KR20140016461A

KR20140016461A - 해삼발효추출물 및 이를 함유하는 피부화장료

Info

Publication number: KR20140016461A
Application number: KR1020120082923A
Authority: KR
Inventors: 이충우; 강영기; 김미애; 양수옥; 유병국
Original assignee: 주식회사 유로코스텍
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2014-02-10

Abstract

본 발명은 해삼 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 (1) 해삼육과 내장의 급냉 및 동결건조 단계; (2) 건조된 해삼육과 내장의 분쇄물을 물과 혼합하고 고초균, 유산균 및 효모를 접종하여 발효하는 단계; (3) 발효액을 숙성하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효방법으로서, 해삼 추출물에 고초균, 유산균, 효모 중에서 선택된 1종 이상의 균주를 접종하여 얻은 발효액을 함유하는 것이 특징이다.
따라서, 본 발명은 상기방법에 의한 발효된 해양천연자원의 생리활성물질을 이용함으로서 기존의 제품과는 차별화된 보습, 탄력, 미백, 피부 주름개선, 항아토피, 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다.
(색 인 어)
해삼발효추출물, 보습, 미백, 탄력강화, 주름개선, 항아토피, 항염증, 화장료 조성물

Description

해삼발효추출물 및 이를 함유하는 피부화장료{Fermented sea cucumber extract and its cosmetic usage}

본 발명은 해삼 발효추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 해삼 발효추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름개선, 항아토피, 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 화장품 분야에서는 해양천연자원들의 발효를 이용한 식품 및 화장품에 대한 관심이 증가되면서, 보습, 탄력, 항염증, 항산화, 항아토피, 미백, 피부 주름 개선 등의 다양한 연구들이 활기를 띠고 있다.

발효는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해 또는 합성시키는 과정을 의미하며, 대표적인 발효 미생물로는 고초균, 유산균, 누룩균, 효모, 곰팡이, 초산균 등이 있다.

발효액 추출물은 다른 어떠한 용매를 사용하지 않고, 발효와 숙성과정을 거쳐 천연소재가 함유하고 있는 당성분을 알콜로 변화시키고, 천연소재 속에 들어있는 플라보노이드, 비타민C, 비타민P, 아미노산, 카테킨 등의 유효성분에 대한 추출효율을 높일 수 있다. 또한, 때론 자극적이거나 독성을 줄 수 있는 천연소재는 발효추출법을 통해 천연소재를 안정화시키거나 독성을 줄이거나 안정한 유도체로 전환시키는 방법으로 사용될 수 있으며, 훨씬 뛰어난 미용상의 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에서 이용된 고초균, 유산균 및 효모는 발효공정에 의해 흡수가 용이한 저분자 물질로 전환하는 능력을 통해, 불안정하거나 불활성인 형태의 성분을 활성 형태로 전환할 뿐 아니라, 천연소재의 보습 및 탄력성 증진, 항염증, 항산화, 항아토피, 미백, 피부주름 개선 효과를 극대화 시킨다. 또한 추출된 이후에 발생될 수 있는 자극적이거나 독성이 나타날 수 있는 천연소재를 안정화 시키거나 독성을 줄임으로써, 효과적으로 안정한 유도체로 전환시킬 수 있다.

해삼은 극피동물 해삼강에 속하는 해삼류의 총칭이다. 해삼의 약효가 인삼과 같다고 바다의 삼 또는 바다에서 나는 인삼이란 뜻으로 '해삼(海蔘)'이라고 불리며 혹은 오이와 비슷하다고 해서 서양에서는 '바다 오이'라고도 부른다. 전 세계적으로 1,100여종의 해삼류가 있다. 해삼은 대부분 10~30cm 크기이지만, 큰 것은 길이가 5미터나 되는 것도 있다고 한다. 해삼은 8000미터 깊이에 사는 모든 해양 생물의 90퍼센트 이상을 차지하며 대부분 바다 밑바닥에서 살지만, 심해에 사는 몇몇 종들은 헤엄을 칠 수도 있다고 보고하고 있다.

잘 알려진 종 가운데 모나카리해삼(Holothuria monacaria), 게해삼(H. pervicax), 흰발검정해삼(H. leucospilota), 쇠빛검정해삼(H. moebi) 등은 한국의 중부 이남 조간대에서 흔히 볼 수 있다. 같은 속(屬)의 뱀눈검정해삼(H. argus)은 몸길이 35cm 안팎이고 회색 또는 흰색 바탕에 뱀눈 모양 얼룩점이 흩어져 있으며 얕은 바다에 많이 산다.

흔히 식용으로 하는 종에는 한국 각 연안에 분포하는 참해삼(Stichopus japonicus), 검정점해삼(Paraastichopus nigripunctatus), 파인애플해삼(Thelenota ananas), 동해 연안에 분포하는 광삼(Cucumaria frondosa japonica), 남부 얕은 바다에 분포하는 사각해삼(Stichopus chloronotus) 등이 있다.

