CN103748107B - 具有免疫原性较小的t细胞和/或b细胞表位的假单胞菌外毒素a - Google Patents

具有免疫原性较小的t细胞和/或b细胞表位的假单胞菌外毒素a Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种假单胞菌外毒素A(PE)，其包含具有一个或多个B细胞和/或T细胞表位的取代的氨基酸序列。本发明进一步提供了相关嵌合分子，及相关核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、和药物组合物。本发明进一步提供了治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，抑制靶细胞生长的方法，产生PE的方法，以及产生嵌合分子的方法。

Description

具有免疫原性较小的T细胞和/或B细胞表位的假单胞菌外毒 素A
对相关申请的交叉引用
本专利申请要求2011年6月9日提交的美国临时专利申请No.61／495,085，和2011年9月16日提交的美国临时专利申请No.61／535,668的权益，每篇均通过全文提述并入本文。
通过提述并入电子提交的材料
本文中通过全文提述并入附此同时提交且如下标识的计算机可读核苷酸／氨基酸序列表：一份名称为“710339_ST25.TXT”的53,884字节ASCII(文本) 文件，日期为2012年6月2日。
发明背景
假单胞菌外毒素A(PE)是一种具有可以有效破坏不合意的细胞，例如癌细胞，或抑制其生长的细胞毒性活性的细菌毒素。因而，PE对于治疗或预防疾病，诸如例如癌症可以是有用的。然而，PE可以是高度免疫原性的。因而， PE施用可以刺激抗PE免疫应答，包括例如抗PE抗体和／或T细胞的产生，其不合意地中和PE的细胞毒性活性。此类免疫原性可以减少能对患者给予的 PE量，这继而可降低PE用于治疗疾病，例如癌症的有效性。如此，需要改善的PE。
发明概述
本发明的一个实施方案提供了一种假单胞菌外毒素A(PE)，其包含具有氨基酸残基L294，L297，Y298，L299，和R302中一个或多个的取代，任选地具有SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的取代和／或SEQ ID NO：1的氨基酸残基R421，L422，L423，A425，R427，L429， Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552， T554，I555，L556，和W558内一个或多个T细胞表位内的一个或多个氨基酸残基的取代的氨基酸序列，只要在所述氨基酸序列包含用丙氨酸对氨基酸残基R302的取代时，氨基酸残基L294，L297，Y298，和L299中至少一个被取代，其中所述氨基酸残基L294，L297，Y298，L299，和R302通过参照SEQ ID NO：1限定。
本发明的另一个实施方案提供了包含氨基酸序列的PE，所述氨基酸序列包含式I：
FCS-R1 m-R2 p-R3 n-PE功能域III
(式1)
其中：
m，n，和p独立是0或1；
FCS包含弗林蛋白酶切割序列的氨基酸残基，该序列可被弗林蛋白酶切割；
R1包含SEQ ID NO：1的残基285-293的1个或多个连续氨基酸残基；
R2包含X1VAX2X3X4AAX5LSW(SEQ ID NO：2)，其中X1，X2，和X4独立是亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；X3是酪氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；且X5是精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；只要所述PE不包含LVALYLAARLSW(SEQ ID NO：3)，且在X5是丙氨酸时，X1，X2，X3，和X4中至少一个是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；
R3包含SEQ ID NO：1的残基306-394的1个或多个连续氨基酸残基；且
PE功能域III包含SEQ ID NO：1的残基395-613，
任选地具有SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的取代和／或SEQ ID NO：1的氨基酸残基R421，L422，L423，A425，R427， L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551， L552，T554，I555，L556，和W558内一个或多个T细胞表位内一个或多个氨基酸残基的取代。
本发明的仍另一个实施方案提供了一种包含氨基酸序列的PE，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1的位置R421，L422，L423，A425，R427，L429， Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552， T554，I555，L556，和W558处一个或多个氨基酸残基的取代；只要
在位置Q485或L516处的氨基酸残基用丙氨酸取代时，SEQ ID NO：1的位置R421，I422，I423，A425，R427，I429，Y439，H440，F443，I444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和W558 处的至少一个其它的氨基酸残基被取代，且
在位置R427，R467，R490，R505，R513，或R551处的氨基酸残基用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺取代时，或者在位置R490处的氨基酸残基用缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸取代时，SEQ ID NO：1的位置R421，L422， L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450， 463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和W558处的至少一个其它的氨基酸残基被取代，其不包括用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺对位置 R427，R467，R490，R505，R513，或R551处氨基酸残基的取代，或者用缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸对位置R490处氨基酸残基的取代，
其中所述氨基酸残基R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439， H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555， L556，和W558通过参照SEQ ID NO：1限定。
本发明的仍另一个实施方案提供了一种假单胞菌外毒素A(PE)，其包含具有如通过参照SEQ ID NO：1限定的氨基酸残基D463，Y481，和L516中一个或多个的取代的PE氨基酸序列，只要在第516位氨基酸残基用丙氨酸取代时，氨基酸残基D463和Y481中至少一个也被取代，其中任选地，所述PE具有一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的进一步的取代，和／或一个或多个T 细胞表位内一个或多个氨基酸残基的进一步的取代，和／或如由SEQ ID NO：1 限定的残基1-273和285-394的一个或多个连续氨基酸残基的缺失。
本发明的其它的实施方案提供了相关嵌合分子，及相关核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、和药物组合物。
本发明的仍另一个实施方案提供了一种治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，该方法包括以有效治疗或预防所述哺乳动物中的癌症的量对所述哺乳动物施用本发明的PE、嵌合分子、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、或药物组合物。
本发明的另一个实施方案提供了一种抑制靶细胞生长的方法，该方法包括以有效抑制所述靶细胞生长的量使所述细胞与本发明的PE、嵌合分子、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、或药物组合物接触。
本发明的其它的实施方案提供了产生本发明的PE的方法及产生本发明的嵌合分子的方法。
附图简述
图1的图显示了世界人口(无阴影的柱形)和供体分组(有阴影的柱形)中多个主要组织相容性复合体II类DR beta1(DRB1)等位基因(x轴)的等位基因频率(y轴)。
图2A的图显示了如通过白介素(IL)-2ELISpot测量的每1x106个细胞的斑点形成细胞(SFC)数目(y轴)，指示了在体外扩充并与培养基(M)(无肽)、肽合并物(pool)3、肽合并物16、或肽合并物22(x轴)一起温育后未免疫供体 (
Figure BDA0000464690400000041
donor)031810aph T细胞的应答。
图2B的图显示了如通过IL-2ELISpot测量的每1x106个细胞的SFC数目 (y轴)，指示了不体外扩充的情况中与无肽、肽合并物3、肽合并物16或肽合并物22(x轴)一起温育后未免疫供体031810aphT细胞的应答。
图3的图显示了来自供体1-50中每名的T细胞的每1x106个细胞的总SFC 数目(y轴)对体外扩充14天后的无肽或肽合并物1-22中的每种(x轴)。点线标示背景的三倍。
图4鉴定对多个供体以各种强度刺激T细胞应答的来自肽合并物3的特定肽和肽内的区域(有阴影区域)。
图5的图显示了对CA46细胞，相对于野生型HA22(一种与PE38缀合的二硫键连接的Fv抗CD22抗体片段)(环形)、L297A HA22(正方形)、或R302A HA22(菱形)的浓度(ng／ml)(x轴)的细胞毒性活性(％对照)(y轴)。
图6A的图显示了在用野生型HA22(有阴影柱形)或R302A HA22(无阴影柱形)培养14天后用无肽、野生型肽(WT15)、或R302A(x轴)再刺激后供体 010710的T细胞应答(每1x106个细胞的SFC)(y轴)。
图6B的图显示了在用野生型HA22(有阴影柱形)或R302A HA22(无阴影柱形)培养14天后用无肽、野生型肽(WT15)、或R302A(x轴)再刺激后供体 111909的T细胞应答(每1x106个细胞的SFC)(y轴)。
图7A的图显示了用HA22(含有PE38)(有阴影柱形)或LR RIT(LR)(含有 SEQ IDNO：1的氨基酸残基274-284和395-613)(无阴影柱形)刺激并用肽合并物1-22之一(x轴)再刺激后供体031510的T细胞应答(每1x106个细胞的SFC) (y轴)。对照包括头孢他啶(CEFT)培养的细胞、在第0天无抗原刺激和第14天无抗原刺激的细胞(“M系”)、和在第0天用LMB9刺激并在第14天无抗原刺激的细胞(“无肽”)。
图7B的图显示了用HA22(含有PE38)(有阴影柱形)或LR RIT(LR)(含有 SEQ IDNO：1的氨基酸残基274-284和395-613)(无阴影柱形)刺激并用无肽或肽合并物1-22之每种(x轴)再刺激后供体021610的T细胞应答(每1x106个细胞的SFC)(y轴)。对照包括头孢他啶(CEFT)培养的细胞、在第0天无抗原刺激和第14天无抗原刺激的细胞(“M系”)、和在第0天用LMB9刺激并在第14天无抗原刺激的细胞(“无肽”)。
图7C的图显示了用HA22(含有PE38)(有阴影柱形)或LR RIT(LR)(含有 SEQ IDNO：1的氨基酸残基274-284和395-613)(无阴影柱形)刺激并用无肽或肽合并物1-22之每种(x轴)再刺激后供体101509的T细胞应答(每1x106个细胞的SFC)(y轴)。对照包括头孢他啶(CEFT)培养的细胞、在第0天无抗原刺激和第14天无抗原刺激的细胞(“M系”)、和在第0天用LMB9刺激并在第14天无抗原刺激的细胞(“无肽”)。
图8鉴定刺激T细胞应答的肽SEQ ID NO：102-111的特异性肽(有阴影区域)，如通过各名患者的IL-2产生测量的。
图9的图显示了SEQ ID NO：31-141之每种的50名供体之每名供体占总体应答的累积百分比。
图10的图显示了抗PE38(域III)噬菌体针对点取代的HA22的反应性。黑色单元代表小于10％反应性，空白单元代表超过10％反应性，而灰色单元标示未测试。取代以其从N端(左侧)至C端(右侧)的位置排序。
图11A和11B的线图显示了竞争实验的结果，该实验测试将与HA22起反应的抗体水平在经历用HA22的临床试验的第一(图11A)和第二(图11B)患者的血清中降低50％(点线)的取代的免疫毒素HA22(“HA，”实心环形)、 HA22-LR(“LR，”空心环形)、HA22-LO5(“LO5，”实心三角形)、HA22-LO6 (“LO6，”空心三角形)、HA22-LR-8M(“LR8M，”实心正方形)、和HA22-LO10 (“LO10，”空心正方形)之每种的浓度。
图12的图显示了在使用PE38治疗的患者血清中抗体对HA22， HA22-LR-8M，HA22-LO10(HA22-LRLO1O)或HA22-LRLO10R的百分比结合。
发明详述
假单胞菌外毒素A(“PE”)是一种由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的细菌毒素(分子量66kD)。天然的、野生型PE序列(SEQ ID NO：1)在美国专利5,602,095中列出，其通过提述并入本文。天然的、野生型PE包括促成细胞毒性的三个结构域。域Ia(氨基酸1-252)介导细胞结合，域II (氨基酸253-364)介导至胞质溶胶的移位，而域III(氨基酸400-613)介导延长因子2的ADP核糖基化。虽然认为PE域III的结构边界开始于残基400，但是认为，域III可需要域Ib的某个区段来保留ADP-核糖基化活性。因而，功能域III定义为PE的残基395-613。域Ib(氨基酸365-399)的功能仍然未确定。不限于特定的理论或机制，认为PE的细胞毒性活性经由抑制真核细胞中的蛋白质合成，例如通过使延长因子2(EF-2)的ADP-糖基化失活而发生。
PE的取代在本文中通过参照PE的氨基酸序列限定。如此，PE的取代在本文中通过参照存在于特定位置的氨基酸残基，继以在所讨论的特定取代中已经替换所述残基的氨基酸来描述。在这点上，PE的具体实施方案的氨基酸序列的位置在本文中称为所述具体实施方案的氨基酸序列的位置或者如由 SEQ ID NO：1限定的位置。在位置如由SEQ ID NO：1限定时，则PE的具体实施方案的氨基酸序列的实际位置相对于SEQ ID NO：1的相应位置限定，并且可以代表与SEQ ID NO：1的残基位置号不同的残基位置号。如此，例如理解相应氨基酸序列中的实际位置可以不同而使取代指PE的具体实施方案的氨基酸序列中与SEQ ID NO：1的613个氨基酸的序列的指定位置对应的氨基酸残基被替换。例如，在位置如SEQ ID NO：1限定时，术语“R490”指通常存在于SEQ ID NO：1的第490位的精氨酸，“R490A”指示用丙氨酸替换通常存在于SEQ ID NO：1的第490位的精氨酸，而“K590Q”指示已经用谷氨酰胺替换通常存在于SEQ ID NO：1的第590位的赖氨酸。倘若为两个或更多个位置处的多处取代，所述两处或更多处取代可以是相同或不同的，即被取代的两个或更多个氨基酸残基的每个氨基酸残基可以用相同或不同氨基酸残基取代，除非另有明确指示。
如本文中使用的，术语“假单胞菌外毒素”和“PE”包括已经自天然蛋白质经过修饰以降低或消除免疫原性的PE。此类修饰可以包括但不限于域Ia 的消除，域Ib、II、和III中的多处氨基酸缺失，单处氨基酸取代，和在羧基端添加一个或多个序列，诸如DEL和REDL(SEQ ID NO：7)。参见Siegall等，J. Biol.Chem.，264：14256-14261(1989)。此类经修饰的PE可以进一步修饰为包含本文中描述的一个或多个T细胞和／或B细胞表位内的一个或多个氨基酸残基的任何本发明的取代。在一个实施方案中，经修饰的PE可以是天然的、野生型PE的细胞毒性片段。PE的细胞毒性片段可以包括随后在靶细胞中进行或不进行蛋白水解或其它加工的情况下有细胞毒性的那些细胞毒性片段(例如为蛋白质或前蛋白)。在一个优选的实施方案中，PE的细胞毒性片段保留天然PE细胞毒性的至少约20％，优选至少约40％，更优选约50％，甚至更优选75％，更优选至少约90％，且仍更优选95％。在特别优选的实施方案中，细胞毒性片段至少具有天然PE的细胞毒性，且优选地，与天然PE相比具有升高的细胞毒性。
降低或消除免疫原性的经修饰的PE包括例如PE4E，PE40，PE38，PE25， PE38QQR，PE38KDEL，和PE35。在一个实施方案中，PE可以是PE4E，PE40， PE38，PE25，PE38QQR(其中PE38具有C端添加的序列QQR)，PE38KDEL(其中PE38具有C端添加的序列KDEL(SEQ ID NO：5))，PE-LR(对溶酶体降解具抗性)，和PE35中任一种。
在一个实施方案中，已经通过缺失域Ia将PE修饰为降低免疫原性，如记载于美国专利4，892,827的，其通过提述并入本文。PE也可以通过取代域Ia的某些残基来修饰。在一个实施方案中，PE可以是PE4E，其是一种取代了的PE，其中存在域Ia，但是其中用酸性残基(例如谷氨酸)替换位置57,246,247，和 249处域Ia的碱性残基，如美国专利5,512,658中披露的，其通过提述并入本文。
PE40是PE的一种截短衍生物(Pai等，Proc.Nat‘lAcad. Sci.USA，88： 3358-62(1991)及Kondo等，Biol.Chem.，263：9470-9475(1988))。PE35是PE的一种35kD羧基端片段，其中氨基酸残基1-279已经缺失，并且分子以第280 位的Met开始，接着是天然PE的氨基酸281-364和381-613。例如，PE35和PE40 披露于美国专利5,602,095和4,892,827，每篇均通过提述并入本文。PE25含有来自域II的11个残基的片段和整个域III。在一些实施方案中，PE仅含有域III。
在一个优选的实施方案中，PE是PE38。PE38含有PE的移位和ADP核糖基化域，但没有细胞结合部分(Hwang J.等，Cell，48：129-136(1987))。PE38是一种由氨基酸253-364和381-613(SEQ ID NO：144)构成的截短的PE蛋白原，其在细胞内加工后活化成其细胞毒性形式(参见例如美国专利5,608,039，其通过提述并入本文，及Pastan等，Biochim.Biophys.Acta，1333：C1-C6(1997))。
在另一个优选的实施方案中，PE是PE-LR。PE-LR含有除了与SEQ ID NO： 1的氨基酸残基274-284(RHRQPRGWEQL(SEQ ID NO：8))对应的弗林蛋白酶切割序列(FCS)外域II的缺失和域Ib的氨基酸残基365-394的缺失。如此，PE-LR 含有SEQ ID NO：1的氨基酸残基274-284和395-613。PE-LR记载于国际专利申请公开文本WO2009／032954，其通过提述并入本文。任选地，PE-LR可以还包含介于FCS和SEQ ID NO：1的氨基酸残基395-613之间的GGS接头肽。
