ES2635416T3 - Exotoxina A de pseudomonas con epítopos de linfocitos T y/o linfocitos B menos inmunogénicos - Google Patents

Abstract

Una exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más de los restos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302, con la condición de que cuando la secuencia de aminoácidos comprenda una sustitución de alanina para el resto del aminoácido R302, al menos uno de los restos de los aminoácidos L294, L297, Y298 y L299 está sustituido, en la que los restos de los aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 se definen por referencia a la SEQ ID NO: 1, y en la que la PE presenta un aumento de la actividad citotóxica y la PE presenta una reducción de la inmunogenicidad en comparación con una PE no sustituida, opcionalmente con una sustitución de uno o más de los restos de los aminoácidos dentro de uno o más epítopos de linfocitos B de SEQ ID NO: 1 y/o una sustitución de uno o más de los restos de los aminoácidos dentro de uno o más epítopos de linfocitos T dentro de los restos de los aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463-519, R551, L552, T554, I555, L556 y W558 de SEQ ID NO: 1, preferentemente en la que la sustitución de uno o más de los restos de los aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de uno o más de los restos de los aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302.

Description

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En una realización de la divulgación, la PE comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la Fórmula I:

FCS -R1m -R2p -R3n -dominio III funcional de PE (Fórmula I) 5 en la que:

m, n, y p son, independientemente, 0 o 1; FCS comprende una secuencia de escisión de furina de restos de aminoácidos, secuencia que se puede escindir con furina; R1 comprende 1 o más restos de aminoácidos continuos de los restos 285-293 de SEQ ID NO: 1; R2 comprende X1VAX2X3X4AAX5LSW (SEQ ID NO: 2), en la que X1, X2, y X4 son independientemente leucina, alanina, glicina, serina, o glutamina; X3 es tirosina, alanina, glicina, serina, o glutamina; y X5 es arginina, alanina, glicina, serina, o glutamina; con la condición de que la PE no comprenda LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) y que

15 cuando X5 sea alanina, al menos uno de X1, X2, X3, y X4 sea alanina, glicina, serina, o glutamina; R3 comprende 1 o más restos de aminoácidos continuos de los restos 306-394 de SEQ ID NO: 1; y el dominio III funcional de PE comprende los restos 395-613 de SEQ ID NO: 1 opcionalmente con una sustitución de uno o más de los restos de los aminoácidos dentro de uno o más epítopos de linfocitos B de SEQ ID NO: 1 y/o una sustitución de uno o más de los restos de los aminoácidos dentro de uno o más epítopos de linfocitos T dentro de los restos de los aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463-519, R551, L552, T554, I555, L556, y W558 de SEQ ID NO: 1. En una realización, la sustitución de uno o más de los restos de los aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, I450, 463-519, R551, L552, T554, I555, L556, y W558 de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de uno o más de los restos de los aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446,

25 A447, I450, Y470, I471, A472, P475, A476, L477, I493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, I555, L556, y W558.

En una realización de la divulgación, m, n, y/o p de Fórmula I son 0. En una realización de la invención, cuando m, n, y p son cada uno 0, la PE de Fórmula I puede comprender adicionalmente un péptido de unión a GGS entre FCS y el dominio III funcional de PE.

Sin quedar ligado por ninguna teoría o mecanismo en particular, se cree que las PE que contienen la secuencia de escisión de furina (FCS) experimentan procesamiento proteolítico dentro de las células diana, activando de ese modo la actividad citotóxica de la toxina. La FCS de las PE de la invención puede comprender cualquier secuencia 35 de escisión de furina adecuada de los restos de los aminoácidos, secuencia que se puede escindir con furina. Las secuencias de escisión de furina a modo de ejemplo se describen en Duckert et al., Protein Engineering, Design & Selection, 17 (1): 107-112 (2004) y en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 2009/032954. En una realización de la invención, la FCS comprende los restos 274-284 de SEQ ID NO: 1 (es decir, RHRQPRGWEQL (SEQ ID NO: 8)), en la que la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epítopos de linfocitos B de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de alanina, glicina, serina, o glutamina para el resto del aminoácido E282 de SEQ ID NO: 1. Otras secuencias de aminoácidos de FCS adecuadas incluyen, pero no se limitan a: R-X1-X2-R, en la que X1 es cualquier aminoácido de origen natural y X2 es cualquier aminoácido de origen natural (SEQ ID NO: 9), RKKR (SEQ ID NO: 10), RRRR (SEQ ID NO: 11), RKAR (SEQ ID NO: 12), SRVARS (SEQ ID NO: 13), TSSRKRRFW (SEQ ID NO: 14), ASRRKARSW (SEQ ID NO: 15), RRVKKRFW (SEQ ID NO: 16), RNVVRRDW (SEQ ID NO: 17),

45 TRAVRRRSW (SEQ ID NO: 18), RQPR (SEQ ID NO: 19), RHRQPRGW (SEQ ID NO: 20), RHRQPRGWE (SEQ ID NO: 21), FIRQPRGWEQ (SEQ ID NO: 22), RQPRGWE (SEQ ID NO: 23), RHRSKRGWEQL (SEQ ID NO: 24), RSKR (SEQ ID NO: 25), RHRSKRGW (SEQ ID NO: 26), HRSKRGWE (SEQ ID NO: 27), RSKRGWEQL (SEQ ID NO: 28), HRSKRGWEQL (SEQ ID NO: 29), RHRSKR (SEQ ID NO: 30), y R-X1-X2-R, en la que X1 es cualquier aminoácido de origen natural y X2 es arginina o lisina (SEQ ID NO: 4).

En una realización de la divulgación, m de Fórmula I es 1 y R1 de Fórmula I comprende los restos 285-293 de SEQ ID NO: 1, en los que la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epítopos de linfocitos B de SEQ ID NO: 1 incluye una sustitución de alanina, glicina, serina, o glutamina para el resto del aminoácido E285 y/o P290 de SEQ ID NO: 1.

55 En otra realización de la divulgación, n de Fórmula I es 1 y R3 de Fórmula I comprende los restos 306-394 de SEQ ID NO: 1, en los que la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epítopos de linfocitos B de SEQ ID NO: 1 incluye una sustitución de alanina, glicina, serina, o glutamina para uno o más de los restos de los aminoácidos R313, N314, P319, D324, E327, E331, y Q332 de SEQ ID NO: 1.

Además, en otra realización de la invención, el dominio III funcional de PE comprende los restos 395-613 de SEQ ID NO: 1, en los que la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epítopos de linfocitos B de SEQ ID NO: 1 incluye una sustitución de alanina, glicina, serina, o glutamina para uno o más de los restos de los aminoácidos D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, 65 E548, R551, R576, K590, Q592, y L597 de SEQ ID NO: 1. En una realización preferente de la invención, el dominio III funcional de PE comprende SEQ ID NO: 142. En una realización especialmente preferente de la invención, el

dominio III funcional de PE comprende SEQ ID NO: 143.

La PE de la invención es menos inmunogénica que una PE no sustituida de acuerdo con la invención si la respuesta inmunológica a la PE de la invención disminuye, de forma cuantitativa o de forma cualitativa, en comparación con la 5 respuesta inmunológica a una PE no sustituida. Una disminución cuantitativa de la inmunogenicidad incluye una disminución de la magnitud o grado de la respuesta inmunológica. La magnitud o grado de inmunogenicidad se pueden medir sobre la base de cualquier número de parámetros conocidos, tales como una disminución del nivel de producción de citoquina (por ejemplo, citoquina específica de antígeno) (concentración de citoquina), una disminución en el número de linfocitos activados (por ejemplo, proliferación de linfocitos (por ejemplo, linfocitos específicos de antígeno)) o reclutados, y/o una disminución en la producción de anticuerpos (anticuerpos específicos de antígeno), etc. Una disminución cualitativa de la inmunogenicidad incluye cualquier cambio en la naturaleza de la respuesta inmunológica que hace que la respuesta inmunológica sea menos eficaz en la mediación de la reducción de la actividad citotóxica de la PE. En la técnica se conocen métodos para medir la inmunogenicidad. Por ejemplo, la medición de los tipos y niveles de citoquina producidos pueden medir la inmunogenicidad. Como alternativa o 15 adicionalmente, la medición de la unión de PE a anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos previamente expuestos a PE) y/o la medición de la capacidad de la PE para inducir anticuerpos se administran a un mamífero (por ejemplo, seres humanos, ratones, y/o ratones en los que el sistema inmunitario está sustituido con un sistema inmunitario de ser humano) pueden medir la inmunogenicidad. Una PE menos inmunogénica se puede caracterizar mediante una disminución en la producción de citoquinas tal como uno cualquiera o más de IFN-γ, TNF-α, y granzima B, y/o una reducción de la estimulación de una respuesta inmunitaria mediada por células, tal como una disminución en la proliferación y activación de linfocitos T y/o macrófagos específicos para PE en comparación con la obtenida con una PE no sustituida. Como alternativa o adicionalmente, la PE menos inmunogénica se puede caracterizar mediante un aumento en la producción de TGF-beta y/o IL-10 en comparación con la obtenida con una PE no sustituida. En una realización preferente, la reducción de la inmunogenicidad se caracteriza por una cualquiera o más de una

25 disminución en la estimulación de linfocitos T, una disminución en la proliferación de linfocitos T, y disminución en la secreción de IFN-γ de linfocitos T y/o granzima B. Como alternativa o adicionalmente, una PE menos inmunogénica se puede caracterizar por una disminución en la estimulación y/o activación de linfocitos B específicos para PE en comparación con la obtenida con una PE no sustituida. Por ejemplo, la PE menos inmunogénica se puede caracterizar por una disminución en la diferenciación de linfocitos B en células plasmáticas que secretan anticuerpos y/o células de memoria en comparación con la obtenida con una PE no sustituida. La reducción de la inmunogenicidad se puede caracterizar mediante una cualquiera o más de una disminución de la estimulación de linfocitos B, una disminución de la proliferación de linfocitos B, y una disminución en la secreción de anticuerpos anti-PE. La disminución cualitativa y cuantitativa de la inmunogenicidad se puede producir de forma simultánea y no son mutuamente exclusivas.

