에 의한 신호 전달을 방해하는 제제(예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1 베타 전환 효소 억제제(예를 들면, Vx740), 항-P7s, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNF 알파 전환 효소 억제제, T-세포 신호 전달 억제제, 예를 들면, 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체 및 이의 유도체(예를 들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) 및 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)), 및 소염성 사이토카인(예를 들면, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)와 같은 제제와도 배합될 수 있다.

항체 또는 항원 결합부가 배합될 수 있는 크론 질환용 치료제의 바람직한 예로는 하기가 포함된다: TNF 길항제, 예를 들면, 항-TNF 항체, D2E7(1996년 2월 9일에 출원된 미국 특허 출원 제 08/599,226호), cA2(Remicade.TM.), CDP 571, 항-TNF 항체 단편(예를 들면, CDP870), TNFR-Ig 작제물, (p75TNFR1gG(ENBREL) 및 p55TNFRIgG(Lenercept), 항-P7s, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), 가용성 IL-13 수용체(sIL-13), 및 PDE4 억제제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 코르티코스테로이드, 예를 들면, 부데노사이드 및 덱사메타손과 배합될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 설파살라진, 5-아미노살리실산 및 올살라진과 같은 제제, 및 전염증성 사이토카인, 예를 들면 IL-1, 예를 들면 IL-1 전환 효소 억제제(예를 들면, Vx740) 및 IL-1ra의 합성 또는 작용을 방해하는 제제와 배합될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 T 세포 신호 전달 억제제, 예를 들면, 티로신 키나제 억제제 6-머캅토퓨린과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 IL-11과 배합될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부과 배합될 수 있는 다발성 경화증용 치료제의 비제한적 예로는 하기가 포함된다: 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 메틸프레드니솔론; 아자티오프린; 사이클로포스파미드; 사이클로스포린; 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 티자니딘; 인터페론-베타 1a(AVONEX; Biogen); 인터페론-베타 1b(BETASERON; Chiron/Berlex); 코폴리머 1(Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라브리빈; 다른 사람 사이토카인 또는 성장인자, 예를 들면, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90과 같은 세포 표면 분자 또는 이의 리간드에 대한 항체와 조합될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부는 또한 제제, 예를 들면, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNF 알파 또는 IL-1과 같은 전염증성 사이토카인에 의한 신호 전달을 방해하는 제제(예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1 베타 전환 효소 억제제(예를 들면, Vx740), 항-P7s, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TACE 억제제, T-세포 신호 전달 억제제, 예를 들면, 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체 및 이의 유도체(예, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 소염성 사이토카인(예, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFβ)과 배합될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부와 배합될 수 있는 다발성 경화증용 치료제의 바람직한 예로는 인터페론 베타, 예를 들면, IFN 베타1a 및 IFN 베타1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, IL-1 억제제, TNF 억제제 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체가 포함된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 항체 일부의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 목적하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 용량으로 필요한 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 상기 항체 또는 항체 일부의 치료학적 유효량은 질환 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중과 개체 내에서 목적하는 반응을 유도해내는 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 치료학적으로 유익한 효과가 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"은 목적하는 예방학적 결과를 달성하기 위해 필요한 용량으로 필요한 시간 동안의 유효한 양을 의미한다. 전형적으로, 예방학적 용량은 질환의 초기 단계 전이나 초기 단계에 피검체에 사용되기 때문에 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적은 양일 것이다.

투약 계획은 목하는 최적 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 1회의 일시주사를 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여할 수도 있으며 또는 치료 상황의 위급성에 따라 비례하여 감소 또는 증가된 용량을 투여할 수도 있다. 특히, 투여의 용이성과 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 용량 단위 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 용량 단위 형태는 치료되는 포유동물 피검체에 대하여 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하고; 각 단위는 요구되는 약제학적 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 용량 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 수득하고자 하는 특정 치료 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체의 민감도 치료에 있어서 상기 활성 화합물을 배합하는 기술 고유의 제한에 따라 결정되고 직접 좌우된다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 비제한의 예시적 범위는 0.1 내지 20mg/kg, 더 바람직하게는 1 내지 10mg/kg, 더욱 더 바람직하게는 0.3 내지 1mg/kg이다. 용량 값이 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 다양할 수 있음을 주지해야 한다. 또한, 임의의 특정 피검체에 대해 특정 투약 요법이 개체의 필요 및 조성물 투여를 관리하거나 감독하는 자의 전문가적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본 명세서에 제시된 용량 범위는 예시적일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아님을 명심해야 한다.

한 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 출원 제12/625,057호(특허 공개 제US 2010-0172862 A2호)에 개시된 약제학적 조성물에 포함된다.

VII . 본 발명의 항체의 용도

IL-12, IL-23 및/또는 p40 서브유닛에 결합하는 이들의 능력이 제공되면, 본 발명의 항체 또는 이의 일부(예를 들면, 이의 단편의 항원 결합부)는 통상의 면역분석법, 예를 들면, 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 방사선면역분석법(RIA) 또는 조직 면역조직화학법을 이용하여 IL-12, IL-23 및/또는 p40 서브유닛(예를 들면, 생물학적 샘플, 혈정 또는 혈장)을 검출하는데 사용할 수 있다.

따라서, 다른 양상에서, 본 발명은, 생물학적 샘플 중의 IL-12, IL-23 및/또는 p40 서브유닛을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은, 본 발명의 항체 또는 항체 일부와 생물학적 샘플을 접촉시키고, IL-12, IL-23 및/또는 p40 서브유닛에 결합된 항체 또는 미결합 항체(또는 항체 일부)를 검출하여 생물학적 샘플 중의 IL-12, IL-23 및/또는 p40 서브유닛을 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플 중의 IL-12, IL-23 및/또는 p40 서브유닛을 검출하는 방법을 제공한다. 항체는 결합 또는 미결합된 항체의 검출을 촉진시키기 위해 직간접적으로 검출가능한 물질로 표지화된다. 적합한 검출가능한 물질로는 각종 효소, 보결분자족, 형광 물질, 발광 물질 및 방사능 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예로는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제가 포함되고; 적합한 보결분자족 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되며; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 포함되며; 적합한 방사능 물질의 예로는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H이 있다.

표지화의 대안으로, 항체, IL-12, IL-23 및/또는 p40 서브유닛은, 검출가능한 물질로 표지된 재조합체("r") IL-12 및/또는 rIL-23 및/또는 rp40 표준물 및 비표지된 항-IL-12 및/또는 항-IL-23 및/또는 항-p-40 서브유닛 항체를 이용하는 경쟁 면역분석에 의해 생물학적 유체에서 분석될 수 있다. 이러한 분석에서, 생물학적 샘플, 표지된 rIL-12 및/또는 rIL-23 및/또는 rp40 표준물 및 항-hIL-12 및/또는 항-IL-23 및/또는 항-p40 서브유닛 항체는 조합되고, 비표지된 항체에 결합된 표지된 rIL-12 및/또는 rIL-23 및/또는 rp40 표준물의 양이 측정된다. 생물학적 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23 및/또는 p40 서브유닛의 양은 각각 항-IL-12 및/또는 항-IL-23 및/또는 항-p40 항체에 결합된 표지된 rIL-12 및/또는 rIL-23, 및/또는 rp40 서브유닛 표준물에 반비례한다.

또한, Y61 및 J695를 포함하는, 본 발명에 포함되는 항체는, 사람 이외의 종 유래의 IL-12, 특히, 영장류 유래의 IL-12 및/또는 IL-23 및/또는 p40을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, Y61은 사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이에서 IL-12를 검출하는데 사용될 수 있다. J695는 사이노몰거스 원숭이, 레서스 원숭이, 및 바분에서 IL-12d를 검출하는데 사용될 수 있다. 그러나, 항체는 마우스 또는 래트 IL-12와 교차 반응하지 않는다.