如上文记录的，或者／另外，可以将部分或整个域Ib缺失，剩余部分通过桥联或者直接通过肽键连接。或者／另外，可以将域II的一些氨基部分缺失。或者／另外，C端末端可以含有残基609-613的天然序列(REDLK)(SEQ ID NO： 6)，或者可以含有可维持PE移位到胞质溶胶中的能力的变异，诸如KDEL (SEQ ID NO：5)或REDL(SEQ ID NO：7)，及这些序列的重复。参见例如美国专利5,854,044；5,821,238；和5,602,095及国际专利申请公开文本WO1999／051643，其通过提述并入本文。已经消除或降低免疫原性的任何PE形式可以与本文中描述的一个或多个T细胞和／或B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的任何本发明的取代组合使用，只要它保留针对靶向细胞的细胞毒性的能力，例如，这通过移位和靶向细胞中的EF-2糖基化实现。
本发明的一个实施方案提供了一种假单胞菌外毒素A(PE)，包括如本文中描述的自天然蛋白质修饰的任何PE，其包含具有氨基酸残基L294，L297， Y298，L299，和R302中一个或多个的取代，任选地具有SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的取代和／或SEQ ID NO：1的氨基酸残基R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443， L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和 W558内一个或多个T细胞表位内的一个或多个氨基酸残基的取代的氨基酸序列，只要在所述氨基酸序列包含用丙氨酸对氨基酸残基R302的取代时，至少一个其它的氨基酸残基被取代，其中所述氨基酸残基L294，L297，Y298， L299，和R302通过参照SEQ ID NO：1限定。优选地，一个或多个T细胞表位内一个或多个氨基酸残基的取代是位置R421，L422，L423，A425，R427， L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，Y470，I471，A472， P475，A476，L477，I493，R494，N495，L498，L499，R500，V501，Y502， V503，R505，L508，P509，R551，L552，T554，I555，L556，和W558处一个或多个氨基酸残基的取代。
本发明的另一个实施方案提供了一种假单胞菌外毒素A(PE)，包括如本文中描述的自天然蛋白质修饰的任何PE，其包含具有氨基酸残基L294，L297，Y298，L299，和R302中一个或多个的取代，任选地具有SEQ ID NO：1 的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的取代和／或SEQ ID NO： 1的氨基酸残基R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443， L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和 W558内一个或多个T细胞表位内的一个或多个氨基酸残基的取代的氨基酸序列，只要在所述氨基酸序列包含用丙氨酸对氨基酸残基R302的取代时，氨基酸残基L294，L297，Y298，和L299中至少一个被取代，其中所述氨基酸残基L294，L297，Y298，L299，和R302通过参照SEQ ID NO：1限定。已经发现了氨基酸残基L294，L297，Y298，L299，和R302位于PE的一个或多个 T细胞表位内。如此，有利地，氨基酸残基L294，L297，Y298，L299，和 R302中一个或多个的取代可以去除一个或多个T细胞表位。因而，有利地，本发明的PE可以比未取代的(例如野生型)PE具有更小的免疫原性。
氨基酸残基L294，L297，Y298，L299，和R302中一个或多个的取代可以是用任何氨基酸残基对氨基酸残基L294，L297，Y298，L299，和R302中一个或多个的取代。在本发明的一个实施方案中，氨基酸残基L294，L297， Y298，L299，和R302中一个或多个的取代是用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺替换氨基酸残基L294，L297，Y298，L299，和R302中一个或多个的取代。
在本发明的一个实施方案中，PE包含X1VAX2X3X4AAX5LSW(SEQ ID NO：2)，其中X1，X2，和X4独立是亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；X3是酪氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；且X5是精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；只要所述PE不包含 LVALYLAARLSW(SEQ ID NO：3)，且在X5是丙氨酸时，X1，X2，X3，和X4中至少一个是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺。
本发明的另一个实施方案提供了一种包含PE氨基酸序列的假单胞菌外毒素A(PE)，所述PE氨基酸序列具有如通过参照SEQ ID NO：1限定的氨基酸残基D463，Y481，和L516中一个或多个的取代，只要在第516位氨基酸残基用丙氨酸取代时，氨基酸残基D463和Y481中至少一个被取代，其中任选地，所述PE具有一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的进一步的取代和／或一个或多个T细胞表位内一个或多个氨基酸残基的进一步的取代，和／或如由SEQ ID NO：1限定的残基1-273和285-394的一个或多个连续氨基酸残基的缺失。优选地，氨基酸残基D463，Y481，和L516中一个或多个的取代是独立用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺替换氨基酸残基D463， Y481，和L516中一个或多个的取代。已经发现了氨基酸残基D463，Y481，和L516位于PE的一个或多个B细胞表位内。如此，有利地，氨基酸残基D463， Y481，和L516中一个或多个的取代可去除一个或多个T细胞和／或B细胞表位。因而，有利地，本发明的PE可比未取代的(例如野生型)PE具有更小的免疫原性。
在本发明的一个实施方案中，一个或多个B细胞表位内进一步的氨基酸取代是如通过参照SEQ ID NO：1限定的氨基酸残基E282，E285，P290，R313， N314，P319，D324，E327，E331，Q332，D403，D406，R412，R427，E431， R432，R458，D461，R467，R490，R505，R513，E522，R538，E548，R551， R576，Q592，和L597中一个或多个的取代。优选地，一个或多个B细胞表位内进一步的氨基酸取代是独立用丙氨酸、甘氨酸、或丝氨酸替换一个或多个氨基酸残基R427，R458，R467，R490，R505，和R538的取代。在一个特别优选的实施方案中，氨基酸残基D463，Y481，和L516中一个或多个的取代是用丙氨酸替换氨基酸残基D463的取代，并且一个或多个B细胞表位内进一步的氨基酸取代是：如通过参照SEQ ID NO：1限定的(a)丙氨酸对氨基酸残基 R427的取代；(b)丙氨酸对氨基酸残基R458的取代；(c)丙氨酸对氨基酸残基R467的取代；(d)丙氨酸对氨基酸残基R490的取代；(e)丙氨酸对氨基酸残基 R505的取代；和(f)丙氨酸对氨基酸残基R538的取代。
除了本文中描述的一个或多个PET细胞和／或B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的取代外，任选地，本发明的PE还可以包含SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的其它的取代。在这点上，在本发明的一个实施方案中，PE具有SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸的取代。在本发明的一个优选的实施方案中，SEQ ID NO：1 的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸的取代包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺对SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸的取代。有利地，一个或多个B细胞表位内的取代可通过去除一个或多个B细胞表位进一步降低免疫原性。取代可以位于任何合适的PEB细胞表位内。例如，例示性的B细胞表位披露于国际专利申请公开文本WO 2007／016150，WO2009／032954，和WO201I／032022，每篇均通过提述并入本文。在一个优选的实施方案中，SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸的取代是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺独立替换氨基酸残基E282，E285，P290，R313，N314，P319，D324，E327，E331， Q332，D403，D406，R412，R427，E431，R432，R458，D461，D463，R467， Y481，R490，R505，R513，L516，E522，R538，E548，R551，R576，K590， Q592，和L597中一个或多个的取代，其中所述氨基酸残基E282，E285，P290， R313，N314，P319，D324，E327，E331，Q332，D403，D406，R412，R427， E431，R432，R458，D461，D463，R467，Y481，R490，R505，R513，L516， E522，R538，E548，R551，R576，K590，Q592，and L597通过参照SEQ ID NO：1限定。在一个特别优选的实施方案中，SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内的氨基酸取代是丙氨酸、甘氨酸、或丝氨酸替换一个或多个氨基酸残基D406，R432，R467，R490，R513，E548，K590，和Q592的取代。在一个特别优选的实施方案中，SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内的氨基酸取代是：(a)丙氨酸对氨基酸残基D406的取代；(b)甘氨酸对氨基酸残基R432的取代；(c)丙氨酸对氨基酸残基R467的取代；(d)丙氨酸对氨基酸残基 R490的取代；(e)丙氨酸对氨基酸残基R513的取代；f)丝氨酸对氨基酸残基 E548的取代；(g)丝氨酸对氨基酸残基K590的取代；和(h)丙氨酸对氨基酸残基Q592的取代。
在本发明的一个实施方案中，PE包含具有单独或与本文中描述的任何其它取代组合的SEQ ID NO：1的位置R421，L422，L423，A425，R427，L429， Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552， T554，I555，L556，和W558处一个或多个氨基酸残基的取代的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NO：1的位置R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519， R551，L552，T554，I555，L556，和W558处一个或多个氨基酸残基的取代是位置R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444， A446，A447，I450，Y470，I471，A472，P475，A476，L477，I493，R494，N495，L498，L499，R500，V501，Y502，V503，R505，L508，P509，R551， L552，T554，I555，L556，和W558处一个或多个氨基酸残基的取代。
SEQ ID NO：1的位置R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439， H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，I552，T554，T555，L556，和W558处一个或多个氨基酸残基的取代可以是用任何氨基酸残基替换SEQ ID NO：1的位置R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440， F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和W558中任一个或多个处的氨基酸残基的取代。SEQ ID NO：1的位置R421， L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447， I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和W558处一个或多个氨基酸残基的取代可以包括例如用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺替换 SEQ ID NO：1的位置421，422，423，425，427，429，439，440，443，444， 446，447，450，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472， 473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485， 486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500，501，502，503，504，505，506，507，508，509，510，511， 512，513，514，515，516，517，518，519，551，552，554，555，556，和558处一个或多个氨基酸残基的取代。在一个优选的实施方案中，SEQ ID NO：1的位置R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443， L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和 W558处一个或多个氨基酸残基的取代是用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺替换氨基酸残基R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439， H440，F443，L444，A446，A447，I450，Y470，I471，A472，P475，A476， L477，I493，R494，N495，L498，L499，R500，V501，Y502，V503，R505， L508，P509，R551，L552，T554，I555，L556，和W558中一个或多个的取代。一个或多个T细胞表位中位于如通过参照SEQ IDNO：1限定的PE位置 R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和W558的一处或多处取代可以进一步降低PE的免疫原性。在一个实施方案中，氨基酸序列没有位置427，467，485，490，505，513，516，和551处一个或多个氨基酸残基的取代。
在本发明的另一个实施方案中，PE包含具有SEQ ID NO：1的位置R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447， I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和W558处一个或多个氨基酸残基的取代的氨基酸序列；只要在位置Q485或L516处的氨基酸残基用丙氨酸取代时，至少一个其它的氨基酸残基被取代，且在位置R427，R467， R490，R505，R513，或R551处的氨基酸残基用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺取代时或者在位置R490处的氨基酸残基用缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸取代时，至少一个其它的氨基酸残基被取代，其不包括用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺对位置282，285，290，313，314，319，324， 327，331，332，403，406，412，427，431，432，458，461，467，490，505，513，522，538，548，551，576，590，592，或597处氨基酸残基的取代或者用缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸对第490位氨基酸残基的取代，其中通过参照SEQ ID NO：1限定氨基酸残基282，285，290，302，313，314，319， 324，327，331，332，403，406，412，427，431，432，458，461，463-519， 522，538，548，551，576，590，592，和597。
在本发明的又一个实施方案中，PE包含具有SEQ ID NO：1的位置R421， L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447， I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和W558处一个或多个氨基酸残基的取代的氨基酸序列；只要在位置Q485或L516处的氨基酸残基用丙氨酸取代时，SEQ ID NO：1的位置R421，L422，L423，A425，R427，L429， Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554， I555，L556，和W558处至少一个其它的氨基酸残基被取代，且在位置R427， R467，R490，R505，R513，或R551处的氨基酸残基用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺取代时或者在位置R490处的氨基酸残基用缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸取代时，SEQ ID NO：1位置R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552， T554，I555，L556，和W558处的至少一个其它的氨基酸残基被取代，其不包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺对位置R427，R467，R490，R505， R513，R551处氨基酸残基的取代或者缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸对位置R490 处的氨基酸残基的取代，其中氨基酸残基R421，L422，L423，A425，R427， L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552， T554，I555，L556，和W558通过参照SEQ ID NO：1限定。
