KR20140022836A - 혈액 악성종양에 대한 조합 요법 - Google Patents

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마이클 갈라틴
로저 지. 울리치
네일 에이. 기에세
브라이언 란뉴티
알버트 유
랭돈 밀러
토마스 엠. 잔
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길리아드 칼리스토가 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 혈액 악성종양 및 염증성 질환의 치료를 위한 신규 치료 전략과 관련된 방법을 제공한다. 특히, 방법은 하기 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의로 제약상 허용되는 부형제; 및 벤다무스틴, 리툭시맙 및 오파투무맙으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 하나 이상의 추가의 치료제의 투여를 포함한다.
<화학식 A>
Figure pct00063

상기 식에서, R은 H, 할로 또는 C1-C6 알킬이고; R'은 C1-C6 알킬이다.
[대표도]
도 40

Description

혈액 악성종양에 대한 조합 요법 {COMBINATION THERAPIES FOR HEMATOLOGIC MALIGNANCIES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2011년 3월 11일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/452,034 및 2011년 6월 3일에 출원된 61/493,317을 우선권 주장하며, 이들은 둘 다 그 전문이 참고로 포함된다.
기술 분야
본원은 치료제 및 의약 화학의 분야이다. 특히, 본원은 혈액 악성종양 및 특정의 다른 상태를 치료하기 위한 다른 치유적 치료와 조합된 특정 퀴나졸린 유도체의 사용에 관한 것이다.
3'-인산화된 포스포이노시티드를 통한 세포 신호전달은 다양한 세포 과정, 예를 들어 악성 형질전환, 성장 인자 신호전달, 염증 및 면역과 관련된다. 이들 인산화된 신호전달 산물을 생성하는 효소인 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI 3-키나제; PI3K)는 원래 포스파티딜이노시톨 (PI) 및 이노시톨 고리의 3'-히드록실에서 인산화된 그의 유도체를 인산화하는, 바이러스 종양단백질 및 성장 인자 수용체 티로신 키나제와 관련된 활성으로서 확인되었다.
PI 3-키나제 활성화는 세포 성장, 분화 및 아폽토시스를 포함하는 소정 범위의 세포 반응에 관련되는 것으로 여겨진다.
PI 3-키나제의 초기 정제 및 분자 클로닝에서, PI 3-키나제는 p85 및 p110 서브유닛으로 이루어진 이종이량체임이 밝혀졌다. 각각 특징적인 110 kDa 촉매 서브유닛 및 조절 서브유닛으로 이루어진, PI3K α, β, δ 및 γ로 명명된 4종의 특징적인 클래스 I PI3K가 확인되었다. 보다 구체적으로, 촉매 서브유닛 중 3종, 즉 p110α, p110β 및 p110δ는 각각 동일한 조절 서브유닛, p85와 상호작용하는 반면, p110γ는 특징적인 조절 서브유닛, p101과 상호작용한다. 인간 세포 및 조직에서의 이들 PI3K 각각의 발현 패턴도 또한 특징적이다.
PI 3-키나제의 p110δ 이소형의 확인이 문헌 [Chantry et al., J Biol Chem, 272:19236-41 (1997)]에 기재되어 있다. 인간 p110δ 이소형이 조직-제한된 방식으로 발현되는 것이 관찰되었다. 이것은 림프구 및 림프성 조직에서 높은 수준으로 발현되며, 이는 이러한 단백질이 면역계의 PI 3-키나제-매개 신호전달에서 소정의 역할을 수행할 수 있다는 것을 제안한다. PI3K의 p110β 이소형은 또한 특정 암에서 PI3K-매개 신호전달에서 소정의 역할을 수행할 수 있다.
암, 염증성 질환 및 자가면역 질환과 관련된 PI3K-매개 장애에 대한 치료가 요구된다. 특히, 혈액 악성종양인 암, 예컨대 백혈병 및 림프종의 치료가 요구된다.
만성 림프구성 백혈병 (CLL)에 대한 기존의 화학면역요법 접근법은 악성 림프구의 증식을 감소시키고 아폽토시스를 증진시킬 수 있으나; 이러한 유익한 효과는 기존의 약물이 이러한 부위에 효과적으로 침투할 수 없고 비-악성 기질 세포가 악성 림프구에 대한 지원을 제공하기 때문에 림프절에서 제한될 수 있다.
CLL에 대한 기존의 화학요법 또는 면역요법은 시클로포스파미드, 클로람부실, 플루다라빈, 리툭시맙, 알렘투주맙 및 오파투무맙을 포함한다. 이러한 요법은 순환성 악성 림프구를 사멸시키는데 특히 효과적이지만, 악성 림프절병증을 감소시키는데는 덜 효과적일 수 있다. 또한, 이러한 요법은 림프구 재분포를 유도하지 않거나 림프구증가증을 유발한다.
CLL을 앓는 환자를 치료하는 분야에서 요구되는 것은 림프구와 기질 세포 사이의 화학주성 신호전달을 조절할 수 있는 치료이다. 또한, 요구되는 것은 악성 림프구를 림프절로부터 순환계로 재분포시키는 이러한 신호전달을 감소시킬 수 있는 치료이다. 이러한 재분포는 화학요법제 또는 면역요법제에 의한 이러한 세포의 보다 우수한 사멸을 허용할 것이다.
본원은 이들 화합물을 암, 염증성 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 다른 화학요법 또는 면역요법과 조합하여 사용하기 위한 방법을 제공함으로써 당업계의 요구를 만족시킨다. 특히, 혈액 악성종양인 암, 예컨대 백혈병 및 림프종이 본원에 기재된 방법에 의해 치료된다.
한 측면에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게
유효량의 하기 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
<화학식 A>
Figure pct00001
(상기 식에서, R은 H, 할로 또는 C1-C6 알킬이고; R'은 C1-C6 알킬임)
임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
벤다무스틴, 리툭시맙 및 오파투무맙으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 하나 이상의 추가의 치료제
를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식 I"의 화합물이다.
<화학식 I">
Figure pct00002
또 다른 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식 II"의 화합물이다.
<화학식 II">
Figure pct00003
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 혈액 악성종양이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 혈액 악성종양은 B-세포 악성종양이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 혈액 악성종양은 백혈병 또는 림프종이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 암은 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 비-호지킨 림프종 (NHL)이다.
일부 실시양태에서, 암은 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)이다.
다른 실시양태에서, 화합물 및 하나 이상의 치료제는 각각 적어도 하나의 사이클 동안 적어도 1회 투여되고, 하나 이상의 치료제는 대상체에게 화합물의 투여와 동일하거나 상이한 사이클에서 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 사이클은 7 내지 42일이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 하나 이상의 치료제는 대상체에게 적어도 하나의 사이클의 적어도 제1일 및 제2일에 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 하나 이상의 치료제는 대상체에게 적어도 하나의 사이클 동안 매주 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 50 mg 내지 200 mg의 화합물이 대상체에게 1일 2회 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 50 내지 1,500 mg/㎡의 하나 이상의 치료제가 대상체에게 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물은 화합물 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 존재한다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 표준 화학요법 치료에 저항성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 적어도 하나의 림프절 비대를 갖는다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 i) 적어도 하나의 화학요법 치료에 불응성이거나, 또는 ii) 화학요법 또는 그의 조합으로의 치료 후에 재발된다.
또 다른 측면에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게
유효량의 하기 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
<화학식 A>
Figure pct00004
(상기 식에서, R은 H, 할로 또는 C1-C6 알킬이고; R'은 C1-C6 알킬임)
임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
벤다무스틴, 리툭시맙, 오파투무맙 및 레날리도미드로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 하나 이상의 추가의 치료제
를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)인 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게
유효량의 하기 화학식 I" 또는 화학식 II"의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및
<화학식 I">
Figure pct00005
<화학식 II">
Figure pct00006
벤다무스틴, 리툭시맙 및 오파투무맙으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 하나 이상의 추가의 치료제
를 투여하는 것을 포함하는, 상기 상태를 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 대상체는 i) 적어도 하나의 화학요법 치료에 불응성이거나, 또는 ii) 화학요법 또는 그의 조합으로의 치료 후에 재발된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 및 하나 이상의 치료제는 각각 적어도 하나의 사이클 동안 적어도 1회 투여되고, 하나 이상의 치료제는 대상체에게 화합물의 투여와 동일하거나 상이한 사이클에서 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 사이클은 7 내지 42일이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 50 mg 내지 200 mg의 화합물이 대상체에게 1일 2회 투여된다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 벤다무스틴이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 벤다무스틴은 대상체에게 적어도 하나의 사이클의 적어도 제1일 및 제2일에 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 벤다무스틴은 적어도 6 사이클 동안 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 벤다무스틴의 각각의 용량은 50 mg/㎡ 내지 150 mg/㎡이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 방법은 대상체에게 리툭시맙을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 리툭시맙은 적어도 6 사이클 동안 각 사이클의 제1일에 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 리툭시맙이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 리툭시맙은 대상체에게 적어도 하나의 사이클 동안 매주 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 리툭시맙의 각각의 용량은 300 mg/㎡ 내지 400 mg/㎡이다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 오파투무맙이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 오파투무맙의 적어도 12회의 용량은 6 사이클에 걸쳐 투여된다.
또 다른 측면에서, 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게
유효량의 하기 화학식 I" 또는 화학식 II"의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및
<화학식 I">
Figure pct00007
<화학식 II">
Figure pct00008
벤다무스틴, 리툭시맙, 오파투무맙 및 레날리도미드로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 하나 이상의 추가의 치료제
를 투여하는 것을 포함하는, 상태를 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 레날리도미드이다.
또 다른 측면에서,
a) B-세포 악성종양을 앓는 대상체를 확인하며, 여기서 대상체는 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®), 카르필조밉 (PR-171), PR-047, 디술피람, 락타시스틴, PS-519, 에포네마이신, 에폭소마이신, 아클라시노마이신, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, 비닐 술폰 트리펩티드 억제제, 리토나비르, PI-083, (+/-)-7-메틸로무랄리드, (-)-7-메틸로무랄리드, 페리포신, 리툭시맙, 실데나필 시트레이트 (비아그라(Viagra)®), CC-5103, 탈리도미드, 에프라투주맙 (hLL2- 항-CD22 인간화 항체), 심바스타틴, 엔자스타우린, 캄파트 1H®, 덱사메타손, DT PACE, 오블리메르센, 안티네오플라스톤 A10, 안티네오플라스톤 AS2 1, 알렘투주맙, 베타 알레틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 히드로클로라이드, PEG화 리포솜 독소루비신 히드로클로라이드, 프레드니손, 프레드니솔론, 클라드리빈, 빈크리스틴 술페이트, 플루다라빈, 필그라스팀, 멜팔란, 재조합 인터페론 알파, 카르무스틴, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 에토포시드, 멜팔란, 돌라스타틴 10, 인듐 In 111 모노클로날 항체 MN-14, 이트륨 Y 90 인간화 에프라투주맙, 항-흉선세포 글로불린, 부술판, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 치료 동종이형 림프구, 이트륨 Y 90 이브리투모맙 티욱세탄, 시롤리무스, 타크롤리무스, 카르보플라틴, 티오테파, 파클리탁셀, 알데스류킨, 재조합 인터페론 알파, 도세탁셀, 이포스파미드, 메스나, 재조합 인터류킨-12, 재조합 인터류킨-11, Bcl-2 패밀리 단백질 억제제 ABT-263, 데니류킨 디프티톡스, 타네스피마이신, 에베롤리무스, 페그필그라스팀, 보리노스타트, 알보시딥, 재조합 flt3 리간드, 재조합 인간 트롬보포이에틴, 림포카인-활성화 킬러 세포, 아미포스틴 3수화물, 아미노캄프토테신, 이리노테칸 히드로클로라이드, 카스포펀진 아세테이트, 클로파라빈, 에포에틴 알파, 넬라라빈, 펜토스타틴, 사르그라모스팀, 비노렐빈 디타르트레이트, WT-1 유사체 펩티드 백신, WT1 126-134 펩티드 백신, 펜레티니드, 익사베필론, 옥살리플라틴, 모노클로날 항체 CD19, 모노클로날 항체 CD20, 오메가-3 지방산, 미톡산트론 히드로클로라이드, 옥트레오티드 아세테이트, 토시투모맙 및 아이오딘 I 131 토시투모맙, 모텍사핀 가돌리늄, 삼산화비소, 티피파르닙, 자가 인간 종양-유래 HSPPC-96, 벨투주맙, 브리오스타틴 1, 항-CD20 모노클로날 항체, 클로람부실, 펜토스타틴, 루밀릭시맙, 아폴리주맙, 항-CD40, 오파투무맙, 템시롤리무스, 벤다무스틴, 퓨린 유사체, 레날리도미드, 알킬화제 및 안트라시클린-함유 요법 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 치료에 저항성이거나 또는 이러한 치료 후에 재발된 것인 단계;
b) B-세포 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게
하기 화학식 I"의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
<화학식 I">
Figure pct00009
임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
벤다무스틴, 리툭시맙, 레날리도미드 및 오파투무맙으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 하나 이상의 추가의 치료제
를 투여하는 단계
를 포함하는, B-세포 장애를 앓는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 대상체는 리툭시맙, 알킬화제, 플루다라빈 및 안트라시클린-함유 요법 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 치료에 불응성이거나 또는 이러한 치료 후에 재발된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 50 mg 내지 200 mg의 화합물이 대상체에게 적어도 하나 이상의 사이클 동안 1일 2회 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 50 mg/㎡ 내지 1,500 mg/㎡의 하나 이상의 추가의 치료제가 대상체에게 적어도 하나 이상의 사이클 동안 적어도 1회 투여되고, 하나 이상의 치료제는 대상체에게 화합물의 투여와 동일하거나 상이한 사이클에서 투여된다.
또 다른 측면에서,
a) B-세포 악성종양을 앓는 대상체를 확인하며, 여기서 대상체는 보르테조밉 (벨케이드®), 카르필조밉 (PR-171), PR-047, 디술피람, 락타시스틴, PS-519, 에포네마이신, 에폭소마이신, 아클라시노마이신, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, 비닐 술폰 트리펩티드 억제제, 리토나비르, PI-083, (+/-)-7-메틸로무랄리드, (-)-7-메틸로무랄리드, 페리포신, 리툭시맙, 실데나필 시트레이트 (비아그라®), CC-5103, 탈리도미드, 에프라투주맙 (hLL2- 항-CD22 인간화 항체), 심바스타틴, 엔자스타우린, 캄파트 1H®, 덱사메타손, DT PACE, 오블리메르센, 안티네오플라스톤 A10, 안티네오플라스톤 AS2 1, 알렘투주맙, 베타 알레틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 히드로클로라이드, PEG화 리포솜 독소루비신 히드로클로라이드, 프레드니손, 프레드니솔론, 클라드리빈, 빈크리스틴 술페이트, 플루다라빈, 필그라스팀, 멜팔란, 재조합 인터페론 알파, 카르무스틴, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 에토포시드, 멜팔란, 돌라스타틴 10, 인듐 In 111 모노클로날 항체 MN-14, 이트륨 Y 90 인간화 에프라투주맙, 항-흉선세포 글로불린, 부술판, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 치료 동종이형 림프구, 이트륨 Y 90 이브리투모맙 티욱세탄, 시롤리무스, 타크롤리무스, 카르보플라틴, 티오테파, 파클리탁셀, 알데스류킨, 재조합 인터페론 알파, 도세탁셀, 이포스파미드, 메스나, 재조합 인터류킨-12, 재조합 인터류킨-11, Bcl-2 패밀리 단백질 억제제 ABT-263, 데니류킨 디프티톡스, 타네스피마이신, 에베롤리무스, 페그필그라스팀, 보리노스타트, 알보시딥, 재조합 flt3 리간드, 재조합 인간 트롬보포이에틴, 림포카인-활성화 킬러 세포, 아미포스틴 3수화물, 아미노캄프토테신, 이리노테칸 히드로클로라이드, 카스포펀진 아세테이트, 클로파라빈, 에포에틴 알파, 넬라라빈, 펜토스타틴, 사르그라모스팀, 비노렐빈 디타르트레이트, WT-1 유사체 펩티드 백신, WT1 126-134 펩티드 백신, 펜레티니드, 익사베필론, 옥살리플라틴, 모노클로날 항체 CD19, 모노클로날 항체 CD20, 오메가-3 지방산, 미톡산트론 히드로클로라이드, 옥트레오티드 아세테이트, 토시투모맙 및 아이오딘 I 131 토시투모맙, 모텍사핀 가돌리늄, 삼산화비소, 티피파르닙, 자가 인간 종양-유래 HSPPC-96, 벨투주맙, 브리오스타틴 1, 항-CD20 모노클로날 항체, 클로람부실, 펜토스타틴, 루밀릭시맙, 아폴리주맙, 항-CD40, 오파투무맙, 템시롤리무스, 벤다무스틴, 퓨린 유사체, 레날리도미드, 알킬화제 및 안트라시클린-함유 요법 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 치료에 저항성이거나 또는 이러한 치료 후에 재발된 것인 단계;
b) B-세포 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게
하기 화학식 I"의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
<화학식 I">
Figure pct00010
임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
벤다무스틴, 리툭시맙, 오파투무맙 및 레날리도미드로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 하나 이상의 추가의 치료제
를 투여하는 단계
를 포함하는, B-세포 장애를 앓는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)의 치료를 필요로 하는 대상체에게
유효량의 하기 화학식 I"의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염;
<화학식 I">
Figure pct00011
임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
벤다무스틴
을 투여하는 것을 포함하는, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 화합물 및 벤다무스틴은 각각 적어도 하나의 사이클 동안 적어도 1회 투여되고, 벤다무스틴은 대상체에게 화합물의 투여와 동일하거나 상이한 사이클에서 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 사이클은 7 내지 42일이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물은 대상체에게 적어도 하나의 사이클 동안 1일 2회 투여되고, 벤다무스틴은 대상체에게 적어도 하나의 사이클의 적어도 제1일 및 제2일에 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 벤다무스틴은 적어도 6 사이클 동안 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물의 용량은 50 mg 내지 200 mg이고, 벤다무스틴의 용량은 50 mg/㎡ 내지 150 mg/㎡이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 방법은 리툭시맙 및 오파투무맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 방법은 리툭시맙, 오파투무맙 및 레날리도미드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)의 치료를 필요로 하는 대상체에게
유효량의 하기 화학식 I"의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염;
<화학식 I">
Figure pct00012
임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
리툭시맙
을 투여하는 것을 포함하는, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)을 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 화합물 및 리툭시맙은 각각 사이클 동안 적어도 1회 투여되고, 리툭시맙은 대상체에게 화합물의 투여와 동일하거나 상이한 사이클에서 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 사이클은 7 내지 42일이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물은 대상체에게 적어도 하나의 사이클 동안 1일 2회 투여되고, 리툭시맙은 대상체에게 적어도 하나의 사이클 동안 매주 투여된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물의 용량은 50 mg 내지 200 mg이고, 리툭시맙의 용량은 300 mg/㎡ 내지 400 mg/㎡이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 방법은 벤다무스틴 및 오파투무맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 방법은 벤다무스틴, 오파투무맙 및 레날리도미드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)의 치료를 필요로 하는 대상체에게
유효량의 하기 화학식 I"의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염;
<화학식 I">
Figure pct00013
임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
레날리도미드
를 투여하는 것을 포함하는, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)을 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 화합물 및 레날리도미드는 각각 사이클 동안 적어도 1회 투여되고, 레날리도미드는 대상체에게 화합물의 투여와 동일하거나 상이한 사이클에서 투여된다.
또 다른 측면에서, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)의 치료를 필요로 하는 대상체에게
유효량의 하기 화학식 I"의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염;
<화학식 I">
Figure pct00014
임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
오파투무맙
을 투여하는 것을 포함하는, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)을 치료하는 방법이 제공된다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물의 용량은 50 mg 내지 200 mg 이고, 오파투무맙의 용량은 200 mg 내지 1500 mg 이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 오파투무맙의 후속 용량과 상이한 오파투무맙의 초기 용량이 투여된다.
도 1은 LB 세포를 사용하여, 화합물 I과 조합된 다양한 농도의 시토카인 IGF-1 및 IL-6의 함수로서 다발성 골수종 (MM) 세포 성장의 그래프 요약을 보여준다.
도 2는 48시간 후의 다양한 농도의 화합물 I, 및 골수 기질 세포 (BMSC)의 존재 또는 부재의 함수로서 다발성 골수종 (MM) 세포의 세포 성장의 그래프 요약을 보여준다.
도 3은 다양한 농도의 화학식 I의 화합물의 함수로서 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포의 아폽토시스의 그래프 요약을 보여준다.
도 4는 여러 상이한 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주에서의 세포 생존율, Akt (Ser473) 인산화의 감소, 및 카스파제 3 활성화에 대한 화합물 I의 효과의 요약 차트를 보여준다.
도 5는 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주의 세포 주기에 대한 화합물 I의 효과의 요약을 보여준다.
도 6은 48시간 및 72시간에서 유방암 T47D 및 HS-578T 세포주에서의 세포 성장에 대한 다양한 농도의 화합물 I의 효과의 그래프 요약을 보여준다.
도 7은 48시간 및 72시간에서 난소 IGROV-1 및 OVCAR-3 세포주에서의 세포 성장에 대한 다양한 농도의 화합물 I의 효과의 그래프 요약을 보여준다.
도 8은 다수의 백혈병 및 림프종 세포주에서의 Akt 인산화에 대한 화합물 I의 효과의 요약을 보여준다.
도 9는 화합물 I의 존재 또는 부재의 함수로서 다양한 조혈암 세포주에서의 Akt 및 pAkt의 SDS-PAGE 영상 및 디스플레이를 보여주며, 이는 화합물 I이 Akt 인산화를 억제한다는 것을 보여준다.
도 10은 다양한 농도의 화학식 I의 화합물의 함수로서 유방암 세포주에서의 아폽토시스성 및 생존 세포 집단의 그래프 요약을 보여주며, 이는 이러한 화합물이 아폽토시스를 유도한다는 것을 입증한다.
도 11은 50, 100 및 200 mg 용량의 화합물 I의 경구 투여 후 12시간에 걸쳐 건강한 인간 대상체의 혈액에서의 상기 화합물의 농도를 보여준다.
도 12는 외투 세포 림프종으로 진단된 인간 환자에서의 28일 (1 사이클)의 화합물 I로의 치료 후의 병변 면적과 치료 전의 병변 면적의 비교를 보여준다.
도 13은 28일 (1 사이클)의 화학식 I의 화합물로의 치료 후 4주 기간에 걸친 환자의 혈액에서의 ALC (절대 림프구 수)를 보여준다.
도 14는 제28일의 투여 (50 mg BID) 후 6시간에 걸친 외투 세포 림프종 (MCL)을 앓고 있는 환자 및 앓고 있지 않은 환자의 혈액에서의 화합물 I의 농도를, 동일한 투여 계획을 사용한 또는 100 mg BID의 화합물 I을 투여한 제7일 (D7)의 정상적인 건강한 지원자의 혈액에서의 농도와 비교하여 보여준다.
도 15는 림프종 및 백혈병 세포주의 패널에서의 PI3K 이소형 발현을 보여준다.
도 16a는 화합물 I에 노출된 백혈병 세포주에서의 세포 생존율 및 아폽토시스 데이터를 보여준다. 도 16b에서, 아넥신 염색은 처리된 세포에서의 아폽토시스 증가를 나타낸다.
도 17A-D는 CLL 환자 세포에서의 상이한 PI3K 이소형 발현의 PAGE 결과를 보여준다.
도 18은 화합물 I의 존재 하에 (A) 카스파제 3 및 (B) PARP 절단의 유도를 보여준다.
도 19는 화합물 I에 대한 노출에 의해 유발된 예후가 불량한 환자로부터의 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포의 아폽토시스 증가를 보여주며, 이는 화합물 I이 약물 저항성 환자에서 효과적이라는 것을 입증한다.
도 20은 화학식 I의 화합물에 대한 노출에 의해 유발된 불응성/재발 환자로부터의 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포의 아폽토시스 증가를 보여준다.
도 21은 화합물 I의 부재 또는 0.1, 1.0, 10 μM의 화합물 I의 존재 하의 포스포-Akt 생산의 결과를 보여준다.
도 22는 호염기구에서의 PI3K 신호전달과 관련된 유동 세포측정법 결과를 보여주며, 이는 자극 없음 (a)과 비교하여 (b) 항-FCεR1 또는 (c) fMLP가 CD63 발현을 증가시킨다는 것을 입증한다.
도 23은 호염기구에서의 화합물 I에 의한 PI3K 억제의 억제를 보여주고, 화합물 I이 p110δ 경로에 의해 유도된 CD63 발현의 억제에 특히 효과적이지만, p110γ 경로에 의해 유도된 발현을 억제하는데 마이크로몰 농도에서 또한 효과적이라는 것을 입증한다.
도 24는 (a) 건강한 지원자에서의 상이한 용량의 화합물 I의 단일 용량 투여, 및 (b) 12시간 기간에 걸쳐 유효 투여량을 유지하는 약동학적 프로파일의 약동학적 데이터를 보여준다.
도 25는 표적을 벗어난 활성을 거의 나타내지 않는, (a) 글루코스 및 (b) 인슐린 수준에 대한 다양한 용량의 화합물 I의 효과를 보여준다.
도 26A는 DLBCL 세포주의 패널에서의 PI3K 이소형 발현을 보여준다.
도 26B는 화합물 I의 존재 또는 부재 하의 DLBCL 세포주에서의 pAkt의 SDS-PAGE 영상을 보여준다.
도 27은 SDS-PAGE에서 ALL 세포주에서의 Akt 및 S6의 인산화에 대한 10 μM 농도의 화합물 I의 효과를 보여준다.
도 28은 일련의 화합물 I 희석물로의 처리 후의 Akt, S6 및 GSK-3β의 인산화의 용량 의존성 감소를 보여준다.
도 29는 cFLIP의 하향조절, 카스파제 3의 절단 및 PARP의 절단에서의 ALL 세포주에 대한 화합물 I의 용량 의존성 효과를 보여준다.
도 30은 a) MM 세포주 및 b) 환자 MM 세포; 및 c) MM.1S 및 LB 세포에서의 p110 델타의 발현을 보여준다.
도 31a는 p110 델타 siRNA (Si) 또는 대조군 siRNA (모의)로 형질감염된 LB 및 INA-6 세포로부터의 p110 델타의 발현을 보여준다.
도 31b는 p110 델타 siRNA (Si) 또는 대조군 siRNA (모의)로의 형질감염 후의 INA-6 세포 성장의 그래프를 보여준다.
도 31c는 48시간 동안 화합물 I과 함께 또는 이들 없이 배양된 생존 세포의 %를 보여준다.
도 31d는 48시간 동안 0 내지 20 μM 농도의 화합물 I과 함께 배양된 후의 생존 MM 세포의 %를 보여준다.
도 31e는 72시간 동안 다양한 농도의 화합물 I과 함께 배양된 후의 건강한 공여자로부터의 생존 말초 혈액 단핵 세포의 %를 보여준다.
도 31f는 120시간 동안 화합물 I (0-5 μM)과 함께 배양된 INA-6 세포로부터의 용해물의 이뮤노블롯팅 결과를 보여준다.
도 32는 a) INA-6 세포를 화합물 I 또는 LY294002와 함께 12시간 동안; b) INA-6 및 MM.1S 세포를 다양한 농도의 화합물 I과 함께 6시간 동안; c) LB 및 INA-6 세포를 화합물 I과 함께 0-6시간 동안 배양한 후의 AKT 및 ERK 발현 프로파일의 이뮤노블롯을 보여준다.
도 33a는 화합물 I로 6시간 동안 처리된 INA-6 및 LB MM 세포 및 LC3 축적의 형광 및 투과 전자 현미경 영상을 보여주고; 화살표는 자가포식소체를 나타낸다.
도 33b는 5 μM의 화합물 I 또는 혈청 고갈로 6시간 동안 처리된 INA-6 세포의 형광 현미경검사 영상을 보여준다.
도 33c는 화합물 I 및 3-MA (3-메틸 아데닌, 공지된 자가포식 억제제)로 처리된 또는 처리되지 않은 INA-6 세포로부터의 LC3 및 베클린-1 단백질 수준의 이뮤노블롯을 보여준다.
도 33d는 100 μM까지의 3-MA로 24시간 동안 처리한 후의 p110δ 양성 LB 세포의 % 성장을 보여준다.
도 34는 다양한 양의 IL-6 또는 IGF-1의 존재 또는 부재 하에 0, 5 및 10 μM의 화합물 I과 공동-배양된 a) LB 또는 b) INA-6 세포의 성장 억제의 수준을 보여준다; 범례: 대조군 배지 (
Figure pct00015
); 5.0 μM (
Figure pct00016
) 또는 10 μM (
Figure pct00017
)의 화합물 I.
도 34c 및 34d는 BMSC의 존재 하에 MM 세포 성장 억제를 보여준다. 34c 단독에 대한 범례: 대조군 배지 (
Figure pct00018
), 화합물 I 2.5 μM (
Figure pct00019
), 5 μM (
Figure pct00020
) 및 10 μM (
Figure pct00021
).
도 34e는 화합물 I 또는 대조군 배지와 함께 48시간 동안 배양된 BMSC로부터의 배양 상청액에서의 IL-6의 이뮤노블롯을 보여준다.
도 34f는 BMSC와 함께 또는 이들 없이 배양된 화합물 I로 처리된 INA-6 세포에서의 AKT 및 ERK 발현 프로파일의 이뮤노블롯을 보여준다.
도 34g는 48시간 동안 화합물 I과 함께 배양한 후의 2명의 상이한 환자에서의 % BMSC 세포 성장을 보여준다.
도 35a는 0, 1 및 10 μM의 화합물 I과 함께 8시간 동안 배양된 HuVEC (인간 제대 정맥 내피 세포) 및 평가된 미세관 형성의 현미경 영상을 보여준다.
도 35b는 화합물 I로 처리된 HuVEC 세포에서의 내피 세포 튜브 형성을 요약하는 막대 차트를 보여준다.
도 35c는 증가하는 배양 농도의 화합물 I의 함수로서 HuVEC의 % 세포 성장을 도해하는 그래프를 보여준다.
도 35d는 8시간 동안 화합물 I과 함께 배양된 후의 HuVEC 세포 용해물의 Akt 및 ERK 발현 감소를 보여준다.
도 36a는 시간의 함수로서 0, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 화합물 II로 처리된 인간 MM 이종이식편을 갖는 SCID 마우스에서의 종양 부피를 도해하며, 이는 인간 이종이식편 종양에 대한 강한 생체내 활성을 보여준다.
도 36b는 화합물 II로 12일 동안 처리된 마우스 상의 인간 MM 이종이식편으로부터의 종양을 대조군 마우스에 비교한 사진을 보여준다.
도 36c는 경시적으로 0, 10 및 30 mg/kg 화합물 II로 처리된 인간 MM 이종이식편을 갖는 SCID 마우스의 생존율을 보여준다.
도 36d는 화합물 II로 처리된 마우스로부터 수확한 종양의 면역-조직화학 분석으로부터의 영상을 대조군과 비교하여 보여주며, 여기서 CD31 및 P-AKT 양성 세포는 암갈색이다.
도 36e는 화합물 II로 처리된 마우스로부터 수확한 종양 조직으로부터의 PDK-1 및 AKT 수준을 검출하는 이뮤노블롯을 대조군과 비교하여 보여준다.
도 36f는 ELISA에 의해 결정된 바와 같이, 4주 처리 기간에 걸쳐 0, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 화합물 II로 처리된 마우스에서 측정된 sIL6R 수준의 차트를 보여준다.