해삼은 보기 드물게 알칼리성 식품으로 칼슘, 철, 인 및 요오드 등의 무기질 성분이 많이 들어 있다. 칼슘과 철의 함량이 매우 높아 성장기의 어린이나 임신부의 조혈 작용을 돕는 것으로 알려져 있고, 인의 양이 칼슘의 흡수를 돕는 이상적인 비율로 들어 있어 칼슘 공급원으로 아주 좋은 식품으로 밝혀져 있으며, 요오드가 많아 신진대사 촉진 등에도 좋고 피부와 혈관의 노화를 방지해주는 황산콘드로이친이 들어 있으며 저칼로리 식품으로 비만, 성인병 예방에도 좋다고 알려져 있다.

해삼의 성분은 sterol, triterpene alchol이 함유되어 있다. 그 중에서도 holotoxin은 8.7mg%으로서 일종의 항 진균성제이며 6.25~25/ml의 농도에서 많은 진균을 억제한다. 또 일종의 mucoprotein을 함유하고 있으며 그 안에는 질소가 12.00% 함유되어 있고 그 다당류 부분의 hexosamine, hexuronic acid와 황산이 분자비는 2,1:1이다.

해삼으로부터 얻어진 해삼추출물에는 뮤코다당체의 한 형태인 콘드로이틴이 함유되어 있다. 이 콘드로이틴은 피부의 수분과 영양분을 축적해주는 역할을 하기 때문에 나이가 들어감에 따라 감소하여 피부노화에 관계한다.

물에 담근 해삼에는 수분 76%, 단백질 21,5%, 지방 0.3%, 탄수화물 1%, 회분 1.1%, 칼슘 118mg%, 인 22mg%, 철 1.4mg%가 들어 있다. 1kg의 건조된 해삼에는 요오드가 6000ug 들어 있다.

마른 해삼은 수분 21.55%, 조단백질 55.51%, 조지방 1.85%, 회분 21.09%, 젖은 해삼은 수분 76%, 단백질 21.5%, 지방 0.3%, 탄수화물 1%, 회분 1.1%, 칼슘 118mg%, 인 22mg%, 철 1.4mg%이다. 마른 해삼의 요오드 함량은 6000mg/kg이다. 또한 칼슘 0.118%를 포함하며 17가지 광물질이 들어 있다. 당류는 1.37%이다. 해삼의 살에는 미오신 B가 들어 있다. 단백질의 주요 성분은 아르기닌, 시스틴이다. 비타민 B1, 0.03mg%, B2 0.11mg%, 트립토판을 비롯한 18가지 아미노산, 콜레스테롤 26mg%, 팔미틴산, 스테아린산, 올레인산, 리놀렌산 등 지방산이 들어 있다.

이렇게 식용 및 약용으로 겸용되고 있는 해삼은 바다의 인삼으로 불리어져온 수산건강식품으로서 그동안 자양강장과 보신용식품으로 널리 사용되어 왔는데, 최근에는 해양천연자원의 활용과 발효의 생리활성에 관한 특징이 부각되면서 의약품, 화장품, 및 기능성 식품 소재로서 많은 연구가 진행 되고 있다.

국내 해삼 발효물 관련 특허를 살펴보면, 한국 등록특허 제10-0244546호에는 해삼을 볏짚과 혼합하여 발효시키고 그 발효물질을 여과하여 얻은 여액을 분말화 한 발효식품이 개시된 바 있으며, 한국 등록특허 제10-0167831호에는 해삼을 수용액 상에서 추출한 후 알코올로 분별 침전시켜 콘드로이틴황산 함유 추출물을 식품, 화장품, 의약품의 원료로 사용하는 방법이 개시된 바도 있다. 한국 등록출원 제 99-0003595호에 의한 해삼 펩타이드의 제조방법에서는 일반적인 분해효소로 처리하여 해삼에 있는 단백질만을 분해한 바도 있다.

이외 해삼의 효능을 이용한 화장품 적용 특허를 살펴보면, 발명의 명칭 해삼 추출물을 이용한 마스크 팩의 제조방법(공개번호 10-2012-0080718), 해삼 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물(공개번호 10-2008-0111813), 해삼으로부터 타이로시네이스 억제능이 있는 추출물을 회수하는 방법 및 그로부터 회수된 해삼 추출물(공개번호 10-2008-0111812), 해삼추출물을 이용하여 주름개선 효과를 가지는 기초화장용영양크림의 제조방법(공개번호 10-2006-0066151), 발명의 명칭 해삼추출물을 함유한 미용비누의 제조방법 및 그 미용비누(공개번호 10-2012-0039833) 등이 있다.

