KR20140033391A

KR20140033391A - 면역원성이 보다 낮은 t 세포 및/또는 b 세포 에피토프를 갖는 슈도모나스 외독소 a

Info

Publication number: KR20140033391A
Application number: KR1020137032402A
Authority: KR
Inventors: 아이라 에이치 파스탄; 로닛 마조르; 마사노리 온다; 아론 바살; 리차드 비어스; 제이미 에버를; 웬하이 리우
Original assignee: 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
Priority date: 2011-06-09
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2014-03-18
Also published as: US9765123B2; CA2838013A1; ES2635416T3; EP2718308B1; US20160215025A1; WO2012170617A1; RU2013151655A; AU2017200541B2; BR112013031262A2; EP2718308A1; JP2014523237A; MX2013014388A; US10428119B2; CN103748107A; JP6449359B2; CN103748107B; JP6100764B2; RU2627216C2; EP3231812A1; AU2017200541A1

Abstract

본 발명은 하나 이상의 B 세포 및/또는 T 세포 에피토프의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A(PE)를 제공한다. 본 발명은 관련된 키메라 분자뿐만 아니라, 관련된 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 및 약학 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법, 표적 세포의 생장을 억제하는 방법, PE를 제조하는 방법, 및 키메라 분자를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

면역원성이 보다 낮은 T 세포 및/또는 B 세포 에피토프를 갖는 슈도모나스 외독소 A{PSEUDOMONAS EXOTOXIN A WITH LESS IMMUNOGENIC T CELL AND/OR B CELL EPITOPES}

관련된 출원에 대한 교차참조

본 특허출원은 2011년 6월 9일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/495,085호, 및 2011년 9월 16일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/535,668호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)의 이익을 주장한다.

전자적으로 제출된 물질의 참고도입

본원과 함께 제출되었고 다음과 같이 확인된 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열목록은 전체적으로 본원에 참고로 도입된다: 2012년 6월 2일자로 생성되고 "710339_ST25.TXT"로 명명된 1개의 53,884 바이트 ASCII(텍스트) 파일.

발명의 배경기술

슈도모나스 외독소 A(PE)는 바람직하지 않은 세포, 예를 들면, 암세포의 생장을 파괴하거나 억제하는 데에 효과적일 수 있는 세포독성 활성을 갖는 세균 독소이다. 따라서, PE는 질환, 예컨대, 암을 치료하거나 예방하는 데에 유용할 수 있다. 그러나, PE는 높은 면역원성을 나타낼 수 있다. 따라서, PE 투여는 바람직하지 않게 PE의 세포독성 활성을 중화시키는 항-PE 면역 반응(예를 들면, 항-PE 항체 및/또는 T 세포의 생성을 포함함)을 자극할 수 있다. 이러한 면역원성은 환자에게 제공될 수 있는 PE의 양을 감소시킴으로써 질환, 예를 들면, 암을 치료하는 데에 있어서 PE의 효과를 감소시킬 수 있다. 따라서, 개선된 PE에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명의 한 실시양태는 임의적으로 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 내의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환과 함께 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열이 아미노산 잔기 R302 대신에 알라닌으로의 치환을 포함하는 경우 아미노산 잔기 L294, L297, Y298 및 L299 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되는, 슈도모나스 외독소 A(PE)를 제공하고, 이때 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302는 서열번호 1의 언급에 의해 정의된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 임의적으로 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 내의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 하기 화학식 I을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 PE를 제공한다:

[화학식 I]

FCS-R¹ _m-R² _p-R³ _n-PE 기능성 도메인 III

상기 식에서,

m, n 및 p는 독립적으로 0 또는 1이고;

FCS는 아미노산 잔기로 구성된 푸린(furin) 절단 서열을 포함하고, 상기 서열은 푸린에 의해 절단될 수 있고;

R¹은 서열번호 1의 잔기 285 내지 293의 하나 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하고;

R²는 X₁VAX₂X₃X₄AAX₅LSW(서열번호 2)를 포함하고, 이때 X₁, X₂ 및 X₄는 독립적으로 류신, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고, X₃은 티로신, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고, X₅는 아르기닌, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이되, PE는 LVALYLAARLSW(서열번호 3)를 포함하지 않고, X₅가 알라닌인 경우 X₁, X₂, X₃ 및 X₄ 중 하나 이상은 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고;

R³은 서열번호 1의 잔기 306 내지 394의 하나 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하고;

PE 기능성 도메인 III은 서열번호 1의 잔기 395 내지 613을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 위치 Q485 또는 L516에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되는 경우 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 치환되고, 위치 R427, R467, R490, R505, R513 또는 R551에서 아미노산 잔기가 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로 치환되는 경우 또는 위치 R490에서 아미노산 잔기가 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환되는 경우 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 치환되고, 이 치환이 위치 R427, R467, R490, R505, R513 또는 R551에서의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환, 또는 위치 490에서의 아미노산 잔기 대신에 발린, 류신 또는 이소류신으로의 치환을 포함하지 않는, PE를 제공하고, 이때 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558은 서열번호 1의 언급에 의해 정의된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 PE 아미노산 서열을 포함하되, 위치 516에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되는 경우 아미노산 잔기 D463 및 Y481 중 하나 이상의 아미노산 잔기도 치환되는, 슈도모나스 외독소 A(PE)를 제공하고, 이때 상기 PE는 임의적으로 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 치환, 및/또는 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 치환, 및/또는 서열번호 1에 의해 정의된 잔기 1 내지 273 및 285 내지 394의 하나 이상의 연속 아미노산 잔기의 결실을 갖는다.

본 발명의 추가 실시양태는 관련된 키메라 분자뿐만 아니라, 관련된 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 및 약학 조성물도 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 PE, 키메라 분자, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 또는 약학 조성물을 포유동물에서 암의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 PE, 키메라 분자, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 또는 약학 조성물을 표적 세포의 생장 억제에 효과적인 양으로 상기 표적 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포의 생장을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가 실시양태는 본 발명의 PE를 제조하는 방법 및 본 발명의 키메라 분자를 제조하는 방법을 제공한다.

도 1은 전세계 인구(비음영 막대) 및 공여자 집단(음영 막대)에서 다양한 주조직적합성 복합체 클래스 II DR 베타 1(DRB1) 대립형질(x 축)의 대립형질 빈도(y 축)를 보여주는 그래프이다.
도 2a는 인터류킨(IL)-2 엘리스폿(ELISpot)에 의해 측정되었을 때 시험관내 증폭 및 배지(M)(펩티드 부재), 펩티드 풀(pool) 3, 펩티드 풀 16 또는 펩티드 풀 22(x 축)와의 항온처리 후 비자극(naive) 공여자 031810aph T 세포의 반응을 표시하는 1 x 10⁶개 세포 당 스폿(spot) 형성 세포(SFC)의 수(y 축)를 보여주는 그래프이다.
도 2b는 IL-2 엘리스폿에 의해 측정되었을 때 시험관내 증폭 없이 펩티드 부재, 펩티드 풀 3, 펩티드 풀 16 또는 펩티드 풀 22(x 축)와의 항온처리 시 비자극 공여자 031810aph T 세포의 반응을 표시하는 1 x 10⁶개 세포 당 SFC의 수(y 축)를 보여주는 그래프이다.
도 3은 14일의 시험관내 증폭 후 펩티드 부재 또는 펩티드 풀 1 내지 22 각각(x 축)에 대한 공여자 1 내지 50 각각으로부터의 T 세포에 의한 1 x 10⁶개 세포 당 SFC의 총 수(y 축)를 보여주는 그래프이다. 점선은 3회 배경을 표시한다.
도 4는 다양한 공여자들에 대해 다양한 강도에서 T 세포 반응을 자극하는 펩티드 풀 3으로부터의 특정 펩티드 및 이 펩티드 내의 영역(음영 영역)을 확인시켜 준다.
도 5는 CA46 세포 상의 야생형 HA22(PE38에 접합된 다이설파이드-연결된 Fv 항-CD22 항체 단편)(원형), L297A HA22(정사각형) 또는 R302A HA22(마름모형)의 농도(ng/㎖)에 비해 상대적인 세포독성 활성(% 대조군)(y 축)을 보여주는 그래프이다.
도 6a는 야생형 HA22(음영 막대) 또는 R302A HA22(비음영 막대)와 함께 14일 동안 배양한 후 펩티드 부재, 야생형 펩티드(WT15) 또는 R302A(y 축)를 사용한 재자극 시 공여자 010710에 대한 T 세포 반응(1 x 10⁶개 세포 당 SFC)(y 축)을 보여주는 그래프이다.
도 6b는 야생형 HA22(음영 막대) 또는 R302A HA22(비음영 막대)와 함께 14일 동안 배양한 후 펩티드 부재, 야생형 펩티드(WT15) 또는 R302A(y 축)를 사용한 재자극 시 공여자 111909에 대한 T 세포 반응(1 x 10⁶개 세포 당 SFC)(y 축)을 보여주는 그래프이다.
도 7a는 (PE38을 함유하는) HA22(음영 막대) 또는 (서열번호 1의 아미노산 잔기 274 내지 284 및 395 내지 613을 함유하는) LR RIT(LR)(비음영 막대)를 사용한 자극 및 펩티드 풀 1 내지 22 중 하나(x 축)를 사용한 재자극 시 공여자 031510에 대한 T 세포 반응(1 x 10⁶개 세포 당 SFC)(y 축)을 보여주는 그래프이다. 대조군은 세프타지딤(ceftazidime)(CEFT)-생장된 세포, 0일째 날 항원으로 자극되지 않고 14일째 날 항원으로 자극되지 않은 세포("M 계통"), 및 0일째 날 LMB9로 자극되고 14일째 날 항원으로 자극되지 않은 세포("펩티드 부재")를 포함하였다.
도 7b는 (PE38을 함유하는) HA22(음영 막대) 또는 (서열번호 1의 아미노산 잔기 274 내지 284 및 395 내지 613을 함유하는) LR RIT(LR)(비음영 막대)를 사용한 자극 및 펩티드 부재 또는 펩티드 풀 1 내지 22 각각(x 축)을 사용한 재자극 시 공여자 021610에 대한 T 세포 반응(1 x 10⁶개 세포 당 SFC)(y 축)을 보여주는 그래프이다. 대조군은 세프타지딤(CEFT)-생장된 세포, 0일째 날 항원으로 자극되지 않고 14일째 날 항원으로 자극되지 않은 세포("M 계통"), 및 0일째 날 LMB9로 자극되고 14일째 날 항원으로 자극되지 않은 세포("펩티드 부재")를 포함하였다.
도 7c는 (PE38을 함유하는) HA22(음영 막대) 또는 (서열번호 1의 아미노산 잔기 274 내지 284 및 395 내지 613을 함유하는) LR RIT(LR)(비음영 막대)를 사용한 자극 및 펩티드 부재 또는 펩티드 풀 1 내지 22 각각(x 축)을 사용한 재자극 시 공여자 101509에 대한 T 세포 반응(1 x 10⁶개 세포 당 SFC)(y 축)을 보여주는 그래프이다. 대조군은 세프타지딤(CEFT)-생장된 세포, 0일째 날 항원으로 자극되지 않고 14일째 날 항원으로 자극되지 않은 세포("M 계통"), 및 0일째 날 LMB9로 자극되고 14일째 날 항원으로 자극되지 않은 세포("펩티드 부재")를 포함하였다.
도 8은 다양한 공여자에 대해 IL-2 생성에 의해 측정되었을 때 T 세포 반응을 자극하는 펩티드 서열번호 102 내지 111의 특정 펩티드(음영 영역)를 확인시켜 준다.
도 9는 서열번호 31 내지 141 각각에 대해 50명의 공여자들에 대한 공여자 당 총 반응의 누적 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 10은 점-치환된 HA22에 대한 항-PE38(도메인 III) 파지의 반응성을 보여주는 도표이다. 흑색 칸은 10% 미만의 반응성을 나타내고, 빈 칸은 10% 이상의 반응성을 나타내고, 회색 칸은 시험되지 않았음을 표시한다. 치환은 N 말단(좌측)부터 C 말단(우측)까지 그들의 위치에 의해 정돈되어 있다.
도 11a 및 11b는 HA를 사용한 임상 시험을 받은 제1(도 11a) 및 제2(도 11b) 환자의 혈청에서 HA22와 반응하는 항체의 수준을 50%(점선)까지 감소시키는 치환된 면역독소 HA22("HA", 폐쇄된 원형), HA22-LR("LR", 개방된 원형), HA22-LO5("LO5", 폐쇄된 삼각형), HA22-LO6("LO6", 개방된 삼각형), HA22-LR-8M("LR8M", 폐쇄된 정사각형) 및 HA22-LO10("LO10", 개방된 정사각형) 각각의 농도를 시험하는 경쟁 실험의 결과를 보여주는 선 그래프이다.
도 12는 PE38을 사용하여 치료한 환자의 혈청에서 항체와 HA22, HA22-LR-8M, HA22-LO10(HA22-LRLO10) 또는 HA22-LRLO10R의 % 결합을 보여주는 그래프이다.

슈도모나스 외독소 A("PE")는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 분비된 세균 독소(분자량 66 kD)이다. 천연 야생형 PE 서열(서열번호 1)은 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,602,095호에 기재되어 있다. 천연 야생형 PE는 세포독성에 기여하는 3개의 구조 도메인을 포함한다. 도메인 Ia(아미노산 1 내지 252)는 세포 결합을 매개하고, 도메인 II(아미노산 253 내지 364)는 세포질로의 전위를 매개하고, 도메인 III(아미노산 400 내지 613)은 연장 인자 2의 ADP 리보실화를 매개한다. PE의 도메인 III의 구조 경계가 잔기 400에서 시작되는 것으로 간주되지만, 도메인 III은 ADP 리보실화 활성을 보유하기 위해 도메인 Ib의 분절을 필요로 할 수 있다고 생각된다. 따라서, 기능성 도메인 III은 PE의 잔기 395 내지 613으로서 정의된다. 도메인 Ib(아미노산 365 내지 399)의 기능은 정의되지 않은 상태로 남아있다. 특정 이론 또는 기작에 의해 구속받지 않지만, PE의 세포독성 활성은 예를 들면, 연장 인자 2(EF-2)의 ADP 리보실화의 불활성화에 의해 진핵 세포에서 단백질 합성의 억제를 통해 발생한다고 생각된다.

PE의 치환은 PE의 아미노산 서열의 언급에 의해 본원에서 정의된다. 따라서, PE의 치환은 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 언급에 이어서 논의되는 특정 치환에서 상기 잔기를 치환시키는 아미노산의 언급에 의해 본원에 기재되어 있다. 이와 관련하여, PE의 특정 실시양태의 아미노산 서열의 위치는 상기 특정 실시양태의 아미노산 서열의 위치 또는 서열번호 1에 의해 정의된 위치로서 본원에서 언급되어 있다. 위치가 서열번호 1에 의해 정의된 바와 같은 경우, PE의 특정 실시양태의 아미노산 서열의 실제 위치는 서열번호 1의 상응하는 위치를 기준으로 정의되고 서열번호 1의 잔기 위치 번호와 상이한 잔기 위치 번호를 나타낼 수 있다. 따라서, 예를 들면, 치환은 서열번호 1의 613-아미노산 서열의 표시된 위치에 상응하는 PE의 특정 실시양태의 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기의 치환을 의미하고, 이때 각각의 아미노산 서열에서의 실제 위치는 상이할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, 위치가 서열번호 1에 의해 정의된 바와 같은 경우, 용어 "R490"은 서열번호 1의 위치 490에 정상적으로 존재하는 아르기닌을 의미하고, "R490A"는 서열번호 1의 위치 490에 정상적으로 존재하는 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있다는 것을 표시하는 반면, "K590Q"는 서열번호 1의 위치 590에 정상적으로 존재하는 라이신이 글루타민으로 치환되어 있다는 것을 표시한다. 2개 이상의 위치에서 다수의 치환이 존재하는 경우, 상기 2개 이상의 치환은 동일하거나 상이할 수 있다(즉, 달리 명시되어 있지 않은 한, 치환되는 2개 이상의 아미노산 잔기들 중 각각의 아미노산 잔기는 동일한 또는 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다).

본원에서 사용된 용어 "슈도모나스 외독소" 및 "PE"는 면역원성을 감소시키거나 제거하기 위해 천연 단백질로부터 변경된 PE를 포함한다. 이러한 변경은 도메인 Ia의 제거, 도메인 Ib, II 및 III에서의 다양한 아미노산 결실, 단일 아미노산 치환 및 카복실 말단에서의 하나 이상의 서열, 예컨대, DEL 및 REDL(서열번호 7)의 추가를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 문헌(Siegall et al., J. Biol. Chem., 264: 14256-14261 (1989))을 참조한다. 이러한 변경된 PE는 본원에 기재된 하나 이상의 T 세포 및/또는 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 본 발명의 치환(들) 중 임의의 치환을 포함하도록 추가로 변경될 수 있다. 한 실시양태에서, 변경된 PE는 천연 야생형 PE의 세포독성 단편일 수 있다. PE의 세포독성 단편은 표적 세포에서 후속 단백질분해 또는 다른 프로세싱을 받거나 받지 않고 (예를 들면, 단백질 또는 전구-단백질로서) 세포독성을 나타내는 단편을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, PE의 세포독성 단편은 천연 PE의 세포독성의 약 20% 이상, 바람직하게는 약 40% 이상, 보다 바람직하게는 약 50%, 훨씬 더 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95%의 세포독성을 보유한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 세포독성 단편은 적어도 천연 PE의 세포독성을 갖고, 바람직하게는 천연 PE에 비해 증가된 세포독성을 갖는다.

면역원성을 감소시키거나 제거하는 변경된 PE는 예를 들면, PE4E, PE40, PE38, PE25, PE38QQR, PE38KDEL 및 PE35를 포함한다. 한 실시양태에서, PE는 PE4E, PE40, PE38, PE25, PE38QQR(이때, PE38은 C 말단에서 추가된 서열 QQR을 가짐), PE38KDEL(이때, PE38은 C 말단에서 추가된 서열 KDEL(서열번호 5)을 가짐), PE-LR(라이소좀 분해에 대한 내성) 및 PE35 중 어느 하나일 수 있다.

한 실시양태에서, PE는 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,892,827호에 기재된 바와 같이 도메인 Ia를 결실시킴으로써 면역원성을 감소시키도록 변경되어 있다. PE는 도메인 Ia의 일부 잔기들을 치환시킴으로써 변경될 수도 있다. 한 실시양태에서, PE는 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,512,658호에 개시된 바와 같이 도메인 Ia가 존재하되, 위치 57, 246, 247 및 249에서 도메인 Ia의 염기성 잔기가 산성 잔기(예를 들면, 글루탐산)으로 치환되어 있는 치환된 PE인 PE4E일 수 있다.

PE40은 PE의 절두된(truncated) 유도체이다(Pai et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 88: 3358-62 (1991) and Kondo et al., Biol. Chem., 263: 9470-9475 (1988)). PE35는 아미노산 잔기 1 내지 279가 결실되어 있는 PE의 35 kD 카복실-말단 단편이고, 상기 분자는 위치 280에서 Met으로 시작된 후 천연 PE의 아미노산 281 내지 364 및 381 내지 613을 갖는다. PE35 및 PE40은 예를 들면, 미국 특허 제5,602,095호 및 제4,892,827호(이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)에 개시되어 있다. PE25는 도메인 II로부터의 11-잔기 단편 및 도메인 III의 전부를 함유한다. 몇몇 실시양태들에서, PE는 도메인 III만을 함유한다.

바람직한 실시양태에서, PE는 PE38이다. PE38은 PE의 전위 및 ADP 리보실화 도메인을 함유하지만 세포-결합 부분을 함유하지 않는다(Hwang J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987)). PE38은 아미노산 253 내지 364 및 381 내지 613(서열번호 144)으로 구성된 절두된 PE 전구-단백질이고, 이 단백질은 세포 내에서의 프로세싱 시 그의 세포독성 형태로 활성화된다(예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,608,039호 및 문헌(Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta, 1333: C1-C6 (1997)) 참조).

또 다른 바람직한 실시양태에서, PE는 PE-LR이다. PE-LR은 서열번호 1의 아미노산 잔기 274 내지 284에 상응하는 푸린 절단 서열(FCS)(RHRQPRGWEQL(서열번호 8))을 제외한 도메인 II의 결실, 및 도메인 Ib의 아미노산 잔기 365 내지 394의 결실을 함유한다. 따라서, PE-LR은 서열번호 1의 아미노산 잔기 274 내지 284 및 395 내지 613을 함유한다. PE-LR은 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공개 제WO 2009/032954호에 기재되어 있다. PE-LR은 임의적으로 서열번호 1의 FCS와 아미노산 잔기 395 내지 613 사이에서 GGS 연결 펩티드를 추가로 포함할 수 있다.