도 37a는 다양한 양의 보르테조밉 (B)과 함께 화합물 I로 처리한 후의 생존 LB 또는 INA-6 MM 세포의 %를 보여준다; 범례: 배지 (
Figure pct00022
), 화합물 I 1.25 μM (
Figure pct00023
), 2.5 μM (
Figure pct00024
), 또는 5.0 μM (
Figure pct00025
).
도 37b는 화합물 I 및/또는 보르테조밉으로 6시간 동안 처리된 INA-6 세포에서의 AKT의 인산화 수준을 비교하는 이뮤노블롯을 보여준다.
도 38은 (A) 여포성 림프종 세포주의 패널에서의 PI3K 이소형 발현; (B) 화합물 I에 대한 노출 후의 pAkt, Akt, pS6 및 S6의 발현 감소; 및 (C) 용량-의존성 방식의 화합물 I에 대한 노출 후의 PARP 및 카스파제-3 절단 증가를 보여준다.
도 39는 (a) 다양한 양의 화합물 I에서 1차 MCL 세포에서의 구성적 PI3K 신호전달의 양; (b) 생존 인자 및 다양한 양의 화합물 I을 함유하는 MCL 세포주에서의 pAkt 생산의 감소를 보여준다.
도 40은 (A) 화합물 I로의 치료 전 및 (B) 1 사이클의 화합물 I로의 치료 후에 CLL을 앓는 환자에서의 거대 림프절병증의 컴퓨터 단층촬영 액와 영상을 보여준다.
도 41은 PI3Kδ 경로의 구성적 활성화가 iNHL 및 CLL에서 악성 B-세포의 증식, 생존, 및 비정상적 수송을 유도한다는 것을 보여준다.
도 42는 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 앓는 20명의 환자가 참여한 연구에서 환자 특성 및 처리 배치를 요약한 표를 보여준다.
도 43은 화학식 I의 화합물을 벤다무스틴 (B) 또는 리툭시맙 (R)과 조합하여 iNHL 또는 CLL을 앓는 환자에게 투여한 연구에서 안전성 프로파일을 요약한 표를 보여준다.
도 44는 iNHL 또는 CLL을 앓는 환자에 대한 벤다무스틴 (B) 또는 리툭시맙 (R)과 조합된 화학식 I의 화합물의 투여 효능의 그래프 요약을 보여준다.
도 45는 화학식 I의 화합물을 벤다무스틴 (B) 또는 리툭시맙 (R)과 조합하여 투여시에 iNHL 또는 CLL을 앓는 환자에서의 반응률을 요약한 표를 보여준다.
도 46은 화학식 I의 화합물만을 단일 작용제로서 CLL을 앓는 환자에게 투여한 연구에서의 림프구 수의 그래프 요약을 보여준다.
도 47은 벤다무스틴 (B) 또는 리툭시맙 (R)과 조합된 화학식 I의 화합물을 CLL을 앓는 환자에게 투여한 연구에서의 림프구 수의 그래프 요약을 보여준다.
도 48A는 화학식 I의 화합물, 벤다무스틴, 또는 조합된 2종의 약물로의 처리 후의 CLL 세포 생존율을 도시하는 컨투어 플롯을 보여준다. 도 48B는 화학식 I의 화합물 (5 μM), 벤다무스틴 (10 μM), 또는 약물 조합으로 처리된 CLL 세포의 평균 상대적 생존율 (평균 ± SEM, n=4)을 도시하는 그래프를 보여준다.
도 49a는 레날리도미드 및 다양한 양의 화학식 I의 화합물에 대한 노출의 함수로서 세포에서의 PI3K-δ 효소 활성의 그래프 요약을 보여준다.
도 49b 및 49c는 CD19+ 세포에서 인산화에 대한 레날리도미드 및/또는 화학식 I의 화합물의 효과를 보여주는 이뮤노블롯 검정의 영상을 보여준다.
도 49d 및 49e는 CD19+ 세포에서 단백질 발현에 대한 형질감염된 siRNA 또는 넌센스 siRNA의 효과를 보여주는 이뮤노블롯 검정의 영상을 보여준다.
도 50a는 CLL 환자의 CD19+ 세포에서 CD40, CD86의 표면 발현에 대한 레날리도미드 및/또는 화학식 I의 화합물의 효과의 그래프 요약을 보여준다.
도 50b는 CLL 환자의 CD19+ 세포에서 CD40, CD86 및 CD154의 mRNA 발현에 대한 레날리도미드 및/또는 화학식 I의 화합물의 효과의 그래프 요약을 보여준다.
도 50c는 CLL 환자의 CD19+ 세포에서 CD20에 대한 레날리도미드 및/또는 화학식 I의 화합물의 효과의 그래프 요약을 보여준다.
도 50d는 CLL 환자의 CD19+ 세포에서 IgM 농도에 대한 레날리도미드 및/또는 화학식 I의 화합물의 효과의 그래프 요약을 보여준다.
도 50e 및 50f는 CLL 환자의 CD19+ 세포에서 시토카인 mRNA 발현에 대한 레날리도미드 및/또는 화학식 I의 화합물의 효과의 그래프 요약을 보여준다.
도 51은 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 앓는 49명의 환자가 참여한 연구에서 환자 특성 및 처리 배치를 요약한 표를 보여준다.
도 52는 화학식 I의 화합물을 벤다무스틴 (B) 또는 리툭시맙 (R)과 조합하여 iNHL 또는 CLL을 앓는 환자에게 투여한 연구에서 안전성 프로파일을 요약한 표를 보여준다.
도 53a는 iNHL을 앓는 환자에 대한 벤다무스틴 (B) 또는 리툭시맙 (R)과 조합된 화학식 I의 화합물 투여의 효능의 그래프 요약을 보여준다.
도 53b는 CLL을 앓는 환자에 대한 벤다무스틴 (B) 또는 리툭시맙 (R)과 조합된 화학식 I의 화합물 투여의 효능의 그래프 요약을 보여준다.
도 54는 벤다무스틴 (B) 또는 리툭시맙 (R)과 조합된 화학식 I의 화합물의 투여시에 iNHL 또는 CLL을 앓는 환자에서의 반응률을 요약한 표를 보여준다.
도 55는 화학식 I의 화합물만을 단일 작용제로서 CLL을 앓는 환자에게 투여한 연구에서 림프구 수의 그래프 요약을 보여준다.
도 56은 벤다무스틴 (B) 또는 리툭시맙 (R)과 조합된 화학식 I의 화합물을 CLL을 앓는 환자에게 투여한 연구에서 림프구 수의 그래프 요약을 보여준다.
도 57a는 화학식 I의 화합물, 벤다무스틴, 플루다라빈, 덱사메타손, 또는 조합된 약물로의 처리 48시간 후에 CLL 세포 생존율을 도시하는 컨투어 플롯을 보여준다. 도 57b는 화학식 I의 화합물 (5 μM), 벤다무스틴 (10 μM), 플루다라빈 (10 μM), 덱사메타손 (10 μM), 또는 조합된 약물로 처리된 CLL 세포의 평균 상대적 생존율 (평균 ± SEM, n=9)을 도시하는 막대 다이어그램을 보여준다.
도 58a는 FACS (n = 30)의 의해 BH3 프로파일링된 말초 혈액 CLL 세포에서 0.03 μM 최종 농도의 BIM BH3 펩티드에 의해 유도된 미토콘드리아 감극을 정량화하는 그래프를 보여준다. 도 58b는 BCL2, Mcl-1 및 Bcl-XL에 대한 우세한 의존성의 패턴을 보여주는 3명의 개별 환자로부터의 BH3 프로파일을 보여준다. 도 58c는 제일선의 CLL 요법을 완료한 6개월 동안 또는 그 내에 진행성 질환 (PD)을 앓는 환자와 비교하여 2008 IW-CLL 기준에 의한 부분 반응 (PR) 또는 완전 반응 (CR)을 달성하는 치료-나이브 환자에서의 BIM 감극을 보여주는 그래프이다 (p=0.024). 도 58d는 돌연변이된 IGHV 상태를 갖는 환자 (n=18)와 비교하여 비돌연변이된 IGHV 상태를 갖는 환자 (n=7)에서의 BIM 감극을 보여주는 그래프이다 (p=0.0026). 도 58e는 배선에 대한 VH 상동성의 백분율과 프라이밍 수준 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다 (p=0.0043).
도 59a 및 59b는 각각 24시간 및 1시간에 전체 웰 형광측정법에 의해 정량화된 CLL 세포 부착을 도시하는 그래프를 보여준다 (각각 단측 p=0.045 및 0.032). 도 59c는 그래프에 도시된 바와 같은 약물 처리와 함께, 24시간 동안 기질NKTert의 존재 또는 부재 하에 공동-배양된 PB-유래 CLL 세포의 아넥신 V/PI에 의해 평가된 바와 같은 CLL 세포 생존율을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 59d는 기질NKTert와 함께 또는 이들 없이 및 화합물 I과 함께 또는 이들 없이 24시간 동안 ABT-737의 존재 하에 배양된 CLL 세포에 대한 용량 반응 곡선을 보여준다. 도 59e는 기질NKTert와 함께 또는 이들 없이 및 화합물 I과 함께 또는 이들 없이 ABT-263의 존재 하에 배양된 CLL 세포에 대한 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 60a는 모든 4명의 환자 샘플에 대해 아넥신V/PI에 의해 측정된 바와 같은 응집체 CLL 세포 백분율 아폽토시스를 보여준다. 도 60b는 대조군과 비교하였을 때 화합물 I로 처리된 기질-노출된 CLL 세포에서의 미토콘드리아 감극을 도시하는 그래프를 보여준다 (단측 p=0.0749). 도 60c는 대조군과 비교하였을 때 화합물 I과 함께 BAD BH3 펩티드 및 ABT-737로 처리된 기질-노출된 CLL 세포에서의 미토콘드리아 감극을 도시하는 그래프를 보여준다 (각각 단측 p=0.0462 및 0.0468).
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기 및 다른 과학 용어 또는 전문용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 그 의미를 명료하게 하고/하거나 용이하게 참조하기 위해서 본원에 정의되고, 이러한 정의를 본원에 포함시키는 것이 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되고 있는 것과 비교하여 실질적인 차이를 나타내는 것으로 간주되어선 안된다. 본원에 기재되고 참조된 다수의 기술 및 절차는 당업자에 의해 잘 이해되고 종래의 방법을 사용하여 통상적으로 이용된다. 적절한 경우에, 상업적으로 입수가능한 키트 및 시약의 사용을 포함하는 절차는 일반적으로 달리 나타내지 않는 한 제조업체가 규정한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 수행한다.
본원에 제공되는 일반적 방법의 논의는 단지 예시적 목적을 위한 것으로 의도된다. 다른 대안적 방법 및 실시양태는 본 개시내용에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
접속사 "또는"으로 연결된 일군의 용어는 군 사이에 상호 배타적일 것을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 하고, 오히려 분명하게 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"으로도 해석되어야 한다. 본 발명의 항목, 요소 또는 성분이 단수형으로 기재되거나 특허청구될 수 있지만, 단수형에 대한 제한이 명백하게 언급되지 않는 한 복수형이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다.
본 발명은 암 및 염증성 질환의 치료를 위한 신규 치료 전략에 관한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 하기 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의로 제약상 허용되는 부형제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
<화학식 A>
Figure pct00026
상기 식에서, R은 H, 할로 또는 C1-C6 알킬이고; R'은 C1-C6 알킬이다.
특정한 실시양태에서, 할로는 F이고; R'은 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
특정한 실시양태에서, R이 퀴나졸리닐 고리의 위치 5에 부착되고, 하기의 구조를 갖는다:
Figure pct00027
.
특정한 실시양태에서, R이 퀴나졸리닐 고리의 위치 6에 부착되고, 하기의 구조를 갖는다:
Figure pct00028
.
본원에 사용된 용어 '화합물'은, 달리 명시되지 않는 한, 화학식 A의 화합물, 예컨대 화합물 I, 화합물 II, 또는 거울상이성질체, 예컨대 I" 또는 II", 또는 거울상이성질체 혼합물을 지칭한다.
"화학식 I의 화합물" 또는 "화합물 I"은 하기 화학식 I의 구조의 화학적 화합물 5-플루오로-3-페닐-2-[1-(9H-퓨린-6-일아미노)-프로필]-3H-퀴나졸린-4-온을 지칭한다:
<화학식 I>
Figure pct00029
.
I"으로 명시되는 화합물 I의 S-거울상이성질체가 하기에 제시된다:
Figure pct00030
(I", S-거울상이성질체).
"화학식 II의 화합물" 또는 "화합물 II"는 하기 화학식 II의 구조의 화학적 화합물 2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)에틸)-6-플루오로-3-페닐퀴나졸린-4(3H)-온을 지칭한다:
<화학식 II>
Figure pct00031
.
II"으로 명시되는 화합물 II의 S-거울상이성질체가 하기에 제시된다:
Figure pct00032
(II", S-거울상이성질체).
한 실시양태에서, 화학식 A의 화합물은 화학식 I의 화합물이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 A의 화합물은 화학식 II의 화합물이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 R- 및 S-거울상이성질체의 라세미 혼합물이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 거울상이성질체들의 혼합물로서 사용되고, 종종 S-거울상이성질체가 풍부화된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 우세하게 S-거울상이성질체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 화학식 A의 화합물은 적어도 80%가 S-거울상이성질체이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 주로 S-거울상이성질체로 구성되고, 여기서 화합물은 적어도 66-95%, 또는 85-99%의 S-거울상이성질체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 적어도 90% 또는 적어도 95%의 S-거울상이성질체의 거울상이성질체 과잉률 (e.e.)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 화합물은 적어도 98% 또는 적어도 99%의 S-거울상이성질체 과잉률 (e.e.)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 화합물은 적어도 95%의 S-거울상이성질체를 포함한다. 실시예 섹션에 제공되는 세포 및 환자 실험에서, 사용된 화합물 I의 샘플은 S-거울상이성질체를 95% 초과하였다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 화학식 I 또는 II의 화합물은 적어도 80%가 S-거울상이성질체이다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물은 주로 S-거울상이성질체로 구성되고, 여기서 화합물은 적어도 66-95%, 또는 85-99%의 S-거울상이성질체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물은 적어도 90% 또는 적어도 95%의 S-거울상이성질체의 거울상이성질체 과잉률 (e.e.)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물은 적어도 98% 또는 적어도 99%의 S-거울상이성질체 과잉률 (e.e.)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물은 적어도 95%의 S-거울상이성질체를 포함한다. 실시예 섹션에 제공되는 세포 및 환자 실험에서, 사용된 화합물 I의 샘플은 95% 초과의 S-거울상이성질체였다.
특정한 실시양태에서, 화합물은 다른 PI3K 이소형과 비교하여 PI3K p110δ를 선택적으로 억제한다.
특정한 실시양태에서, 암은 혈액 악성종양 및/또는 고형 종양이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 혈액 악성종양은 백혈병 또는 림프종이다.
일부 실시양태에서, 림프종은 성숙 (말초) B-세포 신생물이다. 구체적 실시양태에서, 성숙 B-세포 신생물은 B-세포 만성 림프구성 백혈병 / 소림프구성 림프종; B-세포 전림프구성 백혈병; 림프형질세포성 림프종; 변연부 림프종, 예컨대 비장 변연부 B-세포 림프종 (+/- 융모성 림프구), 결절성 변연부 림프종 (+/- 단핵구성 B-세포), 및 점막-연관련 림프성 조직 (MALT) 유형의 림프절외 변연부 B-세포 림프종; 모발상 세포 백혈병; 형질 세포 골수종/형질세포종; 여포성 림프종, 여포 중심; 외투 세포 림프종; 미만성 거대 세포 B-세포 림프종 (종격 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종 및 원발성 삼출 림프종 포함); 및 버킷 림프종/버킷 세포 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 림프종은 다발성 골수종 (MM) 및 비-호지킨 림프종 (NHL), 외투 세포 림프종 (MCL), 여포성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM) 또는 B-세포 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 특정한 실시양태에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 소림프구성 림프종 (SLL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 급성 림프구성 백혈병은 또한 급성 림프모구성 백혈병으로 공지되어 있으며, 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 상기 용어는 둘 다 골수에서 백혈구 세포, 림프구로부터 시작되는 유형의 암을 기재한다.
일부 실시양태에서, 비-호지킨 림프종 (NHL)은 2가지 카테고리인 공격성 NHL 또는 무통성 NHL 중 하나에 속한다. 공격성 NHL은 급속하게 성장하고, 비교적 빠르게 환자의 사망에 이를 수 있다. 치료되지 않은 경우의 생존은 수개월 또는 심지어 수주 내로 측정될 수 있다. 공격성 NHL의 예는 B-세포 신생물, 미만성 거대 B-세포 림프종, T/NK 세포 신생물, 역형성 대세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 백혈병/림프종, 전구체 T-림프모구성 백혈병/림프종, 버킷 림프종, 성인 T-세포 림프종/백혈병 (HTLV1+), 원발성 CNS 림프종, 외투 세포 림프종, 다형성 이식후 림프증식성 장애 (PTLD), AIDS-관련 림프종, 진성 조직구성 림프종, 및 모구성 NK-세포 림프종을 포함한다. 공격성 NHL의 가장 통상적인 유형은 미만성 거대 세포 림프종이다.
무통성 NHL은 느리게 성장하고, 진전된 단계로 질환이 진행될 때까지 대부분의 환자에 대해 명백한 증상을 나타내지 않는다. 무통성 NHL을 앓는 환자의 치료되지 않은 경우의 생존은 수년 내로 측정될 수 있다. 비제한적인 예는 여포성 림프종, 소림프구성 림프종, 변연부 림프종 (예컨대 림프절외 변연부 림프종 (점막 연관 림프성 조직 - MALT 림프종으로 또한 지칭됨), 결절성 변연부 B-세포 림프종 (단핵구모양 B-세포 림프종), 비장 변연부 림프종), 및 림프형질세포성 림프종 (발덴스트롬 마크로글로불린혈증)을 포함한다.
일부 경우에, 조직학적 형질전환이 일어날 수 있고, 예를 들어 환자의 무통성 NHL이 공격성 NHL로 전환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 공격성 NHL 또는 무통성 NHL을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 외투 세포 림프종 (MCL), 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종 (FL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 및 소림프구성 림프종 (SLL), 다발성 골수종 (MM), 및 변연부 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 상태의 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 재발 또는 불응성 상태의 환자에게 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 폐암, 결장암 또는 전립선암이다.
특정한 실시양태에서, 암은 암을 앓고 있지 않은 대상체에서의 PI3K 활성과 비교하여 비정상적인 PI3K 활성과 연관된다.
특정한 실시양태에서, 바람직한 대상체는 화학요법 치료에 불응성이거나, 또는 화학요법으로의 치료 후에 재발된다. 대안적 실시양태에서, 대상체는 신생 환자이다.
특정한 실시양태에서, 방법은 상기 환자에서 PI3Kδ 활성의 수준을 감소시키는 것을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
공지된 치료제로의 치료를 받는 대상체는 치료에 대한 저항성을 경험할 수 있다. 예를 들어, 보르테조밉이 재발/불응성, 재발 및 새롭게 진단된 MM에 대해 FDA의 승인을 받았지만, 일부 환자는 보르테조밉에 반응하지 않고, 그 밖의 환자들은 보르테조밉에 대한 저항성을 수득하였다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 퀴나졸리논 화합물은 공지된 치료제의 효능을 상승작용적으로 증대시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물은 본원에 기재된 임의의 치료제를 증대시킬 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물은 프로테아솜 억제제를 상승작용적으로 증대시킨다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 화학요법적 치료에 저항성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 프로테아솜 억제제에 저항성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 보르테조밉 또는 카르필조밉에 저항성이다. 한 예에서, 본원에 기재된 화합물은 보르테조밉-유도된 MM 세포독성을 상승작용적으로 증대시킨다. 이론에 제한되지 않으면서, 일부 실시양태에서, 본원에 논의된 화합물은 AKT의 보르테조밉-유도된 인산화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 프로테아솜 억제제 치료에 대한 저항성을 극복하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 치료제에 저항성이거나 치료제에 대한 저항성이 발달된 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
이론에 제한되지 않으면서, 화학식 A의 화합물과 통상적인 요법 사이의 상승작용 효과는 말초 순환 내로의 종양 세포 이동을 유도하는 본 발명의 화합물의 능력에 기인할 수 있다. 종양 세포의 말초 순환을 유도하는 것은 종양 상에 작용하고 종양을 보다 효과적으로 중화하는 통상적인 요법의 능력을 증가시킨다. 이러한 상승작용이 CLL 환자에서 입증되었다.
따라서, 방법은 환자에게 화학식 A의 화합물 뿐만 아니라, 상기 환자에서 상기 암을 치료하기 위해 선택된 적어도 하나의 추가의 치료제의 치료 유효량 및/또는 치료 절차의 투여를 포함한다. "치료제"는 본원에 사용되는 바와 같은 하나 이상의 화합물을 지칭할 수 있다. 치료제는 표준 또는 실험적 화학요법 약물일 수 있다. 치료제는 하나 초과의 화학요법 약물의 조합을 포함할 수 있다. 전형적인 화학요법 약물 조합이 본원의 a-q에서 열거된다. 치료될 질환의 유형에 따라 특정한 치료제가 선택될 수 있다. 특정한 혈액 질환에 대한 통상적인 화학요법 치료의 비제한적 예가 하기 섹션에서 기재된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명은 조혈암 환자, 예를 들어 CLL 환자를 보르테조밉 및 화학식 A (예를 들어, 화학식 I, II, I" 또는 II")의 화합물로 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 조합은 상승작용 효과를 제공한다.
특정한 실시양태에서, 상기 치료제는 보르테조밉 (벨케이드®), 카르필조밉 (PR-171), PR-047, 디술피람, 락타시스틴, PS-519, 에포네마이신, 에폭소마이신, 아클라시노마이신, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, 비닐 술폰 트리펩티드 억제제, 리토나비르, PI-083, (+/-)-7-메틸로무랄리드, (-)-7-메틸로무랄리드, 페리포신, 리툭시맙, 실데나필 시트레이트 (비아그라®), CC-5103, 탈리도미드, 에프라투주맙 (hLL2- 항-CD22 인간화 항체), 심바스타틴, 엔자스타우린, 캄파트-1H®, 덱사메타손, DT PACE, 오블리메르센, 안티네오플라스톤 A10, 안티네오플라스톤 AS2-1, 알렘투주맙, 베타 알레틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 히드로클로라이드, PEG화 리포솜 독소루비신 히드로클로라이드, 프레드니손, 프레드니솔론, 클라드리빈, 빈크리스틴 술페이트, 플루다라빈, 필그라스팀, 멜팔란, 재조합 인터페론 알파, 카르무스틴, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 에토포시드, 멜팔란, 돌라스타틴 10, 인듐 In 111 모노클로날 항체 MN-14, 이트륨 Y 90 인간화 에프라투주맙, 항-흉선세포 글로불린, 부술판, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 치료 동종이형 림프구, 이트륨 Y 90 이브리투모맙 티욱세탄, 시롤리무스, 타크롤리무스, 카르보플라틴, 티오테파, 파클리탁셀, 알데스류킨, 재조합 인터페론 알파, 도세탁셀, 이포스파미드, 메스나, 재조합 인터류킨-12, 재조합 인터류킨-11, Bcl-2 패밀리 단백질 억제제 ABT-263, 데니류킨 디프티톡스, 타네스피마이신, 에베롤리무스, 페그필그라스팀, 보리노스타트, 알보시딥, 재조합 flt3 리간드, 재조합 인간 트롬보포이에틴, 림포카인-활성화 킬러 세포, 아미포스틴 3수화물, 아미노캄프토테신, 이리노테칸 히드로클로라이드, 카스포펀진 아세테이트, 클로파라빈, 에포에틴 알파, 넬라라빈, 펜토스타틴, 사르그라모스팀, 비노렐빈 디타르트레이트, WT-1 유사체 펩티드 백신, WT1 126-134 펩티드 백신, 펜레티니드, 익사베필론, 옥살리플라틴, 모노클로날 항체 CD19, 모노클로날 항체 CD20, 오메가-3 지방산, 미톡산트론 히드로클로라이드, 옥트레오티드 아세테이트, 토시투모맙 및 아이오딘 I 131 토시투모맙, 모텍사핀 가돌리늄, 삼산화비소, 티피파르닙, 자가 인간 종양-유래 HSPPC-96, 벨투주맙, 브리오스타틴 1, 항-CD20 모노클로날 항체, 클로람부실, 펜토스타틴, 루밀릭시맙, 아폴리주맙, 항-CD40, 및 오파투무맙, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 치료제의 조합은 상기 열거된 조합 a-q와 같이 최근 및 실험적 요법에서 사용된다.
일부 실시양태에서, 치료제는 바람직하게는 프로테아솜 억제제이다. 일부 실시양태에서, 방법은 화합물을 프로테아솜 억제제와 함께 투여하는 것을 포함한다. 프로테아솜 억제제는 천연 및 합성 화합물을 포함한다. 프로테아솜 억제제의 비제한적 예는 밀레니엄 파마슈티칼스(Millennium pharmaceuticals)가 '벨케이드®'로 판매하는 보르테조밉 ([(1R)-3-메틸-1-({(2S)-3-페닐-2-[(피라진-2-일카르보닐)아미노]프로파노일}아미노)부틸]보론산); 프로테올릭스, 인크(Proteolix, Inc)에서 개발한 카르필조밉 (PR-171) 및 경구 유사체 PR-047을 포함한다. 프로테아솜 억제제의 다른 예는 디술피람; 락타시스틴; 합성 화합물, 예컨대 PS-519, 에포네마이신, 에폭소마이신, 및 아클라시노마이신; 칼파인 억제제, 예컨대 CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341; 비닐 술폰 트리펩티드 억제제; 리토나비르; PI-083; (+/-)-7-메틸로무랄리드; 및 (-)-7-메틸로무랄리드를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 화학식 A의 화합물이 보르테조밉 또는 카르필조밉과 함께 투여된다. 보다 특정한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물이 보르테조밉 또는 카르필조밉과 조합되어 투여된다. 다른 특정한 실시양태에서, 화학식 II의 화합물이 보르테조밉 또는 카르필조밉과 조합되어 투여된다. 특정한 실시양태에서, 화학식 A의 화합물은 리툭시맙 또는 오파투무맙과 조합되어 투여된다. 보다 특정한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 리툭시맙 또는 오파투무맙과 조합되어 투여된다. 다른 특정한 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 리툭시맙 또는 오파투무맙과 조합되어 투여된다.
일부 실시양태에서, 치료제는 알킬화제이다. 알킬화제의 비제한적 예는 예를 들어 부술판, 멜팔란, 클로람부실, 시클로포스파미드, 메클로레타민, 우라무스틴, 이포스파미드, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 티오테파 및 백금 기반 화학요법 약물, 예컨대 아시스플라틴, 카르보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 임의의 화합물은 환자로의 동시 또는 순차적 투여를 위한 단위 투여량 형태로 하나 이상의 다른 활성 치료제에 조합될 수 있다. 조합 요법은 동시 또는 순차 요법으로서 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우에, 조합은 2회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물과 하나 이상의 다른 활성 치료제와의 공투여는 일반적으로 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 다른 활성 치료제를 동시 또는 순차적 투여하여 치료 유효량의 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 다른 활성 치료제가 둘 다 환자의 신체 내에 존재하도록 하는 것을 지칭한다. 대안적 실시양태에서, 화합물과 치료제가 반드시 둘 다 환자의 신체 내에 존재하는 것은 아니지만, 특정한 투여 계획에서는 화합물 및 치료제가 상승작용 효과를 나타낸다.
공투여는 단위 투여량의 본 발명의 화합물을 단위 투여량의 하나 이상의 다른 활성 치료제의 투여 전에 또는 투여 후에 투여하는 것을 포함하고, 예를 들어 하나 이상의 다른 활성 치료제 투여 수초, 수분 또는 수시간 내에 본 발명의 화합물을 투여하는 것이다. 예를 들어, 단위 용량의 본 발명의 화합물을 먼저 투여한 다음, 수초, 수분, 수시간 또는 수일 내에 단위 용량의 하나 이상의 다른 활성 치료제를 투여할 수 있다. 대안적으로, 단위 용량의 하나 이상의 다른 치료제를 먼저 투여한 다음, 수초, 수분, 수시간 또는 수일 내에 단위 용량의 본 발명의 화합물을 투여할 수 있다. 일부 경우에, 단위 용량의 본 발명의 화합물을 먼저 투여한 다음, 어느 정도의 시간 (예를 들어, 1-12시간) 후에, 단위 용량의 하나 이상의 다른 활성 치료제를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 경우에, 단위 용량의 하나 이상의 다른 활성 치료제를 먼저 투여한 다음, 어느 정도의 시간 (예를 들어, 1-12시간) 후에, 단위 용량의 본 발명의 화합물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 단위 용량의 본 발명의 화합물을 먼저 투여한 다음, 어느 정도의 시간 (예를 들어, 1-12일) 후에, 단위 용량의 하나 이상의 다른 활성 치료제를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 경우에, 단위 용량의 하나 이상의 다른 활성 치료제를 먼저 투여한 다음, 어느 정도의 시간 (예를 들어, 1-12일) 후에, 단위 용량의 본 발명의 화합물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 화합물 및 치료제의 수일, 수주 또는 수개월의 기간에 걸친 교대 투여를 포함할 수 있다.
조합 요법은 "상승작용" 및 "상승작용 효과"를 제공할 수 있고, 즉, 활성 성분이 함께 사용되는 경우에 달성되는 효과가 이들 화합물이 개별적으로 사용될 때 달성되는 효과의 합보다 더 크다. 상승작용 효과는 활성 성분이 하기와 같은 경우에 달성될 수 있다: (1) 조합 제제로 공동-제제화되고 투여되거나 동시에 전달되는 경우, (2) 개별 제제로서 교대로 또는 병행하여 전달되는 경우; 또는 (3) 일부 다른 요법에 의한 경우. 교대 요법으로 전달되는 경우에, 상승작용 효과는 화합물이 예를 들어 개별 정제, 환제 또는 캡슐로, 또는 개별 시린지에서의 상이한 주사에 의해 순차적으로 투여 또는 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는 유효 투여량의 각 활성 성분을 순차적으로, 즉 연속적으로 투여한다.