优选地，PE包含一处或多处提高细胞毒性的取代，如披露于例如国际专利申请公开文本WO2007／016150的，其通过提述并入本文。在这点上，本发明的一个实施方案提供了具有SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内的氨基酸取代的PE，并且所述SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内的氨基酸取代是缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸替换氨基酸残基R490的取代，其中氨基酸残基R490通过参照SEQ ID NO：1限定。在本发明的一个实施方案中，用丙氨酸或谷氨酰胺取代通过参照SEQ ID NO：1限定的位置313，327，331，332， 431，432，505，516，538，和590处的一个或多个氨基酸残基可以提供具有升高的细胞毒性的PE，如披露于例如国际专利申请公开文本WO 2007／016150的，其通过提述并入本文。升高的细胞毒性活性和降低的免疫原性可以同时发生，并且不是相互排斥的。既提高细胞毒性活性又降低免疫原性的取代，诸如R490至甘氨酸或者更优选丙氨酸的取代是特别优选的。
在本发明的一个实施方案中，PE包含如下的氨基酸序列，该氨基酸序列包含式I：
FCS-R1 m-R2 p-R3 n-PE功能域III
(式I)
其中：
m，n，和p独立是0或1；
FCS包含弗林蛋白酶切割序列的氨基酸残基，该序列可被弗林蛋白酶切割；
R1包含SEQ ID NO：1的残基285-293的1个或多个连续氨基酸残基；
R2包含X1VAX2X3X4AAX5LSW(SEQ ID NO：2)，其中X1，X2，和X4独立是亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；X3是酪氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；且X5是精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；只要所述PE不包含LVALYLAARLSW(SEQ ID NO：3)，且在X5是丙氨酸时，X1，X2，X3，和X4中至少一个是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺；
R3包含SEQ ID NO：1的残基306-394的1个或多个连续氨基酸残基；且
PE功能域III包含SEQ ID NO：1的残基395-613，任选地具有SEQ ID NO： 1的一个或多个B细胞表位内一个或多个氨基酸残基的取代和／或SEQ ID NO： 1的氨基酸残基R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443， L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和 W558内一个或多个T细胞表位内一个或多个氨基酸残基的取代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的一个或多个氨基酸残基R421，L422，L423，A425， R427，I429，Y439，H440，F443，I444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556，和W558的取代是一个或多个氨基酸残基 R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444，A446， A447，I450，Y470，I471，A472，P475，A476，L477，I493，R494，N495， L498，L499，R500，V501，Y502，V503，R505，L508，P509，R551，L552， T554，I555，L556，和W558的取代。
在本发明的一个实施方案中，式I的m，n，和／或p是0。在本发明的一个实施方案中，在m，n，和p各自是0时，式I的PE可以进一步包含介于FCS和 PE功能域III之间的GGS接头肽。
不限于特定的理论或机制，认为含有弗林蛋白酶切割序列(FCS)的PE在靶细胞内部经历蛋白水解加工，由此活化毒素的细胞毒性活性。本发明的PE 的FCS可以包含任何合适的弗林蛋白酶切割序列的氨基酸残基，该序列可被弗林蛋白酶切割。例示性的弗林蛋白酶切割序列记载于Duckert等，Protein Engineering，Design&Selection，17(1)：107-112(2004)及国际专利申请公开文本WO2009／032954，每篇均通过提述并入本文。在本发明的一个实施方案中，FCS包含SEQ ID NO：1的残基274-284(即RHRQPRGWEQL(SEQ ID NO： 8))，其中SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内的氨基酸取代是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺对SEQ ID NO：1的氨基酸残基E282的取代。其它合适的FCS氨基酸序列包括但不限于：R-X1-X2-R，其中X1是任何天然存在的氨基酸，且X2是任何天然存在的氨基酸(SEQ ID NO：9)，RKKR(SEQ ID NO：10)，RRRR(SEQ ID NO：11)，RKAR(SEQ ID NO：12)，SRVARS(SEQ ID NO：13)，TSSRKRRFW(SEQ ID NO：14)，ASRRKARSW(SEQ ID NO：15)， RRVKKRFW(SEQ ID NO：16)，RNVVRRDW(SEQ ID NO：17)， TRAVRRRSW(SEQ ID NO：18)，RQPR(SEQ ID NO：19)，RHRQPRGW(SEQ ID NO：20)，RHRQPRGWE(SEQ ID NO：21)，HRQPRGWEQ(SEQ ID NO： 22)，RQPRGWE(SEQID NO：23)，RHRSKRGWEQL(SEQ ID NO：24)，RSKR (SEQ ID NO：25)，RHRSKRGW(SEQ ID NO：26)，HRSKRGWE(SEQ ID NO： 27)，RSKRGWEQL(SEQ ID NO：28)，HRSKRGWEQL(SEQ ID NO：29)，RHRSKR(SEQ ID NO：30)，和R-X1-X2-R，其中X1是任何天然存在的氨基酸，且X2是精氨酸或赖氨酸(SEQ ID NO：4)。
在本发明的一个实施方案中，式I的m是1，并且式I的R1包含SEQ ID NO： 1的残基285-293，其中SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内的氨基酸取代包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺对SEQ ID NO：1的氨基酸残基 E285和／或P290的取代。
在本发明的另一个实施方案中，式I的n是1，并且式I的R3包含SEQ ID NO： 1的残基306-394，其中SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内的氨基酸取代包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺对SEQ ID NO：1的氨基酸残基 R313，N314，P319，D324，E327，E331，和Q332中一个或多个的取代。
在本发明的仍另一个实施方案中，PE功能域III包含SEQ ID NO：1的残基 395-613，其中SEQ ID NO：1的一个或多个B细胞表位内的氨基酸取代包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、或谷氨酰胺对SEQ ID NO：1的氨基酸残基D403， D406，R412，R427，E431，R432，R458，D461，D463，R467，Y481，R490， R505，R513，L516，E522，R538，E548，R551，R576，K590，Q592，和 L597中一个或多个的取代。在本发明的一个优选的实施方案中，PE功能域III 包含SEQID NO：142。在本发明的一个特别优选的实施方案中，PE功能域III 包含SEQ ID NO：143。
若与对未取代的PE的免疫应答相比，对本发明的PE的免疫应答是定量或定性降低的，则本发明的PE可以比依照本发明的未取代的PE具有更小的免疫原性。免疫原性的定量降低涵盖免疫应答的量级或程度的降低。免疫原性的量级或程度可以基于任意数量的已知参数测量，所述参数诸如细胞因子(例如抗原特异性细胞因子)产生(细胞因子浓度)水平降低、活化(例如淋巴细胞(例如抗原特异性淋巴细胞)的增殖)或募集的淋巴细胞的数目减少、和／或抗体(抗原特异性抗体)的产生降低，等等。免疫原性的定性降低涵盖使免疫应答在介导PE的细胞毒性活性降低方面有效性较低的免疫应答性质的任何变化。测量免疫原性的方法是本领域中已知的。例如，测量产生的细胞因子的类型和水平可以测量免疫原性。或者／另外，测量PE与抗体(例如先前暴露于 PE的抗体)的结合和／或测量PE在对哺乳动物(例如人、小鼠和／或其中的小鼠免疫***已经用人免疫***替换的小鼠)施用时诱导抗体的能力可以测量免疫原性。免疫原性较小的PE可以表征为与用未取代的PE的获得相比细胞因子诸如IFN-γ、TNF-α、和粒酶B中任一种或多种的产生减少，和／或细胞介导的免疫应答的刺激降低，诸如对PE特异性的T细胞和／或巨噬细胞的增殖和活化降低。或者／另外，免疫原性较小的PE可以表征为与用未取代的PE的获得相比TGF-beta和／或IL-10产生增加。在一个优选的实施方案中，降低的免疫原性表征为T细胞刺激的降低、T细胞增殖的降低、和T细胞IFNγ和／或粒酶B 分泌降低中任一项或多项。或者／另外，免疫原性较小的PE可以表征为与用未取代的PE的获得相比对PE特异性的B细胞的刺激和／或活化降低。例如，免疫原性较小的PE可以表征为与用未取代的PE的获得相比B细胞分化成抗体分泌浆细胞和／或记忆细胞的降低。降低的免疫原性可以表征为B细胞刺激的降低、B细胞增殖的降低、和抗PE抗体分泌降低中任一项或多项。免疫原性的定性和定量降低可以同时发生，并且不是互相排斥的。
本领域普通技术人员会容易领会，本发明的PE可以以多种方式修饰，使得经由修饰提高本发明的PE的治疗性或预防性效力。例如，本发明的PE可以直接或间接经由接头与靶向模块缀合或融合。在这点上，本发明的一个实施方案提供了一种嵌合分子，其包含缀合或融合的(a)靶向模块和(b)本文中描述的任何本发明的PE。将化合物(例如本发明的PE)与靶向模块缀合的实践是本领域中已知的。参见例如Wadwa等，J. Drug Targeting，3：111(1995)，及美国专利5,087,616。
如本文中使用的，术语“靶向模块”指特异性识别并结合细胞表面标志物，使得靶向模块引导本发明的PE投递至在其表面上表达受体的细胞群体的任何分子或药剂。靶向模块包括但不限于抗体(例如单克隆抗体)、或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子、和任何其它天然的或非天然的配体。
如本文中使用的，术语“抗体”指完全(又称为“完整”)抗体或保留抗原识别和结合能力的其抗原结合部分。抗体或其抗原结合部分可以是天然存在的抗体或其抗原结合部分，例如从哺乳动物，例如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等分离和／或纯化的抗体或其抗原结合部分。抗体或其抗原结合部分可以为单体或多聚体形式。还有，抗体或其抗原结合部分对细胞表面标志物可以具有任何的亲和力或亲合力水平。期望地，抗体或其抗原结合部分对细胞表面标志物是特异性的，使得与其它肽或蛋白质具有最小的交叉反应性。
抗体可以是单克隆或多克隆的且任何同种型的，例如IgM，IgG(例如IgG， IgG2，IgG3或IgG4)，IgD，IgA或IgE。可以将针对靶细胞表面标志物的抗体或抗体的单链可变片段(Fv)的互补决定区(CDR)移植或工程化改造到选择的抗体中以对所述抗体赋予针对靶细胞表面标志物的特异性。例如，可以将针对靶细胞表面标志物的抗体的CDR移植到已知三维结构的人抗体框架上(参见例如国际专利申请公开文本WO1998／045322和WO1987／002671；美国专利5,859,205；5,585,089；和4,816,567；欧洲专利申请公开文本0173494；Jones等，Nature，321：522(1986)；Verhoeyen等，Science，239：1534(1988)，Riechmann等， Nature，332：323(1988)；及Winter&Milstein，Nature，349：293(1991))以形成在对人施用时可引起很小的免疫原性应答或不引起免疫原性应答的抗体。在一个优选的实施方案中，靶向模块是单克隆抗体。
抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点，诸如例如完整抗体的可变区或CDR的任何部分。抗体的抗原结合部分的例子包括但不限于重链、轻链、重链或轻链的可变或恒定区、单链可变片段(scFv)、或Fc，Fab，Fab’，Fv, 或F(ab)2’片段；单域抗体(参见例如Wesolowski，Med Microbiol Immunol.， 198(3)：157-74(2009)；Saerens等，Curr.Opin.Pharmacol.，8(5)：600-8(2008)； Harmsen和de Haard，Appl.Microbiol.Biotechnol.，77(1)：13-22(2007)，螺旋稳定化抗体(参见例如Amdt等，J.Mol.Biol.，312：221-228(2001)；三抗体 (triabody)；双抗体(diabody)(欧洲专利申请公开文本0404097；国际专利申请公开文本WO1993／011161；及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90： 6444-6448(1993))；单链抗体分子(“scFvs,”参见例如美国专利5,888,773)；二硫键稳定化的分子(“dsFv,”参见例如美国专利5,747,654和6,558,672)，及域抗体(“dAbs，”参见例如Holt等，TrendsBiotech，21(11)：484-490(2003)， Ghahroudi等，FEBSLett.，414：521-526(1997)，Lauwereys等，EMBO J17：3512- 3520(1998)，Reiter等，J.Mol.Biol.290：685-698(1999)；及Davies和Riechmann， Biotechnology，13：475-479(2001))。
对抗体或其抗原结合部分测试结合任何细胞表面标志物的能力的方法是本领域中已知的，并且包括任何抗体-抗原结合测定法，诸如例如放射性免疫测定法(RIA)、ELISA、Western印迹、免疫沉淀、和竞争性抑制测定法(参见例如Janeway等，见下文及美国专利申请公开文本2002／0197266A1)。
制备抗体的合适方法是本领域中已知的。例如，标准的杂交瘤方法记载于例如
Figure BDA0000464690400000181
and Milstein，Eur.J. Immunol.，5，511-519(1976)，Harlow and Lane(编)，Antibodies：A Laboratory Manual，CSH Press(1988)，及C.A. Janeway等(编)，Immunobiology，第5版，Garland Publishing，New York，NY (2001))。或者，其它方法，诸如EBV-杂交瘤方法(Haskard and Archer，J. Immunol.Methods，74(2)，361-67(1984)，及Roder等，MethodsEnzymol.，121， 140-67(1986))和噬菌体载体表达***(参见例如Huse等，Science，246，1275-81(1989))是本领域中已知的。此外，在非人动物中产生抗体的方法记载于例如美国专利5,545,806，5,569,825，和5,714,352，及美国专利申请公开文本2002／0197266A1。
噬菌体展示也可以用于生成可以在本发明的嵌合分子中使用的抗体。在这点上，可以使用标准分子生物学和重组DNA技术(参见例如Sambrook等 (编)，MolecularCloning,ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2001))生成编码抗体的抗原结合可变(V)域的噬菌体文库。对编码具有期望特异性的可变区的噬菌体选择对期望抗原的特异性结合，并且重建包含选择的可变域的完整或部分抗体。将编码重建抗体的核酸序列导入合适的细胞系，诸如用于杂交瘤产生的骨髓瘤细胞中，使得细胞分泌具有单克隆抗体特征的抗体(参见例如Janeway等，见上文，Huse等，见上文，及美国专利6,265,150)。
或者，抗体可以通过在特定的重链和轻链免疫球蛋白基因方面转基因的转基因小鼠产生。此类方法是本领域中已知的，并且记载于例如美国专利 5,545,806和5,569,825，及Janeway等，见上文。
或者，抗体可以是遗传工程化抗体，例如人源化抗体或嵌合抗体。有利地，人源化抗体提供较低的副作用风险，并且可以在循环中保持更久。用于生成人源化抗体的方法是本领域中已知的，并且详细记载于例如Janeway等，见上文，美国专利5,225,539,5,585,089和5,693,761，欧洲专利0239400B1，及英国专利2188638。人源化抗体也可以使用抗体重修表面技术产生，所述抗体重修表面技术记载于例如美国专利5,639,641和Pedersen等，J.Mol.Biol.， 235，959-973(1994)。
靶向模块可以特异性结合任何合适的细胞表面标志物。特定的靶向模块和／或细胞表面标志物的选择可以根据要靶向的特定细胞群体选择。细胞表面标志物是本领域中已知的(参见例如Mufson等，Front.Biosci.，11：337-43 (2006)；Frankel等，Clin.CancerRes.，6：326-334(2000)；及Kreitman等，AAPS Journal，8(3)：E532-E551(2006))，并且可以是例如蛋白质或糖。在本发明的一个实施方案中，靶向模块是特异性结合细胞表面上的受体的配体。例示性的配体包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、Fas、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、细胞因子(例如IL-2，IL-15，IL-4，IL-13)、淋巴因子、激素、和生长因子(例如转化生长因子(TGFa)、神经元生长因子、上皮生长因子)。
例如，细胞表面标志物可以是癌抗原。如本文中使用的，术语“癌抗原”指仅或主要由肿瘤细胞或癌细胞表达或过表达，使得抗原与肿瘤或癌症有关的任何分子(例如蛋白质、肽、脂质、糖，等等)。另外，癌抗原可以由正常的、非肿瘤、或非癌性细胞表达。然而，在此类情况中，正常的、非肿瘤、或非癌性细胞的癌抗原表达不如肿瘤或癌细胞的表达一样强力。在这点上，肿瘤或癌细胞可以过表达抗原或与正常的、非肿瘤、或非癌性细胞的抗原表达相比以显著更高的水平表达抗原。还有，另外，癌抗原可以由不同发育或成熟状态的细胞表达。例如，另外，癌抗原可以由胚胎或胎儿阶段的细胞(该细胞通常在成年宿主中找不到)表达。或者，另外，癌抗原可以由干细胞或祖细胞(该细胞通常在成年宿主中找不到)表达。
癌抗原可以是由任何癌症或肿瘤，包括本文中描述的癌症和肿瘤的任何细胞表达的抗原。癌抗原可以是仅一类癌症或肿瘤的癌抗原，使得癌抗原与仅一类癌症或肿瘤相关联或其特征性的。或者，癌抗原可以是超过一类癌症或肿瘤的癌抗原(例如可以是特征性的)。例如，癌抗原可以由乳腺和***癌细胞两者表达而正常的、非肿瘤、或非癌细胞根本不表达。