35 Alguien con la experiencia habitual en la materia observará rápidamente que las PE de la invención se pueden modificar en cualquier número de formas, de modo que la eficacia terapéutica o profiláctica de las PE de la invención aumenta a través de la modificación. Por ejemplo, las PE de la invención se pueden conjugar o fusionar ya sea directa o indirectamente a través de un conector a un resto de direccionamiento. En este sentido, una realización de la invención proporciona una molécula quimérica que comprende (a) un resto de direccionamiento conjugado o fusionado con (b) cualquiera de las PE de la invención descritas en el presente documento. La práctica de la conjugación de compuestos, por ejemplo, las de la PE invención, a restos de direccionamiento se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting, 3: 111 (1995), y en el documento de Patente de Estados Unidos N.º 5.087.616.

45 El término "resto de direccionamiento”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula o agente que reconoce y se une de forma específica a un marcador de superficie celular, de modo que el resto de direccionamiento dice la administración de la PE de la invención a una población de células en cuya superficie se expresa el receptor. Los restos de direccionamiento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales), o fragmentos de los mismos, péptidos, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, y cualquier otro ligando natural o no natural.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos completos (también conocidos como "intactos") de porciones de unión antígeno de los mismos que retienen el reconocimiento y la

55 capacidad de unión al antígeno. El anticuerpo o porciones de unión a antígeno del mismo pueden ser un anticuerpo de origen natural o porción de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo aislados y/o purificados a partir de un mamífero, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, etc. El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo pueden estar en forma monomérica o polimérico. Además, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo pueden tener cualquier nivel de afinidad

o avidez hacia el marcador de superficie celular. De forma deseable, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo es específico para el marcador de superficie celular, de modo que existe una reacción cruzada mínima con otros péptidos o proteínas.

El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y de cualquier isotipo, por ejemplo, IgM, IgG (por ejemplo, IgG,

65 IgG2, IgG3 o IgG4), IgD, IgA o IgE. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo o fragmentos variables de una sola cadena (Fvs) de un anticuerpo frente a un marcador de superficie de célula diana

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humanizados usando la tecnología de modificación de superficie de anticuerpos descrita, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos N.º 5.639.641 y en Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).

El resto de direccionamiento se puede unir de forma específica a cualquier marcador de superficie celular adecuado.

5 La elección de un resto de direccionamiento y/o marcador de superficie celular en particular se puede escoger dependiendo de la población de células particular a tener como objetivo. En la técnica se conocen marcadores de superficie celular (véase, por ejemplo, Mufson et al., Front. Biosci., 11: 337-43 (2006); Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000); y Kreitman et al., AAPS Journal, 8 (3): E532-E551 (2006)) y pueden ser, por ejemplo, una proteína o un carbohidrato. En una realización de la invención, el resto de direccionamiento es un ligando que se une de forma específica a un receptor en una superficie celular. Los ejemplos de ligandos incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Fas, ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), una citoquina (por ejemplo, IL-2, IL-15, IL-4, IL-13), una linfoquina, una hormona y un factor de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento transformante (TGFa), factor de crecimiento neuronal, factor de crecimiento epidérmico).

15 El marcador de superficie celular puede ser, por ejemplo, un antígeno de cáncer. La expresión "antígeno de cáncer", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, proteína, péptido, lípido, carbohidrato, etc.) expresada única o predominantemente o sobreexpresada por una célula tumoral o una célula cancerosa, de manera que el antígeno está asociado con el tumor o el cáncer. El antígeno de cáncer se puede expresar adicionalmente por células normales, no tumorales, o no cancerosas. Sin embargo, en tales casos, la expresión del antígeno de cáncer por las células normales, no tumorales o no cancerosas no es tan fuerte como la expresión por el tumor o las células cancerosas. En este sentido, las células tumorales o cancerosas pueden sobreexpresar el antígeno o expresar el antígeno a un nivel significativamente más alto, en comparación con la expresión del antígeno por células normales, no tumorales o no cancerosas. Además, el antígeno de cáncer se

25 puede expresar adicionalmente por células de un estado diferente de desarrollo o maduración. Por ejemplo, el antígeno de cáncer se puede expresar adicionalmente por células de la fase embrionaria o fetal, que normalmente no se encuentran en un hospedador adulto. Como alternativa, el antígeno de cáncer se puede expresar adicionalmente por células madre o células precursoras, células que no se encuentran normalmente en un hospedador adulto.

El antígeno de cáncer puede ser un antígeno expresado por cualquier célula de cualquier cáncer o tumor, incluyendo los cánceres y tumores que se describen en el presente documento. El antígeno de cáncer puede ser un antígeno de cáncer solamente de un tipo de cáncer o tumor, de manera que el antígeno de cáncer se asocia con o es característico de un solo tipo de cáncer o tumor. Como alternativa, el antígeno de cáncer puede ser un antígeno de

35 cáncer (por ejemplo, puede ser característico) de más de un tipo de cáncer o tumor. Por ejemplo, el antígeno de cáncer se puede expresar por células tanto de cáncer de mama como de cáncer de próstata y no expresarse en absoluto por células normales, no tumorales o no cancerosas.

Los antígenos de cáncer a modo de ejemplo a los que el resto de direccionamiento se puede unir de forma específica incluyen, pero no se limitan a, mucina 1 (MUC1), antígeno asociado al melanoma (MAGE), antígeno de melanoma expresado preferentemente (PRAME), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico de próstata (PSA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSFR), CD56, receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2/neu) (también conocido como erbB-2), CD5, CD7, antígeno tumoral de tirosinasa, proteína relacionada con tirosinasa 45 (TRP)1, TRP2, NY-ESO-1, telomerasa y p53. En una realización preferente, el marcador de superficie celular, al que el resto de direccionamiento se une de forma específica, se selecciona entre el grupo que consiste en grupo de diferenciación (CD) 19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, receptor de transferrina, receptor de EGF, mesotelina, cadherina, y Lewis Y. La mesotelina se expresa, por ejemplo, en cáncer de ovario, mesotelioma, cáncer de pulmón de células no microcíticas, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de trompa de Falopio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cuello uterino, y cáncer pancreático. CD22 se expresa, por ejemplo, en leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia prolinfocítica (PLL), linfoma no Hodgkin, linfoma linfocítico pequeño (SLL), y leucemia linfática aguda (ALL). CD25 se expresa, por ejemplo, en leucemias y linfomas, incluyendo leucemia de células pilosas y linfoma de Hodgkin. El antígeno Lewis Y se expresa, por ejemplo, en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer

55 de pulmón y cáncer de páncreas. CD33 se expresa, por ejemplo, en leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielomonocítica crónica (CML) y trastornos mieloproliferativos.

En una realización de la invención, el resto de direccionamiento es un anticuerpo que se une de forma específica a un antígeno de cáncer. Los ejemplos de anticuerpos que se unen de forma específica a antígenos de cáncer incluyen, pero no se limitan, anticuerpos contra el receptor de transferrina (por ejemplo, HB21 y variantes del mismo), anticuerpos contra CD22 (por ejemplo, RFB4 y variantes del mismo), anticuerpos contra CD25 (por ejemplo, anti-Tac y variantes del mismo), anticuerpos contra mesotelina (por ejemplo, SS1, MORAb-009, SS, HN1, HN2, MN, MB, y variantes del mismo) y anticuerpos contra antígeno Lewis Y (por ejemplo, B3 y variantes del mismo). En este sentido, el resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en B3, 65 RFB4, SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2, HB21, y MORAb-009, y porciones de unión a antígeno de los mismos. Los restos de direccionamiento adicionales a modo de ejemplo adecuados para su uso en las moléculas quiméricas de la

invención se desvelan por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos N.ºs 5.242.824 (receptor antitransferrina); 5.846.535 (anti-CD25); 5.889.157 (anti-Lewis Y); 5.981.726 (anti-Lewis Y); 5.990.296 (anti-Lewis Y);

7.081.518 (anti-mesotelina); 7.355.012 (anti-CD22 y anti-CD25); 7.368.110 (anti-mesotelina); 7.470.775 (anti-CD30); 7.521.054 (anti-CD25); y 7.541.034 (anti-CD22); Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º

5 2007/0189962 (anti-CD22); Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000), y Kreitman et al., AAPS Journal, 8 (3): E532-E551 (2006). En otra realización, el resto de direccionamiento puede incluir el resto de direccionamiento de inmunotoxinas conocidas en la técnica. Las inmunotoxinas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, LMB-2 (Anti-Tac(Fv)-PE38), BL22 y HA22 (RFB4(dsFv)-PE38), SS1P (SS1 (dsFv)-PE38), HB21-PE40, y variantes de las mismas. En una realización preferente, el resto de direccionamiento es la porción de unión a antígeno de HA22. HA22 comprende un fragmento de anticuerpo anti-CD22 de Fv unido por puente disulfuro conjugado con PE38. HA22 y variantes del mismo se desvelan en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional WO 2003/027135 y WO 2009/032954.