한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
<화학식 I>
Figure pct00033
한 실시양태에서, 조성물에서 S-거울상이성질체가 풍부화된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
<화학식 II>
Figure pct00034
한 실시양태에서, 조성물에서 S-거울상이성질체가 풍부화된다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 A의 화합물 및 추가의 치료제의 조합을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 다발성 골수종 (MM)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 화학식 A는 화합물 I 또는 II이다. 구체적 실시양태에서, 화학식 A는 화합물 I"이다. 다른 실시양태에서, 화학식 A는 화합물 II"이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 추가의 치료제는 프로테아솜 억제제이다. 구체적 실시양태에서, 추가의 치료제는 보르테조밉이다. 구체적 실시양태에서, 환자에서 다발성 골수종을 치료하는 방법은 화합물 I"을 보르테조밉과 함께 투여하는 것을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 환자에서 다발성 골수종을 치료하는 방법은 화합물 II"을 보르테조밉과 함께 투여하는 것을 포함한다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"은 적어도 60%의 거울상이성질체 과잉률을 갖는다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"은 적어도 70%의 거울상이성질체 과잉률을 갖는다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"은 적어도 80%의 거울상이성질체 과잉률을 갖는다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"은 적어도 90%의 거울상이성질체 과잉률을 갖는다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"은 적어도 95%의 거울상이성질체 과잉률을 갖는다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"은 적어도 98%의 거울상이성질체 과잉률을 갖는다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화합물 I" 또는 II"은 적어도 99%의 거울상이성질체 과잉률을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 치료제의 조합이 화학식 A의 화합물과 함께 투여되고, 여기서 상기 조합은
a) 벤다무스틴;
b) 리툭시맙;
c) 벤다무스틴 및 리툭시맙;
d) 오파투무맙; 및
e) 레날리도미드
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대안적 실시양태에서, 화합물이 치료 절차와 조합되어 투여된다. 특정한 실시양태에서, 치료 절차는 말초 혈액 줄기 세포 이식, 자가 조혈 줄기 세포 이식, 자가 골수 이식, 항체 요법, 생물학적 요법, 효소 억제제 요법, 전신 방사선조사, 줄기 세포 주입, 줄기 세포 보조를 수반한 골수 파괴, 시험관내-처리 말초 혈액 줄기 세포 이식, 제대혈 이식, 면역효소 기술, 면역조직화학 염색 방법, 약리학적 연구, 저-LET 코발트-60 감마선 요법, 블레오마이신, 통상적인 수술, 방사선 요법, 고-용량 화학요법 및 비골수파괴성 동종이형 조혈 줄기 세포 이식으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시양태에서, 이러한 방법은 상기 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것; 및 상기 생물학적 샘플을 혈액 화학 분석, 염색체 전위 분석, 바늘 생검, 형광 계내 혼성화, 실험 바이오마커 분석, 면역조직화학 염색 방법, 유동 세포측정법 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분석 절차로 분석하는 것을 추가로 포함한다.
명명 목적을 위해, 화합물의 퀴나졸리닐 및 퓨리닐 성분은 하기에 따라 넘버링된다:
퓨린
Figure pct00035
퀴나졸린
Figure pct00036
본원에 사용된 용어 "알킬"은 치환되지 않은 경우에 C 및 H만 함유하는, 직쇄, 분지쇄 및 시클릭 1가 히드로카르빌 라디칼, 및 그의 조합을 포함한다. 예는 메틸, 에틸, 이소부틸, 시클로헥실, 시클로펜틸에틸 등을 포함한다. 이러한 각각의 기 중 탄소 원자의 총 수는 종종 본원에 기재되는데, 예를 들어 이들 기가 10개 이하의 탄소 원자를 함유할 수 있는 경우에, 이는 1-10C로서 또는 C1-C10 또는 C1-10으로서 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 포함한다. 플루오로 및 클로로가 종종 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "선택적 PI3Kδ 억제제" 또는 "선택적 PI3Kβ 억제제" 등은 각각 PI3Kδ 또는 PI3Kβ 동종효소를 PI3K 패밀리의 적어도 하나의 다른 동종효소보다 더 효과적으로 억제하는 화합물을 지칭한다. 선택적 억제제는 또한 PI3K의 다른 동종효소에 대해 활성일 수 있지만, 다른 동종효소를 동일한 정도로 억제하기 위해서는 더 높은 농도를 필요로 한다. "선택적"은 또한 대등한 화합물보다 특정한 PI3-키나제를 보다 많이 억제하는 화합물을 기재하도록 사용될 수 있다. "선택적 PI3Kδ 억제제" 화합물은 PI3K 억제제로 통상적으로 및 일반적으로 지칭되는 화합물, 예를 들어 워트만닌 또는 LY294002보다 PI3Kδ에 대해 보다 선택적인 것으로 이해된다. 부수적으로, 워트만닌 및 LY294002는 "비선택적 PI3K 억제제"로 간주된다. 특정 실시양태에서, 선택적으로 PI3Kδ 발현 또는 활성을 음성적으로 조절하는 임의의 유형의 화합물이 본 발명의 방법에서 선택적 PI3Kδ 억제제로서 사용될 수 있다. 또한, 선택적으로 PI3Kδ 발현 또는 활성을 음성적으로 조절하고 허용되는 약리학적 특성을 갖는 임의의 유형의 화합물이 본 발명의 치료 방법에서 선택적 PI3Kδ 억제제로서 사용될 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, 본 발명의 화합물로 p110 델타 억제를 표적화하는 것은 혈액 악성종양 치료를 위한 신규 접근법을 제공하는데, 이는 이러한 방법이 구성적 신호전달을 억제하여 종양 세포의 직접적인 파괴를 일으키기 때문이다. 또한, 이론에 제한되지 않으면서, p110 델타 억제는 종양 세포 귀향, 생존 및 증식에 결정적인 미세환경 신호를 저해한다.
대안적 실시양태에서, 선택적으로 PI3Kβ 발현 또는 활성을 음성적으로 조절하는 임의의 유형의 화합물이 본 발명의 방법에서 선택적 PI3Kβ 억제제로서 사용될 수 있다. 또한, 선택적으로 PI3Kβ 발현 또는 활성을 음성적으로 조절하고 허용되는 약리학적 특성을 갖는 임의의 유형의 화합물이 본 발명의 치료 방법에서 선택적 PI3Kβ 억제제로서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "치료하는"은 장애를 억제하는 것, 즉 그의 발생을 중지시키는 것; 장애를 경감시키는 것, 즉 장애의 퇴행을 유발하는 것; 또는 장애를 완화시키는 것, 즉 장애와 관련된 증상들 중 적어도 하나의 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "치료하는"은 장애에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 장애에 걸린 것으로 진단되지는 않은 동물에서 장애가 발생하는 것을 방지하는 것을 지칭한다. "장애"는 의학적 장애, 질환, 상태, 증후군 등을 비제한적으로 포함하도록 의도된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 호염기구 및/또는 비만 세포의 기능을 저해함으로써, 과도한 또는 바람직하지 않은 호염기구 및/또는 비만 세포 활성을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료를 가능하게 하는 방법을 포함한다. 이러한 방법에 따라, 호염기구 및/또는 비만 세포 내의 포스파티딜이노시톨 3-키나제 델타 (PI3Kδ)의 발현 또는 활성을 선택적으로 억제하는 본 발명의 화합물이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 방법은 PI3Kδ 억제제를 호염기구 및/또는 비만 세포에 의해 자극된 히스타민 방출을 억제하는데 충분한 양으로 사용한다. 따라서, 이러한 화합물 및 다른 PI3Kδ 선택적 억제제의 사용은 히스타민 방출을 특징으로 하는 질환, 즉 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식, ARDS, 폐기종 및 관련 장애와 같은 장애를 포함하는 알레르기성 장애를 치료하는데 유용할 수 있다.
이러한 방법은 재관류 손상, 즉 조직 또는 기관이 허혈에 이어 재관류 기간을 겪는 상황으로부터 일어나는 손상을 입거나 입을 수 있는 대상체를 치료하는데 유용할 수 있다. 용어 "허혈"은 동맥 혈액 유입의 폐쇄로 인한 국소화된 조직 빈혈을 지칭한다. 일시적인 허혈 후 재관류는 이환 부위 내의 혈관의 내피를 통한 호중구 활성화 및 이행을 특징적으로 일으킨다. 이어서, 활성화된 호중구의 축적은 반응성 산소 대사물을 생성하고, 이는 관련된 조직 또는 기관의 성분들을 손상시킨다. "재관류 손상"의 이러한 현상은 혈관 졸중 (전뇌 및 국소 허혈 포함), 출혈성 쇼크, 심근 허혈 또는 경색, 기관 이식, 및 뇌 혈관연축과 같은 상태와 통상적으로 연관된다. 설명하자면, 재관류 손상은 혈액 제공이 저지되었던 심장이 재관류되기 시작할 때 심장 우회 시술의 종료시에 또는 심장 정지 동안 발생한다. PI3Kδ 활성의 억제는 이러한 상황에서의 재관류 손상의 양을 감소시킬 것으로 예상된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 암은 유방암, 폐암, 결장암 또는 전립선암이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 PI3Kβ에 의해 매개되는 비정상적인 또는 바람직하지 못한 세포 신호전달 활성과 연관된 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 고형 종양은 췌장암; 방광암; 결장직장암; 전이성 유방암을 포함하는 유방암; 안드로겐-의존성 및 안드로겐-비의존성 전립선암을 포함하는 전립선암; 예를 들어 전이성 신세포 암종을 포함하는 신암; 간세포성암; 예를 들어 비소세포 폐암 (NSCLC), 세기관지 폐포 암종 (BAC), 및 폐의 선암종을 포함하는 폐암; 예를 들어 진행성 상피암 또는 원발성 복막암을 포함하는 난소암; 자궁 경부암; 위암; 식도암; 예를 들어 두경부의 편평 세포 암종을 포함하는 두경부암; 흑색종; 전이성 신경내분비 종양을 포함하는 신경내분비암; 예를 들어 신경교종, 역형성 핍지교종, 성인 다형성 교모세포종 및 성인 역형성 성상세포종을 포함하는 뇌종양; 골암; 및 연부 조직 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
p110δ의 유전적 제거가 면역계에 제한되는 가벼운 표현형을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 일반적인 관찰은 총괄적인 해부학적 또는 거동 이상이 없이 가임성인 유기체를 포함한다. 조직학적 검사에서, 주요 기관이 정상으로 보이는 것으로 밝혀졌다. 전체 클래스 I PI3K 활성이 B 및 T 세포에서 30-50% 감소되었다. 또한, 감염에 대한 감수성의 증가가 관찰되지 않았다. 또한, 조혈계에 대한 효과는 정상적인 말초 혈액 세포 수, 림프 저형성증의 발생 및 비장 및 림프절 내의 배 중심의 결여, 골수 내의 B220 + IgM + B 세포 전구세포의 개수 감소, 혈청 이뮤노글로불린 수준 감소, 및 흉선에서의 정상적인 T 세포 발생을 포함한다.
p110δ의 유전적 제거는 종양발생에 중요한, 골수 및 B 세포 신호전달에 영향을 미친다. 특히, 티로신 키나제 신호전달, 발생, 증식 및 생존이 골수 세포에서 영향을 받는다. B 세포 기능이 가장 영향을 받고, 여기에는 증식, 분화, 아폽토시스, 및 B 세포 생존 인자 (BCR, CD40, IL-4, 케모카인)에 대한 반응이 포함된다. 따라서, 본 발명은 이러한 골수 및 B 세포 기능 중 하나 이상이 비정상적이거나 바람직하지 않은 질환 상태를 치료하는 방법을 포함한다.
이어서, 분자 수준에서 p110α, p110β, p110δ, p110γ를 표적으로 하는 pan PI3K 억제제 (hvPS34, mTOR, DNA-PK 및 기타)는 모든 조직을 표적화한다. 잠재적인 임상 적응증은 암을 포함하지만, 임상 유해 사례는 암 환자에서의 고인슐린혈증을 포함한다. 염증을 매개하는 세포 및 암 세포를 표적으로 하는 p110δ 선택적 억제제의 이점은 치료가 잘 허용되고 고인슐린혈증과 같은 부작용이 방지된다는 것이고, 여기서 잠재적인 임상 적응증에는 암, 류마티스 관절염, 천식, 알레르기 및 COPD가 포함된다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 암, 류마티스 관절염, 천식, 알레르기, COPD, 또는 본 발명의 화합물로 치료가능한 다른 상태에 대해, 인슐린 저항성 또는 제2형 당뇨병을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 과도한 인슐린 상태 또는 경향이 있는 이러한 치료를 필요로 하는 환자에 대해, 본 발명의 화합물은 pan-PI3K 억제제와 비교하여 특히 유리하다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 I"의 화합물이 바람직한데, 인슐린 신호전달에 불리하게 영향을 미치지 않으면서 혈액 악성종양을 치료하는 것에 치료 이익을 제공하기 때문이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PI3K p110δ를 억제하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 PI3K p110β 또는 p110γ를 억제하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 표적을 벗어나는 활성이 거의 없거나 전혀 없다. 특히, 이러한 방법에서 사용되는 화학식 I의 화합물은 실시예 16의 표 3에 요약된 것들이 포함되는 300종 초과의 단백질 키나제에 대한 활성을 거의 나타내지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 pan-PI3K 억제제의 투여를 포함하는 방법과 비교하여 암 환자에서 고인슐린혈증 효과가 전혀 없거나 최소이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 Akt 인산화를 매개하는 세포를 표적화하는데 유용한데, 이는 화학식 A의 화합물이 Akt 인산화를 억제하기 때문이다. 따라서, 한 실시양태에서, 조혈암, 예컨대 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종과 관련하여 상승된 Akt 인산화를 나타내는 환자를 선택함으로써, 본 발명의 화합물로의 치료에 적합한 환자를 선택할 수 있다.
본원의 방법은 표적을 벗어나는 부담을 방지하고, hERG 억제가 없고 유의한 P450 억제가 없는, 수용체 그람 스크린에서 음성 결과를 특징으로 한다.
본 발명의 방법의 또 다른 이점은 안전성 약리학 연구에서 입증된 바와 같이 불리한 심혈관, 호흡기 또는 중추 신경계 효과가 없다는 것이다. 또한, 래트 및 개에서의 28일 독성 연구에서 높은 치료 지수, 예를 들어 NOAEL (관찰가능한 부작용이 없는 수준) >> 10 μM이 입증되었다. 이는 노출된 군과 그의 적절한 대조군 사이에 독성학적 효과의 빈도 또는 중증도에서의 통계학적으로 또는 생물학적으로 유의한 증가가 없는 화합물질의 가장 높은 실험 용량이다. 부작용은 전체 유기체의 수행능력에 영향을 미칠 수 있거나 추가의 접종에 반응하는 유기체의 능력을 감소시키는 기능적 손상 및/또는 병리학적 병변을 일으키는 임의의 효과로서 정의된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 림프구를 순환계로 넣으면서 림프절병증을 현저하게 감소시킨다. 이러한 림프구 재분포는 악성 CLL 세포를 림프절 외부의 덜 보호된 환경에 넣는 잠재적 이익을 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 A의 화합물과 같은 작용제와 화학요법 및/또는 면역요법의 공투여는 동시에 림프구증가증을 감소시키면서 CLL 세포의 사멸을 증진시킨다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 일련의 표준 시험에서 비-유전자독성이다.
본 발명의 또 다른 이점은 1종 또는 2종의 PI3K 이소형에 대한 화합물 선택성이 pan-PI3K 억제를 나타내는 화합물과 비교하여 개선된 안전성 프로파일을 나타낸다는 것이다. 또 다른 이점에서, 화합물 I은 우수한 표적 적용범위를 갖는 유리한 약동학적 프로파일을 갖고, 글루코스 또는 인슐린 수준에 대한 부작용이 없으며, 정상적인 건강한 지원자가 통상적으로 사용되는 치료 용량을 초과하는 용량에서 이를 잘 허용한다. 본 발명의 또 다른 이점은 본원의 실시예에서 입증되는 바와 같이 광범위한 혈액 악성종양을 치료하는 능력을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 암을 치료하는 것에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 암은 혈액 악성종양이다. 구체적 실시양태에서, 혈액 악성종양은 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 다발성 골수종 (MM) 및 비-호지킨 림프종 (NHL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 비-호지킨 림프종은 미만성 거대 B-세포 림프종 (LDBCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM) 및 림프형질세포성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PI3K는 다수의 혈액 악성종양에 연관되고, 화합물 I로의 치료와 관련된 개념의 전임상 증거가 확립되어 있다. 하기 표는 특정한 혈액 악성종양 및 1차 환자 세포 또는 질환 세포주에 대한 작용 방법을 요약한다.
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본원에 제공된 데이터는 본 발명의 화합물이 림프종 및 백혈병을 치료하는데 유용하다는 것을 입증한다. 림프종 및 백혈병은 일반적으로 p110의 델타 이소형을 선택적으로 발현하고, 예를 들어 도 15는 p110δ가 대부분의 림프종 세포주에서 우세한 반면, p110α는 일반적으로 관찰되지 않았다는 것을 보여준다. 또한 도 16a에 제시된 데이터는 6종의 상이한 백혈병 세포주로부터의 세포 배양물이 화합물 I에 대해 민감하였고, 5-10 마이크로몰 농도의 이러한 화합물에 강하게 영향을 받았다는 것을 보여준다. 도 8 및 9는 화합물 I이 여러 세포주에서 Akt(Ser473) 생산을 억제한다는 것을 뒷받침한다.
예를 들어, CLL은 신호전달 목적을 위해 주로 p110δ를, 및 보다 적은 정도로 p110γ를 생산하며, 따라서 p110δ 및/또는 p110γ를 억제하는 화합물이 이러한 세포들에 대한 선택적 세포독성을 나타낼 것으로 예상된다. 실시예 3은 예후가 불량한 환자들로부터 얻은 세포 (도 19), 및 다른 CLL 치료에 저항성인 것으로 나타난 환자들로부터의 세포 (도 20)를 포함하는 CLL 세포에서 화합물 I에 대한 용량-의존성 세포독성 (도 3)을 보여준다. 또한, 실시예 13 및 도 13은 28일 사이클 동안 50 mg BID의 비로 CLL 환자에게 투여된 화합물 I이 유의한 치료 효과를 제공한다는 것을 입증한다. 림프구에서의 ALC 농도 퍼센트 감소가 관찰된다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 화학식 A의 화합물을 사용하여 약물 저항성 CLL을 앓는 CLL 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 한편으로, 실시예 17은 신호전달을 위해 p110α에 주로 의존하는 섬유모세포 세포주가 화합물 I에 대해 감수성이지 않다는 것을 제안한다. 따라서, 한 측면에서, 환자 선택은 신호전달을 위해 p110α에 주로 의존하는 암을 앓는 환자를 제외하는 것을 포함할 수 있다.
화학식 A의 화합물은 B-세포 및 T-세포 림프종이 둘 다 포함되는 림프종을 치료하는데 또한 유용하다. 도 4의 데이터는 6종의 상이한 ALL 세포주가 화합물 I에 대해 감수성이었고, 이는 6종의 세포주 모두에서 세포 생존율이 유의하게 감소하였다는 것을 입증한다. 도 12 및 실시예 12는 50 mg BID의 화합물 I로 28일 동안 치료된 외투 세포 림프종 환자가 평균적으로 종양 부담의 44% 감소를 경험하였다는 것을 입증한다. 또한, 도 14는 28일 사이클 말기의 MCL 환자가 정상적인 건강한 지원자 (NHV)에서 관찰된 것과 유사한 50 mg 용량의 투여 후의 화합물 I의 혈장 수준을 경험하였다는 것을 입증하고; 따라서 화합물이 치료 사이클 과정에 걸쳐 과도하게 축적되지 않거나 환자가 치료 사이클 과정에 걸친 증가된 대사에 의해 허용성이 되지 않는다.
또한, 화학식 A 또는 화학식 I의 화합물은 Akt 인산화 활성을 구성적으로 발현하는 조혈암을 치료하는데 유용하다. 실시예 8, 및 도 8 및 9에서 B-세포 림프종, T-세포 림프종, ALL, 악성 조직구증, DLBCL 및 AML이 포함되는, 구성적 Akt 인산화를 입증하는 암 세포주가 열거된다. 이러한 세포가 화합물 I에 노출되면 Akt 인산화를 감소시킨다. 구성적 Akt 인산화가 13종의 세포주 중 13종에서 화합물 I에 의해 억제되었음을 보여주는 실시예 19를 또한 참조한다.
특정 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 구체적 실시양태에서, 암은 유방암, 난소암, 폐암, 결장암 또는 전립선암이다. 예를 들어, 도 6은 화합물 I이 2종의 유방암 세포주의 세포 증식을 감소시킨다는 것을 보여주고, 도 10은 3종의 상이한 유방암 세포주에 대한 세포독성을 설명한다. 유사하게, 도 7은 화합물 I이 2종의 난소암 세포주에 대해 세포독성임을 입증한다.
고형 종양의 치료를 위해, p110β에 대해 우수한 활성 (예를 들어, 약 1 μM 미만, 바람직하게는 약 250 nM 미만의 IC50 - 실시예 15 참조)을 나타내는 화학식 A의 화합물을 사용하는 것이 유리한데, 이는 고형 종양이 p110δ 대신에 또는 p110δ보다 많이 이러한 동종효소를 종종 이용하기 때문이다. 따라서, IC50이 약 250 nM 미만인 화학식 A의 화합물이 고형 종양의 치료에 바람직하며; 본원에서 입증되는 바와 같이 화합물 I, I", II, 또는 II"이 이러한 용도에 적합하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료의 대상체는 화학식 A의 화합물의 사용에 의해 치료가능한 것으로 본원에 기재된 상태들 중 적어도 하나로 진단된 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에서 지정된 암으로 진단되었고, 적어도 하나의 통상적인 화학요법제로의 치료에 불응성인 것으로 입증되었다. 예를 들어, 프로테아솜 억제제, 자가 줄기 세포 이식, CHOP 요법, 리툭시맙, 플루다라빈, 알렘투주맙, 통상적인 항암 뉴클레오시드 유사체 및 알킬화제와 같은 치료에 반응하지 않는 환자가 본원에 기재된 치료 방법에 빈번하게 반응한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 치료는 하나 또는 하나 초과의 이러한 치료가 제공된 환자에 대해 지시된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 B-세포, 또는 B 림프구, 관련 질환에 대해 지시된다. B-세포는 자가면역 질환의 발병기전에서 소정의 역할을 한다.
화학식 A (특히 화학식 I, I", II 및 II")의 화합물은 본원에 기재된 상태를 갖는 다양한 대상체, 특히 인간에서의 혈액암을 치료하는데 적합하다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양의 치료를 위해 선택된 대상체는 다른 치료 후에 재발을 경함한 대상체이거나, 또는 다른 치료에 불응성이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 다른 암 약물에 저항성인 혈액 악성종양의 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 높은 수준의 p110δ 활성을 나타내는 혈액 악성종양의 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비교적 낮은 수준의 p110α 활성을 나타내는 혈액 악성종양의 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 Akt 인산화 활성을 구성적으로 발현하는 혈액 악성종양의 치료를 위해 선택된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에게 본원에 기재된 화학식 A의 화합물을 암을 치료하는데 사용되는 요법과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 "요법" 또는 "치료"는 화학식 A의 화합물의 사용을 포함하지 않는 암을 치료하는데 사용되는 임의의 널리 공지된 통상적 또는 실험적 형태의 치료에 의한 암의 치료이다. 특정 실시양태에서, 화학식 A의 화합물과 암 또는 자가면역 질환을 치료하는데 사용되는 통상적 또는 실험적 요법의 조합은 조합되지 않은 치료에 의해 수득되는 결과와 비교하여 우수한 유익하고/거나 바람직한 치료 결과를 제공한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는데 사용되는 요법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 문헌에 기재되어 있다. 요법은 화학요법, 및 화학요법의 조합, 생물학적 요법, 면역요법, 방사성면역요법, 및 모노클로날 항체 및 백신의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 조합 방법은 요법 투여와 동시에 또는 요법 투여 기간 동안에 투여되는 화학식 A의 화합물을 제공한다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 다른 화학요법 치료와 동시에 투여된다. 특정 실시양태에서, 조합 방법은 요법 투여 전에 또는 후에 투여되는 화학식 A의 화합물을 제공한다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 적어도 하나의 표준 또는 실험적 화학요법에 불응성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 적어도 2종의 표준 또는 실험적 화학요법에 불응성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 적어도 3종의 표준 또는 실험적 화학요법에 불응성이다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 적어도 4종의 표준 또는 실험적 화학요법에 불응성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 플루다라빈, 리툭시맙, 알킬화제, 알렘투주맙 및 상기 열거된 화학요법 치료 a-q로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 표준 또는 실험적 화학요법에 불응성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 플루다라빈, 리툭시맙, 알킬화제, 알렘투주맙 및 상기 열거된 화학요법 치료 a-q로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종의 표준 또는 실험적 화학요법에 불응성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 플루다라빈, 리툭시맙, 알킬화제, 알렘투주맙 및 상기 열거된 화학요법 치료 a-q로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3종의 표준 또는 실험적 화학요법에 불응성이다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 대상체는 플루다라빈, 리툭시맙, 알킬화제, 알렘투주맙 및 상기 열거된 화학요법 치료 a-q로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 4종의 표준 또는 실험적 화학요법에 불응성이다.
조합 투여에 관한 정확한 상세사항들은 실험적으로 결정될 수 있다. 화학식 A의 화합물을 선택된 요법과 함께 투여하는 것의 순서 및 타이밍의 개선은 개별 대상체, 대상체에서 치료할 상태의 성질, 및 일반적으로 담당 진료의의 판단에 맞춰질 것이다.
실험적 또는 표준 요법의 비제한적 예가 하기에 기재된다. 또한, 특정 림프종의 치료가 문헌 [Cheson, B.D., Leonard, J.P., "Monoclonal Antibody Therapy for B-Cell Non-Hodgkin's Lymphoma" The New England Journal of Medicine 2008, 359(6), p. 613-626; 및 Wierda, W.G., "Current and Investigational Therapies for Patients with CLL" Hematology 2006, p. 285-294]에 검토되어 있다. 미국에서의 림프종 발생 패턴이 문헌 [Morton, L.M., et al. "Lymphoma Incidence Patterns by WHO Subtype in the United States, 1992-2001" Blood 2006, 107(1), p. 265-276]에 요약되어 있다.
비-호지킨 림프종, 특히 B 세포 기원의 비-호지킨 림프종의 치료는 모노클로날 항체, 표준 화학요법 접근법 (예를 들어, CHOP, CVP, FCM, MCP 등), 방사선면역요법, 및 그의 조합, 특히 항체 요법과 화학요법의 통합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
비-호지킨 림프종/B-세포 암에 대한 접합되지 않은 모노클로날 항체의 비제한적 예는 리툭시맙, 알렘투주맙, 인간 또는 인간화 항-CD20 항체, 루밀릭시맙, 항-TRAIL, 베바시주맙, 갈릭시맙, 에프라투주맙, SGN-40, 및 항-CD74를 포함한다. 비-호지킨 림프종/B-세포 암의 치료에서 사용되는 실험적 항체 작용제의 비제한적 예는 오파투무맙, ha20, PRO131921, 알렘투주맙, 갈릭시맙, SGN-40, CHIR-12.12, 에프라투주맙, 루밀릭시맙, 아폴리주맙, 밀라투주맙 및 베바시주맙을 포함한다. 임의의 모노클로날 항체가 리툭시맙, 플루다라빈, 또는 화학요법제/요법과 조합될 수 있다.
비-호지킨 림프종/B-세포 암에 대한 화학요법의 표준 요법의 비제한적 예는 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손), FCM (플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론), CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), MCP (미톡산트론, 클로람부실, 및 프레드니솔론), R-CHOP (리툭시맙 플러스 CHOP), R-FCM (리툭시맙 플러스 FCM), R-CVP (리툭시맙 플러스 CVP), 및 R-MCP (R-MCP)를 포함한다.
비-호지킨 림프종/B-세포 암에 대한 방사성면역요법의 비제한적 예는 이트륨-90-표지된 이브리투모맙 티욱세탄, 및 아이오딘-131-표지된 토시투모맙을 포함한다. 이들 치료제는 재발 또는 불응성 여포성 또는 저등급 림프종을 앓는 대상체에서의 사용에 대해 승인되어 있다.
외투 세포 림프종에 대한 치유적 치료는 조합 화학요법, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손), 하이퍼CVAD (과분별화 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 덱사메타손, 메토트렉세이트, 시타라빈) 및 FCM (플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론)을 포함한다. 또한, 이러한 요법들에 모노클로날 항체 리툭시맙 (리툭산)이 보충되어 조합 요법 R-CHOP, 하이퍼CVAD-R 및 R-FCM이 형성될 수 있다. 다른 접근법은 상기 언급된 요법들 중 임의의 것을 줄기 세포 이식 또는 ICE (이포스파미드, 카르보플라틴 및 에토포시드)로의 치료와 조합하는 것을 포함한다.
외투 세포 림프종 치료에 대한 또 다른 접근법은 면역요법, 예컨대 리툭시맙 (리툭산)과 같은 모노클로날 항체를 사용하는 것을 포함한다. 리툭시맙은 변연부 림프종, WM, CLL 및 소림프구성 림프종을 포함하는 다른 무통성 B-세포 암에 대해 또한 효과적이다. 리툭시맙 및 화학요법제의 조합이 특히 효과적이다. 변형된 접근법은 모노클로날 항체가 방사성동위원소 입자와 조합된 방사성면역요법, 예컨대 아이오딘-131 토시투모맙 (벡사르(Bexxar)®) 및 이트륨-90 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(Zevalin)®)이다. 또 다른 예에서, 벡사르®가 CHOP와의 순차적 치료에서 사용된다. 또 다른 면역요법 예는 개별 환자의 종양의 유전적 구성을 기초로 하는 암 백신을 사용하는 것을 포함한다. 림프종 백신의 예는 GTOP-99 (마이백스(MyVax)®)이다.
외투 세포 림프종을 치료하는 것에 대한 또 다른 접근법은 고용량 화학요법과 커플링된 자가 줄기 세포 이식이다.
외투 세포 림프종을 치료하는 것에 대한 또 다른 접근법은 프로테아솜 억제제, 예컨대 벨케이드® (보르테조밉 또는 PS-341), 또는 항혈관신생제, 예컨대 탈리도미드를, 특히 리툭산과 조합하여, 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 치료 접근법은 Bcl-2 단백질의 분해를 일으키고 화학요법에 대한 암 세포 감수성을 증가시키는 약물, 예컨대 오블리메르센 (게나센스)을 다른 화학요법제와 조합하여 투여하는 것이다. 또 다른 치료 접근법은 세포 성장의 억제 및 심지어 세포 사멸을 일으킬 수 있는 mTOR 억제제를 투여하는 것을 포함하고; 비제한적 예는 템시롤리무스 (CCI-779), 및 템시롤리무스와 리툭산®, 벨케이드® 또는 다른 화학요법제의 조합이다.
MCL에 대한 다른 최근의 요법이 문헌 [Nature Reviews; Jares, P. 2007]에 개시되어 있다. 비제한적 예는 플라보피리돌, PD0332991, R-로스코비틴 (셀리실립(Selicilib), CYC202), 스티릴 술폰, 오바토클락스 (GX15-070), TRAIL, 항-TRAIL DR4 및 DR5 항체, 템시롤리무스 (CC1-779), 에베롤리무스 (RAD001), BMS-345541, 쿠르쿠민, 보리노스타트 (SAHA), 탈리도미드, 레날리도미드 (레블리미드(Revlimid)®, CC-5013), 및 겔다나마이신 (17-AAG)을 포함한다.