靶向模块可以特异性结合的例示性癌抗原包括但不限于粘蛋白1 (MUC1)、黑色素瘤关联抗原(MAGE)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、癌胚抗原(CEA)、***特异性抗原(PSA)、***特异性膜抗原(PSMA)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)、CD56、人上皮生长因子受体2 (HER2／neu)(又称为erbB-2)、CD5、CD7、酪氨酸酶肿瘤抗原、酪氨酸酶相关蛋白(TRP)1、TRP2、NY-ESO-1、端粒酶、和p53。在一个优选的实施方案中，靶向模块特异性结合的细胞表面标志物选自下组：分化簇(CD)19、CD21、 CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮素、钙粘着蛋白和Lewis Y。间皮素在例如卵巢癌、间皮瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌瘤、输卵管(fallopian tube)癌、头和颈癌、***、和胰腺癌中表达。 CD22在例如毛细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、和急性淋巴细胞性白血病(ALL)中表达。CD25在例如白血病和淋巴瘤，包括毛细胞性白血病和何杰金氏淋巴瘤中表达。Lewis Y抗原在例如膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、食管癌、胃癌、肺癌、和胰腺癌中表达。CD33 在例如急性髓样白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)、和骨髓增殖性病症中表达。
在本发明的一个实施方案中，靶向模块是特异性结合癌抗原的抗体。特异性结合癌抗原的例示性抗体包括但不限于针对转铁蛋白受体的抗体(例如 HB21及其变体)、针对CD22的抗体(例如RFB4及其变体)、针对CD25的抗体 (例如抗Tac及其变体)、针对间皮素的抗体(例如SS1，MORAb-009，SS，HN1， HN2，MN，MB，及其变体)和针对Lewis Y抗原的抗体(例如B3及其变体)。在这点上，靶向模块可以是选自下组的抗体及其抗原结合部分：B3，RFB4，SS， SS1，MN，MB，HN1，HN2，HB21，和MORAb-009。适合于用于本发明的嵌合分子的进一步的例示性靶向模块披露于例如美国专利5,242,824(抗转铁蛋白受体)；5,846,535(抗CD25)；5,889,157(抗Lewis Y)；5,981,726(抗Lewis Y)； 5,990,296(抗Lewis Y)；7,081,518(抗间皮素)；7,355,012(抗CD22和抗CD25)； 7,368,110(抗间皮素)；7,470,775(抗CD30)；7,521,054(抗CD25)；和7,541,034 (抗CD22)；美国专利申请公开文本2007／0189962(抗CD22)；Frankel等，Clin. Cancer Res.，6：326-334(2000)，及Kreitman等，AAPS Journal，8(3)：E532-E551 (2006)，每篇均通过提述并入本文。在另一个实施方案中，靶向模块可以包括本领域中已知的免疫毒素的靶向模块。例示性的免疫毒素包括但不限于 LMB-2(抗Tac(Fv)-PE38)，BL22和HA22(RFB4(dsFv)-PE38)，SS1P(SS l (dsFv)-PE38)，HB21-PE40及其变体。在一个优选的实施方案中，靶向模块是 HA22的抗原结合部分。HA22包含与PE38缀合的二硫键连接的Fv抗CD22抗体片段。HA22及其变体披露于国际专利申请公开文本WO2003／027135和WO2009／032954，其通过提述并入本文。
在本发明的一个实施方案中，嵌合分子包含接头。如本文中使用的，术语“接头”指连接本发明的PE与靶向模块的任何药剂或分子。本领域普通技术人员认可本发明的PE上对于本发明的PE的功能不必需的位点是用于附接接头和／或靶向模块的理想位点，只要接头和／或靶向模块在附接于本发明的 PE后不干扰本发明的PE的功能，即细胞毒性活性，抑制靶细胞生长，或者治疗或预防癌症。接头可以能够与PE和靶向模块两者形成共价键。合适的接头是本领域中已知的，并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头、和肽接头。在PE和靶向模块是多肽的情况中，接头可以经由侧基(例如经由与半胱氨酸的二硫键连接)与氨基酸连接。优选地，接头会与末端氨基酸的氨基和羧基基团的alpha碳连接。
本发明的范围中包括本文中描述的本发明的PE和嵌合分子的功能部分。术语“功能部分”在提及PE或嵌合分子使用时指本发明的PE或嵌合分子的任何部分或片段，该部分或片段保留其作为其中一部分的PE或嵌合分子(亲本PE或嵌合分子)的生物学活性。功能性部分涵盖例如PE或嵌合分子中以与亲本PE或嵌合分子相似的程度、相同的程度、或更高的程度保留特异性结合并破坏靶细胞或抑制靶细胞生长或者治疗或预防癌症的能力的那些部分。提及亲本PE或嵌合分子，功能部分可以包含例如亲本PE或嵌合分子的约10％或更多，约25％或更多，约30％或更多，约50％或更多，约68％或更多，约80％或更多，约90％或更多，或约95％或更多。
功能部分可以在该部分的氨基或羧基端，或在这两个末端包含额外的氨基酸，该额外的氨基酸是亲本PE或嵌合分子的氨基酸序列中找不到的。期望地，所述额外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如特异性结合并且破坏靶细胞或抑制靶细胞生长，具有治疗或预防癌症的能力等。更期望地，与亲本PE或嵌合分子的生物学活性相比，所述额外的氨基酸增强生物学活性。
本发明的范围中包括本文中描述的本发明的PE和嵌合分子的功能性变体。如本文中使用的，术语“功能性变体”指与亲本PE或嵌合分子具有实质性或显著序列同一性或相似性的PE或嵌合分子，该功能性变体保留以其作为变体的PE或嵌合分子的生物学活性。功能性变体涵盖例如以与亲本PE或嵌合分子相似的程度、相同的程度、或更高的程度保留特异性结合并破坏靶细胞或抑制靶细胞生长的能力的本文中描述的PE或嵌合分子(亲本PE或嵌合分子)的那些变体。提及亲本PE或嵌合分子，功能性变体例如可以与亲本PE或嵌合分子在氨基酸序列上是约30％或更多，约50％或更多，约75％或更多，约80％或更多，约90％或更多，约95％或更多，约96％或更多，约97％或更多，约98％或更多，或约99％或更多相同的。
例如，功能性变体可以包含亲本PE或嵌合分子的氨基酸序列及至少一处保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域中已知的，并且包括如下的氨基酸取代，其中用一种具有某些化学和／或物理特性的氨基酸交换另一种具有相同化学或物理特性的氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是取代另一种酸性氨基酸的酸性氨基酸(例如Asp或Glu)、取代另一种具有非极性侧链的氨基酸的具有非极性侧链的氨基酸(例如Ala，Gly,Val，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Trp， Val等等)，取代另一种碱性氨基酸的碱性氨基酸(LVs，Arg等)，取代另一种具有极性侧链的氨基酸的具有极性侧链的氨基酸(Asn，Cys，Gln，Ser,Thr，Tyr 等)，等等。
或者／另外，功能性变体可以包含亲本PE或嵌合分子的氨基酸序列及至少一处非保守氨基酸取代。在此情况中，优选的是非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能性变体的生物学活性。优选地，非保守氨基酸取代增强功能性变体的生物学活性，使得功能性变体的生物学活性与亲本PE或嵌合分子相比是升高的。
本发明的PE或嵌合分子可以基本上由本文中描述的一种或多种规定氨基酸序列组成，使得功能性变体的其它组件，例如其它氨基酸本质上不改变功能性变体的生物学活性。
本发明的PE或嵌合分子(包括功能部分和功能性变体)可以包含合成氨基酸，替换一个或多个天然存在的氨基酸。此类合成的氨基酸是本领域中已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基n-癸酸、高丝氨酸、 S-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反-3-和反-4-羟脯氨酸、4-氨基苯基丙氨酸、 4-硝基苯基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、4-羧基苯基丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯基丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苯甲基-N’-甲基-赖氨酸、N’，N’-联苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α，γ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯基丙氨酸(homophenylalanine)、和α-叔-丁基甘氨酸。
本发明的PE或嵌合分子(包括功能部分和功能性变体)可以是糖基化的，酰胺化的，羧基化的，磷酸化的、酯化的、N-乙酰化的、经由例如二硫键桥环化的、或者转化成酸加成盐和／或任选地二聚化的或多聚化的，或者缀合的。
本发明的一个实施方案提供了一种产生本发明的PE的方法，其包括(a) 重组表达PE，并(b)纯化PE。可以通过本领域中已知的蛋白质和多肽产生方法获得本发明的PE和嵌合分子(包括功能部分和功能性变体)。合适的重新合成多肽和蛋白质的方法记载于参考文献，诸如Chan等，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2005； Peptide and Protein Drug Analysis，Reid，R.编，Marcel Dekker，Inc.，2000；Epitope Mapping，Westwood等编，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2000；及美国专利5,449,752。还有，本发明的PE和嵌合分子可以使用标准重组方法使用本文中描述的核酸重组表达。参见例如Sambrook等， MolecularCloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press， Cold SpringHarbor,NY2001；及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and John Wiley&Sons，NY，1994。
所述方法进一步包括纯化PE。一旦表达后，本发明的PE可以依照本领域中已知的纯化技术纯化。例示性的纯化技术包括但不限于硫酸铵沉淀、亲和柱、和柱层析，或者通过记载于例如R.Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，NY(1982)的规程进行。
本发明的另一个实施方案提供了一种产生本发明的嵌合分子的方法，其包括(a)重组表达嵌合分子，并(b)纯化嵌合分子。可以将嵌合分子重组表达并纯化，如本文中就本发明的其它方面而言描述的。在本发明的一个实施方案中，重组表达嵌合分子包括将编码靶向模块的核苷酸序列和编码PE的核苷酸序列***载体中。该方法可以包括将编码靶向模块的核苷酸序列和编码PE 的核苷酸序列以符合读码框的方式***，使得它编码一条包含功能性靶向模块区和功能性PE区的连续多肽。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将编码PE的核苷酸序列与编码靶向模块的核苷酸序列连接，使得在表达后， PE位于靶向模块的羧基端。在一个备选的实施方案中，所述方法包括将编码 PE的核苷酸序列与编码靶向模块的核苷酸序列连接，使得在表达后，PE位于靶向模块的氨基端。
本发明的仍另一个实施方案提供了一种产生本发明的嵌合分子的方法，其包括(a)重组表达本发明的PE，(b)纯化PE，并(c)将靶向模块与纯化的PE共价连接。可以重组表达本发明的PE，如本文中就本发明的其它方面而言描述的。所述方法进一步包括将靶向模块与纯化的PE共价连接。将PE附接于靶向模块的方法可以随靶向模块的化学结构而变化。例如，所述方法可以包括将PE上存在的多种官能团中的任一种或多种，例如羧酸(COOH)、游离胺 (-NH2)、或硫氢基(-SH)基团与靶向模块上的合适官能团起反应，由此形成PE 和靶向模块之间的共价结合。或者／另外，所述方法可以包括衍生化靶向模块或PE以暴露或附接其它的反应性官能团。衍生化也可以包括将一个或多个接头附接于靶向模块或PE。
在本发明的另一个实施方案中，可以使用非重组方法产生本发明的PE 和嵌合分子。例如，本文中描述的本发明的PE和嵌合分子(包括功能部分和功能性变体)可以由诸如Synpep(Dublin，CA)，Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg，MD)，和MultiplePeptide Systems(San Diego，CA)等公司商业合成。在这点上，本发明的的PE和嵌合分子可以是合成的、重组的、分离的和／或纯化的。
在一些情况中，在嵌合分子已经达到一个或多个靶细胞时可以期望从靶向模块释放PE。在这点上，本发明的嵌合分子可以包含可切割接头。接头可以是通过任何合适的手段，例如用酶可切割的。例如，在靶细胞是癌(例如肿瘤)细胞时，嵌合分子可以包含在存在于肿瘤部位的条件下(例如在暴露于肿瘤关联酶或酸性pH时)可切割的接头。
本发明的一个实施方案提供了一种核酸，其包含编码本文中描述的任何本发明的PE或本发明的嵌合分子的核苷酸序列。如本文中使用的，术语“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”、和“核酸分子”，并且一般意指DNA 或RNA的聚合物，其可以是单链或双链，其可以是合成的或者从天然来源获得的(例如分离和／或纯化的)，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，且其可以含有天然的、非天然的、或改变的核苷酸间连接，诸如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，替代见于未修饰寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。一般优选的是，核酸不包含任何***、缺失、倒位、和／或取代。然而，如本文中讨论的，在一些情况中核酸包含一处或多处***、缺失、倒位、和／或取代可能是合适的。
优选地，本发明的核酸是重组的。如本文中使用的，术语“重组”指(i) 通过连接天然的或合成的核酸区段在活细胞外部构建的分子，或(ii)源自上述 (i)中描述的那些分子的复制的分子。出于本文中的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
可以使用本领域中已知的规程基于化学合成和／或酶促连接反应构建核酸。参见例如Sambrook等，见上文及Ausubel等，见上文。例如，可以使用天然存在的核苷酸或不同方式修饰的核苷酸以化学方式合成核酸，所述不同方式修饰的核苷酸设计为提高分子的生物学稳定性或者提高杂交后形成的双链体的物理稳定性(例如硫代磷酸酯衍生物和经吖啶取代的核苷酸)。可以用于生成核酸的经修饰的核苷酸的例子包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、 5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、beta-D-半乳糖基Q核苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、beta-D- 甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6- 异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷 (queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5- 甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、和2，6-二氨基嘌呤。或者，本发明的一种或多种核酸可以购自公司，诸如 Macromolecular Resources(Fort Collins，CO)和Synthegen(Houston，TX)。
本发明还提供了一种核酸，其包含与本文中描述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文中描述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
优选地，在严格条件下杂交的核苷酸序列在高严格性条件下杂交。“高严格性条件”意指核苷酸序列以比非特异性杂交强得可检测的量与靶序列 (本文中描述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格性条件包括如下的条件，其可以从随机序列区别具有精确互补序列的多核苷酸，或仅含有几个分散错配的多核苷酸，该随机序列恰好仅具有与核苷酸序列匹配的几个小区域(例如3-10个碱基)。具有互补性的此类小区域比14-17或更多个碱基的全长互补物更容易熔解，并且高严格性杂交使它们变得容易可区分。相对较高的严格性条件会包括例如低盐和／或高温条件，诸如通过约0.02-0.1M NaCl或等同物，于温度约50-70℃提供的。此类高严格性条件容许核苷酸序列和模板或靶链之间的很少(若有任何)错配，并且特别适合于检测任何本发明的PE 或嵌合分子的表达。一般领会的是，可以通过添加增加量的甲酰胺使条件变得更严格。
本发明还提供了一种核酸，其包含与本文中描述的任何核酸约70％或更多，例如约80％或更多，约90％或更多，约91％或更多，约92％或更多，约 93％或更多，约94％或更多，约95％或更多，约96％或更多，约97％或更多，约98％或更多，或约99％或更多相同的核苷酸序列。
本发明的核酸可以掺入重组表达载体中。在这点上，本发明提供了重组表达载体，其包含本发明的任何核酸。出于本文中的目的，术语“重组表达载体”意指经遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，其在该构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽、或肽的核苷酸序列，并且在足以使mRNA、蛋白质、多肽、或肽在细胞内表达的条件下使载体与细胞接触时容许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽、或肽。本发明的载体总体上不是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链或双链，其可以是合成的或部分从天然来源获得的，且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的、非天然存在的核苷酸间连接，或者这两类连接。优选地，非天然存在或改变的核苷酸或核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。
本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括那些为了增殖和扩充或者为了表达或者为了这两者而设计的载体，诸如质粒和病毒。载体可以选自下组：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，LaJolla， CA)、pET系列(Novagen，Madison，WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala， Sweden)、和pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)。也可以使用噬菌体载体，诸如λGT10，λGT11，λZapII(Stratagene)，λEMBL4，和λNM1149。植物表达载体的例子包括pBI01，pBI101.2，pBI101.3，pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的例子包括pEUK-Cl，pMAM和pMAMneo(Clontech)。优选地，重组表达载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体。