이와 같이 해삼을 원형 보존하거나, 단백질 성분을 단순 분해하거나, 아니면 단순 화장품 및 식품의 효능으로만 해삼 가공이 존재해 해 왔다.

그러나 종래 해삼 발효 추출물의 유효성분을 이용한 피부의 미백, 보습, 탄력, 항아토피, 항염증의 효능을 확인한 예에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.

현재까지 해삼에 관한 연구들이 활발하게 진행되어 왔으나, 발효 공정을 통해 유효성분을 극대화 시킬 수 있으면서 자극적이거나 독성이 나타날 수 있는 천연소재를 안정화 시킬 수 있는 해삼 발효추출물에 관한 연구는 전무하다.

이에 본 발명은 발효공정을 통한 해삼 발효추출물이 가지는 유효성분의 함량을 증진시킨 화장료 조성물에 관한 것으로서, 해삼 발효추출물을 함유하는 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선, 항아토피, 항염증용 화장료 조성물을 개발하게 되었다.

본 발명은 인체에 안전해야하고, 부작용도 없어야 하며, 인체 친화적이어야 한다. 특히 체질이나 아토피 피부 또는 민감성 피부에도 안심하고 사용할 수 있어야 한다. 해양 동/식물의 천연물들은 안전성이 뛰어날 뿐 만 아니라 인체에 유익한 성분들이 있기 때문에 피부 보습, 미백, 피부개선의 효과를 제공한다. 그리하여 해양 수산물의 일종인 해삼으로부터 안전성이 뛰어나고 여러 가지 기능성을 제공하는 추출물을 찾고자 노력하던 중 해삼 추출물을 포함하고, 이에 유효 발효균주 고초균, 유산균 및 효모를 이용한 발효를 통해 제품에 적용하여 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선, 항아토피, 항염증용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

그리하여, 본 발명은 식품으로서 개발되어 왔던 해삼에 발효 기능성 효능을 추가하여 고부가가치의 기능성 화장품 및 의약품의 소재로 개발하고자하는 시도의 일환으로 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선, 항아토피, 항염증용 화장료 조성물을 발명하고자 하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 발효공정을 통한 해삼 발효 추출물을 만들고 이 해삼 발효 추출물을 함유한 보습, 탄력, 미백, 피부 주름 개선, 항아토피, 항염증 활성 갖는 화장료에 관한 것이다.

본 발명에 사용된 해삼은 (1) 해삼육과 내장의 급냉 및 동결건조 단계; (2) 건조된 해삼육과 내장의 분쇄물을 물과 혼합하고 고초균, 유산균 및 효모를 단독 또는 혼합 접종하여 발효하는 단계; (3) 발효액을 숙성하는 단계; 로부터 얻은 발효액, 또는 그 발효액을 다시 일부 또는 전부 감압농축 및 동결건조 하여 제조하여 얻은 농축물, 또는 발효액 및 농축액 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

해삼은 육질과 내장을 분리한 후 수세하였으며, -80에서 급속냉동 보관하여 동결건조 후 분쇄하여 미세 분말 형태로 제조하였다. 해삼을 동결 건조하여 분말한 후 사용함으로써 해삼의 영양성분 및 기능성 성분을 유지하면서 장시간 보관이 가능하고 보관시 취급이 용이하다는 장점이 있으며, 생리활성 성분의 증가는 물론 해삼 양식 원료 공급이 가능하다.

발효방법은 고초균, 유산균, 효모를 이용하여 해삼 추출물을 혼합 발효시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 배양액을 pH 4.0-5.0 내지 5.0-7.5 로 조정하고, 미리 배양된 고초균, 유산균, 효모를 각각 10⁷- 10⁸ CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 25℃ 내지 50℃ 온도에서 18시간 내지 120시간 배양하였다. 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 발효를 종료하기 위해 80에서 10분간 열을 가하여 고초균, 유산균, 효모의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다. 상기 방법으로 얻어진 발효물은 숙성하는 단계를 거칠 수 있으며, 이로부터 얻은 발효물 또는 그 발효물을 다시 일부 또는 전부 감압농축 및 동결건조하여 얻은 농축물, 또는 발효물 및 농축액 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기의 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않고 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 상기 해삼 발효추출물은 조성물 전체에 대하여 동결건조 중량 기준 0.001 내지 95 중량%로 조성물에 존재할 수 있다.

만약 상기 해삼 발효추출물이 나노캡슐, 마이크로캡슐, 나노좀 등의 제형으로 용액 또는 파우더 형태로 존재한다면 당업자는 상기 농도 범위 내에서 본 발명에 따른 조성물 내에 이 용액 또는 파우더의 양을 조절할 수 있을 것이다. 상기한 바와 같이 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선, 항아토피, 항염증 활성을 갖는 조성물로 가공된 화장품, 식품, 의약품 등에 제공된다.