전술된 바와 같이, 대안적으로 또는 추가로, 도메인 Ib의 일부 또는 전부가 결실될 수 있고, 이때 남은 부분은 가교에 의해 연결되거나 펩티드 결합에 의해 직접적으로 연결된다. 대안적으로 또는 추가로, 도메인 II의 아미노 부분의 일부가 결실될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, C 말단은 잔기 609 내지 613의 천연 서열(REDLK)(서열번호 6)을 함유할 수 있거나, 세포질 내로 전위하는 PE의 능력을 유지할 수 있는 변경, 예컨대, KDEL(서열번호 5) 또는 REDL(서열번호 7), 및 이들 서열들의 반복부를 함유할 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,854,044호, 제5,821,238호 및 제5,602,095호, 및 국제 특허출원 공개 제WO 1999/051643호를 참조한다. 면역원성이 제거되어 있거나 감소되어 있는 임의의 형태의 PE는, 예를 들면, 표적화된 세포에서의 전위 및 EF-2 리보실화에 의해 표적화된 세포에 대한 세포독성을 나타낼 수 있는 능력을 유지하는 한, 본원에 기재된 하나 이상의 T 세포 및/또는 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 본 발명의 치환(들) 중 임의의 치환과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태는 임의적으로 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 내의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환과 함께 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열이 아미노산 잔기 R302 대신에 알라닌으로의 치환을 포함하는 경우 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 치환되는, 슈도모나스 외독소 A(PE)(본원에 기재된 천연 단백질로부터 변경된 임의의 PE를 포함함)를 제공하고, 이때 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302는 서열번호 1의 언급에 의해 정의된다. 바람직하게는, 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, Y470, I471, A472, P475, A476, L477, I493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 임의적으로 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 내의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환과 함께 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열이 아미노산 잔기 R302 대신에 알라닌으로의 치환을 포함하는 경우 아미노산 잔기 L294, L297, Y298 및 L299 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되는, 슈도모나스 외독소 A(PE)(본원에 기재된 천연 단백질로부터 변경된 임의의 PE를 포함함)를 제공하고, 이때 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302는 서열번호 1의 언급에 의해 정의된다. 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302는 PE의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내에 위치한다는 것이 발견되었다. 따라서, 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 유리하게는 하나 이상의 T 세포 에피토프(들)를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명의 PE는 유리하게는 비치환된(예를 들면, 야생형) PE보다 더 낮은 면역원성을 나타낼 수 있다.

아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 임의의 아미노산 잔기로의 치환일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환이다.

본 발명의 한 실시양태에서, PE는 X₁VAX₂X₃X₄AAX₅LSW(서열번호 2)를 포함하고, 이때 X₁, X₂ 및 X₄는 독립적으로 류신, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고, X₃은 티로신, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고, X₅는 아르기닌, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이되, PE는 LVALYLAARLSW(서열번호 3)를 포함하지 않고, X₅가 알라닌인 경우 X₁, X₂, X₃ 및 X₄ 중 하나 이상은 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 PE 아미노산 서열을 포함하되, 위치 516에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되는 경우 아미노산 잔기 D463 및 Y481 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되는, 슈도모나스 외독소 A(PE)를 제공하고, 이때 상기 PE는 임의적으로 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 치환, 및/또는 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 치환, 및/또는 서열번호 1에 의해 정의된 잔기 1 내지 273 및 285 내지 394의 하나 이상의 연속 아미노산 잔기의 결실을 갖는다. 바람직하게는, 아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 독립적으로 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환이다. 아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516은 PE의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내에 위치한다는 것이 발견되었다. 따라서, 아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 유리하게는 하나 이상의 T 세포 및/또는 B 세포 에피토프(들)를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명의 PE는 유리하게는 비치환된(예를 들면, 야생형) PE보다 더 낮은 면역원성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 추가 치환은 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 아미노산 잔기 E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R490, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, Q592 및 L597 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이다. 바람직하게는, 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 추가 치환은 아미노산 잔기 R427, R458, R467, R490, R505 및 R538 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 독립적으로 알라닌, 글리신 또는 세린으로의 치환이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 아미노산 잔기 D463 대신에 알라닌으로의 치환이고, 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 추가 치환은 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 (a) 아미노산 잔기 R427 대신에 알라닌으로의 치환; (b) 아미노산 잔기 R458 대신에 알라닌으로의 치환; (c) 아미노산 잔기 R467 대신에 알라닌으로의 치환; (d) 아미노산 잔기 R490 대신에 알라닌으로의 치환; (e) 아미노산 잔기 R505 대신에 알라닌으로의 치환; 및 (f) 아미노산 잔기 R538 대신에 알라닌으로의 치환이다.

본원에 기재된 하나 이상의 PE T 세포 및/또는 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 치환(들) 이외에, 본 발명의 PE는 임의적으로 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 추가 치환(들)도 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 한 실시양태에서, PE는 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산의 치환을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산의 치환은 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환을 포함한다. 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 치환(들)은 유리하게는 하나 이상의 B 세포 에피토프의 제거를 통해 면역원성을 추가로 감소시킬 수 있다. 상기 치환(들)은 임의의 적절한 PE B 세포 에피토프 내에 위치할 수 있다. 예시적 B 세포 에피토프는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/016150호, 제WO 2009/032954호 및 제WO 2011/032022호(이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)에 개시되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산의 치환은 아미노산 잔기 E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 및 L597 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 독립적으로 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환이고, 이때 아미노산 잔기 E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 및 L597은 서열번호 1의 언급에 의해 정의된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환은 아미노산 잔기 D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 및 Q592 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신 또는 세린으로의 치환이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환은 (a) 아미노산 잔기 D406 대신에 알라닌으로의 치환; (b) 아미노산 잔기 R432 대신에 글리신으로의 치환; (c) 아미노산 잔기 R467 대신에 알라닌으로의 치환; (d) 아미노산 잔기 R490 대신에 알라닌으로의 치환; (e) 아미노산 잔기 R513 대신에 알라닌으로의 치환; (f) 아미노산 잔기 E548 대신에 세린으로의 치환; (g) 아미노산 잔기 K590 대신에 세린으로의 치환; 및 (h) 아미노산 잔기 Q592 대신에 알라닌으로의 치환이다.

본 발명의 한 실시양태에서, PE는 단독으로 또는 본원에 기재된 다른 치환들 중 임의의 다른 치환과 함께 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, Y470, I471, A472, P475, A476, L477, I493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이다.

서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 중 임의의 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기 대신에 임의의 아미노산 잔기로의 치환일 수 있다. 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 예를 들면, 서열번호 1의 위치 421, 422, 423, 425, 427, 429, 439, 440, 443, 444, 446, 447, 450, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 551, 552, 554, 555, 556 및 558에서의 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, Y470, I471, A472, P475, A476, L477, I493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환이다. 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 PE의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에 위치하는 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 치환은 PE의 면역원성을 추가로 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 위치 427, 467, 485, 490, 505, 513, 516 및 551에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PE는 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 위치 Q485 또는 L516에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되는 경우 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 치환되고, 위치 R427, R467, R490, R505, R513 또는 R551에서 아미노산 잔기가 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로 치환되는 경우 또는 위치 R490에서 아미노산 잔기가 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환되는 경우 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 치환되고, 이 치환은 위치 282, 285, 290, 313, 314, 319, 324, 327, 331, 332, 403, 406, 412, 427, 431, 432, 458, 461, 467, 490, 505, 513, 522, 538, 548, 551, 576, 590, 592 또는 597에서의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환, 또는 위치 490에서의 아미노산 잔기 대신에 발린, 류신 또는 이소류신으로의 치환을 포함하지 않고, 이때 아미노산 잔기 282, 285, 290, 302, 313, 314, 319, 324, 327, 331, 332, 403, 406, 412, 427, 431, 432, 458, 461, 463 내지 519, 522, 538, 548, 551, 576, 590, 592 및 597은 서열번호 1의 언급에 의해 정의된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PE는 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 위치 Q485 또는 L516에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되는 경우 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 치환되고, 위치 R427, R467, R490, R505, R513 또는 R551에서 아미노산 잔기가 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로 치환되는 경우 또는 위치 R490에서 아미노산 잔기가 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환되는 경우, 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 치환되고, 이 치환은 위치 R427, R467, R490, R505, R513 또는 R551에서의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환, 또는 위치 R490에서의 아미노산 잔기 대신에 발린, 류신 또는 이소류신으로의 치환을 포함하지 않고, 이때 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558은 서열번호 1의 언급에 의해 정의된다.

바람직하게는, PE는 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공개 제WO 2007/016150호에 개시된 바와 같이 세포독성을 증가시키는 하나 이상의 치환을 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명의 한 실시양태는 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환을 갖는 PE를 제공하고, 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환은 아미노산 잔기 R490 대신에 발린, 류신 또는 이소류신으로의 치환이고, 이때 아미노산 잔기 R490은 서열번호 1의 언급에 의해 정의된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 위치 313, 327, 331, 332, 431, 432, 505, 516, 538 및 590에서 알라닌 또는 글루타민에 의한 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공개 제WO 2007/016150호에 개시된 바와 같이 증가된 세포독성을 갖는 PE를 제공할 수 있다. 증가된 세포독성 활성 및 감소된 면역원성은 동시적으로 발생할 수 있고 상호 배타적이지 않다. 세포독성 활성을 증가시키고 면역원성을 감소시키는 치환, 예컨대, 글리신 또는 보다 바람직하게는 알라닌으로의 R490의 치환이 특히 바람직하다.

본 발명의 한 실시양태에서, PE는 임의적으로 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 내의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 하기 화학식 I을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:

화학식 I

FCS-R¹ _m-R² _p-R³ _n-PE 기능성 도메인 III

상기 식에서,

m, n 및 p는 독립적으로 0 또는 1이고;

FCS는 아미노산 잔기로 구성된 푸린 절단 서열을 포함하고, 상기 서열은 푸린에 의해 절단될 수 있고;

PE 기능성 도메인 III은 서열번호 1의 잔기 395 내지 613을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, Y470, I471, A472, P475, A476, L477, I493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 화학식 I의 m, n 및/또는 p는 0이다. 본 발명의 한 실시양태에서, m, n 및 p가 각각 0인 경우 화학식 I의 PE는 FCS와 PE 기능성 도메인 III 사이에 GGS 연결 펩티드를 추가로 포함할 수 있다.

특정 이론 또는 기작에 의해 구속받지 않지만, 푸린 절단 서열(FCS)을 함유하는 PE는 표적 세포 내에서 단백질분해 프로세싱을 받아 독소의 세포독성 활성을 활성화시킨다고 생각된다. 본 발명의 PE의 FCS는 아미노산 잔기로 구성된 임의의 적합한 푸린 절단 서열(이 서열은 푸린에 의해 절단될 수 있음)을 포함할 수 있다. 예시적 푸린 절단 서열은 문헌(Duckert et al., Protein Engineering, Design & Selection, 17(1): 107-112 (2004)) 및 국제 특허출원 공개 제WO 2009/032954호(이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, FCS는 서열번호 1의 잔기 274 내지 284(즉, RHRQPRGWEQL(서열번호 8))를 포함하고, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환은 서열번호 1의 아미노산 잔기 E282 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환이다. 다른 적합한 FCS 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: R-X₁-X₂-R(이때, X₁은 임의의 천연 아미노산이고, X₂는 임의의 천연 아미노산임)(서열번호 9), RKKR(서열번호 10), RRRR(서열번호 11), RKAR(서열번호 12), SRVARS(서열번호 13), TSSRKRRFW(서열번호 14), ASRRKARSW(서열번호 15), RRVKKRFW(서열번호 16), RNVVRRDW(서열번호 17), TRAVRRRSW(서열번호 18), RQPR(서열번호 19), RHRQPRGW(서열번호 20), RHRQPRGWE(서열번호 21), HRQPRGWEQ(서열번호 22), RQPRGWE(서열번호 23), RHRSKRGWEQL(서열번호 24), RSKR(서열번호 25), RHRSKRGW(서열번호 26), HRSKRGWE(서열번호 27), RSKRGWEQL(서열번호 28), HRSKRGWEQL(서열번호 29), RHRSKR(서열번호 30)임), 및 R-X₁-X₂-R(이때, X₁은 임의의 천연 아미노산이고, X₂는 아르기닌 또는 라이신임)(서열번호 4).

본 발명의 한 실시양태에서, 화학식 I의 m은 1이고, 화학식 I의 R¹은 서열번호 1의 잔기 285 내지 293을 포함하고, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환은 서열번호 1의 아미노산 잔기 E285 및/또는 P290 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 n은 1이고, 화학식 I의 R³은 서열번호 1의 잔기 306 내지 394를 포함하고, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환은 서열번호 1의 아미노산 잔기 R313, N314, P319, D324, E327, E331 및 Q332 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PE 기능성 도메인 III은 서열번호 1의 잔기 395 내지 613을 포함하고, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환은 서열번호 1의 아미노산 잔기 D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 및 L597 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, PE 기능성 도메인 III은 서열번호 142를 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, PE 기능성 도메인 III은 서열번호 143을 포함한다.

본 발명의 PE는 본 발명의 PE에 대한 면역 반응이 비치환된 PE에 대한 면역 반응에 비해 정량적으로 또는 정성적으로 감소된 경우 본 발명에 따른 비치환된 PE보다 더 낮은 면역원성을 나타낼 수 있다. 면역원성의 정량적 감소는 면역 반응의 크기 또는 정도에서의 감소를 포괄한다. 면역원성의 크기 또는 정도는 임의의 수의 공지된 파라미터들, 예컨대, 사이토카인(예를 들면, 항원 특이적 사이토카인) 생성 수준(사이토카인 농도)의 감소, 활성화된(예를 들면, 림프구(예를 들면, 항원 특이적 림프구)의 증식) 또는 동원된 림프구의 수의 감소, 및/또는 항체(항원 특이적 항체) 생성의 감소 등에 근거하여 측정될 수 있다. 면역원성의 정성적 감소는 PE의 세포독성 활성의 감소를 매개하는 데에 있어서 면역 반응을 덜 효과적이게 하는 면역 반응의 성질의 임의의 변화를 포괄한다. 면역원성을 측정하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 생성된 사이토카인의 유형 및 수준의 측정은 면역원성을 측정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, PE와 항체(예를 들면, PE에 이미 노출된 항체)의 결합의 측정 및/또는 포유동물(예를 들면, 인간, 마우스, 및/또는 마우스 면역 시스템이 인간 면역 시스템으로 교체되어 있는 마우스)에게 투여되었을 때 항체를 유도하는 PE의 능력의 측정은 면역원성을 측정할 수 있다. 면역원성이 보다 낮은 PE는 사이토카인, 예컨대, IFN-γ, TNF-α 및 그란자임(granzyme) B 중 임의의 하나 이상의 생성의 감소, 및/또는 세포-매개된 면역 반응의 감소된 자극, 예컨대, 비치환된 PE에 의해 수득된 T 세포 및/또는 대식세포의 증식 및 활성화에 비해 PE에 대해 특이적인 T 세포 및/또는 대식세포의 증식 및 활성화의 감소를 특징으로 할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 면역원성이 보다 낮은 PE는 비치환된 PE에 의해 수득된 TGF-베타 및/또는 IL-10의 생성에 비해 TGF-베타 및/또는 IL-10의 생성의 증가를 특징으로 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 감소된 면역원성은 T 세포 자극의 감소, T 세포 증식의 감소 및 T 세포 IFNγ 및/또는 그란자임 B 분비의 감소 중 임의의 하나 이상을 특징으로 한다. 대안적으로 또는 추가로, 면역원성이 보다 낮은 PE는 비치환된 PE에 의해 수득된 B 세포의 자극 및/또는 활성화에 비해 PE에 대해 특이적인 B 세포의 자극 및/또는 활성화의 감소를 특징으로 할 수 있다. 예를 들면, 면역원성이 보다 낮은 PE는 비치환된 PE에 의해 수득된 B 세포의 분화에 비해 항체 분비 혈장 세포 및/또는 기억 세포로의 B 세포의 분화의 감소를 특징으로 할 수 있다. 감소된 면역원성은 B 세포 자극의 감소, B 세포 증식의 감소 및 항-PE 항체 분비의 감소 중 임의의 하나 이상을 특징으로 할 수 있다. 면역원성의 정성적 감소 및 정량적 감소는 동시적으로 발생할 수 있고 서로 배타적이지 않다.

당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 PE의 치료 또는 예방 효능이 변경을 통해 증가되도록 본 발명의 PE를 임의의 수의 방식으로 변경할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 PE는 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 표적화 모이어티(moiety)에 접합될 수 있거나 융합될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 실시양태는 (a) 본원에 기재된 본 발명의 PE들 중 임의의 PE에 접합된 또는 융합된 (b) 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 화합물, 예를 들면, 본 발명의 PE를 표적화 모이어티에 접합시키는 것은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Wadwa et al., J. Drug Targeting, 3: 111 (1995)) 및 미국 특허 제5,087,616호를 참조한다.

본원에서 사용된 용어 "표적화 모이어티"는 세포 표면 마커를 특이적으로 인식하여 결합하는 임의의 분자 또는 물질을 의미하고, 이로써 표적화 모이어티는 본 발명의 PE가 표면 수용체를 발현하는 세포 집단으로 전달되게 한다. 표적화 모이어티는 항체(예를 들면, 단일클론 항체) 또는 이의 단편, 펩티드, 호르몬, 성장인자, 사이토카인, 및 임의의 다른 천연 또는 비천연 리간드를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "항체"는 항원 인식 및 결합 성능을 보유하는 전체("온전한"으로서도 공지되어 있음) 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 의미한다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 천연 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들면, 포유동물, 예컨대, 마우스, 토끼, 염소, 말, 닭, 햄스터, 인간 등으로부터 단리되고/되거나 정제된 항체 또는 이의 항원 결합 부분일 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있다. 또한, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 세포 표면 마커에 대한 임의의 수준의 친화성 또는 친화력을 가질 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 세포 표면 마커에 대해 특이적이고, 이로써 다른 펩티드 또는 단백질과의 교차반응이 최소화된다.

항체는 단일클론 또는 다중클론 항체일 수 있고 임의의 동종형(isotype), 예를 들면, IgM, IgG(예를 들면, IgG, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgD, IgA 또는 IgE일 수 있다. 표적 세포 표면 마커에 대한 항체 또는 단일쇄 가변 단편(Fv)의 상보성 결정 영역(CDR)은 선택된 항체 내로 이식되거나 조작되어 표적 세포 표면 마커에 대한 특이성을 상기 항체에게 부여할 수 있다. 예를 들면, 표적 세포 표면 마커에 대한 항체의 CDR은 공지된 삼차원적 구조의 인간 항체 골격 상으로 이식되어 인간에게 투여되었을 때 면역원성 반응을 거의 또는 전혀 일으킬 수 없는 항체를 형성할 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 1998/045322호 및 제WO 1987/002671호; 미국 특허 제5,859,205호, 제5,585,089호 및 제4,816,567호; 유럽 특허출원 공개 제0173494호; 문헌(Jones et al., Nature, 321 :522 (1986)); 문헌(Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988)); 문헌(Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988)); 및 문헌(Winter & Milstein, Nature, 349: 293 (1991)) 참조). 바람직한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 단일클론 항체이다.

항원 결합 부분은 하나 이상의 항원 결합 부위를 갖는 임의의 부분, 예를 들면, 온전한 항체의 가변 영역 또는 CDR일 수 있다. 항체의 항원 결합 부분의 예에는 중쇄, 경쇄, 중쇄 또는 경쇄의 가변 또는 불변 영역, 단일쇄 가변 단편(scFv), 또는 Fc, Fab, Fab', Fv 또는 F(ab)₂' 단편; 단일 도메인 항체(예를 들면, 문헌(Wesolowski, Med Microbiol Immunol., 198(3): 157-74 (2009)), 문헌(Saerens et al., Curr. Opin. Pharmacol., 8(5):600-8 (2008)) 및 문헌(Harmsen and de Haard, Appl. Microbiol. Biotechnol., 77(1): 13-22 (2007)) 참조); 나선-안정화된 항체(예를 들면, 문헌(Arndt et al., J. Mol. Biol., 312: 221-228 (2001)) 참조); 트라이아바디(triabody); 다이아바디(diabody)(유럽 특허출원 공개 제0404097호, 국제 특허출원 공개 제WO 1993/011161호 및 문헌(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)); 단일쇄 항체 분자("scFvs", 예를 들면, 미국 특허 제5,888,773호 참조); 다이설파이드-안정화된 항체("dsFvs", 예를 들면, 미국 특허 제5,747,654호 및 제6,558,672호 참조); 및 도메인 항체("dAbs", 예를 들면, 문헌(Holt et al., Trends Biotech, 21(11):484-490 (2003)), 문헌(Ghahroudi et al., FEBS Lett., 414:521-526 (1997)), 문헌(Lauwereys et al., EMBO J 17:3512-3520 (1998)), 문헌(Reiter et al., J. Mol. Biol. 290:685-698 (1999)) 및 문헌(Davies and Riechmann, Biotechnology, 13:475-479 (2001)) 참조)가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.