발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 치료하는데 사용되는 다른 치료제의 비제한적 예는 페리포신, 보르테조밉 (벨케이드®), 리툭시맙, 실데나필 시트레이트 (비아그라®), CC-5103, 탈리도미드, 에프라투주맙 (hLL2- 항-CD22 인간화 항체), 심바스타틴, 엔자스타우린, 캄파트-1H, 덱사메타손, DT PACE, 오블리메르센, 안티네오플라스톤 A10, 안티네오플라스톤 AS2-1, 알렘투주맙, 베타 알레틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 히드로클로라이드, 프레드니손, 빈크리스틴 술페이트, 플루다라빈, 필그라스팀, 멜팔란, 재조합 인터페론 알파, 카르무스틴, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 에토포시드, 멜팔란, 돌라스타틴 10, 인듐 In 111 모노클로날 항체 MN-14, 이트륨 Y 90 인간화 에프라투주맙, 항-흉선세포 글로불린, 부술판, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 치료 동종이형 림프구, 이트륨 Y 90 이브리투모맙 티욱세탄, 시롤리무스, 타크롤리무스, 카르보플라틴, 티오테파, 파클리탁셀, 알데스류킨, 재조합 인터페론 알파, 도세탁셀, 이포스파미드, 메스나, 재조합 인터류킨-12, 재조합 인터류킨-11, Bcl-2 패밀리 단백질 억제제 ABT-263, 데니류킨 디프티톡스, 타네스피마이신, 에베롤리무스, 페그필그라스팀, 보리노스타트, 알보시딥, 재조합 flt3 리간드, 재조합 인간 트롬보포이에틴, 림포카인-활성화 킬러 세포, 아미포스틴 3수화물, 아미노캄프토테신, 이리노테칸 히드로클로라이드, 카스포펀진 아세테이트, 클로파라빈, 에포에틴 알파, 넬라라빈, 펜토스타틴, 사르그라모스팀, 비노렐빈 디타르트레이트, WT-1 유사체 펩티드 백신, WT1 126-134 펩티드 백신, 펜레티니드, 익사베필론, 옥살리플라틴, 모노클로날 항체 CD19, 모노클로날 항체 CD20, 오메가-3 지방산, 미톡산트론 히드로클로라이드, 옥트레오티드 아세테이트, 토시투모맙 및 아이오딘 I-131 토시투모맙, 모텍사핀 가돌리늄, 삼산화비소, 티피파르닙, 자가 인간 종양-유래 HSPPC-96, 벨투주맙, 브리오스타틴 1, 및 PEG화 리포솜형 독소루비신 히드로클로라이드, 및 그의 임의의 조합을 포함한다.
미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 약물 요법을 치료하는데 사용되는 다른 치료제의 비제한적 예 (문헌 [Blood 2005 Abramson, J.])는 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손, 항-CD20 모노클로날 항체, 에토포시드, 블레오마이신, 발덴스트롬에 대해 열거된 작용제들 중 다수, 및 그의 임의의 조합, 예컨대 ICE 및 R-ICE를 포함한다.
발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 치료하는데 사용되는 치료 절차의 비제한적 예는 말초 혈액 줄기 세포 이식, 자가 조혈 줄기 세포 이식, 자가 골수 이식, 항체 요법, 생물학적 요법, 효소 억제제 요법, 전신 방사선조사, 줄기 세포 주입, 줄기 세포 보조를 수반한 골수 파괴, 시험관내-처리 말초 혈액 줄기 세포 이식, 제대혈 이식, 면역효소 기술, 약리학적 연구, 저-LET 코발트-60 감마선 요법, 블레오마이신, 통상적인 수술, 방사선 요법, 및 비골수파괴성 동종이형 조혈 줄기 세포 이식을 포함한다.
만성 림프구성 백혈병을 치료하는데 사용되는 다른 치료제의 비제한적 예 (문헌 [Spectrum, 2006, Fernandes, D.])는 클로람부실 (류케란), 시클로포스파미드 (실록산, 엔독산, 엔독사나, 시클로스틴), 플루다라빈 (플루다라), 펜트스타틴 (니펜트), 클라드리빈 (레우스타린), 독소루비신 (아드리아마이신®, 아드리블라스틴), 빈크리스틴 (온코빈), 프레드니손, 프레드니솔론, 알렘투주맙 (캄파트, 맵캄파트), 발덴스트롬에 대해 열거된 작용제들 중 다수, 및 화학요법과 화학면역요법의 조합 (통상적인 조합 요법: CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손); R-CVP (리툭시맙-CVP); ICE (이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드); R-ICE (리툭시맙-ICE); FCR (플루다라빈, 시클로포스파미드, 리툭시맙); 및 FR (플루다라빈, 리툭시맙) 포함)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 방법은 상기 환자에게 I 또는 II의 화합물 뿐만 아니라, 상기 환자에서 상기 암을 치료하기 위해 선택된 적어도 하나의 치료제의 치료 유효량 및/또는 치료 절차를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 상기 환자에게 I 또는 II의 화합물 뿐만 아니라, a) 벤다무스틴; b) 리툭시맙; c) 벤다무스틴 및 리툭시맙; d) 오파투무맙; 및 e) 레날리도미드로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제의 조합의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 화합물은 당업계에 널리 공지된 통상적으로 이해되는 제제화 기술을 사용하여 동물 대상체에 대한 투여를 위해 제제화될 수 있다. 특정한 투여 방식 및 화학식 A의 화합물에 적합한 제제를 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 화합물은 전구약물 형태, 즉, 대상체에 대한 투여 후에 본 발명의 화합물을 방출하는 보호된 형태로 제조될 수 있다. 전형적으로, 보호기는 체액에서, 예컨대 혈류에서 가수분해됨으로써 활성 화합물을 방출하거나, 생체내에서 산화 또는 환원되어 활성 화합물을 방출한다. 전구약물에 대한 논의는 문헌 [Smith and Williams Introduction to the Principles of Drug Design, Smith, H.J.; Wright, 2nd ed., London (1988)]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 화합물은 순수한 화합물질로 투여될 수 있지만, 전형적으로는 제약 조성물 또는 제제 형태로 화합물을 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 또한 화학식 A의 화합물 및 생체적합성 제약 담체, 아주반트 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 조성물은 부형제(들) 또는 다른 제약상 허용되는 담체와 혼합된 화학식 A의 화합물을 유일한 활성 모이어티로서 또는 다른 작용제, 예컨대 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드, 올리고- 또는 폴리펩티드, 약물, 또는 호르몬과 조합하여 포함할 수 있다. 담체 및 기타 성분은 제제의 다른 성분과 혼화성이고 그의 수용자에게 해롭지 않은 한 제약상 허용되는 것으로 간주될 수 있다.
제약 조성물은 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유하도록 제제화되고, 제약상 사용될 수 있는 제제 내로의 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 임의로 포함할 수 있다. 투여 양식은 일반적으로 담체의 성질을 결정한다. 예를 들어, 비경구 투여용 제제는 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물 및 다른 생리학상 상용성인 용액 중에서 선택될 수 있다. 비경구 투여에 바람직한 담체는 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거액 또는 생리학상 완충 염수이다. 조직 또는 세포 투여의 경우에, 침투되는 특정한 장벽에 대하여 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 단백질을 포함하는 제제의 경우에, 제제는 안정화 물질, 예컨대 폴리올 (예를 들어, 수크로스) 및/또는 계면활성제 (예를 들어, 비이온성 계면활성제) 등을 포함할 수 있다.
대안적으로, 비경구용 제제는 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조되는 활성 화합물의 분산액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예컨대 참깨 오일, 및 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 상기 현탁액은 고도로 농축된 용액이 제조되게 하기 위하여 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 작용제를 또한 포함할 수 있다. 활성제의 pH-감수성 가용화 및/또는 지속 방출을 제공하는 수성 중합체, 예를 들어 메타크릴산 중합체, 예컨대 롬 아메리카 인크(Rohm America Inc.) (뉴저지주 피스카타웨이)로부터 입수가능한 유드라짓(Eudragit)® 시리즈가 코팅제 또는 매트릭스 구조물로서 또한 사용될 수 있다. 에멀젼, 예를 들어 수중유 및 유중수 분산액이 또한 사용될 수 있으며, 이는 유화제 또는 분산제 (표면 활성 물질; 계면활성제)에 의해 임의로 안정화된다. 현탁액은 현탁화제, 예컨대 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천-한천, 트라가칸트 검, 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다.
화학식 A의 활성 화합물을 함유하는 리포솜이 비경구 투여에 또한 사용될 수 있다. 일반적으로 리포솜은 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유래된다. 리포솜 형태의 조성물은 기타 성분, 예컨대 안정화제, 보존제, 부형제 등을 또한 함유할 수 있다. 바람직한 지질은 천연 및 합성 인지질 및 포스파티딜 콜린 (레시틴)을 포함한다. 리포솜의 형성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Prescott (Ed.), Methods in Cell Biology, Vol. XIV, p. 33, Academic Press, New York (1976)]을 참조한다.
경구 투여에 적합한 투여량으로 화학식 A의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 당업계에 널리 공지된 제약상 허용되는 담체를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구 투여용으로 제제화된 제제는 정제, 환제, 캡슐, 카쉐, 당의정, 로젠지, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 엘릭시르, 현탁액, 또는 분말의 형태일 수 있다. 예시를 위해서는, 경구 사용을 위한 제약 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 조합하고, 임의로, 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우에 적합한 보조제를 첨가한 후 과립들의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 얻어질 수 있다. 경구 제제는 비경구 사용에 대해 기재한 것과 유형 면에서 유사한 액체 담체, 예를 들어 완충 수용액, 현탁액 등을 이용할 수 있다.
바람직한 경구 제제는 정제, 당의정 및 젤라틴 캡슐을 포함한다. 이들 제제는 비제한적으로 하기를 포함하는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다:
a) 희석제, 예컨대 당, 예를 들어 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨;
b) 결합제, 예컨대 규산알루미늄마그네슘, 옥수수, 밀, 벼, 감자 등으로부터의 전분;
c) 셀룰로스 물질, 예컨대 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 및 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 검, 예컨대 아라비아 검 및 트라가칸트 검, 및 단백질, 예컨대 젤라틴 및 콜라겐;
d) 붕해제 또는 가용화제, 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨 또는 발포성 조성물;
e) 윤활제, 예컨대 실리카, 활석, 스테아르산 또는 그의 마그네슘 또는 칼슘 염, 및 폴리에틸렌 글리콜;
f) 향미제 및 감미제;
g) 예를 들어 생성물을 확인하거나 활성 화합물의 양 (투여량)을 특성화하기 위한, 착색제 또는 안료; 및
h) 다른 성분, 예컨대 보존제, 안정화제, 팽윤제, 유화제, 용액 프로모터, 삼투압 조절용 염 및 완충제.
일부 바람직한 경구 제제에서, 제약 조성물은 상기 (a) 군으로부터의 적어도 하나의 물질, 또는 상기 (b) 군으로부터의 적어도 하나의 물질, 또는 상기 (c) 군으로부터의 적어도 하나의 물질, 또는 상기 (d) 군으로부터의 적어도 하나의 물질, 또는 상기 (e) 군으로부터의 적어도 하나의 물질을 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 상기 (a)-(e) 군으로부터 선택된 2개의 군 각각으로부터의 적어도 하나의 물질을 포함한다.
젤라틴 캡슐은 젤라틴으로 만들어진 푸시-핏 (push-fit) 캡슐 뿐만 아니라 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 코팅으로 만들어진 연질의 밀봉된 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 충전제, 결합제, 윤활제 및/또는 안정제 등과 혼합된 활성 성분(들)을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서 활성 화합물은 적합한 유체, 예컨대 지방 오일, 액상 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 (안정화제를 포함하거나 포함하지 않음)에 용해 또는 현탁될 수 있다.
당의정 코어에는 적합한 코팅, 예컨대 농축 당 용액이 제공될 수 있으며, 이는 또한 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다.
제약 조성물은 활성 화합물의 염으로서 제공될 수 있다. 염은 수성 또는 다른 양성자성 용매에서 상응하는 유리 산 또는 염기 형태보다 더 가용성인 경향이 있다. 제약상 허용되는 염은 당업계에 널리 공지되어 있다. 산성 모이어티를 함유하는 화합물은 적합한 양이온과 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 양이온은 예를 들어 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨 또는 칼륨) 및 알칼리 토류 (예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘) 양이온을 포함한다.
염기성 모이어티를 함유하는 구조 화학식 (A)의 화합물은 적합한 산과 함께 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 예를 들어, 버지(Berge) 등은 문헌 [J Pharm Sci, 66:1 (1977)]에 제약상 허용되는 염을 상세하게 기개하였다. 염은 본 발명의 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 계내에서 제조되거나 유리 염기 작용체를 적합한 산과 반응시킴으로써 개별적으로 제조될 수 있다.
대표적인 산 부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포롤술포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로아이오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트 (이소티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트 또는 술페이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트 또는 히드로겐 포스페이트, 글루타메이트, 비카르보네이트, p-톨루엔술포네이트 및 운데카노네이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 산 부가염을 형성하도록 사용될 수 있는 산의 예는 염산, 브로민화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기 산, 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기 산을 비제한적으로 포함한다.
염기성 질소-함유 기는 저급 알킬 할라이드, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드; 디알킬 술페이트, 예컨대 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 술페이트; 장쇄 알킬 할라이드, 예컨대 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드; 아릴알킬 할라이드, 예컨대 벤질 및 페네틸 브로마이드; 및 기타의 것과 같은 작용제로 4급화될 수 있다. 이에 의해 용해도 또는 분산성이 변형된 생성물이 수득된다.
제약상 허용되는 담체 내에 제제화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제조하고, 적합한 용기 내에 넣고, 지시된 상태의 치료용으로 라벨을 부착할 수 있다. 따라서, 제조품, 예컨대 본 발명의 화합물의 투여 형태 및 화합물의 사용 지침서를 포함하는 라벨을 포함하는 용기가 또한 고려된다. 키트가 본 발명에서 또한 고려된다. 예를 들어, 키트가 투여 형태의 제약 조성물, 및 의학적 상태의 치료에서의 조성물의 사용 지침서를 함유하는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 어느 경우에도, 라벨 상에 지시된 상태는 염증성 장애, 암 등의 치료를 포함할 수 있다.
투여 방법
화학식 A의 화합물을 포함하는 제약 조성물은 비경구 및 경장 기술을 포함하는 임의의 통상의 방법에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 투여 양식은 조성물이 위장관을 통과하는 경로 이외의 경로, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복강내, 척수내, 근육내, 관절내, 경막내 및 심실내 주사에 의해 투여되는 양식을 포함한다. 경장 투여 양식은 예를 들어 경구 (협측 및 설하 포함) 및 직장 투여를 포함한다. 경상피 투여 양식은 예를 들어 경점막 투여 및 경피 투여를 포함한다. 경점막 투여는, 예를 들어 경장 투여 뿐만 아니라 비강 투여, 흡입 투여 및 심폐 투여; 질 투여; 및 직장 투여를 포함한다. 경피 투여는 패치 및 이온영동 장치 뿐만 아니라 페이스트, 살브 또는 연고의 국소 적용을 예를 들어 포함하는 수동 또는 능동 경피 또는 경피 양식을 포함한다. 고압 기술, 예를 들어 파우더젝트(POWDERJECT)™를 사용하여 비경구 투여가 또한 달성될 수 있다.
수술 기술은 데포(depot) (저장소) 조성물의 이식, 삼투압 펌프 등을 포함한다. 염증 치료를 위한 바람직한 투여 경로는 관절염과 같은 국소 장애를 위한 국부 또는 국소 전달, 또는 광범위한 장애를 위한 전신 전달, 예를 들어 재관류 손상 또는 패혈증과 같은 전신성 상태를 위한 정맥내 전달일 수 있다. 기도가 수반되는 질환, 예를 들어 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 및 폐기종이 포함되는 다른 질환에 대해, 스프레이, 에어로졸, 분말 등의 흡입 또는 심폐 투여에 의해 투여가 달성될 수 있다.
일부 상기 실시양태에서, 화학식 A의 화합물은 화학요법, 방사선요법 및/또는 수술의 투여 전에, 그 동안 또는 그 후에 투여된다. 선택된 제제 및 투여 경로는 개별 대상체, 대상체에서 치료할 상태의 성질, 및 일반적으로, 담당 진료의의 판단에 따라 맞춰질 것이다.
세포를 암 세포인 것으로 확인시키는 마커를 발현하는 암 세포에 대한 표적화된 전달을 위해 화합물을 변형 또는 유도체화시킴으로써 화학식 A의 화합물의 치료 지수가 증진될 수 있다. 예를 들어, 이전에 기재된 바와 같이, 화합물이 암 세포에 근접하여 자신의 효과를 국소적으로 발휘하도록, 암 세포에 대해 선택적이거나 특이적인 마커를 인식하는 항체에 화합물을 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pietersz, et al., Immunol Rev, 129:57 (1992); Trail, et al., Science, 261:212 (1993); 및 Rowlinson-Busza, et al., Curr Opin Oncol, 4:1142 (1992)] 참조). 이러한 화합물의 종양에 대해 지시된 전달은, 특히 방사선 치료 또는 화학요법으로부터 일어날 수 있는 잠재적인 비특이적 독성을 최소화함으로써, 치료 이익을 증진시킨다. 또 다른 측면에서, 화학식 A의 화합물 및 방사성동위원소 또는 화학요법제가 동일한 항종양 항체에 접합될 수 있다.
작용제 자체 및 작용제의 제제의 특성이 투여되는 작용제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 약동학 및 약역학 정보를 전임상 시험관내 및 생체내 연구를 통해 수집한 후에, 임상 시험 과정 중에 인간에서 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료 유효 용량을 초기에 생화학적 및/또는 세포-기반 검정으로부터 추정할 수 있다. 이어서, 투여량을 동물 모델에서 제제화하여, 특정한 PI3K 이소형 또는 이소형의 조합의 발현 또는 활성을 조정하는 바람직한 혈중 농도 범위를 달성한다. 인간 연구를 수행함에 따라, 다양한 질환 및 상태를 위한 적절한 투여량 수준 및 치료의 지속기간에 관하여 추가적인 정보들이 판명될 것이다.
본 발명의 화합물이 잘 허용되지만, 치료 투여량에 대한 제한의 예는 상승된 간 기능 검사 (LFT)이다. LFT는 환자의 혈청 또는 혈장에 대한 표준 임상 생화학 시험을 수반하여, 환자의 간의 상태에 관한 정보를 제공한다. 정상 범위를 벗어나는, 알라닌 트랜스아미나제, 아스파르테이트 트랜스아미나제, 알칼리성 포스파타제, 빌리루빈, 및 감마 글루타밀 트랜스펩티다제와 같은 수준이 가능한 간 독성 신호를 전달할 수 있다. 상승된 간 기능 검사 값 및 후속 간 독성에 대한 잠재성을 피하거나 감소시키기 위해 치료 화합물의 투여가 조정될 수 있다. 예를 들어, 대상체에게 증가되는 용량의 화합물을 투여할 수 있다. 특정 용량에서, 대상체에서 정상 범위를 벗어나는 LFT 수준 상승이 발생하기 시작하여, 이러한 투여량에서 잠재적인 간 독성의 신호를 전달한다. 이에 반응하여, LFT 수준이 치료 담당의가 판단시 허용되는 범위, 예를 들어 치료될 대상에 대해 정상인 범위 내이거나 정상의 약 25% 내지 50% 내인 수준으로 감소되도록 하는 양으로 투여량이 감소될 수 있다. 따라서, 간 기능 검사를 이용하여 화합물의 투여량을 적정할 수 있다.
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어 LD50 (집단 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50 (집단 50%에 대한 치료 유효 용량)을 측정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 "치료 지수"이고, 이는 전형적으로 LD50/ED50 비로 표현된다. 큰 치료 지수를 나타내는, 즉 독성 용량이 유효 용량보다 실질적으로 더 높은 화합물이 바람직하다. 이러한 세포 배양 검정 및 추가의 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간 용도를 위한 투여량 범위를 제제화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
치료-관련 독성 증상들에 의해 투여량이 제한될 수 있다. 상승된 간 기능 검사 이외에 이러한 증상은 빈혈, 시각 혼탁, 설사, 구토, 피로, 점막염, 말초 부종, 발열, 말초 신경병증, 흉막 삼출, 야간 발한, 및 좌위호흡, 또는 그의 조합을 포함한다. 특정 용량에서, 대상체에서 허용되지 않는 수준의 이러한 증상이 발생하면, 유해 사례가 제거되고 더 이상 유해하지 않도록 투여량이 감소될 수 있거나, 또는 치료 담당의가 판단시에 허용되는 수준으로 투여량이 감소될 수 있다.
환자에 대한 화합물의 적합한 용량을 결정하는데 있어 또 다른 고려사항은 혈장 내에서 순환되고 있는 원하는 농도이다. 특정한 실시양태에서, 화합물의 혈중 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 40-3,000 ng/mL이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 화합물의 혈중 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 75-2,000 ng/mL이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 화합물의 혈중 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 500-2,000 ng/mL이다. 바람직한 실시양태에서, 화합물의 혈중 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 40-3,000 ng/mL이고, 여기서 화합물은 화학식 I, I", II, 또는 II"의 화합물이고, 약 50 mg, 100 mg, 150 mg 또는 200 mg의 양으로 경구 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 화합물의 혈중 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 40-3,000 ng/mL이고, 여기서 화합물은 화학식 I의 화합물이고, 약 50 mg, 100 mg, 150 mg 또는 200 mg의 양으로 경구 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 화합물의 혈중 농도는 투여 시점으로부터 12시간 기간에 걸쳐 40-3,000 ng/mL이고, 여기서 화합물은 화학식 II의 화합물이고, 약 50 mg, 100 mg, 150 mg 또는 200 mg의 양으로 경구 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 혈장 내의 최대 농도가 투여로부터 2시간 내에 달성된다.
특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 평균적으로 8 내지 12시간의 기간에 걸쳐 약 10 nM 이상의 약물의 혈장 농도를 제공하도록, 및 약 500 nM 이상, 바람직하게는 약 1000 nM 이상의 최대 혈장 농도를 제공하도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 평균적으로 8 내지 12시간의 기간에 걸쳐 약 100 nM 이상의 약물의 혈장 농도를 제공하도록, 및 약 500 nM 이상, 바람직하게는 약 1000 nM 이상의 최대 혈장 농도를 제공하도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 평균적으로 8 내지 12시간의 기간에 걸쳐 약 200 nM 이상의 약물의 혈장 농도를 제공하도록, 및 약 500 nM 이상, 바람직하게는 약 1000 nM 이상의 최대 혈장 농도를 제공하도록 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 화합물의 최저 농도가 치료 효과, 예컨대 암 세포의 아폽토시스가 관찰되는 범위 내인 혈장 농도를 생성하도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 혈장 내의 PI3Kδ 이소형 활성화 EC50 이상의 최저 혈장 농도를 생성하도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물의 투여량은 화합물 투여로부터 적어도 12시간의 기간 동안 세포 내에서 PI3Kδ 활성화에 대한 EC50 수준을 초과하고 PI3Kγ 활성화에 대한 EC50 수준 미만인 최저 혈중 농도를 생성하도록 선택된다. 예를 들어, 전혈 혈장 내에서 PI3K δ 호염기구 활성화에 대한 EC50 값이 65 nM이고, PI3K γ 호염기구 활성화에 대한 EC50 값이 1100 nM이면, 선택된 화합물의 투여량은 화합물 투여로부터 8-12시간의 기간 동안 60 nM 내지 1100 nM의 화합물의 최저 혈장 농도를 제공한다. 유사하게, PI3Kδ 호염기구 활성화에 대한 EC50 수준을 초과하고 PI3K -α, -β 또는 -γ 호염기구 활성화에 대한 EC50 수준 미만인 최저 혈액 농도를 생성하도록 투여량이 선택될 수 있다. 당업자는 생체내에서의 PI3K 이소형 활성화 또는 억제에 대한 EC50 값을 결정할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 약물의 최저 농도의 상위 범위는 혈장 내의 PI3K -γ, -α 또는 -β 이소형의 EC50 값을 초과할 수 있고, 이에 의해 제한되지는 않는다. 또한, 약물의 혈중 농도 범위는 혈액 악성종양을 치료하는데 있어서 치료적으로 이로운 한편, 바람직하지 않은 부작용을 최소화하는 수준이다.
예를 들어, 화합물이 델타-선택적이면서 임상적으로 유용하도록, 즉 신호전달을 위해 p110γ에 의존하는 암에 대해 효과적이도록 p110γ에 대해 충분한 활성을 나타낼 수 있는데, 이는 다른 이소형, 특히 알파 이소형과 비교하여 여전히 선택적이면서 p110γ의 억제를 위한 유효 투여량을 초과하는 혈장 수준이 달성될 수 있기 때문이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 화합물의 투여량은 p110δ 및 p110γ를 선택적으로 억제하는데 효과적인 혈중 농도를 생성하도록 선택된다.
일부 실시양태에서, 화합물의 투여량은 화합물 투여로부터 8 내지 12시간의 기간 동안 65 nM 내지 1100 nM의 최저 혈장 농도를 제공한다. 일부 상기 실시양태에서, 상기 기간은 화합물 투여로부터 적어도 12시간이다.
특정한 실시양태에서, 화합물이 치료 유효량으로 투여된다.
특정한 실시양태에서, 화합물이 20-500 mg/일의 용량으로 투여된다. 특정한 실시양태에서, 화합물은 50-250 mg/일의 용량으로 투여된다.
특정한 실시양태에서, 화합물은 용량당 25 내지 150 mg의 용량으로 투여되고, 1일 2회 용량이 투여된다 (예를 들어, 25 내지 150 mg 용량으로 BID 투여). 바람직한 실시양태에서, 대상체는 50 mg 내지 100 mg의 화학식 A의 화합물로 1일 2회 치료된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 대상체는 150 mg의 화학식 A의 화합물로 1일 2회 치료된다.
특정한 실시양태에서, 방법은 상기 환자에게 20-500 mg의 초기 1일 용량의 화합물을 투여하는 것 및 임상 효능이 달성될 때까지 상기 용량을 점진적으로 증가시키는 것을 포함한다. 약 25, 50, 100 또는 150 mg의 증분을 사용하여 용량을 증가시킬 수 있다. 투여량은 매일, 격일로, 1주 2회, 또는 1주 1회 증가될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 방법은 임상 효능이 달성된 용량과 동일한 용량의 화합물을 투여함으로써 또는 상기 용량을 효능이 유지될 수 있는 수준으로 점진적으로 감소시킴으로써 상기 환자를 계속 치료하는 것을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 방법은 상기 환자에게 20-500 mg의 초기 1일 용량의 화합물을 투여하는 것 및 적어도 6일에 걸쳐 상기 용량을 1일 50-400 mg의 총 투여량으로 증가시키는 것을 포함한다. 임의로, 투여량이 약 750 mg/일로 추가로 증가될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 화합물은 매일 적어도 2회 투여된다.
특정 실시양태에서, 화합물은 경구로, 정맥내로 또는 흡입에 의해 투여된다. 바람직하게는, 화합물이 경구 투여된다. 일부 실시양태에서, 이는 약 50 mg BID의 투여량, 약 100 mg BID의 투여량, 또는 약 150 mg BID의 투여량으로 경구 투여된다.
본 발명의 방법을 위해, 투여 시기 및 순서를 조절하는 임의의 효과적인 투여 요법이 이용될 수 있다. 바람직하게는, 작용제의 용량은 유효량의 작용제를 포함하는 제약 투여량 단위를 포함한다. 본원에 사용된 "유효량"은 하나 이상의 제약 투여량 단위의 투여를 통해 PI3Kδ 발현 또는 활성을 조정하고/하거나 대상체의 생리학적 파라미터에서의 측정가능한 변화를 유도하는데 충분한 양을 지칭한다. "유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애를 완화시키는데 필요한 양을 또한 지칭할 수 있다.
화학식 A의 화합물에 대한 적합한 투여량 범위는 이러한 고려사항들에 따라 변하지만, 일반적으로, 화합물은 10.0 μg/kg-15 mg/kg(체중); 1.0 μg/kg-10 mg/kg(체중), 또는 0.5 mg/kg-5 mg/kg(체중)의 범위로 투여된다. 따라서, 전형적인 70 kg의 인간 대상체의 경우에, 투여량 범위는 용량당 700 μg-1050 mg; 70 μg-700 mg; 또는 35 mg-350 mg이고, 1일 2회 이상의 용량이 투여될 수 있다. 투여량은 화합물이 예를 들어 정맥내 투여와 비교하여 경구 투여되거나 경피 투여될 경우에 보다 높을 수 있다. 화학식 A의 화합물의 감소된 독성은 비교적 고용량의 치료적 투여를 허용한다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 750 mg/일까지의 본 발명의 화합물의 경구 투여가 적합하다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 50 mg BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 100 mg BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 150 mg BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 200 mg BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 A의 화합물은 350 mg BID의 용량으로 투여된다. 구체적 실시양태에서, 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종의 치료를 위해, 1일 1회 또는 바람직하게는 2회 경구 투여되는, 용량당 약 50-350 mg의 투여량이 종종 적합하다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 750 mg/일까지의 화합물 I" 또는 II"의 경구 투여가 적합하다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 I" 또는 II"의 화합물이 50 mg BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 I" 또는 II"의 화합물이 100 mg BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 I" 또는 II"의 화합물이 150 mg BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 I" 또는 II"의 화합물이 200 mg BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 화학식 I" 또는 II"의 화합물이 350 mg BID의 용량으로 투여된다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종의 치료를 위해, 1일 1회 또는 바람직하게는 2회 경구 투여되는, 용량당 약 50-350 mg의 화학식 I" 또는 II"의 화합물의 투여량이 종종 적합하다.
화합물은 단일 볼루스 용량으로, 정맥내 또는 경피 투여에서와 같이 경시적인 용량으로, 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다.
투여는 적어도 하나의 사이클 동안 계속된다. 일부 실시양태에서, 사이클은 적어도 7일이다. 일부 실시양태에서, 사이클은 약 28일이다. 일부 실시양태에서, 투여가 약 28일 동안 계속된 후에, 적어도 7일 동안 중단된다. 일부 실시양태에서, 완전 사이클은 28일 동안 매일 계속 투여된다. 환자에서 임상 반응의 평가는 각각의 사이클 후에 측정될 수 있다. 임상 결과를 이용하여 투여량을 증가시킬지, 감소시킬지, 중단할지 또는 유지할지 결정할 수 있다.
투여 경로에 따라, 적합한 용량을 체중, 체표면적, 또는 기관 크기에 따라 계산할 수 있다. 최종 투여 요법은 약물의 작용을 변형시키는 다양한 요인, 예를 들어 작용제의 비활성, 질환 상태의 동일성 및 중증도, 환자의 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 및 임의의 감염의 중증도를 고려하여, 우수한 의료 행위의 관점에서 담당의에 의해 결정될 것이다. 고려할 수 있는 추가의 요인은 투여 시간 및 빈도, 약물 조합, 반응 감수성, 및 요법에 대한 허용성/반응을 포함한다. 본원에 언급된 임의의 제제를 수반하는 치료에 적절한 투여량의 추가의 개선은, 특히 개시된 투여량 정보 및 검정, 뿐만 아니라 인간 임상 시험에서 관찰된 약동학적 데이터의 견지에서, 과도한 실험 없이, 숙련된 진료의에 의해 일상적으로 수행된다. 적절한 투여량은 용량 반응 데이터와 함께 체액 또는 기타 샘플 내의 작용제의 농도를 결정하기 위한 확립된 검정의 사용을 통해 확인될 수 있다.