본 발명의 해삼 발효추출물은 피부외용제로서 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 유연화장수, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩 또는 보디 오일 등의 기초 화장료 및 파운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 화장료를 세정제로 사용할 경우, 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 위해 실시예와 비교예 및 실험예를 통하여 상세하게 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는 해삼 발효추출물을 함유하는 조성물의 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선 효과를 확인하였으며, 인체 피부 자극시험 평가를 통해 목적을 달성하였다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 해삼 발효추출물를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 해삼 발효추출물은 콘드로이친황산을 포함한 유효성분을 포함하고, 고초균, 유산균, 효모 중에서 선택되는 1종 이상의 균주를 이용한 발효공정을 통하여 생성된 발효액은 발효공정 과정에서 생성되는 효소에 의한 고분자 화합물의 저분자 화합물로의 전환 및 피부에 유용한 물질이 증가하여 피부보습, 피부탄력 강화, 미백 효과, 항아토피, 항염증효능에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 해삼 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물은 항산화 활성, 콜라겐의 생성, MMP-1(Matrix metalloproteinase ; 콜라겐의 분해를 촉진하는 효소)의 저해 효과가 우수하여 피부 주름 개선 효과를 발휘한다.

<실시예 1> 실험 준비

해삼은 생해삼을 구입하여 이물질을 제거한 다음 통째로 세척하였고, 육질과 내장을 분리한 후 한번 더 세척하였다. -80℃에서 급속냉동 보관하여 동결건조 후 분쇄하여 분말 형태로 제조하였다.

<실시예 2> 해삼 발효추출물의 제조

해삼육질과 내장 분말의 건조 중량의 10배 양의 증류수를 가하여 잘 섞어준 후, pH를 4.0-5.0 내지 6.5-7.5 로 조정하고, 미리 배양된 고초균(Bacillus subtilis) 유산균(Lactobacillus plantarum)과 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 각각 10⁷- 10⁸ CFU/mL 농도가 되도록 첨가한다. 유산균과 고초균은 30-37℃ 온도에서 3 - 7 일간 배양하고, 효모는 50-60℃ 온도에서 24시간 내지 72시간 배양하였다. 발효를 종료하기 위해 80℃에서 10분간 열을 가하여 고초균 유산균 및 효모의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 60℃이하에서 감압농축한 후 동결건조된 것을 사용하였다.

<비교예 1> 해삼 일반 추출물의 제조

대조군으로 사용된 해삼 일반 추출물은 발효 공정 없이 동일한 열수 추출 공정을 통해 수득하였다. 즉, 건조 중량의 10배 양의 증류수를 가하여 잘 섞어준 후, 80℃에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다. 각 추출물은 냉침한 후, 8um 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하였다. 이 여과된 추출액을 60℃이하에서 감압농축한 후 감압건조기를 이용해 완전히 건조시켜 해삼 일반 추출물을 수득하였다.

<실험예 1> 해삼 발효 추출물에 함유된 성분 및 성분의 함량 측정

<1-1> 콘드로이틴황산 함량

콘드로이친황산은 건강기능식품공전에 따라 측정하였다. 즉, 시료 3g을 물을 가하여 혼합하고 100mL로 하여, 이 액 4mL를 정확히 취하여 물을 가해 20mL로 하고, 정량분석용 여지(Adventec. 5C)를 사용하여 여과한 것을 검액으로 하였다. 별도로 두 개의 비색관에 붕산나트륨황산 시약 5mL를 각각 넣고 얼음물로 충분히 냉각한 후 검액과 표준용액을 1mL를 시약 위에 주의하여 가하고 얼음물 속에서 냉각하였다. 각각에 카바졸시액 0.2mL를 정확히 가하여 혼합하고 수욕상에서 15분간 가열하고 얼음물로 실온까지 냉각한다. 이들의 액에 대하여 물 1mL를 사용하여 동일하게 조작한 것을 대조액으로 하여, microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 530nm에서 흡광도를 측정하였다.

콘드로이친황산 함량

시료명	콘드로이친황산 함량(%)
해삼 발효추출물	39
해삼 일반추출물	27

<1-2> 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량 측정

총 페놀 함량 측정은 하기와 같이 수행하였다. 시료 200ul에 1N Folin Ciocalteau 용액 200ul을 넣고 10% 탄산나트륨 용액 200ul을 넣어 상온에서 10분간 방치하였다. 반응액을 150g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 표준곡선은 galic acid 0.1% 농도를 희석하여 작성하였고, 검량선으로부터 시료의 총페놀함량을 산출하였다.