항체 또는 이의 항원 결합 부분이 임의의 세포 표면 마커에 결합하는 능력을 시험하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고 임의의 항체-항원 결합 어세이, 예컨대, 방사면역어세이(RIA), ELISA, 웨스턴 블롯, 면역침전 및 경쟁 억제 어세이를 포함한다(예를 들면, 하기 문헌(Janeway et al.) 및 미국 특허출원 공개 제2002/0197266 A1호 참조).

적합한 항체 제조 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 표준 하이브리도마 방법은 예를 들면, 문헌(Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976)), 문헌(Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988)) 및 문헌(C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5^th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001))에 기재되어 있다. 대안적으로, 다른 방법, 예컨대, EBV-하이브리도마 방법(Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), and Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)) 및 박테리오파지 벡터 발현 시스템(예를 들면, 문헌(Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)) 참조)이 당분야에서 공지되어 있다. 추가로, 비인간 동물에서 항체를 제조하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호 및 제5,714,352호, 및 미국 특허출원 공개 제2002/0197266 A1호에 기재되어 있다.

파지 디스플레이를 사용하여 본 발명의 키메라 분자에서 사용될 수 있는 항체를 발생시킬 수도 있다. 이와 관련하여, 표준 분자생물학 및 재조합 DNA 기법(예를 들면, 문헌(Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)) 참조)을 이용하여 항체의 항원 결합 가변(V) 도메인을 코딩하는 파지 라이브러리를 발생시킬 수 있다. 원하는 특이성을 갖는 가변 영역을 코딩하는 파지를 원하는 항원과의 특이적 결합에 대해 선택하고, 선택된 가변 도메인을 포함하는 완전한 또는 부분적인 항체를 재구성한다. 재구성된 항체를 코딩하는 핵산 서열을 적절한 세포주, 예컨대, 하이브리도마 생성에 사용되는 골수종 세포에 도입하고, 이로써 단일클론 항체의 특성을 갖는 항체는 상기 세포에 의해 분비된다(예를 들면, 상기 문헌(Janeway et al.), 상기 문헌(Huse et al.) 및 미국 특허 제6,265,150호 참조).

대안적으로, 항체는 특이적 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자에 대한 형질전환성을 나타내는 형질전환 마우스에 의해 생성된다. 이러한 방법은 당분야에서 공지되어 있고 예를 들면, 미국 특허 제5,545,806호 및 제5,569,825호, 및 상기 문헌(Janeway et al.)에 기재되어 있다.

대안적으로, 항체는 유전적으로 조작된 항체, 예를 들면, 인간화된 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 유리하게는 보다 낮은 부작용 위험을 제공하고 순환계에서 보다 오래 남아있을 수 있다. 인간화된 항체를 발생시키는 방법은 당분야에서 공지되어 있고 예를 들면, 상기 문헌(Janeway et al.), 미국 특허 제5,225,539호, 제5,585,089호 및 제5,693,761호, 유럽 특허 제0239400 B1호, 및 영국 특허 제2188638호에 상세히 기재되어 있다. 인간화된 항체를 예를 들면, 미국 특허 제5,639,641호 및 문헌(Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994))에 기재된 항체 재표면화 기술을 이용하여 발생시킬 수도 있다.

표적화 모이어티는 임의의 적합한 세포 표면 마커에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적인 표적화 모이어티 및/또는 세포 표면 마커는 표적화될 구체적인 세포 집단에 따라 선택될 수 있다. 세포 표면 마커는 당분야에서 공지되어 있고(예를 들면, 문헌(Mufson et al., Front. Biosci., 11:337-43 (2006)), 문헌(Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6:326-334 (2000)) 및 문헌(Kreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)) 참조), 예를 들면, 단백질 또는 탄수화물일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 세포 표면 상의 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이다. 예시적 리간드는 혈관 내피 성장인자(VEGF), Fas, TNF-관련된 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL), 사이토카인(예를 들면, IL-2, IL-15, IL-4, IL-13), 림포카인, 호르몬 및 성장인자(예를 들면, 형질전환 성장인자(TGFa), 신경 성장인자, 표피 성장인자)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

세포 표면 마커는 예를 들면, 암 항원일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "암 항원"은 종양 세포 또는 암세포에 의해 단독으로 또는 주로 발현되거나 과다발현되는 임의의 분자(예를 들면, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물 등)를 의미하고, 이로써 상기 항원은 종양 또는 암과 관련되어 있다. 암 항원은 정상, 비종양 또는 비암성 세포에 의해서도 발현될 수 있다. 그러나, 이러한 경우, 정상, 비종양 또는 비암성 세포에 의한 암 항원의 발현은 종양 또는 암세포에 의한 발현만큼 강하지 않다. 이와 관련하여, 종양 또는 암세포는 정상, 비종양 또는 비암성 세포에 의한 상기 항원의 발현에 비해 상기 항원을 과다발현할 수 있거나 상기 항원을 유의하게 더 높은 수준으로 발현할 수 있다. 또한, 암 항원은 발생 또는 성숙의 분화 상태의 세포에 의해서도 발현될 수 있다. 예를 들면, 암 항원은 성체 숙주에서 정상적으로 발견되지 않는, 배아 또는 태아 단계의 세포에 의해서도 발현될 수 있다. 대안적으로, 암 항원은 성체 숙주에서 정상적으로 발견되지 않는 줄기 세포 또는 전구체 세포에 의해서도 발현될 수 있다.

암 항원은 본원에 기재된 암 및 종양을 포함하는 임의의 암 또는 종양의 임의의 세포에 의해 발현된 항원일 수 있다. 암 항원은 단지 한 유형의 암 또는 종양의 암 항원일 수 있고, 이로써 상기 암 항원은 단지 한 유형의 암 또는 종양과 관련되어 있거나 단지 한 유형의 암 또는 종양의 특징이다. 대안적으로, 암 항원은 하나 초과의 유형의 암 또는 종양의 암 항원일 수 있다(예를 들면, 특징일 수 있다). 예를 들면, 암 항원은 유방 암세포 및 전립선 암세포 둘다에 의해 발현될 수 있고 정상, 비종양 또는 비암세포에 의해 전혀 발현되지 않을 수 있다.

표적화 모이어티가 특이적으로 결합할 수 있는 예시적 암 항원은 뮤신 1(MUC1), 흑색종 관련 항원(MAGE), 흑색종의 우선적으로 발현된 항원(PRAME), 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 수용체(GM-CSFR), CD56, 인간 표피 성장인자 수용체 2(HER2/neu)(erbB-2로서도 공지되어 있음), CD5, CD7, 티로시나제 종양 항원, 티로시나제 관련 단백질(TRP)1, TRP2, NY-ESO-1, 텔로머라제 및 p53을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 표적화 모이어티가 특이적으로 결합하는 세포 표면 마커는 분화의 클러스터(CD)19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, 트랜스페린(transferrin) 수용체, EGF 수용체, 메소텔린(mesothelin), 캐드헤린(cadherin) 및 루이스(Lewis) Y로 구성된 군으로부터 선택된다. 메소텔린은 예를 들면, 난소암, 중피종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 나팔관암, 두경부암, 자궁경부암 및 췌장암에서 발현된다. CD22는 예를 들면, 모발세포 백혈병, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전구림프구성 백혈병(PLL), 비호지킨 림프종, 소림프구성 림프종(SLL) 및 급성 림프성 백혈병(ALL)에서 발현된다. CD25는 예를 들면, 모발세포 백혈병 및 호지킨 림프종을 포함하는 백혈병 및 림프종에서 발현된다. 루이스 Y 항원은 예를 들면, 방광암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 식도암, 위암, 폐암 및 췌장암에서 발현된다. CD33은 예를 들면, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수단핵구성 백혈병(CML) 및 골수증식 장애에서 발현된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 암 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. 암 항원에 특이적으로 결합하는 예시적 항체는 트랜스페린 수용체에 대한 항체(예를 들면, HB21 및 이의 변이체), CD22에 대한 항체(예를 들면, RFB4 및 이의 변이체), CD25에 대한 항체(예를 들면, 항-Tac 및 이의 변이체), 메소텔린에 대한 항체(예를 들면, SS1, MORAb-009, SS, HN1, HN2, MN, MB, 및 이의 변이체) 및 루이스 Y 항원에 대한 항체(예를 들면, B3 및 이의 변이체)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이와 관련하여, 표적화 모이어티는 B3, RFB4, SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2, HB21 및 MORAb-009, 및 이들의 항원 결합 부분으로 구성된 군으로부터 선택된 항체일 수 있다. 본 발명의 키메라 분자에서 사용되기에 적합한 추가 예시적 표적화 모이어티는 예를 들면, 미국 특허 제5,242,824호(항-트랜스페린 수용체); 미국 특허 제5,846,535호(항-CD25); 미국 특허 제5,889,157호(항-루이스 Y); 미국 특허 제5,981,726호(항-루이스 Y); 미국 특허 제5,990,296호(항-루이스 Y); 미국 특허 제7,081,518호(항-메소텔린); 미국 특허 제7,355,012호(항-CD22 및 항-CD25); 미국 특허 제7,368,110호(항-메소텔린); 미국 특허 제7,470,775호(항-CD30); 미국 특허 제7,521,054호(항-CD25); 미국 특허 제7,541,034호(항-CD22); 미국 특허출원 공개 제2007/0189962호(항-CD22); 문헌(Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000)); 및 문헌(Kreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006))(이들 각각은 본원에 참고로 도입됨)에 개시되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적화 모이어티는 당분야에서 공지된 면역독소의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적 면역독소는 LMB-2(항-Tac(Fv)-PE38), BL22 및 HA22(RFB4(dsFv)-PE38), SS1P(SS1(dsFv)-PE38), HB21-PE40 및 이들의 변이체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 HA22의 항원 결합 부분이다. HA22는 PE38에 접합된 다이설파이드-연결된 Fv 항-CD22 항체 단편을 포함한다. HA22 및 이의 변이체는 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공개 제WO 2003/027135호 및 제WO 2009/032954호에 개시되어 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 키메라 분자는 링커를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "링커"는 본 발명의 PE를 표적화 모이어티에 연결하는 임의의 물질 또는 분자를 의미한다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 PE의 기능에 필요하지 않은 본 발명의 PE 상의 부위가 링커 및/또는 표적화 모이어티를 부착시키기에 이상적인 부위이되, 링커 및/또는 표적화 모이어티가 일단 본 발명의 PE에 부착되면 표적 세포의 생장을 억제하거나 암을 치료하거나 예방하는 본 발명의 PE의 기능, 즉 세포독성 활성을 방해하지 않는다는 것을 인식한다. 링커는 PE 및 표적화 모이어티 둘다와 공유결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당분야에서 공지되어 있고 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커 및 펩티드 링커를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. PE 및 표적화 모이어티가 폴리펩티드인 경우, 링커는 측쇄 기를 통해(예를 들면, 시스테인과의 다이설파이드 연결을 통해) 아미노산에 연결될 수 있다. 바람직하게는, 링커는 말단 아미노산의 아미노 및 카복실 기의 알파 탄소에 연결될 것이다.

본원에 기재된 본 발명의 PE 및 키메라 분자의 기능성 부분도 본 발명의 범위 내에 포함된다. PE 또는 키메라 분자와 관련하여 사용될 때 용어 "기능성 부분"은 본 발명의 PE 또는 키메라 분자의 임의의 부분 또는 단편으로서, 이 부분 또는 단편의 기원이 되는 PE 또는 키메라 분자(모 PE 또는 키메라 분자)의 생물학적 활성을 보유하는 부분 또는 단편을 의미한다. 기능성 부분은 예를 들면, 모 PE 또는 키메라 분자와 유사한 정도, 동일한 정도 또는 더 높은 정도로 표적 세포에 특이적으로 결합하여 표적 세포의 생장을 파괴하거나 억제하거나 암을 치료하거나 예방하는 능력을 보유하는 PE 또는 키메라 분자의 부분을 포괄한다. 모 PE 또는 키메라 분자와 관련하여, 기능성 부분은 예를 들면, 모 PE 또는 키메라 분자의 약 10% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 68% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상을 차지할 수 있다.

기능성 부분은 모 PE 또는 키메라 분자의 아미노산 서열에서 발견되지 않는 추가 아미노산을 상기 부분의 아미노 또는 카복시 말단, 또는 이들 두 말단에서 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 추가 아미노산은 기능성 부분의 생물학적 기능, 예를 들면, 표적 세포에 특이적으로 결합하여 표적 세포의 생장을 파괴하거나 억제하는 기능, 암을 치료하거나 예방하는 능력 등을 방해하지 않는다. 보다 바람직하게는, 상기 추가 아미노산은 모 PE 또는 키메라 분자의 생물학적 활성에 비해 생물학적 활성을 향상시킨다.

본원에 기재된 본 발명의 PE 및 키메라 분자의 기능성 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "기능성 변이체"는 모 PE 또는 키메라 분자에 대해 실질적인 또는 상당한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 PE 또는 키메라 분자를 의미하고, 상기 기능성 변이체는 그 자신의 기원이 되는 PE 또는 키메라 분자의 생물학적 활성을 보유한다. 기능성 변이체는 예를 들면, 모 PE 또는 키메라 분자와 유사한 정도, 동일한 정도 또는 보다 높은 정도로 표적 세포에 특이적으로 결합하여 표적 세포의 생장을 파괴하거나 억제하는 능력을 보유하는, 본원에 기재된 PE 또는 키메라 분자(모 PE 또는 키메라 분자)의 변이체를 포괄한다. 모 PE 또는 키메라 분자와 관련하여, 기능성 변이체는 예를 들면, 아미노산 서열 면에서 모 PE 또는 키메라 분자와 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 동일할 수 있다.

기능성 변이체는 예를 들면, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모 PE 또는 키메라 분자의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 당분야에서 공지되어 있고, 특정 화학적 및/또는 물리적 성질을 갖는 한 아미노산이 동일한 화학적 또는 물리적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 교체되는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 보존적 아미노산 치환은 또 다른 산성 아미노산(예를 들면, Asp 또는 Glu)에 의한 산성 아미노산의 치환, 비극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들면, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val 등)에 의한 비극성 측쇄를 갖는 아미노산의 치환, 또 다른 염기성 아미노산(Lys, Arg 등)에 의한 염기성 아미노산의 치환, 극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr 등)에 의한 극성 측쇄를 갖는 아미노산의 치환 등일 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 기능성 변이체는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 모 PE 또는 키메라 분자의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우, 비보존적 아미노산 치환이 기능성 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나 억제하지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 비보존적 아미노산 치환은 기능성 변이체의 생물학적 활성을 향상시키고, 이로써 기능성 변이체의 생물학적 활성은 모 PE 또는 키메라 분자에 비해 증가된다.

본 발명의 PE 또는 키메라 분자는 본원에 기재된 특정 아미노산 서열 또는 서열들로 본질적으로 구성될 수 있고, 이로써 기능성 변이체의 다른 구성요소, 예를 들면, 아미노산은 기능성 변이체의 생물학적 활성을 본질적으로 변화시키지 않는다.

본 발명의 PE 또는 키메라 분자(본 발명의 기능성 부분 또는 기능성 변이체를 포함함)는 하나 이상의 천연 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르류신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아마이드, N'-벤질-N'-메틸-라이신, N',N'-다이벤질-라이신, 6-하이드록시라이신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카복실산, α-아미노사이클로헥산 카복실산, α-아미노사이클로헵탄 카복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카복실산, α,γ-다이아미노부티르산, α,β-다이아미노프로피온산, 호모페닐알라닌 및 α-tert-부틸글리신을 포함한다.

본 발명의 PE 또는 키메라 분자(기능성 부분 및 기능성 변이체를 포함함)는 글리코실화될 수 있거나, 아마이드화될 수 있거나, 카복실화될 수 있거나, 인산화될 수 있거나, 에스테르화될 수 있거나, N-아실화될 수 있거나, 예를 들면, 다이설파이드 가교를 통해 고리화될 수 있거나, 산부가염으로 전환될 수 있고/있거나, 임의적으로 이량체화될 수 있거나 중합될 수 있거나, 접합될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태는 (a) PE를 재조합적으로 발현시키는 단계 및 (b) PE를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 PE를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 PE 및 키메라 분자(기능성 부분 및 기능성 변이체를 포함함)는 당분야에서 공지된 단백질 및 폴리펩티드의 제조 방법에 의해 수득될 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질을 드 노보(de novo) 합성하는 적합한 방법은 참고자료, 예컨대, 문헌(Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005), 문헌(Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000), 문헌(Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000) 및 미국 특허 제5,449,752호에 기재되어 있다. 또한, 본 발명의 PE 및 키메라 분자는 표준 재조합 방법의 이용을 통해 본원에 기재된 핵산을 사용함으로써 재조합적으로 발현될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001) 및 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994)을 참조한다.

상기 방법은 PE를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 PE는 일단 발현되면 당분야에서 공지된 정제 기법에 따라 정제될 수 있다. 예시적 정제 기법은 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼 및 컬럼 크로마토그래피, 또는 예를 들면, 문헌(R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982))에 기재된 절차를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 (a) 본 발명의 키메라 분자를 재조합적으로 발현시키는 단계 및 (b) 상기 키메라 분자를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 키메라 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 키메라 분자는 본 발명의 다른 양태와 관련하여 본원에 기재된 바와 같이 재조합적으로 발현될 수 있고 정제될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 키메라 분자를 재조합적으로 발현시키는 단계는 표적화 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 PE를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 벡터 내로 삽입하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 기능성 표적화 모이어티 영역 및 기능성 PE 영역을 포함하는 1개의 연속적 폴리펩티드를 코딩하도록 표적화 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 PE를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인 프레임(in frame)으로 삽입하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 방법은 발현 시 PE가 표적화 모이어티의 카복실 말단에 위치하도록 PE를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을, 상기 표적화 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 라이게이션시키는(ligating) 단계를 포함한다. 대안적 실시양태에서, 상기 방법은 발현 시 PE가 표적화 모이어티의 아미노 말단에 위치하도록 PE를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을, 상기 표적화 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 라이게이션시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 (a) 본 발명의 PE를 재조합적으로 발현시키는 단계, (b) 상기 PE를 정제하는 단계 및 (c) 표적화 모이어티를 정제된 PE에 공유연결하는 단계를 포함하는, 본 발명의 키메라 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 PE는 본 발명의 다른 양태와 관련하여 본원에 기재된 바와 같이 재조합적으로 발현될 수 있다. 상기 방법은 표적화 모이어티를 정제된 PE에 공유연결하는 단계를 추가로 포함한다. PE를 표적화 모이어티에 부착시키는 방법은 표적화 모이어티의 화학 구조에 따라 다를 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 PE 상에 존재하는 다양한 작용기들 중 임의의 하나 이상의 작용기, 예를 들면, 카복실산 (COOH), 자유 아민(-NH₂) 또는 설프하이드릴(-SH) 기를 표적화 모이어티 상의 적합한 작용기와 반응시켜 PE와 표적화 모이어티 사이의 공유결합을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 방법은 추가 반응성 작용기를 노출시키거나 부착시키기 위해 표적화 모이어티 또는 PE를 유도체화하는 단계를 포함할 수 있다. 유도체화는 하나 이상의 링커를 표적화 모이어티 또는 PE에 부착시키는 단계도 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 PE 및 키메라 분자는 비재조합 방법의 이용을 통해 생성될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 본 발명의 PE 및 키메라 분자(기능성 부분 및 기능성 변이체를 포함함)는 회사, 예컨대, 신펩(Synpep)(미국 캘리포니아주 더블린 소재), 펩티드 테크놀로지스 코포레이션(Peptide Technologies Corp.)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재), 및 멀티플 펩티드 시스템스(Multiple Peptide Systems)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 의해 상업적으로 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 PE 및 키메라 분자는 합성될 수 있고/있거나, 재조합적으로 제조될 수 있고/있거나, 단리될 수 있고/있거나 정제될 수 있다.

몇몇 상황에서, 키메라 분자가 하나 이상의 표적 세포에 도달하였을 때 PE를 표적화 모이어티로부터 유리시키는 것이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 키메라 분자는 절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커는 임의의 적합한 수단, 예를 들면, 효소에 의해 절단될 수 있다. 예를 들면, 표적 세포가 암(예를 들면, 종양) 세포인 경우, 키메라 분자는 (예를 들면, 종양 관련 효소 또는 산성 pH에 노출된 경우) 종양 부위에 존재하는 조건 하에 절단가능한 링커를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시양태는 본원에 기재된 본 발명의 PE 또는 본 발명의 키메라 분자 중 임의의 PE 또는 키메라 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "핵산"은 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"를 포함하고, 일반적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 합성될 수 있거나 천연 공급원으로부터 수득될 수 있고(예를 들면, 단리될 수 있고/있거나 정제될 수 있고) 천연, 비천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있고 천연, 비천연 또는 변경된 뉴클레오티드간 연결, 예컨대, 비변경된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드들 사이에서 발견되는 포스포다이에스터 대신에 포스포로아미데이트 연결 또는 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있는 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미한다. 핵산이 임의의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하지 않는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 본원에서 논의된 바와 같이 몇몇 경우 핵산이 하나 이상의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하는 것이 적합할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 핵산은 재조합 핵산이다. 본원에서 사용된 용어 "재조합"은 (i) 천연 또는 합성 핵산 분절들을 연결함으로써 살아있는 세포 외부에서 구축된 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에 기재된 분자의 복제로부터 발생된 분자를 의미한다. 본원의 목적상, 상기 복제는 시험관내 복제 또는 생체내 복제일 수 있다.