투여 빈도는 화학식 A의 화합물의 약동학 파라미터 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 모이어티를 제공하거나 또는 원하는 효과를 유지하도록 조정된다. 따라서, 제약 조성물은 화합물의 원하는 최소 수준을 유지하는 것이 요구되는 경우에 단일 용량, 분리된 다중 용량, 연속 주입, 지속 방출 데포, 또는 그의 조합으로 투여될 수 있다. 단기 작용 제약 조성물 (즉, 짧은 반감기)은 1일 1회 또는 1일 1회 초과 (예를 들어, 1일 2회, 3회 또는 4회)로 투여될 수 있다. 장기 작용 제약 조성물은 3일 내지 4일마다, 매주, 또는 2주에 1회 투여될 수 있다. 펌프, 예컨대 피하, 복강내 또는 경막하 펌프가 연속 주입에 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에 유리하게 반응할 대상체는 의학적 및 수의학적 대상체를 포함하고, 일반적으로 인간 환자를 포함한다. 본 발명의 방법이 유용한 다른 대상체는 고양이, 개, 대형 동물, 조류, 예컨대 닭 등이 있다. 일반적으로, 화학식 A의 화합물이 이로울 임의의 대상체가 본 발명의 방법의 투여에 적절하다. 일부 상기 실시양태에서, 환자는 del(17p) 또는 del(11q)의 세포유전학적 특성을 갖는다다. 일부 상기 실시양태에서, 환자는 림프절병증을 앓는 환자이다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 환자에서 림프절병증의 크기를 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1 사이클의 치료 후에 림프절병증의 크기를 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1 사이클의 치료 후에 림프절병증의 크기를 적어도 10%만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1 사이클의 치료 후에 림프절병증의 크기를 적어도 25%만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1 사이클의 치료 후에 림프절병증의 크기를 적어도 30%만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1 사이클의 치료 후에 림프절병증의 크기를 적어도 40%만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1 사이클의 치료 후에 림프절병증의 크기를 적어도 50%만큼 감소시킨다. 일부 상기 실시양태에서, 화합물 I, I", II, 또는 II"의 사용은 1 사이클의 치료 후에 림프절병증의 크기를 적어도 75%만큼 감소시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 암인 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 화학식 I, II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 하나 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 프로테아솜 억제제이다. 하나 이상의 치료제는 벤다무스틴, 리툭시맙, 오파투무맙 및/또는 레날리도미드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 벤다무스틴, 리툭시맙 또는 이러한 2종의 치료제의 조합을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 오파투무맙을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 레날리도미드를 포함한다.
하나 이상의 치료제에 대한 적합한 투여량 범위는 달라질 수 있지만, 일반적으로 하나 이상의 치료제는 50 mg/㎡ 내지 1,500 mg/㎡의 범위로 투여된다. 한 실시양태에서, 벤다무스틴은 50 mg/㎡ 내지 150 mg/㎡의 범위로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 리툭시맙은 300 mg/㎡ 내지 400 mg/㎡의 범위로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 오파투무맙은 300 mg/㎡ 내지 1,500 mg/㎡의 범위로 투여된다.
화학식 A의 화합물과 조합된 하나 이상의 치료제의 투여는 적어도 하나의 사이클 동안 계속될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학식 A의 화합물과 조합된 하나 이상의 치료제의 투여는 적어도 7일 동안 계속될 수 있다. 다른 실시양태에서, 화학식 A의 화합물과 조합된 하나 이상의 치료제의 투여는 약 28일 동안 계속될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학식 A의 화합물 및 하나 이상의 치료제는 각각 적어도 하나의 사이클 동안 적어도 1회 투여된다. 하나 이상의 치료제는 대상체에게 화합물의 투여와 동일하거나 상이한 사이클에서 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 대상체에게 적어도 하나의 사이클의 적어도 제1일 및 제2일에 투여된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 매주 대상체에게 투여된다. 환자에서의 임상 반응의 평가는 각각의 사이클 후에 측정될 수 있다. 임상 결과를 이용하여 투여량을 증가시킬지, 감소시킬지, 중단할지 또는 유지할지 결정할 수 있다.
상기 실시양태들 중 일부에서, 상태는 혈액 악성종양이다. 바람직한 실시양태에서, 상태는 다발성 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B-세포 ALL, T-세포 ALL 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 화합물은 실질적으로 S-거울상이성질체로 구성된다. 구체적 실시양태에서, 화합물은 적어도 95%의 S-거울상이성질체를 포함한다. 상기 실시양태들 중 일부에서, 상기 화합물 및 치료제의 투여는 화합물과 치료제의 조합 없이 수득되는 결과보다 우월한 상승작용적 이익을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되나, 본 발명을 제한하지는 않는다. 하기의 실시예에서, '화학식 I의 화합물' 또는 '화학식 I'에 대한 언급은 여기서 제시된 S-거울상이성질체를 지칭하고, 이러한 실시예에서 사용된 샘플은 키랄 HPLC 방법에 의해 측정시 98.2%ee를 나타내었다:
Figure pct00038
또한, 이러한 화합물의 분석은 물질의 하기의 특성들을 밝혀내었다:
Figure pct00039
실시예 1
MM 세포에서의 세포 성장의 억제
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 다발성 골수종 (MM) 세포에서 시토카인 (IGF-1 및 IL-6)의 세포 성장 자극 효과를 억제한다는 것을 입증한다. LB 세포 (골수단핵구성 골수종 세포주)를 48시간 동안 대조군 배지와 함께; 화학식 I의 화합물과 함께, IL-6 또는 IGF-1의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. MM 세포 성장에 대한 화학식 I의 화합물의 억제 효과를 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라나트륨 브로마이드 (MTT; 케미콘 인터내셔널(Chemicon International)) 염료 흡광도를 측정함으로써 평가하였다. 48시간 배양의 마지막 4시간 동안 각 웰에 대해 5 mg/mL MTT 10 μL에 이어서, 0.04 N HCl을 함유하는 이소프로판올 100 μL로 세포를 펄싱하였다. 분광광도계 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 이용하여 570/630 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과의 요약은 도 1에 제시된다. 0.625 μM-2.5 μM의 화합물 I의 노출은 세포 성장 자극 시토카인의 존재 하에서도 MM 세포 성장을 억제하였다.
실시예 2
세포독성에 대한 BMSC의 효과
본 실시예는 골수 기질 세포 (BMSC)가 화합물 I-유도된 LB 세포 세포독성으로부터 보호하지 않는다는 것을 입증한다. LB 세포를 대조군 배지와 함께, 화학식 I의 화합물과 함께 48시간 동안 BMSC의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. [3H]-티미딘 흡수 검정을 이용하여 세포 증식을 평가하였다. 모든 데이터는 3중 실험의 평균 (± SD)을 나타낸다. 결과의 요약은 도 2에 제시된다. LB 세포 성장은 BMSC의 존재 하에서도 0.625 μM-10 μM의 화합물 I에 대한 노출 후에 감소되었다.
실시예 3
CLL 세포의 아폽토시스에 대한 화합물의 효과
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 환자 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포에서 아폽토시스를 유도한다는 것을 입증한다. 오하이오 주립 대학교로부터 CLL 연구 협회를 통해 B-CLL을 앓는 환자로부터 말초 혈액을 수득하였다. 1차 CD19-양성 세포를 로제트-셉(Rosette-Sep) (스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies))을 사용하여 단리하였다. 세포를 37℃, 5% CO2, 및 높은 습도에서 10% 열-불활성화 태아 소 혈청, 2 mmol/L L-글루타민, 및 페니실린 (100 유닛/mL)/스트렙토마이신 (100 μg/mL; 인비트로젠(Invitrogen))이 보충된 RPMI 1640 (인비트로젠) 중에 유지하였다. 화학식 I의 화합물 또는 배지와 함께 96시간 동안 인큐베이션한 후에, 5x105개의 세포를 PBS로 세척한 다음, 아넥신 V-FITC 원액 (바이오휘태커 인크(BioWhittaker, Inc)) 2 μL 및 20 μg/mL PI (시그마(Sigma)) 10 μL를 함유하는 결합 완충제 (10 mmol/L HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 1.8 mmol/L CaCl2)에 재현탁시켰다. 실온에서 10분 동안 광-차단 구역에서 인큐베이션한 후에, 팩스캔(FACScan)™ (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 상에서 유동 세포측정법에 의해 시편을 정량화하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, CLL 환자 세포를 화합물 I로 처리하면 아폽토시스가 유발되었고, 결과는 용량-의존성인 것으로 보였다.
도 19에서 데이터가 나타내는 바와 같이, 예후가 불량한 환자로부터의 CLL 세포에서 화합물 I 유도된 아폽토시스가 나타났다.
도 20에 제시된 바와 같이, 화합물 I 유도된 아폽토시스가 또한 불응성/재발 환자로부터의 CLL 세포에서 효과적인 것으로 나타났다.
실시예 4
ALL 세포주에서의 화합물의 효과
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 T-ALL 및 B-ALL (급성 림프모구성 백혈병) 백혈병 세포주 둘 다에서 세포 사멸이 동반되는 Akt 인산화의 감소 및 세포 증식의 감소를 일으킨다는 것을 입증한다. 알라마르블루(AlamarBlue) 검정 (인비트로젠)을 사용하여 세포주의 생존율 검정을 수행하였다. 100 μL 부피의 세포 (1 x 106개/웰)를 96-웰의 편평-바닥 플레이트에 넣고, 화학식 I의 화합물 (2x 최종 농도로 웰당 100 μL) 또는 배지 단독을 플레이트에 첨가하였다. 모두 4중으로 수행하였다. 정해진 시간 (48시간) 동안 세포를 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 10 μL 알라마르블루®를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 4시간 동안 인큐베이션하고, 530-560 nm에서의 광학 밀도를 스펙트라맥스(SpectraMax)® M5 플레이트 판독기 2001을 이용하여 수득하였다. 세포 생존율은 처리된 세포/대조군 샘플 사이의 흡광도의 백분율로서 표현되었다. 이러한 결과가 도 4에 제시된 표에 요약된다. 화합물 I에 대한 노출이 다양한 ALL 세포주에서의 세포 생존율의 실질적인 감소 뿐만 아니라 Akt 인산화의 감소를 나타내었다.
실시예 5
ALL 세포 주기에 대한 화합물의 효과
본 실시예는 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주 CCRF-SB를 화학식 I의 화합물로 처리하면 G0/G1 세포 주기 정지가 일어난다는 것을 입증한다. 화학식 I의 화합물의 존재 하의 성장, 및 정상적인 성장 조건 하의 프로피듐 아이오다이드-염색된 CCRF-SB 세포의 대표적인 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석. G0-G1, S, 및 G2-M 기의 세포의 평균 백분율이 막대그래프 아래의 표에서 계산되었다. 결과는 도 5에 제시된다.
실시예 6
유방암 세포의 증식의 억제
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 유방암 세포주의 증식을 억제한다는 것을 입증한다. T47D 및 HS-578T 세포주를 혈청 플러스 지시된 농도의 화학식 I의 화합물의 존재 하에 성장시켰다. 알라마르블루® 검정 (인비트로젠) 96-웰 플레이트에 의해 3중 웰에서 증식을 측정하였다. 증식 검정의 결과가 평균 세포 백분율 값으로 표현되고, 도 6에 제시된다.
실시예 7
난소암 세포주의 증식의 억제
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 난소암 세포주의 증식을 억제한다는 것을 입증한다. IGROV-1 및 OVCAR-3 세포주를 혈청 플러스 지시된 농도의 화학식 I의 화합물의 존재 하에 성장시켰다. 알라마르블루 검정 (인비트로젠) 96-웰 플레이트에 의해 3중 웰에서 증식을 측정하였다. 증식 검정의 결과가 평균 세포 백분율 값으로 표현되고, 도 7에 제시된다.
실시예 8
Akt 인산화의 감소
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 구성적 Akt 인산화를 나타낸 조혈 종양 세포주에서 구성적 Akt 인산화를 감소시킨다는 것을 입증한다. 백혈병 및 림프종 세포주의 대형 패널을 구성적 Akt 인산화에 대해 평가하였다. 이러한 세포주는 B-림프종, T-림프종, ALL, 악성 조직구증, DLBCL 및 AML을 나타낸다. 혈청 비의존성 Akt 인산화를 입증한 세포주를 2시간 동안 화학식 I의 화합물로 처리하였다. 그 후에, 세포를 용해시키고, 크기에 따라 분획화하고, 포스포-Akt(Ser473)에 대해 지시된 항체로 이뮤노블롯팅하였다. 결과가 도 8에 제시된다. 화합물 I에 대한 노출 후에 모든 세포주에서 Akt(Ser473)의 감소가 달성되었다.
실시예 9
DLBCL에서 효과적인 화합물 I
본 실시예는 화합물 I이 미만성 거대 B-세포 림프종 세포에서 PI3K 신호전달을 차단하고 아폽토시스를 유도한다는 증거를 제공한다. 도 26A에 제시된 바와 같이 P110δ가 DLBCL 세포주에서 발현되었다. 도 26B는 화합물 I에 대한 노출이 여러 DLBCL 세포주에서 pAKT 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다.
실시예 10
유방암 세포에서 아폽토시스의 유도
본 실시예는 화학식 I의 화합물이 유방암 세포주에서 아폽토시스를 유도한다는 것을 입증한다. HS-578T, T47D 및 MCF7 세포를 화학식 I의 화합물 또는 상응하는 DMSO 농도로 24시간 동안 처리하였다. 아폽토시스 세포의 백분율을 아넥신 V-FITC/7AAD 염색에 의해 결정하였다. 좌측 하부, 생존 세포 (아넥신 V-FITC/PI 음성); 우측 하부, 초기 아폽토시스 세포 (아넥신 V-FITC 양성 단독); 우측 상부, 중기-후기 아폽토시스 세포 (아넥신 V-FITC/7AAD 이중-양성); 및 좌측 상부, 후기 아폽토시스/괴사 (7AAD 양성 단독). 좌측 하부 사분면 (생존 세포)을 제외한 각각의 사분면 내의 세포의 백분율이 지시된다. 유사한 결과를 제공한 3회의 상이한 실험 중 대표적인 1회의 실험이 도 10에 제시된다.
실시예 11
건강한 지원자에서 제7일의 정상 상태 혈중 농도
본 실시예는 제7일의 건강한 인간 대상체의 혈액에서의 화학식 I의 화합물의 농도에 관한 데이터를 제공한다. 연구 제7일에 50, 100, 또는 200 mg BID의 화학식 I의 화합물의 경구 투여 후 12시간의 기간에 걸쳐 농도를 측정하였다. 도 11은 투여로부터 12시간의 기간에 걸친 약물의 혈장 농도를 주시한다. 약물의 최대 농도가 모든 용량에서 2시간 내에 달성되었다. 50, 100 또는 200 mg BID의 상기 화합물의 투여는 적어도 12시간 동안 호염기구에서 PI3Kδ EC50 농도를 초과하는 농도 수준을 나타내었다.
또한, 17-400 mg의 화학식 I의 화합물이 건강한 지원자에게 투여된 단일 용량 연구를 수행하였다. 화합물의 혈중 농도를 투여로부터 24시간에 걸쳐 측정하였고, 결과가 도 24a에 제시된다. 약 6시간에, 화합물 I의 혈중 농도는 투여된 모든 용량에서 적어도 약 100 nM이었다. 약 12시간에, 화합물 I의 혈중 농도는 용량 50 mg 이상에서 50 nM을 초과하였다. 투여로부터 2시간 내에 화합물 I의 혈중 최대 농도가 달성되었다.
또 다른 실험에서, 평균 화합물 I 농도를 건강한 지원자 (N=6)에서 50 mg BID 투여로부터 제7일에 측정하였다. 전혈 호염기구 활성화 검정에서 결정된 바와 같이, 평균 최저 농도는 PI3Kδ에 대한 EC50보다 높았고, 평균 최대 농도는 PI3Kγ에 대한 EC50보다 낮았다 (도 24b). 본 실시예는 50 mg BID로 투여된 화합물 I의 농도 범위가 적어도 12시간 동안 전혈에서 ED50 PI3Kδ 호염기구 활성화 수준을 초과하지만 최소 ED50 PI3Kγ 호염기구 수준 활성화 수준보다 낮다는 것을 입증한다.
하기 표 1은 연구에서의 대상체의 개관을 제공하고, 여기서 단일 용량 (SD) 또는 다중 용량 (MD)의 화학식 I의 화합물이 다양한 양으로 대상체에게 투여되었다. "n" 값은 각각의 군에서의 대상체의 수를 지칭한다.
Figure pct00040
실시예 12
외투 세포 림프종을 앓는 환자에서 병변에 대한 효과
본 실시예는 화학식 I의 화합물로의 1 사이클의 치료 (28일) 후의 외투 세포 림프종을 앓는 환자의 병변 면적에 관한 데이터를 제공한다. 6개의 병변의 면적을 치료 전에 및 치료 사이클 후에 측정하였다. 50 mg BID의 화학식 I의 화합물의 28일의 경구 투여에 대한 반응은 치료 전의 면적과 비교하여 병변 면적을 감소시켰고, 종양 부담의 44% 감소를 나타내었다. 결과가 도 12에서 확인되는 막대 그래프에 요약된다.
실시예 13
치료에 대한 CLL 을 앓는 환자의 반응
본 실시예는 화학식 I의 화합물의 경구 투여로의 1 사이클 (28일)의 치료 후의 CLL을 앓는 환자의 혈액에서의 절대 림프구 수 (ALC)의 농도에 관한 데이터를 제공한다. 혈중 ALC 농도를 1 사이클의 치료 완료 후 4주 기간에 걸쳐 측정하였다. 치료 결과로서 림프구증가증의 55% 감소 및 림프절병증의 38% 감소가 관찰되었다. ALC 농도의 현저한 감소가 제1주와 제2주 사이에 관찰되었다 (도 13).
실시예 14
건강한 지원자에 대한 림프종 환자의 비교
본 실시예는 림프종 환자의 화학식 I의 화합물의 농도를 정상적인 건강한 지원자와 비교하는 데이터를 제공한다. 외투 세포 림프종을 앓는 환자에서 50 mg BID의 화합물을 경구 투여한지 제28일에, 화합물의 혈중 농도를 투여 후 6시간의 기간에 걸쳐 측정하였다. 투여로부터 제7일에 정상적인 건강한 지원자에서 50 및 100 mg 경구 투여의 농도를 또한 관찰하였다. 결과가 도 14에 요약된다. 따라서, 화합물이 치료 사이클 과정에 걸쳐 과도하게 축적되지 않거나 환자가 치료 사이클 과정에 걸쳐 증가된 대사에 의해 허용성이 되지 않았다.
실시예 15
다양한 키나제에서의 화합물 I의 활성
본 실시예는 표 2에 요약된 바와 같은 키나제 클래스에 걸친 화합물 I의 IC50 프로파일을 보여준다. p110δ에 대해 특히 활성이면서, 화합물 I은 p110γ에 대해 또한 활성이었고, 화합물의 입증된 높은 NOAEL 수준으로 인해, 심지어 p110β에 대해 비-독성인 용량에서 치료적으로 유용하기에 충분히 활성인 한편; 클래스 II-V 포스포이노시티드 키나제에 대해서 활성을 거의 나타내지 않았다. 따라서, 화합물은 델타-선택적이면서 임상적으로 유용하기에, 즉 신호전달을 위해 p110γ에 의존하는 암에 대해 효과적이기에 충분한 활성을 나타낼 수 있는데, 이는 다른 이소형, 특히 알파 이소형과 비교하여 여전히 선택적이면서 p110γ의 억제에 효과적인 투여량을 초과하는 혈장 수준이 달성될 수 있기 때문이다.
Figure pct00041
실시예 16
키놈 범위에 걸친 단백질 키나제 스크린에서의 화합물 I의 표적을 벗어나지 않는 활성
본 실시예는 키놈 범위에 걸친 단백질 키나제 스크린에서 화합물 I이 표적을 벗어나는 활성이 거의 없거나 전혀 없다는 것을 입증한다. 350종을 초과하는 단백질 키나제의 게놈 범위에 걸친 스크린인 앰비트(Ambit) 키놈스캔(KINOMEscan)™을 사용했을 때, 10 μM에서 어떠한 활성도 검출하지 못했다. 이러한 스크린에서의 일부 키나제의 예가 하기 표 3에 제시된다.
Figure pct00042
실시예 17
p110 델타에 대한 화합물 I의 선택성
본 실시예는 화합물 I이 이소형 특이적 세포-기반 검정에서 측정된 바와 같이 p110 델타에 대해 선택적이라는 것을 입증한다.
스위스-3T3 섬유모세포 및 RAW-264를 96-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고, 적어도 90%의 전면성장에 도달하도록 하였다. 세포를 고갈시키고, 비히클 또는 일련의 화합물 I의 희석물로 2시간 동안 처리하고, 각각 PDGF 또는 C5a로 자극하였다. Akt 인산화 및 전체 AKT를 ELISA에 의해 검출하였다. 정제된 B-세포를 비히클 또는 일련의 화합물 I의 희석물로 30분 동안 실온에서 처리한 후에, 정제된 염소 항-인간 IgM을 첨가하였다. 결과는 IgM 가교에 의해 유도된 상대적인 [3H] 티미딘 혼입으로서 표현된다.
Figure pct00043
실시예 18
백혈병 및 림프종 세포주에서 p110 델타의 발현
본 실시예는 PI3K p110 델타가 광범위한 백혈병 및 림프종 세포주에서 고도로 발현된다는 것을 입증한다.
PI3K p110δ는 광범위한 백혈병 및 림프종 세포주에서 증식 및 생존을 촉진한다. 이러한 세포 유형들 중에서, MCL, DLBCL, AML, ALL 및 CML을 조사하였다.
림프종 및 백혈병 세포주의 패널에서의 PI3K p110 α, β, γ 및 δ의 발현이 도 15에서 입증된다. 106개의 세포로부터의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, α, β, γ 및 δ 이소형에 대해 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 정제된 재조합 p110 단백질을 대조군으로 사용하였다. 항-액틴 항체를 사용하여 샘플의 등가의 로딩을 평가하였다. p110δ는 일관적으로 높은 수준으로 발현된 한편, 다른 p110 이소형들은 고도로 가변적이었다. 문헌 [Sujobert, et al., Blood 2005 106(3), 1063-1066]에 논의된 바와 같이 PI3K p110δ는 환자 AML 세포에서 균일하게 발현되는 것으로 공지되어 있다.
실시예 19
p110 델타에 대한 화합물 I의 억제 효과
실시예 19는 p110 델타의 화합물 I 억제가 구성적 경로 활성화가 나타나는 백혈병 및 림프종 세포주에서 PI3K 신호전달을 차단한다는 것을 보여준다.
백혈병 및 림프종 세포주에서 PI3K 경로가 빈번하게 탈조절된다. 48%의 세포주, 또는 27종 중 13종이 구성적 p-AKT가 나타나는 것으로 확인되었다. 또한, PI3K 경로 활성화가 p110δ에 의존성이었다. 화합물 I이 13종의 세포주 중 13종에서 구성적 AKT 인산화를 억제하는 것으로 밝혀졌다.
도 9의 PAGE 결과는 구성적 AKT 인산화가 B-세포 및 T-세포 림프종을 포함하는 11종의 세포주 각각에서 화합물 I의 존재에 의해 억제되었음을 입증한다. 세포를 2시간 동안 10 μM 화합물 I과 함께 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 SDS-PAGE 상에 전개시키고, PDVF 막으로 옮기고, 적절한 항체로 프로빙하였다. 화합물 I이 11종의 세포주 중 11종에서 구성적 AKT 인산화를 억제하는 것으로 확인되었다. T-ALL 및 B-ALL 세포주에 대한 추가적인 세포주 데이터가 도 27에 제시된다. 소정 범위의 농도의 화합물 I (0.1 μM 내지 10 μM)에 대한 노출 후에 Akt 및 S6 인산화의 감소를 농도측정법에 의해 정량화하였고, 퍼센트 변화로 표현되었다 (도 28).
실시예 20
화합물 I은 백혈병 세포주에서 증식 및 아폽토시스를 억제한다
실시예 20은 화합물 I이 백혈병 세포주에서 증식을 억제하고 아폽토시스를 유도한다는 것을 입증한다. 도 16a-b는 24시간 동안의 화합물 I로의 처리가 용량 의존성 방식으로 세포 생존율을 감소시킨다는 것을 보여준다.
10% FBS 혈청의 존재 하에 성장한 ALL 세포주에 대한 증식 검정 (알라마르블루®) 및 측정을 24시간에 수행하였다. 96-웰 플레이트 내의 3중 웰에서 증식을 측정하였다. 화합물 I에 의한 PI3K 신호전달의 억제는 세포 주기 진행의 차단 및/또는 세포 사멸을 일으켰다. 6종의 백혈병 세포주 각각에서, 10 마이크로몰 농도의 화합물 I로 생존율이 40-50%만큼 감소하였다 (도 16a).
화합물 I에 의한 아폽토시스의 유도. 세포를 DMSO (비히클), 1 μM 또는 10 μM 화합물 I로 24시간 동안 처리하였다. 아폽토시스 세포의 백분율을 아넥신 V-FITC/7AAD 염색에 의해 결정하였다. 유사한 결과를 제공한 상이한 실험들 중 대표적인 1회의 실험이 도 16b에 제시된다.
실시예 21
CLL 세포에서 p110 델타의 발현
본 실시예는 환자 CLL 세포에서의 PI3K p110δ 및 p110 δ 이소형 발현을 입증한다.
PI3K 매개된 신호전달 경로가 CLL에 관련되었다. 이러한 경로는 세포 증식, 아폽토시스의 방지, 및 세포 이동에서 소정의 역할을 하였다. 환자 CLL 세포에서의 PI3K 이소형 발현을 결정하기 위해 노력하였다.
CLL 환자 인구통계는 하기 표 5에 요약된다.
Figure pct00044
도 17A-D의 PAGE 영상은 환자 A-E의 CLL 세포에서 p110α, p110δ, p110β, 및 p110γ의 발현을 비교한다. p110δ 및 p110γ가 다른 PI3K 이소형에 비해 각각의 환자에서 발현된다.
실시예 22
화합물 I은 카스파제 3 및 PARP의 절단을 유도한다
본 실시예는 화합물 I이 카스파제 3 및 PARP의 절단을 유도하였다는 것을 입증한다. 도 18A-B는 1, 10 μM의 화합물 I 또는 25 μM의 LY294002의 존재 하의 카스파제 3 및 PARP (폴리(ADP) 리보스 폴리머라제) 절단의 결과를 보여준다.
추가의 실험에서 화합물 I이 카스파제 2 및 PARP 절단을 유도한다는 증거가 제공되었다. 세포를 화합물 I 또는 비히클 단독과 함께 24시간 동안 배양하였다. 그 후에, 세포를 용해시키고, 크기에 따라 분획화하고, FLIP에 대해 지시된 항체로 이뮤노블롯팅하였다 (도 29). 추가로, 전세포 용해물을 전체 카스파제-3, 절단된 카스파제-3, 절단된 PARP, 및 BSA로 코팅된 MDS (메조 스케일 다이아그노스틱스(Meso Scale Diagnostics)) 멀티-스폿 96-웰 4-스폿 플레이트에 첨가하였다. 단백질을 술포-태그(SULFO-TAG) 시약으로 표지된 항체로 검출하고, 정량화하였다. 5 또는 10 μM의 화합물 I에 대한 노출시에 카스파제 3 및 PARP 절단에서의 용량 의존성 반응이 달성되었다.
실시예 23
화합물 I은 PI3K 신호전달을 차단한다
본 실시예는 화합물 I이 환자 AML 세포에서 PI3K 신호전달을 차단한다는 것을 입증한다. PI3Kδ가 AML 환자 세포에서의 신호전달에 관련된다. 도 21은 화합물 I의 부재 또는 0.1, 1.0, 10 μM의 화합물 I의 존재 하의 포스포-Akt 생산의 결과를 보여준다. 이는 화합물 I이 환자 AML 세포에서 포스포-Akt 생산을 감소시킨다는 증거를 제공한다.
실시예 24
전혈을 기초로 하는 호염기구에서의 PI3K 신호전달의 측정
본 실시예는 CD63 표면 발현의 유도에 의한 유동 세포측정법을 이용하는 호염기구에서 PI3K 신호전달의 측정을 위한 전혈 검정을 입증한다.
호염기구에서의 PI3K 신호전달의 억제는 화합물 I이 유용한 약역학 마커이도록 한다. CD63 표면 발현에 의해 PI3K 신호전달이 모니터링된다. 특히, p110δ는 FCεR1 신호전달을 매개하고, p110γ는 fMLP 수용체 신호전달을 매개한다. 호염기구 상에서의 PI3K 매개된 CD63 발현의 유동 세포측정법 분석은 하기의 순차적 단계를 포함한다:
1. 말초 혈액 수집
2. 호염기구 자극 (fMLP 또는 항-FCεR1 Mab)
3. 호염기구 표지 (항-CCR3-FITC 및 항-CD63-PE)
4. 세포 용해 및 고정
5. 유동 세포측정법에 의한 분석
도 22a-c는 a) 자극 없음, b) 항-FCεR1로의 자극, 또는 c) fMLP로의 자극의 결과를 비교한다.
도 23은 화합물 I이 p110δ 매개된 신호전달이 가장 중요한 경우에 특히 활성이지만, p110γ가 사용되는 경우에도 또한 비교적 활성이라는 것을 보여준다: 이는 p110δ 시험의 경우에 << 1 μM, p110γ 시험의 경우에 약 10 μM에서 SD63 발현에서의 50% 감소를 달성하였다. 호염기구 활성화를 인간 전혈에서 플로우2 캐스트(Flow2 CAST)® 키트를 사용하여 측정하였다. 항-FcεRI mAb 또는 fMLP로의 호염기구의 활성화 전에 전혈 샘플을 비히클 또는 일련의 화합물 I의 희석물로 처리하였다. 세포를 항-인간 CD63-FITC 및 항-인간 CCR3-PE mAb의 조합으로 염색하였다. 게이팅 호염기구 집단 내의 CD63 양성 세포의 퍼센트를 여러 치료군에서 결정하고, 비히클 대조군에 대해 정규화하였다.
실시예 25
화합물 I은 CLL 환자에서 림프절병증을 감소시킨다
본 실시예는 del[17p]가 있는 CLL 환자에서의 거대 림프절병증의 크기 감소의 증거를 제공한다. del(17p)가 있는 환자가 액와 림프절병증을 앓고 있었고, 이를 컴퓨터 단층촬영 (CT)에 의해 영상화하여 5.9 cm x 4.1 cm의 기준선 측정값을 제공하였다 (도 40A). 1 사이클의 화합물 I로의 치료 후에, 림프절병증이 3.8 x 1.8 cm의 치수로 감소되었다 (도 40B). 치료 사이클은 200 mg BID 또는 350 mg BID의 화합물 I의 28일의 연속적인 경구 투여였다.
실시예 26
대상체의 글루코스 및 인슐린 수준에 대한 화합물 I의 제한된 효과
본 실시예는 화합물 I로의 치료가 글루코스 및 인슐린 수준에 대한 효과가 거의 없거나 없다는 것을 입증한다. 화합물 I을 50-200 mg 양의 BID로 10일까지의 기간에 걸쳐 대상체에게 투여하였다. 도 25a-b에 제시된 바와 같이, 혈중 글루코스 및 인슐린 농도를 경시적으로 측정하고, 위약 결과와 비교하였다.
혈중 글루코스 농도가 최고 투여량의 화합물 I로의 10일의 치료 후에도 일정하게 유지되었다. 인슐린 수준이 화합물 I로의 7일의 치료 후에 정상 범위 내에서 유지되었다. 이는 화합물 I이 글루코스 및 인슐린 수준에 대한 효과가 거의 없거나 전혀 없다는 증거를 제공한다.
실시예 27
물질 및 방법
본 실시예는 다발성 골수종의 치료에서 화합물 I을 사용하는 것에 관련된 실시예 28-35에 기재된 실험을 수행하는 물질 및 방법에 대한 정보를 제공한다.