총 플라보노이드 함량 측정은 하기와 같이 수행하였다. 시료용액 1% 100ul과 에탄올 300ul, 10% 질산알루미늄용액 20ul, 1M 초산칼륨용액 20ul, 물 560ul을 가하여 충분히 교반한다. 실온에서 40분간 정치 후 액층을 microplate reader (Chromate, USA)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정한다. 공시험은 시료 용액 대신 에탄올 용액을 이용하여 동일하게 처리하였고, 시료 blank는 질산알루미늄용액 대신 물을 사용한 것을 사용하였다. 이때 표준곡선은 Quercetin 0.05% 농도를 희석하여 작성하였고, 검량선으로부터 시료의 총플라보노이드 함량을 산출하였다.

총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량

시료명	총 페놀 함량 (ug/mg of extract)	총 플라보노이드 함량 (ug/mg of extract)
해삼 발효 추출물	16.3	6.0
해삼 일반 추출물	10.9	3.2

<실험예 2> 항산화 활성 비교

해삼 발효추출물의 항산화 활성을 측정하기 위하여, DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 라디칼 소거능을 사용하였다.

500 uM DPPH (2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 용액을 에칠 알콜에 녹여 여과한 후 즉시 사용하였다. 제조된 DPPH 용액과 시료 용액을 1:1로 혼합하여 격렬하게 섞은 후, 상온 암소에 20 분간 방치하였다. Microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 1를 통해 DPPH 라디칼 제거율(%)을 산출하였다. 이때 라디칼을 제거하는 양성 대조군(positive control)으로 1 mM의 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.

'수학식 1'

DPPH 라디칼 제거율(scavenging, %) = (A - B) / A x 100

상기 식에서, A는 공시험액에서 얻은 흡광도이고, B는 검액에서 얻은 흡광도임

해삼 발효추출물의 항산화 활성

농도(%)	항산화력(%)
농도(%)	해삼 발효추출물	해삼 일반추출물
0.005	36%	34%
0.01	69%	48%
0.1	91%	81%

<실험예 3> 피부주름 개선 효과

<3-1> 콜라겐 생합성 평가

시료에 대한 Fibroblast 세포 내에서 새로 생성되는 collagen 양을 측정하기 위해 procollagen assay 를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1% Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10% Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation 시킨다. 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, 시료를 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 48시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM 을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control 로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 추출물 처리 후 48시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio Inc. MK101) 를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. Antibody-POD conjugate solution 100ul를 각 well에 첨가하고, sample이나 standard를 20ul씩 넣은 뒤 잘 섞어서 37에서 3시간 방치하였다. 반응이 끝나면 내용물을 제거한 뒤 PBS 400ul로 4번 세척하였다. 제거 후 기질용액 100ul를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 stop solution 100ul 첨가하여 부드럽게 섞어주었다, microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한 후 표준 농도곡선을 작성하여 콜라겐 양을 산정하였다(표 4).

표 4 에 나타난 바와 같이 추출물들의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴보기 위해서, 해삼 발효 추출물을 처리하였을 경우와 이를 비교하기 위한 해삼 일반 추출물(80, 3h)을 함께 비교하였다. 해삼 일반 추출물(80, 3h) 보다 해삼 발효 추출물로 처리하였을 때, 새로 생성되는 콜라겐양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

해삼 발효 추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 콜라겐 생합성

시험군	procollagen conc.(ug/ml)
시험군	0.04%	0.2%
UV(+)	78
AS 25uM	100
해삼 발효추출물	122	137
해삼 일반추출물	110	119

<3-2> MMP-1 저해 평가

Collagen 을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 collagen type I을 분해하는 MMP-1 (Matrix metalloproteinaseI, collagenase)으로 이를 측정하기 위해 MMP-1 assay를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1% Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10% Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵ 농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation 시킨다. 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, 시료를 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 48시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 추출물 처리 후 48시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 MMP-1 측정 키트 (RPN 2610, Amersham Bioscience, UK) 를 이용하여 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Anti-MMP1 antibody로 코팅된 96 well plate에 buffer를 well 하나에 첨가하여 blank로 삼고, 배지 중에 유리된 샘플과 표준액 100ul를 각각의 well 에 넣는다, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 3회 반복해서 세척 한 후 물기를 완전히 제거한다. 100ul peroxide conjugate를 첨가하고, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 30분간 shaking 하면서 반응시킨다. 100ul 1M H2SO4로 반응을 중지시킨 후 microplate reader (Chromate, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다(표 5).

표 5 에 나타난 바와 같이 추출물들의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴보기 위해서, 해삼 발효 추출물을 처리하였을 경우와 이를 비교하기 위한 해삼 일반 추출물(80, 3h)을 함께 비교하였다. 해삼 일반 추출물(80, 3h)에 비해 해삼 발효 추출물로 처리했을 때 새로 MMP-1 활성이 저해되었고, 이는 콜라겐 생합성 결과(표 5)와 일치하는 양상을 보인다.