本发明的重组表达载体可以使用标准的重组DNA技术制备，所述标准的重组DNA技术记载于例如Sambrook等，见上文及Ausubel等，见上文。表达载体的构建体(其是环状或线性的)可以制备为含有在原核或真核宿主细胞中有功能的复制***。复制***可以源自例如ColEl，2μ质粒，λ，SV40，牛***状瘤病毒，等等。
期望地，在适当时并且考虑载体是基于DNA还是基于RNA的，重组表达载体包含调节序列，诸如转录和翻译起始和终止密码子，其对要接受载体导入的宿主类型(例如细菌、真菌、植物或动物)是特异性的。
重组表达载体可以包括一个或多个标志物基因，其容许选择经转化的或经转染的宿主。标志物基因包括杀生物剂(biocide)抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，营养缺陷型宿主中提供原养型的互补，等等。适合于本发明的表达载体的标志物基因包括例如新霉素／G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因、和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可以包含天然的或非天然的启动子，其与编码本发明的PE 或嵌合分子(包括功能部分和功能性变体)的核苷酸序列或者与同编码PE或嵌合分子的核苷酸序列互补或与编码PE或嵌合分子的核苷酸序列杂交的核苷酸序列可操作连接。选择启动子，例如强、弱、诱导型、组织特异性、和发育特异性在技术人员的普通技术内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的普通技术内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子、或存在于鼠干细胞病毒的长末端重复中的启动子。
本发明的重组表达载体可以为了瞬时表达，为了稳定表达，或者为了这两者而设计。还有，可以制备重组表达载体以供组成性表达或诱导性表达。
本发明的另一个实施方案进一步提供了宿主细胞，其包含本文中描述的任何重组表达载体。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指可以含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌、或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞，粘附细胞或悬浮细胞，即在悬浮液中生长的细胞。为了产生重组的本发明的PE或嵌合分子，优选地，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌细胞。
本发明还提供了细胞群体，其包含至少一种本文中描述的宿主细胞。细胞群体可以是异质群体，其含有包含描述的任何重组表达载体的宿主细胞，另外还有至少一种其它细胞，例如不包含任何重组表达载体的宿主细胞。或者，细胞群体可以是基本上同质的群体，其中该群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如基本上由包含重组表达载体的宿主细胞组成)。该群体还可以是细胞的克隆群体，其中所述群体的所有细胞是包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，使得群体的所有细胞包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群体是包含如本文中描述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
本发明的PE、嵌合分子(包括功能部分和功能性变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)、和细胞群体可以是分离的和／或纯化的。如本文中使用的，术语“分离的”意味着已经从其天然环境移出。如本文中使用的，术语“纯化的”意味着纯度已经升高，其中“纯度”是一项相对术语，并且不必解释为绝对纯度。例如，纯度可以是约50％或更多，约60％或更多，约70％或更多，约80％或更多，约90％或更多，或约100％。优选地，纯度是约90％或更多(例如约90％至约95％)，且更优选地约98％或更多(例如约98％至约99％)。
本发明的PE、嵌合分子(包括功能部分和功能性变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)、和细胞群体(它们在下文都统称为“本发明的 PE材料”)可以配制成组合物，诸如药物组合物。在这点上，本发明提供了药物组合物，其包含PE、嵌合分子(包括功能部分和功能性变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)、和细胞群体中任一种，和药学可接受载体。含有任何本发明的PE材料的本发明的药物组合物可以包含超过一种本发明的PE材料，例如多肽和核酸，或者两种或更多种不同PE。或者，药物组合物可以包含组合的本发明的PE材料与一种或多种其它药学活性剂或药物，诸如化学治疗剂，例如门冬酰胺酶(asparaginase)、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、柔红霉素(daunombicin)、多柔比星 (doxorubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲 (hydroxyurea)、甲氨蝶呤(methotrexate)、帕利他塞(paclitaxel)、利妥昔单抗 (rituximab)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)，等等。
优选地，载体是药学可接受载体。就药物组合物而言，载体可以是那些常规使用的载体之任一种，并且仅受限于化学-物理考虑因素(诸如溶解度和与活性化合物的反应性缺乏)以及施用路径。本文中描述的药学可接受载体，例如，媒介物、佐剂、赋形剂、和稀释剂是本领域技术人员公知的，并且是公众容易得到的。优选的是，药学可接受载体是对活性剂而言是化学惰性的载体和在使用条件下没有有害副作用或毒性的载体。
载体的选择会部分由特定的本发明的PE材料，以及由用于施用本发明的 PE材料的特定方法决定。因而，存在有多种本发明药物组合物的合适配制剂。用于肠胃外(例如皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、和鞘内)、口服、和气雾剂施用的以下配制剂是例示性的，而绝不是限制的。超过一种路径可以用于施用本发明的PE材料，且在某些情况中，特定路径可以比另一种路径提供更即刻且更有效的应答。
外用／局部(topical)配制剂是本领域技术人员公知的。此类配制剂在对皮肤应用的本发明背景中是特别合适的。
适合于口服施用的配制剂可以包括(a)液体溶液，诸如有效量的在稀释剂，诸如水、盐水、或橙汁中溶解的本发明的PE材料；(b)胶囊、囊剂(sachets)、片剂、锭剂、和糖锭(troches)，其各含有预先确定量的作为固体或颗粒的活性成分；(c)粉末；(d)合适液体中的悬浮液；和(e)合适的乳剂。液体配制剂可以包含稀释剂，诸如水和醇，例如，乙醇、苯甲醇、和聚乙烯醇(polyethylene alcohol)，其添加或未添加药学可接受表面活性剂。胶囊形式可以是普通的硬或软壳明胶类型的，其含有例如表面活性剂、滑润剂、和惰性填充剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙、和玉米淀粉。片剂形式可以包含下列一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、***胶、明胶、瓜尔胶(guar gum)、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠 (croscarmellose sodium)、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂、和其它药理学相容性赋形剂。锭剂形式可以包括调味料(flavor)(通常为蔗糖和***胶或黄蓍胶)中的本发明的PE材料，以及软锭剂(pastille)，其包含惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和***胶，乳剂，凝胶等中的本发明的PE材料，其另外含有如本领域中已知的赋形剂。
单独或与其它合适的组分组合的本发明的PE材料可以制备成要经由吸入施用的气雾剂配制剂。这些气雾剂配制剂可以置于加压可接受推进剂，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。气雾剂配制剂也可以配制为非加压制备的药物，诸如在喷雾器或雾化器(atomizer)中。此类喷雾配制剂也可以用于喷雾粘膜。
适合于肠胃外施用的配制剂包括水性和非水性、等张无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使配制剂与意图的接受体的血液等张的溶质，和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂。本发明的PE材料可以在药用载体中的生理学可接受稀释剂中施用，所述生理学可接受稀释剂诸如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、水性右旋糖和相关糖溶液，醇，诸如乙醇或十六烷醇，乙二醇，诸如丙二醇或聚乙二醇，二甲亚砜，甘油，缩酮，诸如2,2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或乙酰化脂肪酸甘油酯，其添加或未添加药学可接受表面活性剂，诸如脂肪酸盐 (soap)或去污剂，助悬剂，诸如果胶，卡波姆(carbomer)，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素，或乳化剂和其它药用佐剂。
可以用于肠胃外配制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体例子包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、矿脂、和矿物油。适合于用于肠胃外施用的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的例子。
适合于用于肠胃外配制剂的脂肪酸盐包括脂肪碱金属、铵、和三乙醇胺盐，并且合适的去污剂包括(a)阳离子型去污剂，诸如例如二甲基二烃基卤化铵和卤化烷基吡啶(alkyl pyridinium halides)，(b)阴离子型去污剂，诸如例如烃基、芳基、和烯烃磺酸盐(olefin sulfonates)、烃基、烯烃(olefin)、醚、和硫酸单甘油酯、和磺基丁二酸酯，(c)非离子型去污剂，诸如例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺、和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去污剂，诸如例如烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基-咪唑啉季铵盐，及(e)其混合物。
肠胃外配制剂通常会在溶液中含有约0.5％至约25％(按重量计)本发明的PE材料。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的发炎，此类组合物可以含有一种或多种非离子型表面活性剂，其具有约12至约17的亲水物-亲脂物平衡(HLB)。此类配制剂中表面活性剂的量的范围通常会是约 5％至约15％(按重量计)。合适的表面活性剂包括聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯，诸如山梨糖醇酐单油酸酯(sorbitan monooleate)和环氧乙烷与疏水性基质 (通过缩合环氧丙烷与丙二醇形成)的高分子量加合物。肠胃外配制剂可以在单位剂量或多剂密封容器，诸如安瓿或小瓶中呈现，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件中贮存，其仅需要刚好在使用前添加无菌液体赋形剂，例如，注射用水。即时注射溶液和悬浮液可以从先前描述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。对于肠胃外组合物有效的药用载体的要求是本领域普通技术人员公知的(参见例如Pharmaceutics and PharmacyPractice，J.B.Lippincott Company, Philadelphia，PA，Banker and Chalmers编，第238-250页(1982)，及ASHP Handbook on InjectableDrugs，Toissel，第4版，第622-630页(1986))。
本领域技术人员会领会，除了上文描述的药物组合物外，本发明的本发明的PE材料还可以配制为包合配合物，诸如环糊精包合配合物，或脂质体。
出于本发明的目的，施用的本发明的PE材料的量或剂量应当足以在哺乳动物中在合理的时间范围里实现期望的应答，例如治疗性或预防性应答。例如，本发明的PE材料的剂量应当足以在从施用时起的约2小时或更长，例如 12至24或更多个小时的时段中抑制靶细胞生长或治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间段可以甚至更长。剂量会由特定的本发明的PE材料的效力和哺乳动物(例如人)的状况，以及要处理的哺乳动物(例如人)的体重决定。
用于确定施用剂量的许多测定法是本领域中已知的。施用剂量可以在体外(例如细胞培养物)或体内(例如动物研究)测定。例如，施用剂量可以通过在细胞培养物和／或动物研究中确定IC50(实现对症状的半最大抑制的剂量)、 LD50(对50％群体致死的剂量)、ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)、和治疗指数来确定。治疗指数是LD50与ED50的比率(即LD50／ED50)。
本发明的PE材料的剂量也会由可能伴随特定本发明的PE材料的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度决定。通常，主治医师会考虑多种因素决定用其治疗每名单独患者的本发明的PE材料的剂量，所述因素诸如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、要施用的本发明的PE材料、施用路径、和所治疗状况的严重性。举例而言而不意图限制本发明，本发明的PE材料的剂量可以是约0.001至约1000mg／kg所治疗受试者的体重／天，约0.01至约10mg／kg 体重／天，约0.01mg至约1mg／kg体重／天，约1至约至约1000mg／kg体重／天，约5至约500mg／kg体重／天，约10至约250mg／kg体重／天，约25至约150mg／kg 体重／天，或约10mg／kg体重／天。
或者，本发明的PE材料可以修饰成贮存药剂(depot)形式，诸如本发明的 PE材料对接受其施用的身体释放的方式就时间和身体内的位置而言受到控制(参见例如美国专利4,450，150).例如，本发明的PE材料的贮存药剂形式可以是一种可植入组合物，其包含本发明的PE材料和多孔或非多孔材料，诸如聚合物，其中本发明的PE材料被非多孔材料包囊或者经由非多孔材料的材料和／或降解扩散。然后，可以将贮存药剂植入身体内期望的位置中，并且以预先确定的速率从植入物释放本发明的PE材料。
可以通过本领域中已知的测定法对本发明的PE材料测定细胞毒性。细胞毒性测定法的例子包括WST测定法，其使用四唑盐WST-1(可购自Roche Applied Sciences的试剂和试剂盒)来测量细胞增殖，如记载于国际专利申请公开文本WO201I／032022的。
涵盖的是，可以在治疗或预防癌症的方法中使用本发明的药物组合物、PE、嵌合分子、核酸、重组表达载体、宿主细胞、或细胞群体。不限于具体的理论或机制，认为本发明的PE经由抑制真核细胞中的蛋白质而破坏或抑制细胞生长，例如通过使延长因子2(EF-2)的ADP核糖基化失活进行抑制。不限于具体的理论或机制，本发明的嵌合分子识别并特异性结合细胞表面标志物，由此在与不表达细胞表面标志物的细胞具有最小或无交叉反应性的情况下将细胞毒性PE投递至表达细胞表面标志物的细胞群体。这样，可以靶向PE 的细胞毒性以破坏或抑制特定群体的细胞，例如癌细胞的生长。在这点上，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物中的癌症的量对哺乳动物施用本文中描述的PE、嵌合分子、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、或药物组合物中任一种。
如本文中使用的，术语“治疗”和“预防”及源自其的词语不一定暗示 100％或完全治疗或预防。而是有不同程度的治疗或预防，对此本领域普通技术人员认为具有潜在益处或治疗效果。在这点上，本发明的方法可以对哺乳动物中的癌症提供任何量的任何水平的治疗或预防。此外，由本发明的方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防所治疗或预防的疾病(例如癌症)的一种或多种状况或症状。还有，出于本文中的目的，“预防”可以涵盖延迟疾病或其症状或状况的发作。