핵산은 당분야에서 공지된 절차를 이용하는 화학적 합성 및/또는 효소 라이게이션 반응에 근거하여 구축될 수 있다. 예를 들면, 상기 문헌(Sambrook et al.) 및 상기 문헌(Ausubel et al.)을 참조한다. 예를 들면, 천연 뉴클레오티드를 사용하거나, 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 혼성화 시 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변경된 뉴클레오티드(예를 들면, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드)를 사용하여 핵산을 화학적으로 합성할 수 있다. 핵산을 발생시키는 데에 사용될 수 있는 변경된 뉴클레오티드의 예에는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 다이하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N⁶-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N⁶-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N⁶-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, 및 2,6-다이아미노푸린이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 핵산들 중 하나 이상의 핵산은 회사, 예컨대, 마크로몰레큘라 리소시스(Macromolecular Resources)(미국 콜로라도주 포트 콜린스 소재) 및 신테겐(Synthegen)(미국 텍사스주 휴스톤 소재)으로부터 구입될 수 있다.

본 발명은 본원에 기재된 핵산들 중 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 조건 하에 본원에 기재된 핵산들 중 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산도 제공한다.

엄격한 조건 하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 높은 엄격성 조건 하에 혼성화한다. "높은 엄격성 조건"은 뉴클레오티드 서열이 비특이적 혼성화보다 검출가능하게 더 강한 양으로 표적 서열(본원에 기재된 핵산들 중 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 혼성화한다는 것을 의미한다. 높은 엄격성 조건은 정확한 상보적 서열을 갖거나 단지 소수의 산재된 불일치를 함유하는 폴리뉴클레오티드를, 뉴클레오티드 서열과 일치하는 단지 소수의 작은 영역(예를 들면, 3개 내지 10개의 염기)을 갖도록 발생된 무작위 서열로부터 구별할 조건을 포함한다. 이러한 작은 상보성 영역은 14개 내지 17개의 염기 또는 그 이상의 염기로 구성된 전장 상보체보다 더 용이하게 용해되고, 높은 엄격성 혼성화는 이들이 용이하게 구별될 수 있게 한다. 상대적으로 높은 엄격성 조건은 예를 들면, 약 50℃ 내지 70℃의 온도에서 저염 및/또는 고온 조건, 예컨대, 약 0.02 M 내지 0.1 M NaCl 또는 등가물에 의해 제공된 조건을 포함할 것이다. 이러한 높은 엄격성 조건은 뉴클레오티드 서열과 주형 또는 표적 가닥 사이의 약간의 불일치(존재하는 경우)를 용인하고, 본 발명의 PE 또는 키메라 분자 중 임의의 PE 또는 키메라 분자의 발현을 검출하는 데에 특히 적합하다. 증가하는 양의 포름아마이드를 첨가함으로써 조건을 보다 더 엄격하게 만들 수 있다는 것은 일반적으로 인식되어 있다.

본 발명은 본원에 기재된 핵산들 중 임의의 핵산과 약 70% 이상, 예를 들면, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산도 제공한다.

본 발명의 핵산은 재조합 발현 벡터 내로 도입될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 본 발명의 핵산들 중 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본원의 목적상, 용어 "재조합 발현 벡터"는 유전적으로 변경된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구축물이 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 숙주 세포 내에서 상기 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 발현되게 하기에 충분한 조건 하에 상기 벡터가 상기 세포와 접촉되는 경우 상기 숙주 세포에 의한 상기 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현을 허용하는 유전적으로 변경된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구축물을 의미한다. 본 발명의 벡터는 전체로서 천연적으로 발생되지 않는다. 그러나, 벡터의 일부는 천연적으로 발생될 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 합성될 수 있거나 부분적으로 천연 공급원으로부터 수득될 수 있고 천연, 비천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있는 임의의 유형의 뉴클레오티드(DNA 및 RNA를 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 천연 뉴클레오티드간 연결, 비천연 뉴클레오티드간 연결 또는 이들 두 유형의 연결을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비천연 또는 변경된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 연결은 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시키는 데에 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 증식 및 증폭을 위해 또는 발현을 위해, 또는 이들 둘다를 위해 디자인된 벡터, 예컨대, 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 벡터는 pUC 시리즈(퍼멘타스 라이프 사이언시스(Fermentas Life Sciences)), pBluescript 시리즈(스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라졸라 소재), pET 시리즈(노바겐(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pGEX 시리즈(파마샤 바이오텍(Pharmacia Biotech), 스웨덴 업살라 소재), 및 pEX 시리즈(클론텍(Clontech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 박테리오파지 벡터, 예컨대, λGT10, λGT11, λZapII(스트라타진), λEMBL4 및 λNM1149도 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예에는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(클론텍)가 포함된다. 동물 발현 벡터의 예에는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(클론텍)가 포함된다. 바람직하게는, 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터이다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 예를 들면, 상기 문헌(Sambrook et al.) 및 상기 문헌(Ausubel et al.)에 기재된 표준 재조합 DNA 기법의 이용을 통해 제조될 수 있다. 원형 또는 선형 발현 벡터의 구축물은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 작용하는 복제 시스템을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은 예를 들면, ColE1, 2 μ 플라스미드, λ, SV40, 소 파필로마 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.

바람직하게는, 재조합 발현 벡터는 이 벡터가 DNA에 근거한 벡터인지 아니면 RNA에 근거한 벡터인지를 고려하여 적절한 경우 상기 벡터가 도입될 숙주(예를 들면, 세균, 진균, 식물 또는 동물)의 유형에 특이적인 조절 서열, 예컨대, 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함한다.

재조합 발현 벡터는 형질전환된 또는 형질감염된 숙주의 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생물제 내성, 예를 들면, 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 원영양성(prototrophy)을 제공하기 위한 영양요구성 숙주에서의 상보성(complementation) 등을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터에 적합한 마커 유전자는 예를 들면, 네오마이신/G418 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 히스티다이놀 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 앰피실린 내성 유전자를 포함한다.

상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 PE 또는 키메라 분자(기능성 부분 및 기능성 변이체를 포함함)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 PE 또는 키메라 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적이거나 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 천연 또는 비천연 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터, 예를 들면, 강한 프로모터, 약한 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 발생 특이적 프로모터의 선택은 당업자의 통상의 기술 내에 있다. 유사하게, 뉴클레오티드 서열과 프로모터의 조합도 당업자의 통상의 기술 내에 있다. 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 또는 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 일시적 발현, 안정한 발현 또는 이들 둘다를 위해 디자인될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 항시적 발현 또는 유도성 발현용으로 만들어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 본원에 기재된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 함유할 수 있는 임의의 유형의 세포를 의미한다. 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 식물, 동물, 진균 또는 조류 세포일 수 있거나, 원핵 세포, 예를 들면, 세균 또는 원생동물일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 세포, 부착 세포 또는 현탁된 세포, 즉 현탁액에서 생장하는 세포일 수 있다. 본 발명의 재조합 PE 또는 키메라 분자를 제조하기 위해, 숙주 세포는 바람직하게는 원핵 세포, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 세포이다.

본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 숙주 세포를 포함하는 세포 집단도 제공한다. 상기 세포 집단은 하나 이상의 다른 세포, 예를 들면, 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하지 않는 숙주 세포 이외에 본원에 기재된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 불균질한 집단일 수 있다. 대안적으로, 세포 집단은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 주로 포함하는(예를 들면, 본질적으로 상기 숙주 세포로 구성된) 실질적으로 균질한 집단일 수 있다. 상기 집단은 집단의 모든 세포들이 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 숙주 세포의 클론인 클론성 세포 집단일 수도 있고, 이로써 상기 집단의 모든 세포들은 재조합 발현 벡터를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포 집단은 본원에 기재된 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 클론성 집단이다.

본 발명의 PE, 키메라 분자(기능성 부분 및 기능성 변이체를 포함함), 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포(이의 집단을 포함함) 및 세포 집단은 단리될 수 있고/있거나 정제될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 제거된 상태를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "정제된"은 순도에서 증가된 상태를 의미하고, 이때 "순도"는 상대적 용어이고 절대적 순도로서 해석될 필요가 없다. 예를 들면, 순도는 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 100%일 수 있다. 순도는 바람직하게는 약 90% 이상(예를 들면, 약 90% 내지 약 95%), 보다 바람직하게는 약 98% 이상(예를 들면, 약 98% 내지 약 99%)이다.

본 발명의 PE, 키메라 분자(기능성 부분 및 기능성 변이체를 포함함), 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포(이의 집단을 포함함) 및 세포 집단(이들 모두 이하에서 "본 발명의 PE 물질"로서 총칭됨)은 조성물, 예컨대, 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 임의의 PE, 키메라 분자(기능성 부분 및 기능성 변이체를 포함함), 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포(이의 집단을 포함함) 및 세포 집단, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 PE 물질들 중 임의의 PE 물질을 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 하나 초과의 본 발명의 PE 물질, 예를 들면, 폴리펩티드 및 핵산, 또는 둘 이상의 상이한 PE를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 약학 조성물은 하나 이상의 다른 약학적 활성 물질 또는 약물, 예컨대, 화학치료제, 예를 들면, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등과 함께 본 발명의 PE 물질을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 담체는 약학적으로 허용가능한 담체이다. 약학 조성물과 관련하여, 담체는 통상적으로 사용되는 담체들 중 임의의 담체일 수 있고 화학-물리적 고려사항, 예컨대, 가용성 및 활성 화합물(들)과의 반응성 결여, 및 투여 경로에 의해서만 한정된다. 본원에 기재된 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들면, 비히클, 보조제, 부형제 및 희석제는 당업자에게 잘 공지되어 있고 공중에게 용이하게 입수될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 활성 물질(들)에 대한 화학적 불활성을 나타내는 담체 및 사용 조건 하에 유해한 부작용 또는 독성을 갖지 않는 담체인 것이 바람직하다.

담체의 선택은 부분적으로 구체적인 본 발명의 PE 물질뿐만 아니라 본 발명의 PE 물질의 투여에 이용되는 구체적인 방법에 의해 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 다양한 적합한 제제들이 존재한다. 비경구(예를 들면, 피하, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 복강내 및 경막내), 경구 및 에어로졸 투여를 위한 하기 제제들은 예시적인 제제들이고 결코 한정하기 위한 것이 아니다. 하나 초과의 경로를 이용하여 본 발명의 PE 물질을 투여할 수 있고, 일부 경우 특정 경로가 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

국소 제제는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 제제는 본 발명과 관련하여 피부에 적용되기에 특히 적합하다.

경구 투여에 적합한 제제는 (a) 액체 용액, 예컨대, 희석제, 예컨대, 물, 식염수 또는 오랜지 쥬스에 용해된 유효량의 본 발명의 PE 물질; (b) 예정된 양의 활성 성분을 고체 또는 과립으로서 각각 함유하는 캡슐제, 사셰, 정제, 로젠지 및 트로치; (c) 산제; (d) 적절한 액체 중의 현탁액; 및 (e) 적합한 유화액을 포함할 수 있다. 액체 제제는 약학적으로 허용가능한 계면활성제가 첨가되어 있거나 첨가되어 있지 않은 희석제, 예컨대, 물 및 알코올, 예를 들면, 에탄올, 벤질 알코올 및 폴리에틸렌 알코올을 포함할 수 있다. 캡슐제 제형은 예를 들면, 계면활성제, 윤활제 및 불활성 충전제, 예컨대, 락토스, 수크로스, 칼슘 포스페이트 및 옥수수 전분을 함유하는 통상의 경질 또는 연질 외피 젤라틴 유형의 캡슐제일 수 있다. 정제 제형은 락토스, 수크로스, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 미세결정질 셀룰로스, 아카시아, 젤라틴, 구아 검, 콜리이드성 이산화규소, 크로스카멜로스 나트륨, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 및 다른 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 붕해제, 보습제, 보존제, 방향제 및 다른 약학적으로 상용가능한 부형제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 로젠지 제형은 방향제, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸쓰 중의 본 발명의 PE 물질뿐만 아니라, 불활성 염기, 예컨대, 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 중의 본 발명의 PE 물질을 포함하는 향정, 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 이러한 부형제들을 추가로 함유하는 유화액, 겔 등도 포함할 수 있다.

본 발명의 PE 물질은 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 함께 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제제로 만들어질 수 있다. 이들 에어로졸 제제들은 가압된 허용가능한 추진제, 예컨대, 다이클로로다이플루오로메탄, 프로판, 질소 등 내에 배치될 수 있다. 에어로졸 제제는 예컨대, 분무기 또는 분사기 내의 비가압된 제제용 약제로서 제제화될 수도 있다. 이러한 분무 제제들은 점막에 분무하는 데에도 사용될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 제제는 제제가 원하는 수용자의 혈액에 대해 등장성을 나타내게 하는 항산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 등장성 멸균 주사 용액 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액; 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 멸균 현탁액 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 본 발명의 PE 물질은 약학적으로 허용가능한 계면활성제, 예컨대, 비누 또는 세제, 현탁제, 예컨대, 펙틴, 카보머, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 또는 카복시메틸셀룰로스, 또는 유화제 및 다른 약학 보조제가 첨가되어 있거나 첨가되어 있지 않은 물, 식염수, 수성 덱스트로스 및 관련 당 용액, 알코올, 예컨대, 에탄올 또는 헥사데실 알코올, 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 다이메틸설폭사이드, 글리세롤, 케탈, 예컨대, 2,2-다이메틸-1,3-다이옥솔란-4-메탄올, 에테르, 폴리(에틸렌글리콜) 400, 오일, 지방산, 지방산 에스터 또는 글리세라이드, 또는 아세틸화된 지방산 글리세라이드를 비롯한 약학 담체 중의 생리학적으로 허용가능한 희석제, 예컨대, 멸균 액체 또는 액체 혼합물로 투여될 수 있다.

비경구 제제에서 사용될 수 있는 오일은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오일을 포함한다. 오일의 구체적인 예에는 땅콩유, 대두유, 참깨유, 면실유, 옥수수유, 올리브유, 광유 및 광물유가 포함된다. 비경구 제제에서 사용되기에 적합한 지방산은 올레산, 스테아르산 및 이소스테아르산을 포함한다. 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트가 적합한 지방산 에스터의 예이다.

비경구 제제에서 사용되기에 적합한 비누는 지방 알칼리 금속, 암모늄 및 트라이에탄올아민 염을 포함하고, 적합한 세제는 (a) 양이온성 세제, 예를 들면, 다이메틸 다이알킬 암모늄 할라이드 및 알킬 피리디늄 할라이드, (b) 음이온성 세제, 예를 들면, 알킬, 아릴 및 올레핀 설포네이트, 알킬, 올레핀, 에테르 및 모노글리세라이드 설페이트, 및 설포석시네이트, (c) 비이온성 세제, 예를 들면, 지방 아민 산화물, 지방산 알칸올아마이드 및 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌 공중합체, (d) 양쪽성 세제, 예를 들면, 알킬-β-아미노프로피오네이트 및 2-알킬-이미다졸린 사차 암모늄 염, 및 (e) 이들의 혼합물을 포함한다.

비경구 제제는 전형적으로 용액 중에 약 0.5 중량% 내지 약 25 중량%의 본 발명의 PE 물질을 함유할 것이다. 보존제 및 완충제도 사용될 수 있다. 주사 부위에서의 자극을 최소화하거나 제거하기 위해, 이러한 조성물은 약 12 내지 약 17의 친수성-친유성 균형(HLB)을 갖는 하나 이상의 비이온성 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 제제에서 계면활성제의 양은 전형적으로 약 5 중량% 내지 약 15 중량%일 것이다. 적합한 계면활성제는 프로필렌 옥사이드와 프로필렌 글리콜의 축합에 의해 형성된 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스터, 예컨대, 소르비탄 모노올레에이트, 및 에틸렌 옥사이드와 소수성 염기의 고분자량 부가물을 포함한다. 비경구 제제는 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉된 용기, 예컨대, 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있고, 주사의 경우 사용 직전에 멸균 액체 부형제, 예를 들면, 물의 첨가만을 요구하는 냉동-건조(동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 전술된 종류의 멸균 산제, 과립제 및 정제로부터 제조될 수 있다. 비경구 조성물을 위한 효과적인 약학 담체의 요건은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238 250 (1982)) 및 문헌(ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622 630 (1986)) 참조).

당업자는 본 발명의 PE 물질이 전술된 약학 조성물 이외에 포접 복합체, 예컨대, 사이클로덱스트린 포접 복합체, 또는 리포좀으로서 제제화될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

본 발명의 목적상, 투여되는 본 발명의 PE 물질의 양 또는 용량은 적절한 시간에 걸쳐 포유동물에서 원하는 반응, 예를 들면, 치료 또는 예방 반응을 수행하기에 충분해야 한다. 예를 들면, 본 발명의 PE 물질의 용량은 투여 시간으로부터 약 2시간 이상의 시간, 예를 들면, 12시간 내지 24시간 또는 그 이상의 시간 이내에 표적 세포의 생장을 억제하거나 암을 치료하거나 예방하기에 충분해야 한다. 일부 실시양태들에서, 상기 시간은 훨씬 더 길 수 있다. 용량은 구체적인 본 발명의 PE 물질의 효능 및 포유동물(예를 들면, 인간)의 상태뿐만 아니라 치료될 포유동물(예를 들면, 인간)의 체중에 의해 결정될 것이다.

투여되는 용량을 결정하는 많은 어세이들이 당분야에서 공지되어 있다. 투여되는 용량은 시험관내(예를 들면, 세포 배양) 또는 생체내(예를 들면, 동물 연구)에서 결정될 수 있다. 예를 들면, 투여되는 용량은 IC₅₀(증상의 절반-최대 억제를 달성하는 용량), LD₅₀(집단의 50%에게 치명적인 용량), ED₅₀(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량), 및 세포 배양 및/또는 동물 연구에서의 치료 지수를 결정함으로써 결정될 수 있다. 치료 지수는 LD₅₀ 대 ED₅₀의 비(즉, LD₅₀/ED₅₀)이다.

본 발명의 PE 물질의 용량은 구체적인 본 발명의 PE 물질의 투여에 의해 수반되는 임의의 불리한 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해서도 결정될 것이다. 전형적으로, 주치의는 다양한 인자들, 예컨대, 연령, 체중, 일반적인 건강, 식습관, 성별, 투여되는 본 발명의 PE 물질, 투여 경로 및 치료되는 병태의 중증도를 고려하여 각각의 개별 환자를 치료하는 데에 사용되는 본 발명의 PE 물질의 용량을 결정할 것이다. 예를 들면, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 PE 물질의 용량은 약 0.001 내지 약 1000 mg/kg(치료될 대상체의 체중)/일, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg(체중)/일, 약 0.01 mg 내지 약 1 mg/kg(체중)/일, 약 1 내지 약 1000 mg/kg(체중)/일, 약 5 내지 약 500 mg/kg(체중)/일, 약 10 내지 약 250 mg/kg(체중)/일, 약 25 내지 약 150 mg/kg(체중)/일, 또는 약 10 mg/kg(체중)/일일 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 PE 물질은 데포 형태로 변경될 수 있고, 이로써 본 발명의 PE 물질이 투여되는 체내로 방출되는 방식은 체내에서의 시간 및 위치와 관련하여 조절된다(예를 들면, 미국 특허 제4,450,150호 참조). 본 발명의 PE 물질의 데포 형태는 예를 들면, 본 발명의 PE 물질 및 다공성 또는 비다공성 물질, 예컨대, 중합체를 포함하는 이식가능한 조성물일 수 있고, 이때 본 발명의 PE 물질은 상기 물질 전체를 통해 및/또는 상기 비다공성 물질의 분해를 통해 캡슐화되거나 확산된다. 그 다음, 상기 데포는 체내의 원하는 위치 내로 이식되고, 본 발명의 PE 물질은 예정된 속도로 이식재로부터 방출된다.

본 발명의 PE 물질은 당분야에서 공지된 어세이에 의해 세포독성에 대해 어세이될 수 있다. 세포독성 어세이의 예에는 국제 특허출원 공개 제WO 2011/032022호에 기재된 바와 같이 테트라졸륨 염 WST-1을 사용하여 세포 증식을 측정하는 WST 어세이(로슈 어플라이드 사이언시스(Roche Applied Sciences)로부터 입수될 수 있는 시약 및 키트)가 포함된다.