해삼 발효 추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 MMP-1 활성 저해도

시험군	MMP-1 (% of control)
시험군	0.0004%	0.002%
UV(+)	100
AS 50uM	72
해삼 발효 추출물	95	79
해삼 일반 추출물	113	89

표 5 에 나타난 바와 같이 추출물들의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴보기 위해서, 해삼 발효 추출물을 처리하였을 경우와 이를 비교하기 위한 해삼 일반 추출물(80℃, 3h)을 함께 비교하였다. 해삼 일반 추출물(80℃, 3h)로 처리했을 때보다 해삼 발효 추출물로 새로 생성되는 콜라겐양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 표 4 의 콜라겐 생합성에 상응하는 결과를 보여준다.

<실험예 4> 데시게이터를 이용한 보습력 측정

본 발명에 따른 해삼 일반 추출물 및 해삼 발효 추출물 5 mL를 플레이트에 넣은 후 완전건조 된 CaCl₂를 흡습제로 하여 35℃ 데시케이터에서 무게를 측정하였다. 무게는 총 144시간 동안 측정하였다. 화장품 배합의 보습성분으로서 일반적으로 사용되는 1,3-부틸렌 글리콜(BG)과 혼합추출물을 비교하여 실험결과를 나타내었다. 그 결과를 표 6 에 나타내었다.

'수학식 2'

보습력(%) = ( 1 - S/S) x 100

여기서, S는 초기 표본의 무게이고, S는 초기 표본의 무게에서 최종 표본의 무게를 차감한 값이다.

해삼 발효 추출물의 데시게이터를 이용한 보습력 측정

시간(hr)	보습력 (%)
시간(hr)	BG	해삼 일반추출물	해삼 발효추출물
24	100	100	100
48	92	89	93
72	85	77	91
120	82	71	89
144	74	60	86

표 6 에 나타낸 바와 같이, 해삼 일반 추출물과 BG에 비해 본 발명에 따른 해삼 발효 추출물의 보습력이 시간 경과에 따라 유의적으로 높은 것을 알 수 있다.

<실험예 5> 에멀젼 베이스 제조

해삼 발효 추출물을 함유한 화장료를 포함한 에멀젼 베이스를 제조하였다. 본 실험에 사용된 화장료는 유화형 화장액 형태이고, 그 조성은 표 7에 나타낸 바와 같다. 우선 표 7에 기록되어 있는 해삼 발효 추출물 및 기타 함량을 중량별로 첨가한 후 (가)상을 가열하여 90로 유지하고 정제수(30%)를 90℃까지 가열한 후 (가)수상 중에 천천히 첨가하여 호모믹서로 균일하게 유화한다. 그 후 실온까지 냉각하고 남은 (나)상의 정제수를 첨가하고 균일하게 교반하여 화장액을 제조하였다.

에멀전 베이스 제조

구분	성분	중량%
가	해삼 일반추출물 및 해삼 발효추출물	2%
	글리세린	3.00
	디소듐이디티에이	0.02
	폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.5
	세테아릴알코올	0.5
	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.0
	폴리아크릴아마이드 & C13-14이소파라핀 & 라우레스-7	0.60
	방부제	적량
나	정제수	to 100

<실험예 6> 피부 탄력 효과에 대한 측정

본 발명에 따른 화장품의 피부 탄력 효과에 대한 검사를 측정하기 위하여, 건강한 30-40대 성인 남녀 10명을 대상으로 하였다. 실험예 5에서 제조된 화장품을 이용하였으며, 시험 초기(baseline), 2주, 4주, 6주에 항온항습실(온도 20-22℃, 상대습도 40-60%)에서 피검자는 세안 후 1시간 동안 피부를 안정화한 다음, 측정을 수행하였다. 피부의 탄력도는 cutometer SEM 474(Courage+Khasaka, Germany)로 눈가 부위를 측정하였으며, 측정시 음압은 500 mbar, 흡입시간은 2sec, 반복 측정 횟수는 5회로 측정하여 평균 수치를 이용하였다.