En una realización de la invención, la molécula quimérica comprende un conector. El término "conector", como se

15 usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente o molécula que conecta la PE de la invención con el resto de direccionamiento. Alguien con una experiencia habitual en la materia reconoce que los sitios en la PE de la invención, que no son necesarios para la función de la PE de la invención, son sitios ideales para unir un conector y/o un resto de direccionamiento, con la condición de que el conector y/o resto de direccionamiento, una vez unidos a la PE de la invención, no interfiera(n) con la función de la PE de la invención, es decir, actividad citotóxica, inhiba el crecimiento de una célula diana, o traqueo prevenga el cáncer. El conector puede ser capaz de formar enlaces covalentes tanto a la PE como al resto de direccionamiento. En la técnica se conocen conectores adecuados e incluyen, pero no se limitan a, conectores de carbono de cadena lineal o ramificada, conectores de carbono heterocíclicos y conectores peptídicos cuando la PE y el resto de direccionamiento son polipéptidos, el conector se puede unir a los aminoácidos a través de grupos laterales (por ejemplo, a través de un enlace disulfuro a cisteína).

25 Preferentemente, los conectores se unirán al carbono alfa de los grupos amino y carboxilo de los aminoácidos terminales.

En el alcance de la invención están incluidas las porciones funcionales de las PE de la invención y moléculas quiméricas que se describen en el presente documento. La expresión "porción funcional", cuando se usa en referencia a una PE o molécula quimérica, se refiere a una parte o fragmento de la PE o molécula quimérica de la invención, parte o fragmento que retiene la actividad biológica de la PE o molécula quimérica de que es una parte (la PE o molécula quimérica precursoras). Las porciones funcionales incluyen, por ejemplo, aquellas partes de una PE o molécula quimérica que conservan la capacidad de unirse de forma específica a, y destruir o inhibir el crecimiento de células diana o tratar o prevenir el cáncer, en una extensión similar, en la misma medida, o en una mayor medida, al

35 igual que la PE o molécula quimérica precursoras. En referencia a la PE o molécula quimérica precursoras, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente un 10 % o más, aproximadamente un 25 % o más, aproximadamente un 30 % o más, aproximadamente un 50 % o más, aproximadamente un 68 % o más, aproximadamente un 80 % o más, aproximadamente un 90 % o más, o aproximadamente un 95 % o más, de la PE o moléculas quimérica precursoras.

La parte funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxi terminales de la porción, o en ambos extremos, aminoácidos adicionales que no se encuentran en la secuencia de aminoácidos de la PE o molécula quimérica precursoras. De forma deseable, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la parte funcional, por ejemplo, uniéndose de forma específica a, y destruyendo o inhibiendo el

45 crecimiento de células diana, teniendo la capacidad de tratar o prevenir el cáncer, etc. de forma más deseable, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica de la PE o molécula quimérica precursoras.

En el alcance de la invención están incluidas las variantes funcionales de las PE de la invención y moléculas quiméricas que se describen en el presente documento. La expresión "variante funcional", como se usa en el presente documento, se refiere a una PE o molécula quimérica que tiene una identidad de secuencia sustancial o significativa o similitud a una PE o molécula quimérica precursoras, variante funcional que conserva la actividad biológica de la PE o molécula quimérica de la que es una variante. Las variantes funcionales incluyen, por ejemplo, las variantes de la PE o molécula quimérica que se describen en el presente documento (la PE o molécula quimérica

55 precursoras) que conservan la capacidad de unirse de forma específica a, y destruir o inhibir el crecimiento de células diana en una extensión similar, en la misma medida, o en una mayor medida, que la PE o molécula quimérica precursoras. En referencia a la PE o molécula quimérica precursoras, la variante funcional puede ser idéntica, por ejemplo, en aproximadamente un 30 % o más, aproximadamente un 50 % o más, aproximadamente un 75 % o más, aproximadamente un 80 % o más, aproximadamente un 90 % o más, aproximadamente un 95 % o más, aproximadamente un 96 % o más, aproximadamente un 97 % o más, aproximadamente un 98 % o más, o aproximadamente un 99 % o más en la secuencia de aminoácidos a la PE o molécula quimérica precursoras.

La variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la PE o molécula quimérica precursoras con al menos una sustitución conservativa de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de 65 aminoácidos se conocen en la técnica e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades químicas y/o físicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades

químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución conservativa de aminoácidos puede ser un aminoácido ácido sustituido por otro aminoácido ácido (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituida por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, He, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico sustituido por otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una

5 cadena lateral polar sustituida por otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.

Como alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del PE parental o molécula quimérica con al menos una sustitución no conservativa de aminoácidos. En este caso, es preferente que la sustitución de aminoácidos no conservativa no interfiera con, o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. Preferentemente, la sustitución no conservativa de aminoácidos mejora la actividad biológica de la variante funcional, de tal manera que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con la PE o molécula quimérica precursoras.

15 La PE o molécula quimérica de la invención puede consistir esencialmente de la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas que se describen en el presente documento, de manera que otros componentes de la variante funcional, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambian sustancialmente la actividad biológica de la variante funcional.

La PE o molécula quimérica de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos de origen natural. En la técnica se conocen aminoácidos sintéticos de este tipo e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexano carboxílico, norleucina, ácido α-amino n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3-y trans-4-hidroxiprolina, 4aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, β-fenilserina β-hidroxifenilalanina,

25 fenilglicina, α-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolina-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metillisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido α-aminociclopentano carboxílico, ácido α-aminociclohexano carboxílico, ácido α-aminocicloheptano carboxílico, ácido α-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido α,γdiaminobutírico, ácido α,β-diaminopropiónico, homofenilalanina, y α-terc-butilglicina.

La PE o molécula quimérica de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) pueden estar glicosidas, amidadas, carboxiladas, fosforiladas, esterificadas, N-aciladas, cicladas a través de, por ejemplo, un puente disulfuro, o se pueden convertir en una sal de adición de ácido y/ u opcionalmente dimerizadas o polimerizadas, o conjugadas.

35 Una realización de la invención proporciona un método para producir la PE de la invención que comprende (a) expresar la PE de forma recombinante y (b) purificar la PE. Las PE y moléculas quiméricas de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) se pueden obtener mediante métodos para producir proteínas y polipéptidos conocidos en la técnica. Los métodos adecuados para síntesis de novo de polipéptidos y proteínas se describen en referencias, tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; y en el documento de Patente de Estados Unidos N.º 5.449.752. Además, las PE y moléculas quiméricas de la invención se pueden expresar de forma recombinante usando los ácidos nucleicos que se describen en el presente documento usando

45 métodos recombinantes convencionales. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular. Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994.

El método comprende adicionalmente la purificación de la PE. Una vez expresadas, las PE de la invención se pueden verificar de acuerdo con técnicas de purificación conocidas en la técnica. Las técnicas de purificación a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, y cromatografía en columna, o mediante procedimientos que se describen, por ejemplo, en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982).

55 Otra realización de la invención proporciona un método para producir la molécula quimérica de la invención que comprende (a) expresar de forma recombinante la molécula quimérica y (b) purificar la molécula quimérica. La molécula quimérica se puede expresar de forma recombinante y purificar como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. En una realización de la invención, la expresión de forma recombinante de la molécula quimérica comprende insertar una secuencia de nucleótidos que codifica un resto de direccionamiento y una secuencia de nucleótidos que codifica un PE en un vector. El método puede comprende insertar la secuencia de nucleótidos que codifica el resto de direccionamiento y la secuencia de nucleótidos que codifican la PE en marcó de modo que codifica un polipéptido continuo que incluye una región de resto de direccionamiento funcionario la región de PE funcional. En una realización de la invención, el método comprende ligar una secuencia de nucleótidos que codifica la PE a una secuencia de nucleótidos que codifica un resto de

65 direccionamiento de modo que, después de su expresión, la PE se sitúa en el extremo carboxilo terminal del resto de direccionamiento. En una realización alternativa, el método comprende ligar una secuencia de nucleótidos que

codifica la PE a una secuencia de nucleótidos que codifica un resto de direccionamiento de modo que, después de su expresión, la PE se sitúa en el extremo amino terminal del resto de direccionamiento.