본 발명의 약학 조성물, PE, 키메라 분자, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포 또는 세포 집단은 암의 치료 또는 예방 방법에서 사용될 수 있다고 생각된다. 특정 이론 또는 기작에 의해 구속받지 않지만, 본 발명의 PE는 진핵 세포에서 단백질 합성의 억제를 통해, 예를 들면, 연장 인자 2(EF-2)의 ADP 리보실화의 불활성화에 의해 세포의 생장을 파괴하거나 억제한다고 생각된다. 특정 이론 또는 기작에 의해 구속받지 않지만, 본 발명의 키메라 분자는 세포 표면 마커를 인식하고 상기 세포 표면 마커에 특이적으로 결합함으로써, 세포 표면 마커를 발현하지 않는 세포와의 교차반응성을 최소한으로 나타내거나 전혀 나타내지 않는 세포독성 PE를 세포 표면 마커를 발현하는 세포의 집단에 전달한다. 이 방식으로, PE의 세포독성은 세포, 예를 들면, 암세포의 특정 집단의 생장을 파괴하거나 억제하도록 표적화될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 PE, 키메라 분자, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 또는 약학 조성물을 포유동물에서 암의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "치료한다" 및 "예방한다"뿐만 아니라 이들로부터 도출된 단어들은 반드시 100% 또는 완전한 치료 또는 예방을 내포하지는 않는다. 오히려, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자가 잠재적인 이익 또는 치료 효과를 갖는 것으로서 인식하는 치료 또는 예방의 다양한 정도가 존재한다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 포유동물에서 임의의 양 또는 임의의 수준의 암 치료 또는 예방을 제공할 수 있다. 나아가, 본 발명의 방법에 의해 제공된 치료 또는 예방은 치료되거나 예방되는 질환, 예를 들면, 암의 하나 이상의 병태 또는 증상의 치료 또는 예방을 포함할 수 있다. 또한, 본원의 목적상, "예방"은 질환, 또는 이의 증상 또는 병태의 발병을 지연시키는 것을 포괄할 수 있다.

숙주 세포 또는 세포 집단이 투여되는 본 발명의 방법의 목적상, 상기 세포는 숙주에 대한 동종이계성(allogeneic) 또는 자가성(autologous) 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 숙주에 대한 자가성 세포이다.

본 발명의 방법과 관련하여, 암은 하기 암들을 포함하는 임의의 암일 수 있다: 임의의 부신암, 육종(예를 들면, 활막육종, 골형성육종, 자궁 평활근육종, 혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종, 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종), 림프종(예를 들면, 소림프구성 림프종, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종), 간세포암종, 신경아교종, 두부암(예를 들면, 편평세포암종), 경부암(예를 들면, 편평세포암종), 급성 림프구성 암, 백혈병(예를 들면, 모발세포 백혈병, 골수성 백혈병(급성 및 만성), 림프성 백혈병(급성 및 만성), 전구림프구성 백혈병(PLL), 골수단핵구성 백혈병(급성 및 만성) 및 림프구성 백혈병(급성 및 만성)), 골암(골형성육종, 섬유육종, 악성 섬유조직구종, 연골육종, 에윙육종, 악성 림프종(세망세포육종), 다발성 골수종, 악성 거대세포 종양, 척삭종, 골연골종(골연골성 외골증), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액유사 섬유종, 유골 골종 및 거대세포 종양), 뇌암(성상세포종, 수모세포종, 신경아교종, 뇌실막종, 종자세포종(송과체종), 다형성 신경아교모세포종, 희소돌기아교세포종, 슈반세포종 및 망막모세포종), 나팔관암, 유방암, 항문, 항문관 또는 항문직장의 암, 안암, 간내 담관암, 관절암, 경부, 담낭 또는 흉막의 암, 코, 비강 또는 중이의 암, 구강암, 음문암(예를 들면, 편평세포암종, 상피내암종, 선암종 및 섬유육종), 골수증식 장애(예를 들면, 만성 골수성 암), 결장암(예를 들면, 결장암종), 식도암(예를 들면, 편평세포암종, 선암종, 평활근육종 및 림프종), 자궁경부암(자궁경부암종 및 전구침습성 자궁경부 형성이상증), 위암, 위장 카르시노이드 종양, 하인두암, 후두암, 간암(예를 들면, 간세포암종, 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포선종 및 혈관종), 폐암(예를 들면, 기관지성암종(편평세포, 미분화된 소세포, 미분화된 대세포 및 선암종), 폐포(세기관지)암종, 기관지선종, 연골종성 과오종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암 및 폐 선암종), 악성 중피종, 피부암(예를 들면, 흑색종, 기저세포암종, 편평세포암종, 카포시 육종, 모반, 이형성 모반, 지방종, 혈관종, 피부섬유종 및 켈로이드), 다발성 골수종, 비인두암, 난소암(예를 들면, 난소암종(심각한 낭선암종, 점액성 낭선암종, 자궁내막모양암종 및 투명세포선암종), 과립난포막세포 종양, 세르톨리-레이디그(Sertoli-Leydig) 세포 종양, 난소고환종 및 악성 기형종), 췌장암(예를 들면, 췌관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 카르시노이드 종양 및 비포마(VIPoma)), 복막, 그물막 또는 장간막의 암, 인두암, 전립선암(예를 들면, 선암종 및 육종), 직장암, 신장암(예를 들면, 선암종, 윌름스 종양(신모세포종), 및 신장세포암종), 소장암(선암종, 림프종, 카르시노이드 종양, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종 및 섬유종), 연조직암, 위암(예를 들면, 암종, 림프종 및 평활근육종), 정소암(예를 들면, 고환종, 기형종, 배아암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 레이디그 세포 종양, 섬유종, 섬유선종, 선종모양 종양 및 지방종), 자궁암(예를 들면, 자궁내막암종), 갑상선암 및 요로상피암(예를 들면, 편평세포암종, 전이세포암종, 선암종, 요관암 및 방광암).

본원에서 사용된 용어 "포유동물"은 설치류 목의 포유동물, 예컨대, 마우스 및 햄스터, 및 중치류 목의 포유동물, 예컨대, 토끼를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 포유동물을 의미한다. 포유동물은 고양이과(고양이) 및 개과(개)를 포함하는 육식류 목의 포유동물인 것이 바람직하다. 포유동물은 소과(소) 및 돼지과(돼지)를 포함하는 우제류 목, 또는 말과(말)를 포함하는 기제류 목의 포유동물인 것이 보다 더 바람직하다. 포유동물은 영장류 목(세보이드(Ceboid) 또는 시모이드(Simoid)(원숭이)), 또는 유인원류 목(인간 및 유인원)의 포유동물인 것이 가장 바람직하다. 특히 바람직한 포유동물은 인간이다.

본원에 기재된 임의의 PE, 키메라 분자, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 또는 약학 조성물을 표적 세포의 생장 억제에 효과적인 양으로 상기 표적 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포의 생장을 억제하는 방법도 제공된다. 표적 세포의 생장은 임의의 양, 예를 들면, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 100%까지 억제될 수 있다. 표적 세포는 생물학적 샘플 중에 제공될 수 있다. 생물학적 샘플은 임의의 적합한 방식에 의해 포유동물 및 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들면, 채혈, 백혈구분리반출법, 및/또는 종양 생검 또는 부검에 의해 수득될 수 있다. 접촉 단계는 포유동물에 대하여 시험관내에서 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 바람직하게는, 접촉은 시험관내에서 일어난다.

본 발명의 한 실시양태에서, 표적 세포는 암세포이다. 표적 세포는 본원에 기재된 임의의 암의 암세포일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 표적은 세포 표면 마커를 발현할 수 있다. 세포 표면 마커는 본 발명의 다른 양태와 관련하여 본원에 기재된 임의의 세포 표면 마커일 수 있다. 세포 표면 마커는 예를 들면, CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, 트랜스페린 수용체, EGF 수용체, 메소텔린, 캐드헤린 및 루이스 Y로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 예하기 위한 것이므로, 당연히 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.

실시예 1

본 실시예는 전세계 인구의 HLA 클래스 2 대립형질의 빈도와 비교된 비자극 공여자 집단의 HLA 클래스 2 대립형질의 빈도를 입증한다.

NIH 혈액 은행으로부터 수득된 65명의 건강한 공여자들 및 NCI에서 면역독소로 치료받은 50명의 환자들로부터 말초혈 단핵세포(PBMC)를 단리하였다. PBMC를 피콜(Ficoll) 밀도 원심분리로 버피 코트(buffy coat)로부터 단리하였다. PCR-SSP/SSO에 근거한 조직 타이핑 키트를 사용하여 환자 및 건강한 공여자의 PBMC의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 반수체(haplotype)를 확인하였다. 그 다음, PBMC를 열-불활성화된 인간 AB 혈청 및 표준 동결 매질에서 동결시키고 사용될 때까지 액체 질소에서 저장하였다.

65명의 건강한 공여자들의 집단을 연구하여 전세계 인구에서 발현된 HLA DR 동종이형(allotype)의 수 및 빈도에 대한 정보를 제공하였다. 비자극 공여자 집단에서 발현된 동종이형의 분석을 전세계 인구와 비교하였는데(Middleton, D. et al., New Allele Frequency Database: www.allelefrequencies.net, Tissue Antigens, 61(5): 403-7(2003)), 이것은 비자극 공여자 집단에서 주요 HLA 클래스 II DRB1 대립형질의 적절한 표시가 존재한다는 것을 보여주었다. 통계적 분석은 전세계 인구와 공여자 집단 사이에 R²=0.52의 상관관계를 보여주었다. 도 1은 전세계 인구에서의 상이한 유형의 HLA 클래스 2 대립형질의 빈도를 비자극 공여자 집단과 비교한다. 표 1은 공여자 집단의 HLA 클래스 II DRB1 반수체를 보여준다.

실시예 2

본 실시예는 T 세포를 자극하는 데에 사용될 펩티드 라이브러리의 제조를 입증한다.

독소 모이어티의 면역원성을 측정하기 위해, PE38의 전체 서열에 걸쳐 있는 111개의 펩티드들로 구성된 라이브러리를 디자인하였다. 상기 펩티드들은 각각 15개 아미노산의 크기를 갖고, 11개의 아미노산에 의해 중첩되는 펩티드 서열번호 31 및 32를 제외하고 12개의 아미노산에 의해 중첩되었다. 상기 펩티드들은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(어메리칸 펩티드 컴파니 인코포레이티드(American Peptide Co. Inc.), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)에 의해 측정되었을 때 95% 초과의 순도로 합성되었다. 동결건조된 합성 펩티드를 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 10 μM 저장 용액을 제조하였다.

상기 펩티드들을 표 2에 나타낸 바와 같이 22개의 풀로 분류하였다. 표 2는 에피토프 맵핑에 사용된 펩티드들의 서열, 서열번호 및 풀 번호를 보여준다.

실시예 3

본 실시예는 비자극 공여자 T 세포의 시험관내 증폭이 펩티드 풀에 대한 T 세포의 민감성 및 반응 수준을 개선한다는 것을 입증한다.

치료 후 환자에서 일어나는 면역 반응을 최소화하고 단기간 어세이에서 비자극 공여자 샘플의 낮은 민감성 및 비반응성을 극복하기 위해, 17일간의 시험관내 증폭 단계를 이용하여 특이적 T 세포 집단을 증폭하였다(Oseroff et al., J. Immunol., 185(2): 943-55 (2010)). 세포를 면역독소로 자극한 후 14일 내지 17일 동안 항온처리하였다. 자극을 위해, 인간 면역 세포 상에 존재하지 않는 항원인 면역독소 LMB9 또는 B3 (dsFv)-PE38 표적화 LeY(Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(16): 7538-42 (1993))를 사용하였다. 14일째 날 내지 17일째 날, 세포를 수거하고 표 2의 22개 펩티드 풀을 사용한 인터루킨(IL)-2 엘리스폿 어세이로 어세이하였다. 시험관내 증폭 단계의 추가는 엘리스폿 어세이의 민감성 및 반응 수준을 개선하였다(예를 들면, 보다 많은 스폿 형성 세포(SFC)가 관찰되었다). 시험관내 증폭 단계는 지원 공여자로부터의 CD4 특이적 반응의 검출을 가능하게 하였고 각각의 어세이에 사용된 세포의 수도 감소시켰다.

대표적인 데이터는 도 2a 및 2b에 나타나 있다. 도 2a는 17일간의 시험관내 증폭 후 LMB9(1.6 ㎍/㎖)의 초기 자극에 이어서 배지 단독(펩티드 부재)(M) 또는 펩티드 풀 3, 16 또는 22를 사용한 재자극에 대한 비자극 공여자 031810aph T 세포의 반응을 표시하는 IL-2 엘리스폿 웰의 계수(enumeration)를 보여준다. 도 2b는 시험관내 증폭이 없는 경우 LMB9(1.6 ㎍/㎖)의 초기 자극에 이어서 배지 단독(펩티드 부재)(M) 또는 펩티드 풀 3, 16 또는 22를 사용한 재자극에 대한 비자극 공여자 031810aph T 세포의 반응을 표시하는 IL-2 엘리스폿 웰의 계수를 보여준다.

특정 이론 또는 기작으로 구속받고자 하는 것은 아니지만, 이 방법은 생체내에서와 같이 전체 재조합 면역독소(RIT)가 항원 제시 세포(APC)에 의해 내재화되고 프로세싱되고 처음 수일의 배양 동안 제시되었기 때문에 면역 반응을 모방하였다고 생각된다. 천연적으로 제시된 펩티드에 반응한 특이적 T 세포가 IL-2의 사용을 통해 유지되고 증폭되었다. 17일간의 증폭 후 T 세포가 인식한 에피토프는 천연적으로 프로세싱되고 천연적으로 제시된 펩티드이었다.

실시예 4

본 실시예는 LVALYLAARLSW(서열번호 3)가 대다수의 공여자들에 대해 T 세포 반응을 자극한다는 것을 입증한다.

면역독소를 사용한 초기 자극 및 14일간의 증폭 후, 세포의 절반을 수거하고 IL-2 엘리스폿을 이용한 초기 풀 스크린을 위해 펩티드 풀에 노출시켰다. 17일째 날, 남은 세포를 사용하여 상기 풀 스크린을 반복하였고, 관찰된 양성 풀에 대한 섬세한 스크린을 수행하였다. 어세이의 14일째 날에 28명의 공여자들에 대해 상이한 반응 패턴들이 관찰되었다. 몇몇 공여자 스크린은 단일 풀에 대한 반응을 나타낸 반면(예를 들면, 공여자 1, 4, 7 및 8), 다른 공여자들(예를 들면, 공여자 15, 16 및 23)은 3개 내지 4개의 풀에 대한 반응을 나타내었다. 중첩된 펩티드 때문에, 풀들 사이의 중첩, 예컨대, 순차적인 풀들이 반응을 갖는 경우(예를 들면, 공여자 15 및 18의 경우 풀 15 및 16에 대한 반응)도 있었다. 역치는 85 SFC/(1 x 10⁶)인 것으로 결정되었다. 이 역치는 85 SFC/(1 x 10⁶) 미만의 값들의 경우 14일째 날의 반응들 중 어떠한 반응도 17일째 날 또는 시험관내 증폭이 반복되었을 때 재현될 수 없었기 때문에 결정되었다. 85 SFC/(1 x 10⁶) 초과의 반응은 재현될 수 있었다.

4명의 공여자들(공여자 25 내지 28)은 임의의 풀에 대한 (관찰된 역치를 초과하는) 반응을 갖지 않았고 비반응성 공여자로서 간주되었다. 전체적으로 스크리닝된 초기 28명의 공여자들 중 24명의 공여자들이 하나 이상의 풀에 대한 반응을 가졌다. 상이한 공여자들은 상이한 최대 반응 수준을 가졌다. 몇몇 공여자들(예를 들면, 공여자 2, 7 및 10)은 높은 최대 반응(풀 3의 경우 1100 SFC를 초과함)을 가진 반면, 다른 공여자들(예를 들면, 공여자 3 및 9)은 동일한 풀에 대한 250 SFC 내지 320 SFC의 반응을 가졌다.

스크리닝된 공여자들의 수를 50까지 증가시켰다. 모든 50명의 공여자들 사이에서 관찰된 스폿 형성 세포의 수를 22개의 펩티드 풀 각각에 대해 합산하였다. 결과는 표 3 및 도 3에 나타나 있다. 모든 50명의 공여자들의 분석은 풀 3(PE 도메인 II에서)이 가장 높은 반응을 제공하였다는 것을 보여준다(표 3; 도 3). 결과는 풀 3이 상이한 HLA들을 갖는 많은 공여자들로부터 반응을 자극한 면역우성 풀이었다는 것을 암시한다.

면역우성 영역(들)을 발견하기 위한 풀 3의 섬세한 스크린은 대다수의 공여자들의 경우 펩티드 서열번호 44 및 45가 풀 3 내의 반응에 대한 원인이었다는 것을 보여주었다(도 4). 도 4는 펩티드 서열번호 44 및 45가 상이한 HLA 상태를 가짐에도 불구하고 대다수의 환자들에서 T 세포를 자극하는 공통된 영역(LVALYLAARLSW)(서열번호 3)을 함유하였다는 것을 보여준다.

실시예 5

본 실시예는 LVALYLAARLSW(서열번호 3) 내의 치환 L294A, L297A, Y298A, L299A 또는 R302A가 LVALYLAARLSW(서열번호 3)의 면역원성을 감소시킨다는 것을 입증한다.

(풀 3 내의) 펩티드 서열번호 44 및 45는 공통적으로 12개의 아미노산을 갖는다. 이 공통 영역 LVALYLAARLSW(서열번호 3)는 서열번호 1의 아미노산 잔기 위치 294 내지 305에 상응하고 MHC 결합 부위뿐만 아니라 T 세포 수용체 결합 부위도 함유한다. LVALYLAARLSW(서열번호 3) 내의 각각의 아미노산을 알라닌으로 치환시켰다. 9명의 비자극 공여자들 및 2명의 환자들로부터의 샘플을 17일 동안 LMB9로 자극하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 IL-2 엘리스폿을 이용하여 어세이하였다. 표 4는 치환된 펩티드들에 대한 11개 샘플들의 스크리닝으로부터 수득된 데이터를 요약한다. 상기 11개 샘플들 중 10개 샘플들의 경우, 하나 이상의 치환이 반응을 야생형(WT)에 대한 반응의 7% 미만까지 감소시켰다. 1명의 공여자를 제외한 모든 공여자들의 경우, 치환 L297A는 반응을 7% 미만까지 감소시켰다. Y298A는 상기 11개 샘플들 중 9개 샘플들에서 반응을 감소시켰고, R302A는 상기 11개 샘플들 중에서 7개 샘플들에서 반응을 감소시켰다. 표 4는 WT 펩티드를 사용하여 수득한 반응의 % 반응을 보여준다.

특정 이론 또는 기작에 의해 구속받지 않지만, 단일 아미노산의 변화 후 감소된 반응은 펩티드와 HLA 분자의 홈(들)의 결합이 방해되거나 T 세포 수용체가 변화된 펩티드를 인식할 수 없기 때문일 수 있다고 생각된다. 어느 경우든, 치환된 펩티드 L279A 및 Y298A는 감소된 반응을 야기하였으므로 감소된 면역원성을 제공하는 것으로 간주될 수 있다.

실시예 6

본 실시예는 치환 R302A가 임의의 신규 T 세포 에피토프를 생성하지 않고 감소된 T 세포 반응을 제공한다는 것을 입증한다.

종래 기재된 바와 같이(Pastan et al., Methods Mol. Biol., 248: 503-18 (2004)), 부위-지정된 돌연변이유발을 이용하여 RIT R302 HA22 및 L297A HA22를 제조하였다. CA46 세포 상의 세포독성 활성을 HA22 야생형의 세포독성 활성과 비교하였다(도 5). 도 5는 치환 L297A 또는 R302A를 갖는 HA22 구축물이 세포독성을 나타내었다는 것을 보여준다. HA22, L297A HA22 및 R302A HA22의 IC₅₀은 각각 1.1 ng/㎖, 1.8 ng/㎖ 및 1.8 ng/㎖이었다.

공여자 010710 및 111909로부터의 PBMC를 WT HA22 또는 HA22-R302A와 함께 14일 동안 배양하였고, 펩티드 부재, 야생형 펩티드 LVALYLAARLSWNQV(서열번호 45)(WT15) 또는 LVALYLAAALSWNQV(서열번호 145)(R302A)를 사용한 재자극 시 T 세포 반응에 대해 어세이하였다. 공여자 010710(도 6a) 및 111909(도 6b) 둘다의 경우, 신규 에피토프가 관찰되지 않았고, 치환된 펩티드에 대한 T 세포 반응이 감소되었다.

실시예 7

본 실시예는 면역우성 에피토프를 함유하는 도메인 II의 부분의 결실이 PE38의 펩티드에 대한 T 세포 반응을 감소시킨다는 것을 입증한다.