피부 탄력성 측정

시험군	피부탄력도(%)
해삼 발효 추출물	32
해삼 일반 추출물	13

Cutometer SEM 474로 측정하여 피부탄력도를 측정한 결과, 해삼 일반 추출물에 비해 해삼 발효 추출물이 피부탄력도가 2.5배 정도 더 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 7> 해삼 발효추출물 화장료 적용에 의한 피부 수분 증가 효과

본 발명에 따른 피부의 보습력 효과를 측정하기 위하여, 설문조사로 피부가 건조하다고 느끼는 20-40세의 여성 40명을 대상으로 상기 실험예 5에서 제조된 화장료를 1일 2회씩 얼굴에 도포하게 한 후 1개월간 사용하게 하였다. 도포 시작 전 항온, 항습 조건(온도 20-22℃, 상대습도 40%)에서 수분보유측정기(corneometer CM825, courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 전도도를 측정하여 기본 값을 삼고, 1주, 2주, 4주 경과 후의 피부 전도도를 측정하여 보습의 증가율을 평가하였다. 이때, 해삼 발효추출물에 대한 음성대조군으로서 해삼 일반추출물을, 양성대조군으로서 추출물 대신 지질혼합물(세라마이드 : 콜레스테롤 : 지방산 = 2: 1: 1)물을 사용하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었으며, 그 결과값은 평균값으로 나타내었다.

피부수분 증가율(%)

시험군	1주 경과	2주 경과	4주 경과
해삼 발효추출물	40	53	73
해삼 일반추출물	35	41	50
양성대조군	37	49	61

<실험예 8> 인체 피부에 대한 미백 효과 시험

연구대상은 건강한 30-40대 성인 남녀 10명을 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5~2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다. 조사 후 시험물질 각 1% (용매는 1,3-부틸렌글리콜:에탄올=7:3), 대조군으로 알부틴 2%, 용매(vehicle)만을 바르고, 한곳은 아무것도 바르지 않고 10 주 동안 상태 변화를 관찰하였다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다. 도포 개시시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(L*)를 하기 수학식 3에 따라 계산하였고, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 L*의 비교로 판정하는데, L* 값이 2 정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5 정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

'수학식 3'

L* = 도포완료시점에서의 L* 값 - 도포개시 할 때 L* 값

피부에 대한 미백 효과

시험군	멜라닌 생성 억제율(%)
해삼 발효 추출물	1.60±0.13
해삼 일반 추출물	1.08±0.05
용매(Vehicle)	0.50±0.15
알부틴	1.53±0.12

상기 표 10의 결과로부터, 본 발명에 의한 해삼 발효 추출물은 해삼 일반 추출물뿐만 아니라 양성대조군인 알부틴 보다 우수한 미백 효과를 보이는 것을 확인하였다.

<실험예 9> 항아토피 활성 측정

<9-1> 디니트로클로로벤젠(DNCB)이 유발된 아토피성 마우스의 혈중 면역글로불린-E(lgE)에 대한 분비 억제능

디니트로클로로벤젠(DNCB)이 유발된 아토피성 마우스를 약 2주 간격으로 모세혈관을 이용해 안 점막에서 혈액을 채취하여 혈중의 혈중 면역글로불린-E(lgE)를 정량하였다. 보통 질환이 유도되어 임상적 점수가 6 내지 7점을 넘어가면 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도가 10 / 이상이 되므로, 채취한 혈액을 약 200 내지 500배 희석하여 측정하였다. 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도는 ELISA 방법을 이용하여 디니트로클로로벤젠(DNCB) 처리가 끝날 때, 그리고 치료 약물의 처리가 끝날 때, 각각 2번 실시하였다. 혈청 내 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도는 약물 처리전의 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도와 처리 후의 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도를 비교하여 감소한 비율을 구한 다음, 약물을 처리한 군의 감소비율과 비교하여 유의성을 검증하였다.

표 11 에서도 확인할 수 있듯이, 해삼 발효추출물 10mg/kg을 경구투여한 군에서 해삼 일반추출물 뿐만 아니라 스테로이드 제제인 덱사메타손(dexamethasone)을 처리한군 보다도 혈중 면역글로불린-E(lgE)의 분비가 억제되는 것을 확인하였다.

해삼 발효추출물의 혈중 면역글로불린-E(lgE)에 대한 분비 억제능

Total IgE (pg/ml)
NC	Dexa 1mM	해삼 일반추출물	해삼 발효추출물
150	106	118	101

* Dexa: Dexamethason

<9-2> 인터페론 감마(IFN-)에 대한 분비 억제능

디니트로클로로벤젠(DNCB)이 유발된 아토피성 마우스의 비장세포를 분리하고 ELISA를 이용하여 상층액에서 해삼 발효추출물에 따른 인터페론 감마(IFN-)의 양을 측정하였다.

그 결과, 표 12 에서도 확인 할 수 있듯이 해삼 발효추출물 10mg/kg을 경구투여한 군에서 해삼 일반추출물 뿐만 아니라 스테로이드 제제인 덱사메타손(dexamethasone) 처리한 군보다도 인터페론 감마(IFN-)의 분비가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

해삼 발효추출물의 인터페론 감마(IFN-)의 분비 억제능

인터페론 감마 (pg/ml)
NC	Dexa 1mM	해삼 일반추출물	해삼 발효추출물
3112	2450	2950	2280

* Dexa: Dexamethason

<실험예 10> 염증반응 억제효과

사람 피부각질세포(human keratinocyte)를 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신 (100 g/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 넣고, 37를 유지하면서 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 수득된 피부각질세포를 6 well plate에 각 well당 3x10⁵개로 분주한 다음 세포배양 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 후 세포에 25 mJ/Cm₂ 량의 자외선을 조사한 후, 시료를 첨가하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후 배양액을 회수하여 염증성 사이토카인인 TNF-a의 분비량을 측정하였다. 측정결과는 표 13 에 나타내었다.