Además, otra realización de la invención proporciona un método para producir la molécula quimérica de la invención

5 que comprende (a) expresar de forma recombinante la PE de la invención, (b) purificar la PE, y (c) unir de forma covalente un resto de direccionamiento a la PE purificada. La PE de la invención se puede expresar de forma recombinante como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. El método comprende adicionalmente unir de forma covalente un resto de direccionamiento a la PE purificada. El método de unión de una PE a un resto de direccionamiento puede variar de acuerdo con la estructura química del resto de direccionamiento. Por ejemplo, el método puede comprender hacer reaccionar uno cualquiera o más de una diversidad de grupos funcionales, por ejemplo grupos ácido carboxílico (COOH), amina libre (-NH2), o sulfhidrilo (-SH) presentes en la PE con un grupo funcional adecuado en el resto de direccionamiento, formando de ese modo un enlace covalente entre la PE y el resto de direccionamiento. Como alternativa o adicionalmente, el método puede comprender la derivatización del resto de direccionamiento o PE para exponer o para unir grupos funcionales

15 reactivos adicionales. La derivatización también puede incluir la unión de uno o más conectores al resto de direccionamiento o PE.

En otra realización de la invención, las PE y moléculas quiméricas de la invención se pueden producir usando métodos no recombinantes. Por ejemplo, las PE y moléculas quiméricas de la invención que se describen en el presente documento (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) se pueden sintetizar de forma comercial en compañías, tales como Synpep (Dublín, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). En este sentido, las PE y moléculas quiméricas de la invención pueden ser sintéticas, recombinantes, aisladas, y/o purificadas.

25 En algunas circunstancias puede ser deseable liberar la PE del resto de direccionamiento cuando la molécula quimérica ha alcanzado una o más células diana. En este sentido, las moléculas quiméricas de la invención deben comprender un conector escindible. El conector se puede escindir mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, por vía enzimática. Por ejemplo, cuando la célula diana es una célula cancerosa (por ejemplo, tumor), la molécula quimérica puede incluir un conector escindible en condiciones presentes en el sitio del tumor (por ejemplo, cuando se expone a enzimas asociadas a tumor o pH ácido).

Una realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las PE de la invención o las moléculas quiméricas de la invención que se describen en el presente documento. La expresión "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, incluye "polinucleótido",

35 "oligonucleótido", y "molécula de ácido nucleico", y generalmente se refiere a un polímero de ADN o ARN, que puede ser de una hebra o de doble hebra, que se puede sintetizar u obtener (por ejemplo, aislar y/o purificar) a partir de fuentes naturales, que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que pueden contener una unión internucleótido natural, no natural, o alterada, tal como un enlace fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido sin modificar. Por lo general es preferente que el ácido nucleico no comprenda ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, en algunos casos puede ser adecuado, como se discute en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones, y/o sustituciones.

Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. Como se usa en el presente documento,

45 el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de células vivas mediante la unión de segmentos de ácidos nucleicos naturales o sintéticos, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las que se han descrito en (i) anteriormente. Para los fines en el presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos se pueden construir basándose en síntesis química y/o reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., mencionado anteriormente, y Ausubel et al., mencionado anteriormente. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar por vía química usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de diversas formas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado después de la 55 hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6-sustituida, 7-metilguanina, 5metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5metoxiuracilo, 2-metiltio-N-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudoufacilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster de metilo del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, uno o más de los ácidos nucleicos de

65 la invención se pueden adquirir en compañías tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

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vaselina y mineral. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico, y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.

5 Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales de metal alcalino graso, amonio, y trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio, y haluros de alquil piridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo, y olefina, alquilo, olefina, éter, y sulfatos de monoglicéridos, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de amina grasa, alcanolamidas de ácido graso, y copolímeros de polioxietileno-polipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, alquil-β-aminopropionatos, y sales de 2-alquil-imidazolina y amonio cuaternario, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales por lo general contendrán aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 25 % en peso del material de PE de la invención en solución. Se pueden usar conservantes y tampones. Con el fin de 15 minimizar o eliminar la irritación en el sitio de la inyección, tales composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente

17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones variara por lo general de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 % en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polietilenglicol, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formada por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en envases sellados de dosis unitaria o múltiples dosis, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en un estado secado por congelación (liofilizado) que requiere solamente la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones inyectables extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos

25 del tipo descrito anteriormente descrito. Los requisitos para vehículos farmacéuticos eficaces para composiciones parenterales son bien conocidos por los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker y Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4ª ed., páginas 622-630 (1986)).

Alguien con experiencia en la materia observará que, además de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, los materiales de PE de la invención se pueden formular como complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina, o liposomas.

Para los fines de la invención, la cantidad o dosis del material de PE de la invención administrada debería ser

35 suficiente para efectuar una respuesta deseada, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica, en el mamífero en un período de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de PE de la invención debería ser suficiente para inhibir el crecimiento de una célula diana o tratar o prevenir el cáncer en un periodo de aproximadamente 2 horas o un periodo superior, por ejemplo, de 12 a 24 o más horas, desde el momento de la administración. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo podría ser aún más largo. La dosis se determinará por la eficacia del material de PE de la invención en particular y la afección del mamífero (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del mamífero (por ejemplo, ser humano) a tratar.

En la técnica se conocen muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Una dosis administrada se puede determinar in vitro (por ejemplo, cultivos celulares) o in vivo (por ejemplo, estudios en animales). Por ejemplo,

45 la dosis administrada se puede determinar mediante la determinación de la CI50 (la dosis que consigue una inhibición semi máxima de los síntomas), la DL50 (la dosis letal para un 50 % de la población), la DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva en un 50 % de la población), y el índice terapéutico en cultivo celular y/o estudios en animales. El índice terapéutico es la proporción de DL50 con respecto a la DE50 (es decir, DL50/DE50).

La dosis del material de PE de la invención también se determinará por la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto secundario adverso que pudiera acompañar a la administración de un material de PE de la invención en particular. Por lo general, el médico tratante decidirá la dosificación del material de PE de la invención con el que se trata a cada paciente individual, teniendo en cuenta una diversidad de factores, tales como edad, peso corporal, salud general, dieta, sexo, material de PE de la invención administrada, vía de administración, y la

55 gravedad de la afección que se está tratando. A modo de ejemplo y no pretendiendo limitar la invención, la dosis del material de PE de la invención puede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del sujeto que se está tratando/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 1 a aproximadamente a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 25 a aproximadamente 150 mg/kg de peso corporal/día, o aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día.

Como alternativa, los materiales de PE de la invención se pueden modificar en una forma de depósito, de modo que

65 en la forma en la que se libera el material de PE de la invención en el cuerpo al que se administra esta controlada con respeto al tiempo y la ubicación dentro del cuerpo (véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados

Unidos N.º 4.450.150). Las formas de depósito de materiales de PE de la invención pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los materiales de PE de la invención y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en el que los materiales de PE de la invención se encapsulan o se difunden a través del material y/o degradación del material no poroso. A continuación con el depósito se implanta en la posición deseada dentro

5 del cuerpo y los materiales de PE de la invención se liberan del implante a una velocidad determinada previamente.

Los materiales de PE de la invención se pueden someter a ensayo para citotoxicidad mediante ensayos conocidos en la técnica. Los ejemplos de ensayos de citotoxicidad incluyen un ensayo de WST, que mide la proliferación celular usando la sal de tetrazolio WST-1 (reactivos y kits disponibles en Roche Applied Sciences), tal como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 2011/032022.

Se contempla que las composiciones farmacéuticas, las PE, moléculas quiméricas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, o poblaciones de células se pueden usar en métodos para tratar o prevenir el cáncer. Sin quedar ligado por ninguna teoría o mecanismo en particular, se cree que las PE de la 15 invención destruyen o inhiben el crecimiento de las células a través de la inhibición de la síntesis de proteínas en células eucariotas, por ejemplo, mediante la inactivación de la ADP-ribosilación del factor de elongación 2 (EF-2). Sin quedar ligado a una teoría o mecanismo en particular, las moléculas quiméricas de la invención reconocen y se unen de forma específica a los marcadores de superficie celular, liberando de ese modo la PE citotóxica a la población de células que expresa el marcador de superficie celular con una reactividad cruzada mínima o sin ella con células que no expresan el marcador de superficie celular. De esta manera, la citotoxicidad de la PE puede ser dirigida a destruir

o inhibir el crecimiento de una población de células en particular, por ejemplo, células cancerosas. En este sentido, la invención proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero que comprende administrar al mamífero cualquiera de las PE, moléculas quiméricas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, célula hospedadora, población de células, o composiciones farmacéuticas que se describen en el presente

25 documento, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Los términos "tratar" y "prevenir" así como expresiones que surgen a partir de los mismos, como se usa en el presente documento, no necesariamente implican un 100 % o tratamiento o prevención completos. Por el contrario, existen diversos grados de tratamiento o prevención de los cuales alguien con experiencia habitual en la materia reconoce que tienen un beneficio potencial o efecto terapéutico. En este sentido, los métodos de la invención pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención de cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o prevención proporcionado por el método de la invención puede incluir el tratamiento o la prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, por ejemplo cáncer, que se está tratando o previniendo. Además, para los fines en el presente documento, "prevención" que incluyen retraso del inicio de la

35 enfermedad, o un síntoma o afección del mismo.

Para los fines de los métodos de la invención, en los que se administran las células hospedadoras o poblaciones de células, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas para el hospedador. Preferentemente, las células son autólogas para el hospedador.