실시예 4에 나타낸 바와 같이, 도메인 II는 (풀 3의 서열번호 44 및 45에 함유된) 면역우성 및 무차별적 에피토프를 함유한다. PE-LR(라이소좀 분해에 대한 내성)(LR 또는 LR RIT로서도 공지되어 있음)은 서열번호 37 및 38에 존재하는 푸린 절단 서열 RHRQPRGWEQL(서열번호 8)을 제외하고 도메인 II의 결실을 함유한다. 따라서, LR RIT는 서열번호 1의 아미노산 잔기 274 내지 284 및 395 내지 613을 함유한다.

표 2의 22개 펩티드 풀들에 대한 HA22(PE38을 함유함)에 의해 자극된 공여자 T 세포의 반응을 PE-LR(면역우성 에피토프를 완전히 결여함)에 의해 자극된 공여자 T 세포의 반응과 비교하였다.

0일째 날, 3명의 공여자들(공여자 031510, 공여자 021610 또는 공여자 101509)로부터의 T 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고 10 ㎍/㎖의 HA22 또는 PE-LR로 자극하였다. 14일째 날, 세포를 수거하고 IL-2 엘리스폿 플레이트에 플레이팅하고 표 2의 22개 풀 중 하나의 펩티드와 함께 사중으로 항온처리하였다. 대조군은 세프타지딤(CEFT)-생장된 세포, 0일째 날 항원으로 자극되지 않고 14일째 항원으로 자극되지 않은 세포("M 라인"), 및 0일째 날 LMB9로 자극되고 14일째 날 항원으로 자극되지 않은 세포("펩티드 부재")를 포함하였다.

결과는 도 7a(공여자 031510), 7b(공여자 021610) 및 7c(공여자 101509)에 나타나 있다. 모든 3개의 공여자들로부터의 T 세포는 HA22(PE38을 함유함)를 사용한 자극 시 및 풀 3의 펩티드를 사용한 재자극 시 반응을 나타내었다. PE-LR로 자극된 세포의 경우에는 반응이 관찰되지 않았다.

실시예 8

본 실시예는 PE 도메인 III 내의 T 세포 에피토프의 확인을 입증한다.

면역독소를 사용한 초기 자극 및 14일간의 증폭 후, 20명의 공여자들로부터의 T 세포를 수거하고 실시예 4에 기재된 바와 같이 IL-2 엘리스폿을 이용한 초기 풀 스크린을 위해 펩티드 풀에 노출시켰다. 17일째 날, 남은 세포를 사용하여 풀 스크린을 반복하고 펩티드 서열번호 102 내지 111을 사용한 섬세한 스크린을 수행하였다. 결과는 도 8에 나타나 있다. 공여자 1 내지 20 각각으로부터의 T 세포에 의한 IL-2 생성을 자극한 펩티드는 도 8에서 음영으로 표시되어 있다.

실시예 9

본 실시예는 IL-2 생성에 의해 측정되었을 때 I493, R494, N495, G496, L498, L499, R500, V501 또는 Y502 대신에 알라닌으로의 치환이 야생형(WT) 펩티드에 대한 반응에 비해 T 세포 반응을 감소시킨다는 것을 입증한다.

야생형 펩티드 IRNGALLRVYVPRSS(서열번호 106)에서 각각의 비-알라닌 아미노산을 알라닌으로 치환시켰다. 비자극 공여자로부터의 샘플을 17일 동안 LMB9로 자극하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 IL-2 엘리스폿을 이용하여 어세이하였다. 표 5는 치환된 펩티드들에 대한 6개 샘플들의 스크리닝으로부터 수득된 데이터를 요약한다.

표 5에 나타낸 바와 같이, 모든 6개 샘플들의 경우, 하나 이상의 치환이 반응을 WT에 대한 반응의 10% 내지 30%까지 감소시켰다. 6개 샘플들 중 5개 샘플들의 경우, 하나 이상의 치환이 반응을 WT에 대한 반응의 10% 미만까지 감소시켰다. 치환 I493A, R494A, N495A, G496A, L498A, L499A, R500A, V501A 또는 Y502A는 6개 샘플들 중 3개 이상의 샘플들에서 T 세포 반응을 WT에 대한 반응에 비해 70% 이상까지 감소시켰다. 표 5는 WT 펩티드를 사용하여 수득한 반응의 % 반응을 보여준다.

실시예 10

본 실시예는 서열번호 38, 39, 44, 45, 81, 82, 86 내지 88, 97, 98, 105 내지 108 및 123 내지 125가 T 세포 에피토프를 함유한다는 것을 입증한다.

50명의 공여자들에 대한 모든 양성 풀들의 섬세한 스크린을 수행하여 면역우성 영역(들)을 확인하였다. 공여자 각각에 대해, SFC의 수를 합산하였고, SFC의 총 수의 펩티드 각각의 분배율을 하기 수학식 I에 따라 계산하고 표준화하였다:

[수학식 I]

상기 식에서,

D는 공여자를 나타내고, x는 50명의 공여자들 중 하나를 나타내고, P는 펩티드를 나타내고, y는 펩티드 서열번호 31 내지 141 중 하나를 나타내고, S_y는 펩티드 y에 대한 SFC의 수를 나타낸다.

표준화된 값은 펩티드 각각의 면역원성의 수준을 나타내고, 50명의 공여자들에 대한 이들 상대적 값들의 점수가 도 9에 표시되어 있다. 도 9는 하기 펩티드들이 T 세포 에피토프를 함유한다는 것을 보여준다: 서열번호 38, 39, 44, 45, 81, 82, 86, 87, 88, 97, 98, 105, 106, 107, 108, 123, 124 및 125.

도메인 III에서 면역원성이 가장 높은 펩티드를 도 9에 기재된 데이터에 근거하여 선별하였다. 펩티드, 펩티드에 반응한 공여자 및 환자의 수, 및 펩티드들에 공통된 서열은 표 6에 기재되어 있다. 표 6의 환자들은 PE38로 이전에 치료받았고, 표 6에 나타낸 반응은 기억 반응이다. 표 6에서, 반응은 펩티드에 반응하는 공여자 또는 환자의 SFC의 5%로서 정의된다.

실시예 11

본 실시예는 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 치환 R421A, L422A, L423A, A425G, R427A, L429A, Y470A, I471A, A472G, P475A, A476G, L477A, I493A, N495A, R494A, L498A, L499A, R500A, V501A, Y502A, V503A, R505A, L508A 또는 P509A가 PE의 면역원성을 감소시킨다는 것을 입증한다.

서열번호 106은 서열번호 1의 아미노산 잔기 위치 493 내지 507에 상응하고, 서열번호 107은 서열번호 1의 아미노산 잔기 위치 496 내지 510에 상응하고, 서열번호 97은 서열번호 1의 아미노산 잔기 위치 466 내지 480에 상응하고, 서열번호 81은 서열번호 1의 아미노산 잔기 위치 418 내지 432에 상응한다. 서열번호 106 및 서열번호 107에서 각각의 아미노산을 알라닌으로 치환시켰다. 공여자들 및 환자들로부터의 샘플을 17일 동안 LMB9로 자극하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 IL-2 엘리스폿을 이용하여 어세이하였다. 표 7(서열번호 106), 표 8(서열번호 107), 표 9(서열번호 97) 및 표 10(서열번호 81)은 치환된 펩티드에 대한 상기 샘플의 스크리닝으로부터 수득된 데이터(야생형(WT) 펩티드에 대한 반응의 %)를 요약한다.

표 7에 나타낸 바와 같이, 치환 I493A, R494A, N495A, L498A, L499A, R500A Y502A, V501A 또는 Y502A는 T 세포 반응을 WT 펩티드에 대한 반응에 비해 70% 이상까지 감소시킨다.

표 8에 나타낸 바와 같이, 치환 L498A, L499A, R500A, V501A, Y502A, V503A, R505A, L508A 또는 P509A는 T 세포 반응을 WT 펩티드에 대한 반응에 비해 70% 이상까지 감소시킨다.

표 9에 나타낸 바와 같이, 치환 Y470A, I471A, A472G, P475A, A476G 또는 L477A는 T 세포 반응을 WT 펩티드에 대한 반응에 비해 70% 이상까지 감소시킨다.

표 10에 나타낸 바와 같이, 치환 R421A, L422A L423A, A425G, R427A 또는 L429A는 T 세포 반응을 WT 펩티드에 대한 반응에 비해 70% 이상까지 감소시킨다.

실시예 12

본 실시예는 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 치환 Y439A, H440A, F443A, L444A, A446G, A447A, I450A, R551A, L552A, T554A, I555A, L556A 또는 W558A가 PE의 면역원성을 감소시킨다는 것을 입증한다.

서열번호 123 및 124 둘다로부터의 아미노산 잔기를 포함하도록 18-머 펩티드(GPEEEGGRLETILGWPLA)(서열번호 198)를 합성하였다. 서열번호 87 및 88 둘다로부터의 아미노산 잔기를 포함하도록 18-머 펩티드(FVGYHGTFLEAAQSIVFG)(서열번호 199)를 합성하였다. 서열번호 198은 서열번호 1의 아미노산 잔기 위치 544 내지 561에 상응하고, 서열번호 199는 서열번호 1의 아미노산 잔기 위치 436 내지 453에 상응한다. 서열번호 198 및 서열번호 199 내의 각각의 아미노산을 알라닌으로 치환시켰다. 공여자들 및 환자들로부터의 샘플을 17일 동안 LMB9로 자극하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 IL-2 엘리스폿을 이용하여 어세이하였다. 표 11(서열번호 198) 및 표 12(서열번호 199)는 치환된 펩티드에 대한 샘플의 스크리닝으로부터 수득된 데이터(야생형(WT) 펩티드에 대한 반응의 %)를 요약한다.

표 11에 나타낸 바와 같이, 치환 R551A, L552A, T554A, I555A, L556A 및 W558A는 T 세포 반응을 WT 펩티드에 대한 반응에 비해 70% 이상까지 감소시킨다.

표 12에 나타낸 바와 같이, 치환 Y439A, H440A, F443A, L444A, A446G, A447A 또는 I450A는 T 세포 반응을 WT 펩티드에 대한 반응에 비해 70% 이상까지 감소시킨다.

실시예 13

본 실시예는 PE 내의 T 세포 에피토프의 확인을 입증한다.

실시예 4 내지 12에서 수득된 결과에 근거하여, 표 13에 기재된 아미노산 서열들을 PE의 T 세포 에피토프로서 확인하였다.

실시예 14 내지 16

하기 물질들 및 방법들을 실시예 14 내지 16을 위해 사용하였다.

환자의 전혈 샘플 수집, 저장 및 RNA 단리: 재조합 면역독소(RIT)로 치료받은 6명의 환자들로부터 혈액 샘플을 수득하였다. 양성자성 세제 및 부가염(프리어날리틱스 게엠베하(PreAnalytiX GmbH), 스위스 홈브레흐티콘 소재)을 함유하는 PAXGENE 튜브 내로 2.5 ㎖ 혈액 샘플을 수집하고 상기 튜브를 4회 내지 6회 약하게 역위시킴으로써 철저히 혼합하고 실온에서 10시간 동안 항온처리한 후 -80℃에서 저장하였다. PAXGENE 혈액 RNA 키트(프리어날리틱스)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 환자의 전혈 샘플로부터 세포내 RNA를 정제하고 -80℃에서 저장하였다.

ScFv 유전자의 중쇄 및 경쇄 cDNA 합성, PCR 증폭 및 조립: 제한효소 부위 또는 벡터 링커를 몇몇 프라이머들에 연결하였다(표 15). 중쇄 레파토리 및 경쇄 레파토리를 따로 제조하여 링커와 연결함으로써 ScFv 형성을 제공하였다. 성숙 B 림프구를 갖는 IgG로부터 중쇄 레파토리를 제조하였다. IgG 불변 영역 프라이머 HuIgG1-4CH1FOR(표 15)과 함께 제1 가닥 cDNA 합성 키트(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 소재)를 사용하여 제1 가닥 cDNA 합성을 수행하였다. κ 불변 영역 프라이머 HuGκFOR(표 15)을 사용하여 Vκ 유전자로부터 경쇄 레파토리를 제조하였다. 40 pmol의 프라이머를 cDNA 합성을 위해 15 ㎕ 반응 혼합물에 첨가하였다.

제1 가닥 cDNA 합성 생성을 이용하여 3-단계 과정으로 V_H 유전자 및 V_κ 유전자를 따로 증폭하였다. IgG 불변 영역 프라이머 HuIgG1-4CH1FOR 및 적절한 패밀리계 인간 V_H 역방향 프라이머들(표 15)의 등몰 혼합물을 제1 단계 PCR에서 사용하여 환자의 전혈 샘플로부터 수득된 세포내 RNA 내의 V_H 유전자를 커버하였다. κ 불변 영역 프라이머 HuGκFOR 및 적절한 패밀리계 인간 V_κ 역방향 프라이머(표 15)를 V_κ 유전자에 대해 사용하였다. 제조자의 권고에 따라 10 pmol의 각각의 프라이머와 함께 고신뢰성(high-fidelity) 중합효소 푸젼(PHUSION)(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)을 사용하여 최종 부피 50 ㎕의 반응 혼합물에서 제1 단계 PCR을 수행하였다.

10 pmol의 각각의 프라이머와 함께 고신뢰성 중합효소 PRIMESTAR(타카라(Takara), 일본 쿄토 소재)를 제2 단계 PCR, 중첩 연장에 의한 스플라이싱(SOE) PCR, 및 삽입물 제조를 위한 마지막 단계에서 제조자의 권고에 따라 사용하였다. NcoI 부위(밑줄로 표시됨)를 포함하는 5'-GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3'(서열번호 185)의 서열을 인간 V_H 역방향 nco 프라이머(표 15)를 위해 인간 V_H 역방향 프라이머에 연결하였다. pCANTAB 벡터를 파지 라이브러리 구축을 위해 사용하였다. pCANTAB 링커를 포함하는 5'-ACC TCC AGA TCC GCC ACC ACC GGA TCC GCC TCC GCC- 3'(서열번호 186)의 서열을 인간 J_H 정방향 링커 프라이머를 위해 인간 J_H 정방향 프라이머에 연결하였다. 인간 V_H 역방향 nco 프라이머 및 인간 J_H 정방향 링커 프라이머를 제2 PCR에서 사용하여 NcoI 부위를 V_H 유전자의 후방에 추가하고 pCANTAB 링커를 V_H 유전자의 전방에 추가하였다.

V_κ 유전자를 증폭하기 위한 제2 단계에서, pCANTAB 링커를 포함하는 5'-GGA TCC GGT GGT GGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC-3'(서열번호 187)의 서열을 인간 V_κ 역방향 링커 프라이머를 위해 인간 V_κ 역방향 프라이머에 연결하였다. NotI 부위(밑줄로 표시됨)를 포함하는 5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC-3'(서열번호 184)의 서열을 인간 Jκ 정방향 Not 프라이머를 위해 인간 J_κ 정방향 프라이머에 연결하였다. 인간 V_κ 역방향 프라이머 및 인간 J_κ 정방향 프라이머를 제2 PCR에서 사용하여 NotI 부위를 V_κ 유전자의 전방에 추가하고 pCANTAB 링커를 V_κ 유전자의 후방에 추가하였다.

(a) V_H 유전자를 위해 R' 링커의 인간 V_H 역방향 Nco 프라이머 및 pCANTAB 링커 프라이머로 구성된 프라이머 쌍(표 15), 및 (b) V_κ 유전자를 위해 F' 링커의 인간 J_κ 정방향 Not 프라이머 및 pCANTAB 링커 프라이머로 구성된 프라이머 쌍(표 15)을 사용하여 제3 단계에서 V_H 유전자 및 V_κ 유전자를 따로 제조하였다.

제3 단계에서 사용된 R' 링커 및 F' 링커의 프라이머들은 상보적 프라이머들이었다. SOE-PCR을 사용하여 V_H 유전자와 V_κ 유전자를 조합하여 ScFv 형성을 제공하였다. 최종적으로, 삽입물 제조를 위해 VHIgGFOR 및 VLREV의 프라이머들(표 15)을 사용하여 ScFv 라이브러리 단편을 증폭하였다.

파지 라이브러리 구축: 증폭된 ScFv 단편을 NcoI 및 NotI으로 절단하고 T4 리가제(ligase)를 사용하여 동일한 효소들로 절단된 pCANTAB 5E 내로 서브클로닝하여 ScFv 라이브러리를 구축하였다. 라이게이션(ligation) 용액을 QIAQUICK 스핀 컬럼(퀴아젠(Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)으로 추출하여 정제하고 물에 재현탁하였다. 발생된 농도는 약 50 ng/㎖이었다. 유전자 펄서(pulser) 및 펄스 조절기 유닛(바이오-라드 레이보레이토리스)을 이용하여 4 ㎕의 샘플을 50 ㎕의 TG1 전기형질전환능 세포(루시겐(Lucigen), 미국 위스콘신주 소재) 내로 전기천공하고 큰 크기의 라이브러리를 위해 6회 반복하였다. 세포를 약 250 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 6 ㎖의 SOC(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)에서 1시간 동안 항온처리하였다. 20 ㎕의 샘플을 수집하고 희석하고 TYE 앰피실린 플레이트 상에서 플레이팅하여 라이브러리 크기를 계산하였다. 200 ㎍/㎖ 앰피실린 및 4% 글루코스를 함유하는 2YT 배지를 6 ㎖의 양으로 첨가하고 또 다른 1시간 동안 항온처리하였다. 100 mg/㎖ 앰피실린 및 2% 글루코스를 함유하는 2YT 배지를 사용하여 배지의 양을 200 ㎖까지 증가시켰다. 세포를 생장시키고(OD₆₀₀ = 0.4), 30분 동안 정치시킨 후 250 rpm에서 30분 동안 진탕하면서 10¹¹ pfu M13K07 헬퍼 파지(뉴 잉글랜드 바이오레이보레이토리스(New England Biolaboratories))로 감염시켰다. 세포를 GSA 로터에서 5,000 rpm에서 5분 동안 수집하고, 250 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 100 ㎍/㎖ 앰피실린 및 50 ㎍/㎖ 가나마이신을 함유하는 100 ㎖ 양의 2YT 배지에 밤새 재현탁하였다.

1/5 부피의 PEG/NaCl(20% 폴리에틸렌 글리콜 6000, 2.5 M NaCl)을 사용하여 상청액으로부터 파지를 침전시키고 2YT 배지로 재현탁하였다. 10 ㎕ 파지의 연속 희석물을 만들고 100 ㎍/㎖ 앰피실린 및 1% 글루코스로 보충된 LB 한천 상에서 플레이팅된 90 ㎕의 TG1 세포(OD₆₀₀ = 0.4)에 첨가함으로써 파지 라이브러리의 역가를 측정하였다. 밤새 생장시킨 후 콜로니의 수를 측정하고 역가를 계산하였다.

파지 라이브러리 패닝(panning): LMB-9(B3(dsFv)-PE38, 루이스 Y 항원에 대해 특이적임)를 파지 라이브러리 패닝을 위한 항원으로서 사용하였다. 50:1의 몰비에서 EZ-링크 설포-NHS-바이오틴(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 일리노이주 록포드 소재)을 사용하여 LMB9를 바이오티닐화하고, 바이오틴 정량 키트(써모 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드 소재)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 각각의 LMB9-바이오틴 상의 바이오틴 기의 수를 측정하였다. 350 ㎖의 파지 및 스트렙타비딘-변경된 자기 비드(DYNABEADS MYONE 스트렙타비딘 T1, 직경 1 ㎛, 바이오티닐화된 Ig의 결합 성능 40 ㎍ mg^-1 내지 50 ㎍ mg^-1, 소수성, 토실-활성화된 비드(인비트로겐))를 3% BSA/PBST(0.1% 트윈-20)에서 미리 차단하였다. 파지를 비드에 의한 탈선별에 적용하였다.

자기 랙(rack)을 이용하여 액체상으로부터 비드를 분리함으로써 상기 비드가 튜브의 측면을 따라 고정되게 하였다. 차단 완충제를 제거하고, 비드를 파지 용액에 재현탁하고 로터 상에서 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 추가 탈선별을 위해 파지 용액을, 미리 차단된 비드를 갖는 또 다른 튜브로 옮겼다. 1 mg 비드를 사용하여 탈선별을 2회 반복하고 2 mg 비드를 사용하여 탈선별을 1회 반복하였다. 파지를 미리 차단된 튜브로 옮기고, 바이오티닐화된 LMB9-바이오틴 항원을 첨가함으로써, 파지-항원-바이오틴 복합체가 제1 라운드의 경우 10 ㎍의 양으로 및 후속 라운드의 경우 5 ㎍의 양으로 LMB9-바이오틴과 함께 형성되게 하였다. 반응 용액을 로터 상에서 실온에서 2시간 동안 항온처리하고 2 mg 비드를 갖는 튜브로 옮겨 로터 상에서 추가 45분 동안 항온처리하였다. 상청액을 제거하고, PBST를 사용하여 비드를 12회 세척하였다. 냉각된 0.1 M HCl을 1 ㎕의 양으로 첨가하여 비드로부터 파지를 방출시키고 pH를 200 ㎕ 트라이스-HCl 용액(pH 8.0)으로 중화시켰다. 이것은 패닝의 결과물이고, 추가 패닝 라운드를 위해 상기 결과물을 레스큐(rescue)하였고, 역가를 계산하였다. 레스큐를 위해 결과물 파지를 0.6 ㎕의 양으로 사용하여 5 ㎖ TG1(OD₆₀₀ = 0.4)을 감염시켰다.