出于本发明的方法的目的，其中施用宿主细胞或细胞群体，细胞可以是对于宿主而言同种异体或自体的细胞。优选地，细胞对于宿主而言是自体的。就本发明的方法而言，癌症可以是任何癌症，包括下列任一种：肾上腺癌、肉瘤(例如滑膜肉瘤、骨源性肉瘤(osteogenic sarcoma)、子宫平滑肌肉瘤 (leiomyosarcoma uteri)、血管肉瘤(angiosarcoma)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、粘液瘤(myxoma)、横纹肌瘤(rhabdomyoma)、纤维瘤(fibroma)、脂肪瘤(lipoma)、和畸胎瘤 (teratoma)、淋巴瘤(例如小淋巴细胞性淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、和非何杰金淋巴瘤)、肝细胞癌瘤(hepatocellular carcinoma)、胶质瘤(glioma)、头癌(headcancer)(例如鳞状细胞癌瘤)、颈癌(neck cancer)(例如鳞状细胞癌瘤)、急性淋巴细胞癌、白血病(例如毛细胞性白血病、髓样白血病(急性和慢性)、淋巴细胞性白血病(急性和慢性)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、骨髓单核细胞性白血病(急性和慢性)、和淋巴细胞性白血病(急性和慢性))、骨癌(bone cancer)(骨源性肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因(Ewing)氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞肿瘤、脊索瘤 (chordoma)、骨软骨瘤(osteochondroma)(骨软骨外生骨疣(osteocartilaginousexostoses))、良性软骨瘤(chondroma)、软骨母细胞瘤(chondroblastoma)、软骨粘液样纤维瘤(chondromyxoid fibroma)、骨样骨瘤(osteoid osteoma)、和巨细胞肿瘤)、脑癌(星形细胞瘤(astrocytoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、神经鞘瘤(schwannoma)、和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、输卵管癌、乳腺癌、***癌、肛管癌、或***直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌、或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、或中耳癌、口腔癌、外阴癌(例如鳞状细胞癌瘤、上皮内癌瘤、腺癌瘤、和纤维肉瘤)、骨髓增殖性病症(例如慢性髓样癌)、结肠癌(例如结肠癌瘤)、食管癌(例如鳞状细胞癌瘤、腺癌瘤、平滑肌肉瘤、和淋巴瘤)、***(***瘤和侵入前(pre-invasive)宫颈发育异常)、胃癌、胃肠类癌瘤、下咽癌、喉癌、肝癌(例如、肝细胞癌瘤、胆管癌瘤、肝胚细胞瘤、血管肉瘤 (angiosarcoma)、肝细胞腺瘤(hepatocellular adenoma)、和血管瘤)、肺癌(例如、支气管癌瘤(鳞状细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、和腺癌瘤)、肺泡(细支气管)癌瘤、支气管腺瘤、软骨错构瘤(chondromatous hamartoma)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、和肺腺癌瘤(lung adenocarcinoma)、恶性间皮瘤、皮肤癌(例如、黑色素瘤、基底细胞癌瘤(basal cellcarcinoma)、鳞状细胞癌瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、痣(nevi)、发育不良性痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、和瘢痕疙瘩)、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、卵巢癌(例如卵巢癌瘤(浆液性囊腺癌瘤(serous cystadenocarcinoma)、粘蛋白性囊腺癌瘤(mucinouscystadenocarcinoma)、子宫内膜样癌瘤(endometrioid carcinoma)、和透明细胞腺癌瘤(clear cell adenocarcinoma)、颗粒-膜细胞肿瘤(granulosa-theca cell tumor)、塞-莱二氏细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、无性细胞瘤(dysgerminoma)、和恶性畸胎瘤)、胰腺癌(例如、导管腺癌瘤(ductal adenocarcinoma)、胰岛瘤、高血糖素瘤(glucagonoma)、胃泌素瘤(gastrinoma)、类癌瘤(carcinoid tumor)、和舒血管肠肽瘤(VIPoma)、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、***癌(例如腺癌瘤和肉瘤)、直肠癌、肾癌(例如、腺癌瘤、维尔姆斯瘤(Wilms tumor)(肾胚细胞瘤(nephroblastoma)、和肾细胞癌瘤(renal cell carcinoma))、小肠癌(腺癌瘤、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、和纤维瘤)、软组织癌、胃癌(例如、癌瘤、淋巴瘤、和平滑肌肉瘤)、睾丸癌 (例如、***瘤(seminoma)、畸胎瘤、胚胎性癌瘤(embryonal carcinoma)、畸胎癌瘤、绒毛膜癌例会(choriocarcinoma)、肉瘤、莱迪希细胞(Leydig cell tumor)、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、和脂肪瘤)、子宫癌(例如、子宫内膜癌瘤)、甲状腺癌、和尿路上皮癌(urothelial cancer)(例如鳞状细胞癌瘤、移行细胞癌瘤、腺癌瘤、输尿管癌、和膀胱癌)。
如本文中使用的，术语“哺乳动物”指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(Rodentia)的哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠，和兔形目(Logomorpha)的哺乳动物，诸如兔。优选的是，哺乳动物来自食肉目(Camivora)，包括猫科(猫) 和犬科(犬)。更优选的是，哺乳动物来自偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛类(牛) 和猪类(猪)或奇蹄目(Perssodactyla)，包括马类(马)。最优选的是，哺乳动物是灵长目(Primates)、新大陆猴类(Ceboids)、或猴类(Simoids)(猴)的或类人猿类(Anthropoids)(人和猿)的。特别优选的哺乳动物是人。
还提供了抑制靶细胞生长的方法，其包括以有效抑制靶细胞生长的量使细胞与本文中描述的PE、嵌合分子、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、或药物组合物中任一项的PE接触。可以将靶细胞的生长抑制任何量，例如约10％或更多，约15％或更多，约20％或更多，约25％或更多，约30％或更多，约35％或更多，约40％或更多，约45％或更多，约50％或更多，约55％或更多，约60％或更多，约65％或更多，约70％或更多，约75％或更多，约 80％或更多，约85％或更多，约90％或更多，约95％或更多，或约100％。可以在生物学样品中提供靶细胞。生物学样品可以以任何合适的方式获自哺乳动物以及获自任何合适的来源。例如，生物学样品可以通过抽血、白细胞提取法(leukapheresis)、和／或肿瘤活组织检查或尸体检查获得。接触步骤可以就哺乳动物而言在在体外或体内发生。优选地，接触在体外进行。
在本发明的一个实施方案中，靶细胞是癌细胞。靶细胞可以是本文中描述的任何癌症的癌细胞。在本发明的一个实施方案中，靶物可以表达细胞表面标志物。细胞表面标志物可以是本文中就本发明的其它方面而言描述的任何细胞表面标志物。例如，细胞表面标志物可以选自：CD19，CD21，CD22， CD25，CD30，CD33，CD79b，转铁蛋白受体、EGF受体、间皮素、钙粘着蛋白、和Lewis Y。
以下实施例进一步例示本发明，但是当然，不应以解释为以任何方式限制其范围。
实施例
实施例1
本实施例阐明与世界人口的频率相比未免疫供体分组中HLA2类等位基因的频率。
从65名获自NIH血库的健康供体和50名在NCI经历用免疫毒素治疗的患者分离外周血单核细胞(PBMC)。通过Ficoll密度离心从血沉棕黄层(buffy coat) 分离PBMC。使用基于PCR-SSP／SSO的组织分型试剂盒鉴定患者和健康供体的PBMC的HLA I类和II类单元型。然后，将PBMC在热失活的人AB血清和标准冷冻培养基中冷冻，并在液氮中贮存，直至使用。
研究65名健康供体的分组以提供关于世界人口中表达的HLA DR同种型的数目和频率的信息。与世界人口比较未免疫供体分组中表达的同种型的分析(Middleton，D.等，New Allele Frequency Database：www.allelefrequencies.net， Tissue Antigens，61(5)：403-7(2003))，其显示了未免疫供体分组中有主要HLA II类DRB1等位基因的合理呈现。统计学分析显示了世界人口与供体分组之间的关联性为R2=0.52。图1比较世界人口与未免疫供体分组中HLA2类等位基因的不同类型的频率。表1显示了供体群体的HLA II类DRB1单元型。
表1
Figure BDA0000464690400000361
Figure BDA0000464690400000371
实施例2
本实施例阐明制备要用于刺激T细胞的肽文库。
为了测定毒素模块的免疫原性，设计111种肽的文库，其跨越PE38的整个序列。所述肽各具有15个氨基酸的大小，并且除了肽SEQ ID NO：31和32 (它们重叠有11个氨基酸)外均重叠有12个氨基酸。肽以>95％纯度合成，如通过高效液相层析(HPLC)(AmericanPeptide Co.Inc.，Sunnyvale，CA)确定。将冻干的合成肽在二甲亚砜(DMSO)中溶解以制备10μtM储备溶液。
将肽分组成22种合并物，如表2中显示的。表2显示了用于表位定位的肽的序列、SEQ ID NO、和合并物号。
Figure BDA0000464690400000381
Figure BDA0000464690400000391
实施例3
本实施例阐明了未免疫供体T细胞的体外扩充改善T细胞对肽合并物的敏感性和应答水平。
为了模拟治疗后患者中发生的免疫应答并且为了克服短期测定法中未免疫供体样品中的低敏感性和不应答性，采用17天体外扩充步骤来扩充特定 T细胞群体(Oserof降，J. Immunol.，185(2)：943-55(2010))。在用免疫毒素刺激后将细胞温育14-17天。对于刺激，使用免疫毒素LMB9或B3(dsFv)-PE38，其靶向LeY(Brinkmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(16)：7538-42 (1993))，一种不存在于人免疫细胞上的抗原。在第14-17天，将细胞收获，并使用表2的22种肽合并物通过白介素(IL)-2ELISpot测定法测定。体外扩充步骤的添加改善ELISpot测定法的灵敏性和应答水平(例如观察到较多的斑点形成细胞(SFC))。体外扩充捕捉容许检测来自志愿者供体的CD4特异性应答，而且还降低用于每个测定法的细胞总数。
图2A和2B中显示了代表性数据。图2A显示了IL-2ELISpot孔的计数，其指示未免疫供体031810aphT细胞对LMB9(1.6μg／ml)的初始刺激，继以在体外扩充17天后用单独的培养基(无肽)(M)或肽合并物3、16、或22的再刺激的应答。图2B显示了IL-2ELISpot孔的计数，其指示未免疫供体031810aphT细胞对LMB9(1.6μg／ml)的初始刺激，继以在不进行体外扩充的情况中用单独的培养基(无肽)(M)或肽合并物3、16、或22的再刺激的应答。
不希望受限于特定的理论或机制，认为此办法模拟免疫应答，因为就像在体内一样，全重组免疫毒素(RIT)被抗原呈递细胞(APC)内在化，加工，并在培养的前几天期间呈现。使用IL-2维持并扩充应答天然呈现的肽的特定T 细胞。那些T细胞在扩充17天后识别的表位是天然加工的且天然呈现的肽。
实施例4
本实施例阐明了LVALYLAARLSW(SEQ ID NO：3)刺激大多数供体的T 细胞应答。
在用免疫毒素的初始刺激并扩充14天后，将半数的细胞收获，并暴露于肽合并物，以用IL-2ELISpot进行初始合并物筛选。在第17天，使用剩余的细胞来重复合并物筛选，并对观察到的阳性合并物实施精细筛选。在测定法的第14天对28名供体观察到不同应答样式。一些供体筛选揭示了对单一合并物(例如供体1，4，7，和8)的应答，而其它供体(例如供体15，16，和23)揭示了对3-4个合并物的应答。由于肽重叠，合并物间也有重叠，诸如例如序贯合并物具有应答的情况(例如供体15和18对合并物15和16的应答)。阈值决定为 85个SFC／(1x106)。决定此阈值，是因为对于85个SFC／(1x106)之下的数值，来自第14天的应答无一在第17天或在重复体外扩充时可再现。超过85个 SFC／(1x106)的应答可再现。
4名供体(供体25-28)对任何合并物没有应答(超过决定的阈值)，并且认为是非应答的。在完全筛选的最初28名供体中，24名供体对至少一种合并物具有应答。不同供体具有不同的最大应答水平。一些供体(例如供体2，7，和10) 具有较高的最大应答(对于合并物3为超过1100个SFC)，而其他供体(例如供体 3和9)对相同合并物具有250-320个SFC的应答。
将筛选的供体数目增加至50。对22种肽合并物之每种总计所有50名供体间观察到的斑点形成细胞数目。表3和图3中显示了结果。对所有50名供体的分析显示了合并物3(在PE域II中)给出最多应答(表3；图3)。结果提示了合并物3是一种免疫显性合并物，其已经刺激来自许多具有不同HLA的供体的应答。
表3
Figure BDA0000464690400000411
寻找免疫显性区的合并物3精细筛选显示了对于大多数供体，肽SEQ ID NO：44和45造成合并物3内的应答(图4)。图4显示了肽SEQ ID NO：44和45含有用于刺激大多数尽管具有不同HLA状态的患者中的T细胞的共同区 (LVALYLAARLSW)(SEQ ID NO：3)。
实施例5
本实施例阐明了LVALYLAARLSW(SEQ ID NO：3)中的取代L294A， L297A，Y298A，L299A，或R302A降低LVALYLAARLSW(SEQ ID NO：3)的免疫原性。
肽SEQ ID NO：44和45(合并物3内)具有12个共同的氨基酸。此共同区LVALYLAARLSW(SEQ ID NO：3)对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置 294-305，并且含有MHC结合位点及T细胞受体结合位点两者。用丙氨酸取代 LVALYLAARLSW(SEQ ID NO：3)中的每个氨基酸。将来自9名未免疫供体和 2名患者的样品用LMB9刺激17天，使用IL-2ELISpot测定，如实施例3中描述的。表4汇总了来自对11份样品筛选取代了的肽的数据。对于11份样品中的 10份，一处或更多处取代将应答降低至对野生型(WT)的应答的7％下。对于除了一个外的所有供体，取代L297A将应答降低至7％或更小。Y298A在11 份样品中的9份中降低应答，而R302A在11份样品中的7份中降低应答。表4 显示了占用WT肽获得的应答的百分比应答。
表4
Figure BDA0000464690400000421
不受限于特定理论或机制，认为单一氨基酸变化后降低的应答可以归因于中断肽对HLA分子沟的结合或T细胞受体不能识别变化的肽。在任一情况中，取代的肽L279A和Y298A引起降低的应答，且因此可以认为提供降低的免疫原性。
实施例6
本实施例阐明了取代R302A不创建任何新的T细胞表位，并且提供降低的T细胞应答。
使用定点诱变来制备RIT R302HA22和L297A HA22，如先前描述的(Pastan等，Methods Mol.Biol.，248：503-18(2004))。与HA22野生型比较对 CA46细胞的细胞毒性活性(图5)。图5显示了具有取代L297A或R302A的HA22 构建体是细胞毒性的。HA22、L297A HA22、和R302A HA22的IC50分别是 1.1、1.8、和1.8ng／ml。
将来自供体010710和111909的PBMC在有WT HA22或HA22-R302A的情况中培养14天，并测定用无肽、野生型肽LVALYLAARLSWNQV(SEQ ID NO： 45)(WT15)、或LVALYLAAALSWNQV(SEQ ID NO：145)(R302A)再刺激后的T细胞应答。对于供体010710(图6A)和111909(图6B)两者，没有观察到新的表位，并且对取代的肽的T细胞应答是降低的。
实施例7
本实施例阐明了域II中含有免疫显性表位的部分的缺失降低对PE38肽的T细胞应答。
如实施例4中显示的，域II含有免疫显性且混杂的表位(包含在合并物3的 SEQ IDNO：44和45中)。PE-LR(对溶酶体降解的抗性)(又称为LR或LR RIT) 含有除了弗林蛋白酶切割序列RHRQPRGWEQL(SEQ ID NO：8)外的域II的缺失，其存在于SEQ ID NO：37和38中。如此，LR RIT含有SEQ ID NO：1的氨基酸残基274-284和395-613。
将由HA22(含有PE38)刺激的对表2的22种肽合并物的供体T细胞应答与由PE-LR(其完全缺乏免疫显性表位)刺激的供体T细胞的应答比较。
在第0天，将来自三名供体(供体031510，供体021610，或供体101509)的T 细胞在6孔板中铺板，并用10μg／ml HA22或PE-LR刺激。在第14天，将细胞收获，并在IL-2ELISpot板中铺板，并以4个重复与表2的22种合并物之每一种的肽一起温育。对照包括经头孢他啶(CEFT)培养的细胞，在第0天没有抗原刺激且在第14天没有抗原刺激的细胞(“M系”)、和在第0天用LMB9刺激且在第14天没有抗原刺激(“无肽”)的细胞。
图7A(供体031510)、7B(供体021610)、和7C(供体101509)中显示了结果。来自所有三名供体的T细胞在用HA22(含有PE38)刺激并用合并物3的肽再刺激后显示应答。对用PE-LR刺激的细胞没有观察到应答。
实施例8
本实施例阐明PE域III中T细胞表位的鉴定。
在用免疫毒素的初始刺激并扩充14天后，将来自20名供体的T细胞收获，并暴露于肽合并物，以用IL-2ELISpot进行初始合并物筛选，如实施例4中描述的。在第17天，使用剩余的细胞来重复合并物筛选，并实施用肽SEQ ID NO： 102-111的精细筛选。图8中显示了结果。刺激来自供体1-20中每名的T细胞产生IL-2的肽在图8中有阴影。
实施例9
本实施例阐明了与对野生型(WT)肽的应答相比，丙氨酸替换I493，R494， N495，G496，L498，L499，R500，V501或Y502的取代降低T细胞应答，如通过 IL-2产生测量的。
用丙氨酸取代野生型肽IRNGALLRVYVPRSS(SEQ ID NO：106)中的每个非丙氨酸氨基酸。将来自未免疫供体的样品用LMB9刺激17天，并使用IL-2 ELISpot测定，如实施例3中描述的。表5汇总了来自对6份样品筛选取代的肽的数据。
表5
Figure BDA0000464690400000441
Figure BDA0000464690400000451
如表5中显示的，对于所有6份样品，一处或更多处取代将应答降低对 WT的应答的10-30％。对于6份样品中的5份，一处或更多处取代将应答降低至对WT的应答的小于10％。在6份样品中的至少3份中，与对WT的应答相比，取代I493A，R494A，N495A，G496A，L498A，L499A，R500A，V501A或Y502A 将T细胞应答降低70％或更多。表5显示了相对用WT肽获得的应答的百分比应答。
实施例10
本实施例阐明了SEQ ID NO：38，39，44，45，81，82，86-88，97，98，105-108，和123-125含有T细胞表位。
对50名供体实施所有阳性合并物的精细筛选以确定免疫显性区。对于每个供体，总计SFC数目，并依照下述公式(I)将每种肽占SFC总数的相对份额计算并标准化，其中D代表供体，且x代表50名供体之一，P代表肽，y代表肽 SEQ ID NO：31-141之一，且Sy代表肽y的SFC数目：
对于每个
Figure BDA0000464690400000452
(I).
标准化的数值代表每种肽的免疫原性水平，并且图9中显示了50名供体的这些相对数值的记录。图9显示了下列肽含有T细胞表位：SEQ ID NOs： 38，39，44，45，81，82，86，87，88，97，98，105，106，107，108，123， 124，和125。
基于图9中列出的数据选择域III中大多数免疫原性肽。表6中列出了肽、响应肽的供体和患者的数目、和这些肽共同的序列。先前用PE38处理表6中的患者，并且表6中显示的应答是记忆应答。在表6中，应答定义为应答肽的供体或患者的SFC的5％。
表6
Figure BDA0000464690400000461
实施例11
本实施例阐明了如通过参照SEQ ID NO：1限定的取代R421A，L422A， L423A，A425G，R427A，L429A，Y470A，I471A，A472G，P475A，A476G， L477A，I493A，N495A，R494A，L498A，L499A，R500A，V501A，Y502A， V503A，R505A，L508A，或P509A降低PE的免疫原性。