본 발명의 항체 및 항체 일부는 시험관내 및 생체내에서 IL-12, IL-23 및/ 또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 일부는, 사람 피검체에서, 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 IL-12 및/또는 IL-23, 및/또는 p40을 갖는 다른 포유동물 피검체(예를 들면, 바분, 사이노몰거스 및 레서스와 같은 영장류)에서, 예를 들면, 이들을 함유하는 세포 배양액에서, IL-12 및/또는 IL-23 및/또는 p40 활성을 억제시키는데 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 사람 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛, 및 바분 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛, 마모셋 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛, 침팬지 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛, 사이노몰거스 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛, 레서스 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 영장류 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성을 중화시키지만 마우스 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛은 중화시키지 않는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공한다. 바람직하게, IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛은 사람 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛이다. 예를 들면, 사람 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 세포 배양액에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 배양 배지에 첨가하여 배양액 중의 사람 IL-12, IL-23, 및/또는 사람 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛 활성을 억제할 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명은, IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성을 억제시키기 위한 방법을 제공한다. IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛은 광범위한 장애의 병태생리학에 관련되었다(Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985- 1996; Morita et al. (1998) Arthritis and Rheumatism. 41 : 306-314; Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367; Fais et al. (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Pyrronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112: 1169- 1178, and Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152:667-672; Pyrronchi et al (1997) Am. J. Path. 150:823- 832). 본 발명은 이러한 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성을 억제시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 피검체에게 투여하여 피검체에서 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성이 억제되도록 하는 것을 포함한다. 바람직하게, IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛은 사람 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛이고, 피검체는 사람 피검체이다. 대안으로, 피검체는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 발현하는 포유동물일 수 있다. 또 다른 피검체는 사람 IL-12, 사람 IL-23, 및/또는 사람 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛이 도입된(예를 들면, 사람 IL-12, 사람 IL-23, 및/또는 사람 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 투여에 의해 또는 사람 IL-12, 사람 IL-23, 및/또는 사람 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛 전이유전자의 발현에 의해) 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료학적 목적을 위해 사람 피검체에게 투여될 수 있다(하기에 추가로 논의됨). 또한, 본 발명의 항체는, 수의학적 목적을 위해 또는 사람 질환의 동물 모델로서, 항체가 교차-반응하는 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛을 발현하는 비-사람 포유동물에게 투여될 수 있다. 후자에 관하여, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료학적 효능을 평가하기 위해 유용할 수 있다(예를 들면, 용량의 시험 및 투여 시간 과정).

본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성이 유해한 장애"는, 장애를 앓고 있는 피검체에서의 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 존재가, 장애의 병태생리학에 책임이 있거나 책임이 있는 것으로 의심되거나 또는 장애를 악화시키는 것에 기여하는 인자인 것으로 밝혀진, 질환 및 다른 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성이 유해한 장애는, IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성의 억제가 상기 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 기대되는 장애이다. 이러한 장애는, 예를 들면, 장애를 앓고 있는 피검체의 생물학적 유체에서의 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 농도의 증가(예를 들면, 피검체의 혈청, 혈장, 활막액 등에서의 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 농도의 증가)에 의해 입증될 수 있고, 이는 예를 들면, 상기 기재된 바와 같은 항-IL-12, 항-IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23d의 항-p40 서브유닛을 이용하여 검출될 수 있다. IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 활성이 유해한 장애의 다수의 예가 존재한다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 치료요법에서 사용되어 본원에 기재된 질환 또는 장애를 치료할 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 본원에 기재된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위해 사용될 수 있다.

추가의 양상에서, 본 발명은 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 발현, 양, 및/또는 활성 중 하나 이상, 및/또는 생물학적 샘플 중의 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 발현, 양, 및/또는 활성 중 하나 이상을 조절하는 제제를 선별하는 방법을 제공하고, 이 방법은, 시험되는 샘플, 예를 들면, 세포, 조직, 기관 또는 연구되는 피검체를 제공하는 단계; 본 발명의 항체(여기서, 상기 항체는 검출가능한 표지를 포함하거나, 또는 상기 항체는 검출가능한 표지를 갖는 제2 분자에 의해 검출가능하다)를 제공하는 단계; 시험 샘플을 시험 제제, 예를 들면, 소분자 화합물 또는 바이오폴리머로 치료하는 단계; 시험 샘플을 항체와 접촉시키는 단계; 및 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 발현, 양, 및/또는 활성, 및/또는 샘플 중의 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 발현, 양, 및/또는 활성을 검출하고/하거나 측정하는 단계(여기서, IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 발현, 양, 및/또는 활성 중 하나 이상의 증가 또는 감소, 및/또는 미치료된 샘플에 대한 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 발현, 양, 및/또는 활성 중 하나 이상의 증가 또는 감소는, IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 발현, 양, 및/또는 활성 중 하나 이상, 및/또는 샘플 중의 IL-12, IL-23, 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛 발현, 양, 및/또는 활성 중 하나 이상을 조절할 수 있는 제제의 지표이다)를 포함한다.

몇몇 비-제한적 특정 장애의 치료에 있어서 본 발명의 항체 및 항체 일부를 사용하는 것은 하기에 추가로 논의된다:

류마티스 관절염

인터류킨-12는 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환에서 역할을 행하는데 관여되어 왔다. 유도가능한 IL-12 p40 메세지는 류마티스 관절염 환자 유래의 활막에서 검출되었고, IL-12는 류마티스 관절염을 지닌 환자 유래의 활막액에 존재하는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, Morita et al, (1998) Arthritis and Rheumatism 41 : 306-314 참조). IL-12 양성 세포는 류마티스 관절염 활막의 서브라이닝층에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 사람 항체 및 항체 일부는, 예를 들면, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 라임 관절염, 류마티스 척추염, 골 관절염 및 통풍성 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 항체 또는 항체 일부는 전신적으로 투여되지만, 소정 장애에 대해서는 항체 또는 항체 일부의 국소 투여가 유리할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는 자가면역 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여될 수 있다.

류마티스 관절염에 관한 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 뮤린 모델에서, 항-IL-12 mAb(래트 항-마우스 IL-12 모노클로날 항체, C17.15)을 이용한 마우스의 치료는 관절염에 앞서 발병을 완전하게 억제하였고, 질환의 발병률 및 중증도를 감소시켰다. 관절염의 발병 후 초기에 항-IL-12 mAb를 이용한 치료는 중증도를 감소시켰지만, 질환의 발병 후 항-IL-12mAb를 이용한 마우스의 후치료는 질환 중증도에 최소의 영향을 가졌다.

크론 질환

또한, 인터류킨-12는 염증성 장 질환, 크론 질환에서도 역할을 행한다. FN-감마 및 IL-12의 증가된 발현은 크론 질환을 지닌 환자의 장 점막에서 발생한다(예를 들면, Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Pyrronchi et al., (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berrebi et al., (1998) Amer. J. Pathol. 152: 667-672 참조). 항-IL-12 항체는 결장염의 마우스 모델, 예를 들면, TNBS 유도된 결장염 IL-2 녹아웃 마우스, 및 최근 IL-10 녹아웃 마우스에서 질환을 저해하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 일부는 염증성 장 질환의 치료에 사용될 수 있다.

다발성 경화증

인터류킨-12는 다발성 경화증의 주요 매개인자로서 관여되어 왔다. 유도가능한 IL-12 p40 메세지 또는 IL-12 자체의 발현은 다발성 경화증을 지닌 환자의 병변에서 확인될 수 있다(Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med 182: 1985-1996, Drulovic et al., (1997) J. Neurol. Sci. 147: 145-150). 다발성 경화증을 지닌 만성 진행성 환자는 IL-12의 순환 수준을 상승시켰다. 다발성 경화증을 지닌 환자 유래의 T-세포 및 항원 제시 세포(APC)를 이용한 조사는 Th1-형 면역 반응을 유도하는 진행성 다발성 경화증의 근거로서 자기-영구화 시리즈의 면역 상호작용을 나타냈다. T 세포로부터의 증가된 IFN-감마의 분비는 APC에 의한 IL-12 생산을 증가시키고, 이는 Th1-형 면역 활성화 및 질환의 만성 상태를 초래하는 주기를 영구화시킨다(Balashov et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 599-603). 다발성 경화증에 있어서 IL-12의 역할은 다발성 경화증의 마우스 및 래트 실험적 알레르기성 뇌척수염 모델을 이용하여 조사되었다. 마우스의 다발성 경화증의 재발성-감퇴 EAE 모델에서, 항-IL-12 mAb를 이용한 사전치료는 마비를 지연시켰고 임상학적 스코어를 감소시켰다. 마비의 피크에서 또는 후속적인 완화기간 동안에 항-IL-12 mAb를 이용한 치료는 임상학적 스코어를 감소시켰다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 사람에서 다발성 경화증과 관련된 증상을 완화시키는 작용을 할 수 있다.