물질
칼리스토가 파마슈티칼스(Calistoga Pharmaceuticals) (워싱톤주 시애틀)에서 p110δ 억제제인 화합물 I 및 화합물 II를 제공하였다. 사용된 화합물 I 및 II의 샘플은 S 거울상이성질체가 95%를 초과하였다. 화합물 I을 디메틸 술폭시드에 10 mM으로 용해시키고, 시험관내 연구를 위해 -20℃에 저장하였다. 화합물 II를 1% 카르복실 메틸셀룰로스 (CMC)/0.5% 트윈 80에 용해시키고, 생체내 연구를 위해 4℃에 저장하였다. 재조합 인간 P110α, β, γ, 및 δ를 0.1% BSA를 함유하는 멸균 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 재구성하였다. 보르테조밉은 밀레니엄 파마슈티칼스 (매사추세츠주 캠브리지)에서 제공하였다. 3-메틸아데닌은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트루이스)에서 구입하였다.
세포 배양
스티븐 로젠(Steven Rosen) 박사 (노스웨스턴 대학교, 일리노이주 시카고)가 Dex-감수성 (MM.1S) 및 저항성 (MM.1R) 인간 MM 세포주를 호의적으로 제공하였다. H929, RPMI8226, 및 U266 인간 MM 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (버니지아주 마나사스)로부터 수득하였다. 윌리엄 달톤(William Dalton) 박사 (리 모핏 캔서 센터(Lee Moffitt Cancer Center), 플로리다주 탐파)가 멜팔란-저항성 RPMI-LR5 및 독소루비신 (Dox)-저항성 RPMI-Dox40 세포주를 호의적으로 제공하였다. 에드워드 톰슨(Edward Thompson) 박사 (텍사스 대학교 의과 대학, 갤버스턴)가 OPM1 혈장 세포 백혈병 세포를 제공하였다. 레나테 부르거(Renate Burger) 박사 (킬 대학교, 독일 킬)가 IL-6-의존성 인간 MM 세포주 INA-6을 제공하였다. LB 인간 MM 세포주는 실험실에서 확립되었다. 표현형 분석에서 세포유전 이상이 나타나지 않았다. 표현형 분석이 표 6에 제시된다. LB 세포주의 CD 발현 프로파일은 유동 세포측정법 분석에 의해 정의되었다.
Figure pct00045
모든 MM 세포주를 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 골수 기질 세포 (BMSC)를 15% 태아 소 혈청, 2 mM L-글루타민 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)), 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (라이프 테크놀로지스)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (시그마)에서 배양하였다. 건강한 지원자로부터 수집된 혈액 샘플을 피콜-파크(Ficoll-Paque)™ 구배에 의해 처리하여, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNC)를 수득하였다. 헬싱키 선언 및 다나-파버 캔서 인스티튜트(Dana-Farber Cancer Institute) (매사추세츠주 보스턴)의 임상시험 심사 위원회의 승인에 따라 BM 샘플로부터 환자 MM 및 BM 세포를 수득하였다. BM 단핵 세포를 피콜-파크™ 밀도 침강을 사용하여 분리하고, 항-CD138 자기 활성화 세포 분리 마이크로 비드 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 캘리포니아주 오번)로의 양성 선별에 의해 형질 세포를 정제하였다 (>95% CD138+). 로제트셉 음성 선별 시스템 (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티시 컬럼비아주 밴쿠버)을 사용하여 MM 환자의 BM으로부터 종양 세포를 또한 정제하였다.
성장 억제 검정
MM 세포주, PBMC, 및 BMSC의 성장에 대한 화합물 I의 성장 억제 효과를 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라-나트륨 브로마이드 (MTT; 케미콘 인터내셔널, 캘리포니아주 테메큘라) 염료 흡광도를 측정함으로써 평가하였다.
BM에서의 주변분비 MM 세포 성장에 대한 화합물 I의 효과
MM 세포 (2x104개의 세포/웰)를 BMSC 코팅된 96-웰 플레이트 (코스타(Costar), 매사추세츠주 캠브리지)에서 약물의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 배양하였다. [3H]-티미딘 (퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 매사추세츠주 보스턴) 흡수에 의해 DNA 합성을 측정하였고, 여기서 [3H]-티미딘 (0.5 μCi/웰)이 48시간 배양의 마지막 8시간 동안 첨가되었다. 모든 실험을 4중으로 수행하였다.
P110δ 발현의 일시적 녹다운
INA-6 세포 및 LB 세포를 셀 라인 뉴클레오펙터 키트 V(Cell Line Nucleofector Kit V) (아맥사 바이오시스템즈(Amaxa BIosystems), 메릴랜드주 게이더스버그)를 사용하여 siRNA 온-타겟(ON-TARGET) 플러스 스마트(SMART) 풀 P110δ 또는 비특이적 대조군 듀플렉스 (다마콘(Dharmacon), 콜로라도주 라파예트)로 일시적으로 형질감염시켰다.
면역형광
사이토스핀(cytospin) 시스템 (써모 샌던(Thermo Shandon), 펜실베니아주 피츠버그)을 사용하여 5분 동안 500 rpm에서의 원심분리에 의해 생존 MM 세포 (2.5Ｘ104개)를 유리 슬라이드 상에 펠릿화시켰다. 세포를 저온 무수 아세톤 및 메탄올에서 10분 동안 고정시켰다. 고정 후에, 세포를 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세척한 다음, 60분 동안 PBS 내의 5% FBS로 차단하였다. 이어서, 슬라이드를 항-CD138 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 캘리포니아주 산타 크루즈)와 함께 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, PBS에서 세척하고, 염소 항-마우스 IgG와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 니콘(Nikon) E800 형광 현미경검사를 이용하여 분석하였다.
아크리딘 오렌지 염색으로의 산성 소포 소기관 (AVO)의 검출 및 정량화
세포질 단백질의 격리 및 AVO의 발생에 의해 자가포식을 특성화하였다. 화합물 I 또는 3MA-처리된 세포에서의 AVO를 검출 및 정량화하기 위해, 최종 농도 1 μg/ml의 아크리딘 오렌지로 15분 동안 생체 염색을 수행하였다. 샘플을 형광 현미경 하에 조사하였다.
혈관신생 검정
화합물 I의 항혈관신생 활성을 시험관내 혈관신생 검정 키트 (케미콘(Chemicon), 캘리포니아주 테메큘라)를 사용하여 결정하였다. HUVEC 및 내피 성장 배지를 론자(Lonza) (미국 메릴랜드주 워커스빌)로부터 수득하였다. HUVEC를 화합물 I과 함께 중합 매트릭스 겔 상에서 37℃에서 배양하였다. 8시간 후에, 튜브 형성을 라이카(Leika) DM IL 현미경검사 (라이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems), 독일 베츨라)를 이용하여 평가하고, IM50 소프트웨어 (라이카 마이크로시스템즈 이미징 솔루션즈(Leica Microsystems Imaging Solutions), 영국 캠브리지)로 분석하였다. HUVEC 세포 이동 및 재배열이 시각화되었고, 분지점의 개수를 계수하였다.
웨스턴 블롯팅
MM 세포를 화합물 I과 함께 또는 이들 없이 배양하고, 수확하고, 세척하고, 방사성면역침전 검정 (RIPA) 완충제, 2 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (5 mg/ml)를 사용하여 용해시켰다. 전세포 용해물을 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 분리에 적용하고, 퓨어 니트로셀룰로스(Pure Nitrocellulose) 막 (바이오-라드 래보러토리즈(Bio-Rad Laboratories), 캘리포니아주 허큘레스)으로 옮기고, 항-AKT, 포스포(p)-AKT (Ser473, Thr 308), ERK1/2, P-ERK1/2, P-PDK1, STAT, P-STAT, P-FKRHL, P-70S6K, LC3, 및 PI3K/p110α Ab (셀 시그널링(Cell Signaling), 매사추세츠주 댄버스); 항-p110β, PI3K/p110δ, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH), α-튜불린, 및 액틴 Ab (산타 크루즈 바이오테크놀로지, 캘리포니아); 및 항-p110γ Ab (알렉시스(Alexis), 캘리포니아주 샌디에고); 및 항-LC3 Ab (앱젠트(Abgent), 캘리포니아주 샌디에고)로 이뮤노블롯팅하였다.
ELISA
MM 세포와 공동배양된 인간 BMSC에 의한 시토카인 분비를 ELISA에 의해 평가하였다. BMSC를 96-웰 플레이트에서 INA-6 세포와 함께 또는 이들 없이 다양한 농도의 화합물 I과 함께 배양하였다. 48시간 후에, 상청액을 수확하고, -80℃에 저장하였다. 시토카인을 듀오(Duo) 세트 ELISA 발색 키트 (R&D 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 측정하였다. 모든 측정을 3중으로 수행하였다.
인간 시토카인 어레이
배양 상청액에서 시토카인 수준을 프로테옴 프로파일러(Proteome Profiler) 항체 어레이 패널 A (R&D 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)를 이용하여 평가하였다. BMSC와의 공동-배양물로부터의 상청액을 제조업체의 지시에 따라 37종의 시토카인에 대한 Ab와 정렬된 막과 4시간 동안 인큐베이션하였다.
인간 MM의 뮤린 이종이식 모델
CB17 SCID 마우스 (48-54일령)를 찰스 리버 래보러토리즈 (Charles River Laboratories) (매사추세츠주 윌밍톤)로부터 구입하였다. 모든 동물 연구를 다나-파버 캔서 인스티튜트의 동물 윤리 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다. 100 μL RPMI-1640 내의 3x106개의 LB 세포를 마우스의 우측 옆구리에 피하 접종하였다. 종양이 촉진가능했을 때, 마우스를 10 mg/kg 또는 30 mg/kg 위관영양을 1일 2회 제공하는 치료군에 할당하였고, 대조군 내의 7마리의 마우스에게는 비히클 단독을 제공하였다. 최장 수직 종양 직경의 캘리퍼 측정을 격일로 수행하여, 타원의 3D 부피를 나타내는 하기의 식을 사용하여 종양 부피를 추정하였다: 4/3 X (폭/2)2 X (길이/2). 종양이 2 cm에 도달했을 때 또는 동물이 빈사 상태일 때 동물을 희생시켰다. 치료 제1일부터 사망까지 생존을 평가하였다. 치료 제1일부터 최초의 희생일까지 캘리퍼 측정을 사용하여 종양 성장을 평가하였고, 상기 최초의 희생일은 대조군에 대해서는 제12일, 치료군에 대해서는 제17일 및 제19일이었다. 캐논 익시(IXY) 디지털 700 카메라로 영상을 포착하였다. 40u/0.60의 라이카 DFC300 FX 카메라 및 라이카 DM IL 현미경 (라이카, 독일 하이델베르크)으로 종양 영상의 생체외 분석을 포착하였다.
인간 태아 골 이식편을 CB17 SCID-마우스 (SCID-hu) 내로 이식하였다. 골 이식 4주 후에, 2.5X106개의 INA-6 세포를 RPMI-1640 배지 100 μl의 최종 부피로 이식편 내의 인간 골수강 내로 직접 주사하였다. INA-6 세포로부터의 가용성 인간 IL-6 수용체 (shuIL-6R)의 수준 증가가 SCID-hu 마우스에서의 MM 세포 성장 및 질환 부담의 지표로서 사용되었다. INA-6 세포를 주사하고 대략 4주 후에 마우스에서 측정가능한 혈청 shuIL-6R이 발생되었고, 이어서 10 또는 30 mg/kg 약물 또는 비히클 단독을 7주 동안 매일 제공하였다. 혈액 샘플을 수집하고, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA, R&D 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)을 사용하여 shuIL-6R 수준에 대해 평가하였다.
통계적 분석
던(Dunn) 다중 비교 검정에 의해 통계적 유의성을 결정하였다. 유의성의 최소 수준은 p<0.05였다. 카플란 마이어(Kaplan-Meier) 곡선 및 로그-순위 분석을 사용하여 생존을 평가하였다. 화합물 I과 보르테조밉의 조합 효과를 캘쿠신(CalcuSyn) 소프트웨어 프로그램 (바이오소프트(Biosoft), 미주리주 퍼거슨)을 사용하여 이소볼로그램 분석에 의해 분석하였다; 조합 지수 (CI) <0.7이 상승작용적 효과를 나타낸다.
실시예 28
MM 세포에서 p110 델타의 발현
본 실시예는 p110 델타가 환자 MM 세포에서 고도로 발현된다는 것을 입증한다. PI3K/p110 발현을 평가하기 위해, 재조합 인간 PI3K/p110α, β, γ, 및 δ 단백질에 대한, 이러한 이소형들에 대한 특이적 면역반응성이 있는 Ab들이 사용되었다. 11종의 MM 세포주 (MM.1S, OPM1, OPM2, RPMI8226, DOX40, LR5, MM.1R, U266, INA-6, H929, 및 LB), 뿐만 아니라 24개의 환자 MM 샘플에서의 p110δ의 발현을 평가하였고, 도 30a 및 30b에 이뮤노블롯이 제시된다. 도 30a는 특이적 항체를 사용하여 이뮤노블롯팅에 의해 검출된 MM 세포주에서의 p110-α, -β, -γ, 및 -δ의 발현을 보여준다. 항-α-튜불린 MAb가 로딩 대조군으로 사용되었다. 환자 MM 세포에서 p110δ는 항-P110δ Ab를 사용하는 이뮤노블롯팅에 의해 검출하였다 (도 30b).
항-GAPDH MAb가 로딩 대조군으로 사용되었다. INA-6 및 LB 세포는 p110δ를 강하게 발현하는 반면, MM.1S, OPM1, MM.1R, Dox40, U266 또는 H929는 p110δ 발현이 결핍되었다 (도 30a).
MM.1S 및 LB 세포에서의 p110δ 발현을 면역형광 분석에 의해 확인하였다 (도 30c). SDS 샘플 완충제 내의 인간 재조합 P110-α, -β, -γ, -δ 단백질을 3분 동안 가열한 후 겔 상에 로딩하였다. (레인 당 10-20 μg.) 재조합 인간 P110-α,-β,-γ,-δ 단백질을 이뮤노블롯 분석에 의해 검출하였다. P110δ 특이적 FITC 접합된 2차 항체를 사용하여 MM1S 및 LB 세포에서 P110δ의 수준을 측정하였다. P110δ는 녹색으로 염색되고, 핵산 (DAPI)은 청색으로 염색되었다.
웨스턴 블롯팅에서, p110δ 발현과 다른 이소형 (α, β 및 γ)의 발현 사이의 상관관계가 밝혀지지 않았다. 중요하게는, 모든 환자 MM 세포가 또한 p110δ를 발현하였다 (도 30b).
실시예 29
MM 세포에서 화합물 I의 세포독성
본 실시예는 화합물 I이 p110δ가 있는 세포에 대해 선택적인 세포독성을 갖는다는 것을 입증한다. 구체적으로, 화합물 I은 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포에서는 세포독성이 없으면서 세포독성 p110 델타 양성 MM 세포 뿐만 아니라 1차 환자 MM 세포에서 세포독성을 강력하게 유도하였고, 이는 유리한 치료 지수를 시사한다.
MM 세포에서의 p110δ 녹다운의 성장 억제 효과를 평가하였다. LB 및 INA-6 세포를 P110δ siRNA (Si) 또는 대조군 siRNA (모의)로 형질감염시켰다. 24시간 후에, P110δ의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다 (도 31a 참조). INA-6 세포를 p110δ siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질감염시킨 후에, 72시간 동안 배양하였다. 세포 성장을 MTT 검정에 의해 평가하였다 (도 31b 참조). 데이터는 대조군의 배수로 표현되는, 3중 배양물의 평균 ± SD를 나타낸다. p110δ siRNA로의 형질감염이 p110δ를 하향-조절하고, 72시간에 MM 세포 성장을 억제하였지만, 모의 siRNA는 그렇지 않았다 (도 31a 및 31b). MM 세포주, PBMC, 및 환자 MM 세포에서의 p110δ 특이적 소분자 억제제 화합물 I의 성장 억제 효과를 평가하였다.
화합물 I이 용량- 및 시간-의존성 방식으로 LB 및 INA-6 MM 세포 (p110δ-양성)에 대해 세포독성을 유도한 반면에, p110δ-음성 세포주에서는 최소 세포독성이 주목되었다 (도 31c). 도 31c에 대한 범례: LB (□), INA-6 (△), RPMI 8226(○), OPM2 (◇), H929 (●), U266 (◆), RPMI- LR5 (▲) 및 OPM1 (■) MM 세포를 48시간 동안 화합물 I과 함께 또는 이들 없이 배양하였다.
중요하게는, 화합물 I이 또한 환자 MM 세포에 대해 세포독성을 유도하였으며 (도 31d), 20 μM까지의 농도에서 4명의 건강한 지원자로부터의 PBMC에서는 세포독성이 없었다 (도 31e). 음성 선별에 의해 BM으로부터 단리된 환자 MM 세포를 화합물 I과 함께 48시간 동안 배양하였다. 건강한 공여자로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포를 화합물 I과 함께 72시간 동안 배양하였다. 데이터는 처리되지 않은 대조군의 백분율로 표현되는, 3중 배양물의 MTT 검정에 의해 평가된 평균 ± SD 생존율을 나타낸다. 이러한 결과는 화합물 I에 대한 민감도가 P110δ 발현과 관련된다는 것을 강력하게 제안하고, 유리한 치료창을 제안한다.
화합물 I에 의해 유도된 세포독성이 아폽토시스를 통한 것인지 여부를 결정하기 위해, 웨스턴 블롯 분석에 의한 카스파제 및 PARP의 절단을 조사하였다. INA-6 세포를 화합물 I (0-5μM)과 함께 120시간 동안 배양하였다. 전세포 용해물을 항-카스파제-3, -8, -9, PARP, 및 α-튜불린 Ab를 사용하는 이뮤노블롯팅에 적용하였다. FL은 전장 단백질을 나타내고, CL은 절단된 단백질을 나타낸다. 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-3, 및 PARP의 유의하게 증가된 절단이 120시간 동안 화합물 I로 처리된 INA-6 MM 세포에서 관찰되었다 (도 31f). 이러한 결과는 화합물 I에 의해 유발된 세포독성이, 적어도 부분적으로, 카스파제-의존성 (내인성 및 외인성 둘 다) 아폽토시스를 통해 매개된다는 것을 나타낸다.
실시예 30
화합물 I에 의한 AKT 및 ERK 인산화의 억제
본 실시예는 화합물 I에 의한 AKT 및 ERK 인산화의 억제를 입증한다.
PI3K의 중요한 하류 이펙터는 세린/트레오닌 단백질 키나제 AKT이고, 이는 키나제 도메인의 활성화 루프 내의 Thr308 및 C-말단 꼬리 내의 Ser473의 인산화에 의해 활성화된다. 양쪽 부위의 인산화는 PI3K에 의해 생성되는 막 포스포이노시티드와 AKT의 N-말단 플렉스트린 상동성 도메인 간의 상호작용을 요구한다. 화합물 I이 양쪽 도메인을 억제하는 것으로 밝혀졌고, 이는 P110δ가 MM 세포주에서 PI3K 신호전달을 담당하는 우세한 이소형이라는 것을 제안한다.
화합물 I에 의한 INA-6 세포에서의 AKT 및 ERK 경로의 억제를 조사하였다. INA-6 세포를 화합물 I 또는 LY294002와 함께 12시간 동안 배양하였다 (도 32a). 액틴 Ab가 로딩 대조군으로 사용되었다. INA-6 및 MM.1S 세포를 화합물 I (0, 0.25, 1.0, 5.0 μM)과 함께 6시간 동안 배양하였다 (도 32b). LB 및 INA-6 세포를 화합물 I과 함께 0-6시간 동안 배양하였다 (도 32c). 전세포 용해물을 AKT, P-AKT (Ser473 및 Thr308), ERK1/2, P-ERK1/2, P-PDK1, 및 P-FKRHL 항체를 사용하는 이뮤노블롯팅에 적용하였다. α-튜불린이 로딩 대조군으로 사용되었다.
화합물 I은 p110δ 양성 INA-6 세포에서 AKT 및 ERK1/2의 인산화를 유의하게 차단하였지만 (도 32a), P110δ 발현이 낮은 MM.1S 세포에서는 AKT 또는 ERK의 인산화에 영향을 미치지 않았다 (도 32b). 화합물 I은 시간- 및 용량-의존성 방식으로 INA-6 및 LB MM 세포에서 상류 PDK-1 및 하류 FKHRL의 인산화를 또한 유의하게 억제하였고 (도 32c), 이는 이러한 세포들에서의 PI3K/AKT 및 ERK 경로 둘 다의 억제를 추가로 확인하였다.
실시예 31
화합물 I은 AVO 발생 및 자가포식을 유도한다
본 실시예는 아폽토시스 및 자가포식 둘 다를 유발하는 화합물 I의 능력을 입증한다.
AKT가 자가포식을 조절하므로, LB 및 INA-6 MM 세포에서 자가포식을 유도하는 것에 대해 화합물 I 조사를 수행하였다.
INA-6 및 LB MM 세포를 5 μM 화합물 I로 6시간 동안 처리하였다. 화합물 I 처리는 형광 현미경검사 또는 투과 전자 현미경검사에 의해 증명되는 바와 같이, LB 및 INA-6 세포에서의 LC3 축적을 유도하였다. 자가포식소체 형성이 LC3 축적에 의해 명백하게 나타났다; 화살표는 자가포식소체를 나타낸다 (도 33a).
INA-6 세포를 5 μM 화합물 I 또는 혈청 고갈로 6시간 동안 처리하고, 1 μg/mL 아크리딘 오렌지로 15분 동안 염색하고, 형광 현미경검사에 의해 분석하였다 (도 33b).
3-MA와 함께 또는 이들 없이 화합물 I로 처리된 INA-6 세포로부터의 용해물의 LC3 및 베클린-1 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 LC3 및 베클린-1 단백질 수준을 결정하였다 (도 33c). GAPDH가 로딩 대조군으로 사용되었다.
면역형광 분석은 화합물 I (5 μM, 6시간) 처리에 의해 유발된 INA-6 및 LB 세포에서의 현저하게 증가된 LC3 염색을 보여주었다 (도 33a). 전자 현미경검사 분석은 또한 화합물 I로 처리된 MM 세포에서 증가된 자가포식 공포 (화살표)를 보여주었다. 자가포식은 산성 소포 소기관 (AVO) 발생을 특징으로 하기 때문에, 아크리딘 오렌지 염색을 수행하였다. 도 33b에 나타난 바와 같이, 아크리딘 오렌지로의 생체 염색은 화합물 I-처리된 LB 및 INA-6 세포에서 AVO의 발생을 나타내었다. 또한, 현저하게 증가된 LC3-II 및 베클린1 단백질이 화합물 I로의 6시간 처리 후 INA-6 MM 세포에서 검출되었고, 이는 3-MA 자가포식 억제제에 의해 차단되었다 (도 33c).
100 μM까지의 농도에서 3-MA에 의해 INA-6 및 LB 세포에서의 세포독성이 유도되지 않았다 (도 33d). P110δ 양성 LB 세포 (◆)를 24시간 동안 3-MA (0-100 μM)로 처리하였다. 데이터는 3중 배양물의 평균 (±SD)을 나타낸다.
이러한 결과는 화합물 I이 카스파제/PARP 절단의 유도보다 더 빠른 시점에 AVO의 발생 및 자가포식을 유도한다는 것을 나타낸다.
자가포식은 세포 성분을 분해시키고, 세포 구성성분을 재활용시키며, 다양한 세포 스트레스에 반응한다. 본 실시예에서, 자가포식의 특징인 LC3-II가 p110δ 양성 MM 세포주에서 화합물 I 처리에 의해 유도되었다. 중요하게는, 세포질 내의 자가포식 공포의 존재, AVO의 형성, LC3의 미세관-연관 단백질 I와 자가포식소체의 막 회합, 및 LC3-II 단백질의 현저한 유도에 의해 증명되는 바와 같이, 화합물 I 처리가 자가포식을 현저하게 증가시켰다. 전자 현미경검사 분석에서, 화합물 I이 자가포식소체를 유도한다는 것이 확인되었다. LC3-II는 LC3-I 전환을 통해 발현되었다. 반대로, 화합물 I에 의해 유도된 자가포식이 자가포식의 특이적 억제제인 3-MA에 의해 저해되었다. 이러한 연구는 화합물 I의 초기 세포독성 효과가 자가포식과 관련된다는 것을 제안한다.
실시예 32
화합물 I은 BMSC의 존재 하에 세포 성장을 억제한다
본 실시예는 BMSC와 주변분비 MM 세포 성장을 억제하는 화합물 I의 능력을 입증한다.
IL-6 및 IGF-1이 MM 세포에서 성장 및 항-아폽토시스를 유도하기 때문에, 화합물 I을 INA-6 및 LB MM 세포에서 이러한 시토카인의 영향을 극복하는 것에 대해 시험하였다. LB 및 INA-6 세포를 IL-6 (1 및 10 ng/ml) (도 34a) 또는 IGF-1 (10 및 100 ng/mL) (도 34b)의 존재 또는 부재 하에 대조군 배지 (
Figure pct00046
); 또는 5.0 μM (
Figure pct00047
) 또는 10 μM (
Figure pct00048
)의 화합물 I과 함께 48시간 동안 배양하였다. 72시간 배양의 마지막 8시간 동안 [3H]-티미딘 혼입을 측정함으로써 DNA 합성을 결정하였다. 데이터는 3중 배양물의 평균 (±SD)을 나타낸다. IL-6 또는 IGF-1이 화합물 I에 의해 유도된 성장 억제에 대해 보호하지 않았다 (도 34a 및 34b).
BM 미세환경이 MM에서 증식 및 약물-저항성을 부여하므로, BMSC의 존재 하의 화합물 I의 MM 세포 성장 억제 효과를 조사하였다.
LB 및 INA-6 MM 세포를 BMSC의 존재 또는 부재 하에 대조군 배지 (
Figure pct00049
), 및 2.5 μM (
Figure pct00050
), 5 μM (
Figure pct00051
) 및 10 μM (
Figure pct00052
)의 화합물 I과 함께 48시간 동안 배양하였다 (도 34c). [3H]-티미딘 혼입에 의해 DNA 합성을 결정하였다. 데이터는 3중 배양물의 평균 (±SD)을 나타낸다.
화합물 I (0-2.5 μM)로 처리된 BMSC로부터의 배양 상청액 내의 IL-6을 ELISA에 의해 측정하였다 (도 34d). 오차 막대는 SD (±)를 나타낸다.
BMSC를 1.0 μM 화합물 I 또는 대조군 배지와 함께 48시간 동안 배양하였다; 배양 상청액 내의 시토카인을 시토카인 어레이를 사용하여 검출하였다 (도 34e).
BMSC와 함께 또는 이들 없이 배양된 INA-6 세포를 화합물로 48시간 동안 처리하였다. 전세포 용해물을 지시된 항체를 사용하는 이뮤노블롯팅에 적용하였다 (도 34f). 액틴이 로딩 대조군으로 사용되었다.
2명의 상이한 환자 (□, ◇)로부터의 BMSC를 화합물 I (0-20μM)로 48시간 동안 처리하였다. 세포 생존율을 MTT 검정에 의해 평가하였다 (도 34g). 값들은 3중 배양물의 평균 ± SD를 나타낸다.
중요하게는, 화합물 I이 BMSC에 의해 유도된, 성장 및 시토카인 분비 (도 34c-e), 뿐만 아니라 AKT 및 ERK의 인산화 (도 34f)를 억제하였다. 대조적으로, BMSC에서는 유의한 성장 억제가 주목되지 않았다 (도 34g). 이러한 결과는 화합물 I이 BM 미세환경의 상황에서 주변분비 MM 세포 성장을 차단한다는 것을 나타낸다.
실시예 33
화합물 I은 혈관신생 HuVEC 세관 형성을 억제한다
본 실시예는 HuVEC 세관 형성을 억제하는 화합물 I의 능력을 입증한다. 혈관신생에서의 PI3K, 특히 p110 이소형의 역할을 조사하였다. 내피 세포는 종양 성장을 위한 혈관신생의 본질적인 조절제이다. Akt 및 ERK 경로 둘 다 내피 세포 성장, 및 혈관신생의 조절과 관련되고, 중요하게는, 내피 세포가 p110δ를 발현한다. 본 실시예는 또한 화합물 I이 Akt 인산화의 하향 조절과 관련하여 시험관내에서 모세혈관-유사 튜브 형성을 차단한다는 것을 입증한다.
혈관신생에 대한 P110δ 억제의 효과를 연구하였다. HuVEC를 0, 1.0, 또는 10 μM의 화합물 I로 8시간 동안 처리하고, 내피 세포에 의한 튜브 형성을 평가하였다 (도 35a). HuVEC 세포를 매트리겔(Matrigel)-코팅된 표면 상에 플레이팅하고, 화합물 I의 존재 또는 부재 하에 8시간 동안 세관이 형성되도록 하였다. 내피 세포 튜브 형성을 현미경 분석에 의해 측정하였다 (도 35b). *P<0.005.
HuVEC를 화합물 I (0-20μM)과 함께 48시간 동안 배양하고, 생존율을 MTT 검정에 의해 평가하였다 (도 35c). 데이터는 대표적인 실험으로부터의 3중 웰의 평균 ± SE이다. 따라서, 화합물 I이 용량-의존성 방식으로 모세혈관-유사 튜브 형성을 억제하였고 (p<0.05) (도 35b), 이때 연관된 세포독성은 없었다 (도 35c).
AKT 및 ERK1/2의 인산화 및 발현이 화합물 I 처리에 의해 HuVEC 세포에서 현저하게 하향 조절되었다. HuVEC를 화합물 I (0-200μM)과 함께 8시간 동안 배양하고, 세포 용해물을 지시된 항체들을 사용하는 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다 (도 35d). 액틴이 로딩 대조군으로 사용되었다.
이러한 발견은 화합물 I이 AKT 및 ERK 활성의 하향 조절과 관련하여 혈관신생을 억제할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 34
화합물 II는 생체내에서 MM 세포 성장을 억제한다
본 실시예는 생체내에서 인간 MM 세포 성장을 억제하는 화합물 II의 능력을 입증한다.
P110δ 억제제의 생체내 효능을 SCID 마우스에 인간 MM 세포가 피하 주사된 이종이식 모델에서 평가하였다.
5x 106개의 LB 세포가 주사된 마우스에게 1일 2회 대조 비히클 (●), 및 화합물 II 10 mg/kg (□) 또는 30 mg/kg (○)을 경구 처리하였다. 평균 종양 부피는 물질 및 방법에서와 같이 계산하였다 (도 36a). 오차 막대는 SD (±)를 나타낸다.
12일 동안 대조 비히클 (상부 패널) 또는 화합물 II (30 mg/kg) (하부 패널)로 처리된 마우스로부터의 대표적인 전신 영상 (도 36b).
화합물 II (30 mg/kg) 처리된 마우스 (우측 패널) 및 대조군 마우스 (좌측 패널)로부터 수확된 종양을 CD31 및 P-AKT Ab를 사용하는 면역조직화학 분석에 적용하였다. CD31 및 P-AKT 양성 세포는 암갈색이었다 (도 36d).
마우스를 화합물 II 10 mg/kg (- -), 30 mg/kg (…) 또는 대조 비히클 (-)로 처리하였다. 처리 제1일부터 희생시킬 때까지 카플란-마이어 곡선을 사용하여 생존을 평가하였다 (도 36c).
대조 비히클 또는 화합물 II (30 mg/kg)로 처리된 마우스로부터 종양 조직을 수확하였다. 인산화된 PDK-1 및 AKT (Ser473)의 단백질 수준을 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅에 의해 결정하였다 (도 36e). 액틴이 로딩 대조군으로 사용되었다.
SCID 마우스 내에서의 인간 골 세편에 생착된 INA-6 세포의 성장을 shuIL-6R의 일련의 혈청 측정에 의해 모니터링하였다. 마우스를 화합물 II 10 mg/kg (□), 30 mg/kg (△) 또는 대조 비히클(●)로 처리하고, shuIL-6R 수준을 매주 ELISA에 의해 결정하였다 (도 36f). 오차 막대는 SD (±)를 나타낸다.