SEQ ID NO：106对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置493-507，SEQ ID NO：107对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置496-510，SEQ ID NO：97 对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置466-480，且SEQ ID NO：81对应于 SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置418-432。用丙氨酸取代SEQ ID NO：106和 SEQ ID NO：107中的每个氨基酸。将来自供体和患者的样品用LMB9刺激17 天，并使用IL-2ELISpot测定，如实施例3中描述的。表7(SEQ ID NO：106)，表 8(SEQ ID NO：107)，表9(SEQ ID NO：97)，及表10(SEQ ID NO：81)汇总了来自对取代的肽筛选样品的数据(占对野生型(WT)肽的应答的％)。
表7(SEQ ID NO：106)
供体／患者 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
无肽 0％ 0％ 0％ 4％ 0％ 9％ 42％ 0％ 1％ 17％ 1％ 0％
WT76 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
I493A 86％ 13％ 0％ 5％ 6％ 20％ 32％ 110％ 36％ 71％ 76％ 0％
R494A 133％ 0％ 2％ 2％ 12％ 26％ 23％ 111％ 2％ 88％ 94％ 1％
N495A 117％ 25％ 2％ 1％ 35％ 40％ 42％ 102％ 31％ 72％ 72％ 1％
G496A 97％ 58％ 18％ 14％ 18％ 37％ 39％ 96％ 63％ 44％ 99％ 8％
L498A 24％ 4％ 0％ 5％ 0％ 80％ 23％ 6％ 4％ 16％ 31％ 1％
L499A 30％ 0％ 0％ 9％ 6％ 31％ 39％ 30％ 1％ 15％ 57％ 1％
R500A 1％ 4％ 24％ 13％ 24％ 26％ 19％ 1％ 2％ 20％ 6％ 1％
V501A 43％ 0％ 7％ 27％ 0％ 46％ 94％ 25％ 13％ 27％ 48％ 4％
Y502A 3％ 4％ 18％ 37％ 12％ 23％ 42％ 5％ 23％ 20％ 0％ 6％
V503A 62％ 58％ 47％ 36％ 41％ 63％ 55％ 35％ 68％ 27％ 43％ 33％
P504A 53％ 125％ 49％ 56％ 206％ 60％ 55％ 35％ 122％ 26％ 18％ 63％
R505A 36％ 83％ 87％ 95％ 147％ 131％ 123％ 36％ 127％ 23％ 30％ 83％
S506A 114％ 138％ 44％ 55％ 312％ 214％ 104％ 101％ 107％ 55％ 82％ 56％
S507A 119％ 96％ 51％ 100％ 235％ 137％ 97％ 71％ 69％ 83％ 84％ 45％
如表7中显示的，与对WT肽的应答相比，取代I493A，R494A，N495A， L498A，L499A，R500A Y502A，V501A，或Y502A将T细胞应答降低70％或更多。
表8(SEQ ID NO：107)
占WT的％ 1 2 3 4 5 6 7
无肽 0％ 0％ 7％ 0％ 18％ 9％ 1％
wt77 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
G496A 29％ 51％ 123％ 126％ 58％ 112％ 37％
A497G 103％ 68％ 126％ 102％ 108％ 129％ 71％
L498A 61％ 38％ 140％ 7％ 20％ 13％ 43％
L499A 46％ 24％ 61％ 33％ 26％ 73％ 1％
R500A 59％ 31％ 124％ 1％ 16％ 1％ 6％
V501A 7％ 18％ 28％ 18％ 26％ 49％ 15％
Y502A 14％ 1％ 9％ 4％ 25％ 8％ 0％
V503A 17％ 1％ 9％ 15％ 39％ 49％ 1％
P504A 46％ 32％ 41％ 38％ 43％ 12％ 36％
R505A 7％ 1％ 22％ 28％ 24％ 39％ 2％
S506A 68％ 42％ 50％ 107％ 93％ 122％ 48％
S507A 35％ 37％ 224％ 86％ 106％ 96％ 60％
L508A 8％ 0％ 15％ 73％ 99％ 88％ 46％
P509A 10％ 4％ 16％ 87％ 101％ 119％ 72％
G510A 113％ 144％ 210％ 116％ 114％ 114％ 104％
如表8中显示的，与对WT肽的应答相比，取代L498A，L499A，R500A， V501A，Y502A，V503A，R505A，L508A，或P509A将T细胞应答降低70％或更多。
表9(SEQ ID NO：97)
相对于WT的％ 1 2 3 4 5 6 7 9 11 12 13
无肽 0％ 6％ 13％ 1％ 13％ 43％ 26％ 0％ 29％ 47％ 0％
WT67 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
F469A 80％ 11％ 104％ 35％ 97％ 60％ 88％ 53％ 68％ 60％ 81％
Y470A 61％ 6％ 48％ 67％ 29％ 29％ 16％ 15％ 97％ 92％ 68％
I471A 17％ 7％ 20％ 20％ 22％ 25％ 12％ 17％ 43％ 55％ 35％
A472G 37％ 20％ 84％ 75％ 46％ 31％ 19％ 0％ 60％ 76％ 60％
P475A 72％ 73％ 34％ 57％ 15％ 59％ 16％ 60％ 40％ 70％ 38％
A476G 75％ 110％ 207％ 26％ 67％ 47％ 35％ 24％ 122％ 115％ 32％
L477A 54％ 92％ 25％ 42％ 26％ 43％ 16％ 15％ 67％ 71％ 52％
A478G 80％ 96％ 134％ 24％ 63％ 41％ 98％ 33％ 84％ 66％ 58％
Y479A 114％ 250％ 108％ 117％ 71％ 82％ 21％ 58％ 110％ 94％ 138％
如表9中显示的，与对WT肽的应答相比，取代Y470A，I471A，A472G， P475A，A476G，或L477A将T细胞应答降低70％或更多。
表10(SEQ ID NO：81)
相对于WT的％ 1 2 3 4 5 6 7 8
无肽 13％ 14％ 7％ 0％ 1％ 0％ 1％ 2％
WT51 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
R421A 22％ 12％ 26％ 23％ 87％ 2％ 5％ 19％
L422A 31％ 10％ 16％ 29％ 18％ 0％ 1％ 30％
L423A 8％ 10％ 6％ 47％ 21％ 11％ 3％ 7％
A425G 57％ 16％ 68％ 105％ 51％ 4％ 6％ 112％
R427A 37％ 10％ 35％ 78％ 81％ 1％ 2％ 54％
L429A 28％ 19％ 124％ 63％ 64％ 38％ 36％ 163％
E430A 112％ 26％ 99％ 100％ 100％ 242％ 73％ 112％
R432A 65％ 57％ 142％ 105％ 92％ 87％ 69％ 228％
如表10中显示的，与对WT肽的应答相比，取代R421A，L422AL423A， A425G，R427A，或L429A将T细胞应答降低70％或更多。
实施例12
本实施例阐明了如通过参照SEQ ID NO：1限定的取代Y439A，H440A， F443A，L444A，A446G，A447A，I450A，R551A，L552A，T554A，I555A， L556A或W558A降低PE的免疫原性。
合成18聚体肽(GPEEEGGRLETILGWPLA)(SEQ ID NO：198)以包括来自SEQ ID NO：123和124两者的氨基酸残基。合成18聚体肽 (FVGYHGTFLEAAQSIVFG)(SEQ ID NO：199)以包括来自SEQ ID NO：87和 88两者的氨基酸残基。SEQ ID NO：198对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置544-561，且SEQ ID NO：199对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基位置 436-453。用丙氨酸取代SEQ ID NO：198和199中的每个氨基酸。将来自供体和患者的样品用LMB9刺激17天，并使用IL-2ELISpot测定，如实施例3中描述的。表11(SEQ ID NO：198)和表12(SEQ IDNO：199)汇总了来自对取代的肽筛选样品的数据(占对野生型(WT)肽的应答的％)。
表11
相对于WT的％ 1 2 3 4 5 6 7
无肽 9％ 2％ 3％ 4％ 3％ 35％ 25％
WT93-94 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
E547A 18％ 254％ 73％ 120％ 122％ 73％ 106％
E548A 24％ 170％ 58％ 98％ 86％ 102％ 207％
R551A 6％ 2％ 62％ 70％ 42％ 40％ 67％
L552A 44％ 10％ 54％ 35％ 11％ 85％ 51％
T554A 9％ 5％ 77％ 133％ 130％ 110％ 95％
I555A 176％ 119％ 111％ 25％ 15％ 63％ 36％
L556A 235％ 3％ 24％ 10％ 13％ 35％ 83％
W558A 200％ 13％ 20％ 26％ 7％ 46％ 54％
P559A 197％ 208％ 24％ 69％ 37％ 65％ 121％
L560A 321％ 162％ 81％ 132％ 117％ 46％ 138％
如表11中显示的，与对WT肽的应答相比，取代R551A，L552A，T554A， I555A，L556A和W558A将T细胞应答降低70％或更多。
表12
相对于WT的％ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
无肽 0％ 4％ 0％ 0％ 1％ 2％ 10％ 9％ 0％ 1％ 18％
WT57-58 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
F436A 98％ 7％ 57％ 159％ 89％ 67％ 41％ 123％ 103％ 103％ 94％
V437A 78％ 81％ 84％ 130％ 96％ 77％ 102％ 148％ 97％ 95％ 103％
G438A 52％ 79％ 67％ 78％ 118％ 81％ 98％ 68％ 71％ 88％ 97％
Y439A 96％ 17％ 22％ 21％ 125％ 88％ 110％ 154％ 79％ 97％ 111％
H440A 12％ 6％ 11％ 95％ 108％ 80％ 90％ 102％ 46％ 113％ 105％
T442A 84％ 31％ 77％ 151％ 93％ 77％ 59％ 127％ 48％ 102％ 79％
F443A 0％ 7％ 2％ 40％ 1％ 13％ 20％ 7％ 5％ 2％ 17％
L444A 54％ 140％ 69％ 74％ 55％ 11％ 14％ 0％ 9％ 4％ 32％
A446G 40％ 119％ 80％ 47％ 107％ 97％ 69％ 16％ 80％ 37％ 120％
A447G 104％ 103％ 65％ 57％ 118％ 73％ 43％ 7％ 19％ 28％ 98％
S449A 126％ 104％ 98％ 93％ 128％ 116％ 163％ 200％ 23％ 65％ 87％
I450A 159％ 124％ 138％ 130％ 108％ 42％ 31％ 11％ 2％ 66％ 20％
V451A 127％ 121％ 119％ 162％ 142％ 94％ 137％ 50％ 82％ 117％ 119％
F452A 126％ 156％ 119％ 154％ 103％ 169％ 104％ 123％ 99％ 104％ 116％
如表12中显示的，与对WT肽的应答相比，取代Y439A，H440A，F443A，L444A，A446G，A447A，或I450A将T细胞应答降低70％或更多。
实施例13
本实施例阐明PE中T细胞表位的鉴定。
基于实施例4-12中获得的结果，表13中列出的氨基酸序列鉴定为PE的T 细胞表位。
表13
SEQ ID NO： 参照SEQ ID NO：1的氨基酸残基 序列
200 276-287 RQPRGWEQLEQC
3 294-305 LVALYLAARLSW
193 421-432 RLLQAHRQLEER
199 436-453 FVGYHGTFLEAAQSIVFG
192 469-480 FYIAGDPALAYG
201 493-510 IRNGALLRVYVPRSSLPG
202 547-560 EEGGRLETILGWPL
实施例14-16
使用以下材料和方法进行实施例14-16：
患者的全血样品收集、贮存、和RNA分离：从6名用重组免疫毒素(RIT) 治疗的患者获得血液样品。将2.5ml血液样品在含有阳离子型去污剂和加成盐的PAXGENE管(PreAnalytiX GmbH，Hombrechtikon，Switzerland)中收集，通过将管温和翻转4-6次彻底混合，并于室温温育10小时，然后于-80℃贮存。使用PAXGENE血液RNA试剂盒(PreAnalytiX)依照制造商的说明书将来自患者全血样品的胞内RNA纯化，并于-80℃贮存。
重链和轻链cDNA合成、PCR扩增和ScFv基因的装配：将限制酶位点或载体接头与一些引物连接(表15)。将重链全集和轻链全集分开制备，并用接头连接以提供ScFv形成。从具有IgG的成熟B淋巴细胞制备重链全集。用IgG 恒定区引物：HuIgG1-4CH1FOR(表15)通过使用第一链cDNA合成试剂盒(GE Healthcare，NJ)实施第一链cDNA合成。使用κ恒定区引物：HuGκFOR(表15) 从Vκ基因制备轻链全集。将40pmol引物添加入15μl反应混合物中以进行cDNA合成。
使用第一链cDNA合成产生通过三步方法分开扩增VH和Vκ基因。在第一步PCR时使用IgG恒定区引物：HuIgG1-4CH1FOR和合适的基于家族的人VH后引物(表15)的等摩尔混合物以覆盖来自患者全血样品的胞内RNA的VH基因。对Vκ基因使用κ恒定区引物：HuGκFOR和合适的基于家族的人Vκ后引物 (表15)。在具有10pmol每种引物的终体积50μl反应混合物中使用高保真性聚合酶PHUSION(New England Biolabs，IpSWich，MA)依照制造商的推荐实施第一步PCR。
用10pmol每种引物依照制造商的推荐使用高保真性聚合酶PRIMESTAR (Takara，Kyoto，Japan)进行第二步PCR、重叠延伸剪接(Splicing by Overlapping Extension，SOE)PCR、和最后一步以制备***物。将包含NcoI位点(加下划线) 的序列5’-GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3’(SEQ ID NO：185)与人VH后引物连接以得到人VH后nco引物(表15)。使用pCANTAB载体来构建噬菌体文库。将包含pCANTAB接头的序列5’-ACC TCC AGA TCC GCC ACC ACCGGA TCC GCC TCC GCC-3’(SEQ ID NO：186)与人JH正向引物连接以得到人JH正向接头引物。在第二次PCR中使用人VH后nco引物和人JH正向接头引物以在VH基因后面添加Nco I位点及在VH基因前添加pCANTAB接头。
在用于扩增Vκ基因的第二步，将包含pCANTAB接头的序列5’-GGA TCC GGT GGTGGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC-3’(SEQ ID NO：187) 与人Vκ后引物连接以得到人Vκ后接头引物。将包含NotI位点(加双下划线)的序列5’-GAG TCA TTC TCG ACT T
Figure BDA0000464690400000521
3’(SEQ ID NO：184)与人 Jκ正向引物连接以得到人Jκ正向Not引物。在第二次PCR时使用人Vκ后引物和人Jκ正向引物以在Vκ前添加Not I位点及Vκ基因后添加pCANTAB接头。
分别使用(a)人VH后Nco引物和R’接头的pCANTAB接头引物的引物对 (表15)(对于VH基因)，和(b)人Jκ正向not引物和F’接头的pCANTAB接头引物的引物对(表15)(对于Vκ基因)在第三步制备VH和Vκ基因。
在第三步使用的R’接头和F’接头的引物是互补引物。使用SOE-PCR，组合VH和Vκ基因以提供ScFv形成。最后，使用VHIgGFOR和VLREV引物(表15) 扩增ScFv文库c段以制备***物。
噬菌体文库构建：将扩增的ScFv片段用NcoI和NotI消化，并使用T4连接酶亚克隆入用相同酶消化的pCANTAB5E中以构建ScFv文库。通过用 QIAQUICK旋转柱(Qiagen，Valencia，CA)提取纯化连接溶液，并在水中重悬。所得的浓度是约50ng／ml。通过使用基因脉冲仪和脉冲控制器单元(Bio-Rad Laboratories)将4μl样品电穿孔到50μl TG1电感受态细胞(Lucigen，WI)中，并且对于较大大小的文库，重复6次。将细胞在6ml SOC(Invitrogen，Carlsbad， CA)中于37℃在以约250rpm摇动的情况中温育1小时。将20μl样品收集，稀释，并在TYE氨苄青霉素板上铺板以计算文库大小。添加具有200μg／ml氨苄青霉素和4％葡萄糖的6ml量的2YT培养基，并再温育1小时。将培养基用具有100 mg／ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2YT培养基补足至200ml。将细胞生长至 OD600=0.4，并在静置30分钟后在以250rpm摇动的情况中用1011pfuM13K07 辅助噬菌体(New England Biolaboratories)感染30分钟。将细胞在GSA转子中以5,000rpm收集5分钟，并在具有100μg／ml氨苄青霉素和50μg／ml卡那霉素的100ml量的2YT培养基中于30℃在以250rpm摇动的情况中重悬过夜。
将噬菌体用1／5体积的PEG／NaCl(20％聚乙二醇6000，2.5M NaCl)从上清液沉淀，并用2YT培养基重悬。通过产生10μl噬菌体的连续稀释液，并添加 90μl TG1细胞(OD600=0.4)，在补充100μg／ml Amp和1％葡萄糖的LB琼脂上铺板确定噬菌体文库的滴度。在过夜生长后确定菌落的数目，并计算滴度。
噬菌体文库淘选：使用LMB-9(B3(dsFv)-PE38，对LewisY抗原特异性) 作为噬菌体文库淘选的抗原。将LMB9使用EZ-Link sulfo-NHS-生物素 (Thermo Scientific，Rockford，IL)以摩尔比50：1生物素化，并使用生物素定量试剂盒(Thermo Scientific，Rockford，IL)依照制造商的说明书确定每个LMB9- 生物素上的生物素基团的数目。将350ml噬菌体和链霉抗生物素蛋白修饰的磁珠(DYNABEADS MYONE链霉抗生物素蛋白T1，直径1μm，生物素化Ig结合性能40-50μg mg-1，疏水性，甲苯磺酰基(tosyl)活化的珠(Invitrogen))在3％ BSA／PBST(0.1％Tween-20)中预封闭。对噬菌体施以用珠去选择(de-selection)。