인슐린-의존성 진성 당뇨병

인터류킨-12는 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM)의 중요한 매개인자로서 관여되어 왔다. IDDM은 IL-12의 투여에 의해 NOD 마우스에서 유도되었고, 항-IL-12 항체는 IDDM의 양자 전이 모델에서 보호성이었다. 발병 초기의 IDDM 환자는 대개 몇몇 잔여 섬 세포 기능이 유지되는 소위 "완해기(honeymoon period)"을 경험한다. 이들 잔여 섬 세포는 인슐린을 생산하고, 투여된 인슐린보다 우수하게 혈당 수준을 조절한다. 항-IL-12 항체를 이용한 이들 발병 초기 환자의 치료는 추가로 섬 세포의 파괴를 예방하여 인슐린의 내인성 공급원을 유지할 수 있다.

건선

인터류킨-12는 건선에서 주요 매개인자로서 관여되어 왔다. 건선은 TH1-형사이토카인 발현 프로파일과 관련된 급성 및 만성 피부 병변을 포함한다(Hamid et al. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1:225-231; Turka et al. (1995) Mol. Med. 1:690-699). 질환을 지닌 사람 피부 샘플에서 IL-12 p35 및 p40 mRNA가 검출되었다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 건선과 같은 만성 피부 장애를 완화시킬 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합부를 이용하여 각종 형태의 건선, 예를 들면, 플라크 건선 및 만성 건선을 치료할 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 중간 내지 중증 건선 등의 각종 중증도의 건선을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되고, 하기 실시예는 어떠한 방법으로도 제한하지 않도록 구성되어야 한다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 문헌 참조, 발행된 특허, 공개된 특허 출원을 포함한 인용된 모든 참조문헌은 본원에 참조로 인용된다. 표의 모든 내용은 참조에 의해 인용된다는 것이 추가로 이해되어야 만 한다.

실시예

본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 설명되고, 이는 추가로 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용 뿐만 아니라, 도면은 이의 전문이 참조로서 명백히 본원에 인용되어 있다.

실시예 1: 단백질 발현 및 정제

A. 사람 모노클로날 항체 J695의 제조 및 검정.

J695는 1,000리터 생물반응기에서 배양된 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주 ALP905(참조, 예를 들면, PCT 공보 번호 WO0056772 A1)로부터 분비되었다. 여과에 의한 CHO 세포의 제거 다음에, mAb를 양이온 교환, 음이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. J695를 5 mM L-시스티딘, 5 mM L-메티오닌, 0.5% 수크로스, 2% D-만니톨, 0.005% 폴리소르베이트-80, pH 6.0에서 71.8mg/ml로 농축시키고, -80℃로 동결시켰다. 비아코어(Biacore), PHA 블라스트(blast), 및 RB 검정은 PCT 공보 번호 WO0056772 A1에 기재된 바와 같이 수행하였고, 이의 전문은 본 발명에 참조로서 인용된다.

B. J695 Fab 단편의 제조.

J695를 20 mM 포스페이트, 2.5 mM 시스테인ㆍHCl, 10 mM EDTA, pH 7.0을 사용하여 20mg/ml로 희석하고, 이어서, 1% 고정된 파파인(cat. # 20341, Pierce Endogen, Rockford, IL) 및 2.5 mM 시스테인ㆍHCl을 함유하는 용액에서 밤새 37℃에서 소화하였다. 파파인을 원심분리(15 min, 3200g)하여 제거하고, 상청액을 20 mM NaH₂P0₄, 150 mM NaCl, pH 7의 일부로 희석시키고, 4℃에서 동일한 완충액에서 평형화된 Hi-trap 단백질 A 컬럼(cat. #17-0402-03, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 통해 통과시켰다. Fab를, 통과하는 유동에서 분리시키고, 4mg/ml로 원심분리에 의해 농축시키고(cat. # UFV4BGC25, Millipore Corporation, Bedford, MA), 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.0으로 투석하였다. Fab를 결정화를 위해 55mg/ml로 추가로 농축시켰다. Fab 농도를 UV 흡광도에 의해 280 nm에서 6 M 구아니딘ㆍHCl, 20 mM NaH₂P0₄, 150 mM NaCl, pH 7.0(ε = 0.67 M^-1cm^-1) 중에서 측정하였다[참조: Gill, S. C. and P. H. von Hippel (1989). "Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data." Anal. Biochem. 182(2): 319-326].

C. J695 Fab/IL-12 p70 복합체의 제조.

IL-12 p70은 안정한 CHO 세포주로부터 발현되었다. 세포 상청액을 Q-세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow), CM-세파로스 패스트 플로우, 페닐 세파로스 고 치환(High Substitution) 패스트 플로우, 나선 카트리지 농축기 및 세파크릴 S-200 고 해상도(High Resolution)로 구성된 수개의 컬럼을 통해 정제하였다. 마지막 컬럼 완충액은 PBS pH7.4이고, 이는 최종 IL-12 p70 저장 완충액이다. 상기와 같이 생성된 J695 Fab를 갖는 복합체는 Fab 및 IL-12 p70 등몰량을 혼합하고, 이어서, 크기 배제 크로마토그래피로 복합체를 분리하여 형성되었다.

실시예 2: 단백질 결정화.

A. J695 Fab 결정 형태 I의 결정화.

J695 Fab는 현적(hanging-drop) 증기 확산 방법을 사용하여 결정화되었다. J695 Fab(1㎕)를 1㎕의 저장소 용액(25% PEG 4000, 0.1 M Na 시트레이트, pH 5.6, 0.2 M (NH₄)₂S0₄)과 혼합하고, 18℃에서 평형화시켰다. 보석-유사 결정이 0.125 x 0.125 x 0.05 mm의 치수로 7일내에 형성되었다. 이들 결정은 "결정 형태 I"로서 본원에서 언급된다.

B. J695 Fab 결정 형태 II의 결정화.

J695 Fab는 현적 증기 확산 방법을 사용하여 결정화되었다. J695 Fab(1㎕)를 1㎕의 저장소 용액(12% PEG 4000, 0.1 M Tris, pH 8.5)과 혼합하고, 4℃에서 평형화시켰다. 정제-유사 결정이 0.25 x 0.05 x 0.025 mm의 치수로 7일내에 성장하였다. 이들 결정은 "결정 형태 II"로서 본원에서 언급된다.

C. J695 Fab/IL-12 p70 복합체의 결정화.

J695 Fab/IL-12 p70 복합체는 현적 증기 확산 방법을 사용하여 결정화되었다. 복합체(1㎕)를 1㎕의 저장소 용액(16% PEG 4K, 10% 2-프로판올, 0.1 M Na HEPES pH 7.5, 0.2 M (NH₄)₂S0₄)과 혼합하고, 18℃에서 평형화시켰다. 저장소 중 첨가제(6% 디옥산, 또는 4.3% 자일리톨)는 확산을 증진시켰다. 결정은 에칭된 말단을 갖는 길쭉한 직사각형 정제였다.

실시예 3: J695 Fab 결정 형태 I의 결정 구조의 측정.

A. J695 Fab 형태 I 결정의 저온보호(Cryoprotection) 및 급속 냉각.

25% PEG 4000, 0.1 M Na 시트레이트, pH 5.6, 0.2 M (NH₄)₂S0₄의 존재하에 상기한 바와 같이 성장한 형태 I 결정을 증가하는 양의 글리세롤(5-15%)을 함유하는 모액 용액 내로 수확하고, 이어서, 액체 질소로 급속 냉각하였다. 상기 결정을 액체 질소 냉장고에 x-선 회절 데이터가 수집될 때까지 저장하였다.