화합물 II (p110 δ 억제제)가 대조군 마우스 (n=7)와 비교하여 치료군 (n=7)에서 MM 종양 성장을 유의하게 감소시켰다. 종양 부피의 비교는 대조군 대 치료군 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다 (vs 10 mg/kg: P<0.05; vs 30 mg/kg: P<0.01) (도 36a). 대조군 마우스와 비교하여 처리된 마우스에서 종양 성장의 현저한 감소가 제12일에 관찰되었다 (도 36b). 카플란-마이어 곡선 및 로그-순위 분석은 대조군에서의 15일 (95% 신뢰 구간, 12-17일)의 평균 전체 생존 (OS) 대 각각 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 화합물 II 처리된 군에서의 23일 (95% CI, 15-34일) 및 32일 (95% CI, 27-49일)을 나타내었다. 대조군 마우스와 비교하여 평균 OS의 통계학적으로 유의한 연장이 또한 치료군에서 관찰되었다 (vs 10 mg/kg: P=0.086; vs 30 mg/kg: P=0.056) (도 36c). 중요하게는, 비히클 단독 또는 화합물 II로의 처리가 체중에 영향을 미치지 않았다. 또한, 면역조직화학 분석 (도 36d) 및 이뮤노블롯 분석 (도 36e)에서, 화합물 II 처리 (30 mg/kg)가 p-Akt 및 p-PDK-1을 유의하게 억제하였을 뿐만 아니라, CD31 양성 세포 및 미세혈관 밀도를 유의하게 감소시켰다는 것 (p<0.01)이 확인되었다 (도 36d). 이는 화합물 II가 Akt 경로의 억제를 통해 생체내에서 혈관신생을 억제할 수 있다는 것을 제안한다.
생체내에서 인간 BM 미세환경의 상황에서의 MM 세포 성장에 대한 화합물 II의 활성을 조사하기 위해, IL-6 의존성 INA-6 세포가 SCID-마우스 내에 피하 이식된 인간 골 세편으로 직접 주사되는 SCID-hu 모델을 사용하였다. 이러한 모델은 INA-6 인간 MM 세포의 인간 IL-6/BMSC-의존성 성장이 있는 인간 BM 미세환경을 재현한다. 이러한 SCID-hu 마우스를 화합물 II 또는 비히클 단독으로 4주 동안 매일 처리하고, 혈청 shuIL-6R을 종양 부담 마커로서 모니터링하였다. 도 36f에 나타난 바와 같이, 화합물 II 처리가 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제하였다. INA-6 세포에 의해 방출되는 혈청 shuIL-6R 수준 감소에 의해 증명되는 바와 같이 이러한 모델에서의 유의한 종양 성장 억제가 관찰되어, p110δ 억제가 생체내에서의 BM 미세환경의 MM 성장 촉진 활성을 차단한다는 것이 확인되었다. 총괄적으로, 이러한 데이터는 화합물 II에 의한 p110δ의 억제가 유의하게 생체내에서 MM 성장을 억제하고 생존을 연장시킨다는 것을 입증한다.
실시예 35
보르테조밉과 조합된 화합물 I은 상승작용적 세포독성을 나타낸다
본 실시예는 상승작용적 MM 세포독성을 매개하는 보르테조밉과 조합된 화합물 I의 효과를 입증한다.
상승작용적 MM 세포독성 유도에서의 화합물 I과 보르테조밉을 조합하는 것의 효과를 연구하였다. LB 및 INA-6 MM 세포를 배지 (
Figure pct00053
), 및 1.25 μM (
Figure pct00054
), 2.5 μM (
Figure pct00055
) 또는 5.0 μM (
Figure pct00056
)의 화합물 I과 함께, 보르테조밉 (0-5 nM)의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 세포독성을 MTT 검정에 의해 평가하였다; 데이터는 4중 배양물의 평균 ± SD를 나타낸다 (도 37a).
INA-6 세포를 화합물 I (5 μM) 및/또는 보르테조밉 (5 nM)으로 6시간 동안 처리하였다. 포스포-AKT (ser473) 항체를 사용하는 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅에 의해 AKT의 인산화를 결정하였다 (도 37b). 액틴이 로딩 대조군으로 사용되었다.
화합물 I이 보르테조밉의 세포독성을 증진시켰다. 보르테조밉 (2.5, 5.0 nM)에 첨가된 증가하는 농도의 화합물 I (1.5-5.0 μM)이 LB 및 INA-6 MM 세포에서 상승작용적 세포독성을 유발하였다 (도 37a 및 표 7). 중요하게는, 보르테조밉 처리에 의한 포스포-Akt의 유도가 화합물 I의 존재 하에 억제되었다 (도 37b).
Figure pct00057
실시예 36
여포성 림프종 세포주에서 효과적인 화합물 I
본 실시예는 화합물 I이 여포성 림프종 세포에서 PI3K 신호전달을 차단하고 아폽토시스를 유도한다는 증거를 제공한다. 도 38A에 나타난 바와 같이 P110δ가 FL 세포주에서 발현되었다. 세포가 화합물 I에 노출되었을 때 특정 세포주가 pAkt, Akt, pS6 및 S6의 생산 감소를 나타내었다 (도 38B). PARP 및 카스파제-3의 절단이 화합물 I에 대한 노출 후에 0.1 μM 및 0.5 μM에서 24시간 후 용량-의존성 방식으로 관찰되었다 (도 38C).
실시예 37
1차 MCL 세포에서 효과적인 화합물 I
본 실시예는 화합물 I이 MCL에 대해 효과적이라는 것을 입증한다. 0.1 μM 또는 1 μM의 화합물 I에 노출되었을 때 화합물 I이 2명의 환자의 1차 MCL 세포에서의 구성적 PI3K 신호전달을 용량 의존성 방식으로 차단하는 것으로 확인되었다 (도 39a). 화합물 I은 또한 MCL 세포주에서 생존 인자 및 케모카인 신호전달을 억제하는 것으로 관찰되었다. 도 39b는 화합물 I의 존재 하에 여러 생존 인자에 노출된 MCL 세포주에서 pAkt의 유의한 감소를 보여주었다.
실시예 38
재발 또는 불응성 B-세포 악성종양을 앓는 환자에서 리툭시맙 및/또는 벤다무스틴과 조합된 화합물의 효과
본 실시예는 재발 또는 불응성 B-세포 악성종양을 앓는 환자에서 리툭시맙 및/또는 벤다무스틴과 조합된 화학식 I의 화합물의 안전성 및 활성을 입증한다.
데이터 컷오프에서, NHL을 앓는 6명 및 CLL을 앓는 6명을 포함하는 12명의 환자가 연구에 등록하였다. 환자를 하기를 포함하였다: 65세 (범위: 55-80세)의 중간 연령을 갖는 남성/여성 n=8 (67%)/4 (33%), 및 재발/불응성 질환 n=8 (67%)/4 (33%). 선행 요법의 중간 수는 3 (범위: 1-11)이었다. 모든 환자에게 화학식 I의 화합물 100 mg BID를 투여하고; 6명의 환자에게 리툭시맙을, 6명의 환자에게 벤다무스틴을 투여하였다. NHL을 앓는 1명의 환자는 딸꾹질 때문에 벤다무스틴의 용량을 감소시켰고, NHL을 앓는 1명의 환자는 증가된 ALT/AST 때문에 화학식 I의 화합물의 용량을 감소시켰으며; 모든 다른 환자는 허용되는 허용성을 갖는 전체-용량 요법을 받았다. 임상 반응 평가는 2 사이클의 조합 치료가 완료된 6명의 환자에서 가능하였으며, 결과는 하기 표 8에 제시된다.
Figure pct00058
따라서, 리툭시맙 또는 벤다무스틴과 조합된 화학식 I의 화합물의 투여는 재발 또는 불응성 B-세포 악성종양을 앓는 환자에서 허용되는 안전성 및 유망한 임상 활성을 보여준다.
실시예 39
재발 또는 불응성 B-세포 악성종양을 앓는 환자에서 리툭시맙 및/또는 벤다무스틴과 조합된 화합물의 효과
본 실시예는 재발 또는 불응성 B-세포 무통성 NHL 및 CLL을 앓는 환자에서 리툭시맙 및/또는 벤다무스틴과 조합된 화학식 I의 화합물의 안전성 및 활성을 입증한다.
iNHL을 앓는 12명 및 CLL을 앓는 8명을 포함하는 20명의 환자가 등록하였다. 환자 특성을 도 42에 요약한다. 모든 환자에게 화학식 I의 화합물을 환자에게 이익이 있는 동안은 1일 2회 (BID) 100 mg 경구로 또는 1일 2회 (BID) 150 mg 경구로 투여하였다. 환자에게 또한 사이클 1의 제1일에 출발하여 8주 동안 매주 리툭시맙 375 mg/㎡을 투여하거나, 6 사이클 동안 각 사이클의 제1일 및 제2일에 벤다무스틴 90 mg/㎡을 투여하였다. 종양 반응을 표준 기준에 따라 평가하였다.
도 43에 나타난 바와 같이, 등급 ≥3 유해 사례는 주로 기존의 질환- 또는 치료-관련 상태 또는 병발성 질병으로부터 생성된 배경 사례를 포함하였다. 벤다무스틴 및 화합물 I을 투여한 환자의 경우에, 등급 ≥3 유해 사례는 B-유도된 골수억제를 포함하였다. 리툭시맙 및 화합물 I을 투여한 환자의 경우에, 등급 ≥3 유해 사례는 드물게 나타났고, 화학식 I의 화합물과 명확하게 관련되지 않았다. iNHL-특이적인 일시적 ALT/AST 상승이 관찰되었으며; 이러한 사례는 약물 중단 동안 해결되었으며, 보다 낮은 용량 수준에서의 화학식 I의 화합물로 다시 개시하였을 때 성공적으로 유지되었다. 화학식 I의 화합물과 관련된 용량-제한 독성이 시험된 환자 코호트 내에서 관찰되지 않았다.
도 44에 나타난 바와 같이, 벤다무스틴 및 화합물 I, 또는 리툭시맙 및 화합물 I의 조합 요법을 받은 iNHL 또는 CLL을 앓는 환자의 거의 모두가 결절 크기의 감소를 경험하였다.
또한, 벤다무스틴 및 화합물 I을 투여하든지 또는 리툭시맙 및 화합물 I을 투여하든지 iNHL을 앓는 환자 및 CLL을 앓는 환자에서 높은 수준의 항종양 활성이 관찰되었다. 도 45의 표에 요약된 바와 같이, 벤다무스틴 및 화합물 I을 투여한 iNHL을 앓는 1명의 환자가 완전 반응을 나타내었다.
따라서, 리툭시맙 또는 벤다무스틴과 조합된 화합물 I의 투여는 재발 또는 불응성 무통성 B-세포 NHL 및 CLL을 앓는 환자에서 허용되는 안전성 및 유망한 임상 활성을 보여준다.
이전 연구에서, 도 46에서 나타난 바와 같이, 화학식 I의 화합물의 투여를 포함하는 단일-작용제 요법은 CLL을 앓는 환자의 ~2/3에서 림프구증가증을 유발하는 림프구 재분포를 일으켰다. 대조적으로, 도 47에 나타난 바와 같이, 벤다무스틴 및 화합물 I 또는 리툭시맙 및 화합물 I로의 조합 요법은 CLL을 앓는 모든 환자에서 악성 림프구 수를 감소시켰다.
따라서, 상기에 논의된 조합 요법은 iNHL 및 CLL을 앓는 환자에서 결절 크기의 감소 및 항종양 활성 뿐만 아니라 CLL을 앓는 환자에서 악성 림프구 수의 감소에서 놀라운 효과 및 부작용이 거의 없는 우수한 결과를 제공한다.
실시예 40
만성 림프구성 백혈병에서 B-세포 수용체 (BCR) 신호전달 및 너스(nurse)-유사 세포 (NLC)의 프로-생존 작용에 대한 벤다무스틴과 조합된 화합물의 효과
본 실시예는 BCR-유래 CLL 세포 활성화에 대한 벤다무스틴과 조합된 화학식 I의 화합물의 효과를 입증한다. 항-IgM과 BCR의 가교는 CLL 세포 생존율을 대조군의 121 ± 5% (평균 ± SEM, n=15, *P< 0.05)로 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 프로-생존 효과는 화학식 I의 화합물에 의해 없어졌는데, CLL 세포 생존율이 48시간에 대조군의 85 ± 3% (평균 ± SEM, n=15, *P< 0.05)로 감소하였다. NLC와 공동-배양된 CLL 세포 생존율은 또한 화학식 I의 화합물에 의해 48시간에 처리되지 않은 대조군의 64 ± 6% (평균 ± SEM, n=10, *P< 0.05)로 유의하게 감소하였다. BCR 가교는 CLL 세포에 의한 케모카인 CCL3 및 CCL4의 분비를 유도하고, 이는 CLL 상청액에서 ELISA에 의해 정량화하였다.
화학식 I의 화합물은 상청액 CCL3 농도를 4060 ± 1392 pg/mL로부터 2901 ± 1220 pg/mL로, CCL4 수준을 5721 ± 1789 pg/mL로부터 3223 ± 1311 pg/mL로 유의하게 감소시켰다 (평균 ± SEM, n=6, *P<0.05). CLL-NLC 공동-배양물에서, 화학식 I의 화합물은 또한 CLL 세포에 의한 CCL3/4 분비를 억제하였다. CCL3 농도는 화학식 I의 화합물에 의해 943 ± 535 pg/mL로부터 156 ± 8 pg/mL로 감소하고, CCL4 농도는 7433 ± 4463 pg/mL로부터 316 ± 53 pg/mL로 감소하였다 (평균 ± SEM, n=5, *P<0.05).
놀랍게도, 화학식 I의 화합물은 또한 CXCL13 수준을 CLL-NLC 공동-배양물에서 151 ± 35로부터 70 ± 27 pg/mL로 감소시켰으며 (평균 ± SEM, n=4, *P=0.05), 이는 화학식 I의 화합물이 NLC에 의해 나타난 바와 같이 CLL 세포 및 CLL 미세환경 둘 다에 약리학적 작용을 갖는다는 것을 나타낸다.
본 실시예는 또한 화학식 I의 화합물의 벤다무스틴과의 조합이 골수 기질 세포 (MSC)와의 CLL 세포 공동-배양물에서 기질-매개 약물 저항성을 극복할 수 있다는 것을 입증한다. 도 48a 및 48b에 나타난 바와 같이, 두 약물의 조합은 CLL 세포 사멸에 대해 상승된 효과를 나타낸다.
또한, 포스포-유동을 이용하여 화학식 I의 화합물이 화학식 I의 화합물로 처리한 CLL 환자로부터 수득한 샘플에서 구성적 및 BCR-유도된 PI3K 경로 활성화를 억제한다는 것을 입증하였다. 화학식 I의 화합물 처리는 pAkt(T308)을 말초 CLL 세포에서 >90% (n=12)만큼 하향-조절하였다. 화학식 I의 화합물로의 매일 처리의 28일 전후에 수득한 14명의 CLL 환자로부터의 혈장 샘플을 다양한 시토카인의 농도에 대해 분석하였다. 흥미롭게도, 이러한 분석은 기준선으로부터 화학식 I의 화합물 처리의 제28+일까지 CCL3 (186 pg/mL로부터 29 pg/mL로), CCL4 (303으로부터 70 pg/mL로), CCL22 (1067로부터 533 pg/mL로), CXCL13 (316 pg/mL로부터 40 pg/mL로), 및 TNFα (104로부터 29 pg/mL로)의 평균 혈장 수준의 유의한 감소를 밝혀내었으며, 이는 CCL3/4 및 CXCL13에 대한 본 발명자들의 시험관내 데이터를 확인한다.
총괄적으로, 본 실시예로부터의 결과는 화학식 I의 화합물이 시험관내에서 BCR- 및 NLC-매개 CLL 세포 생존 및 활성화를 효과적으로 억제한다는 것을 보여준다. 또한, 화학식 I의 화합물은 CLL 세포에 대한 세포독성제, 예컨대 벤다무스틴의 활성을 증진시킨다. 생체내 데이터는 화학식 I의 화합물이 상승된 예비-처리 CCL3 및 CCL4 수준을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이론에 제한되지 않으면서 이러한 관찰은 BCR-유래 신호의 억제가 CLL에서 화학식 I의 화합물의 작용의 주요한 메카니즘일 수 있다는 개념을 제안한다.
실시예 41
CLL에서 포스파티딜이노시톨 3-키나제-δ 경로의 활성화에 대한 레날리도미드와 조합된 화합물의 효과
본 실시예는 CLL을 앓는 환자에서 PI3k-델타 경로의 활성화에 대한 레날리도미드와 조합된 화학식 I의 화합물의 효과를 보여준다.
샘플 수집 및 배양 조건: 단리된 단핵 세포는 음성적으로 B-세포 선별되어 배양물에 넣었다. 화학식 I의 화합물은 칼리스토가 파마슈티칼스 (워싱턴주 시애틀)에서 공급하였다. 레날리도미드 (레블리미드; 셀진(Celgene))를 수득하여 추출하였다.
유동 세포측정법 검정: CD20, CD40, CD80, CD86 또는 IgG1에 대한 항체 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 산호세)를 표면 염색하였다.
이뮤노블롯 분석: 이뮤노블롯을 수행하였다. 항체는 항-AKT, 항-포스포-AKT (Ser473), 항-GSK3β 항-포스포-GSK3β (Ser9) (셀 시그널링, 매사추세츠주 댄버스), 항-p110δ (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 캘리포니아주 산타 크루즈), 및 항-GapdH (밀리포어(Millipore), 매사추세츠주 빌러리카)를 포함하였다.
정량적 RT-PCR: RNA를 트리졸(TRIzol) 시약 (인비트로젠)을 사용하여 추출하고, cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) 제1-가닥 합성 시스템 (인비트로젠)을 이용하여 제조하였다. 실시간 PCR을 미리 설계된 택맨(TaqMan)® 유전자 발현 검정 및 ABI 프리즘 7700(ABI Prism 7700) 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티)을 이용하여 수행하였다.
PI3K 검정: PI3K 검정은 CLL 세포로부터의 전세포 용해물 상에서 수행하였다. ELISA 검정은 제조업체 (에셜론 바이오사이언시스(Echelon Biosciences), 유타주 솔트 레이크 시티)의 지시에 따라 수행하였다.
형질감염: CLL 세포를 형질감염시켰다. p110δ siRNA (암비온(Ambion), 텍사스주 오스틴)는 50nM의 최종 농도로 사용하였다.
이뮤노글로불린 검출: IgM의 양자화를 결정하였다. 간략하게, 레날리도미드-처리된 또는 비히클 대조군-처리된 CLL 세포를 조사하고, PWM (5 μg/mL)의 부재 또는 존재 하에 표적, 정제된 B-세포를 갖는 배양물에 넣었다.
통계적 분석: 모든 보고된 통계적 평가는 이전에 기재된 방법 (7)으로 OSU의 생물통계학 센터에서 수행하였다. 단일 비교에 대한 또는 다중 비교를 위한 조정 후의 α=0.05에서의 p-값이 유의한 것으로 간주된다.
본 실시예의 결과는 레날리도미드가 증가된 mRNA 전사 및 안정화와 AKT, IKK 및 NF-κB 핵 전위의 활성화에 의해 CLL 세포 상에서 CD154를 상향조절한다는 것을 보여준다. CLL 세포의 pan-억제제 LY294002로의 처리는 이러한 AKT 활성화에 길항작용을 하였다.
우선 PI3-키나제 활성화의 특이성을 확인하기 위해, 레날리도미드로의 처리 후에 PI3K의 효소 활성의 직접적인 증가가 결정되었다. 0.5 μM 레날리도미드로 처리되거나 처리되지 않은 CLL 환자 (N=9)로부터의 CD19+ 세포를 1 또는 10 μM 화학식 I의 화합물의 용해물에 첨가하거나 첨가하지 않고 PI3-키나제 활성에 대해 조사하였다. 결과는 단백질의 μg에 대해 계산하였다. PI3K 경로을 통한 레날리도미드로의 신호전달은 4종의 촉매 이소형: p110α, p110β, p110γ, 및 p110δ을 통해 발생할 수 있다. 또한, 소분자 억제제, 화학식 I의 화합물을 통한 PI3K-δ의 억제는 PI3K 효소 활성의 증가를 방지하는 것으로 밝혀졌다 (도 49a).
다음에, 화학식 I의 화합물로의 PI3K-δ의 억제가 레날리도미드에 의해 유도된 AKT의 하류 인산화의 증가를 방지할 수 있는지 여부를 결정하는데 있어서, 화학식 I의 화합물에 의한 PI3K-δ의 억제는 PI3K 활성을 방지하였다. CLL 환자 (N=6)로부터의 CD19+ 세포를 0.5 μM 레날리도미드 및/또는 1 또는 10 μM 화학식 I의 화합물과 함께 또는 이들 없이 48시간 동안 인큐베이션하였다. ser473에서의 AKT 인산화를 이뮤노블롯에 의해 평가하였다. 도 49b를 참조한다.
이러한 결과를 확인하기 위해, GSK3β의 인산화를 평가하였다. CLL 환자 (N=4)로부터의 CD19+ 세포를 0.5 μM 레날리도미드 및/또는 1 또는 10 μM 화학식 I의 화합물과 함께 또는 이들 없이 48시간 동안 인큐베이션하였다. ser9에서의 GSK3β 인산화를 이뮤노블롯에 의해 평가하였다. 4회 실험 중 하나로부터의 결과를 제시하였다. 레날리도미드 처리는 화학식 I의 화합물과의 공동-처리에 의해 방지가능한 GSK3β의 인산화의 증가로 이어지는 것으로 밝혀졌으며, 이는 다시 PI3K-δ 및 레날리도미드 의존성 PI3K 활성 사이의 연결을 제안한다. 도 49c를 참조한다.
이러한 결과가 사실상 PI3K-δ 억제로 인한 것인지 확인하기 위해, CLL 세포에서 PI3K-δ를 녹다운시켰다. CLL 환자 (N=3)로부터의 CD19+ 세포를 PI3K-δ, PI3K-γ 또는 넌센스 표적에 표적화된 siRNA로 형질감염시켰다. p110δ 단백질 발현을 이뮤노블롯에 의해 평가하였다. 3회 실험 중 하나로부터의 결과가 제시된다. 도 49d를 참조한다.
레날리도미드는 PI3K-δ가 녹다운되었을 때 AKT의 인산화를 유도할 수 없는 것으로 밝혀졌다. CLL 환자 (N=3)로부터의 CD19+ 세포를 PI3K-δ, PI3K-γ 또는 넌센스에 표적화된 siRNA로 형질감염시킨 후에 0.5 μM 레날리도미드와 함께 또는 이들 없이 48시간 동안 인큐베이션하였다. ser473에서의 AKT 인산화를 이뮤노블롯에 의해 평가하였다. 3회 실험 중 하나로부터의 결과가 제시된다. 도 49e를 참조한다.
이러한 발견은 레날리도미드에 의한 CLL에서의 PI3K 활성화 및 CLL 세포 상에서의 NF-κB 및 CD154에 대한 후속 효과가 PI3K-δ 의존성 경로를 이용한다는 것을 뒷받침한다.
레날리도미드 처리는 이전에 CLL 세포의 활성화를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견을 확장하기 위해, PI3K-δ 방지된 레날리도미드의 억제를 연구하여 이것이 B-세포 항원 제시에 중요한 다른 공동-자극 분자의 상향조절을 유도하는지 여부를 알아보았다. CLL 환자 (N=25)로부터의 CD19+ 세포를 0.5 μM 레날리도미드 및/또는 10 μM 화학식 I의 화합물로 48시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. CD40 또는 CD86의 표면 발현을 CD40- 또는 CD86-PE 항체 및 IgG1-PE 이소형 대조군을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 화학식 I의 화합물로의 처리는 레날리도미드에 의해 유도된 CD40 및 CD86의 상향조절을 방지할 수 있었다 (각각 p-값=0.0102 및 <0.0001) (도 50a).
유사하게, PI3K-δ의 억제는 또한 레날리도미드에 의해 촉진된 CD40, CD86, CD154 및 CD80의 mRNA의 증가를 방지하는 것으로 밝혀졌다 (모든 유전자의 경우에 p-값<0.009) (도 50b). CLL 환자 (N=15)로부터의 CD19+ 세포를 0.5 μM 레날리도미드 및/또는 10 μM 화학식 I의 화합물로 48시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. RNA를 추출하고, cDNA로 전환시키고, RT-PCR 분석을 수행하여 CD40, CD86 및 CD154 mRNA의 양을 결정하였다.
레날리도미드는 또한 CD20의 내재화를 유도하는 것으로 밝혀졌으며, 화학식 I의 화합물로의 공동 처리는 이러한 영향을 방지하였다 (p-값=0.0057) (도 50c). CLL 환자 (N=5)로부터의 CD19+ 세포를 0.5 μM 레날리도미드 및/또는 10 μM 화학식 I의 화합물로 48시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. CD20의 내재화를 CD20-PE 항체 및 IgG1-PE 이소형 대조군을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 CD20의 표면 발현을 정량함으로써 평가하였다.
레날리도미드-처리된 CLL 세포에서 정상 B-세포를 촉진하여 이뮤노글로불린을 생산하는데 있어 CD40-CD154 축의 중요성이 주어졌으므로, 화학식 I의 화합물을 이것이 이러한 발생을 방지할 수 있는지 여부를 알아보기 위해 평가하였다. CLL 환자 (N=6)로부터의 CD19+ 세포를 0.5 μM 레날리도미드 및/또는 10 μM 화학식 I의 화합물로 48시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. CLL 세포를 조사하고 (20 Gy), 5 μg/mL PWM의 부재 또는 존재 하에 정제된 B-세포가 있는 배양물에 넣었다. IgM의 정량화를 ELISA 분석에 의해 결정하였다. 이전에 (5) 및 본원에서 레날리도미드 처리된 CLL 세포가 증가된 IgM 수준을 갖는 것으로 밝혀진 반면, CLL 세포의 화학식 I의 화합물로의 예비-처리는 IgM의 생산을 완전하게 방지하는 것으로 밝혀졌다 (p-값<0.0001) (도 50d).
마지막으로, 배양물에서 CLL 세포의 레날리도미드 처리를 시험하여 이것이 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 염기성 섬유모세포 성장 인자 (b-FGF)의 종양 세포 생산을 촉진할 수 있는지 여부를 결정하였다. CLL 환자 (N=15)로부터의 CD19+ 세포를 0.5 μM 레날리도미드 및/또는 10 μM 화학식 I의 화합물로 48시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. RNA를 추출하고, cDNA로 전환시키고, RT-PCR 분석을 수행하여 bFGF의 양을 결정하였다. 레날리도미드 처리는 모든 환자에서 b-FGF의 전사 상향조절을 증가시켰으며 (p-값=0.0004), 화학식 I의 화합물의 공동-인큐베이션이 이러한 상향조절을 방지하였다 (p-값<0.001) (도 50e).
유사하게, 레날리도미드 처리는 환자의 하위세트 (13명 중 8명)에서 VEGF의 전사 수준을 증가시켰으며, 이는 다시 화학식 I의 화합물로의 처리에 의해 가역적이었다 (p-값=0.002) (도 50f). (F) CLL 환자 (N=13)로부터의 CD19+ 세포를 0.5 μM 레날리도미드 및/또는 10 μM 화학식 I의 화합물로 48시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. RNA를 추출하고, cDNA로 전환시키고, RT-PCR 분석을 수행하여 VEGF의 양을 결정하였다.
데이터는 총괄적으로 CLL 세포의 레날리도미드-매개 활성화에서 PI3K-δ 경로에 대한 지원을 제공하였다. 이러한 발견의 잠재적 관련성은 CLL에서 레날리도미드의 사용과 관련된 것이 여러가지였다. 화학식 I의 화합물, pan-PI3-키나제 억제제 및 잠재적으로 레날리도미드로 PI3-키나제의 하류의 신호전달에 길항작용을 하는 다른 작용제의 조합은 아마도 이러한 작용제의 면역 조절 특성에 길항작용을 할 수 있을 것이다. 따라서 면역 조절이 바람직하다면 이러한 조합 요법의 적용에 조심스럽게 접근하여야 한다. 대조적으로, 레날리도미드의 비-면역 조절 작용이 바람직하다면, 작용제, 예컨대 화학식 I의 화합물 또는 대안적 PI3-키나제 억제제의 적용이 이들의 놀라운 효과의 관점에서 면역 활성화, 종양 확산, 및 이러한 치료와 연관된 시토카인 방출 증후군을 방지하는데 매력적일 것이다. 이는 특히 CLL 세포에 대한 보호 효과를 나타내는 시토카인, 예컨대 VEGF 16-19 및 b-FGF 16,20,21에서 사실일 수 있다. 실제로, 치료 동안 일련의 시토카인 수준을 조사한 재발된 CLL에서의 레날리도미드의 한 연구는 반응 환자와 비교하여 비-반응 환자가 b-FGF 2를 포함하여 영구적으로 상승된 시토카인 수준을 갖는다는 것에 주목하였다.
실시예 42
이전에 치료된 B-세포 악성종양을 앓는 환자에서 리툭시맙 및/또는 벤다무스틴과 조합된 화합물의 효과
본 실시예는 이전에 치료된 B-세포 악성종양을 앓는 환자에서 리툭시맙 및/또는 벤다무스틴과 조합된 화학식 I의 화합물의 안전성 및 활성을 입증한다.
iNHL을 앓는 27명 및 CLL을 앓는 22명을 포함하는 49명의 환자가 연구에 등록하였다. 환자 특성을 도 51에 요약하였다. 기준선에서, 환자는 고령, 거대 선병증 및 불응성 질환을 포함하는 유해한 예후 특성을 가졌다. 모든 환자는 1종 이상의 선행 치료 요법을 받았고, 일부는 최대 9종의 선행 요법을 받았다. 선행 치료는 리툭시맙, 알킬화제 및/또는 플루다라빈을 포함하며; iNHL을 앓는 대부분의 환자는 선행 안트라시클린-함유 요법으로 치료되었다. 후속 치료는 다수의 환자에서 일찍 수행하였으며, 요법 지속 기간은 1 내지 12 사이클이었다.
모든 환자에게 환자에게 이익이 있는 동안은 화학식 I의 화합물을 1일 2회 (BID) 100 mg 경구로 또는 1일 2회 (BID) 150 mg 경구로 투여하였다. 환자에게 또한 사이클 1의 제1일에 시작하여 8주 동안 매주 리툭시맙 375 mg/㎡를 투여하거나, 또는 6 사이클 동안 각각의 사이클의 제1일 및 제2일에 벤다무스틴 90 mg/㎡를 투여하였다. 종양 반응을 표준 기준에 따라 평가하였다.
도 52에 나타난 바와 같이, 등급 ≥3 유해 사례는 주로 기존의 질환, 선행 요법으로부터의 독성 또는 병발성 질병으로부터 발생하는 배경 사례를 포함하였다. 벤다무스틴 및 화학식 I의 화합물을 투여받은 환자의 경우에, 등급 ≥3 유해 사례는 B-유도된 골수억제를 포함하였다. 리툭시맙 및 화학식 I의 화합물을 투여받은 환자의 경우에, 등급 ≥3 유해 사례는 드물었고, 화학식 I의 화합물과 명백하게 관련되지 않았다. iNHL-특이적인 일시적 ALT/AST 상승이 관찰되었으며; 이러한 사례는 약물 중단시에 해결되었고, 화학식 I의 화합물의 보다 낮은 용량 수준에서 요법을 다시 개시하였을 때 성공적으로 유지되었다. 화학식 I의 화합물과 관련된 어떠한 용량-제한 독성도 시험된 환자 코호트 내에서 관찰되지 않았다.