Con respecto a los métodos de la invención, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo cualquiera de de la glándula adrenal, sarcomas (por ejemplo, sarcoma sinovial, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma uterino, angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma, mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma, y teratoma), linfomas (por ejemplo, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin), carcinoma 45 hepatocelular, glioma, cánceres de cabeza (por ejemplo, carcinoma de células escamosas), cánceres de cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas), cáncer linfocítico agudo, leucemias (por ejemplo, leucemia de células pilosas, leucemia mieloide (aguda y crónica), leucemia linfática (aguda y crónica), leucemia prolinfocítica (PLL), leucemia mielomonocítica (aguda y crónica), y leucemia linfocítica (aguda y crónica), cáncer de hueso ((sarcoma osteogénico, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de células del retículo), mieloma múltiple, tumor de células gigantes malignas, cordoma, osteocondroma (exostosis osteocartilaginosa), condroma benigno, condroblastoma, fibroma condromixoide, osteoma osteoide, y tumores de células gigantes), cáncer cerebral (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma (pinealoma), glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma y retinoblastoma), cáncer de trompa de Falopio, cáncer de mama, cáncer del ano, canal anal, o anorrecto, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar 55 intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, vesícula biliar, o pleura, cáncer de la nariz, cavidad nasal, u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de la vulva (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma y fibrosarcoma), trastornos mieloproliferativos (por ejemplo, cáncer crónico mieloide), cánceres de colon (por ejemplo, carcinoma de colon), cáncer esofágico (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, leiomiosarcoma y linfoma), cáncer de cuello uterino (carcinoma de cuello uterino y displasia de cuello uterino preinvasiva), cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer de hipofaringe, cáncer de laringe, cánceres de hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular, y hemangioma), cánceres de pulmón (por ejemplo, carcinoma broncogénico (células escamosas, células pequeñas no diferenciadas, células grandes no diferenciadas, y adenocarcinoma), carcinoma alveolar (bronquiolar), adenoma bronquial, hamartoma condromatoso, cáncer de 65 pulmón de células microcíticas, cáncer de pulmón de células no microcíticas y adenocarcinoma de pulmón), mesotelioma maligno, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma, carcinoma de células basales, carcinoma de células

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representación razonable de los alelos DRB1 de la clase II de HLA principal en la población base de donantes sin tratamiento previo. El análisis estadístico mostraba una correlación entre la población mundial y la población base de donantes de R2 = 0,52. La Figura 1 compara la frecuencia de los diferentes tipos de alelos de clase 2 de HLA en la población mundial con la población base de donantes sin tratamiento previo. La Tabla 1 muestra los haplotipos DRB1 de la clase II de HLA de la población de donantes.

TABLA 1

Donante N.º

ID del Donante Alelos de HLA II DRB1 Donante N.º ID del Donante Alelos de HLA II DRB1

1

10710aph 1001 1501 26 102609aph 0404 0802

2

021610aph 15 1501 27 100509aph 07 07

3

030210aph 12 1602 28 082509aph 0803 1502

4

030910aph 0301 401 29 120809aph 1101 1302

5

031810aph 0301 1501 30 030211aph 03 11

6

033010aph 08 15 31 090109aph 0301 1303

7

040110aph 0804 13 32 092809aph 0405 1303

8

040610aph 3021 1503 33 032510aph 07 1501

9

040810aph 0407 15 34 121709aph 1101 1502

10

041310aph 0101 301 35 012110aph 0401 07

11

080409aph 0701 1302 36 082709aph 0401 1302

12

081209aph 1404 1501 37 021611aph 04 13

13

111909aph 1001 15 38 100109aph 0401 1502

14

101909aph 0401 0404 39 031611aph 804 1303

15

020210aph 03 0401 40 011910aph 1001

15

16

020410aph 0402 1101 41 032311aph 1501 1502

17

122209aph 12 1602 42 041311aph 0301 0701

18

122910aph 0301 1101 43 072309aph 0803 1502

19

010510aph 1301 1503 44 071311aph 01 07

20

011410aph 0301 03 45 073009aph 0804 1503

21

111209aph 0804 1101 46 042011aph 0806 1501

22

110909aph 1001 1602 47 060811aph 01 13

23

030410aph 0401 1501 48 061511aph 0802 1503

24

011210aph 0401 1304 49 051111aph 0405 11

25

101509aph 0101 0301 50 062911aph 0404 15

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TABLA 3

Péptido

Manchas totales (n = 50) enCélulas Formadoras de Manchas/1millón de células Péptido Manchas totales (n = 50) enCélulas Formadoras de Manchas/1millón de células

sin péptido

1434,5 combinación 12 4235

combinación 1

4947,5 combinación 13 1660

combinación 2

5952,5 combinación 14 6880

combinación 3

22555 combinación 15 4750

combinación 4

1667,5 combinación 16 8555

combinación 5

1925 combinación 17 1792,5

combinación 6

2742,5 combinación 18 1965

combinación 7

5415 combinación, 19 4597,5

combinación 8

3472,5 combinación 20 1680

combinación 9

2245 combinación 21 1435

combinación 10

3572,5 combinación 22 1360

combinación 11

7147,5 imagen17 -

Una identificación sistemática fina de la combinación 3 para encontrar la región o regiones inmunodominantes mostraba que, para la mayoría de los donantes, los péptidos de las SEQ ID NOs: 44 y 45 eran responsables de la

5 respuesta dentro de la combinación 3 (Figura 4). La Figura 4 muestra que los péptidos de las SEQ ID NOs: 44 y 45 contenían una región común (LVALYLAARLSW) (SEQ ID NO: 3) para estimular los linfocitos T en la mayoría de los pacientes a pesar de tener un estado de HLA diferente.

Ejemplo 5

10 Este ejemplo demuestra que las sustituciones L294A, L297A, Y298A, L299A, o R302A en LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) reducen la inmunogenicidad de LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3).

Los péptidos de las SEQ ID NOs: 44 y 45 (dentro de la combinación 3) tienen 12 aminoácidos en común. Este área

15 común, LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3), corresponde a las posiciones 294-305 del resto de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y contiene tanto el sitio de unión a MHC como el sitio de unión al receptor de linfocitos T. Cada aminoácido en LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) estaba sustituido con alanina. Las muestras de 9 donantes sin tratamiento previo y de 2 pacientes se estimularon con LMB9 durante 17 días y se sometieron al ensayo usando ELISpot de IL-2 como se ha descrito en el Ejemplo 3. La Tabla 4 resume los datos de la identificación sistemática de 11 muestras

20 frente a los péptidos sustituidos. Para 10 de las 11 muestras, una sustitución o más disminuía la respuesta por debajo de un 7 % de la respuesta para el tipo silvestre (WT). Para todos los donantes excepto para uno, la sustitución de L297A reducía la respuesta ha un 7 % o inferior. Y298A reducía la respuesta en 9 de las 11 muestras, y R302A reducía la respuesta en 7 de las 11 muestras. La Tabla 4 muestra el porcentaje de respuesta obtenida con el péptido WT.

25

TABLA 4

Paciente 091510

Paciente 012810 d01071 0 d02161 0 d031810 d033010 d040610 d010510 d111909 d030410 d122209

Medio

0 % 2 % 0 % 1 % 10 % 3 % 1 % 14 % 0 % 0 % 13 %

WT 15

100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %

L294A

5 % 21 % 26 % 6 % 26 % 1 % 7 % 23 % 21 % 3 % 49 %

L297A

0 % 2 % 6 % 2 % 6 % 1 % 6 % 6 % 7 % 5 % 52 %

Y298A

0 % 0 % 3 % 2 % 17 % 2 % 1 % 3 % 0 % 3 % 19 %

L299A

5 % 112 % 1 % 28 % 6 % 78 % 45 % 19 % 14 % 24 % 44 %

R302A

14 % 63 % 3 % 6 % 22 % 3 % 7 % 14 % 7 % 5 % 11 %

L303A

71 % 356 % 78 % 27 % 46 % 50 % 59 % 28 % 117 % 70 % 85 %

S304A

133 % 305 % 82 % 26 % 106 % 69 % 56 % 43 % 117 % 64 % 109 %

W305A

186 % 628 % 76 % 58 % 104 % 101 % 64 % 45 % 117 % 132 % 87 %

Sin quedar ligado a ninguna teoría o mecanismo en particular, se cree que la disminución de la respuesta después de un cambio en un solo aminoácido se puede atribuir a una interrupción de la unión del péptido a la hendidura(s) de

5 la molécula de HLA o a una incapacidad del receptor de linfocitos T para reconocer el péptido cambiado. En cualquier caso, los péptidos sustituidos L279A e Y298A causaban una distribución de la respuesta y, por lo tanto, se puede considerar que proporcionan una reducción de la inmunogenicidad.

Ejemplo 6

10 Este ejemplo demuestra que la sustitución de R302A no crea ningún epítopo de linfocitos T nuevo y proporciona una reducción de la respuesta de los linfocitos T.

Para preparar RIT R302 HA22 y L297A HA22 como se ha descrito anteriormente se usó mutagénesis dirigida al sitio

15 (Pastan et al., Methods Mol. Biol, 248: 503-18 (2004)). La actividad citotóxica en las células CA46 se comparó con la de HA22 de tipo silvestre (Figura 5). La Figura 5 muestra que las construcciones de HA22 con la sustitución de L297A o R302A eran citotóxicas. La CI50 de FIA22, L297A HA22, y R302A HA22 era 1,1, 1,8, y 1,8 ng/ml, respectivamente.