B. J695 Fab 형태 I 결정(결정 1)으로부터의 X-선 회절 데이터 수집.

J695 Fab 형태 I 결정(결정 1)으로부터의 X-선 회절 데이터를 1.34-Å 해상도로 빔라인 X26C(λ = 1.1Å)에서 ADSC 양자 210 디텍터를 사용하는 내셔날 신크로트론 광원(National Synchrotron Light Source; NSLS, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY)에서 회전 방법에 의해 수집하였다. Fab 결정을 100 K의 온도에서 옥스포드 크리오시스템스 크리오스트림 쿨러(Oxford Cryosystems Cryostream cooler)를 사용하여 데이터 수집 동안 유지하였다. 데이터의 각 프레임에 대해(합계 240), 결정을 0.5° 회전하였다. 데이터를 프로그램의 HKL2000 스위트(suite)로 처리하였다[참조: Otwinowski, Z. and W. Minor (1997). Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. New York, Academic Press]. 결정 배향을 측정한 후, 데이터를 DENZO를 사용하여 통합하고(공간 그룹 P2₁2₁2₁에서, a = 53.92 Å, b = 67.36 Å, c = 115.79 Å; 단위 셀 정보는 표 5에 요약된다), SCALEPACK를 사용하여 등급화하고 병합하고, 절대 등급으로 놓고, TRUNCATE를 사용하여 구조 인자 진폭(structure factor amplitudes)으로 감소시켰다. 추가의 데이터 조작처리를 CCP4 프로그램 스위트[참조: Collaborative Computational Project 4 (1994) "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50:760-763]로 수행하였다. 5%의 고유 반사(unique reflections)를 유리 R-인자(R_free)의 계산을 위해 무작위 방식으로, "유리(free)" 세트로 배정하고[참조: Brunger, A. T. (1992). "The free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures." Nature 355: 472-474]; 나머지 95%의 반사를 R-인자(R)의 계산을 위해 "작동(working)" 세트로 구성하였다. x-선 회절 데이터를 표 6에 요약한다.

C. J695 Fab 형태 I 결정 구조(결정 1)의 분자 대체 방법(Molecular Replacement Solution).

J695 Fab 결정 형태 I의 구조를 CNX를 사용하여 분자 대체에 의해 해독하였다[참조: Brunger, A. T., P. D. Adams, et al. (1998). "Crystallography & NMR system (CNS): A new software system for macromolecular structure determination." Acta Crystallogr. D54: 905-921]. 단위 셀 용적 및 Fab 분자 중량(46,608 Da)을 기준으로 하여, 형태 I은 비대칭 단위당 1개의 Fab를 포함하는 것으로 예상되었다(45% 용매, V_m = 2.3 Å³/Da)[참조: Matthews, B. W. (1968). "Solvent content of protein crystals." J Mol Biol 33: 491-7]. 5%의 무작위 선택된 반사를 교차-검증(cross-validation)을 위해 정제 동안 사용하였다[참조: Brunger, A. T. (1992). "The free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures." Nature 355: 472-474]. 수개의 상동성 Fab 검색 모델 중에서, J695와 유사한 엘보 각(elbow angle)을 갖는 단지 하나(PDB 엔트리 8fab)[참조: Strong, R. K., R. Campbell, et al. (1991). "Three-dimensional structure of murine anti-p- azophenylarsonate Fab 36-71.1. X-ray crystallography, site-directed mutagenesis, and modeling of the complex with hapten." Biochemistry 30: 3739-3748]를 성공하였고; 강체 정제는 추가로 엘보 각을 변경하였다. 병진 기능은 올바른 공간 그룹이 P2₁2₁2₁임을 나타내었다. 잔기는 검색 모델 사이에 보존되지 않았고, J695는 아닐린으로 절두되고, CDR는 제거되었다. 모사 어닐링(annealing), 포웰 최소화(Powell minimization) 및 그룹 온도 인자 정제를 CNX를 사용하여 수행하였다[참조: Brunger, A. T., P. D. Adams, et al. (1998). "Crystallography & NMR system (CNS): A new software system for macromolecular structure determination." Acta Crystallogr. D54: 905-921]. 정제 후, 올바른 측쇄 원자 및 CDR 잔기를 포지티브 시그마에이-칭량된(SigmaA-weighted)[참조: Read, R. J. (1986). "Improved Fourier coefficients for maps using phases from partial structures with errors." Acta Crystallogr. A42: 140-149] F₀-F_c 전자 밀도(2σ)의 영역으로 시각화 프로그램 O를 사용하여 구축하였다[참조: Jones, T. A., J. Y. Zou, et al. (1991). "Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models." Acta Crystallogr. A47: 110-119]. CDR H3은 무질서하게 나타났고, 모델링되지 않을 수 있다. 대안적인 측쇄 형태를 추가하고, 모델은 추가로 REFMAC에서 비등방성 온도 인자를 사용하여 정제되었다[참조: Murshudov, G. N., A. A. Vagin, et al. (1997). "Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. " Acta Crystallogr. D53: 240-255]. 물 원자를 첨가하고, 모델은 16.4/19.7%의 최종 R_cryst/R_free로 정제되었다. 모델의 품질은 프로체크(Procheck)[참조: Laskowski, R. A., M. W. MacArthur, et al. (1993). "PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures." J. Appl. Crystallogr. 26: 283-291] 및 와트체크(Whatcheck)[참조: Hooft, R. W. W., G. Vriend, et al. (1996). "Errors in protein structures." Nature 381: 272]를 사용하여 평가하였다. 정제 통계학을 표 7에 보고하였다.

실시예 4: J695 Fab 결정 형태 II의 결정 구조의 측정

A. J695 Fab 형태 II 결정의 저온보호 및 급속 냉각.

12% PEG 4000, 0.1 M Tris, pH 8.5의 존재하에 상기한 바와 같이 성장한 형태 II 결정을 증가하는 양의 글리세롤(5-15%)을 함유하는 모액 용액 내로 수확하고, 이어서, 액체 질소로 급속 냉각하였다. 상기 결정을 액체 질소 냉장고에 x-선 회절 데이터가 수집될 때까지 저장하였다.

B. J695 Fab 형태 II 결정(결정 2)으로부터의 X-선 회절 데이터 수집

J695 Fab 형태 II 결정(결정 2)으로부터의 X-선 회절 데이터를 2.1-Å 해상도로 빔라인 X26C(λ = 1.1Å)에서 ADSC 양자 210 디텍터를 사용하는 내셔날 신크로트론 광원(National Synchrotron Light Source; NSLS, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY)에서 회전 방법에 의해 수집하였다. Fab 결정을 100 K의 온도에서 옥스포드 크리오시스템스 크리오스트림 쿨러를 사용하여 데이터 수집 동안 유지하였다. 데이터의 각 프레임에 대해(합계 360), 결정을 0.5° 회전하였다. 데이터를 프로그램의 HKL2000 스위트(suite)로 처리하였다[참조: Otwinowski, Z. and W. Minor 1997 "Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode" New York, Academic Press]. 결정 배향을 측정한 후, 데이터를 DENZO를 사용하여 통합하고(공간 그룹 Ρ2₁에서, a = 85.62 Å, b = 173.41 Å, c = 139.85 Å, β = 105.5°; 단위 셀 정보는 표 5에 요약된다), SCALEPACK를 사용하여 등급화하고 병합하고, 절대 등급으로 놓고, TRUNCATE를 사용하여 구조 인자 진폭으로 감소시켰다. 추가의 데이터 조작처리를 CCP4 프로그램 스위트[참조: Collaborative Computational Project 4 (1994) "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50:760-763]로 수행하였다. 5%의 고유 반사를 유리 R-인자(R_free)의 계산을 위해 무작위 방식으로, "유리" 세트로 배정하고[참조: Brunger, A. T. 1992 "The free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures" Nature 355: 472-474]; 나머지 95%의 반사를 R-인자(R)의 계산을 위해 "작동(working)" 세트로 구성하였다. x-선 회절 데이터를 표 6에 요약한다.