표 13 를 참조하면, 해삼 발효추출물의 경우 자외선에 의해 분비가 증가되는 염증성 사이토카인인 TNF-a(Tumor necrosis factor a)의 분비를 감소시키며, 해삼 일반추출물 뿐만 아니라 양성 대조군으로 사용한 Dexamethason 보다 훨씬 효과가 우수함을 알 수 있다.

해삼 발효추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 TNF-a의 분비량 측정

농도(%)	TNF-a (% of the untreated control)
농도(%)	UV(+)	Dexa 1mM	해삼 일반추출물	해삼 발효추출물
0.0004	100	68	88	71
0.002	100	68	72	45

* Dexa: Dexamethason

<실험예 11> 인체 피부 자극시험 평가

본 발명에 따른 화장품의 안전도를 평가하기 위해 인체 피부 자극시험 평가를 실시하였다. 시험평가는 인체의 피부 1차 자극 시험으로서 첩포시험(팻치테스트)으로 판별하였다. 연구대상은 건강한 10~30대 피험자 30명을 대상으로 CTFA 가이드 라인(The Cosmetic Toiletry and Frangrance association, Safety testing guidelines)에 따라 실시하였다. 실험예 5 에서 제조된 화장액을 각각을 1g씩 적하 시킨 후, 시험 부위인 좌측 상완 내측에 첩포검사를 실시하였다. 첩포는 24시간 도포하며 첩포를 제거한 후는 마킹 펜(marking pen)으로 시험부위를 표시하며 24시간 간격으로 24시간, 48시간, 72시간 후에 각 시험 부위의 염증 및 피부반응을 관찰하여 국제 접촉 피부염 연구회(International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG)의 규정에 따라 판정하도록 하였다(표 14, 15). 최종 판독 결과는 모두 음성반응을 보여 피부 안전성이 우수한 것으로 나타났다(표 16).

피부 안전성 판독의 판정기준

반응	가중치	판정의 기준
-	0	무반응
±	0.5	희미한 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진 형성
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 수포 형성
+++	3	대수포 형성

피부 반응도에 따른 평가 기준(계산값)

시험물질 (Sample)	판정기준
	0.0~0.9	1.0~2.9	3.0~4.9	5.0이상
	무자극	경자극	중자극	강자극

1차 자극 실험 결과

	해삼 발효추출물	해삼 일반추출물
적용 농도(%)	3%	3%
의양성 반응(±)	-	-
약양성 반응(+)	-	-
접촉성 피부염 유발확률(%)	0.00	0.00

(-:무자극)

'수학식 4'

(Grade x No. of respones)

피부반응도 = ------------------------------------------------ x 100

3(Maximum. grad) x n(No. of total subjects)

Claims

해삼 발효추출물을 함유한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
(1) 해삼육과 내장의 분쇄물을 물과 혼합하고 고초균, 유산균 및 효모를 단독 또는 혼합 접종하여 발효하는 단계;
(2) 발효액을 숙성하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효방법.
제 1 항에 있어서, 상기 고초균은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)인 것을 특징으로 하는 발효방법
제 1 항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플렌타럼(Lactobacillus plantarum), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulance) 및 이들의 혼합 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 발효방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효모는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 발효방법.
제 1 항에 있어서, 해삼 발효추출물의 건조 중량을 기준으로 조성물 전체에 대해 0.001 내지 95 중량% 를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항 내지 6 항에 있어서, 해삼 추출물에 고초균, 유산균, 효모로 단독 또는 2종 이상을 통한 발효공정으로 발효시킨 것을 특징으로 하는 피부보습, 피부 탄력강화, 미백, 주름개선 항아토피, 항염증용 화장료 조성물.
제 1 항 내지 6 항에 있어서, 유연 화장수, 영양 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 수중유(O/W) 또는 유중수(W/O)형의 에멀젼, 페이스크성 또는 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 또는 비이온성 형태의 지질 소포체의 형태, 연고, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩 또는 보디오일 등의 기초 화장료, 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 등의 색조 화장료 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부보습, 피부 탄력강화, 미백, 주름개선, 항아토피, 항염증용 화장료 조성물.
제 1 항에 내지 6 항에 있어서, 해삼 발효추출물로 제조된 화장품 또는 생활용품