20 Las PBMC de los donantes 010710 y 111909 se cultivaron durante 14 días con cualquiera de WT HA22 o con HA22-R302A y se sometieron a ensayo para la respuesta de los linfocitos T después de reestimulación sin péptido, péptido de tipo silvestre LVALYLAARLSWNQV (SEQ ID NO: 45) (WT15), o LVALYLAAALSWNQV (SEQ ID NO: 145) (R302A). Para ambos donantes, 010710 (Figura 6A) y 111909 (Figura 6B), no se observaron nuevos epítopos, y la respuesta de los linfocitos T al péptido sustituidos disminuyó.

25

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra que la deleción de la porción del dominio II que contiene el epítopo inmunodominante reduce la respuesta de los linfocitos T a los péptidos de PE38.

30 Como se muestra en el Ejemplo 4, el dominio II contiene un epítopo inmunodominante y promiscuo (contenido en las SEQ ID NOs: 44 y 45 de la combinación 3). PE-LR (resistencia a la degradación lisosómica) (también conocido como LR o LR RIT) contiene una deleción del dominio II excepto para la secuencia de escisión de furina RHRQPRGWEQL (SEQ ID NO: 8), que está presente en las SEQ ID NOs: 37 y 38. Por lo tanto, LR RIT contiene los

35 restos de los aminoácidos 274-284 y 395-613 de SEQ ID NO: 1.

La respuesta de los linfocitos T de donante que se estimularon con HA22 (que contiene PE38) para las 22 combinaciones de péptidos de la Tabla 2 se compararon con las de los linfocitos T de donante que se estimularon con PE-LR (que carece completamente del epítopo inmunodominante).

40

El Día 0, los linfocitos T de tres donantes (Donante 031510, Donante 021610, o Donante 101509) se sembraron en placas de 6 pocillos y se estimularon con 10 µg/ml de cualquiera de HA22 o PE-LR. El día 14, la células se cosecharon y se sembraron en una placa de ELISpot de IL-2 y se incubaron con los péptidos de una de cada una de las 22 combinaciones de la Tabla 2 en replicados de 4. Los controles incluían células cultivadas con ceftazidima

5 (CEFT), células sin estimulación con antígeno el día 0 y ninguna estimulación con antígeno el día 14 ("línea M"), y células con estimulación con LMB9 el día 0 y ninguna estimulación con antígeno el día 14 ("sin péptido").

Los resultados se muestran en las Figuras 7A (Donante 031510), 7B (Donante 021610), y 7C (Donante 101509). Los linfocitos T de los tres donantes demostraban una respuesta después de estimulación con HA22 (que contiene

10 PE38) y reestimulación con los péptidos de la combinación 3. No se observó respuesta para las células que se estimularon con PE-LR.

Ejemplo 8

15 Este ejemplo demuestra la identificación de epítopos de linfocitos T en el dominio III de PE.

Después de estimulación inicial con inmunotoxina y 14 días de expansión, los linfocitos T de 20 donantes se cosecharon y se expusieron a las combinaciones de péptidos para una identificación sistemática inicial de la combinación con ELISpot de IL-2 como se ha descrito en el Ejemplo 4. El día 17, las células restantes se usaron

20 para repetir la identificación sistemática de la combinación y se realizó una identificación sistemática final con los péptidos de las SEQ ID NOs: 102-111. Los resultados se muestran en la Figura 8. Los péptidos que estimulaban la producción de IL-2 mediante los linfocitos T de cada uno de los donantes 1-20 están sombreados en la Figura 8.

Ejemplo 9

25 Este ejemplo demuestra que una sustitución de alanina en lugar de I493, R494, N495, G496, L498, L499, R500, V501 o Y502 reduce la respuesta de los linfocitos T, tal como se mire mediante la producción de IL-2, en comparación con la respuesta para el péptido de tipo silvestre (WT).

30 Cada aminoácido distinto de alanina en el péptido de tipo silvestre IRNGALLRVYVPRSS (SEQ ID NO: 106) estaba sustituido con alanina. Las muestras de los donantes sin tratamiento previo se estimularon con LMB9 durante 17 días y se sometieron a ensayo usando ELISpot de IL-2 como se ha descrito en el Ejemplo 3. La Tabla 5 resume los datos de la identificación sistemática de seis muestras frente a los péptidos sustituidos.

35 TABLA 5

péptido

Donantes

071509wb

091510aph 050710aph 101910aph 121709aph 030211aph

WT SEQ ID NO: 106

100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %

I493A

86 % 13 % 0 % 111 % 5 % 6 %

R494A

133 % 0 % 2 % 62 % 2 % 12 %

N495A

117 % 25 % 2 % 67 % 1 % 35 %

G496A

97 % 58 % 18 % 35 % 14 % 18 %

L498A

24 % 4 % 0 % 57 % 5 % 0 %

L499A

30 % 0 % 0 % 26 % 9 % 6 %

R500A

1 % 4 % 24 % 38 % 13 % 24 %

V501A

43 % 0 % 7 % 31 % 27 % 0 %

Y502A

3 % 4 % 18 % 37 % 37 % 12 %

V503A

62 % 58 % 47 % 37 % 36 % 41 %

P504A

53 % 125 % 49 % 32 % 56 % 206 %

imagen18

Epítopo N.º

combinación Número de donantes que respondieron al péptido (n = 50) Número de pacientes que respondieron al péptido (n = 12) Secuencia Secuencia común

4

19 1 2 2 0 4 4 GPEEEGGRLETILGW (SEQ ID NO: 123) EEGGRLETILGWPLA (SEQ ID NO: 124) GRLETILGWPLAERT (SEQ ID NO: 125) EEGGRLETILGW (SEQ ID NO: 194) GRLETILGWPLA (SEQ ID NO: 195)

5

12 4 2 3 4 5 3 GYVFVGYHGTFLEAA (SEQ ID NO: 86) FVGYHGTFLEAAQSI (SEQ ID NO: 87) YHGTFLEAAQSIVFG (SEQ ID NO: 88) FVGYHGTFLEAA (SEQ ID NO: 196) YHGTFLEAAQSI (SEQ ID NO: 197)

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra que las sustituciones R421A, L422A, L423A, A425G, R427A, L429A, Y470A, I471A, A472G, 5 P475A, A476G, L477A, I493A, N495A, R494A, L498A, L499A, R500A, V501A, Y502A, V503A, R505A, L508A, o P509A como se define por referencia a la SEQ ID NO: 1, reducen la inmunogenicidad de PE.

La SEQ ID NO: 106 corresponde a las posiciones 493-507 del resto de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 107 corresponde a las posiciones 496-510 del resto de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 97 10 corresponde a las posiciones 466-480 del resto de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y la SEQ ID NO: 81 corresponde a las posiciones 418-432 del resto de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Cada aminoácido en la SEQ ID NO: 106 y la SEQ ID NO: 107 estaba sustituido con alanina. Las muestras de donantes y pacientes se estimularon and con LMB9 durante 17 días y se sometieron a ensayo usando ELISpot de IL-2 como se ha descrito en el Ejemplo 3. La Tabla 7 (SEQ ID NO: 106), la Tabla 8 (SEQ ID NO: 107), la Tabla 9 (SEQ ID NO: 97), y la Tabla 10 (SEQ ID NO: 81)

15 resumen los datos (% de la respuesta al péptido de tipo silvestre (WT)) a partir de la identificación sistemática de las muestras frente a los péptidos sustituidos.

TABLA 7 (SEQ ID NO: 106)

Donante/ Paciente

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sin péptido

0 % 0 % 0 % 4 % 0 % 9 % 42 % 0 % 1 % 17 % 1 % 0 %

WT76

100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %

I493A

86 % 13 % 0 % 5 % 6 % 20 % 32 % 110 % 36 % 71 % 76 % 0 %

R494A

133 % 0 % 2 % 2 % 12 % 26 % 23 % 111 % 2 % 88 % 94 % 1 %

N495A

117 % 25 % 2 % 1 % 35 % 40 % 42 % 102 % 31 % 72 % 72 % 1 %

G496A

97 % 58 % 18 % 14 % 18 % 37 % 39 % 96 % 63 % 44 % 99 % 8 %

L498A

24 % 4 % 0 % 5 % 0 % 80 % 23 % 6 % 4 % 16 % 31 % 1 %

L499A

30 % 0 % 0 % 9 % 6 % 31 % 39 % 30 % 1 % 15 % 57 % 1 %

R500A

1 % 4 % 24 % 13 % 24 % 26 % 19 % 1 % 2 % 20 % 6 % 1 %

V501A

43 % 0 % 7 % 27 % 0 % 46 % 94 % 25 % 13 % 27 % 48 % 4 %

Y502A

3 % 4 % 18 % 37 % 12 % 23 % 42 % 5 % 23 % 20 % 0 % 6 %

V503A

62 % 58 % 47 % 36 % 41 % 63 % 55 % 35 % 68 % 27 % 43 % 33 %

P504A

53 % 125 % 49 % 56 % 206 % 60 % 55 % 35 % 122 % 26 % 18 % 63 %

R505A

36 % 83 % 87 % 95 % 147 % 131 % 123 % 36 % 127 % 23 % 30 % 83 %

Donante/ Paciente

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

S506A

114 % 138 % 44 % 55 % 312 % 214 % 104 % 101 % 107 % 55 % 82 % 56 %

S507A

119 % 96 % 51 % 100 % 235 % 137 % 97 % 71 % 69 % 83 % 84 % 45 %

Como se muestra en la Tabla 7, la sustitución de I493A, R494A, N495A, L498A, L499A, R500A Y502A, V501A, o Y502A reduce la respuesta de los linfocitos T en un 70 % o más en comparación con la respuesta para el péptido WT.