C. J695 Fab 형태 II 결정 구조(결정 2)의 분자 대체 방법.

J695 Fab 결정 형태 II의 구조를 분자 대체에 의해 해독하였다. 단위 셀 용적 및 Fab 분자 중량(46,608 Da)을 기준으로 하여, 형태 II는 비대칭 단위당 8 내지 6개의 Fabs를 포함하는 것으로 예상되었다(50-63% 용매, V_m = 2.7-3.6 Å³/Da)[참조: Matthews, B. W. (1968). "Solvent content of protein crystals." J Mol Biol 33: 491-7]. 5%의 무작위 선택된 반사를 교차-검증을 위해 정제 동안 사용하였다[참조: Brunger, A. T. (1992). "The free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures." Nature 355: 472-474]. 거대-정제된 형태 I 구조를 검색 모델로서 사용하는 형태 II 구조를 해독하기 위한 초기 시도는 성공적이지 않았다. 유사-병진 대칭성(pseudo-translational symmetry)인 것으로 나타났고, 이는 본래의 패터슨 맵(native Patterson map)에서 오프-오리진 피크(off-origin peaks)와 일치하고, 가능한 용액(possible solutions)의 쌍과 관련되는데, 그러나, CNX[참조: Brunger, A. T., P. D. Adams, et al. (1998). "Crystallography & NMR system (CNS): A new software system for macromolecular structure determination." Acta Crystallogr. D54: 905-921], AMORE[참조: Navaza, J. (1994). "AMoRe: an automated package for molecular replacement." Acta Crystallog. A50: 157-163] 및 EPMR[참조: Kissinger, C. R., D. K. Gehlhaar, et al. (2001). EPMR: A program for crystallographic molecular replacement by evolutionary search. La Jolla, CA, Agouron Pharmaceuticals, Inc]은 완벽한 용액을 제공하지 않았다. MOLREP[참조: Vagin, A. A. and A. Teplyakov (1997). "MOLREP: an automated program for molecular replacement." J. Appl. Crystallogr. 30: 1022-1025]는 8개의 Fabs가 위치할 수 있고, 이의 조합은 4Å에서 공간 그룹 P2₁에서 32.3%의 상관 계수 및 55.4%의 R-인자를 야기한다. 이 용액은 [100]에 평행한 슈도-다이아드(pseudo-dyad)에 의해 서로 관련된 대략 (011)에 따라 역평형의 방식으로 조정되는 것으로 나타났다. 제2 Fab 쌍은 동일한 다이아드에 대해 배열되지만, ~½a에 의해 대체된다. 이러한 사량체 Fab 어셈블리는 병진 벡터 [~½a, ~½b, ~½c]에 의해 복제되어 비대칭 단위에서 다른 4개의 Fabs를 제공한다.

강체 정제 후, 시그마에이-칭량된 맵의 검사[참조: Read, R. J. (1986). "Improved Fourier coefficients for maps using phases from partial structures with errors." Acta Crystallogr. A42: 140-149]는 2개의 Fabs에서 무질서한 불변 도메인을 나타내었고; 이들 도메인은 제거되고, 전자 밀도 맵을 SOLVE를 사용하여 용매 플래트닝(flattening)에 적용하였다[참조: Terwilliger, T. C. and J. Berenedzen (1999). "Automated MAD and MIR structure solution." Acta Cryst. D. 55: 849-861]. 등방성 B-인자를 사용하는 REFMAC에서 정제[참조: Murshudov, G. N., A. A. Vagin, et al. (1997). "Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method." Acta Crystallogr. D53: 240-255]는 O에서의 리빌딩과 교차되었다[참조: Jones, T. A., J. Y. Zou, et al. (1991). "Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models." Acta Crystallogr. A47: 110-119]. 불변 도메인 및 CDRs는 포지티브 전자 밀도(2σ)로 리빌딩되었다. 2개의 상대적으로 무질서화된 불변 도메인은 약 75 Å² 및 약 85 Å²의 평균 B-인자를 갖는다. 물 원자가 첨가되었고, 모델은 최종 R_cryst/R_free 19.5/25.9%로 정제되었다. 모델의 품질은 프로체크(Procheck)[참조: Laskowski, R. A., M. W. MacArthur, et al. (1993). "PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures." J. Appl. Crystallogr. 26: 283-291] 및 와트체크(Whatcheck)[참조: Hooft, R. W. W., G. Vriend, et al. (1996). "Errors in protein structures." Nature 381 : 272]를 사용하여 평가하였다. 정제 통계학을 표 7에 보고하였다.

D. 단백질 데이터 뱅크에서 항체 구조 시스-트랜스 펩티드 결합 이성체의 분석

단백질 데이터 뱅크에 존재하는 Ab 구조의 펩티드 결합의 시스-대-트랜스(cis-to-trans) 이성질화의 모든 발생을 확인하기 위해 시도하였다. 단백질 데이터 뱅크의 광범위한 조사(2003년 3월 28일에서 현재)는 453 엔트리를 생성하는 모든 이용가능한 Ab 구조의 리스트를 편집하기 위해 수행되었다. 이러한 조사는 닥터 앤드류 씨.알. 마틴(Dr. Andrew C.R. Martin)에 의해 유지관리된 요약 리스트에 의해 도움을 받았다(http://www.bioinf.org.uk/abs/). 처음에, 메뉴얼 조사는 453 Ab 구조의 이러한 세트로 수행되는데, CISPEP 플래그(flag)를 찾는 것을 수행하고, 이는 시스-펩티드 결합을 함유하는 구조의 PDB 헤더(header)에서 발견된다. 시스-펩티드 결합을 함유하는 모든 Ab 구조는 관련 구조를 사용하여 분류되었다. 하나의 그룹은 관련 항체(예를 들면, 돌연변이), 다양한 결찰 상태 또는 결정 형태의 Ab, 및 단일 결정 형태의 Ab의 다중 카피로 이루어졌다. 이어서, 그룹을 시스-펩티드 결합이 프롤린 잔기를 수반하는지의 여부 및 하나의 그룹 멤버로 발견된 시스-프롤린이 보존되거나 다른 그룹 멤버에서 보존되지 않는지의 여부를 결정하기 위해 수동으로 분석하였다. 그러나, CISPEP 플래그에 의한 PDB 엔트리의 주석이 믿을 수 없다는 것을 인식하는 경우, 이러한 분석은 불완전하게 여겨진다.

453 PDB 엔트리는 다음 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 재조사되었다: 모든 453 PDB 엔트리에서 모든 펩티드 결합에 대한 측정치, 펩티드 결합 ω 비틀림 각의 값. 펩티드 결합은, ω가 0 ± 20°인 경우, 시스로서 고려되고, 그렇지 않으면 트랜스로 고려된다. 프로그램 MOLEMAN2는 이러한 단계를 위해 사용되었다[참조: Kleywegt, G. J. (1995). MOLEMAN2: manipulation and analysis of PDB files. Uppsala, Sweden, Dept. of Cell and Molecular Biology, Uppsala University, Biomedical Centre, Box 596, SE- 751 24].

각각 확인된 시스 펩티드 결합을 플랭킹(flanking)하는 아미노산 서열(각 PDB 엔트리에서)을 추출하였다(펩티드 결합을 한정하는 2개의 잔기를 포함하는 전체 8에 대한 ±3 잔기).

각 시스 펩티드 결합에 대한 이러한 검색을 원하는(query) 서열을, 각 PDB 엔트리에서, 453 엔트리의 전체 콜렉션에서 발견된 8-잔기 서열의 모두와 비교하였다. 적합한 정정은 쇄 말단 및 브레이크(break)를 처리한다. 조사는 또한 검색을 원하는 서열을 도출하여 동일한 결정 구조에서 Ig 도메인의 다중 카피의 (통상의) 가능성을 허용하는 PDB 엔트리를 포함하였다.