파지 ELISA 및 파지 클론 서열분석: 3 또는 4 라운드의 패닝 및 파지 레스큐 후, 추가 분석을 위해 최종 라운드의 패닝으로부터 198개의 단일 클론들을 선별하였다. 250 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 신호 클론을 150 ㎕ 2YT 배지(100 ㎍/㎖ 앰피실린, 2% 글루코스)가 함유된 환저 96-웰 플레이트로 4시간 동안 옮기고, 30분 동안 정치시킨 후 250 rpm에서 30분 동안 진탕하면서 50 ㎕ 2YT 배지(100 ㎍/㎖ 앰피실린, 2% 글루코스) 중의 10⁸ pfu M13K07 헬퍼 파지를 상기 웰에 첨가하였다. 96-웰 플레이트용 삽입물을 사용하여 세포를 2700 rpm에서 10분 동안 수집하고 250 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 200 ㎕ 양의 2YT 배지(100 ㎍/㎖ 앰피실린 및 50 ㎍/㎖ 가나마이신을 함유함)에 밤새 재현탁하였다. 100 ㎍/㎖ 앰피실린, 2% 글루코스 및 30% 글리세롤을 함유하는 100 ㎕ 2YT 배지로 펠렛을 재현탁하고 저장액용으로 -80℃에서 저장하였다. 파지 ELISA를 위해 2700 rpm으로 10분 동안 상청액으로부터 파지를 침전시켰다. 96-웰 평저 NUNC MAXISORP 플레이트(넌크 유에스에이(Nunc USA), 미국 뉴욕주 로체스터 소재)를 4℃에서 LMB9(PBS 중의 5 ㎍/㎖)로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 2% 탈지유(셀 시그날링)로 차단하였다. 파지(50 ㎕) 및 2% 우유(50 ㎕)를 함유하는 상청액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 퍼록시다제(peroxidase)-접합된 항-M13(1:1000, 지이 헬쓰케어, 미국 위스콘신주 와우케샤 소재)을 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 포스페이트 완충 식염수 및 트윈-20(PBST)으로 3회 세척하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(써모 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드 소재)을 15분 동안 첨가하였다. 결과를 450 nm에서 분광광도계에서 판독하여 양성 클론 및 음성 클론을 확인하였다. 저장 플레이트의 적절한 웰로부터 파지를 소규모로 단리하기 위해 양성 클론을 선별하고 BIGDYE 터미네이터(Terminator) v1.1 사이클 시퀀싱 키트(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 사용하여 서열분석을 수행하였다. 동일한 서열을 갖는 클론을 제거하고, 발생된 서열들을 IMGT/V-퀘스트(Quest)(www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)로 정렬하였다.

경쟁 ICC-ELISA: 20 ㎖ 크기 배양을 이용하여 전술된 방법으로 파지-항체를 제조하였다. 파지-항체의 희석비를 ELISA로 측정하였다. SS1P 항체 50 ㎕/웰(2% 탈지유 중의 1 ㎍/㎖)을, PBS 중의 4 ㎍/㎖의 농도로 50 ㎕/웰의 양으로 rFc-메소텔린으로 4℃에서 밤새 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 다양한 희석비의 파지-항체를 첨가하고 HRP-접합된 항-M13 및 TMB 기질을 사용하여 검출하였다. 파지-항체의 희석비를 희석 곡선으로 측정하고, 원하는 A450을 약 1.0에서 설정하였다. 환자 혈청, Fv 없는 PE38 또는 단일 돌연변이를 갖는 PE38을 사용하여 경쟁 ICC-ELISA 어세이를 수행함으로써 PE38 항원의 파지-항체-결합 에피토프를 확인하였다. 파지-항체를 4℃에서 단일 돌연변이체의 연속 희석물과 함께 밤새 혼합하고 SS1P-rFc-메소텔린 조합 ELISA 플레이트에 첨가하였다. HRP-접합된 항-M13을 사용하여 파지-항체의 남은 결합을 측정함으로써 파지-항체와 SS1P의 결합에 대한 단일 돌연변이체의 경쟁을 확인하였다. 경쟁 효과를, PE38이 치환을 결여하는 HA22-LR과의 결합으로 표준화하였다.

혈청 항원성: HA22 또는 치환된 HA22와 인간 혈청 중의 항체의 결합을 치환 어세이에서 분석하였다. 인간 혈청은 프로토콜 10C0066 하에 수득되었다. 메소텔린-rFc를 ELISA 플레이트(50 ㎕ PBS 중의 100 ng/웰)에 첨가하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 세척 후, 항-메소텔린/SS1P(50 ㎕ 차단 완충제 중의 100 ng/웰)를 1시간 동안 첨가하여 비결합된 인간 항-PE38 항체를 포획하였다. 별도의 튜브에서 혈청(97배 내지 30658배 희석물)을 2 ㎍/㎖의 HA22 또는 치환된 HA22와 혼합하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 세척한 후, 50 ㎕의 면역독소-항체 혼합물을 각각의 웰로 옮겼다. HA22 또는 치환된 HA22에 결합되지 않은 인간 항체를 SS1P로 포획하고 HRP-접합된 토끼 항-인간 IgG Fc(잭슨 이뮤노리서치 레이보레이토리스(Jackson ImmunoResearch Laboratories), 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)에 이어서 TMB 기질 키트(써모 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Scientific Inc.), 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재)를 사용하여 검출하였다. 소프트맥스프로(SoftMaxPro) 4.0(몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))으로 4-파라메트릭 로기스틱(parametric logistic) 곡선 모델을 이용하여 결합 곡선을 피팅하였다. IC₅₀ 값은 SS1P와의 항체 반응성의 50%를 억제하는 RIT의 농도를 표시한다.

통계: 만-휘트니(Mann-Whitney) 비파라메트릭 방법을 이용하였고, p < 0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 14

본 실시예는 PE38에 대해 특이적인 인간 ScFv의 단리 및 서열분석을 입증한다.

PE38을 함유하는 상이한 재조합 면역독소들(RIT들)로 치료받은 6명의 환자들로부터 혈액 샘플을 수득하였다(표 14). PAXGENE 혈액 RNA 키트(프리어날리틱스 게엠베하, 스위스, 홈브레흐티콘 소재)를 사용하여 혈액 샘플로부터 RNA를 단리하였다. 적절한 불변 영역을 갖는 프라이머(표 15)를 사용하여 RNA로부터 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. 제1 가닥 cDNA를 주형으로서 사용함으로써 V_H cDNA 및 V_κ cDNA에 대한 정확한 크기의 단일 밴드를 수득하였다. V_H 단편 및 V_L 단편을 3-단계에서 개별적으로 증폭하였다. 제한효소 부위 및 링커를 상기 단편에 추가하였다. scFv 형성을 위해 100 ng의 V_H 단편 및 V_L 단편을 중첩 연장에 의한 스플라이싱 중합효소 연쇄 반응(SOE-PCR)에서 조합하였다. scFv 단편을 NcoI 및 NotI으로 절단하고, 동일한 효소들로 절단된 pCANTAB 5E 내로 서브클로닝하여 scFv 라이브러리를 구축하였다.

바이오티닐화된 면역독소 LMB-9(B3-Fv-PE38)를, PE38에 결합되는 Fv를 발현하는 파지의 선별을 위한 항원으로서 사용하였다. 각각의 LMB-9 분자는 6개의 바이오틴을 함유하였다. 7.3 x 10⁷ 내지 1.27 x 10⁸개의 V_H-V_L scFv 클론(표 15)을 함유하는 6개의 인간 항체 라이브러리를 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)(이. 콜라이) TG1 내로의 전기천공으로 수득하였다. 헬퍼 파지(표 15)를 사용한 중복감염으로 파지 라이브러리를 레스큐하고, 350 ㎖의 각각의 라이브러리는 파지의 표면 상에 표시된 약 7 x 10¹²개의 scFv 단편을 수득하였다.

710개의 Fv 함유 파지 클론들을 수득하여 서열분석하였다. 서열분석은 동일한 경쇄 서열을 갖는 2개의 클론들을 제외하고 103개의 독특한 인간 중쇄 및 인간 카파 경쇄 서열들이 존재한다는 것을 보여주었다. Fv가 항-면역독소 항체를 만드는 B 세포로부터 유래되었다는 것을 보이기 위해, 경쟁 연구를 수행하였고 면역 항-혈청이 파지와 LMB-9의 PE38 부분의 결합을 차단하고 클론들 중 어느 클론도 면역독소의 Fv 부분에 결합하지 않았다는 것을 보여주었다. 그 다음, ICC-ELISA를 이용하여 결합 강도를 측정하였다. 47개의 클론들이 약한 결합을 가졌고 추가로 연구되지 않았다. 다른 56개의 클론들을 사용하여 PE38에서 인간 특이적 에피토프를 확인하였다.

실시예 15

본 실시예는 인간 B 세포 에피토프의 위치를 입증한다.

LMB-9는 PE의 도메인 II 및 III 둘다를 함유한다. 도메인 III에만 결합하는 파지를 확인하기 위해, 도메인 III만을 갖고 도메인 II를 결여하는 HA22-LR과 각각의 클론의 결합을 측정하였다. 56개의 파지 클론들 중 15개의 파지 클론들이 HA22-LR에 결합할 수 없었는데, 이것은 이들 15개의 파지 클론들에 의해 인식되는 에피토프가 도메인 II 상에 위치한다는 것을 암시한다. 남은 41개의 파지 클론들과 치환된 단백질(이 단백질의 도메인 III의 표면 상의 개별 아미노산이 큰 용적의 아미노산으로부터 알라닌 또는 글리신으로 변화되어 있음)의 결합을 측정함으로써 상기 남은 41개의 파지 클론들을 사용하여 도메인 III 내의 B 세포 에피토프를 구성하는 잔기를 확인하였다. 이들 치환은 항체 인식 및 결합에 관여하는 큰 용적의 측쇄를 제거하였다. 데이터는 도 10에 나타나 있고, 이때 약한 결합(<10%)을 갖는 클론들은 흑색 칸으로 표시되어 있고, 정상 반응성을 갖는 치환된 단백질은 빈 칸으로 표시되어 있다. 결과는 단일 치환이 많은 클론들의 결합을 감소시켰다는 것을 보여줌으로써, 이들이 동일한 에피토프 군 내에 있다는 것을 암시한다.

치환된 경우 파지와 다양한 에피토프들의 결합을 90% 초과의 수준까지 감소시킨 잔기들의 위치는 표 16에 표시되어 있다. 각각의 인간(H1, H2, H3, H4, H5 및 H6) 및 마우스(2c, 4a, 4b, 5, 6a, 6b 및 7) 에피토프와 관련된 아미노산은 표 16에 표시되어 있다. 인간 에피토프 H1은 D403, R427 및 E431을 함유하였다. R427 및 E431은 마우스 에피토프 4a에 속하고, 이들 잔기들은 마우스 및 인간 항체 결합 둘다에 관여하였다. 인간 에피토프 H2는 마우스 에피토프 2c에 속하는 잔기 R467 및 D463, 및 마우스 에피토프 6a에 속하는 E548을 함유하였다. Y481, L516, E522 및 R551은 인간 특이적 에피토프이었다. 인간 H3 에피토프는 마우스 에피토프 4b에 속하는 R458만을 함유하였다. 인간 에피토프 H4는 R432 및 R505를 함유하였다. R432는 마우스 에피토프 4a에 속하고, R505는 인간 특이적 잔기이었다. 인간 에피토프 H5는 마우스 에피토프 5에 속하는 R490 및 R576으로 구성되었다. 인간 에피토프 H6은 R538을 포함하였다. R538은 마우스 에피토프 2c에 속한다. D406, R412, R513, L597, Q592 및 K590은 마우스 특이적 에피토프이었고 인간 에피토프 결합에 관여하지 않았다.

에피토프 H1과 반응하는 파지 클론은 잔기 D403, R427 및 E431에서의 치환에 의해 영향을 받았다. 알라닌에 의한 이들 잔기들 중 임의의 잔기의 치환은 에피토프를 인식하는 많은 파지들의 결합에 크게 영향을 미쳤다(도 10). 에피토프를 구성하는 치환에 대해 예측된 바와 같이, 이들 잔기들은 도메인 III 상에서 공간적으로 인접하였다. 에피토프 H2는 복잡하였다. 에피토프 H2와 반응하는 파지는 8개의 잔기들에서의 치환에 의해 영향을 받았다. 알라닌에 의한 R467의 치환은 에피토프 H2를 한정하는 8개의 파지들 중 6개의 파지들의 결합을 파괴하였다. 잔기 D463의 치환은 4개의 파지들의 결합을 방해하였고, Y481의 치환은 3개의 파지들의 결합을 방해하였고, R551의 치환은 2개의 파지들의 결합을 방해하였고, 잔기 D461, L516, E522 또는 E548의 치환은 1개의 파지의 결합을 방해하였다. 구조적으로, 이들 잔기들은 제한된 영역에 존재하였고 클러스터를 구성하였다. 에피토프 H3은 R458에 결합하는 2개의 파지들에 의해 인식되었다. 에피토프 H4는 11개의 파지들에 의해 인식되었고, 결합은 R505A 치환에 의해 파괴되었다. R505에 가까운 R432에서의 치환은 11개의 파지들 중 1개의 파지의 결합에 영향을 미쳤다. 에피토프 H5는 4개의 파지들에 의해 인식되었다. 모든 4개의 파지들과의 결합은 R490에서의 치환에 의해 영향을 받았고, R576에서의 치환은 4개의 파지들 중 3개의 파지들의 결합에 영향을 미쳤다. 이들 잔기들은 서열에서 86개의 아미노산들에 의해 분리되어 있었지만 도메인 III 상에서 공간적으로 인접하여 존재하였다. R538에서의 치환은 2개의 파지들 중 1개의 파지의 결합을 제거하였다. 요약하건대, 알라닌에 의한 고도 노출 표면 잔기의 치환은 도메인 III에 결합하는 파지에 결합하는 잔기를 확인시켜 주었는데, 이것은 상기 에피토프들이 도메인 III의 표면 상에서 상이한 부위들에 위치한다는 것을 보여준다.

실시예 16

본 실시예는 인간에 대한 낮은 항원성을 나타내는 재조합 면역독소(RIT)의 생성을 입증한다.

인간 항혈청과의 결합에 관여하는 개별 잔기의 확인을 이용하여, 인간 항혈청과의 반응성을 제거하는 치환을 갖되 세포독성 활성을 보유하고 유용하기에 충분한 양으로 생성될 수 있는 면역독소를 디자인하고 구축하였다. 대다수의 경우, 잔기를 알라닌으로 치환시켰는데, 이는 알라닌의 작은 측쇄가 항체와 잘 반응하지 않고 통상적으로 단백질 폴딩에 영향을 미치지 않기 때문이다. 특히 소수성 표면을 실질적으로 피하기 위해 세린도 사용하였다.

에피토프 맵핑 연구에서의 정보에 근거하여, 인간 Fv와 HA22-LR의 도메인 III의 결합을 파괴하는, 상이한 아미노산들로부터 선택된 치환들을 조합하였다. 상기 치환들은 하기 표 17에 나타나 있다. LR05는 HA22-LR-8M에 존재하는 모든 치환들 및 4개의 신규 치환들을 가졌고, LR06은 HA22-LR-8M으로부터의 2개 치환들 및 4개의 신규 치환들만을 가졌고, LO10은 LR06과 유사하였지만 추가 463A 치환을 가졌다(표 17).

치환된 단백질을 발현시키고 정제하였다. SDS 겔 분석은 치환된 단백질이 95% 초과의 균질성을 갖는다는 것을 보여주었다. 그 다음, 정제된 단백질들을 여러 CD22 양성 세포주들에 대한 세포독성 활성, 및 PE38을 함유하는 면역독소에 대한 중화 항체를 생성하는 환자의 혈청에 존재하는 항체에 결합하는 그들의 능력 면에서의 항원성에 대해 분석하였다. 여러 상이한 면역독소들(LMB-9, SS1P 및 HA22)을 제공받은 환자들로부터 수득된 25개의 혈청들을 분석하였다.

표 19의 데이터는 모든 3개의 신규 면역독소들이 약 1 ng/㎖의 IC₅₀으로 CD22 양성 림프종 세포주에 대한 활성을 나타내었으나 HA22-LR보다 낮은 활성을 나타내었다는 것을 보여준다. 가장 강한 활성을 나타내는 것은 Daudi 세포에 대해 HA22-LR의 60%만큼의 활성을 나타내고 Raji 세포에 대해 27%만큼의 활성을 나타내고 CA46 세포에 대해 29%만큼의 활성을 나타내는 HA22-LO10이었다. 이들 신규 면역독소들은 CD22 특이적이었고 CD22를 발현하지 않는 A431 세포에 대해서는 활성을 갖지 않았다(표 19).

항원성은 면역원과 기존 항체의 결합으로서 정의된다. 치환된 HA22-LO과 인간 환자 혈청의 항원성을 평가하기 위해, HA22와 반응하는 항체의 수준을 50%까지 감소시키는 치환된 면역독소들 각각의 농도를 측정하는 경쟁 실험을 수행하였다. 2개의 환자 혈청을 사용한 전형적인 경쟁 실험의 결과는 도 11a 및 11b에 나타나 있다. 도 11a는 PE38과의 결합이 50%까지 억제되는 HA22, HA22-LR, HA22-LO5, HA22-LO6, HA22-LR-8M 및 HA22-LO10의 농도(IC₅₀)가 각각 84.8 nM, 38.1 nM, 4580 nM, 1440 nM, 3610 nM 및 >396000 nM이었다는 것을 보여준다. HA22 대 HA22-LR, HA22-LO5, HA22-LO6, HA22-LR-8M 및 HA22-LO10의 결합(IC₅₀) 비는 각각 223%, 1.85%, 5.89%, 2.35% 및 <0.0214%이었다. 도 11b는 PE38과의 결합이 50%까지 억제되는 HA22, HA22-LR, HA22-LO5, HA22-LO6, HA22-LR-8M 및 HA22-LO10의 농도가 각각 50.9 nM, 67700 nM, >396000 nM, >396000 nM, >396000 nM 및 >396000 nM이었다는 것을 보여준다. HA22 대 HA22-LR, HA22-LO5, HA22-LO6, HA22-LR-8M 및 HA22-LO10의 결합(IC₅₀) 비는 각각 0.752%, <0.0129%, <0.0129%, <0.0129% 및 <0.0129%이었다.

면역독소 SS1P, HA22 및 LMB9를 함유하는 PE38로 10년 이상 동안 치료받은 32명의 환자들로부터 수득된 전체 혈청을 분석하였다. 치환된 면역독소를 사용한 결합 비는 표 20에 나타나 있다. HA22-LR-LO10과 인간 혈청의 항원성은 HA22, HA22-LR 및 HA22-LR8M에 비해 실질적으로 감소되었다는 것을 발견하였다. 도 12는 PE38의 사용으로 치료받은 환자의 혈청에서 항체와 HA22, HA22-LR-8M, HA22-LRLO10 또는 HA22-LR-LO10R의 % 결합을 보여주는 그래프이다. HA22-LR-LO10R이 HA22-LO10에 존재하는 R458A 치환을 결여한다는 점을 제외하고 HA22-LR-LO10R은 HA22-LO10과 유사하다(표 17 및 18). 도 12는 32명의 환자들 중 23명의 환자들이 100배 이상(100배 내지 10000배)까지 감소된 결합(항원성)을 나타내었다는 것을 보여준다. 32명의 환자들 중 단지 4명의 환자들에서 항원성의 감소를 검출할 수 없었다.

본원에서 인용된 공개문헌, 특허출원 및 특허를 포함하는 모든 참고자료들은 각각의 참고자료가 참고로 도입되는 것으로 개별적으로 및 구체적으로 표시되고 본원에서 전체적으로 기재되어 있는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.