TABLA 8 (SEQ ID NO: 107)

% de WT

1 2 3 4 5 6 7

Sin péptido

0 % 0 % 7 % 0 % 18 % 9 % 1 %

wt 77

100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %

G496A

29 % 51 % 123 % 126 % 58 % 112 % 37 %

A497G

103 % 68 % 126 % 102 % 108 % 129 % 71 %

L498A

61 % 38 % 140 % 7 % 20 % 13 % 43 %

L499A

46 % 24 % 61 % 33 % 26 % 73 % 1 %

R500A

59 % 31 % 124 % 1 % 16 % 1 % 6 %

V501A

7 % 18 % 28 % 18 % 26 % 49 % 15 %

Y502A

14 % 1 % 9 % 4 % 25 % 8 % 0 %

V503A

17 % 1 % 9 % 15 % 39 % 49 % 1 %

P504A

46 % 32 % 41 % 38 % 43 % 12 % 36 %

R505A

7 % 1 % 22 % 28 % 24 % 39 % 2 %

S506A

68 % 42 % 50 % 107 % 93 % 122 % 48 %

S507A

35 % 37 % 224 % 86 % 106 % 96 % 60 %

L508A

8 % 0 % 15 % 73 % 99 % 88 % 46 %

P509A

10 % 4 % 16 % 87 % 101 % 119 % 72 %

G510A

113 % 144 % 210 % 116 % 114 % 114 % 104 %

Como se muestra en la Tabla 8, la sustitución de L498A, L499A, R500A, V501A, Y502A, V503A, R505A, L508A, o P509A reduce la respuesta de los linfocitos T en un 70 % o más en comparación con la respuesta para el péptido WT.

TABLA 9 (SEQ ID NO: 97)

% de WT

1 2 3 4 5 6 7 9 11 12 13

Sin péptido

0 % 6 % 13 % 1 % 13 % 43 % 26 % 0 % 29 % 47 % 0 %

WT67

100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %

F469A

80 % 11 % 104 % 35 % 97 % 60 % 88 % 53 % 68 % 60 % 81 %

Y470A

61 % 6 % 48 % 67 % 29 % 29 % 16 % 15 % 97 % 92 % 68 %

I471A

17 % 7 % 20 % 20 % 22 % 25 % 12 % 17 % 43 % 55 % 35 %

A472G

37 % 20 % 84 % 75 % 46 % 31 % 19 % 0 % 60 % 76 % 60 %

P475A

72 % 73 % 34 % 57 % 15 % 59 % 16 % 60 % 40 % 70 % 38 %

A476G

75 % 110 % 207 % 26 % 67 % 47 % 35 % 24 % 122 % 115 % 32 %

imagen19

% de WT

1 2 3 4 5 6 7

L556A

235 % 3 % 24 % 10 % 13 % 35 % 83 %

W558A

200 % 13 % 20 % 26 % 7 % 46 % 54 %

P559A

197 % 208 % 24 % 69 % 37 % 65 % 121 %

L560A

321 % 162 % 81 % 132 % 117 % 46 % 138 %

Como se muestra en la Tabla 11, la sustitución de R551A, L552A, T554A, I555A, L556A y W558A reduce la respuesta de los linfocitos T en un 70 % o más en comparación con la respuesta para el péptido WT.

TABLA 12

% de WT

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Sin péptido

0 % 4 % 0 % 0 % 1 % 2 % 10 % 9 % 0 % 1 % 18 %

WT 57-58

100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %

F436A

98 % 7 % 57 % 159 % 89 % 67 % 41 % 123 % 103 % 103 % 94 %

V437A

78 % 81 % 84 % 130 % 96 % 77 % 102 % 148 % 97 % 95 % 103 %

G438A

52 % 79 % 67 % 78 % 118 % 81 % 98 % 68 % 71 % 88 % 97 %

Y439A

96 % 17 % 22 % 21 % 125 % 88 % 110 % 154 % 79 % 97 % 111 %

H440A

12 % 6 % 11 % 95 % 108 % 80 % 90 % 102 % 46 % 113 % 105 %

T442A

84 % 31 % 77 % 151 % 93 % 77 % 59 % 127 % 48 % 102 % 79 %

F443A

0 % 7 % 2 % 40 % 1 % 13 % 20 % 7 % 5 % 2 % 17 %

L444A

54 % 140 % 69 % 74 % 55 % 11 % 14 % 0 % 9 % 4 % 32 %

A446G

40 % 119 % 80 % 47 % 107 % 97 % 69 % 16 % 80 % 37 %. 120 %

A447G

104 % 103 % 65 % 57 % 118 % 73 % 43 % 7 % 19 % 28 % 98 %

S449A

126 % 104 % 98 % 93 % 128 % 116 % 163 % 200 % 23 % 65 % 87 %

I450A

159 % 124 % 138 % 130 % 108 % 42 % 31 % 11 % 2 % 66 % 20 %

V451A

127 % 121 % 119 % 162 % 142 % 94 % 137 % 50 % 82 % 117 % 119 %

F452A

126 % 156 % 119 % 154 % 103 % 169 % 104 % 123 % 99 % 104 % 116 %

Como se muestra en la Tabla 12, la sustitución de Y439A, H440A, F443A, L444A, A446G, A447A, o I450A reduce la respuesta de los linfocitos T en un 70 % o más en comparación con la respuesta para el péptido WT. 10 Ejemplo 13 Este ejemplo demuestra la identificación de epítopos de linfocitos T en PE. Basándose en los resultados obtenidos en los Ejemplos 4-12, las secuencias de aminoácidos que se presentan en la 15 Tabla 13 se identificaron como epítopos de linfocitos T de PE. TABLA 13

SEQ ID NO:

Restos de aminoácidos con referencia a la SEQ ID NO: 1 Secuencia

200

276-287 RQPRGWEQLEQC

3

294-305 LVALYLAARLSW

193

421-432 RLLQAHRQLEER

199

436-453 FVGYHGTFLEAAQSIVFG

imagen20

imagen21

imagen22

Biblioteca

Enfermedad RIT Usadas Tamaño de la Biblioteca X 108 clones independientes Tamaño de la Biblioteca de Fagos x 1 013 fpu/ml Tasa de clones positivos después de la cuarta ronda Análisis de secuencias de ADN Clon Independiente

L7

Mesotelioma Pleural SS1P 1,05 2,06 172/190 172 4

L8

Mesotelioma Pleural SS1P 0,73 2,15 98/190 98 63

L9

Cáncer de pulmón SS1P 0,86 2,29 80/190 80 2

Total: 710

103

TABLA 15

SEQ ID NO:

Síntesis de la primera hebra de ADNc

Cebador de la región constante de cadena pesada humana

146

HuIgG1-4CH1FOR 5' GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT 3'

Cebador de la región constante de κ humana

147

HuGκFOR 5' AGA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT 3'

Primera etapa de PCR

Retrocebadores de VH humano

148

HuVH1aBACK 5' CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG 3'

149

HuVH2aBACK 5' CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCT GG 3'

150

HuVH3aBACK 5' GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG 3'

151

HuVH4aBACK 5' CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG 3'

152

HuVH5aBACK 5' GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC 3'

153

HuVH6aBACK 5' CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG 3'

Retrocebadores de Vκ humano

154

HuVκ 1aBACK 5' GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC 3'

155

HuVκ 2aBACK 5' GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC 3'

156

HuVκ 3aBACK 5' GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CC 3'

157

HuVκ 4aBACK 5' GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC 3'

158

HuVκ 5aBACK 5' GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC 3'

159

HuVκ 6aBACK 5' GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC 3'

Segunda etapa de PCR

Retrocebadores de Nco de VH humano

SEQ ID NO:

Síntesis de la primera hebra de ADNc

160

HuVH1aBACKnco 5' GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG 3'

161

HuVH2aBACKnco 5' GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCT GG 3'

162

HuVH3aBACKnco 5' GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG 3'

163

HuVH4aBACKnco 5' GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG 3'

164

HuVH5aBACKnco 5' GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC 3'

165

HuVH6aBACKnco 5' GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG 3'

Cebadores de conector directo de JH humano

166

ConectorHuJH12FOR 5' ACC TCC AGA TCC GCC ACC ACC GGA TCC GCC TCC GCC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC 3'

167

ConectorHuJH3FOR 5' ACC TCC AGA TCC GCC ACC ACC GGA TCC GCC TCC GCC TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC 3'

168

ConectorHuJH45FOR 5' ACC TCC AGA TCC GCC ACC ACC GGA TCC GCC TCC GCC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC 3'

169

ConectorHuJH6FOR 5' ACC TCC AGA TCC GCC ACC ACC GGA TCC GCC TCC GCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC 3'

Cebadores de retroconector de Vκ humano

170

ConectorHuVκ 1aBACK 5' GGA TCC GGT GGT GGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC 3'