使用磁性架从液相分离珠，使珠沿着管侧被固定化。将封闭缓冲液除去，并将珠在噬菌体溶液中重悬，并于室温在转子上温育30分钟。将噬菌体溶液移动到具有预封闭的珠的另一个管以进行再次去选择。将去选择用1mg珠重复两次并用2mg珠重复一次。将噬菌体移动到预封闭的管，并添加生物素化的LMB9-生物素抗原以容许与10μg(对于第一轮)和5μg(对于后续轮次)量的 LMB9-生物素形成噬菌体-抗原-生物素复合物。将反应溶液于室温在转子上温育2小时，并移动至具有2mg珠的管，在转子上再温育45分钟。将上清液除去，并通过使用PBST将珠清洗12次。通过添加1μl量的0.1M冷HC1从珠释放噬菌体，并用200μl Tris-HCl溶液(pH8.0)中和pH。这是淘选的输出，并且将其挽救(rescue)以进行额外的淘选轮次，并计算滴度。使用0.6μl量的输出噬菌体感染5ml TG1(OD600=0.4)以进行挽救。
噬菌体ELISA和噬菌体克隆测序：在3或4轮淘选和噬菌体挽救后，选择来自最终淘选轮次的198个单一克隆以进一步分析。将信号克隆于37℃在以 250rpm摇动的情况中移至具有150μl2YT培养基(100μg／ml氨苄青霉素，2％葡萄糖)的圆底96孔板达4小时，并将50μl2YT培养基(100μg／ml氨苄青霉素，2％葡萄糖)中的108pfu M13K07辅助噬菌体在静置30分钟后在以250rpm摇动的情况中添加至孔中达30分钟。通过2700rpm持续10分钟对96孔板收集具有***物的细胞，并在具有100μg／ml氨苄青霉素和50μ/ml卡那霉素的200μl量的2YT培养基中于30℃在以250rpm摇动的情况中重悬过夜。将沉淀用100μl具有 100μg／ml氨苄青霉素、2％葡萄糖、和30％甘油的2YT培养基重悬，并于-80℃贮存(对于储液)。通过2700rpm持续10分钟将噬菌体从上清液沉淀以进行噬菌体ELISA。将96孔平底NUINC MAXISORP板(NuncUSA，Rochester,NY)于4 ℃用LMB9(PBS中的5μg／ml)包被过夜。将板清洗，并用2％脱脂乳(Cell Signaling)封闭。添加具有噬菌体(50μl)和2％乳(50μl)的上清液，并于室温温育1小时。将板用PBST清洗3次，并于室温添加缀合有过氧化物酶的抗M13 (1：1000，GEHealthcare，Waukesha，WI)达1小时。将板用磷酸盐缓冲盐水和 Tween20(PBST)清洗3次，并添加3，3’，5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物(Thermo Scientific，Rockford，IL)达15分钟。在分光光度计中以450nm阅读结果以确定阳性和阴性克隆。挑出阳性克隆，用于从储液板的合适孔进行小规模噬菌体分离，并通过使用BIGDYE Terminator v1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)实施测序。将具有相同序列的克隆移出，并将所得的序列与IMGT／V-Quest(www.imgt.org／IMGT_vquest/vquest)比对。
竞争ICC-ELISA：以20ml规模培养用上文提及的方法产生噬菌体-抗体。用ELISA确定噬菌体-抗体的稀释。将2％脱脂乳中1μg／ml SS1P抗体50μl／孔添加至ELISA板，所述ELISA板于4℃以PBS中4μg／ml的浓度在50μl／孔的量中用 rFc-间皮素过夜包被。将板用PBST清洗3次；添加各个稀释的噬菌体-抗体，并通过使用缀合有HRP的抗M13和TMB底物检测。通过稀释曲线确定噬菌体 -抗体的稀释，并且期望的A450设置为约1.0。通过使用患者血清、没有Fv的 PE38、或PE38中的信号突变进行竞争ICC-ELISA测定法以确定PE38抗原的噬菌体-抗体结合表位。将噬菌体-抗体与单一突变体的连续稀释液于4℃混合过夜，并添加至SSlP-rFc-间皮素组合ELISA板。单一突变体对噬菌体-抗体对SSlP的结合的竞争如下确定，即使用缀合有HRP的抗M13来测量噬菌体- 抗体的剩余结合。相对于对其中的PE38缺乏取代的HA22-LR的结合标准化竞争效应。
血清抗原性：在置换测定法中分析HA22或取代的HA22对人血清中的抗体的结合。在方案10C0066下获得人血清。将间皮素-rFc添加至ELISA板(50μl PBS／孔中100ng)，并于4℃温育过夜。在清洗后，将抗间皮素／SS1P(50μl封闭缓冲液／孔中的100ng)添加1小时以捕捉未结合的人抗PE38抗体。在分开的管中，将血清(97至30658倍稀释)与2μg／ml HA22或取代的HA22混合，并于4℃温育过夜。在清洗板后，将50μl免疫毒素-抗体混合物转移至每个孔。不结合 HA22或取代的HA22的人抗体被SSlP捕捉，并且通过缀合有HRP的兔抗人 IgG Fc(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)，接着用TMB 底物试剂盒(Thermo Scientific Inc.，Waltham，MA)检测。通过SoftMaxPro4.0 (Molecular Devices)使用四参数logistic曲线模型拟合结合曲线。IC50值指示抑制50％抗体与SSlP的反应性的RIT浓度。
统计学：使用Mann-Whitney非参数方法；认为p<0.05是统计学显著的。
实施例14
本实施例阐明了对PE38特异性的人ScFv的分离和测序。
从用含有PE38的不同重组免疫毒素(RIT)治疗的6名患者获得血液样品 (表14)。使用PAXGENE血液RNA试剂盒(PreAnalytiX GmbH，Hombrechtikon， Switzerland)从血液样品分离RNA。在合适恒定区的情况中使用引物从RNA 合成第一链cDNA(表15)。通过使用第一链cDNA作为模板获得VH和Vκ cDNA的正确大小的单一条带。在三个步骤中个别扩增VH和VL片段。将限制酶位点和接头添加至片段中。将100ng VH和VL片段在重叠延伸剪接聚合酶链式反应(SOE-PCR)中组合，以形成scFv。将scFv片段用Nco I和Not I消化，并亚克隆入用相同的酶消化的pCANTAB5E中以构建scFv文库。
表14
Figure BDA0000464690400000551
表15
Figure BDA0000464690400000561
Figure BDA0000464690400000571
Figure BDA0000464690400000581
使用生物素化的免疫毒素LMB-9(B3-Fv-PE38)作为抗原用于选择表达结合PE38的Fv的噬菌体。每个LMB-9分子含有6个生物素。通过电穿孔入含有7.3x107-1.27x108VH-VLscFv克隆的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli.) TG1中获得6个人抗体文库(表15)。通过用辅助噬菌体进行超感染挽救噬菌体文库(表15)，并且350ml每种文库获得噬菌体表面上展示的约7x1012个scFv 片段。
获得710个含有Fv的噬菌体克隆并测序。测序揭示了除了具有相同轻链序列的2个克隆外，存在有103个独特的人重链和人kappa轻链序列。为了显示Fv源自产生抗免疫毒素抗体的B细胞，实施竞争研究，并且其显示了免疫抗血清阻断噬菌体对LMB-9的PE38部分的结合，并且克隆无一结合免疫毒素的Fv部分。然后，使用ICC-ELISA测量结合强度。47个克隆具有较弱的结合，并且不进一步研究。使用其它56个克隆来测定PE38中的人特异性表位。
实施例15
本实施例阐明人B细胞表位的位置。
LMB-9含有PE的域II和III两者。为了鉴定仅结合III域的噬菌体，测量每个克隆对HA22-LR(其仅具有域III并且缺乏域II)的结合。56个噬菌体克隆中的15个不能结合HA22-LR，指示由这15种噬菌体克隆识别的表位位于域II上。使用剩余的41个噬菌体克隆来鉴定构成域III中的B细胞表位的残基，这通过测量其对取代的蛋白质的结合进行，其中蛋白质的域III表面上的个别氨基酸从较大体积的氨基酸改变为丙氨酸或甘氨酸。这些取代消除牵涉抗体识别和结合的较大体积的侧链。图10中显示了数据，其中黑色单元中显示具有较差结合(<10％)的克隆，并且用空白单元显示具有正常反应性的取代的蛋白质。结果显示了单处取代降低许多克隆的结合，由此指示它们在相同表位组中。
表16中显示了在被取代时将对各种表位的噬菌体结合降低>90％的残基的位置。表16中显示了与每个人(H1，H2，H3，H4，H5和H6)和小鼠(2c，4a，4b，5，6a，6b，和7)表位有关的氨基酸。人表位H1含有D403、R427、和E431。 R427和E431属于小鼠表位4a，并且这些残基牵涉小鼠和人抗体结合两者。人表位H2含有残基R467和D463(其属于小鼠表位2c)和E548(其属于小鼠表位 6a)。Y481，L516，E522，和R551是人特异性表位。人H3表位仅含有属于小鼠表位4b的R458。人表位H4含有R432和R505。R432属于小鼠表位4a，而R505 是人特异性残基。人表位H5由R490和R576(其属于小鼠表位5)构成。人表位 H6包含R538。R538属于小鼠表位2c。D406，R412，R513，L597，Q592和 K590是小鼠特异性表位，并且不牵涉人表位结合。
表16
人表位
H1 D403，R427，E431
H2 R551，E548，L516，E522，D463，D461，Y481，R467
H3 R458
H4 R505，R432
H5 R490，R576
H6 R538
小鼠表位
2c D463，R467，R538
4a R427，E431，R432
4b R406，R458
5 R412，R490，R576
6a L597，R513，E548
6b Q592
7 K590
与表位H1起反应的噬菌体克隆受到残基D403，R427，和E431处的取代影响。用丙氨酸取代这些残基中任一个极大地影响识别表位的多个噬菌体的结合(图10)。如对构成表位的取代预期的，这些残基在域III上是空间相邻的。表位H2是复杂的。与表位H2起反应的噬菌体受到8个残基处的取代影响。用丙氨酸取代R467破坏限定表位H2的8个噬菌体之6个的结合。取代残基D463 阻止4个噬菌体的结合，取代Y481阻止3个噬菌体的结合，取代R551阻止2个噬菌体的结合，而取代残基D461，L516，E522，或E548阻止1个噬菌体的结合。在结构上，这些残基位于有限的区域中，并且构成簇。2个结合R458的噬菌体识别表位H3。11个噬菌体识别表位H4，并且结合受到R505A取代破坏。 R432(其接近R505)处的取代影响11个噬菌体中1个的结合。4个噬菌体识别表位H5。对所有4个的结合受到R490处取代影响，而R576处取代影响4个噬菌体中3个的结合。这些残基在域III上是空间相邻的，即使它们在序列上以86 个氨基酸分开。R538处的取代消除2个噬菌体中1个的结合。总之，用丙氨酸取代高度暴露的表面残基鉴定结合与域III结合的噬菌体的残基，这显示了表位位于域III表面上截然不同的位点。
实施例16
本实施例阐明了人用低抗原性重组免疫毒素(RIT)的产生。
使用牵涉结合人抗血清的个别残基的鉴定来设计并构建具有取代的免疫毒素，所述取代消除与人抗血清的反应性，但保留细胞毒性活性，并且可以以足以有用的量产生。在大多数情况中，用丙氨酸替换残基，因为其较小的侧链与抗体起反应较差，并且它通常不影响蛋白质折叠。也使用丝氨酸来实质性避免特别疏水的表面。
基于表位定位研究中的信息，将选自破坏人Fv对HA22-LR的域III的结合的不同氨基酸的取代进行组合。下文表17中显示了取代。LR05具有 HA22-LR-8M中存在的所有取代和4处新取代，LR06仅具有来自 HA22-LR-8M的2处取代和4处新取代，而LO10与LR06一样，但是具有额外的463A取代(表17)。
表17
Figure BDA0000464690400000601
表18
Figure BDA0000464690400000611
将取代的蛋白质表达并纯化。SDS凝胶分析显示了取代的蛋白质是超过 95％同质的。然后，对纯化的蛋白质分析对几种CD22阳性细胞系的细胞毒性活性以及就其结合患者血清中存在的抗体的能力而言分析抗原性，所述患者已经产生针对含有PE38的免疫毒素的中和性抗体。分析25份来自已经接受几种不同免疫毒素(LMB-9、SS1P和HA22)的患者的血清。
表19中的数据显示了所有3种新免疫毒素以1ng／ml左右的IC50对CD22阳性淋巴瘤系有活性，但是比HA22-LR的活性小。最有活性的是HA22-LO10，其对Daudi细胞有HA22-LR活性的60％，对Raji细胞有活性的27％，而对CA46 细胞有活性的29％。这些新的免疫毒素是CD22特异性的，并且对不表达CD22 的A431细胞没有活性(表19)。
表19
Figure BDA0000464690400000612
抗原性定义为免疫原对现有抗体的结合。为了评估取代的HA22-LO与人患者血清的抗原性，实施竞争实验，其中测量每种取代的免疫毒素的如下浓度，该浓度将与HA22起反应的抗体水平降低50％。图11A和11B中显示了用两份患者血清得到的典型竞争结果。图11A显示了对PE38的结合被抑制50％的 HA22，HA22-LR，HA22-LO5，HA22-LO6，HA22-LR-8M，和HA22-LO10 浓度(IC50)分别是84.8，38.1，4580，1440，3610，>396000nM。HA22与HA22-LR，HA22-LO5，HA22-LO6，HA22-LR-8M，和HA22-LO10的结合(IC50)比分别是223，1.85，5.89，2.35，和<0.0214％。图11B显示了对PE38的结合被抑制50％的HA22，HA22-LR，HA22-LO5，HA22-LO6，HA22-LR-8M，和HA22-LO10 浓度(IC50)分别是50.9，67700，>396000，>396000，>396000，>396000nM。 HA22与HA22-LR，HA22-LO5，HA22-LO6，HA22-LR-8M，和HA22-LO10 的结合(IC50)比是0.752，<0.0129，<0.0129，<0.0129，和<0.0129％。
分析来自32名患者的总体血清，所述患者用含有PE38的免疫毒素SSlP， HA22，和LMB9治疗超过10年。表20中显示了使用取代的免疫毒素的结合率。发现了与HA22，HA22-LR，和HA22-LR8M相比，HA22-LR-LO10与人血清的抗原性是实质性降低的。图12的图显示了在使用PE38治疗的患者血清中抗体对HA22，HA22-LR-8M，HA22-LRLO10，或HA22-LR-LO10R的百分比结合。HA22-LR-LO10R与HA22-LO10相似，只是HA22-LR-LO10R缺乏 HA22-LO10中存在的R458A取代(表17和18)。图12显示了32名患者中的23名呈现降低超过100倍(100-10000倍)的结合(抗原性)。仅在32名患者的4名中，不能检出抗原性的降低。
表20
Figure BDA0000464690400000621
Figure BDA0000464690400000631
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此通过提述并入，其程度就像每篇参考文献个别且明确指定通过提提述并入并在本文中完整列出一样。
在描述本发明的语境中(尤其是在所附权利要求书的语境中)使用术语“一个／种”和“该／所述”及类似指示物应该解释为覆盖单数和复数两者，除非本文中另有指示或者上下文明显冲突。术语“包含”、“具有”、“包括”、和“含有”应当解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)，除非另有记录。本文中数值范围的叙述仅仅意图充当个别提及落入所述范围内的每个不同数值的速记方法，除非本文中另有指示，并且每个不同数值并入说明书中，就像其在本文中个别叙述一样。本文中描述的所有方法可以以任何合适的次序实施，除非本文中另有指示或者上下文另有明显冲突。本文中提供的任何和所有例子、或例示性语言(例如“诸如”)的使用仅仅意图更好地例示本发明，而并不对本发明的范围造成限制，除非另有要求。说明书中的没有文字应当解释为指示任何非要求保护的要素为实施本发明必需的。
本文中描述了本发明的优选实施方案，包括发明人所知实施本发明的最佳模式。那些优选实施方案的变型在阅读上述描述后对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。发明人预期熟练技术人员在适当时采用此类变型，并且发明人意图本发明以与本文中的明确描述不同的方式实施。因而，本发明包括所附权利要求书中叙述的主题的所有修改和等同方案，如由适用法律容许的。此外，其所有可能变型中的上文描述的要素的任何组合是本发明涵盖的，除非本文中另有指示或者上下文另有明显冲突。
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Claims (18)

1.假单胞菌外毒素A(PE)，其氨基酸序列具有氨基酸残基的取代和缺失，其中所述缺失是如通过参照SEQ ID NO:1限定的氨基酸残基1-273和285-394的缺失，并且所述氨基酸残基的取代由以下组成:
(i)(a)丙氨酸对氨基酸残基R427的取代；
(b)丙氨酸对氨基酸残基R458的取代；
(c)丙氨酸对氨基酸残基R467的取代；
(d)丙氨酸对氨基酸残基R490的取代；
(e)丙氨酸对氨基酸残基R505的取代；
(f)丙氨酸对氨基酸残基R538的取代；和
(g)丙氨酸对氨基酸残基D463的取代，或
(ii)(a)丙氨酸对氨基酸残基R427的取代；
(b)丙氨酸对氨基酸残基R467的取代；
(c)丙氨酸对氨基酸残基R490的取代；
(d)丙氨酸对氨基酸残基R505的取代；
(e)丙氨酸对氨基酸残基R538的取代；和
(f)丙氨酸对氨基酸残基D463的取代，
其中参照SEQ ID NO:1限定氨基酸残基D463，R427，R458，R467，R490，R505和R538。
2.嵌合分子，其包含缀合或融合的(a)靶向模块和(b)权利要求1的PE。
3.权利要求2的嵌合分子，其中所述靶向模块是单克隆抗体。
4.权利要求3的嵌合分子，其中所述单克隆抗体特异性结合选自下组的细胞表面标志物：CD19，CD21，CD22，CD25，CD30，CD33，CD79b，转铁蛋白受体、EGF受体、间皮素(mesothelin)、钙粘着蛋白、和Lewis Y。
5.权利要求2的嵌合分子，其中所述靶向模块是选自下组的抗体及其抗原结合部分：B3，RFB4，SS，SS1，MN，MB，HN1，HN2，HB21，MORAb-009，HA22。
6.权利要求2的嵌合分子，其中所述靶向模块是HA22的抗原结合部分。
7.核酸，其包含编码权利要求1的PE的核苷酸序列。
8.重组表达载体，其包含权利要求7的核酸。
9.宿主细胞，其包含权利要求8的重组表达载体。
10.细胞群体，其包含至少一种权利要求9的宿主细胞。
11.药物组合物，其包含(a)权利要求1的PE和(b)药学可接受的载体。
12.权利要求1的PE在制造用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的药物中的用途。
13.权利要求1的PE在制造用于抑制靶细胞生长的药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述靶细胞是癌细胞。
15.权利要求13的用途，其中所述靶细胞表达选自下组的细胞表面标志物：CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮素、钙粘着蛋白、和Lewis Y。
16.产生权利要求1的PE的方法，其包括(a)重组表达所述PE，和(b)纯化所述PE。
17.产生权利要求2的嵌合分子的方法，其包括(a)重组表达所述嵌合分子，和(b)纯化所述嵌合分子。
18.产生权利要求2的嵌合分子的方法，其包括(a)重组表达权利要求1的PE，(b)纯化所述PE，和(c)将靶向模块与纯化的PE共价连接。
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