본원에 달리 표시되어 있거나 문맥에 의해 명확히 부정되지 않는 한, 본 발명의 설명과 관련하여(특히 하기 특허청구범위와 관련하여) 단수형 용어 및 유사한 지시대상의 사용은 단수형 및 복수형 둘다를 커버하는 것으로 해석되어야 한다. 달리 명시되어 있지 않은 한, 용어 "포함하는", "갖는", "비롯한" 및 "함유하는"은 제한을 두지 않는 용어(즉, "포함하나 한정되지 않는"을 의미하는 용어)로서 해석되어야 한다. 본원에서 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 값 범위의 언급은 단지 상기 범위 내에 속하는 각각의 개별 값들을 개별적으로 언급하는 약칭 방법으로서 기여하기 위한 것이고, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 언급되어 있는 것처럼 본 명세서 내로 도입된다. 본원에 달리 표시되어 있거나 문맥에 의해 달리 명확히 부정되지 않는 한, 본원에 기재된 모든 방법들은 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 실시예 또는 예시적 용어(예를 들면, "예컨대")의 사용은 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것일 뿐이고, 달리 청구되어 있지 않은 한 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 용어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비특허청구된 구성요소를 표시하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.

본 발명을 실시하기 위한 본 발명자들에게 공지된 최적 방식을 포함하는 본 발명의 바람직한 실시양태들이 본원에 기재되어 있다. 이들 바람직한 실시양태들의 변경은 상기 설명을 읽었을 때 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 명확해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 적절한 경우 이러한 변경을 이용할 것이라고 예측하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 방식과 다른 방식으로 실시될 것이라고 생각한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용될 때 하기 첨부된 특허청구범위에서 언급된 보호대상의 모든 변형물 및 균등물을 포함한다. 나아가, 본원에 달리 표시되어 있거나 문맥에 의해 달리 명확히 부정되지 않는 한, 전술된 구성요소들(이들의 모든 가능한 변경물들을 포함함)의 임의의 조합도 본 발명에 의해 포괄된다.

SEQUENCE LISTING <110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> PSEUDOMONAS EXOTOXIN A WITH LESS IMMUNOGENIC T CELL AND/OR B CELL EPITOPES <130> 714482 <140> PCT/US2012/041234 <141> 2012-06-07 <150> US 61/495,085 <151> 2011-06-09 <150> US 61/535,668 <151> 2011-09-16 <160> 203 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 613 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val 1 5 10 15 Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro 20 25 30 Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val 35 40 45 Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu 50 55 60 Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu 65 70 75 80 Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser 85 90 95 Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn 100 105 110 Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly 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87 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 87 Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 88 Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly 1 5 10 15 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 89 Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg 1 5 10 15 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 90 Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser 1 5 10 15 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 91 Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu 1 5 10 15 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 92 Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile 1 5 10 15 <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 93 Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly 1 5 10 15 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 94 Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile 1 5 10 15 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 95 Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp 1 5 10 15 <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 96 Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu 1 5 10 15 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 97 Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly 1 5 10 15 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 98 Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln 1 5 10 15 <210> 99 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 99 Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu 1 5 10 15 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 100 Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala 1 5 10 15 <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 101 Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg 1 5 10 15 <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 102 Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn 1 5 10 15 <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 103 Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu 1 5 10 15 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 104 Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val 1 5 10 15 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 105 Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro 1 5 10 15 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 106 Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser 1 5 10 15 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 107 Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly 1 5 10 15 <210> 108 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 108 Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg 1 5 10 15 <210> 109 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 109 Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu 1 5 10 15 <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 110 Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala 1 5 10 15 <210> 111 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 111 Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu 1 5 10 15 <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 112 Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 <210> 113 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 113 Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu 1 5 10 15 <210> 114 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 114 Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 1 5 10 15 <210> 115 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 115 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro 1 5 10 15 <210> 116 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 116 Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu 1 5 10 15 <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 117 Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp 1 5 10 15 <210> 118 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 118 Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr 1 5 10 15 <210> 119 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 119 Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu 1 5 10 15 <210> 120 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 120 Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly 1 5 10 15 <210> 121 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 121 Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu 1 5 10 15 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 122 Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile 1 5 10 15 <210> 123 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 123 Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp 1 5 10 15 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 124 Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala 1 5 10 15 <210> 125 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 125 Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr 1 5 10 15 <210> 126 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 126 Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile 1 5 10 15 <210> 127 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 127 Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala 1 5 10 15 <210> 128 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 128 Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 1 5 10 15 <210> 129 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 129 Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg 1 5 10 15 <210> 130 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 130 Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly 1 5 10 15 <210> 131 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 131 Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu 1 5 10 15 <210> 132 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 132 Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser 1 5 10 15 <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 133 Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro 1 5 10 15 <210> 134 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 134 Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu 1 5 10 15 <210> 135 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 135 Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile 1 5 10 15 <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 136 Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu 1 5 10 15 <210> 137 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 137 Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala 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at position 96 is Ala, Gly, Ser, Gln, or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119) <223> Xaa at position 119 is Ala, Gly, Ser, Gln, or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (154)..(154) <223> Xaa at position 154 is Ala, Gly, Ser, Gln, or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (196)..(196) <223> Xaa at position 196 is Ala, Gly, Ser, Gln, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (198)..(198) <223> Xaa at position 198 is Ala, Gly, Ser, or Gln <400> 142 Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Xaa Val Ser Phe Ser 1 5 10 15 Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His 20 25 30 Arg Gln Leu Glu Glu Xaa Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr 35 40 45 Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg 50 55 60 Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Xaa Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp 65 70 75 80 Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Xaa 85 90 95 Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser 100 105 110 Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Xaa Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu 115 120 125 Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg 130 135 140 Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Xaa Gly Gly Arg Leu Glu Thr 145 150 155 160 Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala 165 170 175 Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser 180 185 190 Ile Pro Asp Xaa Glu Xaa Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser 195 200 205 Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 210 215 <210> 143 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 143 Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Ala Val Ser Phe Ser 1 5 10 15 Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His 20 25 30 Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr 35 40 45 Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg 50 55 60 Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp 65 70 75 80 Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala 85 90 95 Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser 100 105 110 Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu 115 120 125 Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg 130 135 140 Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr 145 150 155 160 Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala 165 170 175 Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser 180 185 190 Ile Pro Asp Ser Glu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser 195 200 205 Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 210 215 <210> 144 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 144 Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro 1 5 10 15 Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu 20 25 30 Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala 35 40 45 Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu 50 55 60 Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu 85 90 95 Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn 100 105 110 Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr 115 120 125 Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg 130 135 140 Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln 145 150 155 160 Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu 165 170 175 Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln 180 185 190 Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala 195 200 205 Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg 210 215 220 Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu 225 230 235 240 Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala 245 250 255 Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp 260 265 270 Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu 275 280 285 Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro 290 295 300 Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro 305 310 315 320 Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 340 345 <210> 145 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 145 Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Ser Trp Asn Gln Val 1 5 10 15 <210> 146 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 146 gtccaccttg gtgttgctgg gctt 24 <210> 147 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 147 agactctccc ctgttgaagc tctt 24 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 148 caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 149 caggtcaact taagggagtc tgg 23 <210> 150 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 150 gaggtgcagc tggtggagtc tgg 23 <210> 151 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 151 caggtgcagc tgcaggagtc ggg 23 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 152 gaggtgcagc tgttgcagtc tgc 23 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 153 caggtacagc tgcagcagtc agg 23 <210> 154 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 154 gacatccaga tgacccagtc tcc 23 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 155 gatgttgtga tgactcagtc tcc 23 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 156 gaaattgtgt tgacgcagtc tcc 23 <210> 157 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 157 gacatcgtga tgacccagtc tcc 23 <210> 158 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 158 gaaacgacac tcacgcagtc tcc 23 <210> 159 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 159 gaaattgtgc tgactcagtc tcc 23 <210> 160 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 160 gcccagccgg ccatggccca ggtgcagctg gtgcagtctg g 41 <210> 161 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 161 gcccagccgg ccatggccca ggtcaactta agggagtctg g 41 <210> 162 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 162 gcccagccgg ccatggccga ggtgcagctg gtggagtctg g 41 <210> 163 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 163 cccagccggc catggcccag gtgcagctgc aggagtcggg 40 <210> 164 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 164 gcccagccgg ccatggccga ggtgcagctg ttgcagtctg c 41 <210> 165 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 165 gcccagccgg ccatggccca ggtacagctg cagcagtcag g 41 <210> 166 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 166 acctccagat ccgccaccac cggatccgcc tccgcctgag gagacggtga ccagggtgcc 60 <210> 167 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 167 acctccagat ccgccaccac cggatccgcc tccgcctgaa gagacggtga ccattgtccc 60 <210> 168 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 168 acctccagat ccgccaccac cggatccgcc tccgcctgag gagacggtga ccagggttcc 60 <210> 169 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 169 acctccagat ccgccaccac cggatccgcc tccgcctgag gagacggtga ccgtggtccc 60 <210> 170 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 170 ggatccggtg gtggcggatc tggaggtggc ggaagcgaca tccagatgac ccagtctcc 59 <210> 171 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 171 ggatccggtg gtggcggatc tggaggtggc ggaagcgatg ttgtgatgac tcagtctcc 59 <210> 172 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 172 ggatccggtg gtggcggatc tggaggtggc ggaagcgaaa ttgtgttgac gcagtctcc 59 <210> 173 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 173 ggatccggtg gtggcggatc tggaggtggc ggaagcgaca tcgtgatgac ccagtctcc 59 <210> 174 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 174 ggatccggtg gtggcggatc tggaggtggc ggaagcgaaa cgacactcac gcagtctcc 59 <210> 175 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 175 ggatccggtg gtggcggatc tggaggtggc ggaagcgaaa ttgtgctgac tcagtctcc 59 <210> 176 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 176 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatttccacc ttggtccc 48 <210> 177 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 177 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccagc ttggtccc 48 <210> 178 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 178 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatatccact ttggtccc 48 <210> 179 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 179 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccacc ttggtccc 48 <210> 180 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 180 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt aatctccagt cgtgtccc 48 <210> 181 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 181 gcttccgcca cctccagatc cgccaccacc ggatccgcct ccgcc 45 <210> 182 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 182 ggcggaggcg gatccggtgg tggcggatct ggaggtggcg gaagc 45 <210> 183 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 183 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcc 33 <210> 184 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 184 gagtcattct cgacttgcgg ccgc 24 <210> 185 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 185 gcccagccgg ccatggcc 18 <210> 186 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 186 acctccagat ccgccaccac cggatccgcc tccgcc 36 <210> 187 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 187 ggatccggtg gtggcggatc tggaggtggc ggaagc 36 <210> 188 <211> 30 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 188 Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val 20 25 30 <210> 189 <211> 42 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 189 Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly 1 5 10 15 Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr 20 25 30 Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu 35 40 <210> 190 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 190 Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro 1 5 10 <210> 191 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 191 Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly 1 5 10 <210> 192 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 192 Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly 1 5 10 <210> 193 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 193 Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg 1 5 10 <210> 194 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 194 Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp 1 5 10 <210> 195 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 195 Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala 1 5 10 <210> 196 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 196 Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala 1 5 10 <210> 197 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 197 Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile 1 5 10 <210> 198 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 198 Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro 1 5 10 15 Leu Ala <210> 199 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 199 Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val 1 5 10 15 Phe Gly <210> 200 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 200 Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys 1 5 10 <210> 201 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 201 Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu 1 5 10 15 Pro Gly <210> 202 <211> 14 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 202 Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu 1 5 10 <210> 203 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 203 Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr 1 5 10 15 Val Pro

Claims

임의적으로 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 내의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환과 함께 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열이 아미노산 잔기 R302 대신에 알라닌으로의 치환을 포함하는 경우 아미노산 잔기 L294, L297, Y298 및 L299 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되는, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A(PE)로서, 이때 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302가 서열번호 1의 언급에 의해 정의되는, PE.
제1항에 있어서,
아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 아미노산 잔기 L294, L297, Y298, L299 및 R302 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환인, PE.
제1항 또는 제2항에 있어서,
X₁VAX₂X₃X₄AAX₅LSW(서열번호 2)를 포함하되, LVALYLAARLSW(서열번호 3)를 포함하지 않는 PE로서, 이때 X₁, X₂ 및 X₄가 독립적으로 류신, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고, X₃이 티로신, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고, X₅가 아르기닌, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이되, X₅가 알라닌인 경우 X₁, X₂, X₃ 및 X₄ 중 하나 이상이 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민인, PE.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환을 갖는 PE.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환을 갖는 PE로서, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환이 아미노산 잔기 E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 및 L597 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환이고, 아미노산 잔기 E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 및 L597이 서열번호 1의 언급에 의해 정의되는, PE.
제5항에 있어서,
서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환이 아미노산 잔기 D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 및 Q592 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신 또는 세린으로의 치환인, PE.
제5항에 있어서,
하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 추가 치환이 아미노산 잔기 R427, R458, D463, R467, R490, R505 및 R538 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 독립적으로 알라닌, 글리신 또는 세린으로의 치환인, PE.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환을 갖는 PE로서, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환이 아미노산 잔기 R490 대신에 발린, 류신 또는 이소류신으로의 치환이고, 아미노산 잔기 R490이 서열번호 1의 언급에 의해 정의되는, PE.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 PE로서, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환이 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, Y470, I471, A472, P475, A476, L477, I493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환인, PE.
제6항에 있어서,
서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 치환이 (a) 아미노산 잔기 D406 대신에 알라닌으로의 치환; (b) 아미노산 잔기 R432 대신에 글리신으로의 치환; (c) 아미노산 잔기 R467 대신에 알라닌으로의 치환; (d) 아미노산 잔기 R490 대신에 알라닌으로의 치환; (e) 아미노산 잔기 R513 대신에 알라닌으로의 치환; (f) 아미노산 잔기 E548 대신에 세린으로의 치환; (g) 아미노산 잔기 K590 대신에 세린으로의 치환; 및 (h) 아미노산 잔기 Q592 대신에 알라닌으로의 치환인, PE.
서열번호 1의 언급에 의해 정의된 아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 PE 아미노산 서열을 포함하되, 위치 516에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되는 경우 아미노산 잔기 D463 및 Y481 중 하나 이상의 아미노산 잔기도 치환되는, 슈도모나스 외독소 A(PE)로서, 임의적으로 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 치환, 및/또는 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 치환, 및/또는 서열번호 1에 의해 정의된 잔기 1 내지 273 및 285 내지 394의 하나 이상의 연속 아미노산 잔기의 결실을 갖는 PE.
제11항에 있어서,
하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 추가 치환을 갖는 PE로서, 이때 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 추가 치환이 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 아미노산 잔기 E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R490, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 및 L597 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환인, PE.
제12항에 있어서,
아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 독립적으로 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환인, PE.
제12항 또는 제13항에 있어서,
하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 추가 치환이 아미노산 잔기 R427, R458, R467, R490, R505 및 R538 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 독립적으로 알라닌, 글리신 또는 세린으로의 치환인, PE.
제14항에 있어서,
아미노산 잔기 D463, Y481 및 L516 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 아미노산 잔기 D463 대신에 알라닌으로의 치환이고, 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 추가 치환이 서열번호 1의 언급에 의해 정의된 (a) 아미노산 잔기 R427 대신에 알라닌으로의 치환; (b) 아미노산 잔기 R458 대신에 알라닌으로의 치환; (c) 아미노산 잔기 R467 대신에 알라닌으로의 치환; (d) 아미노산 잔기 R490 대신에 알라닌으로의 치환; (e) 아미노산 잔기 R505 대신에 알라닌으로의 치환; 및 (f) 아미노산 잔기 R538 대신에 알라닌으로의 치환인, PE.
임의적으로 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558 내의 하나 이상의 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 하기 화학식 I을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 PE:
화학식 I
FCS-R¹ _m-R² _p-R³ _n-PE 기능성 도메인 III
상기 식에서,
m, n 및 p는 독립적으로 0 또는 1이고;
FCS는 아미노산 잔기로 구성된 푸린(furin) 절단 서열을 포함하고, 상기 서열은 푸린에 의해 절단될 수 있고;
R¹은 서열번호 1의 잔기 285 내지 293의 하나 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하고;
R²는 X₁VAX₂X₃X₄AAX₅LSW(서열번호 2)를 포함하고, 이때 X₁, X₂ 및 X₄는 독립적으로 류신, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고, X₃은 티로신, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고, X₅는 아르기닌, 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이되, PE는 LVALYLAARLSW(서열번호 3)를 포함하지 않고, X₅가 알라닌인 경우 X₁, X₂, X₃ 및 X₄ 중 하나 이상은 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민이고;
R³은 서열번호 1의 잔기 306 내지 394의 하나 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하고;
PE 기능성 도메인 III은 서열번호 1의 잔기 395 내지 613을 포함한다.
제16항에 있어서,
푸린 절단 서열(FCS)이 서열번호 1의 잔기 274 내지 284를 포함하고, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 임의적 치환이 서열번호 1의 아미노산 잔기 E282 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환인, PE.
제16항 또는 제17항에 있어서,
m이 1이고, R¹이 서열번호 1의 잔기 285 내지 293을 포함하고, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 임의적 치환이 서열번호 1의 아미노산 잔기 E285 및/또는 P290 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환인, PE.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
n이 1이고, R³이 서열번호 1의 잔기 306 내지 394를 포함하고, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 임의적 치환이 서열번호 1의 아미노산 잔기 R313, N314, P319, D324, E327, E331 및 Q332 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환인, PE.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
PE 기능성 도메인 III이 서열번호 1의 잔기 395 내지 613을 포함하고, 이때 서열번호 1의 하나 이상의 B 세포 에피토프 내의 아미노산의 임의적 치환이 서열번호 1의 아미노산 잔기 D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 및 L597 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환 및/또는 아미노산 잔기 R490 대신에 발린, 류신 또는 이소류신으로의 치환이고, 이때 아미노산 잔기 R490이 서열번호 1의 언급에 의해 정의되는, PE.
제16항, 제17항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
m, n 및/또는 p가 0인, PE.
서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 위치 Q485 또는 L516에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되는 경우 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 치환되고, 위치 R427, R467, R490, R505, R513 또는 R551에서 아미노산 잔기가 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로 치환되는 경우 또는 위치 R490에서 아미노산 잔기가 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환되는 경우 서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 치환되고, 이 치환이 위치 R427, R467, R490, R505, R513 또는 R551에서의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환, 또는 위치 490에서의 아미노산 잔기 대신에 발린, 류신 또는 이소류신으로의 치환을 포함하지 않는, PE로서, 이때 아미노산 잔기 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558이 서열번호 1의 언급에 의해 정의되는, PE.
제1항 또는 제22항에 있어서,
서열번호 1의 위치 R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463 내지 519, R551, L552, T554, I555, L556 및 W558에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 아미노산 잔기 I493, R494, N495, G496, L498, L499, R500, V501 및 Y502 중 하나 이상의 아미노산 잔기 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로의 치환인, PE.
(a) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 PE에 접합된 또는 융합된 (a) 표적화 모이어티(moiety)를 포함하는 키메라 분자.
제24항에 있어서,
표적화 모이어티가 단일클론 항체인, 키메라 분자.
제25항에 있어서,
단일클론 항체가 CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, 트랜스페린(transferrin) 수용체, EGF 수용체, 메소텔린(mesothelin), 캐드헤린(cadherin) 및 루이스(Lewis) Y로 구성된 군으로부터 선택된 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는, 키메라 분자.
제25항에 있어서,
표적화 모이어티가 B3, RFB4, SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2, HB21, MORAb-009, HA22 및 이들의 항원 결합 부분으로 구성된 군으로부터 선택된 항체인, 키메라 분자.
제25항에 있어서,
표적화 모이어티가 HA22의 항원 결합 부분인, 키메라 분자.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 PE 또는 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항의 키메라 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
제29항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제30항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제31항의 하나 이상의 숙주 세포를 포함하는 세포 집단.
(a) 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 PE, 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항의 키메라 분자, 제29항의 핵산, 제30항의 재조합 발현 벡터, 제31항의 숙주 세포 또는 제32항의 세포 집단, 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 PE, 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항의 키메라 분자, 제29항의 핵산, 제30항의 재조합 발현 벡터, 제31항의 숙주 세포, 제32항의 세포 집단 또는 제33항의 약학 조성물을 포유동물에서 암의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 PE, 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항의 키메라 분자, 제29항의 핵산, 제30항의 재조합 발현 벡터, 제31항의 숙주 세포, 제32항의 세포 집단 또는 제33항의 약학 조성물을 표적 세포의 생장 억제에 효과적인 양으로 상기 표적 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포의 생장을 억제하는 방법.
제35항에 있어서,
표적 세포가 암세포인, 방법.
제35항 또는 제36항에 있어서,
표적 세포가 CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, 트랜스페린 수용체, EGF 수용체, 메소텔린, 캐드헤린 및 루이스 Y로 구성된 군으로부터 선택된 세포 표면 마커를 발현하는, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 PE를 제조하는 방법으로서, (a) 상기 PE를 재조합적으로 발현시키는 단계 및 (b) 상기 PE를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항의 키메라 분자를 제조하는 방법으로서, (a) 상기 키메라 분자를 재조합적으로 발현시키는 단계 및 (b) 상기 키메라 분자를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항의 키메라 분자를 제조하는 방법으로서, (a) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 PE를 재조합적으로 발현시키는 단계, (b) 상기 PE를 정제하는 단계 및 (c) 표적화 모이어티를 정제된 PE에 공유연결하는 단계를 포함하는 방법.