171

ConectorHuVκ 2aBACK 5' GGA TCC GGT GGT GGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC 3'

172

ConectorHuVκ, 3aBACK 5' GGA TCC GGT GGT GGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CC 3'

173

ConectorHuVκ 4aBACK 5' GGA TCC GGT GGT GGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC 3'

174

ConectorHuVκ 5aBACK 5' GGA TCC GGT GGT GGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC 3'

SEQ ID NO:

Síntesis de la primera hebra de ADNc

175

ConectorHuVκ 6aBACK 5' GGA TCC GGT GGT GGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC 3'

Cebadores not directos de Jκ humano

176

HuJκ1BACKNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC 3'

177

HuJκ2BACKNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC 3'

178

HuJκ3BACKNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC 3'

179

HuJκ4BACKNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC 3'

180

HuJκ5BACKNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC 3'

Tercera etapa de PCR

181

Conector de R' 5' GCT TCC GCC ACC TCC AGA TCC GCC ACC ACC GGA TCC GCC TCC GCC 3'

182

Conector de F' 5' GGC GGA GGC GGA TCC GGT GGT GGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC 3'

Preparación del fragmento de ScFv

183

VHIgGFOR 5' GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC 3'

184

VLREV 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC 3'

La inmunotoxina biotinilada LMB-9 (B3-Fv-PE38) se usó como el antígeno para la selección de Fvs que expresan fagos que se unían a PE38. Cada molécula de LMB-9 contenía 6 biotinas. Se obtuvieron 6 bibliotecas de anticuerpo humano mediante electroporaciones en TGI de Escherichia coli (E. coli.) que contenía 7,3 x 107 -1,27 x 108 clones

5 de scFv de VH-VL (Tabla 15). La biblioteca de fago se rescató mediante superinfección con fago auxilia (Tabla 15), y 350 ml de cada biblioteca obtenía aproximadamente 7 x 1012 fragmentos de scFv presentados en la superficie del fago.

Se obtuvieron y se secuenciaron 710 clones de fago que contenían Fv. La secuenciación reveló que había 103

10 secuencias de cadena pesada humana y de cadena ligera kappa únicas presentes excepto para 2 clones que tenían la misma secuencia de la cadena ligera. Para mostrar que los Fvs se obtenían a partir de linfocitos B formando anticuerpos anti-inmunotoxina, se realizaron estudios de competición y mostraban que los antisueros inmunes bloqueaban la unión del fago a la porción PE38 de LMB-9, y ninguno de los clones se unían a la porción Fv de la inmunotoxina. La fuerza de la unión se midió a continuación usando un ICC-ELISA. 47 clones presentaban una

15 unión débil y no se estudiaron adicionalmente. Los otros 56 clones se usaron para determinar los epítopos específicos de ser humano en PE38.

Ejemplo 15

20 Este ejemplo demuestra la ubicación de los epítopos de los linfocitos B humanos.

LMB-9 contiene ambos dominios II y III de PE. Para identificar el fago que solo se une al dominio III, se midió la unión de cada clon a HA22-LR, que solamente tenía el dominio III y carece del dominio II. Quince de los 56 fagos no

se pudieron unir a HA22-LR, lo que indica que los epítopos es reconocidos por estos 15 clones de fago estaban situados en el dominio II. Los 41 clones de fagos restantes se usaron para identificar los restos que forman los epítopos de linfocitos B en el dominio III midiendo su unión a proteínas sustituidas en las que los aminoácidos individuales en la superficie del dominio III de la proteína se cambiaron a partir de un aminoácido voluminoso grande

5 por alanina o glicina. Estas sustituciones eliminaron las cadenas laterales voluminosas grandes que están implicadas en el reconocimiento y unión de anticuerpos. Los datos se muestran en la Figura 10 en la que los clones con poca unión (< 10 %) se muestran en celdas de color negro, y las proteínas sustituidas con una reactividad normal se muestran con células en blanco. Los resultados muestran que una sola sustitución disminuía la unión de muchos clones, indicando de ese modo que están en el mismo grupo de epítopos.

10 La posición de los restos que, cuando se sustituyen, reducía la unión al fago en > 90 % para diversos epítopos se muestra en la Tabla 16. Los aminoácidos asociados con cada epítopo de ser humano (H1, H2, H3, H4, H5 y H6) y de ratón (2c, 4a, 4b, 5, 6a, 6b, y 7) se muestran en la Tabla 16. El epítopo H1 humano contenía D403, R427, y E431. R427 y E431 pertenecían al epítopo 4a de ratón, y estos restos estaban implicados en la unión al anticuerpo tanto de

15 ratón como de ser humano. El epítopo H2 de ser humano contenía los restos R467 y D463, que pertenecían al epítopo 2c de ratón, y E548 que pertenecían al epítopo 6a de ratón. Y481, L516, E522, y R551 eran epítopos específicos de ser humano. El epítopo H3 humano contenía solo a R458 que pertenecía al epítopo 4b de ratón. El epítopo H4 humano contenía R432 y R505. R432 pertenecía al epítopo 4a de ratón y R505 era un resto específico de ser humano. El epítopo H5 humano estaba formado por R490 y R576, que pertenecían al epítopo 5 de ratón. El

20 epítopo H6 humano incluía a R538. R538 pertenece al epítopo 2c de ratón. D406, R412, R513, L597, Q592, y K590 eran epítopo sé específicos de ratón y no estaban implicados en la unión de epítopos de ser humano.

TABLA 16

Epítopos de ser humano

imagen23

H1

D403, R427, E431

H2

R551, E548, L516, E522, D463, D461, Y481, R467

H3

R458

H4

R505, R432

H5

R490, R576

H6

R538

Epítopos de ratón

imagen24

2c

D463, R467, R538

4a

R427, E431, R432

Epítopos de ratón

4b

R406, R458

5

R412, R490, R576

6a

L597, R513, E548

6b

Q592

7

K590

25 Los clones de fago que reaccionan con el epítopo H1 estaban influidos por sustituciones en los restos D403, R427, y E431. Una sustitución de cualquiera de estos restos con alanina influía en gran medida en la unión de muchos fagos que reconocían el epítopo (Figura 10). Tal como se espera para las sustituciones que forman un epítopo, estos restos eran espacialmente adyacentes en el dominio III. El epítopo H2 era complejo. Los fagos que reaccionan con el epítopo H2 estaban influidos por sustituciones en 8 restos. La sustitución de R467 con alanina destruía la unión de

30 seis de los ocho fagos que definían el epítopo H2. La sustitución del resto D463 evitaba la unión de cuatro fagos, la sustitución de Y481 evitaba la unión de tres fagos, la sustitución de R551 evitaba la unión de dos fagos, y la sustitución de los restos D461, L516, E522, o E548 evitaba la unión de un fago. Estructuralmente con estos restos residían en un área limitada y formaban un grupo. El epítopo H3 era reconocido por 2 fagos que se unen a R458. El

imagen25

imagen26

TABLA 20

Unión (%)

Paciente

ITs Dilución HA22 LR LO10 LO10R

1

BL22 1192 100 1,2072 0,0118 0,0241

2

BL22 2057 100 372,4138 493,1507 3000,0000

3

BL22 1231 100 528,0992 358,9888 1228,8462

4

BL22 9485 100 202,3988 431,3099 2947,5983

5

BL22 4187 100 5,9797 0,0021 0,0031

6

BL22 1430 100 2,2597 0,0016 0,0033

7

BL22 6673 100 50,1718 0,0057 < 0,00147

8

SS1P 1698 100 < 0,00187 < 0,00187 < 0,00187

9

SS1P 26789 100 < 0,0289 < 0,0289' < 0,0289

10

SS1P 3876 100 < 0,00686 < 0,00686 < 0,00686

11

HA22 962 100 < 0,00194 < 0,00194 < 0,00194

12

HA22 10127 100 0,0219 < 0,00120 < 0,00120

13

HA22 1093 100 0,4298 0,0056 < 0,00555

14

LMB9 38802 100 191,2500 0,0031 382,5000

15

SS1P 121598 100 0,0034 < 0,00274 0,0060

16

SS1P 379861 100 0,4770 < 0,00247 0,0047

17

SS1P 269987 100 0,0433 0,0019 0,0026

18

SS1P 63115 100 0,0040 < 0,00272 < 0,00272

19

SS1P 12938 100 < 0,0623 < 0,0623 < 0,0623

20

SS1P 132398 100 < 0,00583 < 0,00583 0,0093

21

SS1P 10634 100 < 0,00293 < 0,00293 < 0,00293

22

SS1P 17989 100 < 0,00893 < 0,00893 < 0,00893

23

SS1P 20184 100 < 0,0359 < 0,0359 < 0,0359

24

SS1P 29387 100 < 0,00185 < 0,00185 0,0019

25

SS1P 77031 100 < 0,00755 < 0,00755 < 0,00755

26

SS1P 131839 100 < 0,0133 < 0,0133 < 0,0133

27

SS1P 23165 100 30,4545 12,6415 26,5347

28

SS1P 1792 100 17,8081 113,0324 40,1708

29

SS1P 12443 100 < 0,00721 < 0,00721 < 0,00721

30

SS1P 12873 100 < 63,3 < 63,3 < 63,3

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3