잔기의 적어도 6/8이 동일한 경우 및 매칭 서열에서 중심 펩티드 결합이 시스가 아니라 트랜스인 경우, 매칭이 유의한 것으로 고려된다.

이러한 방법으로 결정한 매칭은 높은-상동성 또는 동일한 8-아미노산 서열을 나타내고, 이는 시스 및 트랜스 중심 펩티드 결합 둘 다를 갖는 453 PDB 엔트리의 세트로 나타난다. 예상된 바와 같이, 수개의 항체가 불변 도메인에서 시스-대-트랜스 프롤린 이성체화를 포함하는 것으로 밝혀졌다(J695는 수개의 시스-프롤린을 구성적 이성질 현상을 나타내지 않는 이의 불변 도메인에 포함한다). 분석은 CDRs 내에 시스-대-트랜스 프롤린 이성질화에 중점을 두었다.

시스/트랜스 쌍의 육안 조사는 J695에 추가하여 단지 하나가 모호하게 올바른 것으로 나타났다. 이러한 이전 예는 단일-가닥 DNA-결합 mAb DNA-1(PDB 엔트리 li8m; 2.1-Å 해상도)이고, 이는 2개의 Fabs를 비대칭 단위로 포함한다[참조: Tanner, J. J., A. A. Komissarov, et al. (2001). "Crystal Structure of an Antigen-binding Fragment Bound to Single-stranded DNA." J. Mol. Biol. 314: 807-822]. Fab1 CDR H3에서 ArgH98^H3-ProH99^H3 펩티드 결합은 트랜스이고, 반면, Fab2에서, 시스이다. 결정에서, dT₅ 올리고데옥시뉴클레이티드는 특히 CDRs H3에 의해 2개의 Fabs 사이에 비대칭적으로 결합된다. DNA-1 H3은 다수의 형태로 예시되는 바와 같이 다른 CDRs 보다 더 유연한 것으로 나타나고, 단일 결정 형태 내에 또는 다중 결정 형태 사이에서 채택될 수 있다[참조: Tanner, J. J. (2003). Personal Communication].

분석은 CDRs에서 보통 CDR L3의 위치 95에서 시스-대-트랜스 프롤린 이성체화를 포함하는 것으로 보고된 수개의 항체를 발견하였다. 그러나, 모든 관련 구조의 상세한 검사는 관심있는 영역에서 구조적 에러를 변함없이 나타내었다.

실시예 5: J695 Fab/IL-12 p70 복합체의 결정 구조의 측정.

A. J695 Fab/IL-12 p70 복합체 결정의 저온보호 및 급속 냉각.

16% PEG 4K, 10% 2-프로판올, 0.1 M Na HEPES pH 7.5, 0.2 M (NH₄)₂S0₄의 존재하에 상기한 바와 같이 성장한 J695 Fab/IL-12 p70 복합체 결정을 증가하는 양의 글루코스(5-15%)를 함유하는 모액 용액 내로 수확하고, 이어서, 액체 질소로 급속 냉각하였다. 상기 결정을 액체 질소 냉장고에 x-선 회절 데이터가 수집될 때까지 저장하였다.

B. J695 Fab/IL-12 p70 복합체 결정(결정 3)으로부터의 X-선 회절 데이터 수집.

단일 J695 Fab/IL-12 p70 복합체 결정(결정 3)으로부터의 X-선 회절 데이터를 공업용 거대분자 결정학 협회 공동 액세스 팀(Industrial Macromolecular Crystallography Association Collaborative Access Team; IMCA-CAT) 빔라인 17-BM 및 17-ID(λ = 1.0 A)에서, MAR CCD 디텍터를 사용하는 어드밴스드 광자 원(Advanced Photon Source; APS, Argonne National Laboratory, Argonne, IL)에서 3.25-Å 해상도로 회전 방법에 의해 수집하였다. 복합체 결정을 100 K의 온도에서 옥스포드 크리오시스템스 크리오스트림 쿨러를 사용하여 데이터 수집 동안 유지하였다. 데이터의 각 프레임에 대해(합계 258) 결정을 0.5° 회전하였다. 결정 배향을 측정한 후, 데이터를 MOSFLM[참조: Leslie, A. G. W. (1992). "Recent changes to the MOSFLM package for processing film and image plate data." CCP4 and ESF-EACMB Newsletter on Protein Crystallography 26]를 사용하여 통합하고(공간 그룹 C222₁, a = 136.3151 Å, b = 209.5560 Å, c = 217.1127 Å; 단위 셀 정보는 표 5에 요약된다), SCALA를 사용하여 등급화하고 병합하고[참조: Evans, P. R. (1997). "SCALA." Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter 33: 22-24], 절대 등급으로 놓고, TRUNCATE를 사용하여 구조 인자 진폭으로 감소시켰다. 추가의 데이터 조작처리를 CCP4 프로그램 스위트[참조: Collaborative Computational Project 4 (1994) "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50:760-763]로 수행하였다. 5%의 고유 반사를 유리 R-인자(R_free)의 계산을 위해 무작위 방식으로, "유리" 세트로 배정하고[참조: Brunger, A. T. (1992). "The free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures." Nature 355: 472-474]; 나머지 95%의 반사를 R-인자(R)의 계산을 위해 "작동(working)" 세트로 구성하였다. x-선 회절 데이터를 표 6에 요약한다.

C. J695 Fab/IL-12 p70 복합체 결정 구조(결정 3)의 분자 대체 방법.

J695 Fab/IL-12 p70 복합체의 구조를 분자 대체에 의해 해독하였다. 단위 셀 용적 및 Fab 및 IL-12 p70 분자 중량(46,608 및 약 70,000 Da)을 기준으로 하여, 결정은 비대칭 단위당 2개의 Fab/p70 복합체를 포함하는 것으로 예상되었다(약 61% 용매, V_m = 약 3.3 Å³/Da)[참조: Matthews, B. W. (1968). "Solvent content of protein crystals." J Mol Biol 33:491-7]. 자가-회전 기능(self-rotation function)은 [9.77, 90.00, 180.00] 및 [80.23, 90.00, 180.00]과 동일한 극 회전 각[θ,φ,χ]을 갖는 2개의 비-결정학적 2중 회전 축(two-fold rotation axes)을 나타내었고, 각각은 대략적으로 결정학적 2중 축만큼 강력한 1/3이고, 결정학적 c 축으로부터 b 축을 향하여 약 10°오프셋된 2중 축으로 배향된 비-결정학적 이량체와 일치한다. 유사-병진 대칭성(pseudo-translational symmetry)이 없는 것으로 나타났고, 이는 본래의 패터슨 맵(native Patterson map)에서 오프-오리진 피크(off-origin peaks)의 결손과 일치한다. CNX[참조: Brunger, A. T., P. D. Adams, et al. (1998). "Crystallography & NMR system (CNS): A new software system for macromolecular structure determination." Acta Crystallogr. D54:905-921], AMORE[참조: Navaza, J. (1994). "AMoRe: an automated package for molecular replacement." Acta Crystallog. A50: 157-163], EPMR[참조: Kissinger, C. R., D. K. Gehlhaar, et al. (2001). EPMR: A program for crystallographic molecular replacement by evolutionary search. La Jolla, CA, Agouron Pharmaceuticals, Inc], 및 MOLREP[참조: Vagin, A. A. and A. Teplyakov (1997). "MOLREP: an automated program for molecular replacement." J. Appl. Crystallogr. 30: 1022-1025]를 사용하는 구조를 해독하기 위한 초기 시도는 성공적이지 않았다. J695 Fab/IL-12 p70 복합체의 구조를 궁극적으로 PHASER[참조: Storoni, L. C, A. J. McCoy, et al. (2004). "Likelihood-enhanced fast rotation functions." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60(Pt 3):432-8]로 공간 그룹 C222₁에서 (정제된) J695 Fab 형태 I을 사용하여 해독하였고, IL-12 p70(PDB 엔트리 1f45는 검색 모델로 조정되었다[참조: Yoon, C, S. C. Johnston, et al. (2000). "Charged residues dominate a unique interlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12." The EMBO Journal 19(14):3530-3521]. 먼저, Fab의 2개의 카피를 위치시키고, 이는 1250의 명백하게-올바른 로그-근사 이득(log-likelihood gain; LLG)을 제공한다. IL-12 p70 분자 단독의 위치는 보다 많은 문제가 있고, 이는 모호한 결과를 제공한다(LLG 130, 단지 하나의 분자; 하나의 제2 p70 분자는 위치하지 않을 수 있다). 상기 측정된 바와 같이 위치한 2개의 Fabs 내에, p70에 대한 조사는 훨씬 개선된 LLG(2150)를 제공하는 것 외에 올바른 용액과 일치한다. p70의 이러한 모호한 위치는 또한 p70이 단독으로 사용된 경우 상기 측정된 모호한 위치와 일치하였다.