도 53a 및 53b에 나타난 바와 같이, 벤다무스틴 및 화학식 I의 화합물 또는 리툭시맙 및 화학식 I의 화합물의 조합 요법을 받은 iNHL 또는 CLL을 앓는 환자의 거의 모두가 결절 크기의 감소를 경험하였다.
또한, 높은 수준의 항종양 활성이 벤다무스틴 및 화학식 I의 화합물을 투여하든 또는 리툭시맙 및 화학식 I의 화합물을 투여하든 iNHL을 앓는 환자 및 CLL을 앓는 환자에서 관찰되었다. 도 54에 요약된 바와 같이, 벤다무스틴 및 화학식 I의 화합물을 투여한 iNHL을 앓는 환자 2명이 완전 반응을 나타내었다.
이전 연구에서, 도 55에 나타난 바와 같이, 화학식 I의 화합물의 투여를 포함하는 단일-작용제 요법은 CLL을 앓는 환자에서 일시적 림프구증가증을 유발하는 림프구 재분포를 일으켰다. 대조적으로, 도 56에 나타난 바와 같이, 벤다무스틴 및 화학식 I의 화합물 또는 리툭시맙 및 화학식 I의 화합물로의 조합 요법은 CLL을 앓는 환자에서 악성 림프구 수를 보다 신속하게 감소시켰다.
따라서, 상기 논의된 조합 요법은 iNHL 및 CLL을 앓는 환자에서 결절 크기의 감소 및 항종양 활성 뿐만 아니라 CLL을 앓는 환자에서 악성 림프구 수의 감소에 있어 놀라운 효과 및 부작용이 거의 없는 우수한 결과를 제공한다.
실시예 43
골수 기질 세포 (MSC)와 공동-배양된 CLL 세포에서 덱사메타손, 벤다무스틴 및/또는 플루다라빈과 조합된 화합물의 효과
본 실시예는 CLL 세포를 이들 세포에 세포독성인 약물 (예를 들어, 덱사메타손, 벤다무스틴 및 플루다라빈)의 존재 하에 MSC와 공동-배양하였을 때 CLL 세포에 대한 화학식 I의 화합물의 효과를 입증한다.
CLL 세포를 배지 단독 (대조군) 또는 지시된 용량의 화학식 I의 화합물, 덱사메타손, 벤다무스틴 또는 플루다라빈, 또는 조합된 약물을 함유하는 배지 중에서 MSC와 공동-배양하였다.
생존 세포 집단은 밝은 DiOC6 염색 및 PI 배제를 특징으로 하였으며, 각 컨투어 플롯의 하부 우측 코너에서 게이팅되었다. 각각의 이들 게이트 위에 생존 세포의 백분율을 나타내었다. 도 57a에 나타난 바와 같이, 덱사메타손, 벤다무스틴 또는 플루다라빈과 화학식 I의 화합물의 조합은 CLL 세포 사멸에 대해 증가된 효과를 나타내었다.
약물-처리된 샘플의 생존율은 각각의 시점에서의 대조군 샘플의 생존율 (100%)에 대해 정규화되었다. 도 57b는 9명의 상이한 환자 샘플로부터의 평균 (±SEM)을 나타낸다 (24, 48 및 72시간 후에 평가됨). MSC의 존재 하의 CLL 세포 생존은 각각의 약물-처리된 배양물로부터의 결과를 대조군 배양물로부터의 결과와 비교하여 기재한 별표에 의해 나타난 바와 같이 조합 요법에 의해 유의하게 감소하였다 (P<.05). 예를 들어, 72시간 후에, 처리되지 않은 대조군에 비한 CLL 세포 생존율은 화학식 I의 화합물의 경우에 93% (±0.6%) 및 벤다무스틴의 경우에 60% (±8.7%)였으나, 2종의 약물을 조합한 경우에 42.7% (±11.4%)로 감소하였다. 유사한 결과가 화학식 I의 화합물 및 플루다라빈, 또는 화학식 I의 화합물 및 덱사메타손의 조합의 경우에 관찰되었다.
따라서, 이러한 결과는 화학식 I의 화합물이 아마도 MSC-유래 약물 저항성 신호를 파괴함으로써 CLL 세포를 세포독성제에 감작화시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 44
CLL에서 오파투무맙과 조합된 화합물의 효과
본 실시예는 이전에 CLL에 대해 치료받은 적이 있는 환자의 치료를 위한 오파투무맙과 조합된 화합물 I의 반복 사이클 (28일/사이클)의 단계 1-2 연구를 요약한다.
화합물 I (150 mg 1일 2회 [BID])을 24주에 걸쳐 주어진 오파투무맙의 12회의 주입과 계속적으로 공투여하였다. 오파투무맙을 (화합물 I의 제1 용량과 관련하여) 제1일 또는 제2일에 300 mg의 초기 용량으로 투여하였다. 1주일 후에, 오파투무맙을 7회 용량의 경우에 매주 1,000 mg을 투여하고, 4회 용량의 경우에 4주마다 1,000 mg을 투여하였다. 오파투무맙 치료를 완료한 후에, 각각의 대상체에게 대상체에게 이익이 있는 동안은 화합물 I을 단일 작용제로서 150 mg BID의 용량으로 계속 투여하였다.
21명 환자의 전체 코호트로부터, 11명의 환자의 인구통계 및 예비 효능 데이터가 이용가능하였다. 중간 [범위] 연령은 63세 [54-76세]였다. 환자의 대부분 (9/11; 82%)은 거대 선병증 (최장 치수에서 ≥5 cm 측정된 ≥1 림프절)을 가지고 있었다. 선행 요법의 중간 [범위] 수는 3 [1-6]이었으며, 이는 알킬화제 (10/11; 90%), 리툭시맙 (9/11; 82%), 퓨린 유사체 (8/11; 72%), 알렘투주맙 (3/11; 28%) 및/또는 오파투무맙 (2/11; 18%)에 대한 이전의 노출을 포함한다. 데이터 컷오프에서, 중간 [범위] 처리 기간은 5 [0-7] 사이클이었다. 거의 모든 대상체 (9/11; 82%)가 처음 2 사이클 내에 현저하고 빠른 림프절병증의 감소를 경험하였다. 11명의 환자 중에서, 10명의 사이클 2의 말기 또는 그 후에 종양 평가에 대해 평가가능하였다. 8명의 환자 (80%)가 문헌 [Hallek M, et al. (Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 2008 Jun 15;111(12):5446-56)]에 공개된 기준에 기초하여 연구자에 의해 판단된 바와 같이 반응에 대한 기준을 만족시켰다. 1명의 환자가 안정한 질환에 대한 기준을 만족시키는 감소된 림프절병증을 가지고 있었고, 1명의 환자는 질환 진행 중이었다. 단일-작용제 PI3Kδ 억제에서 예상되는 말초 림프구 수의 일시적 증가의 정도 및 기간이 감소되었다. 일시적 림프구증가증의 감소는 화합물 I 및 오파투무맙의 조합에 의해 유도되었다.
예비 안전성 데이터는 조합 치료가 유리한 안전성 프로파일을 갖고 골수억제가 결핍되어 있다는 것을 보여준다. 또한 약역학적 데이터는 CLL-연관 케모카인 및 시토카인 (CCL3, CCL4, CXCL13 및 TNFα)의 상승된 기준선 수준는 처리 28일 후에 감소되었다. 결과는 오파투무맙과 화합물 I의 조합이 이전에 치료된 CLL을 갖는 환자에서 허용성이 우수한 비-세포독성 치료 요법을 제공한다고 제안한다.
실시예 45
CLL에서 BCL-2 길항제와 조합된 화합물의 효과
본 실시예는 기질-노출된 CLL 세포에 대한 BCL-2 길항제 ABT-737 및 ABT-263과 조합된 화합물 I의 효과를 보여준다.
CLL 세포 정제: 말초 혈액, 골수 및 림프절은 CLL에 대한 진단적 및 면역표현형 기준을 이행하는 동의 환자로부터 수득되었다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 피콜-파크 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 위스콘신주 와우케샤) 밀도 구배 원심분리를 이용하여 혈액 및 조직 샘플로부터 단리하였다. 샘플을 태아 소 혈청 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 샌디에고)에서 신선하게 분석하거나 또는 10% 디메틸 술폭시드 (DMSO; 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스)에 실행가능하게 동결시키고, 액체 질소에 저장하고, 분석을 위해 이후에 해동시켰다. 단세포 현탁액을 분석을 위해 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 기계 상에 준비하였고, CD19+ CLL 세포는 일반적으로 분석된 세포의 >85%를 차치하였다.
세포주: 뮤린 CD154+ L 세포주를 10% FBS, 2.05mM L-글루타민 (하이클론(HyClone), 유타주 로간) 및 페니실린-스트렙토마이신 (셀그로(Cellgro), 버지니아주 마나사스)이 보충된 RPMI 1640 배지 중에 유지하였다. 인간 기질 세포주 기질NKTert는 리켄(Riken) 세포 은행 (일본 츠쿠바)로부터 구입하고, 1 μg/mL 히드로코르티손, 10% FBS, 10% 인간 혈청 (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 2.05-mM L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 알파-MEM 중에 유지하였다. 너스-유사 세포 (NLC)는 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신-글루타민을 갖는 완전 RPMI 1640 배지에 CLL을 앓는 환자로부터의 PBMC를 107개 세포/mL (총 2 mL)의 농도로 현탁시켜 확립하였다. 세포를 24-웰 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스(Corning Life Sciences))에서 14일 동안 성장시켰다.
CLL 세포 및 기질 세포 공동-배양: CLL 세포를 기질 세포주 또는 1차 NLC에 대한 표준화 조건 하에 배양하였다. 간략하게, 기질 세포를 24-웰 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스) 상에 각 실험 하루 전에 3 x 105개 세포/mL/웰의 농도로 시딩하고, 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 기질 세포 전면성장은 위상 대조 현미경검사에서 확인하였고, 이어서 CLL 세포를 기질 세포 층 상에 3 x 106개 세포/mL의 농도로 첨가하였다. 이어서 배양물을 지정된 기간 동안 화합물로 처리하였다. CLL 세포를 분석을 위해 배지를 부드럽게 피펫팅하여 제거하고, 이어서 분석 전에 PBS에서 세척하였다. 달리 나타내지 않는 한 24-시간 공동-배양 시점을 이용하였다.
세포 생존율 시험 및 시약: CLL 세포 생존율은 FACS에 의해 아넥신 V-FITC (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 샌디에고) 및 프로피듐 아이오딘 (PI) (시그마)의 분석에 의해 결정하였다. ABT-737, ABT-263 및 화합물 I을 사용시까지 DMSO 중에 20℃에 저장하였다.
BH3 프로파일링: CLL 환자 말초 혈액, 골수 및 림프절 샘플을 또한 플레이트-기반 형광측정법 또는 FACS 방법에 의해 분석하였다. 간략하게, CLL 환자로부터의 PBMC는 단세포 현탁액으로 제조하고, 디기토닌 (0.002%)를 사용하여 부드럽게 투과시켰다. 형광측정-기반 방법의 경우에, 100 μM JC-1 (인비트로젠)을 이 시점에 첨가하고, 이어서 세포를 개별 BH3-단독 펩티드를 함유하는 개별 웰을 갖는 384-웰 플레이트 상에 로딩하였다. 이어서, JC1-BH3 검정은 3-시간 과정으로 Ex 545 +/- 20 nM 및 Em 590 +/- 20 nm을 사용하는 테칸 사파이어 2(Tecan Safire 2) 상에서 3중으로 수행하였다. FACS-기반 방법의 경우에, CLL 환자 PBMC로부터의 단세포 현탁액을 인간 Fc 블록 (BD 파밍겐(BD Pharmingen))에 이어 항-CD19-V450 (BD 파밍겐) 및 항-CXCR4-APC (BD 파밍겐)를 사용하여 염색하였다. 세포는 PBS에서 세척하고, 이어서 각각 개별 BH3-단독 펩티드를 함유하는 개별 FACS 튜브에 첨가하였다. 샘플을 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 100 μM JC-1을 각각의 튜브에 첨가하고, 샘플을 추가의 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 측정은 407, 488 및 633 nm에서의 레이저를 사용하는 BD FACS Canto II 상에서 수행하였다. JC-1은 530/30-nm 필터 (FITC) 및 585/42-nm 필터 (PE)를 이용하는 488-nm 레이저로부터 측정하였고, 미토콘드리아 감극의 정도를 PE 신호의 중간값의 변화의 대용물을 이용하여 계산하였다. 각각 BH3 펩티드에 반응하여 보고된 미토콘드리아 감극은 음성 대조군, 디메틸 술폭시드 (DMSO) (0%) 및 양성 대조군, 미토콘드리아 탈커플링제 카르보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)-페닐히드라존 (FCCP) (100%)과 JC-1 염료의 PE 형광의 중간 백분율 변화에 대해 정규화된다.
칼세인-기반 부착 검정: CD154+ L 또는 기질NKTert 세포의 전면성장 단층을 24시간 동안 96-웰 플레이트에서 1x104개 세포/웰을 플레이팅하여 생성하였다. 이어서 0.5x106개 세포/ml의 CLL 세포의 단세포 현탁액을 1 μg/mL 칼세인-AM (인비트로젠)으로 1시간 동안 표지하였다. 이어서, 세포는 회전 침강시키고, 1 내지 24시간 동안 화합물 또는 비히클로 처리하였다. 비-부착 세포를 흡입에 의해 세척하였다. CLL 세포 부착을 형광측정법 (Ex/Em = 485/520 nm)에 의해 정량화하고, 니콘 TE2000 전도된 생존-세포 영상화 시스템을 이용하여 직접 시각화하였다.
데이터 분석 및 통계: 결과는 각 도면에 기재된 바와 같이 평균의 표준 오차 및 반복 횟수와 함께 제시된다. 스튜던트(Student) 쌍형성 또는 비-쌍형성 t-검정, 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정, 또는 선형 회귀 분석을 통계 비교에 이용하였다. 분석을 PC용 그래프패드 프리즘 5(GraphPad Prism 5) 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 캘리포니아주 샌디에고)로 수행하였다. 유동 세포측정법 데이터를 FACS Diva 버전 6.1.1 (BD 파밍겐)을 사용하여 분석하였다. 임상 반응을 최고 반응으로 완전 또는 부분 반응을 달성한 환자로서 정의된 반응자, 및 제1 요법 완료 6개월 내에 안정한 질환, 불응성 질환, 또는 진행성 질환을 갖는 정의된 비-반응자의 2008 IW-CLL 기준을 이용하여 평가하였다. 달리 나타내지 않는 한 양측 p-값 ≤ 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
현재, 제일선의 종래 CLL 요법을 받은 다수의 환자는 종종 재발되고, 이들의 치료에 저항성이 발생한다. 다양한 기질에 노출된 CLL 세포는 세포독성 화학요법 (문헌 [Kurtova AV et al. Diverse marrow stromal cells protect CLL cells from spontaneous and drug-induced apoptosis: development of a reliable and reproducible system to assess stromal cell adhesion-mediated drug resistance. Blood. 2009; 114(20):4441-4450]) 및 BH3-모방체, 예컨대 ABT-737 또는 ABT-263 (문헌 [Vogler M et al. Concurrent up-regulation of BCL-XL and BCL2A1 induces approximately 1000-fold resistance to ABT-737 in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2009;113(18):4403-4413]) 둘 다로의 치료에 저항성이기 때문에, 기질 미세환경에서의 CLL 세포는 기질로부터 증식성 또는 항-아폽토시스 신호를 받아 세포 아폽토시스로부터 보호될 수 있다. 따라서, 상호작용을 길항하는 작용제는 CLL에서 기질-매개 저항성을 감소시킬 수 있다.
화학식 I의 화합물은 기질 미세환경을 조절할 수 있다. 임상 연구에서, 화합물 I 및 BCR 경로를 표적으로 하는 다른 작용제로 치료된 대부분의 환자는 빠르고 일시적인 림프구증가증을 나타내었다. 어떠한 이론에로 제한되지 않으면서, 화합물 I은 CXCL12/13을 향한 CLL 세포 화학주성을 억제하거나, 기질 세포 아래의 CLL 세포 이동을 감소시키거나, 케모카인 분비를 하향-조절하거나, 또는 다른 하류 표적, 예컨대 AKT 및 ERK의 인산화를 억제함으로써 기질 미세환경을 조절할 수 있다. 화합물 I이 미토콘드리아 아폽토시스 또는 프라이밍을 증가시킴으로써 CLL-기질 상호작용을 조절하는지 여부를 특성화하기 위해, BH3 프로파일링을 이용하여 사멸전 BCL-2 패밀리 단백질의 사멸전 BH3 도메인의 유래된 펩티드에 의해 유도된 미토콘드리아의 투과화를 측정하였다.
우선, 30명의 환자의 말초 혈액으로부터의 CLL 세포를 조사하였다. 대부분의 환자는 이전에 치료를 받은 적이 없고, 최근에 요법을 받은 환자도 없었다. BH3 프로파일링에서의 0.03 μM의 최종 농도에서, BIM BH3 펩티드는 대부분의 환자 샘플에서 유의한 양의 감극을 유도하였는데, 샘플 중 22/30 (73.3%)개가 1시간까지 >50% 감극을 나타내었다. 도 58a에 나타난 바와 같이, CLL 세포는 아폽토시스에 대해 고도로 프라이밍되었다. 또한, BH3 프로파일링의 결과는 대부분의 CLL 환자 샘플이 BAD BH3 펩티드로부터 비교적 증가된 감극을 나타낸다는 것을 보여주었으며, 이는 BCL-2 (n=23)에 대한 주요 의존성을 제안한다. 도 58b에 나타난 바와 같이, 일부 샘플은 MCL-1 (n=5), 또는 BCL-XL (n=2)에 보다 의존성인 것으로 관찰되었다. 도 58c에 나타난 바와 같이, 2008 IW-CLL 기준에 의한 부분 반응 (PR) 또는 완전 반응 (CR)을 달성한 치료-나이브 환자로부터의 예비-처리 샘플은 제일선의 CLL 요법 완료 6개월 동안 또는 내에 진행성 질환 (PD)을 앓는 환자로부터 샘플보다 더 프라이밍되는 것으로 관찰되었다 (p=0.024). 도 58d에 나타난 바와 같이, BH3 프로파일링은 비돌연변이된 IGHV 상태를 갖는 환자 (n=7)가 돌연변이된 IGHV 상태를 갖는 환자 (n=18)보다 유의하게 더 프라이밍된다는 것을 보여준다 (p=0.0026). 도 58e에 나타난 바와 같이, 배선에 대한 VH 상동성의 백분율은 프라이밍의 수준과 양성적으로 관련되는 것으로 관찰되었다 (p=0.0043). 따라서, CLL 세포가 아폽토시스에 대해 고도로 프라이밍되고, CLL 세포가 통상적으로 BCL-2 의존성이고, 증가된 프라이밍이 개선된 임상 반응 및 비돌연변이된 IGHV와 연관된다는 것이 관찰되었다.
다음에, 시험관내에서 기질-노출된 CLL 세포의 부착, 생존율 및 프라이밍에 대한 화합물 I의 효과를 평가하였다. 도 59a-e는 일반적으로 화합물 I이 기질에서 격리된 CLL 세포를 방출하여 기질-매개 저항성을 극복하는 것으로 관찰되었다는 것을 보여준다. 말초 혈액-유래 CLL 세포를 칼세인-AM으로 표지하고, 화합물 I (10 μM)과 함께 또는 이들 없이 24시간 동안 기질NKTert 상에서 공동-배양하고, 부드럽게 피펫팅하여 세정하고, 광시야 현미경검사에 의해 시각화하였다. 도 59a에 나타난 바와 같이, 기질NKTert와 공동-배양하고 화합물 I로 처리한 CLL 세포는 24시간에 보다 적은 부착을 나타내었다. 또한, 도 59b는 CLL 세포의 감소된 부착이 심지어 단지 화합물 I의 처리 1시간 후에 검출가능하였으며, 이는 CLL 세포 사멸이 일어나기 전이라는 것을 보여주었다. 또한, 도 59c는 화합물 I에 반응한 기질로부터의 CLL 세포의 탈부착이 CLL 세포의 사멸을 증진시킨다는 것을 보여주었다. 특히, 2명의 환자에 대한 평균 생존율 퍼센트가 도 59c에 SEM과 함께 도시되고, 이들 환자는 둘 다 100 nM의 ABT-737 또는 10 μM의 화합물 I 단독에 대한 현저한 기질-매개 저항성을 입증하였다. 이러한 저항성은 2종의 화합물의 조합에 의해 극복되는 것으로 관찰되었다.
화합물 I에 의한 CLL 세포의 직접적인 사멸의 조사를 피하기 위해, ABT-737 및 화합물 I 둘 다에 저항성인 2개의 CLL 환자 샘플을 기질의 존재 하에 처리하였다. 양쪽 샘플에서, 화합물 I은 기질의 존재 하에 ABT-737에 대한 CLL 세포의 감수성을 복구하였다. 또한, 다양한 용량의 ABT-737 및 그의 경구 유사체 ABT-263과 조합된 화합물 I (10 μM)로 처리된 기질-노출된 CLL 세포는 기질-노출된 CLL 세포가 BH3 모방체로의 사멸의 용량-의존성 증가를 나타낸다는 것을 보여주었다. 특히, 도 59d와 관련하여, ABT-737에 대한 저항성이 기질NKTert의 존재 하에 관찰되었으나, 10 nM만큼 낮은 ABT-737의 농도로도 극복될 수 있다. 도 59e와 관련하여, ABT-263은 유사한 용량-반응 곡선을 나타낸다.
PI3K 억제가 프라이밍을 증가시킴으로써 기질-노출된 CLL 세포의 감수성을 증가시키는지 여부를 결정하기 위해, PB-유래 CLL 세포를 24시간 동안 기질NKTert 세포와 함께 또는 이들 없이 배양하고, 아넥신-PI 및 BH3 프로파일링을 이용하여 조사하였다. 처리되지 않은 CLL 세포는 일반적으로 24시간에 걸친 생체외 배양에서 아폽토시스를 나타내었다 (문헌 [Collins RJ et al. Spontaneous programmed death (apoptosis) of B-chronic lymphocytic leukaemia cells following their culture in vitro. British journal of haematology. 1989; 71(3):343-350]). 4개의 CLL 환자 샘플의 기질 공동-배양이 처리되지 않은 세포에서 아폽토시스로부터의 보호로 이어진다. 특히, 도 60a와 관련하여, 2-원 ANOVA 분석은 기질이 화합물 I의 부재 하에 아폽토시스로부터의 보호를 제공한다는 것을 보여주었다. 기질의 부재 하에, 화합물 I은 대조군보다 많은 아폽토시스를 유도하는 것으로 관찰되었다. 기질의 존재 하에, 화합물 I은 대조군보다 유의하게 많은 아폽토시스를 유도하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 어떠한 유의한 차이도 기질의 존재 또는 부재 하의 화합물 I에 의한 사멸 사이에서 관찰되지 않았다.
그러나, 아폽토시스로부터의 저항성 또는 보호는 화합물 I에 의해 역전되었다. 처리되지 않은 기질-노출된 CLL 세포에서의 10% 미만의 아폽토시스와 비교하여 화합물 I (10 μM)로 처리된 기질-노출된 CLL 세포에서 40% 초과의 아폽토시스가 검출되었다. 또한, 도 60b에 나타난 바와 같이, BH3 프로파일링은 화합물 I로 처리된 기질-노출된 CLL 세포가 처리되지 않은 세포와 비교하여 24시간에서 상승된 미토콘드리아 프라이밍을 나타내었다 (p=0.075)는 것을 보여주었다. 도 60c에 나타난 바와 같이, 펩티드로 사용된 BAD BH3 펩티드 및 ABT-737은 둘 다 화합물 I로 처리된 CLL 세포에서 유의하게 보다 많은 미토콘드리아 감극을 유도하였다 (각각 p=0.046 및 p=0.047). 이는 화합물 I로의 처리가 BCL-2 길항작용에 상승된 미토콘드리아 프라이밍 및 상승된 감수성을 수반하며, 기질로부터 CLL을 탈부착시킨다는 것을 제안한다.
전반적으로, 본 실시예는 PI3K 억제가 기질에 의한 CLL 세포의 보호에 길항작용을 하고, 화합물 I이 CLL 세포에 대한 기질의 효과: 부착, 감소된 미토콘드리아 프라이밍, 및 BCL-2를 억제하는 요법에 대한 감소된 감수성을 반전시키는데 효과적이라는 것을 제안한다. 또한, 화합물 I의 효능은 환자에서 림프구 재분포와 연관될 수 있다. 기질로부터 CLL 세포를 방출함으로써, 화합물 I은 아마도 CLL 세포가 항-아폽토시스성 기질 환경으로부터 나오도록 허용하였을 것이며, 이에 의해 그의 미토콘드리아 프라이밍을 증가시키고 아폽토시스에 감수성이 될 것이다. 본 실시예는 또한 BCL-2 억제와 PI3K 억제의 조합이 BCL-2 억제에 대한 반응을 증가시킨다고 제안한다.

Claims (22)

  1. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게
    유효량의 하기 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
    <화학식 A>
    Figure pct00059

    (상기 식에서, R은 H, 할로 또는 C1-C6 알킬이고; R'은 C1-C6 알킬임)
    임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
    벤다무스틴, 리툭시맙, 레날리도미드 및 오파투무맙으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 하나 이상의 추가의 치료제
    를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 화합물이 하기 화학식 I"의 화합물인 방법.
    <화학식 I">
    Figure pct00060
  3. 제1항에 있어서, 화합물이 하기 화학식 II"의 화합물인 방법.
    <화학식 II">
    Figure pct00061
  4. 제1항에 있어서, 암이 혈액 악성종양인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 혈액 악성종양이 B-세포 악성종양인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 혈액 악성종양이 백혈병 또는 림프종인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 암이 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 비-호지킨 림프종 (NHL)인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 암이 무통성 비-호지킨 림프종 (iNHL)인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 화합물 및 하나 이상의 치료제를 각각 적어도 하나의 사이클 동안 적어도 1회 투여하고, 하나 이상의 치료제를 대상체에게 화합물의 투여와 동일하거나 상이한 사이클에서 투여하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 사이클이 7 내지 42일인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 하나 이상의 치료제를 대상체에게 적어도 하나의 사이클의 적어도 제1일 및 제2일에 투여하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 하나 이상의 치료제를 대상체에게 적어도 하나의 사이클 동안 매주 투여하는 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 50 mg 내지 200 mg의 화합물을 대상체에게 1일 2회 투여하는 방법.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 50 mg/㎡ 내지 1,500 mg/㎡의 하나 이상의 치료제를 대상체에게 투여하는 방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 상기 화합물 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물로 존재하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 표준 화학요법 치료에 저항성인 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 하나의 림프절 비대를 갖는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 i) 적어도 하나의 화학요법 치료에 불응성이거나, 또는 ii) 화학요법 또는 그의 조합으로의 치료 후에 재발된 것인 방법.
  19. a) B-세포 악성종양을 앓는 대상체를 확인하며, 여기서 대상체는 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®), 카르필조밉 (PR-171), PR-047, 디술피람, 락타시스틴, PS-519, 에포네마이신, 에폭소마이신, 아클라시노마이신, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, 비닐 술폰 트리펩티드 억제제, 리토나비르, PI-083, (+/-)-7-메틸로무랄리드, (-)-7-메틸로무랄리드, 페리포신, 리툭시맙, 실데나필 시트레이트 (비아그라(Viagra)®), CC-5103, 탈리도미드, 에프라투주맙 (hLL2- 항-CD22 인간화 항체), 심바스타틴, 엔자스타우린, 캄파트 1H®, 덱사메타손, DT PACE, 오블리메르센, 안티네오플라스톤 A10, 안티네오플라스톤 AS2 1, 알렘투주맙, 베타 알레틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 히드로클로라이드, PEG화 리포솜 독소루비신 히드로클로라이드, 프레드니손, 프레드니솔론, 클라드리빈, 빈크리스틴 술페이트, 플루다라빈, 필그라스팀, 멜팔란, 재조합 인터페론 알파, 카르무스틴, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 에토포시드, 멜팔란, 돌라스타틴 10, 인듐 In 111 모노클로날 항체 MN-14, 이트륨 Y 90 인간화 에프라투주맙, 항-흉선세포 글로불린, 부술판, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 치료 동종이형 림프구, 이트륨 Y 90 이브리투모맙 티욱세탄, 시롤리무스, 타크롤리무스, 카르보플라틴, 티오테파, 파클리탁셀, 알데스류킨, 재조합 인터페론 알파, 도세탁셀, 이포스파미드, 메스나, 재조합 인터류킨-12, 재조합 인터류킨-11, Bcl-2 패밀리 단백질 억제제 ABT-263, 데니류킨 디프티톡스, 타네스피마이신, 에베롤리무스, 페그필그라스팀, 보리노스타트, 알보시딥, 재조합 flt3 리간드, 재조합 인간 트롬보포이에틴, 림포카인-활성화 킬러 세포, 아미포스틴 3수화물, 아미노캄프토테신, 이리노테칸 히드로클로라이드, 카스포펀진 아세테이트, 클로파라빈, 에포에틴 알파, 넬라라빈, 펜토스타틴, 사르그라모스팀, 비노렐빈 디타르트레이트, WT-1 유사체 펩티드 백신, WT1 126-134 펩티드 백신, 펜레티니드, 익사베필론, 옥살리플라틴, 모노클로날 항체 CD19, 모노클로날 항체 CD20, 오메가-3 지방산, 미톡산트론 히드로클로라이드, 옥트레오티드 아세테이트, 토시투모맙 및 아이오딘 I 131 토시투모맙, 모텍사핀 가돌리늄, 삼산화비소, 티피파르닙, 자가 인간 종양-유래 HSPPC-96, 벨투주맙, 브리오스타틴 1, 항-CD20 모노클로날 항체, 클로람부실, 펜토스타틴, 루밀릭시맙, 아폴리주맙, 항-CD40, 오파투무맙, 템시롤리무스, 벤다무스틴, 퓨린 유사체, 레날리도미드, 알킬화제 및 안트라시클린-함유 요법 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 치료에 저항성이거나 또는 이러한 치료 후에 재발된 것인 단계;
    b) B-세포 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게
    하기 화학식 I"의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
    <화학식 I">
    Figure pct00062

    임의로 제약상 허용되는 부형제; 및
    벤다무스틴, 리툭시맙, 레날리도미드 및 오파투무맙으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 하나 이상의 추가의 치료제
    를 투여하는 단계
    를 포함하는, B-세포 장애를 앓는 대상체를 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 대상체가 리툭시맙, 알킬화제, 플루다라빈 및 안트라시클린-함유 요법 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 치료에 불응성이거나 또는 이러한 치료 후에 재발된 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 50 mg 내지 200 mg의 화합물을 대상체에게 적어도 하나 이상의 사이클 동안 1일 2회 투여하는 방법.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 50 mg/㎡ 내지 1,500 mg/㎡의 하나 이상의 추가의 치료제를 대상체에게 적어도 하나 이상의 사이클 동안 적어도 1회 투여하고, 하나 이상의 치료제를 대상체에게 화합물의 투여와 동일하거나 상이한 사이클에서 투여하는 방법.
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