강체 정제는 REFMAC를 사용하여 수행되었다[참조: Murshudov, G. N., A. A. Vagin, et al. (1997). "Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method." Acta Crystallogr. D53: 240-255]. 5%의 무작위 선택된 반사를 교차-검증을 위해 정제 동안 사용하였다[참조: Brunger, A. T. (1992). "The free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures." Nature 355: 472-474]. 20-4.0Å 해상도로부터의 데이터를 사용하여, 10개 도메인(각 Fab 면역글로불린 [Ig] 도메인, 및 IL-12 p40 및 p35)을 R_free/R = 0.401/0.413으로 정제하였다. 시그마에이-칭량된 맵의 검사[참조: Read, R. J. (1986). "Improved Fourier coefficients for maps using phases from partial structures with errors." Acta Crystallogr. A42: 140-149]는 연이어(back-to-back) 위치된 2개의 Fab 분자를 나타내고, 하나의 Fab는 IL-12 p40 도메인 1(N-말단 도메인)에 대개 결합된 위치를 조합한다. 맵은 또한 제2 IL-12 분자에 대한 밀도를 나타내었다.

PHASER는 고정되게 유지된 강체-정제된 모델을 사용하여 제2 IL-12 p70을 조사하기 위해 재실행되었다. 이러한 과정은 성공적이었고, 2926의 개선된 LLG를 제공하였다. PHASER 내의 정제는 3562의 최종 LLG를 제공하였다. REFMAC를 사용하는 강체 정제의 반복은, 현재 16개 도메인을 갖고(8개 Fab Ig 도메인, 6개 p40 Ig-유사 도메인, 및 2개의 p35 도메인) R_free/R = 0.400/0.409(20-3.5 Å)를 제공하였다. 등방성 B-인자를 사용하는 계속된 위치 정제(REFMAC)는 O에서 리빌딩과 교차되었고[참조: Jones, T. A., J. Y. Zou, et al. (1991). "Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models." Acta Crystallogr. A47: 110-119], 최종 R_free/R = 0.287/0.216를 제공한다. 모델의 품질은 프로체크(Procheck)[참조: Laskowski, R. A., M. W. MacArthur, et al. (1993). "PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures." J. Appl. Crystallogr. 26: 283-291] 및 와트체크(Whatcheck)[참조: Hooft, R. W. W., G. Vriend, et al. (1996). "Errors in protein structures." Nature 381: 272]를 사용하여 평가하였다. 정제 통계학을 표 7에 보고하였다.

[표 5]

[표 6]

[표 7]

참조문헌에 의한 인용

본 출원에 걸쳐 인용된 모든 인용된 참조문헌(문헌 참조, 특허, 특허 공보 및 웹사이트를 포함함)의 내용 뿐만 아니라, 도면은 이로써 이의 전문이 참조로서 명백하게 인용된다. 본 발명의 실행은, 달리 나타내지 않는 한, 당해 기술 분야에 널리 공지된 항체 제조의 통상적인 기술을 사용할 것이다.

등가물

본 발명에 기재된 상세한 실시예 및 양태는 단지 예시적인 목적으로 제공되고, 본 발명을 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다는 것으로 이해된다. 이의 관점에서 다양한 변형 또는 변화가 당업계의 숙련자에게 제안될 수 있고, 본 출원의 취지 및 이해의 범위 내에 포함되고, 첨부된 특허청구범위의 범위 내인 것으로 고려된다. 예를 들면, 성분들의 관련 수량은 목적하는 효과를 최적화하기 위해 변화될 수 있고, 추가의 성분들이 첨가되고/되거나 유사한 성분들이 기술된 하나 이상의 성분을 대체할 수 있다. 본 발명의 시스템, 방법 및 과정에 관련된 추가의 유리한 특성 및 기능은 첨부된 특허청구범위로부터 명백해질 것이다. 또한, 당업계의 숙련가들은 단지 통상적인 실험, 본 발명에 기술된 본 발명의 특정한 양태에 대한 다수의 등가물을 사용하여 인지할 수 있고, 알아낼 수 있다. 이러한 등가물은 하기 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE INC. <120> ANTI-IL-12/IL-23 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 117813-48220 <150> US 61/460,780 <151> 2011-01-07 <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(115) <223> ABT-874 Heavy Chain Variable Region <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> ABT-874 Light Chain Variable Region <400> 2 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Thr 85 90 95 His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 3 <211> 306 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(306) <223> mature form, human IL-12 P40 subunit. Swiss-Prot P29460 <400> 3 Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln 130 135 140 Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly 145 150 155 160 Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala 165 170 175 Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala 180 185 190 Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg 195 200 205 Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu 210 215 220 Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp 225 230 235 240 Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln 245 250 255 Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr 260 265 270 Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala 275 280 285 Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro 290 295 300 Cys Ser 305 <210> 4 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(197) <223> mature form, human IL-12 P35 subunit. Swiss-Prot P29459 <400> 4 Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu 1 5 10 15 His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys 20 25 30 Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp 35 40 45 His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu 50 55 60 Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr 65 70 75 80 Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe 85 90 95 Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr 100 105 110 Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys 115 120 125 Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu 130 135 140 Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser 145 150 155 160 Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu 165 170 175 Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser 180 185 190 Tyr Leu Asn Ala Ser 195 <210> 5 <211> 328 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(328) <223> Precursor p40 Peptide - sp|P29460|IL12B_HUMAN Interleukin-12 subunit beta OS=Homo sapiens GN=IL12B PE=1 SV=1 <400> 5 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325 <210> 6 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(219) <223> Precursor p35 Peptide - sp|P29459|IL12A_HUMAN Interleukin-12 subunit alpha OS=Homo sapiens GN=IL12A PE=1 SV=2 <400> 6 Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro 20 25 30 Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val 35 40 45 Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys 50 55 60 Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser 65 70 75 80 Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys 85 90 95 Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala 100 105 110 Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr 115 120 125 Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys 130 135 140 Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu 145 150 155 160 Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr 165 170 175 Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys 180 185 190 Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr 195 200 205 Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 210 215 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> 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Claims

IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부로서,
상기 항체는, 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 1 내지 197로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제1항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 1 내지 107로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제1항에 있어서, 상기 항체가 p40 서브유닛의 루프 1 내지 7의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하고, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열번호 3의 아미노산 서열의 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 107, 124 내지 129, 157 내지 164, 및 194 내지 197로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서, 상기 항체가 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제4항에 있어서,
상기 항체가 잔기 14 내지 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 14 내지 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 15 내지 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서, 상기 항체가 잔기 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서, 상기 항체가 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제7항에 있어서,
상기 항체가 잔기 85 내지 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 86 내지 89 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 86, 87, 89 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 루프 3의 아미노산 잔기 87을 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서,
상기 항체가 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 102 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서,
상기 항체가 잔기 124 내지 129로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 5의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 157 내지 164로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 6의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 194 내지 197로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 7의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서, 상기 항체가 잔기 14 내지 23, 58 내지 60, 84 내지 94 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제11항에 있어서,
상기 항체가 잔기 14 내지 18, 85 내지 93, 및 102 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 14 내지 17, 86 내지 89, 93 및 103 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 15 내지 17, 86 내지 87, 89, 93 및 104로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서, 상기 항체가 잔기 14 내지 23 및 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제13항에 있어서,
상기 항체가 잔기 15, 17 내지 21, 23 및 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 내지 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 58 내지 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 2의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서,
상기 항체가 잔기 14 내지 23 및 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 및 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서,
상기 항체가 잔기 14 내지 23 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1 및 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 14 내지 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 1의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제3항에 있어서,
상기 항체가 잔기 84 내지 94 및 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3 및 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상이 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하거나;
상기 항체가 잔기 84 내지 94로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 3의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 잔기 95 내지 107로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 루프 4의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 p40 서브유닛의 일부에, 또는 상기 아미노산 잔기의 1 내지 10Å 이내에 결합하는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제1항의 항체, 또는 이의 항원 결합부와 결합하기 위해 경쟁하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합부.
제1항에 있어서, 항체 Y61 또는 J695가 아닌, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부로서,
상기 항체는, 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고,
여기서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102, 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 이외의 가변 영역 잔기들 중 어느 하나는 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부로서,
상기 항체는, 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고,
여기서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102, 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 중 하나 이상은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제21항에 있어서,
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 및 102 중 하나 이상이 방향족 잔기로 독립적으로 치환되거나;
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 상기 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 및 92 중 하나 이상이 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되거나;
상기 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 92 및 97 중 하나 이상이 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되거나;
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 101 및 상기 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 51 중 하나 이상이 Tyr, Ser, Thr, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되거나;
상기 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나;
상기 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환된거나;
상기 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
상기 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상이 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다)
[여기서, 상기 항체는 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는다:
(a) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상이 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다);
(b) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나;
(c) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환되거나;
(d) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다];
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53 중 하나 이상이 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부로서,
상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33은 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제23항에 있어서,
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33이 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asn, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50이 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57이 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99가 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
상기 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33이 Phe, Tyr, Trp, His, Gln 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제24항에 있어서,
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33이 Lys으로 치환되거나;
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50이 Tyr 또는 Trp으로 치환되거나;
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57이 Ile 또는 Trp으로 치환되거나;
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57이 Ser 또는 Thr으로 치환되거나;
상기 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99가 Tyr 또는 Trp으로 치환되거나;
상기 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33이 Tyr 또는 Trp으로 치환되는,
분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부.
제20항, 제21항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 J695 또는 Y61이 아닌, 항체 또는 이의 항원 결합부.
제20항, 제21항 및 제23항 중 어느 한 항의 항체, 또는 이의 항원 결합부와 결합하기 위해 경쟁하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합부.
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 변경시키는 방법으로서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고,
상기 방법은 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32, 52, 53, 97, 101 및 102 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 35, 51 및 90 내지 101 중 하나 이상을 상이한 아미노산 잔기로 독립적으로 치환하여 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 것을 포함하는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 변경시키는 방법.
제28항에 있어서,
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 27, 32 및 102 중 하나 이상이 방향족 잔기로 독립적으로 치환되거나;
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 97 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 35 및 92가 Lys, Arg, Tyr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되거나;
서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 92 및 97 중 하나 이상이 방향족 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되거나;
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 101 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 51 중 하나 이상이 Tyr, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되거나;
서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나;
서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환되거나;
서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상이 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다)
[여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는다:
(a) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 90 내지 101 중 하나 이상이 적어도 하나 이상의 상이한 아미노산으로 독립적으로 치환되거나(여기서, 항체의 CDRL3의 길이는 12개 아미노산 잔기보다 길거나 12개 아미노산 잔기와 동일하다);
(b) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 91이 Gln을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환되거나;
(c) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 95가 상이한 방향족 아미노산 잔기로 치환되거나;
(d) 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 97이 Phe, Tyr, Trp, His, Asp, Glu, Asn, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된다];
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 52 및 53 중 하나 이상이 Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 독립적으로 치환되는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 변경시키는 방법.
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법으로서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고,
상기 방법은 서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33, 50, 57 및 99 및 서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33 중 하나 이상을 상이한 아미노산 잔기로 치환하여 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 것을 포함하는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법.
제30항에 있어서,
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33이 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asn, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50이 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Gln, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57이 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99가 Phe, Tyr, Trp, His, Met, Arg 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나;
서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33이 Phe, Tyr, Trp, His, Gln 및 Lys으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법.
제31항에 있어서,
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 33이 Lys으로 치환되거나;
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 50이 Tyr 또는 Trp으로 치환되거나;
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57이 Ile 또는 Trp으로 치환되거나;
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 57이 Ser 또는 Thr으로 치환되거나;
서열번호 1의 가변 영역 아미노산 잔기 99가 Tyr 또는 Trp으로 치환되거나;
서열번호 2의 가변 영역 아미노산 잔기 33이 Tyr 또는 Trp으로 치환되는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 변경시키는 방법.
제28항 또는 제30항의 방법에 따라 제조된, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부.
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부로서,
상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 16, 87 및 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 입체형태적 에피토프(conformational epitope)에, 또는 상기 아미노산 잔기의 10Å 이내에 결합하는,
IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부.
제34항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 16에 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부.
제1항, 제20항, 제21항, 제23항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛에, 10^-3M^-1 이하의 K_off 또는 10^-10M 이하의 K_d로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부.
제1항, 제20항, 제21항, 제23항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 생물학적 활성을 중화시키는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부.
제37항의 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제38항에 있어서, 하나 이상의 추가의 생물학적 활성제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항, 제20항, 제21항, 제23항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합부를 암호화하는, 분리된 핵산.
하나 이상의 전사 조절 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 제40항의 핵산을 포함하는, 분리된 핵산 벡터.
제41항의 핵산 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
제42항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵 숙주 세포 또는 원핵 숙주 세포인, 숙주 세포.
피검체에서의 하나 이상의 IL-12 및/또는 IL-23 관련 병태를 진단하는 방법으로서,
상기 방법은, 상기 피검체 유래의 생물학적 샘플을 제1항, 제20항, 제21항, 제23항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합부와 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 중에 존재하는 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 양을 측정함(여기서, 정상 또는 대조군에 대해 비교한 상기 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 p40 서브유닛의 상승되거나 감소된 수준의 검출은 IL-12 및/또는 IL-23 관련 병태의 존재 또는 부재의 지표이다)에 의해 상기 피검체에서의 하나 이상의 IL-12 및/또는 IL-23 관련 병태를 진단하는 단계를 포함하는,
피검체에서의 하나 이상의 IL-12 및/또는 IL-23 관련 병태를 진단하는 방법.
제44항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 검출가능한 표지를 함유하거나, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 검출가능한 표지를 갖는 제2 분자에 의해 검출되는, 방법.
생물학적 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성 중 하나 이상을 조절하는 제제를 식별하기 위한 방법으로서,
상기 방법은, 상기 샘플을 제1항, 제20항, 제21항, 제23항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합부와 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성을 검출함(여기서, 비처리된 샘플에 대해 비교한 상기 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성 중 하나 이상의 증가 또는 감소는 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성 중 하나 이상을 조절할 수 있는 제제의 지표이다)에 의해 상기 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성 중 하나 이상을 조절하는 제제를 식별하는,
생물학적 샘플 중의 IL-12 및/또는 IL-23의 발현, 수준, 및/또는 활성 중 하나 이상을 조절하는 제제를 식별하기 위한 방법.
제46항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부가 검출가능한 표지를 함유하거나, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합부가 검출가능한 표지를 갖는 제2 분자에 의해 검출가능한, 방법.
IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12 및/또는 IL-23의 활성을 억제시키는 방법으로서,
상기 방법은, 상기 피검체에게 제1항, 제20항, 제21항, 제23항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합부를 투여하여 상기 피검체에서 IL-12 및/또는 IL-23의 활성을 억제시키는 것을 포함하는,
IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체에서 IL-12 및/또는 IL-23의 활성을 억제시키는 방법.
IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은, 상기 피검체에게 제1항, 제20항, 제21항, 제23항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합부를 투여하여 상기 피검체를 치료하는 것을 포함하는,
IL-12 및/또는 IL-23의 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피검체를 치료하는 방법.